JP2016540499A - ＰＤＫ１遺伝子の発現を阻害するための方法及び組成物におけるｓｉＲＮＡ及びその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、PDK1遺伝子の発現を阻害するための方法及び医薬組成物におけるsiRNA分子及びその使用に関する。本発明は、PDK1遺伝子の増加した発現及び/又は活性によって特徴付けられる眼状態の治療及び/又は予防における前記siRNA分子の使用にも関し、好ましくは、前記眼状態は、季節性アレルギー性結膜炎、通年性アレルギー性結膜炎、春季角結膜炎、アトピー性角結膜炎、及び巨大乳頭結膜炎等の結膜炎及び/又は眼アレルギーである。

Description

本発明は、眼状態の治療及び/又は予防のための、より詳細には、PDK1の高レベルの発現及び/又は活性に関係する結膜炎及び/又は眼アレルギー等の眼状態の治療及び/又は予防のための方法及び組成物におけるsiRNA製品及びその使用の分野に関する。

RNA干渉(RNAi)は、大半の真核細胞に存在し、低分子二本鎖RNA(dsRNA)分子を使用して相同性依存型遺伝子サイレンシングを導く、天然に存在する転写後調節機構である。Fire及びMelloによる寄生虫の線虫(C. elegans)におけるその発見{Fire、1998}は2006年ノーベル賞を受賞した。その最初の報告の直後に、RNAiは、長いdsRNAを通じてではなく21ヌクレオチド長の二本鎖低分子干渉RNA(siRNA)によって哺乳動物細胞においても起こることが示された{Elbashir、2001}。

RNA干渉のプロセスは、外来遺伝子の発現を妨げるために使用される進化的に保存された細胞防御機構であると考えられている。このプロセスは多様な門及び植物相に共通であり、転写後遺伝子サイレンシングと呼ばれている。RNAi機構の発見以降、ヒト疾患を治療する新たな方法として遺伝子発現を選択的に変えることができる新たな化合物を発見する研究が、それ以外の、低分子又はタンパク質を伴う従来の製薬アプローチでは「新薬開発につながらない(undruggable)」標的に取り組むことにより、爆発的に増加してきた。

現行の知識によれば、RNAiの機構は、長い二本鎖RNAがダイサーとして知られているRNaseIII様タンパク質によりプロセシングされると開始される。タンパク質ダイサーは典型的には、N末端RNAヘリカーゼドメイン、RNA結合いわゆるPiwi/アルゴノート/Zwille(PAZ)ドメイン、2つのRNaseIIIドメイン及び二本鎖RNA結合ドメイン(dsRBD)を含有しており{Collins、2005}、その活性によって長い二本鎖RNAは2塩基3'オーバーハング及び5'リン酸及び3'ヒドロキシル基のある21〜24ヌクレオチド二本鎖siRNAにプロセシングされる。次に、こうして得られたsiRNA二重鎖はRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)として知られるエフェクター複合体に組み込まれ、そこで、RNAヘリカーゼ活性により二本鎖siRNA分子がアデノシン三リン酸(ATP)依存的にほどかれると{Nykanen、2001}、siRNAのアンチセンス又はガイド鎖は、RISCが標的mRNA配列を認識及び切断するように導く{Elbashir、2001}。mRNA分解をもたらすRISCの触媒活性は、エンドヌクレアーゼアルゴノート2(AGO2)により媒介される{Liu、2004; Song、2004}。AGO2はタンパク質の高度に保存されているアルゴノートファミリーに属する。アルゴノートタンパク質は、2つの共通ドメイン、すなわち、PIWI及びPAZドメインを含有する約100KDaの高度に塩基性のタンパク質である{Cerutti、2000}。PIWIドメインはダイサーとの相互作用に極めて重要であり、mRNAの切断の原因となるヌクレアーゼ活性を含有する{Song、2004}。AGO2はガイドとしてsiRNA二重鎖の1つの鎖を使用して相補的配列を含有するメッセンジャーRNAを見つけて、ガイド鎖の5'末端に対して塩基10と11の間でリン酸ジエステル骨格を切断する{Elbashir、2001}。RISCの活性化における重要なステップはAGO2によるセンス又はパッセンジャー鎖の切断であり、複合体からこの鎖を取り除く{Rand、2005}。siRNAガイド鎖とPIWIドメインの間の相互作用を分析する結晶学的研究から、RISCによる標的mRNA認識を導く「シード配列」を構成するのはヌクレオチド2〜8のみであること、及びこの配列において単一ヌクレオチドのミスマッチが起こればこの分子のサイレンシング能力に劇的な影響を与える可能性があることが明らかにされている{Doench 2004; Lewis、2003}。mRNAは切断されると、その断片に保護されていないRNA末端が存在するせいで、細胞内ヌクレアーゼにより更に切断及び分解され、もはやタンパク質に翻訳されることはない{Orban、2005}。一方、RISCはその後のラウンドで再利用されることになる{Hutvagner、2002}。これが、特定のmRNA分子及びその対応するタンパク質の選択的減少をもたらす触媒過程を構成する。siRNAエフェクターを細胞又は組織中に直接送達し、そこでsiRNAエフェクターがRISCを活性化して標的mRNAの強力で特異的なサイレンシングを生ずることにより、所望の任意の遺伝子を調節する目的で、遺伝子サイレンシングというこの天然の機構を利用することが可能である。RNAiは、HIV、ウイルス肝炎、心血管及び脳血管疾患、代謝疾患、神経変性障害並びにがんの治療等の生物医学研究において適用されてきた{Angaji SAら、2010}。

長さ、構造、化学的組成及び配列に関して、siRNAが最大の有効性を達成するために持つべき理想的な特長を報告する多くの研究が発表されてきた。siRNA設計のための最初のパラメータはWO02/44321においてTuschlと同僚らにより提示されたが、それに続く多くの研究、アルゴリズム及び/又は改良点がそれ以降発表されている。siRNA選択アプローチは、機構的な詳細が明らかになるに従って一層精密になっており、その上既存の及び新たなデータを更に分析すれば、これらのアプローチを更に精巧にする追加の洞察が得られる{Walton SPら、2010}。代わりに、最近のいくつかの研究によれば、古典的な19+2 siRNA構造とははっきり異なり、オーバーハング、長さ、又は対称性の点で古典的なsiRNAの重要な特長と一致しない新規のRNAiトリガー構造の設計及び分析が報告され、哺乳動物細胞におけるRNAi機構の柔軟性が考察されている{Chang CIら、2011}。

その上、siRNA安定性の増強に多くの努力が注ぎ込まれてきた。なぜならば、生体液中でのRNaseの偏在性を考慮すると、この安定性はsiRNAに基づく療法にとって大きな障害の1つであると認識されているからである。siRNA分子に固有のもう1つの問題はその免疫原性であり、それによってsiRNAは自然免疫系の非特異的活性化を誘発することが分かってきた。意図しない遺伝子(mRNA)のノックダウンはsiRNA媒介遺伝子サイレンシングのよく知られた副作用である。このノックダウンは、siRNAと狙った標的以外のmRNAの間の部分的相補性の結果として引き起こされ、いずれかのsiRNA鎖に対する配列相補性を有する遺伝子からのオフターゲット効果(off-target effects:OTEs)を引き起こす。安定性増強及びOTE減少のために採る主要な戦略の1つは、2'-O-メチルヌクレオチド、2'-アミノヌクレオチド、又は2'-O若しくは4'-Cメチレン架橋を含有するヌクレオチド等の修飾ヌクレオチドの使用であった。その上、主にホスホロチオエート修飾ヌクレオチドの導入による隣接するヌクレオチドを繋いでいるリボヌクレオチド骨格の修飾が報告されている。増強された安定性及び/又は免疫原性の減少は多くの場合効力とは反比例しているように思われ{Parrish、2000}、ある数、位置及び/又は組合せの修飾ヌクレオチドのみが安定かつ/又は非免疫原性のサイレンシング化合物をもたらす可能性がある。これはsiRNAに基づく治療にとって重要なハードルであるため、良好な結果を示しているある種の修飾パターンを報告する様々な研究が発表されており、その例としてEP1527176、WO2008/050329、WO2008/104978又はWO2009/044392が含まれるが、更に多くの研究が文献中に見出すことができる{Sanghvi YS.2022; Deleaveyら、2012}。

アレルギー疾患は、食べる、肺内に呼吸する、注射する又は接触する外来タンパク質物質(「アレルゲン」)に対するヒト免疫系の過剰反応によって特徴付けられる。アレルギーは、遺伝成分を有する。片親のみがある種類のアレルギーを有する場合、それぞれの子供がアレルギーを有する見込みは3に1つである。両親ともアレルギーを有する場合は、その子供たちがアレルギーを有する可能性ははるかに高くなる(10中7)。アレルギーには治癒はないが、適切な予防及び治療で管理することができる。

世界中の人々の約30%がアレルギー症状を患っており、その40〜80%が目に症状を有する{Key B. 2001}。眼を冒すアレルギー疾患又は眼アレルギーは、非常に広範囲の臨床症状を有する異種遺伝子の疾患グループを構成する。眼アレルギーは通常、結膜(眼と眼瞼の裏層を覆っている膜)がアレルゲンに反応すると起こる。眼アレルギーは単独で又は他のアレルギー症状(例えば、鼻炎又は喘息)と併せて起こることがある。

基礎的な臨床研究により、眼アレルギーに存在する細胞、メディエータ、及び免疫学的事象について益々理解が進んでいる。眼、特に結膜は比較的多数のマスト細胞を有する。アレルゲンが存在すると、アレルゲンはこれらマスト細胞の表面上のFcεRI受容体で免疫グロブリンIgEに結合して、アレルギーのメディエータの活性化及び放出を始動させることができる(脱顆粒として知られるプロセス)。脱顆粒により、ヒスタミン、プロスタグランジン、トリプターゼ及びロイコトリエンを含むマスト細胞成分がマスト細胞外側の環境に放出される。種々の機構を通じて、これらの成分は眼アレルギーの徴候及び症状を生じる。アレルギー性炎症のマスト細胞の活性化は、多くの場合、眼アレルギーの急性相応答又は初期相と呼ばれる。急性相応答は、アレルギー性炎症の部位への炎症細胞の動員により、例えば、好酸球及び好中球の結膜への流入として特徴付けられる遅発相応答まで進むことがある。

眼アレルギーは、アレルギー専門医及び眼科医が遭遇するもっとも一般的な状態の1つを表す。眼アレルギーは通常、以下のような症状及び徴候、すなわち、結膜炎、眼瞼炎、眼瞼結膜炎又は角結膜炎に関連している。眼が赤く痒くなり、流涙及び僅かな眼脂が生じる。重症例では、眼の灼熱感、疼痛及び羞明も示すことがある。

眼を冒すアレルギー疾患には、季節性アレルギー性結膜炎(SAC)及び通年性アレルギー性結膜炎(PAC)等の軽症型、並びに春季角結膜炎(VKC)、アトピー性角結膜炎(AKC)及び巨大乳頭結膜炎(GPC)等の更に重症の症状が含まれる。後者の症状は角膜損傷等の合併症に関連することがあり、視力喪失を引き起こす可能性がある。SAC及びPACは一般的には、外部アレルゲンに対するIgE-マスト細胞媒介過敏症反応であり、AKC及びVKCはいくつかの免疫細胞型を伴う慢性炎症によって特徴付けられる。SAC及びPACアレルゲンは、抗原提示細胞(APC)の助けを借りて、Th2-優位型免疫応答を始動させ、この応答はB細胞からIgE放出を誘発する。アレルギー応答の活性化は通常、マスト細胞の浸潤及び脱顆粒を伴う。

SACは眼におけるもっとも一般的なアレルギー疾患であり、通常は空中花粉、粉塵、及び動物のフケのようなアレルゲンにより引き起こされる。その徴候及び症状は通常、春及び夏に生じ、一般的には冬場に減少する。結膜の掻痒、発赤及び腫脹がもっとも特徴的な症状であるが、流涙、灼熱感、及び羞明もある。ほとんどの場合、SACは重症ではない。しかし、SACは生活の質に影響を与えることがあり、著しい社会経済的影響を与えうるため、患者をひどく不安にさせうる{Kari O.及びSaari KM 2010}。

PACは眼における2番目に一般的なアレルギー疾患であり、通常は動物及びダニにより引き起こされる。その症状及び徴候はSACとほぼ同じであり、違いは患者がアレルギーを起こす特異的なアレルゲンであり、PACは通年性アレルゲンに曝されると年間を通じて起こることがある点である。PACはあらゆる年齢層を冒すが、大部分は若年及び中年の男女である。更に、PACはドライアイ症候群と関係があることが多い。

SAC及びPACはもっとも一般的な形態の眼アレルギーである。見積もりには変動があるが、これらの種類のアレルギーには一般住民の少なくとも15〜20%が冒されると言われている。SAC及びPACは過小診断され、したがって治療が不十分である場合が多い。SAC及びPACでは、アレルゲンにより誘発されるIgEの局所的放出のために、Ca2+依存性機構によってマスト細胞の脱顆粒が促される。IgE活性化マスト細胞は、アレルギー応答の最初のメディエータであるヒスタミン及びロイコトリエン4等の前もって形成された炎症性メディエータを遊離する。これらのメディエータは、アレルギー応答を増幅する領域を浸潤する好酸球を引き付ける。

VKCは主に子供や若年成人が冒される眼球表面の比較的希な慢性アレルギー性炎症である。主な症状は掻痒、発赤、腫脹、眼脂及び羞明である。もっとも特徴的な徴候は上部眼瞼結膜における巨大な乳頭である。

AKCは、眼球表面及び眼瞼の両側性慢性炎症疾患である。もっとも特徴的な徴候は眼瞼上の痒い湿疹病変である。AKC患者が幼年齢で白内障手術を受けることは希ではない{Kari O.及びSaari KM 2010 }。

GPCは上瞼板結膜の乳頭増殖によって特徴付けられる炎症性疾患である。GPCはアレルゲンではなくむしろ不活性物質により引き起こされる。これら刺激性の刺激が取り除かれると、結膜乳頭変化は消散する。コンタクトレンズ表面上のタンパク質の沈着は抗原性となりIgEの産生を刺激するおそれがある{La Rosa M.ら、2013}。

眼アレルギーの現行の治療には非薬理的及び薬理的戦略が含まれる。抗原の回避はあらゆる種類の眼アレルギーについての主要行動修正である。人工的涙代用物はバリア機能をもたらし、結膜粘膜のレベルにおける最前線での防御を改善するのに寄与する。非薬理的戦略が適切な症状緩和をもたらさない場合、薬理的治療を適用すればよい。

眼アレルギーの管理の頼みの綱は、抗ヒスタミン剤等の抗アレルギー治療薬、二重作用又は併用治療及びマスト細胞安定化剤の使用を含む。局所抗ヒスタミン剤(例えば、エメダスチン及びレボカバスチン)はヒスタミン受容体を競合的に及び可逆的にブロックし、掻痒及び発赤を緩和するが、それも短時間のみである。抗ヒスタミン剤は、阻害されたままである他の炎症誘発性メディエータに影響を与えない。作用持続期間が限られているため頻回投与が必要となり、局所抗ヒスタミン剤は、特に長期使用では眼に刺激性になることがある。

鬱血除去剤(例えば、オキシメタゾリン、テトラヒドロゾリン、及びナファゾリン)を抗ヒスタミン剤と組み合わせて使用する併用治療は血管収縮剤として作用するが、点眼するとチクチクする又はヒリヒリすることで知られている。他の有害事象には散瞳及び反動的充血が含まれるため、これらの併用治療はむしろ、短期間緩和させるのに適している。更に、これらの薬物は狭隅角緑内障を罹った患者での使用には推奨されない。マスト細胞安定化剤(例えば、クロモグリク酸、ロドキサミド、ネドクロミル)の作用機序は不明である。マスト細胞安定化剤は既存の症状を緩和することはなく、マスト細胞脱顆粒とその後のアレルゲンへの曝露を防ぐため予防的にのみ使用することができる。マスト細胞安定化剤は負荷期間が必要であり、その期間中の抗原曝露前に適用されなければならない{La Rosa M.ら、2013}。

上述の抗アレルギー薬ではアレルギー炎症過程を十分に制御できない場合、抗炎症剤を使用する。副腎皮質ステロイドは依然として、眼アレルギーの比較的重症な変種において使用されるもっとも強力な薬品の1つである{La Rosa M.ら、2013}。しかし、ステロイド薬は患者の健康全般を脅かす副作用をもたらすことがある。副腎皮質ステロイドの慢性投与は、腸カルシウム吸収を抑制し骨形成を阻害することにより薬物性骨粗鬆症をもたらすことがある。副腎皮質ステロイドの慢性投与の他の有害副作用には、身体代謝過程に対するこれらの薬物の効果による、高血圧、高血糖、高脂血症(トリグリセリドのレベルの増加)及び高コレステロール血症(コレステロールのレベルの増加)が含まれる。ある種の副腎皮質ステロイドは、このクラスの他の化合物よりも眼内圧(「IOP」)を上昇させる大きな潜在力を有することも知られている。例えば、プレドニゾロンは、極めて強力な眼抗炎症薬であるが、中等度の眼抗炎症活性を有するフルオロメトロンよりもIOPを上昇させる傾向が大きいことが知られている。副腎皮質ステロイドの局所的眼使用に関連するIOP上昇のリスクは時間とともに増加していくことも知られている。言い換えると、これらの薬剤の慢性(すなわち、長期)使用は著しいIOP上昇のリスクを増加させる。したがって、副腎皮質ステロイドは眼アレルギーの長期治療には適切ではない可能性がある。更に、副腎皮質ステロイドの慢性使用は、白内障及び緑内障の発症のリスクが増加するせいで禁忌となる{Ono SJ及びAbelson MB、2005}。

アレルギー免疫療法はアレルゲンに対する応答を減少させるのに有用であるが、アレルギー性結膜炎におけるその役割はまだ証明されていない。この治療の主目的は特定のアレルゲンに対して臨床寛容(clinical tolerance)を誘発することである。この療法は漸増用量で皮下に投与され、臨床反応の閾値より下にとどまる。舌下免疫療法(SLIT)は皮下アレルギー免疫療法の代替法と考えられており、舌下に経口投与されるが、SLITの長期結果はまだ入手可能ではない。この種の療法を用いた試験の大半がアレルギー性鼻炎を対象としてきた。一般に、アレルゲン投与に対する免疫応答は療法の有効性を予測せず、療法それ自体が全身反応を生じることがあり、その発生率及び重症度は投与されるアレルゲンの種類に応じて変動する{La Rosa M.ら、2013}。

更に、大多数のもっと新しい眼抗アレルギー剤は作用持続期間を制限し、1日2回投薬が必要である。作用持続期間がもっと長い局所調製物であれば、1日1回滴下すればよいので有利だと考えられる。したがって、従来の眼抗アレルギー剤と類似する安全性プロファイルを達成しつつ、効力及び作用持続期間等の面で利点を与えることができる新たな療法が必要とされている。

RNA干渉に基づく療法は、アレルギー治療において対処されていない必要性を満たす可能性があると指摘されてきた{Popescu FD. 2005}。アレルゲンで感作されたマウスにおいてCD40 siRNAを全身投与すると、樹状細胞及びB細胞機能の阻害並びに調節性T細胞の生成を通じて鼻アレルギー症状を減弱できることが実証されている{Suzuki M.ら、2009}。更に、アレルギー性鼻炎に対する、のsiRNAに基づくアレルゲン特異的療法も、CD40がサイレンシングされアレルゲンがパルスされた樹状細胞を使用することにより開発されている{Suzuki Mら、2010}。

アレルギー反応の発症は、マスト細胞のFcεRI受容体におけるIgE分子へのアレルゲンの結合とともに開始する。FcεRIの活性化は、カルシウムの流入により細胞外分画を形成させるマスト細胞における変化を引き起こす。Ca2+のマスト細胞への流入は、ホスファチジルイノシトール-3-キナーゼ(PI3K)を活性化させる。PI3K経路の活性化は、その後PKB/Akt、SGK及びPKCのようなPI3Kの下流標的をリン酸化するホスホイノシチド依存性キナーゼ(PDK1)の活性化を含む。これらのキナーゼは、カルシウムチャンネルを活性化し。細胞内カルシウム蓄積を流動化し、マスト細胞脱顆粒を活性化する{Shumilina Eら、2010}。

PDK1はまた、PDPK1またはPDHK1としても知られている、PDK1の構造は、2個のドメインに分割することができる；キナーゼすなわち触媒ドメインと、Pleckstrin相同ドメイン(PHドメイン)である。PHドメインは、広範囲の細胞内シグナル伝達に関わるタンパク質、または細胞骨格の構成成分として存在する、およそ120アミノ酸のタンパク質ドメインである。キナーゼドメインは、3個のリガンド結合部位を有している；基質結合部位、ATP結合部位、及びドッキング部位（PIFポケットとしても知られる）である。PDK1は、構成的に活性であり、細胞質及びミトコンドリアマトリックスに発見されている。

EP1513947 (MEDICAL RES COUNCIL)には、PDK1の活性を制御する化合物を選択または設計する方法が記載されている。

US2009/0275570 (ASTRAZENECA AB) には、癌を治療するための、PDK1阻害活性を有する化合物が記載されている。

EP1513947 US2009/0275570 (ASTRAZENECA AB)

Maniatis, T.ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1982、387〜389頁

本発明は、眼アレルギーにおけるPDK1発現及び結果としての眼炎症を減少させるための改良された製品を提供する。従来の抗アレルギー療法薬及びアレルギー免疫療法薬と比べた場合の、siRNA製品で眼アレルギーを治療することによる利点は、siRNAに基づく治療は、長期持続性効果をもつことである。この結果になるのは、エフェクター分子がもはや存在しなくなると、細胞は最初から新たなタンパク質を合成しなければならなくなるが、従来の治療では前記タンパク質のレベルはそのままであるためである。

眼アレルギーは世界中で増加していると思われる。特に工業国では、環境汚染がアレルギーの個人の高まった感受性に対する主要な一因と広く考えられている。悪化する放出汚染に加えて、空中アレルゲンの世界的な増加も研究により指摘されてきた。更に別の考慮すべき事柄は、もっと貧しい国の住民は眼アレルギーの治療を求める可能性が少ないことであり、これが発展途上国で報告されている疾患の発生率を人為的に低くしている可能性のある要因である。

米国喘息アレルギー基金(Asthma and Allergy Foundation in America;AAFA)により、米国でのアレルギーにかかる年間コストは、ほぼ145億ドルと推定されることが示された。5000万の米国人が、屋内/屋外、食品及び薬物、ラテックス、昆虫、皮膚並びに眼アレルギーを含むあらゆる種類のアレルギーを患っている(5人に1人の米国人)と推定されていた。米国のアレルギー有病率は全体的に、あらゆる年齢層、性別及び人種集団にわたって1980年代初期以降ずっと増加してきた。

地理的特性にもかかわらず、世界各国の医師たちが適切な治療経過を選択するための判断基準に共通の根拠を見出している。いくつかの国出身の専門医によれば、これらの判断基準には、投薬の効力、安全性及び利便性並びに患者にとっての投与の快適さが含まれる。したがって、世界中で一定範囲の眼アレルギー症状を訴える患者の数が増加するにつれて、最適な治療を見つけることは、日ごとに一層複雑になり一層関心が持たれる。

本発明のsiRNAの標的配列として選択された標的遺伝子配列PDK1の短い断片を示す図である。 図１−１の続きである。 図１−２の続きである。 図１−３の続きである。 図１−４の続きである。 図１−５の続きである。 図１−６の続きである。 図１−７の続きである。 図１−８の続きである。 図１−９の続きである。 図１−１０の続きである。 図１−１１の続きである。 図１−１２の続きである。 図１−１３の続きである。 図１−１４の続きである。 図１−１５の続きである。 図１−１６の続きである。 図１−１７の続きである。 図１−１８の続きである。 図１−１９の続きである。 図１−２０の続きである。 本発明により包含されるPDK1を標的とする本発明のsiRNA分子のオリゴヌクレオチド配列を示す図である。図に与えられる配列番号はセンス(5'→3')鎖に関する。典型的にはsiRNAはdsRNAとして投与されることになり、したがってセンス鎖もその相補的なアンチセンス鎖も含むことになる。配列番号688〜配列番号1374はそれぞれ配列番号1〜配列番号687を標的とするsiRNAである。一般に、siRNAはセンス鎖及びアンチセンス鎖を含むことになり、3'ジヌクレオチドオーバーハング(例えば、dTdT)を含むこともある。しかし、これは不可欠ではない。 図２−１の続きである。 図２−２の続きである。 図２−３の続きである。 図２−４の続きである。 図２−５の続きである。 図２−６の続きである。 図２−７の続きである。 図２−８の続きである。 図２−９の続きである。 図２−１０の続きである。 図２−１１の続きである。 図２−１２の続きである。 図２−１３の続きである。 図２−１４の続きである。 図２−１５の続きである。 図２−１６の続きである。 図２−１７の続きである。 図２−１８の続きである。 図２−１９の続きである。 図２−２０の続きである。 図２−２１の続きである。 ヒト細胞系統A204におけるPDK1を標的とするsiRNAのトランスフェクション後のインビトロPDK1発現レベルを示す図である。 マウス細胞系統C2C12におけるPDK1を標的とするsiRNAのトランスフェクション後のインビトロPDK1発現レベルを示す図である。 配列番号688のトランスフェクション後の異なる細胞株のインビトロ毒性レベルを示す図である。 配列番号688のトランスフェクション後のヒトマクロファージMHC-1細胞におけるインビトロ誘導脱顆粒を示す図である。 ロコマイシンにより脱顆粒化したヒトマクロファージMHC-1細胞における、配列番号688のトランスフェクション後のインビトロPDK1発現レベルを示す図である。 インビボアッセイの予定を示す図である。 眼アレルギーの誘発後の異なる時間におけるマウス全眼でのPDK1 mRNAのレベルを示す図である。NA:アレルギーなし。 眼アレルギーを示す眼臨床徴候を示す図である。マウスは眼アレルギーの誘発の0.5、1、3、6及び24時間後に観察された。臨床徴候は、以下のパラメータ、結膜浮腫及び充血(injection)、充血(hyperemia)、眼瞼浮腫、眼脂並びに流涙をスケール0〜3で段階分けすることにより吟味した。データはPBS処置群のアレルギーの誘発後0.5時間の臨床スコアリングの百分率として表し、PBSについては16動物及び配列番号688(SYL116021)処置群については24動物の平均±S.E.Mを表す。

第1の態様では、本発明は、PDK1の増加した発現及び/又は活性によって特徴付けられる、好ましくは眼状態の治療及び/又は予防における医薬として使用するためのsiRNA分子の提供に関するものであり、前記分子は、配列番号1〜配列番号687からなる群から選択される配列を特異的に標的とし、細胞内に導入された場合にはPDK1遺伝子の発現を減少させる。好ましくは、標的配列は、配列番号1〜配列番号24からなる群、更に好ましくは、配列番号1〜配列番号6からなる群から選択され、更により好ましくは、標的配列は配列番号1を含む又はからなる。

例えば、siRNA分子が遺伝子の発現を選択的に減少させる又は阻害する場合、前記遺伝子は本発明に従ったsiRNAにより「標的とされて」いることになる。本明細書で使用される語句「選択的に減少する又は阻害する」は、1つの遺伝子、この場合PDK1、の発現に影響を与えるsiRNAを包含する。代わりに、siRNA(の1つの鎖)が厳密な条件下で遺伝子転写物、すなわち、そのmRNAにハイブリダイズする場合、siRNAは前記遺伝子を標的としていることになる。「厳密な条件下で」ハイブリダイズするとは、ハイブリダイゼーションを嫌う傾向がある標準条件下、例えば、高温及び/又は低塩含有量で標的mRNA領域にアニールすることを意味する。Maniatis, T.ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、1982、387〜389頁には適切なプロトコル(0.1×SSC、68℃、2時間を含む)が記載されている。

本明細書で言及される核酸配列は、特に指示がない限り、5'から3'方向に書かれている。用語「核酸」とは、DNA若しくはRNAのどちらか又はDNA(アデニン「A」、シトシン「C」、グアニン「G」、チミン「T」)に若しくはRNA(アデニン「A」、シトシン「C」、グアニン「G」、ウラシル「U」)に存在するプリン若しくはピリミジン塩基を含むそれらの修飾型のことである。「T」塩基は、天然にはRNA中に存在しないが、本明細書に提供される干渉RNAは、例えば、3'末端に「T」塩基を含む場合がある。いくつかの場合、これらの塩基は、リボヌクレオチドの鎖中に存在するデオキシリボヌクレオチドを区別するために「dT」として現れる場合がある。

上に定義される標的配列はsiRNAを設計する目的で使用されるデータベースにおいて転写バリアントの定義のために使用される標的DNA配列として記載され、使用される特定の化合物はそのようなものとして定義されるRNA配列になる。

当分野の専門家は公開されているデータベースを通じていかなる標的遺伝子配列でも入手することができる。例えば、ヒトPDK1 mRNAに対応するGenBank受託番号はNM_001261816(遺伝子ID: 5170)である。マウスPDK1 mRNAに対応する相同GenBank受託番号はNM_001080773 (遺伝子ID: 18607)である。更に、ENSEMBL(MBL-EBI/Wellcome Trust Sanger Institute)は以下のPDK1ヒト及びマウス受託番号、それぞれENSG00000140992及びENSMUSG00000024122を有する。

別のスプライシングにより生成する3個のPDK1転写物に対応するGenBank受託番号は、NP_001248745.1 (Accession Numbers: NM_001261816.1, GI:387849238)、NP_002604.1 (Accession Numbers: NM_002613.4, GI:387849236)、及びNP_112558.2 (Accession Numbers: NM_031268.5, GI:387849237)である。さらに、ENSEMBL(MBL-EBI/Wellcome Trust Sanger Institute)には、さらに10個の公開されたPDK1転写物が発刊されている：ENSP00000344220、ENSP00000455492、ENSP00000395357、ENSP00000268673、ENSP00000455025、ENSP00000455684、ENSP00000373876、ENSP00000455551、ENSP00000455438及びENSP00000346895である。

本発明により同定された前記好ましい標的領域は、配列番号1〜配列番号687からなる群から選択される少なくとも1つの配列を含む又はからなる。

好ましい実施形態では、前記好ましい標的領域は、配列番号1〜配列番号24からなる群から選択される少なくとも1つの配列を含む又はからなる。配列番号1は以下の種、ヒト(Homo sapiens)、ハツカネズミ(Mus musculus)、イヌ(Canis lupus familiaris)、及びドブネズミ(Rattus norvegicus)の間で100%の相同性を示す。配列番号2〜配列番号6は以下の種、ヒト(Homo sapiens)、ハツカネズミ(Mus musculus)、及びイヌ(Canis lupus familiaris)の間で100%の相同性を示す。

別の好ましい態様では、前記好ましい標的領域は、配列番号1〜配列番号6からなる群から選択される少なくとも1つの配列を含む又はからなる。

RNAi分野では、インビトロ研究によりヒトsiRNAが動物モデル遺伝子のノックダウンを誘発することができないことが実証される場合、関連する動物モデルにおけるsiRNAの効力を分析するために代用化合物(surrogate compound)(動物活性類似体)が合成される。この代用物はヒトsiRNAと同じ領域に対して設計され、したがって前記2つのsiRNAは、ヒト標的遺伝子とウサギ標的遺伝子の間の相同性に応じて、少数のヌクレオチドを除いて同じ配列を有する。このアプローチは、他のオリゴヌクレオチドの開発のために、特に毒性学研究のために広く使用されてきた{Kornbrust D.ら、2013}。

更に好ましい実施形態では、前記好ましい標的領域は配列番号1(5'-CUAUCACAUGGUGUUUGAACU -3')を含む又はからなる。

したがって、本発明の態様に従ったsiRNAは、好ましくは、そのアンチセンス鎖が配列番号1〜配列番号687からなる群から選択される少なくとも1つの配列に実質的に相補的であるRNA配列を含み、そのセンス鎖が前記アンチセンス鎖に相補的であるRNA配列を含み、両方の鎖がヌクレオチド間の標準塩基対形成によりハイブリダイズする二本鎖RNA分子を含むことになる。更に好ましくは、本発明の態様に従ったsiRNAは、そのアンチセンス鎖が配列番号1〜配列番号6からなる、更により好ましくは、配列番号1からなる群から選択される少なくとも1つの配列に実質的に相補的であるRNA配列を含む、二本鎖RNA分子を好ましくは含むことになる。

本発明の意味の範囲内で、標的mRNA配列に「実質的に相補的」は、前記標的配列に「実質的に同一」として理解してもよい。当業者が知っている「同一性」は、配列間のヌクレオチドの順番及び同一性をマッチさせることにより決定される場合のヌクレオチド配列間の配列関連性の程度である。一実施形態では、標的mRNA配列に85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%相補性を有するsiRNAのアンチセンス鎖は実質的に相補的であると見なされ、本発明において使用することができる。相補性の百分率は、第2の核酸分子中の1組の連続するヌクレオチドとワトソン-クリック型の塩基対を形成することができる第1の核酸分子中の連続するヌクレオチドの百分率を表している。好ましい実施形態では、アンチセンスsiRNA鎖は標的mRNA配列に100%相補的であり、センス鎖はsiRNAの二本鎖部分にわたってアンチセンス鎖に100%相補的である。siRNAは、不対オーバーハング、例えば、3'ジヌクレオチドオーバーハング、好ましくはdTdTを含んでいてもよい。

好ましい実施形態では、本発明により特定される前記眼状態は眼アレルギー及び/又は眼結膜炎である。更に好ましくは、前記眼状態は、季節性アレルギー性結膜炎、通年性アレルギー性結膜炎、春季角結膜炎、アトピー性角結膜炎、巨大乳頭結膜炎、ドライアイ症候群及びそれらの組合せから選択される。

最先端技術から分かるように、多くの異なる構造がRNA干渉を達成すると提唱されてきた。一般に、これらの二本鎖分子は約19〜約25ヌクレオチド長であり平滑末端構造並びにオーバーハングを持つ構造を含む。オーバーハングは有利であると報告されてきたのであり、RNaseによる認識を減少させダイサーの天然基質を模倣するので、どちらかの鎖の、5'末端に存在していてもよいし3'末端に存在していてもよい。一部の筆者らは分子の両3'末端にオーバーハングを含むことを推奨し、他の筆者らは1つのオーバーハングで十分であると考えている。他の筆者らは特定の修飾パターンを有する平滑末端構造の使用を記載している(EP1527176、WO2005/062937、WO2008/104978、EP2322617、EP2348133、US2013/0130377及び他にも多数)。

オーバーハングは1〜5ヌクレオチドを含んでいてもよく、典型的にはオーバーハングはジヌクレオチドでできている。当分野で使用される古典的な分子は、19ヌクレオチド二本鎖分子を含み、この分子は、Tuschl(WO02/44321)による最初の研究が教唆するように、好ましくは、デオキシヌクレオチドを含む3'ジヌクレオチドオーバーハングを更に含む。これらのオーバーハングはヌクレアーゼ(RNase)分解に対する抵抗性を更に増強すると言われている。後に、Kimら、2005は、21マー産物(ジヌクレオチドオーバーハングを含有する)であることが、RISCに取り込まれるのに必要であると報告している。更に、Bramsenら、2009は、サイレンシング効率を更に増加させるためのオーバーハングへの不安定化修飾の導入の可能性について報告している。

したがって、本発明の種々の態様の好ましい実施形態は、少なくとも1つのオーバーハングを含む配列番号1〜配列番号687からなる群から選択される少なくとも1つの配列を標的とするsiRNA分子に関する。更に好ましくは、前記siRNA分子は、配列番号1〜配列番号6からなる、更により好ましくは、配列番号1からなる群から選択される少なくとも1つの配列を標的とする。本発明が配列番号1〜配列番号687から選択される少なくとも1つの配列を標的とするsiRNA分子に関する場合、前記siRNAは、標的と同等の長さがあり相補的であるアンチセンス鎖、及びアンチセンス鎖と同等の長さがありに相補的であるセンス鎖を含む。アンチセンス及びセンス鎖は、もう一方の鎖にも標的にも相補的ではない及び/又はsiRNAの二本鎖部分で対になっていない追加の塩基を更に含んでいてもよい。例えば、配列番号1は、19ヌクレオチド配列であり、siRNAは、配列同一性のこの部分にわたる19bp二本鎖領域及びジヌクレオチドオーバーハングを含んでいてもよい。

本発明の種々の態様の好ましい実施形態は、配列番号1〜配列番号687からなる群から選択される少なくとも1つの配列を標的とするsiRNA分子に関し、二本鎖siRNA分子のそれぞれの鎖は約18〜約28又はそれよりも多い(例えば、約18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、若しくは28又はそれよりも多い)ヌクレオチド長である。

本発明の種々の態様の別の好ましい実施形態は、18〜28ヌクレオチド長又はそれよりも長い、配列番号688〜配列番号1374からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むsiRNA分子に関する。更に好ましくは、二本鎖siRNA分子は少なくとも19ヌクレオチド長であり、配列番号688〜配列番号1374からなる群から選択される。

本発明の種々の態様の別の代わりの実施形態は、平滑末端分子を提供する。

更に、本発明の好ましい実施形態は、配列番号1〜配列番号687からなる群から選択される少なくとも1つの配列を標的とする19ヌクレオチド二本鎖構造体を含む又はからなるsiRNAに関する。更に好ましくは、siRNAは、配列番号1〜配列番号6からなる、更により好ましくは、配列番号1からなる群から選択される少なくとも1つの配列を標的とする19ヌクレオチド二本鎖構造体を含む又はからなる。

本発明の特定の実施形態は、配列番号1〜配列番号687からなる群から選択される少なくとも1つの配列に対して標的化される19ヌクレオチド二本鎖平滑末端siRNAに関する。更に好ましくは、siRNAは、配列番号1〜配列番号6からなる、更により好ましくは、配列番号1からなる群から選択される少なくとも1つの配列に対して標的化される。更に特定の実施形態では、この化合物は、配列番号668〜配列番号1374からなる群から選択される少なくとも1つの配列を含む又はからなる。更に好ましい実施形態では、このsiRNAのアンチセンス鎖は、配列番号688〜配列番号1374からなる群から選択される少なくとも1つの配列に少なくとも80%、好ましくは、少なくとも90%相補的である。

好ましい実施形態では、この化合物は、配列番号688〜配列番号693からなる群から選択される少なくとも1つの配列を含む又はからなる。

更に好ましい実施形態では、この化合物はSYL1160021と名付けられた本発明者らの基準化合物のセンス鎖に対応する配列番号688(5'-AUGCGUACCCCACUUUCCU -3')を含む又はからなる。

更に、背景技術と呼ばれるセクションに記載されるように、siRNA分子に関する重要問題は、RNaseの偏在性に起因する生体液中でのその分子の不安定性である。したがって、ヌクレオチドに対する多くの異なる化学修飾の使用が、化合物安定性を増強する目的で報告されてきた。

siRNA分子のもう1つの固有の問題はその免疫原性であり、それによりsiRNAは、ある種のサイトカイン、例えば、I型及び/又はII型インターフェロン並びにIL-12、IL-6及び/又はTNF-アルファ産生の上方調節を含む、自然免疫系の非特異的活性化を誘発することが分かってきた。これらの効果の原因は、siRNAによりTLR7、TLR8及び/又はTLR3等のトール様受容体が活性化されることであると考えられている。

これらの効果、RNaseによる認識及び免疫原性は、両方とも配列依存的であるとも報告されている。

RNaseに対する感受性を減少することにより化合物安定性を増強する化学修飾の一部は、それに続く応答の免疫認識の誘発も減少させることができる。しかし、以前のセクションに記載したように、siRNAに化学修飾されたヌクレオチドを挿入すると、サイレンシング効力も減少することがあり、したがって、挿入には注意して取り組まなければならない。

したがって、本発明の種々の態様の好ましい実施形態では、siRNAは化学修飾を有する少なくとも1つのヌクレオチドを更に含む。

安定性を増強し免疫原性効果を減少させる好ましい化学修飾には、2'-O-メチルヌクレオチド、2'-フルオロヌクレオチド、2'-アミノヌクレオチド、2'-デオキシヌクレオチド、又は2'-O若しくは4'-Cメチレン架橋を含有するヌクレオチドが含まれる。エキソヌクレアーゼ保護のための他の好ましい化学修飾には、ExoEndoLight (EEL)、つまりセンス鎖中のすべてのピリミジンの2'-O-メチル残基への修飾、及びアンチセンス鎖における5'-UA-3'又は5'-CA-3'モチーフ中のすべてのピリミジンの修飾が含まれる。更に、センス鎖の1位も2'-O-メチルに変えることができ、センス鎖の5'-リン酸化を防ぎ、したがって、センス鎖を更に不活性化することによりsiRNAの特異性を増加する。更に、センス鎖は14位に2'-O-メチル修飾を含むこともできる。なぜならば、この位の2'-O-Meはセンス鎖を更に不活性化し、したがってsiRNAの特異性を増加させるからである。エキソヌクレアーゼ保護のための他の好ましい化学修飾には、メチルフルオロ(MEF)、つまりセンス鎖上では2'-Fで開始し(5'-末端)、アンチセンス鎖上では2'-O-Meで開始し、2'-フルオロ及び2'-O-メチル修飾が交互に繰り返されるエキソ保護が含まれる。更に、センス鎖の1位は2'-O-Meに、アンチセンス鎖の1位は2'-Fに変えることもできる(これは効率的に5'-リン酸化することができるのと同じく)。その上、隣接するヌクレオチドを繋ぐリボヌクレオチド骨格の修飾は、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチドの導入により行うこともできる。本発明の意味の範囲内での更に好ましい化学修飾は、ウラシルリボヌクレオチドをデオキシチミジン(デオキシリボヌクレオチド)で置換することに関する。本発明の別の好ましい実施形態では、少なくとも1つの化学修飾されたヌクレオチドがsiRNAのセンス鎖上、アンチセンス鎖上又は両鎖上にある。

上述のsiRNA分子は、当技術分野で既知の方法を使用して、細胞内部にその天然の構造のまま送達してもよい。例えば、インビトロ遺伝子サイレンシングを研究する場合、これらの化合物は標準トランスフェクション試薬を使用して投与される。効果をインビボで達成するためには、これらの化合物は裸で又は、例えば、リポソーム等の送達増強剤、特定の部分とのコンジュゲーション等を使用して投与してもよいが、多くの異なる代替案が当技術分野では知られており、身体内の所望の標的部位に応じて別様に使用される。

代わりに、本発明の種々の態様のsiRNA分子は真核生物プロモーターから細胞内で発現させることができる。siRNA分子を発現させることができる組換えベクターは、標的細胞に送達され、標的細胞内に留まることができる。代わりに、核酸分子の一過性発現をもたらすベクターを使用することもできる。そのようなベクターは必要に応じて繰り返し投与することができる。siRNA分子は発現すると、標的mRNAと相互作用しRNA干渉応答を生ずる。このようにして産生されるsiRNA分子は、そのセンス鎖とアンチセンス鎖がヌクレオチドの小さなループにより連結されているので、多くの場合shRNA(ショートヘアピンRNA)と呼ばれる。siRNA分子発現ベクターの送達は、静脈内若しくは筋肉内投与、対象から外植された標的細胞への投与とそれに続く前記対象への再導入等の全身的送達であっても、又は所望の標的細胞への導入を可能にすると考えられる他のいかなる手段による送達であってもよい。

本発明の更なる態様は、PDK1の増加した発現及び/又は活性によって特徴付けられる眼状態の治療方法において使用するための医薬の調製における、配列番号1〜配列番号687からなる群から選択される少なくとも1つの配列を標的とするsiRNAの使用に関する。更に好ましくは、前記少なくとも1つの配列は、配列番号1〜配列番号6からなる群から選択され、更により好ましくは、前記少なくとも1つの配列は、配列番号1からなる。前記方法は患者におけるPDK1の発現を阻害することを含む。用語、阻害は、発現又は活性の減少又は下方調節を示すために使用される。好ましくは、眼状態は眼アレルギー及び/又は結膜炎である。一実施形態では、眼状態は、季節性アレルギー性結膜炎、通年性アレルギー性結膜炎、春季角結膜炎、アトピー性角結膜炎、巨大乳頭結膜炎、ドライアイ症候群及びそれらの組合せを含む群から選択される。

PDK1の増加した発現及び/又は活性によって特徴付けられる眼状態の治療方法も提供される。前記方法は患者におけるPDK1の発現を阻害することを含む。前記方法は、配列番号1〜配列番号687からなる群から選択される少なくとも1つの配列を標的とするsiRNAを投与することを含んでいてもよい。更に好ましくは、前記少なくとも1つの配列は、配列番号1〜配列番号6からなる群から選択され、更により好ましくは、前記少なくとも1つの配列は、配列番号1からなる。

一部の国では、慢性アレルギー性結膜炎とドライアイ症候群の組合せは極めて一般的である。増加しているドライアイ問題は、一般的な人工的気候(artificial climatization)、屋内及び屋外汚染物質並びに他の未知の理由に起因する。ドライアイ症候群を抱える患者のほうが眼アレルギーを患いやすい。なぜならば、涙膜はアレルゲンがマスト細胞と接触するのを防ぐ重要な障壁だからである。

PDK1 mRNAに対するsiRNAを用いた治療的処置は、効果が観察される時間の長さを増加させ、それによって投薬回数を減らし患者のコンプライアンスを高めることにより、低分子の局所的点眼薬に有益であると予想されている。春季角結膜炎、アトピー性角結膜炎、及び巨大乳頭結膜炎を含むがこれらに限定されない眼アレルギー等の症例では、これは特に重要である。なぜならば、これらの症例は慢性状態であることが多いからである。さらに、siRNAを用いた治療により、PDK1のような細胞内タンパク質などの、いわゆる「非薬物標的(undruggable targets)」を治療標的として使用できる。

そのような医薬の調製を考慮すると、本発明の種々の態様のsiRNAは医薬組成物として製剤化することができる。好ましくは、前記siRNAの組成物及び製剤は、対象の器官に局所的に投与してもよい。更により好ましい実施形態では、前記siRNAは、眼への、好ましくは、眼の角膜表面への局所投与のために製剤化してもよい。角膜表面への適用は、例えば、点眼薬、ゲル、ローション、クリーム又は眼球インサートの形態であってもよい。眼への他の投与形態は、眼球への注射を含んでいてもよい。

本発明の種々の態様の更なる好ましい実施形態は、PDK1の増加した発現及び/又は活性によって特徴付けられる眼状態の治療のための医薬として使用するための、先行する段落に記載される配列番号1〜配列番号687からなる群から選択される少なくとも1つの配列を特異的に標的とするsiRNAに関する。更に好ましくは、前記少なくとも1つの配列は、配列番号1〜配列番号6からなる群から選択され、更により好ましくは、前記少なくとも1つの配列は、配列番号1からなる。上述のように、前記配列は、配列番号1〜配列番号687からなる群から選択される少なくとも1つの配列を標的とする19ヌクレオチド二本鎖構造体を含む又はからなるsiRNAであってもよい。このsiRNAは平滑末端であってもよい。好ましくは、siRNAは、配列番号688〜配列番号1374からなる群から選択される少なくとも1つの配列を含む又はからなる。

本発明の文脈では、配列を「特異的に標的とする」ため、本発明のsiRNAは、好ましくは少なくとも同じシード配列を含む。したがって、配列番号1〜配列番号687からなる群から選択される少なくとも1つの配列を特異的に標的とする、本発明に従ったいかなる配列も、好ましくは、アンチセンス鎖の2〜8位で同一である。更に好ましくは、前記少なくとも1つの配列は、配列番号1〜配列番号6からなる群から選択され、更により好ましくは、前記少なくとも1つの配列は、配列番号1からなる。

上記にもかかわらず、本発明の種々の態様のsiRNAを使用して、眼以外の組織においてPDK1をサイレンシングすることができる。したがって、前記siRNAはそれに合うように製剤化すべきである。

例えば、siRNA分子は、対象への投与のための、リポソームを含む送達ビヒクルに含めることができる。担体及び希釈剤並びにその塩は薬学的に許容される製剤中に存在してもよい。核酸分子は、リポソームへの封入、イオン泳動、若しくは生分解性ポリマー、ハイドロゲル、シクロデキストリンポリ乳酸グリコール酸共重合体(PLGA)及びPLCAマイクロスフェア(microsphere)、生分解性ナノカプセル並びに生体付着性マイクロスフェア等の他のビヒクル内への取込み、又はタンパク質性ベクターを含むがこれらに制限されない当業者には既知の種々の方法により細胞に投与することができる。本発明の一実施形態では、siRNA分子は、B型肝炎ウイルスの成分とリポソームを組み合わせる細胞特異的siRNA担体を通じて送達される。別の実施形態では、本発明の核酸分子は、ポリエチレンイミン及びポリエチレンイミン-ポリエチレングリコール-N-アセチルガラクトサミン(PEI-PEG-GAL)又はポリエチレンイミン-ポリエチレングリコール-トリ-N-アセチルガラクトサミン(PEI-PEG-triGAL)誘導体等のその誘導体と一緒に製剤化する又は複合体化することもできる。本発明の好ましい組成物は水溶液、特に、pH範囲が約7.0〜約7.4、好ましくは、pHが7.2±0.5のリン酸緩衝食塩水(PBS)等の生理食塩水である。

本発明のsiRNA分子は、膜破壊剤及び/又はカチオン脂質若しくはヘルパー脂質分子と複合体化してもよい。

本発明と共に使用してもよい送達システムは、例えば、水性及び非水系ゲル、クリーム、多層乳剤(multiple emulsions)、マイクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水溶液及び非水溶液、ローション、エアロゾル、炭化水素系並びに粉末を含み、可溶化剤、透過促進剤(例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコール及びアミノ酸)、及び親水性ポリマー(例えば、ポリカルボフィル及びポリビニルピロリドン)等の賦形剤を含有することができる。一実施形態では、薬学的に許容される担体はリポソーム又は経皮浸透促進剤(transdermal enhancer)である。

本発明の医薬製剤は、細胞又は例えば、ヒトを含む対象への投与、例えば、全身若しくは局所投与に適した形態である。適切な形態は、部分的に、使用又は移行経路、例えば、経口、経皮、又は注射によるものに依拠している。他の要因は当技術分野で知られており、毒性及び組成物又は製剤がその効果を発揮するのを妨げる形態等の考慮すべき点が含まれる。

本発明には、貯蔵又は投与のために調製され、薬学的に許容される担体又は希釈剤中に薬学的有効量の所望の化合物を含む組成物も含まれる。治療的使用のための許容される担体又は希釈剤は製薬技術では周知である。例えば、保存剤、安定化剤、色素及び香味料を提供することができる。これらには、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びp-ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。更に、抗酸化剤及び懸濁剤を使用することができる。

薬学的有効量とは、発生を予防する、阻害する又は疾患状態を治療する(症状をある程度、好ましくは、症状のすべてを軽減する)のに必要な用量である。薬学的有効量は一般的に、疾患の種類、使用される組成物、投与経路、治療されている哺乳動物の種類、検討中の特定の哺乳動物の身体的特徴、併用薬物及び当業者であれば認識する他の要因に依存する。

治療的有効量とは、眼アレルギーに関連する眼障害の開始を遅延させる又は最小限に抑えるのに十分なsiRNAの量のことでもありうる。治療的有効量とは、眼アレルギーに関連する眼障害の処置又は管理において治療効果をもたらす量の治療薬のことでもありうる。更に、本発明のsiRNAに関する治療的有効量とは、単独で又は他の療法と組み合わせて、眼アレルギーに関連する眼障害の処置又は管理において治療効果をもたらす量の治療薬を意味する。本発明のsiRNAの量との関係で使用した場合、前記用語は、全体的療法を改善し、望ましくない効果を減少する若しくは回避する、又はもう1つの治療薬の治療効力を増強する若しくはそれとの相乗効果をもたらす量を包含することができる。

眼アレルギー等の眼障害の処置又は管理における治療効果とは、アレルギー症状の持続的減少のことである。siRNAが細胞内のPDK1のレベルを減少すると仮定すると、処置を停止すれば前記細胞は新しいタンパク質を再合成しなければならない。したがって、siRNA治療に基づく療法は更に持続的な効果をもたらすことになる。これは治療効力の著しい増強と見なされる。

siRNAを使用するさらなる利益は、様々な点眼薬に基づく治療にしばしば付随する、体循環中における存在に由来する副作用又は急性毒性問題の可能性が最小であることである。これは、前記化合物が血流に入った場合、血液中に存在するRNAseに急速に分解されることに起因する。

一方、siRNA分子を単回用量バイアルで市場に出せることは、製剤への抗菌性保存剤の添加を回避できることを意味する。今日、市場に出ている大多数の製剤中には保存剤が存在する。これらの保存剤は一部の患者に不耐性をもたらし、処置を停止することが必要になることがある。いずれの問題も、春季角結膜炎、アトピー性角結膜炎、巨大乳頭結膜炎、毒性結膜炎（あるいは毒性濾胞性結膜炎）及び接触アレルギーを含むがこれらに限定されない眼アレルギー等の状態が多くの場合慢性的であり、したがって、治療も慢性的になることを考慮すると、特に深刻である。

好ましい投与経路の1つは、好ましくは点眼液を使用して、眼に直接滴下することによる局所的投与経路である。上述のように、PDK1 mRNAに対するsiRNAを用いた治療的処置は、効果が観察される時間の長さを増加させ、それによって投薬回数を減らし患者のコンプライアンスを高めることにより、低分子の局所的点眼薬に有益であると予想されている。

しかし、上で説明されるように、眼に対する直接投与経路以外の投与経路も使用することができる。製剤において用いられる正確な投与量及び投与計画も、投与経路に依存することになる。当業者であれば、用いる正確な投与量及び投与計画は障害の重症度にも依存しており、開業医の判断及びそれぞれの患者の状況に応じて決断すべきであることを理解していると考えられる。いかなる特定の対象にとっても特定の用量レベルは、用いられる特定の化合物の活性、年齢、体重、健康全般、性別、食事、投与時間、投与経路及び排泄速度、薬物組合せ、並びに治療を受けている特定の疾患の重症度を含む種々の要因に依存することも理解されている。

本発明の及び本明細書に記載されている製剤又はsiRNAは、従来の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント及び/又はビヒクルを含有する単位用量製剤で投与することができる。製剤は、例えば、錠剤、トローチ、ロゼンジ(lozenge)、水性若しくは油性懸濁液、分散性粉末若しくは顆粒、乳濁液、硬若しくは軟カプセル、又はシロップ若しくはエリキシルとして経口使用に適した形態であってもよい。経口使用を目的とする組成物は、医薬組成物の製造のために当技術分野で既知のいかなる方法に従って調製してもよく、そのような組成物は、薬剤的に優雅で味の良い調製物を提供するために1つ又は複数のそのような甘味料、香味料、着色料又は保存剤を含有しうる。錠剤は、活性成分を、錠剤の製造に適している非毒性の薬学的に許容される賦形剤との混合物として含有する。

これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウム等の不活性希釈剤;顆粒化剤及び崩壊剤、例えば、コーンスターチ又はアルギン酸;結合剤、例えば、デンプン、ゼラチン又はアカシア;並びに潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクであってもよい。錠剤は被覆しないことも可能であり、又は既知の技法により被覆することも可能である。いくつかの場合、そのような被覆は、崩壊及び消化管への吸収を遅延させ、それによって更に長期間にわたって持続する作用をもたらすために既知の技法により調製することができる。例えば、モノステアリン酸グリセリン又はジステアリン酸グリセリン等の時間遅延物質(time delay material)を用いることが可能である。

経口使用のための製剤は、活性成分を不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム若しくはカオリンと混合させる硬ゼラチンカプセルとして、又は活性成分を水若しくは油媒体、例えば、ピーナツオイル、流動パラフィン若しくはオリーブオイルと混合させる軟ゼラチンカプセルとして提供することもできる。

水性懸濁液は活性物質を、水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混合物として含有する。そのような賦形剤は、懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントガム及びアラビアゴムであり、分散剤又は湿潤剤は天然に存在するホスファチド、例えば、レクチン、若しくはアルキレンオキシドと脂肪酸の縮合物、例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はエチレンオキシドと脂肪酸とヘキシトール由来の部分エステルとの縮合物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレイン酸、又はエチレンオキシドと脂肪酸とヘキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合物、例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレイン酸であってもよい。水性懸濁液は、1つ又は複数の保存剤、例えば、エチル若しくはn-プロピルp-ヒドロキシ安息香酸、1つ又は複数の着色料、1つ又は複数の香味料、及びショ糖若しくはサッカリン等の1つ又は複数の甘味料を含有することもできる。

油性懸濁液は、活性成分を植物油、例えば、落花生油、オリーブ油、ゴマ油若しくはココナッツ油に、又は流動パラフィン等の鉱油に懸濁することにより製剤化することができる。油性懸濁液は、増粘剤、例えば、蜜蝋、固形パラフィン又はセチルアルコールを含有することができる。甘味料及び香味料を添加すれば味の良い経口調製物を提供することができる。これらの組成物は、アスコルビン酸等の抗酸化剤を添加することにより保持することが可能である。

水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散性粉末及び顆粒は、活性成分を分散剤又は湿潤剤、懸濁剤及び1つ又は複数の保存剤との混合物として提供する。適切な分散剤若しくは湿潤剤又は懸濁剤はすでに上で言及した薬剤により例示されている。追加の賦形剤、例えば、甘味、香味及び着色剤が存在してもよい。

本発明の医薬組成物は、水中油型乳剤の形態であってもよい。油相は植物油であっても鉱物油であってもこれらの混合物であってもよい。適切な乳化剤は、天然に存在するガム、例えば、アラビアゴム又はトラガントガム、天然に存在するホスファチド、例えば、ダイズ豆、レシチン、及び脂肪酸及びヘキシトール、無水物由来のエステル又は部分エステル、例えば、ソルビタンモノオレイン酸、及び前記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸であってもよい。乳剤は甘味料及び香味料を含有してもよい。

シロップ及びエリキシルは甘味料、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、グルコース又はショ糖で製剤化することができる。そのような製剤は、粘滑剤、保存剤並びに香味料及び着色剤を含有してもよい。本発明の及び本明細書に記載される医薬組成物又はsiRNAは、無菌で注射可能な水性又は油性懸濁液の形態であってもよい。

この懸濁液は、上で言及している適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を使用して既知の技術に従って製剤化することができる。

無菌の注射可能な調製物は、非毒性で非経口的に許容できる希釈剤又は溶剤中の無菌の注射可能な溶液又は懸濁液、例えば、1,3-ブタンジオール中の溶液であってもよい。用いることが可能な許容されるビヒクル及び溶剤には、水、リンゲル液及び等張食塩水がある。更に、無菌の不揮発油は習慣的に溶剤又は懸濁媒として用いられている。この目的のため、合成モノ又はジグリセリドを含むいかなる無菌不揮発油でも用いることができる。更に、オレイン酸等の脂肪酸は注射液の調製に用途がある。

好ましい実施形態では、本発明の組成物は溶液で、好ましくは、PBS等の緩衝生理食塩溶液で、又は例えば、点眼液の形態で等の眼への局所投与のためのゲルで製剤化される。そのような実施形態では、製剤はカチオン乳剤である及び/又は、ポリ(ラクチド-co-グリコリド)、カーボポル(carbopol)、ヒアルロン酸及びポリアクリル酸を含むがこれらに限定されないバイオポリマーを含有してもよい。

本発明の核酸分子は、例えば、薬物の直腸投与のために、坐薬の形態で投与することもできる。これらの組成物は、常温では固体であるが直腸温度では液体で、したがって、直腸内で融解して薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤と薬物を混合することにより調製することができる。そのような材料にはココアバター及びポリエチレングリコールが含まれる。

本発明の核酸分子は無菌媒体で非経口的に投与することができる。薬物は、使用されるビヒクル及び濃度に応じて、ビヒクル中に懸濁させる又は溶解させることができる。有利なことに、局所麻酔薬、保存剤及び緩衝剤等のアジュバントをビヒクル中に溶解させることができる。

したがって、本発明の更なる好ましい実施形態は、先行する段落に記述されているように、配列番号1〜配列番号687からなる群から選択される少なくとも1つの配列を標的とするsiRNAを少なくとも含む医薬組成物に関する。更に好ましくは、前記少なくとも1つの配列は、配列番号1〜配列番号6からなる群から選択される、更により好ましくは、前記少なくとも1つの配列は、配列番号1からなる。

本発明の核酸分子は、全体的治療効果を増加するために他の治療化合物と組み合わせて対象に投与することもできる。適応症を処置するための複数の化合物を使用すれば、副作用の存在を減少させつつ有益な効果を増やすことができる。

本明細書で使用されるように、用語「眼アレルギー」とは、PDK1の増加した発現及び/又は活性により引き起こされる眼球表面のアレルギー性障害のことである。眼アレルギーはアレルギー性結膜炎と呼ばれることもある。眼アレルギーには、季節性アレルギー性結膜炎(SAC)、通年性アレルギー性結膜炎(PAC)、春季角結膜炎(VKC)、アトピー性角結膜炎(AKC)及び巨大乳頭結膜炎(GPC)が含まれるがこれらに限定されない多種多様な病態が含まれる。

本明細書で使用されるように、用語「結膜炎」とは、結膜の炎症のことである。結膜炎はインドでは、はやり目又はマドラスアイ(madras eye)とも呼ばれる。結膜炎は一般には、感染(通常はウイルス性、しかし細菌性のこともある)又はアレルギー反応に起因する。

眼アレルギーの「臨床症状」は、眼掻痒、眼発赤、眼瞼の腫脹、結膜浮腫、流涙、及び鼻炎、鼻づまり、鼻漏、鼻掻痒症(nasal pruritis)及び耳/口蓋掻痒症、並びにくしゃみを含むがこれらに限定されない。本発明は、少なくとも2つの臨床症状、更に好ましくは、少なくとも3つ、更により好ましくは、4つよりも多くを治療する又は予防することが好ましい。

用語「患者」とは、本明細書で使用されるように、哺乳動物を含む動物、好ましくはヒトのことである。

本明細書で使用されるように、用語「アレルゲン」とは、即時型過敏症(アレルギー)を生じることができる環境内にある任意の抗原物質のことである。既知のアレルゲンの一覧表には、植物花粉、カビの胞子、動物のフケ、ハウスダスト、食物、羽毛、色素、石ケン、洗剤、化粧品、プラスチック、及び薬物が含まれる。アレルゲンは、吸入、嚥下、接触、又は注射ことにより身体に入ることができる。空中アレルゲンは、例えば、花粉又は胞子に限定されないが、気流を通じて運ばれるほど軽いアレルゲンである。

本発明における用語「アレルギー性結膜炎」とは、アレルギー反応により引き起こされる結膜の炎症として理解されている。結膜は眼を覆う薄い膜である。アレルゲンが結膜を刺激すると、眼で起きる一般的症状には、発赤(主に末梢小血管の血管拡張に起因する)、眼掻痒、眼瞼腫脹、増加した流涙、羞明、水様分泌物、及び異物感(疼痛を伴う)が含まれる。症状は通常、天候が温かく乾燥しているほうが患者には悪く、気温が下がり雨になると症状がやわらぐ傾向がある。

本発明における用語「眼瞼炎」は眼瞼の慢性的炎症と理解されている。

本発明における用語「眼瞼結膜炎」は、2つの別々の眼状態、眼瞼炎と結膜炎の同時発生と理解されている。眼瞼炎は外部眼瞼を冒し、結膜炎は結膜で生じる。

本発明における用語「角結膜炎」は角膜と結膜の炎症と理解されている。

本発明は以下の非限定的実施例により更に説明される。

0.材料
・マウスPDK1プローブ: Taqman Gene Expression Assay Mm00554306_ml。
・18S内在性対照:Taqmqn Gene Expression Assay. Hs99999901_s1。
・Multiscribe逆転写酵素50U/ml(Applied Biosystems社P/N 4311235)。
・RNase阻害剤20U/μl(Applied Biosystems社P/N N8080119)。
・TaqMan 2X Universal Master Mix。
・非放射性細胞増殖アッセイキット(Promega社、Mannheim、ドイツ)。
・ヒトマスト細胞(HMC-1)。
・DMSO中イオノマイシンカルシウム塩1mM(Sigma Life Science社製Ref# I3909-1ml)。
・アネキシン-V検出キットLife Technologies社(Ref:V13241)。

1.インビトロ分析
1.1異なる細胞株における本発明のsiRNAのトランスフェクション後のPDK1発現レベル
本発明のsiRNAのサイレンシング効果を実証するために、異なる細胞株における本発明の一連のsiRNAのトランスフェクション後、インビトロPDK1発現レベルを測定した。ヒトA204及びマウスC2C12細胞に、トランスフェクション剤(transfection agent)としてそれぞれTransit TKO及びリポフェクタミン2000を用いて、100nMの配列番号688及び配列番号692（両方とも19bp平滑末端dsRNA構造体）をトランスフェクトした。すべてのトランスフェクションは標準的な製造業者の説明書に従って実施した。同じトランスフェクションで、スクランブルしたsiRNA配列を干渉の特異性の対照として使用した。細胞ペレットはトランスフェクション実験後24、48、及び72時間で回収し、siRNA作用機序の結果生じうるmRNAレベルの変動を評価するために処理した。RNAレベルは相対的定量法、Comparative Threshold 2-ΔΔCT法{Livak及びSchmittgen、2001}を使用してリアルタイムPCRにより定量した。すべてのリアルタイム定量PCR実験は3通り実施し、3回の独立した実験で繰り返した。平均及び標準偏差を計算した。図3に示すように、配列番号688は、PDK1 mRNAレベルをA204細胞では、おおよそ50%、C2C12細胞では、70%有意に減少させた。配列番号688に対して、PDK1 mRNAレベルは、72時間で完全には回復しない(図3)。配列番号692もまた、A204細胞(50%)とC2C12細胞(40-50%)の両方でPDK1遺伝子発現レベルを低下させた。配列番号692に対して、PDK1遺伝子発現レベルは72時間で完全に回復する(図4)。

1.2本発明のsiRNAを用いたトランスフェクション後の異なる細胞株の細胞生存能
本発明のsiRNAの細胞生存能を実証するために、異なる細胞株における本発明の特異的なsiRNAのトランスフェクション後、インビトロ毒性レベルを測定した。ヒトA204並びにマウスC2C12及びJ744A.1細胞に、トランスフェクション剤としてそれぞれTransit TKO及びリポフェクタミン2000を用いて100nMの配列番号688(19bp平滑末端dsRNA構造体)をトランスフェクトした。すべてのトランスフェクションは標準的な製造業者の説明書に従って実施した。同じトランスフェクションで、スクランブルしたsiRNA配列を干渉の特異性の対照として使用した。細胞ペレットはトランスフェクション実験後24、48、及び72時間で回収し、siRNAトランスフェクションの結果生じうる細胞生存能レベルの変動を評価するために処理した。細胞生存能はCellTiter 96(登録商標)Aqueous Non-Radiactive Cell. Proliferation Assay from Promega社を使用して測定した。この方法は、490nm吸収の量により測定した場合の、MTSテトラゾリウム化合物をホルマザン生成物に減少させる生細胞の能力(デヒドロゲナーゼ酵素)に基づいている。平均及び標準偏差を計算した。図5に示すように、対照及びスクランブルしたsiRNAと比較して、配列番号688では細胞生存能レベルsiRNAに何の変化も見られなかった。配列番号688に毒性はなく安全である。

1.3本発明のsiRNAを用いたトランスフェクション後のヒトマクロファージMHC-1細胞における誘導脱顆粒
脱顆粒アッセイの目的は、本発明のsiRNA、特に配列番号688(19bp平滑末端化dsRNA構造)のsiRNAをトランスフェクションしてPDK1発現をノックダウンし、アレルギー応答指標として、ヒトマスト細胞系(MHC-1)から脱顆粒比率を評価することである。脱顆粒は、カルシウムイオノフォア、イオノマイシン(Ionomycin)を、4μMの濃度で使用して誘導することにより成功した。アネキシン-V結合法が、Demoと共同開発者ら(Demoら, 1999)に記載されたように、脱顆粒プロセスの評価のパラメーターとして使用された。配列番号688での遺伝子サイレンシング実験により、イオノマイシン(4μM)濃度で配列番号688でトランスフェクションした細胞の表面のアネキシン-V結合において、強力な減少（およそ50%）が示された。これらの結果は、配列番号688投与が、マスト脱顆粒をどのように防ぐことができたかを示す（図6）。脱顆粒と並行して、相対的定量法、Comparative Threshold 2-ΔΔCT法{Livak及びSchmittgen、2001}を使用するリアルタイムPCRにより、トランスフェクション実験24時間後のPDK1 mRNAレベルのアッセイ検出を測定した。図7に示すように、ヒトマスト細胞系(MHC-1)において、20%のPDK1 mRNAレベルの低下が発見された。これらの結果を考慮すると、配列番号688のトランスフェクション後のPDK1 mRNAレベル減少により、ヒトマスト脱顆粒が防止されうることが示された。

2.インビボ分析
これらの実験の目的は、ブタクサ花粉により誘発される眼アレルギーのマウスモデルにおける眼アレルギーに関連する症状を減少させるため、PDK1の発現をサイレンシングするように設計された本発明のsiRNAの効力を分析することであった。特に配列番号688(19bp平滑末端dsRNA構造体、SYL116021)を有するsiRNAの効力を分析した。

ブタクサは、ヒマワリ科キク科(Asteraceae)のブタクサ属(Ambrosia)の顕花植物である。ブタクサ花粉は高度にアレルゲン性であり、一般にはあらゆる空中花粉の中で最大のエアロアレルゲンであり、世界中の花粉症(hay fever)の第一原因と見なされている。米国環境健康科学研究所(NIEHS)は、ブタクサ、並びに長葉羊蹄、藜、シロザ、オオバコ、ヒメスイバ及びヤマヨモギ等の他の草が世界中で花粉アレルゲンの最も多産な生産者の一部であることを示している。この花粉は、アレルギー性結膜炎を試験するための動物モデルにおいて一般的に使用されている{Bacsi Aら、2005}。

この分析の目的は、本発明の化合物、特に配列番号688(SYL116021)の点眼によるPDK1の下方調節が、マウスにおいてブタクサ花粉誘発眼アレルギーにより引き起こされる症状を軽減するかどうかを決定することであった。

本発明者らは、PDK1がマウスの眼において発現しているのかどうか、その発現がブタクサ花粉誘発眼アレルギーへの応答で上方調節されるのかどうかを解析した。本発明者らは、配列番号688(SYL116021)を局所的に適用して、上述のマウスモデルにおけるアレルギー応答に対する、PDK1の発現をサイレンシングする効果も吟味した。この目的のために以下のパラメータを分析した。
・アレルギー誘発への応答における臨床徴候:アレルギー性結膜炎の典型的眼徴候には、掻痒、眼瞼腫脹、結膜腫脹(結膜浮腫)、及び粘液堆積(mucus deposition)が含まれる。眼アレルギーに関連する粘液は大量であり、粘質であり、粘着性でもある。結膜の代替物は通常、眼球結膜が「ガラス状」外見を呈する原因となり、眼瞼結膜の色は赤というよりもむしろピンクになり、度々乳白色の外見を見せる。
・局所マスト細胞の数:アレルギー刺激結膜マスト細胞が脱顆粒して数分後、炎症メディエータの放出が結膜のより深い層から遊走してくる更に多くのマスト細胞を引き付ける。
・好酸球の局所浸潤:結膜への炎症細胞の浸潤はアレルゲン曝露の数時間後に生じ、アレルゲンに対する後期応答の一部である。いくつかの異なる種類の細胞が結膜へ遊走するが、主な種類は好酸球である。
・アレルギーに関係する分子バイオマーカーの発現変化:
- PDK1: マスト細胞の機能は、イオンチャンネル活性と複数のシグナル伝達経路の変化を介して厳密に制御されている。アレルゲンに対する応答におけるマスト細胞の活性化は、イオンの膜浸透性における変化を引き起こす。Ca2+の細胞への流入は、ホスファチジルイノシトール-3-キナーゼ(PI3K)を活性化させる。PI3K経路の活性化は、その後PKB/Akt、SGK及びPKCのようなPI3Kの下流標的をリン酸化するホスホイノシチド依存性キナーゼ(PDK1)の活性化を含む。これらのキナーゼは、カルシウムチャンネルを活性化し。細胞内カルシウム蓄積を流動化し、マスト細胞脱顆粒を活性化することに関する{Shumilina Eら、2010}。

2.1方法
A.動物及び動物の手順
2.1.1試験システム特徴付け

本発明のsiRNAの更なる利点は、配列番号1〜配列番号24が、異なる動物配列に渡って、PDK1遺伝子の高度に保存された領域に一致していることである。実際、これらの配列はヒトとマウスの間で同一であり、この動物モデルは眼アレルギーの試験に特に適している。

2.1.2アレルギーの誘発
アレルギー性結膜炎は、1日目に腹腔内注射により0.25mlのミョウバン中50μgのブタクサ(Rw)花粉の混合物で動物を免疫化することにより誘発した。免疫化溶液は投与直前に調製し、常時光から保護した。免疫化10日後、1.25mgのRw花粉をそれぞれの眼に局所的に滴下した。投与は投与量5μL/眼で実施した。この手順は当業者に既知の標準的な既存の発表されているプロトコルから適応させたもので、siRNAの効力を吟味する前に検証した{Magone M.T.ら、1998}。

2.1.3試験項目管理
試験項目は、6日目に開始して5日間にわたり1日1回動物の両眼に局所的眼経路により適用した(図8)。動物の別個の群はビヒクル(PBS)を投与され、対照として働いた。投与は投与量5μL/眼で実施した。

2.1.4臨床所見及び試料の収集
動物の全体的健康状態は最初の投与から屠殺まで毎日モニターした。マウスは局所的眼花粉の滴下に先立って及び花粉滴下後の24時間までの異なる時点で過敏症の臨床徴候について検査した。結膜浮腫及び充血、眼瞼浮腫、眼脂及び流涙はスケール0〜3で段階分けした。臨床スコアリングは実験条件ついて知らされていない、経験豊かな観察者により実施された。動物はアレルギー負荷の3時間又は24時間後に屠殺された。屠殺眼(sacrifice eyes)に続いて、単離され、後にRNAで保持される。

2.1.5 RNA単離及び逆転写
全RNAは、RNeasy RNA抽出キット(Invitrogen社、CA、米国)を使用して全眼、脾臓又はリンパ節から単離した。4μgの全RNAは、High-Capacity cDNA Archiveキット(Applied Biosystems, Inc.社、Foster City、CA、米国)を使用して製造業者の説明書及びIT-B-0003-01に従って逆転写した。

2.1.6 qPCR
qPCRはStepone plus検出システム(Applied Biosystems社)を使用して実施した。500ナノグラムのそれぞれの試料をTaqMan 2X Universal Master Mixにおいて、95℃で10分間、続いて95℃で15秒間及び60℃で1分間を40サイクルの条件で増幅させた。すべてのqPCR増幅は3通り実施し、常に逆転写対照及びテンプレート対照なしを含む少なくとも2つの独立した実験で繰り返した。PDK1、TLSP及びTnfrsf9 mRNAレベルは、内部標準として18S遺伝子を使用し、ΔΔCT法により相対的に定量するqPCRによって分析した{Livak K. J.及びSchmittgen T. D.、2001}。

2.3 結果
2.3.1マウス眼中のDPK1の発現及び眼アレルギーに対する応答における誘発
DPK1の発現は、方法のセクションで述べたとおりにアレルギー誘発後の異なる時点でマウスの眼において吟味した。図9は、DPK1が眼に存在していること、その発現がアレルギー負荷に対する応答で急速に上方調節されていることを示している。DPK1 mRNAレベルの1.3倍の増加がブタクサ花粉の投与の3時間後に、1.7倍の増加がブタクサ花粉の投与の24時間後に観察された。

2.3.2眼アレルギーのモデルマウスにおける配列番号688(SYL116021)の効率
方法のセクションで述べたとおりに、動物の2つの群にミョウバンに吸着させたブタクサ花粉の用量を腹腔内に(IP)注射した。IP注射の5日後、1つの群(A、n=16)は5日の期間にわたりPBSの点眼/日を受け、もう一方の群(B、n=24)は同一期間中配列番号688(SYL116021)を450μg/眼/日の用量(低用量)で受けた。動物たちは花粉の点眼の0.5、1、3、6及び24時間後に眼アレルギーに関係する症状について検査を受けた。図10に示すように、配列番号688(SYL116021)を用いた処置は、アレルギーの臨床徴候を有意に減少させた。特に、配列番号688(SYL116021)で処理した動物の群において、6時間負荷後に臨床的兆候が観察されなかったことは興味深い；これは、配列番号688(SYL116021)は、臨床的兆候を低下させるのみならず、持続させることを意味する。臨床的兆候のさらなる解析は、配列番号688(SYL116021)が、眼瞼浮腫、流涙及び眼漏(ocular discharge)に特に強力な効果を有することを示した。
(参考文献)

Claims (15)

1. 医薬として使用するための、配列番号1から687からなる群より選択される少なくとも1つの配列を特異的に標的とする、siRNA分子。
2. PDK1の増加した発現及び/又は活性により特徴づけられる眼状態の治療および/または防止において使用するための、請求項１に記載のsiRNA分子。
3. 前記眼状態が、アレルギーおよび/または結膜炎である、請求項２に記載のsiRNA分子。
4. 前記眼状態が、季節性アレルギー性結膜炎、通年性アレルギー性結膜炎、春季角結膜炎、アトピー性角結膜炎、巨大乳頭結膜炎、ドライアイ症候群及びそれらの組合せから選択される、請求項2又は3に記載のsiRNA分子。
5. 19ヌクレオチド二本鎖領域を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のsiRNA分子。
6. 平滑末端である、請求項5に記載のsiRNA分子。
7. 配列番号688〜配列番号1374からなる群から選択される少なくとも1つの配列を含む、または配列番号688〜配列番号1374からなる群から選択される少なくとも1つの配列からなる、請求項1から6のいずれか一項に記載のsiRNA分子。
8. 配列番号1〜配列番号687からなる群から選択される少なくとも1つの配列を特異的に標的とし、細胞内に導入された場合にはPDK1遺伝子の発現を減少させるsiRNA分子であって、19ヌクレオチド平滑末端二本鎖構造体を含むsiRNA分子。
9. 少なくとも1つのヌクレオチドが化学修飾を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載のsiRNA分子。
10. ヌクレオチドの前記化学修飾が、2'-O-メチル化及びウラシルリボースヌクレオチドのデオキシチミジンヌクレオチドによる置換及びこれらの組合せから選択される、請求項9に記載のsiRNA分子。
11. 前記化学修飾がセンス鎖上、アンチセンス鎖上又は両鎖上にある、請求項9又は10に記載のsiRNA分子。
12. PDK1の増加した発現及び/又は活性によって特徴付けられる眼状態の治療のための医薬の製造における請求項1から11のいずれか一項に記載のsiRNA分子の使用。
13. 前記眼状態が眼アレルギー及び/又は結膜炎である、請求項12に記載の使用。
14. 前記眼状態が、季節性アレルギー性結膜炎、通年性アレルギー性結膜炎、春季角結膜炎、アトピー性角結膜炎、巨大乳頭結膜炎、ドライアイ症候群及びそれらの組合せから選択される、請求項12又は13に記載の使用。
15. 請求項1から11に記載のsiRNA分子を少なくとも含む医薬組成物。

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