CN114410627B - 一种特异性敲降TNF-α基因表达的siRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种特异性敲降TNF‑α基因表达的siRNA及其应用，本发明提供的siRNA序列能够特异性敲降TNF‑α转录水平，本发明还通过硫代修饰正义链，在没有明显增加细胞毒性的基础上，又极大提高在血清中抗酶解能力，增加siRNA的体内滞留时间，可在多种肿瘤疾病、自身免疫性疾病治疗中发挥潜在的应用价值。

Description

一种特异性敲降TNF-α基因表达的siRNA及其应用
技术领域
本发明涉及一种特异性敲降TNF-α基因表达的siRNA及其应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
siRNA一般指长度19～25bp，碱基互补配对的双链RNA。目前，siRNA已经有上市的药物，还有更多siRNA药物正在临床试验阶段。血清中丰富的成分，尤其是酶的多样性，使siRNA抗血清酶解的能力较弱，容易降解，这极大的影响siRNA药物在人体内发挥效应的时长。进入临床的siRNA药物中，siRNA序列通过化学修饰，来提高siRNA体内滞留时间。目前应用广泛的修饰方法有以下几种。一、磷酸骨架修饰。比较经典的是硫代修饰，即RNA 碱基连接的磷酸二酯键中，磷酸基团的氧原子被硫原子替换。正义链硫代修饰后能提高 siRNA稳定性，反义链硫代修饰后，可能会带来细胞毒性，且siRNA的敲降能力下降，这可能与反义链结合mRNA后，由于硫代修饰影响RNA链的二级结构，从而靶向mRNA能力下降有关。二、核糖修饰。常用的有RNA戊糖的2’-OH替换成烷基，如2’-OMe、2’-O-MOE； RNA戊糖的2’-OH替换成2’-F、2’-Ara-F或者LNA。比如全球第一个通过FDA批准的siRNA 药物Patisiran，正义链所有尿嘧啶和胞嘧啶作2’-OMe修饰，反义链的两个尿嘧啶作2’-OMe 修饰，在不影响siRNA干扰水平的同时，提高了siRNA滞留人体的时间，避免被快速降解代谢。三、碱基修饰。因为siRNA与mRNA通过碱基之间的氢键互补配对，所以对碱基修饰，增强碱基与碱基之间的相互作用。常用的有m6A、m5C、s2U、Phpc修饰方法。四、其它。Alnylam公司治疗成人急性肝卟啉症的siRNA药物Givosiran，在正义链的3’端添加N 乙酰半乳糖胺(GalNAc)，在提高siRNA稳定性的同时，提高靶向肝细胞的特异性。总的来说，siRNA化学修饰是RNAi进入临床的必然手段，序列的特异性造成电荷与二级结构的不同，每条siRNA都有自己最适合自己的修饰方法，因此并没有一个通用的化学修饰策略或者设计化学修饰的网站。目前siRNA的修饰方法需要科研人员自己设计及筛选。
TNF-α(肿瘤坏死因子)由巨噬细胞、NK细胞及T淋巴细胞产生。由巨噬细胞产生的TNF称作TNF-α，由T淋巴细胞产生的称作TNF-β。TNF-α占总TNF的70％以上，因此一般说的TNF就指TNF-α。人类TNF-α位于染色体6p21.4，由3个内含子和4个外显子组成。 TNF-α的受体是TNFR(TNF receptor)，是一种三聚体结构。体内的成纤维细胞、表皮细胞、角质细胞、星形细胞等都表达TNF-α。
TNF-α的表达与癌症有密切关联，在体内、体外均能杀死某些肿瘤细胞，或抑制增殖作用。在乳腺癌中，TNF-α对癌症分期和转移情况有指导意义。健康成年人的血清中几乎不表达TNF-α，乳腺癌患者TNF-α表达量较高，且随着癌症的恶化，TNF-α的表达逐渐升高。发生乳腺癌细胞转移的患者TNF-α表达比未转移患者要高；手术切除肿瘤后复发患者的TNF-α表达也重新升高。TNF-α的抑制剂英夫利昔单抗就有抑制肿瘤转移的效果。胃癌中，患者血液中TNF-α表达过高，引起患者免疫系统失调，加重患者其它器官损伤，最终引起恶性转移而死亡。早期与晚期患者血清中TNF-α表达较低，中期患者TNF-α表达很高。肝癌中，原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一。TNF-α通过内质网应激信号通路诱导癌细胞增殖，肝癌患者的TNF-α表达水平高于健康人。此外，TNF-α在肝硬化、酒精性肝炎、病毒性肝炎、肝衰竭中表达量均高于健康人。TNF-α在肿瘤中异常高表达提示了，抑制TNF-α的表达可以抑制肿瘤发生的进程，缓解患者的病情。
TNF-α的表达与自身免疫性疾病密切相关。系统性红斑狼疮中，患者血液中TNF-α表达量较健康人高，但是抑制TNF-α的表达，有可能抑制其免疫系统调节功能。用TNF-α抑制剂英夫利昔单抗，患者的皮表损伤明显较少，狼疮活动指数(SLEDAI)明显下降。银屑病中，TNF-α、IL-12、IL-17、IL-23都异常表达。咪喹莫特药膏可以诱导小鼠银屑病样皮肤，实验表明TNF-α基因敲除的小鼠在使用咪喹莫特后，皮损炎症情况轻于对照组。强直性脊柱炎中，TNF-α不仅表达水平升高，而且促进骨赘的生成。TNF-α的表达越高，脊柱活动越受限，可能是TNF-α刺激滑膜成纤维细胞分化为成骨细胞，形成新的骨赘，导致脊柱活动受限。
综上，TNF-α是治疗多种肿瘤疾病、自身免疫性疾病的潜在靶点，一对有效的siTNF-α序列在小分子核酸药物中就显得尤为重要。更优选，一种具有高血清稳定性且敲降TNF-α表达的siRNA在药物研发中更加宝贵。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明通过筛选获得了一对特异性敲降TNF-α表达及功能的siRNA(靶基因GeneBank：MH180383.1)，用于体外、体内实验。本发明还通过化学修饰提供了一对具有高血清稳定性且敲降TNF-α表达的siRNA，用于体外、体内实验，抑制TNF-α的表达及功能。
本发明的第一个目的是提供一种特异性敲降TNF-α基因表达的siRNA，所述的siRNA的正义链的序列为5’-GCCUGUAGCCCAUGUUGUA TT-3’，反义链的序列为3’- TTCGGACAUCGGGUACAACAU-5’。
进一步地，所述的TNF-α基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述的siRNA还包括对其正义链进行硫代修饰。
进一步地，所述的硫代修饰是将其正义链从5’端起第2、3、4、6、7、9、10、11、 12、13、15、16、18和19位碱基中α位磷酸基团的一个氧原子采用硫原子替代。
本发明的第二个目的是提供所述的siRNA在制备治疗肿瘤疾病的药物中的应用。
进一步地，所述的肿瘤疾病包括乳腺癌、胃癌、肝癌中的至少一种。
进一步地，所述的药物通过皮肤用药、静脉注射或雾化鼻吸进行给药。
本发明的第三个目的是提供所述的siRNA在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。
进一步地，所述的自身免疫性疾病包括银屑病、强直性脊柱炎、系统系红斑狼疮中的至少一种。
进一步地，所述的药物通过皮肤用药、静脉注射或雾化鼻吸进行给药。
本发明的有益效果是：
本发明提供的siRNA序列能够特异性敲降TNF-α转录水平，本发明还通过硫代修饰正义链，在没有明显增加细胞毒性的基础上，又极大提高在血清中抗酶解能力，增加siRNA的体内滞留时间，可在多种肿瘤疾病、自身免疫性疾病治疗中发挥潜在的应用价值。
附图说明：
图1是硫代结构式，A是硫代在RNA链中的位置；B是所用硫代试剂的化学结构式；
图2是未修饰的siTNF-α细胞转染后，细胞TNF-α的mRNA表达水平，A为转染未修饰的siTNF-α50pmol，B为转染未修饰的siTNF-α75pmol；
图3是未修饰的siTNF-α细胞转染后，细胞TNF-α的蛋白表达水平；
图4是带FAM荧光基团且化学修饰的siTNF-α转染细胞后，细胞荧光表达情况；
图5是化学修饰的siTNF-α细胞转染后，细胞TNF-α的mRNA表达水平；
图6是化学修饰的siTNF-α细胞转染后，细胞TNF-α的蛋白表达水平；
图7是未化学修饰或化学修饰的siTNF-α在血清中抗酶解能力的验证，A为化学修饰的 siTNF-α在血清中抗酶解能力的验证，B为未化学修饰的siTNF-α在血清中抗酶解能力的验证；
图8是化学修饰的siTNF-α带给细胞的毒性情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：获取未修饰或修饰的siTNF-α
(1)siRNA序列在‘siRNA Target Finder’在线设计得到，设计时不要以5’非翻译区 (5’UTR)和3’非翻译区(3’UTR)及起始密码子附近的序列作为设计siRNA的模板，也要避开外显子与外显子的交界区域。从靶基因起始密码子AUG下游100bp的核苷酸开始搜寻理想的siRNA。设计了3对siTNF-α。通过预实验确认了其中一对特异性敲降水平最高的 siRNA(其正义链和反义链的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示)。
(2)以核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的siRNA作为阴性对照，将特异性敲降水平最高的siRNA及阴性对照进行不同的修饰，修饰或不修饰的siTNF-α的正义链、反义链的序列如表1所示：
表1修饰或不修饰的siTNF-α的正义链、反义链的序列
核酸合成仪输入相应的序列，得到单链。按下表退火成双链siRNA：
表2退火体系
试剂 体积/重量
正义链序列 33ug
反义链序列 33ug
10×退火buffer 10ul
DEPC水 补足100ul
(3)退火程序：水浴锅加热到95℃，关闭水浴锅，混合液放置水浴锅中，等水浴锅自然降温至室温，大约5h。
(4)HPLC纯化。
(5)修饰siTNF-α的硫代在磷酸二酯键中的位置及所用硫代的化学结构式如图1所示。其中图1中，A是硫代在RNA链中的位置；B是所用硫代试剂的化学结构式。
(6)本发明提供的siRNA靶向mRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。siRNA与mRNA 结合的序列在2470bp～2488bp处。
最终，经过验证，修饰的siRNA中，肌酐修饰的抗血清酶降解能力低，双链硫代修饰的有细胞毒性，肌酐、硫代修饰正义链的抗血清能力低，因此，都进行排除，下面实施例中以硫代修饰正义链的siRNA为例，进行效果表述。
实施例2：未修饰或修饰siTNF-α转染细胞，检测细胞TNF-α的mRNA表达水平
(1)转染
①定量siRNA，DEPC水稀释到20uM。
②HaCat细胞传代至12孔板，第二天转染前密度达到30％～50％。
③转染时，2.5ul siRNA加入到50ul DMEM培养基中作为A管，5ul lip3000加入到50ul DMEM培养基中作为B管，A管加入B管中，充分混匀，室温静置15min。滴加到12孔板中。设置对照NC组，未修饰或修饰siTNF-α组，每个实验组做3个平行。
(2)提取RNA
使用天根试剂盒‘RNA prep Pure Cell/Bacteria Kit’，货号为DP430，具体操作如下：
①细胞培养液去除干净，每孔加500ul PBS润洗细胞，弃掉，2次。
②每孔加350ul裂解液RL，吹打细胞后，转移到过滤柱CS上，12000rpm×2min，收集滤液。
③向滤液中加350ul 70％乙醇，混匀，混合液转移到吸附柱CR3中，12000rpm×1min，弃废液，吸附柱放回收集管中。
④吸附柱CR3中加入350ul去蛋白液PW1，12000rpm×1min，弃废液，吸附柱放回收集管中。
⑤吸附柱中加入80ul DNase I，室温静置15min。
⑥吸附柱CR3中加入350ul去蛋白液PW1，12000rpm×1min，弃废液，吸附柱放回收集管中。
⑦吸附柱中加入500ul漂洗液RW，12000rpm×1min，弃废液，吸附柱放回收集管中，重复2次。
⑧12000rpm×1min，掉到残余废液。室温晾干吸附柱5min。
⑨吸附柱正中央滴加30ul DEPC水，室温放置2min，12000rpm×2min。
(3)逆转录RNA，得到cDNA
①按下表格逆转录RNA得到cDNA
表3逆转录配置体系
试剂 体积
5×RT Buffer 4ul
M-MLV(H-)Reverse Transcription Mix 1ul
RNA 1000ng
oligo(dT)20(10uM) 4ul
DEPC水 补足20ul
②PCR仪运行程序：42℃，1h；85℃，5min；4摄氏度，∞；
③20ul的cDNA原液加入180ul的纯化水，混匀。
(4)Q-PCR检测
①按下表配置Q-PCR体系，以检测目的基因的表达
表4 Q-PCR配置体系
试剂 体积
2×Q-PCR Mix 10ul
cDNA 20ng
引物上游(10uM) 1ul
引物下游(10uM) 1ul
纯水 补足20ul
②Q-PCR仪运行程序：95℃，3mins；39个循环(95℃，15s；60℃，30s)；95℃15s； 60℃，1min；95℃，15s。用GAPDH作内参，3个重复，观察溶解曲线和CT值，用2-△△Ct计算目的基因的表达量。
(5)实验结果
图2中，A为转染未修饰的siTNF-α50pmol，B为转染未修饰的siTNF-α75pmol，由图2得知，当未修饰的siTNF-α转染50pmol、75pmol时，有敲降效果，均剩30％以下的表达量，即50pmol、75pmol的转染效果优异。
由图5得知，当修饰的siTNF-α转染50pmol、75pmol、100pmol时，有敲降效果，其中50pmol、75pmol的转染效果更佳，均剩40％以下的表达量，即50pmol、75pmol的转染效果优异。
实施例3：未修饰或修饰siTNF-α转染细胞，检测细胞TNF-α的蛋白表达水平
(1)转染
①定量siRNA，DEPC水稀释到20uM。确定转染浓度是50pmol。
②HaCat细胞传代至12孔板，第二天转染前密度达到30％～50％。
③转染时，2.5ul siRNA加入到50ul DMEM培养基中作为A管，5ul lip3000加入到50ul DMEM培养基中作为B管，A管加入B管中，充分混匀，室温静置15min。滴加到12孔板中。设置对照NC组，未修饰或修饰siTNF-α组，每个实验组做3个平行。
④额外设置1个孔，转染50pmol的带FAM荧光基团的修饰siTNF-α。
(2)细胞培养48h后，收集细胞，提取蛋白质
①PBS洗一遍细胞后，加入200ul含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液(RIPA)，移液器充分吹打后转移至1.5ml EP管中；室温离心12000rpm，5min，手机上清，即细胞总蛋白产物；
②放入水浴锅95℃，5min，使得蛋白充分变性，蛋白定量后-80℃保存备用。
(3)Western Blot检测
①配胶，上样，60V30min，120V 90min；
②减大小适中的PDVF膜，甲醇激活20s，弃甲醇，用纯水洗涤5min，拆开跑胶，放到膜的洗盒里，弃水，倒入转膜液，摇床上洗15min；
③转膜板白板放板，黑面放胶，胶放在棉花最中间一层，一般2层棉花加胶加两层棉花，在膜左上角剪一缺口作标记；
④放入转膜槽内，放入盆里，倒满槽内转膜液，盖上盖子，倒入冰盖满，放入适量的水(水不超过盖子，防止电流不稳定)，100V，2h；
⑤用TBST稀释5％脱脂奶粉，将膜放入5％的牛奶纵，摇床2h进行封闭；
⑥将膜稍微在TBST中洗一下，用一抗稀释液稀释一抗，敷膜上，室温过夜；
⑦用TBST+0.1％Tween-20洗膜，室温10min，3次；
⑧用二抗稀释液稀释二抗，敷膜，室温2h；
⑨用TBST洗膜室温5min，4次，TBS洗膜，室温5min，1次；暗室显影。
(4)细胞荧光
①6h时，取出转染化学修饰siTNF-α-FAM的细胞孔。
②PBS洗涤：侧壁缓缓加入500ul PBS，轻轻晃动孔板，室温静置3～5min，弃掉PBS。重复3次。
③侧壁缓缓加入500ul 4％多聚甲醛，室温固定15min。弃掉液体。
④PBS洗涤：侧壁缓缓加入500ul PBS，轻轻晃动十二孔板，室温静置3～5min，弃掉PBS。重复3次。
⑤侧壁缓缓加入300ul 1×DAPI，室温静置10～15min。弃掉液体。
⑥PBS洗涤：侧壁缓缓加入500ul PBS，轻轻晃动十二孔板，室温静置3～5min，弃掉PBS。重复2～3次。
⑦荧光显微镜下观察
(5)实验结果
图3A中，1～4是A375细胞验证结果，7～8是HaCat细胞验证结果，其中1和7是SEQNC(S1、AS1)50pmol，2和8是SEQ(S1、AS1)50pmol，3和9是SEQ NC(S1、AS1) 75pmol，4和10是SEQ(S1、AS1)75pmol，5是蛋白maker 48KDa处TNF-α的位置，6 是蛋白maker 38KDa处GAPDH的位置。
图3B是图3A的灰度统计图，1是SEQ NC(S1、AS1)50pmol或者75pmol，2是SEQ (S1、AS1)50pmol，3是SEQ(S1、AS1)75pmol。表明siTNF-α在A375细胞、HaCat 细胞中有降低TNF-α表达的作用。
图6A中，1～4是A375细胞验证结果，7～8是HaCat细胞验证结果，其中1和7是SEQNC(S2、AS2)50pmol，2和8是SEQ(S2、AS2)50pmol，3和9是SEQ NC(S2、AS2) 75pmol，4和10是SEQ(S2、AS2)75pmol，5是蛋白maker 48KDa处TNF-α的位置，6 是蛋白maker 38KDa处GAPDH的位置。
图6B是图6A的灰度统计图，1是SEQ NC(S2、AS2)50pmol或者75pmol，2是SEQ (S2、AS2)50pmol，3是SEQ(S2、AS2)75pmol。表明siTNF-α在A375细胞、HaCat 细胞中有降低TNF-α表达的作用。
由图4得知，‘Bright’是白光下HaCat细胞形态，细胞呈片状生长，细胞透亮、干净，生长良好；‘UV’是紫外激发波长330nm-400nm，发射波长450nm下的蓝色，标记细胞核；‘TNF-αps-sig FAM’是转染50pmol的带FAM荧光基团的修饰siTNF-α，激发波长460nm-500nm，发射波长535nm下的绿色，表示siTNF-α成功转染进细胞。
实施例4：化学修饰的siTNF-α的血清酶解实验
(1)混合管配置
①取5只0.2ml PCR管，分别加入400ug化学修饰的siTNF-α与0.5ul胎牛血清，用DEPC 水补足5ul，37℃分别放置N小时，N＝24h、6h、4h、2h、0h。
②未化学修饰的siTNF-α的操作同上。
(2)琼脂糖胶验证
①配胶所用的磨具、耗材纯水冲洗，DEPC水再润洗。
②称量2g琼脂糖，加入100ml 1×TAE溶液，混匀。
③微波炉高火加热2min，取出摇匀，微波炉高火加热1min。
④加入10ul 10000×的Gelred染料，混匀，静置30s，倒入模具。
⑤静置至少30min，等胶彻底冷却凝固。
⑥跑电泳：向PCR小管中加至少1ul的6*loading buffer，混匀，上样，140V，15min。
⑦拍照。
(3)实验结果
由图7A得知，化学修饰的siTNF-α在血清中24h时，依然有部分存在未降解，显示出良好的抗酶解能力。其中0、1、2、3、4是siTNF-α条带的位置，1是2h，2是4h，3是6h， 4是24h，0是0h，5是二甲苯青，6是溴酚蓝的位置。
由图7B得知，未化学修饰的siTNF-α在血清中，6h时剩余一些siRNA，24h时全部降解。其中0、1、2、3、4是siTNF-α条带的位置，1是2h，2是4h，3是6h，4是24h，0 是0h，5是二甲苯青，6是溴酚蓝的位置。
实施例5：化学修饰的siTNF-α的CCK-8实验
(1)有文献报道，硫代修饰siRNA后可能增加细胞毒性，且硫代修饰碱基数量越多，带来细胞毒性的概率越大。我们用A375细胞(人类恶性黑色素瘤)、HaCat细胞(人永生化角质形成细胞)分别验证本发明的化学修饰siTNF-α的细胞毒性。
①第一天，细胞传代至96孔板，使第二天加siRNA时，细胞密度在50％。
②第二天，根据实验需要，每孔滴加2.5ul化学修饰的siTNF-α(约500pmol，是最优转染浓度50pmol的10倍，过量滴加)。
③5％CO2，37℃孵育2h。
④酶标仪在450nm处测量吸光值。
(2)实验结果
由图8A得知，4h时，A375细胞表现出较轻微的细胞毒性，24h内基本没有明显的细胞毒性。
由图8B得知，6h时，HaCat细胞表现出较轻微的细胞毒性，24h内基本没有明显的细胞毒性。
综上所示，本发明提供的未修饰的siTNF-α可以有效敲降TNF-α的mRNA、蛋白水平，抑制了TNF-α的表达；该序列经过化学修饰后，不仅有原来的敲降功能，还显著的提高了血清中的抗酶解能力，并且几乎没有细胞毒性。两条序列可以用于体内、体外实验。针对潜在的肿瘤疾病、自身免疫性疾病，本发明提供的序列为生物创新药、小分子核酸药和医学研究奠定了新基础。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 硅羿科技（上海）有限公司
<120> 一种特异性敲降TNF-α基因表达的siRNA及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4011
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
gctgtctgct tgtgtgtgtg tgtctgggag tgagaacttc ccagtctatc taaggaatgg 60
agggagggac agagggctca aagggagcaa gagctgtggg gagaacaaaa ggataagggc 120
tcagagagct tcagggatat gtgatggact caccaggtga ggccgccaga ctgctgcagg 180
ggaagcaaag gagaagctga gaagaygaag gaaaagtcag ggtctggagg ggcgggggtc 240
agggagctcc tgggagatat ggccacatgt agcggctctg aggaatgggt tacaggagac 300
ctctggggag atgtgaccac agcaatgggt aggagaatgt ccagggctat ggaagtcgag 360
tatggggacc cccmcttaac gaagacaggg ccatgtagag ggccccaggg agtgaaagag 420
cctccaggac ytccaggtat ggaatacagg ggacgtttaa gaagatatgg ccacacactg 480
gggccctgag aagtgagagc ttcatgaaaa aaatcaggga ccccagagtt ccttggaagc 540
caagactgaa accagcatta tgagtctccg ggtcagaatg aaagaagaag gcctgcccca 600
gtggggtctg tgaattcccg ggggtgattt cactccccgg ggctgtccca ggcttgtccc 660
tgctaccccc acccagcctt tcctgaggcc tcaagcctgc caccaagccc ccagctcctt 720
ctccccgcag ggacccaaac acaggcctca ggactcaaca cagcttttcc ctccaacccc 780
gttttctctc cctcaaggac tcagctttct gaagcccctc ccagttctag ttctatcttt 840
ttcctgcatc ctgtctggaa gttagaagga aacagaccac agacctggtc cccaaaagaa 900
atggaggcaa taggttttga ggggcatggg gacggggttc agcctccagg gtcctacaca 960
caaatcagtc agtggcccag aagacccccc tcggaatcgg agcagggagg atggggagtg 1020
tgaggggtat ccttgatgct tgtgtgtccc caactttcca aatccccgcc cccgcgatgg 1080
agaagaaacc gagacagaag gtgcagggcc cactaccgct tcctccagat gagctcatgg 1140
gtttctccac caaggaagtt ttccgctggt tgaatgattc tttccccgcc ctcctctcgc 1200
cccagggaca tataaaggca gttgttggca cacccagcca gcagacgctc cctcagcaag 1260
gacagcagag gaccagctaa gagggagaga agcaactaca gaccccccct gaaaacaacc 1320
ctcagacgcc acatcccctg acaagctgcc aggcaggttc tcttcctctc acatactgac 1380
ccacggctcc accctctctc ccctggaaag gacaccatga gcactgaaag catgatccgg 1440
gacgtggagc tggccgagga ggcgctcccc aagaagacag gggggcccca gggctccagg 1500
cggtgcttgt tcctcagcct cttctccttc ctgatcgtgg caggcgccac cacgctcttc 1560
tgcctgctgc actttggagt gatcggcccc cagagggaag aggtgagtgc ctggccagcc 1620
ttcatccact ctcccaccca aggggaaatg gagacgcaag agagggagag agatgggatg 1680
ggtgaaagat gtgcgctgat agggagggat ggagagaaaa aaacgtggag aaagacgggg 1740
atgcagaaag agatgtggca agagatgggg aagagagaga gagaaagatg gagagacagg 1800
atgtctggca catggaaggt gctcactaag tgtgtatgga gtgaatgaat gaatgaatga 1860
atgaacaagc agatatataa ataagatatg gagacagatg tggggtgtga gaagagagat 1920
gggggaagaa acaagtgata tgaataaaga tggtgagaca gaaagagcgg gaaatatgac 1980
agctaaggag agagatgggg gagataagga gagaagaaga tagggtgtct ggcacacaga 2040
agacactcag ggaaagagct gttgaatgcc tggaaggtga atacacagat gaatggagag 2100
agaaaaccag acacctcagg gctaagagcg caggccagac aggcagccag ctgttcctcc 2160
tttaagggtg actccctcga tgttaaccat tctccttctc cccaacagtt ccccagggac 2220
ctctctctaa tcagccctct ggcccaggca gtcagtaagt gtctccaaac ctctttccta 2280
attctgggtt tgggtttggg ggtagggtta gtaccggtat ggaagcagtg ggggaaattt 2340
aaagttttgg tcttggggga ggatggatgg aggtgaaagt aggggggtat tttctaggaa 2400
gtttaagggt ctcagctttt tcttttctct ctcctcttca ggatcatctt ctcgaacccc 2460
gagtgacaag cctgtagccc atgttgtagg taagagctct gaggatgtgt cttggaactt 2520
ggagggctag gatttgggga ttgaagcccg gctgatggta ggcagaactt ggagacaatg 2580
tgagaaggac tcgctgagct caagggaagg gtggaggaac agcacaggcc ttagtgggat 2640
actcagaacg tcatggccag gtgggatgtg ggatgacaga cagagaggac aggaaccgga 2700
tgtggggtgg gcagagctcg agggccagga tgtggagagt gaaccgacat ggccacactg 2760
actctcctct ccctctctcc ctccctccag caaaccctca agctgagggg cagctccagt 2820
ggctgaaccg ccgggccaat gccctcctgg ccaatggcgt ggagctgaga gataaccagc 2880
tggtggtgcc atcagagggc ctgtacctca tctactccca ggtcctcttc aagggccaag 2940
gctgcccctc cacccatgtg ctcctcaccc acaccatcag ccgcatcgcc gtctcctacc 3000
agaccaaggt caacctcctc tctgccatca agagcccctg ccagagggag accccagagg 3060
gggctgaggc caagccctgg tatgagccca tctatctggg aggggtcttc cagctggaga 3120
agggtgaccg actcagcgct gagatcaatc ggcccgacta tctcgacttt gccgagtctg 3180
ggcaggtcta ctttgggatc attgccctgt gaggaggacg aacatccaac cttcccaaac 3240
gcctcccctg ccccaatccc tttattaccc cctccttcag acaccctcaa cctcttctgg 3300
ctcaaaaaga gaattggggg cttagggtcg gaacccaagc ttagaacttt aagcaacaag 3360
accaccactt cgaaacctgg gattcaggaa tgtgtggcct gcacagtgaa gtgctggcaa 3420
ccactaagaa ttcaaactgg ggcctccaga actcactggg gcctacagct ttgatccctg 3480
acatctggaa tctggagacc agggagcctt tggttctggc cagaatgctg caggacttga 3540
gaagacctca cctagaaatt gacacaagtg gaccttaggc cttcctctct ccagatgttt 3600
ccagacttcc ttgagacacg gagcccagcc ctccccatgg agccagctcc ctctatttat 3660
gtttgcactt gtgattattt attatttatt tattatttat ttatttacag atgaatgtat 3720
ttatttggga gaccggggta tcctggggga cccaatgtag gagctgcctt ggctcagaca 3780
tgttttccgt gaaaacggag ctgaacaata ggctgttccc atgtagcccc ctggcctctg 3840
tgccttcttt tgattatgtt ttttaaaata tttatctgat taagttgtct aaacaatgct 3900
gatttggtga ccaactgtca ctcattgctg agcctctgct ccccagggga gttgtgtctg 3960
taatcgccct actattcagt ggcgagaaat aaagtttgct tagaaaagaa a 4011
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> （人工序列）
<400> 2
gccuguagcc cauguuguat t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> （人工序列）
<400> 3
ttcggacauc ggguacaaca u 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> （人工序列）
<400> 4
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> （人工序列）
<400> 5
ttaagaggcu ugcacagugc a 21

Claims (8)

1.一种特异性敲降TNF-α基因表达的siRNA，其特征在于，所述的siRNA的正义链的序列为5’-GCCUGUAGCCCAUGUUGUATT-3’，反义链的序列为3’-TTCGGACAUCGGGUACAACAU-5’；
所述的siRNA还包括对其正义链进行硫代修饰；所述的硫代修饰是将其正义链从5’端起第2、3、4、6、7、9、10、11、12、13、15、16、18和19位碱基中α位磷酸基团的一个氧原子采用硫原子替代。
2.根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述的TNF-α基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
3.权利要求1～2任一项所述的siRNA在制备治疗肿瘤疾病的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤疾病包括乳腺癌、胃癌、肝癌中的至少一种。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药物通过皮肤用药、静脉注射或雾化鼻吸进行给药。
6.权利要求1～2任一项所述的siRNA在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的自身免疫性疾病包括银屑病、强直性脊柱炎、系统系红斑狼疮中的至少一种。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的药物通过皮肤用药、静脉注射或雾化鼻吸进行给药。
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