CN104640988A - siRNA及其在用于治疗和/或预防眼部病症的方法和组合物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于治疗和/或预防与香草素-1受体(TRPV)的高水平表达和/或活性相关的眼部病症的方法和组合物。
Description
发明领域
本发明涉及提供siRNA产物及其在利用RAN干扰用于治疗和/或预防与瞬时感受器电位香草素(transient receptor potential vanilloid，TRPV1)的高水平表达和/或活性相关的眼部病症的方法和组合物中的应用。其中，与眼睛疼痛相关的眼部病症，如屈光手术后的角膜不适和改变的敏感性、使用隐形眼镜、干眼综合征和舍格伦综合征(Sjogren's syndrome)，将得到减轻。
发明背景
RNA干扰(RNAi)是大部分真核细胞的天然存在的调节机制，其使用小的双链RNA(dsRNA)分子来指导同源依赖性基因沉默。Fire和Mello在虫子秀丽隐杆线虫(C.elegans)中发现RNA干扰{Fire，1998}于2006年被授予诺贝尔奖。在其第一次记载后不久，RNAi也被表明在哺乳动物细胞中发生，不是通过长的dsRNAs而是提供过21个核苷酸长的双链小干扰RNAs(siRNAs)发生{Elbashir，2001}。
认为RNA干扰过程是用于防止外源基因表达的进化上保守的细胞防御机制，并且通常由多个门和群所共有，其中其称为转录后基因沉默。
由于RNAi机制的发现，研究已经激增，以发现可以选择性改变基因表达的新化合物作为治疗人类疾病的新方法，其通过针对使用包括小分子或蛋白的传统药物方法而是“不能用药的”靶标而进行治疗。
按照目前的常识，当长的双链RNAs被称为切酶(Dicer)的RNA酶III样蛋白加工时，起始RNAi机制。蛋白切酶典型地包含N端RNA解旋酶结构域、结合RNA的所谓的Piwi/Argonaute/Zwille(PAZ)结构域、两个RNA酶III结构域和双链RNA结合结构域(dsRBD){Collins，2005}，并且其活性引起将长的双链RNAs加工成具有2个碱基的3’突出端和5’磷酸和3’羟基的21-24个核苷酸的双链siRNAs。然后，得到的siRNA双链体结合在称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的效应子复合物中，其中，当通过RNA解旋酶活性腺苷-三磷酸(ATP)-依赖性解旋双链siRNA分子{Nykanen，2001}时，该siRNA的反义或引导链引导RISC是被并且分裂目标mRNA序列{Elbashir，2001}。导致mRNA降解的RISC的催化活性由核酸内切酶Argonaute 2(AGO2)调节{Liu，2004；Song，2004}。AGO2属于高度保守的Argonaute蛋白家族。Argonaute蛋白是含有两个共有结构域，即PIWI和PAZ结构域的～100KDa的高碱性蛋白{Cerutti，2000}。PIWI结构域对于与切酶相互作用是极其重要的，并且含有负责mRNAs分解的核酸酶活性{Song，2004}。AGO2利用siRNA双链体的一条链作为向导以发现含有互补序列的信使RNAs，并且分解相对于引导链5′末端的碱基10与11之间的磷酸二酯骨架{Elbashir，2001}。RISC活化过程中的重要步骤是通过AGO2分解有义链或过客链，从复合物中去除该链{Rand，2005}。分析siRNA引导链与PIWI结构域之间的相互作用的结晶学研究揭示仅核苷酸2-8组成引导RISC识别靶标mRNA的“种子序列”，并且在该序列中单个核苷酸的错配可能彻底影响该分子的沉默能力{Ma，2005；Doench2004；Lewis，2003}。一旦mRNA已被分解，并且由于在片段中存在未保护的RNA末端，则所述mRNA被细胞内的核酸酶进一步分解和降解，并且将不再翻译成蛋白{Orban，2005}，而RISC将重新循环至后续的轮数中{Hutvagner，2002}。这组成导致特定的mRNA分子和相应的蛋白的选择性减少的催化过程。可以以通过直接向细胞或组织中递送siRNA效应子而调节任意选择的基因的目的来研究这种天然的基因沉默机制，其中其将激活RISC并且产生所靶向的mRNA的有效的且特异性的沉默。
已经公开了许多描述为获得最大的效力siRNA所应该具有的理想的特征、关于长度、结构、化学组成和序列的研究。Tuschl与合作者在WO02/44321中描述了用于siRNA设计的初始参数，但是自此之后已经公开了多种后续的研究、算法和/或改进。此外，已经投入了相当多的努力来增强siRNA的稳定性，原因在于，考虑到RNA酶在生物流体中的普遍存在的性质，这被认为是基于siRNA的治疗的主要障碍之一。用于稳定性增强所遵循的主要策略之一是使用修改的核苷酸，如2’-O-甲基核苷酸，2’-氨基核苷酸，含有2’-O或4’-C亚甲基键的核苷酸。此外，已经描述了对连接相邻的核苷酸的核糖核苷酸骨架的修饰，即，通过引入硫代磷酸酯修饰的核苷酸进行。似乎增强的稳定性通常与功效成反比(Parish，2000)，并且仅有特定数量的、位置和/或修饰的核苷酸的组合才能导致稳定的沉默化合物。由于这是基于siRNA的治疗的主要障碍，已经公开了不同的研究，其描述了表现出良好的结果的特定的修饰模式，这些的实例包括EP1527176，WO2008/050329，WO2008/104978或WO2009/044392，尽管在参考文献中可以找到更多。
瞬时感受器电位香草素-1(TRPV1)，还称为香草素感受器1(VR-1)，是一种辣椒素-响应性配体门控阳离子通道(capsaicin-responsiveligand-gated cation channel)，其在1997年首先被发现(Caterina，1997)。TRPV1主要表达在二级神经元上，并且作为热、辣椒素、质子和内香草素(endovanilloids)的分子检测剂(Caterina，2001；Montell，2002；Baumann，2000)。但是本申请的发明人还已经发现了TRPV1在来自泪腺和睫状体的组织中的表达。
当TRPV1被激动剂(如辣椒素)和其他因子(如热、酸中毒、脂氧合酶产物或花生四烯酸乙醇酰胺)激活时，钙进入细胞，并且起始疼痛信号。通道的活化诱导神经肽从中枢和外周感觉神经末梢的释放，导致疼痛感知、神经源性的炎症以及有时导致平滑肌收缩和咳嗽。事实上，最近的证据提示TRPV1在疼痛、咳嗽、哮喘和尿失禁中的作用(Jia，2005)。事实上，TRPV1是已知的响应疼痛刺激进行止痛治疗的靶标。并且，设计使用不同的技术减少TRPV1的表达的治疗已经记述在WO2004/042046中，或记述在(Schubert，2005)中，其专注于疼痛治疗。
多形性伤害感受器是在角膜中存在的最丰富的伤害感受器类型。存在药理学证据表明这些感受器纤维表达TRPV1受体，原因在于它们响应辣椒素、热和酸。并且，高剂量的辣椒素使得角膜多形性伤害感受器对热和酸的应答失活，而机械应答性保持不受影响。这表明存在于角膜多形性神经末梢的TRPV1受体被选择性失活。因此，可能的是针对伴随着该组织中的炎症和刺激性过程的角膜损伤和持续的疼痛感受的急性伤害性应答的重要部分是由TRPV1活化调节的。
此外，WO2007/045930记述了TRPV1特异性siRNAs用于治疗与眼疼和干眼综合征相关的眼科病理学的应用。然而，本发明提供了用于减少TRPV1表达并且因此减轻眼部不适的改善的产品。相对于传统化学抑制剂，使用siRNA产品治疗这些病症的优点在于基于siRNA的治疗将具有持续更久的效果。该结果是由于这样的事实导致的：一旦不再存在效应分子，则细胞将必须从最开始合成新的感受器；而传统的治疗将使得细胞膜上的感受器水平不受影响。
由于目前的生活模式，受与改变的眼部敏感性相关的眼科病理学的影响的人数非常高，并且预测随着人口的老龄化而增加。屈光手术和隐形眼镜的使用通常引起改变的角膜敏感性和患者的干眼感受。这被长久注视电脑屏幕的工作时间和使用通常进一步使空气变干燥的空调系统而进一步加剧。此外，眼泪的数量和质量随着年龄下降。伴有干眼综合征的症状包括眼部组织的痒、烧灼感和刺激性。更严重的干眼症形式发生在患有舍格伦综合征的患者中。存在这些感受中的一种或不同的组合称为本文意义中的眼部疼痛。目前，估计干眼综合征影响多于一千万的美国人。
附图描述
图1是在用靶向TRPV1的不同siRNAs转染HeLas细胞后，利用Qrt-PCR显示TRPV1的暂时的表达模式的图表，所述靶向TRPV1的不同siRNAs为：本发明所述的化合物(SEQ ID NO：2)，之前记载的靶向不同区域的化合物(SEQ ID NO：7)和另外四种设计靶向TRPV1的siRNAs(SEQID NO：17-20)以及用作阴性对照的混杂序列。显示相同结果的两种备选的表现方式A和B以确保清楚性。
图2是显示在用本发明的不同siRNAs转染HeLas细胞后，利用Qrt-PCR显示TRPV1的暂时的表达模式的图表，所述本发明的不同siRNAs为：SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：6，以及SEQ ID NO：8至SEQ IDNO：16，和用作阴性对照的混杂序列。
图3显示在用辣椒素(capsaicin)刺激后，与辣椒平(capsazepine，一种接受的用于TRPV1依赖性疼痛的止痛剂)相比，用本发明的化合物(SEQ ID NO：2)治疗的兔的眼睛的测量的眼睑开孔(mm)的时间表。
图4是显示在用辣椒素诱导疼痛后由用本发明的化合物(SEQ ID NO：2)和辣椒平治疗所导致的眼睑开孔关于检测之前的值的比率(％)的图。
图5是显示在暴露于10％血浆中24小时后残留的完好的产物的量(％)的图。
图6是显示眼组织中基于5-磷酸化的完好的反义链的SEQ ID NO：2浓度的图，其意指在细胞质区室中存在并且通过5’-磷酸化活化的SEQ IDNO：2(母体化合物)的完好的非代谢的反义链的量。左侧柱状物：5min；右侧柱状物：30min。
发明详述
在第一方面，本发明涉及提供关于siRNA分子的给药方案，其中所述分子特异性靶向SEQ ID NO：1，并且当引入到细胞中时减少TRPV1基因的表达。
例如，当siRNA分子选择性减少或抑制基因的表达时，该基因被本发明所述的siRNA“靶向”。短语“选择性减少或抑制”用在本文中包括影响一种基因(在这种情形中，是TRPV1)的表达的siRNAs。备选地，当siRNA在严格条件下与基因转录物(即，其mRNA)杂交时，所述siRNA靶向该基因。能够“在严格条件下”杂交意指在趋向于不利于杂交的标准条件下，例如，高温和/或低盐含量，与靶标mRNA区域退火。适当的流程(包括0.1×SSC，68℃2小时)记述在Maniatis，T.等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，Cold Spring HarborLaboratory，1982，第387-389页中。
除非另外指明，本文所引用的核酸序列以5’至3’方向书写。术语“核酸”是指DNA或RNA或其修饰的形式，其包含在DNA中存在的嘌呤或嘧啶碱基(腺嘌呤“A”，胞嘧啶“C”，鸟嘌呤“G”，胸腺嘧啶“T”)或在RNA中存在的嘌呤或嘧啶碱基(腺嘌呤“A”，胞嘧啶“C”，鸟嘌呤“G”，尿嘧啶“U”)。例如，本文提供的干扰RNAs可以在3’端包含“T”碱基，即使“T”碱基在RNA中不是天然存在的。在一些情形中，这些碱基可以作为“dT”出现，以区分在核糖核苷酸链中存在的脱氧核糖核苷酸。
上文定义的靶序列记述为靶DNA序列，用于定义在用于设计siRNAs的目的的数据库中的转录变体，而要用的特定的化合物将是这样定义的RNA序列。
已经鉴定了对应于TRPV1的不同的转录变体。对应于由交替剪接产生的四种TRPV1转录物的GenBank登记号为：NM_080704(NM_080704.3，GI：117306161)，NM_018727(NM_018727.5，GI：117306160)，NM_080706(NM_080706.3，GI：117306163)和NM_080705(NM_080705.3，GI：117306162)。此外，ENSEMBL(MBL-EBI/Wellcome Trust SangerInstitute)公布了另外5种TRPV1转录物：ENST00000174621，ENST00000310522，ENST00000344161，ENST00000399752，ENST00000399756，ENST00000399759，ENST00000425167。
本发明提供关于抑制TRPV1基因表达的siRNAs的给药方案，与现有技术中已经公开的那些相比，这些siRNAs是特别有效的。特别有效意指它们获得更高程度的抑制和/或在时间上更持久的作用。
设计这些siRNAs针对前段中所述的所有TRPV1转录变体所共有的靶序列，并且因此调节在细胞中存在的所有可能的编码TRPV1蛋白的mRNAs的RISC-介导的降解。本发明鉴定的所有优选的靶标区域是SEQID NO：1(5’AAGCGCATCTTCTACTTCA-3’)。它们记述在WO2011/148193中。
因此，本发明各个方面所述的siRNA优选地将包含双链RNA分子，其反义链将包含或由基本上与SEQ ID NO：1互补的RNA序列组成，并且其有义链将包含与所述反义链互补的RNA序列，其中两条链通过核苷酸之间的标准碱基配对而杂交。
在本发明的意思内，与靶标mRNA序列“基本上互补”也可以理解为与所述靶序列“基本上相同”。如本领域普通技术人员已知的，“同一性”是通过匹配序列之间的核苷酸的顺序和相同性所确定的核苷酸序列之间的序列相关性的程度。在一个实施方案中，与靶标mRNA序列具有80％以及80％多至100％互补性，例如，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％互补性的siRNA的反义链被认为是基本上互补的，并且可以用作本发明中。互补性百分数描述在第一核酸分子中可以与第二核酸分子中一组相邻的核苷酸在沃森-克里克意义(Watson-Crick sense)上碱基配对的相邻的核苷酸的百分数。
如从现有技术中已知的，已经提议了多种不同的结构来实现RNA干扰。一般地，这些双链分子在长度上约为19至约25个核苷酸，并且包括平端结构以及具有突出端的那些。已经记载突出端是有利的，并且可以存在于每条链的5’端或3’端，原因在于它们减少被RNA酶的识别并且模拟切酶的天然底物。一些作者推荐在分子的两个3’短包含突出端，而其他人认为一个突出端是足够的。其他人已经描述了使用具有特定的修饰模式的平端结构(EP 1527176，WO 2008/104978，以及许多其他的)。
突出端可以由1-5个核苷酸组成，典型地，突出端由二核苷酸组成。本领域中所用的经典的分子包含19个核苷酸的双链分子，其进一步包含3’二核苷酸突出端，优选地包含脱氧核苷酸，如Tuschl的最初的研究所教导的(WO02/44321)。这些突出端被认为进一步增加对核酸酶(RNA酶)降解的耐受性。后来，Kim等2005记述了21-mer产物(含有二核苷酸突出端)是装载到RISC上所必需的。此外，Bramsen等2009记述了向突出端引入可能的去稳定化修饰以进一步增加沉默效率。
由此，本发明的各个方面的优选实施方案是指包含至少一个突出端的靶向SEQ ID NO：1的siRNA分子。
本发明的各个方面的另一个备选的实施方案提供平端分子。
此外，本发明的优选实施方案涉及包含或由靶向SEQ ID NO：1的19个核苷酸的双链结构组成的siRNA。令人惊讶地，所述19个核苷酸的双链RNAs已被证明比之前描述的具有21个核苷酸和3’突出端的产物更加耐受降解，如可以在图5中所看出的。
本发明的具体的实施方案涉及靶向SEQ ID NO：1的19个核苷酸的双链平端siRNA、在更具体的实施方案中，该化合物被确定为SEQ ID NO：2(5’-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3’)。在更优选的实施方案中，该siRNA的反义链与SEQ ID NO：1至少80％、优选至少90％互补。
此外，与称为本领域背景的部分中所述，关于siRNA分子的重要的问题是由于RNA酶的普遍存在的性质其在生物流体中的不稳定性。由此，为增强化合物稳定性的目的，已经记述了对核苷酸的多种不同的化学修饰的应用。
siRNA分子的另一种固有的问题是其免疫原性，由此已经发现siRNAs诱导先天性免疫系统的非特异性的激活，包括某些细胞因子的上调，例如，I型和/或II型干扰素以及IL-12，IL-6和/或TNF-α的产生。认为这些作用的起源是siRNA对Toll样受体(如TLR7，TLR8和/或TLR3)的活化。
这些作用，即被RNA酶识别和免疫原性，二者都已经被记述为是序列依赖性的。
通过减少对RNA酶的敏感性而增强化合物稳定性的一些化学修饰还能够减少后续应答的免疫识别的诱导。然而，在siRNA中插入化学修饰的核苷酸还可能导致减少的沉默功效，如在前部分中所述，并且因此必须仔细考虑。
由此，在本发明的各个方面的优选的实施方案中，siRNA进一步包含至少一个具有化学修饰的核苷酸。
增强稳定性并且减少免疫原性作用的优选的化学修饰包括2’-O-甲基核苷酸，2’-氟核苷酸2’-氨基核苷酸，2’-脱氧核苷酸，含有2’-O或4’-C亚甲基键的核苷酸。此外，通过引入硫代磷酸酯修饰的核苷酸修饰连接相邻的核苷酸的核糖核苷酸骨架。在本发明的意思内的更优选的化学修饰涉及用脱氧胸苷(脱氧核糖核苷酸)替代尿嘧啶核糖核苷酸。在本发明的另一个优选的实施方案中，所述至少一个化学修饰的核苷酸是在有义链上、在反义链上或在siRNA的两条链上。
因此，在一个实施方案中，所述siRNA选自SEQ ID.NO.3，4，5，6，8，9，10，11，12，13，14，15或16。
上述siRNA分子可以使用本领域已知的方法以其天然结构递送至细胞内部。例如，当研究体外基因沉默时，使用标准转染试剂施用这些化合物。为了获得体内效果，这些化合物可以裸露施用，或者使用递送增强剂，如例如脂质体，与特定的结构部分缀合等进行施用，尽管本领域中已知多种不同的备选方案，并且取决于体内的所需要的靶向位点而不同地使用。
备选地，本发明各个方面的siRNA分子可以由真核启动子在细胞中表达。能够表达siRNA分子的重组载体可以被递送至靶细胞中并且在靶细胞中永久存在。备选地，可以使用提供核酸分子的瞬时表达的载体。需要时，所述载体可以重复施用。一旦被表达，所述siRNA分子与靶标mRNA相互作用，并且产生RNA干扰反应。以这种方式产生的siRNA分子通常称为shRNA(短发夹RNA)，原因在于其有义链和反义链通过小的核苷酸环连接在一起。表达siRNA分子的载体的递送可以是系统性的，诸如通过静脉内或肌内施用，通过施用至来自受试者的外植体的靶细胞然后重新引入到所述受试者中，或者通过允许引入到所需要的靶细胞中任何其他的方式。
本发明的另一方面涉及靶向SEQ ID NO.1的siRNA在制备用于治疗特征在于增加的TRPV1表达和/或活性的眼部病症的方法中的药物中的应用，其中所述siRNA按照本文公开的给药方案施用。所述方法包括抑制患者中的TRPV1的表达。术语抑制用来表示表达或活性的下降或下调。优选地，所述眼部病症是眼部疼痛。在一个实施方案中，所述眼部病症选自包括下述的组：屈光手术后的眼部不适和改变的角膜敏感性，使用隐形眼镜，干眼综合征，舍格伦综合征，和其他的眼部病理学。
预测使用针对TRPV1mRNA的siRNAs的治疗性治疗比小分子局部眼部滴剂有益，其通过增加所观察到的作用的时间的长度，由此允许较不频繁的给药和更大的患者依从性。在诸如干眼综合征和改变的角膜敏感性的情形中，由于它们通常是慢性病症，这是特别重要的。
记住制备所述药物，可以配制本发明各个方面的siRNA。优选地，所述siRNAs的组合物和制剂可以局部施用至目的器官。在甚至更优选的实施方案中，它们可以配制用于局部施用至眼睛，优选地施用至眼睛的角膜表面。例如，应用至角膜表面可以以眼用滴液、凝胶剂、洗液、乳膏或眼部插入物的形式进行。对眼睛的其他施用形式可以包括注射到眼睛中。
本发明各个方面的更优选的实施方案涉及前述段落中所述的特异性靶向SEQ ID NO：1的siRNA，其用作用于治疗以增加的TRPV1的表达和/或活性为特征的眼部病症的药物，其中所述siRNA按照本文公开的给药方案施用。如前文所述，其可以是包含或由靶向SEQ ID NO：1的19个核苷酸双链结构组成的siRNA。该siRNA可以是平端的。优选地，所述siRNA是SEQ ID NO：2。本发明本发明使用的其他siRNA可以选自SEQ ID.NO.3，4，5，6，8，9，10，11，12，13，14，15或16。
在本发明的上下文中，为了“特异性靶向”某种序列，本发明的siRNA优选地包含至少相同的种子序列。因此，本发明所述的特异性靶向SEQ IDNo.1的任意序列优选地在反义链的位置2-8是相同的。
尽管如上文所述，本发明各个方面的siRNAs可以用于沉默眼部之外的组织中的TRPV1表达。由此，所述siRNAs应该被相应地配制。
例如，siRNA分子可以包含递送赋形剂(delivery vehicle)，包括脂质体，用于施用给受试者。载体和稀释剂及其盐可以存在于药用制剂中。核酸分子可以通过本领域技术人员已知的多种方法施用至细胞中，所述方法包括，但不限于，包封在脂质体中，通过离子电渗疗法，或通过结合在其他赋形剂中，如生物可降解的聚合物、水凝胶、环糊精聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)和PLCA微球体、可生物降解的纳米胶囊以及生物粘附性微球体，或通过蛋白质样载体进行。在另一个实施方案中，本发明的核酸分子还可以与聚乙烯亚胺及其衍生物一起配制或与聚乙烯亚胺及其衍生物复合，如聚乙烯亚胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亚胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-triGAL)衍生物。本发明的优选的组合物是水溶液，特别是盐水溶液，如pH范围在约7.0-约74、优选pH为7.2±0.5的磷酸缓冲的盐水(PBS)。
本发明的siRNA分子可以与膜分解剂和/或阳离子脂质或辅助脂质分子复合。
可以用于本发明的递送系统包括，例如，水性和非水性凝胶、乳膏、复合型乳剂、微乳剂、脂质体、油膏、水溶液和非水性溶液、洗液、气溶胶、烃类基质和粉剂，并且可以包含赋形剂(excipients)，如增溶剂、渗透促进剂(例如，脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)、亲水聚合物(例如，聚卡波非和聚乙烯吡咯烷酮)。在一个实施方案中，药用载体是脂质体或经皮增强剂。
本发明的药物制剂以适于施用(例如，系统或局部施用)至细胞或受试者中的形式存在，所述受试者包括，例如，人。适当的形式部分取决于应用或进入途径，例如，口服、经皮或通过注射的途径。其他因素在本领域中是已知的，并且包括这样的考虑，如毒性和防止所述组合物或制剂发挥其效果的形式。
本发明还包括制备的用于存储或施用的组合物，其包含在药用载体或稀释剂中的药物有效量的需要的化合物。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在制药领域中是公知的。例如，可以提供防腐剂、稳定剂、染料和调味剂。这些包括苯甲酸钠、山梨酸和对-羟基苯甲酸的酯。另外，还可以使用抗氧化剂和混悬剂。
药物有效剂量是预防、抑制发生或治疗(在某种程度上减轻症状，优选地减轻所有的症状)疾病状态所需要的剂量。药物有效剂量通常取决于疾病的类型、所用的组合物、施用的途径、治疗的哺乳动物的类型、所考虑的具体的哺乳动物的体格特征、同时使用的药物和医学领域技术人员所认识到的其他因素。
特别地，已知除了剂量之外，施用时间表是通过siRNA分子有效下调的重要决定因素。
本发明人已经研发了用于施用siRNA的有效的剂量时间表，用于治疗以增加的TRPV1表达和/或活性为特征的眼部病症，特别是干眼症和/或眼部疼痛，其避免副作用并且可以安全施用。因此，按照本文所述的给药方案施用siRNA分子引起临床改进，其中所述分子特异性靶向SEQ IDNO：1，并且当引入到细胞中时减少TRPV1基因的表达。
当用在本文中时，“有效的剂量时间表”是指足以治疗或管理与TRPV1的过表达相关的眼部病症的本发明的siRNA的量。为了治疗人的干眼症和/或眼部疼痛，优选地减轻眼部疾病的水平，如由本领域技术人员已知的不同的参数所测量的，例如，使用OSDI(眼睛表面指数)调查表(用于干眼症)和/或用于眼部疼痛的VAS(视觉模拟等级)。与治疗前的水平相比，这些水平中的任何减少都是有利的，而不管本发明的化合物是单独递送的，还是与另一种适当的治疗剂组合递送的。(例如，本发明考虑大于约5％，约10％，约25％，约30％，约35％，约40％，约50％或约60％的治疗前IOP的OSDI和/或VAS的减少)。
治疗有效量还可以指足以延缓或最小化与干眼症和/或眼部疼痛相关的眼部病症的发作的siNA的量。治疗有效量还可以指在与干眼症和/或眼部疼痛相关的眼部病症的治疗或管理中提供治疗益处的治疗剂的量。此外，关于本发明的siNA的治疗有效量意指单独的治疗剂的量，或与其他治疗剂组合的量，所述量在与干眼症和/或眼部疼痛相关的眼部病症的治疗或管理中提供治疗益处。与本发明的siNA的量联系使用，该术语可以包括改善整体治疗、减少或避免不需要的作用或增强另一种治疗剂的功效或与另一种治疗剂协同作用的量。
在诸如干眼症和/或眼部疼痛的眼部病症的治疗或管理中的治疗益处是疼痛和/或不需要的感觉的持续减少。鉴于siRNA将减少TRPV1受体在细胞内的水平，当治疗终止时，在感觉到疼痛感觉之前，细胞必须重新合成新的受体。由此，基于siRNA治疗的疗法将具有更持久的效果。这被认为是治疗功效的显著提高。
使用siRNA的另外的益处是由其在系统循环中的存在所导致的副作用或急性毒性稳定的最小的可能性，而这些通常与不同的基于滴眼液的治疗相关。这是由于这样的事实：当所述化合物进入血流中时，其将迅速地被存在于血液中RNA酶降解。
另一方面，本文所述的制剂可以提供在单剂量的小瓶中的事实意指结合抗微生物防腐剂，其存在于现在的市场上的大部分制剂中，并且其在一些患者中产生某种不耐受性，使得其需要停止治疗。当考虑到如同干眼症和/或眼部疼痛的病症通常是慢性的，并且因此这样进行治疗时，这两个问题是特别重要的。
一种优选的施用途径是局部施用，直接滴到眼睛中，优选地使用滴眼液进行。如上文所述，预计使用针对TRPV1mRNA的siRNAs的治疗性治疗比小分子局部眼用滴剂有益，其增加所观察到的效果的时间持久性，由此允许较不频繁的给药和更大的患者依从性。当将siRNA直接施用至眼睛时，通常每天每只眼睛可以施用约0.01mg至约100mg的量。在一个实施方案中，每天每只眼睛施用的量是约0.1mg至约10mg。在另一个实施方案中，每天每只眼睛施用约0.04mg至80mg，约0.04mg至约20mg，约0.08mg至约10mg，约0.08mg至约1.2mg，约0.3至约0.9mg，或约0.08mg至约0.9mg的siNA。
在一个实施方案中，所述剂量是约0.5mg至约1.5mg。在一个实施方案中，所述剂量是约0.3至0.9mg，优选地约0.6mg至约0.9mg。备选地，优选的剂量是每只眼睛每天约0.6mg或约0.9mg。
上文提及的优选的施用途径中的一种是通过使用滴眼剂进行。在一个实施方案中，这些滴眼剂具有25-50微升的体积，含有给定剂量的化合物，优选为26-40微升。优选地，商业点眼药器可以用于药物的最终呈递，并且产生的体积将是每滴约30-约33微升。在另外优选的实施方案中，滴眼剂以约40μl的体积递送。在另外的实施方案中，本发明的组合物在可接受的溶液(如磷酸缓冲的盐水)中以约7.5至约22.5mg/ml的浓度、或备选地约15mg/ml至约22.5mg/ml的浓度包含siRNA，如SEQ ID NO：2的siRNA。本发明的组合物可以包含在PBS和任选地药用赋形剂(诸如例如苯扎氯铵(benzalkonium chloride))中的上述浓度的siRNA。
以上述剂量的治疗可以给药1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20或更多天。优选地，给药10-15天，最优选地10天。给药可以伴有休息期，例如，在继续治疗前7天的休息期。备选地，鉴于干眼症和/或眼部疼痛通常是慢性病症，剂量可能在长期的时间期内以每天为基础给药，导致长期的给药。因此，给药可以以每天为基础持续多于4周，或者备选地，给药可以不以每天为基础持续多于4周。精确的时间表可以依据所述慢性病症的严重性来确定。
然而，如前文所解释的，还可以使用除了直接给药到眼睛之外的给药途径。用于所述制剂的精确的剂量和给药时间表也将取决于给药途径，但是可以使用上述剂量，并且通常每天每只眼睛可以给药约0.01mg至约100mg的量。技术人员应该理解，要用的精确的剂量和给药时间表也取决于病症的严重性，并且应该按照执业者的判断和每名患者的情形来决定。还理解用于任意具体的受试者的特定的剂量水平取决于多种因素，包括所用的具体的化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、日常饮食、给药时间、给药途径和排泄率、药物组合和治疗中的特定疾病的严重性。
本发明的和所述的制剂或siRNA可以以单位剂量制剂进行给药，所述单位剂量制剂包含常规无毒药用载体、辅药和/或赋形剂。制剂可以以适于口服应用的形式存在，例如，作为片剂、药片、锭剂、水性或油性混悬液、分散的粉剂或颗粒剂、乳液、硬或软胶囊、或糖浆或酏剂。旨在口服使用的组合物可以按照本领域已知的用于制备药物组合物的任何方法进行制备，并且所述组合物可以包含一种或多种所述的增甜剂、调味剂、着色剂或防腐剂，以提供制药学上别致且美味的制剂。片剂包含与适于制备片剂的无毒药用赋形剂混合的活性成分。
例如，这些赋形剂可以是惰性稀释剂；诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；粒化剂和崩解剂，例如，玉米淀粉或海藻酸；结合剂，例如，淀粉、明胶或阿拉伯树胶；和润滑剂，例如硬脂酸镁、抑制素或滑石。片剂可以是无包衣的，或者其可以通过已知的技术进行包衣。在一些情形中，所述包衣可以通过已知的技术制成，以延缓在胃肠道中的崩解和吸收，并且由此提供在较长的时间期间内的持续作用。例如，可以使用时间延迟物质，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
用于口服使用的制剂也可以作为硬明胶胶凝存在，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如，碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或作为软明胶胶凝存在，其中活性成分与水或油介质(例如，花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。
水性混悬液包含与适于制备水性混悬液的赋形剂混合的活性物质。所述赋形剂是混悬剂，例如，羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基-甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂可以是天然存在的磷脂(phosphatide)，例如，卵磷脂，或烯烃氧化物与脂肪酸的缩合产物，例如，聚氧乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物，例如，十七乙烯氧基鲸蜡醇，或环氧乙烷与来源于脂肪酸与己糖醇的偏酯的缩合产物，如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯，或环氧乙烷与来源于脂肪酸与己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如，聚乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。水性混悬液还可以包含一种或多种防腐剂，例如，乙基-或正丙基-对羟基苯甲酸酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂，和一种或多种增甜剂，如蔗糖或糖精。
油性混悬液可以通过将活性成分混悬在植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)中或在矿物油(如液体石蜡)中而配制。油性混悬液可以包含增稠剂，例如，蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可以加入增甜剂和调味剂以提供可食用的口服制剂。这些组合物可以通过加入抗氧化剂如抗坏血酸进行保存。
适于通过加入水来制备水性混悬液的分散的粉剂和颗粒剂提供与分散剂或润湿剂、混悬剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。适当的分散剂或润湿剂或混悬剂例如上文已经提及的那些。也可以存在另外的赋形剂，例如，增甜剂、调味剂和着色剂。
本发明的药物组合物还可以以水包油乳液的形式存在。油相可以是植物油或矿物油或这些的混合物。适当的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如，阿拉伯树胶或黄蓍树胶，天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂，和来源于脂肪酸和己糖醇、酸酐的酯和偏酯，例如，失水山梨糖醇单油酸酯，和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如，聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。乳液还可以包含增甜剂和调味剂。
糖浆和酏剂可以用增甜剂进行配制，所述增甜剂例如甘油、丙二醇、山梨醇、葡萄糖或蔗糖。所述制剂还可以包含缓和剂、防腐剂和调味剂和着色剂。本发明的和所述的药物组合物或siRNA可以以无菌注射用水性或油脂性混悬液的形式存在。
这种混悬液可以按照已知技术使用上文已经提及的那些适当的分散剂或润湿剂和混悬剂来配制。
无菌注射制剂也可以是在无毒肠胃外可用的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或混悬液，例如，作为在1，3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的赋形剂和溶剂是水、Ringer′s溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌不挥发的油常用作溶剂或混悬介质。为了这一目的，可以使用任意温和的不挥发的油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。另外，脂肪酸，如油酸，也用于制备注射剂。
在优选的实施方案中，本发明的组合物配制在溶液中，优选地配制在缓冲的盐水溶液中，如PBS，或在用于局部给药到眼睛的凝胶中，如例如，以滴眼剂的形式。在此类实施方案中，所述制剂可以是阳离子乳液和/或包含生物聚合物，包括，但不限于，聚(丙交酯-共-乙交酯)，卡波普、透明质酸(hialuronic acid)和聚丙烯酸。
本发明的核酸分子还可以以栓剂的形式给药，例如，用于药物的直肠给药。这些组合物可以通过将药物与适当的无刺激性赋形剂混合而制备，所述赋形剂在常温是固体的但是在直肠温度是液体的，并且因此在直肠中熔融以释放药物。此类物质包括可可脂和聚乙二醇。
本发明的核酸分子可以在无菌介质中肠胃外给药。取决于所用的赋形剂和浓度，药物可以混悬或溶解在赋形剂中。有利地，辅药，如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂，可以溶解在赋形剂中。
由此，本发明的进一步优选的实施方案涉及药物组合物，其中所述组合物包含至少靶向SEQ ID NO：1的siRNA，以特定的剂量时间表给药，如在前述段落中所述。
本发明的核酸分子还可以与其他治疗性化合物组合施用给受试者，以增加整体治疗效果。使用多种化合物来治疗适应证可以增加有益的效果同时减少副作用的存在。
本发明的siNA化合物还可以提供在试剂盒中，所述试剂盒包括分配器，所述分配器具有开孔，用于以预定体积的小滴分配特定剂量的所述siNA化合物。在优选的实施方案中，本发明的siNA化合物是靶向SEQ IDNO：1的siRNAs。在另一个实施方案中，在本发明的试剂盒中的分配器提供包含或由SEQ ID NO：2组成的组合物。在另一个实施方案中，所述试剂盒可以包含一次性使用的分配器的集合，例如，在一个月内使用，在该特定的情形中，该情形将包含30个一次性使用的分配器。小滴的体积可以在约50μl至约100μl的范围内。所述分配器可以似乎一次性试样的分配器，并且包含约1mg-约2mg的本发明的siNA化合物，并且任选地还包含一种或多种药用稀释剂，以及任选地一种或多种赋形剂。所述分配器中所包含的组合物可以包含浓度为约7.5mg/ml至约22.5mg/ml的本发明的siNA化合物。备选地，所述分配器可以设计用于一个月以上，并且所含有的体积将相应地增加，以提供等价数量的剂量。本发明的试剂盒还可以包括使用说明，指明将1小滴约0.3mg-约0.9mg的本发明的siRNA化合物的剂量施用至每只眼睛中。使用说明可以进一步指明小滴每天一次、每天两次、每天三次或每天四次施用至每只眼睛，并且对每只眼睛的施用是每天发生的、隔天发生的、一周一次的、一周两次的、一周三次的、隔周发生的或一月一次的。
本文引用的所有公开的文献、书籍、参考手册和摘要的内容通过引用完全结合在本文中，以更充分地描述本发明所属的现有技术状态。
由于在不背离本发明的范围和精神的前提下，可以在上述主题中进行各种变化，因此，旨在将上述描述中包含的或附上的权利要求书中定义的所有主题解释为描述和举例说明本发明。依据上述教导可以进行本发明的修改和改变。
在下述非限制性实施例中将进一步描述本发明。
实施例
体外分析
为了发现沉默TRPV1的用于siRNAs的特别有效的靶序列(其包含基因表达的重要抑制)，测试了六种不同的siRNAs。这些siRNAs描述为SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：17-20。
SEQ ID NO：2是本发明所述的靶向SEQ ID NO：1的siRNA，其具有下述序列：
有义：5’-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3’
反义：5’-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3′
SEQ ID NO：7(5’-UCGCCACGACAUGCUCUUGdTdT-3’)对应于之前在WO 2007/045930中记载的经典siRNA分子(长度为21个核苷酸，包含由脱氧胸苷组成的3’突出端)，其有效靶向TRPV1，并且减少针对辣椒素刺激的眼部反应。SEQ ID NO：17-19对应于按照本领域可用的不同算法(如Reynolds等2004或Ui-Tei等2004及其他所述的那些)设计的针对TRPV1的siRNAs。SEQ ID NO：20是由Ambion供应的且设计针对TRPV1的可商购的siRNA。
SEQ ID NO：17
有义：5’-CGCAUCUUCUACUUCAACU-3’
反义：5’-AGUUGAAGUAGAAGAUGCG-3’
SEQ ID NO：18
有义：5’-GCGCAUCUUCUACUUCAAC-3’
反义：5’-GUUGAAGUAGAAGAUGCGC-3’
SEQ ID NO：19
有义：5’-AAAGCCAUGCUCAACCUGC-3’
反义：5’-GCAGGUUGAGCAUGGCUUU-3’
SEQ ID NO：20
有义：5’-UGAUCGCAGGAGUAUCUUUdTdT-3’
反义：5’-AAAGAUACUCCUGCGAUCAdTdT-3’
使用HeLa(人子宫颈腺癌)细胞培养物作为测试上述siRNA的效果的模型。将HeLa细胞用100nM不同的化合物和组为转染剂的Lipofectamine 2000进行转染。所有的转染按照标准供应商的条件进行。在相同的转染中，使用不同的混杂siRNA作为对照。在24、48和72小时收集细胞沉淀物，以在蛋白水平评估可能的变异，并且通过实时PCR进行处理。为了定量通过实时Qrt-PCR获得的结果，我们使用比较阈值法(Comparative Threshold Method)。
如结果所示(图1)，针对靶序列SEQ ID NO：1的siRNA在TRPV1基因沉默方面比之前描述的针对该基因的不同区域的siRNA产物有效得多。并且，这种效果在时间上持续，在转染后72小时，仍然存在显著的mRNA水平下调。这种效果的持久性是未曾预料到的，并且是序列特异性的。
为了提供进一步改进的产物的目的，按照以下描述，在上述产物中引入不同的化学修饰：
SEQ ID NO：3，
有义：5’-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3’
反义：5’-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3’
SEQ ID NO：4，
有义：5’-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3’
反义：5’-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3’
SEQ ID NO：8，
有义：5’-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3’
反义：5’-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3’
SEQ ID NO：9，
有义：5’-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3’
反义：5’-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3’
SEQ ID NO：10，
有义：5’-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3’
反义：5’-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3’
SEQ ID NO：11，
有义：5’-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3’
反义：5’-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3’
其中下划线表示包含2’-O甲基基团的碱基。
SEQ ID NO：5，
有义：5’-AAGCGCAdTCdTdTCdTACdTdTCA-3’
反义：5’-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3’
SEQ ID NO：6，
有义：5’-AAGCGCAdTCdTdTCdTACdTdTCA-3’
反义：5’-dTGAAGdTAGAAGAdTGCGCdTdT-3’
SEQ ID NO：12，
有义：5’-AAGCGCAdTCUdTCdTACdTdTCA-3’
反义：5’-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3’
SEQ ID NO：13，
有义：5’-AAGCGCAdTCUdTCdTACUdTCA-3’
反义：5’-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3’
SEQ ID NO：14，
有义：5’-AAGCGCAdTCUUCdTACUdTCA-3’
反义：5’-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3’
SEQ ID NO：15，
有义：5’-AAGCGCAdTCUUCUACUdTCA-3’
反义：5’-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3’
SEQ ID NO：16，
有义：5’-AAGCGCAdTCUUCUACUdTCA-3’
反义：5’-UGAAGdTAGAAGAdTGCGCUU-3’
其中一些或所有的尿嘧啶核苷酸已被替换为脱氧胸苷核苷酸。
将这些化合物与SEQ ID NO：2(不具有任何修饰的核苷酸的相同的化合物)一起在免疫原性测定中进行测试。结果表明，所有这些化合物都显著地减少在外周血单核细胞中的免疫应答的诱导。并且，大部分化合物诱导的应答在其最高水平上低如由包含在测定中作为对照的已经通过人类临床试验提高的siRNAs(bevasiranib和Sirna-027)所产生的应答。
由于不同的程度的修饰可能改变siRNAs的基因沉默能力，因此通过转染到HeLa细胞中进一步测试这些化合物的RNA干扰能力，并且按照前述段落中所述的方法测量产生的TRPV1mRNA水平。
如从图2中可以看出的，所有的化合物保留在不同程度上有效减少TRPV1mRNA水平的能力。
来源于上述化合物的另一个出乎意料的有益效果是其对RNA酶降解的增强的耐受性，如从图5中可以看出的。
对于这些实验，化合物以2μM的终浓度悬浮在PBS中的10％人血浆中，并且在37℃温育24小时。然后，使用HPLC-UV分析样品，并且确定残留的完好的产物的量。
如从图5中可以看出的，SEQ ID NO：2的19个核苷酸的双链化合物(无任何化学修饰)对降解的耐受性是之前所述的包含3’突出端的SEQID NO：21：5’-CAAGAUCGCACAGGAGAGCdTdT-3’(还记载在WO2007045930中)的几乎3倍。对于SEQ ID NO：3的化合物，这一作用进一步增强，所述化合物包含前述段落中所述的一些化学修饰的核苷酸。
体内分析
干眼症和眼部疼痛的动物模型通常利用兔，在这一情形中，利用新西兰白兔。为了这一目的，本发明的siRNAs的其他益处是靶序列SEQ ID NO：1是整个不同的动物序列中TRPV1基因的高度保守的区域。事实上，这一序列在人与图之间是相同的，这使得该动物模型特别适于研究所述疾病。
使用本领域专家已知的标准眼部疼痛模型(Gonzalez等.1993)进行下述实验。简言之，使用适当的微量移液管向眼睛中滴注30μl 1％辣椒素溶液(已知的TRPV1激动剂)来诱导疼痛。出于伦理考虑，用辣椒素处理的动物之前接受5mM辣椒平(其是已知的辣椒素拮抗剂)剂量或40μl含有所测试的化合物的溶液。因此，与作为参比处理的辣椒平相比，测量止痛作用。
从第1天至第3天，测试和参比项目每天在右眼慢慢滴注一次，第4天每天在右眼慢慢滴注两次(间隔60分钟)。在第4天，在最后一次慢慢滴注后15分钟，在动物的右眼通过单次慢慢滴注辣椒素1％而诱导角膜疼痛。对侧眼睛在整个研究过程中慢慢滴注PBS并且作为对照。
为了测量对疼痛的反应，测量眼睑开口。认为眼睛响应疼痛而闭合，并且随着疼痛感觉减退，角膜开口将增大至恢复正常水平。在处理之前(基线)、仅在疼痛诱导前、然后在疼痛诱导后1，5，10，15，20，25，30分钟测量眼睑开口。
如从图3和4中可以看出的，测试本发明所述的化合物，特别是SEQID NO：2的化合物，并且观察到诱导比辣椒平更高的止痛效果(由眼睑开口程度所测量的眼睑恢复)。因此，该化合物已被证明是用于眼部不适的有效的治疗性治疗。
此外，进行另一种体内实验，其中将本发明的化合物(SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5)与之前在WO 2007045930中记载的SEQID NO：21一起施用至兔子眼睛。
在这一情形中，兔子(每个治疗组6只动物)在连续3天内每天接受化合物给药。在第三天，在最后一次慢慢滴注后两小时，处死动物。从这些动物回收眼组织，并且使用RT-PCR分析TRPV1特异性mRNA的存在。下表(表1)显示在给定的组织中获得的TRPV1基因沉默水平，其表示为用参比化合物SEQ ID NO：21获得的抑制％的比率。
表1
| SEQ ID NO：2 | SEQ ID NO：4 | SEQ ID NO：5 | |
| 泪腺 | 3.06 | 3.15 | 1.92 |
| 睫状体 | 6.54 | 2.48 | 3.57 |
如从这些结果清楚可见，当沉默眼组织中的TRPV1基因表达时，本发明的化合物比之前记载的化合物有效得多。
本发明的化合物的高功效连通长久持续的作用应该提供有利的给药方案，原因在于允许各剂量之间的更长的时间将显著改善患者的生活质量。
进行另一个实验来评估在眼部给药在PBS中的SEQ ID NO：2后在新西兰白兔中的组织分布和血浆暴露。所用的材料和方法如下表(表2)所述。
表2.评估在眼部给药在PBS中的SEQ ID NO：2后在新西兰白兔中的
组织分布和血浆暴露的材料和方法
使用SEQ ID NO：2的钠盐的分子量进行所有的计算。SEQ ID NO：2浓度的计算以三种不同的方式进行：
1.基于SEQ ID NO：2(母体化合物)的完好的未代谢的反义链的峰值面积。该数值是在组织中未改变的母体化合物的量的标记。
2.基于SEQ ID NO：2的完好的5’-磷酸化的反义链的峰值面积。该数值是在细胞质区室中存在的并且通过5’-磷酸化活化的母体化合物的量的标记。
3.基于整个峰值面积。该数值总结了在样品中存在的所有完好和代谢的SEQ ID NO：2。
在给药后5和30分钟采集肝、肾皮质和肾髓质、肺、睫状体、视网膜、虹膜、泪腺、角膜、房水和玻璃液、神经节、血浆和尿液。在对兔(n＝6)一次眼部给药SEQ ID NO：2后，结果表示：
·在向眼睛以低于1ng/g的浓度给药后5和30分钟，在血浆和系统组织样品中检测到SEQ ID NO：2的系统暴露(见表3)。
表3.在向兔眼部给药后SEQ ID NO：2母体化合物的平均浓度。
·在给药后5分钟，可以在所有眼组织和流体中检测到SEQ ID NO：2，并且在给药后30分钟浓度强烈减少(见表4)。
表4.在向兔眼部给药后SEQ ID NO：2母体化合物的平均浓度。
·在视网膜、虹膜、睫状体和泪腺中，在给药后5和30分钟检测到5’-磷酸化的反义-(as)链，表明siRNA在这些组织中的细胞质递送(在靶细胞区室中活化的siRNA)(见图6)。
这些数据反映了在眼部给药SEQ ID NO：2后，动物显现分布在所有眼组织中的活化的SEQ ID NO：2，其可以在给药后5分钟检测到。
在人中的分析
最开始在30名健康的成年人中评估SEQ ID NO：2的化合物的眼部耐受性。
研究分成两个时间期。在第一时间期间，使用单剂量的研究产物进行初始安全性评价，然后用多剂量给药进行第二时间期。
第一时间期，单剂量：对照的，没有干预，并且接受给药的眼睛随机化。由于事实是测试项目仅给药到一只眼睛，而另一只研究没有接受干预，因此，每名志愿者自身是对照，然而进行安全性评价测试。进行安全性评价的眼科医师对药物给药不知情。确定血流对产物的吸收。
第二时间期，多次剂量：开放的、平行的和对照的。接受治疗的眼睛是随机的。评价者对研究产物的给药部位是不知情的。药物给药之前的眼睛与另一只研究都被认为是对照。在这一阶段过程中，除了吸收之外，评价局部和系统安全性，并且适当地，评价研究产物的药物代谢动力学。
一旦已经评价了第一阶段的安全性和药物代谢动力学，就开始第二阶段。第一阶段的结果确定在第二阶段过程中继续药物代谢动力学评价的必要性。
将30个成年人分成不同的治疗组，并且一只眼睛接受单次26.6μl含有600μg剂量的化合物的滴眼剂(第一时间期)，或在一周内每只眼睛接受分别以26.6μl或40μl的体积给药的600或900μg化合物的每日剂量(第二时间期)。第一时间期具有6名志愿者，第二时间期具有24名志愿者，分成两个团体，对每组的一半给药不同的剂量水平。第一时间期包括单剂量，第二时间期总共包括7次剂量(每天给药一次)。
局部耐受性评估是基于在第二时间期最后一次剂量给药后24小时和第一时间期的单剂量缓慢滴注后72小时进行的研究过程中在眼睛表面上检测到的变化(局部不利作用)的频率。良好的耐受性定义为在CTCAEv3标准(关于不利事件的常用术语标准)上不存在3级毒性或更高的毒性。
利用卡方检验来确定局部不利作用与药物疗法之间的关系，考虑与治疗相关的症状或局部迹象是否已在每只眼睛中出现(不管症状的数量)。如果至少一种已经发生，则分析认为在每只眼睛中存在不利作用(见表5)。
表5.分析与药物给药相关的对眼睛的局部不利作用
关于局部变化(局部不利作用)的发展，在治疗的眼睛与未治疗的眼睛之间没有观察到差别，获得1.002的皮尔森卡方(p＝0.317)。
在试验的任意时间期内都没有观察到药物相关的眼睛表面变化；因此，单作为单剂量滴眼剂或作为持续多至七天的多剂量滴眼剂给药时，局部耐受性是极好的。
该试验的另一个目的是评估对化合物的系统耐受性，其通过监测分析治疗后参数、体检、生命体征和心电图的反弹(repercussions)来评估。
在选择过程中，在给药药物之前，以及在最后的检查时，在最后一次给药SEQ ID NO：2后的日子里，进行血液和尿液分析。研究由选择期间与最后的检查之间的分析参数的变化组成，对于相关的数据使用斯氏t检验。下表显示所述参数之间的差异的标准偏差和统计学显著性(见表6)。
表6：选择检查与最后的检查之间的分析参数的变化。
n.s.s.：无统计学显著性。*Wilcoxon检验。
在选择检查与最后的检查之间的一些参数中观察到差别，然而，所有的值都被认为是正常的，没有临床显著性。
如上文所示，在研究过程中，在选择过程中，在治疗期间的不同时间，以及在最后的检查中，采集生命体征(血压和心率)(见表7和8)。
关于对参与第一时间期的六名志愿者用重复的ANOVA测量进行的测量次数和统计学分析的研究的平均值显示如下(见表7)。
表7：在试验的第一时间期的生命体征。n＝6.
n.s.s.：无统计学显著性
在第一天进行的检查和在第七天进行的检查中，在给药第一剂量和最后剂量的研究的医药产品之前和之后一小时采集第二时间期的生命体征。还在选择检查过程中和最后的检查时采集生命体征。将选择值作为基线，在第二时间期内，使用重复ANOVA测量，关于研究过程，对24名志愿者评价生命体征(见表8)。
表8：在试验的第二时间期内的生命体征。n＝24.
n.ss.：无统计学显著性
在选择检查时进行心电图检查，在最后的检查时再进行一次心电图检查。在选择和最后的检查之间进行比较，对于相关的样品使用斯氏t检验比较。下表总结了分析的每个参数和结果的平均值和标准偏差(见表9)。
表9：心电图检查：选择与最后的检查之间的比较
n.s.s.：无统计学显著性。*Wilcoxon检验
在表7和8的一些血压测量中和在表9的一些心率测量中观察到统计学显著变化，但是所有的值都在正常界限内，并且因此，这些差异不是临床显著性的。
系统耐受性良好，在血液和尿液分析中、在心电图检查或在最后评估过程中进行的检查中没有变化。
进行血液分析来确定在给药药物后获得的血浆样品中的SEQ ID NO：2浓度。在第一时间期期间，在给药后4小时进行取样，在产物给药后5、15、30分钟和4小时抽取血液。在第二时间期期间，在第1天给药后5分钟采集血液样品，并且在第7天在化合物给药之前和在产物给药后5分钟都采集。
对于每个时间期不能确定药物代谢动力学曲线，原因在于使用验证的生物分析法(LLOQ：10ng/mL)在任意选择的血液样品中不能检测到所述化合物。在血液中不存在可检测量的化合物与预测的RNA在进入血流后由于RNA酶的存在而快速降解一致。
所有这些事实支持这样的推论：SEQ ID NO：2在健康人中以眼用溶液剂表现出良好的耐受性。
给出在动物模型中获得的阳性结果和在健康人中不存在毒性，然后，在患有眼部疼痛和干眼症的患者中测试所述化合物。
受试者
征集六十名诊断患有轻度至中度眼部疼痛和干眼症合征的成年患者。这些患者中，一半的年龄超过65岁。利用由Allergan Inc.研发的(眼表面疾病指标)调查表和VAS(视觉模拟等级)评估确定眼部疾病的水平。纳入的标准是对于干眼症的评分为13-30，对于疼痛，VAS评分为2-7。在准许进入研究之前进行综合体检和眼睛检查，以确保受试者适合参与该研究。
研究设计
设计平行的、安慰剂对照的、双隐蔽的(double-masked)临床研究，以评价在10天的治疗过程中作为滴眼剂给药的SEQ ID NO：2的化合物的止痛效果和耐受性。
第二目的是在每次给药后评估局部耐受性，系统耐受性(对实验室参数、身体检查和生命体征的作用)和视敏度变化(如果存在)，眼内压，席尔梅试验(Schirmer's test)和泪膜破裂时间，这些可能与研究的产物相关。
在所有情形中，药物或安慰剂慢慢滴注到两只眼睛中。以不知情方式监测两只眼睛。
基线时间期
多至在第一次给药研究产物前的15天，招募受试者确定其参与临床试验的治疗期的资格。
治疗期
在第一天，受试者以2：1的比率随机分为作为滴眼剂局部给药到眼睛的化合物或安慰剂。受试者每只眼睛接受最后体积的40μl的化合物或赋形剂(安慰剂)。给药的剂量是每只眼睛900μg化合物。
受试者每天(包括法定假日和周末)回到地点进行研究产物给药和评估。受试者在两只眼睛中每天一次接受1剂量的化合物，持续10天。
在第十天，患者再接受与在基线进行的检查等价的彻底检查。
随访
在第一次给药后14-20天(在最后一次给药后4-10天)进行的随访时进行最后的评估，以确定治疗期结束后患者的发展。
为了确定SEQ ID NO：2对患者干眼症水平和眼部疼痛的作用，在开始治疗前记录每个单个的和VAS评分，并且与第十天的评分相比较。具体地，在由调查表产生的中值评分中的变化和在VAS评价的中值强度中的变化测量结果。
此外，比较来自在起始治疗前和10天后进行的眼部研究的结果，以证实耐受性。
结果
调查表以0-100的等级评估，较高的评分表示更大的伤残。指标表明区分正常受试者和患有干眼病患者的灵敏性和特异性。由十二个问题组成，并且设计为提供对于干眼病一致的症状的快速表征。是用于测量干眼病的严重性(正常、轻度至中度以及严重的)的有效且可靠的工具，并且已被食品和药物管理局接受用于临床试验。已经评估了的有效性和可靠性，并且已经发现其提供关于干眼症的良好至极佳的可靠性、有效性、灵敏性和特异性。估测的综合评分定义眼睛表面是正常的(0-12点)或具有轻度(13-22点)、中度(23-32点)或重度(33-100点)的疾病。
表10：关于干眼症的n＝23。V0对应于开始治
疗前那一天的VD10对应于第十天的
结果和％表明对患者干眼症水平的中值评分的变化。
| N° | V0 | VD10 | 结果 | ％ |
| 1 | 20，45 | 6，82 | 从轻度到正常 | -66，65 |
| 2 | 27，08 | 20，83 | 从中度到轻度 | -23，08 |
| 3 | 38，64 | 50 | 从较不严重到更严重 | 29，40 |
| 4 | 40，91 | 11，36 | 从严重到正常 | -72，23 |
| 5 | 37，5 | 33，33 | 从更严重到较不严重 | -11，12 |
| 6 | 52，08 | 10，42 | 从严重到正常 | -79，99 |
| 7 | 34，09 | 9，09 | 从严重到正常 | -73，34 |
| 8 | 60 | 17，5 | 从严重到轻度 | -70，83 |
| 9 | 43，18 | 25 | 从严重到中度 | -42，10 |
| 10 | 50 | 56，81 | 从较不严重到更严重 | 13，62 |
| 11 | 32，5 | 10，4 | 从中度到正常 | -68，00 |
| 12 | 39，58 | 29，16 | 从严重到中度 | -26，33 |
| 13 | 43，75 | 36，36 | 从更严重到较不严重 | -16，89 |
| 14 | 43，75 | 59，09 | 从较不严重到更严重 | 35，06 |
| 15 | 43，18 | 52，7 | 从较不严重到更严重 | 22，05 |
| 16 | 45，45 | 43，18 | 从更严重到较不严重 | -4，99 |
| 17 | 25 | 15，9 | 从中度到轻度 | -36，40 |
| 18 | 63，63 | 45，45 | 从更严重到较不严重 | -28，57 |
| 19 | 43，75 | 45，83 | 从较不严重到更严重 | 4，75 |
| 20 | 52，7 | 47，72 | 从更严重到较不严重 | -9，45 |
| 21 | 50 | 55 | 从较不严重到更严重 | 10，00 |
| 22 | 29，16 | 10，4 | 从中度到正常 | -64，33 |
| 23 | 54，16 | 45，45 | 从更严重到较不严重 | -16，08 |
疼痛调查表VAS是疼痛强度的一维测量，其已经广泛用于各种成年人群。VAS测量在连续数值范围内并且不能容易地直接测量的疼痛，如眼部疼痛。对于VAS中的疼痛强度，级别更常被定为“没有疼痛”(评分为0)和“最严重的可想象的疼痛”(评分为10)。
表11：关于眼部疼痛的VAS。n＝23。V0对应于开
始治疗前那一天的VAS，VD10对应于第十天的
VAS。％表示对患者右眼和左眼眼部疼痛水平的中值评分的变化。
结论
考虑到临床试验的化合物：安慰剂的比率为2：1，并且这一比率独立于所分析的患者人数而保持不变，可以推论出，当局部给药到眼睛时，每天给药给患者的SEQ ID NO：2的作用能够减轻干眼病的严重性，并且减轻眼部疼痛。
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Claims (11)
1.靶向SEQ ID NO：1的siRNA在制备用于治疗干眼症和/或眼部疼痛的药物中的应用，其中所述siRNA以约0.1至约10mg/天的剂量施用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述siRNA以约0.5至约1.5mg/天的剂量施用。
3.根据权利要求1所述的应用，其中所述siRNA以约0.6mg至约0.9mg/天的剂量施用。
4.根据前述权利要求所述的应用，其中所述siRNA施用5-15天。
5.根据前述权利要求所述的应用，其中所述siRNA施用10天。
6.根据前述权利要求所述的应用，其中所述siRNA长期施用。
7.根据前述权利要求所述的应用，其中所述siRNA是SEQ ID NO：2定义的化合物。
8.根据前述权利要求所述的应用，其中所述siRNA局部施用到眼睛。
9.靶向SEQ ID NO：1的siRNA，其用于治疗干眼症和/或眼部疼痛，其中所述siRNA以约0.1至约10mg/天的剂量施用。
10.治疗干眼症和/或眼部疼痛的方法，其中以约0.1至约10mg/天的剂量施用靶向SEQ ID NO：1的siRNA。
11.用于施用靶向SEQ ID NO：1的siRNA的医药试剂盒，其包括靶向SEQ ID NO：1的siRNA的供应品，其中所述剂量包含约0.1至约10mg用于每日施用，并且包括印刷的使用说明书，用于根据权利要求1-7施用靶向SEQ ID NO：1的siRNA。
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