KR102136539B1 - 눈 증상의 치료 및/또는 예방을 위한 방법 및 조성물에서 sirna 및 이들의 용도 - Google Patents
눈 증상의 치료 및/또는 예방을 위한 방법 및 조성물에서 sirna 및 이들의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은, 바닐로이드-Ⅰ 수용체(TRPV)의 발현 및/또는 활성도의 높은 레벨과 연관된 눈 증상의 치료 및/또는 예방을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명의 분야
본 발명은, RNA 간섭을 이용한 일시적인 수용체 잠재적인 바닐로이드(transient receptor potential vanilloid, TRPV1)의 발현 및 또는 활성도의 높은 레벨과 연관된 눈 증상(eye conditions)의 치료 및/또는 예방을 위한 방법 및 조성물에서 siRNA 생산물 및 이들의 용도의 제공에 관한 것이다. 다른 것들 중에서, 굴절 수술(refractive surgery) 후의 각막의 가벼운 통증 및 변경된 민감도, 콘택트 렌즈의 사용, 안구건조증, 및 쇼그렌 증후군과 같은 안구의 통증과 연관된 눈 증상은, 완화될 것이다.
본 발명의 배경기술
RNA 간섭(RNAi)은, 상동성-의존 유전자 사일런싱(direct homology-dependent gene silencing)을 유도하도록 작은 이중 가닥 RNA(dsRNA) 분자를 사용하는 대부분의 진핵 세포의 자연적으로 발생하는 조절 매커니즘(naturally occurring regulatory mechanism)이다. Fire and Mello in the worm C. elegans {Fire, 1998}에 의한 이러한 발견은, 2006년에 노벨상을 받았다. 이의 첫 번째 기재 후 얼마 안 되어, RNAi는, 긴 dsRNAs를 통하지 않지만, 이중-가닥 짧은 간섭 RNAs(siRNAs) 21 뉴클레오티드 길이에 의하여, 포유동물 세포에서 발생됨을 또한 보여주었다[Shortly after its first description, RNAi was also shown to occur in mammalian cells, not through long dsRNAs but by means of double-stranded small interfering RNAs (siRNAs) 21 nucleotides long]{Elbashir, 2001}.
RNA 간섭(RNA interference)의 과정은, 이질적인 유전자의 발현을 방지하기 위해 사용된 진화론적으로-보전된 세포의 방어 매커니즘인 것으로 생각되고, 다양한 종족(diverse phyla) 및 식물군에게 보통 공유되고, 이는 전사후 유전자 사일런싱(post-transcriptional gene silencing)으로 불렸다. RNAi 매커니즘의 발견 후에, 작은 분자 또는 단백질을 포함하는 통상적인 약제학적 접근을 갖는 다른 방식의 "의약품이 되지 않을 만한" 것인 타겟을 다룸으로써, 인간 질병을 치료하기 위한 새로운 방식으로서, 유전자 발현을 선택적으로 변경할 수 있는 새로운 화합물을 알아내기 위한 연구의 증가를 가져왔다(Since the discovery of RNAi mechanism there has been an explosion of research to uncover new compounds that can selectively alter gene expression as a new way to treat human disease by addressing targets that are otherwise "undruggable" with traditional pharmaceutical approaches involving small molecules or proteins).
현재의 지식에 따라, RNAi의 매커니즘은, 이중 가닥 RNAs가 다이서(Dicer)로서 알려진 RNase Ⅲ-유사 단백질에 의해 처리된 경우에 개시된다. 상기 단백질 다이서는, N-말단 RNA 헬리카제 도메인, RNA-결합, 소위 Piwi/Argonaute/Zwilie (PAZ) 도메인, 두 개의 RNase Ⅲ 도메인 및 이중-가닥된 RNA 결합 도메인(dsRBD)을 일반적으로 함유하고{Collins, 2005}, 이의 활성은, 긴 이중 가닥 RNAs를 2 베이스 3' 오버행 및 5' 포스페이트 및 3' 히드록실기를 갖는 21 내지 24 개의 뉴클레오티드 이중 가닥 siRNAs 으로의 프로세싱을 유도한다(its activity leads to the processing of the long double stranded RNAs into 21-24 nucleotide double stranded siRNAs with 2 base 3' overhangs and a 5' phosphate and 3' hydroxyl group). 상기 결과적으로 생성된 siRNA 듀플렉스(duplexes)는, 그리고 난 다음에 RNA-유도된 사일런싱 복합체(RNA-induced silencing complex, RISC)로서 알려진 이펙터 복합체(effector complex) 내로 포함되고, 여기서 상기 siRNA의 가이드 가닥(guide strand) 또는 안티센스는, RNA 헬리카제 활성을 통해 이중-가닥 siRNA 분자의 아데노신-트리포스페이트(ATP)-의존적인 풀림(adenosine-triphosphate (ATP)-dependent unwinding) 상{Nykanen, 2001}의 타겟 mRNA 서열을 인식하고 분열하기 위해, RISC를 유도한다{Elbashir, 2001}. mRNA 분열을 유도하는, RISC의 촉매 활성은, 엔도뉴클레아제 아고너트 2(Argonaute 2, AG02)에 의해 매개된다{Liu, 2004; Song, 2004}. AG02는 단백질의 매우 보존된 아고너트 패밀리에 속한다. 아고너트 단백질은, 두 개의 공통의 도메인, 즉 PIWI 및 PAZ 도메인을 함유하는 ~100 KDa의 매우 기본적인 단백질이다{Cerutti, 2000}. 상기 PIWI 도메인은 다이서와 상호작용에 중요하고, mRNAs의 분열에 책임이 있는 뉴클레아제 활성도를 함유한다{Song, 2004}. AG02는 상보적인 서열을 함유하는 메신저 RNAs를 발견하기 위한 가이드로서 상기 siRNA 듀플렉스의 하나의 가닥을 사용하고, 상기 가이드 가닥의 5' 말단에 대한 베이스(bases) 10과 11 사이의 포스포디에스테르 백본(phosphodiester backbone)을 분열한다{Elbashir, 2001}. RISC의 활성화 동안에 중요한 단계는, 상기 컴플렉스로부터 이러한 가닥을 제거하는, AG02에 의한 패신저 가닥(passenger strand) 또는 센스의 분열이다{Rand, 2005}. 상기 siRNA 가이드 가닥과 상기 PIWI 도메인 사이의 상호작용을 분석하는 결정학 연구는, RISC에 의해 타겟 mRNA 인식을 지시하는 "시드 서열(seed sequence)"을 구성하는 오직 뉴클레오티드 2 내지 8이고, 이러한 서열에서 단일 뉴클레오티드의 미스매치(mismatch)가 상기 분자의 사일런싱 능력에 급격하게 영향을 미칠 수도 있음을 나타낸다{Ma, 2005; Doench 2004; Lewis, 2003}. 상기 mRNA가 분열된 때, 및 상기 단편에서 보호되지 않은 RNA 말단의 존재로 인하여, 상기 mRNA는 세포 내의 뉴클레아제에 의해 추가적으로 분열되고 분해되고, RISC가 그 다음 라운드(subsequent rounds) 동안 재사용하지 않으면서{Hutvagner, 2002}, 단백질로 더 이상 번역되지 않을 것이다{Orban, 2005}. 이는 특정한 mRNA 분자 및 이에 대응하는 단백질의 선택적인 감소를 유도하는 촉매 공정을 구성한다. 상기 세포 또는 조직으로 siRNA 이펙터를 직접적으로 전달함으로써 어떠한 유전자(들)의 선택을 조절하는 목적을 갖는 유전자 사일런싱을 위해 이러한 본래의 매커니즘을 이용하는 것을 가능하게 하고, 여기서 이들은 RISC를 활성화시키고, 상기 타겟된 mRNA의 강하고 특정한 사일런싱을 생산할 것이다.
많은 연구는 상기 이상적인 특징, siRNA가 길이, 구조, 화학적 조성, 및 서열에 관하여, 최대의 유효성을 달성해야함을 기재하여 게재되어 있다. siRNA 디자인을 위한 초기의 파라미터는, 많은 그 다음의 연구, 알고리즘 및/또는 개선이 그 후에 발행되었을지라도, Tuschl 및 그의 동료에 의해 시작되었다. 또한, 상당한 노력은 siRNA 안정성을 증진시키는 것에 들어가고, 이는 생물학적 유체에서 RNAses의 흔한 성질이 제공된, siRNA를 기초로 치료를 위한 주요한 장애물 중의 하나로서, 인지되기 때문이다. 안정성 상승을 위한 그 다음의 주요한 전략 중의 하나는, 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 2'-아미노 뉴클레오티드, 2'-O 또는 4'-C 메틸렌 브리지를 함유하는 뉴클레오티드와 같은 변형된 뉴클레오티드의 사용이다. 또한, 인접한 뉴클레오티드를 연결하는 상기 리보뉴클레오티드 백본의 변형은, 주로 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오티드의 도입에 의해, 기재되어 있다. 증진된 안정성이 효능에 대해 역으로 비례하고(Parish, 2000), 변형된 뉴클레오티드의 특정한 수, 위치 및/또는 조합만이 안정된 사일런싱 화합물을 초래함을 나타낸다. 이러한 것이 siRNA-기초된 처리 내의 중요한 장애물이기 때문에, 좋은 결과를 나타내는 특정한 변형 패턴을 기재한 상이한 연구가 발행되었고, 많은 그 이상이 문헌에서 발견될 수도 있을지라도, 이러한 것들의 예는 EP1527176, W02008/050329, W02008/104978 또는 W02009/044392를 포함한다.
바닐로이드 수용체 1(VR-1)로 또한 불리는, 일시적인 수용체 잠재적인 바닐로이드-1(TRPV1)는 1997년에 처음 발견되었고, 캅사이신-반응성 리간드-게이트 양이온 채널이다(Caterina, 1997). TRPV1은 감각 뉴런 상에 주로 발현되고, 열, 캡사이신, 단백질, 및 엔도바닐로이드(endovanilloids)에 대한 분자 검출기로서의 역할을 한다(Caterina, 2001; Montell, 2002; Baumann, 2000). 그러나, 본 출원의 발명자가 또한 발견되었을지라도, TRPV1 발현은 또한, 눈물샘 및 모양체로부터의 조직에서의 TRPV1 발현이 발견되었다.
TRPV1이 캡사이신과 같은 작용물질 및 열, 산성혈증, 리폭시게나아제 생산물 또는 아난다미드와 같은 다른 인자에 의해 활성화된 경우에, 칼슘은 세포로 들어가고, 통증 신호가 개시된다. 상기 채널의 활성은, 통증의 감각, 신경성 염증, 및 때때로, 평활근 수축 및 기침을 결과적으로 유도하는, 중심 및 말단 감각 신경 말단으로부터 신경펩티드 방출을 유도한다. 사실상, 최근의 증거는 통증, 기침, 천식 및 요실금에서 TRPV1의 역할을 제안한다(Jia, 2005). 사실은, TRPV1은, 통증 자극에 대한 반응으로 무통증에 의한 치료를 위한 알려진 타겟이다. 게다가, 상이한 기술을 사용한 TRPV1의 발현 레벨을 감소시키기 위해 설계된 치료는 또한, 통증의 치료에 초점을 맞춘, W02004/042046, 또는 (Schubert, 2005)에 기재되어 있다.
다중형식 통각기(Polymodal nociceptors)는 각막에서 발견된 가장 풍부한 통각수용기 타입(nociceptor type)이다. 이들이 캡사이신, 열 및 산에 반응하기 때문에, 이러한 수용체 섬유가 TRPV1 수용체를 발현하는 약학적인 증거가 존재한다. 게다가, 캡사이신의 높은 복용량은 열 및 산에 대한 각막의 다중형식 통각기의 반응을 비활성화하는 반면에, 기계적인 민감성은 영향을 미치지 않은 상태로 남아있다. 이는 각막의 다중형식 뉴런 말단(corneal polymodal nerve endings)에 존재하는 TRPV1 수용체가 선택적으로 비활성화시킴을 제안한다. 따라서, 이러한 조직에서 염증성 및 자극성 과정을 동반하는 지속된 통증 감각 및 각막의 손상에 대한 급성 침해 반응(acute nociceptive response)의 중요한 부분이 TRPV1 활성에 의해 조절되는 것 같다.
게다가, W02007/045930에서는, 안구 통증 및 안구건조증과 관련된 안구의 병리학의 치료를 위한 TRPV1 특정한 siRNAs의 용도가 기재되어 있다. 그러나, 본 발명은, TRPV1 발현의 감소 및 그 결과로서 안구의 가벼운 통증에 대한 개선된 생산물을 제공한다. siRNA 생산물 대 통상적인 화학 저해제로 이러한 증상을 치료하는 장점은, siRNA를 기초로 하는 치료가 오래 지속하는 영향을 가지는 것이다. 이러한 결과는, 상기 이펙터 분자가 더 이상 존재하지 않을 때, 상기 세포는 스크래치로부터 새로운 수용체를 합성하여야 하는 반면에; 통상적인 치료는 상기 온전한 세포 막에서 수용체의 레벨을 그대로 두는 사실 때문이다(This result is due to the fact that once the effector molecule is no longer present, the cell will have to synthesise new receptors from scratch; whereas traditional treatments would leave the levels of receptors on the cell membrane intact).
현대의 라이프-스타일로 인하여, 변경된 민감성과 관련된 안구의 병적 이상에 의해 영향을 받은 사람의 수가 매우 높고, 개체군의 나이와 증가됨이 예상된다. 굴절 수술 및 컨택트 렌즈의 사용은 환자에 의한 건조한 눈의 감각 및 변경된 각막의 민감성에서 유도된다. 이는 일반적으로 대기를 더 건조시키는 공기-조절 시스템의 사용 및 컴퓨터 스크린을 응시하는 긴 작업 시간에 의해 더 악화된다. 또한, 눈물의 양 및 질이 나이가 들수록 감소된다. 안구건조증을 동반하는 증상은, 안구 조직의 가려움(itching), 버닝(burning) 및 자극을 포함한다. 건조한 눈의 보다 심각한 형태는 쇼그렌 증후군을 갖는 환자에게 발생한다. 하나 또는 상이한 조합의 이러한 자극의 존재는 현재의 문서의 의미 내의 안구의 통증으로 지칭된다. 현재, 안구건조증은 1000 만명 이상의 미국인에게 영향을 미치는 것으로 추정된다.
첫 번째 측면에서, 본 발명은 siRNA 분자에 대한 투여 치료계획(dosage regimen)의 제공에 관한 것이고, 상기 분자는 SEQ ID NO: 1을 특이적으로 타겟하고, 세포에 유도된 경우에, 상기 TRPV1 유전자의 발현을 감소시킨다.
도면의 서술
도 1은, TRPV1을 타겟하는 상이한 siRNAs으로 HeLa 세포의 트랜스펙션 후에, Qrt-PCR을 사용하여, TRPV1의 일시적인 발현 프로파일을 나타내는 도표이다 : 본 발명에 따른 화합물(SEQ ID NO: 2), 상이한 영역을 타겟팅하는 상기에 기재된 화합물(SEQ ID NO: 7), 및 TRPV1을 타겟하기 위해 설계된 다른 4 개의 siRNAs(SEQ ID NO: 17 내지 20) 및 음성 대조군으로서 사용된 뒤섞인 서열(scramble sequence). 상기 동일한 결과의 두 개의 대체적인 표시는, 명확성, A 및 B를 보장하기 위해 나타내었다.
도 2는, 본 발명의 상이한 siRNAs를 갖는 He La 세포의 트랜스펙션 후에, Qrt-PCR을 사용한, TRPV1의 일시적인 발현 프로파일을 나타낸 도표이다: SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 6, 및 SEQ ID NO: 8 내지 SEQ ID NO: 16, 및 음성 대조군으로 사용된 뒤섞인 서열.
도 3은, 캡사제핀(capsazepine), 캡사이신의 자극 후에, TRPV1 의존적인 통증에 대한 용인된 특정한 진통제(accepted specific analgesic)와 비교하여, 본 발명의 화합물(SEQ ID NO: 2)로 처리된 토끼로부터의 눈의 mm로 측정된 눈꺼풀 오프닝(palpebral opening)의 타임라인(timeline)을 나타낸 것이다.
도 4는, 본 발명의 화합물(SEQ ID NO: 2) 및 캡사제핀과의 처리가 원인인,캡사이신으로 통증 유도 후에 상기 눈꺼풀 오프닝의, 예비-테스트 수치(pre-test values)에 대한 비율(%)를 나타내는 그래프이다.
도 5는, 24 시간 동안 10 % 플라즈마에 노출된 후에, 남아있는 온전한 생산물(intact product)의 양(%)을 나타낸 그래프이다.
도 6은, 5'-인산화에 의해 활성화되고, 세포질의 구획에 존재하는, SEQ ID NO: 2의 온전한 대사작용되지 않은 안티센스 가닥(intact nonmetabolized antisense strand)[모 화합물(parent compound)]의 양을 의미하는, 5-인산화된 온전한 안티센스 가닥을 기초로 눈 조직에서 SEQ ID NO: 2의 농도를 나타낸 그래프이다. 왼쪽 막대기: 5 min; 오른쪽 막대기: 30 min.
도 1은, TRPV1을 타겟하는 상이한 siRNAs으로 HeLa 세포의 트랜스펙션 후에, Qrt-PCR을 사용하여, TRPV1의 일시적인 발현 프로파일을 나타내는 도표이다 : 본 발명에 따른 화합물(SEQ ID NO: 2), 상이한 영역을 타겟팅하는 상기에 기재된 화합물(SEQ ID NO: 7), 및 TRPV1을 타겟하기 위해 설계된 다른 4 개의 siRNAs(SEQ ID NO: 17 내지 20) 및 음성 대조군으로서 사용된 뒤섞인 서열(scramble sequence). 상기 동일한 결과의 두 개의 대체적인 표시는, 명확성, A 및 B를 보장하기 위해 나타내었다.
도 2는, 본 발명의 상이한 siRNAs를 갖는 He La 세포의 트랜스펙션 후에, Qrt-PCR을 사용한, TRPV1의 일시적인 발현 프로파일을 나타낸 도표이다: SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO: 6, 및 SEQ ID NO: 8 내지 SEQ ID NO: 16, 및 음성 대조군으로 사용된 뒤섞인 서열.
도 3은, 캡사제핀(capsazepine), 캡사이신의 자극 후에, TRPV1 의존적인 통증에 대한 용인된 특정한 진통제(accepted specific analgesic)와 비교하여, 본 발명의 화합물(SEQ ID NO: 2)로 처리된 토끼로부터의 눈의 mm로 측정된 눈꺼풀 오프닝(palpebral opening)의 타임라인(timeline)을 나타낸 것이다.
도 4는, 본 발명의 화합물(SEQ ID NO: 2) 및 캡사제핀과의 처리가 원인인,캡사이신으로 통증 유도 후에 상기 눈꺼풀 오프닝의, 예비-테스트 수치(pre-test values)에 대한 비율(%)를 나타내는 그래프이다.
도 5는, 24 시간 동안 10 % 플라즈마에 노출된 후에, 남아있는 온전한 생산물(intact product)의 양(%)을 나타낸 그래프이다.
도 6은, 5'-인산화에 의해 활성화되고, 세포질의 구획에 존재하는, SEQ ID NO: 2의 온전한 대사작용되지 않은 안티센스 가닥(intact nonmetabolized antisense strand)[모 화합물(parent compound)]의 양을 의미하는, 5-인산화된 온전한 안티센스 가닥을 기초로 눈 조직에서 SEQ ID NO: 2의 농도를 나타낸 그래프이다. 왼쪽 막대기: 5 min; 오른쪽 막대기: 30 min.
본 발명의 상세한 설명
첫 번째 측면에서, 본 발명은 siRNA 분자에 대한 투여 치료계획의 제공에 관한 것이고, 상기 분자는 SEQ ID NO: 1을 특이적으로 타겟하고, 세포에 유도된 경우에, 상기 TRPV1 유전자의 발현을 감소시킨다.
유전자는, 예를 들어, 상기 siRNA 분자가 상기 유전자의 발현을 선택적으로 감소하거나 저해하는 경우에, 본 발명에 따른 siRNA에 의해 "타겟된다(targeted)". 본원에 사용된 바와 같은 구절 "선택적으로 감소하거나 저해하다(selectively decrease or inhibit)"는, 이러한 경우 TRPV1에서, 하나의 유전자의 발현에 영향을 미치는 siRNAs를 포함한다. 대체적으로, siRNA는, 상기 siRNA가 상기 유전자 전사물, 즉 이의 mRNA에 대한 엄격한 조건 하에 잡종화된 경우의 유전자를 타겟화한다(Alternatively, a siRNA targets a gene when the siRNA hybridizes under stringent conditions to the gene transcript, i.e. its mRNA). "엄격한 조건 하에" 잡종화의 능력은, 표준 조건, 예를 들어 혼성화를 선호하지 않는 경향이 있는 높은 온도 및/또는 낮은 염 함량 하에, 상기 타겟 mRNA 영역에 대한 풀림(annealing)을 의미한다. 적절한 프로토콜(2 시간 동안 68 ℃, 0.1 xSSC를 포함함)은 Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, at pages 387-389에 기재되어 있다.
본원에 인용된 핵산 서열은, 다른 방식으로 나타내지 않는 한 5'에서 3' 방향으로 기재되어 있다. 용어 "핵산"은, DNA(아데닌 "A", 시토신 "C", 구아닌 "G", 티민 "T") 또는 RNA(아데닌 "A", 시토신 "C", 구아닌 "G", 우라실 "U")에 존재하는 퓨린 또는 피리미딘 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA 또는 이의 변형된 형태를 나타낸다. 본원에 제시된 간섭하는 RNAs는, 비록 "T" 염기가 RNA에서 자연적으로 발생하지 않을지라도, 예를 들어 3' 말단에서, "T" 염기를 포함할 수도 있다. 몇몇의 경우에, 이러한 염기는, 리보뉴클레오티드의 사슬에 존재하는 데옥시리보뉴클레오티드를 구별하기 위해, "dT"로서 나타낼 수도 있다.
상기에 정의된 바와 같은 타겟 서열은, siRNAs를 설계하는 목적을 위해 사용된 데이터베이스에서 전사물 변이체(transcript variants)의 정의를 위해 사용된 바와 같은 타겟 DNA 서열로서 기재되어 있다.
TRPV1에 대응하는 상이한 전사물 변이체가 확인되었다. 대체적인 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 생산된 4 가지의 TRPV1 전사물에 대응하는 젠뱅크 접근 번호(GenBank Accession Numbers)는 NM_O80704(NM_O80704.3, GI:117306161), NM_018727(NM_018727.5, GI:117306160), NM_O80706(NM_O80706.3, GI:117306163) 및 NM_O80705(NM_O80705.3, GI: 117306162)이다. 게다가, ENSEMBL (MBL-EBI/Wellcome Trust Sanger Institute)는, ENST00000174621, ENST00000310522, ENST00000344161, ENST00000399752, ENST00000399756, ENST00000399759, ENST00000425167로 공개된 5 개의 추가적인 TRPV1 전사물을 갖는다.
본 발명은 TRPV1 유전자 발현을 저해하는 siRNAs를 위한 투여 치료계획을 제공하고, 이러한 siRNAs는 본 분야의 상태에서 이미 기재된 것들과 비교하여 특히 효율적이다. 특히 효율적임은, 이들이 제 시간이 보다 장기적인 효과 및/또는 보다 높은 정도의 억제를 달성하는 것을 의미한다.
이러한 siRNAs는 이전의 단락에 기재된 TRPV1의 모든 전사물 변이체에 공통된 타겟 서열에 대항하여 설계되고, 따라서, TRPV1 단백질을 코딩하는 세포에 존재하는 모든 가능한 mRNAs의 RISC-매개된 분해(RISC-mediated degradation)를 매개한다. 본 발명에 의해 확인된 상기 바람직한 타겟 영역은 SEQ ID NO: 1(5'-AAGCGCATCTTCTACTTCA-3')에서 확인된다. 이들은 WO2011/148193에 기재되어 있다.
따라서, 본 발명의 측면에 따른 siRNA는 이중 가닥 RNA 분자를 바람직하게 포함할 것이고, 이의 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 1에 실질적으로 상보적인 RNA 서열을 포함하거나 상기 서열로 구성될 것이고, 이의 센스 가닥은 상기 안티센스 가닥에 상보적인 RNA 서열을 포함할 것이고, 여기서 둘 다의 가닥은 뉴클레오티드들 사이에 표준 염기 짝지음(standard base pairing)에 의해 혼성화된다.
본 발명의 의미 내에 타겟 mRNA 서열에 "실질적으로 상보적인 것은(substantially complementary)"는 상기 타겟 서열에 대해 "실질적으로 동일한 것(substantially identical)"으로서 또한 이해될 수도 있다. 본 분야에서 숙련자에 의해 알려진 바와 같은 "동일성"은, 서열들 사이의 뉴클레오티드의 동일성 및 순서를 매칭함으로써 측정된 바와 같이 뉴클레오티드 서열 사이의 서열 관련성의 정도이다. 하나의 실시형태에서, 상기 타겟 mRNA 서열에 대해, 80 %, 및 80 % 내지 100 %까지의 상보성, 예를 들어, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 상보성을 갖는 siRNA의 안티센스 가닥은 실질적으로 상보적인 것으로 간주되고, 본 발명에서 사용될 수도 있다. 상보성의 퍼센트는, 두 번째 핵산 분자에서 인접한 뉴클레오티드의 세트와 왓슨-크릭 센스(Watson-Crick sense)에서 염기쌍일 수 있는 첫 번째 핵산 분자에서 인접한 뉴클레오티드의 퍼센트를 기재한다.
본 분야의 상태로부터 알려진 바와 같이, 많은 상이한 구조물은, RNA 간섭을 달성하기 위한 것을 목적으로 한다. 일반적으로, 이러한 이중 가닥 분자는 길이에서 약 19 내지 약 25 뉴클레오티드이고, 오버행(overhangs)을 갖는 것들 뿐만 아니라 블런트-엔드된 구조물(blunt-ended structures)을 포함한다. 오버행은 유리하게 하기 위해 기재되어 있고, 이들이 RNAses에 의한 인식을 감소시키고, 다이서의 천연의 기질을 모방하는 바와 같이 어떠한 가닥의 3' 말단 또는 5' 말단에 존재할 수도 있다. 몇몇의 저자들은 상기 분자의 3' 말단에서 오버행을 포함하는 것을 추천하지만, 다른 저자들은 충분하기 위해 하나의 오버행을 고려한다. 다른 것들에는, 특정한 변형 패턴을 갖는 블런트-엔드된 구조물의 용도가 기재되어 있다(EP 1527176, WO 2008/104978, 및 그 밖의 다른 것들).
오버행은 1 내지 5 사이의 뉴클레오티드를 포함할 수도 있고, 일반적으로 오버행은 디뉴클레오티드로 구성된다. 본 분야에서 사용된 전통적인 분자는, Tuschl(W0 02/44321)에 의해 초기 연구에서 언급된 바와 같이, 데옥시뉴클레오티드를 바람직하게 포함하는 3' 디뉴클레오티드 오버행을 추가적으로 포함하는 19 개의 뉴클레오티드 이중 가닥된 분자를 포함한다. 이러한 오버행은, 뉴클레아제 (RNase) 분해에 대한 저항을 추가적으로 증진시키기 위한 것이라고 한다. 나중에, Kim et al 2005에는, 21-mer 생산물(디뉴클레오티드 오버행)이 RISC 상에 로딩하기 위해 필수적임이 기재되어 있다. 추가적으로, Bramsen et al. 2009에는, 사일런싱 효율을 추가적으로 증가시키기 위해, 상기 오버행에 대한 가능한 불안정한 변형의 도입이 기재되어 있다.
이와 같이, 본 발명의 다양한 측면의 바람직한 실시형태는, 적어도 하나의 오버행을 포함하는 SEQ ID NO : 1을 타겟팅하는 siRNA 분자를 나타낸다.
본 발명의 다양한 측면의 그 밖의 대체적인 실시형태는 블런트-엔드된 분자를 제공한다.
추가적으로, 본 발명의 바람직한 실시형태는, SEQ ID NO: 1을 타겟팅하는 19 개의 뉴클레오티드 이중-가닥 구조를 포함하거나 이로 이루어진 siRNA에 관한 것이다. 놀랍게도, 상기 19 개의 뉴클레오티드 이중-가닥 RNAs는, 도 5에 나타낼 수도 있는 바와 같이 3' 오버행 및 21 개의 뉴클레오티드를 갖는 상기에 기재된 생산물보다 분해에 대해 보다 저항할 수 있도록 입증되어 있다.
본 발명의 특정한 실시형태는, SEQ ID NO: 1에 대항하여 타겟된 19 뉴클레오티드 이중 가닥된 블런트-엔드된 siRNA에 관한 것이다. 추가적인 특정한 실시형태에서, 이러한 화합물은 SEQ ID NO: 2 (5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3')로서 확인되었다. 추가적으로 바람직한 실시형태에서, 이러한 siRNA의 상기 안티센스 가닥은, SEQ ID NO: 1에 상보적으로, 적어도 80 %, 바람직하게 적어도 90 %이다.
게다가, 본 분야의 배경기술로 언급된 부분에 기재된 바와 같이, siRNA 분자를 갖는 중요한 쟁점은, RNAses의 아주 흔한 성질로 인하여 생물학적 분야에서 이의 불안정성이다. 따라서, 뉴클레오티드에 대한 많은 상이한 화학적 변형의 용도는 화합물 안정성을 증진시키는 목적으로 기재되어 있다.
siRNAs가 특정한 사이토카인, 예를 들어 타입 Ⅰ 및/또는 타입 Ⅱ 인터페론 뿐만 아니라 IL-12, IL-6 및/또는 TNF-생산의 상향-조절을 포함하는, 선천적인 면역계의 불특정의 활성화를 유도하기 위한 것으로 발견됨으로써 siRNA 분자의 다른 고유의 문제점은 이들의 면역원성이다. 이러한 영향의 기원은, siRNA에 의한 TLR7, TLR8 및/또는 TLR3과 같은 톨-유사 수용체의 활성화인 것으로 생각된다.
이들 효과, RNases 및 면역원성에 의한 인식의 둘 다는 또한, 서열-의존적이도록 기재되어 있다.
RNAses에 대한 민감성을 감소시킴으로써 화합물 안정성을 증진시키는 몇몇의 화학적 변형은 또한, 차후 반응의 면역 인식의 유도를 감소시킬 수도 있다. 그러나, siRNA에서 화학적으로 변형된 뉴클레오티드의 삽입은 또한, 상기의 부분에서 기재된 바와 같이 감소된 사일런싱 효능(decreased silencing efficacy)을 결과적으로 나타낼 수도 있다.
따라서, 본 발명의 다양한 측면의 바람직한 실시형태에서, 상기 siRNA는 추가적으로, 화학적 변형을 갖는 적어도 하나의 뉴클레오티드를 포함한다.
안정성을 증진시키고 면역성의 효과를 감소시키는 바람직한 화학적 변형은, 2'-0-메틸 뉴클레오티드, 2'-플루오로 뉴클레오티드 2'-아미노 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 2'-0 또는 4'-C 메틸렌 브리지를 함유하는 뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 포스포로티오에이트의 도입에 의해 인접한 뉴클레오티드를 연결하는 상기 리보뉴클레오티드 백본의 변형은 뉴클레오티드를 변형시킨다. 본 발명의 의미 내에 추가적으로 바람직한 화학적 변형은, 데옥시티미딘(데옥시리보뉴클레오티드)로 우라실 리보뉴클레오티드의 치환과 관련된 것이다[A further preferred chemical modification within the meaning of the present invention relates to the substitution of uracyl ribonucleotides with deoxythymidine (deoxyribonucleotides)]. 본 발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 적어도 하나의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는 상기 센스 가닥, 상기 안티센스 가닥 또는 상기 siRNA의 둘 다의 가닥에 있다.
이에 따라서, 하나의 실시형태에서, 상기 siRNA는 SEQ ID NO.3, 4, 5, 6, 8, 9,10,11,12,13,14,15 또는 16으로부터 선택된 것이다.
상기에 기재된 바와 같은 siRNA 분자는, 본 분야에서 알려진 방법을 사용하여 이들의 본래의 구조에 있어서 상기 세포의 내부로 전달될 수도 있다. 예를 들어, 생체 외 유전자 사일런싱을 연구하는 경우에, 이러한 화합물은 표준 트랜스펙션 시약을 사용하여 투여된다. 생체 내에서 효과를 달성하기 위해, 이러한 화합물은 또한, 많은 상이한 대체물들이 본 분야에서 공지되어 있을지라도, 특정한 모이어티(specific moiety) 등과의 결합, 예를 들어, 리포솜과 같은 전달 증진제를 사용하여 또는 있는 그대로 투여될 수도 있고, 몸 내의 원하는 타겟 부위에 따라 상이하게 사용된다.
대체적으로, 본 발명의 다양한 측면의 siRNA 분자는, 진핵생물 프로모터로부터 세포 내에 발현될 수 있다. 상기 siRNA 분자를 발현할 수 있는 재조합 벡터는 타겟 세포에 전달되고 지속될 수 있다. 대체적으로, 핵산 분자의 일시적인 발현을 제공하는 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 벡터는 필요에 따라 반복적으로 투여될 수 있다. 발현된 때에, 상기 siRNA 분자는 상기 타겟 mRNA와 상호작용하고, RNA 간섭 반응을 일으킨다. 이러한 방식에서 생산된 상기 siRNA 분자는, 이들의 센스 및 안티센스 가닥이 뉴클레오티드의 작은 루프에 의해 연결되는 바와 같이, shRNA(짧은 헤어핀 RNA)로 언급된다. siRNA 분자 발현하는 벡터(siRNA molecule expressing vectors)의 전달은, 정맥내 또는 근육내 투여에 의해, 피검자로부터의 외식된 세포를 타겟하기 위해 투여한 다음에, 상기 피검자 내로 재도입(reintroduction)에 의해, 또는 상기 원하는 타겟 세포 내로 도입을 가능하게 하는 그 밖의 다른 수단에 의한 것과 같이 조직계통적일 수 있다.
본 발명의 추가적인 측면은, TRPV1의 증가된 발현 및/또는 활성에 의해 특징지어지는 눈 질환의 치료의 방법에서의 사용을 위한 약제의 제조에 있어서, SEQ ID NO. 1을 타겟하는 siRNA의 용도에 관한 것으로, 상기 siRNA는 본원에 기재된 상기 투여 치료방법에 따라 투여된 것이다. 상기 방법은 환자에게 TRPV1의 발현을 저해하는 것을 포함한다. 상기 용어 억제는 발현 또는 활성의 감소 또는 하향조절을 나타내기 위해 사용된다. 바람직하게, 상기 눈 증상은 안구 통증이다. 하나의 실시형태에서, 상기 눈 증상은, 굴절 수술 후의 각막의 가벼운 통증 및 변경된 민감도, 콘택트 렌즈의 사용, 안구건조증, 쇼그렌 증후군, 및 그 밖의 눈 병리학을 포함하는 군으로부터 선택된 것이다.
TRPV1 mRNA에 대항하는 유도된 siRNAs와 치료학적 치료는, 효과가 관찰된 시간의 길이를 증가시킴으로써 작은 분자 국소의 안구 점적액(small molecule topical ocular drops) 상에 유리하도록 예측되고, 그렇게 함으로써 보다 빈도가 적은 투여 및 보다 큰 환자 이행(compliance)을 가능하게 한다. 이들이 종종 만성 증상인 바와 같이 이는 안구 건조증 및 변경된 각막의 민감성과 같은 경우에 특히 중요하다.
이러한 약제의 제조를 명심하여, 본 발명의 다양한 측면의 siRNA가 제형화될 수도 있다. 바람직하게, 상기 siRNAs의 조성물 및 제형은, 관심있는 기관에 국소적으로 투여될 수도 있다. 보다 바람직한 실시형태에서, 이들은 눈, 바람직하게 눈의 각막 표면에 국소적인 투여를 위해 제형화될 수도 있다. 상기 각막의 표면에 대한 적용은, 예를 들어, 점안액, 겔, 로션, 크림 또는 각막의 삽입물의 형태일 수도 있다. 상기 눈에 대한 다른 투여 형태는 상기 눈 내로의 주사를 포함할 수도 있다.
본 발명의 다양한 측면의 추가적인 바람직한 실시형태는, TRPV1의 증가된 발현 및/또는 활성도에 의해 특징지어진 눈 증상의 치료를 위한 약제로서 사용하기 위해, 상기의 단락에 기재된 바와 같은 SEQ ID NO: 1를 특이적으로 타겟팅하는 siRNA에 관한 것이고, 상기 siRNA는 본원에 나타낸 상기 투여 치료계획에 따라 투여된다. 상기에 기재된 바와 같이, 이는 SEQ ID NO: 1를 타겟팅하는 19 뉴클레오티드 이중-가닥 구조물을 포함하거나 이로 구성된 siRNA일 수도 있다. 이러한 siRNA는 블런트-엔드된 것일 수도 있다. 바람직하게, 상기 siRNA는 SEQ ID NO: 2이다. 본 발명에 따른 용도를 위한 그 밖의 siRNA는 SEQ ID NO.3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16으로부터 선택될 수도 있다.
본 발명의 맥락 내에서, 본 발명의 서열 siRNA에 "특이적으로 타겟(specifically target)되도록"은 상기 동일한 시드 서열을 바람직하게 포함한다. 따라서, SEQ ID No. 1에 특이적으로 타겟된 본 발명에 따른 어떠한 서열은 위치 2 내지 8 의 상기 안티센스 가닥에 바람직하게 동일하다.
상기에도 불구하고, 본 발명의 다양한 측면의 siRNAs는 눈 이외의 조직에서 TRPV1 발현되지 않게 사용될 수도 있다. 따라서, 상기 siRNAs는 이에 따라 제형화되어야 한다.
예를 들어, siRNA 분자는 피검자에게 투여하기 위해 리포솜을 포함하는, 전달 비히클을 포함할 수 있다. 캐리어 및 희석제 및 이들의 염은, 약제학적으로 허용가능한 제형에 존재할 수 있다. 핵산 분자는, 이온도입법에 의해, 또는 생분해성 고분자, 히드로겔, 시클로덱스트린 폴리(락티코-글리콜릭) 산[poly (lacticco-glycolic) acid, PLGA] 및 PLCA 마이크로스페어(PLCA microspheres), 생분해성 나노캡슐, 및 생부착성 마이크로스페어와 같은 다른 비히클 내로의 혼합에 의해, 또는 단백질원성 벡터(proteinaceous vectors)에 의해, 리포솜에서 캡슐화를 포함하지만, 이로 제한되지 않는, 본 분야의 숙련자에게 알려진 다양한 방법에 의해 세포로 투여될 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 또한, 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글리콜-N-아세틸갈락토사민(PEI-PEG-GAL) 또는 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글리콜-트리-N-아세틸틸갈락토사민(PEI-PEG-triGAL) 유도체와 같은, 폴리에틸렌아민 및 이의 유도체와 제형화되거나 복합체화될 수 있다. 본 발명의 바람직한 조성물은, 수용액, 특히 약 7.0 내지 약 7.4의 pH 범위, 바람직하게 7.2 ± 0.5의 pH를 갖는 인산-완충식염수(PBS)와 같은 염류 용액이다.
본 발명의 siRNA 분자는 막 파괴 제제 및/또는 양이온성 지질 또는 헬퍼 지질 분자와 복합체화될 수도 있다.
본 발명에 사용될 수도 있는 전달 시스템은, 예를 들어, 수성 및 비-수성 겔, 크림, 복합 유제(multiple emulsions), 마이크로에멀젼, 리포솜, 연고, 수성 및 비-수성의 용액, 로션, 에어로졸, 탄화수소 베이스 및 분말(hydrocarbon bases and powders)을 포함하고, 가용화제, 침투 증진제(예를 들어, 지방산, 지방산 에스테르, 지방 알코올 및 아미노산), 및 친수성 중합체(예를 들어, 폴리카르보필 및 폴리비닐피롤리돈)와 같은 부형제를 함유할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 상기 약제학적으로 허용가능한 담체(carrier)는 리포솜 또는 경피 증진제(transdermal enhancer)이다.
본 발명의 약제학적 제형은, 예를 들어, 인간을 포함하는, 세포 또는 피검자 내로, 투여, 예를 들어 전신 또는 국소의 투여에 적절한 형태로 있다. 적절한 형태는 부분적으로, 주사에 의해 또는 예를 들어, 경구, 경피로, 주입의 경로 또는 용도에 따라 달라진다. 그 밖의 인자는 본 분야에서 알려져 있고, 이의 효과를 행사하는 것으로부터 상기 조성물 또는 제형을 예방하는 형태 및 유독성과 같은 고려사항을 포함한다.
본 발명은 또한, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제에서 원하는 화합물의 약제학적으로 유효한 양을 포함하는 투여 또는 저장을 위해 제조된 조성물을 포함한다. 치료학적 용도를 위한 허용가능한 담체 또는 희석제는 본 약제학적 분야에서 널리 알려져 있다. 예를 들어, 보존제, 안정제, 염료 및 향미제(flavouring agent)가 제공될 수 있다. 이러한 것들은, 소듐 벤조에이트, 소르빈산 및 p-히드록시벤조산의 에스테르를 포함한다. 게다가, 항산화제 및 현탁제가 사용될 수 있다.
약제학적 유효량은, 발생을 예방하거나 저해하거나 또는 질병 상태를 치료하는데(몇몇의 정도에 대한 증상, 바람직하게 모든 증상을 경감시키거나) 필요한 투여량이다. 상기 약제학적으로 유효량은 일반적으로, 질병의 타입, 사용된 조성물, 투여의 경로, 치료될 포유동물의 타입, 공동으로 작용하는 약물(concurrent medication), 고려사항 하의 특정한 포유동물의 물리적인 특성, 및 의료 분야에서 통상의 기술자들이 인식되는 그 밖의 인자에 따라 달라진다.
특히, 투여량 뿐만 아니라, 상기 투여 스케줄은, siRNA 분자에 의해 효과적인 하향조절의 중요한 결정요인임이 알려져 있다.
본 발명자는, 부작용을 피하고, 안전하게 투여될 수 있는, TRPV1의 증가된 발현 및/또는 활성도에 의해 특징지어진 눈 증상, 특히 건조한 눈 및 안구의 통증의 치료를 위한 siRNA의 투여를 위한 효과적인 투여 스케줄을 개발하였다. 따라서, SEQ ID NO : 1을 특이적으로 타겟하고, 본원에 기재된 투여 치료계획에 따라 세포에 도입된 경우에 TRPV1 유전자의 발현을 감소시키는, siRNA 분자의 투여는 임상적인 향상을 유도한다.
본원에 사용된 바와 같이, "유효한 투여 스케줄"은, TRPV1의 과잉발현과 관련된 눈 질환을 치료하거나 처리하기에 충분한 본 발명의 siRNA의 양을 나타낸다. 인간에서 건조한 눈 및/또는 안구의 통증의 치료를 위해, 예를 들어, 안구의 통증을 위해, OSDI [안구 표면 지수(ocular surface index)] 설문지(건조한 눈에 대한) 및/또는 VAS[시각적으로 유사한 눈금(visual analogical scale)]를 사용하여, 본 분야의 숙련자에게 알려진 상이한 파라미터에 의해 측정된 바와 같은 안구의 질병의 레벨을 감소시키는 것이 바람직하다. 예비처리 레벨과 비교된 바와 같이 이러한 레벨에서의 어떠한 감소는, 본 발명의 화합물이 그 밖의 적절한 치료법과 함께, 또는 단독으로 수송되든지 아니든지, 유리하다(예를 들어, 본 발명은, 약 5 %, 약 10 %, 약 25 %, 약 30 %, 약 35 %, 약 40 %, 약 50 %, 또는 약 60 %의 예비치료 IOP보다 더 많은 OSDI 및/또는 VAS에서의 감소를 고려한다).
치료학적 유효량은 또한, 건조한 눈 및/또는 안구의 통증과 연관된 눈의 질병의 징후를 지연시키거나 최소화하기 위해 충분한 siNA의 양을 나타낼 수도 있다. 치료학적 유효량은 또한, 건조한 눈 및/또는 안구의 통증과 연관된 눈 질환의 치료 또는 관리에서의 치료학적 이익을 제공하는 치료학적 제제의 양을 나타낼 수도 있다. 게다가, 본 발명의 siNA에 대한 치료학적 유효량은, 단독으로, 또는 건조한 눈 및/또는 안구의 통증과 연관된 눈 질환의 치료 또는 관리에서 치료학적 이익을 제공하는, 그 밖의 치료와 병용한, 치료학적 제제의 양을 의미한다. 본 발명의 siNA의 양과 관련되어 사용된, 상기 용어는, 그 밖의 치료학적 제제와 상호 보존적으로 또는 이의 치료학적 효과를 증진시키거나 원하지 않는 효과를 피하거나 감소시키고, 전체적인 치료를 개선하는 양을 포함할 수 있다.
건조한 눈 및/또는 안구의 통증과 같은 눈 질환의 치료 또는 관리에서 치료학적 이익은, 원하지 않는 감각 및/또는 통증에서의 지속된 감소이다. 상기 세포 내로 TRPV1 수용체의 레벨을 감소시킬 것을 고려하면, 상기 치료가 정지한 경우에, 통증 감각이 인식되기 전에, 상기 세포가 새로운 수용체를 재합성하여야 한다. siRNA 치료를 기초로 한 이러한 치료는 보다 지속된 효과를 가질 것이다. 이는 상기 치료학적 효능의 현저한 향상을 고려한다.
siRNA를 사용하는 추가적인 이익은, 주로 상이한 점안액-기초된 치료와 연관된 체순환에서 이의 존재로부터 유도된 부작용 또는 급성 독성 문제의 최소한의 개연성이다. 이는, 상기 화합물이 혈류에 들어간 경우에, 혈액에 존재하는 RNAase에 의해 빠르게 분해될 것인 사실에 의한 것이다.
다른 한편으로, 본원에 기재된 제형이 단일 투여 바이알에 제공될 수 있는 사실은, 오늘날의 시장에서 대부분의 제형에 존재하는, 항균성 보존제의 혼합을 의미하고, 이는 치료의 중단을 필요로 하는, 몇몇의 환자에서 특정한 과민증을 초래한다. 둘 다의 이슈는 건조한 눈 및 또는 안구의 통증과 같은 증상이 자주 만성임을 명심하여 특히 중요하고, 따라서 치료(treatment)이다.
바람직한 투여 경로 중의 하나는, 바람직하게, 점안액을 사용하여, 눈에 직접적으로 점적 주입에 의한, 국소이다. 상기에 기재된 바와 같이, TRPV1 mRNA에 대항하여 직접적인 siRNA로의 치료학적 치료는, 효과가 관찰된 시간의 길이를 증가시킴으로써 작은 분자 국소의 안구 점적액 상에 유리하도록 예측되고, 그렇게 함으로써 보다 빈도가 적은 투여 및 보다 큰 환자 이행을 가능하게 한다. 상기 siRNA가 눈에 직접적으로 투여된 경우에, 하루 및 눈 당 약 0.01 mg 내지 약 100 mg의 양은 일반적으로 투여될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 하루 및 눈 당 투여된 양은, 약 0.1 mg 내지 10 mg이다. 다른 실시형태에서, siNA의 하루 및 눈 당 약 0.04 mg 내지 80 mg, 약 0.04 mg 내지 약 20 mg, 약 0.08 mg 내지 약 10 mg, 약 0.08 mg 내지 약 1.2 mg, 약 0.3 내지 약 0.9 mg, 또는 약 0.08 mg 내지 약 0.9 mg가 투여된다.
하나의 실시형태에서, 상기 투여량은 약 0.5 mg 내지 약 1.5 mg이다. 하나의 실시형태에서, 상기 투여량은 약 0.3 내지 0.9 mg, 바람직하게 약 0.6 mg 내지 약 0.9 mg이다. 대체적으로, 바람직한 투여량은 하루에 눈 당 약 0.6 mg 또는 약 0.9 mg이다.
상기에 언급된 바와 같이 바람직한 투여 경로 중의 하나는, 점안액의 사용을 통한 것이다. 하나의 실시형태에서, 이러한 점안액은, 화합물의 제공된 투여량을 함유하는 25 내지 50 마이크로리터, 바람직하게 26 내지 40 마이크로리터의 부피를 가진다. 바람직하게, 상업적인 점안기(eyedropper)는 의료의 최종의 제시에 사용될 수도 있고, 상기 결과적인 부피는 점안액 당 약 30 내지 약 33 마이크로리터 사이일 것이다. 추가적으로 바람직한 실시형태에서, 상기 점안액은 약 40 μl의 부피로 전달된다. 추가적인 실시형태에서, 본 발명의 조성물은, 약 7.5 내지 약 22.5 mg/ml, 또는 대체적으로 약 15 mg/ml 내지 약 22.5 mg/ml의 농도로 인산완충식염수와 같은 허용가능한 용액에 SEQ ID NO: 2와 같은 siRNA를 포함한다. 본 발명의 조성물은, PBS에서 siRNA의 상기 농도 및 예를 들어 염화벤잘코늄과 같은 임의적으로 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다.
상기의 투여량에서 치료는, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 날 동안에 투여될 수도 있다. 바람직하게, 투여는 10 내지 15 일, 가장 바람직하게 10 일 동안이다. 투여는 휴지기(rest period), 예를 들어, 치료의 지속 전 7 일의 기간이 뒤따를 수도 있다. 대체적으로, 건조한 눈 및/또는 안구의 통증이 주로 만성 증상임을 고려하면, 상기 투여량은 만성 투여를 결과적으로 야기하는 장기간 동안 매일 투여될 수도 있다. 이에 따라서, 투여는 매일 4 주 이상 동안에 계속될 수도 있고, 또는 대체적으로 투여는 매일은 아니지만 4 주 초과의 기간 동안에 지속될 수도 있다. 상기 정확한 스케줄은 상기 만성 증상의 심각성에 따라 결정될 수 있다.
그러나, 상기에 설명된 바와 같이, 눈에 직접적으로 투여하는 것 이외의 투여 경로가 또한 사용될 수 있다. 상기 제형에 사용될 상기 정확한 복용량 및 투여 스케줄은 또한 투여의 경로에 따라 달라질 것이지만, 상기 투여량이 사용될 수 있고, 눈 당 및 하루에 약 0.01 mg 내지 약 100 mg의 양으로 일반적으로 투여될 수 있다. 사용될 정확한 복용량 및 투여 스케줄이 또한 상기 질환의 심각성에 따라 달라지고, 각각의 환자의 상황 및 의사의 판단에 따라 결정되어야 함을 통상의 기술자는 이해할 것이다. 어떠한 특정한 피검자에 대한 특정한 투여 레벨이, 사용된 특정한 화합물의 활성도, 나이, 몸무게, 일반적인 건강, 성별, 식단, 투여의 시간, 투여의 경로, 배출의 속도, 약물 조합 및 치료를 받고있는 특정한 질병의 심각성을 포함하는 다양한 인자에 따라 달라짐을 이해할 것이다.
본원에 기재된 본 발명의 siRNA 또는 제형은, 통상적인 비-독성 약제학적으로 허용가능한 담체, 아쥬반트(adjuvants) 및/또는 비히클(vehicles)을 함유하는 단위 투여 제형(unit dosage formulations)으로 투여될 수 있다. 제형은, 예를 들어, 정제, 트로키(troches), 캔디(lozenges), 수성 또는 오일의 현탁액, 분산가능한 분말 또는 과립, 에멀젼, 경질 또는 연질 캡슐(hard or soft capsules), 또는 시럽 또는 엘릭시르(elixir)로서, 경구 사용을 위해 적절한 형태일 수 있다. 경구 사용을 위해 의도된 조성물은, 약제학적 조성물의 제조를 위한 본 분야에서 알려진 어떠한 방법에 따라 제조될 수 있고, 이러한 조성물은, 약제학적으로 정밀하고 맛있는 제제를 제공하기 위해, 하나 또는 그 이상의 이러한 감미제, 향미제, 착색제를 함유할 수 있다. 정제는, 정제의 제조에 적절한 비-독성 약제학적으로 허용가능한 부형제와 혼합하여 유효 성분을 함유한다.
이러한 부형제는, 탄산 칼슘, 탄산 나트륨, 락토오스, 인산 칼슘 또는 인산 나트륨과 같은; 예를 들어 비활성 희석제; 과립화 및 붕해제(granulating and disintegrating agents), 예를 들어, 옥수수 전분, 또는 알긴산; 결합제, 예를 들어, 녹말, 젤라틴 또는 아카시아; 및 윤활제, 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 활석일 수 있다. 상기 정제는 코팅되지 않을 수도 있거나, 이들은 공지된 기술에 의해 코팅될 수 있다. 몇몇의 경우에, 이러한 코팅은 위장관에서 분해 및 흡수를 지연시키기 위해 공지된 기술에 의해 제조될 수 있고, 이로 인하여 장기간 상의 지속된 작용을 제공한다. 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테이레이트와 같은 시간 지연 물질(time delay material)이 사용될 수 있다.
경구 사용을 위한 제형은 또한 경질 젤라틴 캡슐로서 존재할 수 있고, 상기 유효 성분은 비활성 고형의 희석제, 예를 들어, 탄산 칼슘, 인산 칼슘 또는 고령토와 혼합되고, 또는 연질 젤라틴 캡슐로서 존재할 수 있고, 여기서 상기 유효 성분은 물 또는 오일 배지(oil medium), 예를 들어, 피넛 오일, 유동 파라핀 또는 올리브 오일과 혼합된다.
수성의 현탁액은, 수성의 현탁액의 제조를 위해 적절한 부형제와 혼합물로 상기 유효 물질을 함유한다. 이러한 부형제는, 현탁제, 예를 들어, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드로프로필메틸셀룰로오스, 소듐 알지네이트, 폴리비닐피롤리돈, 트래거캔스 고무 및 아라비아 고무이고; 분산제 또는 습윤제는, 천연적으로-발생하는 인지질, 예를 들어 레시틴, 또는 지방산을 갖는 알킬렌 옥사이드의 축합 생산물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 긴 사슬 지방족 알코올을 갖는 에틸렌 옥사이드의 축합 생산물, 예를 들어 헵타데카에틸렌옥시세타놀, 또는 지방산으로부터 유도된 부분적인 에스테르를 갖는 에틸렌 옥사이드의 축합 생산물 및 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레이트와 같은 헥시톨 또는 예를 들어 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레이트, 헥시톨 무수물 및 지방산으로부터 유도된 부분 에스테르를 갖는 에틸렌 옥사이드의 축합 생산물일 수 있다. 상기 수성의 현탁액은 또한, 예를 들어, 에틸, 또는 n-프로필 p-히드록시벤조에이트, 하나 또는 그 이상의 착색제, 하나 또는 그 이상의 향미제, 및 수크로오스 또는 사카린과 같은 하나 또는 그 이상의 감미제를 함유할 수 있다.
오일성 현탁액은, 식물성 오일, 예를 들어, 땅콩 기름, 올리브 오일, 참깨 오일 또는 코코넛 오일, 또는 유동 파라핀과 같은 미네랄 오일로 유효 성분을 현탁시킴으로써 제형화될 수 있다. 상기 오일성 현탁액은, 증점안정제, 예를 들어, 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알코올을 함유할 수 있다. 감미제 및 향미제는 맛좋은 경구 제제를 제공하기 위해 첨가될 수 있다. 이러한 조성물은 아스코르브산과 같은 항-산화제의 첨가에 의해 보존될 수 있다.
물의 첨가에 의해 수성의 현탁액의 제조에 적합한 분산가능한 분말 또는 과립은, 분산 또는 습윤제, 현탁제 및 하나 또는 그 이상의 보존제와 함께 유효 성분을 제공한다. 적절한 분산 또는 습윤제 또는 현탁제는, 상기에 이미 언급된 것들에 의해 예시되었다. 추가적인 부형제, 예를 들어, 감미제, 향미제 및 착색제는 또한 존재할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한, 수중유 에멀젼의 형태일 수 있다. 상기 오일 상(oily phase)은 식물성 오일 또는 미네랄 오일 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적절한 유화제는, 자연적으로-발생하는 고무, 예를 들어 아라비아 고무 또는 트래거캔스 고무, 자연적으로-발생하는 인지질, 예를 들어 콩, 레시틴, 및 헥시톨 및 지방산으로부터 유도된 에스테르 또는 부분적인 에스테르, 무수물, 예를 들어, 소르비탄 모노올레이트, 및 에틸렌 옥사이드를 갖는 상기 부분 에스테르의 축합 생산물, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트일 수 있다. 상기 에멀젼은 감미 및 향미제를 또한 함유할 수 있다.
시럽 및 엘릭시르는 감미제, 예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 글루코스 또는 수크로스와 함께 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 또한, 완화제(demulcent), 보존제 및 향미 및 착색제를 함유할 수 있다. 본원에 기재된 본 발명의 상기 약제학적 조성물 또는 siRNA는 멸균의 주사가능한 수성 또는 유지성 현탁액(oleaginous suspension)의 형태일 수 있다.
이러한 현탁액은, 상기에 언급된 이러한 적절한 분산 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 본 분야에 따라 제형화될 수 있다.
멸균의 주사가능한 제제는 또한, 예를 들어, 1,3-부탄디올에서의 용액으로서, 비-독성의 근원적으로 허용가능한 희석제(non-toxic parentally acceptable diluent) 또는 용제로 멸균의 주사가능한 용액 또는 현탁액일 수 있다. 사용될 수 있는 상기 허용가능한 비히클 및 용액은, 물, 링거액 및 등장성 염화 나트륨이다. 게다가, 멸균의, 고정유(fixed oils)는, 용매 또는 현탁화 배지로서 통상적으로 사용된다. 이러한 목적을 위해, 어떠한 혼합 고정된 오일은, 합성의 모노- 또는 디글리세리드를 포함하여 사용될 수 있다. 게다가, 올레산과 같은 지방산은 주사가능한 약물의 제조에서의 사용을 발견한다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 조성물은, 예를 들어, 점안액의 형태와 같은, 눈에 대한 국소 투여를 위한 용액, 바랍직하게 젤 또는 PBS와 같은 완충식염수 용액에 제형화된다. 이러한 실시형태에서, 상기 제형은 양이온성 에멀젼일 수도 있고/있거나 폴리(락티드-코-글리콜라이드), 카르보폴, 히알루론산 및 폴리아크릴산을 포함하지만 이로 제한되지 않는 생체고분자를 함유한다.
본 발명의 핵산 분자는 또한, 예를 들어, 약물의 직장 투여를 위한 좌약의 형태로 투여될 수 있다. 이러한 조성물은, 상온에서 고체이지만, 직장의 온도에서 액체인 적합한 비-자극적인 부형제(non-irritating excipient)와 상기 약물을 혼합함으로써 제조될 수 있고, 따라서, 상기 약물을 방출하도록 직장에서 용해될 것이다. 이러한 물질은 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜을 함유한다.
본 발명의 핵산 분자는 멸균의 배지에 비경구적으로 투여될 수 있다. 사용될 농도 및 비히클에 따라 상기 약물은, 상기 비히클에 현탁되거나 용해될 수 있다. 유리하게, 국소 마취액, 보존제 및 완충제와 같은 아쥬반트는 상기 비히클에 용해될 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 추가적인 바람직한 실시형태는 약제학적 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은, 상기 단락에 기재된 바와 같이, 특정한 투여 스케줄로 SEQ ID NO: 1을 타겟하는 siRNA를 적어도 포함한다.
본 발명의 상기 핵산 분자는 또한, 전체적인 치료학적 효과를 증가시키기 위해, 그 밖의 치료학적 화합물과 함께 피검자에게 투여될 수 있다. 징후를 치료하기 위해 다수의 화합물의 사용은 부작용의 존재를 감소시키면서 유익한 효과를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 siNA 화합물은 또한, 미리 결정된 부피의 작은 물방울(droplet)에서 상기 siNA 화합물의 특정한 투여량을 분산시키기 위한 오리피스(orifice)를 갖는 디스펜서(dispenser)를 포함하는 키트에 제공될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 siNA 화합물은, SEQ ID NO: 1에 대항하여 타겟된 siRNAs이다. 추가적인 실시형태에서, 본 발명의 키트 내의 디스펜서는, SEQ ID NO: 2를 포함하거나 이로 구성된 조성물을 제공한다. 다른 실시형태에서, 상기 키트는 예를 들어, 한 달 동안에 사용하기 위한, 단일 사용 디스펜서의 컬렉션(collection)을 포함할 수 있고, 특정한 경우에, 상기 경우 30 개의 단일 사용 디스펜서를 함유한다. 상기 물방울은 부피에서 약 50 μl 내지 약 100 μl의 범위일 수 있다. 상기 디스펜서는 단일 사용 디스펜서일 수 있고, 본 발명의 siNA 화합물의 약 1 mg과 약 2 mg 사이를 포함하고, 임의적으로 또한, 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용가능한 희석제, 및 임의적으로 하나 또는 그 이상의 부형제를 포함한다. 상기 디스펜서에 함유된 상기 조성물은, 본 발명의 약 7.5 mg/ml 내지 약 22.5 mg/ml의 상기 siNA 화합물의 농도를 포함할 수 있다. 대체적으로, 상기 디스펜서는 한 달 또는 그 이상 동안 사용되도록 설계될 수 있고, 함유된 부피는 투여량의 동등한 수를 제공하기 위해 이에 따라 증가될 것이다. 본 발명의 키트는 또한 1 개의 작은 물방울에서의 약 0.3 mg 내지 약 0.9 mg의 상기 siRNA 화합물의 투여량이 각각의 눈에 적용되는 것임을 명시하는 지시서(instructions)를 또한 포함할 수 있다. 상기 지시서는, 하루에 한 번, 하루에 두 번, 하루에 세 번 또는 하루에 네 번으로 각각의 눈에 적용됨을 추가적으로 명시할 수 있고, 각각의 눈에 대한 적용이 매일, 이틀에 한 번, 일주일에 한 번, 일주일에 두 번, 일주일에 세 번, 격주로, 또는 한 달에 한 번 일어날 것이다.
본원에 인용된 모든 공개된 논문, 책, 참조 설명서 및 초록의 내용은, 본 발명이 존재하는 본 분야의 상태를 보다 완전하게 기재하기 위해 이들 전체로 참고문헌으로 본원에 의해 포함된다.
다양한 변화가 본 발명의 범위 및 본질로부터 벗어남이 없이 상기에 기재된 주제로 만들어질 수 있는 바와 같이, 상기의 기재를 포함하거나 첨부된 특허청구범위에서 정의된 모든 주제는, 본 발명의 서술하고 설명하는 바와 같이 해석됨을 의도한다. 본 발명의 변형 및 변화가 상기 기술에 비추어 가능하다.
본 발명은 하기의 비-제한적인 실시예에 추가적으로 기재되어 있다.
실시예
생체 외
분석
TRPV1(유전자 발현의 중요한 저해를 획득하는)를 침묵시키기 위해 siRNAs에 대한 특히 효율적인 타겟 서열을 발견하기 위해, 6 개의 상이한 siRNAs가 테스트되었다. 이러한 siRNAs는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 17 내지 20으로서 기재되어 있다.
SEQ ID NO: 2는, 하기의 서열을 갖는 본 발명에 따른 SEQ ID NO: 1을 타겟하는 siRNA이다.
센스(Sense) : 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3'
안티센스(Antisense) : 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'
SEQ ID NO: 7 (5'-UCGCCACGACAUGCUCUUGdTdT-3')은, TRPV1를 효율적으로 타겟하기 위해, WO 2007/045930에 이전에 기재된, 통상적인 siRNA 분자[데옥시티미딘으로 제조된 3' 오버행을 함유하는 길이에서 21 뉴클레오티드(21 nucleotides in length containing 3' overhangs made of deoxythymidine)]에 대응하고(corresponds), 캡사이신 자극에 대한 안구의 반응을 감소시킨다. SEQ ID NO: 17 내지 19는, Reynolds et al. 2004 또는 Ui-Tei et al 2004, 및 그 밖의 것들에 의해 기재된 것과 같은 본 분야에서 이용가능한 상이한 알고리즘에 따라 TRPV1에 대항하여 설계된 siRNAs에 대응한다. SEQ ID NO: 20은 Ambion에 의해 제공된 상업적으로 이용가능한 siRNA이고, TRPV1에 대응하게 설계된 것이다.
SEQ ID NO: 17
센스 : 5'-CGCAUCUUCUACUUCAACU-3'
안티센스 : 5'-AGUUGAAGUAGAAGAUGCG-3'
SEQ ID NO: 18
센스 : 5'-GCGCAUCUUCUACUUCAAC-3'
안티센스 : 5'-GUUGAAGUAGAAGAUGCGC-3'
SEQ ID NO: 19
센스 : 5'-AAAGCCAUGCUCAACCUGC-3'
안티센스 : 5'-GCAGGUUGAGCAUGGCUUU-3'
SEQ ID NO: 20
센스 : 5'-UGAUCGCAGGAGUAUCUUUdTdT-3'
안티센스 : 5'-AAAGAUACUCCUGCGAUCAdTdT-3'
상기에 기재된 siRNA의 테스트 효율성에 대한 모델로서, HeLa(인간 자궁경관 선암) 세포 배양물이 사용되었다. HeLa 세포는, 감염 제제로서 리포펙타민 2000 및 100 nM의 상이한 화합물로 트랜스펙션된다(HeLa cells were transfected with 100nM of different compounds and Lipofectamine 2000 as a transfectant agent). 모든 트랜스펙션은, 다음의 표준 제조자의 조건으로 실행되었다. 동일한 트랜스펙션에서, 상이한 뒤섞인 siRNA(different scramble siRNA)는 대조군으로서 사용되었다. 세포 펠렛은 단백질 레벨에서의 가능한 변화를 측정하기 위해 24, 48 및 72 시간에 수집되었고, 리얼타임 PCR에 의해 처리되었다. 리얼타임 Qrt-PCR에 의해 수득된 결과를 수량화하기 위해, 우리는 비교 한계점 방법(Comparative Threshold Method)을 사용하였다.
결과가 나타낸 바와 같이(도 1), 타겟 서열 SEQ ID NO: 1에 대항하여 유도된 siRNA는, 상기 동일한 유전자의 상이한 영역에 대항하여 유도된 상기에 기재된 siRNA 생산물보다 TRPV1 유전자 사일런싱의 면에서 보다 효율적이다. 게다가, 이러한 효과는 제 시간에 지속되었고, 트랜스펙션 후 72 시간에서, mRNA 레벨의 여전히 현저한 하향조절이 있다(Moreover this effect is sustained in time, as at 72 hours post-transfection there is still significant downregulation of mRNA levels). 상기 효과의 이러한 지속 기간은 예측할 수 없고, 특정한 서열이다.
추가적으로 개선된 생산물을 제공하는 목적과 함께, 상이한 화학적인 변형물은 하기의 기재에 따라, 상기 생산물에 도입되었다:
SEQ ID NO: 3,
센스 : 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3'
안티센스 : 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'
SEQ ID NO: 4,
센스 : 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3'
안티센스 : 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'
SEQ ID NO: 8,
센스 : 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3'
안티센스 : 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'
SEQ ID NO: 9,
센스 : 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3'
안티센스 : 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'
SEQ ID NO: 10,
센스: 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3'
안티센스 : 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'
SEQ ID NO: 11,
센스 : 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3'
안티센스 : 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'
여기서, 상기 밑줄은 2'-O메틸기(2'-Omethyl group)를 포함하는 염기를 나타낸다.
SEQ ID NO: 5,
센스 : 5'-AAGCGCAdTCdTdTCdTACdTdTCA-3'
안티센스 : 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'
SEQ ID NO: 6,
센스 : 5'-AAGCGCAdTCdTdTCdTACdTdTCA-3'
안티센스 : 5'-dTGAAGdTAGAAGAdTGCGCdTdT-3'
SEQ ID NO: 12,
센스 : 5'-AAGCGCAdTCUdTCdTACdTdTCA-3'
안티센스 : 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'
SEQ ID NO: 13,
센스 : 5'-AAGCGCAdTCUdTCdTACUdTCA-3'
안티센스 : 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'
SEQ ID NO: 14,
센스 : 5'-AAGCGCAdTCUUCdTACUdTCA-3'
안티센스 : 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'
SEQ ID NO: 15,
센스 : 5'-AAGCGCAdTCUUCUACUdTCA-3'
안티센스 : 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3'
SEQ ID NO: 16,
센스 : 5'-AAGCGCAdTCUUCUACUdTCA-3'
안티센스 : 5'-UGAAGdTAGAAGAdTGCGCUU-3'
여기서, 몇몇 또는 모든 우라실 뉴클레오티드는 데옥시티미딘 뉴클레오티드를 치환된 것이다(some or all uracyl nucleotides have been substituted for deoxythymidine nucleotides).
이러한 화합물은 SEQ ID NO: 2(어떠한 변형된 뉴클레오티드 없이 동일한 화합물)와 함께 면역원성 검정에서 테스트되었다. 결과는, 모든 이러한 화합물이 말초혈액 단핵세포에서 면역 반응의 유도를 현저하게 감소시킴을 나타낸다. 게다가, 대부분의 화합물은, 대조군으로서 상기 검정에 함유된, 인간 임상 실험을 통해 진보된 siRNAs(베바시라닙 및 Sirna-027)에 의해 생산된 것보다 가능한 한 낮게, 이의 가장 높은 레벨에 있는 반응을 유도한다[Moreover, most compounds induced a response which was at its highest levels, as low as that produced by siRNAs which have advanced through human clinical trials (bevasiranib and Sirna-027) which were included in the assays as a control].
변형의 다양한 정도가 siRNAs의 유전자 사일런싱 능력을 변경할 수 있는 바와 같이, 이러한 화합물은 HeLa 세포 내로의 트렌스펙션에 의해 이들의 RNA 간섭 능력을 위해 추가적으로 테스트되었고, 결과적으로 생성된 TRPV1 mRNA 레벨은 상기의 단락에 기재된 방법에 따라 측정되었다.
도 2에서 나타낼 수도 있는 바와 같이, 모든 화합물은 다양한 정도에서의 효율적으로 TRPV1 mRNA 레벨을 감소시키기 위해 상기 능력을 유지한다.
상기에 기재된 화합물로부터 유도된 추가적으로 예측되지 않은 바람직한 효과는 도 5에 나타낼 수도 있는 바와 같이 RNases에 의한 분해에 대한 이들의 증진된 저항이다.
이러한 실험에 대해, 화합물은 2 μM의 최종 농도에서 PBS에서 10 % 인간 플라즈마에 현탁시키고, 37 ℃에서 24 시간 동안 배양되었다. 샘플은 그 후에 HPLC-UV를 사용하여 분석하고, 잔여하는 온전한 생산물의 양이 측정되었다. 도 5에서 관찰될 수도 있는 바와 같이, SEQ ID NO: 2의 상기 19 의 뉴클레오티드 이중-가닥 화합물(어떠한 화학적 변형 없이)은, 이전에 기재된 SEQ ID NO: 21 : 3' 오버행을 포함하는 5'-CAAGAUCGCACAGGAGAGCdTdT-3'(WO 2007045930에 또한 기재됨)보다 분해에 대해 거의 3 배 더 저항한다. 이러한 효과는, 상기에 기재된 단락에 기재된 바와 같이, 몇몇의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 SEQ ID NO: 3의 화합물에 대해 추가적으로 증진되었다.
생체 내
분석
건조한 눈 및 안구 통증의 동물 모델은 종종, 이러한 경우의 뉴질랜드 흰색 토끼에서, 토끼의 사용을 제조하였다. 이러한 실험의 끝에서, 상기 타겟 서열, SEQ ID NO: 1이 상이한 동물 서열을 통해 상기 TRPV1 유전자의 매우 보존된 영역임이 본 발명의 siRNAs의 추가적인 장점이다. 사실은, 이러한 서열은, 상기 질병의 연구를 위해 특히 적합한 이러한 동물 모델을 만드는 것은, 인간과 토끼 사이에 동일하다.
하기에 기재된 상기 실험은, 본 분야의 통상의 기술자에게 알려진 안구 통장의 표준 모델을 사용하여 실행되었다(Gonzalez et al. 1993). 간단하게, 통증은,적절한 마이크로피펫을 사용하여 눈에 1 % 캡사이신(TRPV1의 알려진 작용물질)의 30 μl의 용액의 점적 주입(instillation)을 사용하여 유도되었다. 윤리적인 고려사항으로 인하여, 캡사이신으로 처리될 동물은, 캡사제핀 5 mM, 알려진 캡사이신 작용물질, 또는 테스트될 화합물을 함유하는 40 μl의 용액의 투여량을 이전에 받았다. 따라서, 진통성 효과는 기준 치료로서 캡사제핀과 비교하여 측정되었다.
테스트 및 기준 물품(reference items)은, 오른쪽 눈에서 Day 1 내지 Day 3에서 하루에 한 번 및 Day 4에서 하루에 두 번 주입되었다. 4 일, 15 분 그 다음에 마지막 주입(15 minutes following the last instillation)에서, 각막의 통증은 캡사이신 1 %의 단일 주입에 의해 동물의 오른쪽 눈에서 유도되었다. 상기 반대쪽의 눈은 연구를 통해 PBS로 주입되었고, 대조군으로서 역할을 한다.
통증에 대한 반응을 측정하기 위해, 눈꺼풀 오프닝(palpebral opening)이 측정되었다. 통증에 대한 반응으로 눈이 감아지고, 통증 감각이 진정됨에 따라, 상기 눈꺼풀 오프닝은 정상 레벨로 다시 증가될 것이 고려된다. 상기 눈꺼풀의 오프닝은, 처리 전[베이스라인(baseline)], 통증 유도 직전 및 통증 유도 후 1 분, 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 25 분, 30 분에 측정되었다.
도 3 및 4로부터 나타낼 수도 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물, SEQ ID NO: 2의 화합물에 특이적으로 테스트되었고, 캡사제핀보다 더 높은 진통효과(눈꺼풀 오프닝의 정도에 의해 측정된 바와 같은 눈 회복)를 유도됨이 관찰되었다. 따라서, 이러한 화합물이 안구의 가벼운 통증에 대한 효과적인 치료학적 치료임이 입증되었다.
게다가, 또 다른 생체 내 실험은, 본 발명의 화합물(SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 5)이 WO 2007045930에 기재된, SEQ ID NO: 21과 함께, 토끼의 눈에 투여되었다. 이러한 경우에, 연이은 3 일 동안 상기 화합물이 토끼(처리군 당 6 마리의 토끼)에 매일 투여되었다. 셋째 날, 마지막 주입 후에 2 시간에, 동물은 희생되었다. 이러한 토끼로부터의 안구의 조직이 회수되었고, TRPV1 특정한 mRNA의 존재는 RT-PCR을 사용하여 분석되었다. 하기의 표(표 1)는, 기준 화합물 SEQ ID NO: 21로 달성된 저해 %의 비율로서 나타낸 주어진 조직에서 달성된 TRPV1 유전자 사일런싱의 레벨을 나타낸 것이다.
[표 1]
이러한 결과로부터 분명한 바와 같이, 본 발명의 화합물은, 상기에 기재된 화합물보다 안구의 조직에서 TRPV1 유전자 발현을 사일런싱한 경우에 보다 효과적이다.
본 발명의 화합물의 보다 긴 지속적인 효과와 함께 더 높은 효능은, 투여 사이의 보다 긴 시간을 가능하게 하는 것이 환자의 삶의 질을 현저하게 개선하는 바와 같이, 유리한 투여 치료계획을 제공해야 한다.
다른 실험은, PBS에서 SEQ ID NO: 2의 안구 투여 후에 뉴질랜드 흰색 토끼에서 조직 분포 및 플라즈마 노출을 평가하기 위해 실행되었다. 사용된 물질 및 방법은 하기의 표(표 2)에 명시되어 있다.
[표 2]
모든 계산은 SEQ ID NO: 2의 소듐 염의 분자량을 사용하여 실행되었다. SEQ ID NO: 2 농도의 계산은 세 가지의 다른 방식으로 실행되었다:
1. SEQ ID NO: 2[모 화합물(parent compound)]의 온전한 비-대사작용된 안티센스 가닥의 피크 영역을 기초로 함. 이러한 수치는 상기 조직에서 변하지 않은 상기 모 화합물의 양에 대한 마커이다.
2. SEQ ID NO: 2의 온전한 5'-인산화된 안티센스 가닥의 피크 영역을 기초로 함. 이러한 수치는 세포질의 구획(cytoplasmic compartment)에 존재하고, 5'-인산화에 의해 활성화되는 상기 모 화합물의 양에 대한 마커이다.
3. 전체 피크 영역을 기초로 함. 이러한 수치는 샘플에 존재하는 모든 온전하고 대사작용된 SEQ ID NO: 2를 요약한 것이다.
간, 신장 피질 및 수질, 폐, 모양체, 망막, 홍채, 눈물샘, 각막, 수성 및 유리체 체액(aqueous and vitreal humour), 신경절(ganglion), 플라즈마 및 오줌의 샘플은 투여 후 5 분 및 30 분에 수집되었다. 토끼(n = 6)에 대한 SEQ ID NO: 2의 한 번의 안구 투여 후에, 결과는 하기를 나타낸다:
● SEQ ID NO: 2의 전신성 노출은, 1 ng/g 이하의 농도에서 눈에 대해 투여된 후 5 분 및 30 분에서 플라즈마 및 전신성 조직 샘플에서 검출되었다(표 3을 참고하라).
[표 3]
● SEQ ID NO: 2는, 투여 후 5 분 및 투여 후 30 분 강하게 감소된 농도로 모든 눈 조직 및 유체에서 검출될 수 있다(표 4를 참고하라).
[표 4]
● 망막, 홍채, 모양체 및 눈물샘에서, 상기 5'-인산화된 안티센스 가닥은, 이러한 조직에서 상기 siRNA(타겟 세포 분획에서 활성화된 siRNA)의 세포질 전달(cytoplasmic delivery)을 나타내는 투여 후 5 분 및 30 분에 검출되었다(도 6을 참고하라).
SEQ ID NO: 2의 안구 투여 후에, 활성화된 SEQ ID NO: 2가 존재하는 동물이 투여 후에 5 분에 검출될 수 있는 모든 눈 조직에 분포됨을 이러한 데이터는 나타낸다.
인간에서의 분석
SEQ ID NO: 2에 따른 화합물의 초기의 안구의 내성은 30 명의 건강한 인간 성인에서 평가되었다.
상기 연구는 두 가지의 기간 내로 조직화되었다. 첫 번째 기간 동안에, 초기의 안정성 평가는 조사 생산물의 단일 투여량을 사용하여 평가된 다음에, 두 번째 기간에 다수-투여량 투여로 평가되었다.
기간 1, 단일 투여 : 어떠한 조정 없이 조절됨, 및 투여를 받은 눈의 무작위 추출. 각각의 자원봉사자는, 상기 테스트 물품이 단지 하나의 눈에 투여되고, 다른 눈은 어떠한 조정도 받지 않지만, 상기 안정성 평가 테스트가 실행되는 사실이 제공된, 그/그녀 자신의 대조군이다. 안정성 평가를 하는 안과의사는 상기 약물 투여에 대해 알지 못한다. 혈류 내로의 생산물 흡수가 측정되었다.
기간 2, 다수-투여 : 오픈(Open), 평행한 및 조절됨(parallel and controlled). 상기 처리된 눈은 임의 추출되었다. 상기 평가자는 상기 조사 생산물을 투여하는 부위에 관해서 알 수 없다. 약물 투여 전에 눈 및 다른 눈은 대조군으로서 둘 다 고려되었다. 이러한 단계 동안에, 상기 국소의 및 전신성의 안정성이 흡수 뿐만 아니라 평가되었고, 적절한 경우에, 상기 조사 생산물의 약물동력학도 평가되었다.
첫 번째 단계의 안정성 및 약물동태학이 평가된 경우에, 두 번째 단계가 시작되었다. 상기 첫 번째 단계에 대한 결과는, 상기 두 번째 단계 동안에 약물동태학적 평가를 계속하는 것에 대한 필요성을 확립되었다.
30 명의 성인은 상이한 처리군으로 분배되고, 하나의 눈에 600 ㎍ 투여량의 화합물을 함유하는 단일 26.6 μl 점안액(기간 1), 또는 각각 26.6μl 또는 40μl의 부피로 투여된, 눈 당 600 또는 900 ㎍의 화합물의 일주일 동안의 매일의 투여량(기간 2)을 받았다. 기간 1은 6 명의 자원봉사자를 가지고, 기간 2는, 상기 그룹의 각각의 절반에 적용된 상이한 투여량 레벨을 갖는 두 개의 집단(two cohorts)으로 나뉘어진, 24 명의 자원봉사지를 가진다. 기간 1 은 단일 투여를 포함하고, 기간 2 는 총 7 번의 투여(하루에 한 번의 투여)를 포함한다.
국소 내성 평가(Local tolerance assessment)는, 기간 2에서 마지막 투여량 투여 후의 24 시간 및 기간 1에서 단일 투여 점적 후의 72 시간 후에 실행된 검사 동안에 상기 눈 표면에서 발견된 변형(국소의 부작용)의 빈도를 기초로 한다. 좋은 내성은, CTCAEv3 범위에서, 더 높거나 등급 3 독성의 부재로 정의되었다[부작용에 대한 공통의 용어 기준(Common Terminology Criteria for Adverse Events)].
카이 스퀘어 테스트(Chi Square test)는, 상기 치료에 관하여, 어떠한 증후군 또는 국소의 징후도 각각의 눈에서 나타나지 않는지 여부(복수의 증후군에 상관없이)를 고려하여, 상기 국소의 부작용과 약물 사이의 관계를 측정하기 위해 사용되었다. 상기 분석은, 만약 적어도 하나가 발생하였다면, 각각의 눈에서의 부작용의 존재를 고려하였다(표 5를 참고하라).
[표 5]
국소적인 변형(국소의 부작용)의 발달과 관련하여, 1.002 (p=0.317)의 1.002 (p=0.317)의 피어슨의 카이스퀘어(Pearson's Chi Square)를 수득하는, 처리된 눈과 처리되지 않은 눈 사이에 어떠한 차이도 관찰되지 않았다.
어떠한 약물-관련된 안구의 표면 변형도 실험의 어떠한 기간에 관찰되지 않았다; 따라서, 점안액으로서 7 일까지 동안 다수 투여 또는 단일 투여로서 투여된 경우에 국소의 내성(local tolerance)은 뛰어났다.
이러한 실험의 추가적인 목적은, 처리 후에 신체 실험, 생명 징후 및 심전도에서, 분석학적 파라미터에서의 영향을 모니터링함으로써, 상기 화합물에 대한 전신성 내성을 평가하기 위한 것이다.
혈액 및 소변 분석은, 약물의 투여 전, 및 SEQ ID NO: 2의 최종의 투여 다음날에서, 최종 실험에서, 선택 공정 동안에 실행되었다. 연구는, 관련된 데이터에 대한 학생의 t 테스트를 사용하여, 선택 기간과 최종 조사 사이의 분석학적 파라미터에서 변화로 만들어졌다. 하기의 표는, 상기의 파라미터 사이의 평균, 표준 편차 및 통계학적 유의성을 나타낸 것이다(표 6을 참고하라).
[표 6]
차이점은 상기 선택 실험과 상기 최종 실험 사이의 몇몇의 파라미터에서 관찰되었지만, 모든 수치가 어떠한 임상적인 중요성을 나타내지 않는 정상인 것으로 간주된다.
상기에 나타낸 바와 같이, 연구 동안에, 상기 생명 징후(혈압 및 심박수)는, 선택 동안에, 및 처리 단계 동안에 상이한 시간 및 상기 최종 실험에서 취해졌다(표 7 및 8을 참고하라).
기간 1에서 참가한 6 명의 자원봉사자에서 반복된 측정 ANOVA를 갖는 통계학적 분석 및 측정 시간의 범위에 대한 평균 수치가 하기에 나타내었다(표 7을 참고하라).
[표 7]
기간 2 에서 생명 징후는, 조사의 의학 생산물을 첫 번째 및 마지막 투여량의 투여 전 및 투여 후 1 시간, day 1에서의 실험 및 day 7에서의 실험에서 실행되었다. 상기 생명 징후는 또한 선택 실험 동안 및 최종 실험에서 실행되었다. 베이스라인으로서 상기 선택 수치를 기록하면서, 생명 징후의 진전은 반복된 측정 ANOVA를 사용하여, 기간 2 동안에, 연구의 과정 동안에 24 명의 자원봉사자에 대해 평가되었다(표 8을 참고하라).
[표 8]
심전도는 선택 실험 및 최종 실험에서 추가적으로 실행되었다. 비교는, 관련된 샘플에 대한 스튜던트 t 테스트(Student's t test)를 사용하여, 선택과 최종 실험 사이에 실행되었다. 하기의 표는 각각의 파라미터에 대한 평균 및 표준편차 및 분석의 결과를 요약한 것이다(표 9를 참고하라).
[표 9]
모든 수치가 정상 한계 내에 있기는 하지만, 통계학적으로 중요한 변화는, 표 7 및 8 에서 몇몇의 혈압 측정 및 표 9에서 몇몇의 심박수 측정에서 관찰되었고, 이러한 차이는 임상적으로 중요하지 않다.
전신성 내성은, 혈액, 소변 분석, 심전도 또는 최종의 평가 동안의 조사에서 어떠한 변형도 없이, 좋았다.
혈액 분석은, 상기 약물의 투여 후에 수득된 플라즈마 샘플에서 SEQ ID NO : 2 농도를 측정하기 위해 실행되었다. 첫 번째 기간 동안에, 샘플링은, 투여한 다음에 4 시간 동안, 생산물의 투여 후에 5, 15, 30 분 및 4 시간에 추출된 혈액으로 실행되었다. 두 번째 기간 동안에, 혈액 샘플은, day 1에 투여 후 5 분, 및 또 다시 day 7에 화합물 투여 전 및 생산물 투여 후 5 분에 또한 수집되었다.
약물동력학적 프로파일은, 상기 화합물이 입증된 생물학적 분석 방법(bioanalytical method)(LLOQ: 10 ng/mL)으로 상기 수집된 혈액 샘플 중 어떠한 것에서 발견되지 않는 것과 같은, 어떠한 기간 동안에 검출되지 않을 수 있다. 혈액에서 검출가능한 화합물의 양의 부재는, RNAses의 존재로 인하여 혈류에 들어간 경우에 RNA의 예측된 빠른 분해에 따른 것이다.
이러한 모든 사실은, SEQ ID NO: 2가 건강한 인간에서 안과용 액제에서 좋은 내성을 나타내는 결론을 뒷받침한다.
동물 모델에서 수득된 양성 결과 및 건강한 인간에서 독성의 부재가 제공된,상기 화합물은 그 다음에 안구 통증 및 건조한 눈으로부터 고통받는 환자에서 테스트되었다.
피검자
가벼운 내지 중간의 안구 통증 및 안구건조증을 갖는 것으로 진단된 60 명의 성인 환자가 모집되었다. 이 중에서, 이들 중의 절반은 65 세 이상이다. 안구 질환의 레벨은, Allergan Inc에 의해 개발된 OSOIⓒ(안구 표면 질병 지수) 설문지 및 VAS [시각 유사 규모(visual analogue scale)] 평가를 사용하여 확립되었다. 포함 기준은, 건조한 눈에 대해 OSOIⓒ에서 13 내지 30의 지수(score)이고, 통증에 대해 2 내지 7 VAS의 지수이다. 종합적인 물리적 검사 및 안구의 검사는, 연구에서 참가를 위해 피검자의 적합성을 확인하기 위해, 상기 연구 내에 들어가기 전에 실행되었다.
연구 계획
평행한, 플라세보 조절된, 이중-은폐된 임상학적 연구(parallel, placebo controlled, double-masked clinical study)는, 치료의 10 일 동안 점안액으로서 매일 투여된 SEQ ID NO : 2의 화합물의 진통 효과 및 인내성(tolerability)을 평가하기 위해 계획되었다.
두 번째 목적은, 상기 조사 생산물과 가능한 관련된, 각각의 투여 후에 국소의 인내성, 전신성 인내성(실험실 파라미터, 물리적인 실험, 및 생명 징후에서의 효과), 및 시력, 안압, 쉬르머 테스트 및 누액층 파괴시간(tear break-up time)에서의 변화의 측정이다.
모든 경우에서, 상기 약물 또는 플라세보는 두 개의 눈에 주입되었다. 두 개의 눈은 맹검 방식(blinded fashion)으로 모니터되었다.
베이스라인 기간(
Baseline
period
)
상기 조사의 생산물의 첫 번째 투여 전 15 일까지, 피검자는 상기 임상 실험의 치료 기간에 참여하기 위해 규정에 등록되었다.
치료 기간(
Treatment
period
)
Day 1에 피검자는, 점안액으로서 상기 눈에 국소적으로 투여된 2 : 1의 비율로 화합물 또는 플라세보(placebo)에 대해 임의추출되었다. 피검자는 눈 당 최종 부피의 40 μl의 화합물 또는 비히클(플라세보)를 받았다. 상기 투여된 투여량은 눈 당 900 ㎍의 화합물이다.
피검자는 조사의 생산물의 투여 및 측정을 위해 장소에 각각의 날(공휴일 및 주말을 포함)에 돌아왔다. 피검자는 10 일 동안 두 눈에서 하루에 한번 상기 화합물의 1 번의 투여량을 받았다.
Day 10에 환자는 베이스라인에서 실행된 것과 동일한 조사를 통해 또다시 받았다.
추가 방문(
Follow
-
up
visit
)
최종 평가는, 치료 기간의 마무리 후에 환자의 진전(evolution)을 평가하기 위해, 첫 번째 투여 후 14 내지 20 일(마지막 투여 후 4 내지 10일)에 실시된 추가 방문에서 실행되었다.
건조한 눈 및 안구의 통증의 환자의 레벨에서의 SEQ ID NO: 2의 효과를 측정하기 위해, OSDIⓒ 및 VAS에서의 각각의 개별적인 지수는, 치료 시작하기 전 및 10 일의 치료 지수와 비교되어 실시되었다. 상기 결과는, OSDIⓒ 설문지로부터의 발생한 중간값 지수에서의 변화, 및 VAS 평가의 중간값 강도(median intensity)에서의 변화에서의 명확하게 측정되었다.
또한, 초기의 치료 전 및 10 일 후에 실행된 안구의 조사로부터의 결과는, 인내성을 확인하기 위해 비교되었다.
결과
상기 OSDIⓒ 설문지는 보다 높은 장애를 나타내는 보다 높은 점수를 갖는, 0 내지 100의 점수로 평가되었다. 상기 지수는, 건조한 눈 질병을 갖는 환자 및 정상의 피검자 사이의 구별에서 민감성 및 특이성을 나타낸다. 상기 OSDIⓒ는 12 개의 질문으로 구성되어 있고, 건조한 눈 질병과 일관된 증상의 빠른 표시를 제공하기 위해 디자인되었다. 상기 OSDIⓒ는, 건조한 눈 질병의 심각성[정상(normal), 가벼운 정도(mild) 내지 중간의 정도(moderate), 및 심각한 정도(severe)]을 측정하기 위한 유효하고 믿을 수 있는 수단이고, 임상 실험에서 사용을 위해 식품 의약품국에 의해 승인되었다. 상기 OSDIⓒ의 유효성 및 신뢰성이 측정되었고, 이는 건조한 눈에 대한 뛰어난 신뢰도, 유효성, 민감성 및 특이성에 대해 좋음을 제공됨이 발견되었다. 추정의 전체적인 OSDIⓒ 지수는, 정상의 정도(normal)(0 내지 12 점) 또는 가벼운 정도(mild)(13 내지 22 점), 중간의 정도(moderate)(23 내지 32 점), 또는 심각한 정도(severe)(33 내지 100 점)의 질병으로서 안구 표면을 정의한다.
[표 10]
상기 통증 질문 VAS(pain questionary VAS)는, 다양한 성인 인구에서 널리 사용된 통증 강도의 표면적인 측정이다. 상기 VAS는 수치의 연속체에 걸친 범위에서의 통증을 측정하고, 안구 통증과 같이, 쉽게 직접적으로 측정될 수 없다. VAS에서의 통증 강도에 대해, 상기 점수는, "통증 없음(no pain)"(0의 점수) 및 "가장 나쁜 상상할 수 있는 통증(worst imaginable pain)"(10의 점수)에 의해 대부분 보통 고정된다.
[표 11]
결론
임상 실험의 2 : 1 의 화합물 : 플라세포의 비율을 고려하여, 및 상기 비율은 분석된 환자의 수와 관계없이 유지되었고, 환자에게 매일 적용된 SEQ ID NO: 2의 효과가, 상기 눈에 국소적으로 투여된 경우에 건조한 눈 질병의 심각성을 감소시키고 상기 안구 통증을 감소시킬 수 있음을 결론 내릴 수 있다.
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<222> (17)..(17)
<223> n=deoxythymidine
<400> 13
aagcgcancu ncnacunca 19
<210> 14
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> siRNA against TRPV1
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n=deoxythymidine
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n=deoxythymidine
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> n=deoxythymidine
<400> 14
aagcgcancu ucnacunca 19
<210> 15
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> siRNA against TRPV1
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n=deoxythymidine
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> n=deoxythymidine
<400> 15
aagcgcancu ucuacunca 19
<210> 16
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> siRNA against TRPV1
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n=deoxythymidine
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> n=deoxythymidine
<400> 16
aagcgcancu ucuacunca 19
<210> 17
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> siRNA against TRPV1
<400> 17
cgcaucuucu acuucaacu 19
<210> 18
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> siRNA against TRPV1
<400> 18
gcgcaucuuc uacuucaac 19
<210> 19
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> siRNA against TRPV1
<400> 19
aaagccaugc ucaaccugc 19
<210> 20
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> siRNA against TRPV1
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n=deoxythymidine
<400> 20
ugaucgcagg aguaucuuun n 21
<210> 21
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> siRNA against TRPV1
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n=deoxythymidine
<400> 21
caagaucgca caggagagcn n 21
<210> 22
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> siRNA against TRPV1; antisense to SEQ ID NOs 2-5 and 8-15
<400> 22
ugaaguagaa gaugcgcuu 19
<210> 23
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> siRNA against TRPV1; antisense to SEQ ID No: 6
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n=deoxythymidine
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n=deoxythymidine
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n=deoxythymidine
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(19)
<223> n=deoxythymidine
<400> 23
ngaagnagaa gangcgcnn 19
<210> 24
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> siRNA against TRPV1; antisense to SEQ ID NO: 16
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n=deoxythymidine
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n=deoxythymidine
<400> 24
ugaagnagaa gangcgcuu 19
<210> 25
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> siRNA against TRPV1: antisense to SEQ ID NO: 17
<400> 25
aguugaagua gaagaugcg 19
<210> 26
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> siRNA against TRPV1: antisense to SEQ ID No: 18
<400> 26
guugaaguag aagaugcgc 19
<210> 27
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> siRNA against TRPV1: antisense to SEQ ID NO: 19
<400> 27
gcagguugag cauggcuuu 19
<210> 28
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> siRNA against TRPV1: antisense to SEQ ID NO: 20
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n=deoxythymidine
<400> 28
aaagauacuc cugcgaucan n 21
Claims (11)
- 건조한 눈, 안구의 통증, 또는 이들 모두의 치료에 사용하기 위한 SEQ ID NO: 1에 타겟된 siRNA을 포함하는 약제학적 조성물로서,
상기 siRNA는 하루에 0.3 내지 0.9 mg의 투여량으로 투여되는 것인, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 siRNA는 하루에 눈(eye) 당 0.6 mg 또는 0.9 mg의 투여량으로 투여되는 것인, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 siRNA는 5 내지 15 일 동안 투여되는 것인, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 siRNA는 10 일 동안 투여되는 것인, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 siRNA는 만성적으로(chronically) 투여되는 것인, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 siRNA는 SEQ ID NO: 2로 정의된 화합물인 것인, 약제학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 siRNA는 눈에 국소적으로 투여되는 것인, 약제학적 조성물.
- SEQ ID NO: 1에 타겟된 siRNA의 공급량 및 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따라 SEQ ID NO: 1에 타겟된 siRNA를 투여하기 위한 지시서를 포함하는, SEQ ID NO: 1에 타겟된 siRNA를 투여하기 위한 의료용 키트로서,
상기 투여량은, 일일 투여를 위해 0.3 내지 0.9 mg를 함유하는 것인, 의료용 키트.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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