JP5578388B2 - 中枢神経システム及び／若しくは眼の細胞及び組織中の遺伝子の特異的阻害のための手段と方法 - Google Patents

Description

本発明は中枢神経系（ＣＮＳ）及び／若しくは眼の細胞及び組織中の遺伝子の発現の特異的調節に関係するものである。特に、本発明は、対象物のＣＮＳ及び／もしくは眼の細胞及び／若しくは組織中の１若しくはそれ以上の標的遺伝子の発現の特異的調節に対する組成物の調合用の１若しくはそれ以上の二本鎖オリゴリボヌクレオチド（ｄｓＲＮＡ）の使用に関するものであり、前記組成物は血液脳関門若しくは血液網膜関門の外側で適用されるように設計される。本発明はさらに遺伝子の各機能の同定及び確認の方法に関するものであって、前記方法はテスト細胞、テスト組織、若しくはテスト生物を提供し、結果として生じる表現型と適切な対照の表現型とを比較するためのｄｓＲＮＡの上記使用を含み、これにより前記遺伝子の機能に関する情報を得ることが可能になる。加えて、本発明は本発明の前記方法によって得られる細胞、組織及び非ヒト生物に関するものであり、前記生物は好ましくは中枢神経系若しくは眼の疾患の表現型を示すものである。さらに、本発明はＣＮＳ及び／若しくは眼に関する障害の診断及び／若しくは治療のためのＲＮＡ干渉技術の使用、及び前述の方法を利用した前記眼の細胞及び／若しくは組織中の標的遺伝子の発現を特異的に調節する能力を有する薬剤の同定及び単離の方法に関するものである。

いくつかの特許文献がこの明細書の本文を通じて引用されている。ここに引例された各特許文献（あらゆる製造者の仕様書、取り扱い説明書等を含む）はこの参照によりここに組み込まれる、しかしながら引例された全ての特許文献が本発明の先行技術であるという承認ではない。

ヒトの眼は非常に複雑な器官であって、それは視覚の最適な過程、レンズ上の光線の衝突を電気的刺激（インパルス）へ変換する工程と、意識知覚に関与する脳領域へ伝達する工程とを確実にするように調整されている特有の構造と組織の特異的な機能に起因するものである。特に、光エネルギーの電気インパルスへの変換を仲介し、機能的に極めて高度に特殊化された種類の細胞である例えば多層網膜などの眼底の組織、及び網膜色素上皮（ＲＰＥ）も非常に高度な代謝活性によって特徴付けられる。血液循環からの栄養分を有する光受容体の活性供給と、視覚過程の分解産物の同時除去と処理とは前記ＰＲＥを介して起こり、次にこのＰＲＥはブルッフ膜（Ｂｒｕｎｃｈ'ｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）によって脈絡毛細管枝の血管から離される。前記ＰＲＥ及びブルッフ膜を介する物質の交換は制御され特異的であり、前記血液脳関門に対するこの機能的類似に基づいて、この場合血液網膜関門を説明する。

多数の発現した遺伝子の活性は、前記網膜の細胞中の光伝達過程及び前記血液網膜関門を横切る代謝交換の調節及び実行に必要であり、さらに眼底の組織の多くの構成要素の構造及び機能的整合性の維持にも必要である。従ってこの独自で高度に発達したシステムは、網膜疾患の広い表現型範囲で発現している多くの遺伝的欠陥にとても影響を受けやすい。

ヒト中枢神経系のように、ヒトの眼は多数の特異的な構造及び組織の高度な複雑性及び組織的な機能性で特徴付けられる器官である。両者は、有害な環境の影響に対して関門（涙分泌、酵素、輸送メカニズム、血液網膜関門及び血液ＣＮＳ関門）によって保護される。血液脳関門のように、前記血液網膜関門も眼の内部による薬剤の取り込みに対する生理的な関門を示し、現在の技術では眼疾患の薬理療法−もし可能ならば−を非常に困難にしている。

従って眼科疾患を含む前記ＣＮＳの障害の治療用で市場で現在利用できる薬剤は、高用量の必要性が原因である副作用にしばしば関連した臨床症状の治療にのみ利用可能である。前記ＣＮＳ、特に眼の底部の原因療法は、注入の他には不可能である。さらに、複数要因由来の網膜疾患の病因を構成する複雑な分子代謝相互関係の情報の現状は限られている。その結果、市場で利用できる薬剤はそのような疾患の症状の治療にのみ適している。

本発明の技術的な課題は、ＣＮＳ及び／若しくは眼に関連する疾患の治療のための治療手段の必要性の観点において、前記ＣＮＳ及び／若しくは眼での障害に関する遺伝子の同定及び調節のための手段及び方法を提供することである。より具体的には、本発明の技術課題は、傷つけることなく血液脳関門及び／若しくは血液網膜関門を乗り越えながら、哺乳類ＣＮＳ及び／若しくは眼の標的遺伝子及び遺伝子産物の制御された調節のための非侵襲的方法を提供することである。

これも、例えば標的遺伝子の発現の阻害のための、いわゆる一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの適用に対して関連があり、眼に対するこの適用は硝子体内注入を必要とする。前記血液網膜関門を乗り越えることは、眼組織中のタンパク質発現の特異的阻害による眼科疾患の治療における技術課題を示す。

前記技術課題に対する解決は請求項で特徴付けられる実施形態を提供することによって達成され、以下にさらに記載されている。

従って、本発明は、対象物の中枢神経系及び／若しくは眼の細胞及び／若しくは組織中の１若しくはそれ以上の標的遺伝子の発現の特異的調節のための組成物の調合用の１若しくはそれ以上の二本鎖オリゴリボヌクレオチド（ｄｓＲＮＡ）の使用に関するものであり、前記組成物は血液脳関門若しくは血液網膜関門の外側で適用されるように設計されている。同様に、本発明は前記ＣＮＳ及び／若しくは眼の細胞及び／若しくは組織中の標的遺伝子の発現の特異的な調節に対する方法に関するものであり、そこにおいて１若しくはそれ以上の二本鎖オリゴリボヌクレオチド（ｄｓＲＮＡ）を有する組成物は、血液脳関門若しくは血液網膜関門外の細胞、組織、若しくは生物に導入され、好ましくは前記方法は前記ｄｓＲＮＡを含む細胞及び／若しくは組織を有する非ヒト生物の提供をもたらし、前記生物若しくは対応するテスト細胞若しくは組織は、ＲＮＡ干渉によって１若しくはそれ以上の標的遺伝子の対応するｍＲＮＡを分解できる条件下で維持される。

本発明は、幅広い専門的な意見と対照的な驚くべき発見に基づいており、本発明の活性物質は生理的関門としての血液網膜関門を通過することができ、眼底中の疾患の特異的な治療のために、眼の外側への全身的な若しくは局所的な適用を可能にする。血液網膜関門及び血液脳関門の細胞若しくは分子構造と同様に、機能面での高度な類似性に起因して、本発明によって提供された前記方法と薬剤組成物とは前記血液脳関門を通過し、従って前記ＣＮＳの疾患の治療に適用可能であると予想される。

従って、本発明はＣＮＳ及び／若しくは眼の疾患の治療のための構成要素と同様に、改良された方法を提供する。

本発明の基本概念は、ＣＮＳ及び／若しくは眼の細胞及び組織中の標的遺伝子の発現の特異的な阻害のための方法に関し、この方法は、
−前記血液網膜関門若しくは血液脳関門の外側への１若しくはそれ以上の二本鎖オリゴリボヌクレオチド（ｄｓＲＮＡ）の運搬と、
−各関門を通過する前記二本鎖オリゴリボヌクレオチド（ｄｓＲＮＡ）と、ＲＮＡ干渉による１若しくはそれ以上の標的遺伝子の対応するｍＲＮＡの発現の調節とによるものである。

故に本発明に従うと、前記ＣＮＳ若しくは眼中の標的遺伝子若しくは遺伝子産物の調節ができるｄｓＲＮＡを有する前記組成物は、好ましくは大量の、すなわち化合物の血液脳関門の通過を促進する運搬増強因子の実質上効果的な量なしで、及び／若しくは侵襲性方法及び装置の適用の必要性なしで投与されるように設計され、例えばそれら化合物、方法、及び装置は米国特許出願第ＵＳ２００２１８３６８３号、及び国際公開公報第ＷＯ０３／００００１８号を参照のこと。二本鎖オリゴリボヌクレオチド（ｄｓＲＮＡ）による遺伝子の特異的阻害のための方法は国際出願番号第ＷＯ０１／７５１６４号から理解される。この明細書の開示は本説明でこの参照によりここに組み込まれる。この明細書中は、二本鎖オリゴリボヌクレオチド（ｄｓＲＮＡ）が標的細胞へ運搬された後、ｍＲＮＡの特異的な分解を誘導するということを記載する。この過程の特異性は前記標的遺伝子のｍＲＮＡに対する２つのｄｓＲＮＡ鎖の１つの相補性によって仲介される。遺伝子特異的で、ｄｓＲＮＡ分子による遺伝子の転写後スイッチィングオフの過程はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として説明される。この単語は最初Ｆｉｒｅとその同僚らによって、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓへのｄｓＲＮＡ分子の運搬は、遺伝子発現を阻害するという観察（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９）を記載するために開発された。その後にＲＮＡｉは植物、原生動物、昆虫（Ｋａｓｓｃｈａｕ ａｎｄ Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ １９９８）、及び最近では哺乳類細胞（Ｃａｐｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２００１）においても証明された。ＲＮＡｉによる遺伝子発現抑制メカニズムはまだ完全に理解されていない。非哺乳類細胞の研究により、ｄｓＲＮＡ分子は内因性リボヌクレアーゼによって低分子干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ分子）に形質転換されることを示された(Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｇｒｉｓｈｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１;Ｈａｍｉｌｔｏｎ ａｎｄ Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，１９９９；Ｋｎｉｇｈｔ ａｎｄ Ｂａｓｓ，２００１；Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０００)。２１から２３ｂｐ（塩基対）長ｓｉＲＮＡ分子は従って前記標的遺伝子のｍＲＮＡの分解の実際の介在物質である。標的遺伝子の前記特異的阻害に対して、二本鎖オリゴリボヌクレオチドが、標的遺伝子と同一の長さ２１から２３ヌクレオチド（塩基対）を呈すれば十分であり；例えばＥｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６（２００２），１９９〜２１３と、Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１０（２００２），５６３〜５７４を参照のこと。

ＣＮＳ及び眼、特に眼底に対する活性物質の対象適用の技術課題は、ヒト眼及び脳の構造が原因であり、それらの関門は活性物質が前記標的組織に到達することを妨げる。現在の治療は多くの副作用を伴い、長期的な結果を有すると予想される。例えば眼底への注入などの直接的な適用は、特に繰り返し治療若しくは慢性治療が必要な際に、関係する人にとってはとても不快である。さらに、眼球への直接的な適用は多くの副作用、及び中期的に発生する二次障害はそれぞれ、例えば白内障や緑内障などを伴う。一方全身的な適用はしばしば大量の活性物質が前記標的組織中に検出されることなしに、概して標的器官である眼や脳以外で副作用を発生させる。全身的適用の好ましくない副作用の危険を最小限にする十分な標的特異性を有していても、なおこの適用方法は非効率である、なぜなら前記標的組織及び標的細胞は血液脳関門若しくは血液網膜関門の向こう側に位置付けられており、この関門の厳しい働きのため前記活性物質がその活性部位に到達できないためである。この課題は本発明によって解決されている。

最近市場にある眼科疾患の治療に対する薬剤は、目薬という比較的簡単な適用がこの場合可能であるので、ほぼ眼の前部の臨床症状の治療に対して使用可能である。特に眼の後部の原因治療は、前述の副作用を伴う前記注入以外の従来の薬剤組成物では不可能である。ＣＮＳ関連障害は現在主に全身的適用によって治療されている。いくつかの場合において、例としてパーキンソン病などでの外科手術若しくは移植プローブによる刺激は前記症状を緩和できるが、前記病気の原因を治療するものではない。この技術課題に対する解決方法として、本発明は前記ＣＮＳ若しくは眼底の疾患における分子レベルでの特異的介入のための方法を提供し、これは前記標的組織への直接的適用を必要としない。本発明は、ＣＮＳ、眼の内側、及び眼底の病気、特に眼球の内部部分の病気の、未だ一般的ではない若しくはただ不十分に取り扱われている治療領域を総合的に開拓する。前記介入は、ＣＮＳ若しくは眼それぞれの前記標的組織中で特異的に若しくは優性に発現した遺伝子の阻害に基づいており、血液脳関門及び／若しくは血液網膜関門を通過する必要性活性物質の能力によって特徴付けられ、前記各関門の外側での全身的若しくは局所的適用を可能にする。

ＣＮＳ障害の例としては、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、双極性障害、統合失語症、健忘症、偏頭痛、脳卒中、不眠症、アルコール依存症、不安症、強迫性障害、大脳後天性ヒト免疫不全症候群、慢性痛及び他多数の疾患などである。

本発明の組成物は局所的に若しくは全身的に、例えば静脈内などに投与される。非経口投与に対する製剤は、無菌水溶液若しくは非水溶性溶液、懸濁液、及び乳濁液を含む。非水溶性溶媒の例としては、プロピレングリコールと、ポリエチレングリコールと、例えばオリーブ油などの植物性油と、例えばエチルオレイン酸などの注入可能な有機エステルとである。水溶性担体は水、アルコール性／水溶性水溶液、乳濁液、若しくは生理食塩水と緩衝液を含む懸濁液を含む。非経口溶媒は食塩水、リンガーブドウ糖、ブドウ糖及び塩化ナトリウム、ラクトリンガー液、若しくは固定油を含む。非経口媒体は液体及び栄養性補充薬、電解質補充薬（例えばリンガーブドウ糖に基づいた補充薬）及びそれと同等なものを含む。防腐剤及び他の添加物は例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスとそれらと同等なものなどで存在する。さらに、本発明の前記薬剤組成物は、例えばインターロイキン、若しくはインターフェロンなど、前記薬剤組成物の所望の使用に依存するさらなる因子を有する。

本発明に従うと、前記薬剤組成物は、約０．１μｇ〜約１０ｍｇユニット／日、及び／若しくはユニット／ｋｇ体重の間の効果的な用量で対象物に投与され、好ましくは０．１〜２．０ｍｇの間である。前記適切な用量はさらに下で及び実施例において記載されているように決定できる。

好ましい実施形態において、本発明による前記使用は上記ＣＮＳなどの障害の治療を対象にしている。最も好ましくは、治療する前記障害は眼に関係している。そのような障害は脈絡網膜炎及びヘルペス網膜炎を含み、これらは後天性型の網膜疾患として考えられており、網膜障害疾患の大部分は遺伝的素因の低下である。これらは例えば初期網膜剥離（ａｂｌａｔｉｏ ｒｅｔｉｎａｅ）、網膜芽細胞腫、網膜星細胞腫（Ｂｏｕｒｎｅｖｉｌｌｅ‐Ｐｒｉｎｇｌｅ）、網膜血管腫症（Ｈｉｐｐｅｌ‐Ｌｉｎｄａｕ）、コート病（滲出性網膜炎）、イールズ病、中心性漿液性網膜症、眼白子症、網膜色素変性症、白点状網膜炎、アッシャー症候群、レーバー先天性黒内障、錐体ジストロフィー、卵黄様黄斑変性症（ベスト病）、若年性網膜分離症、ノースカロライナ黄斑変性症、ソルスビー（Ｓｏｒｓｂｙ）基底ジストロフィー、ドイン（Ｄｏｙｎｅ’ｓ）ハニカム網膜ジストロフィー（Ｍａｌａｔｔｉａ Ｌｅｖｅｎｔｉｎｅｓｅ）、スタルガルト病、ワーグナー硝子体網膜変性症、若しくは加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、同様にベスト梅毒若しくはスタルガルト梅毒のような単一遺伝子網膜症など、を含む。さまざまな遺伝的欠陥はこの広範囲の眼科疾患表現型を導く若しくは生じやすくすると知られている。

従って、本発明の前記方法と使用の好ましい実施形態において、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、感覚神経網膜及び／若しくは脈絡膜の細胞は特に好ましい。本発明の特定の実施形態において、治療される前記障害は滲出型加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）若しくは糖尿病性網膜症である。

以下に続く説明では、遺伝的構成要素を有する複雑な眼科疾患の例としてＡＭＤを扱う。この例は分子的原因の研究、及び診断と薬剤処置戦略の開発に関する前記関連技術課題を説明する。

ＡＭＤは網膜変性のサブタイプとして考えられており、先進国での視覚疾病の最も共通する原因であり、有病率は５２歳以上の人では９％、から７５歳以上の人では２５％を越えて増加している（Ｐａｅｔｋａｕ ｅｔ ａｌ．１９７８，Ｌｅｉｂｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．１９８０，Ｂａｎｋｓ ａｎｄ Ｈｕｔｔｏｎ １９８１，Ｇｈａｆｏｕｒ ｅｔ ａｌ．１９８３，Ｈｙｍａｎ １９８７，Ｈｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．１９８３，Ｇｒｅｙ ｅｔ ａｌ．１９８９，Ｙａｐ ａｎｄ Ｗｅａｔｈｅｒｉｌｌ １９８９，Ｈｅｉｂａ ｅｔ ａｌ．１９９４．）
ＡＭＤは内因性因子と同様に外因性因子によって引き起こされる複雑な病気である（Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｚａｃｈａｒｙ １９８８，Ｓｅｄｄｏｎ ｅｔ ａｌ．１９９７）。環境要因に加えて、いくつかの個人的危険要因、例えば遠視、明色皮膚及び虹彩色、高い血清コレステロールレベル、高血圧、若しくは喫煙など、が提言された（Ｈｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．１９８３，Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．１９９３，Ｓｐｅｒｄｕｔｏ ａｎｄ Ｈｉｌｌｅｒ １９８６，Ｔｈｅ Ｅｙｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃａｓｅ−Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ １９９２，Ｂｒｅｓｓｌｅｒ ａｎｄ Ｂｒｅｓｓｌｅｒ １９９５）。ＡＭＤに対する遺伝的構成要素はいくつかの研究グループによって実証されており（Ｇａｓｓ １９７３，Ｐｉｇｕｅｔ ｅｔ ａｌ．１９９３，Ｓｉｌｖｅｓｔｒｉ ｅｔ ａｌ．１９９４）、前記疾患は遺伝的な傾向がある患者において環境／個人的要因によって誘発されるという仮説が導かれた。変異によってＡＭＤにかかりやすくなる遺伝子数は知られていないが、多数であろう。

ＡＭＤの治療のための最近の物理的アプローチ、例えばレーザー光凝固術、光線力学療法（ｖｅｒｔｅｐｒｏｆｉｎ、商標名Ｖｉｓｕｄｙｎｅ（商標登録）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を用いた）、放射線若しくは外科的療法など、を使用しての成功は、中程度のパーセンテージの患者で達成されただけであった。ＡＭＤの誘発遺伝子の同定に対して従来のアプローチを適用することは、遺伝的な不均一が原因で困難である。臨床的表現型の複雑さにより、変異によってＡＭＤにかかりやすくなる遺伝子の数は大量であると推測される。

それ故、ここに記載された本発明の前記方法、使用、及び組成物は、他の疾患と同様にこの特定の疾患の治療に対する重要な改良、及び代替治療行為を説明する。それら実施形態に関して、前記薬剤的組成物は好ましくは、前記眼の後部に効果的である（及び適用される）ように設計され、好ましくは血液網膜関門の網膜領域の外側に適用されるように設計された形態である。

前述したように、本発明に従って用いられる化合物はｄｓＲＮＡであり、好ましくは二本鎖オリゴリボヌクレオチド（ｄｓＲＮＡ）の一部を含むリボヌクレオチドで通常実質上構成されている。望ましくは、二本鎖高次構造中に存在する前記二本鎖ＲＮＡの範囲は、少なくとも５、１０、２０、３０、５０、７５、１００、若しくは２００を含む。前記二本鎖範囲は好ましくは１５〜３０ヌクレオチド、最も好ましくは２０〜２５、特に好ましくは２１〜２３ヌクレオチドを含む。標的部位の選択における手段としての二次構造予測及びｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ到達性は、例えばＡｍａｒｚｇｕｉｏｕｉに記載されている（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８ （２０００），４１１３〜４１２４．）。修飾デオキシヌクレオシドの取り込みによるＤＮＡの二次構造標的の最小化：ハイブリダイゼーションによる核酸分析のための予想は、Ｎｇｕｙｅｎ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８（２０００），３９０４〜３９０９）に記載されている。前記ｄｓＲＮＡ分子は末端３’ヒドロキシル基も含むことができ、１若しくはそれ以上のヌクレオチドの付加、欠損、置換、若しくは修飾によって前記遺伝子若しくは遺伝子産物のヌクレオチド配列と異なる、天然由来ＲＮＡの類似体を表す。標的遺伝子の遺伝子発現を阻害するためにＲＮＡを生細胞へ導入する一般的な工程は、二本鎖構造のＲＮＡ、すなわちｄｓＲＮＡ若しくはＲＮＡｉを有し、当業者には知られており、国際出願番号第ＷＯ９９／３２６１８号、第ＷＯ０１／６８８３６号、第ＷＯ０１／７７３５０号、第ＷＯ００／４４８９５号、第ＷＯ０２／０５５６９２号、及び第ＷＯ０２／０５５６９３号に記載されており、この内容の開示はこの参照により取り込まれる。好ましくは、前記ＲＮＡ干渉の対象の前記標的遺伝子は優性遺伝子であり、若しくはより好ましくはＣＮＳ及び／若しくは眼の前記細胞及び／若しくは組織中に発現された遺伝子である。

別の技術課題は、診断及び薬理学的処置の標的としてのそれら遺伝子の評価と、ＣＮＳ及び網膜疾患を引き起こす遺伝子の同定とからなる。従来の実験戦略はしばしば適用することが困難である。ＡＭＤに関して、低い普及率及び／若しくは発生率、若しくは一般的に７０歳代で診断される晩年でのみ起こる症状の発生は、前記病因に関連した遺伝子の前記同定を妨害する。ポジショナルクローニングは、連鎖解析が矛盾した結果を導き、患者やその家族が少ないためほぼ実行できないので多くの場合不可能である。同様に、連鎖解析は解析される患者群が病因を解明しようとしている病気とは異なる障害を患う個人を含む場合、決定的ではなくなるかもしれない。２若しくはそれ以上の障害が多くのＣＮＳ障害の場合のように、区別して診断することが困難である同一若しくはとても類似した症状を有している場合、これは起こり得る。例えば統合失調症は、多数の遺伝子が関連したいくつかの異なる病因によって引き起こされると考えられている。

従って、更なる様態において、本発明はＣＮＳ及び／若しくは眼の細胞及び／若しくは組織中の標的遺伝子の発現の特異的調節のための方法に関し、この方法において１若しくはそれ以上の二本鎖オリゴリボヌクレオチド（ｄｓＲＮＡ）を有する組成物が血液脳関門若しくは血液網膜関門の外側の細胞、組織若しくは器官に導入される。これらの細胞、組織若しくは器官は、同定された標的遺伝子の評価のために用いられ、一方そのような標的遺伝子の同定のためにも用いられ、その工程は：
１若しくはそれ以上の対応ｍＲＮＡを分解する工程と、
１若しくはそれ以上の標的遺伝子の前記対応ｍＲＮＡは分解される、テスト細胞若しくはテスト組織を提供及び維持する工程と、
好ましくは、前記遺伝子の機能情報を得るために、前記産生されたテスト細胞若しくはテスト組織が発現する表現型を、適切な対照細胞若しくは対照組織と比較及び観察する工程とを有する。

好ましい実施形態において、及び実施例に記載されたように、これは提供された前記テスト細胞若しくは組織が上述の組成物を適用した動物由来であることを意味している。前記テスト細胞若しくは組織の検定はｉｎ ｖｉｖｏ若しくはｉｎ ｖｉｔｒｏで実行可能であり、例えば対象細胞若しくは組織が前記動物から単離された後の哺乳動物が特に好ましい。

細胞の機能、細胞中の遺伝子の発現、若しくは細胞中の標的ポリペプチドの生物活性を調節する核酸配列を同定するための、単一細胞培養ベース方法に基づいた手段及び方法は、例えば欧州特許番号ＥＰ １ ２２９ １３４ Ａ２に記載されている。しかしながら、二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ発現ベクター等の選択に関わる前記技術詳細は、例えば前述の欧州特許明細書ＥＰ １ ２２９ １３４ Ａ２等の先行技術から入手し、動物システムに基づいて実行される前記発明の方法に適用することができる、すなわちこの方法において少なくとも前記１若しくはそれ以上の二本鎖ＲＮＡ分子を適用する時は、前記テスト細胞若しくはテスト組織は好ましくは非ヒト動物で構成される。標的遺伝子機能は前記ｄｓＲＮＡを適用する際、前記細胞、組織若しくは動物の表現型での反応性の変化を観察することによって理解され、前記表現型は好ましくは前記ＣＮＳ及び／若しくは眼の障害に関連するものである。

本発明の好ましい実施形態において、前述の使用若しくは方法では標的遺伝子発現の阻害となる発現の特異的調節を述べた。前記１若しくはそれ以上の標的遺伝子は、好ましくは細胞性ｍＲＮＡをコード化している。前述したように、前記標的細胞及び／若しくは組織は、眼の細胞及び／若しくは組織である。

本発明の実施形態において、前記細胞若しくは組織は眼球の内部部分の細胞若しくは組織であり、好ましくは網膜細胞であり、特に好ましくは網膜色素上皮（ＲＰＥ）の細胞若しくは感覚神経網膜細胞である。

さらに、本発明は１若しくはそれ以上の二本鎖オリゴリボヌクレオチド（ｄｓＲＮＡ）を含む薬剤若しくは薬剤的組成物に関するものであり、ｄｓＲＮＡはＲＮＡ干渉の手段によって標的遺伝子の制限された機能により眼科疾患を引き起こす１若しくはそれ以上の標的遺伝子の対応ｍＲＮＡの発現を阻害するものであり、血液網膜関門の外側、特に眼の外側に適用される。同時に、例えば注入などの直接的適用に関連した、ヒト眼の構造に基づいた直接的適用、例えば注入などに関連した副作用は、及び特に繰り返し若しくは慢性的な治療に係るヒトにとって非常に不快で、例えば白内障及び緑内障などの長期的な結果に関連した副作用は、本発明によって軽減される。二本鎖オリゴリボヌクレオチド（ｄｓＲＮＡ）は対応ｍＲＮＡ分子のＲＮＡ干渉によって前記標的細胞中の標的遺伝子の阻害を誘発するために、本発明で用いられ、適用後血液網膜関門を通過する。本発明はさらに、遺伝的に引き起こされた眼科疾患の特異的な治療に対するｄｓＲＮＡ分子の薬剤を含む。本発明は、未だ一般的ではない若しくはただ不十分に取り扱われている眼の内側及び眼の裏の疾患の治療領域を広範囲に開発する。

網膜組織の細胞及びＲＰＥの特異的機能に基づいて、その異常な機能が眼の裏側の疾患を引き起こす遺伝子は、眼の裏側の組織及び細胞で特に発現され、従って薬剤処置の好ましい標的を意味していると仮定されている。脳及び／若しくは眼の組織中で特に発現された遺伝子を標的にした場合に、遺伝子発現を調節する効果は最大になり、副作用が全くないか若しくは少ししかない。従って本発明は上記の使用若しくは方法の実施形態を含み、前記標的遺伝子の１若しくはそれ以上は前記細胞及び／若しくは組織中で優性発現であるか、若しくは前記標的遺伝子の１若しくはそれ以上の発現は前記細胞及び／若しくは組織に特異的である。本発明の基礎となる技術課題の解決方法は、特異的阻害に対する方法の提供からなり、この遺伝子の異常機能は一遺伝子的若しくは多因子性起源のＣＮＳ若しくは眼科疾患に関連している。例えばＡＭＤは変性網膜疾患の一形態として考えられる。

前に言及したように、標的遺伝子の特異的阻害のためには、二本鎖オリゴリボヌクレオチドが前記標的遺伝子に対して同一若しくは実質的に同一である、長さ２１〜２３ヌクレオチド（塩基対）を有することで十分である。前記ｄｓＲＮＡ分子は長さ２１〜２３ヌクレオチドである前述の使用若しくは方法は本発明の好ましい実施形態である。前記ｄｓＲＮＡ分子は末端３’ヒドロキシル基を含むことができ、化学的に合成される及び／若しくは天然由来ＲＮＡの類似体を示す。前記ｄｓＲＮＡ類似体は、１若しくはそれ以上のヌクレオチドの付加、欠損、置換若しくは修飾によって対応天然由来ＲＮＡと異なることもできる。好ましい実施形態において、前記ｄｓＲＮＡ分子は"転写後サイレンシング"によって前記対応標的遺伝子を阻害する。

本発明の中心的な概念は、例えば静脈内注射などの全身的に適用した後血液網膜関門を通過でき、特に眼底の組織中の標的遺伝子を不活性化する、２１から２３ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ分子である点で驚くべきものである。ｄｓＲＮＡによって血液網膜関門を克服することを示すことができた実験は今まで１つもなかったので、この関門を克服することはなおさら注目すべきことである。血液網膜関門及び血液脳関門の細胞構造及び分子構造だけでなく機能における高い類似性のおかげで、本発明によって提供された前記方法及び薬剤的組成物は血液脳関門も通過することが可能であり、それによりＣＮＳの疾患の治療にも適用可能である。

前記ヌクレオチドは"裸の"ｄｓＲＮＡとして適用され得るだけでなく、好ましい実施形態において前記ｄｓＲＮＡ分子はベクターによってコード化される。ｄｓＲＮＡをコード化するベクター及び組換え核酸分子、若しくは細胞中に発現された適切に組み換えされたＲＮＡ前駆体は、標的低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を産生するために細胞によって加工（プロセシング）され、このｓｉＲＮＡは特許文献、例えばＷＯ０３／００６４７７などで記載されたように前記細胞独自のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いて標的遺伝子を（特異的ｍＲＮＡｓを排除（ｃｌｅａｎｉｎｇ）することによって）選択的に抑制する。発現が一時的及び特異的（すなわち特異的な時間及び／若しくは特異的な組織、器官若しくは細胞中で）のどちらも選択的に調節され得る適切な制御配列は、当業者においてはよく知られており、とりわけＷＯ０３／００６４７７中にも記載されており、そこに開示されている内容はこの参照によりここに組み込まれる。

特に好ましいのは、前記ｄｓＲＮＡの発現は細胞及び／若しくは組織特異的プロモーターの制御下であることである。本発明の教示することに従って用いられ得るベクターは当業者にとっては知られているものであり；例えば、ＴａｖｅｒｎａｒａｋｉｓらのＮａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２４（２０００），１８０〜１８３に記載されている、導入遺伝子によってコード化された二本鎖ＲＮＡによる遺伝性及び誘導性の遺伝的干渉、などを参照のこと。さらに遺伝子転移及び遺伝子組換え動物の産生のためのベクター及び方法は先行技術中に記載されており；例えば、ＱｉｎｇらのＶｉｒｏｌ．７７（２００３），２７４１〜２７４６中に記載されているアデノ随伴ウイルス関連ベクター、ＣｈｅｎｇらのＣｕｒｒ．Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２４（２００４），１９６〜２０１中に記載されている成体ウサギ網膜へのヒト免疫不全ウイルスタイプ２（ＨＩＶ−２）ベクター仲介ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子転移、ＫｒｅｐｐｅｌらのＩｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４３（２００３），１９６５〜１９７０中に記載されている大容量アデノウイルスでの遺伝子転移後のＲＰＥ中での長期的な導入遺伝子発現、及びＢｏｒｒａｓらのＪ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．３（２００１），４３７〜４４９中に記載されているｉｎ ｖｉｖｏサルの眼球前部への反復アデノウイルスＧＦＰ遺伝子運搬の非侵襲性観察などがある。ＣＮＳ遺伝子転移はＬｅｏｎｅらのＣｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１（１９９９），４８７〜４９２中にも記載されていた。

さらに、前記ｄｓＲＮＡｓは他の分子に結合して及び／若しくは１若しくはそれ以上の適した担体と結合して、前記細胞若しくは組織に導入され得る。そのような担体はミセル構造であり、好ましくはリポソーム、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）などのウイルス由来或いは合成的に生産された被覆タンパク質、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）若しくはアデノウイルスなどである。また前記ｄｓＲＮＡは陽イオン性ポルフィリン、陽イオン性ポリアミン、重合体ＤＮＡ結合陽イオン、若しくは膜融合性ペプチドに結合され得る。前記ｄｓＲＮＡの被覆タンパク質若しくはリポソームへのパッケージング、及び／若しくは前記ｄｓＲＮＡの担体との結合は、標的を改善するだけでなく半減期を延長する。担体及び／若しくは前記ｄｓＲＮＡ結合分子として、前記ｄｓＲＮＡ分子が標的細胞若しくは標的組織へ、適用後決められた期間以上で持続的に運搬されるようなものが選択されることが好ましい。従って副作用を引き起こすであろう若しくは単純に効果のないであろうｄｓＲＮＡの最高濃度は避けられる。前記細胞及び／若しくは組織特異的であると上で定義された担体も好ましい。そのような担体は当業者によく知られており；例えば、ミセル特性におけるアシル鎖長の効果に関してはＡｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍ．Ｅｄ．１３（２００２），９９１〜１００６；陽イオンリポソーム及びシクロデキストリンに関してはＤａｓｓ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５４（２００２），３〜２７；組換えアデノ随伴ウイルス仲介遺伝子運搬の形質導入効果を増強するプロタミン硫酸に関してはＹａｎｇ ａｎｄ Ｈｓｉｅｈ，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１８（２００１），９２２〜９２７などを参照のこと。

本発明中に記載された方法は、ｄｓＲＮＡ分子（好ましくは上で特定された長さで）は眼球の外側で全身的若しくは局所的適用の後、眼の中で検出され得るということは初めて示されたという事実によって先行技術とは区別される。この検出は眼の内部の細胞若しくは組織中の特定された標的遺伝子の、ＲＮＡ干渉による特異的阻害に基づいている。

言うまでもなく、上述のスクリーニング方法におけるインターフェロン反応の誘導は、細胞死、抗増殖抑制、及び恐らく遺伝子サイレンシングの阻止を導くとされており望ましくない。遺伝子サイレンシングの間のインターフェロン反応を阻止する手段及び方法は当業者には知られており、とりわけ欧州特許番号第ＥＰ１ ２２９ １３４ Ａ２号の実施例７に記載されており、そこで開示されている内容はこの参照によりここに組み込まれる。本発明の方法及び使用の好ましい実施形態において、前記組成物は、ＣＮＳ若しくは眼の前記細胞若しくは組織に適切な担体によって導入されるように設計され、血液ＣＮＳ関門及び／若しくは血液網膜関門の外側で行われる適用、例えば目薬などによって特徴付けられた形態中にある。またそれは全身的に、イオン注入的に、若しくは眼球後注入によって投与され得る。

イオン注入は、電流を用いた組織内へのイオン化分子の能動的導入として定義されてきた。この技術は、全身血液循環と同様にドナー電極（例えば皮膚など）の下で組織へのドラッグデリバリー（薬物送達）を増強するために用いられており、全身への薬剤の運搬を提供する。イオン注入装置は少なくとも２つの電極を必要とし、それら両方は体の生体膜表面のある部分と電気的に接触している。"ドナー"若しくは"能動的な（ａｃｔｉｖｅ）"電極として一般的に言及される１つの電極は、例えば薬剤やプロドラッグなどの生理活性物質が体に運搬されるための電極である。反対の極性を有するもう１つの電極は体と電源の間の電気回路を完成するために機能する。この電極は"受容体"若しくは"受動的な"電極として一般的に言及される。イオン注入の間、薬剤溶液及び隣接する組織を通過するための電流を形成するために電極全体に電位が印加される。イオン注入は血液血管関連障害（例えば再狭窄など）、膀胱、子宮、尿道及び前立腺の障害の治療に対して説明されてきた。米国特許番号第６，２１９，５５７号；第５，５８８，９６１号；第５，８４３，０１６号；第５，４８６，１６０号、第５，２２２，９３６号；第５，２３２，４４１号；第５，４０１，２３９号；及び第５，７２８，０６８号は、中空、管状器官（膀胱、尿道及び前立腺）、及び血管への挿入のための異なるタイプのイオン泳動カテーテルを開示している。米国特許出願第２００２１８３６８３号はＣＮＳへの活性物質の運搬のための方法を示唆している。

ここに記載されたあらゆる使用及び方法において、対象物若しくは生物体は脊椎動物であり、好ましくは哺乳類若しくはヒトである。記載された方法は脊椎動物由来、好ましくは哺乳類由来の細胞及び／若しくは組織に適用され得る。ヒト細胞及び／組織は好ましい。

例えばＡＭＤ若しくは他の網膜疾患パターンに対する、１つ若しくは多くの原因遺伝子の制限された若しくは欠損した機能に基づいている病理学的代謝相互関係に関する最近の知識は、そのような疾患の治療には不十分である。前記障害の複雑さ、及び眼若しくはＣＮＳの介入及び処置用の単純な方法がないことが原因で、そのような疾患に対する適した動物若しくは細胞培養モデルは利用できない。本発明によって提供された方法を用いて、優性遺伝由来の眼の内部及び／若しくはＣＮＳの疾患の症状を呈する動物モデルが簡単に作成される。これらの動物モデルは眼科およびＣＮＳ関連疾患に対する特定の薬剤の開発の開始に適しており、製品の確証に用いられ得る。

従って、手順の実施例によって以下に説明される方法は、対象（その制限された機能が眼及び／若しくはＣＮＳの疾患を引き起こす）を有する動物モデルと同様に細胞培養の提供に適しており、その対象は同定され確証され得る。前記方法はさらに、眼底へ直接的に適用する必要なしに、分子レベルでの眼科疾患の特定の処置に適している。特に標的細胞中の遺伝子の阻害に対するＲＮＡｉの特異性は望ましくない副作用のリスクを最小化する。

さらなる実施形態において、本発明は遺伝子組換え（トランスジェニック）非ヒト動物に関するものであり、この動物は１若しくはそれ以上のｄｓＲＮＡ分子の存在が原因で１若しくはそれ以上の標的遺伝子の異常発現を示し、特にＣＮＳ及び／若しくは眼の疾患を再現する際、上記の方法によって得られる。本発明によっても含まれ、例えばトランスジェニックマウスなどの遺伝子組換え非ヒト動物を製造するための方法は、ポリヌクレオチド、若しくは前記ポリペプチドをコード化している標的ベクターの胚細胞、胚性細胞、幹細胞或いは卵、若しくはそこから由来した細胞への導入を有している。前記非ヒト動物はここに記載された発明のスクリーニング方法に従って用いられ得る。遺伝子組換え胚の産生及びそれらのスクリーニングは、例えばＡ．Ｌ．Ｊｏｙｎｅｒ Ｅｄ．，Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９３），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．に記載されているように実行され得る。遺伝子組換え非ヒト動物を作成するための一般的な方法は従来技術中に記載されており、例えば国際公開公報第ＷＯ９４／２４２７４号を参照のこと。遺伝子組換え非ヒト生物体（標的非ヒト動物を相同的に含む）を作成するために、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は好ましい。例えば不活性ＳＮＬ７６／７細胞支持細胞層（ＭｃＭａｈｏｎ ａｎｄ Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｃｅｌｌ ６２：１０７３〜１０８５（１９９０））上に有糸分裂的に培養されたＡＢ−１系統などのマウスＥＳ細胞は、基本的に記載された（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．（１９８７）Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ），ｐ．７１〜１１２）ように、相同遺伝子群標的に対して用いられる。他の適切なＥＳ株は、限定されるものではないが、Ｅ１４系統（Ｈｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２６：２９２〜２９５（１９８７））、Ｄ３系統（Ｄｏｅｔｓｃｈｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．８７：２７〜４５（１９８５））、ＣＣＥ株（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２３：４４５〜４４８（１９８６））、ＡＫ−７系統（Ｚｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７７：８７５‐８８４（１９９４））を含む。特異的標的変異を有するＥＳ細胞からマウス系統の産生に成功するかはＥＳ細胞の多分化能（すなわち宿主の例えば胚盤胞若しくは桑実胚などの発生中の胚に注入された際、胚発生に関与し、その結果生まれる動物の胚細胞に寄与するそれらの能力）に依存している。注入ＥＳ細胞を含む前記胚盤胞は、偽妊娠の非ヒト雌の子宮内で発達してもよく、キメラマウスとして生まれる。その結果生まれる遺伝子組換えマウスはリコンビナーゼ若しくはレポーター遺伝子座を有する細胞に対してキメラであり、戻し交配され、リコンビナーゼ若しくはレポーター遺伝子座（ｌｏｃｕｓ／ｌｏｃｉ）に対する遺伝子組換えマウスのヘテロ接合性を同定するために、子孫のＤＮＡ尾生検のＰＣＲ若しくはサザンブロット解析によって標的導入遺伝子の存在をスクリーニングされる。発生の特定の段階及び／若しくは遺伝子組換え動物の生涯で、標的遺伝子発現若しくは機能を不活性にすることも望ましい。これは例えば組織特異的（上記参照）な、発生調節性及び／若しくは細胞調節性プロモーター、及び／若しくは誘導性プロモーターなどを用いて達成され得、このプロモーターは例えば前記標的遺伝子ｍＲＮＡをコード化するＲＮＡ転写物に対するアンチセンス若しくはリボザイムの発現を促進する（上記参照）。適切な誘導性システムは例えばＧｏｓｓｅｎとＢｕｊａｒｄ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９ ＵＳＡ（１９９２），５５４７〜５５５１）、及びＧｏｓｓｅｎら（Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１２（１９９４），５８〜６２）によって記載されたようなテトラサイクリン調節遺伝子発現である。同様に変異遺伝子の発現はそのような調節因子によって調節される。好ましくは遺伝子組換え動物の細胞中の導入遺伝子の存在は、好ましくは上記に記載されたようなＣＮＳ及び／若しくは眼の障害に関連した状態に対して、様々な生理的で、発生上及び／若しくは形態学上の変化を導く。

本発明の方法に対して特に哺乳動物が好ましく、特にマウスとラットが好ましい。本発明に従って適用され得る対応する動物システムは当業者に知られており；例えばＳｈｉｂａｔａらのＮｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２２（２００２），３３７〜３４９に記載された、ノックアウト及びトランスジェニック（遺伝子組換え）マウスモデルを含む、神経学的障害に対する分子生物学的アプローチを参照のこと。しかしながら、このモデルシステムは価値のある予測結果を提供することが示されているので、広く用いられているゼブラフィッシュも使用され；Ｇｅｒｌａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．６７（２０００），７７３〜７８２を参照のこと。

本発明の別の実施形態において、前記遺伝子組換え非ヒト動物はＣＮＳ及び／若しくは眼の障害の治療のための薬剤を発見する過程に対して用いられる。好ましい非ヒト遺伝子組換え動物は哺乳類であり例えばマウスである。特に好ましくは遺伝子組換え生物であり、特にこの生物が眼の疾患の表現型を現す場合は好ましい。眼球の内部部分の疾患の表現型は、網膜疾患及び特に変性網膜疾患が好ましい。前記生物は例えばマウス、ラット若しくはゼブラフィッシュであり；上記参照のこと。

本発明の好ましい実施形態は、上に定義されたような疾患の治療に効果的な薬剤的組成物であり、本発明の説明に開示された組成物を有している。本発明の実施形態において、ＣＮＳ及び／若しくは眼の疾患に関連した遺伝子若しくは遺伝子発現を検出するのに効果的な診断用組成物も含まれ、説明に定義されたような組成物、若しくは細胞、組織、或いは上記に記載された生物体を有している。

細胞培養に対してのみ記載されている、ｓｉＲＮＡ及び他のＲＮＡベース分子を使用している引用文献と異なり、本発明に従って実行された実験は、長さ２１〜２３ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ分子は、例えば静脈注射などの全身的適用の後、血液網膜関門を通過し、眼底の組織中の標的遺伝子を特異的に不活性にする能力があるということを示している。ｄｓＲＮＡによって血液網膜関門を克服することを示すことができた実験は今まで１つもなかったので、この血液網膜関門の克服はなおさら注目すべきである。従って実施例の手段によって以下に説明されている本発明の方法及び使用は動物モデルの提供に適しており、眼の疾患の原因である制限された機能である標的はこの動物モデルによって同定され確認され得る。それらの方法は、例えば影響を受ける細胞若しくは組織の部位に直接適用する必要がない、分子レベルでのＣＮＳ及び眼科疾患の特異的干渉にさらに適している。例えば標的細胞中に特異的に発現した遺伝子の阻害のための好ましいＲＮＡｉなどの選択的インヒビター（阻害剤）の特異性は、望ましくない副作用のリスクを最小化する。

上に記載された本発明の方法及び使用のすべてにおける薬剤的組成物の用量は、主治医及び臨床的要因によって決定される。医学分野ではよく知られているように、患者一人一人に対する用量は多くの要因に依存しており、この要因としては患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、全身の健康、及び並行して投与される他の薬剤を含む。局所的な用量は例えば０．００１μｇ〜１０ｍｇの範囲内（若しくはこの範囲内の発現若しくは発現阻害のための核酸の範囲内）であり；しかしながら特に当該要因を考慮すれば、この典型的な範囲以下若しくは以上の用量は想定される。一般的に、前記薬剤的組成物の標準投与としての前記用量は０．０１μｇ〜１０ｍｇユニット／日の範囲内であるべきである。もし前記用量が連続的な注入ならば、特に０．０１μｇ〜１０ｍｇユニット／ｋｇ体重／分の範囲内であるべきである。経過は定期評価によって観察され得る。用量は変わるが、核酸の静脈内投与に対して好ましい用量は約１０^６〜１０^１２コピー核酸分子である。

本発明の治療用若しくは診断用組成物は、標的遺伝子若しくは遺伝子産物の調節が必要とされている障害を治療若しくは診断するのに十分である効果的な用量で個人に投与される。前記効果的な量は例えば個人の状態、体重、性別、及び年齢などの様々な要因に従って変わる。他の要因として投与形態を含む。前記薬剤的組成物は例えば冠内、腹腔内、皮下、静脈内、経皮内、滑膜内、筋肉内、若しくは経口経路などの様々な経路で個人に提供される。加えて、他の薬剤の同時投与若しくは経時的な投与も望ましい。

治療的に効果的な用量とは、前記症状若しくは状態を回復させるために必要とされる、本発明に従って記載された化合物の量を意味している。そのような化合物の治療効果及び毒性は細胞培養若しくは実験動物中で標準的な薬剤的手順、例えばＥＤ５０（集団の５０％で治療的に効果的な用量）及びＬＤ５０（集団の５０％に対して致死である用量）によって決定され得る。治療効果と毒性効果の間の用量割合は治療指標となり、ＬＤ５０／ＥＤ５０として表される。

加えて本発明は、眼の細胞及び／若しくは組織中の標的遺伝子の発現の特異的調節ができる薬剤の同定及び単離のための方法を提供し、以下の工程：
−上記の細胞或いは組織、若しくは非ヒト器官をスクリーニングするために化合物と接触する工程と、
−前記化合物は前記１若しくはそれ以上の二本鎖オリゴリボヌクレオチド（ｄｓＲＮＡ）分子に拮抗する若しくは作用するかどうかを決定する工程とを有している。

好ましい実施形態は、さらに前記化合物で処置された非ヒト生物−若しくはテスト細胞若しくは組織を未処置対照と比較する工程を有しており、そこにおいて上で定義されたような前記表現型の復帰若しくは回復は、適切な薬剤、若しくは眼に関連した疾患の治療用の薬剤に対するリード化合物を示している。

本発明の方法に従ってテストされ同定されるテスト物質は、例えばｃＤＮＡ発現ライブラリー、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、有機小化合物、ホルモン、ペプチド擬態、ＰＮＡｓ、アプタマー、若しくは同種のものなどの発現ライブラリーとなる（Ｍｉｌｎｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １（１９９５），８７９〜８８０；Ｈｕｐｐ，Ｃｅｌｌ ８３（１９９５），２３７〜２４５；Ｇｉｂｂｓ，Ｃｅｌｌ ７９（１９９４），１９３〜１９８、及び上に記載された文献）。テストされる前記テスト物質は、"ｆａｓｔ ｓｅｃｏｎｄｓ"と呼ばれている既知の薬剤でもあり得る。本発明はさらにテスト細胞を第二テスト物質、若しくは第一テスト物質の存在下のテスト物質の混合物と接触する工程にも関する。

上述したように、本発明は遺伝子活性を調節できる薬剤を同定し、得るための簡便なｉｎ ｖｉｖｏ検定法を提供し、それにより例えば統合失語症、パーキンソン病、アルツハイマー病、を含むＣＮＳ障害、及び上記の眼科疾患に関連した疾患の治療のための治療的因子として効果的である。これに従うと、本発明は、本発明分野では適切に標的遺伝子活性を調節できることで知られていたが、標的遺伝子活性若しくはその欠落によって誘発された生物の表現型反応の知識不足が原因で医療的使用にはこれまで提供されなかった化合物にも用途を提供する。本発明の１実施形態は、特に前記物質がこれまでＣＮＳ若しくは眼の障害の治療のための薬剤として知られていなかった場合、そのようなスクリーニングによって調節因子若しくはその誘導体として同定された薬剤若しくはプロドラッグの製造方法を有している。

物質はそれらｉｎ ｖｉｖｏ投与の後、排泄によって、若しくは代謝によって除去されるために１若しくはそれ以上の活性代謝産物若しくは不活性代謝産物に代謝される（Ｍｅｙｅｒ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．２４（１９９６），４４９〜４５９）。従って、本発明の方法に従って同定され得られた実際の化合物若しくは薬剤を用いるよりはむしろ、プロドラッグとして対応する薬剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）が用いられ、それは患者の代謝によって患者中で活性型に変換されるものである。プロドラッグ及び薬剤の適用に対して取られる予備的手段は前記文献に記載されている；再検討のためにＯｚａｍａ，Ｊ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｓｃｉ．２１（１９９６），３２２〜３２９を参照のこと。

さらに、本発明は前記ＣＮＳ及び眼科疾患の治療用の組成物の準備のためのそれらあらゆる方法によって同定され、単離され及び／若しくは生産された化合物の使用に関連する。治療用の方法として、同定された物質若しくはそれを含む組成物はそのような障害を患っている対象物に投与され得る。上記の方法によって同定され、単離され及び／若しくは生産された化合物は、薬剤の探索における及び薬剤若しくはプロドラッグの準備におけるリード化合物としても用いられ得る。

上に列挙された様々な工程はこの分野において一般的に知られている。例えば、これらの技術を実行するためのコンピュータプログラムは利用でき；例えばＲｅｉｎ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｌｉｇａｎｄ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ（Ａｌａｎ Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）などがある。化学的誘導体及び類似体の準備のための方法は当業者によく知られており、例えばＢｅｉｌｓｔｅｉｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｉｎｃ．，１７５ Ｆｉｆｔｈ Ａｖｅｎｕｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１００１０ Ｕ．Ｓ．Ａ．及びＯｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ．中に記載されている。さらにペプチド擬態、及び／若しくはコンピュータを用いた設計デザインの適切な誘導体及び類似体は、例えば上記の方法に従って使用され得る。薬剤発見におけるリード産生のための方法は、タンパク質の使用、及び例えば質量分析計（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７（１９９５），８８５９〜８８６０）やいくつかの核磁気共鳴分析（ＮＭＲ）方法（Ｆｅｊｚｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６（１９９９），７５５〜７６９；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２（１９９７），８９３０〜８９３１）などの検出方法を含む。それらは定量的構造活性相関（ＱＳＡＲ）分析（Ｋｕｂｉｎｙｉ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１（１９９３），２５５３〜２５６４，Ｋｕｂｉｎｙｉ，Ｐｈａｒｍ．Ｕｎｓｅｒｅｒ Ｚｅｉｔ ２３（１９９４），２８１〜２９０）、コンビナトリアル生化学、古典化学、及びその他（例えばＨｏｌｚｇｒａｂｅ ａｎｄ Ｂｅｃｈｔｏｌｄ，Ｐｈａｒｍ．Ａｃｔａ Ｈｅｌｖ．７４（２０００），１４９〜１５５を参照のこと）を含む若しくは依存している。さらに、担体の例及び処方の方法はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。

本発明はＣＮＳ及び／若しくは眼の細胞及び／若しくは組織中の１若しくはそれ以上の標的遺伝子の発現の特異的な調節のための組成物、核酸、非ヒト生物、宿主細胞、細胞株、組織、器官、薬剤、担体及び／若しくはベクターから成る群から選択された成分の使用にも関するものであり、前記成分は血液脳関門若しくは血液網膜関門の網膜領域の外で適用可能な１若しくはそれ以上のｄｓＲＮＡ分子を有する。上で言及された前記成分の１若しくはそれ以上は、ここの上で定義されたような方法における使用のためのキットの一要素となり得る。本発明はさらにＲＮＡ干渉の使用、及びＣＮＳ及び／若しくは眼に関連した障害の診断及び／若しくは治療に用いられた核酸、非ヒト生物、宿主細胞、細胞株、組織、器官、担体及び／若しくはベクターの使用と同様に、ドラッグデリバリー、若しくは標的遺伝子単離及び／若しくは確認におけるこれらの方法、細胞若しくは非ヒト生物体のいずれか１つの使用に関するものである。

本発明は例えばこれ以前に記載されたような特異的試薬を含むキット構成にも関するものである。オリゴヌクレオチド、ｄｓＲＮＡ若しくはベクターを含んでいるキットが準備され得る。このようなキットは例えば標的遺伝子の機能などを検出するために用いられる。このような特性は、これに限定されるものではないが、本発明の上記方法に従った法医学的分析、診断適用、及び疫学的研究を含む様々な目的に有用である。組換えＲＮＡ分子は例えば前記検出及び標的遺伝子の決定に適したキットの処方に役立つ。そのようなキットは、厳重な管理下にある少なくとも１つのコンテナを保持するのに適した区分された担体を一般的に有する。前記担体はさらに標的遺伝子若しくは遺伝子産物の発現若しくは活性の検出に適した組換えタンパク質若しくは抗体などの試薬を有する。前記担体は標識化抗原或いは酵素基質、若しくはそのような物などの検出のための手段も含む。

これら実施形態及び他の実施形態は、本記載及び実施例中に開示され含まれる。本発明に従って用いられ得る前記物質、方法、適用及び成分に関する文献は、例えば電子装置を用いて公共のライブラリーやデータベースで手に入れることができる。例えば公共のデータベース‘Ｍｅｄｌｉｎｅ’を用いることができ、これは米国国立衛生研究所（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）のｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ及び／若しくはｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅによって支援されている。他のデータベースおよびインターネットアドレス、例えばヨーロッパ分子生物学研究所の一部である欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）など、は当業者にはよく知られており、インターネット検索機関を用いることによって見つけることができる。バイオテクノロジーの特許情報の検索及び特許情報に対する関連情報源の要約、これは遡及検索や最近の認識に役立つ、はＢｅｒｋｓ，ＴＩＢＴＥＣＨ １２（１９９４），３５２〜３６４に記載されている。

上の開示は全般に本発明を記載する。本発明のより総合的な理解は以下に続く特定の実施例及び図に対する言及によって得られ、それらはただ単に説明のために提供され、本発明の範囲を限定する意図はない。参照に言及された全ての内容（本文及び製造者取り扱い説明書、及び明細書等に引用された文献参照、特許文献、公開特許文献を含む）はこの参照により明示的にここに組み込まれる；しかしながらこれら文書のいずれか１つが実は本発明の先行技術であるということを承認するものではない。

他に記述がない限り、本発明は、本分野の当業者にはよく知られている、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子組換え生物学、ミクロ生物学、組換えＤＮＡ及びＲＮＡ技術の従来技術を利用することによって実行される。文献中のそのような技術の総合的な説明のために、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９）と、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，１９８５）と、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．，１９８４）と、Ｍｕｌｌｉｓらの米国特許番号第４，６８３，１９５号と、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ & Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８４）と、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ & Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．１９８４）と、Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）と、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）と、Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）と、ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）と、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）と、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）と、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）と、Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）などを参照のこと。

実施例として、ｄｓＲＮＡ分子による遺伝子組換えマウス（ＦＶＢ．Ｃｇ−Ｔｇ（ＧＦＰＵ）５ＮＡＧＹ，Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の網膜色素上皮（ＲＰＥ）と網膜中の緑色蛍光タンパク質の発現の阻害を解析した。

実施例１は、マウス動物モデルにおける標的遺伝子ｅＧＦＰのｄｓＲＮＡによる特異的転写後遺伝子サイレンシングを説明しており、それは全身的適用における転写後遺伝子サイレンシングに対する最適ｄｓＲＮＡ濃度中で決定される（実験手順１、結果は表１と図１を参照のこと）。前記手段は遺伝子組換えマウスのｉｎ ｖｉｖｏ処置を含み、標的遺伝子ｅＧＦＰに対するｄｓＲＮＡオリゴリボヌクレオチド分子の全身的適用によってそれらの体細胞中で緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）の促進された形態を発現する。対照動物も非サイレンシングｄｓＲＮＡ分子で全身的に処置される。転写後遺伝子サイレンシングの目的で、鎮痛性若しくは麻酔性影響下にない前記動物は、１００若しくは２００μｇのｅＧＦＰ特異的ｄｓＲＮＡ／ｋｇ体重（ＢＷ）を、対照群は２００μｇ非サイレンシングｄｓＲＮＡ／ｋｇＢＷの静脈内尾静脈注射（処置１日目はｄａｙ０、処置完了日はｄａｙ２０）毎日施される。バッファーで処置された対照動物（０．１ｍｇバッファーの静脈内注射を尾静脈へ毎日施す）も維持された。実験動物の各群は８体から成り、最大注射量／１注射は０．１ｍｌである。２０日目に前記動物はＣＯ_２吸入により屠殺される。前記マウス中の目における緑色蛍光タンパク質の発現は免疫組織学的に試験される（自発的ｅＧＦＰ蛍光：蛍光顕微鏡評価、ｅＧＦＰ特異的免疫蛍光染色：蛍光顕微鏡評価）。

実施例２は、マウス動物モデルにおける標的遺伝子ｅＧＦＰのｄｓＲＮＡによる特異的転写後遺伝子サイレンシングを説明しており、それは尾静脈への単一全身的静脈内ｄｓＲＮＡ注射後の、全身的適用のための転写後遺伝子サイレンシングの有効性の最適時間（＝前記遺伝子サイレンシング効果が最大である時点）中で決定される（実験手順２）。前記手順は遺伝子組換えマウスのｉｎ ｖｉｖｏ処置を含み、標的遺伝子ｅＧＦＰに対するｄｓＲＮＡオリゴリボヌクレオチド分子の全身的適用によってそれらの体細胞中で緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）の促進された形態を発現する。対照動物も非サイレンシングｄｓＲＮＡ分子で全身的に処置される。転写後遺伝子サイレンシングの目的で、鎮痛性若しくは麻酔性影響下にない前記動物は、０日目に２００μｇのｅＧＦＰ特異的ｄｓＲＮＡ／ｋｇ体重（ＢＷ）を、対照群は２００μｇ非サイレンシングｄｓＲＮＡ／ｋｇＢＷの単一静脈内尾静脈注射を施される。実験動物の各群は８体から成り、最大注射量／１注射は０．１ｍｌである。静脈内注射後２、３、５、１０日目に前記動物はＣＯ_２吸入により屠殺される。前記マウス中の目における緑色蛍光タンパク質の発現は免疫組織学的に試験される（自発的ｅＧＦＰ蛍光：蛍光顕微鏡評価、ｅＧＦＰ特異的免疫蛍光染色：蛍光顕微鏡評価）。

実施例３はマウス動物モデルにおける標的遺伝子ｅＧＦＰのｄｓＲＮＡによる特異的転写後遺伝子サイレンシングを説明しており、それは局所的（眼球後）適用における転写後遺伝子サイレンシングに対する最適ｄｓＲＮＡ濃度中で決定される（実験手順３）。前記手段は遺伝子組換えマウスのｉｎ ｖｉｖｏ処置を含み、標的遺伝子ｅＧＦＰに対するｄｓＲＮＡオリゴリボヌクレオチド分子の眼球後適用によってそれらの体細胞中で緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）の促進された形態を発現する。対照動物も非サイレンシングｄｓＲＮＡ分子若しくはバッファーで眼球後注射を施される。転写後遺伝子サイレンシングの目的で、鎮痛性若しくは麻酔性影響下にない前記動物は、２００μｇのｅＧＦＰ特異的ｄｓＲＮＡ／ｋｇ体重（ＢＷ）を、対照群は２００μｇ非サイレンシングｄｓＲＮＡ／ｋｇＢＷ若しくはバッファーの単一眼球後注射（処置１日目はｄａｙ０、処置完了日はｄａｙ２０）を施される。実験動物の各群は３〜８体から成り、最大注射量／１注射は０．００５ｍｌである。前記眼球後ｄｓＲＮＡ注射は右目と左目の両方に実行される。３日目若しくは６日目に前記動物はＣＯ_２吸入により屠殺される。前記マウス中の目における緑色蛍光タンパク質の発現は免疫組織学的に試験される（自発的ｅＧＦＰ蛍光：蛍光顕微鏡評価、ｅＧＦＰ特異的免疫蛍光染色：蛍光顕微鏡評価）。

実験例４はマウス動物モデルにおける標的遺伝子ｅＧＦＰのｄｓＲＮＡによる特異的転写後遺伝子サイレンシングを説明しており、それは単一眼球後ｄｓＲＮＡ注射後の、局所的（眼球後）適用のための転写後遺伝子サイレンシングの有効性の最適時間（＝前記遺伝子サイレンシング効果が最大である時点）中で決定される（実験手順４）。前記手順は遺伝子組換えマウスのｉｎ ｖｉｖｏ処置を含み、標的遺伝子ｅＧＦＰに対するｄｓＲＮＡオリゴリボヌクレオチド分子の眼球後注射によってそれらの体細胞中で緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）の促進された形態を発現する。対照動物も非サイレンシングｄｓＲＮＡ分子若しくはバッファーで眼球後注射を施される。転写後遺伝子サイレンシングの目的で、鎮痛性若しくは麻酔性影響下にない前記動物は、０日目に２００μｇのｅＧＦＰ特異的ｄｓＲＮＡ／ｋｇ体重（ＢＷ）を、対照群は２００μｇ非サイレンシングｄｓＲＮＡ／ｋｇＢＷ若しくはバッファーの単一眼球後注射を施される。実験動物の各群は８体から成り、最大注射量／１注射は０．００５ｍｌである。前記眼球後ｄｓＲＮＡ注射は右目と左目の両方に実行される。眼球後注射後２、３、５、１０日目に前記動物はＣＯ_２吸入により屠殺される。前記マウス中の目における緑色蛍光タンパク質の発現は免疫組織学的に試験される（自発的ｅＧＦＰ蛍光：蛍光顕微鏡評価、ｅＧＦＰ特異的免疫蛍光染色：蛍光顕微鏡評価）。

実施例５はマウス動物モデルにおける標的遺伝子ｅＧＦＰのｄｓＲＮＡによる特異的転写後遺伝子サイレンシングを説明しており、それは眼球後ｄｓＲＮＡ注射後の、反復局所的（眼球後）適用における転写後遺伝子サイレンシングの最適ｄｓＲＮＡ活性中で決定される（実験手順５）。前記手順は遺伝子組換えマウスのｉｎ ｖｉｖｏ処置を含み、標的遺伝子ｅＧＦＰに対するｄｓＲＮＡオリゴリボヌクレオチド分子の眼球後注射によってそれらの体細胞中で緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）の促進された形態を発現する。対照動物も非サイレンシングｄｓＲＮＡ分子若しくはバッファーで眼球後注射を施される。転写後遺伝子サイレンシングの目的で、鎮痛性若しくは麻酔性影響下にない前記動物は０、７、１４日目（処置１日目はｄａｙ０、処置完了日はｄａｙ１４）に２００μｇのｅＧＦＰ特異的ｄｓＲＮＡ／ｋｇ体重（ＢＷ）を、対照群は２００μｇ非サイレンシングｄｓＲＮＡ／ｋｇＢＷ若しくは０．００５ｍｌバッファーの眼球後注射を施される。実験動物の各群は８体から成り、最大注射量／１注射は０．００５ｍｌである。前記眼球後ｄｓＲＮＡ注射は右目と左目の両方に実行される。１５日目に前記動物はＣＯ_２吸入により屠殺される。前記マウス中の目における緑色蛍光タンパク質の発現は免疫組織学的に試験される（自発的ｅＧＦＰ蛍光：蛍光顕微鏡評価、ｅＧＦＰ特異的免疫蛍光染色：蛍光顕微鏡評価）。

ｄｓＲＮＡコンストラクト及びプラスミド：
ｄｓＲＮＡ分子の設計に対して、２つのヌクレオチドの長さで対称的な３’オーバーハングを有する２１ヌクレオチド（ｎｔ）長のセンス鎖及びアンチセンス鎖を得るために、タイプＡＡ（Ｎ１９）ＴＴ（Ｎはあらゆるヌクレオチドを表す）の配列は標的ｍＲＮＡの配列から選択された。３’オーバーハングにおいて、２’デオキシチミジンはウリジンの代わりに用いられた。前記ｄｓＲＮＡ分子が独占的に標的遺伝子に対応していることを確実にするために、選択されたｄｓＲＮＡ配列はＢＬＡＳＴ解析でマウスゲノムに対してテストされる。前記２１−ｎｔＲＮＡ分子は化学的に合成され精製される。二本鎖形成のために、１００μｇの各センス及びアンチセンスオリゴリボヌクレオチドは１０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、２０ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．０）に混合され９５℃に加熱され、１８時間室温で冷却される。前記ｄｓＲＮＡ分子はエタノール沈殿され、無菌バッファー（１００ｍＭカリウムアセテート、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、２ｍＭマグネシウムアセテート、ｐＨ７．４）に再懸濁される。前記ｄｓＲＮＡの整合性及び二本鎖特性はゲル電気泳動で確認される。代わりに前記ｄｓＲＮＡ分子は市販供給業者から購入される。前記標的遺伝子の配列及び対応するｄｓＲＮＡ分子は以下の通りである：

マウスの鎮痛若しくは麻酔：
全身的適用のために、動物は固定され、前記ｄｓＲＮＡが尾静脈中に静脈注射され（最大注射量：０．１ｍｌ）、鎮痛若しくは麻酔は静脈注射自体より動物にストレスを与えるので控える。眼球後注射（最大注射量：０．００５ｍｌ）のために、動物は短期間イソフルラン吸入麻酔を施され、鎮痛目的にメタミゾール（Ｍｅｔａｍｉｚｏｌｅ）ナトリウムが供給される。前記動物は次に彼らの慣れた動物ケージ周囲に保持された。Ｉｎ ｖｉｖｏ診断の完了後（各動物実験の完了は実施例１〜５にそれぞれ記載されている）、前記動物はＣＯ_２吸入により屠殺され、眼球除去され、この眼は組織学的（免疫組織学的）に研究される。

網膜色素上皮及び網膜中のｅＧＦＰ発現の研究
除去後、前記眼は４％ホルマリン／ＰＢＳ溶液で２４時間固定される、標準的な方法を用いて、固定されたサンプルは連続的に濃度が増加していくアルコール中でその後脱水され、パラフィン中に包埋される。ミクロトーム下で標準５〜１２μｍの連続切片を作成し、温水浴中で伸ばされ、ポリリジンコートカバースリップへ移される。前記切片は次にインキュベーター中で２時間、５２℃で乾燥される。この乾燥切片はキシレン中で脱パラフィン化され、連続的に濃度が減少していくアルコール中に移され、その後Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に移される。ブロッキング後、前記切片は一次抗ｅＧＦＰ抗血清（ポリクローナルヤギ抗ｅＧＦＰ抗血清、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｎｏ．ｓｃ−５３８４）で２時間インキュベートされる。Ｃｙ２共役ウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｄｉａｎｏｖａ，Ｎｏ．３０５−２２５−０４５）によって免疫蛍光染色の手法によって検出される。前記サンプルは包埋され、次にＥｃｌｉｐｓｅ ＴＥ−２０００−Ｓ光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）での顕微鏡観察のためにのせられ、２０Ｘ及び４０Ｘ／１．３対物レンズが装備される。脱パラフィン化、未処理切片中の自発的ｅＧＦＰ特異的蛍光は蛍光顕微鏡を用いて解析される。

実験手順
実験手順１：全身的ｓｉＲＮＡ適用。転写後遺伝子サイレンシングに対する最適ｄｓＲＮＡ濃度の決定。

結果は図１を参照のこと。

実験手順２：０日目の転写後遺伝子サイレンシングの有効性の最適時間（＝尾静脈中への単一全身的ｄｓＲＮＡ静脈内注射後の前記遺伝子サイレンシング効果が最大である時点）の決定のための全身的ｓｉＲＮＡ適用。

実験手順３：眼球後ｓｉＲＮＡ適用。転写後遺伝子サイレンシングに対する最適ｄｓＲＮＡ濃度の決定。

０日目に単一眼球後ｓｉＲＮＡ注射、３日目と６日目に実験完了（ＢＷ＝体重）。

実験手順４：転写後遺伝子サイレンシングの有効性の最適時間（＝単一眼球後ｄｓＲＮＡ適用後の０日目の前記遺伝子サイレンシング効果が最大である時点）の決定のための眼球後ｄｓＲＮＡ注射。

実験手順５：転写後遺伝子サイレンシングの決定のための反復眼球後ｄｓＲＮＡ注射。

０、７、１４日目に２００μｇのｄｓＲＮＡ／ｋｇ ＢＷの眼球後注射；１５日目に組織学評価。

全身的ｄｓＲＮＡ処置ＦＶＢ．ＤＧ−ＴＧ（ＧＦＰＵ）５ＮＡＧＹマウスの網膜及び網膜色素上皮（ＲＰＥ）中のｅＧＦＰ発現。この図は、ｄｓＲＮＡ処置ＦＶＢ．Ｃｇ−Ｔｇ（ＧＦＰＵ）５ＮＡＧＹマウスの眼パラフィン切片中のｅＧＦＰ発現を示している。全身的ｄｓＲＮＡ処置ＦＶＢ．ＤＧ−ＴＧ（ＧＦＰＵ）５ＮＡＧＹマウスの網膜及び網膜色素上皮（ＲＰＥ）中の発現はバッファー対照で最も高く、非サイレンシングｄｓＲＮＡで処置したマウスではわずかに減少し、ｅＧＦＰ特異的ｄｓＲＮＡ処置マウスでは明らかに減少した（バッファー対照>２００μｇ／ｋｇＢＷ非サイレンシングｄｓＲＮＡ>１００μｇ／ｋｇ ＢＷ ｅＧＦＰ特異的ｄｓＲＮＡ>２００μｇ／ｋｇ ＢＷ ｅＧＦＰ特異的ｄｓＲＮＡ）。

Claims (26)

1. 対象の眼の細胞及び／若しくは組織中におけるＡＭＤ標的遺伝子の発現を特異的に調節する組成物を準備するための１若しくはそれ以上の二本鎖オリゴリボヌクレオチド（ｄｓＲＮＡ）の使用であって、
   前記組成物は血液網膜関門の外側で適用されるように設計されるものであり、前記組成物は、眼球後注入または全身適用によって非経口的に投与されるものであり、前記ｄｓＲＮＡ分子は、長さが２１〜２３ヌクレオチドである、使用。
2. 請求項１の使用において、
   前記使用はテスト細胞、テスト組織、若しくはテスト非ヒト生物を結果として提供するものであり、それらは好ましくはＲＮＡ干渉によって１若しくはそれ以上の標的遺伝子の対応するｍＲＮＡの分解が可能である条件下で維持され得るものである、使用。
3. 請求項２の使用であって、遺伝子の機能の同定若しくは確認に関してさらに、
   前記テスト細胞、テスト組織、若しくはテスト生物に結果として生じる表現型と適切な対照の表現型とを比較する工程とを有し、
   これにより前記遺伝子の機能に基づく情報を得るものである、使用。
4. 請求項１〜３のいずれか１つの使用において、
   発現の前記特異的調節はＡＭＤ標的遺伝子発現の阻害である、使用。
5. 請求項１〜４のいずれか１つの使用において、
   前記細胞及び／若しくは組織は、眼の細胞及び／若しくは組織である、使用。
6. 請求項１〜５のいずれか１つの使用において、
   前記細胞若しくは組織は、眼球の内部部分の細胞若しくは組織である、使用。
7. 請求項６の使用において、
   前記細胞は網膜細胞である、使用。
8. 請求項７の使用において、
   前記細胞は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の細胞若しくは感覚神経網膜細胞である、使用。
9. 請求項１〜８のいずれか１つの使用において、
   前記ｄｓＲＮＡ分子は、末端３’ヒドロキシル基を含むものである、使用。
10. 請求項１〜９のいずれか１つの使用において、
    前記ｄｓＲＮＡ分子は、化学的に合成されたものである、使用。
11. 請求項１〜１０のいずれか１つの使用において、
    前記ｄｓＲＮＡ分子は、天然由来ＲＮＡの類似体を示すものである、使用。
12. 請求項１〜１１のいずれか１つの使用において、
    前記ｄｓＲＮＡ類似体は対応する天然由来ＲＮＡとは、１若しくはそれ以上のヌクレオチドの付加、欠損、置換、若しくは修飾によって異なるものである、使用。
13. 請求項１〜１２のいずれか１つの使用において、
    前記ｄｓＲＮＡ分子は転写後サイレンシングによって、対応する標的遺伝子を阻害するものである、使用。
14. 請求項１〜１３のいずれか１つの使用において、
    前記ｄｓＲＮＡ分子は、ベクターによってコードされるものである、使用。
15. 請求項１〜１１のいずれか１つの使用において、
    前記ｄｓＲＮＡの発現は、細胞及び組織特異的プロモーターの制御下にあるものである、使用。
16. 請求項１〜１１のいずれか１つの使用において、
    前記ｄｓＲＮＡは前記細胞若しくは組織へ、他の分子と結合して及び／若しくは１若しくはそれ以上の適切な担体と組み合わされて導入されるものである、使用。
17. 請求項１６の使用において、
    前記担体はミセル構造であり、リポソーム、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）などのウイルスから由来した或いは合成的に生産されたコートタンパク質、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）若しくはアデノウイルスから成る群から選択されるものである、使用。
18. 請求項１６または１７の使用において、
    前記ｄｓＲＮＡは陽イオンポルフィリン、陽イオンポリアミン、重合性ＤＮＡ結合陽イオン、若しくは膜融合性ペプチドに結合されるものである、使用。
19. 請求項１６〜１８のいずれか１つの使用において、
    前記担体及び／若しくは前記ｄｓＲＮＡ結合分子は、前記ｄｓＲＮＡ分子が前記標的細胞若しくは標的組織へ、適用後決められた期間以上で持続的に運搬されるように選択されたものである、使用。
20. 請求項１６〜１９のいずれか１つの使用において、
    前記担体は請求項５〜８のいずれか１つで定義されたような前記細胞及び／若しくは組織に特異的である、使用。
21. 請求項１〜２０のいずれか１つの使用において、
    前記組成物は眼球の外側に眼球後或いは全身適用によって適用される形態である、使用。
22. 請求項１〜２０のいずれか１つの使用において、
    前記対象物若しくは生物は脊椎動物である、使用。
23. 請求項１〜２０のいずれか１つの使用において、
    前記対象物若しくは生物は哺乳動物である、使用。
24. 請求項２〜２１のいずれか１つの使用において、
    前記細胞及び／若しくは組織は脊椎動物由来のものである、使用。
25. 請求項２〜２１、若しくは２４のいずれか１つの使用において、
    前記細胞及び／若しくは組織は、哺乳類由来のものである、使用。
26. 請求項２５の使用において、
    前記細胞及び／若しくは組織はヒト由来のものである、使用。

Images