MX2015002802A - Siarn y su uso en los metodos y composiciones para el tratamiento y/o prevencion de enfermedades de los ojos. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a métodos y composiciones para el tratamiento y/o prevención de afecciones oculares relacionadas con altos niveles de expresión y/o actividad del receptor vaniloide-1 (TRPV).

Description

siARN Y SU USO EN LOS MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA EL TRATAMIENTO Y/O PREVENCIÓN DE ENFERMEDADES DE LOS OJOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la provisión de productos de siARN y su uso en los métodos y composiciones para el tratamiento y/o prevención de afecciones oculares relacionadas con altos niveles de expresión y/o actividad del vaniloide potencial de receptor temporal (TRPV1) utilizando la interferencia de ARN. Entre otras cosas, deben ser mitigadas las condiciones oculares asociadas al dolor ocular, como malestar y alteración de la sensibilidad de la córnea después de la cirugía refractiva, el uso de lentes de contacto, el síndrome de ojo seco, y el síndrome de Sjogren.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El ARN de interferencia (ARNi) es un mecanismo regulador de ocurrencia natural de la mayoría de las células eucariotas que utilizan moléculas pequeñas de ARN de doble cadena (dsARN) para el silenciamiento directo de genes dependiente de homología. Su descubrimiento por Fire y Mello en el gusano C. elegans {Fire, 1998} fue galardonado con el premio Nobel en 2006. Poco después de su primera descripción, también se demostró que ARNi se produce en las células de mamíferos, no a través de largo dsARNs sino por medio de ARNs de interferencia pequeños de doble cadena (siARNs) de 21 nucleótidos de longitud {Elbashir, 2001}.

Se cree que el proceso de la interferencia de ARN es un mecanismo de defensa celular conservado evolutivamente para evitar la expresión de genes extraños y es comúnmente compartido por diversos phylum y flora, donde se denomina silenciamiento de genes post-transcripcional . Desde el descubrimiento del mecanismo de ARNi ha habido una explosión de la investigación para descubrir nuevos compuestos que pueden alterar selectivamente la expresión génica como una nueva manera de tratar la enfermedad humana abordando objetivos que son de otro modo "no susceptible a ser modificadas por fármacos" con los enfoques farmacéuticos tradicionales que implican moléculas o proteínas pequeñas.

Según los conocimientos actuales, se inicia el mecanismo de ARNi cuando se procesan ARNs largos de doble cadena por una proteína similar a RNasa III conocida como Dicer. La proteína Dicer contiene típicamente un dominio de helicasa de ARN N-terminal, un dominio Piwi/Argonaute/Zwille PAZ) así llamado de unión a ARN, dos dominios de ARNsa III y un dominio de unón de ARN de doble cadena (dsRBD) {Collins, 2005} y su actividad conduce a la transformación de las largas ARNs de doble cadena en siARN de doble cadena de 21 -24 nucleótidos con 2 colgantes de base 3' y un fosfato 5' y grupo hidroxilo 3'. Los duplos de siARN resultantes se incorporan en el complejo efector conocido como complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), donde el antisentido o guia de cadena de RISC de guia de siARN para reconocer y separar las secuencias de ARNm objetivo {Elbashir, 2001} sobre la adenosina-trifosfato dependiente de (ATP) que se desenrrolla de la molécula de siARN de doble cadena a través de una actividad de ARN helicasa {Nykanen, 2001}. La actividad catalítica de RISC, que conduce a la degradación del ARNm, está mediada por la endonucleasa de Argonaute 2 (AG02) {Liu, 2004; Song, 2004}. AG02 pertenece a la familia Argonaute altamente conservada de proteínas. Las proteínas Argonaute son -100 KDa proteínas muy básicas que contienen dos dominios comunes, a saber dominios PIWI y PAZ {Cerutti, 2000}. El dominio PIWI es crucial para la interacción con Dicer y contiene la actividad nucleasa responsable de la escisión del ARNm {Song, 2004}. AG02 utiliza una cadena del siARN dúplex como una guía para encontrar ARN mensajeros que contienen secuencias complementarias y escinde el esqueleto fosfodiéster entre las bases 10 y 11 con relación al extremo 5' de la cadena guía {Elbashir, 2001}. Un paso importante durante la activación de RISC es la escisión de la cadena de sentido o pasajero por AG02, que retira esta cadena desde el complejo {Rand, 2005}. Estudios de cristalografía análisis de la interacción entre la cadena guía siARN y el dominio PIWI revelan que es sólo de 2 a 8 nucleótidos que constituye una "secuencia de semillas" que dirige el reconocimiento ARNm objetivo por RISC, y que una falta de coincidencia de un solo nucleótido en esta secuencia puede afectar drásticamente silenciar capacidad de la molécula {Ma, 2005; Doench 2004; Lewis, 2003}. Una vez que el mARN se ha escindido, y debido a la presencia de extremos de ARN sin protección en los fragmentos, el ARNm es más escindido y degradado por nucleasas intracelulares y ya no se traduce en proteínas {Orban, 2005} mientras RISC se reciela para sus rondas posteriores {Hutvagner, 2002}. Esto constituye un proceso catalítico que conduce a la reducción selectiva de moléculas de ARNm específicas y las proteínas correspondientes. Es posible explotar este mecanismo nativo para el silenciamiento de genes con el propósito de regular cualquier gen de elección mediante el suministro directamente de efectores siARN en las células o tejidos, donde se activarán RISC y producir un silenciamiento potente y específico del ARNm objetivo.

Se han publicado muchos estudios que describen los aspectos ideales con un siARN deberá tener que lograr la máxima eficacia, en cuanto a la longitud, estructura, composición química y secuencia. Los parámetros iniciales para el diseño de siARN se establecieron por Tuschl y colaboradores en el documento WO02/44321, aunque muchos estudios posteriores, se han publicado algoritmos y/o mejoras desde entonces. Además, se ha hecho un considerable esfuerzo para mejorar la estabilidad de siARN ya que esto es percibido como uno de los principales obstáculos para la terapia basada en siARN, dada la naturaleza ubicua de ARNsas en fluidos biológicos. Una de las principales estrategias para la mejora de la estabilidad seguida ha sido el uso de nucleótidos modificados tales como nucleótidos de nucleótidos 2 '-O-metilo, de 2'-amino, nucleótidos que contienen puentes de metileno 2'-0 o 4'-C. Además, se ha descrito la modificación de la estructura de la base de ribonucleótido que se conecta con nucleótidos adyacentes, principalmente por la introducción de fosforotioato modificado nucleótidos. Parece que la estabilidad mejorada a menudo es inversamente proporcional a la eficacia (Parish, 2000), y sólo un cierto número, posiciones y/o combinaciones de nucleótidos modificados pueden dar lugar a un compuesto silenciamiento estable. Como se trata de un obstáculo importante dentro de los tratamientos a base de siARN, han sido publicados diferentes estudios que describen ciertos patrones de modificación que muestran buenos resultados, los ejemplos de este tipo incluyen EP1527176, W02008/050329, W02008/104978 o W02009/044392, aunque muchos más se pueden encontrar en la literatura.

El Vaniloido-1 Potencial de Receptor Temporal (TRPV1), también llamado Receptor Vanilolido 1 (VR-1), es un canal catiónico de compuerta de ligando que responde a capsaicina, que fue descubierta por primera vez en 1997 (Caterina, 1997). TRPV1 se expresa principalmente en las neuronas sensoriales y sirve como un detector molecular para el calor, la capsaicina, protones, y endovaniloides (Caterina, 2001; Montell, 2002; Baumann, 2000). Aunque los inventores de la presente solicitud también han encontrado expresión de TRPV1 en los tejidos de glándula lagrimal y el cuerpo ciliar.

Cuando TRPV1 se activa por los agonistas tales como la capsaicina y otros factores tales como el calor, acidosis, los productos de la lipoxigenasa o la anandamida, el calcio entra en la célula y se inician las señales de dolor. La activación del canal induce la liberación de neuropéptidos de las terminales nerviosas sensoriales centrales y periféricas, dando como resultado la sensación de dolor, inflamación neurogénica, y, a veces, en la contracción del músculo liso y tos. Como cuestión de hecho, la evidencia reciente sugiere un papel de TRPV1 en el dolor, tos, asma e incontinencia urinaria (Jia, 2005). De hecho, TRPV1 es un objetivo conocido para los tratamientos de analgesia en respuesta a estímulos de dolor. Por otra parte, los tratamientos diseñados para reducir los niveles de expresión de TRPV1 utilizando diferentes teenologías también se han descrito en el documento W02004/042046, o (Schubert, 2005), con un enfoque en el tratamiento del dolor.

Los nociceptores polimodales son el tipo más abundante de los nociceptores que se encuentran en la córnea. Existe evidencia de que estas fibras farmacológicas de los receptores expresan el receptor TRPV1 porque responden a la capsaicina, el calor y ácido. Además, las altas dosis de capsaicina inactivan la respuesta al calor y al ácido de los nociceptores polimodales de la córnea mientras que la capacidad de respuesta mecánica no se ve afectada. Esto sugiere que los receptores TRPV1 presentes en las terminaciones nerviosas polimodales de la córnea fueron selectivamente inactivados.

Por lo tanto, es probable que una parte importante de la respuesta nociceptiva aguda a la lesión corneal y las sensaciones de dolor sostenidas que acompañan a los procesos inflamatorios e irritativos en este tejido está mediada por la activación TRPV1.

Además, W02007/045930 describe el uso de TRPV1 siARN específicos para el tratamiento de patologías oculares relacionadas con el dolor ocular y el síndrome de ojo seco. Sin embargo, la presente invención proporciona productos mejorados para reducir la expresión de TRPV1 y el malestar ocular consecuente. La ventaja de tratar estas condiciones con productos siARN vs inhibidores químicos tradicionales es que los tratamientos basados en siARN tendrán un efecto más duradero. Este resultado es debido al hecho de que una vez que la molécula efectora ya no está presente, la célula tiene que sintetizar nuevos receptores a partir de cero; mientras que los tratamientos tradicionales dejarían intactos los niveles de receptores en la membrana celular .

Debido al estilo de vida actual, el número de personas afectadas por patologías oculares relacionados con la sensibilidad ocular alterada es bastante alta, y se espera que aumente con el envejecimiento de la población. La cirugía refractiva y el uso de lentes de contacto a menudo derivan en la alteración de la sensibilidad corneal y una sensación de ojo seco por el paciente. Esto se agrava aún más por largas horas de trabajo mirando la pantalla de la computadora y el uso de sistemas de aire acondicionado que suele secar aún más la atmósfera. Además, la cantidad y calidad de las lágrimas disminuyen con la edad. Los síntomas que acompañan a los síndromes del ojo seco incluyen picazón, ardor e irritación de los tejidos oculares. Una forma más grave de ojo seco ocurre en pacientes con síndrome de Sjogren.

La presencia de una o diferentes combinaciones de estas sensaciones se denomina dolor ocular en el sentido del presente texto. En la actualidad se calcula que el síndrome de ojo seco afecta a más de 10 millones de estadounidenses .

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es un diagrama gue muestra el perfil de expresión temporal de TRPV1, usando QRT-PCR, después de la transfección de células Hela con diferentes siARNs dirigidos TRPV1: un compuesto de acuerdo con la presente invención (SEC ID NO: 2), un compuesto descrito previamente orientado a una región diferente (SEC ID NO: 7), y otros cuatro siARNs (SEC ID NO: 17 a 20) diseñados para dirigir TRPV1 y una secuencia combinada utilizada como control negativo. Dos representaciones alternativas de los mismos resultados se muestran para garantizar la claridad, A y B.

La Figura 2 es un diagrama que muestra el perfil de expresión temporal de TRPV1, usando QRT-PCR, después de la transfección de células HeLa con diferentes siARNs de la presente invención: SEC ID NO: 2 a SEC ID NO: 6, y SEC ID NO: 8 a SEC ID NO: 16, y una secuencia combinada utilizada como control negativo.

La Figura 3 muestra una línea de tiempo con la apertura palpebral medida en mm de los ojos de los conejos tratados con un compuesto de la presente invención (SEC ID NO: 2) en comparación con la capsazepina, un analgésico especifico aceptado para dolor dependiente de TRPV1, después de la estimulación con capsaicina .

La Figura 4 es un gráfico que muestra la relación (%) con respecto a los valores pre-prueba, de la abertura palpebral después de la inducción del dolor con la capsaicina, que resulta del tratamiento con un compuesto de la presente invención (SEC ID NO: 2) y capsazepina .

La Figura 5 es un gráfico que muestra la cantidad de producto intacto (%) restante después de haber sido expuesto a 10% de plasma durante 24 horas.

La Figura 6 es un gráfico que muestra la concentración de SEC ID NO: 2 en los tejidos del ojo sobre la base de cadena antisentido intacta 5-fosforilada, lo que significa que la cantidad de la cadena antisentido no metabolizada intacta de SEC ID NO: 2 (compuesto parental) que es presente en el compartimiento citoplasmático y se activa por fosforilación de 5'. Barra de la izquierda: 5 min; barra derecha : 30 min.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la presente invención se refiere a la provisión de un régimen de dosificación para una molécula de siARN en donde dicha molécula se dirige específicamente a SEC ID NO: 1 y reduce la expresión del gen TRPV1 cuando se introduce en una célula.

Un gen es "dirigido" por un siARN según la presente invención cuando, por ejemplo, la molécula de siARN disminuye o inhibe la expresión del gen selectivamente. La frase "disminuir o inhibir selectivamente" tal como se utiliza aquí abarca siARN que afectan a la expresión de un gen, en este caso TRPV1. Alternativamente, un siARN dirigido a un gen cuando el siARN se híbrida en condiciones rigurosas con el gen transcrito, es decir, su ARNm. Capaz de hibridarse "en condiciones rigurosas" significa recocido para la región ARNm objetivo, en condiciones estándar, por ejemplo, alta temperatura y/o con bajo contenido de sal que tienden a desfavorecer la hibridación. Un protocolo adecuado (que implica O.lxSSC, 68 °C durante 2 horas) se describe en Maniatis, T., et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory, 1982, en las páginas 387-389.

Las secuencias de ácido nucleico citadas en este documento se escriben en una dirección 5' a 3' a menos que se indique lo contrario. El término "ácido nucleico" se refiere a ADN o ARN o una forma modificada del mismo que comprende las bases de purina o pirimidina presentes en el ADN (adenina "A", citosina "C", guanina "G", timina "T") o en el ARN (adenina "A", citosina "C", guanina "G", uracilo "U"). Los ARN de interferencia proporcionados en este documento pueden comprender bases de "T", por ejemplo en extremos 3', a pesar de que las bases de "T" no se producen naturalmente en el ARN. En algunos casos, estas bases pueden aparecer como "dT" para diferenciar desoxirribonucleótidos presentes en una cadena de ribonucleótidos .

La secuencia objetivo como se definió anteriormente se describe como una secuencia de ADN objetivo tal como se utiliza para la definición de variantes de transcripción en las bases de datos utilizadas para los fines de diseño de siARN, mientras que los compuestos específicos a utilizar serán secuencias de ARN definidos como tales.

Se han identificado diferentes variantes de la transcripción correspondientes a TRPV1 . Los números de Acceso GenBank correspondientes a cuatro transcripciones TRPV1 producidas por división alternativa son: NM_080704 (NM_080 704.3, GI: 117306161), NM_018727 (NM_018727.5, GI: 117306160), NM_080 706 (NM_08070 6.3, GI: 117306163) y NM_080705 (NM_080705.3, GI: 117306162). Además, ENSEMBL (MBL-EBI /Wellcome Trust Sanger Institute) tiene otras 5 transcripciones TRPV1 publicadas: ENST00000174621, ENST00000310522, ENSTO OOO0344161, ENSTO OOOO399752, ENSTOO000399756, ENSTO OOOO399759, ENST00OOO425167 .

La presente invención proporciona regímenes de dosificación para siARN que inhiben la expresión del gen TRPVl, estos siARN siendo especialmente eficientes en comparación con los que se describen en el estado de la téenica. Especialmente eficiente significa que logren mayores grados de inhibición y/o un efecto más prolongado en el tiempo.

Estos siARN están diseñados contra una secuencia objetivo común a todas las variantes de transcripción de TRPVl descritos en el párrafo anterior, y por lo tanto median la degradación mediada por RISC de todos los mARN posibles presentes en la proteína codificación celular de TRPVl. Dicha región objetivo preferida identificada por la presente invención se identifica en la SEC ID NO: 1 (5'-AAGCGCATCTTCTACTTCA-3 '). Se describen en W02011/148193 .

En consecuencia, un siARN según los aspectos de la presente invención comprenderán preferiblemente una molécula de ARN de doble cadena, cuya cadena antisentido comprenderá o consistirá en una secuencia de ARN sustancialmente complementaria a la SEC ID NO: 1, y su cadena de sentido comprenderá una secuencia de ARN complementaria a la cadena antisentido, en la que ambas cadenas se hibridan por emparejamiento de bases entre los nucleótidos estándar.

En el sentido de la presente invención "sustancialmente complementaria" a una secuencia de ARNm objetivo, también puede entenderse como "sustancialmente idéntica" a dicha secuencia objetivo. "Identidad", como se conoce por un experto normal en la téenica, es el grado de relación de secuencia entre secuencias de nucleótidos tal como se determina comparando el orden y la identidad de nucleótidos entre secuencias. En una modalidad, la cadena antisentido de un siARN que tiene 80%, y entre 80% hasta el 100% de complementariedad, por ejemplo, complementar iedad de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%, a la secuencia de ARNm objetivo se consideran sustancialmente complementaria y se pueden usar en la presente invención. El porcentaje de complementariedad describe el porcentaje de nucleótidos contiguos en una primera molécula de ácido nucleico que puede base de par en el sentido de Watson-Crick con un conjunto de nucleótidos contiguos en una segunda molécula de ácido nucleico.

Como es conocido por el estado de la técnica, se han propuesto muchas estructuras diferentes para lograr la interferencia de ARN. Generalmente, estas moléculas de doble cadena son de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud, e incluyen estructuras de extremos romos, asi como aquellos con colgantes. Se han descrito colgantes por ser ventajosos y pueden estar presentes en extremos 3' o en extremos 5' de cualquiera de las cadenas ya que reducen el reconocimiento por ARNasa e imitan el sustrato natural de Dicer. Algunos autores recomiendan incluyendo colgantes en ambos extremos 3' de las moléculas, mientras que otros lo consideran que es suficiente un colgante. Otros han descrito el uso de estructuras de punta roma con patrones específicos de modificación (EP 1527176, WO 2008/104978, y muchos otros).

Los colgantes pueden estar compuestos entre 1 y 5 nucleótidos, típicamente los colgantes se componen de dinucleót idos. Las moléculas clásicas utilizadas en el campo, comprenden una molécula de doble cadena de 19 nucleótidos que comprende además colgantes de dinucleót idos 3' que comprenden preferentemente desoxinucleótidos como se enseña en los estudios iniciales por Tuschl (WO02/44321) . Estos colgantes se dice para mejorar aún más la resistencia a la degradación de nucleasa (RNasa). Más tarde, Kim et al.2005 describe que los productos 21-mer (que contiene colgantes de dinucleót idos) son necesarios para la carga en RISC. Además, Bramsen et al. 2009 describen la introducción de posibles modificaciones desestabilizantees de los colgantes para aumentar aún más la eficiencia de silenci amiento.

Como tal, una modalidad preferida de los diversos aspectos de la presente invención se refiere a moléculas de siARN dirigidas a SEC ID NO: 1 que comprenden al menos un saliente.

Otra modalidad alternativa de los diversos aspectos de la presente invención proporciona moléculas de extremos romos.

Adicionalmente, una modalidad preferida de la presente invención se refiere a un siARN que comprende o que consiste en una estructura de doble cadena de nucleótidos 19 focalización SEC ID NO: 1.

Sorprendentemente, dichos 19 nucleótidos ARNs de doble cadena han demostrado ser más resistentes a la degradación que previamente describe productos con 21 nucleótidos y colgantes 3' como puede verse en la Figura 5.

Una modalidad particular de la presente invención se refiere a un 19 nucleótidos de doble cadena de extremos romos siARN dirigidos contra la SEC ID NO: 1.

En una modalidad particular adicional de este compuesto se identifica como SEC ID NO: 2 (5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA- 3). En una modalidad preferida adicional, la cadena antisentido de esta siARN es al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, complementaria a la SEC ID NO: 1.

Además, como se describe en la sección denominada antecedentes de la téenica, un problema importante con las moléculas de siARN es su inestabilidad en los fluidos biológicos debido a la naturaleza ubicua de ARNasa. En consecuencia, el uso de muchas modificaciones químicas diferentes a los nucleótidos ha sido descrito con el propósito de mejorar la estabilidad del compuesto.

Otro problema inherente de las moléculas de siARN es su inmunogenicidad, por lo que se han encontrado siARN para inducir la activación inespecífica del sistema inmunitario innato, incluyendo la regulación de ciertas citoquinas, por ejemplo, interferón tipo I y/o tipo II así como la IL-12, IL-6 y/o la producción de TNF-alfa. El origen de estos efectos se cree que es la activación de los receptores similares a Toll como TLR7, TLR8 y/o TLR3 por siARN.

Ambos de estos efectos, el reconocimiento por RNasa e inmunogenicidad, también se han descrito que son dependientes de la secuencia.

Algunas de las modificaciones químicas que potencian la estabilidad del compuesto por la disminución de la susceptibilidad a las ARNasa también son capaces de reducir la inducción de reconocimiento inmune de la respuesta subsiguiente. Sin embargo, la inserción de nucleótidos modificados químicamente en un siARN puede también dar como resultado la disminución de la eficacia de silenciamiento como se describe en la sección anterior, y por lo tanto debe abordarse con precaución.

En consecuencia, en una modalidad preferida de los diversos aspectos de la presente invención, el siARN comprende además al menos un nucleótido con una modificación química.

Las modificaciones químicas preferidas que mejoran la estabilidad y reducir los efectos inmunogénicos incluyen nucleótidos de 2'-O-metilo, nucleótidos de 2'-fluoro, nucleótidos de 2'-amino, nucleótidos 2'-desoxi, nucleótidos que contienen puentes de metileno 2' o 4' 0-C. Además, la modificación de la estructura de la base de ribonucleótido que conecta nucleótidos adyacentes por la introducción de nucleótidos modificados con fosforotioato. Una modificación química preferida adicional, en el sentido de la presente invención se refiere a la sustitución de ribonucleótidos uracilo con desoxit imidina (desoxirribonucleótidos ). En otra modalidad preferida de la presente invención, al menos un nucleótido modificado químicamente está en la cadena con sentido, en la cadena antisentido o en ambas cadenas del siARN.

Por consiguiente, en una modalidad, el siARN se selecciona de SEC ID. NO. 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16.

Las moléculas de siARN como se describió anteriormente pueden ser provistas al interior de la célula en su estructura nativa usando procedimientos conocidos en la téenica. Por ejemplo, al estudiar el silenciamiento de genes in vitro, estos compuestos se administran utilizando reactivos de transfección estándar. Para lograr efectos in vivo de estos compuestos también se pueden administrar desnudos o usando agentes potenciadores de la administración tales como, por ejemplo liposomas, la conjugación con una porción especifico, etc., aunque son conocidas muchas alternativas diferentes en la técnica, y se utilizan de manera diferente dependiendo del sitio objetivo deseado dentro del cuerpo.

Alternativamente, las moléculas de siARN de los diversos aspectos de la invención se pueden expresar dentro de las células a partir de promotores eucariotas. Los vectores recombinantes capaces de expresar las moléculas de siARN pueden ser suministrados y persistir en células objetivo. Alternativamente, los vectores pueden ser utilizados para que proporcionen la expresión transitoria de moléculas de ácido nucleico. Tales vectores se pueden administrar repetidamente según sea necesario. Una vez expresada, la molécula de siARN interacciona con el ARNm objetivo y genera una respuesta de interferencia de ARN . Las moléculas de siARN producidas de esta manera se denominan a menudo shARN (ARN de horquilla corta), ya que sus cadenas de sentido y antisentido están unidas por un bucle pequeño de nucleótidos. El suministro de los vectores de expresión de moléculas siARN puede ser sistémico, como mediante la administración intravenosa o intramuscular, mediante la administración a células ex-plantadas objetivo de un sujeto seguido de reintroducción en el sujeto, o por cualquier otro medio que permitan la introducción en la célula objetivo deseada.

Un aspecto adicional de la invención se refiere al uso de siARN dirigido a SEC ID NO.1 en la preparación de un medicamento para usarse en un método de tratamiento de una afección ocular caracterizada por aumento de la expresión y/o actividad de TRPVl en donde el siARN se administra según el régimen de dosificación descrito en este documento. El método comprende inhibir la expresión de TRPVl en un paciente. El término inhibición se utiliza para indicar una disminución o regulación por disminución de la expresión o actividad. Preferiblemente, la afección ocular es el dolor ocular. En una modalidad, la condición de ojo se selecciona del grupo que comprende molestia ocular y sensibilidad alterada de la córnea tras la cirugía refractiva, uso de lentes de contacto, síndrome de ojo seco, síndrome de Sjogren, y otras patologías oculares Se espera que el tratamiento terapéutico con siARN dirigido contra TRPV1 mARN sea benéfico sobre gotas oculares tópicas de moléculas pequeñas mediante el aumento de la longitud de tiempo cuyo efecto se observa, lo que permite una dosificación menos frecuente y una mayor conformidad del paciente. Esto es especialmente importante en casos tales como el síndrome de ojo seco y una alteración de la sensibilidad corneal ya que a menudo son afecciones crónicas.

Teniendo en cuenta la preparación de tal medicamento, se puede formular el siARN de los diversos aspectos de la presente invención. Preferiblemente, las composiciones y formulaciones de tales siARN pueden administrarse por vía tópica al órgano de interés. En una modalidad aún más preferida se pueden formular la administración tópica en el ojo, preferiblemente a la superficie de la córnea del ojo. La aplicación a la superficie de la córnea puede, por ejemplo, estar en la forma de gotas para los ojos, un gel, loción, crema o inserciones oculares. Otras formas de administración en el ojo pueden incluir inyección en el ojo.

Una modalidad preferida adicional de los diversos aspectos de la presente invención se refiere a un siARN dirigido específicamente a SEC ID NO: 1 como se describe en los párrafos anteriores, para usarse como un medicamento para el tratamiento de una afección ocular carácter izada por aumento de la expresión y/o actividad de TRPV1 en donde el siARN se administra según el régimen de dosificación descrito en este documento. Como se describió anteriormente, puede ser que comprende un siARN o que consta de una estructura de doble cadena de 19 nucleótidos que se dirige a SEC ID NO: 1. Este siARN puede ser de extremos romos. Preferiblemente, el siARN es SEC ID NO: 2. Otros siARN para usarse de acuerdo con la invención puede ser seleccionada de SEC ID. NO. 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16.

En el contexto de la presente invención, para "dirigir específicamente" una secuencia de siARN de la invención comprende preferiblemente al menos la misma secuencia de semilla. Por lo tanto, cualquier secuencia de acuerdo con la invención que se dirige específicamente a la SEC ID NO. 1 es preferiblemente idéntica en las posiciones 2-8 de la cadena antisentido.

No obstante lo anterior, los siARNs de los diversos aspectos de la presente invención se pueden usar para silenciar la expresión de TRPV1 en tejidos distintos del ojo. En consecuencia, tales siARN se deben formular en consecuencia.

Por ejemplo, una molécula de siARN puede comprender un vehículo de suministro, incluyendo liposomas, para la administración a un sujeto. Los vehículos y diluyentes y sus sales pueden estar presentes en formulaciones farmacéuticamente aceptables. Las moléculas de ácido nucleico pueden administrarse a las células por una variedad de métodos conocidos por los expertos en la téenica, incluyendo, pero no limitados a, encapsulación en liposomas, por iontoforesis , o por incorporación en otros vehículos, tales como polímeros biodegradables , hidrogeles, ciclodextr inas ácido poli (láctico-co-glicólico) (PLGA) y microesferas PLCA, nanocápsulas biodegradables, y microesferas bioadhesivas, o por vectores proteináceos . En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico de la invención también se pueden formular o formar complejos con polietilenimina y sus derivados, tales como derivados poliet ilenimina-polietilenglicol-N-acet ilgalactosamina (PEI-PEG-GAL) o poliet ilenimina-poliet ilenglicol-tri-N-acetilgalactosamina (PEI-PEG-Trigal ). Las composiciones preferidas de la invención son soluciones acuosas, soluciones salinas específicamente tales como solución salina tamponada con fosfato (PBS) con un intervalo de pH de aproximadamente 7.0 a aproximadamente 7.4, preferiblemente con un pH de 7.2 + 0.5.

Una molécula de siARN de la invención puede formar un complejo con los agentes perturbadores de la membrana y/o un lípido o ayudante molécula de lípido catiónico .

Los sistemas de administración que pueden usarse con la invención incluyen, por ejemplo, geles acuosos y no acuosos, cremas, emulsiones múltiples, microemulsiones , liposomas, pomadas, soluciones acuosas y no acuosas, lociones, aerosoles, bases de hidrocarburos y polvos, y puede contener excipientes tales como solubilizadores , potenciadores de permeación (por ejemplo, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, alcoholes grasos y aminoácidos), y polímeros hidrófilos (por ejemplo, policarbóf ilo y polivinilpirrolidona ). En una modalidad, el vehículo farmacéuticamente aceptable es un liposoma o un potenciador transdérmico.

Una formulación farmacéutica de la invención está en una forma adecuada para la administración, por ejemplo, la administración sistémica o local, en una célula o sujeto, incluyendo por ejemplo un ser humano.

Las formas adecuadas, en parte, dependen del uso o la vía de entrada, por ejemplo oral, transdérmica, o por inyección. Otros factores son conocidos en la téenica, e incluyen consideraciones tales como toxicidad y formas que impiden que la composición o formulación ejerzan su efecto .

La presente invención también incluye composiciones preparadas para el almacenamiento o administración que incluyen una cantidad farmacéuticamente efectiva de los compuestos deseados en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los vehículos o diluyentes aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica. Por ejemplo, conservadores, estabilizantes, colorantes y pueden ser proporcionados agentes aromatizantes. Estos incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico . Además, los antioxidantes y agentes de suspensión pueden ser utilizados.

Una dosis farmacéuticamente efectiva es la dosis requerida para prevenir, inhibir la ocurrencia o tratar (aliviar un síntoma en cierta medida, preferentemente todos los síntomas) un estado de enfermedad. La dosis farmacéuticamente efectiva depende generalmente del tipo de enfermedad, la composición usada, la vía de administración, el tipo de mamífero tratado, las características físicas del mamífero específico bajo consideración, la medicación concurrente y otros factores que los expertos en la medicina artes reconocerán.

En particular, se sabe que, además de la dosis, el programa de administración es un determinante importante de la regulación a la baja efectiva por las moléculas de siARN.

Los inventores han desarrollado un programa de dosificación efectiva para la administración de un siARN para el tratamiento de una afección ocular caracterizada por aumento de la expresión y/o actividad de TRPV1, en particular ojo seco y/o dolor ocular, lo que evita efectos secundarios y puede administrarse de forma segura. Así, la administración de una molécula de siARN en donde dicha molécula se dirige específicamente a SEC ID NO: 1 y reduce la expresión de gen TRPV1 cuando se introduce en una célula de acuerdo con los regímenes de dosificación descritos en este documento conduce a la mejoría clínica.

En la presente descripción un "esquema de dosificación efectiva" se refiere a la cantidad de siARN de la invención suficiente para tratar o manejar un trastorno ocular asociado a la sobreexpresión de TRPV1. Para el tratamiento del ojo seco y/o dolor ocular en los seres humanos, se prefiere reducir los niveles de la enfermedad ocular como se mide por diferentes parámetros conocidos por los expertos en la téenica, por ejemplo usando el cuestionario OSDI (índice de superficie ocular) (para el ojo seco) y/o EVA (escala visual analógica) para el dolor ocular. Cualquier reducción en estos niveles en comparación con los niveles de pretratamiento es ventajoso, si los compuestos de la invención se suministran solos, o en combinación con otra terapéutica adecuada (por ejemplo, la invención contempla una disminución en OSDI y/o VAS mayor que aproximadamente 5%, alrededor de 10%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 35%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 50%, o aproximadamente 60% del pretratamiento IOP) .

Una cantidad terapéuticamente efectiva también puede referirse a la cantidad de un suficiente siNA para retrasar o minimizar la aparición de un trastorno ocular asociado con el ojo seco y/o dolor ocular. Una cantidad terapéuticamente efectiva también puede referirse a la cantidad del agente terapéutico que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o manejo de un trastorno ocular asociado con el ojo seco y/o dolor ocular. Además, una cantidad terapéuticamente efectiva con respecto a un siNA de la invención significa la cantidad de agente terapéutico solo, o en combinación con otras terapias, que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o manejo de un trastorno ocular asociado con el ojo seco y/o dolor ocular. Usado en relación con una cantidad de un siNA de la invención, el término puede abarcar una cantidad que mejora la terapia global, reduce o evita los efectos no deseados, o aumenta la eficacia terapéutica o efecto sinérgico con otro agente terapéutico.

Un beneficio terapéutico en el tratamiento o manejo de un trastorno del ojo tales como ojo seco y/o dolor ocular es la disminución sostenida en el dolor y/o sensaciones indeseables. Dado que siARN disminuirá los niveles de los receptores TRPVl dentro de la célula, una vez que el tratamiento se detiene la célula debe volver a sintetizar nuevos receptores antes de que se perciben las sensaciones de dolor. Como tales terapias basadas en tratamientos siARN tendrá un efecto más sostenido. Esto se considera una mejora significativa de la eficacia terapéutica .

Un beneficio adicional del uso de siARN es la probabilidad mínima de efectos secundarios o problemas de toxicidad aguda derivados de su presencia en la circulación sistémica, a menudo asociado con diferentes tratamientos basados en gotas para ojos. Esto es debido al hecho de que cuando el compuesto entra en el torrente sanguíneo, se degrada rápidamente por ARNasa presentes en la sangre.

Por otro lado, el hecho de que la formulación descrita en este documento puede ser ofrecido en viales de dosis única, significa conservadores antimicrobianos de incorporación, presentes en la mayoría de las formulaciones en el mercado hoy en día, y que producen una cierta intolerancia en algunos pacientes, por lo que es necesario detener el tratamiento. Ambas cuestiones son especialmente importantes si se tiene en cuenta que las condiciones como el ojo seco y o dolor ocular son a menudo crónica y, por lo tanto, también lo es el tratamiento .

Una de las rutas de administración preferida es tópica, por instilación directamente en el ojo, preferiblemente usando gotas para los ojos. Como se describió anteriormente, se espera que el tratamiento terapéutico con siARNs dirigido contra TRPV1 mARN sea benéfico sobre pequeñas gotas oculares tópicas de moléculas mediante el aumento de la longitud de tiempo que se observa efecto, permitiendo así una dosificación menos frecuente y una mayor conformidad del paciente. Cuando el siARN se administra directamente en el ojo, generalmente una cantidad de alrededor de 0.01 mg a aproximadamente 100 mg por día y por cada ojo se puede administrar. En una modalidad, la cantidad administrada por día y por cada ojo es de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 10 mg. En otra modalidad, alrededor de 0.04 mg a 80 mg, de aproximadamente 0.04 mg a aproximadamente 20 mg, aproximadamente 0.08 mg a aproximadamente 10 mg, aproximadamente 0.08 mg a aproximadamente 1.2 mg, aproximadamente 0.3 a aproximadamente 0.9 mg, o aproximadamente 0.08 mg a aproximadamente 0.9 mg, se administra por ojo por día de siNA.

En una modalidad, la dosis es de aproximadamente 0.5 mg a aproximadamente 1.5 mg. En una modalidad, la dosis es de aproximadamente 0.3 a 0.9 mg, preferiblemente de aproximadamente 0.6 mg a aproximadamente 0.9 mg. Alternativamente, una dosis preferida es de aproximadamente 0.6 mg o aproximadamente 0.9 mg por ojo por día.

Una de las vías de administración preferidas como se mencionó anteriormente es mediante el uso de gotas para los ojos. En una modalidad estas gotas tienen un volumen de entre 25 y 50 microlitros que contienen la dosis dada de compuesto, preferiblemente entre 26 y 40 microlitros. Preferiblemente, cuentagotas comerciales pueden utilizarse en la presentación final de la medicina, y el volumen resultante sería entre aproximadamente 30 y aproximadamente 33 microlitros por gota. En una modalidad adicionalmente preferida las gotas se entregan en un volumen de aproximadamente 40 ml. En una modalidad adicional la composición de la invención comprende un siARN como la de SEC ID NO: 2 en una solución aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato a una concentración de aproximadamente 7.5 a aproximadamente 22.5 mg/ml, o alternativamente de aproximadamente 15 mg/ml a aproximadamente 22.5 mg/ml. Las composiciones de la invención pueden comprender las concentraciones anteriores de siARN en PBS y opcionalmente excipientes farmacéuticamente aceptables tales como por ejemplo cloruro de benzalconio.

El tratamiento en las dosis anteriores se puede administrar durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más día. Preferiblemente, la administración es durante 10 a 15 dias, más preferiblemente durante 10 dias. La administración puede ser seguida por un periodo de descanso, por ejemplo, un periodo de descanso de 7 dias antes de la continuación del tratamiento. Alternativamente, dado que el ojo seco y/o dolor ocular son a menudo condiciones crónicas, las dosis se pueden administrar en una base diaria durante un largo periodo que resulta en una administración crónica. Por consiguiente, la administración puede continuarse durante más de 4 semanas sobre una base diaria, o alternativamente, la administración puede continuarse durante más de 4 semanas, pero no sobre una base diaria. El calendario preciso puede determinarse de acuerdo con la gravedad de la afección crónica.

Sin embargo, como se explicó anteriormen te, también se pueden utilizar otras vías de administración que las que son directamente en el ojo. Se pueden emplear dosis precisa y horario de administración en la formulación lo cual también dependerá de la via de administración, pero se pueden emplear las dosis anteriores y se puede administrar generalmente una cantidad de aproximadamente 0.01 mg a alrededor de 100 mg por día y por ojo. Un experto entendería que la pauta de dosificación y administración precisa a utilizar también depende de la gravedad del trastorno, y debe decidirse de acuerdo con el juicio del médico y las circunstancias de cada paciente. También se entiende que el nivel de dosis específico para cualquier sujeto particular depende de una variedad de factores incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo de administración, via de administración, y velocidad de excreción, combinación de fármacos y gravedad de la terapia que experimenta la enfermedad particular.

Las formulaciones o siARN de la invención y se describe en el presente documento se pueden administrar en formulaciones de dosificación unitaria que contienen convencionales aceptables excipientes, adyuvantes y/o vehículos no tóxicos farmacéuticamente. Las formulaciones pueden estar en una forma adecuada para uso oral, por ejemplo, como comprimidos, trociscos, pastillas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersadles, emulsiones, cápsulas duras o blandas, o jarabes o elixires. Las composiciones destinadas para uso oral pueden prepararse de acuerdo con cualquier método conocido en la téenica para la fabricación de composiciones farmacéuticas y tales composiciones pueden contener uno o más de tales agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes o agentes conservadores a fin de proporcionar preparaciones farmacéut icamente elegantes y agradables al paladar. Los comprimidos contienen el ingrediente activo en mezcla con excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos que son adecuados para la fabricación de comprimidos.

Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes inertes; tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio; agentes de granulación y disgregantes, por ejemplo, almidón de maíz, o ácido algínico; agentes aglutinantes, por ejemplo almidón, gelatina o goma arábiga; y agentes lubricantes, por ejemplo estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Los comprimidos pueden estar sin recubrir o pueden estar recubiertos mediante téenicas conocidas. En algunos casos tales revestimientos pueden prepararse mediante técnicas conocidas para retrasar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal y proporcionar asi una acción sostenida durante un periodo más largo. Por ejemplo, puede emplearse un material de retardo temporal tal como monoestearat o de glicerilo o diestearato de glicerilo.

Las formulaciones para uso oral también pueden presentarse como cápsulas duras de gelatina donde el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín, o como cápsulas de gelatina blanda en las que el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio de aceite, por ejemplo aceite de cacahuate, parafina líquida o aceite de oliva.

Las suspensiones acuosas contienen los materiales activos en una mezcla con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Tales excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo carboximet ilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidropropil-metilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona , goma de tragacanto y goma arábiga; agentes dispersantes o humectantes puede ser un fosfátido de origen natural, por ejemplo, lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo heptadecaetilenoxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ásteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como monooleato de sorbitol de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo monooleato de polietileno. Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservadores, por ejemplo etilo, o p-hidroxibenzoato de n-propilo, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes aromatizantes, y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina.

Las suspensiones oleosas se pueden formular suspendiendo los ingredientes activos en un aceite vegetal, por ejemplo aceite de cacahuate, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco, o en un aceite mineral tal como parafina liquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo cera de abejas, parafina dura o alcohol cetilico. Los agentes edulcorantes y los agentes aromatizantes se pueden añadir para proporcionar preparaciones orales agradables al paladar. Estas composiciones se pueden conservar mediante la adición de un antioxidante tal como ácido ascórbico.

Los polvos y gránulos dispersables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua proporcionan el ingrediente activo mezclado con un agente dispersante o humectante, agente de suspensión y uno o más conservadores. Los agentes dispersantes o humectantes o de suspensión se ejemplifican por aquellos ya mencionados anteriormente. Los excipientes adicionales, por ejemplo edulcorantes, aromatizantes y agentes colorantes, también pueden estar presentes .

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal o un aceite mineral o mezclas de éstos. Los agentes emulsionantes adecuados pueden ser gomas de origen natural, por ejemplo goma arábiga o goma tragacanto, fosfátidos de origen natural, por ejemplo soja, lecitina, y ésteres o ásteres parciales derivados de ácidos grasos y hexitol, anhídridos, por ejemplo monooleato de sorbitán, y productos de condensación de dichos ásteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo monooleato de polioxietilensorbitán . Las emulsiones también pueden contener agentes edulcorantes y aromatizantes.

Los jarabes y elixires pueden formularse con agentes edulcorantes, por ejemplo glicerol, propilenglicol , sorbitol, glucosa o sacarosa. Tales formulaciones también pueden contener un demulcente, un conservante y agentes aromatizantes y colorantes. Las composiciones farmacéuticas o siARN de la invención y se describe en el presente documento pueden estar en la forma de una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril.

Esta suspensión se puede formular de acuerdo con la téenica conocida usando los agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión que se han mencionado anteriormente.

Una preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente parenteralmente aceptable no tóxico o disolvente, por ejemplo como una solución en 1, 3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro sódico. Además, los aceites fijos estériles se emplean convencionalmente como un medio disolvente o de suspensión. Para este propósito, cualquier aceite fijo suave puede ser empleado incluyendo sintéticos mono- o diglicéridos. Además, los ácidos grasos tales como ácido oleico encuentran uso en la preparación de inyectables.

En modalidades preferidas, las composiciones de la invención se formulan en una solución, preferiblemente una solución salina tamponada tal como PBS, o un gel para la administración tópica en el ojo, tal como, por ejemplo, en forma de gotas para los ojos. En tales modalidades, las formulaciones pueden ser emulsiones catiónicas y/o contener biopolímeros incluyendo, pero no limitado a, poli (lactida-co-glicolida), carbopol, ácido hialurónico y ácido poliacrílico.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención también pueden administrarse en forma de supositorios, v.gr., para la administración rectal del fármaco. Estas composiciones se pueden preparar mezclando el fármaco con un excipiente no irritante adecuado que es sólido a temperaturas ordinarias pero líquido a la temperatura rectal y por lo tanto se fundirá en el recto para liberar el fármaco. Tales materiales incluyen manteca de cacao y polietilenglicoles.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden administrarse parenteralmente en un medio estéril. El fármaco, dependiendo del vehículo y la concentración usados, puede suspenderse o disolverse en el vehículo. Ventajosamente, los adyuvantes tales como anestésicos locales, conservadores y agentes de tamponamiento se pueden disolver en el vehículo.

Como tal, una modalidad preferida adicional de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica en la que dicha composición comprende al menos un siARN dirigido a SEC ID NO: 1 en un horario de dosificación específica, como se ha descrito en los párrafos anteriores.

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención también se pueden administrar a un sujeto en combinación con otros compuestos terapéuticos para aumentar el efecto terapéutico global. El uso de múltiples compuestos para tratar una indicación puede aumentar los efectos benéficos, mientras que reduce la presencia de efectos secundarios.

Los compuestos siNA de la invención también se pueden proporcionar en kits que comprenden un dispensador con un orificio para la dispensación de dosis específicas del compuesto siNA en una gota de volumen predeterminado. En una modalidad preferida, los compuestos de siNA de la invención son siARN dirigidos contra la SEC ID NO: 1. En una modalidad adicional, los dispensadores dentro del kit de la invención proporcionan una composición que comprende o que consiste en SEC ID NO: 2. En otra modalidad el kit puede comprender una colección de uso único dispensador, por ejemplo para su uso durante un mes, en este caso especifico, el caso contendría 30 dispensadores de un solo uso. La gota puede variar de aproximadamente 50 ml a aproximadamente 100 ml en volumen. El dispensador puede ser un solo uso dispensador y comprender entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 2 mg de los compuestos siNA de la invención, y opcionalmente también comprender uno o más diluyentes farmacéuticamente aceptables, y opcionalmente uno o más excipientes. La composición contenida en el dispensador puede comprender una concentración de entre aproximadamente 7.5 mg/ml a aproximadamente 22.5 mg/ml del compuesto siNA de la invención. Alternativamente, el dispensador puede ser diseñado para ser utilizado durante un mes o más, y los volúmenes contenidos aumentarán en consecuencia para proporcionar el número equivalente de dosis. Los kits de la invención también pueden comprender las instrucciones que se especifica que una dosis del compuesto de siARN de entre aproximadamente 0.3 mg y aproximadamente 0.9 mg en 1 gota se va a aplicar a cada ojo. Las instrucciones se especifican, además, que las gotas se aplican a cada ojo una vez al día, dos veces al día, tres veces al día, o cuatro veces al día, y que la aplicación a cada ojo es a tener lugar al día, cada dos días, una vez a la semana, dos veces a la semana, tres veces a la semana, cada dos semanas o una vez al mes.

Los contenidos de todos los artículos publicados, libros, manuales de referencia y resúmenes citados en el presente documento, se incorporan por referencia en su totalidad para describir más completamente el estado de la téenica a la que pertenece la invención.

Dado que se pueden hacer diversos cambios en la materia descrita anteriormente sin alejarse del alcance y espíritu de la presente invención, se pretende que toda la materia contenida en la descripción anterior, o se define en las reivindicaciones anexas, es interpretada como descriptiva e ilustrativa de la presente invención. Las modificaciones y variaciones de la presente invención son posibles en vista de las enseñanzas anteriores.

La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitativos.

EJEMPLOS Análisis in vitro Con el fin de encontrar una secuencia objetivo particularmente efectiva para siARN para silenciar TRPV1 (que obtienen una inhibición importante de la expresión génica), se probaron seis siARN diferentes. Estos siARN se describen como SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 7 y SEC ID NO: 17 a 20.

La SEC ID NO: 2 es un siARN dirigido a SEC ID NO: 1 de acuerdo con la presente invención que tiene la siguiente secuencia: Sentido: 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3' Antisentido: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3' La SEC ID NO: 7 (5'-UCGCCACGACAUGCUCUUGdTdT-3') corresponde a una molécula de siARN clásica (21 nucleótidos de longitud que contiene colgantes 3' formados de desoxitimidina) anteriormente descritos en el documento WO 2007/045930 para orientar con eficacia TRPV1 y reducir la respuesta ocular a la capsaicina estímulos. SEC ID NO: 17 a 19 corresponden a siARN diseñados contra TRPV1 de acuerdo con diferentes algoritmos disponibles en la téenica tales como los descritos por Rcynolds et al.2004 o Ui-Tei et al 2004, y otros. SEC ID NO: 20 es un siARN disponible comercialmente suministrado por Ambion y diseñado contra TRPV1.

SEC ID NO: 17 Sentido: 5'-CGCAUCUUCUACUUCAACU-3' Antisentido: 5'-AGUUGAAGUAGAAGAUGCG-3' SEC ID NO: 18 Sentido: 5'-GCGCAUCUUCUACUUCAAC-3' Antisentido: 5'-GUUGAAGUAGAAGAUGCGC-3' SEC ID NO: 19 Sentido: 5'-AAAGCCAUGCUCAACCUGC-3' Antisentido: 5'-GCAGGUUGAGCAUGGCUUU-3' SEC ID NO: 20 Sentido: 5'UGAUCGCAGGAGUAUCUULJdTdT-3' Antisentido: 5'AAAGAUACUCCUGCGAUCAdTdT-3' Como un modelo para probar la efectividad de los siARN descritos antes, se utilizaron cultivos de células HeLa (adenocarcinoma de cuello uterino humano). Las células HeLa fueron transíectadas con 100 nM de diferentes compuestos y Lipofectamine 2000 como un agente transfectante. Todas las transíecciones se realizaron siguiendo las condiciones del fabricante estándar. En la misma transfección se utilizó una combinación de siARN diferente como control. Los sedimentos celulares se recogieron a 24, 48, y 72 horas para evaluar las posibles variaciones en los niveles de proteina y procesados por PCR en tiempo real. Con el fin de cuantificar los resultados obtenidos por el tiempo real QRT-PCR, se utilizó el método de umbral comparativo.

Como muestran los resultados (Figura 1), un siARN dirigido contra la secuencia objetivo SEC ID NO: 1, es mucho más eficiente en términos de TRPV1 silenciamiento de los genes que los productos siARN descritos anteriormente dirigidos contra una región diferente del mismo gen. Además, este efecto se mantiene en el tiempo, como a las 72 horas después de la transfección todavía hay desregulación significativa de los niveles de mARN. Esta duración del efecto es impredecible y es específica de secuencias.

Con el objetivo de proporcionar nuevos productos mejorados, se introdujeron diferentes modificaciones químicas en el producto anteriormente, de acuerdo con la siguiente descripción: SEC ID NO: 3, Sentido: 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3' Antisentido: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3' SEC ID NO: 4, Sentido: 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3' Antisentido: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3' SEC ID NO: 8, Sentido: 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3' Antisentido: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3' SEC ID NO: 9, Sentido: 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3' Antisentido: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3’ SEC ID NO: 10, Sentido: 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3' Antisentido: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3' SEC ID NO: 11, Sentido: 5'-AAGCGCAUCUUCUACUUCA-3' Antisentido: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3' En donde lo subrayado representa bases que comprenden un grupo 2'-O-metilo.

SEC ID NO: 5, Sentido: 5'-AAGCGCAdTCdTdTCdTACdTdTCA-3' Antisentido: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3' SEC ID NO: 6, Sentido: 5'-AAGCGCAdTCdTdTCdTACdTdTCA-3' Antisentido: 5'-dTGAAGdTAGAAGAdTGCGCdTdT-3' SEC ID NO: 12 Sentido: 5'-AAGCGCAdTCUdTCdTACdTdTCA-3' Antisentido: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3' SEC ID NO: 13, Sentido: 5'-AAGCGCAdTCUdTCdTACUdTCA-3' Antisentido: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3' SEC ID NO: 14, Sentido: 5'-AAGCGCAdTCUUCdTACUdTCA-3' Antisentido: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3' SEC ID NO: 15, Sentido: 5'-AAGCGCAdTCUUCUACUdTCA-3’ Antisentido: 5'-UGAAGUAGAAGAUGCGCUU-3' SEC ID NO: 16, Sentido: 5'-AAGCGCAdTCUUCUACUdTCA-3' Antisentido: 5'-UGAAGdTAGAAGAdTGCGCUT-3' En donde algunos o todos los nucleótidos uracilo han sido sustituidos por nucleótidos de deoxitimidina.

Estos compuestos se probaron en ensayos de inmunogenicidad junto con SEC ID NO: 2 (el mismo compuesto sin ningún tipo de nucleótidos modificados). Los resultados mostraron que todos estos compuestos reducen significativamente la inducción de una respuesta inmune en células mononucleares de sangre periférica. Por otra parte, la mayoría de los compuestos inducen una respuesta que estaba en su nivel más alto, tan bajo como el producido por siARN que han avanzado a través de ensayos clínicos en humanos (bevasiranib y siRNA-027) que se incluyeron en los ensayos como control.

Dado que diversos grados de modificación pueden alterar la capacidad de silenciamiento de genes de siARN, estos compuestos se ensayaron adicionalmente por su capacidad de ARN de interferencia por transfección en células HeLa, y niveles de mARN de TRPV1 resultantes se midieron de acuerdo con el método descrito en los párrafos precedentes.

Como puede verse en la Figura 2, todos los compuestos retienen la capacidad de disminuir de manera eficiente los niveles de mARN de TRPV1 en diversos grados.

Un efecto benéfico inesperado adicional derivado de los compuestos descritos anteriormente es su mayor resistencia a la degradación por RNasa como puede verse en la Figura 5.

Para estos experimentos, los compuestos se suspendieron en 10% de plasma humano en PBS a una concentración final de 2 mM y se incubaron durante 24 horas a 37 °C. Después se analizaron las muestras mediante HPLC-UV y se determina la cantidad de producto restante intacto. Como se puede observar en la Figura 5, el compuesto de 19 nucleótidos de doble cadena de la SEC ID NO: 2 (sin modificación química) es casi 3 veces más resistente a la degradación que se ha descrito anteriormente en SEC ID NO: 21: 5 '-CGCAAGAUCACAGGAGAGCdTdT-3'(también descrito en el documento WO 2007045930), que comprende colgantes 3'. Este efecto es aún mayor para el compuesto de la SEC ID NO: 3, que incluye algunos nucleótidos modificados químicamente como se describe en los párrafos precedentes.

Análisis in vivo Los modelos animales de ojo seco y dolor ocular a menudo hacen uso de los conejos, en este caso conejos blancos de Nueva Zelanda. Para ello, una ventaja adicional de los siARN de la presente invención es que la secuencia objetivo, SEC ID NO: 1, es una región altamente conservada del gen TRPVl, a través de diferentes secuencias de animales. De hecho, esta secuencia es idéntica entre el ser humano y conejo, haciendo de este modelo animal especialmente adecuado para el estudio de dichas enfermedades.

El experimento descrito a continuación se realizó utilizando un modelo estándar de dolor ocular conocido por un experto en el campo (González et al. 1993). Brevemente, el dolor se indujo mediante la instilación de 30 ml de una solución de 1% de capsaicina (un agonista conocido de TRPV1) para el ojo usando un micropipeta apropiado. Debido a consideraciones éticas, los animales a ser tratados con capsaicina hablan recibido previamente una dosis de 5 mM capsazepina, un antagonista de la capsaicina conocido, o 40 ml de una solución que contiene el compuesto a ensayar. Por lo tanto efecto analgésico se mide en comparación con capsazepina como tratamiento de referencia.

Los artículos de prueba y referencia se instilan una vez al día desde el día 1 al día 3 y dos veces al día en el Día 4 (ritmo de 60 minutos) en los ojos derechos. En el Día 4, 15 minutos después de la última instilación, dolor corneal se indujo en el ojo derecho de los animales por una sola instilación de capsaicina 1%. El ojo contralateral fue inculcado con PBS durante todo el estudio y sirvió como control.

Para medir la respuesta al dolor, se midió la apertura palpebral. Se considera que el ojo se cierra en respuesta al dolor, y dado que las sensaciones de dolor disminuyen la abertura palpebral que aumentará de nuevo a los niveles normales. La apertura palpebral se midió antes del tratamiento (línea de base), justo antes de la inducción de dolor y luego 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, minutos después de la inducción del dolor.

Como puede verse en las Figuras 3 y 4, se probó un compuesto de acuerdo con la presente invención, específicamente el compuesto de SEC ID NO: 2, y se observó para inducir un efecto analgésico más alta que la recuperación de capsazepina (ojo tal como se mide por el grado de palpebral apertura). Por lo tanto este compuesto ha demostrado ser un tratamiento terapéutico efectivo para el malestar ocular.

Además, se realizó otro experimento in vivo en el que los compuestos de la presente invención (SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 4 y SEC ID NO: 5) se administraron a ojos de conejos, junto con SEC ID NO: 21, previamente descrito en el documento WO 2007045930. En este caso, los conejos (6 animales por grupo de tratamiento) recibieron una administración diaria del compuesto durante 3 días consecutivos. En el tercer día, dos horas después de la última instilación, se sacrificaron los animales. Los tejidos oculares de estos conejos fueron recuperados y la presencia de TRPV1 ARNm específica se analizó mediante RT-PCR. La siguiente tabla (Tabla 1) muestra los niveles de silenciamiento de genes TRPV1 logrado en un tejido determinado, expresada como una relación de la% de inhibición conseguido con el compuesto de referencia SEC ID NO: 21.

Tabla 1 Como se aclara a partir de estos resultados, los compuestos de la presente invención son mucho más eficaces cuando se silencia la expresión del gen TRPV1 en los tejidos oculares que en los compuestos descritos previamente.

La eficacia más alta junto con el efecto más duradero de los compuestos de la invención, debe proporcionar regímenes de dosis ventajosas, dado que permitir más tiempo entre las dosis mejoraría significativamente la calidad de vida de los pacientes.

Se realizó otro experimento para evaluar la distribución en los tejidos y la exposición de plasma en conejos blancos de Nueva Zelanda tras la administración ocular de la SEC ID NO: 2 en PBS. Los materiales y métodos empleados se especifican en la siguiente tabla (Tabla 2).

Tabla 2. Materiales y métodos para evaluar la distribución de tejidos y la exposición de plasma en Conejos blancos New Zealand después de la administración ocular de la SEC ID NO: 2 en PBS Todos los cálculos se realizaron utilizando el peso molecular de la sal sódica de la SEC ID NO: 2. El cálculo de concentraciones de SEC ID NO: 2 se realizaron en tres formas diferentes: 1. Basándose en el área pico de cadena antisentido intacta no metabolizada de la SEC ID NO: 2 (compuesto original). Este valor es un marcador de la cantidad del compuesto de origen que no se ha modificado en el tejido. 2. Basándose en el área pico de cadena antisentido intacta 5'-fosforilado de la SEC ID NO: 2. Este valor es un marcador de la cantidad del compuesto padre que está presente en el compartimiento citoplasmático y se activa por fosforilación en 5'. 3. Basándose en el área pico total. Este valor se resume toda la SEC ID NO: 2 intacta y metabolizada que están presentes en la muestra.

Se recogieron muestras de higado, corteza renal y médula, pulmón, cuerpo ciliar, retina, iris, glándula lacrimal, córnea, humor acuoso y vitreo, ganglio, plasma y orina de 5 y 30 minutos después de la dosis. Después de una administración ocular de la SEC ID NO: 2 a conejos (n = 6) los resultados indicaron: • La exposición sistémica de la SEC ID NO: 2 se detectó en muestras de plasma y tejidos sistémicos a los 5 y 30 minutos después de la dosificación para el ojo a concentraciones inferiores a 1 ng/g (véase la Tabla 3).

Tabla 3. Las concentraciones medias de SEC ID NO: 2 compuesto original después de la administración ocular de conejos.

SEC ID NO: 2 puede ser detectada en todos los tejidos y fluidos del ojo 5 minutos después de la dosificación y al fuerte disminución de las concentraciones de 30 minutos después de la dosis (ver Tabla 4).

Tabla 4. Las concentraciones medias de SEC ID NO: 2 de compuesto original después de la administración a conejos.

• En retina, iris, cuerpo ciliar y glándula lagrimal se detectó la cadena en antisentido-(as) 5'-fosforilada a 5 y 30 minutos después de la dosis que indica un suministro citoplasmático de siARN en estos tejidos (siARN activado en el compartimiento de la célula objetivo) (ver la Figura 6).

Estos datos reflejan que después de la administración ocular de la SEC ID NO: 2, los animales presentan SEC ID NO: 2 activada distribuida en todos los tejidos del ojo que pueden ser detectados 5 minutos después de la dosificación.

Análisis en los seres humanos Inicialmente, la tolerancia ocular del compuesto de acuerdo con la SEC ID NO: 2 se evaluó en 30 adultos humanos sanos.

El estudio se divide en dos periodos. Durante el primer periodo de una evaluación inicial de la seguridad se realizó utilizando una dosis única del producto de investigación, seguido por un segundo periodo con una administración de dosis múltiple.

Periodo 1, dosis única: controlado con ninguna intervención, y asignación al azar del ojo que recibe la administración. Cada voluntario fue su propio control, dado el hecho de que el elemento de la prueba se administró a un solo ojo mientras que el otro ojo no recibió ninguna intervención, sin embargo se realizaron las pruebas de evaluación de seguridad. El oftalmólogo hacer la evaluación de la seguridad no conocía la administración del fármaco. Se determinó el producto de absorción en el torrente sanguíneo.

Período 2, multidosis: Abierto, paralelo y controlado. El ojo tratado fue al azar. El evaluador sin conocer el sitio de administración de productos en fase de investigación. El ojo antes de la administración del fármaco y el otro ojo se consideran como controles. Durante esta etapa se evaluó la seguridad local y sistémica, además de la absorción y, en su caso, la farmacocinética del producto en investigación.

La segunda etapa se inició una vez que la seguridad y la farmacocinética de la primera etapa había sido evaluada. Los resultados de la primera etapa establecieron la necesidad de continuar con la evaluación farmacocinética durante la segunda etapa.

Se distribuyeron 30 adultos en diferentes grupos de tratamiento y recibieron una sola gota en el ojo 26.6 ml que contiene una dosis de 600 mg de compuesto en un ojo (periodo 1), o una dosis diaria durante una semana de 600 o 900 mg de compuesto por ojo (periodo 2), administrado en un volumen de 26.6 ml o 40 m?, respectivamente. El Período 1 tenia 6 voluntarios y el período 2 tenía 24 voluntarios, divididos en dos grupos con un nivel de dosis diferente aplicada a cada mitad del grupo. El periodo 1 comprende una sola dosis y el periodo de 2 comprende 7 dosis en total (una administración por dia).

La evaluación de tolerancia local se basa en la frecuencia de las alteraciones (efectos adversos locales) detectados en la superficie del ojo durante las exploraciones realizadas 24 horas después de la última administración de la dosis en el periodo 2 y 72 horas después de la instilación de dosis única en el periodo 1. La buena tolerancia se define como la ausencia de toxicidad de grado 3 o superior, en la escala CTCAEv3 (Criterios de Terminología Común para Eventos adversos).

Se utilizó una prueba Xi Cuadrada para determinar la relación entre los efectos adversos locales y el medicamento, teniendo en cuenta si se presentaron o no síntomas o signos locales en cada ojo (independientemente del número de los síntomas), en relación con el tratamiento. El análisis consideró la presencia de un efecto adverso en cada ojo, si se habían producido al menos uno (ver Tabla 5).

Tabla 5. Análisis de los efectos adversos locales en los ojos, en relación con la administración de la medicación.

Con respecto al desarrollo de alteraciones locales (efectos adversos locales), no se observaron diferencias entre el ojo tratado y el ojo no tratado, la obtención de Xi Cuadrado de Pearson de 1.002 (p = 0.317).

No se observaron alteraciones oculares superficiales relacionadas con los fármacos en cualquier período de la prueba; por lo tanto, la tolerancia local fue excelente cuando se administra como dosis únicas o múltiples de hasta siete días como gotas para los ojos.

Un objeto adicional de este ensayo fue evaluar la tolerancia sistémica al compuesto, mediante la supervisión de repercusiones sobre los parámetros analíticos, en el examen físico, signos vitales y electrocardiograma después del tratamiento.

Los análisis de sangre y orina se realizaron durante el proceso de selección, antes de la administración de la medicación, y en el examen final, en los días siguientes a la última administración de la SEC ID NO: 2. Se realizó un estudio de la variación de los parámetros analíticos entre el período de selección y el examen final, utilizando la prueba t de Student para datos relacionados. La tabla siguiente muestra la media, la desviación estándar y la significación estadística de la diferencia entre dichos parámetros (véase la Tabla 6).

Tabla 6: Variación de los parámetros analíticos entre el examen de selección y el examen final. n.s.s.: No estadísticamente significativo. * Prueba Wilconxon Se observaron diferencias en algunos parámetros entre el examen de selección y el examen final, sin embargo se consideraron todos los valores como normales, sin ninguna significación clínica.

Como se indicó anteriormente, durante el estudio, se tomaron los signos vitales (presión arterial y frecuencia cardiaca) durante la selección, y en diferentes momentos durante la fase de tratamiento y en el examen final (véanse las tablas 7 y 8).

A continuación se muestran los valores medios para alcanzar los tiempos de medición y el análisis estadístico con medidas repetidas ANOVA en los seis voluntarios que participan en el periodo 1 (ver tabla 7).

Tabla 7: Los signos vitales durante el periodo 1 de la prueba. n.s.s.: no estadísticamente significativa Los signos vitales en el período 2 se tomaron en el examen realizado en el día 1 y en la realizada en el día 7, antes y una hora después de la administración de la primera y la última dosis del medicamento en investigación. Los signos vitales también se tomaron durante el examen de selección y en el examen final. Tomando los valores de selección como la linea de base, la evolución de los signos vitales se evaluó para los 24 voluntarios para el curso del estudio, durante el periodo 2, usando un ANOVA de medidas repetidas (véase la Tabla 8).

Tabla 8: Los signos vitales durante el segundo periodo del ensayo. n.s.s.: no estadísticamente significativa Se realizó un electrocardiograma en el examen de selección y un electrocardiograma más a fondo en el examen final. Se hace una comparación entre la selección y exámenes finales, utilizando la prueba t de Student para muestras relacionadas. La siguiente tabla resume la media y la desviación estándar para cada parámetro y el resultado del análisis (véase la Tabla 9).

Tabla 9: Electrocardiograma: Una comparación entre la selección y exámenes finales n.s.s.: no estadísticamente significativa. * Prueba de Wilcoxon Se observaron cambios estadísticamente significativos en algunas de las mediciones de presión arterial en la Tabla 7 y 8, y algunas de las mediciones de la frecuencia cardíaca en la Tabla 9, a pesar de todos los valores llegaron dentro de límites normales, y por lo tanto estas diferencias no son clínicamente significativos.

La tolerancia sistémica fue buena, sin alteraciones en los análisis de sangre y orina, electrocardiograma o en el examen realizado durante la evaluación final.

Se realizó un análisis de sangre para determinar las concentraciones de SEC ID NO: 2 en muestras de plasma obtenidas tras la administración del fármaco. Durante el primer período, el muestreo se realizó durante las 4 horas siguientes a la administración, con sangre se extrajo a 5, 15, 30 minutos y 4 horas después de la administración del producto. Durante el segundo período se recogieron muestras de sangre 5 minutos después de la administración en el día 1, y de nuevo el día 7, tanto antes de la administración del compuesto y también 5 minutos después de la administración del producto.

No se pudo determinar un perfil farmacocinético por cualquiera de los períodos, como el compuesto no fue detectado en ninguna de las muestras de sangre recogidas con el método bioanalítico validado (LLOQ: 10 ng/ml). La ausencia de cantidades detectables de compuesto en la sangre está en línea con la rápida degradación esperado de ARN al entrar en el torrente sanguíneo debido a la presencia de ARNasas.

Todos estos hechos apoyan la conclusión de que la SEC ID NO: 2 muestra una buena tolerancia en una solución oftálmica en humanos sanos.

Dados los resultados positivos obtenidos en los modelos animales y la ausencia de toxicidad en los seres humanos sanos, los compuestos se ensayaron a continuación en los pacientes que sufren de dolor ocular y el ojo seco.

Sujetos Sesenta pacientes adultos que fueron diagnosticados con dolor ocular de leve a moderado y el síndrome de ojo seco son reclutados. De estos, la mitad de ellos tienen más de 65 años de edad. Los niveles de enfermedad ocular se establecerán a partir del cuestionario OSDI © (índice de enfermedad de la superficie ocular) desarrollado por Allergan Inc. y evaluación VAS (escala analógica visual). Los criterios de inclusión fueron una puntuación de 13-30 en el OSDI © para el ojo seco y una puntuación de VAS de 2 a 7 para el dolor. Un examen físico completo y un examen ocular se realizan antes de la admisión en el estudio para asegurar la idoneidad de los sujetos para la participación en el estudio.

Diseño del estudio Se diseñó un estudio clínico doble ciego paralelo, controlado con placebo, para evaluar el efecto analgésico y la tolerancia del compuesto de la SEC ID NO: 2 administrado diariamente como gotas para los ojos durante 10 días de tratamiento .

Los objetivos secundarios que son evaluados para tolerancia local después de cada dosis, la capacidad de tolerancia sistémica (efecto sobre los parámetros de laboratorio, examen físico y signos vitales), y cambios (si los hay) en la agudeza visual, la presión intraocular, la prueba de Schirmer y el tiempo de ruptura del lagrimal, posiblemente relacionada con el producto en investigación.

En todos los casos, la droga o el placebo se inculcaron en ambos ojos. Ambos ojos se controlan de una manera ciega.

Periodo de referencia Hasta 5 días antes de la primera administración de los temas de investigación de productos están inscritos para la elegibilidad para participar en el período de tratamiento del ensayo clínico.

Período de tratamiento En el Día 1 los sujetos se asignaron al azar a compuesto o placebo en una proporción de 2: 1 se administra en forma tópica en el ojo, como gotas para los ojos. Los sujetos reciben un volumen final de 40 ml de compuesto o vehículo (placebo) por ojo. La dosis administrada es de 900 g de compuesto por ojo.

Los sujetos vuelven cada día (incluyendo días festivos y fines de semana) en el sitio de la administración y evaluación de producto en investigación. Los sujetos reciben 1 dosis del compuesto una vez al dia en ambos ojos durante 10 dias.

El dia 10 los pacientes reciben de nuevo un examen completo equivalente al realizado al inicio del estudio.

Visita de seguimiento La evaluación final se realiza en la visita de seguimiento que se lleva a cabo de 14 a 20 dias después de la primera administración (de 4 a 10 dias después de la última administración) para determinar la evolución de los pacientes después de terminar el periodo de tratamiento.

Para determinar el efecto de la SEC ID NO: 2 en el nivel del ojo seco y dolor ocular de los pacientes, cada puntuación individual en OSDI © y VAS es bajado el dia antes de comenzar el tratamiento, y se comparó con la del dia 10. El resultado se mide específicamente en los cambios en la mediana de la puntuación resultante de OSDI © cuestionario, y los cambios en la intensidad media de la evaluación VAS.

Además, los resultados de exploraciones oculares realizadas antes de iniciar el tratamiento y después de 10 días se comparan para confirmar la tolerancia.

Resultados El cuestionario de OSDI © se evaluó en una escala de 0 a 100, con una puntuación más alta que representan una mayor discapacidad. El índice demuestra sensibilidad y especificidad para distinguir entre sujetos normales y pacientes con enfermedad del ojo seco. El OSDI © consta de doce preguntas y está diseñado para proporcionar una indicación rápida de los síntomas que son consistentes con la enfermedad del ojo seco. El OSDI © es un instrumento válido y fiable para medir la gravedad de la enfermedad del ojo seco (normal, de leve a moderada y grave) y ha sido aceptado por la Administración de Alimentos y Medicamentos para su uso en ensayos clínicos. La validez y confiabilidad del OSDI © se han evaluado y se ha encontrado que proporcionan confiabilidad de buena a excelente, validez, sensibilidad y especificidad para los ojos secos. Una estimación de puntuación global de OSDI © define la superficie ocular como normal (0-12 puntos) o por tener enfermedad leve (13-22 puntos), moderada (23-32 puntos), o grave (33-100 puntos).

Tabla 10: OSDI © para el ojo seco, n = 23. V0 corresponde al OSDI © el día antes de comenzar el tratamiento, y VD10 corresponde al OSDI © el día 10. El resultado y el % muestra los cambios en la puntuación media en el nivel del ojo seco de los pacientes.

El cuestionario de dolor VAS es una medida unidimensional de la intensidad del dolor, que ha sido ampliamente utilizado en diversas poblaciones de adultos. El dolor VAS medidas que va a través de un continuo de valores y no puede fácilmente ser medido directamente, al igual que el dolor ocular. Por la intensidad del dolor en la EVA, la escala es más comúnmente anclado por "sin dolor" (puntuación de 0) y "el peor dolor imaginable" (puntuación de 10).

Tabla 11: VAS para el dolor ocular, n = 23. V0 corresponde a la VAS el dia antes de comenzar el tratamiento, y VD10 corresponde a la VAS el dia 10. El % muestra cambios en la puntuación media en el nivel de los pacientes de dolor ocular en el ojo derecho y el izquierdo.

Conclusiones Teniendo en cuenta la relación de compuesto: placebo de 2: 1 del ensayo clínico, y que esta relación se mantiene independientemente del número de pacientes analizados, se puede concluir que el efecto de SEC ID NO: 2 que se aplica a diario al paciente, es capaz de reducir la gravedad de la enfermedad del ojo seco y reducir el dolor ocular cuando se administra tópicamente en el ojo.

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Claims (11)

REIVINDICACIONES

1.- El uso de un siARN dirigido a SEC ID NO: 1 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del ojo seco y/o dolor ocular en donde el siARN se administra a una dosificación de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 mg por dia.

2.- El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el siARN se administra a una dosificación de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 1.5 mg por dia.

3.- El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el siARN se administra a una dosis de aproximadamente 0.6 mg o aproximadamente 0.9 mg por ojo por dia.

4.- El uso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho siARN se administra durante 5-15 dias.

5.- El uso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho siARN se administra durante 10 dias.

6.- El uso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho siARN se administra crónicamente.

7.- El uso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho siARN es el compuesto definido como SEC ID NO: 2.

8.- El uso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho siARN se administra tópicamente en el ojo.

9.- Un siARN dirigido a la SEC ID NO: 1 para su uso en el tratamiento del ojo seco y/o dolor ocular, en donde el siARN se administra a una dosificación de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 mg por dia.

10.- El método de tratamiento del ojo seco y/o dolor ocular, en donde un siARN dirigido a la SEC ID NO: 1 se administra a una dosificación de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 mg por dia.

11.- Un kit médico para la administración de un siARN dirigido a la SEC ID NO: 1 que comprende un suministro de un siARN dirigido a SEC ID NO: 1, en donde dicha dosificación contiene de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 mg para la administración diaria y se imprimen instrucciones para administrar un siARN dirigido a SEC ID NO: 1, de conformidad con las reivindicaciones 1 a 7. RESUMEN La invención se refiere a métodos y composiciones para el tratamiento y/o prevención de afecciones oculares relacionadas con altos niveles de expresión y/o actividad del receptor vaniloide-1 (TRPV).