CN116024212A - 抑制IL-25基因表达的siRNA及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制IL‑25基因表达的siRNA及其应用，本发明提供的siRNA序列能够特异性敲降IL‑25表达水平，本发明还通过硫代修饰正义链，在没有明显增加细胞毒性的基础上，提高了siRNA在血清中抵抗酶水解的能力，延长作用时间，为治疗自身免疫性疾病带来重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种抑制IL-25基因表达的siRNA及其应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
IL-25是白介素17家族的成员之一，又称IL-17E。人IL-25全长3987bp，位于14号染色体。它的受体是IL-17RB。IL-25主要作用于高表达MHC-II、低表达CD11c的非B/非T细胞；T细胞方面，Th2型记忆细胞、NKT细胞、CD14+细胞也是IL-25的靶细胞。在IL-25的刺激下，NF-kB活化因子1通过细胞内SEF1R结构域结合到IL-17RB上，激活NF-kB信号通路。IL-25还可以通过胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)与树突状细胞(DCs)之间的相互作用，促进IL-17RB的表达，增加Th2型记忆细胞的功能，发挥免疫调节作用。现有研究表明，IL-25会参与的免疫疾病至少包括银屑病、过敏性肺炎、类风湿性关节炎、变应性肉芽肿血管炎和自身免疫性糖尿病等。所以，IL-25是自身免疫性疾病的潜在治疗靶点。
siRNA的作用方式又称RNA干扰或RNAi。siRNA通常是19～25bp的双链RNA分子，其功能是诱发同源mRNA高效特异性降解，从而降低某个蛋白质的表达。细胞内存在的dsRNA，被Dicer酶(RNaseIII家族成员)识别后，剪切成siRNA片段，siRNA与细胞内其它蛋白质形成RNA介导的RISC复合物，该复合物去寻找与siRNA反义链同源的mRNA，在ATP作用下，Dicer酶使siRNA解螺旋，释放正义链，保留反义链，反义链与mRNA特异性互补配对，RISC迅速切割这条mRNA；由于该mRNA没有poly(A)尾巴和5’帽结构的保护，可被其它核酸酶快速水解，从而抑制了该条mRNA翻译成蛋白质。所以，siRNA特异性降低了mRNA水平甚至蛋白水平的表达。
siRNA在生物医药领域中的应用有两大难题。一个是序列特异性，另一个是易被核酸酶降解。siRNA序列可以容忍1～2个碱基与mRNA错配，但是出现3个及以上错配时，靶向其它非目标mRNA的几率大大增加，而且随着错配碱基的出现，siRNA的干扰效率也可能下降。即设计一条特异性强的siRNA是第一个要解决的问题。其次，体外递送siRNA进入体内，siRNA由于体内丰富的核酸酶，极易被降解代谢掉，或者产生不被期望的免疫刺激反应。将siRNA的序列进行化学修饰，能提高siRNA的稳定性，减轻负面的免疫刺激。常用的化学修饰主要包括磷酸骨架修饰、核糖修饰和碱基修饰。例如专利号CN 107904239 A中验证过，未修饰的siRNA-RB在30分钟后已明显降解，而经过化学修饰的siRNA-RB在30分钟内无明显的降解。即设计有效的siRNA修饰且不影响敲降水平的化学修饰方法是另一个要解决的问题。
目前，在RNAi领域中，通过FDA批准上市的几款siRNA药物，都属于Anlylam公司，换句话说，Anlylam公司占有siRNA药物市场的巨大份额，且siRNA药物研发速度快。第一款上市的药物是2018年8月FDA批准的patisiran，用于治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性(haTTR)引起的神经损伤。正义链和反义链各包含21个核苷酸。正义链的19个核苷酸与反义链的互补19个核苷酸杂交，从而形成19个核苷酸碱基对，并在每条链上留下两个3'-末端核苷酸作为未杂交的突出端，在修饰上Patisiran同时应用了2’-O-M和2’-O-Me修饰。后面陆续上市药物还有治疗急性肝卟啉症的givosiran及治疗原发性1型高草酸尿症药物Lumasiran。目前，国内圣诺医药正在加速治疗增生瘢痕的siRNA药物已经进入临床II期。目前尚未有治疗银屑病等自身免疫疾病的siRNA药物研发报道。本发明基于IL-25的基因序列特征设计合成的siRNA序列旨在能够特异性敲降IL-25基因表达水平，同时对序列进行修饰以解决siRNA在血清中的稳定性问题，并避免潜在的细胞毒性，以达到可有效地改善和治疗自身免疫性疾病的目标。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明通过筛选获得一对特异性敲降IL-25表达及功能的siRNA(靶基因ID：NM_172314.2、NM_022789.4)，正义链和反义链分别如SEQ ID No.1、SEQID No.2所示，适用于体内、体外实验。
本发明的第一个目的是提供一种抑制IL-25基因表达的siRNA，所述的siRNA的正义链的序列为5’-CCUGGAGAUAUGAGUUGGATT-3’，反义链的序列为3’-TTGGACCUCUAUACUCAACCU-5’。
进一步地，所述siRNA特异性靶向NCBI编号为NM_172314.2或NM_022789.4的IL-25基因相应的mRNA同源序列片段。
进一步地，所述的siRNA还包括对其正义链进行化学修饰。
进一步地，所述的化学修饰为硫代修饰。
进一步地，所述的硫代修饰是将其正义链从5’端起第2、3、4、5、7、9、10、11、12、14、16、17、18和20位碱基中α位磷酸基团的一个氧原子采用硫原子替代。
进一步地，所述的硫代修饰是将其正义链从5’端起第2、3、4、7、9、10、11、12、14、16、17和20位碱基中α位磷酸基团的一个氧原子采用硫原子替代。
本发明的第二个目的是提供所述的siRNA在制备治疗免疫性疾病的药物中的应用。
进一步地，所述的免疫性疾病至少包括银屑病、强制性脊柱炎、系统性红斑狼疮中的至少一种。
进一步地，所述的药物通过皮肤给药、静脉注射或粘膜给药进行给药。
进一步地，所述的药物通过递送载体的包裹，比如脂质体(LNP)，通过皮肤用药(皮下注射、皮内注射)、粘膜给药(雾化鼻吸)和全身给药(静脉滴珠)等，将siRNA递送进体内，发挥作用，治疗自身免疫性疾病。
本发明的有益效果是：
本发明提供的siRNA序列能够特异性敲降IL-25表达水平，本发明还通过硫代修饰正义链，在没有明显增加细胞毒性的基础上，提高了siRNA在血清中抵抗酶水解的能力，延长作用时间，为治疗自身免疫性疾病带来重要的应用价值。
附图说明：
图1是硫代结构式；
图2是siIL-25制备得到后纯化的产物进行质检；
图3是IL-25的siRNA筛选出SEQ ID No.1、SEQ ID No.2的过程；
图4是3对siIL-25在血清中抗酶解能力的验证；
图5是2对化学修饰的siIL-25对靶基因mRNA水平的抑制效果；
图6是2对化学修饰的siIL-25对靶基因蛋白水平的抑制效果；
图7是2对化学修饰的siIL-25对细胞毒性的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1：筛选有效敲降IL-25mRNA的siRNA
(1)设计3对IL-25的siRNA，简写siIL25-1、siIL25-2、siIL25-3，序列在NCBI数据库中比对，特异性靶向IL-25的mRNA，和其它非靶基因没有结合。
(2)通过核酸合成仪，采用固相合成的方法，得到siIL-25的粗产物。粗产物经AKTAexplorer100纯化得到最终产物。
(3)以siIL25-2为例，图2中A是siIL25-2纯化时的图谱，收集图谱中‘1-A2’区段的产物，作纯化后的产物。图2中B是纯化产物跑液相，siRNA在13.871min附近出峰，纯度大于95％。取少量siIL25-2跑琼脂糖电泳，得到图2中C，其中1和2是siRNA产物的位置，产物大小约在21bp附近。
(4)转染细胞
①定量siRNA，DEPC水稀释到20uM。
②HaCat细胞传代至12孔板，第二天转染前密度达到30％～50％。
③转染时，2.5ul siRNA加入到50ul DMEM培养基中作为A管，5ul lip3000加入到50ul DMEM培养基中作为B管，A管加入B管中，充分混匀，室温静置15min。滴加到12孔板中。设置对照NC组，每个实验组做3个平行。
④48h时，按照天根试剂盒‘RNA prep Pure Cell/Bacteria Kit，货号为DP430’提取RNA基因组。
⑤逆转录得到cDNA。
⑥Q-PCR检测IL-25的mRNA表达量。
(5)实验结果
图3中是HaCat细胞转染siIL25-1、siIL25-2、siIL25-3的结果，由图3中A得到，我们设计的3条siRNA序列在转染50pmol时均有效敲除IL-25，其中siIL25-2敲降mRNA的效果最佳；由图3中B得到我们将siIL25-2转染80pmol时，其敲降IL-25的效果依旧显著，即我们选中siIL25-2作进一步研究，siIL25-2是本发明中的SEQ ID No.1(5’-CCUGGAGAUAUGAGUUGGATT-3’)、SEQ ID No.2(3’-TTGGACCUCUAUACUCAACCU-5’)；SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2靶向结合的mRNA序列的NCBI编号为NM_172314.2或NM_022789.4；下文中提到的siIL25即指siIL25-2这对序列。
实施例2：筛选siIL-25的化学修饰方法
(1)设计siIL-25的化学修饰方法两对，命名为siIL-25mode1、siIL-25mode2。其中，siIL-25mode1的序列是正义链：5’-C*C*U*G*GA*GA*U*A*U*GA*GU*U*G*GA*TT-3’、反义链：3’-TTGGACCUCUAUACUCAACCU-5’；siIL-25mode2的序列是正义链：5’-C*C*U*GGA*GA*U*A*U*GA*GU*U*GGA*TT-3’、反义链：3’-TTGGACCUCUAUACUCAACCU-5’，修饰IL-25的硫代在磷酸二酯键中的位置及硫代化学结构式如图1所示，图1中A是硫代在RNA链中的位置，图1中B是硫代的化学结构式。
表1
| 名称 | 序列 |
| SEQ ID No.1 | 5’-CCUGGAGAUAUGAGUUGGATT-3’ |
| SEQ ID No.2 | 3’-TTGGACCUCUAUACUCAACCU-5’ |
| mode1 | 5’-C*C*U*G*GA*GA*U*A*U*GA*GU*U*G*GA*TT-3’ |
| mode2 | 5’-C*C*U*GGA*GA*U*A*U*GA*GU*U*GGA*TT-3’ |
(2)血清稳定性验证
①取多只0.2ml PCR管，分别加入800ng siIL-25mode1与1ul胎牛血清，用DEPC水补足10ul，37℃分别放置N小时，N＝6h、4h、2h、0h。siIL-25mode2操作相同。
②未化学修饰的siIL-25的操作同上。
③跑琼脂糖凝胶电泳，140V，15min。
③血清稳定性实验结果：
图4中，1、2、3、4是siIL-25mode1条带的位置，5、6、7、8是siIL-25mode2条带的位置，9、10、11、12是siIL25条带的位置(siIL25-2：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2)，13是二甲苯青的位置，14是溴酚蓝的位置；1、5、9是0h，2、6、10是2h，3、7、11是4h，4、8、12是6h。
由图4得到，siIL-25mode1及siIL-25mode2在血清中随着时间的增加，逐渐降解，6h时还有明显的siRNA存在siIL25，反观siIL-25，在2h时计划降解大部分siRNA，4h时几乎全部降解，说明化学修饰的siIL-25mode1、siIL-25mode2提高了酶解的能力。
(3)mRNA水平验证
①按实施例1中的方法，将siIL-25mode1、siIL-25mode2纯化后，转染HaCat细胞，提取细胞RNA，逆转录成cDNA后，通过Q-PCR测IL-25的表达。
②mRNA实验结果
由图5中左图得到，mode1在75pmol～100pmol时，有良好的敲降效果，其中75pmol时，敲降mRNA约75％；由图5中右图得到，mode2在50pmol～100pmol时，有良好的敲降效果，其中100pmol时，敲降mRNA约90％；
(4)蛋白水平验证
①按实施例1中的方法，将siIL-25mode1、siIL-25mode2纯化后，转染HaCat细胞。
②48h后，PBS洗一遍细胞后，加入200ul含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液(RIPA)，移液器充分吹打后转移至1.5ml EP管中；室温离心12000rpm，5min，取上清，即细胞总蛋白产物。
③放入水浴锅95℃，5min，使得蛋白充分变性，蛋白定量后-80℃保存备用。
④配置聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶8％，分离胶12％，蛋白上样，60V 30min，120V90min。
⑤剪大小适中的PDVF膜，甲醇激活20s，弃甲醇，用纯水洗涤5min，拆开跑胶，放到膜的洗盒里，弃水，倒入转膜液，摇床上洗15min。
⑥转膜板白板放板，黑面放胶，胶放在棉花最中间一层，一般2层棉花加胶加两层棉花，在膜左上角剪一缺口作标记。
⑦放入转膜槽内，放入盆里，倒满槽内转膜液，盖上盖子，倒入冰盖满，放入适量的水(水不超过盖子，防止电流不稳定)，100V，2h。
⑧用TBST稀释5％脱脂奶粉，将膜放入5％的牛奶纵，摇床2h进行封闭。
⑨将膜稍微在TBST中洗一下，用一抗稀释液稀释一抗，敷膜上，室温过夜。
⑩用TBST+0.1％Tween-20洗膜，室温10min，3次。
用二抗稀释液稀释二抗，敷膜，室温2h。
用TBST洗膜室温5min，4次，TBS洗膜，室温5min，1次；暗室显影。
蛋白实验结果
图6中A、B是western blot实验结果。图6中A的1、7是IL-25蛋白在20KDa的位置，2、8是GAPDH在35KDa的位置，3是siNC 50pmol组，4是mode1 50pml组，5是mode2 50pmol组，6、12是细胞空白对照组，9是siNC 75pmol组,10是mode1 75pmol组，11是mode2 75pmol组。图6中B是灰度统计图，由实验结果得知，转染mode1 50pmol时，IL-25蛋白水平下降；转染mode175pmol或mode2 75pmol时，IL-25蛋白水平下降明显。说明mode1和mode2有效的降低了IL-25蛋白的表达。
(5)一些无效的化学修饰序列
我们在筛选化学修饰方法时，有很多对siIL-25化学修饰的序列，没有抵抗血清酶水解的能力，或者没能有效敲降IL-25的mRNA水平。这里仅仅列出一小部分IL-25无效的化学修饰方法。
表2
实施例3：siIL-25mode1、siIL-25mode2的细胞毒性检测
(1)有文献报道，硫代修饰siRNA 后可能增加细胞毒性，且硫代修饰碱基数量越多，带来细胞毒性的概率越大。我们用HaCat细胞(人永生化角质形成细胞)验证本发明的化学修饰siIL-25的细胞毒性。
①第一天，细胞传代至96孔板，使第二天加siRNA 时，细胞密度在50％。
②第二天，根据实验需要，每孔滴加500pmol的siIL-25mode1或siIL-25mode2。
③5％ CO2，37℃孵育过夜。
④试剂盒检测细胞活性，酶标仪在450nm处测量吸光值。
(2)实验结果
由图7得知，mode1、mode2在2h、4h、6h、16h、24h时均没有明显的影响细胞活力，基本没有毒性。
综上所述，本发明提供的未修饰的siIL-25有效敲降IL-25的mRNA水平，经过化学修饰后，不仅能有效降低mRNA和蛋白水平的表达，还显著的提高在血清中抵抗酶降解的能力，并且几乎没有细胞毒性。本发明提供的序列可以用于体外、体内实验。针对自身免疫性疾病，本发明提供的序列为生物创新药、小分子核酸药等研究提供了重要的应用价值。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.一种抑制IL-25基因表达的siRNA，其特征在于，所述的siRNA的正义链的序列为5’-CCUGGAGAUAUGAGUUGGATT-3’，反义链的序列为3’-TTGGACCUCUAUACUCAACCU-5’。
2.根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述siRNA特异性靶向NCBI编号为NM_172314.2或NM_022789.4的IL-25基因相应的mRNA同源序列片段。
3.根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述的siRNA还包括对其正义链进行化学修饰。
4.根据权利要求3所述的siRNA，其特征在于，所述的化学修饰为硫代修饰。
5.根据权利要求4所述的siRNA，其特征在于，所述的硫代修饰是将其正义链从5’端起第2、3、4、5、7、9、10、11、12、14、16、17、18和20位碱基中α位磷酸基团的一个氧原子采用硫原子替代。
6.根据权利要求4所述的siRNA，其特征在于，所述的硫代修饰是将其正义链从5’端起第2、3、4、7、9、10、11、12、14、16、17和20位碱基中α位磷酸基团的一个氧原子采用硫原子替代。
7.权利要求1～6任一项所述的siRNA在制备治疗免疫性疾病的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的免疫性疾病至少包括银屑病、强制性脊柱炎、系统性红斑狼疮中的至少一种。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的药物通过皮肤给药、静脉注射或粘膜给药进行给药。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的皮肤给药包括皮下注射或皮内注射，所述的粘膜给药包括雾化鼻吸。
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