KR20090042297A

KR20090042297A - ＩＯＰ―관련 증상을 치료하기 위한 그렘린의 ＲＮＡｉ 매개 억제

Info

Publication number: KR20090042297A
Application number: KR1020097004684A
Authority: KR
Inventors: 존 이. 차터톤; 애보트 에프. 클라크
Original assignee: 알콘 리서치, 리미티드
Priority date: 2006-08-24
Filing date: 2007-08-24
Publication date: 2009-04-29
Also published as: CA2659464A1; US20080051361A1; AU2007286545A1; WO2008024983A2; WO2008024983A3; CN102743767A; US20100305193A1; MX2009001896A; BRPI0715821A2; ZA200900553B; JP2010501188A; CN101517081A; US20120077864A1; EP2059597A2

Abstract

안내압-관련 증상, 이를 테면 고안압증 및 정상안압 녹내장 및 개방각 녹내장을 포함하는 녹내장에서 그렘린을 억제하도록 RNA 간섭이 제공된다.

Description

ＩＯＰ―관련 증상을 치료하기 위한 그렘린의 ＲＮＡｉ 매개 억제{RNAI-MEDIATED INHIBITION OF GREMLIN FOR TREATMENT OF IOP-RELATED CONDITIONS}

본 출원은 그 내용이 본원에 참고로 자세히 인용되는 2006년 8월 24일자 출원된 미국 가특허 출원 제 60/839,826호의 이점을 청구한다.

본 발명은 안내압 (IOP)-관련 증상, 이를 테면 고안압증 및 정상안압 녹내장 및 개방각 녹내장을 포함하는 녹내장에서 단백질 그렘린(gremlin)의 발현을 억제하기 위한 간섭 RNA 조성물 분야에 관한 것이다.

녹내장은 특정의 임상적 특징을 공유하는 시신경병증의 이질적 그룹이다. 녹내장에서의 시력 손상은 시야 특징적 변화, 신경 섬유층 결손 및 시신경유두(optic nerve head; ONH)의 점진적 함몰에 의해 임상적으로 진단되는 신경 망막에서의 망막 신경절 세포의 선택적인 사멸에 기인한다. 녹내장의 진행을 위한 주요 위험 인자 중 하나는 고안압증(상승된 안압)의 존재이다. 적당한 안압은 눈의 모양을 유지하며, 무혈관 각막 및 수정체로 안방수(aqueous humor)의 흐름을 위한 압력 구배를 제공하기 위하여 필요하다. 또한 IOP 수준은 IOP 저하 약제로부터 효과를 얻은 환자가 증명하듯이, 정상 안압 녹내장(normal tension glaucoma; NTG)의 발병 기전과도 관련있다. NTG 환자에서 중심 각막 두께의 조정이 IOP로 판독되는 경우, 이러한 환자의 다수가 고안압증으로 밝혀졌다.

녹내장과 관련된 상승된 IOP는 안구 전방 챔버의 홍채-각막 각에 위치하는 특수화된 작은 조직인, 소주망(trabecular meshwork; TM)에서 증가된 안방수 유출에 대한 저항에서 기인한다. TM에 대한 녹내장성 변화는 TM 세포 손실 및 단백질성 플라그 유사물질을 포함하는 세포외 파편의 침착 및 축적을 포함한다. 더불어, 녹내장성 ONH에서 발생하는 변화가 존재한다. 녹내장성 눈에서는 ONH 아교 세포에서의 형태학적 및 이동성 변화가 있다. 상승된 IOP 및/또는 일과성 허혈 발작에 대응하여, ONH 세포외 기질 조성의 변화 및 아교 세포 및 망막 신경절 세포 축삭 형태학에서의 변질이 있다.

원발성 녹내장은 해부학적 또는 생리학적 근거를 갖는 안구액 흐름의 방해로부터 기인한다. 속발성 녹내장은 눈에 대한 상처 또는 외상, 또는 앞서 존재했던 질환의 결과로 발생한다. 또한 만성적 또는 단순한 녹내장으로 알려진 원발성 개방우각 녹내장(Primary open-angle glaucoma; POAG)은 모든 원발성 녹내장의 대부분을 나타낸다. POAG는 소주망의 변성을 특징으로 하며, 이러한 소주망의 변성은 눈으로부터의 액체 분비에 대하여 비정상적으로 큰 저항을 유발한다. 이러한 저항의 결과로 IOP가 상승되고, 눈에서 정상적으로 생산된 액체를 증가된 저항에 대하여 구동하는 것이 요구된다.

2003년 7월 10일자에 제 WO 03/055443호로 공개된 PCT 출원 제 PCT/US02/35251호는 녹내장의 조기 진단, 녹내장의 치료 및 이의 유용한 화합물의 동정에 관한 것이다. 여기에는 BMP2 작용제, BMP4 작용제, BMP5 작용제, BMP7 작 용제, Smad 1-5 작용제, 초르딘(chordin) 길항제, 그렘린 길항제 및 폴리스태틴(follistatin) 길항제로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나의 화합물로 구성된 서열을 포함하는 조성물을 이를 요하는 환자에 투여하여, 녹내장을 치료하는 방법이 제공된다. 간섭 RNA의 사용에 대한 교시 또는 제안이 PCT 공보 제 WO 03/055443호에 제공되지 않았다.

현재 행해지는 항-녹내장 치료는 안방수 형성 억제제 또는 포도공막 유출 증진제, 배수를 증진시켜 주는 여과 수술인 섬유주절제술(trabeculectomy), 또는 레이저 섬유주 성형술(laser trabeculoplasty)을 이용함으로써 IOP를 낮추는 것을 포함한다. 약학적인 항-녹내장의 접근은 원치 않는 다양한 부작용을 나타낸다. 예를 들어 필로카르핀(pilocarpine)과 같은 축동제는 시야의 침침함 및 다른 부정적인 시야 부작용을 유발할 수 있다. 또한, 전신적으로 투여된 CAI(탄산탈수효소저해제: carbonic anhydrase inhibitors)는 구토, 소화불량, 피로 및 대사성 산성을 유발할 수도 있다. 더 나아가 특정 베타-차단제는 폐조직의 베타-2 수용체에서 그들의 효과에 기인한 심각한 폐의 부작용과도 관련 있다. 교감신경약물(sympathomimetics)은 빈맥, 부정맥 및 고혈압을 유발한다. 이러한 부정적인 부작용은 환자의 순응도를 감소시키거나 치료의 종결을 유발할 수 있다. 게다가, 현재 IOP 감소 치료의 효능은 상대적으로 일시적이며, 매일 반복적인 투여가 요구되며, 일부 경우에 시간 경과와 동시에 효능이 감소된다.

녹내장에서 고안압증의 중요성과 앞선 치료 방법의 부족함에 따라, 녹내장 진행의 근원적인 원인을 다루는 고안압증의 개선된 치료 방법이 요망된다.

발명의 요약

본 발명은 GREM1 mRNA 발현을 침묵시키고, 이에 따라, 그렘린이 IOP 증가와 관련된 적어도 일부의 인자(이를 테면 TGFβ)를 차단하는 골 형성 단백질(bone morphogenic protein)에 갖는 길항 효과를 제거하는 간섭 RNA를 제공한다. 따라서, GREM1 mRNA 발현을 침묵시키면, IOP-관련 증상을 지닌 환자에서 안내압의 감소가 유발된다. 본 발명의 간섭 RNA는 고안압증 및 녹내장, 이를 테면 정상안압 녹내장 및 개방각 녹내장이 있는 환자를 치료하는 데 유용하다.

본 발명은 또한 대상에서 GREM1 mRNA의 발현을 약화시키는 방법을 제공한다. 일면에서, 상기 방법은 19개 내지 49개 뉴클레오티드 길이를 갖는 간섭 RNA의 유효량 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함한다. 또다른 면에서, 인간에서 GREM1의 발현을 약화시키기 위하여 대상의 눈에 투여된다.

일 면에서, 본 발명은 GREM1(GenBank 수탁 번호 NM_013372)을 코딩하는 센스 cDNA 서열인 서열 번호 1에 상응하는 mRNA의 부분을 인식할 수 있는 영역을 포함하는 간섭 RNA를 대상의 눈에 투여하는 것을 포함하고, 이에 따라 GREM1 mRNA의 발현을 약화시켜, 대상의 눈에서 GREM1 mRNA의 발현을 약화시키는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 서열 번호 1의 부분에 상응하는 mRNA의 부분을 인식할 수 있는 영역을 포함하는 간섭 RNA를 대상의 눈에 투여하는 것을 포함하고, 이에 따라 GREM1 mRNA의 발현을 약화시켜, 이를 요하는 대상에서 IOP-관련 증상을 치료하는 방법을 제공한다.

특정 면에서, 본 발명의 간섭 RNA는 서열 번호 1의 부분에 상응하는 mRNA를 표적으로 하도록 설계되며, 여기에서 상기 부분은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 402, 403, 404, 407, 410, 425, 449, 455, 485, 642, 643, 686, 784, 1230, 1516, 1554, 1811, 2101, 2185, 2212, 2223, 2368, 2370, 2401, 2412, 2413, 2617, 2692, 2693, 2862, 2889, 3084, 3733, 3743, 3752, 3773, 3846, 4004, 4099, 216, 235, 236, 265, 267, 273, 279, 280, 281, 389, 391, 401, 416, 426, 427, 439, 440, 459, 461, 471, 472, 491, 497, 520, 545, 546, 575, 581, 587, 592, 595, 596, 598, 599, 624, 626, 640, 646, 650, 652, 657, 659, 673, 676, 678, 679, 688, 또는 689를 포함한다. 특정 면에서, "서열 번호 1의 부분"은 약 19 내지 약 49개 뉴클레오티드 길이이다.

특정 면에서, 본 발명의 간섭 RNA는 약 19 내지 약 49개 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 다른 면에서, 간섭 RNA는 센스 뉴클레오티드 가닥 및 안티센스 뉴클레오티드 가닥을 포함하며, 여기에서 각 가닥은 다른 가닥과 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 가지고, 안티센스 가닥은 서열 번호 1의 부분에 상응하는 GREM1 mRNA의 부분을 인식할 수 있으며, GREM1 mRNA의 부분과 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 가진다. 센스 및 안티센스 가닥은 링커 서열에 의해 연결될 수 있으며, 이는 센스 및 안티센스 가닥이 서로 혼성화하여 본원에 기술된 바와 같은 헤어핀 루프 (hairpin loop) 구조가 형성되도록 한다.

또다른 면에서, 본 발명의 간섭 RNA는 단일-가닥 간섭 RNA이며, 여기에서 단일-가닥 간섭 RNA는 서열 번호 1의 부분에 상응하는 mRNA의 부분을 인식한다. 특정 면에서, 간섭 RNA는 서열 번호 1의 부분에 상응하는 mRNA의 부분과 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 가진다. 다른 면에서, 서열 번호 1의 부분은 서열 번호 1의 402, 403, 404, 407, 410, 425, 449, 455, 485, 642, 643, 686, 784, 1230, 1516, 1554, 1811, 2101, 2185, 2212, 2223, 2368, 2370, 2401, 2412, 2413, 2617, 2692, 2693, 2862, 2889, 3084, 3733, 3743, 3752, 3773, 3846, 4004, 4099, 216, 235, 236, 265, 267, 273, 279, 280, 281, 389, 391, 401, 416, 426, 427, 439, 440, 459, 461, 471, 472, 491, 497, 520, 545, 546, 575, 581, 587, 592, 595, 596, 598, 599, 624, 626, 640, 646, 650, 652, 657, 659, 673, 676, 678, 679, 688, 또는 689를 포함한다.

또다른 면에서, 본 발명의 간섭 RNA는 (a) 서열 번호 2 및 서열 번호 13 내지 서열 번호 98 중 임의의 것에 상응하는 mRNA의 3' 말단의 끝에서 두번째 13개 뉴클레오티드와 적어도 90%의 서열 상보성을 갖거나 적어도 90%의 서열 상동성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역; (b) 서열 번호 2 및 서열 번호 13 내지 서열 번호 98 중 임의의 것에 상응하는 mRNA의 3' 말단의 끝에서 두번째 14개 뉴클레오티드와 적어도 85%의 서열 상보성을 갖거나 적어도 85%의 서열 상동성을 갖는 적어도 14개의 인접 뉴클레오티드 영역; 또는 (c) 서열 번호 2 및 서열 번호 13 내지 서열 번호 98 중 임의의 것에 상응하는 mRNA의 3' 말단의 끝에서 두번째 15, 16, 17, 또는 18개 뉴클레오티드와 각각 적어도 80%의 서열 상보성을 갖거나, 적어도 80%의 서열 상동성을 갖는 적어도 15, 16, 17, 또는 18개 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하며, 이에 의해 GREM1 mRNA의 발현이 약화된다.

추가의 면에서, 본 발명의 간섭 RNA 또는 본 발명의 간섭 RNA를 포함하는 조성물은 국소적, 유리체내, 경공막(transcleral), 안구 주위, 결막, 테논낭하, 전방내, 망막하, 결막하, 눈뒤 또는 시신경관내 경로를 통하여 대상에 투여된다. 간섭 RNA 또는 조성물은 예를 들어 간섭 RNA 발현 벡터로부터 생체내 발현을 통하여 투여될 수 있다. 특정 면에서, 간섭 RNA 또는 조성물은 에어로졸, 구강, 피부, 피부내, 흡입, 근육내, 비강내, 안구내, 폐내, 정맥내, 복강내, 비강, 안구, 경구, 귀, 비경구, 패치, 피하, 혀 밑, 국소적 또는 경피 경로를 통하여 투여될 수 있다.

일면에서, 본 발명의 간섭 RNA 분자는 분리된다. 용어 "분리된"은 간섭 RNA가 그의 완전한 본래 환경으로부터 유리된 것을 의미한다.

본 발명은 RNA 간섭을 통하여 GREM1 유전자의 발현을 하향 조절하는 이중-가닥 siRNA 분자를 포함하는 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하여, 이를 요하는 대상에서 IOP-관련 증상을 치료하는 방법을 추가로 제공하며, 여기에서 siRNA 분자의 각 가닥은 독립적으로 약 19 내지 약 27개 뉴클레오티드 길이이며, siRNA 분자의 한 가닥은 GREM1 유전자에 상응하는 mRNA에 실직적으로 상보성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하여, siRNA 분자가 RNA 간섭을 통하여 mRNA를 절단시키도록 한다. 특정 면에서, siRNA 분자는 에어로졸, 구강, 피부, 피부내, 흡입, 근육내, 비강내, 안구내, 폐내, 정맥내, 복강내, 비강, 안구, 경구, 귀, 비경구, 패치, 피하, 혀 밑, 국소적 또는 경피 경로를 통하여 투여된다.

본 발명은 제1 간섭 RNA 외에 제2 간섭 RNA를 대상에 투여하는 것을 추가로 제공한다. 제2 간섭 RNA는 제1 간섭 RNA와 동일한 mRNA 표적 유전자를 표적으로 할 수 있거나, 다른 유전자를 표적으로 할 수 있다. 또한, 제3, 제4, 또는 제5 등의 간섭 RNA가 동일한 방식으로 투여될 수 있다.

GREM1 mRNA의 발현을 약화시키는 의약의 제조에서 본원에 기술된 임의의 구체예의 용도 또한 본 발명의 구체예이다.

본 발명의 특정 바람직한 구체예는 하기 특정 바람직한 구체예 및 청구항의 더욱 상세한 기술로부터 더욱 명백해질 것이다.

도 1은 각각 10 nM, 1 nM 및 0.1 nM의 그렘린 siRNA #1, #2, #3 및 #4로 트랜스펙션(transfected)된 GTM-3 세포에서 그렘린 mRNA 발현의 qRT-PCT 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 각각 10 nM, 1 nM 및 0.1 nM의 그렘린 siRNA #1, #2, #3 및 #4로 트랜스펙션된 GTM-3 세포에서 그렘린 단백질 발현의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다.

발명의 상세한 설명

본원에 나타낸 상세한 설명은 예시적인 것이고, 단지 본 발명의 바람직한 구 체예를 예시적으로 기술할 목적이며, 본 발명의 다양한 구체예의 원리 및 개념적 면을 설명하는데 가장 유용하며 용이하게 이해될 것이라 여겨지는 것을 제공하려는 이유로 제시된다. 이와 관련하여, 본 발명의 기본적인 이해를 위해 필요한 것 이상으로 자세하게 본 발명을 구조적으로 설명하려는 시도를 하지 않았으며, 상세한 설명은 본 발명의 일부 형태가 실제로 구체화될 수 있는 방법이 본 분야의 숙련자에게 명백하도록 하는 도면 및/또는 실시예와 함께 나타내었다.

다음의 정의 및 설명은 다음 실시예에서 명백하고 모호하지 않게 변형되거나, 의미의 적용이 임의의 구성을 무의미하거나 본질적으로 무의미하게 하지 않는 한, 임의의 나중의 구성이 조절될 것을 의미하고 이로 의도된다. 용어의 구성이 그것을 무의미하거나 본질적으로 무의미하게 하는 경우, 상기 정의는 본 분야의 숙련자에게 공지된 사전 또는 Webster's Dictionary, 3rd Edition, 이를 테면 "Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology" (Ed. Anthony Smith, Oxford University Press, Oxford, 2004)으로부터 취해질 것이다.

본원에 사용된 모든 퍼센트는 달리 나타내지 않는 한 중량 퍼센트이다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "단수"는 달리 지시되지 않는 한, "하나", "적어도 하나", 또는 "하나 이상"을 의미하는 것으로 취해진다. 문맥에 의해 달리 요구되지 않으면, 본원에 사용된 단수형 용어는 복수를 포함할 것이며, 복수 용어는 단수를 포함할 것이다.

특정 구체예에서, 본 발명은 그렘린 (GREM1) mRNA의 발현을 억제하기 위한 간섭 RNA의 용도에 관한 것이다. 그렘린은 골 형성 단백질 (BMP) 길항제의 CAN 패 밀리의 구성원이다. 이러한 패밀리의 모든 구성원은 8 원의 환 시스틴 노트(knot)를 포함한다. 일부 성장 인자 수용체 리간드, 이를 테면 BMP, TGFβ 및 PDGF는 또한 시스틴 노트 슈퍼패밀리에 속한다. BMP 2, 4, 5 및 7; BMP 수용체 R1a, R1b 및 R2; 및BMP 길항제 그렘린, 밤비(bambi) 및 초르딘은 소주망 (TM)에서 발현된다 (PCT 출원 제 PCT/US02/35251호, Id.; Wordinger et al, Mol. Vision 2002, 8:241-250). BMP 신호는 IOP 상승과 관련된 TGFβ-유도된 TM 기능 변화 중 적어도 일부를 차단한다 (예를 들어, 피브로넥틴 분비 증가). 그렘린은 TGFβ 신호에서 BMP의 이러한 효과를 길항한다. 또한, 그렘린 발현이 녹내장의 TM 세포에서 증가되며, 그렘린은 배양된 인간 눈에서 IOP를 증가시킨다 (PCT 출원 제 PCT/US02/35251호, Id ). 또한, 그렘린 발현을 침묵시키는 것은 본원에서 고안압증 및 녹내장과 관련된 안구 질환의 치료에서 IOP를 낮추는 유효한 방법으로 제공된다.

본 발명에 따라서, GREM1 mRNA의 발현을 억제시키면, 그렘린의 활성이 효율적으로 감소된다. 또한, 외인적으로 제공되거나 내인적으로 발현되는 본원에서와 같은 간섭 RNA는 GREM1 mRNA를 침묵시키는 데 특히 효율적이다.

RNA 간섭 (RNAi)은 유전자 발현을 침묵시키는 데 이중 가닥의 RNA (dsRNA)를 사용하는 방법이다. 이론적인 결부없이, RNAi는 RNaseⅢ-유사 효소인 다이서(dicer)에 의해 긴 dsRNA가 작은 간섭 RNA(siRNA)로 절단되는 것으로 시작된다. siRNA는 대부분 약 19개 내지 28개 뉴클레오티드, 또는 20개 내지 25개 뉴클레오티드, 또는 21개 내지 22개 뉴클레오티드 길이의 dsRNA이며, 종종 2-뉴클레오티드 3' 오버행(overhang), 및 5' 포스페이트 및 3' 하이드록실 말단을 포함한다. siRNA 의 한 가닥은 RISC(RNA-유도 침묵 복합체)로 잘 알려진 리보핵단백질 복합체로 도입된다. RISC는 도입되는 siRNA 가닥에 적어도 부분적으로 상보적인 mRNA 분자를 식별한 후, 이러한 표적 mRNA를 절단하거나 이들의 번역을 억제하는 데 이러한 siRNA 가닥을 이용한다. 그러므로, RISC로 도입되는 siRNA 가닥은 가이드(guide) 가닥 또는 안티센스 가닥으로 알려져 있다. 패신져(passenger) 가닥 또는 센스 가닥으로 알려진 다른 siRNA 가닥은 siRNA로부터 제거되며, 표적 mRNA와 적어도 부분적으로 상동성을 갖는다. 당업자들은 이론상, siRNA의 두 가닥이 RISC에 도입될 수 있으며, 가이드 가닥으로서도 기능할 수 있다는 것을 알 것이다. 그러나 siRNA 설계(예를 들면, 바람직한 가이드 가닥의 5' 말단에서 siRNA 듀플렉스 안전성 감소)는 RISC로의 안티센스 가닥의 도입을 유리하게 할 수 있다.

siRNA의 안티센스 가닥은 안티센스 가닥이 RISC로 도입되고 이에 따라 RISC가 절단 또는 번역 저지를 위하여 안티센스 siRNA 가닥에 적어도 부분적인 상보성을 지닌 표적 mRNA를 식별하게 하는 siRNA의 활성 가이드 제(guiding agent)이다. 적어도 부분적으로 가이드 서열에 상보적인 서열을 갖는 mRNA의 RISC 매개의 절단은 이 mRNA에 의해 코딩되는 상응하는 단백질 및 이 mRNA의 안정된 상태의 수준 감소를 가져온다. 다른 방법으로, RISC는 또한 표적 mRNA의 절단 없이 번역의 저지를 통하여 상응하는 단백질의 발현을 감소시킬 수 있다.

본 발명의 간섭 RNA는 표적 mRNA의 절단을 위하여, 촉매적 방식으로 작용하며, 즉 간섭 RNA는 근사화학량론(Substoichiometric)의 양으로 표적 mRNA의 억제에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 절단 조건하에 치료 효과를 제공하기 위해서는, 안 티센스 요법과 비교할 경우, 상당히 적은 간섭 RNA가 요구된다.

특정 구체예에서, 본 발명은 IOP-관련 증상을 지닌 환자에서 GREM1 표적 mRNA의 발현을 억제하고, 이에 따라 GREM1 수준을 감소시키기 위하여 간섭 RNA를 이용하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따라서, 외인적으로 제공되거나 내인적으로 발현되어 제공되는 간섭 RNA는 안구 조직에서 GREM1 발현을 침묵시킨다.

본원에 사용된 구문 "mRNA 발현의 약화"는 mRNA의 절단 또는 번역의 직접적인 억제를 통하여 표적 mRNA가 단백질로 번역되는 것을 감소시키는 간섭 RNA(예, siRNA)의 양을 발현시키거나 투여하는 것을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "억제", "침묵", 및 "약화"는 본 발명의 간섭 RNA의 부재 하에서 표적 mRNA의 발현 또는 상응하는 단백질에 비하여, 표적 mRNA의 발현 또는 상응하는 단백질의 상당한 감소를 말한다. 표적 mRNA 또는 상응 단백질의 발현 감소는 보통 "녹-다운(knock-down)"이라 언급되며, 비-표적 대조군 RNA(예, 비-표적 대조군 siRNA)의 투여 또는 발현 이후 존재하는 수준과 비교하여 기록된다. 본 발명의 구체적인 예에서는 50% 내지 100% 양의 발현의 녹-다운이 고려되었다. 그러나 본 발명의 목적을 위해 이러한 녹-다운 수준이 달성되는 것이 필수적이지는 않다.

녹-다운은 주로 qPCR(정량적 연쇄중합효소반응) 증폭을 이용하여 mRNA 수준을 측정하거나, 웨스턴 블롯 또는 ELISA(효소 결합 면역 측정법)로 단백질 수준을 측정하여, 평가된다. 단백질 수준 분석은 mRNA 절단 및 번역 억제 둘다에 대한 평가를 제공한다. 녹-다운을 측정하는 추가의 기술은 RNA 용액 혼성화, 뉴클레아제 보호, 노던 혼성화, 마이크로어레이를 통한 유전자 발현 관찰, 항체 결합, 방사선 면역 검정법 및 형광에 의해 활성화된 세포 분석을 포함한다.

본 발명의 간섭 RNA 분자에 의하여 GREM1의 발현을 약화시키는 것은 인간 또는 다른 포유 동물에서 예를 들어 내안압의 개선, 시야 상실(Visual Field Loss)의 개선, 또는 시신경 유두 변화의 개선과 같은 IOP-관련 증후의 개선을 관찰함으로써 추측될 수 있다.

예를 들면, HeLa 세포에서 내인적 표적 유전자 발현 수준을 녹다운 시키는 간섭 RNA의 능력은, 예를 들면, 하기와 같이 시험관 내에서 평가될 수 있다. HeLa 세포를 표준 배양 배지 (예를 들어, 10% 우태아 혈청으로 보충된 DMEM)에서 트랜스펙션하기 24 시간 전에 플레이팅하였다. 트랜스펙션은 예를 들어, 제조자의 지시에 따라 Dharmafect 1(Dharmacon, Lafayette, CO)을 사용하여, 0.1 nM-100 nM 범위의 간섭 RNA 농도에서 수행하였다. SiCONTROL™ 비-표적 siRNA #1 및 siCONTROL™ 사이클로필린(cyclophilin) B siRNA (Dharmacon)을 각각 음성 및 양성 대조군으로 이용하였다. 트랜스펙션 후 24 시간에 예를 들어, 바람직하게 표적 부위와 오버랩되는 TAQMAN® 유전자 발현 분석(Applied Biosystem, Foster City, CA)을 사용하여 표적 mRNA 수준 및 사이클로필린 B mRNA (PPIB, NM_000942) 수준을 qPCR로 평가하였다(Applied Biosystems, Foster City, CA). 트랜스펙션 효능이 100%인 경우, 양성 대조군 siRNA는 사이클로필린 B mRNA의 본질적으로 완전한 녹다운을 제공하였다. 이에 따라, 표적 mRNA 녹다운은 사이클로필린 B siRNA로 트랜스펙션된 TM 세포 중에서 사이클로필린 B mRNA 수준을 참조로 하여 트랜스펙션 효능에 대하여 보정하였다. 표적 단백질 수준은, 트랜스펙션 약 72 시간 후(실제 시간은 단백질 전 환율에 좌우됨), 예를 들어, 웨스턴 블롯으로 평가될 수 있다. 배양된 세포로부터의 RNA 및/또는 단백질 분리를 위한 표준 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 비-특이적인 오프 표적 효과 기회를 감소시키기 위하여, 가능한 가장 작은 간섭 RNA 농도가 표적 유전자 발현에서 원하는 수준의 녹다운을 생산하기 위하여 사용되어야 한다. 인간 각막 상피 세포 또는 인간 안구 세포주는 내인성 표적 유전자의 수준을 녹다운시키는 간섭 RNA의 능력을 평가하기 위하여 사용될 수 있다.

일 구체예에서, GREM1 수준을 감소시키기 위하여 GREM1 mRNA를 표적으로 하는 단일 간섭 RNA가 투여된다. 다른 구체예에서, GREM1 mRNA를 표적으로 하는 둘 이상의 간섭 RNA가 GREM1 수준을 감소시키기 위하여 투여된다.

GenBank 데이터 베이스는 서열 번호 1로서 "서열 목록"에 제공된 수탁 번호 NM_013372으로 GREM1에 대한 DNA 서열을 제공한다. 서열 번호 1은 그렘린을 코딩하는 mRNA에 상응하는 DNA의 센스 가닥 서열을 제공한다("U" 염기를 위한 "T" 염기를 제외). GREM1에 대한 코딩 서열은 뉴클레오티드 160-714이다.

상기 개시된 GREM1 mRNA 서열의 등가물은 이의 대안적인 스플라이스 형태, 대립 유전자 형태, 동질 효소(isozyme) 또는 동족체(cognate)이다. 동족체는 서열 번호 1과 동족인 또다른 포유동물 종에서의 그렘린 mRNA이다(예를 들어, 오쏘로그(ortholog)).

특정 구체예에서, IOP-관련 증상의 치료를 필요로 하거나 IOP-관련 증상의 발생 위험이 있는 "대상"은 그렘린의 원하지 않거나 부적절한 발현 또는 활성과 관련된 IOP-관련 증상을 갖거나 IOP-관련 증상을 가질 위험이 있는 인간 또는 다른 포유 동물이다. 이러한 질병과 관련된 안구 구조는, 예를 들어, 눈, 망막, 맥락막, 렌즈, 각막, 소주망, 홍채, 시신경, 시신경유두, 공막, 전방 또는 후부 단편 또는 모양체를 포함할 수 있다. 또한 대상은 안구 세포, 세포 배양물, 기관 또는 생체 외 기관 또는 조직 또는 세포일 수 있다.

본원에 사용된 "IOP-관련 증상"은 고안압증 및 내안압 (IOP) 증가와 관련된 안구 질환, 이를 테면 정상안압 녹내장 및 개방각 녹내장을 비롯한 녹내장을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "siRNA"는 달리 언급되지 않는다면 이중-가닥 간섭 RNA를 말한다. 전형적으로, 본 발명의 siRNA는 각각의 가닥이 약 19 내지 약 28개 뉴클레오티드(예를 들어, 약 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 또는 28개 뉴클레오티드)를 갖는 두 개의 뉴클레오티드 가닥을 포함하는 이중-가닥 핵산 분자이다. 이중-가닥 간섭 RNA를 언급하는 경우, 구문 "19 내지 49개 뉴클레오티드를 갖는 간섭 RNA"는 센스 및 안티센스 가닥이 독립적으로 간섭 RNA 분자를 포함하는 약 19 내지 약 49개 뉴클레오티드의 길이를 가지며, 여기에서 센스 및 안티센스 가닥이 링커 분자에 의해 연결되는 것을 의미한다.

siRNA 분자 외에, 다른 간섭 RNA 분자 및 RNA-유사 분자는 RISC와 상호작용하고, 유전자의 발현을 침묵시킬 수 있다. RISC와 상호작용할 수 있는 다른 RNA 분자의 예는 shRNA(짧은 헤어핀 RNA), 단일 가닥 siRNA, miRNA(마이크로RNA) 및 다이서-기질 27-mer 듀플렉스를 포함한다. RISC와 상호작용할 수 있는 RNA-유사 분자의 예는 화학적으로 변형된 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드, 하나 또는 그 이 상의 비-뉴클레오티드, 하나 또는 그 이상의 데옥시리보뉴클레오티드, 및/또는 하나 또는 그 이상의 비-포스포디에스테르 결합을 포함하는 siRNA, 단일-가닥 siRNA, 마이크로 RNA 및 shRNA 분자를 포함한다. 유전자 발현에 있어서 RISC와 상호작용할 수 있으며 RISC 매개의 변화에 관여하는 모든 RNA 또는 RNA-유사 분자를 "간섭 RNA" 또는 "간섭 RNA 분자"라고 칭하였다. 그러므로, siRNA, 단일-가닥 RNA, shRNA, miRNA 및 다이서-기질 27-mer 듀플렉스는 "간섭 RNA" 또는 "간섭 RNA 분자"의 부분집합이다.

단일 가닥 간섭 RNA는 이중 가닥 RNA보다 mRNA 침묵에 더 작은 영향을 미치는 것으로 관찰되었다. 그러므로, 본 발명의 구체예는 또한 서열 번호 1의 부분과 적어도 거의 완벽한 인접 상보성의 영역을 갖는 단일 가닥 간섭 RNA의 투여를 위해 제공된다. 단일 가닥 간섭 RNA는 상기 기술한 이중 가닥 간섭 RNA를 위하여, 약 19내지 약 49개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 단일 가닥 간섭 RNA는 5' 포스페이트를 갖거나 5' 위치에서 인시츄(in situ) 또는 생체 내에서 인산화된다. "5' 인산화"란 용어는 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에서 당(예, 리보스, 디옥시리보스 또는 이들의 유사체)의 C5 하이드록실 그룹에 대한 에스테르 결합을 통하여 부착된 포스페이트 그룹을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 기술하기 위하여 사용된다.

단일 가닥 간섭 RNA는 화학적으로 합성되거나 또는 시험관 내 전사에 의하여, 또는 이중 가닥 간섭 RNA에 관해서는 백터 또는 발현 카세트로부터 내인적으로 발현될 수 있다. 5' 포스페이트 그룹은 키나아제를 통해 첨가될 수 있으며, 또한, 5' 포스페이트는 뉴클레아제에 의한 RNA의 절단의 결과일 수도 있다. 헤어핀 간섭 RNA는 스템-루프 또는 헤어핀 구조(예를 들어, shRNA)에서 간섭 RNA의 센스 및 안티센스 가닥을 포함하는 단일 분자 (예를 들어, 단일 올리고뉴클레오티드 사슬)이다. 예를 들어, shRNA는 DNA 벡터로부터 발현될 수 있으며, 여기서 센스 간섭 RNA 가닥을 코딩하는 DNA 올리고뉴클레오티드는 짧은 스페이서에 의해 역 상보성 안티센스 간섭 RNA 가닥을 코딩하는 DNA 올리고뉴클레오티드에 연결된다. 선택된 발현 벡터를 위하여 필요하다면, 3' 말단의 T 및 제한 자리를 형성하는 뉴클레오티드가 첨가될 수 있다. 생성된 RNA 전사물은 스템-루프 구조를 형성하기 위하여 그 자신의 뒤에 접힌다.

본 명세서에 기술된 핵산 서열은 달리 지적하지 않았다면, 5'에서 3' 방향으로 기재되었다. 본원에 사용된 용어 "핵산"은 DNA(아데닌 "A," 시토신 "C," 구아닌 "G," 티민 "T") 또는 RNA(아데닌 "A," 시토신 "C," 구아닌 "G," 우라실 "U")에 존재하는 퓨린 또는 피리미딘 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 변형된 형태를 언급하는데 이용되었다. 비록 RNA에는 자연적으로 "T" 염기가 존재할 수 없지만, 여기에서 간섭 RNA는 특별히 3' 말단에 "T" 염기를 포함할 수 있다. "핵산"은 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"를 포함하며, 단일 가닥 분자 또는 이중 가닥 분자를 말하는 것일 수도 있다. 이중 가닥 분자는 A와 T 염기, C와 G 염기 및 A와 U 염기 사이에서 왓슨-크릭 염기 쌍에 의해 형성된다. 이중 가닥 분자의 가닥은 서로에 대해 부분적으로, 실질적으로, 또는 완전하게 상보성일 수 있으며, 염기 서열 상보성의 본질 및 정도에 의해 좌우되는 결합력으로 듀 플렉스 하이브리드(duplex hybrid)를 형성할 것이다.

본원에 사용된 구문 "DNA 표적 서열"은 본 발명의 간섭 RNA를 도출하는 데 사용되는 DNA 서열을 말한다. 본원에 사용된 구문 "RNA 표적 서열", "간섭 RNA 표적 서열" 및 "RNA 표적"은 본 발명의 간섭 RNA에 의해 인식될 수 있는 GREM1 mRNA 서열의 부분 또는 GREM1 mRNA를 말하며, 여기에서, 간섭 RNA는 본원에 기술된 바와 같이 GREM1 유전자 발현을 침묵시킬 수 있다. "RNA 표적 서열", "siRNA 표적 서열" 및 "RNA 표적"은 전형적으로 DNA 서열의 부분에 상응하는 mRNA 서열이다. mRNA 서열은 상응하는 DNA 서열의 서열로부터 용이하게 추론된다. 예를 들어, 서열 번호 1은 GREM1에 대한 mRNA에 상응하는 DNA의 센스 가닥 서열을 제공한다. mRNA 서열은 "T" 염기가 "U" 염기로 대체된 DNA 센스 가닥 서열과 동일하다. 따라서, GREM1의 mRNA 서열은 서열 번호 1로부터 알 수 있다. 서열 번호 1에 상응하는 mRNA의 표적 서열은 mRNA의 5' 또는 3' 미번역 영역 및 mRNA의 코딩 영역에 있을 수 있다.

특정 구체예에서, 표적 mRNA 서열 내의 간섭 RNA 표적 서열(예를 들어, siRNA 표적 서열)은 이용가능한 설계 도구를 이용하여 선별된다. GREM1 표적 서열에 상응하는 간섭 RNA는 표적 mRNA를 발현하는 세포의 트랜스펙션 후 본원에 기술된 녹다운 평가로 시험관 내에서 테스트된다. 간섭 RNA는 본원에 기술된 바와 같이 동물 모델을 사용하여 생체 내에서 평가될 수 있다.

siRNA의 표적 서열을 선별하는 기술은 록펠레 대학의 웹 싸이트에서 이용가능한 Tuschl 등("The siRNA User Guide" revised May 6, 2004)의 방법; 앰비온 웹 싸이트, Ambion Inc.에서 이용가능한 Technical Bulletin #506, "siRNA Design Guidelines"; 다른 웹-기초의 설계 도구 예를 들면, Invitrogen, Dharmacon, Integrated DNA Technologies, Genscript, 또는 Proligo 웹 싸이트에 의해 제공된다. 초기 조사 기준은 G/C 함량이 35% 내지 55%이며, 19 내지 27개 뉴클레오티드의 siRNA의 길이를 포함할 수 있다. 표적 서열은 코딩 영역 또는 mRNA의 5' 또는 3' 미번역 영역에 위치할 수 있다. 표적 서열은 본원에 기술된 것과 같은 간섭 RNA 분자를 도출하는 데 사용될 수 있다.

표 1은 상기 나타낸 바와 같은 방식으로 본 발명의 siRNA가 설계된 서열 번호 1의 GREM1 DNA 표적 서열의 예를 열거한 것이다. GREM1은 상기 나타낸 바와 같이 그렘린을 코딩한다.

상기 예에 나타낸 바와 같이, 본 분야의 숙련자는 표 1에 제공된 표적 서열 정보를 사용하여, 서열 번호 1에서 서열 위치를 참고하고, 서열 번호 1에 상보적이거나 거의 상보적인 뉴클레오티드를 첨가하거나 결실시켜 표 1에 제공된 서열보다 더 짧거나 더 긴 길이를 갖는 간섭 RNA를 설계할 수 있다.

예를 들어, 서열 번호 2는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 402 내지 420에 존재하는 GREM1 mRNA에 대한 19-뉴클레오티드 DNA 표적 서열의 예를 나타낸다:

서열번호 2의 상응하는 mRNA 서열을 표적으로 하고, 21-뉴클레오티드 가닥 및 2-뉴클레오티드 가닥 3' 오버행을 갖는 본 발명의 siRNA는 다음과 같다:

각각의 "N" 잔기는 임의의 뉴클레오티드(A, C, G, U, T) 또는 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 3' 말단은 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 포함하는 것과 이들 사이의 것의 많은 수의 "N" 잔기를 가질 수 있다. 두 가닥에서 "N" 잔기는 같은 잔기(예를 들어, UU, AA, CC, GG 또는 TT)이거나, 다를 수 있다(예를 들어, AC, AG, AU, CA, CG, CU, GA, GC, GU, UA, UC 또는 UG). 3' 오버행은 같을 수도 있고 다를 수도 있다. 한 구체예에서는, 양쪽 가닥 모두 3'UU 오버행을 갖는다.

서열번호 2의 상응하는 mRNA 서열을 표적으로 하고, 각각의 가닥에서 21-뉴클레오티드 가닥 및 3'UU 오버행을 갖는 본 발명의 siRNA의 예는 다음과 같다:

또한, 간섭 RNA는 뉴클레오티드의 5'오버행을 갖거나 또는 블런트 말단(blunt end)을 가질 수 있다. 서열번호 2의 상응하는 mRNA 서열을 표적으로 하고, 19-뉴클레오티드 및 블런트 말단을 갖는 본 발명의 siRNA의 예는 다음과 같다:

이중-가닥 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)의 가닥은 헤어핀 또는 스템-루프 구조(예를 들어, shRNA)를 형성하기 위하여 연결될 수 있다. 서열번호 2의 상응하는 mRNA 서열을 표적으로 하고, 19 bp 이중 가닥 스템 영역 및 3'UU 오버행을 갖는 본 발명의 shRNA의 예는 다음과 같다:

N은 뉴클레오티드 A, T, C, G, U 또는 당업자들에게 알려진 변형된 형태이다. 루프에 뉴클레오티드 N의 수는 3 내지 23, 또는 5 내지 15, 또는 7 내지 13, 또는 4 내지 9, 또는 9 내지 11을 포함하는 수 또는 그 사이의 수이거나, 또는 뉴클레오티드 N의 수는 9이다. 루프에서 뉴클레오티드의 일부는 루프에서 다른 뉴클레오티드와의 염기쌍 상호작용에 연루될 수 있다. 루프의 형성을 위해 이용될수 있는 올리고뉴클레오티드의 서열의 예는 5'-UUCAAGAGA-3'(Brummelkamp, T.R. et al. (2002) Science 296: 550) 및 5'-UUUGUGUAG-3'(Castanotto, D. et al. (2002) RNA 8:1454)를 포함한다. 생성된 단일 사슬 올리고뉴클레오티드가 RNAi 기작과 상호작용 가능한 이중 가닥 부분을 포함하는 스템-루프 또는 헤어핀 구조를 형성하는 것은 당업자들에 의해 인식될 것이다.

상기 동정된 siRNA 표적 서열은 다이서-기질 27-mer 듀플렉스의 설계를 용이하게 하기 위하여, 3' 말단에서 연장될 수 있다. 서열번호 1의 뉴클레오티드 402 내지 426에 존재하는 25-뉴클레오티드 DNA 표적 서열을 산출하는 GREM1 DNA 서열(서열 번호 1)에서 6 뉴클레오티드로 동정된 19-뉴클레오티드 DNA 표적 서열(서열번호 2)의 연장은 다음과 같다:

본 발명의 다이서-기질 27-mer 듀플렉스의 예는 서열번호 10의 상응하는 mRNA 서열을 표적으로 한다:

센스 가닥의 3' 말단에서 두 개의 뉴클레오티드(예를 들어, 서열번호 120의 GU 뉴클레오티드)는 처리를 증진시키기 위한 데옥시뉴클레오티드일 수 있다. 본원에 제공된 것과 같은 19 내지 21개 뉴클레오티드 표적 서열 유래의 다이서-기질 27-mer의 설계는 IDT(Integrated DNA Technologies) 웹 싸이트 및 문헌[Kim, D.-H. et al, (February, 2005) Nature Biotechnology 23:2;222-226]에 의해 추가로 검토되었다.

siRNA 및 다른 간섭 RNA 형태로 가이드된 표적 RNA의 절단 반응은 고도의 서열 특이성이 있다. 예를 들어, 일반적으로, siRNA 분자는 표적 mRNA의 부분 서열과 동일한 센스 뉴클레오티드 가닥 및 mRNA 발현의 억제를 위한 표적 mRNA에 정확하게 상보적인 안티센스 뉴클레오티드 가닥을 포함한다. 그러나 간섭 RNA가 표적 mRNA를 인식하고 GREM1 유전자의 발현을 침묵시킬 수 있는 한, 안티센스 siRNA 가닥 및 표적 mRNA 사이 또는 안티센스 siRNA 가닥 및 센스 siRNA 가닥의 사이의 100% 서열 상보성이 본 발명을 실시하는 데 요구되지 않는다. 그러므로, 예를 들면, 본 발명은 유전적 돌연변이, 균주 다형성 또는 진화적 일탈에서 기인한 것으로 여겨지는 변형 및 간섭 RNA 분자의 활성에 영향을 미치지 않는 뉴클레오티드 치환을 포함하는 안티센스 가닥과 표적 mRNA 및 안티센스 가닥과 센스 가닥 사이의 서 열 변이를 허용하며, 여기에서, 상기 변이는 표적 mRNA에 대한 안티센스 가닥의 인식을 방해하지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 간섭 RNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 가지며, 센스 및 안티센스 가닥은 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명의 간섭 RNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 지니며, 이 안티센스 가닥은 GREM1 mRNA의 표적 서열에 대하여 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상보성 영역을 포함하며, 센스 가닥은 GREM1 mRNA의 표적 서열과 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 인접 상동성 영역을 각각 포함한다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 간섭 RNA는 mRNA내에서 상응하는 표적 서열 3' 말단의 끝에서 두번째 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개 뉴클레오티드와 서열 상보성 퍼센트 또는 서열 상동성 퍼센트를 갖는 적어도 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함한다. 간섭 RNA 가닥 각각의 길이는 약 19개 내지 약 49개의 뉴클레오티드를 포함하며, 약 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 또는 49개 뉴클레오티드의 길이를 포함할 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 간섭 RNA의 안티센스 가닥이 표적 mRNA와 적어도 19개 뉴클레오티드의 적어도 거의-완벽한 상보성을 갖는다. 본 원에서 사용된 "거의-완벽한"이란 siRNA의 안티센스 가닥이 표적 mRNA의 적어도 한 부분에 "실질적으로 상보적인" 것을 의미하며, siRNA의 센스 가닥이 표적 mRNA의 적어도 한 부 분과 "실질적으로 동일한"것을 의미한다. 당업자들에게 알려진 "상동성"은 서열 사이의 뉴클레오티드의 순서 및 상동성을 매칭하여 결정된 뉴클레오티드 서열 사이에서의 서열 연관 정도이다. 일 구체예에서, 표적 mRNA서열에 80% 및 80%에서 100%까지의 상보성, 예를 들어 85%, 90% 또는 95% 상보성을 갖는 siRNA의 안티센스 가닥이 거의 완벽한 상보성으로 간주되며, 본 발명에 이용될 수 있다. "완벽한" 인접 상보성은 근접 염기 쌍의 표준 왓슨-크릭 염기 쌍이다. "적어도 거의 완벽한" 인접 상보성은 본 명세서에서 이용된 "완벽한" 상보성을 포함한다. 상동성 또는 상보성을 결정하기 위한 컴퓨터 방법은 뉴클레오티드 서열의 최상의 매칭 정도를 동정하기 위하여 설계되었으며, 예로는 BLASTN(Altschul, S.F., et al. (1990) J. MoI. Biol. 215:403-410)이 있다.

용어 "상동성 퍼센트"는 제2 핵산 분자에서 같은 길이의 인접 뉴클레오티드의 세트와 동일한 제1 핵산 분자 내의 인접 뉴클레오티드의 퍼센트를 의미한다. 용어 "상보성 퍼센트"는 제2 핵산 분자에서 인접 뉴클레오티드의 세트와 왓슨-크릭 센스에서 염기 쌍을 이룰 수 있는 제1 핵산 분자 내 인접 뉴클레오티드의 퍼센트를 의미한다.

표적 mRNA와 siRNA의 한 가닥(센스 가닥) 사이의 관계는 상동성의 관계이다. 또한 siRNA의 센스 가닥은 존재한다면 패신져 가닥이라고 불린다. 표적 mRNA 및 siRNA의 다른 가닥(안티센스 가닥) 사이의 관계는 상보성의 관계이다. 또한 siRNA의 안티센스 가닥은 가이드 가닥이라고도 불린다.

서열 번호 1의 부분에 상보성이 아닌 안티센스 siRNA 가닥의 영역(들)이 있 을 수 있다. 비-상보적인 영역은 두개의 상보적인 영역 사이, 또는 상보적인 영역의 3', 5', 또는 양 말단에 있을 수 있다. 영역은 하나 이상의 염기일 수 있다.

간섭 RNA 분자에서 센스 및 안티센스 가닥은 또한 다른 가닥과 염기 쌍을 형성하지 않는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 또는 두 가닥은 혼성화되는 경우 벌지(bulge) 또는 미스매치가 형성되도록 다른 가닥의 그 위치에서의 뉴클레오티드와 쌍을 이루지 않는 추가의 뉴클레오티드(들)를 포함할 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 간섭 RNA 분자는 미스매치, G-U 워블 (wobble) 또는 벌지를 갖는 센스 및 안티센스 가닥을 포함할 수 있다. 미스매치, G-U 워블 또는 벌지는 또한 안티센스 가닥 및 그의 표적 사이에 발생할 수 있다 (예를 들어, Saxena et ah, 2003, J. Biol Chem.278:44312-9 참조).

이중 가닥 간섭 RNA의 한 가닥 또는 두 가닥 모두는 1개 내지 6개 뉴클레오티드의 3' 오버행을 가질 수 있으며, 이는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 오버행의 뉴클레오티드는 염기 쌍을 이루지 않는다. 본 발명의 일구체예에서, 간섭 RNA는 TT 또는 UU의 3' 오버행을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 간섭 RNA는 적어도 하나의 블런트 말단을 포함한다. 말단은 대부분 5' 포스페이트 그룹 또는 3' 하이드록실 그룹을 갖는다. 다른 구체예에서 안티센스 가닥은 5' 포스페이트 그룹을 가지며, 센스 가닥은 5' 하이드록실 그룹을 갖는다. 또 다른 구체적인 예에서, 말단은 다른 분자 또는 작용기의 공유결합 첨가에 의해 추가로 변형된다.

이중 가닥 siRNA의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 상기 언급한 두개의 단일 가닥의 듀플렉스 형성 중에 있거나, 또는 상보성 영역이 염기 쌍을 이루는 단일 가닥의 분자일 수 있고, 영역이 서로 혼성화되는 경우 링커 분자에 의해 공유 결합되어 헤어핀 루프를 형성한다. 헤어핀은 각각 두개의 염기로 쌍을 이룬 RNA 분자의 간섭 RNA 형성하기 위하여 다이서라는 단백질에 의해 세포 내적으로 절단된다고 알려졌다. 링커 분자는 또한 특정 뉴클레아제에 의해 생체 내 또는 시험관 내에서 절단될 수 있는 제한 부위를 포함하도록 설계될 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명은 DNA 표적에 상응하는 mRNA의 3' 말단의 끝에서 두번째 13개 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성을 갖거나 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 간섭 RNA 분자를 제공하며, 영역 내에서 하나의 뉴클레오티드 치환을 허용한다. 두개의 뉴클레오티드 치환 (예를 들어, 11/13 = 85% 상동성/상보성)은 상기 구에 포함되지 않는다. 또다른 구체예에서, 본 발명은 DNA 표적에 상응하는 mRNA의 3' 말단의 끝에서 두번째 14개 뉴클레오티드와 적어도 85% 서열 상보성을 갖거나 적어도 85% 서열 상동성을 갖는 적어도 14개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 간섭 RNA 분자를 제공한다. 두개의 뉴클레오티드 치환(예를 들어, 12/14 = 86% 상동성/상보성)은 상기 구에 포함된다. 추가의 구체예에서, 본 발명은 DNA 표적에 상응하는 mRNA의 3' 말단의 끝에서 두번째 14개 뉴클레오티드와 적어도 80% 서열 상보성을 갖거나 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 적어도 15, 16, 17, 또는 18개의 인접 뉴클레오티드 영역을 포함하는 간섭 RNA 분자를 제공한다. 3개의 뉴클레오티드 치환은 상기 구에 포함된다.

5'에서 3' 방향으로 기재된 핵산 서열에서 끝에서 두번째 염기는 마지막 염기의 옆의 염기를, 즉, 3' 염기 옆의 염기를 의미한다. 5'에서 3' 방향으로 기재된 핵산 서열의 끝에서 두번째 13개 염기는 3' 염기 옆의 마지막 13개 염기의 서열을 의미하며, 3' 염기는 포함하지 않는다. 유사하게 5'에서 3' 방향으로 기재된 핵산 서열의 끝에서 두번째 14, 15, 16, 17 또는 18개 염기는 각각 3' 염기 옆의 서열의 마지막 14, 15, 16, 17 또는 18개 염기를 의미하며, 3' 염기는 포함하지 않는다.

간섭 RNA는 화학적 합성, 시험관 내의 전사, 또는 다이서 또는 유사한 활성을 갖는 다른 적당한 뉴클레아제에 의한 긴 이중 가닥 RNA의 절단으로 외생적으로 생성될 수 있다. 통상적인 DNA/RNA 합성기를 이용하여 보호된 리보뉴클레오시드 포스포라미디트로부터 생성되는 화학적으로 합성된 간섭 RNA는 앰비온사(Austin, TX), 인비트로젠(Carlsbad, CA) 또는 다마콘(Lafayette, CO)과 같은 상업적 공급자로부터 수득될 수 있다. 간섭 RNA는 예를 들면, 용매, 또는 레진, 침전, 전기영동, 크로마토그래피 또는 이들의 조합에 의한 추출로 정제될 수 있다. 대안적으로, 간섭 RNA는 샘플 처리 과정에서 기인하는 손실을 피하기 위하여 거의 정제 없이 사용될 수 있다.

간섭 RNA가 화학 합성에 의하여 생성되는 경우, 하나 또는 두(존재하는 경우) 가닥의 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서의 인산화는 siRNA 효능 및 결합 RISC 복합체의 특이성을 증진시킬 수 있으나 인산화는 세포 내적으로 발생할 수 있기 때문에, 필요하지 않다.

또한, 간섭 RNA는 플라스미드 또는 바이러스 발현 벡터 또는 최소 발현 카세트로부터, 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 프로모터 및 간섭 RNA를 위한 적절한 주형(들)을 포함하는 PCR 산출 단편으로부터 내생적으로 발현될 수 있다. shRNA를 위하여, 상업적으로 이용 가능한 플라스미드-기초의 발현 벡터의 예는 pSilencer 시리즈(앰비온, Austin, TX) 및 pCpG-siRNA(인비트로젠, San Diego, CA)의 구성원을 포함한다. 간섭 RNA의 발현을 위한 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 렌티바이러스(예, HIV, FIV 및 EIAV) 및 허피스 바이러스를 포함하는 다양한 바이러스로부터 유래될 수 있다. shRNA 발현을 위하여, 상업적으로 이용 가능한 바이러스 벡터의 예는 pSilencer adeno(앰비온, Austin, TX) 및 pLenti6/BLOCK-iT™-DEST(인비트로젠, Carlsbad, CA)을 포함한다. 바이러스 벡터의 선택, 벡터로부터 간섭 RNA를 발현시키는 방법 및 바이러스 벡터를 전달하는 방법은 당업계의 통상의 기술로 가능하다. PCR로 생성되는 shRNA 발현 카세트의 생산 키트의 예에는 Silencer Express(앰비온, Austin, TX) 및 siXpress(미루스, Madison, WT)를 포함한다.

특정 구체예에서, 제1 간섭 RNA는 제1 간섭 RNA를 발현할 수 있는 제1 발현 벡터로부터의 생체 내 발현을 통하여 투여될 수 있으며, 제2 간섭 RNA는 제2 간섭 RNA를 발현할 수 있는 제2 발현 벡터로부터 생체 내 발현을 통하여 투여될 수 있거나, 두 간섭 RNA는 두 간섭 RNA들을 발현할 수 있는 단일 발현 벡터로부터 생체 내 발현을 통하여 투여될 수 있다. 추가의 간섭 RNA가 (예를 들어, 다중 간섭 RNA를 발현할 수 있는 단일 발현 벡터를 통하여, 또는 분리 발현 벡터를 통하여)유사한 방식으로 투여될 수 있다.

간섭 RNA는 본 분야의 숙련자에게 알려진 다양한 진핵세포 프로모터, 이를 테면 U6 또는 H1 프로모터와 같은 pol III 프로모터, 또는 사이토메갈로바이러스 프로모터와 같은 pol II 프로모터로부터 발현될 수 있다. 당업자들은 이들 프로모터가 간섭 RNA의 발현이 유도가능하도록 사용할 수 있는 것을 인식할 것이다.

본 발명의 특정 구체예에서, 간섭 RNA의 안티센스 가닥이 생체 내에서 RISC 복합체의 부분으로서 mRNA와 혼성화한다.

"혼성화"는 상보적 또는 거의 상보적인 염기 서열을 갖는 단일 가닥 핵산이 상호작용하여 혼성물(hybrid)이라 불리는 수소-결합 복합체를 형성하는 과정을 말한다. 혼성화 반응은 민감하며 선택적이다. 시험관 내에서의 혼성화 특이성(예, 엄격함)은 예를 들어, 예비혼성화 및 혼성화 용액 중에 염 또는 포름아미드의 농도에 의하여, 그리고 혼성화 온도에 의하여 조절되며; 이러한 방법은 본 분야에 공지이다. 특히, 엄격함은 염 농도의 감소, 포름아미드 농도의 증가 또는 혼성화 온도를 올림으로써 증가된다.

예를 들어, 아주 엄격한 조건은 약 50% 포름아미드, 37℃ 내지 42℃에서 발생할 수 있다. 감소된 엄격한 조건은 약 35% 내지 25% 포름아미드, 30℃ 내지 35℃에서 발생할 수 있다. 혼성화를 위한 엄격한 조건의 예는 문헌 [Sambrook, J., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]에 제공된다. 엄격한 혼성화 조건의 또 다른 예는 50℃ 또는 70℃에서, 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 12 내지 16 시간 동안 혼성화 후, 세척하거나, 또는 70℃에서 1×SSC, 또는 50℃에서 1×SSC, 50% 포름아미드로 혼성화한 후, 70℃에서 0.3×SSC로 세척하거나, 또는 70℃에서 4×SSC, 또는 50℃에서 4×SSC, 50% 포름아미드로 혼성화한 후, 67℃에서 1×SSC로 세척하는 것을 포함한다. 혼성화 온도는 혼성물의 Tm(융점)보다 약 5 내지 10℃ 낮으며, 19 내지 49개의 염기 쌍의 길이의 혼성물의 Tm은 하기의 계산식으로 결정된다: Tm℃ = 81.5 + 16.6(log₁₀[Na+]) + 0.41 (% G+C)-(600/N)(여기에서 N은 하이브리드의 염기 수를 의미하며, [Na+]는 혼성화 용액의 나트륨 이온의 농도를 의미한다).

상기 기술된 시험관 내 혼성화 분석은 후보 siRNA와 표적 사이의 결합이 특이성을 가지는지의 여부를 예측하는 방법을 제공한다. 그러나 RISC 복합체의 범위에서, 시험관내에서 혼성화에 대하여 높은 엄격성을 나타내지 않는 안티센스 가닥으로, 표적이 특이적으로 분해될 수 있다.

간섭 RNA는 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 첨가, 결실, 치환, 또는 변형에 의해 자연적으로 발생하는 RNA와 다를 수 있다. 뉴클레오티드가 아닌 물질은 5' 말단 및 3' 말단 또는 내부에서 간섭 RNA에 결합할 수 있다. 이러한 변형은 주로 간섭 RNA의 뉴클레아제 저항을 증가시키고, 세포 흡수를 증진시키며, 세포 표적을 증진시키고, 간섭 RNA 추적을 원조하고, 더 나은 안정성 또는 인터페론 경로의 활성화 가능성을 감소시키기 위하여 설계된다. 예를 들어, 간섭 RNA는 오버행의 말단에 퓨린 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 피롤리딘 링 커(linker)에 의한 siRNA 분자의 센스 가닥 3' 말단에서 콜레스테롤의 접합은 또한, siRNA에 안정성을 제공한다.

다른 변형은 예를 들어, 3' 말단 비오틴 분자, 세포를 관통하는 특성을 지닌 것으로 알려진 펩티드, 나노 입자, 펩티도미메틱(peptidomimetic), 형광 염료 또는 덴드리머(dendrimer)를 포함한다.

본 발명의 구체예에서 뉴클레오티드는 그들의 염기 부분, 그들의 당 부분 또는 분자의 포스페이트 부분 및 작용에서 변형될 수 있다. 변형은 예를 들어, 알킬, 알콕시기, 아미노, 디아자, 할로, 하이드록실, 티올기 또는 이들의 조합을 포함한다. 뉴클레오티드는 이를 테면 리보뉴클레오티드를 데옥시뉴클레오티드로 대체하는 것과 같이 더 나은 안정성을 갖거나, 2' OH 그룹을 2' 아미노 그룹, 2'O-메틸 그룹, 2' 메톡시에틸 그룹 또는 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿쥐(bridge)로 대체하는 것과 같이 당 변형을 갖는 유사체로 치환될 수 있다. 뉴클레오티드의 퓨린 또는 피리미딘 유사체의 예로는 크산틴, 하이포크산틴, 아자퓨린, 메틸티오아데닌, 7-데아자-아데노신 및, O- 및 N- 변형 뉴클레오티드를 포함한다. 뉴클레오티드의 포스페이트 그룹은 포스페이트 그룹의 하나 또는 그 이상의 산소를 질소 또는 황(포스포로티오에이트)으로 치환하여 변형될 수 있다. 변형은 예를 들면, 기능 증진, 안정성 또는 투과성의 증진, 또는 편재화 또는 표적을 지시하는데 유용하다.

특정 구체예에서, 본 발명의 간섭 분자는 상기 기술된 바와 같은 적어도 하나의 변형을 포함한다.

특정 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 간섭 RNA 분자를 포함하는 약제학적 조성물(본원에서 "조성물"로도 언급)을 제공한다. 약학적 조성물은 물, 완충액, 식염수, 글리신, 히알루론산, 맨니톨 등과 같은 것 및 하기 기술되는 것을 포함하는 생리학적으로 허용되는 담체 매질과 혼합된 본 발명의 간섭 RNA 또는 이의 염을 99 중량% 이하로 포함하는 제제이다.

본 발명의 간섭 RNA는 용액, 현탁액 또는 에멀젼으로 투여된다. 다음은 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 약제학적 조성물 제제의 예이다.

양(중량 %)

간섭 RNA 최대 99; 0.1-99; 0.1-50; 0.5-10.0

하이드록시프로필메틸셀룰로오스 0.5

염화나트륨 0.8

염화 벤즈알코늄 0.01

EDTA 0.01

NaOH/HCl qs pH 7.4

정제수(RNase 없음) qs 100 ㎖

양(중량 %)

간섭 RNA 최대 99; 0.1-99; 0.1-50; 0.5-10.0

인산완충염수 1.0

염화 벤즈알코늄 0.01

폴리소르베이트 80 0.5

정제수(RNase 없음) q.s. 100%까지

양(중량 %)

간섭 RNA 최대 99; 0.1-99; 0.1-50; 0.5-10.0

일염기성인산나트륨 0.05

이염기성인산나트륨(무수) 0.15

염화나트륨 0.75

디소듐 EDTA 0.05

크레모폴 EL 0.1

염화 벤즈알코늄 0.01

HCl 및/또는 NaOH pH 7.3-7.4

정제수(RNase 없음) q.s. 100%까지

양(중량 %)

간섭 RNA 최대 99; 0.1-99; 0.1-50; 0.5-10.0

인산완충식염수 1.0

수산화프로필-베타-사이클로덱스트린 4.0

정제수(RNase 없음) q.s. 100%까지

본원에 사용된 용어 "유효량"은 포유 동물에서 치료 반응을 생성할 것으로 결정된 간섭 RNA 또는 간섭 RNA를 포함하는 약제학적 조성물의 양을 말한다. 이러한 치료적 유효량은 본원에 기술된 방법을 사용하여 본 분야의 숙련자에 의해 즉시 확인된다.

통상, 본 발명의 구체예의 간섭 RNA의 유효량은 100 pM 내지 1000 nM, 또는 1 nM 내지 400 nM, 또는 5 nM 내지 약 100 nM, 또는 약 10 nM의 표적 세포 표면의 세포 외 농도를 유발한다. 이 국소 농도를 달성하기 위하여 요구되는 투여량은 전달 방법, 전달의 자리, 전달 부위 및 표적 세포 또는 조직 사이의 세포층의 수, 전달이 전체적인식 또는 국소적인식 등을 포함하는 매우 다양한 요소에 따라 달라질 수 있다. 전달 부위에서의 농도는 표적 세포 또는 조직의 표면에서보다 상당히 높을 수 있다. 국소적 조성물은 하루에 1회 내지 4회, 표적 기관, 이를 테면 눈의 표면에 전달되거나 또는 숙련된 임상의의 관례적인 재량에 따라서 매일, 주마다, 격주마다, 달마다 또는 그 이상으로 전달 스케쥴을 연장할 수도 있다. 제제의 pH는 약 pH 4.0 내지 약 ph 9.0, 또는 pH 4.5 내지 pH 7.4이다.

제제의 유효량은 예를 들면, 대상의 연령, 인종 및 성별, 표적 유전자 전사/단백질 전환율, 간섭 RNA 효능 및 간섭 RNA 안정성과 같은 인자에 달려있다. 일 구체예에서, 간섭 RNA는 표적 기관에 국소적으로 전달되며 치료적 용량으로 소주망, 망막 또는 시신경유두와 같은 GREM1 mRNA-함유 조직에 도달하여, GREM1-관련 질환 진행을 개선한다.

GREM1 mRNA에 대한 간섭 RNA로의 환자의 치료는 작용 기간을 연장시킴으로써 소 분자 치료가 보다 유익할 것이 예상되어 지므로, 투여량 횟수는 감소될 것이고 환자의 순응은 나아지며, 표적 특이성은 증가하고 이에 따라 부작용이 감소할 것이다.

본원에서 사용되는 "허용되는 담체"는 최대한 안구 자극이 없고, 필요하다면 적절한 보존 상태가 제공되고, 동일한 용량으로 본 발명의 하나 이상의 간섭 RNA를 전달할 수 있는 담체를 말한다. 본 발명의 구체예에서 간섭 RNA의 투여를 위하여 허용되는 담체는 양이온성 지질-기제의 트랜스펙션 제제 TransIT^®-TKO(미루스 사, Madison, WI), LIPOFECTIN^®, 리포펙타민, OLIGOFECTAMINE™(인비트로젠, Carlsbad, CA) 또는 DHARMAFECT™(다마콘, Lafayette, CO); 폴리에틸렌이민과 같은 폴리양이온; Tat, 폴리아르기닌 또는 Penetratin(Antp 펩티드)과 같은 양이온 펩티드; 또는 리포좀을 포함한다. 리포좀은 표준 소낭-형성 지질 및 콜레스테롤과 같은 스테롤로부터 형성되며, 예를 들면, 내피 세포 표면 항원에 대하여 결합 친화도를 갖는 단일클론성 항체와 같은 표적 분자를 포함할 수 있다. 또한, 리포좀은 페길화 리포좀일 수 있다.

간섭 RNA는 용액 중에, 현탁액 중에 또는 생분해성 또는 비-생분해성 전달 장치로 전달될 수 있다. 간섭 RNA는 단독으로 또는 정의된 공유 접합체 성분으로서 전달될 수 있다. 또한, 간섭 RNA는 양이온의 지질, 양이온의 펩티드 또는 양이온의 폴리머와 복합체를 형성할 수 있으며; 단백질, 융합 단백질 또는 핵산과 결합하는 성질을 갖는 단백질 도메인(예, 프로타민)과 복합체를 형성할 수 있거나; 나노입자 또는 리포좀 중에 캡슐화될 수 있다. 조직- 또는 세포-특이적 전달은 항체 또는 항체 단편과 같은 적절한 표적 부분의 포함으로 이루어질 수 있다.

간섭 RNA는 예를 들어, 에어로졸, 구강, 피부, 피부내, 흡입, 근육내, 비강내, 안구내, 폐내, 정맥내, 복강내, 비강, 안구, 경구, 귀, 비경구, 패치, 피하, 혀 밑, 국소적 또는 경피 투여를 통하여 전달될 수 있다.

특정 구체예에서, 간섭 RNA 분자를 사용한 안구 질병의 치료는 눈에 직접적으로 간섭 RNA 분자를 투여하여 달성된다. 눈으로의 국부 투여는 전신 전달보다 투여량이 더 작을 수 있고, 분자가 눈 외의 조직의 유전자 표적을 침묵시킬 확률이 더 적은 것을 포함하는 많은 이유로 유익하다.

수 많은 연구에서 눈으로 간섭 RNA 분자를 생체 내 전달하는 것이 성공적이며 유효한 것으로 나타났다. 예를 들어, Kim 등은 VEGF 경로 유전자를 표적으로 하는 siRNA의 결막하 주사 및 전신 전달이 마우스 눈에서 혈관 신생을 억제하는 것을 기술하였다 (Kim et al., 2004, Am. J. Pathol. 165:2177-2185). 또한, 연구는 유리체 강으로 전달된 siRNA가 눈을 통해 확산될수 있으며, 주사 후 최대 5일 까지 검출 가능한 것을 나타내었다 (Campochiaro, 2006, Gene Therapy 13:559-562).

간섭 RNA는 안구 주위, 결막, 테논낭하, 전방내, 유리체내, 안구내, 망막하, 결막하, 눈뒤 또는 시신경관내 주입과 같은 안조직 주입에 의하여; 카테터 또는 망막 펠렛, 안구내 삽입, 좌약 또는, 다공성, 비다공성 또는 젤라틴 물질을 포함하는 임플란트와 같은 다른 대체 기구의 사용으로; 국소적 점안액 또는 연고로; 또는 공막(공막을 통하여)에 인접하거나 공막 내에서(공막내) 또는 눈 내에 이식되거나 쿨데삭(Cul-De-Sac)의 서방성 기구에 의해 눈에 직접 전달될 수 있다. 전방내 주입 은 각막에서 안구의 전방을 통하여 약제가 소주망으로 도달하도록 할 수 있다. 시신경관내 주입은 쉴렘관으로 방출하는 정맥 채취기 채널로 또는 쉴렘관을 통하여 이루어질 수 있다.

안과적 전달을 위하여, 간섭 RNA는 안과학적으로 허용되는 보존제, 공용매, 계면활성제, 점성 증진제, 침투 증진제, 완충액, 염화나트륨 또는 물과 배합되어, 멸균된 안용 수성 현탁액 또는 용액을 형성할 수 있다. 용액 제제는 생리적으로 허용되는 등장성 수성 완충액 중에 간섭 RNA를 용해시켜 제조될 수 있다. 또한, 용액은 간섭 RNA의 용해를 보조하기 위하여 허용되는 계면활성제를 포함할 수 있다. 하이드록시메틸 셀룰로오스, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등의 점성 형성 시약은 본 발명의 조성물에 첨가되어 화합물의 보유력을 증진시킬 수 있다.

멸균 안용 연고 제제를 제조하기 위하여, 간섭 RNA는 미네랄 오일, 액체 라놀린 또는 백색 바셀린과 같은 적절한 비히클 중에서 보존제와 배합된다. 멸균 안용 젤 제제는 간섭 RNA를, 예를 들면, 당업계에 공지된 방법에 따라 CARBOPOL^®-940(BF Goodrich, Charlotte, NC) 등의 배합물로부터 제조된 친수성 기제에 현탁함으로써 제조될 수 있다. VISCOAT^®(Alcon Laboratories, Inc., Fort Worth, TX)는 예를 들면, 안구내 주입에 이용될 수 있다. 본 발명의 다른 조성물은 눈에서 간섭 RNA의 침투성이 작을 경우, 크레모폴 및 TWEEN^® 80(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, Sigma Aldrich, St. Louis, MO)과 같은 침투 증진제를 포함할 수 있 다.

특정 구체예에서, 본 발명은 세포 중에서 본원에서 상술한 mRNA의 발현을 약화하는 시약을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 siRNA 또는 shRNA 발현 벡터를 포함한다. siRNA 및 비-바이러스 shRNA 발현 벡터를 위하여, 키트는 또한 트랜스펙션 시약 또는 다른 적절한 전달 비히클을 포함할 수 있다. 바이러스 shRNA 발현 벡터를 위하여, 키트는 바이러스 벡터 및/또는 바이러스 벡터의 생산을 위해 필요한 성분(예, 바이러스 벡터 주형 및 패키지를 위한 추가적인 헬퍼 벡터를 포함하는 벡터뿐만 아니라 패키지된 세포주)을 포함할 수 있다. 또한 키트는 양성 및 음성 대조군 siRNA 또는 shRNA 발현 벡터를 포함할 수 있다 (예, 비-표적 대조군 siRNA 또는 관련없는 mRNA를 표적으로 하는 siRNA)를 포함할 수 있다. 또한 키트는 관심 있는 표적 유전자(예, 웨스턴 블랏을 위하여 상응하는 단백질에 대한 항체 및/또는 표적 mRNA를 검출하기 위한 정량 PCR에 이용되는 프라이머 및 프로브)의 녹다운을 평가하는 시약을 포함할 수 있다. 대안적으로, 키트는 siRNA 서열 또는 shRNA 서열 및 사용설명서 및 시험관 내에서 전사에 의해 siRNA를 생산하거나 shRNA 발현 벡터를 작제하기 위하여 필요한 물질을 포함할 수 있다.

패키지된 조합에서, 엄격히 억제된 상태로 컨테이너 수단을 수용하기에 적당한 캐리어 수단 및 간섭 RNA 조성물과 허용되는 담체를 포함하는 제1 컨테이너 수단을 포함하는 키트 형태의 약학적 배합물이 추가로 제공된다. 또한, 이러한 키트는 필요하다면, 하나 이상의 다양한 상업적 약학적 키트 성분, 예를 들면, 당업자들이 용이하게 알 수 있는 바와 같은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 추 가의 컨테이너 등을 갖는 컨테이너를 포함할 수 있다. 투여되는 성분의 양을 나타내는 투여 안내 및/또는 성분 혼합을 안내하는 인쇄된 사용 설명서가 삽입물 또는 라벨로서 키트에 또한 포함될 수 있다.

당업자들은 본 명세서에 비추어, 본원에 개시된 구체예의 명백한 변형이 본 발명의 목적 및 범위를 벗어나지 않고 만들어질 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 본원에서 개시된 모든 구체예는 본 명세서에 비추어볼 경우, 과도한 실험 없이 만들어질 수 있으며 실행될 수 있다. 본 발명의 모든 영역은 명세서 및 이와 동등한 구체예로 준비되었다. 명세서는 본 발명에 주어진 권리를 보호하기 위한 전체 관점에서 과도하게 좁게 해석되지 않아야 한다.

본 발명의 특정 구체예를 나타내고 기술하였으나, 수많은 변화와 대안적인 구체예가 당업자에게 발생할 것이다. 따라서, 본 발명은 그의 목적 또는 필수적인 특성을 벗어나지 않는 다른 특정 형태로 구체화될 수 있다. 기술된 구체예는 모든 면에서 제한하는 것이 아닌 설명하는 것으로서 고려될 것이다. 이에 따라, 본 발명의 범위는 상술한 설명보다 첨부된 청구항에 의해 나타내어진다. 청구항의 등가물의 의미 및 범위 내에 있는 청구항에 대한 모든 변경은 그의 범위 내에 포함될 것이다. 또한, 본원에 언급된 모든 공개 문헌, 특허 및 출원은 이의 전체가 제시된 것과 같이 본원에 참고로 인용된다.

실시된 실험 및 얻은 결과를 포함하는 다음 실시예는 예시의 목적일 뿐이며, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

GTM -3 세포에서 특이적으로 그렘린을 침묵시키기 위한 간섭 RNA

표준 시험관 내 농도 (0.1- 10 nM)의 그렘린 siRNA 또는 siCONTROL RISC-부재 siRNA #2 및 DHARMAFECT® #1 트랜스펙션 시약 (Dharmacon, Lafayette, CO)을 사용하여 GTM-3 세포의 트랜스펙션을 수행하였다. 모든 siRNA를 20 mM KCl, 6 mM HEPES (pH 7.5), 0.2 mM MgCl₂의 수용액인 1X siRNA 완충액 중에 용해시켰다. siRNA의 부피가 동 부피의 1X siRNA 완충액으로 대체된 완충액 대조군(null)을 대조군 샘플에 포함시켰다. 그렘린 siRNA는 그렘린 mRNA 서열에 포함된 19-뉴클레오티드 서열에 대하여 특이성을 갖는 이중-가닥 간섭 RNA이다(서열 번호 1에서 유래). siGremlin #1은 서열 번호 63을 표적으로 하고; siGremlin #2는 서열 번호 95를 표적으로 하며; siGremlin #3은 서열 번호 85를 표적으로 하고; siGremlin #4는 서열 번호 51을 표적으로 한다. 고성능 cDNA 역 전사 키트, Assays-On-Demand 유전자 발현 키트, TaqMan Universal PCR 마스터 믹스, 및 ABI PRISM 7700 서열 검출기 (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여, 그렘린 mRNA 수준을 결정하였다. 그렘린 mRNA 발현을 PPIB3 mRNA 수준에 대하여 정상화하고, 비-트랜스펙션 세포(null)에서 그렘린 발현과 비교하여 기록하였다. 항-그렘린 항체를 사용하여 그렘린 단백질 발현을 웨스턴 블롯으로 결정하였다 (Orbigen, San Diego, CA). 도 1에 나타낸 바와 같이, RISC-부재의 음성 대조군 siRNA로 트랜스펙션하면, 그렘린 mRNA 발현이 25-50% 증가하였다. 따라서, 비-트랜스펙션 세포에서 그렘린 발현 에 대한 정상화는 그렘린 mRNA 발현에서 그렘린-특이적 siRNA의 효과를 낮게 산정할 수도 있다. 시험된 4개의 siRNA 중에서 siGremlin #2가 그렘린 mRNA 발현에 가장 큰 효과를 가졌으며, 비-트랜스펙션 세포에 비하여 1 및 0.1 nM에서 ≤ 50% 감소 및 10 nM에서 약 65% 감소를 유발하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, siGremlin #2는 그렘린 단백질 발현을 상당히 감소시켰으며, 이는 qRT-PCR 데이터와 일치한다.

상기의 설명은 본 발명의 특정 구체예를 강조하는 것이며, 이의 모든 변형 또는 이를 대신하는 등가물이 첨부된 청구항에 나타낸 바와 같은 본 발명의 목적 및 범위 내에 있는 것이 이해될 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Alcon Manufacturing, Ltd. Chatterton, Jon E. Clark, Abbot F. <120> RNAi-Mediated Inhibition of Gremlin for Treatment of IOP-Related Conditions <130> 3146 <160> 98 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 4175 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 actcggtgcg ccttccgcgg accgggcgac ccagtgcacg gccgccgcgt cactctcggt 60 cccgctgacc ccgcgccgag ccccggcggc tctggccgcg gccgcactca gcgccacgcg 120 tcgaaagcgc aggccccgag gacccgccgc actgacagta tgagccgcac agcctacacg 180 gtgggagccc tgcttctcct cttggggacc ctgctgccgg ctgctgaagg gaaaaagaaa 240 gggtcccaag gtgccatccc cccgccagac aaggcccagc acaatgactc agagcagact 300 cagtcgcccc agcagcctgg ctccaggaac cgggggcggg gccaagggcg gggcactgcc 360 atgcccgggg aggaggtgct ggagtccagc caagaggccc tgcatgtgac ggagcgcaaa 420 tacctgaagc gagactggtg caaaacccag ccgcttaagc agaccatcca cgaggaaggc 480 tgcaacagtc gcaccatcat caaccgcttc tgttacggcc agtgcaactc tttctacatc 540 cccaggcaca tccggaagga ggaaggttcc tttcagtcct gctccttctg caagcccaag 600 aaattcacta ccatgatggt cacactcaac tgccctgaac tacagccacc taccaagaag 660 aagagagtca cacgtgtgaa 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atttttatgg caagatattt gtggtcttga 3240 tcatacctat taaaataatg ccaaacacca aatatgaatt ttatgatgta cactttgtgc 3300 ttggcattaa aagaaaaaaa cacacatcct ggaagtctgt aagttgtttt ttgttactgt 3360 aggtcttcaa agttaagagt gtaagtgaaa aatctggagg agaggataat ttccactgtg 3420 tggaatgtga atagttaaat gaaaagttat ggttatttaa tgtaattatt acttcaaatc 3480 ctttggtcac tgtgatttca agcatgtttt ctttttctcc tttatatgac tttctctgag 3540 ttgggcaaag aagaagctga cacaccgtat gttgttagag tcttttatct ggtcagggga 3600 aacaaaatct tgacccagct gaacatgtct tcctgagtca gtgcctgaat ctttattttt 3660 taaattgaat gttccttaaa ggttaacatt tctaaagcaa tattaagaaa gactttaaat 3720 gttattttgg aagacttacg atgcatgtat acaaacgaat agcagataat gatgactagt 3780 tcacacataa agtcctttta aggagaaaat ctaaaatgaa aagtggataa acagaacatt 3840 tataagtgat cagttaatgc ctaagagtga aagtagttct attgacattc ctcaagatat 3900 ttaatatcaa ctgcattatg tattatgtct gcttaaatca tttaaaaacg gcaaagaatt 3960 atatagacta tgaggtacct tgctgtgtag gaggatgaaa ggggagttga tagtctcata 4020 aaactaattt ggcttcaagt ttcatgaatc tgtaactaga atttaatttt caccccaata 4080 atgttctata tagcctttgc taaagagcaa ctaataaatt aaacctattc tttcaaaaaa 4140 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 4175 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 2 gcatgtgacg gagcgcaaa 19 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sense strand with 3'NN <220> <221> misc_RNA <222> (1)..(19) <223> ribonucleotides <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> any, A, T/U, C, G <400> 3 gcaugugacg gagcgcaaan n 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Antisense strand with 3'NN <220> <221> misc_RNA <222> (1)..(19) <223> ribonucleotides <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> any, A, T/U, C, G <400> 4 uuugcgcucc gucacaugcn n 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Sense Strand <400> 5 gcaugugacg gagcgcaaau u 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Antisense Strand <400> 6 uuugcgcucc gucacaugcu u 21 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> 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Sequence <400> 14 atgtgacgga gcgcaaata 19 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 15 tgacggagcg caaatacct 19 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 16 cggagcgcaa atacctgaa 19 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 17 tgaagcgaga ctggtgcaa 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 18 agccgcttaa gcagaccat 19 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 19 ttaagcagac catccacga 19 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 20 acagtcgcac catcatcaa 19 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 21 acagccacct accaagaag 19 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 22 cagccaccta ccaagaaga 19 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Target Sequence <400> 23 gtcgttgcat atccatcga 19 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Claims

RNA 간섭을 통하여 GREM1 mRNA의 발현을 약화시키는 간섭 RNA 분자를 환자에 투여하는 것을 포함하여, 이를 요하는 환자에서 IOP-관련 증상을 치료하는 방법.
제 1항에 있어서, 간섭 RNA 분자가 이중 가닥이고, 각 가닥은 독립적으로 약 19 내지 약 27개 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 각 가닥은 독립적으로 약 19 내지 약 25개 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 각 가닥은 독립적으로 약 19 내지 약 21개 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 센스 및 안티센스 가닥이 링커에 의해 연결되어 환자에서 GREM1 mRNA 발현을 약화시킬 수 있는 shRNA를 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 간섭 RNA 분자가 블런트(blunt) 말단을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 간섭 RNA 분자의 적어도 한 가닥이 3' 오버행(overhang)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서, 3' 오버행이 약 1 내지 약 6개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 3' 오버행이 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 간섭 RNA 분자가 에어로졸, 구강, 피부, 피부내, 흡입, 근육내, 비강내, 안구내, 폐내, 정맥내, 복강내, 비강, 안구, 경구, 귀, 비경구, 패치, 피하, 혀 밑, 국소적 또는 경피 경로를 통하여 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 간섭 RNA 분자가 간섭 RNA 분자를 발현할 수 있는 발현 벡터로부터 생체 내 발현을 통하여 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 환자가 IOP-관련 증상을 갖거나, 이의 발생 위험이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항에 있어서, IOP-관련 증상이 녹내장인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 간섭 RNA 분자가 서열 번호 2 및 서열 번호 13 내지 서열 번호 98의 임의의 것에 상응하는 GREM1 mRNA의 부분을 인식하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 간섭 RNA 분자가 서열 번호 1의 뉴클레오티드 402, 403, 404, 407, 410, 425, 449, 455, 485, 642, 643, 686, 784, 1230, 1516, 1554, 1811, 2101, 2185, 2212, 2223, 2368, 2370, 2401, 2412, 2413, 2617, 2692, 2693, 2862, 2889, 3084, 3733, 3743, 3752, 3773, 3846, 4004, 4099, 216, 235, 236, 265, 267, 273, 279, 280, 281, 389, 391, 401, 416, 426, 427, 439, 440, 459, 461, 471, 472, 491, 497, 520, 545, 546, 575, 581, 587, 592, 595, 596, 598, 599, 624, 626, 640, 646, 650, 652, 657, 659, 673, 676, 678, 679, 688, 또는 689를 포함하는 GREM1 mRNA의 부분을 인식하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 간섭 RNA 분자가 적어도 하나의 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 간섭 RNA 분자가 shRNA, siRNA, 또는 miRNA인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 간섭 RNA 분자가 국소적, 유리체내, 경공막(transcleral), 안구 주위, 결막, 테논낭하, 전방내, 망막하, 결막하, 눈뒤 또는 시신경관내 경로를 통하여 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
RNA 간섭을 통하여 GREM1 mRNA의 발현을 하향 조절하는 간섭 RNA 분자를 환자의 눈에 투여하는 것을 포함하여, 환자의 눈에서 GREM1 mRNA의 발현을 약화시키는 방법.
제 19항에 있어서, 간섭 RNA 분자가 이중 가닥이고, 각 가닥은 독립적으로 약 19 내지 약 27개 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는 방법.
제 20항에 있어서, 각 가닥은 독립적으로 약 19 내지 약 25개 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는 방법.
제 20항에 있어서, 각 가닥은 독립적으로 약 19 내지 약 21개 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는 방법.
제 20항에 있어서, 센스 및 안티센스 가닥이 링커에 의해 연결되어 환자의 GREM1 mRNA 발현을 약화시킬 수 있는 shRNA를 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 20항에 있어서, 간섭 RNA 분자가 블런트 말단을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 20항에 있어서, 간섭 RNA 분자의 적어도 한 가닥이 3' 오버행을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 25항에 있어서, 3' 오버행이 약 1 내지 약 6개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 26항에 있어서, 3' 오버행이 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19항에 있어서, 간섭 RNA 분자가 에어로졸, 구강, 피부, 피부내, 흡입, 근육내, 비강내, 안구내, 폐내, 정맥내, 복강내, 비강, 안구, 경구, 귀, 비경구, 패치, 피하, 혀 밑, 국소적 또는 경피 경로를 통하여 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19항에 있어서, 간섭 RNA 분자가 간섭 RNA 분자를 발현할 수 있는 발현 벡터로부터 생체 내 발현을 통하여 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19항에 있어서, 환자가 IOP-관련 증상을 갖거나, 이의 발생 위험이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 30항에 있어서, IOP-관련 증상이 녹내장인 것을 특징으로 하는 방법.
제 19항에 있어서, 간섭 RNA 분자가 서열 번호 2 및 서열 번호 13 내지 서열 번호 98의 임의의 것에 상응하는 GREM1 mRNA의 부분을 인식하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19항에 있어서, 간섭 RNA 분자가 서열 번호 1의 뉴클레오티드 402, 403, 404, 407, 410, 425, 449, 455, 485, 642, 643, 686, 784, 1230, 1516, 1554, 1811, 2101, 2185, 2212, 2223, 2368, 2370, 2401, 2412, 2413, 2617, 2692, 2693, 2862, 2889, 3084, 3733, 3743, 3752, 3773, 3846, 4004, 4099, 216, 235, 236, 265, 267, 273, 279, 280, 281, 389, 391, 401, 416, 426, 427, 439, 440, 459, 461, 471, 472, 491, 497, 520, 545, 546, 575, 581, 587, 592, 595, 596, 598, 599, 624, 626, 640, 646, 650, 652, 657, 659, 673, 676, 678, 679, 688, 또는 689를 포함하는 GREM1 mRNA의 부분을 인식하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19항에 있어서, 간섭 RNA 분자가 국소적, 유리체내, 경공막, 안구 주위, 결막, 테논낭하, 전방내, 망막하, 결막하, 눈뒤 또는 시신경관내 경로를 통하여 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19항에 있어서, 간섭 RNA 분자가 적어도 하나의 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 19항에 있어서, 간섭 RNA 분자가 shRNA, siRNA, 또는 miRNA인 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 서열 번호 2 및 서열 번호 13 내지 서열 번호 98 중 임의의 것에 상응하는 mRNA의 3' 말단의 끝에서 두번째 13개 뉴클레오티드와 적어도 90% 서열 상보성 또는 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 적어도 13개의 인접 뉴클레오티드의 영역;

(b) 서열 번호 2 및 서열 번호 13 내지 서열 번호 98 중 임의의 것에 상응하는 mRNA의 3' 말단의 끝에서 두번째 14개 뉴클레오티드와 적어도 85% 서열 상보성 또는 적어도 85% 서열 상동성을 갖는 적어도 14개의 인접 뉴클레오티드의 영역; 또는

(c) 서열 번호 2 및 서열 번호 13 내지 서열 번호 98 중 임의의 것에 상응하는 mRNA의 3' 말단의 끝에서 두번째 15, 16, 17, 또는 18개 뉴클레오티드와 각각 적어도 80% 서열 상보성 또는 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 적어도 15, 16, 17, 또는 18개의 인접 뉴클레오티드의 영역을 포함하며, 약 19 내지 약 49개 뉴클레오 티드 길이를 갖는 간섭 RNA 분자.
제 37항에 있어서, 서열 번호 2 및 서열 번호 13 내지 서열 번호 98의 임의의 것에 상응하는 GREM1 mRNA의 부분을 인식하는 것을 특징으로 하는 간섭 RNA 분자.
제 37항에 있어서, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 402, 403, 404, 407, 410, 425, 449, 455, 485, 642, 643, 686, 784, 1230, 1516, 1554, 1811, 2101, 2185, 2212, 2223, 2368, 2370, 2401, 2412, 2413, 2617, 2692, 2693, 2862, 2889, 3084, 3733, 3743, 3752, 3773, 3846, 4004, 4099, 216, 235, 236, 265, 267, 273, 279, 280, 281, 389, 391, 401, 416, 426, 427, 439, 440, 459, 461, 471, 472, 491, 497, 520, 545, 546, 575, 581, 587, 592, 595, 596, 598, 599, 624, 626, 640, 646, 650, 652, 657, 659, 673, 676, 678, 679, 688, 또는 689를 포함하는 GREM1 mRNA의 부분을 인식하는 것을 특징으로 하는 간섭 RNA 분자.
제 37항에 있어서, shRNA, siRNA, 또는 miRNA인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 37항에 있어서, 적어도 하나의 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 37항에 있어서, 이중 가닥이며, 이의 적어도 한 가닥은 3' 오버행을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 42항에 있어서, 3' 오버행이 약 1 내지 약 6개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 43항에 있어서, 3' 오버행이 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 37항에 있어서, 이중 가닥이며 블런트 말단을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.