CN101517081A - RNAi介导的Gremlin抑制用于治疗眼内压相关的状况 - Google Patents

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Abstract

提供了用于抑制眼内压相关状况中gremlin的RNA干扰，所述状况包括高眼压和青光眼，例如正常眼压性青光眼和开角型青光眼。

Description

RNAi介导的Gremlin抑制用于治疗眼内压相关的状况
本申请要求2006年8月24日申请的美国临时专利申请系列号60/839,826的优先权，将其文本特别引入此处作为参考。
发明领域
本发明涉及干扰RNA组合物的领域，所述组合物用于抑制眼内压(IOP)相关状况中蛋白质gremlin的表达，所述状况为例如高眼压和青光眼，包括正常眼压性青光眼和开角型青光眼。
发明背景
青光眼是一组异质性视神经疾病，它们共有某些临床特征。青光眼中视力的丧失是由于神经视网膜中视网膜神经节细胞的选择性死亡，其在临床上被诊断为视野的特征性改变、神经纤维层缺陷，和视神经头(ONH)的进行性杯形弯曲。青光眼发展的一个主要危险因素是存在眼高压(升高的眼内压(IOP))。需要足够的眼内压来维持眼的形状和提供压力梯度以允许房水向无血管的角膜和晶状体的流动。IOP水平也可以涉及正常眼压性青光眼(NTG)的病理，如从IOP降低药疗法受益的患者所证实。一旦进行中心角膜厚度的调节到NTG患者中的IOP读数，发现这些患者许多是眼高压的。
与青光眼相关的升高的IOP是由于小梁网(TM)中升高的房水流出阻力，小梁网是位于眼前房的虹膜-角膜角中的小的特化组织。TM的青光眼改变包括TM细胞的丧失和细胞外碎片的沉积和积累，所述碎片包括蛋白质性质的斑块样物质。此外，在青光眼ONH中也发生改变。在青光眼性眼中，在ONH胶质细胞中发生形态和流动性改变。在应答升高的IOP和/或暂时缺血损伤时，ONH细胞外基质的组成改变并且神经胶质细胞和视网膜神经节细胞轴突形态发生改变。
原发性青光眼由眼内液流动的失调引起，所述眼内液具有解剖学或生理学基础。继发性青光眼由于对眼的损伤或创伤或者现有疾病引起。原发性开角型青光眼(POAG)也称作慢性或单纯性青光眼，代表所有原发性青光眼的多数。POAG的特征是小梁网的变性，导致对从眼的液体排出的异常高的阻力。此类阻力结果是IOP的升高，需要IOP来驱动眼正常产生的液体穿过升高的阻力。
PCT申请号PCT/US02/35251(于2003年7月10日以WO 03/055443公开)涉及青光眼的早期诊断、治疗青光眼及对此有用的化合物的鉴定。其中提供了治疗青光眼的方法，其通过将组合物施用于有此需要的患者，所述组合物包含由至少一种选自下列的化合物组成的序列：BMP2激动剂、BMP4激动剂、BMP5激动剂、BMP7激动剂、Smad1-5激动剂、脊索发生素拮抗剂、gremlin拮抗剂和促滤泡素抑制素拮抗剂。PCT公开WO03/055443并未提供使用干扰RNA的教导或建议。
当前的抗青光眼疗法包括通过使用房水形成的抑制剂或增强眼色素层巩膜流出的试剂、激光小梁成形术、或小梁切除术来降低IOP，所述小梁切除术属于增强排出的过滤外科手术。药物抗青光眼方法已显示出多种不期望的副作用。例如，缩瞳药例如毛果芸香碱可引起目昏和其它不利的视觉副作用。
全身施用的碳酸酐酶抑制剂(CAIs)也可引起恶心、消化不良、疲劳和代谢性酸中毒。此外，某些β-阻断剂已逐渐变为与严重的肺部副作用相关，这归因于它们对肺部组织中β-2受体的影响。拟交感神经药引起心博过速、心律失常和高血压。此类副作用可导致降低的患者依从性或导致治疗的终止。另外，目前IOP降低疗法的功效是相对短效的，每天需要反复给药，且在一些情况下，功效随时间降低。
考虑到青光眼中高眼压的重要性，以及现有治疗方法的不足，将期望有一种治疗高眼压的改良的方法，该方法将解决其进展的根本原因。
发明概述
本发明提供了沉默GREM1mRNA表达从而去除gremlin对骨形态发生蛋白(bone morphogenic protein)的拮抗作用的干扰RNA，所述骨形态发生蛋白阻断至少一些与IOP升高有关的某些因子(例如TGFβ)。因此，沉默GREM1 mRNA表达导致患有IOP相关状况的患者中眼内压的降低。本发明的干扰RNA对治疗患有IOP相关状况，包括高眼压和青光眼例如正常眼压性青光眼和开角型青光眼的患者是有用的。
本发明还提供了减弱受试者中IGF1R mRNA表达的方法。在一方面，该方法包括对受试者施用包含有效量的干扰RNA和药学上可接受的载体的组合物，所述干扰RNA具有19到49个核苷酸的长度。在另一方面，施用于受试者的眼用于减弱人中GREM1的表达。
在一方面，本发明提供了减弱受试者眼中GREM1 mRNA表达的方法，其包括对受试者的眼睛施用干扰RNA，该干扰RNA包含能识别对应于SEQ ID NO：1的mRNA的部分的区域，所述SEQ ID NO：1是编码GREM1的有义cDNA序列(GenBank检索号NM 013372)，其中GREM1mRNA的表达因而被减弱。另外，本发明提供了治疗有此需要的受试者中IOP相关状况的方法，其包括对受试者的眼睛施用干扰RNA，该干扰RNA包含能识别对应于SEQ ID NO：1的部分的mRNA部分的区域，其中GREM1 mRNA的表达因而被减弱。
在某些方面，设计本发明的干扰RNA用来靶定对应于SEQ ID NO：1的部分的mRNA，其中所述部分包含SEQ ID NO：1的核苷酸402、403、404、407、410、425、449、455、485、642、643、686、784、1230、1516、1554、1811、2101、2185、2212、2223、2368、2370、2401、2412、2413、2617、2692、2693、2862、2889、3084、3733、3743、3752、3773、3846、4004、4099、216、235、236、265、267、273、279、280、281、389、391、401、416、426、427、439、440、459、461、471、472、491、497、520、545、546、575、581、587、592、595、596、598、599、624、626、640、646、650、652、657、659、673、676、678、679、688、或689。在特别的方面，“SEQ ID NO：1的部分”的长度是约19至约49个核苷酸。
在某些方面，本发明的干扰RNA具有约19至约49个核苷酸的长度。在其它方面，干扰RNA包含有义核苷酸链和反义核苷酸链，其中每条链具有与另一条链至少19个核苷酸的至少接近完全连续互补的区域，其中反义链可识别对应于SEQ ID NO：1的部分的GREM1 mRNA部分，且具有与所述GREM1 mRNA部分至少19个核苷酸的至少接近完全连续互补的区域。有义和反义链可通过接头序列连接，所述接头序列允许有义和反义链彼此杂交从而形成如此处所述的发夹环结构。
在再一方面，本发明的干扰RNA是单链干扰RNA，且其中单链干扰RNA识别对应于SEQ ID NO：1的部分的mRNA部分。在某些方面，干扰RNA具有与对应于SEQ ID NO：1的部分的mRNA部分至少19个核苷酸的至少接近完全连续互补的区域。在其它方面，SEQ ID NO：1的部分包含SEQ ID NO：1的核苷酸402、403、404、407、410、425、449、455、485、642、643、686、784、1230、1516、1554、1811、2101、2185、2212、2223、2368、2370、2401、2412、2413、2617、2692、2693、2862、2889、3084、3733、3743、3752、3773、3846、4004、4099、216、235、236、265、267、273、279、280、281、389、391、401、416、426、427、439、440、459、461、471、472、491、497、520、545、546、575、581、587、592、595、596、598、599、624、626、640、646、650、652、657、659、673、676、678、679、688、或689。
在其它方面，本发明的干扰RNA包含：(a)至少13个连续核苷酸的区域，其与对应于SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：13-SEQ ID NO：98中任一个的mRNA的3’末端的倒数第二位的13个核苷酸有至少90％序列互补性、或者至少90％序列同一性；(b)至少14个连续核苷酸的区域，其与对应于SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：13-SEQ ID NO：98中任一个的mRNA的3’末端的倒数第二位的14个核苷酸有至少85％序列互补性、或者至少85％序列同一性；或者(c)至少15、16、17或18个连续核苷酸的区域，其分别与对应于SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：13-SEQ ID NO：98中任一个的mRNA的3’末端的倒数第二位的15、16、17或18个核苷酸有至少80％序列互补性、或者至少80％序列同一性；其中GREM1mRNA的表达因而得以减弱。
在另外的方面，经局部、玻璃体内、经巩膜(transcleral)、眼周、结膜、眼球筋膜下(subtenon)、前房内(intracameral)、视网膜下、结膜下、眼球后、或小管内的途径将本发明的干扰RNA或包含本发明的干扰RNA的组合物施用于受试者。干扰RNA或组合物可通过例如干扰RNA表达载体的体内表达来施用。在某些方面，可通过气雾剂、含服、皮肤、皮内、吸入、肌内、鼻内、眼内、肺内、静脉内、腹膜内、经鼻、眼、口、耳、肠胃外、贴剂、皮下、舌下、局部或者经皮施用干扰RNA或组合物。
在一方面，本发明的干扰RNA分子是分离的。术语“分离的”是指干扰RNA脱离了其总的天然环境。
本发明进一步提供了治疗有此需要的受试者中IOP相关状况的方法，包括向受试者施用包含双链siRNA分子的组合物，所述siRNA分子经RNA干扰下调了GREM1基因的表达，其中siRNA分子的每条链独立地为约19到约27个核苷酸长度；并且该siRNA分子的一条链包含具有与对应于GREM1基因的mRNA的实质互补性的核苷酸序列，从而siRNA分子通过RNA干扰指导mRNA的切割。在某些方面，通过气雾剂、含服、皮肤、皮内、吸入、肌内、鼻内、眼内、肺内、静脉内、腹膜内、经鼻、眼、口、耳、肠胃外、贴剂、皮下、舌下、局部或经皮途径施用siRNA分子。
本发明进一步提供用于向受试者除第一种干扰RNA外施用第二干扰RNA。第二种干扰RNA可与第一种干扰RNA靶定相同的mRNA靶基因，或可靶定不同的基因。此外，可以类似的方式施用第三、第四或第五等等干扰RNA。
如此处所述的任一实施方案在制备用于减弱GREM1 mRNA表达的药物中的用途也是本发明的实施方案。
本发明特别优选的实施方案将从下文对某些优选实施方案的更详细描述和权利要求变得显而易见。
附图简述
图1显示了用Gremlin siRNA#1、#2、#3和#4转染的GTM-3细胞中Gremlin mRNA表达的qRT-PCR分析的结果，每种siRNA为10nM、1nM和0.1nM。
图2显示了用Gremlin siRNA#1、#2、#3和#4转染的GTM-3细胞中Gremlin蛋白质表达的蛋白质印迹分析的结果，每种siRNA为10nM、1nM和0.1nM。
发明详述
本文显示的细节是通过实例并且仅仅用于阐明性讨论本发明的优选实施方案的目的并且是为了提供被认为是最有用的和容易理解本发明的多种实施方案的原理和概念方面的原因而给出。在这方面，不试图比基本理解本发明、附图描述和/或实施例所必须的更详细的本发明的结构细节，使得本领域技术人员对于实践中怎样体现本发明的几种形式是显而易见的。
下面的定义和解释意在在将来的任何构造中起控制作用，除非在下面的实施例中清楚并且明确地修饰，或者当所述含义的应用使得任何构造无意义或者基本上无意义时。对于术语的构造将使得它无意义或基本上无意义的情况，该定义将从Webster′s Dictionary(第三版)或本领域技术人员所知的词典例如Oxford Dictionary of Biochemistry Molecular Biology(Ed.Anthony Smith，Oxford University Press，Oxford，2004)得到。
如此处所用的，除非另外指出，所有百分比都是重量百分比。
如此处所用的且除非另外指出，术语“一个”是指“一个”、“至少一个”或“一个或多个”。除非通过上下文另外需要，此处所用的单数术语将包括复数，且复数的术语将包括单数。
在某些实施方案中，本发明涉及干扰RNA抑制gremlin(GREM1)mRNA表达的用途。Gremlin是骨形态发生蛋白(BMP)拮抗剂的CAN家族的成员。该家族的所有成员含有八成员的环形胱氨酸结。几种生长因子受体配体，包括BMPs、TGFβ和PDGF，也属于胱氨酸结超家族。BMPs2、4、5和7；BMP受体R1a、R1b和R2；以及BMP拮抗剂gremlin、bambi、和脊索发生素表达于小梁网(TM)中(PCT申请号PCT/US02/35251，同前；Wordinger等人.，Mol.Vision 2002，8：241-250)。BMP信号阻断了至少一些与增高的IOP相关的TM功能(例如，增高的纤连蛋白分泌)中TGFβ诱导的变化。Gremlin拮抗了BMP对TGFβ信号转导的该效果。而且，青光眼TM细胞中gremlin表达升高(PCT申请号PCT/US02/35251，同前)，且gremlin提高了培养的人眼睛中的IOP。因此，此处提供沉默gremlin表达作为在高眼压和青光眼相关的眼睛疾病的治疗中降低IOP的有效方法。
根据本发明，抑制GREM1 mRNA的表达有效减少了gremlin的作用。而且，外源提供或内源表达的如此处所述的干扰RNA在沉默GREM1mRNA中是特别有效的。
RNA干扰(RNAi)是用双链RNA(dsRNA)沉默基因表达的一种过程。不希望被理论束缚，RNAi以RNA酶III样酶切丁酶将较长dsRNA切割成小的干扰RNA(siRNA)开始。siRNA是dsRNA，其长度通常为约19到28个核苷酸，或者20到25个核苷酸，或者21到22个核苷酸，并且通常含有2个核苷酸的3’突出端，和5’磷酸和3’羟基末端。siRNA的一条链掺入到称作RNA诱导性沉默复合物(RISC)的核糖核蛋白复合物。RISC使用该siRNA链鉴定与掺入的siRNA链至少部分互补的mRNA分子，然后切割这些靶mRNA或者抑制它们的翻译。因此，掺入RISC的siRNA链被称作引导链或者反义链。另一siRNA链称作过客链或者有义链，被从siRNA清除并且与靶标mRNA至少部分同源。本领域技术人员将认识到siRNA的任一链可以掺入到RISC中并且作为引导链发挥功能。然而，siRNA设计(例如，在期望的引导链的5’末端的降低的siRNA双链体稳定性)可以有利于期望的引导链掺入到RISC中。
siRNA的反义链是siRNA的活性引导剂，因为反义链掺入到RISC中，从而允许RISC鉴定与该反义siRNA至少部分互补的靶标mRNA用于切割或翻译抑制。具有与引导链至少部分互补性的序列的mRNA的RISC介导的切割导致该mRNA和该mRNA编码的对应的蛋白质的稳态水平降低。备选地，RISC还可通过翻译阻抑降低对应蛋白质的表达而不用切割靶标mRNA。
本发明的干扰RNA对于靶标mRNA的切割似乎以催化的方式作用，即，干扰RNA能够以亚化学计量的量实现靶标mRNA的抑制。与反义疗法相比，需要显著较少的干扰RNA来在此类切割条件下提供治疗效果。
在某些实施方案中，本发明提供在患有IOP相关状况的患者中利用干扰RNA抑制GREM1靶mRNA表达从而降低GREM1水平的方法。根据本发明，外源提供或内源表达的干扰RNA实现了在眼组织中GREM1表达的沉默。
如此处所用的短语“减弱mRNA的表达”，是指施用或表达一定量的干扰RNA(例如，siRNA)以通过mRNA切割或者通过翻译的直接抑制来减少靶标mRNA向蛋白质的翻译。如此处所述的术语“抑制”、“沉默”和“减弱”指的是与不存在本发明的干扰RNA时靶mRNA或对应蛋白质的表达相比，靶mRNA或对应蛋白质的表达可检测的降低。靶mRNA或对应蛋白质表达的降低通常被称作“击倒”且相对于施用或表达非寻靶对照RNA(即，非寻靶对照siRNA)后存在的水平来报告。此处的实施方案预计包括和50％到100％之间的量的表达击倒。然而，不必为了本发明的目的实现此类击倒水平。
通常通过用定量聚合酶链式反应(qPCR)扩增测量mRNA水平或者通过蛋白质印迹或者酶联免疫吸附测定(ELISA)测量蛋白质水平来评估击倒。分析蛋白质水平提供了mRNA切割以及翻译抑制的评估。用于测量击倒的其他技术包括RNA溶液杂交、核酸酶保护、northern杂交、用微阵列进行基因表达监测、抗体结合、放射免疫测定法，和荧光激活的细胞分析。
由本发明的干扰RNA分子引起的GREM1的减弱表达可通过例如观察IOP相关症状的改善，例如眼内压的改善、视野损失的改善、或视神经头变化的改善而在人或其它哺乳动物中得以推断。
可如下在体外评估干扰RNA击倒例如HeLa细胞中内源性靶基因表达水平的能力。在转染前24小时将HeLa细胞平板接种在标准生长培养基(例如，补充了10％胎牛血清的DMEM)中。使用例如Dharmafect 1(Dharmacon，Lafayette，CO)根据生产商的教导以0.1nM到100nM的干扰RNA浓度进行转染。将SiCONTROLTM非寻靶siRNA#1和siCONTROLTM亲环蛋白B siRNA(Dharmacon)分别用作阴性和阳性对照。在转染后24小时通过qPCR评估靶mRNA水平和亲环蛋白BmRNA(PPIB，NM_000942)水平，使用例如优选覆盖靶位点的
Figure A20078003081700151
基因表达测定法(Applied Biosystems，Foster City，CA)。当转染效率是100％时，阳性对照siRNA给出了亲环蛋白B mRNA的基本完全的击倒。因此，通过参考转染了亲环蛋白B mRNA的细胞中亲环蛋白B mRNA水平来用转染效率校正靶mRNA击倒。可以在转染后约72小时(实际的时间取决于蛋白质更新率)通过例如蛋白质印迹评估靶蛋白水平。用于从培养的细胞分离RNA和/或蛋白质的标准技术是本领域技术人员已知的。为了降低非特异性、脱靶效应的机会，使用干扰RNA的最低可能的浓度，其将产生希望水平的靶基因表达击倒。人角膜上皮细胞或其它人眼细胞系也可用于评估干扰RNA对内源靶基因的击倒水平的能力。
在一个实施方案中，施用靶定GREM1 mRNA的单一干扰RNA以降低GREM1水平。在其他实施方案中，施用靶定GREM1 mRNA的两种或多种干扰RNA以降低GREM1水平。
GenBank数据库以检索号NM_013372提供了GREM1的DNA序列，在“序列表”中以SEQ ID NO：1提供。SEQ ID NO：1提供了对应于编码gremlin的mRNA的DNA的有义链序列(只是用“T”碱基代替“U”碱基)。GREM1的编码序列为核苷酸160-714。
上述GREM1 mRNA序列的等同物是其选择性剪接形式、等位基因形式、同工酶或者同族序列。同族序列是来自另一哺乳动物物种的与SEQ IDNO：1同源的gremlin mRNA(即，直向同源物)。
在某些实施方案中，需要治疗IOP相关状况或者处于发展IOP相关状况的危险中的“受试者”是具有与gremlin的不希望的或者不合适的表达或活性相关的IOP相关状况或者处于有IOP相关状况的危险中的人或者其他哺乳动物。与此类病症相关的眼结构可以包括例如，眼、视网膜、脉络膜、晶状体、角膜、小梁网、虹膜、视神经、视神经头、巩膜、前段和后段、或者睫状体。受试者也可以是眼细胞、细胞培养物、器官或者离体(ex vivo)器官或组织或细胞。
如此处所用的“IOP相关状况”包括眼内高压和与升高的眼内压(1OP)相关的眼疾病，例如青光眼，包括正常眼压性青光眼和开角型青光眼。
除非另有标注，如此处所用的术语“siRNA”指的是双链干扰RNA。通常，本发明的siRNA是包含两条核苷酸链的双链核酸分子，每条链具有约19至约28个核苷酸(即，约19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个核苷酸)。当指双链干扰RNA时，术语“具有19至49个核苷酸长度的干扰RNA”指反义和有义链独立地具有约19至约49个核苷酸的长度，包括其中有义和反义链通过接头分子相连接的干扰RNA分子。
除了siRNA分子，其它干扰RNA分子和RNA样分子可与RISC相互作用并沉默基因表达。可与RISC相互作用的其它干扰RNA分子的例子包括短发夹RNA(shRNA)、单链siRNA、微小RNA(miRNA)和切丁酶底物27聚体双链体。可以与RISC相互作用的RNA样分子的例子包括siRNA、单链siRNA、微小RNA和含有一个或多个化学修饰的核苷酸、一个或多个非核苷酸、一个或多个脱氧核糖核苷酸、和/或一个或多个非磷酸二酯键的shRNA分子。将可以与RISC相互作用并且参与基因表达中RISC介导的改变的所有RNA或RNA样分子都称作“干扰RNA”或“干扰RNA分子”。因此，siRNA、单链siRNA、shRNA、miRNA和切丁酶底物27聚体双链体是“干扰RNA”或“干扰RNA分子”的子集。
已经发现单链干扰RNA实现mRNA沉默，尽管效率低于双链siRNA。因此，本发明的实施方案也提供了单链干扰RNA的施用，所述单链干扰RNA具有与SEQ ID NO：1的部分至少接近完全连续互补的区域。与上面引用的双链干扰RNA一样，单链干扰RNA具有约19到约49个核苷酸的长度。单链干扰RNA具有5’磷酸或者在5’位置原位或体内磷酸化。术语“5’磷酸化的”用于描述例如多核苷酸或寡核苷酸，其具有通过酯键连接到该多核苷酸或寡核苷酸的5’末端的糖(例如，核糖、脱氧核糖或者它们的类似物)的C5羟基的磷酸基团。
如此处所述参考双链干扰RNA，单链干扰RNA可通过化学合成或者通过体外转录或者从载体或表达盒内源表达。5’磷酸基团可以通过激酶加入，或者5’磷酸可以是RNA的核酸酶切割的结果。发夹干扰RNA是单个分子(例如，单个寡核苷酸链)，其在茎环或发夹结构(例如，shRNA)中包含干扰RNA的有义链和反义链。例如，shRNA可以从DNA载体表达，所述载体中，编码有义干扰RNA链的DNA寡核苷酸通过短的间隔区连接到编码反向互补的反义干扰RNA链的DNA寡核苷酸。如果选择的表达载体需要，那么可以加入3’末端T和形成限制性位点的核苷酸。所得的RNA转录物自身向后折叠形成茎环结构。
除非另外指出，此处引用的核酸序列以5’到3’的方向书写。如此处所用的术语“核酸”指DNA或RNA或其修饰形式，其包含DNA中存在的嘌呤或嘧啶碱基(腺嘌呤“A”、胞嘧啶“C”、鸟嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”)或者RNA中的嘌呤或嘧啶碱基(腺嘌呤“A”、胞嘧啶“C”、鸟嘌呤“G”、尿嘧啶“U”)。本文提供的干扰RNA可以包含“T”碱基，尤其在3’末端，尽管“T”碱基不是天然存在于RNA中。“核酸”包括术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并且可以指单链分子或双链分子。双链分子通过A和T碱基、C和G碱基，和A和U碱基之间的沃森-克里克碱基配对形成。双链分子的链可以相互部分、基本上或者完全互补并且将形成双链体杂交分子，其成键强度取决于碱基序列的性质和互补性程度。
如此处所用的术语“DNA靶序列”是指用来衍生本发明的干扰RNA的DNA序列。如此处所用的术语“RNA靶序列”、“干扰RNA靶序列”和“RNA靶”是指GREM1 mRNA或GREM1 mRNA序列的部分，其可由本发明的干扰RNA识别，从而干扰RNA可沉默如此处所述的GREM1基因表达。“RNA靶序列”、“siRNA靶序列”和“RNA靶”通常是与DNA序列的部分相对应的mRNA序列。mRNA序列可容易地从对应于DNA序列的序列推导出。例如，SEQ ID NO：1提供了对应于GREM1 mRNA的DNA的有义链序列。mRNA序列与DNA有义链序列相同，只是用“U”碱基替换了“T”碱基。因此，GREM1的mRNA序列从SEQ ID NO：1中已知。对应于SEQID NO：1的mRNA中的靶序列可位于mRNA的5’或3’非翻译区以及mRNA的编码区中。
在某些实施方案中，利用可获得的设计工具来选择靶mRNA序列内的干扰RNA靶序列(例如，siRNA靶序列)。然后在体外通过转染表达靶mRNA的细胞，随后如此处所述进行击倒评价来测试对应于GREM1靶序列的干扰RNA。可在体内利用如此处所述的动物模型进一步评估干扰RNA。
提供了用于选择siRNA的靶序列的技术，例如，通过由Tuschl，T.等人，″The siRNA User Guide，″(2004年5月6日修订，可以在RockefellerUniversity网站获取；技术公报#506，″siRNA Design Guidelines，″AmbionInc(Ambion的网站)；和其他基于网页的设计工具，例如在Invitrogen、Dharmacon、Integrated DNA Technologies、Genscript或Proligo网站提供。最初的搜索参数可以包括35％到55％之间的G/C含量和19到27个核苷酸的siRNA长度。靶序列可以位于mRNA的编码区或者5’或3’非翻译区中。靶序列可用于衍生干扰RNA分子，例如此处所述的那些。
表1列出了SEQ ID NO：1的GREM DNA靶序列的例子，从所述靶序列以上述方式设计本发明的siRNA。GREM1编码gremlin，如上所述。
表1.用于siRNA的GREM1靶序列
GREM1靶序列   关于SEQ ID NO：1的起始核苷酸# SEQ ID NO：
  GCATGTGACGGAGCGCAAA   402   2
  CATGTGACGGAGCGCAAAT   403   13
  ATGTGACGGAGCGCAAATA   404   14
  TGACGGAGCGCAAATACCT   407   15
  CGGAGCGCAAATACCTGAA   410   16
  TGAAGCGAGACTGGTGCAA   425   17
  AGCCGCTTAAGCAGACCAT   449   18
  TTAAGCAGACCATCCACGA   455   19
  ACAGTCGCACCATCATCAA   485   20
  ACAGCCACCTACCAAGAAG   642   21
  CAGCCACCTACCAAGAAGA   643   22
  GTCGTTGCATATCCATCGA   686   23
  GATTCTTACTTGGCTTAAA   784   24
  TCAGTCTAATCTCTTGTTT   1230   25
  GAAATGAGATTGCCAGAAA   1516   26
  GCAATCTGCTCAAACCTAA   1554   27
  GCCACTAACTTGATTGATA   1811   28
  AGCATAGCATCATGATGTA   2101   29
  GGCACTGTCCTCTGATTAA   2185   30
  TACTGGCAATGGCTACTTA   2212   31
  GCTACTTAGGATTGATCTA   2223   32
  CTAGCCAAGTCCTATGTAA   2368   33
  AGCCAAGTCCTATGTAATA   2370   34
  ACTGCAGACTTGAGATTCA   2401   35
  GAGATTCAGTTGCCGATCA   2412   36
  AGATTCAGTTGCCGATCAA   2413   37
  AGGCGAATTTGTCCAAACA   2617   38
  CCACATTCTCCAACAATAA   2692   39
  CACATTCTCCAACAATAAA   2693   40
  TTTAACTCTGCCACAAGAA   2862   41
  CGTTAACGGAGATGACTTA   2889   42
  GCCTATATTAAGACTAGTA   3084   43
  GACTTACGATGCATGTATA   3733   44
  GCATGTATACAAACGAATA   3743   45
  CAAACGAATAGCAGATAAT   3752   46
  TGACTAGTTCACACATAAA   3773   47
  GTGATCAGTTAATGCCTAA   3846   48
  GAGTTGATAGTCTCATAAA   4004   49
  GCTAAAGAGCAACTAATAA   4099   50
  GCCGGCTGCTGAAGGGAAA   216   51
  AAGAAAGGGTCCCAAGGTG   235   52
  AGAAAGGGTCCCAAGGTGC   236   53
  CCAGACAAGGCCCAGCACA   265   54
  AGACAAGGCCCAGCACAAT   267   55
  GGCCCAGCACAATGACTCA   273   56
  GCACAATGACTCAGAGCAG   279   57
  CACAATGACTCAGAGCAGA   280   58
  ACAATGACTCAGAGCAGAC   281   59
  GCCAAGAGGCCCTGCATGT   389   60
  CAAGAGGCCCTGCATGTGA   391   61
  TGCATGTGACGGAGCGCAA   401   62
  GCAAATACCTGAAGCGAGA   416   63
  GAAGCGAGACTGGTGCAAA   426   64
  AAGCGAGACTGGTGCAAAA   427   65
  TGCAAAACCCAGCCGCTTA   439   66
  GCAAAACCCAGCCGCTTAA   440   67
  GCAGACCATCCACGAGGAA   459   68
  AGACCATCCACGAGGAAGG   461   69
  CGAGGAAGGCTGCAACAGT   471   70
  GAGGAAGGCTGCAACAGTC   472   71
  GCACCATCATCAACCGCTT   491   72
  TCATCAACCGCTTCTGTTA   497   73
  CAGTGCAACTCTTTCTACA   520   74
  GGCACATCCGGAAGGAGGA   545   75
  GCACATCCGGAAGGAGGAA   546   76
  AGTCCTGCTCCTTCTGCAA   575   77
  GCTCCTTCTGCAAGCCCAA   581   78
  TCTGCAAGCCCAAGAAATT   587   79
  AAGCCCAAGAAATTCACTA   592   80
  CCCAAGAAATTCACTACCA   595   81
  CCAAGAAATTCACTACCAT   596   82
  AAGAAATTCACTACCATGA   598   83
  AGAAATTCACTACCATGAT   599   84
  ACTCAACTGCCCTGAACTA   624   85
  TCAACTGCCCTGAACTACA   626   86
  CTACAGCCACCTACCAAGA   640   87
  CCACCTACCAAGAAGAAGA   646   88
  CTACCAAGAAGAAGAGAGT   650   89
  ACCAAGAAGAAGAGAGTCA   652   90
  GAAGAAGAGAGTCACACGT   657   91
  AGAAGAGAGTCACACGTGT   659   92
  CGTGTGAAGCAGTGTCGTT   673   93
  GTGAAGCAGTGTCGTTGCA   676   94
  GAAGCAGTGTCGTTGCATA   678   95
  AAGCAGTGTCGTTGCATAT   679   96
  CGTTGCATATCCATCGATT   688   97
  GTTGCATATCCATCGATTT   689   98
如上面实施例中引用的，本领域技术人员能够使用表1中提供的靶序列信息，通过参考SEQ ID NO：1中的序列位置和加入或缺失与SEQ IDNO：1互补或者接近互补的核苷酸，设计出具有比表1中提供的序列更短或更长长度的干扰RNA。
例如，SEQ ID NO：2代表了GREM1 mRNA的19个核苷酸的DNA靶序列的例子，其存在于SEQ ID NO：1的核苷酸402到420：
5’-GCATGTGACGGAGCGCAAA-3’    SEQ ID NO：2。
靶定SEQ ID NO：2的对应mRNA序列并且具有21个核苷酸链和2个核苷酸的3’突出端的本发明的siRNA是：
5′-GCAUGUGACGGAGCGCAAANN-3′       SEQ ID NO：3
3′-NNCGUACACUGCCUCGCGUUU-5′       SEQ ID NO：4。
每个“N”残基可以是任何核苷酸(A、C、G、U、T)或者修饰的核苷酸。3’末端可以具有许多“N”残基，包括1、2、3、4、5和6个。在任一链上的“N”残基可以是相同的残基(例如，UU、AA、CC、GG或TT)或它们可以是不同的(例如，AC、AG、AU、CA、CG、CU、GA、GC、GU、UA、UC或UG)。3’突出端可以是相同的或者它们可以是不同的。在一个实施方案中，两条链都具有3’UU突出端。
本发明的靶定SEQ ID NO：2的对应的mRNA序列并且具有21个核苷酸链和3′UU突出端的siRNA的例子是：
5′-GCAUGUGACGGAGCGCAAAUU-3′        SEQ ID NO：5
3′-UUCGUACACUGCCUCGCGUUU-5′        SEQ ID NO：6
干扰RNA也可以具有5’突出端核苷酸或者它可以具有平头末端。本发明的靶定SEQ ID NO：2的对应的mRNA序列并且具有19个核苷酸链和平头末端的siRNA是：
5′-GCAUGUGACGGAGCGCAAA-3′    SEQ ID NO：7
3′-CGUACACUGCCUCGCGUUU-5′    SEQ ID NO：8。
双链干扰RNA(例如，siRNA)的链可连接从而形成发夹或者茎环结构(例如，shRNA)。本发明的靶定SEQ ID NO：2的对应的mRNA序列并且具有19bp双链茎环区和3’UU突出端的shRNA的例子是：
N是核苷酸A、T、C、G、U，或者本领域技术人员已知的修饰形式。环中核苷酸N的数目是3到23、或5到15、或7到13、或4到9、或9到11之间并且包括端点的数字，或者核苷酸的数目是9。环中一些核苷酸可以参与与环中其他核苷酸的碱基对相互作用。可以用于形成环的寡核苷酸序列的实例包括5’-UUCAAGAGA-3’(Brummelkamp，T.R等人(2002)Science 296：550)和5’-UUUGUGUAG-3’(Castanotto，D.等人(2002)RNA 8：1454)。本领域技术人员将认识到所得的单链寡核苷酸形成茎环或者发夹结构，其包含能够与RNAi机器相互作用的双链区。
上面鉴定的siRNA靶序列可以在3’末端延伸以方便切丁酶底物27聚体双链体的设计。例如，在GREM1DNA序列(SEQ ID NO：1)中鉴定的19个核苷酸的DNA靶序列(SEQ ID NO：2)延伸6个核苷酸产生了存在于SEQID NO：1的核苷酸402到426的25个核苷酸的DNA靶序列：
5’-GCATGTGACGGAGCGCAAATACCTG-3’SEQ ID NO：10。
用于靶定SEQ ID NO：10的对应mRNA序列的本发明的切丁酶底物27聚体双链体为：
5′-GCAUGUGACGGAGCGCAAAUACCUG  -3′    SEQ ID NO：11
3′-UUCGUACACUGCCUCGCGUUUAUGGAC  -5′  SEQ ID NO：12
有义链的3’末端的两个核苷酸(即，SEQ ID NO：120的GU核苷酸)可以是用于增强的加工的脱氧核苷酸。如本文提供的切丁酶底物27聚体双链体从19-21个核苷酸靶序列的设计由Integrated DNA Technologies(1DT)网站和Kim，D.-H.等人(February，2005)Nature Biotechnology 23：2；222-226进一步讨论。
由siRNA和其它形式的干扰RNA指导的靶RNA切割反应是高度序列特异性的。例如，通常，siRNA分子含有在序列上与靶mRNA的部分相一致的有义核苷酸链和与靶的部分精确互补的反义核苷酸链用于抑制mRNA表达。然而，只要干扰RNA可识别靶mRNA并沉默GREM1基因的表达，反义siRNA链和靶标mRNA之间或者反义siRNA链和有义siRNA链之间100％序列互补性并不是实施本发明所需的。从而，例如，本发明允许反义链和靶mRNA之间以及反义链和有义链之间的序列变异，包括不影响RNA分子活性的替换、以及可以预期是由于遗传突变、菌株多态性或者进化趋异导致的变异，其中变异不妨碍反义链对靶mRNA的识别。
在本发明的一项实施方案中，本发明的干扰RNA具有有义链和反义链，且有义和反义链包含至少19个氨基酸的至少接近完全连续互补的区域。在本发明的另一实施方案中，本发明的干扰RNA具有有义链和反义链，且反义链包含与GREM1 mRNA的靶序列至少19个核苷酸的至少接近完全连续互补的区域，有义链包含与GREM1 mRNA的靶序列具有至少19个核苷酸的至少接近完全连续同一性的区域。在本发明的进一步的实施方案中，干扰RNA包含分别与mRNA内的对应的靶序列的3’末端的倒数第二位的13、14、15、16、17或18个核苷酸具有一定百分比的序列互补性或者一定百分比的序列同一性的至少13、14、15、16、17或18个连续核苷酸的区域。干扰RNA的每条链的长度包含约19至约49个核苷酸，并可包含约19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个核苷酸长度。
在某些实施方案中，本发明的干扰RNA的反义链具有与靶mRNA至少接近完全连续互补的至少19个核苷酸。如本文所用的，“接近完全”指siRNA的反义链与靶标mRNA的至少部分“基本上互补”并且siRNA的有义链与靶标mRNA的至少部分“基本上同一”。如本领域普通技术人员所知的“同一性”是如通过匹配序列之间核苷酸的顺序和同一性确定的核苷酸序列之间的序列相关性程度。在一个实施方案中，与靶标mRNA序列具有80％和80到100％互补性，例如85％、90％或95％互补性的siRNA的反义链被认为是接近完全互补并且可以用于本发明中。“完全”连续互补性是相邻碱基对的标准沃森-克里克碱基配对。“至少接近完全”连续互补性包括如本文所用的“完全”互补性。设计用于确定同一性或互补性的计算机方法以鉴定核苷酸序列的最大的匹配程度，例如，BLASTN(Altschul，S.F.，等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。
术语“百分比同一性”描述第一个核酸分子中与第二个核酸分子中相同长度的一组连续核苷酸相同的连续核苷酸的百分比。术语“百分比互补性”描述第一个核酸分子中可以与第二个核酸分子中一组连续核苷酸在沃森-克里克意义上碱基配对的连续核苷酸的百分比。靶标mRNA和siRNA的一条链(有义链)之间的关系是同一性关系。将siRNA的有义链也称作过客链(如果存在)。靶标mRNA和siRNA的另一条链(反义链)之间的关系是互补性关系。将siRNA的反义链也称作引导链。
可以存在与SEQ ID NO：1的部分不互补的反义siRNA链的一个或多个区域。非互补区可以在互补区的3’或5’端或两端或者在两个互补区之间。区域可以是一个或多个碱基。
干扰RNA分子中的有义和反义链也可包含不与另一条链形成碱基对的核苷酸。例如，一条或两条链可包含额外的核苷酸或不与另一条链上该位置的核苷酸配对的核苷酸，从而当链杂交时形成凸起或错配。因此，本发明的干扰RNA分子可包含具有错配、G-U摆动、或凸起的有义和反义链。错配、G-U摆动和凸起也可发生于反义链及其靶标之间(见，例如，Saxena等人，2003，J.Biol.Chem.278：44312-9)。
双链干扰RNA的一条或两条链可以具有1到6个核苷酸的3’突出端，所述核苷酸可以是核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸或者其混合物。突出端的核苷酸不是碱基配对的。在本发明的一项实施方案中，干扰RNA包含TT或UU的3’突出端。在本发明的另一实施方案中，干扰RNA包含至少一个平头末端。末端通常具有5’磷酸基团或者3’羟基基团。在其他实施方案中，反义链具有5’磷酸基团，有义链具有5’羟基基团。在其他实施方案中，通过共价加入其他分子或官能团进一步修饰末端。
双链siRNA的有义和反义链可以为如上述的两个单链的双链体形式或者可以是单链分子，其中互补性区域是碱基配对的且当区域间彼此杂交时通过接头分子共价连接形成发夹环。认为发夹通过称作的切丁酶的蛋白质在细胞内切割，形成两个单独的碱基配对的RNA分子的干扰RNA。也可设计接头分子以包含可在体内或体外通过特定的核酸酶进行切割的限制性位点。
在一项实施方案中，本发明提供了包含至少13个连续核苷酸区域的干扰RNA分子，所述区域与对应于DNA靶标的mRNA的3’端倒数第二位的13个核苷酸具有至少90％的序列互补性、或至少90％的序列同一性，所述区域内允许一个核苷酸替换。两个核苷酸替换(即11/13＝85％同一性/互补性)不包括在此术语中。在另一实施方案中，本发明提供了包含至少14个连续核苷酸的区域的干扰RNA分子，该区域与对应于DNA靶标的mRNA的3’端倒数第二位的14个核苷酸具有至少85％的序列互补性、或至少85％的序列同一性。两个核苷酸替换(即12/14＝86％同一性/互补性)包括于此术语中。在另一实施方案中，本发明提供了包含至少15、16、17或18个连续核苷酸的区域的干扰RNA分子，该区域与对应于DNA靶标的mRNA的3’端倒数第二位的14个核苷酸具有至少80％的序列互补性、或至少80％的序列同一性。三个核苷酸替换包括于此术语中。
以5’到3’方向书写的核酸序列中倒数第二位碱基是与最后一个碱基相邻的碱基，即3’碱基相邻的碱基。以5’到3’方向书写的核酸序列的倒数第二位13个碱基是与3’碱基相邻的最后13个碱基的序列并且不包括3’碱基。类似地，以5’到3’方向书写的核酸序列的倒数第二位的14、15、16、17、或18个碱基是分别与3’碱基相邻的最后14、15、16、17、或18个碱基的序列并且不包括3’碱基。
干扰RNA可以通过化学合成、体外转录或用切丁酶或具有相似活性的另一合适的核酸酶切割较长的双链RNA外源地产生。使用常规的DNA/RNA合成仪从受保护的核糖核苷亚磷酰胺产生的化学合成的干扰RNA可以从供应商如Ambion Inc.(Austin，TX)、Invitrogen(Carlsbad，CA)，或Dharmacon(Lafayette，CO)得到。通过例如用溶剂或树脂提取、沉淀、电泳、层析或者其组合纯化干扰RNA。备选地，干扰RNA可以进行很少的纯化(如果使用)以避免由于样品处理导致的损失。
切丁酶当通过化学合成产生干扰RNA时，在一条或两条链的5’末端核苷酸的5’位的磷酸化(当存在时)可以增强siRNA功效和结合的RISC复合体的特异性，但是不是必需的，因为可以在细胞内发生磷酸化。
干扰RNA也可以从质粒或病毒表达载体或者从最小的表达盒内源地表达，所述表达盒为例如，PCR产生的片段，其包含一个或多个启动子和干扰RNA的一个或多个合适的模板。用于shRNA的通过商业途径可获得的基于质粒的表达载体的实例包括pSilencer系列的成员(Ambion，Austin，TX)和pCpG-siRNA(InvivoGen，San Diego，CA)。用于表达干扰RNA的病毒载体可以从多种病毒得到，包括腺病毒、腺伴随病毒、慢病毒(例如，HIV、FIV和EIAV)，和泡疹病毒。用于shRNA表达的通过商业途径可获得的病毒载体的实例包括pSilencer adeno(Ambion，Austin，TX)和pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST(Invitrogen，Carlsbad，CA)。病毒载体的选择、从载体表达干扰RNA的方法和递送病毒载体的方法是本领域技术人员能力之内的。用于产生PCR产生的shRNA表达盒的试剂盒的实例包括Silencer Express(Ambion，Austin，TX)和siXpress(Minis，Madison，WI)。
在某些实施方案中，可以通过从能够表达第一种干扰RNA的第一种表达载体体内表达施用第一种干扰RNA，并且可以通过从能够表达第二种干扰RNA的第二种表达载体体内表达施用第二种干扰RNA，或者可以通过从能够表达两种干扰RNA的单个表达载体体内表达施用两种干扰RNA。其它的干扰RNA可以类似的方式来施用(即，通过单独的表达载体或通过能够表达多种干扰RNA的单一表达载体)。
可以从本领域技术人员已知的多种真核启动子表达干扰RNA，所述启动子包括pol III启动子，如U6或H1启动子，或者pol II启动子，如巨细胞病毒启动子。本领域技术人员将认识到可以改造这些启动子以允许可诱导地表达干扰RNA。
在本发明的一些实施方案中，干扰RNA的反义链作为RISC复合体的部分在体内与mRNA杂交。“杂交”指具有互补或接近互补的碱基序列的单链核酸相互作用形成称作杂交分子的氢键结合的复合体的过程。杂交反应是灵敏的和选择性的。在体外，杂交的特异性(即，严格性)通过例如预杂交或杂交溶液中盐或甲酰胺的浓度，和通过杂交温度控制；此类步骤是本领域公知的。具体地，通过降低盐浓度、增加甲酰胺浓度或者升高杂交温度增加严格性。
例如，可以在约50％甲酰胺、37℃到42℃下发生高严格条件。可以在约35％到25％甲酰胺、30℃到35℃的条件下发生降低的严格性条件。杂交的严格性条件的实例在Sambrook，J.，1989，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y中提供。严格杂交条件的其他实例包括400mM NaCl，40mMPIPES pH 6.4，1mM EDTA，50℃或70℃下12-16小时接着洗涤，或在70℃下1XSSC中或者50℃下1XSSC，50％甲酰胺中杂交，接着在0.3XSSC中70℃下洗涤，或者在4XSSC中70℃下或者4XSSC，50％甲酰胺中50℃下杂交，接着在67℃下1XSSC中洗涤。杂交温度比杂交分子的解链温度(Tm)低5-10℃，其中对于长度为19到49个碱基对的杂交分子，使用下面的计算确定Tm：Tm℃＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是杂交分子中碱基数目，[Na+]是杂交缓冲液中钠离子浓度。
上述体外杂交测定法提供了预测候选siRNA和靶标之间的结合是否将具有特异性的方法。然而，在RISC复合物的背景中，用在体外杂交不表现出高严格性的反义链也可以发生对靶标的特异切割。
干扰RNA可以通过加入、缺失、替代或修饰一个或多个核苷酸而与天然存在的RNA不同。非核苷酸材料可以结合到干扰RNA的5’末端、3’末端或者内部。通常设计此类修饰以增加干扰RNA的核酸酶抗性，提高细胞摄入，增强细胞寻靶，帮助示踪干扰RNA，进一步提高稳定性，或者降低干扰素途径活化的潜力。例如，干扰RNA可以在突出端的末端包含嘌呤核苷酸。通过例如吡咯烷接头将胆固醇缀合到siRNA分子的有义链的3’末端为siRNA提供了稳定性。
其他修饰包括例如3’末端生物素分子、已知具有细胞穿透性质的肽、纳米颗粒、肽模拟物、荧光染料，或者树状聚体。
核苷酸可以在它们的碱基部分、在它们的糖部分、或者在该分子的磷酸部分被修饰并且在本发明的实施方案中发挥功能。修饰包括例如用烷基、烷氧基、氨基、脱氮杂、卤素、羟基、硫羟基或者其组合取代。核苷酸可以用具有更大稳定性的类似物取代，如用脱氧核糖核苷酸取代核糖核苷酸，或者具有糖修饰，如用2’氨基、2’O-甲基、2’甲氧基乙基，或者2’-O，4’-C亚甲基桥取代2’OH基团。核苷酸的嘌呤或嘧啶类似物的实例包括黄嘌呤、次黄嘌呤、氮杂嘌呤、甲基硫代腺嘌呤、7-脱氮杂-腺苷和O-和N-修饰的核苷酸。可以用氮或者硫(硫代磷酸酯)取代磷酸基团的一个或多个氧来修饰核苷酸的磷酸基团。修饰可用于例如增强功能、提高稳定性或通透性，或者指导定位或寻靶。
在某些实施方案中，本发明的干扰分子包括至少一种如上所述的修饰。
在某些实施方案中，本发明提供了包含本发明的干扰RNA分子的药物组合物(此处也称作“组合物”)。药物组合物是包含按重量计高达99％的本发明的干扰RNA或其盐的制剂，所述干扰RNA或其盐与生理学可接受的载体介质相混和，所述载体介质包括下文所述的那些，且例如水、缓冲液、盐水、甘氨酸、透明质酸、甘露醇等等。
本发明的干扰RNA作为溶液剂、混悬剂或乳剂施用。下面是可用于本发明的方法中的药物组合物制剂的实例。
  以重量％表示的量
  干扰RNA   高达99；0.1-99；0.1-50；0.5-10.0
  羟丙基甲基纤维素   0.5
  氯化钠   0.8
  苯扎氯铵   0.01
  EDTA   0.01
  NaOH/HCl   至pH 7.4
  纯化的水(无RNA酶)   至100mL
  以重量％表示的量
  干扰RNA   高达99；0.1-99；0.1-50；0.5-10.0
  磷酸缓冲盐水   1.0
  苯扎氯铵   0.01
  聚山梨酯80   0.5
  纯化的水(无RNA酶)   至100％
  以重量％表示的量
  干扰RNA   高达99；0.1-99；0.1-50；0.5-10.0
  磷酸二氢钠   0.05
  磷酸氢二钠(无水)   0.15
  氯化钠   0.75
  EDTA二钠   0.05
  Cremophor EL   0.1
  苯扎氯铵   0.01
  HCl和/或NaOH   pH 7.3-7.4
  纯化的水(无RNA酶)   至100％
  以重量％表示的量
  干扰RNA   高达99；0.1-99；0.1-50；0.5-10.0
  磷酸缓冲盐水   1.0
  羟丙基-β-环糊精   4.0
  纯化的水(无RNA酶)   至100％
如此处所用的术语“有效量”是指在哺乳动物中产生治疗反应所确定的干扰RNA或包含干扰RNA的药物组合物的量。此类治疗有效量通过本领域技术人员并利用如此处所述的方法是容易确定的。
通常，本发明的有效量的干扰RNA导致靶细胞表面的细胞外浓度为100pM到1000nM，或1nM到400nM，或5nM到约100nM或到约10nM。实现该局部浓度所需的剂量将随着许多因素而变，所述因素包括递送方法、递送位点、递送位点和靶细胞或组织之间细胞层数目，和递送是局部还是全身的，等等。递送位点的浓度可以比靶细胞或组织表面的显著更高。根据临床医生的常规考虑，将局部组合物每天四次或以延长的递送时间表，如每天、每周、每两周、每月或更长时间一次递送到靶器官例如眼睛表面。制剂的pH为约pH 4.0到约pH9.0，或约pH 4.5到约pH 7.4。
制剂的有效量可以取决于如下因素，如受试者的年龄、种族、性别、靶基因转录物/蛋白质更新的速率、干扰RNA效力、和干扰RNA稳定性。在一个实施方案中，将干扰RNA局部递送到靶器官并且以治疗剂量到达含有GREM1 mRNA的组织，如小梁网、视网膜和视神经头，从而改善GREM1相关的疾病过程。
预期用针对GREM1 mRNA的干扰RNA对患者的治疗性治疗比与小分子治疗有益处，干扰RNA治疗性治疗通过增加作用持续时间从而允许较低频率给药和更大的患者依从性，并通过增加靶特异性从而减轻副作用来实现所述益处。
如此处所用的“可接受的载体”是指那些载体，其最多引起、很少引起或不引起眼刺激、如果需要，提供合适的防腐作用，和以均匀剂量递送本发明的一种或多种干扰RNA。用于施用本发明实施方案的干扰RNA的可接受的载体包括基于阳离子脂类的转染试剂
Figure A20078003081700311
-TKO(MirusCorporation，Madison，WI)、Lipofectamine、OLIGOFECTAMINETM(Invitrogen，Carlsbad，CA)或DHARMAFECTTM(Dharmacon，Lafayette，CO)；聚阳离子，如聚乙烯亚胺；阳离子肽，如Tat、聚精氨酸或者Penetratin(Antp肽)；纳米颗粒；或者脂质体。脂质体从标准的形成小泡的脂类和固醇，如胆固醇形成，并且可以包括寻靶分子，如对细胞表面抗原具有结合亲和力的单克隆抗体。此外，脂质体可以是加入聚乙二醇的脂质体。
可以以溶液、悬浮液、或者生物蚀解的或非生物蚀解的递送装置递送干扰RNA。干扰RNA可以单独递送或者作为确定的共价缀合物的组分递送。干扰RNA也可以与阳离子脂类、阳离子肽、或者阳离子聚合物络合；与具有核酸结合性质的蛋白质、融合蛋白或者蛋白质结构域(例如，鱼精蛋白)络合；或者包囊在纳米颗粒或者脂质体中。通过包括合适的寻靶部分如抗体或者抗体片段可以完成组织或细胞特异性递送。
例如，可以通过气雾剂、含服、皮肤、皮内、吸入、肌内、鼻内、眼内、肺内、静脉内、腹膜内、经鼻、眼、口、耳、肠胃外、贴剂、皮下、舌下、局部或者经皮施用递送干扰RNA。
在某些实施方案中，用干扰RNA分子治疗眼病症是通过将干扰RNA分子直接施用于眼来完成的。由于许多原因，对眼局部施用是有利的，包括：剂量可比全身递送更小，且分子在不同于眼睛的组织中沉默基因靶的机会更少。
许多研究已显示在体内成功并有效将干扰RNA递送至眼。例如，Kim等人证实结膜下注射和全身递送靶向VEGF通路基因的siRNA抑制了小鼠眼中的血管发生(Kim等人.，2004，Am.J.Pathol.165：2177-2185)。另外，研究已显示递送至玻璃体腔的siRNA可扩散至整个眼睛，并在注射后达5天都可检测到(Campochiaro，2006，Gene Therapy 13：559-562)。
可以通过眼组织注射，如眼周、结膜、眼球筋膜下(subtenon)、前房内(intracameral)玻璃体内、眼内、视网膜下、结膜下、眼球后、或者小管内注射将干扰RNA直接递送到眼中；或者使用导管或者其他放置装置，如视网膜弹丸剂、眼内插入物、栓剂或者包含多孔的、非多孔的或者凝胶状材料的植入物直接应用于眼；通过局部眼滴剂或者软膏剂；或者通过盲路中的缓释装置或者植入巩膜附近(经巩膜)或巩膜中(巩膜内)或者眼中进行递送。前眼房注射可以通过角膜注射到前房中以允许活性剂到达小梁网。小管内注射可以注射到静脉集合管引流输淋管或者注射到输淋管中。
对于眼递送，干扰RNA可以与眼科可接受的防腐剂、共溶剂、表面活性剂、粘性增强剂、渗透增强剂、缓冲剂、氯化钠或者水组合以形成水性的无菌眼用混悬液或溶液。通过将干扰RNA溶解在生理学上可接受的等渗水性缓冲液中可以制备溶液制剂。此外，溶液可以包括可接受的表面活性剂以帮助溶解干扰RNA。粘性助剂，如羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等可以加入到本发明的组合物中用于提高化合物的保留。
为了制备无菌眼用软膏制剂，将干扰RNA与防腐剂在合适的载体，如矿物油、液体羊毛脂或者白矿脂中组合。根据本领域中已知的方法，通过将干扰RNA悬浮在从例如
Figure A20078003081700331
-940(BF Goodrich，Charlotte，NC)等的组合制备的亲水基质中制备无菌眼用凝胶制剂。
Figure A20078003081700332
(Alcon Laboratories，Inc.，Fort Worth，TX)可以用于例如眼内注射。在干扰RNA在眼中的渗透性较弱的情况下，本发明的其他组合物可以含有渗透增强剂，如cremephor和
Figure A20078003081700333
80(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯，Sigma Aldrich，St.Louis，MO)。
在某些实施方案中，本发明还提供了试剂盒，其包括用于减弱如本文引用的mRNA在细胞中表达的试剂。该试剂盒含有siRNA或shRNA表达载体。对于siRNA和非病毒shRNA表达载体，试剂盒也可以含有转染试剂或者其他合适的递送载体。对于病毒shRNA表达载体，试剂盒可以含有病毒载体和/或病毒载体的产生所必须的组分(例如，包装细胞系以及包含病毒载体模板的载体和用于包装的额外辅助载体)。试剂盒也可以含有阳性和阴性对照siRNA或者shRNA表达载体(例如，非寻靶对照siRNA或者靶定不相关mRNA的siRNA)。试剂盒还可以含有用于评估预期靶基因的击倒的试剂(例如，用于检测靶标mRNA的定量PCR的引物和探针和/或用于蛋白质印迹的抗对应蛋白质的抗体)。备选地，试剂盒可以包含siRNA序列或者shRNA序列和使用说明书和通过体外转录产生siRNA或者构建shRNA表达载体必须的材料。
还提供了药盒形式的药物组合，其在包装的组合中包括载体工具，其适于接受与之密切限制的容器工具，和第一个容器工具，其包括干扰RNA组合物和可接受的载体。如果需要，此类药盒可以还包括多种常规的药物药物组分的一种或多种，如具有一种或多种药学上可接受的载体的容器、额外容器，等等，如本领域技术人员将显而易见。药盒中也可以包括作为插页或标签的印刷的说明书，其指出待施用的组分的量，施用指导，和/或用于混合组分的指导。
本领域技术人员参考本公开将理解可以进行本文公开的实施方案的多种修饰而不背离本发明的精神和范围。参考本公开可以不用过度实验就可以做出和实施本文公开的所有实施方案。本发明的完整范围在本公开和其等同实施方案中给出。不应将本说明书理解为过度地限制本发明的完整保护范围。
尽管已经显示和描述了本发明的特定的实施方案，本领域技术人员将想到许多变型和备选的实施方案。因此，可以以其他特定形式体现本发明而不背离其精神或基本特征。认为所述的实施方案在所有方面仅仅是阐明性而不是限制性的。因此，本发明的范围通过所附权利要求而不是前面的说明书指出。在权利要求的等同权利要求意义和范围内对权利要求进行的所有改变都包括在它们的范围内。此外，将本文提到的所有出版文献、专利和申请都引入作为参考，就好像将它们完整给出一样。
提供下面的实施例、包括所做的实验和获得的结果仅仅为了阐明性目的，并不解释为对本发明的限制。
实施例1
用于特异性沉默GTM-3细胞中Gremlin的干扰RNA
使用标准体外浓度(0.1-10nM)的Gremlin siRNA或siCONTROL无RISC-的siRNA#2和
Figure A20078003081700341
#1转染试剂(Dharmacon，Lafayette，CO)完成GTM-3细胞的转染。将所有siRNA溶解在1XsiRNA缓冲液中，该缓冲液是20mM KCl，6mM HEPES(pH 7.5)，0.2mM MgCl2的水溶液。对照样品包括缓冲液对照，其中将siRNA的体积用等体积的1X siRNA缓冲液(空白)替换。Gremlin siRNA是双链干扰RNA，其对Gremlin mRNA序列内所含的19个核苷酸序列(衍生自SEQ ID NO：1)具有特异性。SiGremlin#1靶向SEQ ID NO：63；siGremlin#2靶向SEQ IDNO：95；siGremlin#3靶向SEQ ID NO：85；siGremlin#4靶向SEQ IDNO：51。利用高容量cDNA反转录试剂盒(High Capacity cDNA ReverseTranscription Kit)、按需测定基因表达试剂盒(Assays-On-Demand GeneExpression kits)、TaqMan通用PCR主混合物(TaqMan Universal PCRMaster Mix)、和ABI PRISM 7700测序仪(ABI PRISM 7700 SequenceDetector)(Applied Biosystems，Foster City，CA)通过qRT-PCR测定Gremlin mRNA水平。相对于PPIB3mRNA水平对Gremlin mRNA表达进行归一化，并相对于非转染细胞中的Gremlin表达(空白)报告其表达。利用抗Gremlin抗体(Orbigen，San Diego，CA)通过蛋白质印迹测定了Gremlin蛋白质的表达。如图1所示，用无RISC阴性对照siRNA转染引起了Gremlin mRNA表达25-50％的增加。因此，相对于非转染细胞中Gremlin表达的归一化可能低估了Gremlin特异性siRNA对GremlinmRNA表达的影响。在所测试的四种siRNA中，siGremlin#2对GremlinmRNA表达具有最大的影响，相对于非转染细胞，在10nM时引起约65％的降低且在1和0.1nM引起≤50％的降低。如图2所示，siGremlin #2显著降低了Gremlin蛋白质表达，与qRT-PCR数据相一致。
应当理解上述公开强调了本发明的特定技术方案，并且所有等同的修饰或备选方案均在如所附的权利要求中给出的本发明的精神和范围内。

Claims (45)

1、治疗需要其的患者中IOP相关状况的方法，其包括对该患者施用干扰RNA分子，该干扰RNA分子通过RNA干扰减弱GREM1 mRNA的表达。
2、权利要求1的方法，其中所述干扰RNA分子是双链的且每条链独立地为约19至约27个核苷酸长度。
3、权利要求2的方法，其中每条链独立地为约19个核苷酸至约25个核苷酸长度。
4、权利要求2的方法，其中每条链独立地为约19个核苷酸至约21个核苷酸长度。
5、权利要求2的方法，其中所述有义链和反义链通过接头连接从而形成shRNA，其可减弱患者中GREM1 mRNA的表达。
6、权利要求2的方法，其中所述干扰RNA分子具有平头末端。
7、权利要求2的方法，其中所述干扰RNA分子的至少一条链包含3’突出端。
8、权利要求7的方法，其中所述3’突出端包含约1至约6个核苷酸。
9、权利要求8的方法，其中所述3’突出端包含2个核苷酸。
10、权利要求1的方法，其中通过气雾剂、含服、皮肤、皮内、吸入、肌内、鼻内、眼内、肺内、静脉内、腹膜内、经鼻、眼、口、耳、肠胃外、贴剂、皮下、舌下、局部或经皮途径施用所述干扰RNA分子。
11、权利要求1的方法，其中通过在体内从能够表达干扰RNA分子的表达载体表达来施用所述干扰RNA分子。
12、权利要求1的方法，其中所述患者具有IOP相关状况或处于发展IOP相关状况的危险中。
13、权利要求12的方法，其中所述IOP相关状况是青光眼。
14、权利要求1的方法，其中所述干扰RNA分子识别对应于SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：13-SEQ ID NO：98中任一个的GREM1 mRNA的部分。
15、权利要求1的方法，其中所述干扰RNA分子识别GREM1 mRNA的部分，其中该部分包含SEQ ID NO：1的核苷酸402、403、404、407、410、425、449、455、485、642、643、686、784、1230、1516、1554、1811、2101、2185、2212、2223、2368、2370、2401、2412、2413、2617、2692、2693、2862、2889、3084、3733、3743、3752、3773、3846、4004、4099、216、235、236、265、267、273、279、280、281、389、391、401、416、426、427、439、440、459、461、471、472、491、497、520、545、546、575、581、587、592、595、596、598、599、624、626、640、646、650、652、657、659、673、676、678、679、688、或689。
16、权利要求1的方法，其中所述干扰RNA分子包含至少一种修饰。
17、权利要求1的组合物，其中干扰RNA分子是shRNA、siRNA或miRNA。
18、权利要求1的方法，其中通过局部、玻璃体内、经巩膜(transcleral)、眼周、结膜、眼球筋膜下(subtenon)、前房内(intracameral)、视网膜下、结膜下、眼球后、或小管内途径所述施用干扰RNA分子。
19、减弱患者眼睛中GREM1 mRNA表达的方法，其包括对患者的眼睛施用干扰RNA分子，该干扰RNA分子通过RNA干扰下调GREM1mRNA的表达。
20、权利要求19的方法，其中所述干扰RNA分子是双链的，且每条链独立地为约19至约27个核苷酸长度。
21、权利要求20的方法，其中每条链独立地为约19个核苷酸至约25个核苷酸长度。
22、权利要求20的方法，其中每条链独立地为约19个核苷酸至约21个核苷酸长度。
23、权利要求20的方法，其中所述有义链和反义链通过接头连接以形成shRNA，其可减弱患者中GREM1 mRNA的表达。
24、权利要求20的方法，其中所述干扰RNA分子具有平头末端。
25、权利要求20的方法，其中所述干扰RNA分子的至少一条链包含3’突出端。
26、权利要求25的方法，其中所述3’突出端包含约1至6个核苷酸。
27、权利要求26的方法，其中所述3’突出端包含2个核苷酸。
28、权利要求19的方法，其中通过气雾剂、含服、皮肤、皮内、吸入、肌内、鼻内、眼内、肺内、静脉内、腹膜内、经鼻、眼、口、耳、肠胃外、贴剂、皮下、舌下、局部或经皮途径施用所述干扰RNA分子。
29、权利要求19的方法，其中通过在体内从能够表达干扰RNA分子的表达载体表达来施用所述干扰RNA分子。
30、权利要求19的方法，其中所述患者具有IOP相关状况或处于发展IOP相关状况的危险中。
31、权利要求30的方法，其中所述IOP相关状况是青光眼。
32、权利要求19的方法，其中所述干扰RNA分子识别对应于SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：13-SEQ ID NO：98中任一个的GREM1 mRNA的部分。
33、权利要求19的方法，其中所述干扰RNA分子识别GREM1 mRNA的部分，其中该部分包含SEQ ID NO：1的核苷酸402、403、404、407、410、425、449、455、485、642、643、686、784、1230、1516、1554、1811、2101、2185、2212、2223、2368、2370、2401、2412、2413、2617、2692、2693、2862、2889、3084、3733、3743、3752、3773、3846、4004、4099、216、235、236、265、267、273、279、280、281、389、391、401、416、426、427、439、440、459、461、471、472、491、497、520、545、546、575、581、587、592、595、596、598、599、624、626、640、646、650、652、657、659、673、676、678、679、688、或689。
34、权利要求19的方法，其中通过局部、玻璃体内、经巩膜、眼周、结膜、眼球筋膜下、前房内、视网膜下、结膜下、眼球后、或小管内途径施用干扰所述干扰RNA分子。
35、权利要求19的方法，其中所述干扰RNA分子包含至少一种修饰。
36、权利要求19的组合物，其中所述干扰RNA分子是shRNA、siRNA或miRNA。
37、具有约19至约49个核苷酸长度的干扰RNA分子，该干扰RNA分子包含：
(a)至少13个连续核苷酸的区域，其与对应于SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：13-SEQ ID NO：98中任一个的mRNA的3’末端的倒数第二位的13个核苷酸有至少90％的序列互补性、或者至少90％的序列同一性；
(b)至少14个连续核苷酸的区域，其与对应于SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：13-SEQ ID NO：98中任一个的mRNA的3’末端的倒数第二位的14个核苷酸有至少85％的序列互补性、或者至少85％的序列同一性；或者
(c)至少15、16、17或18个连续核苷酸的区域，其分别与对应于SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：13-SEQ ID NO：98中任一个的mRNA的3’末端的倒数第二位的15、16、17或18个核苷酸有至少80％序列互补性、或者至少80％序列同一性。
38、权利要求37的干扰RNA分子，其中所述干扰RNA分子识别对应于SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：13-SEQ ID NO：98中任一个的GREM1mRNA的部分。
39、权利要求37的干扰RNA分子，其中所述干扰RNA分子识别GREM1 mRNA的部分，其中该部分包含SEQ ID NO：1的核苷酸402、403、404、407、410、425、449、455、485、642、643、686、784、1230、1516、1554、1811、2101、2185、2212、2223、2368、2370、2401、2412、2413、2617、2692、2693、2862、2889、3084、3733、3743、3752、3773、3846、4004、4099、216、235、236、265、267、273、279、280、281、389、391、401、416、426、427、439、440、459、461、471、472、491、497、520、545、546、575、581、587、592、595、596、598、599、624、626、640、646、650、652、657、659、673、676、678、679、688、或689。
40、权利要求37的组合物，其中所述干扰RNA分子是shRNA、siRNA或miRNA。
41、权利要求37的方法，其中所述干扰RNA分子包含至少一种修饰。
42、权利要求37的方法，其中所述干扰RNA分子是双链的，且其中所述干扰RNA分子的至少一条链包含3’突出端。
43、权利要求42的方法，其中所述3’突出端包含约1至约6个核苷酸。
44、权利要求43的方法，其中所述3’突出端包含2个核苷酸。
45、权利要求37的方法，其中所述干扰RNA分子是双链的，且所述干扰RNA分子具有平头末端。
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