JP2015529210A - 眼の状態を処置および／または防止するためのｓｉＲＮＡならびに方法および組成物におけるそれらの使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、バニロイド１型受容体（ＴＲＰＶ）の高レベルの発現および／または活性と関連する眼の状態を処置および／または防止するための方法および組成物に関する。

Description

本発明は、一過性受容体電位バニロイド１型（ＴＲＰＶ１：ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｖａｎｉｌｌｏｉｄ １）の高レベルの発現および／または活性と関連する眼の状態をＲＮＡ干渉を使用して処置および／または防止するためのｓｉＲＮＡ生成物ならびに方法および組成物におけるそれらの使用の提供に関する。とりわけ、屈折矯正手術後の角膜の不快感および感受性の変化、コンタクトレンズの使用、ドライアイ症候群、およびシェーグレン症候群など、眼痛と関連する眼の状態を緩和するものとする。

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ：ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）とは、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ：ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ）分子を使用して相同性依存型遺伝子サイレンシングを指示する、ほとんどの真核細胞の自然に起こる調節メカニズムである。２００６年に、ＦｉｒｅおよびＭｅｌｌｏによる蠕虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるその発見（Ｆｉｒｅ、１９９８）に対してノーベル賞が授与された。その最初の発表のすぐ後、哺乳動物細胞において、長鎖のｄｓＲＮＡを介してではなく２１個のヌクレオチド長の低分子二本鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）によってもＲＮＡｉが生じることが示された。（Ｅｌｂａｓｈｉｒ、２００１）。

ＲＮＡ干渉の過程は、外来遺伝子の発現を防止するために使用される進化上保存された細胞防御メカニズムであると考えられており、様々な動物系統および微生物叢で共有されており、転写後遺伝子サイレンシングと呼ばれている。ＲＮＡｉメカニズムの発見以降、低分子またはタンパク質を使用する従来の薬学的手法では「新薬開発の見込みのない」とされた標的を取り扱うことによって、ヒト疾患を処置する新たな方途として遺伝子発現を選択的に変化させうる新たな化合物を見出す研究が爆発的になされている。

最新の知見によれば、ＲＮＡｉのメカニズムは、長鎖二本鎖ＲＮＡが、ダイサーとして公知のＲＮアーゼＩＩＩ様タンパク質によりプロセシングされるときに誘発される。タンパク質であるダイサーは典型的に、Ｎ末端ＲＮＡヘリカーゼドメイン、ＲＮＡ結合性のいわゆるＰＡＺ（Ｐｉｗｉ／アルゴノート（Ａｒｇｏｎａｕｔｅ）／Ｚｗｉｌｌｅ）ドメイン、２つのＲＮアーゼＩＩＩドメイン、および二本鎖ＲＮＡ結合性ドメイン（ｄｓＲＢＤ）（Ｃｏｌｌｉｎｓ、２００５）を含有し、その活性は、長鎖二本鎖ＲＮＡの、２塩基の３’オーバーハングならびに５’側リン酸基および３’側ヒドロキシル基を含む２１〜２４個のヌクレオチドの二本鎖ｓｉＲＮＡへのプロセシングをもたらす。次いで、結果として得られるｓｉＲＮＡ二重鎖は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ：ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）として公知のエフェクター複合体に組み込まれ、そこでＲＮＡヘリカーゼ活性により（Ｎｙｋａｎｅｎ、２００１）二本鎖ｓｉＲＮＡ分子がアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）依存的に巻き戻されると、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖またはガイド鎖が、標的ｍＲＮＡ配列を認識および切断するようにＲＩＳＣを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ、２００１）。ｍＲＮＡの分解をもたらすＲＩＳＣの触媒活性は、エンドヌクレアーゼであるアルゴノート２（ＡＧＯ２）により媒介される（Ｌｉｕ、２００４；Ｓｏｎｇ、２００４）。ＡＧＯ２は、高度に保存されたアルゴノートファミリーのタンパク質に属する。アルゴノートタンパク質は、２つの共通ドメイン、すなわちＰＩＷＩドメインおよびＰＡＺドメインを含有する約１００ＫＤａの塩基性の強いタンパク質である（Ｃｅｒｕｔｔｉ、２０００）。ＰＩＷＩドメインはダイサーとの相互作用に極めて重要であり、ｍＲＮＡの切断の一因となるヌクレアーゼ活性を含有する（Ｓｏｎｇ、２００４）。ＡＧＯ２は、ｓｉＲＮＡ二重鎖の一方の鎖をガイドとして使用して相補配列を含有するメッセンジャーＲＮＡを探し出し、ガイド鎖の５’末端に対応する１０〜１１塩基のホスホジエステル骨格を切断する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ、２００１）。ＲＩＳＣの活性化における重要なステップは、ＡＧＯ２によりセンス鎖またはパッセンジャー鎖を切断してこの鎖を複合体から除去することである（Ｒａｎｄ、２００５）。結晶構造解析研究により、ｓｉＲＮＡガイド鎖とＰＩＷＩドメインとの間の相互作用が解析され、ＲＩＳＣによる標的ｍＲＮＡの認識を指示する「シード配列」を構成するのはわずか２〜８個のヌクレオチドであり、この配列内の単一のヌクレオチドのミスマッチでも分子のサイレンシング能に強烈な影響を及ぼす可能性があることが明らかにされている（Ｍａ、２００５；Ｄｏｅｎｃｈ、２００４；Ｌｅｗｉｓ、２００３）。ｍＲＮＡが切断されると、断片内の保護されていないＲＮＡ末端の存在のためにｍＲＮＡが細胞内ヌクレアーゼによりさらに切断および分解され、タンパク質に翻訳されなくなるが（Ｏｒｂａｎ、２００５）、ＲＩＳＣは後続のラウンドのために再利用される（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ、２００２）。これが、特異的なｍＲＮＡ分子とそれに対応するタンパク質とを選択的に低減させる触媒過程を構成する。ｓｉＲＮＡエフェクターを細胞または組織へと直接送達し、そこでＲＩＳＣを活性化させ、標的化されたｍＲＮＡの強力かつ特異的なサイレンシングをもたらすことにより、選択されたいずれかの遺伝子（複数可）を調節する目的で、この天然の遺伝子サイレンシングに関するメカニズムを利用することが可能である。

ｓｉＲＮＡの理想的な特色は、長さ、構造、化学組成、および配列に関して最大の有効性を達成しなければならないものであると記載する多くの研究が公表されている。それ以来、多くの後続の研究、アルゴリズム、および／または改善が公表されているが、ｓｉＲＮＡをデザインするための初期のパラメータは、ＷＯ０２／４４３２１におけるＴｕｓｃｈｌとその共同研究者により設定された。また、ｓｉＲＮＡの安定性の増強にも並々ならぬ努力が傾けられており、これは、生物学的流体中にＲＮアーゼが遍在していることを考慮すればｓｉＲＮＡに基づく治療にとって主要な障害のうちの１つとして認識されている。安定性の増強のためにとられた主要な戦略のうちの１つは、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−アミノヌクレオチド、２’−Ｏメチレン架橋または４’−Ｃメチレン架橋を含有するヌクレオチドなど、修飾ヌクレオチドの使用である。また、主に、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチドの導入による、隣接するヌクレオチドを連結するリボヌクレオチド骨格の修飾も記載されている。安定性の増強は、有効性に反比例することが多いと考えられており（Ｐａｒｉｓｈ、２０００）、所定の数、位置、および／または組合せの修飾ヌクレオチドだけが安定的なサイレンシング化合物を結果としてもたらしうる。これは、ｓｉＲＮＡベースの処置において重大な障害であるので、良好な結果を示すある種の修飾パターンについて記載する様々な研究が公表されており、このような研究の例としては、ＥＰ１５２７１７６、ＷＯ２００８／０５０３２９、ＷＯ２００８／１０４９７８、またはＷＯ２００９／０４４３９２が挙げられるが、文献ではさらに多くの研究を見出すことができる。

また、バニロイド受容体１型（ＶＲ−１）とも呼ばれる、ＴＲＰＶ１（一過性受容体電位バニロイド１型）は、１９９７年に初めて発見されたカプサイシン応答性リガンド感受性カチオンチャネルである（Ｃａｔｅｒｉｎａ、１９９７）。ＴＲＰＶ１は主に感覚ニューロン上で発現し、熱、カプサイシン、プロトン、およびエンドバニロイドの分子検出器として用いられる（Ｃａｔｅｒｉｎａ、２００１；Ｍｏｎｔｅｌｌ、２００２；Ｂａｕｍａｎｎ、２０００）。しかしながら本出願の本発明者らは、涙腺および毛様体に由来する組織でもＴＲＰＶ１が発現されることを見出した。

ＴＲＰＶ１が、カプサイシンなどのアゴニスト、および熱、アシドーシス、リポキシゲナーゼ生成物、またはアナンダミドなどの他の因子により活性化されると、カルシウムが細胞に入り、疼痛シグナルが誘発される。チャネルが活性化されると、中枢感覚神経末端および末梢感覚神経末端からの神経ペプチドの放出が誘導され、疼痛の感覚、神経性炎症を引き起こし、時には平滑筋の収縮および咳を引き起こす。実のところ、近年の証拠によれば、疼痛、咳、喘息、および尿失禁におけるＴＲＰＶ１の役割が示唆されている（Ｊｉａ、２００５）。実際、ＴＲＰＶ１は、疼痛刺激に応答する鎮痛による処置のための公知の標的である。さらにＷＯ２００４／０４２０４６または（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ、２００５）では、疼痛の処置に焦点を当てた異なる技術を使用して、ＴＲＰＶ１の発現レベルを低減するようにデザインされた処置も記載されている。

多モード侵害受容器は、角膜内で見出される最も豊富な侵害受容器の種類である。これらの受容体線維はカプサイシン、熱、および酸に応答するため、ＴＲＰＶ１受容体を発現させるという薬理学的証拠が存在する。さらに、高用量のカプサイシンが、角膜多モード侵害受容器の熱および酸に対する応答を不活化させるのに対し、機械的応答性は依然として影響を受けないままである。これは、角膜多モード神経末端内に存在するＴＲＰＶ１受容体が、選択的に不活化されたことを示唆する。

したがって、角膜損傷に対する急性侵害性応答、ならびにこの組織内での炎症性過程および刺激性過程を伴う持続的な疼痛感覚の重要部分は、ＴＲＰＶ１活性化が媒介する可能性が高い。

さらに、ＷＯ２００７／０４５９３０は、眼痛およびドライアイ症候群と関連する眼病態を処置するためのＴＲＰＶ１特異的ｓｉＲＮＡの使用について記載している。しかし、この発明は、ＴＲＰＶ１の発現およびその帰結として生じる眼不快感を低減するための生成物の改善を提供する。従来の化学阻害剤と比べて、これらの状態をｓｉＲＮＡ生成物で処置することの利点は、ｓｉＲＮＡに基づく処置は長期間持続する効果を有することである。この結果は、エフェクター分子が存在しなくなると、細胞は新たな受容体を最初から合成しなければならないのに対し、従来の処置は、細胞膜上の受容体レベルを無傷のまま残すという事実によるものである。

今日のライフスタイルに起因して、眼の感受性の変化に関連する眼病態に罹る人の数は極めて多く、人口の老化と共に増大することが予測されている。屈折矯正手術およびコンタクトレンズの使用により、患者は角膜の感受性の変化とドライアイの感覚とを発生させることが多い。これは、コンピュータの画面を見つめる長い作業時間や、通常空気をさらに乾燥させる空調システムの使用によりさらに悪化する。また、涙液の量および質も年齢と共に低下する。ドライアイ症候群に伴う症状としては、眼組織の掻痒感、灼熱感および刺激感が挙げられる。ドライアイのより重度の形態は、シェーグレン症候群患者で生じる。本明細書の意図において、これらの感覚のうち１つまたは様々な組合せの存在を眼痛と称する。現在、ドライアイ症候群は、１千万人を超える米国人に影響を及ぼすと推定されている。

ＷＯ０２／４４３２１ ＥＰ１５２７１７６ ＷＯ２００８／０５０３２９ ＷＯ２００８／１０４９７８ ＷＯ２００９／０４４３９２ ＷＯ２００４／０４２０４６ ＷＯ２００７／０４５９３０ ＷＯ２０１１／１４８１９３

Ｆｉｒｅ，Ａ．、Ｓ．Ｘｕら（１９９８）、「Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ」、Ｎａｔｕｒｅ、３９１（６６６９）：８０６〜１１頁 Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．、Ｗ．Ｌｅｎｄｅｃｋｅｌら（２００１）、「ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ２１− ａｎｄ ２２−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＲＮＡｓ」、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ、１５（２）：１８８〜２００頁 Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｒ．Ｅ．およびＸ．Ｃｈｅｎｇ（２００５）、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ＲＮＡｉ」、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、５７９（２６）：５８４１〜９頁 Ｎｙｋａｎｅｎ，Ａ．、Ｂ．Ｈａｌｅｙら（２００１）、「ＡＴＰ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｐａｔｈｗａｙ」、Ｃｅｌｌ、１０７（３）：３０９〜２１頁 Ｌｉｕ，Ｊ．、Ｍ．Ａ．Ｃａｒｍｅｌｌら（２００４）、「Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２ ｉｓ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ＲＮＡｉ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０５（５６８９）：１４３７〜４１頁 Ｓｏｎｇ，Ｊ．Ｊ．、Ｓ．Ｋ．Ｓｍｉｔｈら（２００４）、「Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ａｒｇｏｎａｕｔｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＲＩＳＣ ｓｌｉｃｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０５（５６８９）：１４３４〜７頁 Ｃｅｒｕｔｔｉ，Ｌ．、Ｎ．Ｍｉａｎら（２０００）、「Ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ＰＡＺ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ｒｅｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｉｗｉ ｄｏｍａｉｎ」、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ、２５（１０）：４８１〜２頁 Ｒａｎｄ，Ｔ．Ａ．、Ｓ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎら（２００５）、「Ａｒｇｏｎａｕｔｅ２ ｃｌｅａｖｅｓ ｔｈｅ ａｎｔｉ−ｇｕｉｄｅ ｓｔｒａｎｄ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｄｕｒｉｎｇ ＲＩＳＣ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」、Ｃｅｌｌ、１２３（４）：６２１〜９頁 Ｍａ，Ｊ．Ｂ．、Ｙ．Ｒ．Ｙｕａｎら（２００５）、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ５’−ｅｎｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ｂｙ ｔｈｅ Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ Ｐｉｗｉ ｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｎａｔｕｒｅ、４３４（７０３３）：６６６〜７０頁 Ｄｏｅｎｃｈ，Ｊ．Ｇ．、Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．、「ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｔａｒｇｅｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ」、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１８、５０４〜５１１頁、２００４ Ｌｅｗｉｓ，Ｂ．Ｐ．、Ｓｈｉｈ Ｉ．ら、「ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｓ」、Ｃｅｌｌ、１１５：７８７〜７９８頁、２００３ Ｏｒｂａｎ，Ｔ．Ｉ．およびＥ．Ｉｚａｕｒｒａｌｄｅ（２００５）、「Ｄｅｃａｙ ｏｆ ｍＲＮＡｓ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｂｙ ＲＩＳＣ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ＸＲＮ１ ，ｔｈｅ Ｓｋｉ ｃｏｍｐｌｅｘ，ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｏｓｏｍｅ」、Ｒｎａ、１１（４）：４５９〜６９頁 Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ，Ｇ．およびＰ．Ｄ．Ｚａｍｏｒｅ（２００２）、「Ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｉｎ ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｔｕｒｎｏｖｅｒ ＲＮＡｉ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｐｌｅｘ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７（５５８９）：２０５６〜６０頁 Ｐａｒｒｉｓｈ，Ｓ．、Ｊ．Ｆｌｅｅｎｏｒら（２０００）、「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｔｏｍｙ ｏｆ ａ ｄｓＲＮＡ ｔｒｉｇｇｅｒ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｗｏ ｔｒｉｇｇｅｒ ｓｔｒａｎｄｓ ｉｎ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ」、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ、６（５）：１０７７〜８７頁 Ｃａｔｅｒｉｎａら（１９９７）、「Ｔｈｅ ｃａｐｓａｉｃｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ａ ｈｅａｔ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｉｎ ｐａｔｈｗａｙ」、Ｎａｔｕｒｅ、３８９（６６５３）：８１６〜２４頁 Ｃａｔｅｒｉｎａら（２００１）、「Ｔｈｅ ｖａｎｉｌｌｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇａｔｅｗａｙ ｔｏ ｔｈｅ ｐａｉｎ ｐａｔｈｗａｙ」、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２４：４８７〜５１７頁 Ｍｏｎｔｅｌｌら（２００２）、「Ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡｓ（ｓｈＲＮＡｓ）ｉｎｄｕｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ」、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ、１６（８）：９４８〜５８頁 Ｂａｕｍａｎｎ ＴＫおよびＭａｒｔｅｎｓｏｎ ＭＥ（２０００）、「Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｏｎｓ ｂｏｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｏｆ ｃａｐｓａｉｃｉｎ−ｇａｔｅｄ ｃｈａｎｎｅｌｓ」、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０：ＲＣ８０頁 Ｊｉａら（２００５）、「ＴＲＰＶ１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｉｎ，ｃｏｕｇｈ，ａｉｒｗａｙ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｕｒｉｎａｒｙ ｉｎｃｏｎｔｉｎｅｎｃｅ」、Ｄｒｕｇ Ｎｅｗｓ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ、１８（３）：１６５〜７１頁 Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｓ．ら（２００５）、「Ｌｏｃａｌ ＲＮＡ ｔａｒｇｅｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｓｉＲＮＡ ｅｆｆｉｃａｃｙ：ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎｔｅｎｔｉｏｎａｌｌｙ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ」、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３４８：８８３〜８９３頁 Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２、３８７〜３８９頁 Ｋｉｍら、２００５ Ｂｒａｍｓｅｎら、２００９ Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ａ．、Ｌｅａｋｅ，Ｄ．ら（２００４）、「Ｒａｔｉｏｎａｌ ｓｉＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２２（３）：３２６〜３０頁 Ｕｉ−Ｔｅｉ，Ｋ．、Ｎａｉｔｏ，Ｙ．ら（２００４）、「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｓｉＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｍａｍｍａｌｉａｎ ａｎｄ ｃｈｉｃｋ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、３２（３）：９３６〜４８頁 Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｇ．Ｇ．、Ｇａｒｃｉａ，Ｐ．ら（１９９３）、「Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｐｓａｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｃｕｌａｒ ｐａｉｎ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｂｙ ｃａｌｃｉｕｍ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ」、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ、３４（１２）：３３２９〜３３３５頁

第１の態様では、本発明は、ｓｉＲＮＡ分子のための投与レジメンの提供に関し、ここで前記分子は、細胞内に導入されると配列番号１を特異的に標的化して、ＴＲＰＶ１遺伝子の発現を低減させる。

例えば、ｓｉＲＮＡ分子が遺伝子の発現を選択的に低下させるかまたは阻害する場合、その遺伝子は、本発明に係るｓｉＲＮＡにより「標的化」される。本明細書で用いられる「〜を選択的に低下させるかまたは阻害する」という語句は、１つの遺伝子、この場合はＴＲＰＶ１の発現に影響を及ぼすｓｉＲＮＡを包摂する。その代わりに、ストリンジェントな条件下でｓｉＲＮＡが遺伝子転写物、すなわちそのｍＲＮＡとハイブリダイズする場合も、遺伝子を標的化する。「ストリンジェントな条件下で」ハイブリダイズすることが可能であるとは、標的ｍＲＮＡ領域に、標準的条件下、例えば、ハイブリダイゼーションに好適でない傾向がある高温および／または低塩含量下でアニールすることを意味する。適切なプロトコール（０．１倍濃度のＳＳＣを使用、６８℃で２時間）は、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８２、３８７〜３８９頁において記載されている。

本明細書で列挙される核酸配列は、特に他の指示がない限り、５’から３’方向で書き記される。「核酸」という用語は、ＤＮＡ内に存在するプリン塩基もしくはピリミジン塩基（アデニン「Ａ」、シトシン「Ｃ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」）またはＲＮＡ内に存在するプリン塩基もしくはピリミジン塩基（アデニン「Ａ」、シトシン「Ｃ」、グアニン「Ｇ」、ウラシル「Ｕ」）を含むＤＮＡもしくはＲＮＡまたはその修飾形態を指す。「Ｔ」塩基は通常ＲＮＡに存在しないが、本明細書で示される干渉型ＲＮＡは例えば３’末端に「Ｔ」塩基を含んでいてもよい。場合によっては、これらの塩基は、リボヌクレオチド鎖に存在するデオキシリボヌクレオチドと区別するために「ｄＴ」と表すこともある。

上記で規定した標的配列は、ｓｉＲＮＡをデザインする目的で使用されるデータベースにおいて転写変異体を規定するために使用される標的ＤＮＡ配列として説明されるが、使用される特異的化合物は、それ自体が規定されるＲＮＡ配列であると予想される。

ＴＲＰＶ１に対応する様々な転写変異体が同定されている。オルタナティブスプライシングにより作製された４つのＴＲＰＶ１転写物に対応するＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、ＮＭ＿０８０７０４（ＮＭ＿０８０７０４．３、ＧＩ：１１７３０６１６１）、ＮＭ＿０１８７２７（ＮＭ＿０１８７２７．５、ＧＩ：１１７３０６１６０）、ＮＭ＿０８０７０６（ＮＭ＿０８０７０６．３、ＧＩ：１１７３０６１６３）、およびＮＭ＿０８０７０５（ＮＭ＿０８０７０５．３、ＧＩ：１１７３０６１６２）である。さらに、ＥＮＳＥＭＢＬ（ＭＢＬ−ＥＢＩ／Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）も、５つのさらなるＴＲＰＶ１転写物：ＥＮＳＴ０００００１７４６２１、ＥＮＳＴ０００００３１０５２２、ＥＮＳＴ０００００３４４１６１、ＥＮＳＴ０００００３９９７５２、ＥＮＳＴ０００００３９９７５６、ＥＮＳＴ０００００３９９７５９、ＥＮＳＴ０００００４２５１６７を公表している。

本発明は、ＴＲＰＶ１遺伝子の発現を阻害するｓｉＲＮＡのための投与レジメンを提供し、これらのｓｉＲＮＡは、現況技術で既に開示されているｓｉＲＮＡと比較してとりわけ効果的である。「とりわけ効果的」とは、それらがより高度な阻害を達成するか、および／またはより長期間の効果を達成することを意味する。

これらのｓｉＲＮＡは、前出の段落で記載したＴＲＰＶ１の全ての転写変異体に共通の標的配列に対してデザインされていることから、ＴＲＰＶ１タンパク質をコードする細胞内に存在する可能性のある全てのｍＲＮＡのＲＩＳＣが介在する分解を媒介する。本発明により同定される前記好ましい標的領域は、配列番号１（５’−ＡＡＧＣＧＣＡＴＣＴＴＣＴＡＣＴＴＣＡ−３’）と同定される。これらのｓｉＲＮＡは、ＷＯ２０１１／１４８１９３において記載されている。

したがって、本発明の態様に係るｓｉＲＮＡは、そのアンチセンス鎖が配列番号１と実質的に相補的なＲＮＡ配列を含むかまたは配列番号１と実質的に相補的なＲＮＡ配列からなり、そのセンス鎖がアンチセンス鎖と相補的なＲＮＡ配列を含み、両方の鎖がヌクレオチドの間の標準的な塩基対合によりハイブリダイズする二本鎖ＲＮＡ分子を含むことが好ましい。

本発明の意味の範囲内で、標的ｍＲＮＡ配列と「実質的に相補的である」とは、前記標的配列と「実質的に同一である」とも理解することができる。当業者公知の「同一性」とは、配列間のヌクレオチドの順序および同一性をマッチさせることにより決定されるヌクレオチド配列間の配列類縁性の程度である。一実施形態では、標的ｍＲＮＡ配列に対して、８０％の相補性を有するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖、および８０％から最大１００％の間の相補性を有するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相補性を有するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が実質的に相補的であると考えられ、本発明で使用することができる。相補性の百分率とは、第２の核酸分子内の連続するヌクレオチドのセットとワトソン−クリックの様式で塩基対を形成できる第１の核酸分子内の連続するヌクレオチドの百分率のことである。

現況技術から公知である通り、ＲＮＡ干渉を達成するための多くの様々な構造が提唱されている。一般に、これらの二本鎖分子は、長さが約１９〜約２５個のヌクレオチドであり、平滑末端構造のほか、オーバーハングを伴う構造も含む。オーバーハングは、ＲＮアーゼによる認識を低減させ、ダイサーの天然基質を模倣するので、有利であることが記載されており、いずれかの鎖の５’末端上に存在する場合もあり、３’末端上に存在する場合もある。ある著者らは、分子の両方の３’末端上のオーバーハングの取り込みを推奨するが、他の著者らは、１つのオーバーハングで十分であると考える。他の著者らは、特異的な修飾パターンを有する平滑末端構造の使用について記載している（ＥＰ１５２７１７６、ＷＯ２００８／１０４９７８、および多くの他の文献）。

オーバーハングは、１〜５個のヌクレオチドを含んでいてもよく、典型的に、オーバーハングはジヌクレオチドからなる。当分野において使用される古典的な分子は、好ましくはＴｕｓｃｈｌ（ＷＯ０２／４４３２１）による初期の研究において教示されるデオキシヌクレオチドを含む、３’ジヌクレオチドのオーバーハングをさらに含む、１９個のヌクレオチドの二本鎖分子を含む。これらのオーバーハングは、ヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）分解に対する耐性をさらに増強すると言われている。その後、Ｋｉｍら、２００５は、２１−ｍｅｒの生成物（ジヌクレオチドのオーバーハングを含有する）がＲＩＳＣへのローディングに必要であることについて記載している。さらに、Ｂｒａｍｓｅｎら、２００９は、サイレンシング効率をさらに増大させるように、オーバーハングに対する可能な不安定化修飾の導入について記載している。

本発明の多様な態様の好ましい実施形態はそれ自体、少なくとも１つのオーバーハングを含む、配列番号１を標的化するｓｉＲＮＡ分子を指す。

本発明の多様な態様の別の代替的な実施形態は、平滑末端分子を提供する。

さらに、本発明の好ましい実施形態は、配列番号１を標的化する１９個のヌクレオチドの二本鎖構造を含むかまたはこれからなるｓｉＲＮＡに関する。驚くべきことに、前記１９個のヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡは、図５からわかるように、２１個のヌクレオチドおよび３’オーバーハングを有する上述した生成物より高い分解に対する耐性を有することが分かっている。

本発明の特定の実施形態は、配列番号１に標的化された１９個のヌクレオチドの二本鎖平滑末端ｓｉＲＮＡに関する。さらなる特定の実施形態では、この化合物は、配列番号２（５’−ＡＡＧＣＧＣＡＵＣＵＵＣＵＡＣＵＵＣＡ−３’）と同定される。さらに好ましい実施形態では、このｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号１と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％相補的である。

さらに、「背景技術」と題した節で記載した通り、ｓｉＲＮＡ分子に関する重要な問題は、ＲＮアーゼが遍在するために生物学的流体中でそれらが不安定であることである。したがって、化合物の安定性を増強する目的で、ヌクレオチドに対する多くの異なる化学修飾の使用が記載されている。

ｓｉＲＮＡ分子の別の固有の問題はそれらの免疫原性であり、ｓｉＲＮＡは、ある種のサイトカイン、例えば、Ｉ型インターフェロンおよび／またはＩＩ型インターフェロンのほか、ＩＬ−１２、ＩＬ−６および／またはＴＮＦ−アルファの産生の上方調節などの生得免疫系の非特異的活性化を誘導することが見出されている。これらの作用の原因は、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８および／またはＴＬＲ３などのＴｏｌｌ様受容体がｓｉＲＮＡによって活性化されることと考えられる。

また、ＲＮアーゼによる認識および免疫原性というこれらの作用はいずれも、配列依存的であることが記載されている。

ＲＮアーゼに対する感受性を低下させることにより化合物の安定性を増強するある種の化学修飾は、後続の応答の免疫による認識の誘導も低減する可能性がある。しかしまた、ｓｉＲＮＡ内に化学修飾されたヌクレオチドを挿入することにより、前出の節で記載したサイレンシングの有効性の低下をもたらす場合もあり、よって、注意深く取り組まなければならない。

したがって、本発明の多様な態様の好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡは、化学修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドをさらに含む。

安定性を増強して免疫原性作用を低減する好ましい化学修飾としては、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−フルオロヌクレオチド、２’−アミノヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、２’−Ｏメチレン架橋または４’−Ｃメチレン架橋を含有するヌクレオチドが挙げられる。また、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチドの導入による、隣接するヌクレオチドを連結するリボヌクレオチド骨格の修飾も挙げられる。本発明の意味の範囲内のさらに好ましい化学修飾は、ウラシルリボヌクレオチドのデオキシチミジン（デオキシリボヌクレオチド）による置換に関する。本発明の別の好ましい実施形態では、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖上、アンチセンス鎖上、または両方の鎖上にある。

したがって、一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号３、４、５、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６から選択される。

上記で記載したｓｉＲＮＡ分子は、当技術分野で公知の方法を使用して、それらの天然構造で細胞内部へと送達することができる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける遺伝子サイレンシングについて研究する場合、これらの化合物は、標準的なトランスフェクション試薬を使用して投与される。ｉｎ ｖｉｖｏで効果を達成するには、これらの化合物はそのままの状態で投与されてもよく、当技術分野では多くの異なる代替法が公知であるが、例えばリポソーム、部位特異的なコンジュゲーション等のための送達増強剤を使用して投与されてもよく、体内の所望の標的部位に応じて様々に使用される。

その代わりに、本発明の多様な態様のｓｉＲＮＡ分子は、細胞内で、真核プロモーターにより発現させることができる。ｓｉＲＮＡ分子を発現させることが可能な組換えベクターは、標的細胞内に送達して存続させることができる。その代わりに、核酸分子の一過性発現をもたらすベクターを使用することもできる。このようなベクターは、必要に応じて繰り返し投与してもよい。ｓｉＲＮＡ分子は、発現されると標的ｍＲＮＡと相互作用し、ＲＮＡ干渉応答を発生させる。このようにして産生されたｓｉＲＮＡ分子は、ｓｈＲＮＡ（ショートヘアピンＲＮＡ）と称することが多く、それらのセンス鎖とアンチセンス鎖とは、ヌクレオチドの低分子ループにより連結される。ｓｉＲＮＡ分子を発現させるベクターは、例えば静脈内投与もしくは筋肉内投与、対象由来の体外培養した標的細胞に投与した後に対象に再導入すること、またはその他のあらゆる所望の標的細胞への導入を可能とする手段によって全身性送達されてもよい。

本発明のさらなる態様は、ＴＲＰＶ１の発現および／または活性の増大を特徴とする眼の状態を処置する方法で使用するための医薬の調製における、配列番号１を標的化するｓｉＲＮＡの使用であって、ｓｉＲＮＡを、本明細書で開示される投与レジメンに従い投与する使用に関する。方法は、患者におけるＴＲＰＶ１の発現を阻害するステップを含む。阻害という用語は、発現または活性の低下または下方調節を示すのに使用される。眼の状態は、眼痛であることが好ましい。一実施形態では、眼の状態は、屈折矯正手術後の眼不快感および角膜の感受性の変化、コンタクトレンズの使用、ドライアイ症候群、シェーグレン症候群、他の眼病態を含む群より選択される。

ＴＲＰＶ１ ｍＲＮＡに向けられたｓｉＲＮＡによる治療的処置は、効果が観察される時間の長さを延長して、投与頻度を減らして患者による服薬遵守を向上させることから、低分子局所用点眼剤よりも有益であることが予測されている。これはとりわけ、慢性状態であることが多いドライアイ症候群および角膜の感受性の変化などの症例において重要である。

このような医薬の調製を念頭に置き、本発明の多様な態様のｓｉＲＮＡを製剤化することができる。好ましくは、前記ｓｉＲＮＡの組成物および製剤は、対象の器官に局所投与することができる。なおより好ましい実施形態では、それらを眼に、好ましくは眼の角膜表面に局所投与するために製剤化することができる。角膜表面への適用は、例えば、点眼剤、ゲル、ローション、クリーム、または眼内挿入物（ｏｃｕｌａｒ ｉｎｓｅｒｔ）の形態でなされてもよい。眼への他の投与形態としては、眼内注射が挙げられる。

本発明の多様な態様のさらに好ましい実施形態は、ＴＲＰＶ１の発現および／または活性の増大を特徴とする眼の状態を処置するための医薬としての使用のための、前出の段落で記載した配列番号１を特異的に標的化するｓｉＲＮＡに関し、ここで前記ｓｉＲＮＡは、本明細書で開示される投与レジメンに従い投与される。上記で記載した通り、ｓｉＲＮＡは、配列番号１を標的化する１９個のヌクレオチドの二本鎖構造を含むかまたはこれからなるｓｉＲＮＡであってもよい。このｓｉＲＮＡは、平滑末端であってもよい。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、配列番号２である。本発明に係る使用のための他のｓｉＲＮＡは、配列番号３、４、５、６、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６から選択することができる。

本発明の文脈内では、配列を「特異的に標的化する」ために、本発明のｓｉＲＮＡは、少なくとも同じシード配列を含むことが好ましい。したがって、配列番号１を特異的に標的化する、本発明に係るいずれの配列も、アンチセンス鎖の２〜８位において同一であることが好ましい。

上記にかかわらず、本発明の多様な態様のｓｉＲＮＡを眼以外の組織内でＴＲＰＶ１の発現をサイレンシングするのに使用することができる。したがって、前記ｓｉＲＮＡは、それに応じて適宜製剤化されるものとする。

例えば、ｓｉＲＮＡ分子は、対象への投与のための、リポソームなどの送達媒体を含んでいてもよい。薬学的に許容される製剤中に、担体および希釈剤ならびにそれらの塩が存在していてもよい。核酸分子は、これらに限定されないが、リポソーム内の封入、イオントフォレーシス、または生体分解性ポリマー、ハイドロゲル、シクロデキストリンポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェアおよびＰＬＣＡマイクロスフェア、生体分解性ナノカプセル、ならびに生体接着性マイクロスフェアなど他の媒体への取り込み、またはタンパク質性ベクターなどの当業者公知の様々な方法により細胞に投与することができる。別の実施形態では、本発明の核酸分子はまた、ポリエチレンイミンおよびその誘導体、例えば、ポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）またはポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−トリ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ｔｒｉＧＡＬ）誘導体などと共に製剤化または複合体化することもできる。本発明の好ましい組成物は、水溶液、とりわけｐＨ範囲が約７．０〜約７．４であり、好ましくはｐＨが７．２±０．５であるリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）などの生理食塩液である。

本発明のｓｉＲＮＡ分子は、膜破壊剤および／またはカチオン性脂質もしくはヘルパー脂質分子と複合体化することができる。

本発明と共に使用可能な送達系は、例えば、水性ゲルおよび非水性ゲル、クリーム、多重エマルジョン、マイクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水溶液および非水溶液、ローション、エアロゾル、炭化水素ベースおよび炭化水素粉末を含み、可溶化剤、浸透増強剤（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコールおよびアミノ酸）、および親水性ポリマー（例えば、ポリカルボフィルおよびポリビニルピロリドン）などの賦形剤を含有しうる。一実施形態では、薬学的に許容される担体は、リポソームまたは経皮増強剤である。

本発明の医薬製剤は、例えば、ヒトを含む細胞または対象への投与、例えば、全身投与または局所投与に適した形態である。適切な形態は、用途または例えば経口、経皮、もしくは注射などの投与経路によってある程度決まる。その他の要素も当業界公知であり、例えば組成物または製剤が効果を発揮するのを妨げる毒性および形態などの検討事項が挙げられる。

本発明はまた、薬学的に許容される担体中または希釈剤中に薬学的有効量の所望の化合物を含む、保管または投与のために調製される組成物も含む。治療的使用に許容される担体または希釈剤が医薬分野で周知である。例えば、保存剤、安定化剤、色素、および芳香剤が供給されていてもよい。これらの例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。加えて、抗酸化剤および懸濁化剤も使用することができる。

薬学的有効用量とは、疾患状態の発生を防止するか、阻害するか、または疾患状態を処置する（症状をある程度緩和する、好ましくは症状の全てを緩和する）のに要する用量である。薬学的有効用量は一般に、疾患の種類、使用される組成物、投与経路、処置される哺乳動物の種類、検討される具体的な哺乳動物の身体的特徴、併用薬物、医療分野の当業者が認識する他の要素に依存する。

特に、投与量に加えて、投与計画も、ｓｉＲＮＡ分子による有効な下方調節の重要な決定要素であることが公知である。

本発明者らは、副作用を回避して安全に投与することが可能な、ＴＲＰＶ１の発現および／または活性の増大を特徴とする眼の状態、特に、ドライアイおよび／または眼痛を処置するためのｓｉＲＮＡを投与するための有効な投与計画を開発した。したがって、本明細書で記載される投与レジメンに従い細胞内に導入されると配列番号１を特異的に標的化してＴＲＰＶ１遺伝子の発現を低減するｓｉＲＮＡ分子の投与は、臨床的な改善をもたらす。

本明細書で用いられる「有効な投与計画」とは、ＴＲＰＶ１の過剰発現と関連する眼障害を処置または管理するのに十分な、本発明のｓｉＲＮＡの量を指す。ヒトにおけるドライアイおよび／または眼痛の処置のためには、当業者公知の様々なパラメータにより、例えば、眼表面疾患指数（ＯＳＤＩ：ｏｃｕｌａｒ ｓｕｒｆａｃｅ ｉｎｄｅｘ）質問票（ドライアイについての）および／または眼痛についての視覚的アナログ尺度（ＶＡＳ：ｖｉｓｕａｌ ａｎａｌｏｇｕｅ ｓｃａｌｅ）を使用して測定される眼疾患のレベルを低減することが好ましい。本発明の化合物を単独で送達するのか別の適切な治療剤と組み合わせて送達するのかにかかわらず、処置前レベルと比較してこれらのレベルがどのような程度でも低下することが有利である（例えば、本発明は、処置前の値の約５％、約１０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約５０％、または約６０％を超えるＯＳＤＩおよび／またはＶＡＳの低下を想定する）。

治療有効量はまた、ドライアイおよび／または眼痛と関連する眼障害の発症を遅延させるかまたは最小化するのに十分なｓｉＲＮＡの量も指す場合もある。治療有効量はまた、ドライアイおよび／または眼痛と関連する眼障害の処置または管理における治療的利益をもたらす治療剤の量も指す場合もある。さらに、本発明のｓｉＲＮＡについての治療有効量とは、単独であるかまたは他の治療と組み合わせた治療剤の量であって、ドライアイおよび／または眼痛と関連する眼障害の処置または管理における治療的利益をもたらす治療剤の量を意味する。本発明のｓｉＲＮＡの量との関連で使用される治療有効量という用語は、治療の全体を改善するか、有害作用を低減もしくは回避するか、または別の治療剤の治療有効性を増強するかもしくはこれと相乗作用する量を包摂しうる。

ドライアイおよび／または眼痛などの眼障害の処置または管理における治療的利益とは、疼痛および／または不快な感覚の持続的な軽減である。ｓｉＲＮＡが細胞内のＴＲＰＶ１受容体のレベルを低下させると仮定すれば、処置を中止してても、細胞が新たな受容体を再合成しなければ疼痛感覚は感知されないと予想される。そのため、ｓｉＲＮＡ処置に基づく治療はより持続的な効果を有すると予想される。これは、治療有効性の顕著な増強であると考えられる。

ｓｉＲＮＡを使用するさらなる利益は、異なる点眼剤ベースの処置と関連することが多い、全身の循環内のその存在に由来する副作用または急性毒性問題の可能性を最小化することである。これは、化合物が血流中に入ると、血中に存在するＲＮアーゼにより急速に分解されるということに起因する。

他方、本明細書で記載される製剤は単回投与用バイアルで提供できるが、これは、現在市販されているほとんどの製剤に含まれる抗微生物性保存剤が一部の患者においてある種の不忍容性を引き起こして処置の中止を余儀なくされることを考慮したものである。いずれの問題も、ドライアイおよび／または眼痛のような状態が慢性であることが多く、したがって処置も長期にわたることを考慮すればとりわけ重要である。

好ましい投与経路のうちの１つは、好ましくは点眼剤を使用して、眼に対する直接の滴下を介する局所経路である。上記で記載した通り、ＴＲＰＶ１ ｍＲＮＡに向けられたｓｉＲＮＡによる治療的処置は、効果が観察される時間の長さを延長して、投与頻度を減らして患者による服薬遵守を向上させることから、低分子局所用点眼剤よりも有益であることが予測されている。ｓｉＲＮＡを眼に直接投与する場合、一般に、１日当たり眼１つ当たり約０．０１ｍｇ〜約１００ｍｇの量を投与することができる。一実施形態では、１日当たり眼１つ当たりに投与される量は、約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇである。別の実施形態では、１日当たり眼１つ当たり約０．０４ｍｇ〜８０ｍｇ、約０．０４ｍｇ〜約２０ｍｇ、約０．０８ｍｇ〜約１０ｍｇ、約０．０８ｍｇ〜約１．２ｍｇ、約０．３〜約０．９ｍｇ、または約０．０８ｍｇ〜約０．９ｍｇのｓｉＲＮＡを投与する。

一実施形態では、投与量は、約０．５ｍｇ〜約１．５ｍｇである。一実施形態では、投与量は、約０．３〜０．９ｍｇ、好ましくは約０．６ｍｇ〜約０．９ｍｇである。その代わりに、好ましい投与量は、１日当たり眼１つ当たり約０．６ｍｇまたは約０．９ｍｇである。

上記で言及した好ましい投与経路のうちいずれかは、点眼剤の使用を介する。一実施形態では、これらの点眼剤の体積は、所与の用量の化合物を含有する、２５から５０マイクロリットルの間、好ましくは２６から４０マイクロリットルの間である。好ましくは、市販の点眼器を、最終的な医薬含有量になるようにして使用してもよく、結果として得られる体積は、液滴１滴当たり約３０から約３３マイクロリットルの間となると予想される。さらに好ましい実施形態では、点眼剤は、約４０μｌの体積で送達される。さらなる実施形態では、本発明の組成物は、配列番号２のｓｉＲＮＡなどのｓｉＲＮＡをリン酸緩衝生理食塩液などの許容される溶液中に、約７．５〜約２２．５ｍｇ／ｍｌ、またあるいは約１５ｍｇ／ｍｌ〜約２２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で含む。本発明の組成物は、ＰＢＳおよび例えば塩化ベンザルコニウムなどの任意選択の薬学的に許容される賦形剤中に、上記濃度のｓｉＲＮＡを含んでいてもよい。

上記の投与量での処置は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日間またはそれより長く施してもよい。投与は、好ましくは１０〜１５日間であり、最も好ましくは１０日間である。投与後には、処置を継続する前に、休薬期間、例えば、７日間の休薬期間を置くことができる。その代わりに、ドライアイおよび／または眼痛は慢性状態であることが多いことを考慮して、長期間にわたり投与量を毎日投与して、長期投与を行ってもよい。したがって、投与は、４週間より長く毎日継続してもよく、またはその代わりに、投与は、４週間より長く、ただし毎日ではなく継続してもよい。正確な計画は、慢性状態の重症度に従い決定することができる。

しかし、上記で説明した通り、眼に対する直接投与以外の投与経路もまた使用することができる。製剤中で使用される正確な投与量および投与計画は投与経路によっても決まるが、上記の投与量を使用してもよく、一般に、１日当たり眼１つ当たり約０．０１ｍｇ〜約１００ｍｇの量を投与してもよい。当業者は、使用される正確な投与量および投与計画は障害の重篤度によっても決まり、主治医の判断および各患者の状況に従い決定すべきことを理解しているであろう。また、任意の特定の対象に特異的な用量レベルは、使用される特異的化合物の活性、年齢、体重、全般的健康、性別、食餌、投与回数、投与経路、および排出速度、薬物の組合せ、ならびに治療中の特定の疾患の重症度を含む様々な要素に依存することも理解される。

本明細書で記載される本発明のｓｉＲＮＡの製剤は、従来の非毒性で薬学的に許容される担体、アジュバント、および／または媒体を含有する単位投与量製剤により投与することができる。製剤は、経口使用に適する形態、例えば、錠剤、トローチ、ドロップ、水性または油性の懸濁液、分散性粉末または顆粒、エマルジョン、ハードカプセルもしくはソフトカプセル、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤などでありうる。経口使用を意図した組成物は医薬組成物製造分野において公知のあらゆる方法に従い調製することができ、このような組成物は、薬学的に洗練され飲みやすい調製物を得るために、１種または複数の甘味剤、芳香剤、着色剤、または保存剤を含有していてもよい。錠剤は、錠剤製造に適した非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合された有効成分を含有する。

これらの賦形剤は、例えば、不活性の希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウムなど；造粒剤および崩壊剤、例えばトウモロコシデンプンまたはアルギン酸；結合剤、例えばデンプン、ゼラチン、またはアカシア；ならびに滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、または滑石でありうる。錠剤は、コーティングされていなくてもよいし、公知の技法によりコーティングされていてもよい。場合によって、このようなコーティングを公知の技法により消化管内の崩壊および吸収を遅延させるように調製することにより、長期間持続的な作用を達成できる。例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を使用してもよい。

経口使用のための製剤はまた、有効成分を、不活性の固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、またはカオリンと混合したハードゼラチンカプセルとして提供してもよいし、有効成分を、水または油の媒質、例えばピーナッツ油、液体パラフィン、またはオリーブ油と混合したソフトゼラチンカプセルとして提供してもよい。

水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適する賦形剤との混合物中に活性材料を含有する。このような賦形剤は、懸濁化剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピル−メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガムであり；分散剤または保湿剤は、天然に存在するホスファチド、例えばレシチン、または酸化アルキレンと脂肪酸との縮合生成物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、または酸化エチレンと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、または酸化エチレンと脂肪酸およびヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなど、または酸化エチレンと脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導された部分エステルとの縮合生成物、例えばポリエチレンソルビタンモノオレエートでありうる。水性懸濁液はまた、１種または複数の保存剤、例えば、エチルｐ−ヒドロキシベンゾエート、またはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、１種または複数の着色剤、１種または複数の芳香剤、および１種または複数の甘味剤、例えばスクロースまたはサッカリンなども含有しうる。

油性懸濁液は、植物油、例えばラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、もしくはヤシ油中で、または液体パラフィンなどの鉱油中で有効成分を懸濁することによって製剤化することができる。油性懸濁液は、増粘剤、例えば蜜蝋、硬質パラフィン、またはセチルアルコールを含有しうる。甘味剤および芳香剤を添加して、飲みやすい経口調製物を得てもよい。これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤を添加することにより保存することができる。

水を添加することにより水性懸濁液を調製するのに適した分散性粉末および顆粒は、分散剤または保湿剤、懸濁化剤、および１種または複数の保存剤と混合した状態の有効成分を提供する。適切な分散剤または保湿剤または懸濁化剤は、上記で既に言及した分散剤または保湿剤または懸濁化剤により例示される。また、さらなる賦形剤、例えば甘味剤、芳香剤、および着色剤が存在していてもよい。

本発明の医薬組成物はまた、水中油エマルジョンの形態でもありうる。油性相は、植物油もしくは鉱油またはこれらの混合物でありうる。適切な乳化剤は、天然に存在するガム、例えば、アカシアガムまたはトラガカントガム、天然に存在するホスファチド、例えば、ダイズ、レシチン、ならびに脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導されたエステルまたは部分エステル、例えばソルビタンモノオレエート、ならびに前記部分エステルと酸化エチレンとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートでありうる。エマルジョンはまた、甘味剤および芳香剤も含有しうる。

シロップ剤およびエリキシル剤は、甘味剤、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、グルコース、またはスクロースと共に製剤化することができる。このような製剤はまた、粘滑剤、保存剤および芳香剤および着色剤も含有しうる。本発明の医薬組成物またはｓｉＲＮＡおよび本明細書で記載される医薬組成物またはｓｉＲＮＡは、水性または油性の滅菌注射用懸濁液の形態でありうる。

この懸濁液は、公知の技術に従い、上記で言及した適切な分散剤または保湿剤および懸濁化剤を使用して製剤化することができる。

滅菌注射用調製物はまた、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液など、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または滅菌注射用懸濁液でもありうる。使用可能な許容される媒体および溶媒のなかでも特に、水、リンゲル液、および等張性の塩化ナトリウム溶液が挙げられる。加えて、滅菌固定油は、従来溶媒または懸濁化媒質として使用されている。この目的で、合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリドなどのあらゆるブランドの固定油を使用することができる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸も注射剤の調製に使用される。

好ましい実施形態では、本発明の組成物は、例えば、点眼剤などの形態で眼に局所投与するための溶液、好ましくはＰＢＳなどの緩衝生理食塩液、またはゲルにより製剤化される。このような実施形態では、製剤は、これらに限定されないが、カチオン性エマルジョンであってもよく、かつ／またはポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、カルボポール、ヒアルロン酸、およびポリアクリル酸などのバイオポリマーを含有する。

本発明の核酸分子はまた、例えば、薬物を直腸内投与するための坐剤の形態で投与することもできる。これらの組成物は、薬物を、常温では固体であるが直腸内温度では液体であり、したがって直腸内で融解して薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤と混合することにより調製することができる。このような材料は、ココアバターおよびポリエチレングリコールを含む。

本発明の核酸分子は、滅菌媒質により非経口投与することができる。薬物は、使用される媒体および濃度に応じて、媒体中に懸濁させてもよいし溶存させてもよい。有利には、媒体中に局所麻酔剤、保存剤、および緩衝剤などのアジュバントを溶存させてもよい。

したがって本発明のさらに好ましい実施形態は、少なくとも、配列番号１を標的化するｓｉＲＮＡを前出の段落で記載した具体的な濃度で含む医薬組成物に関する。

また本発明の核酸分子を他の治療用化合物と組み合わせて対象に投与することによっても、治療の全体的効果を増大させることができる。適応症を処置するための多重化合物の使用は、副作用の発生を低減しながら、有益な効果を増大させうる。

本発明のｓｉＲＮＡ化合物はまた、所定体積の液滴中に具体的な投与量のｓｉＲＮＡ化合物を分注するための開口部を伴う分注器を含むキットにより供給することもできる。好ましい実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡ化合物は、配列番号１を標的化するｓｉＲＮＡである。さらなる実施形態では、本発明のキット内の分注器は、配列番号２を含むかまたはこれからなる組成物を供給する。別の実施形態では、キットは、例えば、１カ月使用するための単回使用用分注器の集合体を含んでいてもよく、この具体的な場合において３０本の単回使用用分注器がケースに含有されると予想される。液滴の体積は、約５０μｌ〜約１００μｌの範囲でありうる。分注器は、単回使用用分注器であってもよく、約１ｍｇから約２ｍｇの間の本発明のｓｉＲＮＡ化合物を含んでいてもよく、任意選択でさらに１種または複数の薬学的に許容される希釈剤を含んでいてもよく、任意選択で１種または複数の賦形剤を含んでいてもよい。分注器内に含有される組成物は、約７．５ｍｇ／ｍｌから約２２．５ｍｇ／ｍｌの間の濃度の本発明のｓｉＲＮＡ化合物を含んでいてもよい。その代わりに、分注器は、１カ月以上使用されるようにデザインすることができ、これに応じて、含有される体積も、同等回数分の用量になるように増大させる。本発明のキットはまた、液滴１滴中に約０．３ｍｇから約０．９ｍｇの間のｓｉＲＮＡ化合物の投与量を各眼に適用することを指定する指示書を含んでいてもよい。指示書は、液滴を、各眼に１日１回、１日２回、１日３回、または１日４回適用すること、各眼への適用を、毎日、隔日、毎週１回、毎週２回、毎週３回、隔週、または毎月１回行うことをさらに指定する場合もある。

本発明が関与する分野の現況技術をより詳細に説明するために、本明細書で引用される全ての公表された論文、書籍、参考マニュアル、および抄録の内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

本発明の範囲および精神から逸脱することなく、上記で記載した対象物に多様な変化を施すことが可能なので、上記の記載に含有されるかまたは添付の特許請求の範囲で規定される全ての対象物は、本発明について記載的かつ例示的なものとして解釈されることが意図される。上記の教示を考慮して、本発明を改変したり変更したりしてもよい。

ＨｅＬａ細胞に、ＴＲＰＶ１を標的化する異なるｓｉＲＮＡ：本発明に係る化合物（配列番号２）、異なる領域を標的化する、既述の化合物（配列番号７）、およびＴＲＰＶ１を標的化するようにデザインされた、別の４つのｓｉＲＮＡ（配列番号１７〜２０）、および陰性対照として使用されるスクランブル配列をトランスフェクトした後で、Ｑｒｔ−ＰＣＲを使用する、ＴＲＰＶ１の経時的発現プロファイルを示す略図である。明確さを確保するため、同じ結果についての２つの代替的な表示であるＡおよびＢを示す。 ＨｅＬａ細胞に、本発明の異なるｓｉＲＮＡ：配列番号２〜配列番号６、および配列番号８〜配列番号１６、および陰性対照として使用されるスクランブル配列をトランスフェクトした後でＱｒｔ−ＰＣＲを使用する、ＴＲＰＶ１の経時的発現プロファイルを示す略図である。 カプサイシンによる刺激の後で、本発明の化合物（配列番号２）で処置されたウサギに由来する眼の、ｍｍ単位で測定された眼瞼開口についての時系列を、ＴＲＰＶ１依存性疼痛に特異的な承認鎮痛剤であるカプサゼピンと比較して示す図である。 カプサイシンによる疼痛の誘導後において、本発明の化合物（配列番号２）およびカプサゼピンによる処置から得られる、眼瞼開口の、試験前の値に対する比率（％）を示すグラフである。 ２４時間にわたり１０％の血漿へと曝露された後で残存する無傷生成物（％）の量を示すグラフである。 無傷の５’−リン酸化アンチセンス鎖に基づく、眼組織内の配列番号２の濃度であって、細胞質画分内に存在し、５’−リン酸化により活性化される、無傷の代謝されていない、配列番号２のアンチセンス鎖（親化合物）の量を意味する濃度を示すグラフである。左バー：５分後；右バー：３０分後。

本発明を、以下の非限定的な実施例においてさらに説明する。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ解析
ｓｉＲＮＡが、ＴＲＰＶ１をサイレンシングする（遺伝子発現の重要な阻害を得る）のに特に有効な標的配列を見出すために、６つの異なるｓｉＲＮＡについて調べた。これらのｓｉＲＮＡを、配列番号２、配列番号７、および配列番号１７〜２０として記載する。

配列番号２とは、本発明に係る配列番号１を標的化するｓｉＲＮＡであって、以下の配列：
センス：５’−ＡＡＧＣＧＣＡＵＣＵＵＣＵＡＣＵＵＣＡ−３’
アンチセンス：５’−ＵＧＡＡＧＵＡＧＡＡＧＡＵＧＣＧＣＵＵ−３’
を有するｓｉＲＮＡである。

配列番号７（５’−ＵＣＧＣＣＡＣＧＡＣＡＵＧＣＵＣＵＵＧｄＴｄＴ−３’）は、ＴＲＰＶ１を効果的に標的化し、カプサイシン刺激に対する眼の応答を低減することが、ＷＯ２００７／０４５９３０で既述の古典的なｓｉＲＮＡ分子（デオキシチミジンからなる３’オーバーハングを含有する長さ２１個のヌクレオチド）に対応する。配列番号１７〜１９は、Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、２００４またはＵｉ−Ｔｅｉら、２００４、および他の文献により記載されているアルゴリズムなど、当技術分野で利用可能な異なるアルゴリズムに従いＴＲＰＶ１に対してデザインされたｓｉＲＮＡに対応する。配列番号２０は、Ａｍｂｉｏｎにより供給され、ＴＲＰＶ１に対してデザインされている市販のｓｉＲＮＡである。
配列番号１７
センス：５’−ＣＧＣＡＵＣＵＵＣＵＡＣＵＵＣＡＡＣＵ−３’
アンチセンス：５’−ＡＧＵＵＧＡＡＧＵＡＧＡＡＧＡＵＧＣＧ−３’
配列番号１８
センス：５’−ＧＣＧＣＡＵＣＵＵＣＵＡＣＵＵＣＡＡＣ−３’
アンチセンス：５’−ＧＵＵＧＡＡＧＵＡＧＡＡＧＡＵＧＣＧＣ−３’
配列番号１９
センス：５’−ＡＡＡＧＣＣＡＵＧＣＵＣＡＡＣＣＵＧＣ−３’
アンチセンス：５’−ＧＣＡＧＧＵＵＧＡＧＣＡＵＧＧＣＵＵＵ−３’
配列番号２０
センス：５’−ＵＧＡＵＣＧＣＡＧＧＡＧＵＡＵＣＵＵＵｄＴｄＴ−３’
アンチセンス：５’−ＡＡＡＧＡＵＡＣＵＣＣＵＧＣＧＡＵＣＡｄＴｄＴ−３’

上記で記載したｓｉＲＮＡの有効性について調べるためのモデルとして、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸部腺がん）細胞の培養物を使用した。ＨｅＬａ細胞を、１００ｎＭの異なる化合物およびトランスフェクト剤（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ ａｇｅｎｔ）としてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００でトランスフェクトした。全てのトランスフェクションは、製造元による標準的な指示書に従い行った。同じトランスフェクションにおいて、異なるスクランブルｓｉＲＮＡを対照として使用した。細胞ペレットを２４、４８、および７２時間後に回収してタンパク質レベルにおいて起こり得る変動を評価し、リアルタイムＰＣＲで処理した。リアルタイムＱｒｔ−ＰＣＲにより得られた結果を定量化するために、比較閾値法を使用した。

結果により示される（図１）通り、標的配列である配列番号１に向けられたｓｉＲＮＡは、ＴＲＰＶ１遺伝子のサイレンシングに関して、同じ遺伝子の異なる領域に向けられた既述のｓｉＲＮＡ生成物よりはるかに効果的である。さらに、トランスフェクションの７２時間後においても、ｍＲＮＡレベルのなお顕著な下方調節が認められることから、この効果は長期持続する。この効果の持続は、予測外であり、配列特異的である。

生成物のさらなる改善をもたらす目的で、以下の記載に従い上記生成物に異なる化学修飾を導入した：
配列番号３：
センス：５’−ＡＡＧＣＧＣＡＵＣＵＵＣＵＡＣＵＵＣＡ−３’
アンチセンス：５’−ＵＧＡＡＧＵＡＧＡＡＧＡＵＧＣＧＣＵＵ−３’
配列番号４：
センス：５’−ＡＡＧＣＧＣＡＵＣＵＵＣＵＡＣＵＵＣＡ−３’
アンチセンス：５’−ＵＧＡＡＧＵＡＧＡＡＧＡＵＧＣＧＣＵＵ−３’
配列番号８：
センス：５’−ＡＡＧＣＧＣＡＵＣＵＵＣＵＡＣＵＵＣＡ−３’
アンチセンス：５’−ＵＧＡＡＧＵＡＧＡＡＧＡＵＧＣＧＣＵＵ−３’
配列番号９：
センス：５’−ＡＡＧＣＧＣＡＵＣＵＵＣＵＡＣＵＵＣＡ−３’
アンチセンス：５’−ＵＧＡＡＧＵＡＧＡＡＧＡＵＧＣＧＣＵＵ−３’
配列番号１０：
センス：５’−ＡＡＧＣＧＣＡＵＣＵＵＣＵＡＣＵＵＣＡ−３’
アンチセンス：５’−ＵＧＡＡＧＵＡＧＡＡＧＡＵＧＣＧＣＵＵ−３’
配列番号１１：
センス：５’−ＡＡＧＣＧＣＡＵＣＵＵＣＵＡＣＵＵＣＡ−３’
アンチセンス：５’−ＵＧＡＡＧＵＡＧＡＡＧＡＵＧＣＧＣＵＵ−３’
［配列中、下線部は、２’−Ｏ−メチル基を含む塩基を表す］
配列番号５：
センス：５’−ＡＡＧＣＧＣＡｄＴＣｄＴｄＴＣｄＴＡＣｄＴｄＴＣＡ−３’
アンチセンス：５’−ＵＧＡＡＧＵＡＧＡＡＧＡＵＧＣＧＣＵＵ−３’
配列番号６：
センス：５’−ＡＡＧＣＧＣＡｄＴＣｄＴｄＴＣｄＴＡＣｄＴｄＴＣＡ−３’
アンチセンス：５’−ｄＴＧＡＡＧｄＴＡＧＡＡＧＡｄＴＧＣＧＣｄＴｄＴ−３’
配列番号１２：
センス：５’−ＡＡＧＣＧＣＡｄＴＣＵｄＴＣｄＴＡＣｄＴｄＴＣＡ−３’
アンチセンス：５’−ＵＧＡＡＧＵＡＧＡＡＧＡＵＧＣＧＣＵＵ−３’
配列番号１３：
センス：５’−ＡＡＧＣＧＣＡｄＴＣＵｄＴＣｄＴＡＣＵｄＴＣＡ−３’
アンチセンス：５’−ＵＧＡＡＧＵＡＧＡＡＧＡＵＧＣＧＣＵＵ−３’
配列番号１４：
センス：５’−ＡＡＧＣＧＣＡｄＴＣＵＵＣｄＴＡＣＵｄＴＣＡ−３’
アンチセンス：５’−ＵＧＡＡＧＵＡＧＡＡＧＡＵＧＣＧＣＵＵ−３’
配列番号１５：
センス：５’−ＡＡＧＣＧＣＡｄＴＣＵＵＣＵＡＣＵｄＴＣＡ−３’
アンチセンス：５’−ＵＧＡＡＧＵＡＧＡＡＧＡＵＧＣＧＣＵＵ−３’
配列番号１６：
センス：５’−ＡＡＧＣＧＣＡｄＴＣＵＵＣＵＡＣＵｄＴＣＡ−３’
アンチセンス：５’−ＵＧＡＡＧｄＴＡＧＡＡＧＡｄＴＧＣＧＣＵＵ−３’。

上記配列中、一部または全てのウラシルヌクレオチドは、デオキシチミジンヌクレオチドに置換されている。

これらの化合物を、配列番号２（いかなる修飾ヌクレオチドも含まない同じ化合物）と共に、免疫原性アッセイにおいて調べた。結果から、これらの全ての化合物が、末梢血単核細胞内の免疫応答の誘導を顕著に低減させることが示された。さらに、ほとんどの化合物は、その最高レベルで応答を誘導し、その応答は、ヒト臨床試験を通過しアッセイに対照として組み入れられたｓｉＲＮＡ（ベバシラニブおよびＳｉｒｎａ−０２７）によりもたらされる応答と同じ程度に低かった。

様々な程度の修飾によりｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング能を変化させることが可能なため、これらの化合物をＨｅＬａ細胞にトランスフェクトすることによりそれらのＲＮＡ干渉能力についてさらに調べ、結果として得られるＴＲＰＶ１ ｍＲＮＡレベルを前出の段落において記載した方法に従い測定した。

図２からわかるように、全ての化合物は、ＴＲＰＶ１ ｍＲＮＡレベルを多様な程度で効率的に低下させる能力を保持する。

上記で記載した化合物に由来する、予測されなかったさらに有益な効果は、それらの図５で観察できるＲＮアーゼによる分解に対する耐性の増強である。

これらの実験のために、化合物を、ＰＢＳ中に１０％ヒト血漿中に、２μＭの最終濃度で懸濁させ、３７℃で２４時間にわたりインキュベートした。次いで、試料を、ＨＰＬＣ−ＵＶを使用して解析し、残存する無傷生成物の量を決定する。図５で観察されうる通り、１９個のヌクレオチドの二本鎖配列番号２の化合物（いかなる化学修飾も含まない）は、分解に対する耐性が既述の３’オーバーハングを含む配列番号２１：５’−ＣＡＡＧＡＵＣＧＣＡＣＡＧＧＡＧＡＧＣｄＴｄＴ−３’（また、ＷＯ２００７０４５９３０においても記載されている）のほぼ３倍である。この効果は、前出の段落で記載した、一部の化学修飾されたヌクレオチドを含む配列番号３の化合物についてさらに増強されている。

ｉｎ ｖｉｖｏ解析
ドライアイおよび眼痛の動物モデルは、ウサギ、この場合にはニュージーランドホワイトウサギを使用することが多い。この目的で、本発明のｓｉＲＮＡのさらなる利点は、標的配列である配列番号１が、様々な動物配列全体でＴＲＰＶ１遺伝子の高度に保存された領域であることである。実際、この配列はヒトとウサギとで同一であることから、この動物モデルは前記疾患の研究にとりわけ適するものとなっている。

以下で記載される実験は、当業者公知の眼痛の標準的なモデル（Ｇｏｎｚａｌｅｚら、１９９３）を使用して実施した。略述すると、疼痛は、適切なマイクロピペットを使用して１％のカプサイシン（ＴＲＰＶ１の公知のアゴニスト）溶液３０μｌを眼に滴下することにより誘導した。倫理的な配慮により、カプサイシンで処置される動物には、用量５ｍＭの公知のカプサイシンアンタゴニストであるカプサゼピンまたは被験化合物を含有する４０μｌの溶液をあらかじめ施した。こうして、鎮痛効果を、基準処置としてのカプサゼピンと比較して測定する。

被験物質および基準物質を、右眼に、１日目〜３日目には１日１回滴下し、４日目には１日２回（６０分間の間隔を置く）滴下した。４日目、最後の滴下の１５分後、動物の右眼に１％のカプサイシンの単回滴下により、角膜疼痛を誘導した。反対側の眼には、研究を通じてＰＢＳを滴下し、対照として用いた。

疼痛に対する応答を測定するために、眼瞼開口を測定した。眼は疼痛に応答して閉じられ、疼痛感覚が収まると、眼瞼開口は正常レベルに戻って増大すると考えられる。処置前（ベースライン）、疼痛を誘導する直前に眼瞼開口を測定し、次いで、疼痛を誘導した１、５、１０、１５、２０、２５、３０分後にも眼瞼開口を測定した。

図３および４からわかるように、本発明に係る化合物を、とりわけ配列番号２の化合物について調べ、カプサゼピンより大きな鎮痛効果（眼瞼開口の程度により測定される眼の回復）が誘導されることを観察した。したがって、この化合物は、眼不快感に有効な治療的処置であることが分かった。

さらに、本発明の化合物（配列番号２、配列番号４、および配列番号５）を、ＷＯ２００７０４５９３０で記述の配列番号２１と共にウサギの眼に投与する別のｉｎ ｖｉｖｏ実験も実施した。この場合、ウサギ（処置群１つ当たり６匹ずつの動物）には、化合物を３日連続で毎日投与した。３日目の最後の滴下の２時間後に、動物を屠殺した。これらのウサギからの眼組織を回収し、ＲＴ−ＰＣＲを使用してＴＲＰＶ１特異的なｍＲＮＡの存在について解析した。以下の表（表１）は、所与の組織内で達成されたＴＲＰＶ１遺伝子サイレンシングのレベルを示し、配列番号２１の基準化合物により達成された阻害に対する比率％として表される。

これらの結果から明らかな通り、本発明の化合物は、眼組織内のＴＲＰＶ１遺伝子の発現をサイレンシングするときに、既述の化合物よりはるかに有効である。

本発明の化合物の長時間持続する効果と共により大きな有効性を有することから、例えば投与間の時間の延長を可能にする等の有利な投与レジメンが可能になり、患者の生活の質が顕著に改善されるものと予想される。

別の実験を実施して、ＰＢＳによる配列番号２の眼内投与後のニュージーランドホワイトウサギにおける組織分布および血漿曝露を評価した。使用される材料および方法を、以下の表（表２）で指定する。

全ての計算は、配列番号２のナトリウム塩の分子量を使用して行った。配列番号２の濃度の計算は、３つの異なる方式で行った：
１．無傷の代謝されていない配列番号２のアンチセンス鎖（親化合物）のピーク面積に基づく方式。この値は、組織内で変化しない親化合物の量のマーカーである；
２．無傷の配列番号２の５’−リン酸化アンチセンス鎖のピーク面積に基づく方式。この値は、細胞質画分内に存在し、５’−リン酸化により活性化される親化合物の量のマーカーである；
３．全ピーク面積に基づく方式。この値は、試料中に存在する無傷の配列番号２および代謝された配列番号２の全てを集約する。

投与の５分後および３０分後において、肝臓、腎臓皮質および腎臓髄質、肺、毛様体、網膜、虹彩、涙腺、角膜、房水および硝子体液、神経節、血漿、ならびに尿の試料を回収した。ウサギ（ｎ＝６）への配列番号２の１回の眼内投与の後、結果から以下のことが示された。
・配列番号２の全身曝露は、１ｎｇ／ｇ以下の濃度での眼への投与の５分後および３０分後において、血漿中および全身組織試料中で検出された（表３を参照されたい）。

・配列番号２は、投与の５分後において、全ての眼組織内および眼流体中で検出することができ、投与の３０分後において、濃度を大きく低下させた（表４を参照されたい）。

・網膜、虹彩、毛様体、および涙腺では、投与の５分後および３０分後において、５’−リン酸化アンチセンス（ａｓ）鎖が検出されたことから、ｓｉＲＮＡ（標的細胞区画内の活性化ｓｉＲＮＡ）のこれらの組織内の細胞質内送達が指し示される（図６を参照されたい）。

これらのデータは、配列番号２の眼投与後において、動物は、全ての眼組織内に分布する活性化配列番号２であって、投与の５分後に検出されうる活性化配列番号２を提示することを反映する。

ヒトにおける解析
まず、配列番号２に従う化合物に対する眼の忍容性を、３０例の健常ヒト成人において評価した。

研究は、２つの期間で構成された。第１の期間で被験薬の単回投与を使用し、初期の安全性評価を行った後、第２の期間で複数回投与を行った。

期間１、単回投与：非介入群を対照し、投与が施された眼を無作為化した。一方の眼だけに被験物質が投与され他方の眼には介入が施されないということから、各ボランティアが自分自身の対照であったが、安全性評価試験も実施した。安全性評価を行う眼科医は、薬物投与に対して盲検とされた。血流への生成物の吸収を決定した。

期間２、複数回投与：オープン並行群間対照研究：処置される眼を無作為化した。評価者は、被験薬の投与部位について盲検とされた。薬物投与前の眼および他方の眼はいずれも、対照と考えた。この段階で吸収を評価し、適切な場合は被験薬の薬物動態に加えて局所の安全性および全身の安全性も評価した。

第１段階の安全性および薬物動態を評価したら、第２段階を開始した。第１段階の結果により、第２段階でも薬物動態評価を継続する必要があるかどうかを確立した。

３０例の成人を、異なる処置群に分配し、一方の眼に、単回で、用量６００μｇの化合物を含有する２６．６μｌの点眼剤を施す（期間１）か、または眼１つ当たり６００もしくは９００μｇの化合物を１週間にわたり毎日投与し（期間２）、それぞれ、２６．６μｌまたは４０μｌの体積で投与した。期間１は６例のボランティアを対象とし、期間２は、２４例のボランティアを対象とし、群の半分の各々に異なる用量レベルを適用する２つのコホートへと分けた。合計で、期間１は単回の投与を含み、期間２は７回の投与を含む（１日当たり１回の投与）。

局所的な忍容性の評価は、期間２における最後の投与の２４時間後、および期間１における単回滴下の７２時間後に実施される検査において眼の表面上で検出される変化（局所的な有害作用）の頻度に基づいてなされた。良好な忍容性は、ＣＴＣＡＥｖ３尺度（有害事象共通用語基準）におけるグレード３以上の毒性の非存在として規定した。

カイ二乗検定を使用して、局所的な有害作用と薬物との関係を決定し、症状または局所的徴候（症状の数に関わらず）が、処置との関係で各眼に現れたのか否かについて検討した。少なくとも１つの症状または徴候が生じた場合は、解析により、各眼における有害作用の存在について検討した（表５を参照されたい）。

局所的変化（局所的な有害作用）の発生については、処置される眼と処置されない眼との間の差違が観察されず、ピアソンのカイ二乗値１．００２（ｐ＝０．３１７）を得た。

試験のいずれの期間においても、薬物関連の眼表面変化は、観察されず、したがって、最長で７日間にわたる点眼剤で単回投与または複数回投与として投与される場合の局所的忍容性は極めて良好であった。

この試験のさらなる目的は、処置後における解析パラメータに対する影響、身体検査、バイタルサイン、および心電図に対する影響をモニタリングすることにより、化合物に対する全身の忍容性を評価することであった。

選択過程、薬物を投与する前、および最終回の配列番号２の投与の数日後の最終検査において、血液解析および尿解析を実施した。関連データについてのスチューデントのｔ検定を使用して、選択時と最終検査時との間の解析パラメータの変化について研究を行った。以下の表は、前記パラメータの間の差違の平均、標準偏差、および統計学的有意性を示す（表６を参照されたい）。

一部のパラメータでは、選択検査時と最終検査時との間で差違が観察されたが、全ての値は、正常であると考えられ、臨床的有意性は認められなかった。

上記で指し示した通り、研究期間内の選択時、および処置段階の異なる時点、および最終検査時において、バイタルサイン（血圧および心拍）を測定した（表７および８を参照されたい）。

期間１に参加した６例のボランティアについての、測定時点にわたる平均値および反復測定ＡＮＯＶＡによる統計学的解析を以下に示す（表７を参照されたい）。

期間２におけるバイタルサインは、１日目に行った検査および７日目に行った検査において、被験医薬生成物の初回投与および最終回投与の前とこれらを行った１時間後に測定した。バイタルサインはまた、選択検査時および最終検査時においても測定した。選択時の値をベースラインとし、反復測定ＡＮＯＶＡを使用して、バイタルサインの推移を、２４例のボランティアについて、期間２の研究の経過にわたり評価した（表８を参照されたい）。

心電図は、選択検査時に実施し、最終検査時にもさらなる心電図を実施した。関連試料についてスチューデントのｔ検定を使用して、選択検査時と最終検査時との間の比較を行う。以下の表は、解析の各パラメータおよび結果の平均および標準偏差についてまとめる（表９を参照されたい）。

表７および８の血圧測定値の一部ならびに表９の心拍測定値の一部において統計学的に有意な変化が観察されたが、全ての値は、正常な限界内に収まり、したがって、これらの差違は、臨床的に有意ではない。

全身の忍容性は良好であり、血液解析および尿解析、心電図、または最終評価時において行われた検査における変化は見られなかった。

血液解析を実施して、薬物の投与後に得られる血漿試料中の配列番号２の濃度を決定した。第１の期間において、投与後４時間にわたりサンプリングを実施し、生成物投与の５、１５、３０分後、および４時間後に血液を抽出した。第２の期間において、１日目の投与の５分後に血液試料を回収し、７日目の化合物投与の前、かつ、また、生成物投与の５分後のいずれにおいても再度血液試料を回収した。

検証された生物学的解析法により、回収された血液試料のいずれにおいても化合物が検出されなかったので、いずれの期間についても、薬物動態プロファイルは決定することができなかった（ＬＬＯＱ：１０ｎｇ／ｍＬ）。血中の検出可能な量の化合物の非存在は、血流に入ったときに予測される、ＲＮアーゼの存在に起因するＲＮＡの急速な分解と符合する。

全てのこれらの事実は、配列番号２は、健常なヒトにおける眼科溶液中で良好な忍容性を示すという結論を裏付ける。

次いで、動物モデルにおいて得られた肯定的な結果および健常なヒトにおける毒性の非存在を踏まえ、化合物を、眼痛およびドライアイを患う患者において調べた。

対象
軽度から中等度の眼痛およびドライアイ症候群を有すると診断された６０例の成人患者を登録した。これらの患者のうち半分の患者は６５歳を超える。眼疾患のレベルは、Ａｌｌｅｒｇａｎ Ｉｎｃ．により開発されたＯＳＤＩ（Ｃ）（眼表面疾患指数）質問票およびＶＡＳ（視覚的アナログ尺度）の評価を使用して確立する。組み入れ基準は、ドライアイについては、ＯＳＤＩ（Ｃ）における１３〜３０のスコアであり、疼痛については、ＶＡＳにおける２〜７のスコアであった。研究への受け入れの前に、包括的な身体検査および眼検査を実施して、研究への参加に対する対象の適性を確認する。

研究デザイン
１０日間の処置において、毎日点眼剤として投与される配列番号２の化合物の鎮痛効果および忍容性を評価するために、並行群間プラセボ対照二重盲検臨床研究をデザインした。

副次的目的は、各回の投与後における局所忍容性、全身忍容性（検査室パラメータ、身体検査、およびバイタルサインに対する影響）、ならびに被験薬と関連する可能性がある視力、眼内圧、シルマー検査および涙液層破壊時間の変化（存在する場合）の評価である。

全ての場合において、薬物またはプラセボを両眼に滴下する。両方の眼を、盲検化された様式でモニタリングする。

ベースライン期間
初回の被験薬投与の最大で１５日前に、対象を、臨床試験の処置期間に参加する適格性に照らして登録する。

処置期間
１日目において、対象を、点眼剤として眼に局所投与される化合物またはプラセボへと、２：１の比で無作為化する。対象には、眼１つ当たりの最終体積４０μｌの化合物または媒体（プラセボ）を施した。なされた投与は、眼１つ当たり９００μｇの化合物の投与である。

対象は、被験薬の投与および評価のために、毎日（金融機関の休業日および週末を含む）施設に来院する。対象には、投与１回分の化合物を、両眼に１日１回１０日間にわたり施す。

１０日目において、患者は再度、ベースラインにおいて実施される検査と同等の完全な検査を受ける。

追跡来院
初回投与の１４〜２０日後に（最終回投与の４〜１０日後に）行われる追跡来院時において、最終評価を行い、処置期間の終了後における患者の動向を決定する。

配列番号２の、患者のドライアイおよび眼痛のレベルに対する効果を決定するため、ＯＳＤＩ（Ｃ）およびＶＡＳにおける各個別のスコアを、処置を開始する前日に記録し、１０日目のスコアと比較する。結果はとりわけ、ＯＳＤＩ（Ｃ）質問票から得られる中央値スコアの変化、およびＶＡＳ評価の中央値強度の変化により測定する。

また、処置を開始する前および処置の１０日後において実施される眼検査に由来する結果も比較して、忍容性を確認する。

結果
ＯＳＤＩ（Ｃ）質問票は、０〜１００の尺度で評価し、スコアが大きいほど重篤な機能障害が表される。指数は、正常対象とドライアイ疾患を伴う患者との識別における感度および特異度を裏付けている。ＯＳＤＩ（Ｃ）は、１２の質問からなり、ドライアイ疾患と符合する症状を迅速に指し示すようにデザインされている。ＯＳＤＩ（Ｃ）は、ドライアイ疾患の重症度（正常、軽度〜中等度、および重度）を測定するための、妥当かつ信頼できる手段であり、米国食品医薬品局により、臨床試験における使用について承認されている。ＯＳＤＩ（Ｃ）の妥当性および信頼性は評価され、ドライアイについての良好〜極めて良好な信頼性、妥当性、感度および特異度をもたらすことが見出されている。全体的なＯＳＤＩ（Ｃ）スコアの推定値により、眼表面を、正常（０〜１２ポイント）な表面、または軽度（１３〜２２ポイント）の疾患、中等度（２３〜３２ポイント）の疾患、もしくは重度（３３〜１００ポイント）の疾患を有する表面として規定した。

疼痛質問票であるＶＡＳは、様々な成人集団において広く使用されている、疼痛の強さについての一次元的尺度である。ＶＡＳでは、連続的な値にわたり、眼痛のように直接容易に測定することができない疼痛を測定する。ＶＡＳでは、疼痛の強さについて、尺度を、「疼痛なし」（０のスコア）および「想像しうる最悪の疼痛」（１０のスコア）の両極とすることが最も一般的である。

結論
臨床試験の化合物：プラセボ比が２：１であること、およびこの比が、解析される患者の数とは独立に維持されることを考慮すると、眼に局所投与されると、患者へと毎日適用される配列番号２の効果は、ドライアイ疾患の重症度を低減し、眼痛を低減することが可能であると結論することができる。

Claims (11)

1. ドライアイおよび／または眼痛を処置するための医薬の製造における配列番号１を標的化するｓｉＲＮＡの使用であって、前記ｓｉＲＮＡは、１日当たり約０．１〜約１０ｍｇの投与量で投与される、使用。
2. 前記ｓｉＲＮＡが、１日当たり約０．５〜約１．５ｍｇの投与量で投与される、請求項１に記載の使用。
3. 前記ｓｉＲＮＡが、１日当たり眼１つ当たり約０．６ｍｇまたは約０．９ｍｇの投与量で投与される、請求項１に記載の使用。
4. 前記ｓｉＲＮＡが、５〜１５日間投与される、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
5. 前記ｓｉＲＮＡが、１０日間投与される、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用。
6. 前記ｓｉＲＮＡが、長期間投与される、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用。
7. 前記ｓｉＲＮＡが、配列番号２として規定される化合物である、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用。
8. 前記ｓｉＲＮＡが、眼に局所投与される、請求項１から７のいずれか一項に記載の使用。
9. １日当たり約０．１〜約１０ｍｇの投与量で投与される、ドライアイおよび／または眼痛の処置で使用するための、配列番号１を標的化するｓｉＲＮＡ。
10. 配列番号１を標的化するｓｉＲＮＡが１日当たり約０．１〜約１０ｍｇの投与量で投与される、ドライアイおよび／または眼痛を処置する方法。
11. 配列番号１を標的化するｓｉＲＮＡを投与するための医療用キットであって、毎日投与するために約０．１〜約１０ｍｇの投与量で含有される配列番号１を標的化するｓｉＲＮＡと、請求項１から７のいずれか一項に従って配列番号１を標的化するｓｉＲＮＡを投与するための印刷された指示書とを供給することを含む、医療用キット。