CN101137754A - 用于治疗青光眼的卷曲相关蛋白-1的RNAi介导性抑制 - Google Patents

用于治疗青光眼的卷曲相关蛋白-1的RNAi介导性抑制 Download PDF

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CN101137754A CNA2006800079445A CN200680007944A CN101137754A CN 101137754 A CN101137754 A CN 101137754A CN A2006800079445 A CNA2006800079445 A CN A2006800079445A CN 200680007944 A CN200680007944 A CN 200680007944A CN 101137754 A CN101137754 A CN 101137754A
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A·F·克拉克
王万恒
L·G·麦克纳特
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Abstract

提供RNA干扰用于抑制卷曲相关蛋白－1mRNA的表达，尤其用于治疗患有青光眼的或有青光眼发展风险的患者。

Description

用于治疗青光眼的卷曲相关蛋白-1的RNAi介导性抑制
本发明涉及通过抑制卷曲相关蛋白-1(Frizzled Related Protein-1，FRP)表达而治疗青光眼的干扰性RNA组合物的领域。
发明背景
青光眼是共有某些临床特征的一组多样的视神经病。青光眼中视力损失的原因是神经视网膜中视网膜神经节细胞的选择性死亡，这种选择性死亡的临床诊断为视野的特征性改变、神经纤维层缺损和视神经头(ONH)累进杯化。发生青光眼的一个主要风险因素是存在高眼压症(升高的眼内压，IOP)。需要足够的眼内压以便维持眼的形状和提供允许房水流动至无血管的角膜和晶状体压力梯度。IOP水平似乎还参与正常张力青光眼(NTG)的发病机制，如患者从降低IOP的药物获益所证实。一旦在NTG患者中调节角膜中央厚度至IOP读数时，可以发现这些患者中多数患者眼内压过高。
与青光眼相关的升高的IOP归咎于处在眼前房的虹膜角膜角中的一小片特化组织即小梁网(TM)内升高的房水流出阻力。TM的青光眼性改变包括TM细胞的损失和胞外残片(包括蛋白斑样物质)的沉积和积累。此外，还存在发生于青光眼性ONH内的改变。在青光眼性眼中，在ONM神经胶质细胞中存在形态学改变和活动度改变。作为对升高的IOP和/或短暂缺血性损伤的反应，在ONH胞外基质组成方面存在改变并且在神经胶质细胞形态学及视网膜神经节细胞轴突形态学方面存在变异。
原发性青光眼因具有解剖学或生理学基础的眼内液体流动紊乱产生。继发性青光眼因眼外伤或眼创伤或先存疾病发生。原发性开角型青光眼(POAG)又称作慢性青光眼或单纯性青光眼，占全部原发性青光眼的90％。POAG以小梁网降解为特征，该降解导致对来自眼的液体排出的异常高阻力。这种阻力的后果是IOP的增加，其中推动正常由眼产生的液体克服这种增加的阻力需要IOP的增加。
目前的抗青光眼疗法包括通过使用房水形成抑制剂或增强葡萄膜巩膜流出的药剂降低IOP、激光小梁成型术或作为旨在改善排出的滤过手术的小梁切除术。药物抗青光眼方法已经显示出多种有害副作用。例如，缩瞳药如毛果芸香碱可以引起视力模糊和其它不利的视觉副作用。全身施用的碳酸酐酶抑制剂(CAI)还可以引起恶心、消化不良、疲劳和代谢性酸中毒。另外，某些β-阻断剂已经日益与严重的肺部副作用相关，其原因是β-阻断剂对肺组织中β-2受体的影响。拟交感神经药引起心动过速、心律不齐和高血压。此类副作用可以导致患者适从性降低或终止治疗。此外，目前降低IOP疗法的效力是相对短时的，需要在每日期间重复给药，并且在某些例子中，效力随时间下降。
鉴于青光眼的重要性以及目前治疗方法的不当，需要改良的治疗方法。
发明简述
本发明通过提供对青光眼和前期青光眼(pre-glaumoma)相关性病症非常有力和有效的治疗、预防或介入而克服现有技术的这些缺点和其它缺点。在一个方面，本发明方法包括通过施用干扰性RNA治疗患青光眼的或有青光眼发展风险的受试者，其中所述的干扰性RNA使FRP-1mRNA表达沉默，因而干扰Wnt信号途径并阻止与青光眼和前期青光眼细胞活性有关的级联事件。
术语“青光眼”如本文中所用，包括眼的前期青光眼病症(如高血压)和眼的青光眼病症，并且包括由直接或间接导致青光眼和青光眼相关性病症的FRP-1mRNA的表达产生的细胞性改变。本文所提供的干扰性RNA提供这种沉默作用，与此同时消除因非特异性药剂所致的毒性副作用。
本发明涉及靶向FRP-1mRNA并且因此干扰FRP-1mRNA表达的干扰性RNA。本发明的干扰性RNA用于治疗患有青光眼或有青光眼发展风险的患者。
本发明的实施方案是减弱受试者的卷曲相关蛋白-1mRNA表达的方法，该方法包括向受试者施用包含有效量的具有19至49个核苷酸长度的干扰性RNA和可药用载体的组合物。卷曲相关蛋白-1mRNA的表达因而受到减弱。
本发明的另一个实施方案是在需要治疗的受试者中治疗青光眼的方法。该方法包括向向受试者的眼施用包含有效量的具有19至49个核苷酸长度的干扰性RNA和可药用载体的组合物。青光眼因此得到治疗。在本发明的一个实施方案中受试者是人并且此人患青光眼。在另一个实施方案中，受试者是人并且此人具有青光眼发展风险。
对于以上所提及的实施方案，干扰性RNA包含至少13个连续核苷酸的区域，该区域与对应于SEQ ED NO：2、SEQ ID NO：8-SEQ ID NO：190和SEQ ID NO：192任何一个的mRNA3′末端的次末13个核苷酸具有至少90％的序列互补性或至少90％的序列同一性。
在以上所提及方法的又一实施方案中，组合物还包含具有19至49个核苷酸长度并包含至少13个连续核苷酸的区域的第二个干扰性RNA，其中所述的区域与对应于SEQ ED NO：2、SEQ ID NO：8-SEQ ID NO：190和SEQ ID NO：192任何一个的第二个mRNA3′末端的次末13个核苷酸具有至少90％的序列互补性或至少90％的序列同一性。
在本发明的又一个实施方案中，减弱受试者的卷曲相关蛋白-1mRNA表达的方法包括向受试者施用包含有效量的具有19至49个核苷酸长度的干扰性RNA和可药用载体的组合物，并且此干扰性RNA包含有义核苷酸链、反义核苷酸链和至少19个核苷酸至少接近完全连续互补的区域，其中反义链在生理条件下与对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：191的mRNA的一部分杂交并具有至少19个核苷酸的区域，所述区域与分别对应于SEQID NO：1或SEQ ID NO：191的mRNA的杂交部分至少接近完全连续互补。卷曲相关蛋白-1mRNA的表达因而受到减弱。
本发明的另一个实施方案是在需要治疗的受试者中治疗青光眼的方法。该方法包括向向受试者的眼施用包含有效量的具有19至49个核苷酸长度的干扰性RNA和可药用载体的组合物，该干扰性RNA包含有义核苷酸链、反义核苷酸链和具有至少19个核苷酸至少接近完全连续互补的区域；其中反义链在生理条件下与对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：191的mRNA的一部分杂交并具有至少19个核苷酸的区域，所述区域与分别对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：191的mRNA的杂交部分至少接近完全连续互补。青光眼因而得到治疗。
对于以上所提及的方法，设计干扰性RNA的反义链以便靶向对应于SEQ ID NO：1且包含核苷酸509、521、524、767、818、843、850、872、881、900、959、968、971、983、986、989、1001、1016、1019、1022、1031、1034、1052、1088、1121、1127、1207、1360、1445、1450、1478、1487、1524、1535、1562、1579、1613、1661、1667、1724、1730、1753、1757、1763、1771、1794、1800、1813、1887、1893、1916、2001、2006、2106、2117、2135、2142、2152、2200、2203、2206、2241、2263、2276、2279、2389、2410、2430、2464、2468、2482、2502、2506、2572、2645、2666、2681、2697、2715、2734、2760、2770、2783、2797、2807、2844、2917、2937、2961、3005、3010、3080、3130、3150、3156、3179、3185、3196、3244、3281、3345、3350、3365、3372、3403、3410、3424、3428、3450、3453、3460、3596、3668、3672、3746、3762、3776、3786、3789、3826、3835、3844、3847、3867、3912、3924、3958、3976、3981、4012、4022、4071、4089、4154、4157、4208、4369、4375、4441、966、408、409、463、754、862、863、864、868、874、909、913、915、956、1118、1135、1634、1637、1640、1737、1867、1868、2100、2259、2260、2483、2598、2673、2675、2779、2985、2986、2987、2988、3055、3062、3161、3217、3355、3623、3648、3665、3817、4153或4252的mRNA。在又一个实施方案中，设计干扰性RNA的反义链以便靶向对应于SEQ ID NO：191且包含核苷酸3352的mRNA。
具有19至49个核苷酸长度的第二个干扰性RNA也可以施用至受试者；此第二个干扰性RNA包含有义核苷酸链、反义核苷酸链和至少19个核苷酸至少接近完全连续互补的区域，其中第二个干扰性RNA的反义链在生理条件下与对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：191的mRNA的第二个部分杂交，并且该反义链具有至少19个核苷酸的区域，所述区域与分别对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：191的mRNA的第二个杂交部分至少接近完全连续互补。
本发明的又一个实施方案是减弱受试者的卷曲相关蛋白-1mRNA表达的方法，包括向受试者施用包含有效量的具有19至49个核苷酸长度的单链干扰性RNA和可药用载体的组合物，其中单链干扰性RNA在生理条件下与对应于包含如上所确定核苷酸的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：191的mRNA的一部分杂交。
本发明的又一个实施方案包括组合物，该组合物包含具有19至49个核苷酸长度并包含对应于SEQ ED NO：2、SEQ ID NO：8-SEQ ID NO：190和SEQ ID NO：192任何一个的核苷酸序列或其互补序列的干扰性RNA和可药用载体。
如本文中所述的任意实施方案在制备用于如前所述减弱FRP-1mRNA表达的药物中的用途也是本发明实施方案。
附图简述
本图显示，如通过QPCR所测量，干扰性RNA对COS7细胞中内源性FRP1mRNA水平的影响。如实施例1中所述，与对照相比，在转染后第1天(22％，P＝0.04)和第3天(32％，P＝0.002)观察到FRP1mRNA的显著抑制。
发明详述
RNA干扰(RNAi)是使用双链RNA(dsRNA)以使基因表达沉默的过程。不希望受理论的限制，RNAi始于通过RNA酶III样酶dicer将较长dsRNA切割成小的干扰性RNA(siRNA)。siRNA是通常长度在约19个至28个核苷酸、或20个至25个核苷酸、或21个至22个核苷酸并且常常含有二核苷酸3′突出端和5′磷酸末端及3′羟基末端的dsRNA。siRNA的一条链掺入称作RNA诱导性沉默复合体(RISC)的核糖核蛋白复合体。RISC利用此siRNA链确定至少部分地与所掺入siRNA链互补的mRNA分子，随后切割这些靶mRNA或抑制其转录。因此，将掺入至RISC的siRNA链称作引导链或反义链。称作过客链或有义链的另一条siRNA链从siRNA中消除并且至少部分地与靶mRNA同源。本领域技术人员将认识到，原则上siRNA两条链中任一条链均可以掺入RISC并作为引导链发挥功能。然而，对siRNA进行设计(例如在反义链的5′端处siRNA双链体稳定性降低)可利于反义链掺入RISC。
具有至少部分与引导链互补的序列的mRNA的RISC介导性切割引起该mRNA以及该mRNA所编码相应蛋白质的稳态水平下降。或者，RISC还可以通过翻译性抑制降低相应蛋白质的表达，而不切割靶mRNA。其它RNA分子和RNA样分子还可以与RISC相互作用并使基因表达沉默。可以与RISC相互作用的其它RNA分子的实例包括短发夹RNA(shRNA)、单链siRNA、微RNA(miRNA)和dicer-底物27聚双链体。除非另外说明，术语“siRNA”如本文中所用指双链干扰性RNA。可以与RISC相互作用的RNA样分子的实例包括含有一个或多个化学修饰核苷酸、一个或多个脱氧核糖核苷酸和/或一个或多个非磷酸二酯键的RNA分子。为了本讨论的目的，将可以与RISC相互作用并参与RISC介导性基因表达改变的全部RNA或RNA样分子称为“干扰性RNA”。因此，siRNA、shRNA、miRNA和dicer-底物27聚双链体是“干扰性RNA”的亚类。
本发明实施方案的干扰性RNA似乎以催化方式切割靶mRNA，即干扰性RNA能够以亚化学计量的量实现靶mRNA的抑制。当与反义疗法相比时，需要显著较少的干扰性RNA以便在如此切割条件下提供治疗效果。
本发明涉及干扰性RNA的用途，即抑制卷曲相关蛋白-1(FRP-1)mRNA的表达，因而干扰Wnt信号途经并阻止与青光眼和前期青光眼细胞活性有关的事件级联。根据本发明，外源提供或内源表达的干扰性siRNA特别有效地使卷曲相关蛋白-1(FRP-1)mRNA在眼组织中沉默。
卷曲相关蛋白(FRP)是分泌性蛋白质家族，其通过结合胞外的Wnt并且阻止Wnt与膜结合的卷曲相关蛋白受体相互作用，或通过与卷曲受体形成无功能的复合体而拮抗Wnt信号途径(Bafico等.J.Biol.Chem.，274(23)：16180-16187(1999))，因而阻止与一个细胞对另一个细胞及对胞外基质的差异性黏附有关的事件级联。
本发明人连同其它发明人，如Hellberg等美国公开的专利申请第2004/0186159号、申请第10/488,496号(在本文中完整地引用作为参考)所述，已经确定在众多青光眼性小梁网细胞系内卷曲相关蛋白(FRP)是差异性表达的。经过维持于培养基内已灌注的人眼前段的FRP-1灌注引起流动速率下降以及睫状体和小梁网(TM)中的β-联蛋白水平相应下降。在培养的前段中下降的流动速率模拟了完整的眼中流出阻力的增加(眼内压增加)。
本发明人连同其它发明人已经证实，在青光眼性小梁网组织和青光眼性细胞中FRP-1的表达上调(Clark等2001年2月28日提交的名为“Diagnostics and Therapeutics for Glaucoma”的美国公开的专利申请第2002/0049177号、专利申请第09/796,008号，所述专利申请在本文中完整地引用作为参考)。
这些结果证实，小梁网和睫状体中存在活化的Wnt信号途径并提示该途径至少部分地负责维持经过TM的流出量并从而控制IOP。
除非另外说明，本文中提及的核酸序列以5′至3′方向书写。术语“核酸”，如本文中所用，指DNA或RNA或其修饰的形式，包含DNA内存在的嘌呤或嘧啶碱基(腺嘌呤“6A”、胞嘧啶66C”、鸟嘌呤“6G”、胸腺嘧啶66T”)或RNA内存在的嘌呤或嘧啶碱基(腺嘌呤“A”、胞嘧啶66C”、鸟嘌呤“G”、尿嘧啶66U”)。本文中提供的干扰性RNA包含66T”碱基，尤其在3′末端包含“T”碱基，即便66T”碱基并不天然地存在于RNA内。“核酸”包括术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并且可以指单链分子或双链分子。双链分子通过A和T碱基、C和G碱基以及A和U碱基之间的Watson-Crick碱基配对形成。双链分子的链可以彼此间具有部分的、大部分的或完全的互补性并且形成杂合双链体，其结合强度取决于碱基序列互补的性质和程度。
mRNA序列看轻易地从对应于DNA序列的序列推导出。例如，SEQ IDNO：1提供与FRP-1的mRNA相对应的DNA的有义链序列。mRNA的序列与“T”碱基替换为“U”残基的DNA有义链序列完全相同。
因此，FRP-1的mRNA序列自SEQ ID NO：1获知，FRP-1等效物的mRNA序列自SEQ ID NO：191获知。
卷曲相关蛋白(FRP-1)mRNA：GenBank数据库提供登录号为AF056087的FRP-1的DNA序列，在“序列表”内作为SEQ ID NO：1提供。SEQ ID NO：1提供与编码FRP-1的mRNA相对应的DNA的有义链序列(除“T”碱基对应“U”碱基外)。FRP-1的编码序列为核苷酸303至1244。
以上引用的FRP-1mRNA序列的等效物是可变剪接形式、等位基因形式或其同族形式。同族形式是来自另一个哺乳动物物种的与SEQ ID NO：1同源的卷曲相关蛋白-1mRNA(即直向同源物)。与SEQ ID NO：1相关的FRP-1核酸序列包括具有GenBank登录号NM_003012(以下引用)、BC036503、AF001900、BC004466、AF017987和BT019677的那些核酸序列。
GenBank数据库提供登录号为NM_003012的FRP-1的其它DNA序列，在“序列表”内作为SEQ ID NO：191提供，并被视为SEQ ID NO：1的等效物。SEQ ID NO：191提供与编码FRP-1的mRNA相对应的DNA的有义链序列(除“T”碱基对应“U”碱基外)。FRP-1的编码序列为核苷酸303至1247。
减弱mRNA的表达：短语“减弱mRNA的表达”，如本文中所用，意指施用或表达一定量的干扰性RNA(例如siRNA)以便经mRNA切割或经翻译的直接抑制而减少靶mRNA翻译成蛋白质。靶mRNA或相应蛋白质的表达减少通常称作“敲低”并报道为相对于在非靶向性对照RNA(例如非靶向性siRNA)施用或表达后所存在的水平。本文中的实施方案考虑了敲低表达的量包括并且在50％至100％之间。然而，为本发明目的实现如此的敲低水平是不需要的。在一个实施方案中，施用靶向FRP-1的单一干扰性RNA。在另一个实施方案中，施用靶向FRP-1mRNA的两种或更多种干扰性RNA。
敲低通常通过使用定量聚合酶链式反应(qPCR)扩增法测量mRNA水平或通过蛋白质印迹或酶联免疫吸附测定法(ELISA)测量蛋白质水平进行评估。蛋白质水平的分析提供对mRNA切割以及翻译抑制的评估。用于测量敲低的其它技术包括RNA溶液杂交、核酸酶保护、RNA印迹杂交、用微阵列监测基因表达、抗体结合、放射免疫测定和荧光激活的细胞分析。
FRP-1的抑制还可以如本文先前引用作为参考的美国公开的专利申请2004/0186159中所述，通过检查灌注的人眼前段中的FRP-1水平、β-联蛋白水平或流出速率在体外测定。简而言之，眼的前段用Dulbecco氏改良Eagle氏培养基(DMEM)在11mm Hg恒压下灌注。每只眼的流出速率通过在指定时间内对其蓄积物称重进行测量。在稳定化时期后，眼用载体对照或乱序siRNA序列对照或如本文中所述用于减弱FRP-1的siRNA加以灌注并监测眼的流出速率2-5日。房水流出速率通过在指定时间内对其蓄积物称重进行测量。与对照值相比，流出量的增加表明siRNA对减弱FRP-1是有效的。
FRP-1的抑制还在人或哺乳动物中因观察到青光眼症状的改善，例如眼内压的改善、视野损失的改善或视神经头改变的改善加以推测。
干扰性RNA：在本发明的一个实施方案中，干扰性RNA(例如siRNA)具有有义链和反义链，并且有义链和反义链包含至少19个核苷酸至少接近完全连续互补的区域。在本发明的又一个实施方案中，干扰性RNA包含至少13、14、15、16、17或18个连续核苷酸的区域，其中该区域分别与mRNA内相应靶序列3′末端的次末13、14、15、16、17或18个核苷酸序列的具有互补性百分数或序列同一性百分数。
干扰性RNA的每条链的长度包含19至49个核苷酸，并且可以包含19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49个核苷酸长度。
siRNA的反义链是siRNA活性的引导介质，原因在于反义链掺入RISC，因而允许RISC确定与反义siRNA链具有至少部分互补性的靶mRNA用于切割或翻译性抑制。
在本发明的实施方案中，使用可得到的设计工具选择靶mRNA内的干扰性RNA靶序列(例如siRNA靶序列)。与FRP-1靶序列相对应的干扰性RNA随后通过转染表达靶mRNA的细胞，随后通过如上所述的敲低评估得到测试。
用于选择针对siRNA的靶序列的技术通过在洛克菲勒大学网站上可获得的2004年5月6日修订的Tuschl，T.等“The siRNA User Guide”；通过Ambion Inc.网站上的技术公告#506，“siRNA Design Guidelines”并通过基于网络的其它设计工具例如Invitrogen、Dharmacon、Integrated DNATechnologies、Genscript或Proligo提供。初始搜索参数可以包括35％至55％之间的G/C含量和19至27个核苷酸的siRNA长度。靶序列可以位于mRNA的编码序列内或5′或3′非翻译区内。
FRP-1mRNA的19-核苷酸DNA靶序列的实施方案存在于SEQ IDNO：1的核苷酸第509至527处：
5′-CGTGGGCTACAAGAAGATG-3′SEQ ID NO：2。
靶向SEQ ID NO：2的相应mRNA序列并具有21-核苷酸链和2-核苷酸3′突出端的本发明siRNA是：
5′-CGUGGGCUACAAGAAGAUGNN-3′SEQ ID NO：3
3′-NNGCACCCGAUGUUCUUCUAC-5′SEQ ID NO：4。
每个“N”残基可以是任意的核苷酸(A、C、G、U、T)或修饰的核苷酸。3′末端可以具有多个“N”残基，其数目在如下数字之间并包括这些数字：1、2、3、4、5和6。在两条链中任何一条链上的“N”残基可以是相同残基(例如UU、AA、CC、GG或TT)或它们可以是不相同的(例如AC、AG、AU、CA、CG、CU、GA、GC、GU、UA、UC或UG)。3′突出端可以是相同的或它们可以是不相同的。在一个实施方案中，两条链均具有3′UU突出端。
靶向SEQ ID NO：2的相应mRNA序列并在每一条链上具有21-核苷酸链和3′UU突出端的本发明siRNA是：
5′-CGUGGGCUACAAGAAGAUGUU-3′SEQ ID NO：5
3′-UUGCACCCGAUGUUCUUCUAC-5′SEQ ID NO：6。
干扰性RNA还可以具有核苷酸的5′突出端或其可以具有平端。靶向SEQ ID NO：2的相应mRNA序列并在每一条链上具有19-核苷酸链和平端的本发明siRNA是：
5′-CGUGGGCUACAAGAAGAUG-3′SEQ ID NO：193
3′-GCACCCGAUGUUCUUCUAC-5′SEQ ID NO：194。
双链干扰性RNA(例如siRNA)的链可以连接以形成发夹结构或茎-环结构(例如shRNA)。靶向SEQ ID NO：2的相应mRNA序列并具有19bp双链茎区和3′UU突出端的本发明shRNA是：
Figure A20068000794400201
N是核苷酸A、T、C、G、U或本领域普通技术人员已知的修饰的形式。环中的核苷酸N的数目在如下数字之间并包括这些数字：3至23，或5至15，或7至13，或4至9，或9至11，或者核苷酸N的数目是9。环中一些核苷酸可以参与同环中其它的核苷酸的碱基配对相互作用。可以用于形成环的寡核苷酸序列的实例包括5′-UUCAAGAGA-3′(Brummelkamp，T.R.等，(2002)Science296：550)和5′-UUUGUGUAG-3′(Castanotto，D.等，(2002)RNA8：1454)。本领域技术人员知道所得的单链寡核苷酸形成包含能够与RNAi装置相互作用的双链区的茎-环结构或发夹结构。
以上确定的siRNA靶序列可以在3’末端延伸以便于设计dicer-底物27聚双链体。在FRP-1DNA序列(SEQ ID NO：1)中所确定的19-核苷酸DNA靶序列(SEQ ID NO：2)的6个核苷酸的延伸产生存在于SEQ ID NO：1的第509至533核苷酸处的25-核苷酸DNA靶序列：
5′-CGTGGGCTACAAGAAGATGGTGCTG-3′SEQ ID NO：195。
靶向SEQ ID NO：195的相应mRNA序列的本发明dicer-底物27聚双链体是：
5′-CGUGGGCUACAAGAAGAUGGUGCUG-3′SEQ ID NO：196
3′-UUGCACCCGAUGUUCUUCUACCACGAC-5′SEQ ID NO：197。
在有义链3’末端的两个核苷酸(即SEQ ID NO：196的UG核苷酸)可以是脱氧核苷酸(即TG)用于强化加工。从如本文中所提供的19-21核苷酸靶序列中设计dicer-底物27聚双链体还由Integrated DNA Technologies(IDT)网站和由Kim，D.-H.等，(February，2005)Nature Biotechnology23：2；222-226进一步讨论。
当通过化学合成产生干扰性RNA时，在一条链或两条链(当存在时)的5′末端核苷酸的5′位置的磷酸化可以增强在结合的RISC复合体中的siRNA效力和特异性，但这不是必需的，因为磷酸化可以在细胞内发生。
表1列出SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：191的FRP1DNA靶序列的实例，以如上所述方式从中设计了本发明的siRNA。如上所述，FRP1编码卷曲相关蛋白-1。
表1.用于siRNA的FRP1靶序列
FRP1靶序列 起始核苷酸在SEQ ID NO：1中的编号 SEQ ID NO：
CGTGGGCTACAAGAAGATG 509 2
GAAGATGGTGCTGCCCAAC 521 8
GATGGTGCTGCCCAACCTG 524 9
GTGTGACAAGTTCCCGGAG 767 10
TGCCACCGAAGCCTCCAAG 818 11
GGCACAACGGTGTGTCCTC 843 12
CGGTGTGTCCTCCCTGTGA 850 13
CGAGTTGAAATCTGAGGCC 872 14
ATCTGAGGCCATCATTGAA 881 15
CATCTCTGTGCCAGCGAGT 900 16
TGGCGACAAGAAGATTGTC 959 17
GAAGATTGTCCCCAAGAAG 968 18
GATTGTCCCCAAGAAGAAG 971 19
GAAGAAGAAGCCCCTGAAG 983 20
GAAGAAGCCCCTGAAGTTG 986 21
GAAGCCCCTGAAGTTGGGG 989 22
GTTGGGGCCCATCAAGAAG 1001 23
GAAGAAGGACCTGAAGAAG 1016 24
GAAGGACCTGAAGAAGCTT 1019 25
GGACCTGAAGAAGCTTGTG 1022 26
GAAGCTTGTGCTGTACCTG 1031 27
GCTTGTGCTGTACCTGAAG 1034 28
GAATGGGGCTGACTGTCCC 1052 29
CCTCAGCCACCACTTCCTC 1088 30
GGTGAAGAGCCAGTACTTG 1121 31
GAGCCAGTACTTGCTGACG 1127 32
ACCATGAGTGCCCCACCTT 1207 33
TCCAGTCGGCTTGTTCTTG 1360 34
AGCAAGGGCCATTTAGATT 1445 35
GGGCCATTTAGATTAGGAA 1450 36
GATCCGCAATGTGGAGCAG 1478 37
TGTGGAGCAGCAGCCACTG 1487 38
ACCATTTCCAACAGCAACA 1524 39
CAGCAACACAGCCACTAAA 1535 40
AGGGGGATTGGGCGGAAAG 1562 41
AGTGAGAGCCAGCAGCAAA 1579 42
CTTGTTGGTGTGGATCTAT 1613 43
TTCTAATGATTGGCAAGTC 1661 44
TGATTGGCAAGTCACGTTG 1667 45
ATGGAAACAGACTCATACC 1724 46
ACAGACTCATACCACACTT 1730 47
TTAAGGTCAAGCCCAGAAA 1753 48
GGTCAAGCCCAGAAAGTGA 1757 49
GCCCAGAAAGTGATAAGTG 1763 50
AGTGATAAGTGCAGGGAGG 1771 51
GTGCAAGTCCATTATCTAA 1794 52
GTCCATTATCTAATAGTGA 1800 53
TAGTGACAGCAAAGGGACC 1813 54
TCTGAATCAGCCAGTCTCA 1887 55
TCAGCCAGTCTCAGATGCC 1893 56
AGTTTCGGTTCCTATGAGC 1916 57
AGGAAACCACAGTGAGCCT 2001 58
ACCACAGTGAGCCTGAGAG 2006 59
CAGTCCAGCAAATTGCTAG 2106 60
ATTGCTAGTCAGGGTGAAT 2117 61
TTGTGAAATTGGGTGAAGA 2135 62
ATTGGGTGAAGAGCTTAGG 2142 63
GAGCTTAGGATTCTAATCT 2152 64
GAACAATGACAAACACCCA 2200 65
CAATGACAAACACCCACTT 2203 66
TGACAAACACCCACTTATT 2206 67
CAGTCTACATTGAGCATTT 2241 68
AGGTGTGCTAGAACAAGGT 2263 69
CAAGGTCTCCTGATCCGTC 2276 70
GGTCTCCTGATCCGTCCGA 2279 71
GAGTCCGTGGTTGCCCTAG 2389 72
CCTAACACCCCCTAGCAAA 2410 73
CTCACAGAGCTTTCCGTTT 2430 74
AGAAACATTTCCTTTGAAC 2464 75
ACATTTCCTTTGAACTTGA 2468 76
CTTGATTGCCTATGGATCA 2482 77
AGAAATTCAGAACAGCCTG 2502 78
ATTCAGAACAGCCTGCCTG 2506 79
AGTTGACATGGGTGGGGTG 2572 80
GTACCCTGAGATACTTCCC 2645 81
AGCCCTTATGTTTAATCAG 2666 82
TCAGCGATGTATATAAGCC 2681 83
GCCAGTTCACTTAGACAAC 2697 84
CTTTACCCTTCTTGTCCAA 2715 85
TGTACAGGAAGTAGTTCTA 2734 86
TGCATATTAATTTCTTCCC 2760 87
TTTCTTCCCCCAAAGCCGG 2770 88
AGCCGGATTCTTAATTCTC 2783 89
TTCTCTGCAACACTTTGAG 2797 90
CACTTTGAGGACATTTATG 2807 91
TGCTTATACCCAGTGAGGA 2844 92
AGGATGGTAGATTCTGTTA 2917 93
CTCTTGAAGACTCCAGTAT 2937 94
TCAGCATGCCCGCCTAGTT 2961 95
ATTAACCTCTCACAGTTAG 3005 96
CCTCTCACAGTTAGTGATC 3010 97
AGTGCTGGGGACCTTAAGT 3080 98
TGTGTATATATATTAGCTA 3130 99
TTAGAAATATTCTACTTCT 3150 100
ATATTCTACTTCTCTGTTG 3156 101
ACTGAAATTCAGAGCAAGT 3179 102
ATTCAGAGCAAGTTCCTGA 3185 103
GTTCCTGAGTGCGTGGATC 3196 104
GAGTTCAGTGCTCATACGT 3244 105
AGTGCCTCATGCAACCGGG 3281 106
CATAAGTAGTTACCACAGA 3345 107
GTAGTTACCACAGAATACG 3350 108
TACGGAAGAGCAGGTGACT 3365 109
GAGCAGGTGACTGTGCTGT 3372 110
ATGGGAATTCTCAGGTAGG 3403 111
TTCTCAGGTAGGAAGCAAC 3410 112
GCAACAGCTTCAGAAAGAG 3424 113
CAGCTTCAGAAAGAGCTCA 3428 114
TAAATTGGAAATGTGAATC 3450 115
ATTGGAAATGTGAATCGCA 3453 116
ATGTGAATCGCAGCTGTGG 3460 117
GGGAGGCTCTCTGTAGGCA 3596 118
CCAATGTGCAGACTGATTG 3668 119
TGTGCAGACTGATTGGCCT 3672 120
TTATCGCTAGGGCCAAGGT 3746 121
GGTGGGATTTGTAAAGCTT 3762 122
AGCTTTACAATAATCATTC 3776 123
TAATCATTCTGGATAGAGT 3786 124
TCATTCTGGATAGAGTCCT 3789 125
CTCAGTTAAATCTTTGAAG 3826 126
ATCTTTGAAGAATATTTGT 3835 127
GAATATTTGTAGTTATCTT 3844 128
TATTTGTAGTTATCTTAGA 3847 129
GATAGCATGGGAGGTGAGG 3867 130
TATCCTGTGTAACACTTGG 3912 131
CACTTGGCTCTTGGTACCT 3924 132
GTTCTCCCCAGGGTAGAAT 3958 133
TTCAATCAGAGCTCCAGTT 3976 134
TCAGAGCTCCAGTTTGCAT 3981 135
ATTACAGTAATCCCATTTC 4012 136
TCCCATTTCCCAAACCTAA 4022 137
CTGGTTGCTGTGTCATAAC 4071 138
CTTCATAGATGCAGGAGGC 4089 139
TAACATACTGGCCGTTCTG 4154 140
CATACTGGCCGTTCTGACC 4157 141
ATTCCCGTTTCCTCTAGTT 4208 142
TAGTAATTCCCGTACGTGT 4369 143
TTCCCGTACGTGTTCATTT 4375 144
TCACTCAATTAATCAATGA 4441 145
AAGAAGATTGTCCCCAAGAAG(SEQID NO：18具有加入的5′AA) 966 146
GTGAGCTTCCAGTCGGACA 408 147
TGAGCTTCCAGTCGGACAT 409 148
CACCTCAGTGCGTGGACAT 463 149
CCGAGATGCTTAAGTGTGA 754 150
CCTGTGACAACGAGTTGAA 862 151
CTGTGACAACGAGTTGAAA 863 152
TGTGACAACGAGTTGAAAT 864 153
ACAACGAGTTGAAATCTGA 868 154
AGTTGAAATCTGAGGCCAT 874 155
GCCAGCGAGTTTGCACTGA 909 156
GCGAGTTTGCACTGAGGAT 913 157
GAGTTTGCACTGAGGATGA 915 158
AAATGGCGACAAGAAGATT 956 159
CAAGGTGAAGAGCCAGTAC 1118 160
ACTTGCTGACGGCCATCCA 1135 161
GCTGATCTATGCCTTTCAA 1634 162
GATCTATGCCTTTCAACTA 1637 163
CTATGCCTTTCAACTAGAA 1640 164
CATACCACACTTACAATTA 1737 165
TCCGTGTGATTGTCTTTGA 1867 166
CCGTGTGATTGTCTTTGAA 1868 167
TTAGAACAGTCCAGCAAAT 2100 168
TGAAAGGTGTGCTAGAACA 2259 169
GAAAGGTGTGCTAGAACAA 2260 170
TTGATTGCCTATGGATCAA 2483 171
CCAGCGAGAGAGTTTCAAA 2598 172
ATGTTTAATCAGCGATGTA 2673 173
GTTTAATCAGCGATGTATA 2675 174
CCAAAGCCGGATTCTTAAT 2779 175
CCGGAGAGTTATCCTGATA 2985 176
CGGAGAGTTATCCTGATAA 2986 177
GGAGAGTTATCCTGATAAA 2987 178
GAGAGTTATCCTGATAAAT 2988 179
GGTTCTCTCTGACCTTTCA 3055 180
TCTGACCTTTCATCGTAAA 3062 181
CTACTTCTCTGTTGTCAAA 3161 182
GGTCTTAGTTCTGGTTGAT 3217 183
TACCACAGAATACGGAAGA 3355 184
CACTATCACGAGCCTTTGT 3623 185
CCACAAAGTATCTAACAAA 3648 186
AAACCAATGTGCAGACTGA 3665 187
TTGGCAGAACTCAGTTAAA 3817 188
ATAACATACTGGCCGTTCT 4153 189
ATCCTAAGTCTCTTACAAA 4252 190
FRP1靶序列 起始核苷酸在SEQ ID NO：191中的编号 SEQ ID NO：
CATTAGTAGTTACCACAGA 3352 192
如以上实例中所提及，技术人员能够使用表1中提供的靶序列信息，通过参考SEQ ID NO.1或SEQ ID NO：191中的序列位置并添加或缺失分别与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO：191互补或接近互补的核苷酸，设计出长度比表1中所提供序列更短或更长的干扰性RNA。
由siRNA或其它形式的干扰性RNA引导的靶RNA切割反应是高度序列特异性的。通常，含有与靶mRNA的一部分在序列上完全相同的有义核苷酸链和与靶mRNA的一部分完全互补的反义核苷酸链的siRNA是用于抑制本文中所提及的mRNA的siRNA实施方案。然而，实施本发明不需要在反义siRNA链与靶mRNA之间或在反义siRNA链和有义siRNA链之间的100％的序列互补性。因此，本发明例如允许可以因遗传突变、株多态性或进化趋异而预期的序列变异。
在本发明的一个实施方案中，siRNA的反义链具有至少19个核苷酸与靶mRNA至少接近完全连续互补。“接近完全”如本文中所用意指siRNA的反义链“基本上与靶mRNA的至少一部分互补”，并且siRNA的有义链“基本上与靶mRNA的至少一部分完全相同”。如本领域普通技术人员所知，“同一性”是如在序列间通过匹配核苷酸的次序和身份所测定的核苷酸序列间序列相关性的程度。在一个实施方案中，与靶mRNA序列具有80％以及80％直至100％之间的互补性(例如85％、90％或95％互补性)的siRNA的反义链认为是接近完全互补的，并且可以在本发明内使用。“完全”连续的互补性是毗邻碱基对的标准Watson-Crick碱基配对。“至少接近完全”连续的互补性包括如本文中所用的“完全”互补性。设计了用于测定同一性或互补性的计算机方法，例如BLASTN(Altschul，S.F.等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)以提供最大程度的核苷酸序列匹配。
术语“同一性百分数”描述第一个核酸分子内的连续核苷酸百分数，其与长度相同的第二个核酸分子中一组连续核苷酸相同的连续核苷酸百分数。术语“互补性百分数”描述在第一个核酸分子内可以与第二个核酸分子中一组连续核苷酸发生Watson-Crick意义的碱基配对的连续核苷酸的百分数。
靶mRNA(有义链)与siRNA的一条链(有义链)之间的关系是同一关系。siRNA的有义链(若存在)又称作过客链。靶mRNA(有义链)与siRNA的另一条链(反义链)之间的关系是互补关系。siRNA的反义链也称作引导链。
以5′至3′方向书写的核酸序列中的次末碱基是紧邻最末碱基的碱基，即紧邻3′碱基的碱基。以5′至3′方向书写的核酸序列中次末13个碱基是序列中紧邻3′碱基的最后13个碱基并且不包括3′碱基。类似地，以5′至3′方向书写的核酸序列中的14、15、16、17或18个次末碱基是序列中紧邻3′碱基的最后14、15、16、17或18个碱基并且不包括3′碱基。
短语“与对应于任一(序列标识符)的mRNA3’末端的次末13个核苷酸具有至少90％的序列互补性或至少90％的序列同一性的至少13个连续核苷酸的区域”允许一个核苷酸置换。该短语中不包括双核苷酸置换(即11/13＝85％同一性/互补性)。
在本发明的一个实施方案中，连续核苷酸的区域是至少14个连续核苷酸的区域，该区域与对应于经每一序列标识符所确定的序列的mRNA3’末端的次末14个核苷酸具有至少85％的序列互补性或至少85％的序列同一性。该短语中包括两个核苷酸置换(即12/14＝86％同一性/互补性)。
在本发明的又一个实施方案中，连续核苷酸的区域是至少15、16、17或18个连续核苷酸的区域，该区域与对应于序列标识符的序列的mRNA3’末端的次末14个核苷酸具有至少80％的序列互补性或至少80％的序列同一性。该短语中包括三个核苷酸置换。
对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：191的mRNA中的靶序列可以位于mRNA的5′或3′非翻译区以及mRNA的编码区内。
双链干扰RNA的一条或两条链可以具有1至6个核苷酸的3′突出端，其中核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或其混合物。突出端的核苷酸不发生碱基配对。在本发明的一个实施方案中，干扰RNA包含TT或UU的3′突出端。在本发明的另一实施方案中，干扰性RNA包含至少一个平端。末端通常具有5′磷酸基或3′羟基。在另外的实施方案中，反义链具有5′磷酸基，并且有义链具有5′羟基基。仍在另外的实施方案中，末端还通过共价性添加其它分子或官能团得到进一步修饰。
双链siRNA的有义链和反义链可以是如上所述的两条单链的双链体形式或可以是单个分子，在所述单个分子中互补区域发生碱基配对并且通过发夹或环共价地连接以形成单一的链。据信发夹通过称作dicer的蛋白质在细胞内切割以形成由两个独立的碱基配对RNA分子组成的干扰RNA。
干扰RNA可以因添加、缺失、置换或修饰一个或多个核苷酸而不同于天然存在的RNA。非核苷酸物质可以在5′端、3′端或在内部与干扰RNA结合。通常设计此类修饰以增加干扰RNA的核酸酶抗性、促进细胞摄取、增强细胞靶向性、辅助追踪干扰性RNA、进一步改善稳定性或减弱激活干扰素途径的潜能。例如，干扰RNA可以在突出端的末尾包含嘌呤核苷酸，例如，胆固醇通过吡咯烷连接体缀合至ds siRNA分子有义链的3′端也对siRNA提供稳定性。其它修饰例如包括3′末端生物素分子、已知具有穿透细胞特性的肽、纳米粒子、模拟肽、荧光染料或树状聚体。
核苷酸可以在分子的碱基部分、其糖部分或磷酸部分被修饰并且在本发明实施方案中发挥作用。修饰例如包括用烷基、烷氧基、氨基、脱氮(deaza)、卤素、羟基、硫羟基或其组合置换。核苷酸可以例如用具有更高稳定性的类似物取代，如用脱氧核糖核苷酸替换核糖核苷酸，或具有糖修饰，如2′OH由2′氨基、2′O-甲基、2′甲氧乙基或2′-O，4′-C亚甲基桥替换。核苷酸的嘌呤或嘧啶类似物实例是黄嘌呤、次黄嘌呤、氮杂嘌呤、甲基硫代腺嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤以及O-和N-修饰的核苷酸。核苷酸的磷酸基可以通过用氮或用硫(硫代磷酸酯)取代磷酸基的一个或多个氧进行修饰。修饰对例如改善功能、改善稳定性或通透性或者指导定位或靶向是有用的。
反义干扰性RNA链中可以存在不与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：191的一部分互补的一个或多个区域。非互补性区域可以位于互补区域的3′端、5′端或两端或在两个互补区域之间。
干扰性RNA可以通过化学合成、通过体外转录或通过用dicer或用具有相似活性的另一种适宜核酸酶切割较长双链RNA而外源地产生。使用常规DNA/RNA合成仪从受保护的核糖核苷亚磷酰胺中产生的化学合成的干扰性RNA可以从商业供应商如Ambion Inc.(Austin，TX)、Invitrogen(Carlsbad，CA)或Dharmacon(Lafayette，CO)得到。干扰性RNA例如通过用溶剂或树脂提取、沉淀、电泳、层析或其组合加以纯化。备选地，干扰性RNA可以几乎不进行纯化而使用，以避免因样品加工引起的损失。
干扰性RNA还可以从质粒或病毒表达载体或从最小表达盒(例如包含一个或多个启动子及对干扰性RNA适合的一个或多个模板的PCR生成片段)中内源表达。用于shRNA的可商业得到的基于质粒的表达载体包括pSilencer系列(Ambion，Austin，TX)和pCpG-siRNA(InvivoGen，SanDiego，CA)的成员。用于表达干扰性RNA的病毒载体可以衍生自多种病毒，包括腺病毒、腺相关病毒、慢病毒(例如HIV、FIV和EIAV)和疱疹病毒。用于shRNA表达的可商业得到的病毒载体包括pSilencer adeno(Ambion，Austin，TX)和pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST(Invitrogen，Carlsbad，CA)。选择病毒载体、从载体表达干扰性RNA的方法和递送病毒载体的方法处于本领域普通技术人员的能力范围内。用于产生PCR生成的shRNA表达盒的试剂盒实例包括Silencer Express(Ambion，Austin，TX)和siXpress(Minis，Madison，WI)。第一个干扰性RNA可以从能够表达第一个干扰性RNA的第一个表达载体中经体内表达施用并且第二个干扰性RNA可以从能够表达第二个干扰性RNA的第二个表达载体中经体内表达施用，或两种干扰性RNA可以从能够表达两种干扰性RNA的单个表达载体中经体内表达施用。
干扰性RNA可以从本领域普通技术人员已知的多种真核启动子中表达，包括polIII启动子如U6或H1启动子，或pol II启动子如巨细胞病毒启动子。本领域技术人员知道，也可以将这些启动调整以允许干扰性RNA的诱导表达。
在生理条件下的杂交：在本发明的某些实施方案中，干扰性RNA的反义链与作为RISC复合体的一部分的mRNA在体内杂交。
“杂交”指这样的过程，在该过程中具有互补或接近互补的碱基序列的单链核酸相互作用以形成氢键结合的复合体(称作杂合体)。杂交反应是敏感的并且是选择性的。在体外，杂交的特异性(即严格性)例如受到预杂交溶液和杂交溶液中盐或甲酰胺的浓度控制，并受杂交温度控制，此类方法在本领域内众所周知。尤其，严格性通过降低盐浓度、增加甲酰胺浓度或升高杂交温度而提高。
例如，高严格条件可以在约50％甲酰胺于37℃至42℃发生。减弱的严格条件可以在约35％至25％甲酰胺于约30℃至35℃发生。用于杂交的严格条件实例由Sambrook，J.，1989，Molecular Cloning：A LaboratoryManuAl，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N·Y.提供。严格杂交条件的其它实例包括400mM NaCI、40mM PIPES pH6.4、1mM EDTA、50℃或70℃持续12-16小时，随后洗涤，或于70℃在1×SSC或于50℃在1×SSC、50％甲酰胺中杂交，随后于70℃在0.3×SSC中洗涤，或于70℃在4×SSC或50℃在4×SSC、50％甲酰胺中杂交，随后于67℃在1×SSC中洗涤。用于杂交的温度是低于杂合体的解链温度(Tm)约5-10℃的温度，其中对于长度在19至49碱基对之间的杂合体Tm使用如下计算式测定：Tm℃＝81.5+16.6(1og10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是杂合体中碱基的数目，并且[Na+]是杂交缓冲液中钠离子的浓度。
以上所述的体外杂交分析提供了预测候选siRNA与靶标之间的结合是否具有特异性的方法。然而，在RISC复合体的环境中，靶标的特异性切割还用对体外杂交不表现出高严格性的反义链产生。
单链干扰性RNA：如上所提及，干扰性RNA最终作为单链发挥作用。已发现单链(ss)干扰性RNA实现了mRNA沉默，尽管效率低于双链RNA。因此，本发明的实施方案还提供单链干扰性RNA的施用，其中单链干扰性RNA在生理条件下与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：191的一部分杂交，并具有至少19个核苷酸的分别与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：109的杂交部分至少接近完全连续互补的区域。单链干扰性RNA具有如以上对双链干扰性RNA提及的19至49个核苷酸长度。单链干扰性RNA具有5′磷酸或在原位(in situ)或在体内在5′位置上被磷酸化。术语“5′磷酸化”用于描述例如多核苷酸或寡核苷酸，其具有通过酯键与位于多核苷酸或寡核苷酸5′末端的糖(例如核糖或脱氧核糖或者它们的类似物)的C5羟基连接的磷酸基团。
单链干扰性RNA可如对双链干扰性RNA所述通过化学合成或通过体外转录或从载体或表达盒内源性表达来合成。5′磷酸基可以通过激酶添加或5′磷酸可以是核酸酶切割RNA的结果。递送如对于双链干扰性RNA所述。在一个实施方案中，施用具有保护末端和核酸酶抗性修饰的单链干扰性RNA用于沉默。单链干扰性RNA可以干燥以贮存或溶解于水溶液内。该溶液可以含有缓冲剂或盐以便抑制复性或用于稳定。
发夹干扰性RNA：发夹干扰性RN是在茎-环结构或发夹结构(例如shRNA)中既包含干扰性RNA的有义链又包含其反义链的单链分子(例如寡核苷酸单链)。例如，shRNA可以从DNA载体中表达，在该DNA载体中编码有义干扰性RNA链的DNA寡核苷酸通过短间隔区与编码反向互补的反义干扰性RNA链的DNA寡核苷酸连接。对于所选的表达载体，如果需要可以添加3′末端T和形成限制性位点的核苷酸。得到的RNA转录物向自身折回以形成茎-环结构。
施用模式：干扰性RNA可以通过眼组织施用，如眼周、结膜、筋膜下、前房内、玻璃体内、眼内、视网膜下、结膜下、眼球后、小管内或脉络膜上施用；通过注射、通过使用导管或其它的布放装置如视网膜弹丸剂(retinal pellet)、眼内插入物、栓剂或者包含多孔材料、非多孔材料或凝胶性材料的植入体直接施用于眼；通过局部用的眼滴剂或眼膏；通过在盲管内或所植入毗邻于巩膜(经巩膜的)或眼内的缓释装置。前房内注射可以穿过角膜抵达前房以允许药剂抵达小梁网。小管内注射可以进入流出施莱姆管的静脉收集通道或进入施莱姆管。全身性施用或肠胃外施用预期包括但不限于静脉内、皮下、透皮和口服送递。
受试者：因青光眼或有青光眼发展风险而需要治疗的受试者是这样的人或其它动物，其患有与如本文中所提及FRP-1的不需要或不当的表达或活性有关的青光眼或具有青光眼相关性病症(如高血压)发展风险。与此类病症相关的眼结构可以包括例如眼、视网膜、脉络膜、晶状体、角膜、小梁网、虹膜、视神经、视神经头、巩膜、眼房、玻璃体腔、睫状体或后段。受试者还可以是眼细胞、细胞培养物、器官或者先体外后体内的器官或组织。
制剂和剂量：药物制剂包含与生理可接受的眼用载体介质如水、缓冲剂、盐水、甘油、透明质酸、甘露醇等混合的重量至多99％的本发明干扰性RNA或其盐。
本发明的干扰性RNA作为溶液剂、混悬剂或乳剂施用。如下是本发明所体现的可能制剂的实例。
                       量(重量百分比)
干扰RNA                至多99；0.1-99；0.1-50；0.5-10.0
羟丙基甲基纤维素       0.5
氯化钠                 0.8
苯扎氯铵               0.01
EDTA                   0.01
NaOH/HCl               调至pH7.4
纯化水(无RNA酶)        补足至100mL
                       量(重量百分比)
干扰RNA                至多99；0.1-99；0.1-50；0.5-10.0
磷酸缓冲盐水           1.0
苯扎氯铵               0.01
聚山梨酯80             0.5
纯化水(无RNA酶)        补足至100％
                       量(重量百分比)
干扰RNA                至多99；0.1-99；0.1-50；0.5-10.0
磷酸二氢钠             0.05
磷酸氢二钠(无水)       0.15
氯化钠                 0.75
EDTA钠                 0.05
Cremophor EL           0.1
苯扎氯铵               0.01
HCl和/或NaOH           pH7.3-7.4
纯化水(无RNA酶)        补足至100％
                       量(重量百分比)
干扰RNA                至多99；0.1-99；0.1-50；0.5-10.0
磷酸缓冲盐水           1.0
羟丙基-β-环糊精       4.0
纯化水(无RNA酶)        补足至100％
通常，如本文中提供的复合组合物的剂量可以变化，但将处于有效量内，该有效量指在交叠的时间间隔期间共同起作用的干扰性RNA组合的量，该量有效地抑制新血管形成或血管发生或使其退化，因而例如在人类患者中阻止或治疗视网膜水肿、AMD、DR、与视网膜局部缺血相关的后遗症或PSNV。
通常，有效量的本发明实施方案的干扰性RNA在靶细胞表面产生从100pM至100nM，或从1nM至50nM，或从5nM至约10nM，或约25nM的细胞外浓度。实现这种局部浓度所需要的计量将根据多种因素如送递方法、送递部位、送递位点与靶细胞或靶组织间细胞层的数目、送递是局部性还是是全身性等变化。在送递位点上的浓度可以显著高于在靶细胞表面或靶组织表面的浓度。根据熟练临床医生的常规自行决定权，局部使用的组合物每日或在延长的送递方案中如每日、每周、每两周、每月或更长时间向眼表面送递一次至四次。制剂的pH是约pH4-9，或pH4.5至pH7.4。
用针对FRP-1mRNA的siRNA对患者的治疗性治疗预期将通过增加作用时间(因而允许较少的给药次数和患者的更多服从)从小分子的局部使用的眼滴剂中得益。
虽然精确给药方案由临床医生自行决定，但干扰RNA可以在临床医生指导下通过每只眼各滴一滴施用。制剂的有效量取决于如下因素，如受试者的年龄、种族和性别或高眼压症的严重性、靶基因转录物/蛋白质周转的速率、干扰性RNA的效率和干扰性RNA的稳定性。在一个实施方案中，将干扰性RNA以治疗剂量局部地送递至眼睛并抵达小梁网、视网膜或视神经头，因而改善青光眼疾病过程。
可接受的载体：可眼用的载体指至多引起轻微眼刺激至不引起眼刺激、根据需要提供适宜防腐作用、并且以均一剂量递送一种或多种本发明干扰RNA的载体。用于施用本发明实施方案的干扰性RNA的可接受载体包括基于阳离子脂类的转染试剂TransIT-TKO(Minis Corporation，Madison，WT)、LIPOFECTIN、Lipofectamine、OLIGOFECTAMINETM(Invitrogen，Carlsbad，CA)或DHARMAFECTTM(Dharmacon，Lafayette，CO)；聚阳离子如聚乙烯亚胺；阳离子肽如Tat、聚精氨酸或穿透素(Penetratin)(Antp肽)或脂质体。脂质体例如从标准的形成载体的脂和固醇如胆固醇形成，并且可以例如包括靶向性分子，如具有内皮细胞表面抗原结合亲和力的单克隆抗体。此外，脂质体可以是PEG化的脂质体。
干扰性RNA可以在溶液、在混悬液或在可生物蚀解的或不可生物蚀解的送递装置内送递。干扰性RNA可以单独地送递或作为定义的共价缀合物的成分送递。干扰性RNA还可以与阳离子脂类、阳离子肽或阳离子聚合物复合；与具有核酸结合特性的蛋白质、融合蛋白或蛋白质结构域(例如鱼精蛋白)复合；或包裹于纳米粒子内。组织特异性或细胞特异性送递可以通过包含适宜的靶向性部分如抗体或抗体片段实现。
对于眼用递送，干扰RNA可以与眼科可用的防腐剂、共溶剂、表面活性剂、增黏剂、渗透增强剂、缓冲剂、氯化钠或水组合以形成含水的无菌眼用混悬剂或溶液剂。眼用溶液制剂可以通过将干扰性RNA溶解于生理可接受的等渗含水缓冲液内制备。此外，眼用溶液剂可包括眼科可用的表面活性剂以辅助抑制剂溶解。黏度形成剂如羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等可以添加至本发明的组合物以改善化合物的滞留。
为了制备无菌的眼用软膏制剂，将干扰RNA与合适载体如矿物油、液体羊毛脂或白软石蜡中的防腐剂组合。无菌的眼用凝胶制剂可以通过将干扰RNA混悬于亲水性基质内制备，其中亲水性基质根据本领域已知用于其它眼用制剂的方法例如从CARBOPOL-940(BF Goodrich，Charlotte，NC)等的组合中制备。VISCOAT(Alcon Laboratories，Inc.，Fort Worth，TX)可以例如用于眼内注射。当干扰RNA在眼中穿透性较弱时，本发明的其它组合物可以含有渗透增强剂如Cremephor和TWEEN80(聚氧乙烯失水山梨糖醇单月桂酸酯，Sigma Aldrich，St.Louis，MO)。
试剂盒：本发明的实施方案提供包含用于减弱细胞内如本文中提及的mRNA的表达的试剂的试剂盒。试剂盒含有siRNA表达载体或shRNA表达载体。对于siRNA表达载体或非病毒性shRNA表达载体，试剂盒还可以含有转染试剂或其它合适的送递媒介。对于病毒性shRNA表达载体，试剂盒可以含有病毒载体和/或产生病毒载体所必需的成分(例如包装细胞系以及包含病毒载体模板的载体和用于包装的额外的辅助载体)。试剂盒还可以含有作为阳性对照或阴性对照的siRNA表达载体或shRNA表达载体(例如非靶向性对照siRNA或靶向不相关mRNA的siRNA)。试剂盒还可以含有用于评估靶基因敲低的试剂(例如用于检测靶mRNA的定量PCR的引物和探针和/或用于蛋白质印迹的抗相应蛋白质的抗体)。备选地，试剂盒可以包含siRNA序列或shRNA序列以及说明书和通过体外转录生成siRNA或构建siRNA表达载体所需要的材料。
还提供试剂盒形式的药物组合，其以组合包装的方式包括适应于接受容器工具的载体工具(容器工具将紧密限制于载体工具中)以及包含干扰性RNA组合物和可眼用载体的第一容器工具。此类试剂盒还可以根据需要包含一个或多个常规的药物试剂盒成分，例如具有一种或多种可药用载体的容器、其它容器等，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。在试剂盒中还可以包括作为插页或作为标签的印制的说明书，说明待施用成分的量、施用指导和/或混合各成分的指导。
FRP-1干扰性RNA敲低例如人小梁网(TM)细胞中内源性FRP-1表达的能力如下实施。命名为GTM3或HTM-3的已转化的人TM细胞系(见Pang，LH.等，1994.Curr.Eye Res.13：51-63)的转染使用标准体外浓度(100nM)的如本文所述FRP-1干扰RNA以及LIPOFECTAMINETM2000(Invitrogen，Carlsbad，CAlifornia)以1∶1(w/v)比例进行。杂乱siRNA和lamin A/C siRNA(Dharmacon)用作对照。QPCR TAQMAN正向引物和反向引物以及包含靶位点的探针组用于评估mRNA切割的程度。此类引物/探针组可以由例如ABI(Applied Biosystems，Foster City，CA)合成。为减少非特异性脱靶效应的可能，对siRNA确定抑制FRP-1mRNA表达的siRNA的最低可能浓度。FRP-1mRNA敲低使用合适引物/探针组通过QPCR扩增评估。FRP-1siRNA在GTM3细胞中的剂量反应在例如以0、1、3、10、30和100nM剂量范围的siRNA处理24小时后的GTM3细胞中观察到。数据使用GraphPad Prism4软件(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)以可变斜率、sigmoidal剂量反应算法和100％最大约束(top constraint)加以拟合。对于所测试的特定siRNA获得IC50。
实施例1用于沉默FRP1的干扰性RNA
本研究检测FRP1干扰性RNA敲低COS细胞内的内源性FRP1mRNA水平的能力。
在转染前一天将COS-7细胞以约20％的汇合铺于12孔平板中。在转染时，细胞表现出50-70％的汇合。在转染后第1天和第3天收获细胞。具有有义链序列5′AAGAAGAUUGUCCCCAAGAAG3′(SEQ ID NO：146，其为添加5′AA的SEQ ID NO：18；自Dharmacon，Lafayette，Colorado购买)的双链FRP1-siRNA的转染使用OLIGOFECTAMINETM(Invitrogen，Carlsbad，CA)和每孔100nM siRNA(12孔板)一式三份开展。对照不含siRNA。通过用于PCR的RNAqueousTM(Ambion，Austin，TX)提取RNA并且cDNA用TAQMANTM逆转录试剂(PE Biosystems(AppliedBiosystems，Foster City，CA))合成。QPCR使用TAQMANTM通用PCR主混合物和7700SDS(PE Biosystems)一式三份开展。使用核糖体RNA(18s，PE Biosystems)作为多重QPCR内的归一化对照。QPCR数据示于图1，与对照相比，显示在转染后第1天(22％，P＝0.04)和第3天(32％，P＝0.002)显著地抑制FRP1mRNA。
本文中所提及参考文献以它们提供示例性方法或其它细节补充本文中所述的方法和细节的程度具体引用作为参考。
本领域技术人员在本公开指示下将认识到可以对本文中公开的实施方案进行明显修改而不脱离本发明的精神和范围。本文中公开的全部实施方案可以在本公开指示下无需过度实验即得到实施和执行。本发明的全部范围在本公开及其等效实施方案中阐述。说明书不得解释为过于缩小本发明所授予全部保护范围。
如本文中所用并且除非另外说明，术语“a”和“an”具有“一”、“至少一”或“多于一”的意思。
<110>爱尔康公司(ALCON，INC.)
<120>用于治疗青光眼的卷曲相关蛋白-1的RNAi介导性抑制
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<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>4469
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
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<210>4
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<212>DNA
<213>人工的
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<223>带有3’NN的反义链
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)..(19)
<223>核糖核苷酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(21)
<223>任何的A，T/U，C，G
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Figure A20068000794400413
<210>5
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<212>RNA
<213>人工的
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<223>有义链
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Figure A20068000794400421
<210>6
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<212>RNA
<213>人工的
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<223>反义链
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<211>48
<212>DNA
<213>人工的
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<223>带有环的发夹双链体
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<221>misc_feature
<222>(28)..(48)
<223>核糖核苷酸
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<210>64
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>64
Figure A20068000794400544
<210>65
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>65
Figure A20068000794400545
<210>66
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>66
<210>67
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>67
Figure A20068000794400552
<210>68
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>68
Figure A20068000794400553
<210>69
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>69
<210>70
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>70
Figure A20068000794400555
<210>71
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>71
Figure A20068000794400561
<210>72
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>72
<210>73
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>73
<210>74
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>74
Figure A20068000794400564
<210>75
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>75
Figure A20068000794400565
<210>76
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>76
Figure A20068000794400571
<210>77
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>77
<210>78
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>78
<210>79
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>79
Figure A20068000794400574
<210>80
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>80
Figure A20068000794400575
<210>81
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>81
<210>82
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>82
Figure A20068000794400582
<210>83
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>83
Figure A20068000794400583
<210>84
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>84
Figure A20068000794400584
<210>85
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>85
Figure A20068000794400591
<210>86
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>86
Figure A20068000794400592
<210>87
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>87
Figure A20068000794400593
<210>88
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>88
Figure A20068000794400594
<210>89
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>89
Figure A20068000794400595
<210>90
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>90
Figure A20068000794400601
<210>91
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>91
Figure A20068000794400602
<210>92
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>92
Figure A20068000794400603
<210>93
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>93
<210>94
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>94
Figure A20068000794400605
<210>95
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>95
Figure A20068000794400611
<210>96
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>96
<210>97
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>97
Figure A20068000794400613
<210>98
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>98
<210>99
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>99
Figure A20068000794400615
<210>100
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>100
Figure A20068000794400621
<210>101
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>101
Figure A20068000794400622
<210>102
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>102
Figure A20068000794400623
<210>103
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>103
Figure A20068000794400624
<210>104
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>104
Figure A20068000794400625
<210>105
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>105
Figure A20068000794400631
<210>106
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>106
Figure A20068000794400632
<210>107
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>107
Figure A20068000794400633
<210>108
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>108
Figure A20068000794400634
<210>109
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>109
Figure A20068000794400635
<210>110
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>110
<210>111
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>111
Figure A20068000794400642
<210>112
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>112
<210>113
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>113
Figure A20068000794400644
<210>114
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>114
Figure A20068000794400651
<210>115
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>115
Figure A20068000794400652
<210>116
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>116
<210>117
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>117
Figure A20068000794400654
<210>118
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>118
<210>119
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>119
Figure A20068000794400661
<210>120
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>120
Figure A20068000794400662
<210>121
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>121
Figure A20068000794400663
<210>122
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>122
Figure A20068000794400664
<210>123
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>123
Figure A20068000794400665
<210>124
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>124
Figure A20068000794400671
<210>125
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>125
Figure A20068000794400672
<210>126
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>126
Figure A20068000794400673
<210>127
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>127
<210>128
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>128
<210>129
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>129
Figure A20068000794400681
<210>130
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>130
Figure A20068000794400682
<210>131
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>131
<210>132
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>132
Figure A20068000794400684
<210>133
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>133
Figure A20068000794400685
<210>134
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>134
Figure A20068000794400691
<210>135
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>135
Figure A20068000794400692
<210>136
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>136
<210>137
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>137
Figure A20068000794400694
<210>138
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>138
<210>139
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>139
Figure A20068000794400701
<210>140
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>140
Figure A20068000794400702
<210>141
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>141
Figure A20068000794400703
<210>142
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>142
Figure A20068000794400704
<210>143
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>143
Figure A20068000794400711
<210>144
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>144
Figure A20068000794400712
<210>145
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
4223>靶序列
<400>145
Figure A20068000794400713
<210>146
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>146
Figure A20068000794400714
<210>147
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>147
Figure A20068000794400715
<210>148
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>148
Figure A20068000794400721
<210>149
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>149
Figure A20068000794400722
<210>150
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>150
Figure A20068000794400723
<210>151
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>151
Figure A20068000794400724
<210>152
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>152
Figure A20068000794400725
<210>153
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>153
Figure A20068000794400731
<210>154
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>154
Figure A20068000794400732
<210>155
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>155
Figure A20068000794400733
<210>156
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>156
Figure A20068000794400734
<210>157
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>157
Figure A20068000794400735
<210>158
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>158
Figure A20068000794400741
<210>159
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>159
Figure A20068000794400742
<210>160
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>160
Figure A20068000794400743
<210>161
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>161
Figure A20068000794400744
<210>162
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>162
Figure A20068000794400745
<210>163
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>163
Figure A20068000794400751
<210>164
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>164
Figure A20068000794400752
<210>165
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>165
Figure A20068000794400753
<210>166
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>166
Figure A20068000794400754
<210>167
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>167
Figure A20068000794400755
<210>168
<211>19
<212>DNA
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Figure A20068000794400761
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Figure A20068000794400762
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<211>19
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<213>人工的
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Figure A20068000794400763
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<213>人工的
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Figure A20068000794400781
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<400>183
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<213>人工的
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<400>184
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<213>人工的
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<223>靶序列
<400>185
Figure A20068000794400794
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<211>19
<212>DNA
<213>人工的
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<223>靶序列
<400>186
Figure A20068000794400795
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<211>19
<212>DNA
<213>人工的
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<223>靶序列
<400>187
Figure A20068000794400801
<210>188
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
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<223>靶序列
<400>188
Figure A20068000794400802
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<211>19
<212>DNA
<213>人工的
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<223>靶序列
<400>189
Figure A20068000794400803
<210>190
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
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<223>靶序列
<400>190
Figure A20068000794400804
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<211>4465
<212>DNA
<213>人
<400>191
Figure A20068000794400805
Figure A20068000794400811
Figure A20068000794400821
Figure A20068000794400831
<210>192
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>靶序列
<400>192
Figure A20068000794400832
<210>193
<211>19
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<223>有义链
<400>193
Figure A20068000794400833
<210>194
<211>19
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<223)反义链
<400>194
Figure A20068000794400841
<210>195
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>有义链
<400>195
Figure A20068000794400842
<210>196
<211>25
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<223>有义链
<400>196
Figure A20068000794400843
<210>197
<211>27
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<223>反义链
<400>197
Figure A20068000794400844

Claims (47)

1.减弱受试者的卷曲相关蛋白-1 mRNA表达的方法，包括向受试者施用包含有效量的长度为19至49个核苷酸的干扰性RNA和可药用载体的组合物，其中卷曲相关蛋白-1 mRNA的表达因此得到减弱；所述干扰性RNA包含至少13个连续核苷酸的区域，所述的区域与对应于SEQ EDNO：2、SEQ ID NO：8-SEQ ID NO：190和SEQ ID NO：192任何一个的mRNA的3’末端的次末13个核苷酸具有至少90％的序列互补性或至少90％的序列同一性。
2.权利要求1所述的方法，其中组合物还包含第二个干扰性RNA，该第二个干扰性RNA具有19至49个核苷酸长度并包含至少13个连续核苷酸的区域，所述的区域与对应于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：8-SEQ IDNO：190和SEQ ID NO：192任何一个的第二个mRNA 3’末端的次末13个核苷酸具有至少90％的序列互补性或至少90％的序列同一性。
3.权利要求1所述的方法，其中干扰性RNA包含至少14个连续核苷酸的区域，所述的区域与对应于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：8-SEQ IDNO：190和SEQ ID NO：192任何一个的mRNA 3’末端的次末14个核苷酸具有至少85％的序列互补性或至少85％的序列同一性。
4.权利要求1所述的方法，其中干扰性RNA包含至少15、16、17或18个连续核苷酸的区域，所述的区域分别与对应于SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：8-SEQ ID NO：190和SEQ ID NO：192任何一个的mRNA 3’末端的次末15、16、17或18个核苷酸具有至少80％的序列互补性或至少80％的序列同一性。
5.权利要求1所述的方法，其中干扰性RNA是shRNA。
6.权利要求1所述的方法，其中组合物经局部、玻璃体内、经巩膜、眼周、结膜、筋膜下、前房内、视网膜下、结膜下、眼球后、小管内或脉络膜上途径施用。
7.权利要求1所述的方法，其中干扰性RNA从能够表达干扰性RNA的表达载体经体内表达而施用。
8.权利要求1所述的方法，其中干扰性RNA是miRNA。
9.权利要求1所述的方法，其中干扰性RNA是siRNA。
10.包含有效量的具有19至49个核苷酸长度的干扰性RNA和可药用载体的组合物在制备治疗受试者中青光眼的药物中的用途，所述干扰性RNA包含至少13个连续核苷酸的区域，所述的区域与对应于SEQ EDNO：2、SEQ ID NO：8-SEQ ID NO：190和SEQ ID NO：192任何一个的mRNA的3’末端的次末13个核苷酸具有至少90％的序列互补性或至少90％的序列同一性。
11.权利要求10所述的用途，其中组合物还包含第二个干扰性RNA，该第二个干扰性RNA具有19至49个核苷酸长度并包含至少13个连续核苷酸的区域，所述的区域与对应于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：8-SEQ IDNO：190和SEQ ID NO：192任何一个的第二个mRNA 3’末端的次末13个核苷酸具有至少90％的序列互补性或至少90％的序列同一性。
12.权利要求10所述的用途，其中干扰性RNA包含至少14个连续核苷酸的区域，所述的区域与对应于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：8-SEQ IDNO：190和SEQ ID NO：192任何一个的mRNA 3’末端的次末14个核苷酸具有至少85％的序列互补性或至少85％的序列同一性。
13.权利要求10所述的用途，其中干扰性RNA包含至少15、16、17或18个连续核苷酸的区域，所述的区域分别与对应于SEQ ID NO：2、SEQID NO：8-SEQ ID NO：190和SEQ ID NO：192任何一个的mRNA 3’末端的次末15、16、17或18个核苷酸具有至少80％的序列互补性或至少80％的序列同一性。
14.权利要求10所述的用途，其中干扰性RNA是shRNA。
15.权利要求10所述的用途，其中将组合物制备成用于局部、玻璃体内、经巩膜、眼周、结膜、筋膜下、前房内、视网膜下、结膜下、眼球后、小管内或脉络膜上施用。
16.权利要求10所述的用途，其中将组合物制备成用于从能够表达干扰性RNA的表达载体经体内表达而施用。
17.权利要求10所述的用途，其中干扰性RNA是miRNA。
18.权利要求10所述的用途，其中干扰性RNA是siRNA。
19.权利要求10所述的用途，其中至少13个连续核苷酸的区域与对应于SEQ ED NO：2、SEQ ID NO：8-SEQ ID NO：190任何一个的mRNA 3’末端的次末13个核苷酸具有至少90％的序列互补性或至少90％的序列同一性。
20.权利要求10所述的用途，其中至少13个连续核苷酸的区域与对应于SEQ ED NO：192的mRNA 3’末端的次末13个核苷酸具有至少90％的序列互补性或至少90％的序列同一性。
21.减弱受试者的卷曲相关蛋白-1 mRNA表达的方法，包括向受试者施用包含有效量的长度为19至49个核苷酸的干扰性RNA和可药用载体的组合物，其中卷曲相关蛋白-1 mRNA的表达因此得到减弱；所述干扰性RNA包含有义核苷酸链、反义核苷酸链和至少19个核苷酸至少接近完全连续互补的区域；其中反义链在生理条件下与对应于SEQ ID NO：1或SEQID NO：191的mRNA的一部分杂交，并具有至少19个核苷酸的区域，所述的区域与对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：191的mRNA的杂交部分至少接近完全连续互补。
22.权利要求21所述的方法，其中反义链在生理条件下与对应于SEQID NO：1的mRNA的一部分杂交，并具有至少19个核苷酸的区域，所述的区域与对应于SEQ ID NO：1的mRNA的杂交部分至少接近完全连续互补。
23.权利要求21所述的方法，其中反义链在生理条件下与对应于SEQID NO：191的mRNA的一部分杂交，并具有至少19个核苷酸的区域，所述的区域与对应于SEQ ID NO：191的mRNA的杂交部分至少接近完全连续互补。
24.权利要求21所述的方法，其中将干扰性RNA的反义链设计成靶向对应于SEQ ID NO：1且包含核苷酸509、521、524、767、818、843、850、872、881、900、959、968、971、983、986、989、1001、1016、1019、1022、1031、1034、1052、1088、1121、1127、1207、1360、1445、1450、1478、1487、1524、1535、1562、1579、1613、1661、1667、1724、1730、1753、1757、1763、1771、1794、1800、1813、1887、1893、1916、2001、2006、2106、2117、2135、2142、2152、2200、2203、2206、2241、2263、2276、2279、2389、2410、2430、2464、2468、2482、2502、2506、2572、2645、2666、2681、2697、2715、2734、2760、2770、2783、2797、2807、2844、2917、2937、2961、3005、3010、3080、3130、3150、3156、3179、3185、3196、3244、3281、3345、3350、3365、3372、3403、3410、3424、3428、3450、3453、3460、3596、3668、3672、3746、3762、3776、3786、3789、3826、3835、3844、3847、3867、3912、3924、3958、3976、3981、4012、4022、4071、4089、4154、4157、4208、4369、4375、4441、966、408、409、463、754、862、863、864、868、874、909、913、915、956、1118、1135、1634、1637、1640、1737、1867、1868、2100、2259、2260、2483、2598、2673、2675、2779、2985、2986、2987、2988、3055、3062、3161、3217、3355、3623、3648、3665、3817、4153或4252的mRNA。
25.权利要求21所述的方法，其中将干扰性RNA的反义链设计成靶向对应于SEQ ID NO：191且包含核苷酸3352的mRNA。
26.权利要求21所述的方法，还包括向受试者施用第二个干扰性RNA，该第二个干扰性RNA具有19至49个核苷酸长度并包含有义核苷酸链、反义核苷酸链和至少19个核苷酸至少接近完全连续互补的区域；其中第二个干扰性RNA的反义链在生理条件下与对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：191的mRNA的第二个部分杂交并具有至少19个核苷酸的区域，所述的区域与分别对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：191的mRNA的第二个杂交部分至少接近完全连续互补。
27.权利要求21所述的方法，其中有义核苷酸链和反义核苷酸链通过核苷酸链环连接。
28.权利要求21所述的方法，其中组合物经局部、玻璃体内、经巩膜、眼周、结膜、筋膜下、前房内、视网膜下、结膜下、眼球后、小管内或脉络膜上途径施用。
29.权利要求21所述的方法，其中干扰性RNA从能够表达干扰性RNA的表达载体经体内表达而施用。
30.包含有效量的具有19至49个核苷酸长度的干扰性RNA和可药用载体的组合物在制备治疗受试者中青光眼的药物中用途，所述干扰性RNA包含有义核苷酸链、反义核苷酸链和至少19个核苷酸至少接近完全连续互补的区域；其中反义链在生理条件下与对应于SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：191的mRNA的一部分杂交，并具有至少19个核苷酸的区域，所述的区域与分别对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：191的mRNA的杂交部分至少接近完全连续互补。
31.权利要求30所述的用途，其中反义链在生理条件下与对应于SEQID NO：1的mRNA的一部分杂交，并具有至少19个核苷酸的区域，所述的区域与对应于SEQ ID NO：1的mRNA的杂交部分至少接近完全连续互补。
32.权利要求30所述的用途，其中反义链在生理条件下与对应于SEQID NO：191的mRNA的一部分杂交，并具有至少19个核苷酸的区域，所述的区域与对应于SEQ ID NO：191的mRNA的杂交部分至少接近完全连续互补。
33.权利要求30所述的用途，其中将干扰性RNA的反义链设计成靶向对应于SEQ ID NO：1且包含核苷酸509、521、524、767、818、843、850、872、881、900、959、968、971、983、986、989、1001、1016、1019、1022、1031、1034、1052、1088、1121、1127、1207、1360、1445、1450、1478、1487、1524、1535、1562、1579、1613、1661、1667、1724、1730、1753、1757、1763、1771、1794、1800、1813、1887、1893、1916、2001、2006、2106、2117、2135、2142、2152、2200、2203、2206、2241、2263、2276、2279、2389、2410、2430、2464、2468、2482、2502、2506、2572、2645、2666、2681、2697、2715、2734、2760、2770、2783、2797、2807、2844、2917、2937、2961、3005、3010、3080、3130、3150、3156、3179、3185、3196、3244、3281、3345、3350、3365、3372、3403、3410、3424、3428、3450、3453、3460、3596、3668、3672、3746、3762、3776、3786、3789、3826、3835、3844、3847、3867、3912、3924、3958、3976、3981、4012、4022、4071、4089、4154、4157、4208、4369、4375、4441、966、408、409、463、754、862、863、864、868、874、909、913、915、956、1118、1135、1634、1637、1640、1737、1867、1868、2100、2259、2260、2483、2598、2673、2675、2779、2985、2986、2987、2988、3055、3062、3161、3217、3355、3623、3648、3665、3817、4153或4252的mRNA。
34.权利要求30所述的用途，其中将干扰性RNA的反义链设计成靶向对应于SEQ ID NO：191且包含核苷酸3352的mRNA。
35.权利要求30所述的用途，还包括向受试者施用第二个干扰性RNA，该第二个干扰性RNA具有19至49个核苷酸长度并包含有义核苷酸链、反义核苷酸链和至少19个核苷酸至少接近完全连续互补的区域；其中第二个干扰性RNA的反义链在生理条件下与对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：191的mRNA的第二个部分杂交并具有至少19个核苷酸的区域，所述的区域与分别对应于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：191的mRNA的第二个杂交部分至少接近完全连续互补。
36.权利要求30所述的用途，其中有义核苷酸链和反义核苷酸链通过核苷酸链环连接。
37.权利要求30所述的用途，其中组合物经局部、玻璃体内、经巩膜、眼周、结膜、筋膜下、前房内、视网膜下、结膜下、眼球后、小管内或脉络膜上途径施用。
38.权利要求30所述的用途，其中将组合物制备成从能够表达干扰性RNA的表达载体经体内表达而施用。
39.减弱受试者的卷曲相关蛋白-1 mRNA表达的方法，包括向受试者施用包含有效量的具有19至49个核苷酸长度的单链干扰性RNA和可药用载体的组合物，其中卷曲相关蛋白-1 mRNA的表达因此得到减弱；其中单链干扰性RNA在生理条件下与对应于SEQ ID NO：1且包含核苷酸509、521、524、767、818、843、850、872、881、900、959、968、971、983、986、989、1001、1016、1019、1022、1031、1034、1052、1088、1121、1127、1207、1360、1445、1450、1478、1487、1524、1535、1562、1579、1613、1661、1667、1724、1730、1753、1757、1763、1771、1794、1800、1813、1887、1893、1916、2001、2006、2106、2117、2135、2142、2152、2200、2203、2206、2241、2263、2276、2279、2389、2410、2430、2464、2468、2482、2502、2506、2572、2645、2666、2681、2697、2715、2734、2760、2770、2783、2797、2807、2844、2917、2937、2961、3005、3010、3080、3130、3150、3156、3179、3185、3196、3244、3281、3345、3350、3365、3372、3403、3410、3424、3428、3450、3453、3460、3596、3668、3672、3746、3762、3776、3786、3789、3826、3835、3844、3847、3867、3912、3924、3958、3976、3981、4012、4022、4071、4089、4154、4157、4208、4369、4375、4441、966、408、409、463、754、862、863、864、868、874、909、913、915、956、1118、1135、1634、1637、1640、1737、1867、1868、2100、2259、2260、2483、2598、2673、2675、2779、2985、2986、2987、2988、3055、3062、3161、3217、3355、3623、3648、3665、3817、4153或4252的一部分mRNA杂交，并且干扰性RNA具有与对应于SEQ ID NO：1的mRNA的杂交部分至少接近完全连续互补的区域；或者，其中单链干扰性RNA在生理条件下与对应于SEQ ID NO：191且包含核苷酸3352的一部分mRNA杂交，并且干扰性RNA具有至少19个核苷酸的区域，所述的区域与对应于SEQ ID NO.191的mRNA的杂交部分至少接近完全连续互补。
40.权利要求39所述的方法，其中组合物经局部、玻璃体内、经巩膜、眼周、结膜、筋膜下、前房内、视网膜下、结膜下、眼球后、小管内或脉络膜上途径施用。
41.权利要求39所述的方法，其中干扰性RNA从能够表达干扰性RNA的表达载体经体内表达而施用。
42.权利要求39所述的方法，其中干扰性RNA是miRNA。
43.权利要求39所述的方法，其中干扰性RNA是siRNA。
44.包含干扰性RNA和可药用载体的组合物，其中所述的干扰性RNA具有19至49个核苷酸长度并包含对应于SEQ ID NO.2、SEQ ID NO：8-SEQ ID NO：190和SEQ ID NO：192任何一个的核苷酸序列或其互补序列。
45.权利要求44所述的组合物，其中干扰性RNA是shRNA。
46.权利要求44所述的组合物，其中干扰性RNA是siRNA。
47.权利要求44所述的组合物，其中干扰性RNA是miRNA。
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