BRPI0715821A2 - inibiÇço de gremlina mediada por rnai para tratamento de condiÇÕes relacionadas À iop - Google Patents

Abstract

Patente de Invenção:"INIBIÇçO DE GREMLINA MEDIADA POR RNAi PARA TRATAMENTO DE CONDIÇÕES RELACIONADAS À IOP". A presente invenção refere-se a interferência de RNA para a inibição de gremlina em condições relacionadas à pressão intraocular, inclusive hipertensão ocular e glaucoma, tal como, glaucoma de tensão normal e glaucoma de ângulo aberto.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "INIBIÇÃO DE GREMLINA MEDIADA POR RNAi PARA TRATAMENTO DE CONDIÇÕES RELACIONADAS À IOP".

O presente pedido reivindica o benefício de Pedido de Patente Provisório Número de Série U.S. 60/839.826 depositado em 24 de agosto de 2006, cujo texto está especificamente incorporado aqui a título de referência. CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao campo de composições de RNA interferente para a inibição de expressão da proteína gremlina em con- dições relacionadas à pressão intraocular (IOP), tais como, hipertensão ocu- Iar e glaucoma inclusive glaucoma de tensão normal e glaucoma de ângulo aberto.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O glaucoma é um grupo heterogêneo de neuropatias óticas que partilham algumas características clínicas. A perda de visão em glaucoma se deve à morte seletiva de células do gânglio retiniano na retina neural que é clinicamente diagnosticada por alterações características no campo visual, defeitos na camada de fibras nervosas, e uma escavação progressiva do disco ótico (ONH). Um dos principais fatores de risco do desenvolvimento de glaucoma é a presença de hipertensão ocular (pressão intraocular elevada). É necessária uma pressão intraocular adequada para manter o formato do olho e fornecer um gradiente de pressão para permitir o fluxo de humor a- quoso até a córnea avascular e lente. Os níveis de IOP também podem es- tar envolvidos na patogênese de glaucoma de tensão normal (NTG)1 como evidenciado por pacientes que se beneficiam de medicações de redução de IOP. Uma vez que são feitos ajustes na espessura corneal central em leitu- ras de IOP em pacientes NTG1 muitos desses pacientes foram identificados como hipertensivos oculares.

A IOP elevada associada com glaucoma se deve à resistência de fluxo de humor aquoso elevada na rede trabecular (TM), um pequeno tecido especializado localizado no ângulo entre a íris e a córnea da câmara anterior ocular. As alterações glaucomatosas na TM incluem uma perda em células da TM e o depósito e acúmulo de fragmentos extracelulares que in- cluem material proteináceo tipo placa. Ademais, também há alterações que ocorrem no ONH glaucomatoso. Em olhos glaucomatosos, há alterações morfológicas e de mobilidade nas células gliais do ONH. Em resposta à IOP elevada e/ou episódios isquêmicos transitórios, há uma alteração na compo- sição da matriz extracelular de ONH e alterações nas morfologias de axônio de células gliais e de células do gânglio retiniano. Os glaucomas primários resultam de perturbações no fluxo de fluido intraocular que possui uma base anatômica ou fisiológica. Os glaucomas secundários ocorrem como resulta- do de lesão ou trauma ocular ou uma doença preexistente. O glaucoma de ângulo aberto primário (POAG), também conhecido como glaucoma crônico ou simples, representa a maior parte de todos os glaucomas primários. O POAG é caracterizado pela degeneração da rede trabecular, resultando em resistência anormalmente alta à drenagem de fluido do olho. Uma conse- quência de tal resistência é um aumento na IOP que é exigido para conduzir o fluido normalmente produzido pelo olho através da resistência aumentada.

O pedido PCT N0 PCT/US02/35251, publicado como WO 03/055443 em 10 de julho de 2003, se refere ao diagnóstico precoce, trata- mento de glaucoma, e identificação de compostos úteis para esse. Um mé- todo de tratamento de glaucoma é proporcionado aqui por meio de uma composição que compreende uma seqüência que consiste em pelo menos um composto selecionado a partir do grupo que consiste em um agonista BMP2, um agonista BMP4, um agonista BMP5, um agonista BMP7, um ago- nista Smad 1-5, um antagonista cordina, um antagonista gremlina e um an- tagonista folistatina é administrado a um paciente necessitado desse. Ne- nhuma instrução ou sugestão de uso de RNA interferente é fornecida pela publicação PCT WO 03/055443.

As terapias antiglaucoma atuais incluem redução de IOP por meio do uso de supressores de formação de humor aquoso ou agentes que aumentam o fluxo uveoscleral, trabeculoplastia a laser, ou trabeculectomia, que é uma cirurgia filtrante para aprimorar a drenagem. As abordagens far- macêuticas antiglaucoma apresentaram vários efeitos colaterais indesejá- veis. Por exemplo, mióticos, tal como, pilocarpina podem causar embaça- mento da visão e outros efeitos colaterais visuais negativos. Os inibidores de anidrase carbônica sistemicamente administrados (CAIs) também podem causar náusea, dispepsia, fadiga, e acidose metabólica. Ademais, alguns beta-bloqueadores vêm sendo progressivamente associados a sérios efeitos colaterais pulmonares atribuíveis a seus efeitos sobre os beta-2 receptores no tecido pulmonar. Os simpatomiméticos causam taquicardia, arritmia e hipertensão. Tais efeitos colaterais negativos podem resultar em adesão de paciente reduzida ou no término da terapia. Ademais, a eficácia de terapias de redução de IOP atuais dura relativamente pouco, o que requer dosagem repetida durante cada dia e, em alguns casos, a eficácia diminui ao longo do tempo.

Devido à importância de hipertensão ocular em glaucoma, e às limitações de métodos anteriores de tratamento, poderia ser desejável pos- suir um método aperfeiçoado de tratamento de hipertensão ocular poderia atender as causas básicas de seu progresso. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção proporciona RNAs interferentes que silenciam a ex- pressão de mRNA GREM1 com isso remove-se o efeito antagonístico que a gremlina possui sobre a proteína morfogenética óssea, tal proteína bloqueia pelo menos alguns fatores que são associados a um aumento na IOP (tal como, TGFp). Assim, o silenciamento de expressão de mRNA GREM1 resul- ta na redução de pressão intraocular em pacientes com condições relacio- nadas à IOP. Os RNAs interferentes da invenção são úteis para tratar paci- entes com condições relacionadas à IOP que incluem hipertensão ocular e glaucoma, tais como, glaucoma de tensão normal e glaucoma de ângulo a- berto.

A invenção também proporciona um método para atenuar a ex- pressão de mRNA GREM1 em um indivíduo. Em um aspecto, o método compreende administrar ao indivíduo uma composição que compreende uma quantidade eficaz de RNA interferente que possui um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em outro aspecto, a administração é realizada a um dos olhos do indivíduo para ate- nuar a expressão de GREM1 em um humano.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método para atenu- ar a expressão de mRNA GREM1 em um dos olhos de um indivíduo, que compreende administrar ao olho do indivíduo um RNA interferente que com- preende uma região que pode reconhecer uma parte de mRNA correspon- dente à SEQ ID NO: 1, que é a seqüência de cDNA senso que codifica GREM1 (N0 de Acesso GenBank NM_013372), onde a expressão de mRNA GREM1 é atenuada desse modo. Ademais, a invenção proporciona métodos de tratamento de uma condição relacionada à IOP em um indivíduo necessi- tado desses, que compreende administrar ao olho do indivíduo um RNA in- terferente que compreende uma região que pode reconhecer uma parte de mRNA correspondente a uma parte da SEQ ID NO: 1, onde a expressão de mRNA GREM1 é atenuada desse modo. Em alguns aspectos, um RNA interferente da invenção é proje-

tado para marcar um mRNA correspondente a uma parte da SEQ ID NO: 1, onde a parte compreende nucleotídeos 402, 403, 404, 407, 410, 425, 449, 455, 485, 642, 643, 686, 784, 1230, 1516, 1554, 1811, 2101, 2185, 2212, 2223, 2368, 2370, 2401, 2412, 2413, 2617, 2692, 2693, 2862, 2889, 3084, 3733, 3743, 3752, 3773, 3846, 4004, 4099, 216, 235, 236, 265, 267, 273, 279, 280, 281, 389, 391, 401, 416, 426, 427, 439, 440, 459, 461, 471, 472, 491, 497, 520, 545, 546, 575, 581, 587, 592, 595, 596, 598, 599, 624, 626, 640, 646, 650, 652, 657, 659, 673, 676, 678, 679, 688, ou 689 of SEQ ID NO: 1. Em aspectos particulares, uma "parte da SEQ ID NO: 1" possui cerca de 19 a cerca de 49 nucleotídeos de comprimento.

Em alguns aspectos, um RNA interferente da invenção possui um comprimento de 19 a cerca de 49 nucleotídeos. Em outros aspectos, o RNA interferente compreende uma fita de nucleotídeo senso e uma fita de nucleotídeo antissenso, onde cada fita possui uma região de complementa- ridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com a outra fita, e onde a fita antissenso pode reconhecer uma parte do mRNA GREM1 correspondente a uma parte da SEQ ID NO: 1, e possui uma região de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotideos com a parte do mRNA GREM1. As fitas senso e an- tissenso podem ser conectados por uma seqüência ligadora, que permite que as fitas senso e antissenso hibridizem um ao outro formando assim uma estrutura em grampo, como descrito aqui.

Ainda em outros aspectos, um RNA interferente da invenção é um RNA interferente de fita simples, e onde o RNA interferente de cadeia simples reconhece uma parte do mRNA correspondente a uma parte da SEQ ID NO: 1. Em alguns aspectos, o RNA interferente possui uma região de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotideos com a parte de mRNA correspondente à parte da SEQ ID NO: 1. Em outros aspectos, a parte da SEQ ID NO: 1 compreende 402, 403, 404, 407, 410, 425, 449, 455, 485, 642, 643, 686, 784, 1230, 1516, 1554, 1811, 2101, 2185, 2212, 2223, 2368, 2370, 2401, 2412, 2413, 2617, 2692, 2693, 2862, 2889, 3084, 3733, 3743, 3752, 3773, 3846, 4004, 4099, 216, 235, 236, 265, 267, 273, 279, 280, 281, 389, 391, 401, 416, 426, 427, 439, 440, 459, 461, 471, 472, 491, 497, 520, 545, 546, 575, 581, 587, 592, 595, 596, 598, 599, 624, 626, 640, 646, 650, 652, 657, 659, 673, 676, 678, 679, 688, ou 689 da SEQ ID NO: 1. Ainda em outros aspectos, um RNA interferente da invenção

compreende: (a) uma região de pelo menos 13 nucleotideos contíguos que possui pelo menos 90% de complementaridade de seqüência a, ou pelo me- nos 90% de identidade de seqüência aos 13 penúltimos nucleotideos da 3' extremidade de um mRNA correspondente a qualquer uma das SEQ ID NO:2, e SEQ ID NO: 13 - SEQ ID NO: 98; (b) uma região de pelo menos 14 nucleotideos contíguos que possuem pelo menos 85% de complementarida- de de seqüência a, ou pelo menos 85% de identidade de seqüência aos 14 penúltimos nucleotideos da 3' extremidade de um mRNA correspondente a qualquer uma das SEQ ID NO:2, e SEQ ID NO: 13 - SEQ ID NO: 98; ou (c) uma região de pelo menos 15, 16, 17, ou 18 nucleotideos contíguos que possuem pelo menos 80% de complementaridade de seqüência a, ou pelo menos 80% de identidade de seqüência aos 15, 16, 17, ou 18 penúltimos nucleotídeos, respectivamente, da 3' extremidade de um mRNA correspon- dente a qualquer uma das SEQ ID NO:2, e SEQ ID NO: 13 - SEQ ID NO:98; onde a expressão do mRNA GREM1 é atenuada desse modo.

Em aspectos adicionais, um RNA interferente da invenção ou composição que compreende um RNA interferente da invenção é adminis- trado a um indivíduo por meio de uma via tópica, intravítrea, transescleral, periocular, conjuntival, subtenoniana, intracameral, sub-retiniana, subconjun- tival, retrobulbar, ou intracanalicular. O RNA interferente ou composição po- de ser administrado, por exemplo, por meio de uma expressão in vivo de um vetor de expressão de RNA interferente. Em alguns aspectos, o RNA interfe- rente ou composição pode ser administrado por meio de um aerossol, via bucal, dérmica, intradérmica, inalante, intramuscular, intranasal, intraocular, intrapulmonar, intravenosa, intraperitoneal, nasal, ocular, oral, ótica, parente- ral, emplastro, subcutânea, sublingual, tópica, ou transdérmica. Em um aspecto, uma molécula de RNA interferente da invenção

é isolada. O termo "isolado" significa que o RNA interferente está livre de seu ambiente natural total.

A invenção proporciona ainda métodos para tratar uma condição relacionada à IOP em um indivíduo necessitado desses, que compreendem administrar ao indivíduo uma composição que compreende uma molécula de siRNA de fita dupla que infrarregula a expressão de um gene GREM1 atra- vés da interferência de RNA, onde cada fita da molécula de siRNA consiste independentemente em cerca de 19 a cerca de 27 nucleotídeos de compri- mento, e uma fita da molécula de siRNA compreende uma seqüência de nu- cleotídeo que possui complementaridade substancial a um mRNA corres- pondente ao gene GREM1 de modo que a molécula de siRNA controle a clivagem do mRNA através da interferência de RNA. Em alguns aspectos, a molécula de siRNA é administrada por um aerossol, via bucal, dérmica, in- tradérmica, inalante, intramuscular, intranasal, intraocular, intrapulmonar, intravenosa, intraperitoneal, nasal, ocular, oral, ótica, parenteral, emplastro, subcutânea, sublingual, tópica, ou transdérmica.

A invenção proporciona ainda a administração de um segundo RNA interferente a um indivíduo além de um primeiro RNA interferente. O segundo RNA interferente pode marcar o mesmo gene alvo de mRNA que o primeiro RNA interferente ou pode marcar um gene diferente. Ademais, um terceiro, quarto, ou quinto, etc. O RNA interferente pode ser administrado de maneira similar.

Uso de qualquer uma das modalidades, como descrito aqui, na preparação de um medicamento para atenuar a expressão de mRNA GREM1 também é uma modalidade da presente invenção.

As modalidades preferidas específicas da invenção tornar-se-ão óbvias a partir da seguinte descrição mais detalhada de algumas modalida- des preferidas e das reivindicações. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra os resultados de uma análise qRT-PCR da expressão de mRNA da Gremlina em células GTM-3 transfectadas com siRNAs da Gremlina #1, #2, #3, e #4, cada uma em 10 nM, 1 nM, e 0,1 nM.

A Figura 2 mostra os resultados de uma análise western blot da expressão de proteína Gremlina em células GTM-3 transfectadas com siR- NAs da Gremlina #1, #2, #3, e #4, cada uma em 10 nM, 1 nM, e 0,1 nM. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Os detalhes mostrados aqui são descritos a título de exemplo e

apenas para propósitos de discussão ilustrativa das modalidades preferidas da presente invenção e são apresentados devido ao fato de proporcionarem o que acredita-se ser a descrição mais útil e facilmente entendida dos prin- cípios e aspectos conceituais de várias modalidades da invenção. Nesse aspecto, nenhuma tentativa é feita para mostrar detalhes estruturais da in- venção em mais detalhes que o necessário para a compreensão fundamen- tal da invenção, sendo que a descrição obtida com os desenhos e/ou exem- plos torna óbvio aos versados na técnica como as diversas formas da inven- ção podem ser incluídas na prática. As seguintes definições e explicações têm o propósito e preten-

dem controlar qualquer construção futura, exceto onde clara e precisamente modificadas nos seguintes exemplos ou quando a aplicação do significado proporcionar qualquer construção insignificante ou essencialmente insignifi- cante. Em casos onde a construção do termo poderia se tornar insignificante ou essencialmente insignificante, a definição poderia ser obtida do Dicionário Webster, 3rd Edition ou um dicionário conhecido pelos versados na técnica, tal como o Dicionário Oxford de Bioquímica e Biologia Molecular (Ed. An- thony Smith, Oxford University Press, Oxford, 2004).

Como usado aqui, todas as porcentagens são porcentagens por peso, exceto onde estabelecido em contrário.

Como usado aqui e exceto onde indicado em contrário, os ter- mos "um" e "uma" significam "um", "pelo menos um" ou "um ou mais". Exce- to onde exigido em contrário pelo contexto, os termos no singular usados aqui devem incluir formas no plural e os termos no plural devem incluir for- mas no singular.

Em algumas modalidades, a invenção se refere ao uso de RNA interferente para inibir a expressão de mRNA da gremlina (GREM1). A gre- mlina é um elemento da família CAN de antagonistas da proteína morfogêni- ca óssea (BMP). Todos os elementos dessa família contêm um nó de cistina de anel com oito elementos. Diversos Iigantes de receptor do fator de cres- cimento, inclusive BMPs, TGFp, e PDGF, também pertencem à superfamília de nó de cistina. As BMPs 2, 4, 5, e 7; receptores de BMP R1a, R1b, e R2; e os antagonistas de BMP gremlina, bambi, e cordina são expressos na rede trabecular (TM) (pedido PCT N0 PCT/US02/35251, Id.; Wordinger et al., Mol. Vision 2002, 8:241-250). A sinalização de BMP bloqueia pelo menos algu- mas das alterações induzidas por TGFp em função de TM que estão associ- adas com IOP elevada (por exemplo, secreção de fibronectina aumentada). A gremlina antagoniza esse efeito de BMP sobre a sinalização de TGFp. Ademais, a expressão de gremlina é elevada em células glaucomatosas de TM (pedido PCT N0 PCT/US02/35251, Id.), e a gremlina aumenta a IOP em olhos humanos cultivados. Portanto, o silenciamento da expressão de gre- mlina é proporcionado aqui como um método eficaz de reduzir a IOP no tra- tamento de doença ocular relacionada à hipertensão e glaucoma.

De acordo com a presente invenção, a inibição da expressão de mRNA GREM1 reduz de forma eficaz a ação da gremlina. Ademais, os RNAs interferentes como descrito aqui proporcionados de forma exógena ou expressos de forma endógena são particularmente eficazes no silenciamen- to de mRNA GREM1.

A interferência de RNA (RNAi) é um processo por meio do qual o

RNA de cadeia dupla (dsRNA) é usado para silenciar a expressão do gene. Embora sem se ater à teoria, o RNAi começa com a clivagem de dsRNAs mais longos em pequenos RNAs interferentes (siRNAs) por uma enzima tipo RNaseIII1 dicer. Os SiRNAs são dsRNAs que possuem geralmente cerca de 19 a 28 nucleotídeos, ou 20 a 25 nucleotídeos, ou 21 a 22 nucleotídeos de comprimento e geralmente contêm ressaltos 3' com 2 nucleotídeos, e 5' fos- fato e terminações 3" hidroxila. Uma fita do siRNA é incorporada em um complexo de ribonucleoproteína conhecido como o complexo de silencia- mento induzido por RNA (RISC). O RISC usa essa fita de siRNA para identi- ficar as moléculas de mRNA que são pelo menos parcialmente complemen- tares à fita de siRNA incorporada, e então cliva esses mRNAs alvo ou inibe sua tradução. Portanto, a fita de siRNA que é incorporada em RISC é co- nhecida como a fita guia ou a fita antissenso. A outra fita de siRNA, conheci- da como a fita passageira ou a fita senso, é eliminada do siRNA e é pelo menos parcialmente homólogo ao mRNA alvo. Os versados na técnica irão perceber que, a princípio, cada fita de um siRNA pode ser incorporado em RISO e funciona como uma fita guia. Entretanto, o desenho de siRNA (por exemplo, estabilidade de siRNA dúplex reduzida na extremidade 5' da fita guia desejada) pode favorecer a incorporação da fita guia desejada em RISC.

A fita antissenso de um siRNA é o agente guia ativo do siRNA, pois a fita antissenso é incorporada e RISC, permitindo desse modo que o RISC identifique os mRNAs alvo com complementaridade pelo menos parci- al à fita de siRNA antissenso para clivagem ou repressão translacional. A clivagem mediada por RISC de mRNAs que possuem uma seqüência pelo menos parcialmente complementar à fita guia resulta em uma redução no nível de estado estacionário daquele mRNA e da proteína correspondente codificada por esse mRNA. Alternativamente, o RISC também pode reduzir a expressão da proteína correspondente através da repressão translacional sem a clivagem do mRNA alvo.

Os RNAs interferentes da invenção parecem atuar de maneira catalítica para clivagem de mRNA alvo, ou seja, o RNA interferente é capaz de realizar a inibição de mRNA alvo em quantidades subestequiométricas. Como comparado com terapias antissenso, significativamente menos RNA interferente é requerido para proporcionar um efeito terapêutico sob tais condições de clivagem.

Em algumas modalidades, a invenção proporciona métodos de utilização de RNA interferente para inibir a expressão de mRNA alvo de GREM1 reduzindo assim os níveis de GREM1 em pacientes com uma con- dição relacionada à IOP. De acordo com a presente invenção, os RNAs in- terferentes fornecidos de forma exógena ou expressos de forma endógena realizam o silenciamento da expressão de GREM1 em tecidos oculares.

A frase, "atenuar a expressão de um mRNA", como usado aqui, significa administrar ou expressar uma quantidade de RNA interferente (por exemplo, um siRNA) para reduzir a tradução do mRNA alvo em proteína, tanto através da clivagem de mRNA como através da inibição direta de tra- dução. Os termos "inibir", "silenciar", e "atenuar", como usados aqui, se refe- rem a uma redução mensurável na expressão de um mRNA alvo ou a prote- ína correspondente como comparada com a expressão do mRNA alvo ou a proteína correspondente na ausência de um RNA interferente da invenção. A redução na expressão do mRNA alvo ou a proteína correspondente é co- mumente referida como "restrição" e é relatada com relação aos níveis pre- sentes após a administração ou expressão de um RNA de controle de não- marcação (por exemplo, um siRNA de controle de não-marcação). A restri- ção da expressão de uma quantidade inclusive e entre 50% e 100% é con- templada aqui por modalidades. Entretanto, não é necessário que tais níveis de restrição sejam atingidos para propósitos da presente invenção.

A restrição é comumente avaliada ao medir os níveis de mRNA utilizando a amplificação de reação em cadeia da polimerase quantitativa (gPCR) ou ao medir os níveis de proteína por western blot ou teste imuno- enzimático (ELISA). A análise do nível de proteína proporciona uma avalia- ção tanto da clivagem de mRNA bem como da inibição de tradução. Técni- cas adicionais para medir a restrição incluem hibridização de solução de RNA1 proteção de nuclease, hibridização northern, monitoramento de ex- pressão genética com um microarranjo, ligação de anticorpo, rádio-imuno- ensaio, e análise celular ativada por fluorescência.

A atenuação da expressão de GREM1 por uma molécula de RNA interferente da invenção pode ser inferida em um ser humano ou outro mamífero ao observar o desenvolvimento de um sintoma relacionado à IOP1 tal como, aumento da pressão intraocular, progresso da perda de campo visual, ou desenvolvimento de alterações no disco ótico, por exemplo.

A capacidade de o RNA interferente restringir os níveis de ex- pressão de gene alvo endógena, por exemplo, em células HeLa, pode ser avaliada in vitro como se segue. As células HeLa são semeadas 24 h antes da transfecção em meio de crescimento padrão (por exemplo, DMEM su- plementado com 10% de soro bovino fetal). A transfecção é realizada utili- zando, por exemplo, Dharmafect 1 (Dharmacon, Lafayette, CO) de acordo com as instruções do fabricante em concentrações de RNA interferente que variam de 0,1 nM a 100 nM. O siRNA de não-marcação #1 SiCONTROL® e siRNA Ciclofilina B SiCONTROL® (Dharmacon) são usados como controles negativos e positivos, respectivamente. Os níveis de mRNA alvo e níveis de mRNA ciclofilina B (PPIB, NM 000942) são avaliados por gPCR 24 h pós- transfecção utilizando, por exemplo, um Ensaio de Expressão Genética TAQMAN® que sobrepõe, de preferência, o sítio alvo (Applied Biosystems, Foster City, CA). O siRNA de controle positivo fornece restrição essencial- mente completa de mRNA ciclofilina B quando a eficiência de transfecção for 100%. Portanto, a restrição de mRNA alvo é corrigida para eficiência de transfecção por referência ao nível de mRNA ciclofilina B em células trans- fectadas com o siRNA ciclofilina B. Os níveis de proteína alvo podem ser avaliados aproximadamente 72 h após a transfecção (tempo real dependen- te da taxa de renovação da proteína) por western blot, por exemplo. As téc- nicas padrão de isolamento de RNA e/ou proteína de células cultivadas são bem conhecidas pelos versados na técnica. Para reduzir a chance de efeitos não esperados e não-específicos, utiliza-se a menor concentração possível de RNA interferente para produzir o nível desejado de restrição na expres- são do gene alvo. As células epiteliais corneanas humanas ou outras linha- gens de células oculares humanas também podem ser usadas para avalia- ção da capacidade de o RNA interferente restringir os níveis de gene alvo endógeno.

Em uma modalidade, um único mRNA GREM1 de marcação de RNA interferente é administrado para reduzir os níveis de GREM1. Em ou- tras modalidades, dois ou mais RNAs interferentes que marcam o mRNA de GREM1 são administrados para reduzir os níveis de GREM1.

O banco de dados GenBank proporciona a seqüência de DNA de GREM1 como o número de acesso NM 013372, fornecida na "Listagem de Seqüência" como SEQ ID NO:1. A SEQ ID NO:1 fornece a seqüência de fita senso de DNA que corresponde ao mRNA que codifica gremlina (com a exceção de bases "T" para bases "U"). A seqüência de codificação de GREM1 é a partir dos nucleotídeos 160 a 714.

Os equivalentes da seqüência de mRNA de GREM1 citados a- cima são formas de junção alternativas, formas alélicas, isozimas, ou um cognato dessas. Um cognato é um mRNA gremlina de outras espécies de mamífero que é homólogo À SEQ ID NO: 1 (ou seja, um ortólogo).

Em algumas modalidades, um "indivíduo" necessitado de trata- mento para uma condição relacionada à IOP ou em risco de desenvolver uma condição relacionada à IOP é um ser humano ou outro mamífero que possui uma condição relacionada à IOP ou em risco de desenvolver uma condição relacionada à IOP associada com a expressão ou atividade indese- jada ou inadequada de gremlina. As estruturas oculares associadas com tais distúrbios podem incluir o olho, retina, coróide, lente, córnea, rede trabecu- lar, íris, nervo ótico, disco ótico, esclera, segmento anterior ou posterior, ou corpo ciliar, por exemplo. Um indivíduo também pode ser uma célula ocular, cultura celular, órgão ou um órgão ex vivo ou tecido ou célula. Uma "condição relacionada à IOP", como usada aqui, inclui hi- pertensão ocular e doenças oculares associadas com pressão intraocular elevada (IOP)1 tal como, glaucoma, inclusive glaucoma de tensão normal e glaucoma de ângulo aberto.

O termo "siRNA", como usado aqui, se refere a um RNA interfe-

rente de cadeia dupla, exceto onde observado em contrário. Tipicamente, um siRNA da invenção é uma molécula de ácido nucléico de cadeia dupla que compreende duas cadeias de nucleotídeo, sendo que cada cadeia pos- sui cerca de 19 a cerca de 28 nucleotídeos (ou seja, cerca de 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, ou 28 nucleotídeos). A frase "RNA interferente que possui um comprimento de 19 a 49 nucleotídeos", quando refere-se a um RNA in- terferente de cadeia dupla significa que as fitas antissenso e senso possuem independentemente um comprimento de cerca de 19 a cerca de 49 nucleotí- deos, inclusive as moléculas de RNA interferente onde as fitas senso e an- tissenso são conectados por uma molécula ligadora.

Além das moléculas de siRNA moléculas, outras moléculas de RNA interferente e moléculas tipo RNA pode interagir com RISC e silenciar a expressão genética. Exemplos de outras moléculas de RNA interferente que podem interagir com RISC incluem RNAs de pequeno grampo (shRNAs), siRNAs de cadeia simples, microRNAs (miRNAs), e substrato dicer 27-mero duplexes. Exemplos de moléculas tipo RNA que podem interagir com RISC incluem siRNA, siRNA de cadeia simples, microRNA, e moléculas de shRNA que contêm um ou mais nucleotídeos quimicamente modificados, um ou mais não-nucleotídeos, um ou mais desoxirribonucleotídeos, e/ou um ou mais ligações de não-fosfodiéster. Todas as moléculas de RNA ou tipo RNA que podem interagir com RISC e participam em alterações mediadas por RISC em expressão genética são referidas aqui como "RNAs ínterferentes" ou "moléculas de RNA interferente". Os SiRNAs, siRNAs de cadeia simples, shRNAs, miRNAs, e substrato dicer 27-mero duplexes são, portanto, sub- conjuntos de "RNA ínterferentes" ou "moléculas de RNA interferente molécu- las".

Foi verificado que o RNA interferente de cadeia simples realiza o silenciamento de mRNA, apesar de menos eficientemente do que o RNA de cadeia dupla. Portanto,as modalidades da presente invenção também pro- porcionam a administração de um RNA interferente de cadeia simples que possui uma região de complementaridade contígua pelo menos quase per- feita a uma parte da SEQ ID NO: 1. O RNA interferente de cadeia simples possui um comprimento de cerca de 19 a cerca de 49 nucleotídeos confor- me o RNA interferente de cadeia dupla citado acima. O RNA interferente de cadeia simples possui um 5' fosfato ou é fosforilado in situ ou in vivo na po- sição 5'. O termo "5' fosforilado" é usado para descrever, por exemplo, os polinucleotídeos ou oligonucleotídeos que possuem um grupo fosfato ligado através da ligação de éster a hidroxila C5 do açúcar (por exemplo, ribose, desoxirribose, ou um análogo desse) na extremidade 5' do polinucleotídeo ou oligonucleotídeo.

Os RNAs interferentes de cadeia simples podem ser quimica- mente sintetizados ou por transcrição in vitro ou expressos de forma endó- gena a partir de vetores ou cassetes de expressão como descrito aqui com referência aos RNAs interferentes de cadeia dupla. Os grupos 5' fosfato po- dem ser adicionados por meio de uma quinase, ou um 5' fosfato pode ser o resultado da clivagem de nuclease de um RNA. Um RNA interferente de grampo é uma molécula simples (por exemplo, uma cadeia de oligonucleotí- deo simples) que compreende tanto as fita senso como antissenso de um RNA interferente em uma estrutura tipo alça (stem-loop) ou grampo (por e- xemplo, a shRNA). Por exemplo, os shRNAs podem ser expressos a partir de vetores de DNA em que os oligonucleotídeos de DNA que codificam uma fita de RNA interferente sendo são ligados aos oligonucleotídeos de DNA que codificam a fita de RNA interferente antissenso complementar reversa por um pequeno espaçador. Se for necessário selecionar o vetor de expres- são, os Ts 3' terminal e nucleotídeos que formam os sítios de restrição po- dem ser adicionados. A transcrição de RNA resultante se dobra sobre si mesma para formar uma estrutura tipo alça.

As seqüências de ácido nucléico citadas aqui são escritas em uma direção 5' a 3', exceto onde indicado em contrário. O termo "ácido nu- cléico", como usado aqui, se refere tanto ao DNA como RNA ou uma forma modificada desse que compreende as bases de purina ou pirimidina presen- tes em DNA (adenina "A", citosina "C", guanina "G", timina "T") ou em RNA (adenina "A", citosina "C", guanina "G", uracila "U"). Os RNAs interferentes proporcionados aqui podem compreender bases "T", particularmente nas extremidades 3', mesmo que as bases "T" não ocorram naturalmente em RNA. "Ácido nucléico" inclui os termos "oligonucleotídeo" e "polinucleotídeo" e podem se referir a uma molécula de cadeia simples ou uma molécula de cadeia dupla. Uma molécula de cadeia dupla é formada por pareamento de bases Watson-Crick entre as bases AeT, bases C e G, e entre bases A e U. As fitas de uma molécula de cadeia dupla podem possuir complementari- dade parcial, substancial ou total uns aos outros e irão formar um híbrido dúplex, cuja resistência de ligação depende da natureza e grau de comple- mentaridade da seqüência de bases. A frase "seqüência alvo de DNA" como usado aqui se refere à

seqüência de DNA que é usada para derivar um RNA interferente da inven- ção. As frases "seqüência alvo de RNA", "seqüência alvo de RNA interferen- te", e "alvo de RNA" como usadas aqui se referem ao mRNA GREM1 ou à parte da seqüência de mRNA GREM1 que pode ser reconhecida por um RNA interferente da invenção, por meio disso o RNA interferente pode silen- ciar a expressão genética de GREM1 como discutido aqui. Uma "seqüência alvo de RNA", uma "seqüência alvo de siRNA", e um "alvo de RNA" são tipi- camente seqüências de mRNA que correspondem a uma parte de uma se- qüência de DNA. Uma seqüência de mRNA é facilmente deduzida a partir da seqüência de DNA correspondente. Por exemplo, a SEQ ID NO: 1 propor- ciona a seqüência de fita senso de DNA correspondente ao mRNA de GREM1. A seqüência de mRNA é idêntica à seqüência de fita senso de DNA com as bases "T" substituídas por bases "U". Portanto, a seqüência de mR- NA de GREM1 é conhecida a partir da SEQ ID NO: 1. Uma seqüência alvo nos mRNAs correspondentes à SEQ ID NO: 1 pode estar nas regiões 5' ou 3' não-traduzidas do mRNA bem como na região de codificação do mRNA.

Em algumas modalidades, as seqüências alvo de RNA interfe- rente (por exemplo, seqüências alvo de siRNA) dentro de uma seqüência de mRNA alvo são selecionadas utilizando ferramentas de desenho disponí- veis. Os RNAs interferentes correspondentes à seqüência alvo de GREM1 são, então, testados in vitro por meio de transfecção de células que expres- sam o mRNA alvo seguidos pela avaliação de restrição, como descrito aqui. Os RNAs interferentes podem ser adicionalmente avaliados in vivo utilizando modelos animais, como descrito aqui.

Proporcionam-se técnicas para selecionar seqüências alvo de siRNAs, por exemplo, por Tuschl, T. et ai, 'The siRNA User Guide", revisa- do em 6 de maio de 2004, disponível junto ao web site de Rockefeller Uni- versity; por Technical Bulletin #506, "siRNA Design Guidelines", Ambion Inc. no web site de Ambion; e por outras ferramentas de desenho baseadas em web, por exemplo, em Invitrogen, Dharmacon, Integrated DNA Technologies, Genscript, ou web sites de Proligo. Os parâmetros de pesquisa iniciais po- dem incluir teores de G/C entre 35% e 55% e comprimentos de siRNA entre 19 e 27 nucleotídeos. A seqüência alvo pode ser localizada na região de co- dificação ou nas regiões 5' ou 3' não-traduzidas do mRNA. As seqüências alvo podem ser usadas para derivar moléculas de RNA, tais como aquelas descritas aqui.

A Tabela 1 lista exemplos de seqüências alvo de DNA GREM1

da SEQ ID NO: 1 a partir das quais os siRNAs da presente invenção são desenhados da maneira estabelecida acima. GREM1 codifica gremlina, co- mo observado acima.

Tabela 1. Seqüências Alvo de GREM1 para siRNAs

Seqüências Alvo de GREM1 N0 de Nucleotídeo de Partida com referência à SEQ ID NO:1 SEQ ID NO: GCATGTGACGGAGCGCAAA 402 2 CATGTGACGGAGCGCAAAT 403 13 ATGTGACGGAGCGCAAATA 404 14 TGACGGAGCGCAAATACCT 407 15 Seqüências Alvo de GREM1 N0 de Nucleotídeo de Partida com referência à SEQ ID NO:1 SEQ ID NO: CGGAGCGCAAATACCTGAA 410 16 TGAAGCGAGACTGGTGCAA 425 17 AGCCGCTTAAGCAGACCAT 449 18 TTAAG CAG ACCATCCACG A 455 19 ACAGTCG CACC ATCATCAA 485 20 ACAGCCACCTACCAAGAAG 642 21 CAGCCACCTACCAAGAAGA 643 22 GTCGTTGCATATCCATCGA 686 23 GATTCTTACTTGGCTTAAA 784 24 TCAGTCTAATCTCTTGTTT 1230 25 GAAATGAGATTGCCAGAAA 1516 26 GCAATCTGCTCAAACCTAA 1554 27 GCCACTAACTTGATTGATA 1811 28 AGCATAGCATCATGATGTA 2101 29 GGCACTGTCCTCTGATTAA 2185 30 TACTGGCAATGGCTACTTA 2212 31 GCTACTTAGGATTGATCTA 2223 32 CTAGCCAAGTCCTATGTAA 2368 33 AGCCAAGTCCTATGTAATA 2370 34 ACTG C AG ACTTG AG ATTC A 2401 35 GAGATTCAGTTGCCGATCA 2412 36 AGATTCAGTTGCCGATCAA 2413 37 Seqüências Alvo de GREM1 N0 de Nucleotídeo de Partida com referência à SEQ ID NO:1 SEQ ID NO: AGGCGAATTTGTCCAAACA 2617 38 CCACATTCTCCAACAATAA 2692 39 CACATTCTCCAACAATAAA 2693 40 TTTAACTCTGCCACAAGAA 2862 41 CGTTAACGGAGATGACTTA 2889 42 GCCTATATTAAGACTAGTA 3084 43 GACTTACGATGCATGTATA 3733 44 GCATGTATACAAACGAATA 3743 45 C AAACG AATAG CAG ATAAT 3752 46 TGACTAGTTCACACATAAA 3773 47 GTGATCAGTTAATGCCTAA 3846 48 GAGTTGATAGTCTCATAAA 4004 49 GCTAAAGAGCÃACTÃATÃA 4099 50 GCCGGCTGCTGAAGGGAAA 216 51 AAGAAAGGGTCCCAAGGTG 235 52 AGAAAGGGTCCCAAGGTGC 236 53 CCAGACAAGGCCCAGCACA 265 54 AGACAAGGCCCAGCACAAT 267 55 GGCCCAGCACAATGACTCA 273 56 GCACAATGACTCAGAGCAG 279 57 CACAATGACTCAGAGCAGA 280 58 ACAATGACTCAGAGCAGAC 281 59 Seqüências Alvo de GREM1 N0 de Nucleotídeo de Partida com referência à SEQ ID NO:1 SEQ ID NO: GCCAAGAGGCCCTGCATGT 389 60 CAAGAGGCCCTGCATGTGA 391 61 TGCATGTGACGGAGCGCAA 401 62 GCAAATACCTGAAGCGAGA 416 63 GAAGCGAGACTGGTGCAAA 426 64 AAGCGAGACTGGTGCAAAA 427 65 TGCAAAACCCAGCCGCTTA 439 66 GCAAAACCCAGCCGCTTAA 440 67 GCAGACCATCCACGAGGAA 459 68 AGACCATCCACGAGGAAGG 461 69 CGAGGAAGGCTGCAACAGT 471 70 GAGGAAGGCTGCAACAGTC 472 71 GCACCATCATCAACCGCTT 491 72 TCATCAACCGCTTCTGTTA 497 73 CAGTG CAACTCTTTCTACA 520 74 GGCACATCCGGAAGGAGGA 545 75 GCACATCCGGAAGGAGGAA 546 76 AGTCCTGCTCCTTCTGCAA 575 77 GCTCCTTCTGCAAGCCCAA 581 78 TCTGCAAGCCCAAGAAATT 587 79 AAGCCCAAGAAATTCACTA 592 80 CCCAAGAAATTCACTACCA 595 81 Seqüências Alvo de GREM1 N0 de Nucleotídeo de Partida com referência à SEQ ID NO:1 SEQ ID NO: CCAAGAAATTCACTACCAT 596 82 AAGAAATTCACTACCATGA 598 83 AGAAATTCACTACCATGAT 599 84 ACTCAACTGCCCTGAACTA 624 85 TCAACTGCCCTGAACTACA 626 86 CTACAG CC ACCTACCAAG A 640 87 CCACCTACCAAGAAGAAGA 646 88 CTACCAAGAAGAAGAGAGT 650 89 ACCÃAGÃAGÃAGAGAGTCA 652 90 GAAGAAGAGAGTCACACGT 657 91 AGAAGAGAGTCACACGTGT 659 92 CGTGTGAAGCAGTGTCGTT 673 93 GTGAAGCAGTGTCGTTGCA 676 94 GAAGCAGTGTCGTTGCATA 678 95 AAGCAGTGTCGTTGCATAT 679 96 CGTTGCATATCCATCGATT 688 97 GTTGCATATCCATCGATTT 689 98

Como citado nos exemplos acima, um versado na técnica é ca-

paz de usar as informações de seqüência alvo fornecidas na Tabela 1 para projetar os RNAs interferentes que possuem um comprimento mais curto ou mais longo do que as seqüências proporcionadas na Tabela 1 ao referir-se à posição de seqüência na SEQ ID NO: 1 e adicionar ou deletar os nucleotí- deos complementares ou quase complementares à SEQ ID NO: 1.

Por exemplo, a SEQ ID NO: 2 representa um exemplo de uma seqüência alvo de DNA de 19 nucleotídeos para mRNA GREM1 presente nos nucleotídeos 402 a 420 da SEQ ID NO: 1:

5'- GCATGTGACGGAGCGCAAA -3' SEQ ID NO:2. Um siRNA da invenção para marcar uma seqüência de mRNA correspondente da SEQ ID NO:2 e possui cadeias de 21 nucleotídeos e um 3' ressalto de 2 nucleotídeos é:

5'- GCAUGUGACGGAGCGCAAANN -3' SEQ ID NO:3 3' -NNCGUACACUGCCUCGCGUUU -5' SEQ ID NO:4. Cada resíduo de "N" pode ser qualquer nucleotídeo (A, C, G, U, T) ou nucleotídeo modificado. A extremidade 3' pode possuir inúmeros resí- duos de "N" entre e inclusive 1, 2, 3, 4, 5, e 6. Os resíduos de "N" sobre ca- da cadeia pode ser o mesmo resíduo (por exemplo, UU, AA, CC1 GG1 ou TT) ou esses podem ser diferentes (por exemplo, AC, AG, AU, CA1 CG, CU, GA, GC, GU, UA1 UC1 ou UG). Os ressaltos 3' podem ser iguais ou podem ser diferentes. Em uma modalidade, ambas as cadeias possuem um ressalto 3'UU.

Um exemplo de um siRNA da invenção para marcar uma se- qüência de mRNA correspondente da SEQ ID NO:2 e possui cadeias de 21 nucleotídeos e um ressalto 3'UU sobre cada cadeia é: 5'- GCAUGUGACGGAGCGCAAAUU -3' SEQ ID NO:5

13 - UUCGUACACUGCCUCGCGUUU -5' SEQ ID NO:6. O RNA interferente também pode possuir um 5' ressalto de nu- cleotídeos ou esse pode possuir extremidades cegas. Um exemplo de um siRNA da invenção para marcar uma seqüência de for mRNA corresponden- te da SEQ ID NO:2 e possui cadeias de 19 nucleotídeos e extremidades ce- gas é:

5'- GCAUGUGACGGAGCGCAAA -3' SEQ ID NO:7

3'- CGUACACUGCCUCGCGUUU -5' SEQ ID NO:8.

As fitas de um RNA interferente de cadeia dupla (por exemplo, um siRNA) podem ser conectados para formar uma estrutura em grampo ou alça (por exemplo, um shRNA). Um exemplo de um shRNA da invenção que marca uma seqüência de mRNA correspondente da SEQ ID NO:2 e possui uma região tipo haste de cadeia dupla de 19 bp e um 3'UU ressalto é:

NNN

/ \

5'-GCAUGUGACGGAGCGCAAA N

3' -UUCGUACACUGCCUCGCGtJDU N SEQ ID NO: 9.

\ / NNN

N é um nucleotídeo A, T, C1 G, U, ou uma forma modificada co- nhecida por um versado na técnica. O número de nucleotídeos N na alça é um número entre e inclusive 3 a 23, ou 5 a 15, ou 7 a 13, ou 4 a 9, ou 9 a 11, ou o número de nucleotídeos N é 9. Alguns dos nucleotídeos na alça podem estar envolvidos em interações base-par com outros nucleotídeos na alça. Exemplos de seqüências de oligonucleotídeo que podem ser usadas para formar a alça incluem 5'-UUCAAGAGA-3' (Brummelkamp, T.R. et al. (2002) Science 296: 550) e 5'-UUUGUGUAG-3' (Castanotto, D. et al. (2002) RNA 8:1454). Será observado por um versado na técnica que o oligonucleo- tídeo de cadeia simples resultante forma uma estrutura tipo alça ou grampo que compreende uma região de cadeia dupla capaz de interagir com o me- canismo de RNAi.

A seqüência alvo de siRNA identificada acima pode ser estendi- da na extremidade 3' para facilitar o desenho de substrato dicer 27-mero duplexes. Por exemplo, a extensão da seqüência alvo de DNA de 19 nucleo- tídeos (SEQ ID NO:2) identificada na seqüência de DNA de GREM1 (SEQ ID NO: I) por 6 nucleotídeos produz uma seqüência alvo de DNA de 25 nu- cleotídeos presente em nucleotídeos 402 a 426 da SEQ ID NO: 1: 5'- GCATGTGACGGAGCGCAAATACCTG -3' SEQIDNO:10.

Um exemplo de um substrato dicer 27-mero duplexes da inven- ção para marcar uma seqüência de mRNA correspondente da SEQ ID NO: é:

5'- GCAUGUGACGGAGCGCAAAUACCUG -3' SEQ ID NO:11 3'UUCGUACACUGCCUCGCGUUUAUGGAC -51 SEQ ID NO:12.

Os dois nucleotídeos na extremidade 3' da fita senso (ou seja, os nucleotídeos GU da SEQ ID NO: 120) podem ser desoxinucleotídeos pa- ra processamento aprimorado. O desenho de substrato dicer 27-mero du- plexes de seqüências alvo de 19 a 21 nucleotídeos, tais como aquelas pro- porcionadas aqui, é adicionalmente discutido pelo website Integrated DNA Technologies (IDT) e por Kim, D.-H. et ai., (February, 2005) Nature Biotech- nology 23:2; 222-226.

A reação de clivagem de RNA alvo conduzida por siRNAs e ou-

tras formas de RNA interferente é altamente específica em seqüência. Por exemplo, em geral, uma molécula de siRNA contém uma fita de nucleotídeo senso idêntico em seqüência a uma parte do mRNA alvo e uma fita de nu- cleotídeo antissenso exatamente complementar a uma parte do alvo para inibição de expressão de mRNA. Entretanto, 100% de complementaridade de seqüência entre a fita de siRNA antissenso e o mRNA alvo, ou entre a fita de siRNA antissenso e a fita de siRNA senso, não são requeridos para prati- car a presente invenção, enquanto o RNA interferente pode reconhecer o mRNA alvo e silenciar a expressão do gene GREM1. Assim, por exemplo, a invenção permite variações de seqüência entre a fita antissenso e o mRNA alvo e entre a fita antissenso e a fita senso, inclusive as substituições de nu- cleotídeo que não afetam a atividade da molécula de RNA interferente, bem como variações que são esperadas devido à mutação genética, polimorfis- mo de cepas, ou divergência evolutiva, onde as variações não eliminam a identificação da fita antissenso no mRNA alvo.

Em uma modalidade da invenção, o RNA interferente da inven- ção possui uma fita senso e uma fita antissenso, e as fitas senso e antissen- so compreendem uma região de complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos. Em outra modalidade da in- venção, um RNA interferente da invenção possui uma fita senso e uma fita antissenso, e a fita antissenso compreende uma região de complementari- dade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos a uma seqüência avo de mRNA de GREM1, e a fita senso compreende uma região de identidade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com uma seqüência alvo de MRNA de GREM1, respectiva- mente. Em uma modalidade adicional da invenção, o RNA interferente com- preende uma região de pelo menos 13, 20 14, 15, 16, 17, ou 18 nucleotí- deos contíguos que possui porcentagens de complementaridade de seqüên- cia ou, possui porcentagens de identidade de seqüência com os penúltimos 13, 14, 15, 16, 17, ou 18 nucleotídeos, respectivamente, da extremidade 3' da seqüência alvo correspondente dentro de um mRNA. O comprimento de cada fita do RNA interferente compreende cerca de 19 a cerca de 49 nucleo- tídeos, e pode compreender um comprimento de cerca de 19, 20, 21, 22, 23, 24, 225, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, ou 49 nucleotídeos.

Em algumas modalidades, a fita antissenso de um RNA interfe- rente da invenção possui complementaridade contígua pelo menos quase perfeita de pelo menos 19 nucleotídeos com o mRNA alvo. "Quase perfeita", como usado aqui, significa que a fita antissenso do siRNA é "substancial- mente complementar", e a fita senso do siRNA é "substancialmente idêntico" a pelo menos uma parte do mRNA alvo. "Identidade", como conhecido por um versado na técnica, é o grau de afinidade de seqüência entre as seqüên- cias de nucleotídeo como determinado ao comparar a ordem e identidade de nucleotídeos entre as seqüências. Em uma modalidade, a fita antissenso de um siRNA que possui 80% e entre 80% até 100% de complementaridade, por exemplo, 85%, 90% ou 95% de complementaridade, à seqüência de mRNA alvo é considerado com uma complementaridade quase perfeita e pode ser usado na presente invenção. Complementaridade contígua "perfei- ta" é o pareamento de bases Watson-Crick padrão de pares de bases adja- centes. Complementaridade contígua "pelo menos quase perfeita" inclui complementaridade "perfeita", como usado aqui. Os métodos de computador para determinar a identidade ou complementaridade são designados para identificar o grau mais alto de compatibilidade de seqüências de nucleotídeo, por exemplo, BLASTN (Altschul, S.F., et al. (1990) J. Mol. Bioi 215:403- 410).

O termo "porcentagem de identidade" descreve a porcentagem de nucleotídeos contíguos em uma primeira molécula de ácido nucléico que é são os mesmos em um conjunto de nucleotídeos contíguos do mesmo comprimento em uma segunda molécula de ácido nucléico. O termo "por- centagem de complementaridade" descreve a porcentagem de nucleotídeos contíguos em uma primeira molécula de ácido nucléico que pode se empare- lhar no sentido Watson-Crick com um conjunto de nucleotídeos contíguos em uma segunda molécula de ácido nucléico.

A relação entre um mRNA alvo e uma fita de um siRNA (a fita

senso) é de identidade. A fita senso de um siRNA também é chamada de uma fita passageira, se presente. A relação entre um mRNA alvo e a outra fita de um siRNA (a fita antissenso) é de complementaridade. A fita antis- senso de um siRNA também é chamada de uma fita guia. Pode haver uma região ou regiões da fita de siRNA antissenso

que não é (são) complementar(es) a uma parte da SEQ ID NO: 1. As regiões não-complementares podem estar nas extremidades 3', 5' ou ambas de uma região complementar ou entre duas regiões complementares. Uma região pode ser uma ou mais bases. As fitas senso e antissenso em uma molécula de RNA interferen-

te também podem compreender nucleotídeos que não formam pares de ba- ses com a outra fita. Por exemplo, um ou ambas as fitas podem compreen- der nucleotídeos adicionais ou nucleotídeos que não se emparelham com um nucleotídeo naquela posição sobre a outra fita, de modo que uma saliên- cia ou uma incompatibilidade seja formada quando as fitas forem hibridiza- das. Assim, uma molécula de RNA interferente da invenção pode compre- ender fitas senso e antissenso que possuem incompatibilidades, oscilações G-U, ou saliências. As incompatibilidades, oscilações G-U, e saliências tam- bém podem ocorrer entre a fita antissenso e seu alvo (veja, por exemplo, Saxena et ai, 2003, J. Biol. Chem.278:44312-9).

Uma ou ambas os fitas de RNA interferente de cadeia dupla po- dem possuir um ressalto 3' de 1 a 6 nucleotídeos, esses podem ser ribonu- cleotídeos ou desoxirribonucleotídeos ou uma mistura desses. Os nucleotí- deos do ressalto não possuem bases pareadas. Em uma modalidade da in- venção, o RNA interferente compreende um ressalto 3' de TT ou UU. Em outra modalidade da invenção, o RNA interferente compreende pelo menos uma extremidade cega. As terminações geralmente possuem um grupo 5' fosfato ou um grupo 3' hidroxila. Em outras modalidades, a fita antissenso possui um grupo 5' fosfato, e a fita senso possui um grupo 5' hidroxila. Ainda em outras modalidades, as terminações são adicionalmente modificadas por adição covalente de outras moléculas ou grupos funcionais.

As fitas senso e antissenso do siRNA de cadeia dupla podem

estar em uma formação dúplex de duas cadeias simples, como descrito aci- ma ou podem ser uma molécula de cadeia simples onde as regiões de com- plementaridade possuem bases pareadas e são covalentemente ligadas por uma molécula Iigadora para formar um grampo quando as regiões forem hi- bridizadas umas às outras. Acredita-se que o grampo seja clivado de forma intracelular por uma proteína chamada dicer para formar um RNA interferen- te de duas moléculas de RNA individuais com bases pareadas. Uma molé- cula Iigadora também pode ser designada para compreender um sítio de restrição que pode ser clivado in vivo ou in vitro por uma nuclease particular. Em uma modalidade, a invenção proporciona uma molécula de

RNA interferente que compreende uma região de pelo menos 13 nucleotí- deos contíguos que possuem pelo menos 90% de complementaridade de seqüência, ou pelo menos 90% de identidade de seqüência aos penúltimos 13 nucleotídeos da extremidade 3" de um mRNA correspondente a um alvo de DNA, que permite uma substituição de nucleotídeo dentro da região. Du- as substituições de nucleotídeo (ou seja, 11/13 = 85% de identidade/ com- plementaridade) não estão incluídas em tal frase. Em outra modalidade, a invenção proporciona uma molécula de RNA interferente que compreende uma região de pelo menos 14 nucleotídeos contíguos que possuem pelo menos 85% de complementaridade de seqüência, ou pelo menos 85% de identidade de seqüência aos penúltimos 14 nucleotídeos da extremidade 3' de um mRNA correspondente a um alvo de DNA. Duas substituições de nu- cleotídeo (ou seja, 12/14 = 86% de identidade/complementaridade) estão incluídas em tal frase. Em uma modalidade adicional, a invenção proporcio- na uma molécula de RNA interferente que compreende uma região de pelo menos 15, 16, 17, ou 18 nucleotídeos contíguos que possuem pelo menos 80% de complementaridade de seqüência, ou pelo menos 80% de identida- de de seqüência aos penúltimos 14 nucleotídeos da extremidade 3' de um mRNA correspondente a um alvo de DNA. Três substituições de nucleotídeo estão incluídas em tal frase.

A penúltima base em uma seqüência de ácido nucléico que é escrita em uma direção 5' a 3' é a próxima à última base, ou seja, a base próxima à base 3'. As 13 penúltimas bases de uma seqüência de ácido nu- cléico escrita em uma direção 5' a 3' são as últimas 13 bases de uma se- qüência próxima à base 3' e não inclui a base 3'. Similarmente, as penúlti- mas 14, 15, 16, 17, ou 18 bases de uma seqüência de ácido nucléico escrita em uma direção 5' a 3' são as últimas 14, 15, 16, 17, ou 18 bases de uma seqüência, respectivamente, próximas à base 3' e não incluem a base 3'.

Os RNAs interferentes podem ser gerados de forma exógena por síntese química, por transcrição in vitro, ou por clivagem de RNA de ca- deia dupla mais longa com dicer ou outra nuclease apropriada com atividade similar. Os RNAs interferentes quimicamente sintetizados, produzidos a par- tir de fosforamiditas de ribonucleosídeo protegidas utilizando um sintetizador de DNA/RNA convencional, podem ser obtidos a partir de fornecedores co- merciais, tais como, Ambion Inc. (Austin, TX), Invitrogen (Carlsbad, CA), ou Dharmacon (Lafayette, CO). Os RNAs interferentes podem ser purificados por extração com um solvente ou resina, precipitação, eletroforese, croma- tografia, ou uma combinação desses, por exemplo. Alternativamente, os RNAs interferente podem ser usados com pouca ou nenhuma purificação para evitar perdas devido ao processamento de amostra.

Quando os RNAs interferentes forem produzidos por síntese química, a fosforilação na posição 5' do nucleotídeo na extremidade 5' de uma ou ambas as fitas (quando presentes) pode aumentar a eficácia de siRNA e a especificidade do complexo RISC ligado, porém isso não é reque- rido uma vez que a fosforilação pode ocorrer de forma intracelular.

Os RNAs interferentes também podem ser expressos de forma endógena a partir de plasmídeo ou vetores de expressão viral ou de casse- tes de expressão mínimos, por exemplo, fragmentos gerados por PCR que compreendem um ou mais promotores e um modelo ou modelos apropria- dos para o RNA interferente. Exemplos de vetores de expressão baseados em plasmídeo comercialmente disponíveis para shRNA incluem elementos da série pSilencer (Ambion, Austin, TX) e pCpG-siRNA (InvivoGen, San Die- go, CA). Os vetores virais para a expressão de RNA interferente podem ser derivados de uma variedade de vírus inclusive adenovírus, vírus adeno- associado, lentivírus (por exemplo, HIV1 FIV1 e EIAV), e vírus da herpes. E- xemplos de vetores virais comercialmente disponíveis para a expressão de shRNA incluem pSilencer adeno (Ambion, Austin, TX) e pl_enti6BLOCK- iTTM-DEST (Invitrogen, Carlsbad, CA). A seleção de vetores virais, métodos para expressar o RNA interferente a partir do vetor e método para fornecer o vetor viral está dentro da habilidade do versado na técnica. Exemplos de kits para a produção de cassetes de expressão de shRNA gerados por PCR in- cluem Silencer Express (Ambion, Austin, TX) e siXpress (Miras, Madison, Wl).

Em algumas modalidades, um primeiro RNA interferente pode

ser administrado por expressão in vivo de um primeiro vetor de expressão capaz de expressar o primeiro RNA interferente e um segundo RNA interfe- rente pode ser administrado por expressão in vivo de um segundo vetor de expressão capaz de expressar o segundo RNA interferente, ou ambos os RNAs interferentes podem ser administrados por expressão in vivo de um único vetor de expressão capaz de expressar ambos os RNAs interferentes. Os RNAs interferentes adicionais podem ser administrados de maneira simi- lar (ou seja, por vetores de expressão separados ou por um único vetor de expressão capaz de expressar múltiplos RNAs interferentes). Os RNAs interferentes podem ser expressos a partir de uma va-

riedade de promotores eucarióticos conhecidos pelos versados na técnica, inclusive promotores pol III, tais como, promotores U6 ou H1, ou promotores pol II, tal como, o promotor de citomegalovírus. Os versados na técnica irão reconhecer que esses promotores também podem ser adaptados para per- mitir a expressão induzível do RNA interferente.

Em algumas modalidades da presente invenção, uma fita antis- senso de um RNA interferente se hibridiza com um mRNA in vivo como par- te do complexo RISC.

"Hibridização" se refere a um processo onde os ácidos nucléicos de cadeia simples com seqüências de base complementares ou quase com- plementares interagem para formar complexos ligados a hidrogênio chama- dos de híbridos. As reações de hibridização são sensíveis e seletivas. In vi- tro, a especificidade de hibridização (ou seja, severidade) é controlada pelas concentrações de sal ou formamida em soluções de pré-hibridização e hibri- dização, por exemplo, e pela temperatura de hibridização; tais procedimen- tos são bem conhecidos na técnica. Em particular, a severidade é aumenta- da ao reduzir a concentração de sal, aumentar a concentração de formami- da, ou elevar a temperatura de hibridização.

Por exemplo, poderiam ocorrer condições de alta severidade em cerca de 50% de formamida a 37°C a 42°C. Poderia ocorrer condições de severidade reduzida em cerca de 35% a 25% de formamida a 30°C a 35°C. Exemplos de condições de severidade de hibridização são fornecidos em Sambrook, J., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Exemplos adicionais de condições de hibridização severas incluem 400 mM de NaCI, 40 mM de Pl- PES pH 6,4, 1 mM de EDTA, 50°C ou 70°C durante 12 a 16 horas seguidos por lavagem, ou hibridização a 70°C em 1XSSC ou 50°C em 1XSSC, 50% de formamida seguidos por lavagem a 70°C em 0,3XSSC, ou hibridização a 70°C em 4XSSC ou 50°C em 4XSSC, 50% de formamida seguidos por lava- gem a 67°C em 1XSSC. A temperatura de hibridização é cerca de 5 a 10°C mais baixa que a temperatura de fusão (Tm) do híbrido onde Tm é determi- nada para híbridos entre 19 e 49 pares de base de comprimento utilizando o seguinte cálculo:

Tm 0C = 81,5 + 16,6(logio[Na+]) + 0,41 (% G+C) - (600/N) onde N é o número de bases no híbrido, e [Na+] é a concentração de íons de só- dio no tampão de hibridização. A análise de hibridização in vitro descrita acima proporciona um

método para prever se a ligação entre um siRNA candidato e um alvo possu- irá especificidade. Entretanto, no contexto do complexo RISC, a clivagem específica de um alvo também pode ocorrer com uma fita antissenso que não demonstra alta severidade para hibridização in vitro.

Os RNAs interferentes podem se diferir de RNA naturalmente ocorrente pela adição, deleção, substituição ou modificação de um ou mais nucleotídeos. O material de não-nucleotídeo pode ser ligado ao RNA interfe- rente, tanto na extremidade 5', a extremidade 3', ou internamente. Tais modi- ficações são comumente designadas para aumentar a resistência da nucle- ase dos RNAs interferentes, para aprimorar a absorção celular, para aprimo- rar a marcação celular, para ajudar a identificar o RNA interferente, ainda para aprimorar a estabilidade, ou para reduzir o potencial de ativação da rota de interferon. Por exemplo, os RNAs interferentes podem compreender um nucleotídeo de purina nas extremidades de ressaltos. A conjugação de co- Iesterol com a extremidade 3' da fita senso de uma molécula de siRNA por meio de um Iigante de pirrolidina, por exemplo, também proporciona estabili- dade a um siRNA.

As modificações adicionais incluem uma molécula de biotina 3' terminal, um peptídeo conhecido por possuir propriedades de penetração celular, uma nanopartícula, um peptidomimético, um corante fluorescente, ou um dendrímero, por exemplo. Os nucleotídeos podem ser modificados sobre sua parte de ba-

se, sobre sua parte de açúcar, ou sobre a parte de fosfato da molécula e funcionam nas modalidades da presente invenção. As modificações incluem substituições por grupos alquila, alcóxi, amino, deaza, halo, hidroxila, tiol, ou uma combinação desses, por exemplo. Os nucleotídeos podem ser substitu- idos por análogos com maior estabilidade, tal como, substituindo um ribonu- cleotídeo por um desoxirribonucleotídeo, ou com modificações de açúcar, tais como, grupos 2' OH substituídos por grupos 2' amino, grupos 2' O- metila, grupos 2' metoxietila, ou uma ponte de 2-0, 4'-C metileno, por e- xemplo. Exemplos de um análogo de purina ou pirimidina de nucleotídeos incluem xantina, hipoxantina, azapurina, metiltioadenina, 7-deaza-adenosina e nucleotídeos modificados por O e Ν. O grupo fosfato do nucleotídeo pode ser modificado ao substituir um ou mais dos oxigênios do grupo fosfato por nitrogênio ou enxofre (fosforotioatos). As modificações são úteis, por exem- plo, para aprimorar a função, para aperfeiçoar a estabilidade ou permeabili- dade, ou para dirigir a localização ou marcação.

ção compreende pelo menos uma das modificações, como descrito acima.

farmacêuticas (também referidas aqui como "composições") que compreen- dem uma molécula de RNA interferente da invenção. As composições far- macêuticas são formulações que compreendem RNAs interferentes, ou sais desses, da invenção até 99% por peso misturados com um meio de veículo fisiologicamente aceitável, inclusive aquelas descritas abaixo, e tais como, água, tampão, salina, glicina, ácido hialurônico, manitol, e similares. Os RNAs interferentes da presente invenção são administrados como soluções, suspensões, ou emulsões. Os seguintes são exemplos de formulações de composição farmacêutica que podem ser usados nos métodos da invenção. RNA Interferente Quantidade em % de peso

Em algumas modalidades, uma molécula interferente da inven-

Em algumas modalidades, a invenção proporciona composições

até 99; 0,1-99; 0,1 - 50;

Cloreto de sódio

Cloreto de Benzalcônio

EDTA

NaOH/HCI

Hidroxipropilmeticelulose

0,5-10,0 0,5 0,8 0,01 0,01

RNA interferente

Água Purificada (isenta de Rnase)

qs pH 7,4 qs 100 mL Quantidade em % de peso

até 99; 0,1-99; 0,1 - 50; 0,5 - 10,0

Salina Tamponada com Fosfato Cloreto de Benzalcônio Polissorbato 80

1,0 0,01 0,5

Água Purificada (isenta de RNase) RNA interferente

Quantidade em % de peso até 99; 0,1-99; 0,1 - 50; 0,5 - 10,0

q.s. a 100% Fosfato de sódio monobásico 0,05

Fosfato de sódio dibásico 0,15

(anidroso)

Cloreto de sódio 0,75

EDTA Dissódico 0,05

CremophorEL 0,1

Cloreto de benzalcônio 0,01

HCI e/ou NaOH pH 7,3-7,4

Água purificada (isenta de RNase) q.s. a 100%

RNAinterferente Quantidade em % de peso

até 99; 0,1-99 ; 0,1 - 50; 0,5 - 10,0 Salina Tamponada com Fosfato 1,0

Hidroxipropil-p-ciclodextrina 4,0

Água purificada (isenta de RNase) q.s. a 100%

Como usado aqui, o termo "quantidade eficaz" se refere à quan-

tidade de RNA interferente ou uma composição farmacêutica que compre- ende um RNA interferente determinado para produzir uma resposta terapêu- tica em um mamífero. Tais quantidades terapeuticamente eficazes são fa- cilmente verificadas por um versado na técnica e utilizando os métodos, co- mo descrito aqui.

Geralmente, uma quantidade eficaz dos RNAs interferentes da invenção resulta em uma concentração extracelular na superfície da célula alvo de 100 pM a 1000 nM, ou de 1 nM a 400 nM, ou de 5 nM a cerca de 100 nM, ou cerca de 10 nM. A dose requerida para obter essa concentração local irá variar dependendo de inúmeros fatores inclusive o método de en- trega, o sítio de entrega, o número de camadas celulares entre o sítio de entrega e a célula ou tecido alvo, se a entrega for local ou sistêmica, etc. A concentração no sítio de entrega pode ser consideravelmente maior que na superfície da célula ou tecido alvo. As composições tópicas podem ser Iibe- radas na superfície do gene alvo, tal como, no olho, uma a quatro vezes por dia, ou em um programa de entrega prolongada, tal como, diariamente, se- manalmente, quinzenalmente, mensalmente, ou por mais tempo, de acordo com o critério rotineiro de um clínico. O pH da formulação é cerca de pH 4,0 a cerca de pH 9,0, ou cerca de pH 4,5 a cerca de pH 7,4.

Uma quantidade eficaz de uma formulação pode depender de fatores, tais como, a idade, raça, e sexo do indivíduo, a taxa de renovação de transcrição/proteína de gene alvo, a potência do RNA interferente, e a estabilidade do RNA interferente, por exemplo. Em uma modalidade, o RNA interferente é distribuído de forma tópica a um órgão alvo e atinge o tecido que contém mRNA de GREM1, tal como, a rede trabecular, retina ou disco ótico em uma dose terapêutica, aperfeiçoando assim o processo da doença associada a GREM1.

Espera-se que o tratamento terapêutico de pacientes com RNAs interferentes dirigido contra mRNA de GREM1 seja benéfico sobre tratamen- tos de pequena molécula ao aumentar a duração de ação, permitindo assim dosagem menos freqüente e maior adesão do paciente, e ao aumentar a especificidade alvo, reduzindo assim os efeitos colaterais. Um "veículo acei- tável", como usado aqui, se refere àqueles veículos que causam no máximo, pouca ou nenhuma irritação ocular, proporcionam conservação adequada, se necessário, e entregam um ou mais RNA interferentes da presente inven- ção em uma dosagem homogênea. Um veículo aceitável para administração de RNA interferente de modalidades da presente invenção incluem reagen- tes de transfecção baseada em lipídeo catiônico TranslT®>-TKO (Minis Corporation, Madison, Wl), LIPOFECTIN®, Lipofectamina, OLIGOFECTA- MINE® (Invitrogen, Carlsbad, CA), ou DHARMAFECT® (Dharmacon, Lafa- yette, CO); policátions, tais como polietilenoimina; peptídeos catiônicos, tais como, Tat, poliarginina, ou Penetratina (peptídeo Antp); nanopartículas; ou lipossomas. As Iipossomas são formadas a partir de lipídeos formadores de vesicular padrão e um esterol, tal como, colesterol, e podem incluir uma mo- lécula de marcação, tal como, um anticorpo monoclonal que possui afinidade de ligação com antígenos de superfície celular, por exemplo. Ademais, as lipossomas podem ser lipossomas PEGuiladas.

Os RNAs interferentes podem ser entregues em solução, em suspensão, ou em dispositivos de entrega bioerodíveis ou não-bioerodíveis. Os RNAs interferentes podem ser entregues sozinhos ou como componen- tes de conjugados covalentes definidos. Os RNAs interferentes também po- dem ser complexados com lipídeos catiônicos, peptídeos catiônicos, ou po- límeros catiônicos; complexados com proteínas, proteínas de fusão, ou do- mínios de proteína com propriedades de ligação de ácido nucléico (por e- xemplo, protamina); ou encapsulados em nanopartículas ou lipossomas. A entrega específica de tecido ou célula pode ser realizada pela inclusão de uma porção de marcação apropriada, tal como, um anticorpo ou fragmento de anticorpo. O RNA interferente pode ser entregue por meio de aerossol, administração bucal, dérmica, intradérmica, inalante, intramuscular, intrana- sal, intraocular, intrapulmonar, intravenosa, intraperitoneal, nasal, ocular, oral, ótica, parenteral, emplastro, subcutânea, sublingual, tópica, ou trans- dérmica, por exemplo.

Em algumas modalidades, o tratamento de doenças oculares com moléculas de RNA interferente é realizado pela administração de uma molécula de RNA interferente diretamente ao olho. A administração local ao olho é vantajosa por inúmeras razões, que incluem: a dose pode ser menor do que a entrega sistêmica, e há menos chance de as moléculas silenciarem o alvo genético em tecidos além do olho. Inúmeros estudos mostraram entrega in vivo bem-sucedida e

eficaz de moléculas de RNA interferente ao olho. Por exemplo, Kim et al. demonstraram que a injeção subconjuntival e entrega sistêmica de siRNAs que marca gene de rota VEGF inibiu angiogênese no olho de um camun- dongo (Kim et al., 2004, Am. J. Pathol. 165:2177-2185). Ademais, estudos mostraram que o siRNA entregue à cavidade vítrea pode se difundir por todo o olho, e é detectável até cinco dias após a injeção (Campochiaro, 2006, Gene Therapy 13:559-562).

O RNA interferente pode ser diretamente entregue ao olho por injeção de tecido ocular, tais como, injeções perioculares, conjuntivais, sub- tenonianas, intracamerais, intravítreas, intraoculares, sub-retinianas, subcon- juntivais, retrobulbares, ou intracanaliculares; por aplicação direta ao olho utilizando um cateter ou outro dispositivo de colocação, tal como, um pelete retiniano, inserto intraocular, supositório ou um implante que compreende um material poroso, não-poroso, ou gelatinoso; por gotas ou pomadas ocula- res tópicas; ou por um dispositivo de liberação lenta no fundo-de-saco ou implantado adjacente à esclera (transescleral) ou na esclera (intraescleral) ou dentro do olho. A injeção intracameral pode ser através da córnea na câmara anterior para permitir que o agente atinja a rede trabecular. A injeção intracanalicular pode ser dentro dos canais coletores venosos que drenam o canal de Schlemm ou no canal de Schlemm.

Para entrega oftálmica, um RNA interferente pode ser combina- do com conservantes oftalmologicamente aceitáveis, co-solventes, tensoati- vos, intensificadores de viscosidade, intensificadores de penetração, tam- pões, cloreto de sódio, ou água para formar uma suspensão ou solução of- tálmica aquosa e estéril. As formulações de solução podem ser preparadas ao dissolver o RNA interferente em um tampão aquoso isotônico fisiologica- mente aceitável. Ademais, a solução pode incluir um tensoativo aceitável para ajudar a dissolver o RNA interferente. Os agentes de construção de viscosidade, tais como, hidroximetil celulose, hidroxietil celulose, metilcelulo- se, polivinilpirrolidona, ou similares podem ser adicionados às composições da presente invenção para aprimorar a retenção do composto. Para preparar uma formulação de pomada oftálmica estéril, o

RNA interferente é combinado com um conservante em um veículo apropri- ado, tal como, óleo mineral, Ianolina líquida, ou petrolato branco. As formu- lações de gel oftálmico estéril podem ser preparadas ao suspender o RNA interferente em uma base hidrofílica preparada a partir da combinação de, por exemplo, CARBC>POL®-940 (BF Goodrich, Charlotte, NC), ou similares, de acordo com os métodos conhecidos na técnica. VISCOAT® (Alcon Labo- ratories, Inc., Fort Worth, TX) pode ser usado para injeção intraocular, por exemplo. Outras composições da presente invenção podem conter agentes intensificadores de penetração, tais como, cremephor e TWEEN® 80 (mono- Iaurato polioxetileno sorbitano, Sigma Aldrich1 St. Louis, MO), no caso de o RNA interferente ser menos penetrante no olho.

Em algumas modalidades, a invenção também proporciona um kit que inclui reagentes para atenuar a expressão de um mRNA, como citado aqui, em uma célula. O kit contém um siRNA ou um vetor de expressão de shRNA. Para siRNAs e vetores de expressão de shRNA não-virais, o kit também contém um reagente de transfecção ou outro veículo de entrega adequado. Para vetores de expressão de shRNA virais, o kit pode conter o vetor viral e/ou os componentes necessários para a produção de vetor viral (por exemplo, uma linhagem celular empacotadora bem como um vetor que compreende o modelo de vetor viral e vetores auxiliares adicionais para em- pacotamento). O kit também pode conter siRNAs de controle positivo e ne- gativo ou vetores de expressão de shRNA (por exemplo, um siRNA de con- trole de não-marcação ou um siRNA que marca um mRNA não-relacionado). O kit também pode conter reagentes para avaliar a restrição do gene alvo pretendido (por exemplo, iniciadores e sondas para PCR quantitativa para detectar o mRNA alvo e/ou anticorpos contra a proteína correspondente pa- ra western blots). Alternativamente, o kit pode compreender uma seqüência de siRNA ou uma seqüência de shRNA e as instruções e materiais necessá- rios para gerar o siRNA por meio de transcrição in vitro ou para construir um vetor de expressão de shRNA. Uma combinação farmacêutica em forma de kit é adicionalmente fornecida incluindo, em combinação embalada, um meio de veículo adaptado para receber um meio de recipiente em confinamento apertado com o mesmo e um primeiro meio de recipiente que inclui uma composição de RNA interferente e um veículo aceitável. Tais kits podem in- cluir ainda, se desejado, um ou mais entre vários componentes do kit farma- cêutico convencional, tais como, por exemplo, recipientes com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, recipientes adicionais, etc., como tornar-se-á óbvio para o versado na técnica. Instruções impressas, tanto como insertos ou como rótulos, indicando as quantidades dos componentes que serão administradas, indicações de administração, e/ou indicações para mistura dos componentes, também podem ser incluídas no kit. Os versados na técnica, devido à presente descrição, irão avali-

ar que modificações óbvias das modalidades descritas aqui podem ser feitas sem que se abandone o espírito e escopo da invenção. Todas as modalida- des descritas aqui podem ser realizadas e executadas sem experimentação indevida em consideração com a presente descrição. O escopo total da in- venção é apresentado na descrição e modalidades equivalentes dessa. O relatório descritivo não deve ser interpretado como uma limitação indevida do escopo total de proteção ao qual a presente invenção é conferida. Embo- ra uma modalidade particular da invenção seja mostrada e descrita, inúme- ras variações e modalidades alternativas irão ocorrer na técnica. Conse- quentemente, a invenção pode ser incorporada em outras formas específi- cas sem que se abandone seu espírito ou características essenciais. As mo- dalidades descritas devem ser consideradas em todos os aspectos apenas como ilustrativas e não restritivas. O escopo da invenção é, portanto, indica- do pelas reivindicações em anexo em vez de pela descrição anterior. Todas as alterações nas reivindicações que estão dentro do significado e âmbito de equivalência das reivindicações devem ser incluídas dentro de seu escopo. Ademais, todos os documentos publicados, patentes, e pedidos menciona- dos aqui estão incorporados por meio desse a título de referência, se apre- sentado em sua totalidade.

O seguinte exemplo, inclusive os experimentos realizados e re- sultados obtidos são proporcionados apenas para propósitos ilustrativos e não devem ser interpretados como uma limitação da invenção. Exemplo 1

RNA Interferente Especificamente para Silenciamento de Gremlina em Célu- las GTM-3

A transfecção de células GTM-3 foi realizada utilizando concen- trações in vitro padrão (0,1- 10 nM) de siRNAs de Gremlina ou siRNA #2 isento de RISC siCONTROL e reagente de transfecção DHARMAFECT® #1 (Dharmacon, Lafayette, CO). Todos os siRNAs foram dissolvidos em 1X tampão de siRNA, uma solução aquosa de 20 mM de KCI, 6 mM de HEPES (pH 7,5), 0,2 mM de MgCI2- As amostras de controle incluíram um controle de tampão onde o volume de siRNA foi substituído por um volume igual de 1X de tampão de siRNA (Nulo). Os siRNAs de Gremlina são RNAs interfe- rentes de cadeia dupla que possuem especificidade de seqüências de 19 nucleotídeos contidas dentro da seqüência de mRNA de Gremlina (derivada da SEQ ID NO:1). siGremlina #1 marcada SEQ ID NO: 63; siGremlina #2 marcada SEQ ID NO: 95; siGremlina #3 marcada SEQ ID NO: 85; siGremli- na #4 marcada SEQ ID NO: 51. O nível de mRNA de Gremlina foi determi- nado por qRT- PCR utilizando o Kit de Transcrição Reversa de cDNA de Alta Capacidade, Assays-On-Demand Gene Expression kits, TaqMan Universal PCR Master Mix1 e um Detector de Seqüência ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA). A expressão de mRNA de Gremlina foi norma- lizada para o nível de mRNA PPIB3, e é descrita com relação à expressão de Gremlina em células não-transfectadas (nulas). A expressão de proteína Gremlina foi determinada por western blot utilizando um anticorpo anti- Gremlina (Origem, San Diego, CA). Como mostrado na Figura 1, a transfec- ção com o siRNA de controle negativo isento de RISC causou um aumento de 25 a 50% na expressão de mRNA de Gremlina. Portanto, a normalização da expressão de Gremlina em células não-transfectadas provavelmente subestimou o efeito dos siRNAs específicos de Gremlina sobre a expressão de mRNA de Gremlina. Dos quatro siRNAs testados, siGremlina #2 apresen- tou o maior efeito sobre a expressão de mRNA de Gremlina, causando uma redução de aproximadamente 65% em 10 nM e uma redução < 50% em 1 e 0,1 nM, com relação às células não-transfectadas. Como mostrado na Figu- ra 2, a siGremlina #2 reduziu significativamente a expressão de proteína Gremlina, de acordo com os dados de qRT-PCR.

Deve ser entendido que a seguinte descrição enfatiza algumas modalidades específicas da invenção e que todas as modificações ou alter- nativas equivalentes a essa estão dentro do espírito e escopo da invenção como descrito nas reivindicações em anexo. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA <110> Alcon Manufacturing, Ltd.

Chatterton, Jon E. Clark, Abbot F.

<120> INIBIÇÃO DE GREMLINA MEDIADA POR RNAl PARA TRATAMENTO DE

CONDIÇÕES RELACIONADAS À IOP

<130> 3146 <160> 98 <170> Patente em versão 3.3 <210> <211> <212> 1 4175 DNA <213> Homo sapiens <400> 1 actcggtgcg ccttccgcgg accgggcgac ccagtgcacg gccgccgcgt cactctcggt 60 cccgctgacc ccgcgccgag ccccggcggc tctggccgcg gccgcactca gcgccacgcg 120 tcgaaagcgc aggccccgag gacccgccgc actgacagta tgagccgcac agcctacacg 180 gtgggagccc tgcttctcct cttggggacc ctgctgccgg ctgctgaagg gaaaaagaaa 240 gggtcccaag gtgccatccc cccgccagac aaggcccagc acaatgactc agagcagact 300 cagtcgcccc agcagcctgg ctccaggaac cgggggcggg gccaagggcg gggcactgcc 360 atgcccgggg aggaggtgct ggagtccagc caagaggccc tgcatgtgac ggagcgcaaa 420 tacctgaagc gagactggtg caaaacccag ccgcttaagc agaccatcca cgaggaaggc 480 tgcaacagtc gcaccatcat caaccgcttc tgttacggcc agtgcaactc tttctacatc 540 cccaggcaca tccggaagga ggaaggttcc tttcagtcct gctccttctg caagcccaag 600 aaattcacta ccatgatggt cacactcaac tgccctgaac tacagccacc taccaagaag 660 aagagagtca cacgtgtgaa gcagtgtcgt tgcatatcca tcgatttgga ttaagccaaa 720 tccaggtgca cccagcatgt cctaggaatg cagccccagg aagtcccaga cctaaaacaa 780 ccagattctt acttggctta aacctagagg ccagaagaac ccccagctgc ctcctggcag 840 gagcctgctt gtgcgtagtt cgtgtgcatg agtgtggatg ggtgcctgtg ggtgttttta 900 gacaccagag aaaacacagt ctctgctaga gagcactccc tattttgtaa acatatctgc 960 tttaatgggg atgtaccaga aacccacctc accccggctc acatctaaag gggcggggcc 1020 gtggtctggt tctgactttg tgtttttgtg ccctcctggg gaccagaatc tcctttcgga 1080 atgaatgttc atggaagagg ctcctctgag acatggaaaa gtccttttaa cctgtgcttg catctcttct taagttgata gtgactatgt aaattaattc acttaaccat gatgcaaatg tgggagaggc tggtgtgggc aaggacaagc gggtgaggcc aaatcaggtc cagcaaaagt caataccaga acacaggctg atgcttctga caagtgaaca gaggagaaat gagattgcca gctcaaacct aacaccaaac tgaaaacata gcaagttagc taaaccaaac caactcctct gtttagaact ctctgcatag gggtgggaat aatacctttc ctttatcgtg gttatagtca gcttctgaga gccactaact tgattgataa gtagtctaag atgagagagt ttagggacta ctttttgttt taactattgt caggagattg ataaagggaa ttgcctctgg ctagagagta gggatatgac ctccctttct ttatgtgctc agcatagcat catgatgtat tagctgttca gtaactattc agtatttact ggtaggcact tggctactta ggattgatct aagggccaaa ggatttggtt aacctgtttt cttcaagcct ctttttgcct tgtatcttct cagcctccta actgcagact tgagattcag ttgccgatca tcgagaagct gtttttattt cgtttttgtt aacaggagcc atttcaaggc gggagatatt caaactttta aactcactac tgatgattct tgtgtgtgtt ttgtatacac tgtatgaccc ccaacaataa agcacagagt ggatttaatt gggtgggaga gaagaaaagg gaaagaagct atgacattca gaaccagcaa acactgaatt tgcaatttcg ttaacggaga tgacttaagt taccacagtc ttgcacataa gtgcagattt

ggcaagagac ctgttttagt gctgcattcg 1140 catcctcctt tcctcctcct cctcacaatc 1200 cagtctaatc tcttgtttgc caaggttcct 1260 tttttcattt tgtgaagacc ctccagactc 1320 aggatagtgg agtgagaaag ggagggtgga 1380 cagtagggac attgcagaag cttgaaaggc 1440 gaaagtcttt tcctagtatt taacagaacc 1500 gaaagtgatt aactttggcc gttgcaatct 1560 aatactgacc actcctatgt tcggacccaa 1620 gctttgtccc tcaggtggaa aagagaggta 1680 taatcaaaaa cctcagaggc tgaaattcct 1740 gctcatttcc attccactat ttcccataat 1800 agatcctgcc tctgctgagt gtacctgaca 1860 ctctgtttta gcaagagata ttttgggggt 1920 ggctaaagag aagacgacga gagtaaggaa 1980 gttaggtgtt aatacctggt agagatgtaa 2040 actgaggatc tgaggggacc ctgttaggag 2100 tctgctactg gttggatgga cataactatt 2160 gtcctctgat taaacttggc ctactggcaa 2220 gtgcagggtg ggtgaacttt attgtacttt 2280 gaggttttat atacaaactc cctgaatact 2340 gccaagtcct atgtaatatg gaaaacaaac 2400 aggctctggc attcagagaa cccttgcaac 2460 ttgatccagt gctctcccat ctaacaacta 2520 ttaaacaccc aaaatgttgg gtctgatttt 2580 cacgctaggc gaatttgtcc aaacacatag 2640 caccccaaat ctttgtattg tccacattct 2700 aagcacacaa atgctaaggc agaattttga 2760 gaaaatgtaa aaccacacca gggaggaaaa 2820 tctcttgttg ttttaactct gccacaagaa 2880 tggcagcagt aatcttcttt taggagcttg 2940 ggctcaagta aagagaattt cctcaacact 3000 aacttcactg ggataatcag cagcgtaact gaaatatctg ttcttcttac tgtgcctata caactttcat tgaaaatgcc atatctatac tgatatattt tttcattatt atagtagaat tcatacctat taaaataatg ccaaacacca ttggcattaa aagaaaaaaa cacacatcct aggtcttcaa agttaagagt gtaagtgaaa tggaatgtga atagttaaat gaaaagttat ctttggtcac tgtgatttca agcatgtttt ttgggcaaag aagaagctga cacaccgtat aacaaaatct tgacccagct gaacatgtct taaattgaat gttccttaaa ggttaacatt gttattttgg aagacttacg atgcatgtat tcacacataa agtcctttta aggagaaaat tataagtgat cagttaatgc ctaagagtga ttaatatcaa ctgcattatg tattatgtct atatagacta tgaggtacct tgctgtgtag aaactaattt ggcttcaagt ttcatgaatc atgttctata tagcctttgc taaagagcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa <210> 2 <211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência alvo

<400> 2

gcatgtgacg gagcgcaaa <210> 3 <211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

accctaaaag catatcacta gccaaagagg 3060 ttaagactag tacaaatgtg gtgtgtcttc 3120 catattttat tcgagtcact gatgatgtaa 3180 atttttatgg caagatattt gtggtcttga 3240 aatatgaatt ttatgatgta cactttgtgc 3300 ggaagtctgt aagttgtttt ttgttactgt 3360 aatctggagg agaggataat ttccactgtg 3420 ggttatttaa tgtaattatt acttcaaatc 3480 ctttttctcc tttatatgac tttctctgag 3540 gttgttagag tcttttatct ggtcagggga 3600 tcctgagtca gtgcctgaat ctttattttt 3660 tctaaagcaa tattaagaaa gactttaaat 3720 acaaacgaat agcagataat gatgactagt 3780 ctaaaatgaa aagtggataa acagaacatt 3840 aagtagttct attgacattc ctcaagatat 3900 gcttaaatca tttaaaaacg gcaaagaatt 3960 gaggatgaaa ggggagttga tagtctcata 4020 tgtaactaga atttaatttt caccccaata 4080 ctaataaatt aaacctattc tttcaaaaaa 4140 aaaaa 4175

19 <220>

<223> cepa senso com 3'NN <220>

<221> mi sc_RNA

<222> (1)..(19)

<223> ribonucleotídeos <220>

<221> característica mista

<222> (20)..(21)

<223> any, A, τ/υ, C1 G

<400> 3

gcaugugacg gagcgcaaan η 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Cepa antissenso com 3'NN <220>

<221> mi sc_RNA

<222> (1)..(19)

<223> ribonucleotideos <220>

<221> característica mista

<222> (20)..(21)

<223> any, A, T/u, C, G

<400> 4

uuugcgcucc gucacaugcn η 21

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial 10

15

20

25

30

<220>

<223> Cepa senso

<400> 5 gcaugugacg gagcgcaaau u

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial <220>

<223> Cepa antissenso

<400> 6 uuugcgcucc gucacaugcu u

<210> 7

<211> 19

<212> RNA

<213> Artificial <220> <223> <400>

Cepa senso 7

gcaugugacg gagcgcaaa <210> 8

<211> <212> <213> <220> <223> <400>

19 RNA

Artificial

Cepa antissenso 8

uuugcgcucc gucacaugc <210> 9 <211> 48

<212> DNA

<213> Artificial

21

21

19

19 10

15

20

25

30

<220> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <400>

gcaugugacg <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>

gcatgtgacg <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>

gcaugugacg

Grampo dúplex com laço

mi sc_RNA

(1)..(19)

ri bonucleotideos

característica mista

(20)..(27)

any, A, T/u, c, G

característica mista (28)..(48) ri bonucleotideos

9

gagcgcaaan nnnnnnnuuu gcgcuccguc acaugcuu

10 25 DNA

Artificial

Cepa senso 10

gagcgcaaat acctg 11 25 RNA

Artificial

Cepa senso 11

gagcgcaaau accug

48

25

25 <210> 12 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Cepa antissenso <400> 12

cagguauuug cgcuccguca caugcuu 27

<210> IB <211> 19 <212> DNA

<213> Artificial

<220>

<22Β> Seqüência alvo

<400> 13

catgtgacgg agcgcaaat 19

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 14

atgtgacgga gcgcaaata 19

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 15 tgacggagcg caaatacct 19

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 16

cggagcgcaa atacctgaa 19

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 17

tgaagcgaga ctggtgcaa 19

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 18

agccgcttaa gcagaccat 19

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 19 ttaagcagac catccacga <210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 20 acagtcgcac catcatcaa

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 21 acagccacct accaagaag

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 22 cagccaccta ccaagaaga

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 23 gtcgttgcat atccatcga 19

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 24

gattcttact tggcttaaa 19

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 25

tcagtctaat ctcttgttt 19

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 26

gaaatgagat tgccagaaa 19

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 27 10

15

20

25

30

gcaatctgct <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>

gccactaact <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>

agcatagcat <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>

ggcactgtcc <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>

caaacctaa 28 19 DNA

Artificial

Seqüência alvo 28

tgattgata

29

19

DNA

Artificial

Seqüência alvo

29

catgatgta

30 19 DNA

Artifi ciai

Seqüência alvo

30

tctgattaa

31 19 DNA

Artificial

Seqüência alvo 31

19

19

19

19 tactggcaat ggctactta <210> 32

19

<211> <212> <213> <220> <223> <400>

19 DNA

Artificial

Seqüência alvo 32

10

gctacttagg attgatcta <210> 33

19

15

20

25

30

<211> <212> <213> <220> <223> <400>

ctagccaagt <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>

agccaagtcc

<210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

19 DNA

Artificial

Seqüência alvo

33

cctatgtaa

34 19 DNA

Artificial

Seqüência alvo

34

tatgtaata

35 19 DNA

Artificial Seqüência alvo

19

19 <400>

actgcagact <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> gagattcagt <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>

agattcagtt <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>

aggcgaattt <210> <211> <212> <213> <220> <223>

35

tgagattca

36 19 DNA

Artificial

Seqüência alvo

36

tgccgatca

37 19 DNA

Artificial

Seqüência alvo

37

gccgatcaa

38 19 DNA

Artifi ciai

Seqüência alvo

38

gtccaaaca

39 19 DNA

Artificial Seqüência alvo

19

19

19

19 10

15

20

25

30

<400> 39

ccacattctc caacaataa

<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>

40 19 DNA

Artifi ciai

Seqüência alvo 40

cacattctcc aacaataaa <210> 41

<211> <212> <213> <220> <223> <400>

19 DNA

Artificial

Seqüência alvo 41

tttaactctg ccacaagaa <210> 42

<211> <212> <213> <220> <223> <400>

19 DNA

Artificial

Seqüência alvo 42

cgttaacgga gatgactta <210> 43

<211> <212> <213> <220> <223>

19 DNA

Artificial Seqüência alvo

19

19

19

19 gacttacgat gcatgtata 19

15

20

25

30

<400> 43 gcctatatta agactagta <210> 44 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Seqüência <400> 44 gacttacgat gcatgtata <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Seqüência <400> 45 gcatgtatac aaacgaata <210> 46 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Seqüência <400> 46 caaacgaata gcagataat <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Seqüência

19

19

19 <400> 47

tgactagttc acacataaa 19

<210> 48

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 48

gtgatcagtt aatgcctaa 19

<210> 49

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 49

gagttgatag tctcataaa 19

<210> 50

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 50

gctaaagagc aactaataa 19

<210> 51

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo <400> 51

gccggctgct gaagggaaa 19

<210> 52

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 52

aagaaagggt cccaaggtg 19

<210> 53

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 53

agaaagggtc ccaaggtgc 19

<210> 54

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 54

ccagacaagg cccagcaca 19

<210> 55

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220> <223> Seqüência alvo

<400> 55

agacaaggcc cagcacaat 19

<210> 56

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 56

ggcccagcac aatgactca 19

<210> 57

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 57

gcacaatgac tcagagcag 19

<210> 58

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 58

cacaatgact cagagcaga 19

<210> 59

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220> <223> Seqüência alvo

<400> 59

acaatgactc agagcagac 19

<210> 60

<211> 19

<212> DNA

<21B> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 60

gccaagaggc cctgcatgt 19

<210> 61

<211> 19

<212> DNA

<21B> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 61

caagaggccc tgcatgtga 19

<210> 62

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 62

tgcatgtgac ggagcgcaa 19

<210> 63

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220> 10

15

20

25

30

<223> Seqüência alvo <400> 63

gcaaatacct gaagcgaga

<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>

64 19 DNA

Artificial

Seqüência alvo 64

gaagcgagac tggtgcaaa <210> 65

<211> <212> <213> <220> <223> <400>

19 DNA

Artificial

Seqüência alvo 65

aagcgagact ggtgcaaaa

<210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>

66 19 DNA

Artificial

Seqüência alvo 66

tgcaaaaccc agccgctta <210> 67

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

19

19

19

19 <223> Seqüência alvo

<400> 67

gcaaaaccca gccgcttaa 19

<210> 68

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 68

gcagaccatc cacgaggaa 19

<210> 69

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 69

agaccatcca cgaggaagg 19

<210> 70

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> seqüência alvo

<400> 70

cgaggaaggc tgcaacagt 19

<210> 71

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220> 10

15

20

25

30

<223> Seqüência alvo

<400> 71

gaggaaggct gcaacagtc <210> 72

19 DNA

Artificial

<211> <212> <213> <220> <22B> <400>

seqüência alvo 72

gcaccatcat caaccgctt <210> 73

<211> <212> <213> <220> <223> <400>

19 DNA

Artificial

Seqüência alvo 73

tcatcaaccg cttctgtta <210> 74

<211> <212> <213> <220> <223> <400>

19 DNA

Artificial

Seqüência alvo 74

cagtgcaact ctttctaca <210> 75

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

19

19

19

19 <223> Seqüência alvo

<400> 75

ggcacatccg gaaggagga 19

<210> 76

<211> 19

<212> DNA

<21B> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 76

gcacatccgg aaggaggaa 19

<210> 77

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 77

agtcctgctc cttctgcaa 19

<210> 78

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 78

gctccttctg caagcccaa 19

<210> 79

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220> <223> Seqüência alvo

<400> 79

tctgcaagcc caagaaatt 19

<210> 80

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 80

aagcccaaga aattcacta 19

<210> 81

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 81

cccaagaaat tcactacca 19

<210> 82

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 82

ccaagaaatt cactaccat 19

<210> 83

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220> <223> Seqüência alvo

<400> 83

aagaaattca ctaccatga 19

<210> 84

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 84

agaaattcac taccatgat 19

<210> 85

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 85

actcaactgc cctgaacta 19

<210> 86

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 86

tcaactgccc tgaactaca 19

<210> 87

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220> 10

15

20

25

30

<223> <400>

ctacagccac <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>

ccacctacca <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>

ctaccaagaa <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400>

accaagaaga <210> <211> <212> <213> <220>

Seqüência alvo

87

ctaccaaga

88 19 DNA

Artificial

Seqüência alvo 88

agaagaaga

89

19

DNA

Artificial

Seqüência alvo

89

gaagagagt

90 19 DNA

Artificial

Seqüência alvo

90

agagagtca

91 19 DNA

Artificial

19

19

19

19 <223> Seqüência alvo

<400> 91

gaagaagaga gtcacacgt 19

<210> 92

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 92

agaagagagt cacacgtgt 19

<210> 93

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 93

cgtgtgaagc agtgtcgtt 19

<210> 94

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 94

gtgaagcagt gtcgttgca 19

<210> 95

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220> <223> Seqüência alvo

<400> 95

gaagcagtgt cgttgcata 19

<210> 96

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 96

aagcagtgtc gttgcatat 19

<210> 97

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 97

cgttgcatat ccatcgatt 19

<210> 98

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Seqüência alvo

<400> 98

gttgcatatc catcgattt 19

Claims (45)

1. Método para tratar uma condição relacionada à IOP em um paciente necessitado desse, que compreende administrar ao paciente uma molécula de RNA interferente que atenua a expressão do mRNA de GREM1 através da interferência de RNA.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a molécula de RNA interferente possui cadeia dupla e cada cadeia possui independente- mente cerca de 19 a cerca de 27 nucleotídeos de comprimento.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, onde cada cadeia possui independentemente cerca de 19 nucleotídeos a cerca de 25 nucleotí- deos de comprimento.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, onde cada cadeia possui independentemente cerca de 19 nucleotídeos a cerca de 21 nucleotí- deos de comprimento.

5. Método, de acordo com a reivindicação 2, onde as fitas senso e antissenso são conectadas por um Iigante para formar um shRNA que po- de atenuar a expressão de mRNA de GREM1 em um paciente.

6. Método, de acordo com a reivindicação 2, onde a molécula de RNA interferente possui extremidades cegas.

7. Método, de acordo com a reivindicação 2, onde pelo menos uma fita da molécula de RNA interferente compreende um ressalto 3'.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, onde o ressalto 3' compreende cerca de 1 a cerca de 6 nucleotídeos.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, onde o ressalto 3' compreende 2 nucleotídeos.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a molécula de RNA interferente é administrada por via aerossol, bucal, dérmica, intra- dérmica, inalante, intramuscular, intranasal, intraocular, intrapulmonar, intra- venosa, intraperitoneal, nasal, ocular, oral, ótica, parenteral, adesivo, subcu- tânea, sublingual, tópica ou transdérmica.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a molécula de RNA interferente é administrada por uma expressão in vivo de um vetor de expressão capaz de expressar a molécula de RNA interferente.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde o paciente possui ou está em risco de desenvolver uma condição relacionada à IOP.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, onde a condição 5 relacionada à IOP é glaucoma.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a molécula de RNA interferente identifica uma parte de mRNA de GREM1 que corresponde a qualquer uma das SEQ ID N0:2, e SEQ ID NO: 13 - SEQ ID NO: 98.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a molécula de RNA interferente identifica uma parte de mRNA de GREM1, onde a parte compreende nucleotídeos 402, 403, 404, 407, 410, 425, 449, 455, 485, 642, 643, 686, 784, 1230, 1516, 1554, 1811, 2101, 2185, 2212, 2223, 2368, 2370, 2401, 2412, 2413, 2617, 2692, 2693, 2862, 2889, 3084, 3733, 3743, 3752, 3773, 3846, 4004, 4099, 216, 235, 236, 265, 267, 273, 279, 280, 2281, 389, 391, 401, 416, 426, 427, 439, 440, 459, 461, 471, 472, 491, 497, 520, 545, 546, 575, 581, 587, 592, 595, 596, 598, 599, 624, 626, 640, 646, 650, 652, 657, 659, 673, 676, 678, 679, 688, ou 689 da SEQ ID NO: 1.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a molécula de RNA interferente compreende pelo menos uma modificação.

17. Composição, de acordo com a reivindicação 1, onde a molé- cula de RNA interferente é um shRNA, um siRNA, ou um miRNA.

18. Método, de acordo com a reivindicação 1, onde a molécula de RNA interferente é administrada por uma via tópica, intravítrea, transes- cleral, periocular, conjuntival, subtenoniana, intracameral, sub-retiniana, subconjuntival, retrobulbar, ou intracanalicular.

19. Método para atenuar a expressão de um mRNA de GREM1 no olho de um paciente, que compreende administrar ao olho do paciente uma molécula de RNA interferente que infrarregula a expressão do mRNA de GREM1 por meio de um RNA interferente.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, onde a molécula de RNA interferente possui cadeia dupla e cada cadeia possui independen- temente cerca de 19 a cerca de 27 nucleotídeos de comprimento.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, onde cada ca- deia possui independentemente cerca de 19 nucleotídeos a cerca de 25 nu- cleotídeos de comprimento.

22. Método, de acordo com a reivindicação 20, onde cada ca- deia possui independentemente cerca de 19 nucleotídeos a cerca de 21 nu- cleotídeos de comprimento.

23. Método, de acordo com a reivindicação 20, onde as fitas senso e antissenso são conectados por um Iigante para formar um shRNA que pode atenuar a expressão de mRNA de GREM1 em um paciente.

24. Método, de acordo com a reivindicação 20, onde a molécula de RNA interferente possui extremidades cegas.

25. Método, de acordo com a reivindicação 20, onde pelo menos uma fita da molécula de RNA interferente compreende um ressalto 3'.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, onde o ressalto 3' compreende cerca de 1 a cerca de 6 nucleotídeos.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, onde o ressalto 3' compreende 2 nucleotídeos.

28. Método, de acordo com a reivindicação 19, onde a molécula de RNA interferente é administrada por via aerossol, bucal, dérmica, intra- dérmica, inalante, intramuscular, intranasal, intraocular, intrapulmonar, intra- venosa, intraperitoneal, nasal, ocular, oral, ótica, parenteral, emplastro, sub- cutânea, sublingual, tópica ou transdérmica.

29. Método, de acordo com a reivindicação 19, onde a molécula de RNA interferente é administrada por meio de expressão in vivo de um vetor de expressão capaz de expressar a molécula de RNA interferente.

30. Método, de acordo com a reivindicação 19, onde o paciente possui ou está e risco de desenvolver uma condição relacionada à IOP.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, onde a condição relacionada à IOP é glaucoma.

32. Método, de acordo com a reivindicação 19, onde a molécula de RNA interferente identifica uma parte do mRNA de GREM1 que corres- ponde a qualquer uma das SEQ ID NO:2, e SEQ ID NO: 13 - SEQ ID NO:98.

33. Método, de acordo com a reivindicação 19, onde a molécula de RNA interferente identifica uma parte do mRNA de GREM1, onde a parte compreende os nucleotídeos 402, 403, 404, 407, 410, 425, 449, 455, 485, 642, 643, 686, 784, 1230, 1516, 1554, 1811, 2101, 2185, 2212, 2223, 2368, 2370, 2401, 2412, 2413, 2617, 2692, 2693, 2862, 2889, 3084, 3733, 3743, 3752, 3773, 3846, 4004, 4099, 216, 235, 236, 265, 267, 273, 279, 280, 281, 389, 391, 401, 416, 426, 427, 439, 440, 459, 461, 471, 472, 491, 497, 520, 545, 546, 575, 581, 587, 592, 595, 596, 598, 599, 624, 626, 640, 646, 650, 652, 657, 659, 673, 676, 678, 679, 688, ou 689 da SEQ ID NO: 1.

34. Método, de acordo com a reivindicação 19, onde a molécula de RNA interferente é administrada por uma via tópica, intravítrea, transes- cleral, periocular, conjuntival, subtenoniana, intracameral, sub-retiniana, subconjuntival, retrobulbar, ou intracanalicular.

35. Método, de acordo com a reivindicação 19, onde a molécula de RNA interferente compreende pelo menos uma modificação.

36. Composição, de acordo com a reivindicação 19, onde a mo- lécula de RNA interferente é um shRNA, um siRNA, ou um miRNA.

37. Molécula de RNA interferente que possui um comprimento de cerca de 19 a cerca de 49 nucleotídeos, sendo que a molécula de RNA interferente compreende: (a) uma região de pelo menos 13 nucleotídeos contíguos que possuem pelo menos 90% de complementaridade de seqüência, ou pelo menos 90% de identidade de seqüência aos 13 penúltimos nucleotídeos da extremidade 3' de um mRNA correspondente a qualquer uma das SEQ ID NO:2,e SEQ ID NO: 13-SEQ ID NO: 98; (b) uma região de pelo menos 14 nucleotídeos contíguos que possuem pelo menos 85% de complementaridade de seqüência ou pelo menos 85% de identidade de seqüência aos 14 penúltimos nucleotídeos da extremidade 3' de um mRNA correspondente a qualquer uma das SEQ ID NO:2, e SEQ ID NO: 13 - SEQ ID NO: 98; ou (c) uma região de pelo menos 15, 16, 17, ou 18 nucleotídeos contíguos que possuem pelo menos 80% de complementaridade de se- quência, ou pelo menos 80% de identidade de seqüência aos penúltimos 15, -16, 17, ou 18 nucleotídeos, respectivamente, da extremidade 3' de um mR- NA correspondente a qualquer uma das SEQ ID NO:2, e SEQ ID NO: 13 - SEQ ID NO: 98.

38. Molécula de RNA interferente, de acordo com a reivindicação -37, onde a molécula de RNA interferente identifica uma parte de mRNA de GREM1 que corresponde a qualquer uma das SEQ ID NO:2, D NO: 13 - SEQ ID NO: 98.

39. Molécula de RNA interferente, de acordo com a reivindicação -37, onde a molécula de RNA interferente identifica uma parte de mRNA de GREM1, onde a parte compreende nucleotídeos 402, 403, 404, 407, 410, -425, 449, 455, 485, 642, 643, 686, 784, 1230, 1516, 1554, 1811, 2101, 2185, -2212, 2223, 2368, 2370, 2401, 2412, 2413, 2617, 2692, 2693, 2862, 2889, -3084, 3733, 3743, 3752, 3773, 3846, 4004, 4099, 216, 235, 236, 265, 267, - 273, 279, 280, 281, 389, 391, 401, 416, 426, 427, 439, 440, 459, 461, 471, -472, 491, 497, 520, 545, 546, 575, 581, 587, 592, 595, 596, 598, 599, 624, -626, 640, 646, 650, 652, 657, 659, 673, 676, 678, 679, 688, ou 689 da SEQ ID NO: 1.

40. Composição, de acordo com a reivindicação 37, onde a mo- lécula de RNA interferente é um shRNA, um siRNA, ou um miRNA.

41. Método, de acordo com a reivindicação 37, onde a molécula de RNA interferente compreende pelo menos uma modificação.

42. Método, de acordo com a reivindicação 37, onde a molécula de RNA interferente possui cadeia dupla, e onde pelo menos uma fita de molécula de RNA compreende um ressalto 3'.

43. Método, de acordo com a reivindicação 42, onde o ressalto -3' compreende cerca de 1 a cerca de 6 nucleotídeos.

44. Método, de acordo com a reivindicação 43, onde o ressalto -3' compreende 2 nucleotídeos.

45. Método, de acordo com a reivindicação 37, onde a molécula de RNA interferente possui cadeia dupla, e a molécula de RNA interferente possui extremidades cegas.