RS57620B1 - Sirnk i njena primena u metodama i kompozicijama za lečenje i/ili prevenciju očnih stanja - Google Patents

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE NA KOJU SE PREDMETNI PRONALAZAK ODNOSI

[0001] Predmetni pronalazak odnosi se na obezbeđivanje proizvoda siRNK i njihovu primenu u metodama i kompozicijama za lečenje i/ili prevenciju očnih stanja povezanih sa visokim nivoima ekspresije i ili aktivnosti vaniloidnog receptora tranzitornog potencijala (TRPV1) korišćenjem RNK interferencije. Između ostalih, očna stanja povezana sa bolom u oku kao što su nelagodnost i promenjena osetljivost rožnjače nakon refraktivne hirurgije, upotrebe kontaktnih sočiva, sindrom suvog oka i Sjogrenov sindrom trebalo bi da se ublaže.

STANJE TEHNIKE PREDMETNOG PRONALSKA

[0002] RNK interferencija (RNKi) je prirodni regulatorni mehanizam većine eukariotskih ćelija koji koristi male molekule dvolančane RNK (dsRNK) da bi regulisali utišavanje gena zavisno od homologije. Njeno otkriće od strane Fire i Mello u crvu C. elegans {Fire, 1998} je nagrađeno Nobelovom nagradom 2006. Ubrzo nakon njenog prvog opisa, pokazano je da se RNKi takođe javlja u ćelijama sisara, ne preko dugih dsRNK već pomoću dvolančanih malih interferirajućih RNK (siRNK kiseline) dugih 21 nukleotid {Elbashir, 2001}.

[0003] Smatra se da je proces RNK interferencije evolutivno-konzerviran ćelijski mehanizam odbrane korišćen za prevenciju ekspresije stranih gena i obično ga dele raznovrsni filumi i flora, gde se naziva post-transkripciono utišavanje gena. Od otkrivanja mehanizma RNKi došlo je do eksplozije istraživanja kako bi se otkrila nova jedinjenja koja mogu selektivno menjati gensku ekspresiju kao novi način za lečenje bolesti ljudi ciljanjem meta koje inače "nisu osetljive na lek" sa tradicionalnim farmaceutskim pristupima koji uključuju male molekule ili proteine.

[0004] U skladu sa trenutnim znanjem, mehanizam RNKi je iniciran kada su dugačke dvolančane RNK obrađene pomoću proteina sličnog RNazi III koji je poznat kao Dicer. Protein Dicer tipično sadrži N-terminalni RNK helikazni domen, RNK-vezujući takozvani Piwi/Argonaute/Zwille (PAZ) domen, dva RNaza III domena i vezujući domen dvolančane RNK (dsRBD) {Collins, 2005} i njegova aktivnost vodi ka obrađivanju dugačkih dvolančanih RNK u dvolančane siRNK od 21-24 nukleotida sa 3' “overhangs” od 2 baze i 5' fosfatnom i 3' hidroksilnom grupom. Dobijeni siRNK dupleksi su zatim inkorporirani u efektorski kompleks poznat kao RNK-indukovani utišavajući kompleks (RNA-induced silencing complex - RISC), gde antisens ili vodeći lanac siRNK usmerava RISC da prepozna i cepa ciljne iRNK sekvence {Elbashir, 2001} nakon odmotavanja zavisnog od adenozintrifosfata (ATP) molekula dvolančane siRNK kroz aktivnost RNK helikaze {Nykanen, 2001}. Katalitička aktivnost od RISC, koja vodi ka iRNK degradaciji, je posredovana pomoću endonukleaze Argonaut 2 (AGO2) {Liu, 2004; Song, 2004}. AGO2 pripada visoko konzerviranoj Argonaut familiji proteina. Argonaut proteini su visoko bazni proteini od ∼100 KDa koji sadrže dva uobičajena domena, naime PIWI i PAZ domene {Cerutti, 2000}. PIWI domen je krucijalan za interakciju sa Dicer-om i sadrži nukleaznu aktivnost odgovornu za cepanje iRNK kiselina {Song, 2004}. AGO2 koristi jedan lanac siRNK dupleksa kao vodič da nađe informacione RNK kiseline koje sadrže komplementarne sekvence i cepa fosfodiestarsku kičmu između baza 10 i 11 u odnosu na 5' kraj vodećeg lanca {Elbashir, 2001}. Značajan korak tokom aktivacije RISC je cepanje sens ili putnik lanca pomoću AGO2, uklanjanjem ovog lanca iz kompleksa {Rand, 2005}. Kristalografske studije koje analiziraju interakciju između vodećeg lanca siRNK i PIWI domena otkrivaju da su to samo nukelotidi 2 do 8 koji konstituišu " seme sekvencu" koja reguliše prepoznavanje ciljne iRNK pomoću RISC, i da neusklađenost jednog nukleotida u ovoj sekvenci može drastično uticati na utišavajuću sposobnost molekula {Ma, 2005; Doench 2004; Lewis, 2003}. Jednom kada se iRNK iscepa, i usled prisustva nezaštićenih RNK krajeva u fragmentima, iRNK se dalje cepa i degradira pomoću unutarćelijskih nukleaza i neće više biti translatirana u proteine {Orban, 2005} dok će se RISC reciklirati za naredne krugove {Hutvagner, 2002}. Ovo konstituiše katalitički proces koji dovodi do selektivne redukcije specifičnih molekula iRNK i odgovarajućih proteina. Moguće je eksploatisati ovaj nativni mehanizam za utišavanje gena sa svrhom regulisanja bilo kog (kojih) gena po izboru direktnim isporučivanjem siRNK efektora u ćelije ili tkiva, gde će aktivirati RISC i proizvesti snažno i specifično utišavanje ciljane iRNK.

[0005] Objavljene su mnoge studije koje opisuju idealne osobine koje siRNK treba da ima da bi postigla maksimalnu efikasnost, u pogledu dužine, strukture, hemijskog sastava i sekvence. Početne parametre za dizajn siRNK postavili su Tuschl i saradnici u WO02/44321, iako su mnoge naknadne studije, algoritmi i/ili poboljšanja objavljeni od tada. Takođe, značajan napor je uložen u poboljšanje stabilnosti siRNK jer se ovo smatra jednom od glavnih prepreka za terapiju zasnovanu na siRNK, s obzirom na sveprisutnu prirodu RNAza u biološkim tečnostima. Jedna od glavnih strategija koja je praćena za poboljšanje stabilnosti bila je upotreba modifikovanih nukleotida kao što su 2'-O-metil nukleotidi, 2'-amino nukleotidi, nukleotidi koji sadrže 2'-O ili 4'-C metilen mostove. Takođe, opisana je modifikacija ribonukleotidne kičme koja povezuje susedne nukleotide, uglavnom uvođenjem nukleotida modifikovanih fosforotioatom. Čini se da je poboljšana stabilnost često obrnuto proporcionalna efikasnosti (Parish, 2000), i samo određeni broj, pozicije i/ili kombinacije modifikovanih nukleotida mogu dati stabilno jedinjenje za utišavanje. Pošto je ovo važna prepreka u tretmanima zasnovanim na siRNK, objavljene su različite studije koje opisuju šablone određene modifikacije koja pokazuje dobre rezultate, primeri takvih uključuju EP1527176, WO2008/050329, WO2008/104978 ili WO2009/044392, iako se mnogo više može naći u literaturi.

[0006] Vaniloidni receptor tranzitnog potencijala 1 (TRPV1), takođe nazvan Vaniloidni receptor 1 (VR-1), je ligandom kontrolisan katjonski kanal koji reaguje na kapsaicin, koji je prvi put otkriven u 1997 (Caterina, 1997). TRPV1 je uglavnom eksprimiran na senzornim neunronima i služi kao molekularni detektor za toplotu, kapsaicin, protone, i endovaniloide (Caterina, 2001; Montell, 2002; Baumann, 2000). Mada su pronalazači iz predmete prijave takođe pronašli TRPV1 ekspresiju u tkivima iz suzne žlezde i cilijarnog tela.

[0007] Kada se TRPV1 aktivira od strane agonista kao što su kapsaicin i drugi faktori kao što su toplota, acidoza, proizvodi lipoksigenaze ili anandamid, kalcijum ulazi u ćeliju i inicirani su signali bola. Aktivacija kanala izaziva oslobađanje neuropeptida iz centralnih i perifernih senzornih nervnih završetaka, što dovodi do osećaja bola, neurogene inflamacije, a ponekad, do kontrakcije glatkih mišića i kašlja. U stvari, nedavni dokaz ukazuje na ulogu TRPV1 u bolu, kašlju, astmi i urinarnoj inkontinenciji (Jia, 2005). Zapravo, TRPV1 je poznata meta za lečenja pomoću analgezije u odgovoru na bolne stimuluse. Osim toga, lečenja formulisana da smanje nivoe ekspresije TRPV1 korišćenjem različitih tehnologija su takođe opisana u WO2004/042046, ili (Schubert, 2005), sa fokusom na lečenje bola.

[0008] Polimodalni nociceptori su najobilniji tip nociceptora koji se nalazi u rožnjači. Postoji farmakološki dokaz da ova receptorska vlakna eksprimiraju TRPV1 receptor jer ona reaguju na kapsaicin, toplotu i kiselinu. Osim toga, visoke doze kapsaicina inaktiviraju odgovor kornealnih polimodalnih nociceptora na toplotu i kiselinu dok mehanička reakcija ostaje nepromenjena. Ovo ukazuje na to da su TRPV1 receptori prisutni u kornealnim polimodalnim nervnim završecima bili selektivno inaktivirani.

[0009] Stoga, verovatno je da su, važan deo akutnog nociceptivnog odgovora na povredu rožnjače i stalni osećaji bola koji prate zapaljenske i iritativne procese u ovom tkivu, posredovani aktivacijom TRPV1.

[0010] Osim toga, WO2007/045930 opisuje primenu TRPV1 specifičnih siRNK kiselina za lečenje okularnih patologija povezanih sa bolom u oku i sindroma suvog oka. Međutim, predmetni pronalazak obezbeđuje poboljšane proizvode za smanjivanje TRPV1 ekspresije i posledične okularne nelagodnosti. Prednost tretiranja ovih stanja sa siRNK proizvodima naspram tradicionalnih hemijskih inhibitora je što će lečenja bazirana na siRNK imati dugotrajniji efekat. Ovaj rezultat je zbog činjenice da jednom kada efektorski molekul nije više prisutan, ćelija će morati da sintetiše nove receptore od samog početka; dok bi tradicionalni tretmani ostavili nivoe receptora na ćelijskoj membrani intaktnim.

[0011] WO2011/148193 opisuje siRNK kiseline koje inhibiraju TRPV1 gensku ekspresiju, koje ciljaju sekvencu zajedničku za varijante transkripata za TRPV1, 5'-AAGCGCATCTTCTACTTCA-3'.

[0012] Zbog trenutnog načina života, broj ljudi pogođenih okularnim patologijama povezanih sa izmenjenom očnom senzitivnošću je dosta visok, i očekuje se da će se povećati sa starenjem stanovništva. Refraktivna hirurgija i upotreba kontaktnih sočiva često dovode do izmenjene osetljivosti rožnjače i osećaja suvog oka kod pacijenta. Ovo je dodatno pogoršano gledanjem u kompjuterske ekrane tokom dugog radnog vremena i upotrebom klima uređaja koji obično dodatno suše vazduh. Takođe, količina i kvalitet suza se smanjuju sa godinama. Simptomi koji prate sindrome suvog oka obuhvataju svrab, peckanje i iritaciju očnih tkiva. Teži oblik suvog oka javlja se kod pacijenata sa Sjogrenovim sindromom. Prisustvo jedne ili različitih kombinacija ovih senzacija naziva se bol u očima u smislu predmetnog teksta. Procenjeno je da trenutno sindrom suvog oka pogađa više od 10 miliona Amerikanaca.

OPIS NACRTA

[0013]

Slika 1 je dijagram koji prikazuje vremenski ekspresioni profil TRPV1, korišćenjem Qrt-PCR, nakon transfekcije HeLa ćelija sa različitim siRNK kiselinama koje ciljaju TRPV1: jedinjenje u skladu sa predmetnim pronalasom (SEK ID BR: 2), prethodno opisano jedinjenje koje cilja različiti region (SEK ID BR: 7), i druge četiri siRNK kiseline (SEK ID BR: 17 do 20) dizajnirane da ciljaju TRPV1 i skremblovana sekvenca korišćena kao negativna kontrola. Dva alternativna prikaza istih rezultata su prikazana da bi se obezbedila jasnoća, A i B.

Slika 2 je dijagram koji prikazuje vremenski ekspresioni profil TRPV1, korišćenjem Qrt-PCR, nakon transfekcije HeLa ćelija sa različitim siRNK kiselinama predmetnog pronalaska: SEK ID BR: 2 do SEK ID BR: 6, i SEK ID BR: 8 do SEK ID BR: 16, i skremblovana sekvenca korišćena kao negativna kontrola.

Slika 3 prikazuje vremensku liniju sa palpebralnim otvaranjem izmerenim u mm u očima zečeva tretiranih sa jedinjenjem predmetnog pronalaska (SEK ID BR: 2) u poređenju sa kapsazepinom, prihvaćenim specifičnim analgetikom za bol zavisan od TRPV1, nakon stimulacije sa kapsaicinom.

Slika 4 je grafikon koji prikazuje odnos (%) uzimajući u obzir vrednosti iz prethodnog testa, palpebralnog otvaranja posle indukovanja bola sa kapsaicinom, koje nastaje iz tretmana sa jedinjenjem predmetnog pronalaska (SEK ID BR: 2) i kapsazepinom.

Slika 5 je grafikon koji prikazuje količinu intaktnog proizvoda (%) koji preostaje nakon izlaganja 10% plazmi tokom 24 sata.

Slika 6 je grafikon koji prikazuje koncentraciju od SEK ID BR: 2 u očnim tkivima na osnovu 5-fosforilovanog intaktnog antisens lanca, što podrazumeva količinu intaktnog nemetabolizovanog antisens lanca od SEK ID BR: 2 (izvorno jedinjenje) koji je prisutan u citoplazmatskom odeljku i aktivira se sa 5'-fosforilacijom. Levi stubić: 5 min; desni stubić: 30min.

DETALJAN OPIS PREDMETNOG PRONALASKA

[0014] Predmetni pronalazak obezbeđuje siRNK usmerenu na SEK ID BR: 1 za primenu u lečenju suvog oka i/ili bola u oku gde je siRNK administrirana u dozi od oko 0.3 do oko 0.9 mg po danu. Dalji aspekti pronalaska su navedeni u zavisnim patentnim zahtevima. Takođe je obezbeđen medicinski komplet za lečenje suvog oka i/ili bola u oku u skladu sa nezavisnim patentnim zahtevom 8.

[0015] Ovde je opisano obezbeđivanje doznog režima za siRNK molekul gde pomenuti molekul specifično cilja SEK ID BR: 1 i smanjuje ekspresiju TRPV1 gena kada je uveden u ćeliju.

[0016] Gen je "ciljan" pomoću siRNK u skladu sa predmetnim pronalaskom kada, na primer, siRNK molekul selektivno smanjuje ili inhibira ekspresiju gena. Fraza "selektivno smanjuje ili inhibira" kao što je ovde korišćeno obuhvata siRNK kiseline koje deluju na ekspresiju jednog gena, u ovom slučaju TRPV1. Alternativno, siRNK cilja gen kada siRNK hibridizuje pod strogim uslovima za genski transkript, tj. njegovu iRNK. Sposobnost hibridizacije "pod strogim uslovima" označava vezivanje („annealing“) za ciljni iRNK region, u standardnim uslovima, npr., visoka temperatura i/ili nizak sadržaj soli koji teže da suzbiju hibridizaciju. Pogodni protokol (koji uključuje 0.1×SSC, 68 °C tokom 2 sata) je opisan u Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, na stranama 387-389.

[0017] Sekvence nukleinskih kiselina navedene ovde su napisane u smeru 5' ka 3' ukoliko nije naznačeno drugačije. Termin „nukleinska kiselina" odnosi se na ili DNK ili RNK ili njihov modifikovani oblik koji sadrži purinske ili pirimidinske baze prisutne u DNK (adenin "A", citozin "C", guanin "G", timin "T") ili u RNK (adenin "A", citozin "C", guanin "G", uracil "U"). Interferirajuće RNK kiseline obezbeđene ovde mogu da sadrže "T" baze, na primer na 3' krajevima, čak iako se "T" baze ne javljaju prirodno u RNK. U nekim slučajevima ove baze mogu da se pojave kao "dT" da se razlikuju dezoksiribonukleotidi prisutni u lancu ribonukleotida.

[0018] Ciljna sekvenca kao što je definisano iznad je opisana kao ciljna DNK sekvenca kao što je korišćeno za definiciju varijanti transkripta u bazama podataka korišćenim za svrhe dizajniranja siRNK kiselina, dok će specifična jedinjenja koja će se koristiti biti RNK sekvence definisane kao takve.

[0019] Različite varijante transkripata koje odgovaraju TRPV1 su identifikovane. Pristupni Brojevi banke gena (GenBank) koji odgovaraju za četiri TRPV1 transkripata proizvedenih pomoću alternativnog splajsovanja su: NM_080704 (NM_080704.3, GI:117306161), NM_018727 (NM_018727.5, GI:117306160), NM_080706 (NM_080706.3, GI:117306163) i NM_080705 (NM_080705.3, GI:117306162). Osim toga, ENSEMBL (MBL-EBI/Wellcome Trust Sanger Institute) imaju 5 dodatnih TRPV1 transkripata objavljenih: ENST00000174621, ENST00000310522, ENST00000344161, ENST00000399752, ENST00000399756, ENST00000399759, ENST00000425167.

[0020] Ovde su opisani dozni režimi za siRNK kiseline koje inhibiraju TRPV1 gensku ekspresiju, ove siRNK kiseline koje su posebno efikasne u poređenju sa onima koje su već objavljene u stanju tehnike. Posebno efikasne znači da one postižu više stepene inhibicije i/ili produženiji efekat u vremenu.

[0021] Ove siRNK su dizajnirane za ciljnu sekvencu zajedničku za sve varijante transkripata za TRPV1 opisanih u prethodnom paragrafu, i na taj način posreduju u degradaciji koja je posredovana pomoću RISC svih mogućih iRNK kiselina prisutnih u ćeliji koja kodira TRPV1 protein. Navedeni poželjni ciljni region je identifikovan u SEK ID BR: 1 (5'-AAGCGCATCTTCTACTTCA-3'). Oni su opisani u WO2011/148193.

[0022] Zbog toga, siRNK u skladu sa aspektima predmetnog pronalaska sadrži molekul dvolančane RNK, čiji će antisens lanac sadržati ili se sastojati od RNK sekvence koja je u suštini komplementarna sa SEK ID BR: 1, i njen sens lanac će sadržati RNK sekvencu komplementarnu antisens lancu, gde su oba lanca hibridizovana standardnim baznim sparivanjem između nukleotida. U okviru značenja predmetnog pronalaska "suštinski komplementaran" sa ciljnom iRNK sekvencom, takođe se može shvatiti kao "suštinski identičan" navedenoj ciljnoj sekvenci. "Identičnost" kao što je poznato prosečnom poznavaocu oblasti, jeste stepen srodnosti sekvence između nukleotidnih sekvenci kao što je određeno podudaranjem redosleda i identiteta nukleotida između sekvenci. U jednom tehničkom rešenju antisens lanac od siRNK koji ima 80%, i između 80% do 100% komplementarnosti, na primer, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% komplementarnosti, sa ciljnom iRNK sekvencom se smatra suštinski komplementarnim i može biti korišćen u predmetnom pronalasku. Procenat komplementarnosti opisuje procenat susednih nukleotida u prvom molekulu nukleinske kiseline koji može formirati bazni par u Votson-Krikovom smislu sa nizom susednih nukleotida u drugom molekulu nukleinske kiseline.

[0023] Kao što je poznato iz stanja tehnike, predložene su mnoge različite strukture za postizanje interferencije RNK. Generalno ovi dvolančani molekuli su od oko 19 do oko 25 nukleotida u dužini, i uključuju strukture sa tupim krajevima kao i one sa “overhangs”. Opisano je da su “overhangs” povoljni i mogu biti prisutni na 5' krajevima ili na 3' krajevima bilo kog lanca jer smanjuju prepoznavanje pomoću RNAza i imitiraju prirodni susptrat za Dicer. Neki autori preporučuju uključivanje “overhangs” na oba 3' kraja molekula, dok drugi smatraju da je jedan „overhang“ dovoljan. Drugi su opisali upotrebu struktura sa tupim krajevima sa specifičnim šablonima modifikacije (EP 1527176, WO 2008/104978, i mnogi drugi).

[0024] “Overhangs” mogu biti sačinjeni od između 1 i 5 nukleotida, tipično “overhangs” su napravljeni od dinukleotida. Klasični molekuli korišćeni u oblasti, sadrže dvolančani molekul od 19 nukleotida koji dalje sadrži 3' dinukleotidne “overhangs” koji poželjno sadrže dezoksinukleotide kako je razmatrano u početnim studijama od strane Tuschl (WO02/44321). Smatra se da ovi “overhangs” dalje poboljšavaju otpornost na degradaciju nukleazom (RNazom). Kasnije, Kim et al 2005 opisuju da su 21-merni proizvodi (koji sadrže dinukleotidne “overhangs”) neophodni za dodavanje na RISC. Dalje, Bramsen et al. 2009 opisuje uvođenje mogućih destabilizujućih modifikacija za “overhangs” da se dalje poveća efikasnost utišavanja.

[0025] Kao takvo, poželjno tehničko rešenje raznih aspekata predmetnog pronalaska odnosi se na siRNK molekule koji ciljaju SEK ID BR: 1 koji sadrže najmanje jedan „overhang“. Drugo alternativno tehničko rešenje raznih aspekata predmetnog pronalaska obezbeđuje molekule sa tupim krajevima. Predmetni pronalazak stavlja na uvid javnosti siRNK koja sadrži ili se sastoji od dvolančane strukture od 19 nukleotida koja cilja SEK ID BR: 1. Iznenađujuće, navedene dvolančane RNK kiseline od 19 nukleotida su pokazane kao otpornije na degradaciju od prethodno opisanih proizvoda sa 21 nukleotidom i 3' “overhangs” kao što se može videti na slici 5. Predmetni pronalazak stavlja na uvid javnosti dvolančane siRNK sa tupim krajevima od 19 nukleotida koje su usmerene na SEK ID BR: 1. U dodatnom posebnom tehničkom rešenju ovo jedinjenje je identifikovano kao SEK ID BR: 2 (5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3'). U dodatnom poželjnom tehničkom rešenju, antisens lanac ove siRNK je najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, komplementaran sa SEK ID BR: 1.

[0026] Osim toga, kao što je opisano u odeljku pod nazivom stanje tehnike, važno pitanje sa siRNK molekulima je njihova nestabilnost u biološkim tečnostima zbog sveobuhvatne prirode RNAza. Zbog toga, opisana je upotreba mnogih različitih hemijskih modifikacija za nukleotide sa ciljem poboljšanja stabilnosti jedinjenja.

[0027] Još jedan inherentni problem siRNK molekula je njihova imunogenost, pri čemu je nađeno da siRNK kiseline indukuju nespecifičnu aktivaciju urođenog imunskog sistema, uključujući pozitivnu regulaciju određenih citokina, npr. interferona tipa I i/ili tipa II, kao i proizvodnje IL-12, IL-6 i/ili TNF-alfa. Smatra se da je poreklo ovih efekata aktiviranje receptora sličnih Toll-u, kao što su TLR7, TLR8 i/ili TLR3 pomoću siRNK.

[0028] Oba ova efekta, prepoznavanje od strane RNaza i imunogenost, su takođe opisani kao zavisni od sekvence.

[0029] Neke od hemijskih modifikacija koje poboljšavaju stabilnost jedinjenja smanjivanjem osetljivosti na RNAze su takođe sposobne da smanje indukciju imunološkog prepoznavanja naknadnog odgovora. Međutim, insercija hemijski modifikovanih nukleotida u siRNK takođe može rezultovati smanjenom efikasnošću utišavanja, kao što je opisano u prethodnom odeljku, i stoga se mora pristupati sa oprezom.

[0030] Shodno tome, siRNK može dalje da sadrži najmanje jedan nukleotid sa hemijskom modifikacijom. Poželjne hemijske modifikacije koje poboljšavaju stabilnost i smanjuju imunogene efekte uključuju 2'-O-metil nukleotide, 2'-fluoro nukleotide 2'-amino nukleotide, 2'-dezoksi nukleotide, nukleotide koji sadrže 2'-O ili 4'-C metilen mostove. Takođe, modifikacija ribonukleotidne kičme koja povezuje susedne nukleotide uvođenjem nukleotida modifikovanih fosforotioatom. Dodatna poželjna hemijska modifikacija u smislu predmetnog pronalaska odnosi se na supstituciju uracil ribonukleotida sa dezoksitimidinom (dezoksiribonukleotidi). U još jednom poželjnom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, najmanje jedan hemijski modifikovani nukleotid je na sens lancu, na antisens lancu ili na oba lanca siRNK.

[0031] Prema tome, siRNK može biti odabrana od SEK ID. BR.3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili 16. siRNK molekuli kao što je opisano iznad mogu se isporučiti u unutrašnjost ćelije u svojoj nativnoj strukturi korišćenjem metoda poznatih u oblasti. Na primer, prilikom proučavanja in vitro utišavanja gena, ova jedinjenja se administriraju pomoću standardnih reagensa za transfekciju. Da bi se postigli efekti in vivo ova jedinjenja mogu takođe biti primenjena čista ili pomoću sredstava za poboljšanje isporučivanja, kao što su na primer lipozomi, konjugacijom sa specifičnim segmentom, itd. iako su mnoge različite alternative poznate u oblasti, i koriste se različito u zavisnosti od željenog ciljnog mesta unutar tela.

[0032] Alternativno, siRNK molekuli raznih aspekata pronalaska mogu biti eksprimirani unutar ćelija iz eukariotskih promotera. Rekombinantni vektori sposobni da eksprimiraju siRNK molekule mogu biti isporučeni i dalje postojati u ciljnim ćelijama. Alternativno, vektori mogu biti korišćeni da obezbede prolaznu ekspresiju molekula nukleinskih kiselina. Takvi vektori se mogu administrirati u više navrata ako je potrebno. Kada je jednom eksprimiran, siRNK molekul interaguje sa ciljnom iRNK i generiše odgovor RNK interferencije. siRNK molekuli proizvedeni na ovaj način su često nazvani shRNK (short

1

hairpin RNK – mala RNK u obliku ukosnice), jer su njihovi sens i antisens spojeni malom petljom nukleotida. Isporuka vektora koji eksprimiraju siRNK molekul može biti sistemska, kao što je intravenska ili intra-muskularna administracija, pomoću administracije u ciljne ćelije koje su eksplantirane iz subjekta praćeno ponovnim uvođenjem u subjekt, ili na bilo koji drugi način koji bi dozvolio uvođenje u željenu ciljnu ćeliju.

[0033] Takođe stavljena na uvid javnosti ovde je primena siRNK koja cilja SEK ID BR.1 u pripremanju leka za primenu u metodi lečenja stanja oka okarakterisanog povećanom ekspresijom i/ili aktivnošću TRPV1 gde je siRNK administrirana u skladu sa doznim režimom stavljenim ovde na uvid javnosti. Metoda obuhvata inhibiranje ekspresije TRPV1 kod pacijenta. Termin inhibicija se koristi da ukaže na smanjenje ili negativnu regulaciju ekspresije ili aktivnosti. Poželjno, stanje očiju je očni bol. U jednom tehničkom rešenju, stanje oka odabrano je iz grupe koja obuhvata nelagodnost u oku i promenjenu osetljivost rožnjače posle refraktivne hirurgije, upotrebe kontaktnih sočiva, sindrom suvog oka, Sjogrenov sindrom i druge patologije oka.

[0034] Očekuje se da će terapijsko lečenje sa siRNK kiselinama usmerenim protiv TRPV1 iRNK biti korisnije od topikalnih kapi za oči u vidu malih molekula putem produžavanja vremena tokom koga se primećuje efekat, time omogućavajući manje učestalo doziranje i bolju komplijansu pacijenta. Ovo je naročito važno u slučajevima kao što su sindrom suvog oka i promenjena osetljivost rožnjače jer su to često hronična stanja.

[0035] Imajući u vidu pripremu takvog leka, siRNK opisana ovde može biti formulisana. Poželjno, kompozicije i formulacije pomenutih siRNK mogu se administrirati topikalno na organ od interesa. U još poželjnijem tehničkom rešenju one se mogu se formulisati za topikalnu administraciju na oko, poželjno na površinu rožnjače oka. Nanošenje na površinu rožnjače može, na primer, biti u obliku kapi za oči, gela, losiona, kreme ili očnih umetaka. Ostali oblici administracije u oko mogu uključivati injekciju u oko.

[0036] Dalje opisana ovde je siRNK koja specifično cilja SEK ID BR: 1 kao što je opisano u prethodnim paragrafima, za primenu kao lek za lečenje stanja oka okarakterisanog povećanom ekspresijom i/ili aktivnošću TRPV1 gde je siRNK administrirana u skladu sa doznim režimom koji je ovde stavljen na uvid javnosti. Kao što je opisano iznad, to može biti siRNK koja sadrži ili se sastoji od dvolančane strukture od 19 nukleotida koja cilja SEK ID BR: 1. Ova siRNK može biti sa tupim krajevima. Poželjno, siRNK je SEK ID BR: 2. Druga siRNK za primenu može biti odabrana od SEK ID. BR.3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili 16.

[0037] U sklopu konteksta predmetnog pronalaska, "specifično ciljati" sekvencu siRNK pronalaska poželjno sadrži barem istu seme sekvencu. Prema tome, bilo koja sekvenca koja specifično cilja SEK ID BR.1 je poželjno identična na položajima 2-8 antisens lanca.

[0038] Bez obzira na gore navedeno, siRNK kiseline opisane ovde se mogu koristiti za utišavanje ekspresije TRPV1 u tkivima različitim od oka. Stoga, pomenute siRNK kiseline treba formulisati shodno tome.

[0039] Na primer, molekul siRNK može sadržati nosač za isporuku, uključujući lipozome, za administraciju subjektu. Nosači i razblaživači i njihove soli mogu biti prisutni u farmaceutski prihvatljivim formulacijama. Molekuli nukleinske kiseline mogu se administrirati ćelijama raznim metodama koje su poznate prosečnim poznavaocima oblasti, uključujući, ali ne ograničeno na, enkapsulaciju u lipozome, pomoću jontoforeze, ili inkorporiranjem u druge nosače, kao što su biorazgradivi polimeri, hidrogelovi, mikrosfere poli (mlečne-ko-glikolne) kiseline (PLGA) i PLCA sa ciklodekstrinima, biorazgradive nanokapsule i bioadhezivne mikrosfere, ili pomoću proteinskih vektora. U još jednom tehničkom rešenju, mulekuli nukleinske kiseline opisani ovde mogu takođe biti formulisani ili u kompleksu sa polietileniminom ili njegovim derivatima, kao što su polietilenimin-polietilenglikol-N-acetilgalaktozamin (PEI-PEG-GAL) ili polietilenimin-polietilenglikol-tri-N-acetilgalaktozamin (PEI-PEG-triGAL) derivati. Poželjne kompozicije su vodeni rastvori, specifično slani fiziološki rastvori kao što je fiziološki rastvor puferisan fosfatom (PBS) sa opsegom pH od oko 7.0 do oko 7.4, poželjno sa pH od 7.2 ± 0.5.

[0040] Molekul siRNK opisan ovde može formirati kompleks sa agensima koji remete membranu i/ili katjonskim lipidnim ili pomoćnim lipidnim molekulom.

[0041] Sistemi isporuke koji se mogu koristiti uključuju, na primer, vodene i ne-vodene gelove, kreme, višestruke emulzije, mikroemulzije, lipozome, masti, vodene i ne-vodene rastvore, losione, aerosole, ugljovodonične baze i praškove, i mogu sadržati ekscipijense kao što su kao solubilizatori, agensi koji poboljšavaju propuštanje (npr. masne kiseline, estri masnih kiselina, masni alkoholi i aminokiseline) i hidrofilni polimeri (npr. polikarbofil i polivinilpirolidon). U jednom tehničkom rešenju, farmaceutski prihvatljiv nosač je lipozom ili transdermalni pojačivač.

[0042] Farmaceutska formulacija opisana ovde je u obliku pogodnom za administraciju, npr. sistemsku ili lokalnu administraciju, u ćeliju ili subjektu, uključujući na primer čoveka. Pogodni oblici, delimično, zavise od primene ili puta unosa, na primer oralno, transdermalno ili injekcijom. Drugi faktori su poznati u oblasti, i uključuju razmatranja kao što su toksičnost i oblici koji sprečavaju da kompozicija ili formulacija izvrše svoj efekat.

[0043] Takođe su ovde stavljene na uvid javnosti kompozicije za čuvanje ili administraciju koje uključuju farmaceustki efikasnu količinu željenih jedinjenja u farmaceutski prihvatljivom nosaču ili razblaživaču. Prihvatljivi nosači ili razblaživači za terapijsku primenu su dobro poznati u farmaceutskoj oblasti. Na primer, konzervansi, stabilizatori, boje i agensi za podešavanje ukusa mogu biti obezbeđeni. Ovi uključuju natrijum benzoat, sorbinsku kiselinu i estre p-hidroksibenzoeve kiseline. Dodatno, mogu se koristiti antioksidansi i agensi za suspendovanje.

[0044] Farmaceutski efikasna doza je ona doza potrebna da spreči, inhibira pojavu ili leči (ublaži simptom do neke mere, poželjno sve simptome) stanje bolesti. Farmaceutski efikasna doza uglavnom zavisi od tipa bolesti, upotrebljene kompozicije, puta adminsitracije, vrste sisara koji se tretira, fizičkih karakteristika određenog sisara koji se uzima u obzir, leka koji se uzima istovremeno, i drugih faktora koje će prepoznati prosečni poznavaoci medicinskih oblasti.

[0045] Naročito, poznato je da je pored doze, raspored administracije važna determinanta efikasne negativne regulacije pomoću siRNK molekula.

[0046] Pronalazači su razvili efikasan raspored doziranja za administraciju siRNK za lečenje stanja očiju koje je okarakterisano povećanom ekspresijom i/ili aktivnošću TRPV1, naročito suvog oka i bola u oku, koji izbegava sporedne efekte i može se bezbedno administrirati. Tako, administracija molekula siRNK u kojoj navedeni molekul specifično cilja SEK ID BR: 1 i smanjuje ekspresiju TRPV1 gena kada se uvede u ćeliju prema doznim režimima opisanim ovde dovodi do kliničkog poboljšanja.

[0047] Kao što je ovde korišćeno "efikasan raspored doziranja" odnosi se na količinu siRNK dovoljnu da leči ili kontroliše poremećaj oka koji je povezan sa prekomernom ekspresijom TRPV1. Za lečenje suvog oka i/ili bola u oku kod ljudi, poželjno je smanjiti nivoe očne bolesti kako su izmereni različitim parametrima poznatim prosečnim poznavaocima bolesti, na primer korišćenjem OSDI (ocular surface index – indeks površine oka) upitnika (za suvo oko) i/ili VAS (vizuelna analogna skala) za bol u oku. Bilo koje smanjenje u ovim nivoima u

1

poređenju sa nivoima pre lečenja je povoljno, bilo da su jedinjenja isporučena sama, ili u kombinaciji sa drugim pogodnim terapeutikom. (npr., objava predviđa smanjenje u OSDI i/ili VAS veće od oko 5%, oko 10%, oko 25%, oko 30%, oko 35%, oko 40%, oko 50%, ili oko 60% od IOP pre lečenja).

[0048] Terapijski efikasna količina može se takođe odnositi na količinu siNK koja je dovoljna da odloži ili minimizira početak poremećaja oka udruženog sa suvim okom i/ili bolom u oku. Terapijski efikasna količina takođe može da se odnosi na količinu terapijskog agensa koji pruža terapeutsku korist u lečenju ili kontrolisanju poremećaja oka povezanog sa suvim okom i/ili bolom u oku. Dalje, terapijski efikasna količina koja se odnosi na siNK pronalaska označava onu količinu terapijskog agensa samog, ili u kombinaciji sa drugim terapijama, koja obezbeđuje terapijsku korist u lečenju ili kontrolisanju poremećaja oka vezanog za suvo oko i/ili bol u oku. Primenjen u vezi sa količinom siNK, termin može obuhvatiti količinu koja poboljšava sveukupnu terapiju, smanjuje ili izbegava nepoželjne efekte, ili povećava terapijsku efikasnost ili sinergizira sa drugim terapijskim agensom.

[0049] Terapijska korist u lečenju ili kontrolisanju očnog poremećaja kao što su suvo oko i/ili bol u oku je trajno smanjenje bola i/ili neželjenih senzacija. S obzirom da će siRNK smanjiti nivoe TRPV1 receptora unutar ćelije, jednom kada se tretman zaustavi ćelija mora ponovo sintetisati nove receptore pre nego što se dožive bolne senzacije. Kao takve terapije zasnovane na siRNK tretmanima će imati održiviji efekat. Ovo se smatra značajnim poboljšanjem terapijske efikasnosti.

[0050] Dodatna korist upotrebe siRNK je minimalna verovatnoća sporednih efekata ili problema akutne toksičnosti izvedenih iz njenog prisustva u sistemskoj cirkulaciji, često povezani sa različitim tretmanima na bazi kapi za oči. Ovo je zbog činjenice da kada jedinjenje ulazi u krvotok, brzo će biti degradirano pomoću RNAza prisutnih u krvi.

[0051] Sa druge strane, činjenica da se formulacija opisana ovde može ponuditi u bočicama sa pojedinačnom dozom, podrazumeva inkorporaciju antimikrobnih konzervanasa, prisutnih u većini formulacija na tržištu danas, i koji proizvode određenu netoleranciju kod nekih pacijenata, zbog čega je neophodno zaustaviti tretman. Oba pitanja su posebno važna imajući u vidu da su stanja poput suvog oka i ili bola u oku često hronična i stoga je i tretman.

[0052] Jedan od poželjnih puteva administracije je topikalni, instilacijom direktno u oko, poželjno korišćenjem kapi za oči. Kao što je opisano iznad, očekivano je da je terapijski tretman sa siRNK kiselinama usmerenim na TRPV1 iRNK korisniji od topikalnih kapi za oči u vidu malih molekula produžavanjem vremena tokom kog se opaža efekat, time dozvoljavajući manje učestalo doziranje i veću komplijansu pacijenta. Kada je siRNK administrirana direktno u oko, generalno količina od oko 0.01 mg do oko 100 mg po danu i po oku može biti administrirana. U jednom tehničkom rešenju, količina administrirana po danu i po oku je oko 0.1 mg do oko 10 mg. U još jednom tehničkom rešenju, oko 0.04 mg do 80 mg, oko 0.04 mg do oko 20 mg, oko 0.08 mg do oko 10 mg, oko 0.08 mg do oko 1.2 mg, oko 0.3 do oko 0.9 mg, ili oko 0.08 mg do oko 0.9 mg, po oku po danu siNK je administrirano.

[0053] U jednom tehničkom rešenju, doza je oko 0.5mg do oko 1.5mg. U jednom tehničkom rešenju, doza je oko 0.3 do 0.9 mg, poželjno oko 0.6 mg do oko 0.9 mg. Alternativno poželjna doza je oko 0.6 mg ili oko 0.9 mg po oku po danu.

[0054] Jedan od poželjnih puteva administracije kao što je iznad pomenuto je putem primene kapi za oči. U jednom tehničkom rešenju ove kapi za oči imaju zapreminu od između 25 i 50 mikrolitara koja sadrži datu dozu jedinjenja, poželjno između 26 i 40 mikrolitara. Poželjno, komercijalne kapaljke za oči mogu biti korišćene u finalnoj prezentaciji leka, i rezultujuća zapremina bi mogla biti između oko 30 i oko 33 mikrolitara po kapi. U dodatno poželjnom tehničkom rešenju kapi za oči su isporučene u zapremini od oko 40 µl. U dodatnom tehničkom rešenju kompozicija pronalaska sadrži siRNK kao što je ona sa SEK ID BR: 2 u prihvatljivom rastvoru kao što je fiziološki rastvor puferovan fosfatom u koncentraciji od oko 7.5 do oko 22.5 mg/ml, ili alternativno od oko 15 mg/ml do oko 22.5 mg/ml. Kompozicije pronalaska mogu da sadrže gornje koncentracije siRNK u PBS-u i opciono farmaceutski prihvatljive ekscipijense kao što je na primer benzalkonijum hlorid.

[0055] Tretman u dozama iznad može biti administriran tokom 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više dana. Poželjno, administracija je tokom 10-15 dana, najpoželjnije tokom 10 dana. Administracija može biti praćena periodom odmora, na primer periodom odmora od 7 dana pre nastavka tretmana. Alternativno, s obzirom da su suvo oko i/ili bol u oku često hronična stanja, doze mogu biti administrirane na dnevnoj bazi tokom dugog perioda rezultujući hroničnom administracijom. Prema tome, administracija se može nastaviti tokom više od 4 nedelje na dnevnoj bazi, ili alternativno, administracija se može nastaviti tokom više od 4 nedelje ali ne na dnevnoj bazi. Precizan raspored se može utvrditi u skladu sa težinom hroničnog stanja.

1

[0056] Međutim, kao što je objašnjeno iznad, mogu se takođe koristiti putevi administracije drugačiji od onog direktno u oko. Precizan raspored doziranja i administracije koji će se koristiti u formulaciji takođe će zavisiti od puta administracije, ali se gore navedene doze mogu koristiti i uglavnom količina oko 0.01 mg do oko 100 mg po danu i po oku se može administrirati. Prosečan poznavalac oblasti bi shvatio da precizan raspored doziranja i administracije koji treba da se koristi takođe zavisi od ozbiljnosti poremećaja, i trebalo bi da se odluči u skladu sa procenom osobe koja obavlja stručni posao i okolnostima svakog pacijenta. Takođe se shvata da specifični nivo doze za bilo kog posebnog subjekta zavisi od različitih faktora uključujući aktivnost specifičnog jedinjenja koje se koristi, starosti, telesne mase, opšteg zdravlja, pola, ishrane, vremena administracije, puta administracije, i brzine izlučivanja, kombinacije lekova i težine određene bolesti koja se podvrgava lečenju.

[0057] Formulacije ili siRNK opisane ovde mogu biti administrirane u jediničnim doznim formulacijama koje sadrže konvencionalne netoksične farmaceustki prihvatljive transportere, adjuvanse i/ili nosače. Formulacije mogu biti u obliku pogodnom za oralnu primenu, na primer, kao tablete, pastile, lozenge, vodene ili uljane suspenzije, disperzibilni praškovi ili granule, emulzija, tvrde ili meke kapsule, ili sirupi ili eliksiri. Kompozicije namenjene za oralnu primenu mogu se pripremiti prema bilo kojoj metodi poznatoj u oblasti za proizvodnju farmaceutskih kompozicija i takve kompozicije mogu da sadrže jedan ili više takvih zaslađivača, agenasa za podešavanje ukusa, agenasa za bojenje ili agenasa za konzerviranje kako bi se obezbedio farmaceutski elegantni i ukusni preparati. Tablete sadrže aktivni sastojak u smeši sa netoksičnim farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima koji su pogodni za proizvodnju tableta.

[0058] Ovi ekscipijensi mogu biti, na primer, inertni razblaživači; kao što su kalcijum karbonat, natrijum karbonat, laktoza, kalcijum-fosfat ili natrijum-fosfat; agensi za granulisanje i raspadanje, na primer, kukuruzni skrob, ili alginska kiselina; agensi za vezivanje, na primer skrob, želatin ili akacija; i lubrikanti, na primer magnezijum stearat, stearinska kiselina ili talk. Tablete mogu biti bez premaza ili mogu biti premazane poznatim tehnikama. U nekim slučajevima ovakvi premazi mogu biti pripremljeni poznatim tehnikama da bi se odložilo raspadanje i apsorpcija u gastrointestinalnom traktu i time obezbedilo kontinuirano dejstvo tokom dužeg perioda. Na primer, može se koristiti materijal koji omogućava vremensko odlaganje kao što je gliceril monostearat ili gliceril distearat.

1

[0059] Formulacije za oralnu primenu takođe mogu biti predstavljene kao tvrde želatinske kapsule u kojima se aktivni sastojak meša sa inertnim čvrstim razblaživačem, na primer, kalcijum karbonatom, kalcijum fosfatom ili kaolinom, ili kao meke želatinske kapsule u kojima je aktivni sastojak pomešan sa vodom ili uljanim medijumom, na primer uljem od kikirikija, tečnim parafinom ili maslinovim uljem.

[0060] Vodene suspenzije sadrže aktivne materijale u smeši sa ekscipijensima pogodnim za proizvodnju vodenih suspenzija. Takvi ekscipijensi su agensi za suspendovanje, na primer natrijum karboksimetilceluloza, metilceluloza, hidropropil-metilceluloza, natrijum alginat, polivinilpirolidon, guma tragakant i guma akacija; agensi za dispergovanje ili vlaženje mogu biti prirodni fosfatid, na primer, lecitin, ili proizvodi kondenzacije alkilen oksida sa masnim kiselinama, na primer polioksietilen stearat, ili proizvodi kondenzacije etilen oksida sa alifatičnim alkoholima dugog lanca, na primer heptadekaetilenoksicetanol, ili kondenzacioni proizvodi etilen oksida sa parcijalnim estrima izvedenim iz masnih kiselina i heksitola kao što je polioksietilen sorbitol monooleat, ili kondenzacioni proizvodi etilen oksida sa parcijalnim estrima izvedenim iz masnih kiselina i anhidrida heksitola, na primer polietilen sorbitan monooleat. Vodene suspenzije takođe mogu da sadrže jedan ili više konzervanasa, na primer etil, ili n-propil p-hidroksibenzoat, jedan ili više agenasa za bojenje, jedan ili više agenasa za podešavanje ukusa, i jedan ili više zaslađivača, kao što su saharoza ili saharin.

[0061] Uljane suspenzije mogu se formulisati suspendovanjem aktivnih sastojaka u biljnom ulju, na primer ulju kikirikija, maslinovom ulju, susamovom ulju ili kokosovom ulju, ili u mineralnom ulju kao što je tečni parafin. Uljane suspenzije mogu sadržati agens za zgušnjavanje, na primer pčelinji vosak, tvrdi parafin ili cetil alkohol. Zaslađivači i agensi za podešavanje ukusa mogu se dodati kako bi se obezbedili ukusni oralni preparati. Ove kompozicije se mogu konzervirati dodavanjem antioksidansa kao što je askorbinska kiselina.

[0062] Disperzibilni praškovi i granule pogodni za priremu vodene suspenzije dodavanjem vode obezbeđuju aktivni sastojak u smeši sa agensom za dispergovanje iili vlaženje, agensom za suspendovanje i jednim ili više konzervanasa. Pogodni agensi za dispergovanje ili vlaženje ili agensi za suspendovanje su predstavljeni kao primer pomoću onih već pomenutih iznad. Dodatni ekscipijensi, zaslađivači, agensi za podešavanje ukusa i agensi za bojenje, mogu takođe biti prisutni.

[0063] Farmaceutske kompozicije takođe mogu biti u obliku emulzija ulje-u-vodi. Uljana faza može biti biljno ulje ili mineralno ulje ili njihove smeše. Pogodni emulgatori mogu biti

1

prirodne gume, na primer guma akcija ili guma tragakant, prirodni fosfatidi, na primer soja, lecitin i estri ili parcijalni estri dobijeni iz masnih kiselina i heksitola, anhidridi, na primer sorbitan monooleat i proizvodi kondenzacije pomenutih parcijalnih estara sa etilen oksidom, na primer polioksietilen sorbitan monooleat. Emulzije mogu takođe sadržati zaslađivače i agense za podešavanje ukusa.

[0064] Sirupi i eliksiri mogu biti formulisani sa zaslađivačima, na primer glicerolom, , propilen glikolom, sorbitolom, glukozom ili saharozom. Takve formulacije mogu takođe sadržati demulcent, konzervans i agense za podešavanje ukusa i bojenje. Farmaceutske kompozicije ili siRNK opisani ovde mogu biti u obliku sterilne injektabilne vodene ili uljane suspenzije.

[0065] Ova suspenzija se može formulisati u skladu sa poznatom oblašću korišćenjem onih pogodnih agenasa za dispergovanje ili vlaženje i agenasa za suspendovanje koji su pomenuti gore.

[0066] Sterilni injektabilni preparat može takođe biti sterilni injektabilni rastvor ili suspenzija u netoksičnom parentalno prihvatljivom razblaživaču ili rastvaraču, na primer kao rastvor u 1,3-butandiolu. Među prihvatljivim nosačima i rastvaračima koji se mogu koristiti su voda, Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Pored toga, sterilna, fiksna ulja se konvencionalno koriste kao rastvarač ili medijum za suspendovanje. U tu svrhu, može se koristiti bilo koje blago fiksno ulje uključujući sintetske mono-ili digliceride. Dodatno, masne kiseline kao što je oleinska kiselina pronalaze primenu u pripremanju injekcija.

[0067] U poželjnim tehničkim rešenjima, kompozicije opisane ovde se formulišu u rastvoru, poželjno puferovanom fiziološkom rastvoru kao što je PBS, ili gelu za topikalnu administraciju u oko, kao što je,na primer, u obliku kapi za oči. U takvim tehničkim rešenjima, formulacije mogu biti katjonske emulzije i/ili sadrže biopolimere uključujući, ali bez ograničenja, poli(laktid-ko-glikolid), karbopol, hijaluronsku kiselinu i poliakrilnu kiselinu.

[0068] Molekuli nukleinske kiseline opisani ovde takođe mogu biti administrirani u obliku supozitorija, npr., za rektalnu administraciju leka. Ove kompozicije mogu biti pripremljene mešanjem leka sa odgovarajućim ne-iritirajućim ekscipijensom koji je čvrst na uobičajenim temperaturama ali tečan na rektalnoj temperaturi i stoga će se topiti u rektumu kako bi oslobodio lek. Takvi materijali uključuju kakao puter i polietilen glikole.

1

[0069] Molekuli nukleinske kiseline opisani ovde mogu da se administriraju parenteralno u sterilnom medijumu. Lek, u zavisnosti od nosača i koncentracije koji su korišćeni, može biti bilo suspendovan bilo rastvoren u nosaču. Povoljno, adjuvansi kao što su lokalni anestetici, konzervansi i agensi za puferovanje mogu se rastvoriti u nosaču.

[0070] Kao takva, dalje stavljena ovde na uvid javnosti je farmaceutska kompozicija gde navedena kompozicija sadrži barem siRNK koja cilja SEK ID BR: 1 pri specifičnom doznom rasporedu, kao što je opisano u prethodnim paragrafima.

[0071] Molekuli nukleinske kiseline opisani ovde takođe mogu biti administrirani subjektu u kombinaciji sa drugim terapijskim jedinjenjima da bi se povećao ukupni terapijski efekat. Upotreba više jedinjenja za lečenje indikacije može povećati korisne efekte dok se smanjuje prisustvo sporednih efekata.

[0072] siNK jedinjenja opisana ovde takođe mogu biti obezbeđena u kompletima koji sadrže dispenzer sa otvorom za dispenzovanje specifičnih doza siNK jedinjenja u kapljici unapred određene zapremine. U poželjnom tehničkom rešenju siNK jedinjenja su siRNK kiseline usmerene na SEK ID BR: 1. U daljem tehničkom rešenju dispenzeri u okviru kompleta obezbeđuju kompoziciju koja sadrži ili se sastoji od SEK ID BR: 2. U još jednom tehničkom rešenju komplet može da sadrži kolekciju dispenzera za jednokratnu upotrebu, na primer za upotrebu tokom jednog meseca, u ovom konkretnom slučaju, pakovanje bi sadržalo 30 dispenzera za jednokratnu upotrebu. Kapljica se može kretati u opsegu zapremine od oko 50 µl do oko 100 µl. Dispenzer može biti dispenzer za jednokratnu upotrebu i sadržati između oko 1 mg i oko 2 mg siNK jedinjenja, i opciono sadržati takođe jedan ili više farmaceutski prihvatljivih razblaživača, i opciono jedan ili više ekscipijenasa. Kompozicija sadržana u dispenzeru može takođe da sadrži koncentraciju između oko 7.5 mg/ml do oko 22.5 mg/ml siNK jedinjenja. Alternativno, dispenzer može biti dizajniran da se koristi tokom mesec dana ili više i sadržane zapremine će se povećavati shodno tome da se obezbedi ekvivalentan broj doza. Kompleti mogu takođe da sadrže uputstva koja definišu da doza siRNK jedinjenja između oko 0.3 mg i oko 0.9 mg u 1 kapljici treba da se primeni u svako oko. Uputstva mogu dalje definisati da se kapljice primenjuju u svako oko jednom dnevno, dva puta dnevno, tri puta dnevno, ili četiri puta dnevno, i da se aplikacija u svako oko vrši svakodnevno, svaki drugi dan, jednom nedeljno, dva puta nedeljno, tri puta nedeljno, svake druge nedelje ili jednom mesečno.

[0073] Pronalazak je dalje opisan u sledećim ne-ograničavajućim primerima.

1

PRIMERI

In vitro analiza

[0074] Da bi se našla posebno efikasna ciljna sekvenca za siRNK kiseline da se utiša TRPV1 (čime se postiže značajna inhibicija genske ekspresije), šest različitih siRNK kiselina su testirane. Ove siRNK kiseline su opisane kao SEK ID BR: 2, SEK ID BR: 7 i SEK ID BR: 17 do 20.

SEK ID BR: 7 (5'-UCGCCACGACAUGCUCUUGdTdT-3') odgovara klasičnom siRNK molekulu (21 nukleotid u dužini koji sadrži 3' “overhangs” načinjen od dezoksitimidina) prethodno opisanom u WO 2007/045930 da efikasno cilja TRPV1 i smanjuje odgovor oka na stimuluse kapsaicina. SEK ID BR: 17 do 19 odgovara siRNK kiselinama dizajniranim za TRPV1 u skladu sa različitim algoritmima koji su dostupni u oblasti kao što su oni koje su opisali Reynolds et al. 2004 ili Ui-Tei et al 2004, i drugi. SEK ID BR: 20 je komercijalno dostupna siRNK obezbeđena od strane Ambion i dizajnirana za TRPV1.

[0075] Kao model za testiranje efikasnosti gore opisane siRNK, korišćene su ćelijske kulture HeLa (humanog adenokarcinoma grlića materice). HeLa ćelije su transfektovane sa 100nM različitih jedinjenja i Lipofektaminom 2000 kao agensom za transfekciju. Sve transfekcije su

2

izvedene praćenjem standardnih uslova proizvođača. U istoj transfekciji kao kontrola je korišćena različita skremblovana siRNK. Ćelijski peleti su sakupljeni na 24, 48 i 72 časa da bi se procenile moguće varijacije u nivoima proteina i obrađeni pomoću PCR u realnom vremenu. Da bi se kvantifikovali rezultati dobijeni pomoću Qrt-PCR u realnom vremenu, koristili smo metodu komparacije praga.

[0076] Kao što pokazuju rezultati (slika 1), siRNK usmerena na ciljnu sekvencu SEK ID BR: 1, je mnogo efikasnija u pogledu TRPV1 genskog utišavanja od prethodno opisanih proizvoda siRNK usmerenih na različiti region istog gena. Povrh toga, ovaj efekat se održava u vremenu, pošto je 72 sata posle transfekcije još uvek značajna negativna regulacija iRNK nivoa. Ovo trajanje efekta je nepredvidljivo i specifično je za sekvencu.

[0077] U cilju pružanja dodatnih poboljšanih proizvoda, uvedene su različite hemijske modifikacije na gore navedeni proizvod, u skladu sa opisom ispod:

[0079] Gde su neki ili svi uracil nukleotidi supstituisani dezoksimetidinskim nukleotidima.

[0080] Ova jedinjenja su testirana u testovima imunogenosti zajedno sa SEK ID BR: 2 (isto jedinjenje bez ikakvih modifikovanih nukleotida). Rezultati su pokazali da su sva ova jedinjenja značajno smanjila indukciju imunološkog odgovora u mononuklearnim ćelijama periferne krvi. Pored toga, većina jedinjenja indukovala je odgovor koji je bio na svojim najvišim nivoima, nizak kao onaj proizveden pomoću siRNK kiselina koje su napredovale kroz kliničke studije na ljudima (bevasiranib i Sirna-027) koje su bile uključene u testove kao kontrola.

[0081] Kako varirajući stepeni modifikacija mogu menjati sposobnost genskog utišavanja siRNK kiselina, ova jedinjenja su dalje testirana za njihov kapacitet RNK interferencije pomoću transfekcije u HeLa ćelije, i rezultujući TRPV1 iRNK nivoi su izmereni u skladu sa metodom koja je opisana u prethodnim paragrafima.

[0082] Kao što se može videti na slici 2, sva jedinjenja zadržavaju sposobnost da efikasno smanje TRPV1 iRNK nivoe u varirajućim stepenima.

[0083] Dalji neočekivani korisni efekat izveden iz prethodno opisanih jedinjenja je njihova povećana otpornost na degradaciju pomoću RNaza, što se može videti na Slici 5.

[0084] Za ove eksperimente, jedinjenja su suspendovana u 10% humanoj plazmi u PBS-u u finalnoj koncentraciji od 2 µM i inkubirana tokom 24 sata na 37°C. Uzorci su zatim analizirani korišćenjem HPLC-UV i određena je količina preostalog inataktnog proizvoda. Kao što se može primetiti na slici 5, dvolančano jedinjenje sa 19 nukleotida sa SEK ID BR: 2 (bez bilo kakve hemijske modifikacije) je skoro 3 puta otpornije na degradaciju od prethodno opisane SEK ID BR: 21: 5'-CAAGAUCGCACAGGAGAGCdTdT-3' (takođe opisana u WO 2007045930) koja sadrži 3' “overhangs”. Ovaj efekat je dodatno poboljšan za jedinjenje sa SEK ID BR: 3, koje uključuje neke hemijski modifikovane nukleotide kao što je opisano u prethodnim paragrafima.

In vivo analiza

[0085] Animalni modeli suvog oka i bola u oku često koriste zečeve, u ovom slučaju novozelandske bele (New Zealand White) zečeve. U tom smislu, dodatna prednost siRNK kiselina predmetnog pronalaska je u tome što je ciljna sekvenca, SEK ID BR: 1, visoko konzerviran region TRPV1 gena, kroz različite sekvence životinja. Zapravo, ova sekvenca je identična između čoveka i zeca, čineći ovaj životinjski model posebno pogodnim za proučavanje navedenih bolesti.

[0086] Eksperiment koji je opisan ispod izveden je korišćenjem standardnog modela bola u oku koji je poznat prosečnom poznavaocu oblasti (Gonzalez et al., 1993). Ukratko, bol je indukovan korišćenjem instilacije 30µl rastvora 1% kapsaicina (poznatog agonista TRPV1) u oko pomoću odgovarajuće mikropipete. Zbog etičkih razmatranja, životinje koje treba da se tretiraju sa kapsaicinom ranije su primale dozu kapsazepina 5mM, poznatog antagonista kapsaicina, ili 40 µl rastvora koji sadrži jedinjenje koje se testira. Stoga analgetski efekat se meri u poređenju sa kapsazepinom kao referentnim tretmanom.

2

[0087] Test i referentne stavke se instiliraju jednom dnevno od Dana 1 do Dana 3 i dva puta dnevno na Dan 4 (tempo od 60 minuta) u desne oči. Na Dan 4, 15 minuta nakon poslednje instilacije, kornealni bol je indukovan u desnom oku životinja jednom instilacijom 1% kapsaicina. U kontralateralno oko je instiliran PBS tokom studije i služilo je kao kontrola.

[0088] Da bi se izmerio odgovor na bol, izmereno je palpebralno otvaranje. Smatra se da je oko zatvoreno u odgovoru na bol, i kako bolne senzacije opadnu, palpebralno otvaranje će se povećati natrag na normalne nivoe. Palperbalno otvaranje je izmereno pre tretmana (osnovna vrednost), neposredno pre indukcije bola, i zatim 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, minuta nakon indukcije bola.

[0089] Kao što se može videti sa slika 3 i 4, testirano je jedinjenje, posebno jedinjenje sa SEK ID BR: 2, i primećeno je da indukuje veći analgetski efekat od kapsazepina (oporavak oka kao što je izmereno stepenom palpebralnog otvaranja). Stoga je dokazano da je ovo jedinjenje efikasan terapijski tretman za nelagodnost u oku.

[0090] Osim toga, izveden je još jedan in vivo eksperiment u kome su jedinjenja (SEK ID BR: 2, SEK ID BR: 4 i SEK ID BR: 5) administrirana u oči zečeva, zajedno sa SEK ID BR: 21, prethodno opisanom u WO 2007045930

U ovom slučaju, zečevi (6 životinja po grupi koja se tretira) su dobijali dnevnu administraciju jedinjenja tokom 3 uzastopna dana. Trećeg dana, dva sata posle poslednje instilacije, životinje su žrtvovane. Očna tkiva ovih zečeva su oporavljena i prisustvo TRPV1 specifične iRNK je analizirano korišćenjem RT-PCR. U sledećoj tabeli (Tabela 1) prikazani su nivoi utišavanja TRPV1 gena postignuti u datom tkivu izraženi kao odnos % inhibicije postignute sa SEK ID BR: 21 referentnog jedinjenja.

Tabela. 1

[0091] Kao što je jasno iz ovih rezultata, jedinjenja su mnogo efikasnija od prethodno opisanih jedinjenja kada se utišava TRPV1 genska ekspresija u očnim tkivima.

Veća efikasnost, zajedno sa dugotrajnijim efektom jedinjenja, trebalo bi da obezbede povoljne režime doziranja, jer omogućavanje više vremena između doza značajno bi poboljšalo kvalitet života pacijenta.

[0092] Još jedan eksperiment je izveden kako bi se procenila tkivna distribucija i izloženost u plazmi kod novozelandskih belih zečeva nakon administracije u oko SEK ID BR: 2 u PBS-u. Korišćeni materijali i metode su navedeni u tabeli koja sledi (Tabela 2).

Tabela 2. Materijali i metode za procenu tkivne distribucije i izloženosti u plazmi kod novozelandskih belih zečeva nakon administracije u oko SEK ID BR: 2 u PBS-u

[0093] Svi proračuni su izvršeni korišćenjem molekulske mase natrijumove soli za SEK ID BR: 2. Izračunavanje koncentracija za SEK ID BR: 2 izvršeno je na tri različita načina:

2

1. Na osnovu površine ispod pika intaktnog ne-metabolisanog antisens lanca od SEK ID BR: 2 (izvorno jedinjenje). Ova vrednost je marker za količinu izvornog jedinjenja koje je nepromenjeno u tkivu.

2. Na osnovu površine ispod pika intaktnog 5'-fosforilisanog antisens lanca od SEK ID BR: 2. Ova vrednost je marker za količinu izvornog jedinjenja koje je prisutno u citoplazmatskom odeljku i aktivirano je pomoću 5'-fosforilacije.

3. Na osnovu ukupne površine ispod pika. Ova vrednost sumira sve intaktne i metabolisane SEK ID BR: 2 koje su prisutne u uzorku.

[0094] Uzorci jetre, bubrežnog korteksa i srži, pluća, cilijarnog tela, retine, irisa, suzne žlezde, rožnjače, vodenog i staklenog humora, gangliona, plazme i urina su sakupljeni 5 i 30 minuta nakon doziranja. Nakon jedne okularne administracije SEK ID BR: 2 zečevima (n = 6) rezultati su pokazali:

• Sistemska izloženost SEK ID BR: 2 je detektovana u plazmi i sistemskim tkivnim uzorcima 5 i 30 minuta nakon doziranja u oko u koncentracijama ispod 1 ng/g (videti Tabelu 3).

Tabela 3. Srednje koncentracije za izvorno jedinjenje SEK ID BR: 2 nakon okularne administracije zečevima.

2

• SEK ID BR: 2 bi mogla biti detektovana u svim tkivima i tečnostima oka 5 minuta nakon doziranja i pri vrlo smanjenim koncentracijama 30 minuta nakon doziranja (videti Tabelu 4).

Tabela 4. Srednje koncentracije za izvorno jedinjenje SEK ID BR: 2 nakon okularne administracije zečevima.

• U retini, irisu, cilijarnom telu i suznoj žlezdi, 5'-fosforilisani antisens-(as) lanac je detektovan 5 i 30 minuta nakon doziranja ukazujući na citoplazmatsku isporuku siRNK u ovim tkivima (aktivirana siRNK u ciljnom ćelijskom odeljku) (videti Sliku 6).

[0095] Ovi podaci pokazuju da nakon okularne administracije SEK ID BR: 2, životinje pokazuju aktiviranu SEK ID BR: 2 distribuiranu u sva očna tkiva koja se može detektovati 5 minuta nakon doziranja.

Analiza kod ljudi

[0096] U početku je očna tolerancija jedinjenju u skladu sa SEK ID BR: 2 procenjena kod 30 zdravih odraslih osoba.

2

Studija je organizovana u dva dela. Tokom prvog dela izvršena je inicijalna evaluacija bezbednosti korišćenjem pojedinačne doze ispitivanog proizvoda, nakon čega sledi drugi deo sa administracijom više doza.

Deo 1, pojedinačna doza: kontrolisan bez intervencije, i randomizacije oka koje prima administraciju. Svaki volonter je bio njegova/njena sopstvena kontrola, s obzirom na to da je proizvod koji se testira administriran u samo jedno oko dok drugo oko nije primilo nikakvu intervenciju, međutim testovi procene bezbednosti su sprovedeni. Oftalmolog koji je napravio procenu bezbednosti nije znao za administraciju leka. Apsorpcija proizvoda u krvotok je određena.

Deo 2, više-doza: Otvoren, paralelan i kontrolisan. Tretirano oko je randomizovano. Procenjivaču nije bilo poznato mesto administracije ispitivanog proizvoda. Oba, i oko pre administracije leka i drugo oko, su uzeta u obzir kao kontrole. Tokom ove faze, procenjena je lokalna i sistemska bezbednost, pored apsorpcije i, gde je prikladno, farmakokinetika ispitivanog proizvoda.

Druga faza je započela kada su evaluirani bezbednost i farmakokinetika prve faze. Rezultati za prvu fazu uspostavili su potrebu da se nastavi farmakokinetička procena tokom druge faze.

[0097] 30 odraslih osoba je raspoređeno u različte grupe koje se tretiraju i primale su ili jednu kap u oko od 26.6 µl koja sadrži 600 µg doze jedinjenja u jedno oko (deo 1), ili dnevnu dozu tokom jedne nedelje od 600 ili 900 µg jedinjenja po oku (deo 2), administriranu u zapremini od 26.6 µl ili 40 µl, redom. Deo 1 ima 6 volontera i deo 2 ima 24 volontera, podeljenih u dve kohorte sa različitim doznim nivoom primenjenim u svakoj polovini grupe. Deo 1 obuhvata pojedinačnu dozu i deo 2 obuhvata ukupno 7 doza (jedna administracija po danu).

[0098] Procena lokalne tolerancije bazirana je na učestalosti promena (lokalnih neželjenih efekata) detektovanih na površini oka tokom istraživanja obavljenih 24 sata nakon administracije poslednje doze u Delu 2 i 72 sata nakon instilacije pojedinačne doze u delu 1. Dobra tolerancija je definisana kao odsustvo toksičnosti stepena 3 ili višeg, na CTCAEv3 skali (Common Terminology Criteria for Adverse Events - Zajednički terminološki kriterijumi za neželjene događaje).

[0099] Hi kvadrat test je korišćen da se odredi odnos između lokalnih neželjenih efekata i leka, uzimajući u obzir da li su se pojavili ili ne simptomi ili lokalni znaci u svakom oku (bez obzira na broj simptoma), u odnosu na tretman. Analiza je uzimala u obzir prisustvo neželjenog efekta u svakom oku, ako se najmanje jedan desio (videti Tabelu 5).

2

Tabela 5. Analiza lokalnih neželjenih efekata u očima, u odnosu na administraciju leka.

[0100] Što se tiče razvoja lokalnih promena (lokalnih neželjenih efekata), nisu primećene razlike između tretiranog oka i netretiranog oka, dobijanjem Pirsonovog Hi Kvadrata od 1.002 (p=0.317).

[0101] U bilo kom delu studije nisu primećene nikakve promene površine oka povezane sa lekom; stoga je lokalna tolerancija bila izvrsna kada je administriran u jednoj ili više doza do sedam dana u vidu kapi za oči.

[0102] Dodatni cilj ove studije bio je da se proceni sistemska tolerancija na jedinjenje, praćenjem posledica na analitičke parametre, na fizički pregled, vitalne znake i elektrokardiogram nakon tretmana.

2

[0103] Analize krvi i urina su izvedene tokom procesa selekcije, pre administracije leka, pri finalnom pregledu, u danima nakon finalne administracije SEK ID BR: 2. Studija je napravljena od varijacija u analitičkim parametrima između perioda selekcije i finalnog pregleda, korišćenjem Studentovog t testa za povezane podatke. Tabela koja sledi pokazuje srednju vrednost, standardnu devijaciju i statističku značajnost razlike između pomenutih parametara (videti Tabelu 6).

Tabela 6: Varijacija u analitičkim parametrima između selekcionog pregleda i finalnog pregleda.

[0104] Razlike su primećene kod nekih parametara između selekcionog pregleda i finalnog pregleda, međutim sve vrednosti su smatrane normalnim, bez kliničkog značaja.

[0105] Kao što je gore navedeno, tokom studije, vitalni znaci (krvni pritisak i srčana frekvencija) su uzeti u obzir tokom selekcije, i u različitim vremenima tokom faze tretmana i na finalnom pregledu (videti Tabele 7 i 8).

[0106] Srednje vrednosti za dostizanje vremena merenja i statistička analiza ANOVA sa ponovljenim merenjima na šest volontera koji učestvuju u delu 1, je prikazana ispod (videti Tabelu 7).

Tabela 7: Vitalni znaci tokom dela 1 studije. n=6.

1

2

[0107] Vitalni znaci u delu 2 su izmereni na pregledu obavljenom na dan 1 i na jednom obavljenom na dan 7, pre i jedan sat nakon administracije prve i poslednje doze ispitivanog medicinskog proizvoda. Vitalni znaci su takođe izmereni tokom selekcionog pregleda i finalnog pregleda. Uzimajući selekcione vrednosti kao osnovu vrednost, promena vitalnih znaka je procenjena za 24 volontera tokom studije, tokom dela 2, korišćenjem ANOVA sa ponovljenim merenjima (videti Tabelu 8).

Tabela 8: Vitalni znaci tokom drugog dela studije. n=24.

4

[0108] Elektrokardiogram je urađen u selekcionom pregledu i dodatni elektrokariodgram na finalnom pregledu. Poređenje je napravljeno između selekcionih i finalnih pregleda, korišćenjem Studentovog t testa za povezane uzorke. Sledeća tabela sumira srednju vrednost i standardnu devijaciju za svaki parametar i rezultat analize (videti Tabelu 9).

Tabela 9: Elektrokardiogram: Poređenje između selekcionih i finalnih pregleda

[0109] Statistički značajne promene su primećene u nekim merenjima krvnog pritiska u Tabeli 7 i 8 i nekim od merenja srčane frekvence u Tabeli 9, iako su se sve vrednosti javljale u normalnim granicama, i stoga ove razlike nisu klinički značajne.

[0110] Sistemska tolerancija je bila dobra, bez promena u analizama krvi i urina, elektrokardiogramu ili u pregledu urađenom tokom finalne procene.

[0111] Analiza krvi je izvedena da se odrede koncentracije SEK ID BR: 2 u uzorcima plazme koji su dobijeni nakon administracije leka. Tokom prvog dela, uzimanje uzorka je izvedeno tokom 4 sata nakon administracije, sa krvlju koja se ekstrahuje na 5, 15, 30 minuta i 4 sata nakon administracije proizvoda. Tokom drugog dela uzorci krvi su sakupljeni 5 minuta nakon administracije na dan 1, i ponovo na dan 7 oba pre administracije jedinjenja i takođe 5 minuta nakon administracije proizvoda.

[0112] Farmakokinetički profil ne bi mogao biti određen ni u jednom periodu, jer jedinjenje nije detektovano putem validirane bioanalitičke metode (LLOQ: 10 ng/mL) u ni jednom od sakupljenih uzoraka krvi. Odsustvo detektabilnih količina jedinjenja u krvi je u skladu sa očekivanom brzom degradacijom RNK nakon ulaska u krvotok zbog prisustva RNAza.

[0113] Sve ove činjenice podržavaju zaključak da SEK ID BR: 2 pokazuje dobru toleranciju u oftalmološkom rastvoru kod zdravih ljudi.

[0114] S obzirom na pozitivne rezultate dobijene u animalnim modelima i odsustvo toksičnosti kod zdravih ljudi, jedinjenja se zatim testiraju kod pacijenata koji pate od bola u oku i suvog oka.

Subjekti

[0115] Šezdeset odraslih pacijenata kojima je dijagnostikovan blag do umeren bol u oku i sindrom suvog oka je angažovano. Od takvih, polovina je bila preko 65 godina starosti. Nivoi bolesti oka su utvrđeni korišćenjem upitnika OSDI© (indeks bolesti površine oka) razvijenog od strane Allergan Inc. i procene VAS (vizuelna analogna skala). Inkluzioni kriterijum su bili skor od 13-30 u OSDI© za suvo oko i skor od 2 do 7 VAS za bol. Sveobuhvatni fizički pregled i pregled očiju se izvode pre ulaska u studiju kako bi se osigurala podobnost subjekata za učešće u studiji.

Dizajn studije

[0116] Paralelna, placebo kontrolisana, duplo-maskirana studija je dizajnira da se procene analgetski efekat i podnošljivost jedinjenja sa SEK ID BR: 2 administriranog dnevno u vidu kapi za oči tokom 10 dana lečenja.

Sekundarni ciljevi su procena lokalne podnošljivosti nakon svake doze, sistemske podnošljivosti (efekat na laboratorijske parametre, fizički pregled i vitalne znake), i promena (ako postoje) u oštrini vida, intraokularnom pritisku, Širmerovom testu i vremenu prekidanja suznog filma, moguće povezanih sa ispitivanim proizvodom.

[0116] U svim slučajevima, lek ili placebo je instiliran u oba oka. Oba oka se nadgledaju na „slep“ način.

Početni period

[0118] Do 15 dana pre prve administracije ispitivanog proizvoda subjekti su prihvaćeni kao kvalifikovani da učestvuju u Periodu lečenja kliničke studije.

Period lečenja

[0119] Na Dan 1 subjekti su randomizovani za jedinjenje ili placebo u odnosu od 2:1 administriranim topikalno u oko, u vidu kapi za oči. Subjekti primaju finalnu zapreminu od 40 µl jedinjenja ili nosača (placebo) po oku. Doza koja je administrirana je 900 µg jedinjenja po oku.

[0120] Subjekti se vraćaju svaki dan (uključujući i praznike i vikende) na lokaciju radi administracije ispitivanog proizvoda i procena. Subjekti primaju 1 dozu jedinjenja jednom dnevno u oba oka tokom 10 dana.

[0121] Na dan 10 pacijenti ponovo prolaze kroz temeljno ispitivanje ekvivalentno onom koje je izvedeno na početku.

Kontrola

[0122] Finalna procena je izvršena tokom kontrole koja je obično 14 do 20 dana nakon prve administracije (od 4 do 10 dana nakon poslednje administracije) da se odrede promene kod pacijenata nakon završetka perioda lečenja.

[0123] Da bi se odredio efekat SEK ID BR: 2 na nivo suvog oka i bola u oku pacijenata, svaki pojedinačni skor za OSDI© i VAS je zabeležen dan pre početka lečenja, i upoređen sa onim od dana 10. Rezultat je izmeren specifično u promenama u srednjem skoru koji se dobija iz OSDI© upitnika, i promenama u srednjem intenzitetu iz VAS procene.

[0124] Takođe, rezultati očnih istraživanja izvedenih pre započinjanja lečenja i nakon 10 dana se upoređuju da se potvrdi tolerancija.

Rezultati

[0125] OSDI© upitnik je procenjen na skali od 0 do 100, sa višim skorovima koji predstavljaju veću nesposobnost. Indeks pokazuje osetljivost i specifičnost u razlikovanju između normalnih subjekata i pacijenata sa bolešću suvog oka. OSDl© se sastoji od dvanaest pitanja i dizajniran je da obezbedi brzu indikaciju simptoma koji su u skladu sa bolešću suvog oka. OSDI© je validan i pouzdan instrument za merenje ozbiljnosti bolesti suvog oka (normalna, blaga do umerena i teška) i prihvaćen je od strane Administracije za hranu i lekove za korišćenje u kliničkim ispitivanjima. Validnost i pouzdanost OSDI© su procenjeni i utvrđeno je da obezbeđuje dobru do odličnu pouzdanost, validnost, osetljivost i specifičnost za suve oči. Procenjen celokupni OSDI© skor je definisao površinu oka kao normalnu (0-12 poena) ili kao da postoji blaga (13-22 poena), umerena (23-32 poena) ili teška (33-100 poena) bolest.

Tabela 10: OSDI© za suvo oko. n=23. V0 odgovara OSDI© dan pre započinjanja lečenja, i VD10 odgovara OSDI© na dan 10. Rezultat i % pokazuje promene u srednjem skoru na nivo suvog oka pacijenata.

[0126] Upitnik o bolu VAS je unidimenzionalna mera intenziteta bola, koja je široko korišćena u raznolikoj populaciji odraslih ljudi. VAS meri bol koji koji se kreće preko kontinuuma vrednosti i ne može lako biti direktno izmeren, kao bol u oku. Za intenzitet bola u VAS, skala je najčešće uspostavljena pomoću „bez bola“ (skor od 0) i „najgori bol koji se može zamisliti" (skor od 10).

Tabela 11: VAS za bol u oku. n=23. V0 odgovara VAS dan pre započinjanja lečenja, i VD10 odgovara VAS na dan 10. % pokazuje promene u srednjem skoru na nivo bola u oku pacijenata na desnom i levom oku.

4

Zaključci

[0127] Uzimajući u obzir odnos jedinjenje:placebo od 2:1 iz kliničke studije, i da se ovaj odnos održava nezavisno od broja analiziranih pacijenata, može se zaključiti da je efekat od SEK ID BR: 2 primenjenog dnevno pacijentu, sposoban da smanji težinu bolesti suvog oka i smanji bol u oku kada se administrira topikalno u oko.

REFERENCE

[0128]

Baumann TK & Martenson ME. (2000). "Extracellular protons both increase the activity and reduce the conductance of capsaicin-gated channels." J Neurosci 20:RC80.

Caterina et al. (1997). "The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway." Nature 389(6653):816-24.

Caterina et al. (2001). "The vanilloid receptor: a molecular gateway to the pain pathway." Annu Rev Neurosci.24:487-517.

Cerutti, L., N. Mian, et al. (2000). "Domains in gene silencing and cell differentiation proteins: the novel PAZ domain and redefinition of the Piwi domain." Trends Biochem Sci 25(10): 481-2.

Collins, R. E. and X. Cheng (2005). "Structural domains in RNAi." FEBS Lett 579(26): 5841-9.

Doench, J.G. Sharp, P.A. "specificity of microRNA target selection in translational repression" Genes Dev.18, 504-511; 2004

Elbashir, S. M., W. Lendeckel, et al. (2001). "RNA interference is mediated by 21-and 22-nucleotide RNAs." Genes Dev 15(2): 188-200.

Fire, A., S. Xu, et al. (1998). "Potent and specific genetic interference by doublestranded RNA in Caenorhabditis elegans." Nature 391 (6669): 806-11.

Gonzalez, G. G., Garcia, P. et al. (1993). "Reduction of capsacin-induced ocular pain and neurogenic inflammation by calcium antagonists." Invest Ophthalmol Vis Sci 34(12):3329-3335.

Hutvagner, G. and P. D. Zamore (2002). "A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex." Science 297(5589): 2056-60.

Jia et al. (2005). "TRPV1 receptor: a target for the treatment of pain, cough, airway disease and urinary incontinence." Drug News Perspect 18(3):165-71.

Lewis, B.P., Shih I. Et al. "prediction of mammalian micro RNA targets" Cell 115:787-798;2003

Liu, J., M. A. Carmell, et al. (2004). "Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi." Science 305(5689): 1437-41.

Ma, J. B., Y. R. Yuan, et al. (2005). "Structural basis for 5'-end-specific recognition of guide RNA by the A. fulgidus Piwi protein." Nature 434(7033): 666-70.

Montell et al. (2002). "Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells." Genes Dev 16(8):948-58.

Nykanen, A., B. Haley, et al. (2001). "ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway." Cell 107(3): 309-21.

Orban, T. I. and E. Izaurralde (2005). "Decay of mRNAs targeted by RISC requires XRN1, the Ski complex, and the exosome." Rna 11(4): 459-69.

Parrish, S., J. Fleenor, et al. (2000). "Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference." Mol Cell 6(5): 1077-87.

Rand, T. A., S. Petersen, et al. (2005). "Argonaute2 cleaves the anti-guide strand of siRNA during RISC activation." Cell 123(4): 621-9.

Reynolds, A., Leake, D., et al. (2004). "Rational siRNA design for RNA interference " Nat Biotechnol 22(3):326-30.

Schubert, S. et al. (2005). "Local RNA target structure influences siRNA efficacy: systematic analysis of intentionally designed binding regions." J Mol Biol 348:883-893.

Song, J. J., S. K. Smith, et al. (2004). "Crystal structure of Argonaute and its implications for RISC slicer activity." Science 305(5689): 1434-7.

Ui-Tei, K., Naito, Y., et al. (2004). "Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference." Nucleic Acids Res 32(3): 936-48.

4

Claims (8)

Patentni zahtevi

1. siRNK usmerena na SEK ID BR: 1 za primenu u lečenju suvog oka i/ili bola u oku gde je siRNK administrirana u dozi od oko 0.3 do oko 0.9 mg po danu.

2. siRNK za primenu prema patentnom zahtevu 1 gde je siRNK administrirana u dozi od oko 0.6 mg ili oko 0.9 mg po oku po danu.

3. siRNK za primenu prema prethodnom patentnom zahtevu gde pomenuta siRNK je administrirana tokom 5-15 dana.

4. siRNK za primenu prema prethodnom patentnom zahtevu gde pomenuta siRNK je administrirana tokom 10 dana.

5. siRNK za primenu prema prethodnom patentnom zahtevu gde pomenuta siRNK je administrirana hronično.

6. siRNK za primenu prema prethodnom patentnom zahtevu gde pomenuta siRNK je jedinjenje definisano kao SEK ID BR: 2.

7. siRNK za primenu prema prethodnom patentnom zahtevu gde pomenuta siRNK je administrirana topikalno na oko.

8. Medicinski komplet za lečenje suvog oka i/ili bola u oku koji sadrži količinu siRNK usmerenu na SEK ID BR: 1, dispenzer sa otvorom za dispenzovanje doze od oko 0.3 do oko 0.9 mg siRNK u kapljici unapred određene zapremine, i štampane instrukcije za administriranje siRNK usmerene na SEK ID BR:1 u skladu sa patentnim zahtevima 1 do 7 u dozi od oko 0.3 do oko 0.9 mg za dnevnu administraciju.