JP5592892B2 - 眼障害の治療方法 - Google Patents

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関連出願
本出願は、２００８年１０月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／１９６９９５号および２００８年１１月１１日に出願された同第６１／１９８９３１号、ならびに２００９年２月１５日に出願された国際特許公報ＰＣＴ／ＩＬ２００９／０００１７９号の優先権を主張し、これらは全てその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

配列表に対する参照
本明細書に記載の配列（配列番号１〜３３，５９６）は、２００９年１０月２０日に作成された、ファイルサイズ５９５２ＫＢの「１８８−ＰＣＴ２．ＳＴ２５．ｔｘｔ」という表題のテキストファイル中に、ＵＳＰＴＯ電子出願システム（ＥＦＳ）を介して本出願とともに提出されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、眼障害の治療を必要とする対象の眼障害を治療する非侵襲的方法であって、対象の網膜の網膜神経節細胞の損失と関連する標的遺伝子に対する治療的オリゴヌクレオチドを含む薬学的組成物を対象の眼の表面に局所投与する工程を含む方法に関する。さらに、本発明は、眼疾患、眼障害、または眼損傷に苦しむ対象の網膜神経節細胞生存を促進する非侵襲的方法に関する。

網膜組織、特に網膜神経節細胞への核酸化合物の送達は、薬物送達の大きな課題を提示している。これまで、点眼薬が主に前部障害の治療に有用であると考えられてきたが、それは、核酸が角膜を通過せず、後部眼組織に十分な薬物濃度が届かないことが示されているからである（ｄｅｌ Ａｍｏ ａｎｄ Ｕｒｔｔｉ，２００８．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ １３（３／４）：１３５−１４３；Ｆａｔｔａｌ ａｎｄ Ｂｏｃｈｏｔ，２００６．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ Ｒｅｖ ５６：１２０３−１２２３に概説されている）。

網膜神経節細胞（ＲＧＣ）は、眼の網膜の内側表面近くにあるニューロンの一種である。網膜神経節細胞は、光受容体から視覚情報を受容し、網膜から脳のいくつかの領域に視覚情報をまとめて伝達する。

さらに、網膜神経節細胞の損失の阻害を必要とする対象の網膜神経節細胞の損失を阻害するための非侵襲的な方法が依然として必要である。様々な眼疾患および眼障害は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の死を特徴とする。したがって、眼疾患、眼障害、もしくは眼損傷に苦しむ対象、あるいは網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の変性もしくは死を特徴とするおよび／または該変性もしくは死によって仲介される眼疾患、眼障害、もしくは眼損傷を発症するリスクのある対象の網膜神経節細胞の損失（ＲＧＣ）を阻害するための非侵襲的方法が依然として必要である。

本発明は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の変性または死と関連する眼疾患、眼障害、および眼損傷を治療する非侵襲的方法、ならびに本発明において有用な組成物に関する。本発明の方法は、対象の眼の表面に、対象の網膜神経節細胞の生存を促進するのに有用な治療的オリゴヌクレオチド組成物を局所投与することを含む。これまで、オリゴヌクレオチドは、それぞれ、有害な副作用および患者の服薬遵守不良を伴う方法である、全身送達または硝子体内注射によって網膜眼組織に送達されてきた。本発明は、網膜神経節細胞をアポトーシスから救うためのおよび眼障害を治療するための、オリゴヌクレオチドを含む局所眼科用組成物、および対象の網膜の網膜神経節細胞の損失と関連する標的遺伝子の発現を下方調節する非侵襲的なその使用方法を提供する。

したがって、本発明の一態様では、眼疾患、眼障害、または眼損傷に苦しむ対象の網膜組織へのオリゴヌクレオチドの非侵襲的な送達方法であって、オリゴヌクレオチドを含む眼科用組成物を対象の眼の表面に局所適用することを含む方法を提供する。

別の態様では、本発明は、眼障害に苦しむ対象の網膜神経節細胞へのオリゴヌクレオチドの非侵襲的な送達方法であって、オリゴヌクレオチドを含む眼科用組成物を対象の眼の表面に局所適用することを含む方法を提供する。

さらに別の態様では、本発明は、眼疾患、眼障害、または眼損傷に苦しむ対象の網膜の網膜神経節細胞の損失と関連する標的遺伝子の発現を減弱させる方法であって、標的遺伝子の標的ｍＲＮＡ産物に対する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む薬学的組成物を、対象の網膜における遺伝子の発現を減弱させるのに有効な量で、かつこの遺伝子の発現を減弱させるのに有効な期間にわたって、対象の眼の表面に局所的に（非侵襲的に）投与することを含む方法を提供する。

さらなる態様では、本発明は、網膜神経節細胞損失または網膜神経節細胞傷害に苦しむ対象を治療するおよび眼疾患、眼障害、もしくは眼損傷に苦しむ、または眼疾患、眼障害、もしくは眼損傷を発症するリスクのある対象に眼神経保護を提供する方法を提供する。本方法は、対象の網膜神経節細胞損失または網膜神経節細胞傷害を阻害するのに有効な量で、かつ対象の網膜神経節細胞損失または網膜神経節細胞傷害を阻害するのに有効な期間にわたって、対象の網膜内の標的遺伝子に対する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む眼科用薬学的組成物を対象の眼の表面に局所投与することを含む。

様々な実施形態では、眼科用薬学的組成物は、クリーム、発泡体（フォーム）、ペースト、軟膏、エマルジョン、点眼薬をはじめとする液体溶液、ゲル、スプレー、懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロスフェア、マイクロカプセル、ナノスフェア、ナノ粒子、脂質小胞、リポソーム、ポリマー小胞、パッチ、またはコンタクトレンズとして処方される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、点眼薬として処方される。好ましい実施形態では、眼科用組成物は、例えば、点眼薬の滴下によってまたはミストの投与によって眼に投与される。

特定の実施形態では、少なくとも１つの標的眼ｍＲＮＡは、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されるｍＲＮＡポリヌクレオチドから選択される。特定の実施形態では、少なくとも１つの標的遺伝子は、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されるｍＲＮＡポリヌクレオチドに転写される遺伝子から選択される。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、化学修飾ｓｉＲＮＡ、未修飾ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、リボザイム、ｍｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡから選択される。好ましい実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、化学修飾ｓｉＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５９〜３３，５９６に示される、表Ｂ１〜Ｂ３６に示されるセンスおよび対応するアンチセンスオリゴヌクレオチド対から選択される。

いくつかの実施形態では、眼障害、眼疾患、または眼損傷は、緑内障、ドライアイ、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、または加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）から選択される。他の実施形態では、眼障害、眼疾患、または眼損傷は、視神経炎、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分岐閉塞症（ＢＲＶＯ）から選択される。さらなる実施形態では、眼障害、眼疾患、または眼損傷は、網膜色素変性症（ＲＰ）、虚血性視神経症、または視神経損傷である。さらなる実施形態では、眼障害、眼疾患、または眼損傷は、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、網膜神経節変性症、黄斑変性症、遺伝性視神経症、代謝性視神経症、毒物による視神経症、または有害な薬物反応もしくはビタミン欠乏により引き起こされる神経症である。さらに別の実施形態では、障害は、腫瘍と関連する視力喪失である。

様々な実施形態では、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ化合物は、点眼薬をはじめとする、液体溶液として対象の眼に投与される。様々な実施形態では、本発明は、眼疾患、眼障害、または眼損傷に苦しむ対象の網膜神経節細胞の損失と関連する標的眼遺伝子の発現を減弱させる方法であって、点眼薬として処方された眼科用薬学的組成物を対象の眼の表面に局所適用することを含む方法を提供する。

様々な実施形態では、標的眼ｍＲＮＡの発現を、眼疾患、眼障害、または眼損傷に苦しむ対象の網膜の眼細胞で減弱させる。様々な実施形態では、眼細胞には、涙腺の腺房細胞、涙腺の導管細胞、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、脈絡膜細胞、角膜細胞、毛様体突起の細胞、もしくは線維柱帯網の細胞、またはそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。

本発明は、対象の網膜神経節細胞の損失を阻害する方法であって、対象の網膜の網膜神経節細胞の損失と関連する標的遺伝子の発現を下方調節する治療有効量の少なくとも１つのｓｉＲＮＡを含む眼科用組成物を対象の眼の表面に非侵襲的に投与し、それにより網膜神経節細胞の損失を阻害することを含む方法を提供する。特定の実施形態では、２以上の標的遺伝子を本発明による方法によって下方調節する。特定の実施形態では、対象の網膜の網膜神経節細胞の損失と関連する少なくとも１つの標的遺伝子（眼ｍＲＮＡ）の発現を減弱させることにより、眼神経保護特性が付与される。様々な実施形態では、少なくとも１つの眼標的遺伝子は、配列番号１〜５８に示される、表Ａ１〜Ａ４中のリストから選択される。

一実施形態では、眼障害は緑内障である。したがって、本発明は、緑内障に苦しむ対象の網膜神経節細胞の損失を阻害する方法であって、対象の網膜の網膜神経節細胞の損失と関連する標的遺伝子（標的眼ｍＲＮＡ）を下方調節する治療有効量の少なくとも１つのｓｉＲＮＡを含む眼科用組成物を対象の眼の表面に局所的に（非侵襲的に）適用し、それにより対象の眼の網膜神経節細胞の損失を阻害することを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは化学修飾されている。いくつかの実施形態では、化学修飾ｓｉＲＮＡは、対象の眼の網膜内の遺伝子（標的眼ｍＲＮＡ）の発現を減弱させる。他の実施形態では、化学修飾ｓｉＲＮＡは、対象の眼の視神経内の標的眼ｍＲＮＡの発現を減弱させる。特定の実施形態では、対象の網膜の網膜神経節細胞の損失と関連する少なくとも１つの標的遺伝子（眼ｍＲＮＡ）の発現を減弱させることは、緑内障を治療するのに有効である。特定の実施形態では、少なくとも１つの標的遺伝子は、配列番号１〜３５に示される、表Ａ１中のリストから選択される。特定の好ましい実施形態では、標的遺伝子は、ＣＡＳＰ２（配列番号１〜２）、ＡＳＰＰ１（配列番号４）、ＴＰ５３ＢＰ２（配列番号６〜７）、ＢＮＩＰ３（配列番号１２）、ＲＴＰ８０１Ｌ（配列番号１４）、ＡＣＨＥ（配列番号１９〜２０）、ＡＤＲＢ１（配列番号２１）、およびＣＡＰＮＳ１（配列番号２８〜２９）から選択される。様々な実施形態では、遺伝子は、配列番号１〜２に示されている。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、配列番号８５１５〜９５１６に示されるオリゴヌクレオチド配列の対から選択される。

別の実施形態では、眼障害はドライアイである。したがって、本発明は、ドライアイに苦しむ対象の網膜神経節細胞の損失を阻害する方法を提供する。本方法は、対象の網膜の網膜神経節細胞の損失と関連する標的遺伝子（標的眼ｍＲＮＡ）を下方調節する治療有効量の少なくとも１つのｓｉＲＮＡを含む眼科用組成物を対象の眼の表面に局所的に（非侵襲的に）投与し、それにより対象の眼の網膜神経節細胞の損失を阻害することを含む。好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは化学修飾されている。特定の実施形態では、少なくとも１つの標的眼ｍＲＮＡの発現を減弱させることは、ドライアイ障害を治療するのに有効である。特定の実施形態では、網膜神経節細胞の損失と関連する少なくとも１つの標的遺伝子の発現を減弱させることは、ドライアイの症状を軽減させるのに有効である。特定の実施形態では、少なくとも１つの標的遺伝子（眼標的ｍＲＮＡ）は、対象の眼の網膜神経節細胞で発現している。特定の実施形態では、少なくとも１つの標的遺伝子（眼標的ｍＲＮＡ）は、対象の眼の涙腺で発現している。特定の実施形態では、少なくとも１つの標的遺伝子は、配列番号５（ｐ５３）、配列番号８〜１０（ＬＲＤＤ）、配列番号２６〜２７（ＳＨＣ１）、ならびに配列番号３０〜４４（ＦＡＳおよびＦＡＳリガンド）のいずれか１つに示される表Ａ２から選択される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、ＦＡＳ、ＦＡＳリガンド（ＦＡＳＬ）、ｐ５３、ＬＲＤＤ、ＰＡＲＰ１、ＡＩＦ（アポトーシス誘導因子）、ＮＯＳ１、ＮＯＳ２Ａ、ＸＩＡＰ、およびＳＨＣ１−ＳＨＣから選択される。特定の好ましい実施形態では、標的遺伝子は、配列番号３６〜配列番号４３または配列番号４４のいずれか１つに示されている。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、配列番号１３，２２５〜１５，２２４に示されるオリゴヌクレオチド配列の対から選択される。

別の実施形態では、眼障害はＡＭＤ、ＤＲ、またはＤＭＥである。したがって、本発明は、ＡＭＤ、ＤＲ、またはＤＭＥに苦しむ対象の網膜神経節細胞の損失を阻害する方法を提供する。本方法は、対象の網膜の網膜神経節細胞の損失と関連する標的遺伝子（標的眼ｍＲＮＡ）を下方調節する治療有効量の少なくとも１つのｓｉＲＮＡを含む眼科用組成物を対象の眼の表面に局所的に（非侵襲的に）投与し、それにより対象の眼の網膜神経節細胞の損失を阻害することを含む。好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは化学修飾されている。特定の実施形態では、網膜神経節細胞の損失と関連する少なくとも１つの標的遺伝子の発現を減弱させることは、ＡＭＤ、ＤＲ、またはＤＭＥを治療するのに有効である。特定の実施形態では、網膜神経節細胞の損失と関連する少なくとも１つの標的遺伝子の発現を減弱させることは、ＡＭＤ、ＤＲ、またはＤＭＥの症状を軽減させるのに有効である。特定の実施形態では、少なくとも１つのｓｉＲＮＡの投与は、対象の眼の網膜神経節細胞内の少なくとも１つの標的遺伝子（眼ｍＲＮＡ）の発現を減弱させる。特定の実施形態では、少なくとも１つのｓｉＲＮＡの投与は、対象の眼の脈絡膜内の少なくとも１つの標的遺伝子（標的眼ｍＲＮＡ）の発現を減弱させる。特定の実施形態では、少なくとも１つの標的遺伝子は、配列番号１〜２、３、５、６〜７、８〜１０、１２、１３、２４〜２５、２６〜２７、３０〜３５、４５〜５３のいずれか１つに示される、表Ａ３に記載されている。特定の好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＣＴＳＤ、ＲＴＰ８０１、およびＢＮＩＰ３を標的とする。特定の好ましい実施形態では、障害はＤＲであり、ｓｉＲＮＡは、配列番号４８〜５３に示されるｍＲＮＡを標的とする。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、配列番号２４５７５〜２９５９４に示される配列のいずれか１つから選択される。特定の好ましい実施形態では、障害はＡＭＤであり、ｓｉＲＮＡは配列番号３に示される遺伝子を標的とし、ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、配列番号１１２８５〜１２２２４に示される配列のいずれか１つから選択される。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、配列番号２４５７５〜２９５９４に示されるオリゴヌクレオチド配列の対から選択される。

さらなる実施形態では、眼障害は網膜色素変性症（ＲＰ）である。したがって、本発明は、ＲＰに苦しむ対象の網膜神経節細胞の損失を阻害する方法を提供する。本方法は、対象の網膜の網膜神経節細胞の損失と関連する標的遺伝子（標的眼ｍＲＮＡ）を下方調節する治療有効量の少なくとも１つのｓｉＲＮＡを含む眼科用組成物を対象の眼の表面に局所的に（非侵襲的に）投与し、それにより対象の眼の網膜神経節細胞の損失を阻害することを含む。好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは化学修飾されている。特定の実施形態では、網膜神経節細胞の損失と関連する少なくとも１つの標的遺伝子の発現を減弱させることは、ＲＰに有効である。特定の実施形態では、網膜神経節細胞の損失と関連する少なくとも１つの標的遺伝子の発現を減弱させることは、ＲＰの症状を軽減させるのに有効である。特定の実施形態では、少なくとも１つの標的眼ｍＲＮＡは、配列番号３、１４、２６〜３５、５４〜５７のいずれか１つに示されるｍＲＮＡに転写される表Ａ４に記載の遺伝子から選択される遺伝子の産物である。いくつかの実施形態では、標的眼ｍＲＮＡは、ＣＡＳＰ１、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ１２、ＲＴＰ８０１、ＲＴＰ８０１Ｌ、ＣＡＰＮＳ１、ＰＡＲＰ１、ＡＩＦ、ＮＯＳ１、ＮＯＳ２、ＸＩＡＰ、およびＳＨＣ１−ＳＨＣからなる群から選択される遺伝子の産物である。特定の好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号５６〜５７に示されるｍＲＮＡを標的とする。

別の態様では、本発明は、対象において網膜神経節細胞をアポトーシスから救う方法であって、対象の網膜内の標的遺伝子に対する治療有効量の少なくとも１つのｓｉＲＮＡを含む眼科用組成物を対象の眼の表面に非侵襲的に適用し、それにより対象において網膜神経節細胞をアポトーシスから救う方法を特徴とする。好ましい実施形態では、少なくとも１つのｓｉＲＮＡは、化学修飾されている。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されている。様々な実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、表Ｂ１〜Ｂ３６に示され、かつ配列番号５９〜３３，５９６に示されるセンスオリゴヌクレオチドおよび対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される。

別の態様では、本発明は、眼神経症の兆候または症状を呈する対象の網膜神経節細胞の生存を促進する方法であって、対象の網膜内の標的遺伝子に対する治療有効量の少なくとも１つのｓｉＲＮＡを含む眼科用組成物を対象の眼の表面に非侵襲的に投与し、それにより対象の網膜神経節細胞の生存を促進することを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、少なくとも１つのｓｉＲＮＡは化学修飾されている。特定の実施形態では、眼神経症の兆候または症状は、アポトーシスによって仲介される。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されている。様々な実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５９〜３３，５９６に示されるセンスオリゴヌクレオチドおよび対応するアンチセンスオリゴヌクレオチド対から選択される。

さらに別の態様では、本発明は、対象の網膜神経節細胞の死と関連する眼疾患の効果を予防するか、治療するか、または緩和する方法であって、対象の網膜内の標的遺伝子に対する治療有効量の少なくとも１つのｓｉＲＮＡを含む眼科用組成物を対象の眼の表面に非侵襲的に適用し、それにより対象の網膜神経節細胞の死と関連する眼疾患の効果を予防するか、治療するか、または緩和する方法に関する。好ましい実施形態では、少なくとも１つのｓｉＲＮＡは化学修飾されている。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されている。様々な実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５９〜３３，５９６に示される、表Ｂ１〜Ｂ３６に示されるセンスオリゴヌクレオチドおよび対応するアンチセンスオリゴヌクレオチド対から選択される。

本発明の別の態様は、対象の網膜神経節細胞死を治療または予防する方法であって、（ａ）対象の網膜内の標的遺伝子に対する治療有効量の少なくとも１つのｓｉＲＮＡと、（ｂ）薬学的に許容される賦形剤もしくは担体またはその混合物とを含む眼科用薬学的組成物を対象の眼の表面に非侵襲的に適用し、それにより対象の網膜神経節細胞死を治療または予防する方法を提供する。好ましい実施形態では、少なくとも１つのｓｉＲＮＡは化学修飾されている。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されている。様々な実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５９〜３３，５９６に示されるセンスオリゴヌクレオチドおよび対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される。

別の態様では、本発明は、対象の眼における眼圧（ＩＯＰ）の上昇により仲介される網膜神経節細胞死を予防する方法であって、対象の網膜内の標的遺伝子に対する治療有効量の少なくとも１つのｓｉＲＮＡを含む眼科用組成物を対象の眼の表面に非侵襲的に投与し、それにより対象における網膜神経節細胞死を予防する方法に関する。好ましい実施形態では、少なくとも１つのｓｉＲＮＡは化学修飾されている。本方法による特定の実施形態では、対象は、緑内障に悩んでいる。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されている。様々な実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５９〜３３，５９６に示されるセンスオリゴヌクレオチドおよび対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される。

本発明はさらに、ＩＯＰの上昇に苦しむ対象において網膜細胞の死を遅延させるか、網膜細胞の死を予防するか、または網膜細胞を死から救う方法であって、対象の網膜におけるＲＧＣの死と関連する標的遺伝子に対する治療有効量の少なくとも１つのｓｉＲＮＡを含む眼科用組成物を対象の眼の表面に非侵襲的に適用し、それにより網膜細胞の損傷もしくは死を遅延させるか、網膜細胞の損傷もしくは死を予防するか、または網膜細胞を損傷もしくは死から救い、かつ眼圧（ＩＯＰ）が実質的に上昇したままである、方法を提供する。好ましい実施形態では、少なくとも１つのｓｉＲＮＡは化学修飾されている。本方法による特定の実施形態では、対象は、緑内障に悩んでいる。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されている。様々な実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５９〜３３，５９６に示されるセンスオリゴヌクレオチドおよび対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される。

本発明はさらに、網膜神経節細胞損失または網膜神経節細胞傷害に苦しむ対象を治療する方法であって、対象の網膜内の標的遺伝子に対する治療有効量の少なくとも１つのｓｉＲＮＡを含む眼科用組成物を対象の眼の表面に非侵襲的に投与し、それにより対象を治療するかまたは対象における網膜神経節細胞死を軽減させる方法を提供する。好ましい実施形態では、少なくとも１つのｓｉＲＮＡは化学修飾されている。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されている。様々な実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５９〜３３，５９６に示されるセンスオリゴヌクレオチドおよび対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される。

本発明はさらに、網膜神経節細胞損失を低下させ、眼神経保護を必要とする対象に眼神経保護を提供する方法であって、対象の網膜内の標的遺伝子に対する治療有効量の少なくとも１つのｓｉＲＮＡを含む眼科用組成物を対象の眼の表面に非侵襲的に投与し、それにより網膜神経節細胞損失を低下させ、対象に眼神経保護を提供する方法を提供する。好ましい実施形態では、少なくとも１つのｓｉＲＮＡは化学修飾されている。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されている。様々な実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５９〜３３，５９６に示される、表Ｂ１〜Ｂ３６に示されるセンスオリゴヌクレオチドおよび対応するアンチセンスオリゴヌクレオチド対から選択される。

本発明はさらに、対象の網膜神経節細胞の損失と関連する視野損失を予防する方法であって、対象の網膜内の標的遺伝子に対する治療有効量の少なくとも１つのｓｉＲＮＡを含む眼科用組成物を対象の眼の表面に非侵襲的に投与し、それにより対象における視野損失を予防する方法を提供する。好ましい実施形態では、少なくとも１つのｓｉＲＮＡは化学修飾されている。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されている。様々な実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５９〜３３，５９６に示される、表Ｂ１〜Ｂ３６に示されるセンスオリゴヌクレオチドおよび対応するアンチセンスオリゴヌクレオチド対から選択される。

別の態様では、本発明は、対象の網膜神経節細胞の損失と関連する眼疾患の非侵襲的治療のための眼科用組成物であって、（ａ）対象の網膜内の標的遺伝子に対する治療有効量の少なくとも１つのｓｉＲＮＡと、（ｂ）薬学的に許容される賦形剤もしくは担体またはその混合物とを含む眼科用組成物を提供する。好ましい実施形態では、少なくとも１つのｓｉＲＮＡは化学修飾されている。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されている。様々な実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５９〜３３，５９６に示される、表Ｂ１〜Ｂ３６に示されるセンスオリゴヌクレオチドおよび対応するアンチセンスオリゴヌクレオチド対から選択される。

さらに別の態様では、本発明は、視覚系の組織の病的異常／変化と関連する眼疾患の非侵襲的治療のための局所眼科用薬学的組成物であって、（ａ）対象の網膜内の標的遺伝子に対する治療有効量の少なくとも１つのｓｉＲＮＡであり、この標的遺伝子が配列番号１〜５８のいずれか１つに示されているｓｉＲＮＡと、（ｂ）薬学的に許容される賦形剤もしくは担体またはその混合物とを含む、局所眼科用薬学的組成物を提供する。好ましい実施形態では、少なくとも１つのｓｉＲＮＡは化学修飾されている。様々な実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５９〜３３，５９６に示される、表Ｂ１〜Ｂ３６に示されるセンスオリゴヌクレオチドおよび対応するアンチセンスオリゴヌクレオチド対から選択される。

別の態様によれば、本発明は、網膜神経節細胞の死と関連する眼疾患に悩む対象を治療するときに使用される局所眼科用薬学的組成物であって、（ａ）対象の網膜内の標的遺伝子に対する治療有効量の少なくとも１つのｓｉＲＮＡであり、この標的遺伝子が配列番号１〜５８のいずれか１つに示されているｓｉＲＮＡと、（ｂ）薬学的に許容される賦形剤もしくは担体またはその混合物とを含む、局所眼科用薬学的組成物に関する。好ましい実施形態では、少なくとも１つのｓｉＲＮＡは化学修飾されている。様々な実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５９〜３３，５９６に示される、表Ｂ１〜Ｂ３６に示されるセンスオリゴヌクレオチドおよび対応するアンチセンスオリゴヌクレオチド対から選択される。

様々な実施形態では、眼疾患は、緑内障、ドライアイ、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、視神経炎、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分岐閉塞症、虚血性視神経症、視神経損傷、未熟児網膜症（ＲＯＰ）もしくは網膜色素変性症（ＲＰ）、網膜神経節変性症、黄斑変性症遺伝性視神経症、代謝性視神経症、毒物による神経症、または有害な薬物反応もしくはビタミン欠乏により引き起こされる神経症を含む群から選択され、組成物は、クリーム、発泡体、ペースト、軟膏、エマルジョン、液体溶液、点眼薬、ゲル、スプレー、懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロスフェア、マイクロカプセル、ナノスフェア、ナノ粒子、脂質小胞、リポソーム、ポリマー小胞、パッチ、生体挿入物として処方される。好ましい実施形態では、組成物は、点眼薬として処方される。

別の態様では、本発明は、（ａ）容器中の本発明による薬学的組成物と、（ｂ）この組成物を用いて眼疾患を治療するための取扱説明書とを含む、包装された薬学的調製物に関する。様々な実施形態では、本発明による薬学的組成物は、眼疾患に苦しむ対象の網膜内の標的遺伝子に対する治療有効量の少なくとも１つのｓｉＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、少なくとも１つのｓｉＲＮＡは化学修飾されている。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されている。様々な実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５９〜３３，５９６に示されるセンスオリゴヌクレオチドおよび対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される。本発明の本態様による特定の一実施形態では、薬学的組成物は、対象の網膜神経節細胞の損失と関連する眼疾患の非侵襲的治療のためのものである。本発明の本態様による別の特定の実施形態では、薬学的組成物は、視覚系の組織の病的異常／変化と関連する眼疾患の非侵襲的治療のためのものである。本発明の本態様によるさらに別の特定の実施形態では、薬学的組成物は、網膜神経節細胞の死と関連する眼疾患に悩む対象を治療するときに使用するためのものである。

別の態様によれば、本発明は、対象における網膜神経節細胞生存を促進するための医薬品の製造における本発明による薬学的組成物の使用に関する。様々な実施形態では、本発明による薬学的組成物は、眼疾患に苦しむ対象の網膜内の標的遺伝子に対する治療有効量の少なくとも１つのｓｉＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、少なくとも１つのｓｉＲＮＡは化学修飾されている。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されている。様々な実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５９〜３３，５９６に示される、表Ｂ１〜Ｂ３６に示されるセンスオリゴヌクレオチドおよび対応するアンチセンスオリゴヌクレオチド対から選択される。本発明の本態様による特定の一実施形態では、薬学的組成物は、対象の網膜神経節細胞の損失と関連する眼疾患の非侵襲的治療のためのものである。本発明の本態様による別の特定の実施形態では、薬学的組成物は、視覚系の組織の病的異常／変化と関連する眼疾患の非侵襲的治療のためのものである。本発明の本態様によるさらに別の特定の実施形態では、薬学的組成物は、網膜神経節細胞の死と関連する眼疾患に悩む対象を治療するときに使用するためのものである。

いくつかの実施形態では、組成物には、粘度増強剤が含まれる。粘度増強剤は、例えば、セルロースおよびセルロース誘導体、メチルセルロースおよびメチルセルロース誘導体をはじめとする親水性ポリマーから選択される。このような薬剤としては、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、それらの誘導体、それらの組合せ、およびそれらの塩が挙げられる。いくつかの実施形態では、粘度増強剤はメチルセルロースである。特定の実施形態では、粘度増強剤は、約０．０１％〜約４％の濃度で提供され、他の実施形態では、粘度増強剤は、約０．１％〜約３％の濃度で、または約０．５％〜約２％の濃度で提供される。

いくつかの実施形態では、組成物には、浸透圧バランスを与える薬剤、または界面活性剤が含まれる。このような薬剤としては、グリセロール、エチレングリコール、ポリ（エチレングリコール）、プロピレングリコール、ソルビトール、マンニトール、単糖、二糖、およびオリゴ糖が挙げられる。

本発明はさらに、治療を必要とする対象の緑内障を治療する方法であって、対象の眼内の標的遺伝子に対する治療有効量の少なくとも１つのｓｉＲＮＡを、緑内障を治療するのに有効な量で、対象の眼の表面に局所的に（非侵襲的に）投与することを含む方法を提供する。特定の好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは化学修飾ｓｉＲＮＡである。特定の実施形態では、少なくとも１つのｓｉＲＮＡは、対象の眼の網膜で発現される少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害する。特定の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子の阻害は、眼神経保護特性を付与する。特定の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子は、配列番号１〜３５に示されるｍＲＮＡに転写される表Ａ１中のリストから選択される。特定の好ましい実施形態では、遺伝子は、ＣＡＳＰ２（配列番号１〜２）、ＡＳＰＰ１（配列番号４）、ＴＰ５３ＢＰ２（配列番号６〜７）、ＢＮＩＰ３（配列番号１２）、ＲＴＰ８０１Ｌ（配列番号１４）、ＡＣＨＥ（配列番号１９〜２０）、ＡＤＲＢ１（配列番号２１）、およびＣＡＰＮＳ１（配列番号２８〜２９）から選択される。様々な実施形態では、遺伝子は、配列番号１〜２に示されている。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、配列番号８５１５〜９５１６に示される配列のいずれか１つから選択される。

本発明はさらに、ドライアイの治療を必要とする対象のドライアイを治療する方法であって、対象の眼で発現される少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害する治療有効量の少なくとも１つのｓｉＲＮＡを、ドライアイの症状を軽減させるのに有効な量で、対象の眼の表面に局所的に（非侵襲的に）適用することを含む方法を提供する。特定の好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは化学修飾ｓｉＲＮＡである。特定の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子は対象の涙腺で発現している。特定の実施形態では、少なくとも遺伝子は、配列番号５、配列番号８〜１０、配列番号２６〜２７、および配列番号３０〜４４のいずれか１つに示される、表Ａ２から選択される。いくつかの実施形態では、遺伝子は、ＦＡＳ、ＦＡＳリガンド（ＦＡＳＬ）、ｐ５３、ＬＲＤＤ、ＰＡＲＰ１、ＡＩＦ（アポトーシス誘導因子）、ＮＯＳ１、ＮＯＳ２Ａ、ＸＩＡＰ、およびＳＨＣ１−ＳＨＣから選択される。特定の好ましい実施形態では、遺伝子は、配列番号３６〜配列番号４４のいずれか１つに示されるｍＲＮＡに転写される。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、配列番号１３，２２５〜１５，２２４に示される、表１６〜１７中の配列のいずれか１つから選択される。

本発明はさらに、ＡＭＤ、ＤＲ、またはＤＭＥの治療を必要とする対象のＡＭＤ、ＤＲ、またはＤＭＥを治療する方法であって、対象の眼で発現される少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害する治療有効量の少なくとも１つのｓｉＲＮＡを、ＡＭＤ、ＤＲ、またはＤＭＥの症状を軽減させるのに有効な量で、対象の眼の表面に局所的に（非侵襲的に）投与することを含む方法を提供する。特定の好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは化学修飾ｓｉＲＮＡである。特定の実施形態では、少なくとも１つのｓｉＲＮＡは、対象の眼の脈絡膜で発現される少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害する。特定の実施形態では、少なくとも１つの標的眼ｍＲＮＡは、配列番号１〜２、３、５、６〜７、８〜１０、１２、１３、２４〜２５、２６〜２７、３０〜３５、４５〜５３のいずれか１つに示される、表Ａ３に記載されている。特定の好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＣＴＳＤ、ＲＴＰ８０１、およびＢＮＩＰ３を標的とする。特定の好ましい実施形態では、障害はＤＲであり、ｓｉＲＮＡは、配列番号４８〜５３に示されるｍＲＮＡを標的とする。

さらなる実施形態では、眼障害は網膜色素変性症（ＲＰ）である。したがって、本発明は、ＲＰに苦しむ対象の眼内の標的眼ｍＲＮＡの発現を減弱させる方法を提供する。本方法は、対象の眼内の標的遺伝子に対する治療有効量の少なくとも１つのｓｉＲＮＡを対象の眼の表面に局所的に（非侵襲的に）適用することを含む。特定の好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは化学修飾ｓｉＲＮＡである。特定の実施形態では、少なくとも１つの標的遺伝子（標的眼ｍＲＮＡ）の発現を減弱させることは、ＲＰを治療するのに有効である。特定の実施形態では、少なくとも１つの標的眼ｍＲＮＡの減弱は、ＲＰの症状を軽減させるのに有効である。特定の実施形態では、少なくとも１つの標的眼ｍＲＮＡは、配列番号３、１４、２６〜３５、５４〜５７のいずれか１つに示されるｍＲＮＡに転写される表Ａ４に記載の遺伝子から選択される遺伝子の産物である。いくつかの実施形態では、標的眼ｍＲＮＡは、ＣＡＳＰ１、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ１２、ＲＴＰ８０１、ＲＴＰ８０１Ｌ、ＣＡＰＮＳ１、ＰＡＲＰ１、ＡＩＦ、ＮＯＳ１、ＮＯＳ２、ＸＩＡＰ、およびＳＨＣ１−ＳＨＣからなる群から選択される遺伝子の産物である。特定の好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号５６〜５７に示されるｍＲＮＡを標的とする。

様々な実施形態では、少なくとも１つのｓｉＲＮＡは化学修飾されている。様々な実施形態では、少なくとも１つのｓｉＲＮＡは、対象の眼においてｍＲＮＡにハイブリダイズし、かつｍＲＮＡの発現を減弱させる、標的ｍＲＮＡ内に存在する核酸配列と十分に相同な配列を有する十分な数の連続するヌクレオチドを含む。

様々な実施形態では、少なくとも１つのｓｉＲＮＡは、対象の眼において遺伝子にハイブリダイズし、かつ遺伝子の発現を低下させるかまたは阻害する、遺伝子内に存在する核酸配列と十分に相同な配列を有する十分な数の連続するヌクレオチドを含む。

点眼投与後にマウスの網膜に取り込まれたＣｙ３標識ＤＤＩＴ４ ｓｉＲＮＡの代表的な画像（図１Ａ〜図１Ｂ）。 点眼投与後にマウスの涙腺の導管細胞および腺房細胞に取り込まれたＣｙ３標識ＤＤＩＴ４ ｓｉＲＮＡの代表的な画像（図２Ａ〜２Ｃ）。 点眼薬の投与後、投与１および４時間後のラット脈絡膜におけるＣｙ３−ｓｉＲＮＡの蓄積の時間経過（図３Ａ〜３Ｃ）。 眼への点眼投与１時間後の線維柱帯網および毛様体へのＣｙ３−ｓｉＲＮＡ送達。 図５Ａ〜５Ｂは、ｐ５３遺伝子を標的としたＱＭ５−ｓｉＲＮＡの点眼投与１時間後の網膜の共焦点顕微鏡検査（倍率６０倍）を示す。網膜（網膜色素上皮細胞、網膜神経節細胞）内のｓｉＲＮＡはＣｙ３蛍光で示されている。 図６Ａは、マウス網膜に取り込まれたＣｙ３標識ＤＤＩＴ４ ｓｉＲＮＡの代表的な画像である。図６Ｂは、点眼による投与の１時間後のＤＤＩＴ４＿１ Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡの蓄積を示す。光受容体細胞の脈絡膜、外核層、ＲＰＥ、および外節層は、Ｃｙ３染色を示す。 Ｄｙ−６４９／Ｃ６染色の使用によるＲＧＣ細胞での点眼による投与１時間後のＤＤＩＴ４＿１ Ｄｙ−６４９／Ｃ６−ｓｉＲＮＡの蓄積を示す。 様々な染色方法による網膜組織への対照ｓｉＲＮＡ ＦＩＴＣ−ＣＮＬ＿１ＲＤ／ＣＮＬ＿１ＦＤおよびスクランブル３’ｃｙ３−ＣＮＬ＿１送達を表す（図８Ａ〜８Ｃ）。 マウス網膜組織への様々な構造のＣａｓｐ２の送達を示す（図９Ａ〜９Ｂ）。 ＴＧＡＳＥＩＩ−ＦＡＭおよびＨＮＯＥＬ−ＦＡＭ送達を示す（図１０Ａ〜１０Ｂ）。 陽性対照群としてのＰＢＳ中のｐ５３に対するｓｉＲＮＡの網膜送達を示す。 無傷の動物においてまたはｓｉＲＮＡを含まないＥＤを投与したときに、蛍光シグナルが網膜で得られないことを示す（図１２Ａ〜１２Ｂ）。 網膜でのｐ５３のノックダウンを示す実験の結果を示す。図１３Ａ〜１３Ｂは、ｐ５３タンパク質レベルを測定するための標準曲線を示す。図１３Ｃ〜１３Ｄは、点眼薬による網膜ｐ５３ノックダウンを示す。

本発明は、様々な眼疾患および眼障害を治療するための局所オリゴヌクレオチド組成物およびその非侵襲的な使用方法を提供する。特に、本発明は、この疾患または障害に苦しむ対象の眼における遺伝子発現と関連する様々な眼疾患および眼障害の治療方法を提供する。

本発明は、ｓｉＲＮＡ組成物の局所への非侵襲的投与が特定の眼組織および眼細胞型を標的とし、眼の表面に局所送達されたときにそれらの組織および細胞で活性があるという予期せぬ発見に一部基づいている。この発見は、ｓｉＲＮＡ送達に対する既知の障害を考慮すると驚くべきことであり、硝子体内または全身への送達に対する現実的な代替手段としての非侵襲的方法を提供する。

ｓｉＲＮＡ分子が標的遺伝子のｍＲＮＡをサイレンシングするのに有効であるために、ｓｉＲＮＡは、３つのレベルのターゲッティング、すなわち、標的組織への、標的細胞型への、および標的細胞内コンパートメントへのターゲッティングが必要となる。本発明は、今から、眼疾患および眼障害を治療する非侵襲的方法を開示する。

本発明は、一般に、眼細胞で発現される遺伝子の発現を下方調節する化合物、特に新規の小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および眼組織および眼細胞におけるそれらの遺伝子の発現と関連する医学的状態に苦しむ対象の治療におけるこれらの新規ｓｉＲＮＡの使用に関する。

眼標的ｍＲＮＡの発現を減弱させる方法および眼の障害を治療する方法は、本明細書で詳細に論じられており、任意の該分子および／または組成物は任意の該状態に苦しむ対象の治療において有益に利用され得る。

本発明のｓｉＲＮＡは、活性を増加させ得る、安定性を増加させ得る、およびまたは毒性を最小限に抑え得る構造および修飾を有しており、本発明のｓｉＲＮＡの新規の修飾は、標的遺伝子発現、特に本明細書で論じられている標的遺伝子を妨害するかまたは減弱させるときに有用な二本鎖ＲＮＡ配列に有益に適用することができる。

適応症ごとの標的遺伝子の非限定的な例の詳細を、以下、表Ａ１〜Ａ４に示す。

「変異体」または「ｖ」は、転写物変異体を指す。

表Ａ１〜Ａ４は、本発明のオリゴヌクレオチド阻害剤が向けられるヒトｍＲＮＡのポリヌクレオチド配列の一例についてのｇｉ（ＧｅｎｅＩｎｆｏ識別子）およびアクセッション番号を提供する（「ｖ」は、転写物変異体を指す）。

表Ａ１、Ａ２、Ａ３、およびＡ４中の遺伝子の阻害は、それぞれ、特に、緑内障、ドライアイ、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、および網膜色素変性症（ＲＰ）を治療するときに有用である。

定義
便宜を図るために、明細書、実施例、および特許請求の範囲で利用される特定の用語が、本明細書で記載されている。

本明細書で使用するとき、そうではないことが文脈から明らかに示されない限り、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」には、複数形が含まれることに留意すべきである。

本発明の態様または実施形態がマーカッシュ群または他の代替群に関して記載されている場合、当業者は、本発明がそれによりマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関しても記載されていることを認識するであろう。

「阻害剤」は、遺伝子の発現またはそのような遺伝子の産物の活性を、所望の生物学的または生理学的効果を達成するのに十分な程度にまで低下させることができる化合物を指す。本明細書で使用される「阻害剤」という用語は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびリボザイムをはじめとする、１以上のオリゴヌクレオチド阻害剤を指す。阻害は、ｍＲＮＡの発現の減弱、下方調節、またはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の場合、サイレンシングとも呼ばれ得る。本明細書に開示される阻害剤は、オリゴヌクレオチド構造物中の糖部分および／または塩基部分および／またはヌクレオチド間連結に対する改変などの修飾を組み込んでいる化学修飾ｓｉＲＮＡ化合物である。

本明細書で使用される「阻害する」または「軽減（減弱）させる」という用語は、遺伝子、その変異体もしくは産物の発現、またはそのような遺伝子の産物の活性を、所望の生物学的または生理学的効果を達成するのに十分な程度にまで低下させることを指す。阻害は完全なものであっても、部分的なものであってもよい。例えば、ＣＡＳＰ２遺伝子の「阻害」は、遺伝子発現（転写もしくは翻訳）または表Ａ１〜Ａ３のどれかに開示されている１以上の変異体もしくはそのＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）もしくは他の変異体のポリペプチド活性の阻害を意味する。

「眼組織」は、眼の構造と関連する任意の組織を指し、非限定的な形で、強膜、角膜、脈絡膜、網膜、涙腺、および視神経を含むことが意図される。

「眼細胞」は、眼および涙器の構造と関連する任意の細胞を指し、非限定的な形で、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、角膜細胞、結膜、前房、虹彩、毛様体突起、網膜、脈絡膜および脈絡膜細胞、線維柱帯網などを含むことが意図される。例えば、線維柱帯網には、内部ブドウ膜網、角膜強膜網、および近傍小管組織が含まれる。涙腺には、涙腺それ自体、下涙点および上涙点、下涙管および上涙管、涙嚢などが含まれる。

本明細書で使用するとき、「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は互換的に用いることができ、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含むヌクレオチド配列を指す。これらの用語は、等価物として、ヌクレオチド類似体から作られたＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの類似体を含むことも理解されるべきである。本明細書の全体を通じて、ｍＲＮＡ配列は、対応する遺伝子を表すものとして示されている。「ｍＲＮＡポリヌクレオチド配列」およびｍＲＮＡという用語は互換的に用いられている。

「オリゴヌクレオチド」、「オリゴリボヌクレオチド」、または「オリゴマー」は、約２〜約５０ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド配列を指す。この配列の各々のＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドは、独立に、天然のものであっても合成されたものであってもよく、かつ／または修飾されたものであっても未修飾のものであってもよい。修飾には、オリゴヌクレオチド中の糖部分、塩基部分、またはヌクレオチド間連結に対する改変が含まれる。本発明の化合物は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、およびそれらの組合せを含む分子を包含する。

本発明は、標的遺伝子の発現をインビボで阻害するための方法および組成物を提供する。一般に、本方法は、表Ａ１〜Ａ４に示す遺伝子のｍＲＮＡを標的とするために、ＲＮＡ干渉メカニズムによって標的遺伝子の発現を下方調節するのに十分な量で、オリゴリボヌクレオチド、特に小干渉ＲＮＡ（すなわち、ｓｉＲＮＡ）または細胞内でｓｉＲＮＡを生じさせることができる核酸物質を局所投与することを含む。特に、本方法を用いて、眼組織または眼細胞でのその遺伝子の発現と関連した眼障害または眼疾患に苦しむ対象の治療のために遺伝子の発現を阻害することができる。本発明に従って、標的遺伝子のｓｉＲＮＡ分子または阻害剤を、様々な眼の病変を治療するための薬物として使用する。

「ヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを包含することが意図され、これらは、天然のものであっても合成されたものであってもよく、かつ／または修飾されたものであっても未修飾のものであってもよい。修飾には、糖部分、塩基部分、および／またはヌクレオチド間連結に対する改変および置換が含まれる。

本明細書で使用するとき、「非対合ヌクレオチド類似体」という用語は、６デスアミノアデノシン（ネブラリン）、４−Ｍｅ−インドール、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、Ｄｓ、Ｐａ、Ｎ３−ＭｅリボＵ、Ｎ３−ＭｅリボＴ、Ｎ３−Ｍｅ ｄＣ、Ｎ３−Ｍｅ−ｄＴ、Ｎ１−Ｍｅ−ｄＧ、Ｎ１−Ｍｅ−ｄＡ、Ｎ３−エチル−ｄＣ、Ｎ３−Ｍｅ ｄＣを含むが、これらに限定されない、非塩基対合部分を含むヌクレオチド類似体を意味する。いくつかの実施形態では、非塩基対合ヌクレオチド類似体は、リボヌクレオチドである。他の実施形態では、それはデオキシリボヌクレオチドである。

ヌクレオチド／オリゴヌクレオチドの類似体、またはヌクレオチド／オリゴヌクレオチドに対する修飾は全て、該類似体または修飾がこのヌクレオチド／オリゴヌクレオチドの安定性および機能に大した悪影響を及ぼさないならば、本発明とともに利用され得る。許容される修飾には、糖部分の修飾、塩基部分の修飾、ヌクレオチド間連結における修飾、およびそれらの組合せが含まれる。

本発明において、時に「無塩基ヌクレオチド（脱塩基ヌクレオチド）」または「無塩基ヌクレオチド類似体（脱塩基ヌクレオチド類似体）」と呼ばれるものは、より適切には、疑似ヌクレオチドまたは非従来型部分と呼ばれる。ヌクレオチドは、リボースまたはデオキシリボース糖、リン酸、および塩基（ＤＮＡ中のアデニン、グアニン、チミン、またはシトシン；ＲＮＡ中のアデニン、グアニン、ウラシル、またはシトシン）からなる、モノマー単位の核酸である。修飾ヌクレオチドは、糖、リン酸、およびまたは塩基の１つまたは複数における修飾を含む。無塩基疑似ヌクレオチドは塩基を欠いており、したがって、厳密には、ヌクレオチドではない。

本明細書で使用される「キャッピング部分」という用語には、無塩基リボース部分、無塩基デオキシリボース部分、２’Ｏアルキル修飾をはじめとする無塩基リボースおよび無塩基デオキシリボース部分の修飾；逆方向無塩基リボースおよび無塩基デオキシリボース部分ならびにそれらの修飾；Ｃ６−イミノ−Ｐｉ；Ｌ−ＤＮＡおよびＬ−ＲＮＡをはじめとするミラーヌクレオチド；５’ＯＭｅヌクレオチド；ならびに４’，５’−メチレンヌクレオチドをはじめとするヌクレオチド類似体；１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド、炭素環ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルホスフェート；１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート、３−アミノプロピルホスフェート；６−アミノヘキシルホスフェート；１２−アミノドデシルホスフェート；ヒドロキシプロピルホスフェート；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−逆方向無塩基部分；１，４−ブタンジオールホスフェート；５’−アミノ；ならびに架橋または非架橋メチルホスホネートおよび５’−メルカプト部分が含まれる。２’−Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチドは、２’−ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドまたは２’−ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドとも呼ばれる。

特定の好ましいキャッピング部分は、無塩基リボースまたは無塩基デオキシリボース部分；逆方向無塩基リボースまたは無塩基デオキシリボース部分；Ｃ６−アミノ−Ｐｉ；Ｌ−ＤＮＡおよびＬ−ＲＮＡをはじめとするミラーヌクレオチドである。

本明細書で使用される「非従来型部分」という用語は、無塩基リボース部分、無塩基デオキシリボース部分、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、非塩基対合ヌクレオチド類似体、ならびに２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合によって隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチド；ＬＮＡを含む架橋核酸およびエチレン架橋核酸を指す。

無塩基デオキシリボース部分としては、例えば、無塩基デオキシリボース−３’−ホスフェート；１，２−ジデオキシ−Ｄ−リボフラノース−３−ホスフェート；１，４−アンヒドロ−２−デオキシ−Ｄ−リビトール−３−ホスフェートが挙げられる。逆方向無塩基デオキシリボース部分としては、逆方向デオキシリボ無塩基；３’，５逆方向デオキシ無塩基５’−ホスフェートが挙げられる。

本発明に関連して、「ミラー」ヌクレオチド（シュピーゲルマーとも呼ばれる）は、天然に存在するまたはよく利用されるヌクレオチドに対する逆向きのキラリティー、すなわち、天然に存在するまたはよく利用されるヌクレオチドの鏡像を有するヌクレオチド類似体である。ミラーヌクレオチドは、リボヌクレオチド（Ｌ−ＲＮＡ）またはデオキシリボヌクレオチド（Ｌ−ＤＮＡ）であり、少なくとも１つの糖もしくは塩基修飾および／またはホスホロチオエートもしくはホスホネート部分などの、骨格修飾をさらに含み得る。米国特許第６，６０２，８５８号には、少なくとも１つのＬ−ヌクレオチド置換を含む核酸触媒が開示されている。ミラーヌクレオチドとしては、例えば、Ｌ−ＤＮＡ（Ｌ−デオキシリボアデノシン−３’−ホスフェート（ミラーｄＡ）；Ｌ−デオキシリボシチジン−３’−ホスフェート（ミラーｄＣ）；Ｌ−デオキシリボグアノシン−３’−ホスフェート（ミラーｄＧ）；Ｌ−デオキシリボチミジン−３’−ホスフェート（ミラーｄＴ）およびＬ−ＲＮＡ（Ｌ−リボアデノシン−３’−ホスフェート（ミラーｒＡ）；Ｌ−リボシチジン−３’−ホスフェート（ミラーｒＣ）；Ｌ−リボグアノシン−３’−ホスフェート（ミラーｒＧ）；Ｌ−リボウラシル−３’−ホスフェート（ミラーｄＵ）が挙げられる。

修飾デオキシリボヌクレオチドとしては、例えば、５’末端位置（位置番号１）のヌクレオチドとして有用であり得る５’ＯＭｅ ＤＮＡ（５−メチル−デオキシリボグアノシン−３’−ホスフェート）；ＰＡＣＥ（デオキシリボアデニン３’ホスホノアセテート、デオキシリボシチジン３’ホスホノアセテート、デオキシリボグアノシン３’ホスホノアセテート、デオキシリボチミジン３’ホスホノアセテートが挙げられる。

架橋核酸としては、ＬＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン架橋核酸アデノシン３’モノホスフェート、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン架橋核酸５−メチル−シチジン３’モノホスフェート、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン架橋核酸グアノシン３’モノホスフェート、５−メチル−ウリジン（またはチミジン）３’モノホスフェート）；およびＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸アデノシン３’モノホスフェート、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸５−メチル−シチジン３’モノホスフェート、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸グアノシン３’モノホスフェート、５−メチル−ウリジン（またはチミジン）３’モノホスフェート）が挙げられる。

本発明のいくつかの実施形態では、好ましい非従来型部分は、無塩基リボース部分、無塩基デオキシリボース部分、デオキシリボヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、および２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合によって隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドである。

一態様によれば、本発明は、未修飾および修飾ヌクレオチドを含む阻害性オリゴヌクレオチド化合物を提供する。この化合物は、糖修飾、塩基修飾、およびヌクレオチド間連結修飾からなる群から選択される少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含み、ＤＮＡ、およびＥＮＡ（エチレン架橋核酸）をはじめとするＬＮＡ（ロックされた核酸）；ＰＮＡ（ペプチド核酸）；アラビノシド；ＰＡＣＥ（ホスホノアセテートおよびその誘導体）などの修飾ヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、または６炭素糖を有するヌクレオチドを含み得る。

一実施形態では、化合物は、少なくとも１つのリボヌクレオチドの糖部分上の２’修飾（「２’糖修飾」）を含む。特定の実施形態では、化合物は、場合により交互の位置に、２’Ｏ−アルキルまたは２’−フルオロまたは２’Ｏ−アリールまたは任意の他の２’糖修飾を含む。

他の安定化する修飾（例えば、オリゴマーの３’または５’末端に付加される修飾ヌクレオチド）も可能である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの骨格は修飾されており、リン酸−Ｄ−リボース実体を含むが、３リン酸−Ｄ−リボース実体、トリエステル、チオエート、２’−５’架橋骨格（５’−２’とも呼ばれ得る）、ＰＡＣＥ修飾ヌクレオチド間連結、または任意の他の種類の修飾をも含み得る。

他の修飾としては、オリゴヌクレオチドの５’および／または３’末端への付加が挙げられる。このような末端修飾は、脂質、ペプチド、糖、または他の分子であってもよい。

糖残基への考えられる修飾はマニホールドであり、これには、２’−Ｏアルキル、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、アラビノシド；アルトリトール（ＡＮＡ）、およびモルホリノをはじめとする他の６員糖、ならびにシクロヘキシニルが含まれる。

ＬＮＡ化合物は、国際特許公報ＷＯ００／４７５９９号、ＷＯ９９／１４２２６号、およびＷＯ９８／３９３５２号に開示されている。ＬＮＡヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡ化合物の例は、Ｅｌｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，（ＮＡＲ ２００５．３３（１）：４３９−４４７）および国際特許公報ＷＯ２００４／０８３４３０号に開示されている。６員環ヌクレオチド類似体は、Ａｌｌａｒｔ，ｅｔ ａｌ（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ & Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９８，１７：１５２３−１５２６；およびＰｅｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ，ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｏｒｇ． ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６：１４５７−１４６０）に開示されている。ヘキシトールおよびアルトリトールヌクレオチドモノマーをはじめとする６員環ヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオチドは、国際特許公報公報ＷＯ２００６／０４７８４２号に開示されている。

エチル（ホスホ−エチルトリエステルを生じさせる）；プロピル（ホスホ−プロピルトリエステルを生じさせる）；およびブチル（ホスホ−ブチルトリエステルを生じさせる）などの、骨格修飾も可能である。他の骨格修飾としては、ポリマー骨格、環状骨格、非環状骨格、チオホスフェート−Ｄ−リボース骨格、アミデート、およびホスホノアセテート誘導体が挙げられる。特定の構造物としては、１つまたは複数の２’−５’ヌクレオチド間連結（架橋または骨格）を有するｓｉＲＮＡ化合物が挙げられる。

本発明はまた、様々な遺伝子の発現を下方調節する化合物、特に新規の小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）化合物、ならびに様々な眼疾患および眼の医学的状態の治療におけるこれらの新規ｓｉＲＮＡの使用に関する。

各々の遺伝子について、１９−ｍｅｒのオリゴマー配列の個別リストがあるが、これらのオリゴマー配列は、ヒト遺伝子発現を標的とするのに最も良い配列として特許アルゴリズムにおけるそのスコアに基づいて優先順位が付けられている。２１−ｍｅｒまたは２３−ｍｅｒのｓｉＲＮＡ配列は、本明細書に開示されている１９−ｍｅｒ配列の５’および／または３’伸長によって生成させることができる。このような伸長は、好ましくは対応するｍＲＮＡ配列に相補的である。特定の２３−ｍｅｒオリゴマーはこの方法により考案されたが、この場合、優先順位付けの順序は、対応する１９−ｍｅｒの順序である。表Ｂ１〜Ｂ３６には、ｓｉＲＮＡを調製するときに有用なヒトのセンスオリゴヌクレオチドおよび対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドが示されている。種間の略語は、Ｍｓ：マウス、Ｒｂ：ウサギ、Ｃｈｍｐ：チンパンジー、Ｍｎｋ：サル、Ｃｈｎ：チンチラ、ＧＰ：モルモットとする。

眼疾患
治療的オリゴヌクレオチド化合物の局所送達は、広範な眼疾患および眼障害の治療に有用である。本発明の化合物のいくらかは、例えば、
１．原発開放隅角緑内障／続発開放隅角緑内障
２．多発性硬化症（視神経炎）
３．網膜中心静脈閉塞症または網膜静脈分岐閉塞症
４．（てんかん重積状態、ＨＩＶ−１感染症における）虚血性視神経症
５．視神経損傷
６．鞍上部の中（トルコ鞍の上）に及ぶ腫瘍
７．視交叉近傍腫瘍（下垂体腫瘍による視交叉の圧迫と関連する視力喪失は、一時的または永続的であり得、おそらく網膜神経節細胞の不可逆的な逆行性変性の程度に関連する）
８．網膜芽細胞腫
において、視神経の神経保護が有益である疾患および障害に苦しむ患者を治療するときに有用である。

原発開放隅角緑内障
緑内障の症例の大部分は、原発開放隅角緑内障ＰＯＡＧ（慢性開放隅角緑内障とも呼ばれる）として知られる形態である。ＰＯＡＧは、眼圧（ＩＯＰ）を生じさせる、眼の前房内の房水の蓄積に起因する。ＩＯＰの上昇は、「眼圧測定」試験によって測定することができるが、これは、流体が眼に侵入し、十分な流体が眼から出て行かないことに起因する。通常、流体は、毛様体内の血管から漏れ出すことによって眼に入る。この流体は、最終的には、水晶体を越え、瞳孔（虹彩の中央開口部）を通り抜けて、虹彩と角膜が一体となっている形成された解剖学的な角である、虹彩−角膜隅角に進む。その後、この流体は、隅角の線維柱帯網を通過し、シュレム管を経由して眼から出る。

過剰の流体が眼に入った場合、または線維柱帯網の「排出口」が（例えば、破片または細胞で）詰まった場合、結果的に十分な流体が眼から出ず、「開放隅角緑内障」と呼ばれる状態になって、圧力が蓄積する。開放隅角緑内障は、虹彩の後部が水晶体前面に付着して「瞳孔ブロック」を作り、眼内液が瞳孔を通過して前房に入るのを妨げるときにも生じることがある。

虹彩と角膜の間の隅角が狭過ぎるかまたは閉じてさえいる場合、流体が逆流し、「閉塞隅角緑内障」と呼ばれる状態になって、圧力が増加する。

治療されない緑内障は、最終的には、視神経萎縮および失明に至る。

正常眼圧緑内障
眼圧は、米国における約２５〜３０％の緑内障症例で正常（１２〜２２ｍｍＨｇ）であり、これは、正常眼圧緑内障として知られる状態である（日本では、この割合は、７０％もの高さであり得る）。視神経傷害を引き起こすが、ＩＯＰには影響を及ぼさない他の要因が存在する。

閉塞隅角緑内障
閉塞隅角緑内障（別名、隅角閉塞緑内障）は、全緑内障症例の１５％の原因である。これは、米国ではＰＯＡＧよりも一般的ではないが、アジア人の間に罹患率が高いために、世界の緑内障症例の約半数を占めている。虹彩は水晶体に押し付けられ、時にはそれにくっつき、排水隅角を閉鎖する。これは突然起こることがあり、圧力がすぐに上昇する。これは、瞳孔が突然収縮したときに、遺伝的に感受性の高い人に起こることが多い。閉塞隅角緑内障は、慢性かつ緩徐であることもあるが、あまり一般的でない状態である。

先天性緑内障
眼の排出管が正しく発達しない、先天性緑内障は、生まれつき存在する。これは非常に稀であり、新生児１０，０００人に約１人で起こる。これは、遺伝性疾患である場合があり、多くの場合、マイクロサージェリーで矯正することができる。

一態様では、本発明は、緑内障に苦しむ対象の眼内の標的眼ｍＲＮＡの発現を減弱させる方法であって、有効量の少なくとも１つの化学修飾ｓｉＲＮＡと薬学的に許容される担体とを対象の眼の表面に局所的に（非侵襲的に）投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態では、少なくとも１つの眼標的ｍＲＮＡは、配列番号１〜３５に示される、表Ａ１中のリストから選択される遺伝子の産物である。特定の好ましい実施形態では、標的眼ｍＲＮＡは、ＣＡＳＰ２、ＡＳＰＰ１、ＴＰ５３ＢＰ２、ＢＮＩＰ３、ＲＴＰ８０１Ｌ、ＡＣＨＥ、ＡＤＲＢ１、およびＣＡＰＮＳ１から選択される遺伝子の産物である。現在好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、点眼薬としての送達用に処方される。様々な実施形態では、標的眼ｍＲＮＡは、配列番号１〜２に示されている。

別の態様では、本発明は、治療を必要とする対象の緑内障を治療する方法であって、対象の眼内の標的遺伝子の発現を阻害する治療有効量の少なくとも１つの化学修飾ｓｉＲＮＡを対象の眼の表面に局所的に（非侵襲的に）投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子は、配列番号１〜３５のいずれか１つに示されるｍＲＮＡに転写される、表Ａ１中のリストから選択されるヒト遺伝子である。特定の好ましい実施形態では、遺伝子は、ＣＡＳＰ２、ＡＳＰＰ１、ＴＰ５３ＢＰ２、ＢＮＩＰ３、ＲＴＰ８０１Ｌ、ＡＣＨＥ、ＡＤＲＢ１、およびＣＡＰＮＳ１から選択される。現在好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、点眼薬としての送達用に処方される。様々な実施形態では、標的眼ｍＲＮＡは、配列番号１〜２に示されている。

視神経炎
視神経炎は、眼球内の視神経および視神経乳頭の一部を冒し得る視神経の炎症（乳頭炎）または眼球の後ろの部分を冒し得る視神経の炎症（球後視神経炎）である。視神経炎は、以下のいずれかによっても生じ得る：多発性硬化症または後感染性脳脊髄炎などの脱髄疾患；炎症性疾患（例えば、副鼻腔炎、髄膜炎、結核、梅毒、脈絡網膜炎、眼窩の炎症）の合併症をはじめとする全身性のウイルスまたは細菌感染症；栄養疾患および代謝疾患（例えば、糖尿病、悪性貧血、甲状腺機能亢進症）；主に若い人を冒す珍しい形態の遺伝性視神経症である、レーベル遺伝性視神経症；毒素（タバコ、メタノール、キニーネ、ヒ素、サリチル酸塩、鉛）；ならびに外傷。

視神経萎縮
視神経萎縮は、視神経および視索神経線維の変性に起因する遺伝性または後天性の視力喪失障害である。これは、網膜中心静脈もしくは網膜中心動脈の閉塞、動脈硬化性の変化によって獲得されることがあり、変性網膜疾患に続発することがあり、視神経に対する圧力の結果であることがあり、または代謝疾患（例えば、糖尿病）、外傷、緑内障、もしくは（アルコール、タバコ、もしくは他の毒に対する）毒性に関連するものであることがある。視神経線維の変性および萎縮は不可逆的であるが、静脈内ステロイド注射が、場合によっては、このプロセスの速度を落とすことが分かっている。

乳頭浮腫
（腫瘍誘導性の）頭蓋内圧の上昇、悪性高血圧症、または網膜中心静脈の血栓症によることが最も多い、視神経乳頭（乳頭）の腫脹。この疾患は通常、両側性であり、神経頭は非常に隆起しかつ腫脹しており、瞳孔応答は通常、正常である。視力は最初は影響を受けず、眼球運動時の痛みはない。続発性視神経萎縮および永久的な視力喪失は、乳頭浮腫の主因が治療されないままである場合に、生じることがある。

虚血性視神経症（ＩＯＮ）
栄養動脈の閉塞性障害の結果としての（通常、片方の眼の）視神経への動脈血供給の喪失に起因する重篤な失明病。視神経症は、視神経乳頭の青白い浮腫を生じさせる、前部視神経症であることもあるし、または視神経乳頭が腫脹せず、眼球と視交叉の間に異常が生じる、後部視神経症であることもある。虚血性前部視神経症は通常、突発性であり得るかまたは数日間かけて生じ得る視力喪失を引き起こす。虚血性後部視神経症は一般的ではなく、診断は、他の原因、主に脳卒中および脳腫瘍の除外に大きく左右される。

他の疾患および状態としては、ドライアイ、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、および網膜色素変性症が挙げられる。

ドライアイ
乾性角結膜炎または乾性角膜炎としても知られる、ドライアイは、通常、眼を潤す涙液膜の産生の減少に起因するよくある問題である。大半のドライアイ患者は不快感を経験し、視覚喪失はないが、重篤な場合には、角膜が傷害を受けるかまたは感染するようになることがある。

ドライアイは、不快感、視覚障害、および眼表面に傷害を与える可能性のある涙液膜不安定性という症状をもたらす涙および眼表面の多因子疾患である。これは、涙液膜のモル浸透圧濃度の増加と眼表面の炎症とを伴う。

涙腺は、腺房細胞、導管細胞、および筋上皮細胞から構成された多小葉組織である。腺房細胞は、涙腺に存在する細胞の８０％を占めており、タンパク質の合成、貯蔵、および分泌のための部位である。これらのタンパク質のうちのいくつかは、眼表面の健康に極めて重要な抗菌性（リゾチーム、ラクトフェリン）または増殖因子（表皮増殖因子、形質転換増殖因子α、角質実質細胞増殖因子）特性を有する。導管細胞の主な機能は、腺房細胞により分泌される一次流体を改変することと、水および電解質を分泌することである。筋上皮細胞は、腺房細胞および導管細胞の基底部分を取り囲む、多数の突起を含んでおり、収縮して導管から流体を追い出し、眼表面に出すと考えられている。

涙腺機能不全のメカニズム
アポトーシス、ホルモンの不均衡、自己抗体の産生、シグナル伝達分子の変化、神経機能不全、および炎症促進性サイトカインのレベル増加は、涙腺不全の考えられるメディエーターであると提唱されている。シェーグレン症候群の主な症状の１つは、ドライアイである。涙腺の腺房および導管上皮細胞のアポトーシスは、分泌機能の障害の原因となるあり得るメカニズムであると提唱されている。（Ｍａｎｇａｎｅｌｌｉ ａｎｄ Ｆｉｅｔｔａ，Ｓｅｍｉｎ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．２００３．３３（１）：４９−６５）。理論に束縛されることを望まないが、アポトーシス性の上皮細胞死は、Ｆａｓ（Ａｐｏ−１／ＣＤ９５）、ＦａｓＬ（ＦａｓＬ／ＣＤ９５Ｌ）、Ｂａｘ、カスパーゼ、パーフォリン、およびグランザイムＢを含むいくつかのアポトーシス経路の活性化によるものであり得る。パーフォリンおよびグランザイムＢなどの、プロテアーゼの放出を介する細胞傷害性Ｔ細胞、またはＴ細胞により発現されるＦａｓＬと上皮細胞上のＦａｓとの相互作用は、腺房細胞のアポトーシスを引き起こすことができる。

現在のドライアイに対する治療は、主に、潤滑剤による涙の補充；涙点閉鎖、モイストチャンバー眼鏡、またはコンタクトレンズなどの療法による涙の保持；例えば、分泌促進剤による涙の刺激；生物学的代用涙液；抗炎症療法（シクロスポリン、コルチコステロイド、テトラサイクリン）；および食餌性必須脂肪酸などの、局所的かつ対症的なものである。

一態様では、本発明は、ドライアイに苦しむ対象の眼内の標的眼ｍＲＮＡの発現を減弱させる方法であって、有効量の少なくとも１つの化学修飾ｓｉＲＮＡと薬学的に許容される担体とを対象の眼の表面に局所的に（非侵襲的に）投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、標的眼ｍＲＮＡは、配列番号５、８〜１０、２６〜２７、３０〜４４に示される、表Ａ２から選択されるヒト遺伝子の産物である。いくつかの実施形態では、標的眼ｍＲＮＡは、ＦＡＳ、ＦＡＳリガンド（ＦＡＳＬ）、ｐ５３、ＬＲＤＤ、ＰＡＲＰ１、ＡＩＦ（アポトーシス誘導因子）、ＮＯＳ１、ＮＯＳ２Ａ、ＸＩＡＰ、およびＳＨＣ１−ＳＨＣから選択される。特定の好ましい実施形態では、標的眼ｍＲＮＡは、配列番号３６〜４４のいずれか１つに示されている。現在好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、点眼薬としての送達用に処方される。様々な実施形態では、対象は、シェーグレン症候群に苦しんでいる。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、配列番号１３２２５〜１５２２４に示される、表１６〜１７中の配列から選択される。

別の態様では、本発明は、治療を必要とする対象のドライアイを治療する方法であって、対象の眼内の標的遺伝子の発現を阻害する治療有効量の少なくとも１つの化学修飾ｓｉＲＮＡを対象の眼の表面に局所的に（非侵襲的に）投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、表Ａ２から選択されるヒト遺伝子であり、そのｍＲＮＡは、配列番号５、８〜１０、２６〜２７、または３０〜４４のいずれか１つに示されている。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、ＦＡＳ、ＦＡＳリガンド（ＦＡＳＬ）、ｐ５３、ＬＲＤＤ、ＰＡＲＰ１、ＡＩＦ（アポトーシス誘導因子）、ＮＯＳ１、ＮＯＳ２Ａ、ＸＩＡＰ、およびＳＨＣ１−ＳＨＣから選択される。特定の好ましい実施形態では、標的遺伝子ｍＲＮＡは、配列番号３６〜４４のいずれか１つに示されている。現在好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、点眼薬としての送達用に処方される。様々な実施形態では、対象は、シェーグレン症候群に苦しんでいる。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、配列番号１３２２５〜１５２２４に示される、表１６〜１７中の配列から選択される。

網膜色素変性症
網膜色素変性症（ＲＰ）は、進行性の周辺視力の喪失と中心視力喪失を引き起こし得る夜盲症とを特徴とする一群の遺伝性障害を表す。網膜色素変性症には現在治療法がないが、この疾患の進行は、食餌性ビタミンＡの補充によって減弱させることができる。

桿体光受容体細胞および錐体光受容体細胞におけるアポトーシスは、ＲＰにおける網膜変性の決定的に重要なプロセスであり、成人失明の主な原因となっている。

一態様では、本発明は、網膜色素変性症（ＲＰ）に苦しむ対象の眼内の標的眼ｍＲＮＡの発現を減弱させる方法であって、有効量の少なくとも１つの化学修飾ｓｉＲＮＡと薬学的に許容される担体とを対象の眼の表面に局所的に（非侵襲的に）投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、標的眼ｍＲＮＡは、表Ａ４に記載の遺伝子、すなわち、配列番号３、１４、２６〜３５、５４〜５７のいずれか１つに示されるｍＲＮＡに転写される遺伝子から選択される遺伝子の産物である。いくつかの実施形態では、標的眼ｍＲＮＡは、ＣＡＳＰ１、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ１２、ＲＴＰ８０１、ＲＴＰ８０１Ｌ、カルパインＳ１、ＰＡＲＰ１、ＡＩＦ、ＮＯＳ１、ＮＯＳ２、ＸＩＡＰ、およびＳＨＣ１−ＳＨＣからなる群から選択される遺伝子の産物である。現在好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、点眼薬としての送達用に処方される。特定の好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号５６〜５７に示されるｍＲＮＡを標的とする。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、配列番号９５１７〜１０５１６に示される、表１１中の配列から選択される。

別の態様では、本発明は、治療を必要とする対象の網膜色素変性症（ＲＰ）を治療する方法であって対象の眼内の標的遺伝子の発現を阻害する治療有効量の少なくとも１つの化学修飾ｓｉＲＮＡを対象の眼の表面に局所的に（非侵襲的に）投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、配列番号３、１４、２６〜３５、５４〜５７のいずれか１つに示されるｍＲＮＡに転写される、表Ａ４に記載のヒト遺伝子である。いくつかの実施形態では、遺伝子は、ＣＡＳＰ１、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ１２、ＲＴＰ８０１、ＲＴＰ８０１Ｌ、カルパインＳ１、ＰＡＲＰ１、ＡＩＦ、ＮＯＳ１、ＮＯＳ２、ＸＩＡＰ、およびＳＨＣ１−ＳＨＣからなる群から選択されるヒト遺伝子である。現在好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、点眼薬としての送達用に処方される。特定の好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、配列番号５６〜５７に示されるｍＲＮＡを標的とし、かつ阻害する。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、配列番号９５１７〜１０５１６に示される、表１１中の配列から選択される。

糖尿病性網膜症
糖尿病性網膜症は糖尿病の合併症であり、失明の主な原因である。これは、糖尿病が網膜内側の小血管を傷害するときに生じる。糖尿病性網膜症は以下の４つの段階を有する。
−軽症非増殖網膜症：網膜血管内の毛細血管瘤。
−中等症非増殖網膜症。疾患が進行するにつれて、網膜に栄養を与える一部の血管が遮断される。
−重症非増殖網膜症。さらに多くの血管が遮断され、網膜の様々な部位から血液供給を奪う。これは、新しい血管の増殖により切り抜けられる。
−増殖網膜症。新しい血管が網膜および硝子体ゲルの表面に沿って増殖する。血管から血液が漏出するとき、重度の視力喪失および失明すら生じることがある。

妊娠中、糖尿病性網膜症は、糖尿病の女性にとって問題となり得る。

一態様では、本発明は、糖尿病性網膜症に苦しむ対象の眼内の標的眼ｍＲＮＡの発現を減弱させる方法であって、有効量の少なくとも１つの化学修飾ｓｉＲＮＡと薬学的に許容される担体とを対象の眼の表面に局所的に（非侵襲的に）投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、標的眼ｍＲＮＡは、配列番号１〜２、３、５、６〜７、８〜１０、１２、１３、２４〜２５、２６〜２７、３０〜３５、４５〜５３のいずれか１つに示されるｍＲＮＡを有する表Ａ３に記載のヒト遺伝子の産物である。現在好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、点眼薬としての送達用に処方される。特定の好ましい実施形態では、標的眼ｍＲＮＡは、配列番号４８〜５３のいずれか１つに示されている。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、配列番号２６６９〜３６４８および２５５７５〜２９５９４に示される、表４、２８〜３２中の配列から選択される。

別の態様では、本発明は、治療を必要とする対象の糖尿病性網膜症を治療する方法であって、対象の眼内の標的遺伝子の発現を阻害する治療有効量の少なくとも１つの化学修飾ｓｉＲＮＡを対象の眼の表面に局所的に（非侵襲的に）投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、配列番号１〜２、３、５、６〜７、８〜１０、１２、１３、２４〜２５、２６〜２７、３０〜３５、４５〜５３のいずれか１つに示されるｍＲＮＡを有する、表Ａ３に記載のヒト遺伝子である。現在好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、点眼薬としての送達用に処方される。特定の好ましい実施形態では、標的眼ｍＲＮＡは、配列番号４８〜５３のいずれか１つに示されている。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖は、配列番号２６６９〜３６４８および２５５７５〜２９５９４に示される、表４、２８〜３２中の配列から選択される。

理論に束縛されることの望まないが、糖尿病性網膜症によって傷害された血管は、２通りの方法で視力喪失を引き起こす。脆い異常血管が発生し、血液を眼の中心に漏出させ、視野をぼやけさせることがある。これが増殖網膜症であり、４番目の、最も進行した疾患段階である。流体が黄斑の中心に漏出し、視野をぼやけさせることがある。この状態は黄斑浮腫と呼ばれる。これは、糖尿病性網膜症のどの段階でも起こり得るが、疾患が進行するにつれて起こる可能性が高く、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）として知られている。

加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）
米国の６５歳を過ぎた個人において、最良矯正視力低下の最もよく見られる原因は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）として知られる網膜障害である。ＡＭＤに冒される眼の部分は、主に光受容体細胞から構成される、網膜の中心の小さな部分である黄斑である。ＡＭＤが進行するにつれて、この疾患は、急な中心視力の喪失を特徴とする。いわゆる「乾性」ＡＭＤは、ＡＭＤ患者の約８５％〜９０％を占めており、細胞の全体的な萎縮による眼色素分布の変化、光受容体の損失、および網膜機能の低下を伴う。「湿性」ＡＭＤは、網膜下空間における血栓または瘢痕を生じさせる異常脈絡膜血管の増殖を伴う。したがって、「湿性」ＡＭＤの発症は、神経網膜下の異常な脈絡膜新生血管ネットワーク（脈絡膜新血管形成、ＣＮＶ）の形成のために起こる。新たに形成される血管は、過度に漏れやすい。これにより、視力の喪失をもたらす網膜下液および血液の蓄積が生じる。最終的に、脈絡膜と網膜を含む大きな円板状瘢痕が形成されるので、罹患した領域内の機能的な網膜が全て失われる。乾性ＡＭＤ患者は質の低下した視力を保持し得るが、湿性ＡＭＤは、多くの場合、失明に至る（Ｈａｍｄｉ & Ｋｅｎｎｅｙ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｅ３０５−３１４，Ｍａｙ ２００３）。

一態様では、本発明は、ＡＭＤまたはＤＭＥに苦しむ対象の眼内の標的眼ｍＲＮＡの発現を減弱させる方法であって、有効量の少なくとも１つの化学修飾ｓｉＲＮＡと薬学的に許容される担体とを対象の眼の表面に局所的に（非侵襲的に）投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、標的眼ｍＲＮＡは、配列番号１〜２、３、５、６〜７、８〜１０、１２、１３、２４〜２５、２６〜２７、３０〜３５、４５〜５３のいずれか１つに示されるｍＲＮＡを有する、表Ａ３に記載のヒト遺伝子の産物である。現在好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、点眼薬としての送達用に処方される。特定の好ましい実施形態では、標的眼ｍＲＮＡは、ヒトＣＴＳＤ、ＲＴＰ８０１、およびＢＮＩＰ３の産物である。

別の態様では、本発明は、治療を必要とする対象のＡＭＤまたはＤＭＥを治療する方法であって、対象の眼内の標的遺伝子の発現を阻害する治療有効量の少なくとも１つの化学修飾ｓｉＲＮＡを対象の眼の表面に局所的に（非侵襲的に）投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、配列番号１〜２、３、５、６〜７、８〜１０、１２、１３、２４〜２５、２６〜２７、３０〜３５、４５〜５３のいずれか１つに示されるｍＲＮＡを有する、表Ａ３に記載のヒト遺伝子である。現在好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡは、点眼薬としての送達用に処方される。特定の好ましい実施形態では、標的ヒト遺伝子は、ヒトＣＴＳＤ、ＲＴＰ８０１、およびＢＮＩＰ３である。

本発明の化合物により治療されるさらなる眼疾患
ウイルス性疾患および細菌性疾患
眼組織と関連するウイルス性疾患および細菌性疾患を本発明の化合物により治療することができる。結膜炎および他の眼瞼の疾患または病気は、特に、本発明の方法に従って、このような疾患を引き起こす生物の複製および／または生存に必須の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドを投与することにより治療することができる。

腫瘍と関連する視力喪失
別の態様では、本発明は、腫瘍と関連する視力喪失の治療を必要とする対象における腫瘍と関連する視力喪失を治療する方法であって、対象における腫瘍と関連する少なくとも１つの遺伝子の発現を阻害する治療有効量の少なくとも１つの化学修飾ｓｉＲＮＡを対象の眼の表面に視力喪失を治療するのに有効な量で局所的にかつ非侵襲的に投与することを含む方法を提供する。

本発明による、視力喪失を引き起こす腫瘍には、悪性新生物（癌）と良性腫瘍の両方が含まれる。腫瘍には、任意の眼組織または任意の種類の眼細胞の腫瘍が含まれ、それらには、脈絡膜腫瘍、結膜腫瘍、眼瞼腫瘍、浸潤性眼内腫瘍、虹彩腫瘍、転移性眼球腫瘍、視神経腫瘍、眼窩腫瘍、および網膜腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。特に、本発明が治療を目指している腫瘍および癌の限定的なリストとしては、脈絡膜血管腫、脈絡膜黒色腫、脈絡膜転移、脈絡膜母斑、脈絡膜骨腫、毛様体黒色腫、および太田母斑などの脈絡膜腫瘍；結膜カポジ肉腫、眼球上類皮腫、結膜のリンパ腫、黒色腫および異型ＰＡＭ、色素性結膜腫瘍、瞼裂斑、翼状片、結膜の扁平上皮癌および上皮内癌などの結膜腫瘍；基底細胞癌、毛細血管腫、汗腺嚢腫、眼瞼辺縁の母斑、脂漏性角化症、眼瞼の悪性黒色腫、眼瞼の皮脂腺癌、および眼瞼の扁平上皮癌などの眼瞼腫瘍；慢性リンパ性白血病、浸潤性脈絡膜症、および眼内リンパ腫などの浸潤性眼内腫瘍；前部ブドウ膜転移、虹彩嚢胞、虹彩褐色細胞腫、虹彩黒色腫、および虹彩の真珠嚢胞などの虹彩腫瘍；転移性脈絡膜黒色腫などの転移性眼球腫瘍；視神経を冒す脈絡膜黒色腫、視神経症を伴う乳頭周囲転移、視神経褐色細胞腫、視神経鞘髄膜腫などの視神経腫瘍；涙腺の腺様嚢胞癌、眼窩の海綿状血管腫、眼窩のリンパ管腫、眼窩粘液嚢胞、眼窩偽腫瘍、眼窩横紋筋肉腫、小児の眼周囲血管腫、および硬化性眼窩偽腫瘍などの眼窩腫瘍；網膜色素上皮（ＲＰＥ）肥大、網膜色素上皮（ＲＰＥ）腫瘍、網膜芽細胞腫、およびフォン・ヒッペル血管腫などの網膜腫瘍が挙げられる。

薬学的組成物
本発明のオリゴヌクレオチド化合物を、未加工の化学物質として投与することが可能であり得るが、それらを薬学的組成物として投与することが好ましい。したがって、本発明は、１以上の本発明の化合物と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。この組成物は、２以上の異なるオリゴヌクレオチド／ｓｉＲＮＡの混合物を含み得る。

本発明はさらに、上で開示されたような１以上の遺伝子を阻害するのに有効な量の１以上の本発明の化合物に共有結合または非共有結合した少なくとも１つの本発明の化合物と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。この化合物は、１以上の本発明のオリゴリボヌクレオチドを産生するよう、内在性の細胞複合体によって細胞内でプロセッシングされ得る。

本発明はさらに、薬学的に許容される担体と眼疾患または眼障害に苦しむ対象の眼におけるヒト遺伝子の発現を下方調節するのに有効な量の１以上の本発明の化合物とを含む薬学的組成物を提供する。

本発明はまた、薬学的組成物を調製するプロセスであって、
１以上の本発明の化合物を準備することと
該化合物を薬学的に許容される担体と混合することと
を含む、プロセスを提供する。

薬学的に許容される担体は、好ましくは眼科用投与のために当業者によって選択される。

様々な実施形態では、本発明の薬学的組成物は、水性の滅菌眼科用懸濁液または溶液を形成させるために、水、塩化ナトリウム、緩衝液、食塩水（例えば、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ））、マンニトールなど、およびそれらの組合せのような生理的に許容される眼科用担体媒体と混合された、最大９９重量％の少なくとも１つの本発明のｓｉＲＮＡ化合物、またはその塩を含む。

薬学的組成物はさらに、例えば、塩化ベンザルコニウムなどの、少なくとも１つの眼科用に許容される防腐剤を任意で含む。さらに、眼科用薬学的組成物には、ｓｉＲＮＡを溶解させる助けとなる眼科用に許容される界面活性剤が含まれてもよい。

本発明の眼科用薬学的組成物は、１以上の干渉ＲＮＡを、例えば、生理的に許容される等張水性緩衝液などの、眼科用に許容される担体とともに溶解させるかまたは混合することにより調製されてもよい。

好ましい実施形態では、眼科用組成物の調製において使用されるｓｉＲＮＡ化合物は、薬学的に有効な用量で眼科用に許容される担体とともに混合される。特定の好ましい実施形態では、眼科用に許容される担体はＰＢＳである。

いくつかの実施形態では、本発明の薬学的眼科用組成物はさらに、非ステロイド性抗炎症薬、コルチコステロイド、抗生物質などのような、追加の薬学的活性剤または薬学的活性剤の組合せを含む。

さらに、本発明は、本発明の遺伝子の発現を、対照と比較して少なくとも２０％阻害する方法であって、本発明の遺伝子のｍＲＮＡ転写物を１以上の本発明の化合物と接触させることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、活性のあるｓｉＲＮＡ化合物は、対照と比較して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％のレベルで遺伝子発現を阻害する。特定の好ましい実施形態では、阻害は、対照と比較して少なくとも７５％、８０％、または９０％のレベルである。

一実施形態では、オリゴリボヌクレオチドは、１以上の本発明の遺伝子を阻害し、この阻害は、遺伝子機能の阻害、ポリペプチドの阻害、およびｍＲＮＡ発現の阻害を含む群から選択される。

一実施形態では、化合物はポリペプチドを阻害し、この阻害は、機能の阻害（とりわけ、酵素アッセイまたはネイティブな遺伝子／ポリペプチドの既知の相互作用因子との結合アッセイにより検討し得るもの）、タンパク質の阻害（とりわけ、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、または免疫沈降により検討し得るもの）、およびｍＲＮＡ発現の阻害（とりわけ、ノーザンブロッティング、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、インサイチュハイブリダイゼーション、またはマイクロアレイハイブリダイゼーションにより検討し得るもの）を含む群から選択される。

併用療法
本発明の化合物は、単独でまたは眼障害もしくは眼疾患を治療するときに有用な別の治療剤と組み合わせて投与することができる。

いくつかの実施形態では、本発明の薬学的眼科用組成物はさらに、オリゴヌクレオチド， 例えば、ｓｉＲＮＡ、非ステロイド性抗炎症薬、コルチコステロイド、抗生物質などのような、追加の薬学的活性剤または薬学的活性剤の組合せを含む。

一実施形態では、２以上の治療剤の共投与は、相乗的効果、すなわち、組合せ物の個々の成分の治療効果の合計よりも大きい治療効果を達成する。別の実施形態では、２以上の治療剤の共投与は相加的効果を達成する。

併用療法を含む有効成分を、単一投薬形態によってまたは各々の活性剤の個別投与によって一緒に投与してもよい。特定の実施形態では、第１の治療剤および第２の治療剤を単一投薬形態で投与する。これらの薬剤を局所投与用の単一溶液に処方してもよい。あるいは、第１の治療剤および第２の治療剤を、別々の組成物として投与してもよい。第１の活性剤を第２の活性剤と同時に投与してもよく、または第１の活性剤を第２の活性剤とともに間欠的に投与してもよい。第１の治療剤の投与と第２の治療剤の投与の間の時間の長さを、所望の治療効果を達成するよう調整してもよい。例えば、第２の治療剤を、第１の治療剤の投与のわずか数分（例えば、１、２、５、１０、３０、もしくは６０分）後または数時間（例えば、２、４、６、１０、１２、２４、もしくは３６時間）後に投与してもよい。特定の実施形態では、第２の治療剤の投与と投与の間に２以上の投薬量のこれらの治療剤の１つを投与することが有利であり得る。例えば、第２の治療剤を、第１の治療剤の投与２時後に投与し、その後、１０時間で再び投与してもよい。あるいは、第２の治療剤の投与と投与の間に２以上の投薬量の第１の治療剤を投与することが有利であり得る。特定の実施形態では、併用療法の全体的な治療効果が、一部併用療法の組合せ効果または相乗的効果によるものであるように、各々の有効成分の治療効果は、各々の治療剤の持続期間の少なくとも一部の間、重複することが好ましい。

送達
本明細書に開示されているｓｉＲＮＡ分子を、担体または希釈剤とともに調製された分子の直接的な適用によって眼の標的組織に送達する。

「裸のｓｉＲＮＡ（ネイキッドｓｉＲＮＡ）」という用語は、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム製剤、リポフェクチン、または沈殿剤などをはじめとする、細胞内への侵入を助けるか、促進するか、または容易にするように作用する任意の送達ビヒクルまたは製剤を含まないｓｉＲＮＡ分子を指す。例えば、ＰＢＳまたは許容される眼科用製剤中のｓｉＲＮＡは、「裸のｓｉＲＮＡ」である。本発明の特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは裸のｓｉＲＮＡとして送達される。特定の用途のために、例えば、ポリマーまたは粘度増強剤の添加によって、眼または鼻腔におけるｓｉＲＮＡの滞留時間を増加させる製剤が望ましい場合がある。

特に、哺乳動物細胞へのｓｉＲＮＡの送達の増強および改善を目的とした送達系が開発されている（例えば、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ ＦＥＢＳ Ｌｅｔ．２００３，５３９：１１１−１１４；Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００２，２０：１００６−１０１０；Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｖｉｓｉｏｎ ２００３，９：２１０−２１６；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００３．３２７：７６１−７６６；Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２００２，３２：１０７−１０８、およびＳｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ ２００３，３１，１１：２７１７−２７２４を参照されたい）。

薬学的に許容される担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバント、およびビヒクルならびにインプラント担体は、通常、本発明の有効成分と反応しない、不活性で、毒性のない固体または液体の充填剤、希釈剤、またはカプセル化材料を指し、これらは、リポソームおよびマイクロスフェアを含む。本発明において有用な送達系の例としては、米国特許第５，２２５，１８２号；同第５，１６９，３８３号；同第５，１６７，６１６号；同第４，９５９，２１７号；同第４，９２５，６７８号；同第４，４８７，６０３号；同第４，４８６，１９４号；同第４，４４７，２３３号；同第４，４４７，２２４号；同第４，４３９，１９６号；および同第４，４７５，１９６号が挙げられる。多くの他のそのようなインプラント、送達系、およびモジュールが当業者に周知である。

局所的な眼球送達または鼻腔内送達のための薬学的組成物を調製するときに考慮すべき事項の総説については、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｏｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ編，Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ １９９７の中のＢａｒ−Ｉｌａｎ ａｎｄ Ｎｅｕｍａｎｎに見出すことができる。

局所の投与経路は、好ましくは対象に有効投薬量の治療ｓｉＲＮＡ化合物を提供するために利用される。投薬形態としては、分散液、懸濁液、溶液、軟膏などを挙げることができる。特定の好ましい実施形態では、少なくとも１つのｓｉＲＮＡを含む本発明の薬学的組成物は、点眼薬として送達される。別の実施形態では、少なくとも１つのｓｉＲＮＡを含む本発明の薬学的組成物は、スプレーまたはミストとして送達される。例えば、米国特許第４，０５２，９８５号には、眼科用スプレーアプリケータが開示されている。

本発明の特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、例えば、直接的な接触によってまたは細胞、組織、もしくは細胞内液への拡散によって、局所的にその標的細胞に達する。本発明のｓｉＲＮＡまたは薬学的組成物は、個々の患者の臨床状態、治療される疾患、投与スケジュール、患者の年齢、性別、体重、および医師に知られた他の要因を考慮に入れて、適切な医療行為に従って投与および投薬される。

本明細書における目的のための「治療有効用量」は、したがって、当該技術分野で公知であるような検討事項によって決定される。用量は、疾患経過の改善、より速やかな回復、症状の改善、症状の消失、および当業者により適切な尺度として選択されるような他の指標を含むが、これらに限定されない、改善を達成するのに有効でなければならない。本発明のｓｉＲＮＡは、単回用量または複数回用量で投与することができる。

一般に、ヒトに対する化合物の活性用量は、単回用量または複数回用量レジメンの場合に１日当たり１回の用量または１日当たり２回もしくは３回もしくはそれより多くの回数のレジメンにおいて、１日当たり１ｎｇ／ｋｇ〜約２０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ化合物は、眼に局所適用するために点眼薬として処方され、組成物の容量で約５μｇ／μｌ〜約６０μｇ／μｌ、組成物の容量で約６．６μｇ／μｌ、組成物の容量で約２５μｇ／μｌ、組成物の容量で約３３．３μｇ／μｌ、組成物の容量で約５０μｇ／μｌを含む。

製剤のｐＨは、約ｐＨ５〜約ｐＨ８、または約ｐＨ５〜約ｐＨ７、または約ｐＨ５〜約ｐＨ６である。特定の実施形態では、ｐＨは、約Ｐｈ５．９、約ｐＨ６．１５、約ｐＨ６．２５、約ｐＨ６．３、約ｐＨ６．５、約ｐＨ７．２５である。本発明の化合物は、眼の表面に局所投与することができる。化合物は、好ましくは化合物としてまたは有効成分の薬学的に許容される塩として、薬学的に許容される担体、溶媒、希釈剤、賦形剤、アジュバントおよびまたはビヒクルと組み合わせて適用されることに留意すべきである。本明細書に開示されているように、好ましい送達方法は、眼科用組成物の眼への局所適用である。

液体形態を点滴薬またはスプレー用に調製してもよい。液体組成物としては、有機共溶媒を含むおよび含まない水性溶液、水性または油性懸濁液、食用油を含むエマルジョン、ならびに同様の薬学的ビヒクルが挙げられる。

これらの化合物を任意の好適な眼への投与経路によって、例えば、スプレーもしくは点滴薬によるものとして、および局所的に、軟膏、または点滴薬によるものとして、治療のためにヒトおよび動物に投与してもよい。

治療方法
一態様では、本発明は、対象の眼における表Ａ１〜Ａ４に記載の遺伝子の発現と関連する眼疾患または眼障害の治療を必要とする対象の治療のための方法であって、これらの遺伝子の少なくとも１つの発現を阻害する一定量の化学修飾ｓｉＲＮＡをこの対象に局所的にかつ非侵襲的に投与することを含む方法に関する。特定の好ましい実施形態では、１または２以上の遺伝子標的に対する２以上のｓｉＲＮＡ化合物を投与する。

好ましい実施形態では、治療される対象は温血動物、および特に、ヒトを含む哺乳動物である。

本発明の方法は、表Ａ１〜Ａ４の遺伝子の発現を下方調節する１以上の阻害性化合物；および特にそれにより対象を治療するための治療有効用量のｓｉＲＮＡを対象の眼に局所的にかつ非侵襲的に投与することを含む。

「治療」という用語は、治療的治療と予防的または防止的措置の両方を指し、この場合、その目的は、上記の関連眼障害を予防することまたは遅延させること、減弱させることである。治療を必要とする者としては、この疾患または状態を既に経験している者、この疾患または状態を有する傾向がある者、およびこの疾患または状態を予防すべき者が含まれる。本発明の化合物は、眼の疾患もしくは状態またはそれと関連する症状の発症前、発症中、または発症後に投与し得る。治療が予防を目的とする場合、本発明は、疾患または障害の発症を遅延させるまたは疾患または障害の進行を防ぐ方法に関する。

眼障害としては、急性帯状潜在性網膜外層症、アディー症候群、加齢黄斑変性症、弱視、無虹彩、瞳孔不同、無眼球体、無水晶体、眼瞼炎、眼瞼下垂、眼瞼痙攣、失明、白内障、霰粒腫、脈絡網膜炎、先天性脈絡膜欠如、欠損症、結膜疾患、結膜炎、角膜疾患、角膜変性症、角膜浮腫、角膜潰瘍、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、複視、二重睫毛、ドライアイ症候群、デュアン眼球後退症候群、眼瞼外反、眼内炎、内反、内斜視、落屑症候群、外斜視、眼異常、眼新生物、外眼筋線維化症候群、緑内障、脳回転状萎縮症、半盲、ヘルマンスキー−パドラック症候群、麦粒腫、ホルネル症候群、遠視、前房出血、虹彩炎、カーンズ−セイヤー症候群、角膜炎、円錐角膜、涙器疾患、涙道閉塞症、水晶体疾患、黄斑変性症、眼振、病的眼球運動障害、動眼神経疾患、眼筋麻痺、視神経萎縮症、遺伝性視神経疾患、視神経炎、虚血性視神経症、眼窩蜂巣炎、乳頭浮腫、老眼、翼状片、瞳孔障害、屈折異常、網膜剥離、網膜疾患、網膜静脈閉塞症、網膜芽細胞腫、網膜色素変性症、未熟網膜症、網膜分離症、強膜炎、暗点、斜視、シェーグレン症候群、タイゲソン表層点状角膜炎、トラコーマ、ブドウ膜炎が挙げられる。

オリゴヌクレオチド
本明細書に開示されている方法で有用なオリゴヌクレオチドは、好ましくは二本鎖オリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡ化合物であり、未修飾の化合物ならびに化学的におよび／または構造的に修飾された化合物を含む。

既知の遺伝子に対応するｓｉＲＮＡの選択と合成は広く報告されており；例えば、Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏ Ｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６；６５０５２；Ｃｈａｌｋ ｅｔ ａｌ．，ＢＢＲＣ．２００４，３１９（１）：２６４−７４；Ｓｉｏｕｄ & Ｌｅｉｒｄａｌ，Ｍｅｔ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００４，２５２：４５７−６９；Ｌｅｖｅｎｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．２００４，２０（３）：４３０−２；Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ．２００４，３２（３）：９３６−４８を参照されたい。修飾ｓｉＲＮＡの使用と製造の例については、例えば、Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００３，４２（２６）：７９６７−７５；Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ．２００３，９（９）：１０３４−４８；ＰＣＴ刊行物ＷＯ２００４／０１５１０７号およびＷＯ０２／４４３２１号ならびに米国特許第５，８９８，０３１号および同第６，１０７，０９４号を参照されたい。

本発明は、所望の遺伝子の発現を下方調節する、二本鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）を提供する。本発明のｓｉＲＮＡは、センス鎖が所望の遺伝子のｍＲＮＡ配列に由来し、かつアンチセンス鎖がこのセンス鎖に相補的である二重鎖オリゴリボヌクレオチドである。一般に、標的ｍＲＮＡ配列とのわずかな違いは、ｓｉＲＮＡ活性を損なうことなく許容される（例えば、Ｃｚａｕｄｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ．２００３，３１（１１）：２７０５−２７１６を参照されたい）。本発明のｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡを破壊してまたはｍＲＮＡを破壊することなく、転写後レベルで遺伝子発現を阻害する。理論に束縛されるわけではないが、ｓｉＲＮＡは、特異的な切断や分解のためにｍＲＮＡを標的とし得るおよび／または標的とされたメッセージからの翻訳を阻害し得る。

いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、平滑末端である、すなわち、ＺおよびＺ’が、一方または両方の末端に存在しない。特に、ｓｉＲＮＡは、第１の鎖の５’−末端および第２の鎖の３’−末端により規定される末端で、および／または第１の鎖の３’−末端および第２の鎖の５’−末端により規定される末端で、平滑末端であり得る。

他の実施形態では、２つの鎖のうちの少なくとも１つは、５’−末端に少なくとも１つのヌクレオチドの突出を有していてもよく；この突出は、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドからなっていてもよい。これらの鎖のうちの少なくとも１つはまた、３’−末端に少なくとも１つのヌクレオチドの突出を任意で有していてもよい。この突出は、約１〜約５ヌクレオチドからなっていてもよい。

ＲＮＡ二重鎖の長さは、約１８〜約４０リボヌクレオチド、好ましくは１９、２１、または２３リボヌクレオチドである。さらに、各々の鎖の長さは、約１５〜約４０塩基、好ましくは１８〜２３塩基、およびより好ましくは１９、２１、または２３リボヌクレオチドからなる群から選択される長さを独立に有していてもよい。いくつかの実施形態では、２０ｍｅｒまたは２２−ｍｅｒの分子が企図され得る。

特定の実施形態では、該第１の鎖と標的核酸の相補性は完全（１００％）である。いくつかの実施形態では、これらの鎖は、実質的に相補的である、すなわち、該第１の鎖と標的核酸の間に１個、２個、または最大３個のミスマッチがある。実質的に相補的とは、別の配列に対する、約８４％を超える相補性を指す。例えば、１９塩基対からなる二重鎖領域において、１個のミスマッチは、９４．７％の相補性をもたらし、２個のミスマッチは、約８９．５％の相補性をもたらし、３個のミスマッチは、約８４．２％の相補性をもたらし、この二重鎖領域を実質的に相補的であるようにする。したがって、実質的に同一とは、別の配列に対する、約８４％を超える同一性を指す。

第１の鎖と第２の鎖はループ構造によって連結されていてもよく、このループ構造は、特に、ポリエチレングリコールなどの非核酸ポリマーから構成されていてもよい。あるいは、このループ構造は、修飾および非修飾リボヌクレオチドならびに修飾および非修飾デオキシリボヌクレオチドをはじめとする、核酸から構成されていてもよい。

さらに、ｓｉＲＮＡの第１の鎖の５’−末端が第２の鎖の３’−末端に連結されていてもよく、または第１の鎖の３’−末端が第２の鎖の５’−末端に連結されていてもよく、該連結は、典型的には２〜１００ヌクレオ塩基、好ましくは約２〜約３０ヌクレオ塩基の長さを有する核酸リンカーを介するものである。

１９−ｍｅｒおよび２３−ｍｅｒのオリゴマーの場合、化合物のアンチセンス鎖およびセンス鎖の少なくとも１つに修飾された交互のリボヌクレオチドを有する本発明の化合物の好ましい実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端および３’末端のリボヌクレオチドは、それらの糖残基中で修飾されており、かつセンス鎖の５’末端および３’末端のリボヌクレオチドは、それらの糖残基中で修飾されていない。２１−ｍｅｒオリゴマーの場合、センス鎖の５’末端および３’末端のリボヌクレオチドは、それらの糖残基中で修飾されており、かつアンチセンス鎖の５’末端および３’末端のリボヌクレオチドは、それらの糖残基中で修飾されていないか、または３’末端に任意の追加の修飾を有していてもよい。上で述べたように、アンチセンス鎖の中央のヌクレオチドは修飾されていないことが好ましい。

さらに、本発明は、一方の鎖または両方の鎖の１個、２個、または３個のヌクレオチドが置換され、それにより少なくとも１つの塩基対ミスマッチがもたらされている二本鎖核酸分子を含むｓｉＲＮＡを提供する。各々の鎖における置換ヌクレオチドは、好ましくは一方の鎖または両方の鎖の末端領域にある。

本発明の好ましい一実施形態によれば、オリゴヌクレオチド／ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖およびセンス鎖は、３’−末端でのみリン酸化されており、５’−末端ではリン酸化されていない。本発明の別の好ましい実施形態によれば、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、リン酸化されていない。本発明のさらに別の好ましい実施形態によれば、センス鎖の最も５’のリボヌクレオチドは、インビボでの５’−リン酸化のいかなる可能性も排除するように修飾されている。

本明細書に開示されている任意のｓｉＲＮＡ配列は、本明細書に開示されている修飾／構造のいずれかを有して調製することができる。配列＋構造の組合せは新規であり、本明細書に開示されている状態の治療で使用することができる。

ｓｉＲＮＡ構造
既知の遺伝子に対応するｓｉＲＮＡの選択および合成は、広く報告されている；（例えば、 Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏ Ｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００６；２００６：６５０５２；Ｃｈａｌｋ ｅｔ ａｌ．，ＢＢＲＣ．２００４，３１９（１）：２６４−７４；Ｓｉｏｕｄ & Ｌｅｉｒｄａｌ，Ｍｅｔ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．；２００４，２５２：４５７−６９；Ｌｅｖｅｎｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．２００４，２０（３）：４３０−２；Ｕｉ−Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ．２００４，３２（３）：９３６−４８を参照されたい）。

修飾ｓｉＲＮＡの使用、および製造の例については、例えば、Ｂｒａａｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００３，４２（２６）：７９６７−７５；Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ，２００３，９（９）：１０３４−４８；ＰＣＴ刊行物ＷＯ２００４／０１５１０７号（ａｔｕｇｅｎ ＡＧ）およびＷＯ０２／４４３２１号（Ｔｕｓｃｈｌ ｅｔ ａｌ）を参照されたい。米国特許第５，８９８，０３１号および同第６，１０７，０９４号には、化学修飾オリゴマーが教示されている。米国特許公報第２００５／００８０２４６号と同第２００５／００４２６４７号は、それぞれ、交互のモチーフを有するオリゴマー化合物と化学修飾ヌクレオシド間連結を有するｄｓＲＮＡ化合物に関するものである。

他の修飾が開示されている。５’−ホスフェート部分の包含は、ショウジョウバエ胚におけるｓｉＲＮＡの活性を増強することが示され（Ｂｏｕｔｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．２００１，１１：１７７６−１７８０）、ヒトＨｅＬａ細胞におけるｓｉＲＮＡ機能に必要とされる（Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２００２，１０：５３７−４８）。Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ ｅｔ ａｌ．，（ＮＡＲ，２００３，３１（２）：５８９−９５）は、ｓｉＲＮＡ活性が２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）修飾の位置付けによって決まることを示した。Ｈｏｌｅｎ ｅｔ ａｌ（ＮＡＲ．２００３，３１（９）：２４０１−０７）は、少数の２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオシドを有するｓｉＲＮＡは野生型と比較して良好な活性を示すが、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオシドの数が増加するにつれて活性が低下することを報告した。Ｃｈｉｕ ａｎｄ Ｒａｎａ（ＲＮＡ．２００３，９：１０３４−４８）は、センス鎖またはアンチセンス鎖（完全に修飾された鎖）への２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオシドの組込みにより、未修飾ｓｉＲＮＡと比べてｓｉＲＮＡ活性が激しく低下したことを教示している。アンチセンス鎖の５’−末端における２’−ＯＭｅ基の配置が活性を激しく制限することが報告されたのに対し、アンチセンスの３’−末端およびセンス鎖の両方の末端における配置は許容された（Ｃｚａｕｄｅｒｎａ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ．２００３，３１（１１）：２７０５−１６；ＷＯ２００４／０１５１０７号）。本発明の分子は、毒性がなく、かつ様々な疾患の治療のための薬学的組成物として処方され得るという点で、利点がある。

ヌクレオチドは、天然塩基または合成修飾塩基から選択することができる。天然塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、およびウラシルが挙げられる。ヌクレオチドの修飾塩基としては、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル，２−プロピルおよび他のアルキルアデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザシトシンおよび６−アザチミン、疑似ウラシル、４−チオウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオールアデニン、８−チオールアルキルアデニン、８−ヒドロキシアデニンおよび他の８−置換アデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシグアニンおよび他の置換グアニン、他のアザアデニンおよびデアザアデニン、他のアザグアニンおよびデアザグアニン、５−トリフルオロメチルウラシル、ならびに５−トリフルオロシトシンが挙げられる。１以上の無塩基部分を含む分子（非従来型または疑似ヌクレオチド）は、ＲＮＡヌクレオチドとＤＮＡヌクレオチドを交互に含む分子と同様に、本発明により包含される。

さらに、１以上のヌクレオチドの構造が治療または実験用の試薬として根本的に改変されているかまたは該試薬としてより適しているポリヌクレオチドの類似体を調製することができる。ヌクレオチド類似体の一例は、ＤＮＡ（またはＲＮＡ）中のデオキシリボース（またはリボース）リン酸骨格がペプチド中に見られるものと類似したポリアミド骨格と置き換えられているペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ類似体は酵素分解に抵抗性があることや、インビボおよびインビトロでの寿命が長いことが示されている。

糖残基に対するあり得る修飾はマニホールドであり、これには、２’−Ｏアルキル、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、アラビノシド、アルトリトール（ＡＮＡ）およびモルホリノをはじめとする他の６員糖、ならびにシクロヘキシニルが含まれる。さらに、該分子は、２’アルキル、２’フルオロ、２’Ｏアリール、２’アミン、および２’アルコキシなどの、糖上の修飾をさらに含んでいてもよい。さらなる糖修飾が本明細書で論じられている。

ＬＮＡ化合物は、国際特許公報ＷＯ００／４７５９９号、ＷＯ９９／１４２２６号、およびＷＯ９８／３９３５２号に開示されている。ＬＮＡヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡ化合物の例は、Ｅｌｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，（ＮＡＲ ２００５．３３（１）：４３９−４４７）およびＰＣＴ特許公報ＷＯ２００４／０８３４３０号に開示されている。

本発明の化合物は、１以上の逆方向ヌクレオチド、例えば、逆方向チミジン、または逆方向アデニンを用いて合成することができる（例えば、Ｔａｋｅｉ，ｅｔ ａｌ．，２００２．ＪＢＣ ２７７（２６）：２３８００−０６を参照されたい）。

エチル（ホスホ−エチルトリエステルを生じさせる）；プロピル（ホスホ−プロピルトリエステルを生じさせる）；およびブチル（ホスホ−ブチルトリエステルを生じさせる）などの骨格修飾も可能である。他の骨格修飾としては、ポリマー骨格、環状骨格、非環状骨格、チオホスフェート−Ｄ−リボース骨格、アミデート、およびホスホノアセテート誘導体が挙げられる。特定の構造物としては、１つまたは複数の２’−５’ヌクレオチド間連結（架橋または骨格）を有するｓｉＲＮＡ化合物が挙げられる。

さらに、本発明の阻害性核酸分子は、１以上のギャップおよび／または１以上のニックおよび／または１以上のミスマッチを含んでいてもよい。理論に束縛されることを望まないが、ギャップ、ニック、およびミスマッチは、核酸／ｓｉＲＮＡが、ＤＩＣＥＲ、ＤＲＯＳＨＡ、またはＲＩＳＣなどの内在性の細胞機構によって、より容易にその阻害性成分へとプロセッシングされ得るように、核酸／ｓｉＲＮＡを部分的に不安定化する利点を有する。

本発明の分子は、このような分子または他の阻害性ヌクレオチド分子をコードする他の核酸配列または分子の他に、ｓｉＲＮＡ、合成ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、および合成ｓｈＲＮＡを含んでいてもよい。

本発明の化合物はさらに、末端修飾を含んでいてもよい。ビオチン基を、第１の鎖および／または第２の鎖の最も５’または最も３’のヌクレオチドあるいは両方の末端に付加してもよい。より好ましい実施形態では、ビオチン基をポリペプチドまたはタンパク質に結合させる。ポリペプチドまたはタンパク質を他の上記修飾のいずれかによって付加することも本発明の範囲内である。

本明細書に開示されている様々な末端修飾は、好ましくは本明細書に開示されている核酸のヌクレオチドのリボース部分にある。特に、末端修飾を、２’ＯＨ、３’ＯＨ、および５’ＯＨ位置を含むが、これらに限定されない、リボース部分のＯＨ−基のいずれかに付加し得るか、またはこれらの基のいずれかに置き換え得るが、このように修飾されたヌクレオチドが末端ヌクレオチドであることを条件とする。逆方向無塩基または無塩基であるのは、ヌクレオ塩基部分を有さないデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれかである。この種の化合物は、特に、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ，２００２．１２，１３１−４３）に記載されている。

本発明に関連して、核酸中のギャップは、一方の鎖において１以上の内部ヌクレオチドがないことを指すが、核酸中のニックは、一方の鎖において２つの隣接ヌクレオチド間のヌクレオチド間連結がないことを指す。本発明の分子はいずれも、１以上のギャップおよび／または１以上のニックを含み得る。本発明によってさらに提供されるのは、本明細書に開示された分子のいずれかによりコードされるｓｉＲＮＡ、本明細書に開示された分子のいずれかをコードするベクター、および本明細書に開示された分子またはそれをコードするベクターのいずれかと；薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物である。

本発明の方法によって投与される特定の分子が、以下で「構造モチーフ」という表題の下に開示されている。明確にするために、これらの分子のいずれかを、本発明の方法のいずれかによって投与することができる。

構造モチーフ
本明細書に開示されているように、以下の構造に示される以下の修飾のうちの１つによってまたはタンデムｓｉＲＮＡもしくはＲＮＡｓｔａｒ（下記参照）として化学的におよびまたは構造的に修飾されているｓｉＲＮＡ化合物が、本発明の方法において有用である。表１〜３６には、対応するｓｉＲＮＡ化合物を調製するときに有用な、配列番号５９〜３３５９６に示される、センスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド対が提供されている。

一態様では、本発明は、構造（Ａ）：
（Ａ） ５’ （Ｎ）_x−Ｚ ３’（アンチセンス鎖）
３’ Ｚ’−（Ｎ’）_ｙ ５’（センス鎖）
に示される化合物を提供し、
ここで、ＮおよびＮ’は各々、未修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、未修飾デオキシリボヌクレオチド、および修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
（Ｎ）_ｘおよび（Ｎ’）_ｙは各々、各々の連続するＮまたはＮ’が共有結合によって次のＮまたはＮ’に結合しているオリゴヌクレオチドであり；
ｘおよびｙは各々、１８〜４０の整数であり；
ＺおよびＺ’は各々、存在していても存在していなくてもよいが、存在する場合には、それが存在する鎖の３’末端で共有結合的に付加された１〜５個の連続するヌクレオチドであり；かつ
（Ｎ）_xの配列は、網膜で発現されかつ眼疾患または眼障害と関連する遺伝子のｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドに実質的に相補的なアンチセンス配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されている。

特定の実施形態では、本発明は、構造Ｂ
（Ｂ） ５’（Ｎ）ｘ ３’ アンチセンス鎖
３’（Ｎ’）ｙ ５’ センス鎖
を有する化合物を提供し、
ここで、（Ｎ）_ｘおよび（Ｎ’）_ｙは各々、各々の連続するＮまたはＮ’が共有結合によって次のＮまたはＮ’に結合している未修飾リボヌクレオチドまたは修飾リボヌクレオチドであるオリゴマーであり；
ｘおよびｙは各々、１９、２１、または２３であり、（Ｎ）_ｘおよび（Ｎ’）_ｙは完全に相補的であり
（Ｎ）_ｘおよび（Ｎ’）_ｙの各々における交互のリボヌクレオチドは、２’−ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含み；
（Ｎ’）_ｙの配列は、（Ｎ）ｘに相補的な配列であり；かつ（Ｎ）_ｘの配列は、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されるｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドに実質的に相補的なアンチセンス配列を含む。

いくつかの実施形態では、（Ｎ）_ｘおよび（Ｎ’）_ｙは各々、３’末端および５’末端で独立にリン酸化されているかまたはリン酸化されていない。

本発明の特定の実施形態では、交互のリボヌクレオチドは、化合物のアンチセンス鎖とセンス鎖の両方において修飾されている。

ｘおよびｙが各々、１９または２３である、特定の実施形態では、（Ｎ）_ｘの５’末端および３’末端にある各々のＮは修飾されており；かつ（Ｎ’）_ｙの５’末端および３’末端にある各々のＮ’は未修飾である。

ｘおよびｙが各々２１である、特定の実施形態では、（Ｎ）_ｘの５’末端および３’末端にある各々のＮは未修飾であり；かつ（Ｎ’）_ｙの５’末端および３’末端にある各々のＮ’ は修飾されている。

特定の実施形態では、ｘおよびｙが１９であるとき、ｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖（Ｎ）_ｘの１番目、３番目、５番目、７番目、９番目、１１番目、１３番目、１５番目、１７番目、および１９番目のヌクレオチド上の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと、センス鎖（Ｎ’）_ｙの２番目、４番目、６番目、８番目、１０番目、１２番目、１４番目、１６番目、および１８番目のヌクレオチド中の２’−ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドとからなる。様々な実施形態では、これらの特定のｓｉＲＮＡ化合物は両方の末端において平滑末端である。

いくつかの実施形態では、本発明は、構造（Ｃ）：
（Ｃ） ５’ （Ｎ）ｘ−Ｚ ３’ アンチセンス鎖
３’ Ｚ’−（Ｎ’）ｙ ５’ センス鎖
を有する化合物を提供し、
ここで、ＮおよびＮ’は各々、未修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、未修飾デオキシリボヌクレオチド、および修飾デオキシリボヌクレオチドから独立に選択されるヌクレオチドであり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは各々、各々の連続するヌクレオチドが共有結合によって次のヌクレオチドに結合し、かつｘおよびｙが各々、１８〜４０の整数であるオリゴマーであり；
（Ｎ）ｘにおいて、ヌクレオチドは未修飾であるか、または（Ｎ）ｘは交互の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドおよび未修飾リボヌクレオチドを含み；かつ（Ｎ）ｘの中央位置にあるリボヌクレオチドは、２’ＯＭｅ糖修飾されているかもしくは未修飾であり、好ましくは未修飾であり；
（Ｎ’）ｙは、未修飾リボヌクレオチドを含んで、末端位置または最後から２番目の位置に１個の修飾ヌクレオチドをさらに含み、ここで、この修飾ヌクレオチドは、ミラーヌクレオチド、二環状ヌクレオチド、２’−糖修飾ヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’ホスホジエステル結合、Ｐ−アルコキシ連結、もしくはＰＡＣＥ連結から選択されるヌクレオチド間連結によって隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドからなる群から選択され；
２以上のヌクレオチドが（Ｎ’）ｙ中で修飾されている場合、修飾ヌクレオチドは連続していてもよく；
ＺおよびＺ’は各々、存在していても存在していなくてもよいが、存在する場合には、それが付加されている任意のオリゴマーの３’末端で共有結合的に付加された１〜５個のデオキシリボヌクレオチドであり；
（Ｎ’）_ｙの配列は、（Ｎ）ｘに実質的に相補的な配列を含み；かつ（Ｎ）_ｘの配列は、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されるｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドに実質的に相補的なアンチセンス配列を含む。

特定の実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ）ｘにおいて、各々の修飾リボヌクレオチドは、２’−ＯＭｅ糖修飾であり、（Ｎ）ｘの中央にあるリボヌクレオチドは未修飾である。したがって、ｘ＝１９である化合物において、（Ｎ）ｘは、位置１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９に２’−Ｏ−メチル糖修飾リボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、および１９に２’−ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含み、かつ例えば、位置５に少なくとも１つの無塩基または逆方向無塩基疑似ヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、８、１１、１３、１５、１７、および１９に２’−ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、かつ例えば、位置６に少なくとも１つの無塩基または逆方向無塩基疑似ヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、８、１１、１３、１７、および１９に２’−ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、かつ例えば、位置１５に少なくとも１つの無塩基または逆方向無塩基疑似ヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、および１９に２’−ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、かつ例えば、位置１４に少なくとも１つの無塩基または逆方向無塩基疑似ヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置１、２、３、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９に２’−ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、かつ例えば、位置５に少なくとも１つの無塩基または逆方向無塩基疑似ヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置１、２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９に２’−ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、かつ例えば、位置６に少なくとも１つの無塩基または逆方向無塩基疑似ヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置１、２、３、５、７、９、１１、１３、１７、および１９に２’−ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、かつ例えば、位置１５に少なくとも１つの無塩基または逆方向無塩基疑似ヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置１、２、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９に２’−ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、かつ例えば、位置１４に少なくとも１つの無塩基または逆方向無塩基疑似ヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９に２’−ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、かつ例えば、位置５に少なくとも１つの無塩基または逆方向無塩基疑似ヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置１、２、４、６、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９に２’−ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、かつ例えば、位置５に少なくとも１つの無塩基または逆方向無塩基疑似ヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、８、１１、１３、１４、１６、１７、および１９に２’−ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、かつ例えば、位置１５に少なくとも１つの無塩基または逆方向無塩基疑似ヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置１、２、３、５、７、９、１１、１３、１４、１６、１７、および１９に２’−ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、かつ例えば、位置１５に少なくとも１つの無塩基または逆方向無塩基疑似ヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、および１９に２’−ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、かつ例えば、位置７に少なくとも１つの無塩基または逆方向無塩基疑似ヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、１１、１３、１５、１７、および１９に２’−ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、かつ例えば、位置８に少なくとも１つの無塩基または逆方向無塩基疑似ヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、および１９に２’−ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、かつ例えば、位置９に少なくとも１つの無塩基または逆方向無塩基疑似ヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、および１９に２’−ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、かつ例えば、位置１０に少なくとも１つの無塩基または逆方向無塩基疑似ヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、８、１３、１５、１７、および１９に２’−ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、かつ例えば、位置１１に少なくとも１つの無塩基または逆方向無塩基疑似ヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、および１９に２’−ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、かつ例えば、位置１２に少なくとも１つの無塩基または逆方向無塩基疑似ヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、８、１１、１５、１７、および１９に２’−ＯＭｅ修飾リボヌクレオチドを含み、かつ例えば、位置１３に少なくとも１つの無塩基または逆方向無塩基疑似ヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。

さらに他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、標的遺伝子と比べて少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む。特定の好ましい実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置５、６、または１４に単一のヌクレオチドミスマッチを含む。構造（Ｃ）の一実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端および３’末端のどちらかまたは両方の少なくとも２つのヌクレオチドは、２’−５’ホスホジエステル結合により結合されている。特定の好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２３であり；（Ｎ）ｘにおいて、ヌクレオチドは、２’−ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと未修飾リボヌクレオチドを交互に繰り返し、（Ｎ）ｘの中央にあるリボヌクレオチドは未修飾であり；かつ（Ｎ’）ｙの３’末端の３つのヌクレオチドは、２つの２’−５’ホスホジエステル結合により結合されている（本明細書において構造Ｉとして示されている）。他の好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２３であり；（Ｎ）ｘにおいて、ヌクレオチドは、２’−ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと未修飾リボヌクレオチドを交互に繰り返し、（Ｎ）ｘの中央にあるリボヌクレオチドは未修飾であり；かつ（Ｎ’）ｙの５’末端の４個の連続するヌクレオチドは、３つの２’−５’ホスホジエステル結合により結合されている。さらなる実施形態では、（Ｎ）ｙの中央位置にある追加のヌクレオチドは、２’−ＯＭｅ糖修飾されている。別の好ましい実施形態では、（Ｎ）ｘにおいて、ヌクレオチドは、２’−ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドと未修飾リボヌクレオチドを交互に繰り返し、かつ（Ｎ’）ｙにおいて、５’末端の４個の連続するヌクレオチドは、３つの２’−５’ホスホジエステル結合により結合され、５’末端ヌクレオチドまたは５’末端の２個もしくは３個の連続するヌクレオチドは、３’−Ｏ−メチル（３’−ＯＭｅ）修飾を含む。

構造Ｃの特定の好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙにおいて、少なくとも１つの位置が無塩基または逆方向無塩基疑似ヌクレオチドを含み、好ましくは５つの位置が無塩基または逆方向無塩基疑似ヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、以下の位置が無塩基または逆方向無塩基を含む：位置１と１６〜１９、位置１５〜１９、位置１〜２と１７〜１９、位置１〜３と１８〜１９、位置１〜４と１９、および位置１〜５。（Ｎ’）ｙは、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。

構造Ｃの特定の好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙにおいて、少なくとも１つの位置のヌクレオチドが、ミラーヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、および２’−５’ヌクレオチド間結合によって隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドを含む。

構造Ｃの特定の好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、かつ（Ｎ’）ｙはミラーヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、ミラーヌクレオチドはＬ−ＤＮＡヌクレオチドである。特定の実施形態では、Ｌ−ＤＮＡはＬ−デオキシリボシチジンである。いくつかの実施形態では、（Ｎ’）ｙは、位置１８にＬ−ＤＮＡを含む。他の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、位置１７および１８にＬ−ＤＮＡを含む。特定の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、位置２におよび位置１７と１８の一方または両方にＬ−ＤＮＡ置換を含む。特定の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、５’−Ｏ−メチルＤＮＡなどの５’末端キャップヌクレオチドまたは無塩基もしくは逆方向無塩基疑似ヌクレオチドを突出としてさらに含む。

さらに他の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、標的遺伝子と比べて少なくとも１つのヌクレオチドミスマッチを含む。特定の好ましい実施形態では、（Ｎ’）ｙは、位置６、１４、または１５に単一のヌクレオチドミスマッチを含む。

さらに他の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、位置１５のＤＮＡと、位置１７と１８の一方または両方にあるＬ−ＤＮＡとを含む。その構造において、位置２は、Ｌ−ＤＮＡまたは無塩基疑似ヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。

ｘ＝ｙ＝２１またはｘ＝ｙ＝２３である構造Ｃの他の実施形態が想定され：これらの実施形態では、上で論じられている（Ｎ’）ｙに対する修飾は、位置１５、１６、１７、１８にある代わりに、２１ｍｅｒの場合、位置１７、１８、１９、２０にあり、２３ｍｅｒの場合、位置１９、２０、２１、２２にあり；同様に、位置１７と１８の一方または両方にある修飾は、２１ｍｅｒの場合、位置１９または２０の一方または両方にあり、２３ｍｅｒの場合、位置２１と２２の一方または両方にある。１９ｍｅｒ中の修飾は全て、２１ｍｅｒおよび２３ｍｅｒに対して同様に調整される。

構造（Ｃ）の様々な実施形態によれば、（Ｎ’）ｙにおいて、３’末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するリボヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間連結により結合されている。好ましい一実施形態では、（Ｎ’）ｙの３’末端の４個の連続するヌクレオチドは、３つの２’−５’ホスホジエステル結合により結合され、ここで、２’−５’ホスホジエステル結合を形成する１以上の２’−５’ヌクレオチドは、３’−Ｏ−メチル糖修飾をさらに含む。好ましくは、（Ｎ’）ｙの３’末端ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル糖修飾を含む。構造Ｃの特定の好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり、（Ｎ’）ｙにおいて、位置１５、１６、１７、１８、および１９の２以上の連続するヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、２’−５’ヌクレオチド間結合を形成するヌクレオチドは、３’デオキシリボースヌクレオチドまたは３’メトキシヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、（Ｎ’）ｙ中の位置１７および１８のヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合により結合されている。他の実施形態では、（Ｎ’）ｙ中の位置１６、１７、１８、１６〜１７、１７〜１８、または１６〜１８のヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間結合により結合されている。

特定の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、位置２のＬ−ＤＮＡと、位置１６、１７、１８、１６〜１７、１７〜１８、または１６〜１８の２’−５’ヌクレオチド間結合とを含む。特定の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、位置１６、１７、１８、１６〜１７、１７〜１８、または１６〜１８の２’−５’ヌクレオチド間結合と、５’末端キャップヌクレオチドとを含む。

構造（Ｃ）の様々な実施形態によれば、（Ｎ’）ｙにおいて、いずれかの末端にある２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するヌクレオチドまたは５’末端および３’末端の各々にある２〜８個の修飾ヌクレオチドは、独立に、ミラーヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ミラーヌクレオチドはＬ−リボヌクレオチドである。他の実施形態では、ミラーヌクレオチドはＬ−デオキシリボヌクレオチドである。ミラーヌクレオチドは、糖部分もしくは塩基部分でまたはヌクレオチド間連結においてさらに修飾されていてもよい。

構造（Ｃ）の好ましい一実施形態では、（Ｎ’）ｙの３’末端ヌクレオチドまたは３’末端の２個もしくは３個の連続するヌクレオチドは、Ｌ−デオキシリボヌクレオチドである。

構造（Ｃ）の他の実施形態では、（Ｎ’）ｙにおいて、いずれかの末端にある２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するリボヌクレオチドまたは５’末端および３’末端の各々にある２〜８個の修飾ヌクレオチドは、独立に、２’糖修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、２’糖修飾は、アミノ、フルオロ、アルコキシ、またはアルキル部分の存在を含む。特定の実施形態では、２’糖修飾は、メトキシ部分（２’−ＯＭｅ）を含む。

一連の好ましい実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の３、４、または５個の連続するヌクレオチドは、２’−ＯＭｅ修飾を含む。別の好ましい実施形態では、（Ｎ’）ｙの３’末端の３個の連続するヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾を含む。

構造（Ｃ）のいくつかの実施形態では、（Ｎ’）ｙにおいて、いずれかにある２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するリボヌクレオチドまたは５’末端および３’末端の各々にある２〜８個の修飾ヌクレオチドは、独立に、二環状ヌクレオチドである。様々な実施形態では、二環状ヌクレオチドはロックされた核酸（ＬＮＡ）である。２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−架橋核酸（ＥＮＡ）はＬＮＡの一種である（以下を参照）。

様々な実施形態では、（Ｎ’）ｙは、５’末端にまたは３’末端と５’末端の両方に修飾ヌクレオチドを含む。

構造（Ｃ）のいくつかの実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端および３’末端のどちらかまたは両方の少なくとも２個のヌクレオチドは、Ｐ−エトキシ骨格修飾により結合されている。特定の好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２３であり；（Ｎ）ｘにおいて、ヌクレオチドは、修飾リボヌクレオチドと未修飾リボヌクレオチドを交互に繰り返し、各々の修飾リボヌクレオチドは、その糖の上に２’−Ｏ−メチルを有するよう修飾され、（Ｎ）ｘの中央部分にあるリボヌクレオチドは未修飾であり；かつ（Ｎ’）ｙの３’末端または５’末端の４個の連続するヌクレオチドは、３つのＰ−エトキシ骨格修飾により結合されている。別の好ましい実施形態では、（Ｎ’）ｙの３’末端または５’末端の３個の連続するヌクレオチドは、２つのＰ−エトキシ骨格修飾により結合されている。

構造（Ｃ）のいくつかの実施形態では、（Ｎ’）ｙにおいて、５’末端および３’末端の各々にある２、３、４、５、６、７、または８個の連続するリボヌクレオチドは、独立に、ミラーヌクレオチド、２’−５’ホスホジエステル結合により結合したヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、または二環状ヌクレオチドである。一実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端および３’末端の修飾は同一である。好ましい一実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の４個の連続するヌクレオチドは、３つの２’−５’ホスホジエステル結合により結合されており、かつ（Ｎ’）ｙの３’末端の３個の連続するヌクレオチドは、２つの２’−５’ホスホジエステル結合により結合されている。別の実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の修飾は、（Ｎ’）ｙの３’末端の修飾と異なっている。特定の一実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の修飾ヌクレオチドはミラーヌクレオチドであり、かつ（Ｎ’）ｙの３’末端の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ホスホジエステル結合により結合されている。別の特定の実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の３個の連続するヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドであり、かつ（Ｎ’）ｙの３’末端の３個の連続するヌクレオチドは、２つの２’−５’ホスホジエステル結合により結合されている。（Ｎ）ｘにおいて、ヌクレオチドは、修飾リボヌクレオチドと未修飾リボヌクレオチドを交互に繰り返し、各々の修飾リボヌクレオチドはその糖の上に２’−Ｏ−メチルを有するよう修飾され、かつ（Ｎ）ｘの中央にあるリボヌクレオチドは未修飾であるか、または（Ｎ）ｘ中のリボヌクレオチドは未修飾である。

構造（Ｃ）の別の実施形態では、本発明は、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２３であり；（Ｎ）ｘにおいて、ヌクレオチドが、修飾リボヌクレオチドと未修飾リボヌクレオチドを交互に繰り返し、各々の修飾リボヌクレオチドがその糖の上に２’−Ｏ−メチルを有するよう修飾され、かつ（Ｎ）ｘの中央にあるリボヌクレオチドが未修飾であり；（Ｎ’）ｙの３’末端の３個のヌクレオチドが、２つの２’−５’ホスホジエステル結合により結合されており、かつ（Ｎ’）ｙの５’末端の３個のヌクレオチドがＥＮＡなどのＬＮＡである、化合物を提供する。

構造（Ｃ）の別の実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の５個の連続するヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル糖修飾を含み、かつ（Ｎ’）ｙの３’末端の２個の連続するヌクレオチドはＬ−ＤＮＡである。

さらに別の実施形態では、本発明は、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２３であり；（Ｎ）ｘが未修飾リボヌクレオチドからなり；（Ｎ’）ｙの３’末端の３個の連続するヌクレオチドが、２つの２’−５’ホスホジエステル結合により結合されており、かつ（Ｎ’）ｙの５’末端の３個の連続するヌクレオチドが、ＥＮＡなどのＬＮＡである、 化合物を提供する。

構造（Ｃ）の他の実施形態によれば、（Ｎ’）ｙにおいて、５’末端もしくは３’末端ヌクレオチド、またはどちらかの末端にある２、３、４、５、もしくは６個の連続するヌクレオチド、または５’末端および３’末端の各々にある１〜４個の修飾ヌクレオチドは、独立に、ホスホノカルボキシレートまたはホスフィノカルボキシレートヌクレオチド（ＰＡＣＥヌクレオチド）である。いくつかの実施形態では、ＰＡＣＥヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。いくつかの好ましい実施形態では、（Ｎ’）ｙにおいて、５’末端および３’末端の各々にある１または２個の連続するヌクレオチドは、ＰＡＣＥヌクレオチドである。ＰＡＣＥヌクレオチドおよび類似体の例は、米国特許第６，６９３，１８７号および同第７，０６７，６４１号に開示されており、両方とも参照により組み込まれる。

追加の実施形態では、本発明は、構造（Ｄ）：
（Ｄ） ５’ （Ｎ）ｘ−Ｚ ３’ アンチセンス鎖
３’ Ｚ’−（Ｎ’）ｙ ５’ センス鎖
を有する化合物を提供し、
ここで、ＮおよびＮ’は各々、未修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、未修飾デオキシリボヌクレオチド、または修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは各々、各々の連続するヌクレオチドが共有結合によって次のヌクレオチドに結合し、かつｘおよびｙが各々、１８〜４０の整数であるオリゴマーであり；
（Ｎ）ｘは、未修飾リボヌクレオチドを含んで、３’末端位置または３’の最後から２番目の位置に１個の修飾ヌクレオチドをさらに含み、ここで、この修飾ヌクレオチドは、二環状ヌクレオチド、２’−糖修飾ヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’ホスホジエステル結合、Ｐ−アルコキシ連結、もしくはＰＡＣＥ連結から選択されるヌクレオチド間連結によって隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドからなる群から選択され；
（Ｎ’）ｙは、未修飾リボヌクレオチドを含んで、５’末端位置または５’の最後から２番目の位置に１個の修飾ヌクレオチドをさらに含み、ここで、この修飾ヌクレオチドは、二環状ヌクレオチド、２’−糖修飾ヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’ホスホジエステル結合、Ｐ−アルコキシ連結、もしくはＰＡＣＥ連結から選択されるヌクレオチド間連結によって隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドからなる群から選択され；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの各々において、修飾ヌクレオチドと未修飾ヌクレオチドは交互になっておらず；
ＺおよびＺ’は各々、存在していても存在していなくてもよいが、存在する場合には、それが付加されている任意のオリゴマーの３’末端で共有結合的に付加された１〜５個のデオキシリボヌクレオチドであり；
（Ｎ’）_ｙの配列は、（Ｎ）ｘに実質的に相補的な配列であり；かつ
（Ｎ）_ｘの配列は、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されるｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドに対する実質的な相補性を有するアンチセンス配列を含む。

構造（Ｄ）の一実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２３であり；（Ｎ）ｘは、２個の連続するヌクレオチドが３’末端の１つの２’−５’ヌクレオチド間連結により結合されている未修飾リボヌクレオチドを含み；かつ（Ｎ’）ｙは、２個の連続するヌクレオチドが５’末端の１つの２’−５’ヌクレオチド間連結により結合されている未修飾リボヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２３であり；（Ｎ）ｘは、３’末端の３個の連続するヌクレオチドが２つの２’−５’ホスホジエステル結合により結合されている未修飾リボヌクレオチドを含み；かつ（Ｎ’）ｙは、５’末端の４個の連続するヌクレオチドが３つの２’−５’ホスホジエステル結合により結合されている未修飾リボヌクレオチドを含む（本明細書において構造ＩＩとして示されている）。

構造（Ｄ）の様々な実施形態によれば、（Ｎ）ｘの３’末端の最後または最後から２番目の位置から始まる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するリボヌクレオチドおよび（Ｎ’）ｙの５’末端の最後または最後から２番目の位置から始まる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するリボヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間連結により結合されている。

構造（Ｄ）の好ましい一実施形態によれば、（Ｎ’）ｙの５’末端の４個の連続するヌクレオチドは、３つの２’−５’ホスホジエステル結合により結合されており、かつ（Ｎ’）ｘの３’末端の３個の連続するヌクレオチドは、２つの２’−５’ホスホジエステル結合により結合されている。（Ｎ’）ｙの５’末端の３個のヌクレオチドおよび（Ｎ’）ｘの３’末端の２個のヌクレオチドはまた、３’−Ｏ−メチル修飾を含んでいてもよい。

構造（Ｄ）の様々な実施形態によれば、（Ｎ）ｘの３’末端の最後または最後から２番目の位置から始まる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するヌクレオチドおよび（Ｎ’）ｙの５’末端の最後または最後から２番目の位置から始まる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するリボヌクレオチドは、独立に、ミラーヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ミラーはＬ−リボヌクレオチドである。他の実施形態では、ミラーヌクレオチドはＬ−デオキシリボヌクレオチドである。

構造（Ｄ）の他の実施形態では、（Ｎ）ｘの３’末端の最後または最後から２番目の位置から始まる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するリボヌクレオチドおよび（Ｎ’）ｙの５’末端の最後または最後から２番目の位置から始まる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するリボヌクレオチドは、独立に、２’糖修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、２’糖修飾は、アミノ、フルオロ、アルコキシ、またはアルキル部分の存在を含む。特定の実施形態では、２’糖修飾はメトキシ部分（２’−ＯＭｅ）を含む。

構造（Ｄ）の好ましい一実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の５個の連続するヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾を含み、かつ（Ｎ’）ｘの３’末端の５個の連続するヌクレオチド は２’−Ｏ−メチル修飾を含む。構造（Ｄ）の別の好ましい実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の１０個の連続するヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾を含み、かつ（Ｎ’）ｘの３’末端の５個の連続するヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾を含む。構造（Ｄ）の別の好ましい実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の１３個の連続するヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾を含み、かつ（Ｎ’）ｘの３’末端の５個の連続するヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾を含む。

構造（Ｄ）のいくつかの実施形態では、（Ｎ’）ｙにおいて、（Ｎ）ｘの３’末端の最後または最後から２番目の位置から始まる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するリボヌクレオチドおよび（Ｎ’）ｙの５’末端の最後または最後から２番目の位置から始まる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するリボヌクレオチドは、独立に、二環状ヌクレオチドである。様々な実施形態では、二環状ヌクレオチドは、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−架橋核酸（ＥＮＡ）などのロックされた核酸（ＬＮＡ）である。

構造（Ｄ）の様々な実施形態では、（Ｎ’）ｙは、二環状ヌクレオチド、２’−糖修飾ヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’ホスホジエステル結合、Ｐ−アルコキシ連結、もしくはＰＡＣＥ連結から選択されるヌクレオチド間連結によって隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドからなる群から選択される修飾ヌクレオチドを含む。

構造（Ｄ）の様々な実施形態では、（Ｎ）ｘは、二環状ヌクレオチド、２’−糖修飾ヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’ホスホジエステル結合、Ｐ−アルコキシ連結、もしくはＰＡＣＥ連結から選択されるヌクレオチド間連結によって隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドからなる群から選択される修飾ヌクレオチドを含む。

同じ鎖の３’末端および５’末端の各々が修飾ヌクレオチドを含む実施形態では、５’末端および３’末端の修飾は同一である。別の実施形態では、５’末端の修飾は、同じ鎖の３’末端の修飾と異なっている。特定の一実施形態では、５’末端の修飾ヌクレオチドはミラーヌクレオチドであり、かつ同じ鎖の３’末端の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ホスホジエステル結合により結合されている。

構造（Ｄ）の特定の一実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の５個の連続するヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾を含み、かつ（Ｎ’）ｙの３’末端の２個の連続するヌクレオチドはＬ−ＤＮＡである。さらに、化合物は、（Ｎ’）ｘの３’末端に５個の連続する２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。

構造（Ｄ）の様々な実施形態では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドと異なっている。例えば、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは２’糖修飾ヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間連結により結合されたヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドはミラーヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間連結により結合されたヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間連結により結合されたヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドはミラーヌクレオチドである。

追加の実施形態では、本発明は、構造（Ｅ）：
（Ｅ） ５’ （Ｎ）ｘ−Ｚ ３’ アンチセンス鎖
３’ Ｚ’−（Ｎ’）ｙ ５’ センス鎖
を有する化合物を提供し、
ここで、ＮおよびＮ’は各々、未修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、未修飾デオキシリボヌクレオチド、または修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは各々、各々の連続するヌクレオチドが共有結合によって次のヌクレオチドに結合し、かつｘおよびｙが各々、１８〜４０の整数であるオリゴマーであり；
（Ｎ）ｘは、未修飾リボヌクレオチドを含んで、５’末端位置または５’の最後から２番目の位置に１個の修飾ヌクレオチドをさらに含み、ここで、この修飾ヌクレオチドは、二環状ヌクレオチド、２’−糖修飾ヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’ホスホジエステル結合、Ｐ−アルコキシ連結、もしくはＰＡＣＥ連結から選択されるヌクレオチド間連結によって隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドからなる群から選択され；
（Ｎ’）ｙは、未修飾リボヌクレオチドを含んで、３’末端位置または３’の最後から２番目の位置に１個の修飾ヌクレオチドをさらに含み、ここで、この修飾ヌクレオチドは、二環状ヌクレオチド、２’−糖修飾ヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’ホスホジエステル結合、Ｐ−アルコキシ連結、もしくはＰＡＣＥ連結から選択されるヌクレオチド間連結によって隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドからなる群から選択され；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの各々において、修飾ヌクレオチドと未修飾ヌクレオチドは交互になっておらず；
ＺおよびＺ’は各々、存在していても存在していなくてもよいが、存在する場合には、それが付加されている任意のオリゴマーの３’末端で共有結合的に付加された１〜５個のデオキシリボヌクレオチドであり；
（Ｎ’）_ｙの配列は、（Ｎ）ｘに実質的に相補的な配列であり；かつ
（Ｎ）_ｘの配列は、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されるｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドに対する実質的な相補性を有するアンチセンス配列を含む。

特定の好ましい実施形態では、（Ｎ）ｘの５’末端の最後のヌクレオチドは未修飾である。

構造（Ｅ）の様々な実施形態によれば、（Ｎ）ｘの５’末端の最後または最後から２番目の位置から始まる、好ましくは５’の最後から２番目の位置から始まる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するリボヌクレオチド、および（Ｎ’）ｙの３’末端の最後または最後から２番目の位置から始まる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するリボヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間連結により結合されている。

構造（Ｅ）の様々な実施形態によれば、（Ｎ）ｘの５’末端の最後または最後から２番目の位置から始まる、好ましくは５’の最後から２番目の位置から始まる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するリボヌクレオチド、および（Ｎ’）ｙの３’末端の最後または最後から２番目の位置から始まる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するリボヌクレオチドは、独立に、ミラーヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ミラーはＬ−リボヌクレオチドである。他の実施形態では、ミラーヌクレオチドはＬ−デオキシリボヌクレオチドである。

構造（Ｅ）の他の実施形態では、（Ｎ）ｘの５’末端の最後または最後から２番目の位置から始まる、好ましくは５’の最後から２番目の位置から始まる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するリボヌクレオチド、および（Ｎ’）ｙの３’末端の最後または最後から２番目の位置から始まる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するリボヌクレオチドは、独立に、２’糖修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、２’糖修飾は、アミノ、フルオロ、アルコキシ、またはアルキル部分の存在を含む。特定の実施形態では、２’糖修飾はメトキシ部分（２’−ＯＭｅ）を含む。

構造（Ｅ）のいくつかの実施形態では、（Ｎ’）ｙにおいて、（Ｎ）ｘの５’末端の最後または最後から２番目の位置から始まる、好ましくは５’の最後から２番目の位置から始まる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するリボヌクレオチド、および（Ｎ’）ｙの３’末端の最後または最後から２番目の位置から始まる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するリボヌクレオチドは、独立に、二環状ヌクレオチドである。様々な実施形態では、二環状ヌクレオチドは、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−架橋核酸（ＥＮＡ）などのロックされた核酸（ＬＮＡ）である。

構造（Ｅ）の様々な実施形態では、（Ｎ’）ｙは、３’末端にまたは３’末端および５’末端の各々に二環状ヌクレオチド、２’−糖修飾ヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、Ｐ−アルコキシ骨格修飾によって隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチド、または２’−５’ホスホジエステル結合、Ｐ−アルコキシ連結、もしくはＰＡＣＥ連結から選択されるヌクレオチド間連結によって隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを含む。

構造（Ｅ）の様々な実施形態では、（Ｎ）ｘは、５’末端にまたは３’末端および５’末端の各々に二環状ヌクレオチド、２’−糖修飾ヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’ホスホジエステル結合、Ｐ−アルコキシ連結、もしくはＰＡＣＥ連結から選択されるヌクレオチド間連結によって隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを含む。

同じ鎖の３’末端と５’末端の両方が修飾ヌクレオチドを含む一実施形態では、５’末端および３’末端の修飾は同一である。別の実施形態では、５’末端の修飾は、同じ鎖の３’末端の修飾と異なっている。特定の一実施形態では、５’末端の修飾ヌクレオチドはミラーヌクレオチドであり、かつ同じ鎖の３’末端の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ホスホジエステル結合により結合されている。

構造（Ｅ）の様々な実施形態では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドと異なっている。例えば、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは２’糖修飾ヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間連結により結合されたヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドはミラーヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間連結により結合されたヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間連結により結合されたヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドはミラーヌクレオチドである。

追加の実施形態では、本発明は、構造（Ｆ）：
（Ｆ） ５’ （Ｎ）ｘ−Ｚ ３’ アンチセンス鎖
３’ Ｚ’−（Ｎ’）ｙ ５’ センス鎖
を有する化合物を提供し、
ここで、ＮおよびＮ’は各々、未修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、未修飾デオキシリボヌクレオチド、または修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは各々、各々の連続するヌクレオチドが共有結合によって次のヌクレオチドに結合し、かつｘおよびｙが各々、１８〜４０の整数であるオリゴマーであり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは各々、未修飾リボヌクレオチドを含んで、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの各々が独立に３’末端または３’の最後から２番目の位置に１個の修飾ヌクレオチドを含み、ここで、この修飾ヌクレオチドは、二環状ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、Ｐ−アルコキシ骨格修飾によって隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチド、または２’−５’ホスホジエステル結合によって隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドから選択され；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの各々において、修飾ヌクレオチドと未修飾ヌクレオチドは交互になっておらず；
ＺおよびＺ’は各々、存在していても存在していなくてもよいが、存在する場合には、それが付加されている任意のオリゴマーの３’末端で共有結合的に付加された１〜５個のデオキシリボヌクレオチドであり；
（Ｎ’）_ｙの配列は、（Ｎ）ｘに実質的に相補的な配列であり；かつ
（Ｎ）_ｘの配列は、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されるｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドに対する実質的な相補性を有するアンチセンス配列を含む。

構造（Ｆ）のいくつかの実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９またはｘ＝ｙ＝２３であり；（Ｎ’）ｙは、未修飾リボヌクレオチドを含んで、３’末端の２個の連続するヌクレオチドが２個の連続するミラーデオキシリボヌクレオチドを含み；かつ（Ｎ）ｘは、未修飾リボヌクレオチドを含んで、３’末端の１個のヌクレオチドがミラーデオキシリボヌクレオチドを含む（構造ＩＩＩに示されている）。

構造（Ｆ）の様々な実施形態によれば、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの３’末端の最後または最後から２番目の位置から独立に始まる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するリボヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間連結により結合されている。

構造（Ｆ）の好ましい一実施形態によれば、（Ｎ’）ｙの３’末端の３個の連続するヌクレオチドは、２つの２’−５’ホスホジエステル結合により結合されており、かつ（Ｎ’）ｘの３’末端の３個の連続するヌクレオチドは、２つの２’−５’ホスホジエステル結合により結合されている。

構造（Ｆ）の様々な実施形態によれば、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの３’末端の最後または最後から２番目の位置から独立に始まる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するヌクレオチドは、独立に、ミラーヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ミラーヌクレオチドはＬ−リボヌクレオチドである。他の実施形態では、ミラーヌクレオチドはＬ−デオキシリボヌクレオチドである。

構造（Ｆ）の他の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの３’末端の最後または最後から２番目の位置から独立に始まる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するリボヌクレオチドは、独立に、２’糖修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、２’糖修飾は、アミノ、フルオロ、アルコキシ、またはアルキル部分の存在を含む。特定の実施形態では、２’糖修飾はメトキシ部分（２’−ＯＭｅ）を含む。

構造（Ｆ）のいくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの３’末端の最後または最後から２番目の位置から独立に始まる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するリボヌクレオチドは、独立に、二環状ヌクレオチドである。様々な実施形態では、二環状ヌクレオチドは、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−架橋核酸（ＥＮＡ）などのロックされた核酸（ＬＮＡ）である。

構造（Ｆ）の様々な実施形態では、（Ｎ’）ｙは、３’末端にまたは３’末端と５’末端の両方に二環状ヌクレオチド、２’−糖修飾ヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’ホスホジエステル結合、Ｐ−アルコキシ連結、もしくはＰＡＣＥ連結から選択されるヌクレオチド間連結によって隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを含む。

構造（Ｆ）の様々な実施形態では、（Ｎ）ｘは、３’末端にまたは３’末端および５’末端の各々に二環状ヌクレオチド、２’−糖修飾ヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’ホスホジエステル結合、Ｐ−アルコキシ連結、もしくはＰＡＣＥ連結から選択されるヌクレオチド間連結によって隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを含む。

同じ鎖の３’末端と５’末端の各々が修飾ヌクレオチドを含む一実施形態では、５’末端および３’末端の修飾は同一である。別の実施形態では、５’末端の修飾は、同じ鎖の３’末端の修飾と異なっている。特定の一実施形態では、５’末端の修飾ヌクレオチドはミラーヌクレオチドであり、かつ同じ鎖の３’末端の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ホスホジエステル結合により結合されている。

構造（Ｆ）の様々な実施形態では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドと異なっている。例えば、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは２’糖修飾ヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間連結により結合されたヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドはミラーヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間連結により結合されたヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間連結により結合されたヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドはミラーヌクレオチドである。

追加の実施形態では、本発明は、構造（Ｇ）：
（Ｇ） ５’ （Ｎ）ｘ−Ｚ ３’ アンチセンス鎖
３’ Ｚ’−（Ｎ’）ｙ ５’ センス鎖
を有する化合物を提供し、
ここで、ＮおよびＮ’は各々、未修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、未修飾デオキシリボヌクレオチド、または修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは各々、各々の連続するヌクレオチドが共有結合によって次のヌクレオチドに結合し、かつｘおよびｙが各々、１８〜４０の整数であるオリゴマーであり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは各々、未修飾リボヌクレオチドを含んで、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの各々が、５’末端位置または５’の最後から２番目の位置に１個の修飾ヌクレオチドを独立に含み、ここで、この修飾ヌクレオチドは、二環状ヌクレオチド、２’糖修飾ヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、Ｐ−アルコキシ骨格修飾によって隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチド、または２’−５’ホスホジエステル結合によって隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドから選択され；
（Ｎ）ｘについて、修飾ヌクレオチドは、好ましくは５’末端の最後から２番目の位置にあり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの各々において、修飾ヌクレオチドと未修飾ヌクレオチドは交互になっておらず；
ＺおよびＺ’は各々、存在していても存在していなくてもよいが、存在する場合には、それが付加されている任意のオリゴマーの３’末端で共有結合的に付加された１〜５個のデオキシリボヌクレオチドであり；
（Ｎ’）_ｙの配列は、（Ｎ）ｘに実質的に相補的な配列であり；かつ
（Ｎ）_ｘの配列は、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されるｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドに対する実質的な相補性を有するアンチセンス配列を含む。

構造（Ｇ）のいくつかの実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９である。

構造（Ｇ）の様々な実施形態によれば、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの５’末端の最後または最後から２番目の位置から独立に始まる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するリボヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間連結により結合されている。（Ｎ）ｘについて、修飾ヌクレオチドは、好ましくは５’末端の最後から２番目の位置から始まる。

構造（Ｇ）の様々な実施形態によれば、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの５’末端の最後または最後から２番目の位置から独立に始まる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するヌクレオチドは、独立に、ミラーヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ミラーヌクレオチドはＬ−リボヌクレオチドである。他の実施形態では、ミラーヌクレオチドはＬ−デオキシリボヌクレオチドである。（Ｎ）ｘについて、修飾ヌクレオチドは、好ましくは５’末端の最後から２番目の位置から始まる。

構造（Ｇ）の他の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの５’末端の最後または最後から２番目の位置から独立に始まる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するリボヌクレオチドは、独立に、２’糖修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、２’糖修飾は、アミノ、フルオロ、アルコキシ、またはアルキル部分の存在を含む。特定の実施形態では、２’糖修飾はメトキシ部分（２’−ＯＭｅ）を含む。いくつかの好ましい実施形態では、連続する修飾ヌクレオチドは、好ましくは（Ｎ）ｘの５’末端の最後から２番目の位置から始まる。

構造（Ｇ）の好ましい一実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の５個の連続するリボヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾を含み、かつ（Ｎ）ｘの５’の最後から２番目の位置の１個のリボヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾を含む。構造（Ｇ）の別の好ましい実施形態では、（Ｎ’）ｙの５’末端の５個の連続するリボヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾を含み、かつ（Ｎ’）ｘの５’末端位置の２個の連続するリボヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾を含む。

構造（Ｇ）のいくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの５’末端の最後または最後から２番目の位置から独立に始まる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するリボヌクレオチドは、二環状ヌクレオチドである。様々な実施形態では、二環状ヌクレオチドは、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−架橋核酸（ＥＮＡ）などのロックされた核酸（ＬＮＡ）である。いくつかの好ましい実施形態では、連続する修飾ヌクレオチドは、好ましくは（Ｎ）ｘの５’末端の最後から２番目の位置から始まる。

構造（Ｇ）の様々な実施形態では、（Ｎ’）ｙは、５’末端にまたは３’末端および５’末端の各々に二環状ヌクレオチド、２’−糖修飾ヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’ホスホジエステル結合、Ｐ−アルコキシ連結、もしくはＰＡＣＥ連結から選択されるヌクレオチド間連結によって隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを含む。

構造（Ｇ）の様々な実施形態では、（Ｎ）ｘは、５’末端にまたは３’末端および５’末端の各々に二環状ヌクレオチド、２’−糖修飾ヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’ホスホジエステル結合、Ｐ−アルコキシ連結、もしくはＰＡＣＥ連結から選択されるヌクレオチド間連結によって隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを含む。

同じ鎖の３’末端と５’末端の各々が修飾ヌクレオチドを含む一実施形態では、５’末端および３’末端の修飾は同一である。別の実施形態では、５’末端の修飾は、同じ鎖の３’末端の修飾と異なっている。特定の一実施形態では、５’末端の修飾ヌクレオチドはミラーヌクレオチドであり、かつ同じ鎖の３’末端の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ホスホジエステル結合により結合されている。構造（Ｇ）の様々な実施形態では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドと異なっている。例えば、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは２’糖修飾ヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間連結により結合されたヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドはミラーヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間連結により結合されたヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間連結により結合されたヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドはミラーヌクレオチドである。

追加の実施形態では、本発明は、構造（Ｈ）：
（Ｈ） ５’ （Ｎ）ｘ−Ｚ ３’ アンチセンス鎖
３’ Ｚ’−（Ｎ’）ｙ ５’ センス鎖
を有する化合物を提供し、
ここで、ＮおよびＮ’は各々、未修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、未修飾デオキシリボヌクレオチド、または修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは各々、各々の連続するヌクレオチドが共有結合によって次のヌクレオチドに結合し、かつｘおよびｙが各々、１８〜４０の整数であるオリゴマーであり；
（Ｎ）ｘは、未修飾リボヌクレオチドを含んで、３’末端もしくは３’の最後から２番目の位置または５’末端もしくは５’の最後から２番目の位置に１個の修飾ヌクレオチドをさらに含み、ここで、この修飾ヌクレオチドは、二環状ヌクレオチド、２’−糖修飾ヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’ホスホジエステル結合、Ｐ−アルコキシ連結、もしくはＰＡＣＥ連結から選択されるヌクレオチド間連結によって隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドからなる群から選択され；
（Ｎ’）ｙは、未修飾リボヌクレオチドを含んで、内部位置に１個の修飾ヌクレオチドをさらに含み、ここで、この修飾ヌクレオチドは、二環状ヌクレオチド、２’−糖修飾ヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’ホスホジエステル結合、Ｐ−アルコキシ連結、もしくはＰＡＣＥ連結から選択されるヌクレオチド間連結によって隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドからなる群から選択され；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙの各々において、修飾ヌクレオチドと未修飾ヌクレオチドは交互になっておらず；
ＺおよびＺ’は各々、存在していても存在していなくてもよいが、存在する場合には、それが付加されている任意のオリゴマーの３’末端で共有結合的に付加された１〜５個のデオキシリボヌクレオチドであり；
（Ｎ’）_ｙの配列は、（Ｎ）ｘに実質的に相補的な配列であり；かつ
（Ｎ）_ｘの配列は、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されるｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドに対する実質的な相補性を有するアンチセンス配列を含む。

構造（Ｈ）の一実施形態では、（Ｎ）ｘの３’末端または５’末端または両方の末端の最後または最後から２番目の位置から独立に始まる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するリボヌクレオチドは、独立に、２’糖修飾ヌクレオチド、二環状ヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’ホスホジエステル結合により隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドであり、かつ（Ｎ’）ｙ中の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続する内部リボヌクレオチドは、独立に、２’糖修飾ヌクレオチド、二環状ヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’ホスホジエステル結合により隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、２’糖修飾は、アミノ、フルオロ、アルコキシ、またはアルキル部分の存在を含む。特定の実施形態では、２’糖修飾リボヌクレオチドはメトキシ部分（２’−ＯＭｅ）を含む。

構造（Ｈ）の別の実施形態では、（Ｎ’）ｙの３’末端もしくは５’末端の最後もしくは最後から２番目の位置から独立に始まる２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するリボヌクレオチドまたは（Ｎ’）ｙの５’末端および３’末端の各々にある２〜８個の連続するヌクレオチドは、独立に、２’糖修飾ヌクレオチド、二環状ヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’ホスホジエステル結合により隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドであり、かつ（Ｎ）ｘ中の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続する内部リボヌクレオチドは、独立に、２’糖修飾ヌクレオチド、二環状ヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、アルトリトールヌクレオチド、または２’−５’ホスホジエステル結合により隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドである。

同じ鎖の３’末端および５’末端の各々が、修飾ヌクレオチドを含む一実施形態では、５’末端および３’末端の修飾は同一である。別の実施形態では、５’末端の修飾は、同じ鎖の３’末端の修飾と異なっている。特定の一実施形態では、５’末端の修飾ヌクレオチドはミラーヌクレオチドであり、かつ同じ鎖の３’末端の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ホスホジエステル結合により結合されている。

構造（Ｈ）の様々な実施形態では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドと異なっている。例えば、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは２’糖修飾ヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間連結により結合されたヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドはミラーヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間連結により結合されたヌクレオチドである。別の例では、（Ｎ）ｘ中の修飾ヌクレオチドは、２’−５’ヌクレオチド間連結により結合されたヌクレオチドであり、（Ｎ’）ｙ中の修飾ヌクレオチドはミラーヌクレオチドである。

構造（Ｈ）の好ましい一実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９であり；（Ｎ’）ｙの９〜１１のヌクレオチド位置９〜１１の３個の連続するリボヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾を含み、かつ（Ｎ’）ｘの３’末端位置の５個の連続するリボヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾を含む。

一態様では、本発明は、以下に示される構造（Ｉ）：
（Ｉ） ５’ （Ｎ）ｘ−Ｚ ３’ （アンチセンス鎖）
３’ Ｚ’−（Ｎ’）ｙ−ｚ’’ ５’ （センス鎖）
を有する化合物を提供し、
ここで、ＮおよびＮ’は各々、未修飾であっても修飾されていてもよいリボヌクレオチド、または非従来型部分であり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは各々、各々の連続するＮまたはＮ’が共有結合によって次のＮまたはＮ’に結合されているオリゴヌクレオチドであり；
ＺおよびＺ’は、存在していても存在していなくてもよいが、存在する場合には、独立に、それが存在する鎖の３’末端で共有結合的に付加された１〜５個の連続するヌクレオチドであり；
ｚ’’は、存在していても存在していなくてもよいが、存在する場合には、（Ｎ’）ｙの５’末端で共有結合的に付加されているキャッピング部分であり；
ｘ＝１８〜２７であり；
ｙ＝１８〜２７であり；
（Ｎ）ｘは、修飾および未修飾リボヌクレオチドを含み、各々の修飾リボヌクレオチドは、その糖の上に２’−Ｏ−メチルを有し、ここで、（Ｎ）ｘの３’末端のＮは、修飾リボヌクレオチドであり、（Ｎ）ｘは、３’末端から始まる少なくとも５個の交互の修飾リボヌクレオチドおよび合計で少なくとも９個の修飾リボヌクレオチドを含み、かつ残りのＮは各々、未修飾リボヌクレオチドであり；
（Ｎ’）ｙにおいて、少なくとも１つの非従来型部分が存在し、この非従来型部分は、無塩基リボース部分、無塩基デオキシリボース部分、修飾または未修飾デオキシリボヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、および２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合によって隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドであってもよく；かつ
（Ｎ）ｘの配列は、（Ｎ’）ｙの配列に実質的に相補的な配列であり；かつ
（Ｎ）_ｘの配列は、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されるｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドに対する実質的な相補性を有するアンチセンス配列を含む。

いくつかの実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９である。他の実施形態では、ｘ＝ｙ＝２３である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの非従来型部分は、（Ｎ’）ｙ中の位置１５、１６、１７、または１８に存在する。いくつかの実施形態では、非従来型部分は、ミラーヌクレオチド、無塩基リボース部分、および無塩基デオキシリボース部分から選択される。いくつかの好ましい実施形態では、非従来型部分は、ミラーヌクレオチド、好ましくはＬ−ＤＮＡ部分である。いくつかの実施形態では、Ｌ−ＤＮＡ部分は、位置１７、位置１８、または位置１７と１８に存在する。

他の実施形態では、非従来型部分は無塩基部分である。様々な実施形態では、（Ｎ’）ｙは、少なくとも５個の無塩基リボース部分または無塩基デオキシリボース部分を含む。

さらに他の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、少なくとも５個の無塩基リボース部分または無塩基デオキシリボース部分を含み、かつＮ’の少なくとも１つはＬＮＡである。

構造（ＩＸ）のいくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘは、９個の交互の修飾リボヌクレオチドを含む。構造（Ｉ）の他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２に２’Ｏ修飾ヌクレオチドをさらに含む９個の交互の修飾リボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘは、奇数の位置１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９に２’−ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２と１８の一方または両方に２’−ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドをさらに含む。さらに他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９に２’−ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。

様々な実施形態では、ｚ’’が存在し、無塩基リボース部分、デオキシリボース部分；逆方向無塩基リボース部分、デオキシリボース部分；Ｃ６−アミノ−Ｐｉ；ミラーヌクレオチドから選択される。

別の態様では、本発明は、以下に示される構造（Ｊ）：
（Ｊ） ５’ （Ｎ）ｘ−Ｚ ３’ （アンチセンス鎖）
３’ Ｚ’−（Ｎ’）ｙ−ｚ’’ ５’ （センス鎖）
を有する化合物を提供し、
ここで、ＮおよびＮ’は各々、未修飾であっても修飾されていてもよいリボヌクレオチド、または非従来型部分であり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは各々、各々の連続するＮまたはＮ’が共有結合によって次のＮまたはＮ’に結合されているオリゴヌクレオチドであり；
ＺおよびＺ’は、存在していても存在していなくてもよいが、存在する場合には、独立に、それが存在する鎖の３’末端で共有結合的に付加された１〜５個の連続するヌクレオチドであり；
ｚ’’は、存在していても存在していなくてもよいが、存在する場合には、（Ｎ’）ｙの５’末端で共有結合的に付加されているキャッピング部分であり；
ｘ＝１８〜２７であり；
ｙ＝１８〜２７であり；
（Ｎ）ｘは、修飾または未修飾リボヌクレオチド、および任意で少なくとも１つの非従来型部分を含み；
（Ｎ’）ｙにおいて、少なくとも１つの非従来型部分が存在し、この非従来型部分は、無塩基リボース部分、無塩基デオキシリボース部分、修飾もしくは未修飾デオキシリボヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、非塩基対合ヌクレオチド類似体、または２’−５’ヌクレオチド間リン酸結合によって隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドであってもよく；かつ
（Ｎ）ｘの配列は、（Ｎ’）ｙの配列に相補的な配列であり；かつ
（Ｎ）_ｘの配列は、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されるｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドに対する実質的な相補性を有するアンチセンス配列を含む。

いくつかの実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９である。他の実施形態では、ｘ＝ｙ＝２３である。いくつかの好ましい実施形態では、（Ｎ）ｘは、修飾および未修飾リボヌクレオチドと、少なくとも１つの非従来型部分とを含む。

いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘにおいて、３’末端のＮは修飾リボヌクレオチドであり、かつ（Ｎ）ｘは少なくとも８個の修飾リボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、少なくとも８個の修飾リボヌクレオチドのうちの少なくとも５個は、３’末端から始まって交互になっている。いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５のうちの１つに無塩基部分を含む。

いくつかの実施形態では、（Ｎ’）ｙ中の少なくとも１つの非従来型部分は、位置１５、１６、１７、または１８に存在する。いくつかの実施形態では、非従来型部分は、ミラーヌクレオチド、無塩基リボース部分、および無塩基デオキシリボース部分から選択される。いくつかの好ましい実施形態では、非従来型部分は、ミラーヌクレオチド、好ましくはＬ−ＤＮＡ部分である。いくつかの実施形態では、Ｌ−ＤＮＡ部分は、位置１７、位置１８、または位置１７と１８に存在する。他の実施形態では、（Ｎ’）ｙ中の少なくとも１つの非従来型部分は、無塩基リボース部分または無塩基デオキシリボース部分である。

構造（Ｘ）の様々な実施形態では、ｚ’’が存在し、かつ無塩基リボース部分、デオキシリボース部分；逆方向無塩基リボース部分、デオキシリボース部分；Ｃ６−アミノ−Ｐｉ；ミラーヌクレオチドから選択される。

さらに別の態様では、本発明は、以下に示される構造（Ｋ）：
（Ｋ） ５’ （Ｎ）_ｘ−Ｚ ３’ （アンチセンス鎖）
３’ Ｚ’−（Ｎ’）_ｙ−ｚ’’ ５’ （センス鎖）
を有する化合物を提供し、
ここで、ＮおよびＮ’は各々、未修飾であっても修飾されていてもよいリボヌクレオチド、または非従来型部分であり；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは各々、各々の連続するＮまたはＮ’が共有結合によって次のＮまたはＮ’に結合されているオリゴヌクレオチドであり；
ＺおよびＺ’は、存在していても存在していなくてもよいが、存在する場合には、独立に、それが存在する鎖の３’末端で共有結合的に付加された１〜５個の連続するヌクレオチドであり；
ｚ’’は、存在していても存在していなくてもよいが、存在する場合には、（Ｎ’）ｙの５’末端で共有結合的に付加されているキャッピング部分であり；
ｘ＝１８〜２７であり；
ｙ＝１８〜２７であり；
（Ｎ）ｘは、修飾または未修飾リボヌクレオチドと非従来型部分の組合せを含み、どの修飾リボヌクレオチドもその糖の上に２’−Ｏ−メチルを有し；
（Ｎ’）ｙは、修飾または未修飾リボヌクレオチド、および任意で非従来型部分を含み、どの修飾リボヌクレオチドもその糖の上に２’ＯＭｅを有し；
（Ｎ）ｘの配列は、（Ｎ’）ｙの配列に実質的に相補的な配列であり；かつ
（Ｎ）_ｘの配列は、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されるｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドに対する実質的な相補性を有し；かつこのｍＲＮＡに相補的な連続するヌクレオチドが１５個未満である、アンチセンス配列を含む。

いくつかの実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９である。他の実施形態では、ｘ＝ｙ＝２３である。いくつかの好ましい実施形態では、少なくとも１つの好ましい１つの非従来型部分が（Ｎ）ｘに存在し、かつ無塩基リボース部分または無塩基デオキシリボース部分である。他の実施形態では、少なくとも１つの非従来型部分が（Ｎ）ｘに存在し、かつ非塩基対合ヌクレオチド類似体である。様々な実施形態では、（Ｎ’）ｙは未修飾リボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘは、少なくとも５個の無塩基リボース部分もしくは無塩基デオキシリボース部分またはその組合せを含む。特定の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび／または（Ｎ’）ｙは、（Ｎ’）ｙおよび／または（Ｎ）ｘ中の対応する修飾または未修飾リボヌクレオチドと塩基対合しない修飾リボヌクレオチドを含む。

様々な実施形態では、本発明は、構造（Ｌ）：
（Ｌ） ５’ （Ｎ）_ｘ−Ｚ ３’ （アンチセンス鎖）
３’ Ｚ’−（Ｎ’）_ｙ ５’ （センス鎖）
に示されるｓｉＲＮＡを提供し、
ここで、ＮおよびＮ’は各々、未修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、未修飾デオキシリボヌクレオチド、および修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
（Ｎ）_ｘおよび（Ｎ’）_ｙは各々、各々の連続するＮまたはＮ’が共有結合によって次のＮまたはＮ’に結合されているオリゴヌクレオチドであり；
ＺおよびＺ’は存在せず；
ｘ＝ｙ＝１９であり；
（Ｎ’）ｙにおいて、位置１５、１６、１７、１８、および１９の少なくとも１つにあるヌクレオチドは、無塩基疑似ヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、および２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドから選択されるヌクレオチドを含み；
（Ｎ）ｘは、交互の修飾リボヌクレオチドと未修飾リボヌクレオチドとを含み、各々の修飾リボヌクレオチドはその糖の上に２’−Ｏ−メチルを有するように修飾されており、かつ（Ｎ）ｘの中央位置にあるリボヌクレオチドは、修飾されているかまたは未修飾であり、好ましくは未修飾であり；かつ
（Ｎ）ｘの配列は、（Ｎ’）ｙの配列に実質的に相補的な配列であり；かつ
（Ｎ）_ｘの配列は、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されるｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドに対する実質的な相補性を有するアンチセンス配列を含む。

構造（Ｌ）のいくつかの実施形態では、（Ｎ’）ｙにおいて、位置１７と１８の一方または両方にあるヌクレオチドは、無塩基疑似ヌクレオチド、ミラーヌクレオチド、および２’−５’ヌクレオチド間結合により隣接ヌクレオチドに結合されたヌクレオチドから選択される修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ミラーヌクレオチドは、Ｌ−ＤＮＡおよびＬ−ＲＮＡから選択される。様々な実施形態では、ミラーヌクレオチドはＬ−ＤＮＡである。

様々な実施形態では、（Ｎ’）ｙは位置１５に修飾ヌクレオチドを含み、ここで、修飾ヌクレオチドは、ミラーヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドから選択される。

特定の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、位置２に修飾ヌクレオチドまたは疑似ヌクレオチドをさらに含み、ここで、疑似ヌクレオチドは無塩基疑似ヌクレオチド類似体であってもよく、かつ修飾ヌクレオチドは任意でミラーヌクレオチドである。

様々な実施形態では、アンチセンス鎖（Ｎ）ｘは、奇数の位置（５’から３’へ；位置１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９）に２’Ｏ−Ｍｅ修飾リボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２と１８の一方または両方に２’Ｏ−Ｍｅ修飾リボヌクレオチドをさらに含む。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９に２’−ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。

ｘ＝ｙ＝２１またはｘ＝ｙ＝２３である構造（Ｌ）、（Ｉ）、および（Ｊ）の他の実施形態が想定され；これらの実施形態では、上で論じられている（Ｎ’）ｙに対する修飾は、位置１７および１８にある代わりに、２１−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの場合、位置１９および２０にあり、２３ｍｅｒオリゴヌクレオチドの場合、２１および２２にあり；同様に、位置１５、１６、１７、１８、または１９にある修飾は、２１−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの場合、位置１７、１８、１９、２０、または２１にあり、２３−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの場合、位置１９、２０、２１、２２、または２３にある。アンチセンス鎖上の２’−ＯＭｅ修飾も同様に調整される。いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘは、２１ｍｅｒオリゴヌクレオチドの場合、奇数の位置（５’から３’へ；位置１、３、５、７、９、１２、１４、１６、１８、２０）［位置１１のヌクレオチドは未修飾］に、および２３ｍｅｒオリゴヌクレオチドの場合、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３［位置１２のヌクレオチドは未修飾］に、２’−ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、２１ｍｅｒオリゴヌクレオチドの場合、位置２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０［位置１１のヌクレオチドは未修飾］に、および２３ｍｅｒオリゴヌクレオチドの場合、位置２、４、６、８、１０、１３、１５、１７、１９、２１、２３［位置１２のヌクレオチドは未修飾］に、２’−ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。

いくつかの実施形態では、（Ｎ’）ｙは、５’末端キャップヌクレオチドをさらに含む。様々な実施形態では、末端キャップ部分は、無塩基疑似ヌクレオチド類似体、逆方向無塩基疑似ヌクレオチド類似体、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチド、およびＣ６−イミンリン酸（末端にリン酸を含むＣ６アミノリンカー）から選択される。

他の実施形態では、本発明は、以下に示される構造（Ｍ）：
５’ （Ｎ）_ｘ−Ｚ ３’ （アンチセンス鎖）
３’ Ｚ’−（Ｎ’）_ｙ ５’ （センス鎖）
を有する化合物を提供し、
ここで、ＮおよびＮ’は各々、疑似ヌクレオチドおよびヌクレオチドから選択され；
各々のヌクレオチドは、未修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、未修飾デオキシリボヌクレオチド、および修飾デオキシリボヌクレオチドから選択され；
（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは各々、各々の連続するＮまたはＮ’が共有結合によって次のＮまたはＮ’に結合されているオリゴヌクレオチドであり；
ＺおよびＺ’は存在せず；
ｘ＝１８〜２７であり；
ｙ＝１８〜２７であり；
（Ｎ）ｘの配列は、（Ｎ’）ｙの配列に実質的に相補的な配列であり；かつ
（Ｎ）_ｘの配列は、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されるｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドに対する実質的な相補性を有するアンチセンス配列を含み；
Ｎの少なくとも１つは、（Ｎ）ｘが標的遺伝子のｍＲＮＡに相補的な１５個未満の連続するヌクレオチドを含むように、（Ｎ）ｘの位置における無塩基疑似ヌクレオチド、非対合ヌクレオチド類似体、および標的遺伝子のｍＲＮＡに対するヌクレオチドミスマッチから選択される。

他の実施形態では、本発明は、以下に示される構造（Ｎ）：
（Ｎ） ５’ （Ｎ）_ｘ−Ｚ ３’ （アンチセンス鎖）
３’ Ｚ’−（Ｎ’）_ｙ ５’ （センス鎖）
を有する二本鎖化合物を提供し、
ここで、ＮおよびＮ’は各々、未修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、未修飾デオキシリボヌクレオチド、および修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
（Ｎ）_ｘおよび（Ｎ’）_ｙは各々、各々の連続するＮまたはＮ’が共有結合によって次のＮまたはＮ’に結合されているオリゴヌクレオチドであり；
ＺおよびＺ’は存在せず；
ｘおよびｙは各々、１８〜４０の整数であり；
（Ｎ）ｘの配列は、（Ｎ’）ｙの配列に実質的に相補的な配列であり；かつ
（Ｎ）_ｘの配列は、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されるｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドに対する実質的な相補性を有するアンチセンス配列を含み；
（Ｎ）ｘ、（Ｎ’）ｙ、または（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙは、（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙが二本鎖化合物中で１５個未満の塩基対を形成するように、非塩基対合修飾ヌクレオチドを含む。

他の実施形態では、本発明は、以下に示される構造（Ｏ）：
（Ｏ） ５’ （Ｎ）_ｘ−Ｚ ３’ （アンチセンス鎖）
３’ Ｚ’−（Ｎ’）_ｙ ５’ （センス鎖）
を有する化合物を提供し、
ここで、Ｎは各々、未修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、未修飾デオキシリボヌクレオチド、および修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
Ｎ’は各々、６員の糖ヌクレオチド、７員の糖ヌクレオチド、モルホリノ部分、ペプチド核酸、およびそれらの組合せから選択されるヌクレオチド類似体であり；
（Ｎ）_ｘおよび（Ｎ’）_ｙは各々、各々の連続するＮまたはＮ’が共有結合によって次のＮまたはＮ’に結合されているオリゴヌクレオチドであり；
ＺおよびＺ’は存在せず；
ｘおよびｙは各々、１８〜４０の整数であり；
（Ｎ）ｘの配列は、（Ｎ’）ｙの配列に実質的に相補的な配列であり；かつ（Ｎ）_ｘの配列は、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されるｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドに対する実質的な相補性を有するアンチセンス配列を含む。

他の実施形態では、本発明は、以下に示される構造（Ｐ）：
（Ｐ） ５’ （Ｎ）_ｘ−Ｚ ３’ （アンチセンス鎖）
３’ Ｚ’−（Ｎ’）_ｙ ５’ （センス鎖）
を有する化合物を提供し、
ここで、ＮおよびＮ’は各々、未修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、未修飾デオキシリボヌクレオチド、および修飾デオキシリボヌクレオチドから選択されるヌクレオチドであり；
（Ｎ）_ｘおよび（Ｎ’）_ｙは各々、各々の連続するＮまたはＮ’が共有結合によって次のＮまたはＮ’に結合されているオリゴヌクレオチドであり；
ＺおよびＺ’は存在せず；
ｘおよびｙは各々、１８〜４０の整数であり；
（Ｎ）ｘもしくは（Ｎ’）ｙの内部位置にあるＮもしくはＮ’のうちの１つまたは（Ｎ）ｘもしくは（Ｎ’）ｙの末端位置にあるＮもしくはＮ’のうちの１つもしくは複数は、無塩基部分または２’修飾ヌクレオチドを含み；
（Ｎ）ｘの配列は、（Ｎ’）ｙの配列に実質的に相補的な配列であり；かつ（Ｎ）_ｘの配列は、配列番号１〜５８のいずれか１つに示されるｍＲＮＡ中の約１８〜約４０個の連続するリボヌクレオチドに対する実質的な相補性を有するアンチセンス配列を含む。

様々な実施形態では、（Ｎ’）ｙは位置１５に修飾ヌクレオチドを含み、ここで、修飾ヌクレオチドは、ミラーヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドから選択される。

特定の実施形態では、（Ｎ’）ｙは、位置２に修飾ヌクレオチドをさらに含み、ここで、修飾ヌクレオチドは、ミラーヌクレオチドおよび無塩基疑似ヌクレオチド類似体から選択される。

様々な実施形態では、アンチセンス鎖（Ｎ）ｘは、奇数の位置（５’から３’へ；位置１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９）に２’Ｏ−Ｍｅ修飾リボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２と１８の一方または両方に２’Ｏ−Ｍｅ修飾リボヌクレオチドをさらに含む。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは、位置２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、１９に２’−ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを含む。

上記の構造モチーフ（Ａ）〜（Ｐ）は、哺乳動物または非哺乳動物の遺伝子に対する任意のオリゴヌクレオチド対（センス鎖およびアンチセンス鎖）の場合に有用である。いくつかの実施形態では、哺乳動物遺伝子は、好ましくは、配列番号１〜５８に示されるｍＲＮＡを有する、表Ａ１〜Ａ４に示される遺伝子から選択されるヒト遺伝子である。特定の好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５９〜３３，５９６に示されるｓｉＲＮＡ対のいずれか１つから選択される。以下の表Ａ５には、特定の好ましいセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド対が示されている。

上記の構造（Ａ）〜（Ｐ）の全てについて、様々な実施形態では、ｘ＝ｙであり、かつｘおよびｙは各々、１９、２０、２１、２２、または２３である。好ましい実施形態では、ｘ＝ｙ＝１９である。さらなる実施形態では、化合物は、交互の位置に修飾リボヌクレオチドを含み、ここで、（Ｎ）ｘの５’末端および３’末端にある各々のＮは、その糖残基中で修飾されており、かつ中央のリボヌクレオチド、例えば、１９−ｍｅｒ鎖の位置１０、２１ｍｅｒの位置１１、および２３−ｍｅｒ鎖の位置１２にあるリボヌクレオチドは、修飾されていない。

ｘ＝ｙ＝２１またはｘ＝ｙ＝２３であるいくつかの実施形態では、１９ｍｅｒにおける修飾の位置は、２１ｍｅｒおよび２３ｍｅｒの場合には調整され、ただし、アンチセンス鎖の中央のヌクレオチドは、好ましくは修飾されていない。

上記の構造（Ａ）〜（Ｐ）の全てについて、いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘも（Ｎ’）ｙも３’末端および５’末端でリン酸化されていない。他の実施形態では、（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙのどちらかまたは両方は、３’末端でリン酸化されている。さらに別の実施形態では、（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙのどちらかまたは両方は、切断不可能なリン酸基を用いて３’末端でリン酸化されている。さらに別の実施形態では、（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙのどちらかまたは両方は、切断可能なまたは切断不可能なリン酸基を用いて末端の２’末端位置でリン酸化されている。これらの特定のｓｉＲＮＡ化合物はまた平滑末端であり、かつ末端でリン酸化されていない；しかしながら、比較実験により、３’−末端の一方または両方でリン酸化されているｓｉＲＮＡ化合物が、リン酸化されていない化合物と比較してインビボで同様の活性を有することが示されている。

上記の構造（Ａ）〜（Ｐ）の全てについて、いくつかの実施形態では、化合物は平滑末端であり、例えば、この場合、ＺおよびＺ’は両方とも存在しない。代わりの実施形態では、化合物は、少なくとも１つの３’突出を含み、この場合、ＺまたはＺ’のうちの少なくとも１つが存在する。ＺおよびＺ’は、独立に、１以上の共有結合した修飾または非修飾ヌクレオチド、例えば、逆方向ｄＴまたはｄＡ；ｄＴ、ＬＮＡ、ミラーヌクレオチドなどを含む。いくつかの実施形態では、ＺおよびＺ’は各々、ｄＴおよびｄＴｄＴから独立に選択される。Ｚおよび／またはＺ’が存在するｓｉＲＮＡは、ＺおよびＺ’が存在しないｓｉＲＮＡと同様の活性および安定性を有する。

上述の構造全てについての特定の実施形態では、化合物は、架橋核酸または二環状ヌクレオチドとも定義される１以上のロックされた核酸（ＬＮＡ）を含む。好ましいロックされた核酸は、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンヌクレオシド（ＥＮＡ）または２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレンヌクレオシドである。ＬＮＡおよびＥＮＡヌクレオチドの他の例は、全て参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ９８／３９３５２号、ＷＯ００／４７５９９号、およびＷＯ９９／１４２２６号に開示されている。

上述の構造全てについての特定の実施形態では、化合物は、１，５アンヒドロ−２−デオキシ−Ｄ−アルトリト−ヘキシトールとも定義される、１以上のアルトリトールモノマー（ヌクレオチド）を含む（例えば、Ａｌｌａｒｔ，ｅｔ ａｌ．，１９９８．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ & Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １７：１５２３−１５２６；Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ & Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １８：１３７１−１３７６；Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７，ＮＡＲ ３５（４）：１０６４−１０７４を参照されたく；全て参照により本明細書に組み込まれる）。

本発明は、Ｎおよび／またはＮ’が各々、デオキシリボヌクレオチド（Ｄ−Ａ、Ｄ−Ｃ、Ｄ−Ｇ、Ｄ−Ｔ）である化合物を明示的に除外する。特定の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは、独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のデオキシリボヌクレオチドを含んでいてもよい。特定の実施形態では、本発明は、Ｎが各々、未修飾リボヌクレオチドであり、かつ（Ｎ’）ｙの３’末端ヌクレオチドまたは３’末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドである化合物を提供する。さらに他の実施形態では、Ｎは各々、未修飾リボヌクレオチドであり、かつ（Ｎ’）ｙの５’末端ヌクレオチドまたは５’末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個の連続するヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。さらなる実施形態では、（Ｎ）ｘの５’末端ヌクレオチドまたは５’末端の２、３、４、５、６、７、８、もしくは９個の連続するヌクレオチドおよび３’末端の１、２、３、４、５、もしくは６個の連続するヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドであり、かつＮ’は各々、未修飾リボヌクレオチドである。またさらなる実施形態では、（Ｎ）ｘは、未修飾リボヌクレオチドと、５’末端および３’末端の各々に独立にある１または２個、３または４個の連続するデオキシリボヌクレオチドと、内部位置にある１または２個、３、４、５、または６個の連続するデオキシリボヌクレオチドとを含み；かつＮ’は各々、未修飾リボヌクレオチドである。特定の実施形態では、（Ｎ’）ｙの３’末端ヌクレオチドまたは３’末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ １３、もしくは１４個の連続するヌクレオチドおよび（Ｎ）ｘの末端５’ヌクレオチドまたは５’末端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ １３、もしくは１４個の連続するヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドである。本発明は、Ｎおよび／またはＮ’が各々、デオキシリボヌクレオチドである化合物を除外する。いくつかの実施形態では、Ｎの５’末端ヌクレオチドまたはＮの２もしくは３個の連続およびＮ’のうちの１、２、もしくは３個は、デオキシリボヌクレオチドである。活性のあるＤＮＡ／ＲＮＡ ｓｉＲＮＡキメラの特定の例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公報第２００５／０００４０６４号、およびＵｉ−Ｔｅｉ，２００８（ＮＡＲ ３６（７）：２１３６−２１５１）に開示されている。

別途示されない限り、本明細書で論じられている構造の好ましい実施形態では、各々の連続するＮとＮ’の間の共有結合は、ホスホジエステル結合である。

本発明により提供される追加の新規分子は、連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであり、ここで、このようなヌクレオチドの第１の部分は阻害性ＲＮＡ分子をコードし、このようなヌクレオチドの第２の部分は第２の阻害性ＲＮＡ分子をコードし、このようなヌクレオチドの第３の部分は第３の阻害性ＲＮＡ分子をコードする。第１、第２、および第３の部分は各々、二本鎖ＲＮＡの１つの鎖を含んでいてもよく、かつ第１、第２、および第３の部分はリンカーによって１つに結合されていてもよい。さらに、オリゴヌクレオチドは、１以上のリンカーによって１つに結合された３つの二本鎖部分を含んでいてもよい。

したがって、本発明により提供される１つの分子は、３つの阻害性ＲＮＡ分子をコードする連続するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであり；該オリゴヌクレオチドは、３つの二本鎖アームが、上記に提示された任意のリンカーなどの、１以上のリンカーによって１つに結合されるように、三本鎖構造を有していてもよい。この分子は、「星」状構造を形成し、本明細書において、ＲＮＡスターと呼ばれる場合がある。このような構造は、本発明の譲受者に譲渡され、かつその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ特許公報ＷＯ２００７／０９１２６９号に開示されている。

共有結合は、あるヌクレオチドモノマーを隣接ヌクレオチドモノマーと結合させるヌクレオチド間連結を指す。共有結合としては、例えば、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結合、Ｐ−アルコキシ結合、Ｐ−カルボキシ結合などが挙げられる。ＲＮＡとＤＮＡの通常のヌクレオシド間連結は、３’から５’へのホスホジエステル連結である。特定の好ましい実施形態では、共有結合はホスホジエステル結合である。共有結合は、とりわけ、ＷＯ２００４／０４１９２４号に開示されているものなどの、リンを含有しないヌクレオシド間連結を包含する。別途示されない限り、本明細書で論じられている構造の好ましい実施形態では、各々の連続するＮとＮ’の間の共有結合は、ホスホジエステル結合である。

上述の構造全てについて、いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘのオリゴヌクレオチド配列は、（Ｎ’）ｙのオリゴヌクレオチド配列に完全に相補的である。他の実施形態では、（Ｎ）ｘおよび（Ｎ’）ｙは実質的に相補的である。特定の実施形態では、（Ｎ）ｘは標的配列に完全に相補的である。他の実施形態では、（Ｎ）ｘは標的配列に実質的に相補的である。

いくつかの実施形態では、（Ｎ）ｘも（Ｎ’）ｙも３’末端および５’末端でリン酸化されていない。他の実施形態では、（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙのどちらかまたは両方は、３’末端でリン酸化されている（３’Ｐｉ）。さらに別の実施形態では、（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙのどちらかまたは両方は、切断不可能なリン酸基を用いて３’末端でリン酸化されている。さらに別の実施形態では、（Ｎ）ｘと（Ｎ’）ｙのどちらかまたは両方は、切断可能なまたは切断不可能なリン酸基を用いて末端２’末端位置でリン酸化されている。さらに、本発明の阻害性核酸分子は、１以上のギャップおよび／または１以上のニックおよび／または１以上のミスマッチを含んでいてもよい。理論に束縛されることを望まないが、ギャップ、ニック、およびミスマッチは、ＤＩＣＥＲ、ＤＲＯＳＨＡ、またはＲＩＳＣなどの内在性の細胞機構によって、より容易にその阻害性成分へとプロセッシングされ得るように、核酸／ｓｉＲＮＡを部分的に不安定化する利点を有する。

本発明との関連で、核酸中のギャップは、一方の鎖において１以上の内部ヌクレオチドがないことを指すが、核酸中のニックは、一方の鎖において２つの隣接ヌクレオチド間のヌクレオチド間連結がないことを指す。本発明の分子はいずれも、１以上のギャップおよび／または１以上のニックを含有していてもよい。

本明細書で論じられている構造は、任意の標的遺伝子に対するアンチセンスおよび対応するセンス核酸配列に組み込まれたとき、その標的遺伝子の発現を減少させるときに有用なｓｉＲＮＡ化合物を提供する。標的遺伝子は、哺乳動物または非哺乳動物の遺伝子である。本発明の方法は、対象の眼内の標的遺伝子の発現を阻害する１以上のｓｉＲＮＡ化合物を対象の眼に局所的にかつ非侵襲的に投与することを含む。

ｓｉＲＮＡ合成
本発明の化合物は、リボ核酸（またはデオキシリボ核酸）オリゴヌクレオチドの合成のための、当該技術分野でよく知られている方法のいずれかによって合成することができる。このような合成は、とりわけ、Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｉｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９２；４８：２２２３−２３１１；Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｉｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９３；４９：６１２３−６１９４、およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７；１５４：２８７−３１３に記載されており；チオエートの合成は、とりわけ、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８５；５４：３６７−４０２に記載されており、ＲＮＡ分子の合成は、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ ２００５ Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ Ｐ．編；Ｋａｐ．２：１７−３１のＳｐｒｏａｔに記載されており、それぞれの下流のプロセスは、とりわけ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９８９ Ｏｌｉｖｅｒ編；Ｋａｐ．７：１８３−２０８のＰｉｎｇｏｕｄ ｅｔ．ａｌ．，に記載されている。

例えば、Ｕｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８７，１０９：７８４５；Ｓｃａｒｉｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ，１９９０，１８：５４３３；Ｗｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ １９９５，．２３：２６７７−２６８４；およびＷｉｎｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，１９９７，７４：５９に記載されたような手順などの、他の合成手順が当該技術分野で知られており、これらの手順は、５’−末端のジメトキシトリチル、および３’−末端のホスホロアミダイトなどの、一般的な核酸保護基およびカップリング基を利用し得る。望ましい場合には、修飾（例えば、２’−Ｏ−メチル化）ヌクレオチドおよび未修飾ヌクレオチドが組み込まれる。

本発明のオリゴヌクレオチドを別々に合成し、例えば、ライゲーションによって（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９２，２５６：９９２３；国際特許公報ＷＯ９３／２３５６９号；Ｓｈａｂａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ １９９１，１９：４２４７；Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ & Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９７，１６：９５１；Ｂｅｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ １９９７，８：２０４）、あるいは合成および／または脱保護後のハイブリダイゼーションによって、合成後に１つに結合することができる。

市販の機械（特に、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なもの）を使用することができ；オリゴヌクレオチドが、本明細書に開示されている配列によって調製されることに留意すべきである。化学合成断片の重複する対を、当該技術分野で周知の方法を用いて連結することができる（例えば、米国特許第６，１２１，４２６号を参照されたい）。これらの鎖を別々に合成し、その後、チューブの中で互いにアニーリングさせる。その後、二本鎖ｓｉＲＮＡを、ＨＰＬＣによって（例えば、それらの一方が過剰であるために）アニーリングしなかった一本鎖オリゴヌクレオチドから分離する。本発明のｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ断片に関して、２以上のこのような配列を合成し、本発明で使用するために１つに結合させることができる。

本発明の化合物を、例えば、（本発明の譲受者に譲渡され、かつその全体が参照により本明細書に組み込まれる）米国特許公報第２００４／００１９００１号（ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ）、およびＰＣＴ特許公報ＷＯ２００７／０９１２６９号に記載されたような、タンデム合成法によって合成することもでき、ここで、両方のｓｉＲＮＡ鎖は、切断可能なリンカーによって隔てられた単一の連続するオリゴヌクレオチド断片または鎖として合成されるが、この断片または鎖は後に切断されて、別々のｓｉＲＮＡ断片または鎖を生じさせ、これがハイブリダイスし、ｓｉＲＮＡ二重鎖の精製が可能になる。リンカーは、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーであることができる。

本発明はさらに、本明細書で言及された任意の疾患または状態の治療のための２つまたはそれより多くのｓｉＲＮＡ分子を含む薬学的組成物を提供し、該２つの分子は、同等のもしくは別な形で有益な活性を生み出す量で、薬学的組成物中で物理的に１つに混合され得るか、または共有結合もしくは非共有結合され得るか、または２〜１００、好ましくは２〜５０、もしくは２〜３０ヌクレオチドの範囲の長さの核酸リンカーによって１つに結合され得る。

したがって、ｓｉＲＮＡ分子は、共有結合もしくは非共有結合されるか、またはリンカーによって結合されて、タンデムｓｉＲＮＡ化合物を形成し得る。２つのｓｉＲＮＡ配列を含むこのようなタンデムｓｉＲＮＡ化合物は、典型的には、約３８〜１５０ヌクレオチド長、より好ましくは３８または４０〜６０ヌクレオチド長であり、かつ３以上のｓｉＲＮＡ配列がタンデム分子に含まれる場合、それに応じてより長いものとなる。２以上のｓｈＲＮＡをコードするタンデム分子と同様に、内部細胞プロセッシングにより産生されるｓｉＲＮＡ、例えば、長いｄｓＲＮＡをコードする２以上のより長い配列から構成されるより長いタンデムな化合物も想定される。このようなタンデム分子も本発明の一部と考えられる。本発明の２以上のｓｉＲＮＡ配列を含むタンデム化合物が想定される。

さらに、本明細書に開示されている疾患の治療のための増強されたターゲッティングを達成するために、本明細書に開示されているｓｉＲＮＡまたはこのようなｓｉＲＮＡを含むもしくはコードする任意の核酸分子を、標的細胞上に発現される細胞表面内在化可能分子に対する抗体（アプタマー分子を含む）に（共有結合的にまたは非共有結合的に）連結または結合させることができる。例えば、抗Ｆａｓ抗体（好ましくは中和抗体）を（共有結合的にまたは非共有結合的に）任意のｓｉＲＮＡ化合物と組み合わせてもよい。

本発明の化合物を、直接的にまたはウイルスもしくは非ウイルスベクターを用いて、送達することができる。直接的に送達する場合、配列は通常ヌクレアーゼ耐性とされる。あるいは、配列が本明細書で以下に開示される細胞で発現されるように、配列を発現カセットまたはコンストラクトに組み込むことができる。通常、コンストラクトは、標的とされた細胞で配列が発現するのを可能にする適切な調節配列またはプロモーターを含有する。任意で本発明の化合物の送達に使用されるベクターは市販されており、当業者に公知の方法によって本発明の化合物の送達のために修飾し得る。

１以上のステムおよびループ構造を含む長いオリゴヌクレオチド（典型的には、２５〜５００ヌクレオチド長）は、ステム領域が本発明のオリゴヌクレオチドの配列を含む場合、担体、好ましくは、薬学的に許容される担体中で送達され得、かつ内在性の細胞複合体によって（例えば、上記のようなＤＲＯＳＨＡおよびＤＩＣＥＲによって）細胞内でプロセッシングされて、本発明のオリゴヌクレオチドである１以上のより小さい二本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）を産生し得ることも想定される。このオリゴヌクレオチドは、タンデムｓｈＲＮＡコンストラクトと呼ぶことができる。この長いオリゴヌクレオチドは、１以上のステムおよびループ構造を含む一本鎖オリゴヌクレオチドであり、ここで、各々のステム領域は、本発明の遺伝子のセンスおよび対応するアンチセンスｓｉＲＮＡ配列を含むことが想定される。

ＲＮＡ干渉
ＲＮＡｉ現象に関するいくつかのＰＣＴ出願が最近公開されている。これらには、ＰＣＴ刊行物ＷＯ００／４４８９５号；ＰＣＴ刊行物ＷＯ００／４９０３５号；ＰＣＴ刊行物ＷＯ００／６３３６４号；ＰＣＴ刊行物ＷＯ０１／３６６４１号；ＰＣＴ刊行物ＷＯ０１／３６６４６号；ＰＣＴ刊行物ＷＯ９９／３２６１９号；ＰＣＴ刊行物ＷＯ００／４４９１４号；ＰＣＴ刊行物ＷＯ０１／２９０５８号；およびＰＣＴ刊行物ＷＯ０１／７５１６４号が含まれる。

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ｄｓＲＮＡ種が細胞質タンパク質複合体に侵入する能力に基づいており、この細胞質タンパク質複合体の中で、ｄｓＲＮＡ種は相補的な細胞ＲＮＡにターゲッティングされ、それを特異的に分解する。ＲＮＡ干渉応答は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を仲介する、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と一般に呼ばれる、ｓｉＲＮＡを含有するエンドヌクレアーゼ複合体を特色とする。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の真ん中で起こり得る（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，２００１，１５（２）：１８８−２００）。さらに詳細には、より長いｄｓＲＮＡは、タイプＩＩＩ ＲＮアーゼ（ＤＩＣＥＲ、ＤＲＯＳＨＡなど；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４０９（６８１８）：３６３−６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００３，４２５（６９５６）：４１５−９）によって、短い（１７〜２９ｂｐ）ｄｓＲＮＡ断片（短い阻害性ＲＮＡ、「ｓｉＲＮＡ」とも呼ばれる）に消化される。ＲＩＳＣタンパク質複合体は、これらの断片と相補的ｍＲＮＡとを認識する。全体のプロセスは、標的ｍＲＮＡのエンドヌクレアーゼ切断によって完了する（ＭｃＭａｎｕｓ & Ｓｈａｒｐ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ，２００２，３（１０）：７３７−４７；Ｐａｄｄｉｓｏｎ & Ｈａｎｎｏｎ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００３，５（３）：２１７−２４）。（これらの用語および提唱されたメカニズムに関する追加の情報については、例えば、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ ２００１，７（１１）：１５０９−２１；Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ，Ｃｅｌｌ ２００１，１０７（４）：４１５−８、およびＰＣＴ刊行物ＷＯ０１／３６６４６号を参照されたい）。

いくつかのグループが、細胞内でｓｉＲＮＡを生成させることができるＤＮＡベースのベクターの開発を記載している。この方法は、通常、細胞内でｓｉＲＮＡを形成するように効率的にプロセッシングされる短いヘアピンＲＮＡの転写を伴う（Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ ２００２，９９：１４４３−１４４８；Ｐａｄｄｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ & Ｄｅｖ ２００２，１６：９４８−９５８；Ｓｕｉ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ ２００２，８：５５１５−５５２０；およびＢｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２，２９６：５５０−５５３）。これらの報告には、多数の内在性および外因性に発現される遺伝子を特異的に標的とすることができるｓｉＲＮＡを生成させる方法が記載されている。

本発明は例証となるように記載されており、使用される専門用語は、限定語ではなく、説明語の性質を持つことが意図されていることが理解されるべきである。

明白なことであるが、本発明の多くの修飾および変化が、上記の教示に照らして可能である。それゆえ、添付の特許請求の範囲内で、本発明は、具体的に記載されたものとは別の方法で実施することができることが理解されるべきである。

本出願の全体を通して、米国特許をはじめとする、様々な刊行物が、著者および年号および番号付き特許により参照されている。これらの刊行物および特許および特許出願のその全体としての開示は、本発明が関係する当該技術分野の状況をより十分に説明するために、参照により本出願に組み込まれる。

本発明は、実施例を参照しながら、以下で詳細に説明されるが、それに限定されるものとみなされるべきではない。

本明細書における任意の文書の引用は、そのような文書が、関連のある従来技術、または本出願の任意の請求請求の範囲の特許性に対する考慮された資料であるという承認として意図されるものではない。任意の文書の内容または日付に関する記述はいずれも、出願の時点で出願人に利用可能な情報に基づくものであり、かつそのような記述の正しさに関する承認を構成するものではない。

さらに詳細に説明することなく、当業者であれば、前述の説明を用いて、本発明を最大限まで利用することができると考えられる。以下の好ましい具体的な実施形態は、それゆえ、特許請求された発明を単に例証するものであって、決して限定するものとみなされるべきではない。

本明細書で具体的には記載されていない当該技術分野で公知の標準的な分子生物学プロトコルは、通常、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ（１９８９，１９９２）、およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８８）、およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）、およびＰｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）、およびＷａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ ｉｎ Ｂｉｒｒｅｎ ｅｔ ａｌ（編） Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌｓ．１−４ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）に記載されたもの、ならびに米国特許第４，６６６，８２８号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８０１，５３１号；同第５，１９２，６５９号、および同第５，２７２，０５７号に示されたような方法に本質的に従い、これらは参照により本明細書に組み込まれる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、標準的なＰＣＲプロトコル：Ａ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載された通りに実施した。フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）と組み合わせたインサイチュＰＣＲは、特定のＤＮＡおよびｍＲＮＡ配列を含有する細胞の検出に使用することができる（Ｔｅｓｔｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １９９６，８７：３８２２）。ＲＴ−ＰＣＲを実施する方法は、当該技術分野で周知である。

細胞培養
ＨｅＬａ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）は、Ｃｚａｕｄｅｒｎａ，ｅｔ ａｌ．（ＮＡＲ，２００３．３１：６７０−８２）に記載の通りに培養した。ヒトケラチノサイトは、１０％ＦＣＳを含有するダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃で培養した。マウス細胞株のＢ１６Ｖ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）は、１０％ＦＣＳを含有するダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃で培養した。培養条件は、（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｉｎｄ Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９７，１９（４）：２３１−９）に記載の通りであった。

いずれの場合にも、細胞を、ウェル当たり約５０，０００細胞の密度で本明細書に記載の実験に供し、本発明による二本鎖核酸を２０ｎＭの濃度で添加し、それにより、二本鎖核酸を、１μｇ／ｍｌの以下に記載の特許脂質を用いて複合体化した。

組織化学／顕微鏡図において、矢印は、組織の染色に注意を向けるために付け加えられた。

動物モデル
緑内障および網膜神経節細胞（ＲＧＣ）死のモデル系
ラットにおけるＯＮＣモデル
様々な動物モデルが、緑内障を治療する上でのｓｉＲＮＡ治療の効果を研究するのに有用である。ラットの視神経挫滅モデルでは、麻酔ラットの眼窩視神経（ＯＮ）を眼窩上からのアプローチによって露出させ、髄膜を切り取り、ＯＮ内の全ての軸索を、鉗子で１０秒間押し潰すことによって篩板から２ｍｍの位置で切断する。緑内障を治療または予防するための本発明の活性阻害剤（例えば、ｓｉＲＮＡ）の試験を、例えば、Ｐｅａｓｅ ｅｔ ａｌ．（Ｊ． Ｇｌａｕｃｏｍａ，２００６，１５（６）：５１２−９．Ｍａｎｏｍｅｔｒｉｃ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ＴｏｎｏＬａｂ ａｎｄ ＴｏｎｏＰｅｎ ｔｏｎｏｍｅｔｅｒｓ ｉｎ ｒａｔｓ ｗｉｔｈ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｌａｕｃｏｍａ ａｎｄ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｍｉｃｅ）によって記載された動物モデルで行なう。

成体Ｗｉｓｔａｒラットにおける視神経挫滅（ＯＣＮ）モデルも、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）死を研究するための認められているモデルである。このモデルでのＲＧＣ死の発症と動態は非常に再現性が高く；ＲＧＣアポトーシスがＯＣＮ後４〜５日目に始まり；大量のＲＧＣ損失（約５０〜６０％）がＯＣＮ後７〜１０日目に観察され；ＲＧＣ損失の９５％がＯＣＮ後３〜４週までに起こる。このモデルは、試験薬物のインビボでの神経保護効力の立証を可能にする。

いくつかの非限定的な例では、表Ａ１〜Ａ４に示される遺伝子に対するｓｉＲＮＡ化合物は、これらのｓｉＲＮＡ化合物が、局所的にかつ非侵襲的に眼に送達されたときに、緑内障および／またはＲＧＣ死を治療および／または予防することを示すこの動物モデルで試験される。

ラットにおけるＩＯＰモデル
眼圧（ＩＯＰ）は、眼の内側の流体圧の尺度である。この流体は、房水と呼ばれるが、これは、循環した後、特殊化した流出路を経由して排出される。一般的な形態の緑内障で見られるように、この排出システムが適切に機能しない場合、眼の内側の圧力が高まる。Ｃａｓｅｙ Ｅｙｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，Ｏｒｅｇｏｎ）でＪ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎ博士と同僚によって開発されたＢｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙラットにおける高眼圧症のモデルが本研究で使用されている。Ｍｏｒｒｉｓｏｎモデルは、房水流出路の遮断を引き起こす、強膜上静脈への高張食塩水の注射を伴う。この手順は、眼圧の漸増とＲＧＣの段階的な死をもたらす。重要なことに、このモデルで観察される内部網膜萎縮、視神経変性、および視神経頭再構築は、ヒト緑内障で見られるものと同じである。したがって、Ｍｏｒｒｉｓｏｎモデルは、最も優れた緑内障の前臨床齧歯類モデルと考えられる。

ラットにおけるインビボ軸索切断モデル
このモデルでは、ＲＧＣアポトーシスを成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける視神経（ＯＮ）の軸索切断によって誘導する。このモデル系でのＲＧＣ死の発症と動態は非常に再現性が高く、非侵襲的に投与されたｓｉＲＮＡ化合物のインビボでの神経保護効力の立証を可能にする。この方法を用ると、ＲＧＣ死の時間経過は予測通りの経過をたどる。すなわち、細胞死は５日目に始まり、２週までに、これらのニューロンの９０％超の速やかな損失にまで進む。

ビヒクル製剤および例示的点眼製剤
水性点眼製剤は、任意で、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝剤、ホウ酸塩緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、酒石酸塩緩衝剤、酢酸塩緩衝剤、アミノ酸、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなど）、等張物質（例えば、ソルビトール、グルコース、およびマンニトールなどの糖類、グリセリン、濃グリセリン、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールなどの多価アルコール類、塩化ナトリウムなどの塩類）、防腐剤または消毒剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ｐ−オキシ安息香酸メチルまたはｐ−オキシ安息香酸エチルなどのｐ−オキシ安息香酸、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、ソルビン酸またはその塩、チメロサール、クロロブタノールなど）、可溶化促進剤または安定剤（例えば、シクロデキストリンおよびその誘導体、ポリビニルピロリドンなどの水溶性ポリマー）、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０）などの界面活性剤、ｐＨ調整物質（例えば、塩酸、酢酸、リン酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウムなど）、キレート剤（例えば、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、縮合リン酸ナトリウム）などのような、普通に組み込まれる様々な添加物を含有する。

水性懸濁液の形態の点眼製剤はまた、上記の添加物の他に、懸濁剤（例えば、ポリビニルピロリドン、モノステアリン酸グリセリン）および分散剤（例えば、チロキサポールやポリソルベート８０などの界面活性剤、アルギン酸ナトリウムなどのイオン性ポリマー）を含み、それにより、点眼製剤がさらに均一な微粒子および十分に分散した水性懸濁液となるのを確実にしてもよい。

眼科用軟膏は、精製ラノリン、ワセリン、プラスチベース、流動パラフィン、ポリエチレングリコールなどのような、既知の軟膏基剤を含んでいてもよい。

例示的点眼製剤１：
ＰＢＳ中のｓｉＲＮＡ化合物の製剤（「裸のｓｉＲＮＡ製剤」）は、通常、乾燥ｓｉＲＮＡをＰＢＳに溶解することによって調製される。この製剤は、組成物の容量で約５μｇ／μｌ〜約６０μｇ／μｌの範囲の量で通常存在する少なくとも１つのｓｉＲＮＡ化合物を含む。

非限定的に例において、ＰＢＳ中のｓｉＲＮＡ化合物の製剤を以下のように調製した：滅菌条件下で、５００ｍｇの乾燥ｓｉＲＮＡを２５ｍｌの滅菌再蒸留水（ＤＤＷ）に溶解させて、透明な２０ｍｇ／ｍｌ溶液を得た。この溶液を、使用するまで−８０℃で保存した。その後、ＤＤＷ中の２０ｍｇ／ｍｌストック溶液を、以下のように、ＰＢＳ中で、１００μｇ／３μｌの作業濃度にした：３２５μｌの２０ｍｇ／ｍｌのｓｉＲＮＡ溶液ストック（６．５ｍｇ）を０．１５ＭのＮａＣｌおよびＥｔＯＨにより沈殿させ、組織培養用のラミナーの下で乾燥させた（滅菌条件）。６．５ｍｇの乾燥ｓｉＲＮＡを１３０μｌのＰＢＳに溶解させて、点眼製剤１を形成させた。

例示的点眼製剤２：
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ化合物は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ） １Ｍ、ｐＨ８．０（例えば、Ｓｉｇｍａ（カタログ＃Ｔ−１５０３）から入手可能）中で処方される。

非限定的に例において、１２１．１ｇのＴＲＩＳベース（Ｓｉｇｍａ ＃Ｔ１５０３）を７００ｍｌのｄｄＨ_２Ｏに溶解させた。濃ＨＣｌを添加して所望のｐＨ８を得た。最終的に１Ｌ溶液になるようにＤＤＷを添加した。滅菌条件下で、４２．４２６ｍｇのｓｉＲＮＡ化合物粉末を２．１ｍｌの滅菌再蒸留水に溶解させ、透明な２０ｍｇ／ｍｌ（１．５ｍＭ）ストック溶液を得た。このストック溶液を、使用するまで−８０℃で保存した。滅菌条件下で、対応量のｓｉＲＮＡストックを凍結乾燥させ、対応量の１ＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８に再懸濁した。

例示的点眼製剤３：
使用される粘度増強剤の濃度は、典型的には、約０．０５〜約５．０％（ｗ／ｖ）、およびより望ましくは約０．１〜約３．０％（ｗ／ｖ）の範囲内である。１つの好ましい眼科用組成物は、約０．０１〜約０．０７５％（ｗ／ｖ）の有効成分；約０．１５〜約２．５％（ｗ／ｖ）のポリオキシル４０ステアレート；約０．１〜約３．０％（ｗ／ｖ）の、２５ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースから選択されるセルロース増粘剤；および約０．０００１％〜約０．０１％（ｗ／ｖ）の、ブチル化ヒドロキシトルエンまたはチオ硫酸ナトリウムから選択される酸化防止剤を含む。

ポリオキシル４０ステアレートまたはポリオキシエチレンセチルエーテルまたはポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテルなどの界面活性剤とｓｉＲＮＡを組み合わせることにより、眼にあまり刺激を起こさせず、眼でより良く分布し、かつ安定性がより高い点眼調製物が得られる。酸化防止剤やセルロース増粘剤を含めると、眼での活性治療剤（すなわち、ｓｉＲＮＡ）の分布と安定性とがさらに改善される。

例えば、等張剤、緩衝剤、防腐剤、およびまたはｐＨ調整剤などの、他の賦形剤も添加してもよい。所望の点眼調製物を得るために、適当な量の滅菌精製水が存在する。

眼科用組成物のｐＨは、当該技術分野で知られているような、眼科用調製物に通常使用される範囲内であるが、望ましくは、５〜８の範囲内である。この製剤は、組成物の容量で約６．６μｇ／μｌ〜約５０μｇ／μｌの範囲の量で通常存在する少なくとも１つのｓｉＲＮＡ化合物をさらに含む。

例示的点眼製剤４：
薬物の水晶体への局所送達では、眼表面での薬物保持が重要であると考えられる。理論に束縛されることの望まないが、眼表面での保持の増大によって、薬物の角膜から房水、その後、水晶体への眼内吸収が増大する。

いくつかの実施形態では、局所懸濁液が好ましい。局所懸濁液の非限定的な例としては、（１）ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ、０．５％ｗ／ｖ）、（２）キサンタンガム（０．５％ｗ／ｖ）、（３）ジェランガム（０．５％ｗ／ｖ）、（４）カルボポール（０．２５％ｗ／ｖ）、および（５）カルボポール（０．２５％ｗ／ｖ）−ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）（０．２５％ｗ／ｖ）が挙げられる。粘度測定は、粘度計を用いて行なわれる。

製剤は、組成物の容量で約５μｇ／μｌ〜約６０μｇ／μｌの範囲の量で通常存在する少なくとも１つのｓｉＲＮＡ化合物をさらに含む。

例示的点眼製剤５：
眼科用組成物では、防腐剤の有効性を高めるために、キレート剤が任意で使用される。好適なキレート剤は、当該技術分野で知られているものであり、限定することを意図するものではないが、エデト酸二ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、およびエデト酸二カリウムのようなエデト酸（ＥＤＴＡ）塩が有用なキレート剤の例である。ＥＤＴＡが４個のカルボン酸官能基を有する種を指すことや、これらのカルボン酸基が、それが含まれる組成物のｐＨに応じて、プロトン化され得るまたは脱プロトン化され（すなわち、塩形態となり）得ることが理解される。

緩衝剤は、眼科使用のためにｐＨを所望の範囲に調整するために一般に使用される。通常、約５〜８のｐＨが望ましいが、これは、治療活性剤または他の賦形剤の安定性または溶解度などを考慮して、調整する必要があり得る。

眼科用組成物中の別のよく使用される賦形剤は、粘度増強剤、または増粘剤である。増粘剤は、好都合な投与のために製剤の形態を改良することから、眼との接触を高めて、バイオアベイラビリティーを改善することまで、様々な理由で使用される。粘度増強剤は、単糖、多糖などの親水性基、エチレンオキシド基、ヒドロキシル基、カルボン酸基、または他の荷電官能基を含有するポリマーを含む。いくつかの例に限定することを意図するものではないが、有用な粘度増強剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポビドン、ポリビニルアルコール、およびポリエチレングリコールである。

製剤は、組成物の容量で約５μｇ／μｌ〜約６０μｇ／μｌの範囲の量で通常存在する少なくとも１つのｓｉＲＮＡ化合物をさらに含む。

例示的点眼製剤６（「製剤Ａ」）：
製剤「Ａ」：２つの溶液、ＡとＢを調製する。

溶液Ａの調製：４％メチルセルロース水溶液。０．４ｇのメチルセルロース２５（ＳｃｉｅｎｃｅＬａｂ．ｃｏｍ，Ｃａｔ＃ ＳＬＭ２０５０）を、５０ｍｌ滅菌チューブ（Ｎｏｒｂｏｏｋ，Ｃａｔ＃ ７０８２−５１）中の最終容量１０ｍｌの無発熱原性注射用水（ＷＦＩ）に溶解させる。中に小型の滅菌撹拌子を入れ、キャップを閉める。メチルセルロースが乳白色の溶液を形成するまで少なくとも５分間撹拌しながら、沸騰水浴に保つ。

溶液Ｂの調製：２％グリセロール；０．０２％（ｖ／ｖ） ＥＤＴＡ溶液。３３３．３ｕＬの６０％グリセロール（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ＃ Ｇ６２７９）と２μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ＝８（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ＃ Ｅ９８８４）（最終−１００ｕＭ）を９．６６５ｍｌのＷＦＩ（Ｎｏｒｂｏｏｋ，Ｃａｔ＃ ７０８２−５１）に添加する。最終容量−１０ｍＬ。

溶液Ｂ中の（作業濃度に関して）２倍のｓｉＲＮＡ溶液を調製する。注意：ストックｓｉＲＮＡ容量が大幅に高い場合、後から２倍のｓｉＲＮＡ溶液中で容量を調整することができるように、溶液Ｂの最終容量をうまく１０ｍＬ未満に保つ。

作業ｓｉＲＮＡ溶液の調製：
溶液Ａを約４０〜５０℃（依然として液体）になるまで制御して冷却し、所望の容量を等容量の溶液Ｂ中の２倍のｓｉＲＮＡ溶液と混合する。

最終的なｓｉＲＮＡ製剤は、ＷＦＩ中に２％メチルセルロース、１％グリセロール、および０．０１％（ｖ／ｖ）（５０ｕＭ） ＥＤＴＡを含有する。最終的なｐＨは、約７．４、モル浸透圧濃度は、ヒト涙液膜に類似するべきである。最終製剤中のｓｉＲＮＡ濃度は、３３．３ｍｇ／ｍｌである。

週に１度新鮮なものを調製し、１日用量に分注しなければならない。これらのアリコートを４℃に保つ。適用前に、この用量を室温で２０〜３０分間加温する。

メチルセルロースの最終濃度は、約０．１％〜約３％ｗ／ｖ、約０．１％〜約２％ｗ／ｖ、約０．１％〜１．５％ｗ／ｖ メチルセルロース、好ましくは約２％ｗ／ｖである。グリセロールの最終濃度は、約０．１％〜約５％ｖ／ｖ、約０．５％〜約２％、好ましくは約１％ｖ／ｖである。ＥＤＴＡの最終濃度は、約０．００１％〜約０．０５％、約０．００５％〜約０．０１％、好ましくは約０．０１％ｗ／ｖである。

例示的点眼製剤７：
いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡを、市販の潤滑点眼製剤中で処方する。市販の潤滑点眼製剤の非限定的な例は、Ａｌｃｏｎ Ｉｎｃから入手可能なシスタン（登録商標）である。このような市販の潤滑点眼製剤は、通常、ポリエチレングリコールおよび／またはプロピレングリコール、ホウ酸などの消毒剤および／または抗ウイルス剤、ヒドロキシプロピルグアーなどのゲル化剤、塩化カリウムおよび／または塩化ナトリウムおよび／または塩化マグネシウムおよび／または塩化カルシウムおよび／または塩化亜鉛、ポリクアド（登録商標）などの防腐剤、ならびに精製水を含む。滅菌条件下で、３００ｍｇのｓｉＲＮＡ粉末を１５ｍｌの滅菌再蒸留水に溶解させて、透明な２０ｍｇ／ｍｌ溶液を得る。この溶液を、使用するまで−８０℃で保存する。その後、再蒸留水中の２０ｍｇ／ｍｌストック溶液を、以下のように、製剤中、１００μｇ／３μｌの作業濃度にする。

最終的な処方量１．７ｍｇのｓｉＲＮＡを得るために、２０ｍｇ／ｍｌのｓｉＲＮＡストック８５μｌ（１．７ｍｇ）を、０．１５ＭのＮａＣｌおよびＥｔＯＨにより沈殿させ、組織培養用のラミナーの下で乾燥させる（滅菌条件）。

３３．３ｍｇ／ｍｌのｓｉＲＮＡ溶液を得るために、１．７ｍｇの乾燥ｓｉＲＮＡを、５１μＬのシスタン（登録商標）に溶解させる。

ｓｉＲＮＡ化合物は標的遺伝子のノックダウン（ＫＤ）を誘導する
実施例１：ｓｉＲＮＡ化合物のインビトロ試験
約１．５〜２×１０^５個の被験細胞（ヒト遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡの場合、ＨｅＬａ細胞および／または２９３Ｔ細胞、ならびにラット／マウス遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡの場合、ＮＲＫ５２（正常ラット腎臓近位尿細管細胞）細胞および／またはＮＭｕＭＧ細胞（マウス乳房上皮細胞株））を、６ウェルプレート中のウェルごとに播種した（７０〜８０％コンフルエント）。

約２４時間後、細胞を、最終濃度５ｎＭまたは２０ｎＭのリポフェクトアミン（商標）２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｓｉＲＮＡ化合物でトランスフェクトした。これらの細胞を、ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で７２時間インキュベートした。

トランスフェクションの陽性対照として、ホスファターゼおよびテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）−Ｃｙ３標識ｓｉＲＮＡ化合物を使用した。（アンチセンス鎖とセンス鎖の両方の糖残基の２’位で修飾されており、この２’位の部分はメトキシである）交互の修飾リボヌクレオチドと未修飾リボヌクレオチドを有しており、アンチセンス鎖の５’末端および３’末端のリボヌクレオチドが、その糖残基中で修飾され、かつセンス鎖の５’末端および３’末端のリボヌクレオチドが、その糖残基中で未修飾である、様々な化学修飾平滑末端ｓｉＲＮＡ化合物を試験した。別のｓｉＲＮＡ化合物は、交互のパターンのメトキシ部分を有するアンチセンスと、２つの２’５’架橋により結合された３個のリボヌクレオチドを３’末端に有するセンス鎖とを有する平滑末端構造を含み；３’末端の２’５’架橋により結合された３個のリボヌクレオチドを有するアンチセンス鎖とセンス鎖とを含む別のｓｉＲＮＡ化合物を使用した。被験化合物のいくつかは、交互のパターンのメトキシ部分を有するアンチセンスと、３’末端または３’の最後から２番目の位置に１または２個のＬ−ヌクレオチドを有するセンス鎖とを有する平滑末端構造を含んでいた。

ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ化合物を、ｓｉＲＮＡ活性の陰性対照として使用した。トランスフェクションの７２時間後に、細胞を採取し、細胞からＲＮＡを抽出した。トランスフェクション効率を蛍光顕微鏡検査で試験した。特定の好ましいｓｉＲＮＡ構造を用いた遺伝子発現の阻害パーセントを、内在性遺伝子を発現する細胞における標的遺伝子のｑＰＣＲ解析を用いて決定した。

一般に、インビトロ試験のために選択された特定の配列を有するｓｉＲＮＡは、ヒトと非ヒト霊長類、ラット、またはウサギ遺伝子などの第２の種とに特異的なものであった。これらのＲＮＡ配列を有し、かつ本明細書に記載の通りに修飾されたｓｉＲＮＡを用いて、同様の結果が得られる。

アポトーシスや神経保護に関する遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを同様の手順によって試験すると、活性がありかつその対応する標的遺伝子のノックダウンを誘導することができることが分かった。

非侵襲的投与用に調製され、点眼によって投与されるｓｉＲＮＡは、インビボで標的網膜組織に送達される
実施例２：蛍光顕微鏡検査および共焦点顕微鏡検査でモニタリングしたときのマウス視組織におけるＣＹ３標識ｓｉＲＮＡ（ＰＢＳ中に処方されたｓｉＲＮＡ）の分布
本研究では、局所眼内経路を経由した涙腺および眼構造へのｓｉＲＮＡのインビボ送達が示された。

略語：Ｅ．Ｄ．＝点眼；ＩＳＨ＝インサイチュハイブリダイゼーション

本研究の目的は、非侵襲的な局所眼内経路を経由したＤＤＩＴ４−Ｃｙ３標識ｓｉＲＮＡ（ＲＴＰ８０１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ化合物）の涙腺への送達を試験することであった。局所眼内経路を、ｓｉＲＮＡの涙腺、眼の前房、網膜、および視神経への送達について評価した。

材料および方法

ＤＤＩＴ４−Ｃｙ３ ｓｉＲＮＡ（マウスＲＴＰ８０１に対するｓｉＲＮＡ）を、ＰＢＳ中の２０ｍ−／ｍｌストック溶液として処方し、使用するまで−８０℃で保存した。

実験手順
本研究には、以下の表Ｃ２に記載される６つの実験群が含まれた：以下のように、マウスを単一のｓｉＲＮＡ ＤＤＩＴ４−Ｃｙ３で処置した：
第Ｖ群（ＡおよびＢ）：用量レジメ：５０μｇ／マウス／３μｌ／眼、投与経路：右点眼（Ｅ．Ｄ．）；
第Ａｍ−Ｖ−Ａ群、第Ａｍ３−ＶＩＩＩ群、第Ａｍ３−ＩＸ群：用量レジメ：５０μｇ／マウス／３μｌ／眼、投与経路：両眼、点眼（Ｅ．Ｄ．）；
第ＶＩ−Ａ群：用量レジメ：２０μｇ／マウス／３μｌ／眼、投与経路：右眼、点眼（Ｅ．Ｄ．）；
第ＶＩＩ群、第Ａｍ−ＶＩＩ群：無処置対照。

ｓｉＲＮＡ用量を滅菌条件下で調製した。ｓｉＲＮＡアリコートを投与前に室温で少なくとも３０分間解凍した。（各々のマウス当たりの）アリコート当たりの総量には、計算容量のさらに２０％が含まれた。指定されたｓｉＲＮＡ用量を、眼１つ当たり、３μｌ（実験群Ｖ〜ＶＩ）容量で送達した。

麻酔：以下のように、ケタミン／キシラジン混合液を用いてマウスに麻酔をかけた：ケタミン０．８５ｍｌ＋キシラジン０．１５ｍｌ＋食塩水０．９ｍｌ、混合溶液０．１ｍｌ／２０ｇｒ体重（ＢＷ）。

点眼（Ｅ．Ｄ．）送達：とがっていないピペットチップを用いて、３μｌ試料容量を処置される眼（角膜表面）にゆっくりと滴下し；麻酔誘発低体温を防ぐために、動物を暖かい環境に置き、意識を取り戻した後、ケージに戻した。

計画的安楽死：処置後、研究デザイン（表Ｃ２、終了の時点）に従って、全ての群のマウスを安楽死させた。

終了工程は心穿刺と採血により達成され；採取された血清／血漿は、さらなるｓｉＲＮＡ血液検出解析のために保存された（−２０℃）。

組織回収：全ての動物の視神経、涙腺（左右）を含む左右眼を摘出し、第Ｖ−Ａ群の動物の脳（脳の前部および中央部、前頭方向面）、第ＶＩＩ群、第Ａｍ３−ＶＩＩＩ群、第Ａｍ３−ＩＸ群の脳（脳の前部および中央部、前頭方向面）を摘出し、最適切断温度（ＯＣＴ）化合物中に包埋し、クライオスタットで切片化して、８μｍのスライスにし、これを顕微鏡スライド（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ／Ｐｌｕｓ（商標））上に置いた。切片を９５％ＥｔＯＨ中で７分間固定した後、ＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ）で対比染色し、無水ＥｔＯＨ中で１分間インキュベートし、キシレン中で５分間インキュベートし、風乾させ、標本にした。

組織評価：光学顕微鏡検査とデジタルイメージングを用いて、ｓｉＲＮＡの送達を評価した。組織学（顕微鏡）検査によって、単独または涙腺の導管細胞と組み合わせた腺房などの特定の細胞または構造内の明瞭な蛍光シグナルが示された場合にのみ、組織断片が陽性である（すなわち、Ｃｙ３ ＤＤＩＴ４ ｓｉＲＮＡ細胞内取込みが成功した）とみなされた。角膜、隅角、毛様体などの前眼房構造、または網膜（網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）、網膜神経節細胞（ＲＧＣ））などの後眼房の場合には、バックグラウンドＤＡＰＩ染色が組織構造を識別するのに役立った。。組織学検査によって、ある実験群の全ての動物が、検査された細胞型／組織内で同じ蛍光シグナルを示すことが示された場合、送達が陽性であるとみなされた（すなわち、投与の時点または経路）。

結果および考察
全ての凍結切片を光学顕微鏡検査（明視野、ＢＦ）および蛍光共焦点顕微鏡検査で解析した。蛍光シグナルを以下の組織で可視化した。

Ｅ．Ｄ．送達による網膜（網膜色素上皮細胞、網膜神経節細胞） 図１Ａ〜１Ｂ：マウス網膜に取り込まれたＣｙ３標識ＤＤＩＴ４ ｓｉＲＮＡの代表的画像。

図１Ａ：Ｅ．Ｄ．投与の１時間後の網膜の蛍光顕微鏡検査（上のパネル、倍率４０倍）。右の矢印は、Ｃｙ３染色された網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を特定し、左の矢印は、Ｃｙ３染色された網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）を特定している。網膜神経節細胞層の共焦点顕微鏡検査（下のパネル、倍率６０倍）。下段の９つの図は、Ｃｙ３標識組織（左）、明視野（ＢＦ、中央）、およびこの２つの合成（Ｍ、右）を示す。矢印は、標識されたＲＧＣを指している。

１Ｂの図：Ｅ．Ｄ．投与の４時間後の網膜の共焦点顕微鏡検査（上４０倍、下６０倍）。ＲＧＣのＣｙ３染色が際立っている。

涙腺（腺房細胞、導管細胞）へのｓｉＲＮＡの点眼送達 図２Ａ〜２Ｄ：マウス涙腺の導管および腺房細胞に取り込まれたＣｙ３標識ＤＤＩＴ４ ｓｉＲＮＡの代表的画像。

図２Ａ：Ｅ．Ｄ．投与の１時間後の涙腺の蛍光顕微鏡検査（Ｍ＝合成されたＤＡＰＩ−Ｃｙ３染色）。中央の矢印は腺房細胞を指し、右の矢印は導管上皮細胞を指し、左の灰色の矢印は涙管を指す（倍率６０倍）。

図２Ｂ：Ｅ．Ｄ．投与の１時間後の涙腺の共焦点顕微鏡検査（上４０倍および下のパネル６０倍）。合成された画像Ｍにおける矢印は涙管を指している。

図２Ｃ：Ｅ．Ｄ．投与の１時間後の涙腺の共焦点顕微鏡検査（４０倍）。矢印は腺房細胞を指している。

図２Ｄ：Ｅ．Ｄ．投与の４時間後の涙腺の共焦点顕微鏡検査（６０倍）。

図３Ａ〜３Ｃは、投与１時間および４時間後の、点眼による投与後のラット脈絡膜におけるＣｙ３−ｓｉＲＮＡの蓄積の時間経過を示す。脈絡膜、外核層、ＲＰＥ、および光受容体細胞の外節層は、Ｃｙ３染色を示している。

図４は、点眼による投与の１時間後の線維柱帯網末端毛様体へのＣｙ３−ｓｉＲＮＡ送達を示す。

様々な化学修飾ｓｉＲＮＡ（構造モチーフ）を、マウスＣｙ３標識ｓｉＲＮＡを用いて試験した。上で示されたものと同様の組織分布が、試験された全ての構造：両方の鎖に交互の天然リボヌクレオチドと２’Ｏ−Ｍｅ糖修飾リボヌクレオチドを有する構造Ｂ；アンチセンス鎖上の交互の天然リボヌクレオチドおよび２’Ｏ−Ｍｅ糖修飾リボヌクレオチドと、センス鎖の３’末端の２’５’ヌクレオチド間連結により結合された３個のリボヌクレオチドとを有する構造Ｉ；ならびにアンチセンス鎖とセンス鎖の各々の３’末端の２’５’ヌクレオチド間により結合された３個のリボヌクレオチドを有する構造について観察された。

実施例３：ラットにおける処方されたｓｉＲＮＡの局所眼内経路送達の検討（ＰＢＳ中またはメチルセルロース２％中に処方されたｓｉＲＮＡ（「製剤Ａ」））
本研究では、ＰＢＳ中または製剤Ａ中のいずれかに処方され、点眼によって適用されるＤＤＩＴ４−Ｃｙ３ ｓｉＲＮＡの眼内送達をラットにおいて試験した。

実験デザイン：
１）第Ｉ群、第ＩＩ群、第ＩＩＩ群、第ＩＶ群、第Ｖ群：用量レジメ：製剤Ａ中に処方されたｓｉＲＮＡ；１００μｇ／ラット／３μｌ／眼、投与経路：両側性の点眼（Ｅ．Ｄ．）；
２）第Ｉａ群、第ＩＩａ群、第ＩＩＩａ群、第ＩＶａ群、第Ｖａ群：用量レジメ：ＰＢＳ中に処方されたｓｉＲＮＡ；１００μｇ／ラット／３μｌ／眼、投与経路：両側性の点眼（Ｅ．Ｄ．）；
３）第ＶＩ群：製剤Ａの処方ビヒクル（ｓｉＲＮＡなし）で処置された対照群；１００μｇ／ラット／３μｌ／眼、投与経路：両側性の点眼（Ｅ．Ｄ．）；
４）第ＶＩＩ群：無傷対照

ｓｉＲＮＡ用量を滅菌条件下で調製した。ｓｉＲＮＡアリコートを投与前に室温で少なくとも３０分間解凍した。（各々のマウス当たりの）アリコート当たりの総量には、計算容量のさらに２０％が含まれた。指定されたｓｉＲＮＡ用量を、眼１つ当たり、３μｌ容量で送達した。

麻酔：エキセジン（４ｍｌ／ｋｇ）を用いて第Ｉ群〜第ＶＩＩ群のラットに麻酔をかけた。

終了工程：研究終了時に、エキセジン（４ｍｌ／ｋｇ）によって動物に深く麻酔をかけた。その後、蠕動ポンプ標準レジメを用いて、ラットに新鮮な１０％中性緩衝ホルマリンを皮質内灌流させた。

組織回収：全ての動物の視神経を含む左右の眼を除核し、穴を開け、ゆっくりと回転させながら１０％中性緩衝ホルマリン中、室温でさらに１時間、後固定し、ショ糖勾配によって、４℃で一晩、段階的に凍結保護し、回転させながら４℃で一晩、最適切断温度（ＯＣＴ）化合物中で凍結保護した後、ＯＣＴ化合物中に包埋し、クライオスタットで切片化して、１２μｍのスライスにし、これを顕微鏡スライド（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ／Ｐｌｕｓ）上に置いた。切片をＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ）で対比染色し、標本にした。

光学顕微鏡検査とデジタルイメージングを用いて、ｓｉＲＮＡの送達を評価した。組織学検査によって、ある実験群内の全ての動物が、特定の細胞型／組織内で同じ蛍光シグナルを示すことが示された場合、組織断片が陽性であるとみなされた（すなわち、前眼房、網膜、および視神経送達でのＣｙ３ ＤＤＩＴ４＿１ ｓｉＲＮＡ導入が成功したとみなされた）。

結果：全ての凍結切片を光学顕微鏡検査（明視野、ＢＦ）および蛍光共焦点顕微鏡検査で解析した。蛍光シグナルを網膜色素上皮細胞および網膜神経節細胞で可視化した。特に、ＰＢＳ中に処方された化合物は、投与の３時間後に眼組織中で最大分布に達し、６時間の時点で該組織から排出された。しかしながら、製剤Ａ中に処方された化合物は、投与２４時間後に眼組織に最大限分布した。

実施例４：カニクイザルにおける（ＰＢＳ中に処方された）ｓｉＲＮＡの眼内分布

本研究の目的は、カニクイザルの眼の表面への単回局所眼内投与後の、ＰＢＳ中に処方されたｓｉＲＮＡの組織分布を調べることであった。全ての組織を、必要に応じて、約１〜約２ｇ試料または全体として、３つ１組で瞬間凍結させた。

ＲＮＡ精製
凍結試料を液体窒素下で微小粉末になるまですり潰した。少量の粉末組織をＲＮＡ抽出に使用した。残りの組織は、さらに使用するまで−８０℃で保存した。ポリＡＲＮＡを、ＭｉｃｒｏＰｏｌｙ（Ａ）Ｐｕｒｉｓｔ ｍＲＮＡ精製キット（＃１９１９）を用いて各々の試料から抽出し、組織または細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡ単離をするための製造元のプロトコルに従って処理した。ＲＮＡの最終的な収量およびスペクトル特性を以下の表Ｃ５にまとめる。

脾臓由来の１μｇおよびリンパ節由来の０．７μｇのポリＡ ＲＮＡ調製物を、ランダムプライマーを用いるｃＤＮＡ合成に使用した。Ｃａｓｐ２遺伝子が両方のｃＤＮＡ調製物から首尾よく増幅された。

結果を下記の表Ｃ６にまとめる。

結論：カニクイザルの眼の表面への単回局所眼内投与後の、ＰＢＳ中に処方されたｓｉＲＮＡは、神経網膜に達し、ｑＰＣＲ Ｓ&Ｌ法によって測定することができる。

実施例５：マウスの標的網膜組織への（ＴＲＩＳ中に処方された）ｓｉＲＮＡの送達
様々なフルオロフォアで標識されたｓｉＲＮＡ分子の局所送達の検討
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ） １Ｍ、ｐＨ８中に処方された２０μｇの様々な蛍光標識ｓｉＲＮＡの投与１時間後の、マウスへの局所送達。

試験されたｓｉＲＮＡ：
Ｃｙ３−ＱＭ５；Ｃｙ３−ＤＤＩＴ４；Ｃｙ３．５−ＤＤＩＴ４；ＤＤＩＴ４＿１ Ｄｙ−６４９／Ｃ６；ＦＩＴＣ−ＣＮＬ＿１；３’Ｃｙ３−ＣＮＬ＿１；Ｃｙ３−Ｃａｓｐ２＿４ Ｌ−ＤＮＡ；Ｃｙ３−ＡＳ−Ｃａｓｐ２＿４；ＴＧＡＳＥＩＩ−ＦＡＭ；ＨＮＯＥＬ−ＦＡＭ。（ＱＭ５は、ｐ５３を標的とするラット／マウスのｓｉＲＮＡであり；ＣＮＬは、対照スクランブルｓｉＲＮＡである）

例示的な化学修飾Ｃａｓｐ２ｓｉＲＮＡ化合物は以下の通りであった：
１．センス：ＧＣＣＡＧＡＡＵＧＵＧＧＡＡＣＵＣ２ｐＣ２ｐＵ、１７および１８は、２’−５’−架橋である
アンチセンス：ｍＡＧｍＧＡｍＧＵｍＵＣｍＣＡｍＣＡｍＵＵｍＣＵｍＧＧｍＣ−ｃｙ３
２．センス：ＧＣＣＡＧＡＡＵＧＵＧＧＡＡＣＵＣ；ＬｄＣ；ＬｄＴ １８および１９は、Ｌ−ＤＮＡである
アンチセンス：ｍＡＧｍＧＡｍＧＵｍＵＣｍＣＡｍＣＡｍＵＵｍＣＵｍＧＧｍＣ−ｃｙ３
３．センス：ＧＣＣＡＧＡＡＵＧＵＧＧＡＡＣＵＣ；ＬｄＣ；Ｕ１８は、Ｌ−ＤＮＡ部分である
アンチセンス：ｍＡＧｍＧＡｍＧＵｍＵＣｍＣＡｍＣＡｍＵＵｍＣＵｍＧＧｍＣ−ｃｙ３

ＬｄＣ、ＬｄＴは、Ｌ−ＤＮＡヌクレオチドを指し、ｍＡ、ｍＣ、Ｍｇ、Ｍｕは、２’Ｏ−メトキシリボヌクレオチドを指す。

処方されたもの（処方化合物）：以下のｓｉＲＮＡからなる、１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０中のｓｉＲＮＡ：ＱＭ５−Ｃｙ３＃１、ＱＭ５−Ｃｙ３＃１０、ＤＤＩＴ４＿１−Ｃｙ３、ＤＤＩＴ４＿１Ｃｙ３．５、Ｒｅｄｄ１４（ＤＤＩＴ４＿１） Ｄｙ−６４９／Ｃ６、ＦＩＴＣ−ＣＮＬ＿１ＲＤ／ＣＮＬ＿１ＦＤ、スクランブル３’Ｃｙ３ＣＮＬ １、Ｃｙ３−ＡＳ−ＣＡＳＰ２＿４−Ｓｔｒｕｃ−Ｌ−ＤＮＡ−ｓ（センスの３’にある２残基）−ｐｌｕｓ−ａｌｔ ＡＳ、Ｃｙ３ＡＳ− ＣＡＳＰ２＿４−Ｓｔｒｕｃ２−５−ｓ（センスの３’にある２残基）−ｐｌｕｓ−ａｌｔ ＡＳ、ＴＧＡＳＥＩＩ−ＦＡＭ、ＨＮＯＥＬ−ＦＡＭ。

試験物質の説明：滅菌条件下で、対応量のｓｉＲＮＡストックを凍結乾燥させ、対応量の１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８に再懸濁した（表Ｃ７参照）。

供給された量：（Ｂｉｏｓｐｒｉｎｇ，ＡＧによって合成された）各々の被験ｓｉＲＮＡについて１バイアル

保存条件：使用するまで凍結した。使用前に、試料を解凍し、室温に３０分間維持した。

対照品
陽性対照−ＰＢＳ中のＤＤＩＴ４＿１−Ｃｙ３、バッチ＃：１１７８２１

試験物質の説明：滅菌条件下で、４２．４２６ｍｇのＤＤＩＴ４＿１−Ｃｙ３粉末（ＢｉｏＳｐｒｉｎｇを２．１ｍｌの滅菌再蒸留水に溶解させて、透明な２０ｍｇ／ｍｌ（１．５ｍＭ）溶液を得た。この溶液を、使用するまで−８０℃で保存した。

ビヒクル−１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０−Ｓｉｇｍａ（カタログ＃Ｔ−１５０３）から外部調達する。１２１．１ｇのＴＲＩＳベース（Ｓｉｇｍａ ＃Ｔ１５０３）を７００ｍｌのｄｄＨ_２Ｏに溶解させた。濃ＨＣｌを用いて所望のｐＨ８を得た。最終的に１Ｌ溶液となるように、ＤＤＷを添加した。

ビヒクル−ＰＢＳ×１０−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（カタログ＃０２−０２３−５Ａ；（１０×ＰＢＳの場合） バッチ＃：６１９１１３）から外部調達する

試験系
動物：
種：マウス；系統：ＲＴＰ−８０１ＷＴ；ＣＭＦ−６０８ＷＴ
供給源：Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｒａｅｌ。
年齢：８〜１２週齢；体重範囲：１７〜２８ｇ
性別：オス；群サイズ：１；動物の総数：１４匹
動物管理：食餌：動物には市販の齧歯類用食餌を自由に与え、飲料水を自由に飲ませた。環境：（ｉ）少なくとも５日の順化。（ｉｉ）動物は全て、研究期間中ずっと、環境制御された収容条件で、アクセスが制限された施設に閉じ込められ、承認された標準操作手順（ＳＯＰ）に従って維持された。

実験デザイン
概要：本研究には、表Ｃ８に記載の１４の実験群が含まれた。

点眼によってｓｉＲＮＡ送達された実験群１〜１２、点眼によってビヒクル［ＴＲＩＳ １Ｍ ｐＨ８処置対照］送達された第１３群、および第１４群（無処置対照）。以下のように、マウスに１回分のｓｉＲＮＡを処置した：
−第１群〜第９群および第１２群：用量レジメ：２０μｇ／眼／３μｌ／ｓｉＲＮＡ、第１０群：用量レジメ ５．８１μｇ／眼／３μｌ／ｓｉＲＮＡ、第１１群：用量レジメ ２．２４μｇ／眼／３μｌ／ｓｉＲＮＡ投与経路：点眼（Ｅ．Ｄ．）；
−第１３群：ビヒクル（ＴＲＩＳ １Ｍ ｐＨ８） ３μｌ／眼対照
−第１４群：無処置対照

送達用のｓｉＲＮＡ用量を滅菌条件下で調製し、−２０℃で保存した。ｓｉＲＮＡアリコートを投与前に室温で少なくとも３０分間解凍した。（各々のマウス当たりの）アリコート当たりの総量には、計算容量のさらに２０％が含まれた。指定されたｓｉＲＮＡ用量を、眼１つ当たり、３．５μｌ（実験群１〜９および１２）容量で送達した。指定されたｓｉＲＮＡ用量を、眼１つ当たり、３．２μｌ（実験群１０および１１）容量で送達した。

麻酔：以下のように、ケタミン／キシラジン混合液を用いてマウスに麻酔をかけた：ケタミン０．８５ｍｌ＋キシラジン０．１５ｍｌ＋食塩水０．９ｍｌ、混合溶液０．１ｍｌ／２０ｇ体重（ＢＷ）。

点眼送達：とがっていないピペットチップを用いて、３μｌ容量試料を各々の眼（角膜表面）にゆっくりと滴下し；麻酔誘発低体温を防ぐために、動物を暖かい環境に置き、意識を取り戻した後、そのケージに戻した。

計画的安楽死：研究デザイン（表Ｃ８、終了の時点）に従って、全ての群のマウスを屠殺した。

終了工程は頸椎脱臼により達成された。

組織回収：全ての動物の視神経を含む左右の眼を除核し、網膜を刃で横断的に解剖し、水晶体／硝子体を丁寧に取り出した。残った眼杯を４％ＰＦＡ（ＰＢＳ ｐＨ７．４中）で３０分間固定した後、３０％スクロースを４℃で３時間染み込ませた。氷冷したＰＢＳ ｐＨ７．４で５分間３回洗浄した。その後、これを最適切断温度（ＯＣＴ）化合物中に包埋し、クライオスタットで縦方向に切片化して、４μｍのスライスにし、これを顕微鏡スライド（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ／Ｐｌｕｓ）上に置いた。切片をＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ）で対比染色し、標本にした。

全ての動物の全血液滴を、カバーガラスを用いてスライド上に塗抹し、カバーをかけた。その後、これをマニキュア液でのり付けした。

評価
光学顕微鏡検査とデジタルイメージングを用いて、ｓｉＲＮＡの送達を評価した。組織学（顕微鏡）検査によって、前房または後房の特定の細胞または構造、および網膜内の明瞭な蛍光シグナルが示された場合にのみ、組織断片が陽性である（すなわち、ｓｉＲＮＡ導入／細胞内取込みがうまく起こった）とみなされた。バックグラウンドＤＡＰＩ染色が組織構造を識別するのに役立った。組織学検査が群内で一貫している（細胞型または構造染色が両側性に同一である）、すなわち、組織学検査によって、同じ実験群の全ての細胞型／組織（前眼房、網膜、および視神経）で同じ蛍光シグナルが示された場合、送達が陽性であるとみなされた。

結果
図５Ａ〜５Ｂ：ｐ５３遺伝子を標的とするＱＭ５−ｓｉＲＮＡの点眼投与の１時間後の、網膜の共焦点顕微鏡検査（倍率６０倍）。網膜（網膜色素上皮細胞、網膜神経節細胞）内のｓｉＲＮＡがＣｙ３蛍光で示されている。

図６Ａ〜６Ｂは、マウス網膜に取り込まれたＣｙ３標識ＤＤＩＴ４ ｓｉＲＮＡの代表的な画像である。

図６Ｂは、点眼による投与の１時間後のＤＤＩＴ４＿１ Ｃｙ３−ｓｉＲＮＡの蓄積を示す。光受容体細胞の脈絡膜、外核層、ＲＰＥ、および外節層は、Ｃｙ３染色を示す。

図７は、Ｄｙ−６４９／Ｃ６染色の使用によるＲＧＣ細胞での点眼による投与の１時間後のＤＤＩＴ４＿１ Ｄｙ−６４９／Ｃ６−ｓｉＲＮＡの蓄積を示す。

図８Ａ〜８Ｃは、様々な染色方法による網膜組織への対照ｓｉＲＮＡ ＦＩＴＣ−ＣＮＬ＿１ＲＤ／ＣＮＬ＿１ＦＤおよびスクランブル３’ｃｙ３−ＣＮＬ＿１送達を示す。図９Ａ〜９Ｂは、マウス網膜組織への様々な構造のＣＡＳＰ２の送達を示す。

図１０Ａおよび１０Ｂは、ＴＧＡＳＥＩＩ−ＦＡＭおよびＨＮＯＥＬ−ＦＡＭ送達を示す。

図１１は、陽性対照群としてのＰＢＳ中のｐ５３に対するｓｉＲＮＡの網膜送達を示し、
図１２Ａおよび１２Ｂは、無傷の動物においてまたはｓｉＲＮＡを含まないＥＤを投与したときに、蛍光シグナルが網膜において得られないことを示す。

結論：網膜への送達における配列依存的な相違や、フルオロフォア依存的な相違も遺伝子依存的な相違も見られなかった。本研究により、眼構造：ＲＧＣ、ＲＰＥ、光受容体、脈絡膜へのＣＡＳＰ２、ＲＴＰ８０１、ＴＩＧＡＳＥＩＩ、およびｐ５３標的遺伝子に対するＣｙ３コンジュゲートｓｉＲＮＡ化合物の効率的な送達が示された。

実施例６：インビボでのラットにおける標的網膜組織への（ＰＢＳ中またはＭＣ ２％中に処方された（製剤「Ａ」））ＣＡＳＰ２ ｓｉＲＮＡの送達の定量
網膜へのｓｉＲＮＡの送達用の様々な点眼製剤の検討。
本研究の目的は、様々な点眼（ＥＤ）製剤中での単回局所投与後１、３、６、および２４時間の時点でのラット網膜におけるＣＡＳＰ２＿４＿Ｓ５１０ ｓｉＲＮＡ量の測定であった。

試験品
物質（未処方化合物）：ＣＡＳＰ２＿４＿Ｓ５１０（ＣＡＳＰ２に対するｓｉＲＮＡ）
Ａｇｉｌｅｎｔ（製造元のカタログ＃ ＱＰＩ−１００７、バッチ＃：Ｑ０２Ｆ０８００２Ｎ）により供給された
試験物質の説明：ＣＡＳＰ２＿４＿Ｓ５１０：Ｓ−逆方向−無塩基５’−ｃａｐ、Ｌ−ＤＮＡ１８／ＡＳ−ＡＬ。式Ｉ：
式Ｉ
ＳＥＮ ５’ ｉＢ−ＧＣＣＡＧＡＡＵＧＵＧＧＡＡＣＵＣＣＵ ３’
ＡＳ ３’ ｃＧｇＵｃＵｕＡｃＡＣｃＵｕＧａＧｇＡ ５’
に示すような、センス鎖（ＳＥＮ）が、未修飾リボヌクレオチド（大文字）、位置１８のＬ−デオキシリボヌクレオチド（太字、下線付き）、およびＳＥＮ鎖の５’末端に存在する逆方向デオキシ無塩基部分（ｉＢ）を含み；かつアンチセンス鎖（ＡＳ）が、未修飾リボヌクレオチド（大文字）、および位置２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、および１９の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド（小文字）を含む、２つの別々の鎖を有する１９−ｍｅｒの化学修飾平滑末端二重鎖。

保存条件：−８０℃

ＰＢＳ中に処方されたｓｉＲＮＡ：ＰＢＳ中の３３．３ｍｇ／ｍｌ ＣＡＳＰ２＿４＿Ｓ５１０（点眼用の溶液）

試験物質の説明：滅菌条件下で、３００ｍｇの乾燥ＣＡＳＰ２＿４＿Ｓ５１０ ｓｉＲＮＡを１５ｍｌの滅菌再蒸留水に溶解させて、透明な２０ｍｇ／ｍｌ溶液を得た。この溶液を、使用するまで−８０℃で保存した。その後、ＤＤＷ中の２０ｍｇ／ｍｌストック溶液を、以下のように、ＰＢＳ中、１００μｇ／３μｌの作業濃度にした。

６．５ｍｇのＣＡＳＰ２＿４＿Ｓ５１０ ｓｉＲＮＡ：３２５μｌの２０ｍｇ／ｍｌストックのＣＡＳＰ２＿４（６．５ｍｇ）を０．１５ＭのＮａＣｌおよびＥｔＯＨにより沈殿させ、組織培養用のラミナーの下で乾燥させた（滅菌条件）。ｓｉＲＮＡ溶液３３．３ｍｇ／ｍｌ：６．５ｍｇ 乾燥ｓｉＲＮＡを、１９５μｌのＰＢＳ×１に溶解させた。調製量：４本のチューブに分注された６．５ｍｇ／１９５μｌ。

保存条件：新たに調製する

製剤Ａ中に処方されたｓｉＲＮＡ：２％（ｗ／ｖ）メチルセルロースおよび１％（ｖ／ｖ）滅菌グリセロールおよび０．０１％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ溶液を含むパイロジェンを含まない水中の３３．３ｍｇ／ｍｌのＣＡＳＰ２＿４＿Ｓ５１０ ｓｉＲＮＡ溶液（点眼用の溶液）

試験物質の説明：滅菌条件下で、３００ｍｇの乾燥ＣＡＳＰ２＿４＿Ｓ５１０ ｓｉＲＮＡを１５ｍｌの滅菌再蒸留水に溶解させて、透明な２０ｍｇ／ｍｌ溶液を得た。この溶液を、使用するまで−８０℃で保存した。ＤＤＷ中の２０ｍｇ／ｍｌストック溶液を、以下のように、製剤中、１００μｇ／３μｌの作業濃度にした。

６．５ｍｇのＣＡＳＰ２＿４＿Ｓ５１０ ｓｉＲＮＡ：３２５μｌの２０ｍｇ／ｍｌストックのＣＡＳＰ２＿４（６．５ｍｇ）を０．１５ＭのＮａＣｌおよびＥｔＯＨにより沈殿させ、組織培養用のラミナーの下で乾燥させた（滅菌条件）。

ｓｉＲＮＡ溶液３３．３ｍｇ／ｍｌ：６．５ｍｇの乾燥ｓｉＲＮＡを１９５μｌの製剤Ａ溶液に溶解させた。

調製量：４本のチューブに分注された６．５ｍｇ／１９５μｌ。

保存条件：新たに調製する

対照品
メチルセルロース製剤（ｓｉＲＮＡなし）−パイロジェンを含まない水中の２％メチルセルロースおよび１％ｖ／ｖ滅菌グリセロールおよび０．０１％ｗ／ｖ ＥＤＴＡ溶液を以下のように調製した。

溶液Ａ：０．４ｇのメチルセルロース２５（ＳｃｉｅｎｃｅＬａｂ．ｃｏｍ，Ｃａｔ＃ ＳＬＭ２０５０）を最終容量１０ｍｌの高温沸騰水（８０〜９０℃）（Ｎｏｒｂｒｏｏｋ）に溶解させ、室温まで冷却し、１：１の比（最終濃度２％）で溶液Ｂに添加したもの。

溶液Ｂ：９．６６ｍｌ ＷＦＩ（Ｎｏｒｂｒｏｏｋ）中の３３２μｌの６０％グリセロール（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ＃ Ｇ６２７９）および２μｌ ＥＤＴＡ溶液 ｐＨ８（Ｓｉｇｍａ製，Ｃａｔ＃ Ｅ９８８４）。

５００μＬの溶液Ａを５００μＬの溶液Ｂと混合して、パイロジェンを含まない水中の２％ メチルセルロースおよび１％ｖ／ｖ 滅菌グリセロールおよび０．０１％ｗ／ｖ ＥＤＴＡ溶液（最終ｐＨは約７．４であり、モル浸透圧濃度はヒト涙液膜と同様であった）を得た。

ＰＢＳは、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ （Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ カタログ＃０２−０２３−５Ａ（１０×ＰＢＳの場合）；バッチ＃６１９１１３）により供給された。

試験系
使用した動物：種：ラット；系統：成体、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）
供給源：Ｈａｒｌａｎ，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ Ｉｓｒａｅｌ
年齢：８〜１０週齢；体重範囲：１８０〜２５０ｇ
性別：オス；群サイズ：ｎ＝６／３；動物の総数：５４匹
動物管理：食餌：動物には市販の齧歯類用食餌を自由に与え、飲料水を自由に飲ませた。
環境：
（ｉ）少なくとも５日の順化。
（ｉｉ）動物は全て、研究期間中ずっと、環境制御された収容条件で、アクセスが制限された施設に閉じ込められ、承認された標準操作手順（ＳＯＰ）に従って維持された。動物には市販の齧歯類用食餌（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ ２０１８Ｓ Ｇｌｏｂａｌ １８％タンパク質齧歯類用食餌）と、濾過し、塩素消毒し、酸性化した水とを自由に与えた。

フィルタートップ付きのマイクロアイソレーターケージに、ラット１〜６匹／ケージでラットを入れた。ケージは、試験期間中、制御された環境−制御コンピュータでモニタリングされた、温度（２０〜２４℃）、相対湿度（３０〜７０％）、１２時間明／１２時間暗周期という条件の下で維持した。

実験デザイン
研究デザイン：眼製剤のＥＤ適用後のＣＡＳＰ２＿４ ｓｉＲＮＡの網膜濃度を、ｓｉＲＮＡ投与後の様々な時点で屠殺された研究群においてｑＰＣＲで測定した。各々の実験用ｓｉＲＮＡ処置群には、６匹のラットが含まれた。ＥＤを表Ｃ９の研究デザインで詳細に記載したように両側性に適用した。

ｓｉＲＮＡ投与後の終了時点：終了設定は表Ｃ９の研究デザインに従って行なわれた。実験群の投与と屠殺は別々の日に行なわれた。

麻酔：実験の経過において、ＥＤ適用のためにおよび／または屠殺前に、動物にエキセジン（Ｉ．Ｐ．４ｍｌ／ｋｇ）で麻酔をかけた。

点眼送達：３μｌ試験容量の試験品またはビヒクルを、とがっていないピペットチップ（フィルターチップ １０μｌ 滅菌（短い））で、麻酔した動物の角膜表面に両側性に適用した。麻酔誘発低体温を防ぐために、動物を暖かい環境に置き、意識を取り戻した後、そのケージに戻した（実験群７および８）。全ての研究群の動物の屠殺は研究デザインに従うものであった。研究デザインに従って組織を回収した。

計画的安楽死：研究デザイン（表Ｃ９、終了）に従って、全ての動物に深く麻酔をかけ、安楽死させた。

灌流設定：ラットに経心的にＰＢＳ（２〜３分後、２０〜５０ｍｌ／分）を灌流させた。

組織回収：灌流後、両眼（左右）を除核し、氷上で保存した。顕微鏡を用いて、これらの眼を解剖し、場合により、試料等級分け尺度に従って、肉眼的病理を等級分けした。角膜を縁に沿って切断して解剖し、水晶体を丁寧に取り出し、網膜と硝子体を強膜から慎重に切り離した。網膜と硝子体（液）（網膜：「神経網膜」＋網膜色素上皮＋脈絡膜を含む）の全体を適切にマーキングされた２本の別々の適当な試験チューブに回収した。解剖された網膜を（各々の網膜を新鮮なＰＢＳを含む別々の試験チューブに入れて）大量のＰＢＳ中で洗浄し、余分な液体をキムワイプ（登録商標）で除去し、網膜を液体窒素で瞬間凍結させた。網膜と硝子体の試料をＲＮＡ抽出にかけた。

評価
ＲＮＡ抽出：
網膜：ＲＮＡを、二重抽出により、各々の網膜試料から（左右）１つずつ抽出した。ＲＮＡをｃＤＮＡ調製とｑＰＣＲ解析に移した。

硝子体：硝子体由来のＣａｓｐ２＿４ ｓｉＲＮＡ検出用の材料を、以下のプロトコルを用いて得た。

ラット硝子体は各々、約１０μｌであった。５００μｌの試薬Ａ ＥＺ−ＲＮＡＩＩ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｃａｔ ｎｏ．２０−４１０−１００）を各々の硝子体に添加した。試料をホモジナイズし、１０μｇのｔＲＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌストックから１μｌ）を添加した。試料を室温で５分間保存した。その後、ＥＺ−ＲＮＡＩＩ Ｂ：４００μｌとＥＺ−ＲＮＡＩＩ Ｃ：９０μｌを添加し、よく混合した。試料を室温で１０分間保存した後、４℃で１５分間、１２０００ｇで遠心分離した。

上部相を新鮮なチューブに移し、そこに、イソプロパノール：５００μｌとリニアアクリルアミド：５μｌを添加した。試料を−２０℃で一晩保存し、４℃で２０分間、１２０００ｇで遠心分離し、７５％エタノールで２回洗浄した。ペレットを１５μｌのＨ_２Ｏに溶解させた。

ｓｉＲＮＡ定量：網膜および硝子体液中のｓｉＲＮＡの量（ｓｉＲＮＡ定量は硝子体ごとに行なった）をｑＰＣＲによるｓｉＲＮＡ定量で調べた。ｑＰＣＲは、Ｑｕａｒｋの標準操作手順に従って行なった。ＣＡＳＰ２＿４ ｓｉＲＮＡと参照遺伝子の発現を検証した。結果は表Ｃ１０にまとめている。

結論：本研究により、投与の１および３時間後の、ｓｉＲＮＡの網膜への効率的な送達が示された。ｑＰＣＲ解析により、製剤Ａ中で１００μｇのｓｉＲＮＡを適用した後、網膜で、平均して、１時間後に１１ｆＭｏｌ／μｇのトータルＲＮＡ、および３時間後に２ｆＭｏｌ／μｇのｓｉＲＮＡが得られたことが示された。ＰＢＳ中で同じ濃度を投与した場合、１時間後に、６ｆｍｏｌ／μｇの量のｓｉＲＮＡが得られ、３時間後に８ｆｍｏｌ／μｇの総ＲＮＡが得られた。

実施例７：ラットの標的網膜組織における非侵襲的に投与された（様々な製剤中に処方された）ｓｉＲＮＡ化合物の定量
インビボでのｓｉＲＮＡの網膜への非侵襲的送達用の様々な点眼製剤の検討
本研究の目的は、点眼薬（ＥＤ）として投与するために調製された様々なｓｉＲＮＡ製剤の単回局所適用の３時間後の正常ラット網膜におけるＣＡＳＰ２＿４＿Ｓ５１０ ｓｉＲＮＡ量の評価であった。

試験品
物質（未処方化合物） Ａｇｉｌｅｎｔ（製造元のカタログ＃ ＱＰＩ−１００７、バッチ＃：Ｑ０２Ｆ０８００２Ｎ）により供給されたＣＡＳＰ２＿４＿Ｓ５１０（ＣＡＳＰ２に対するｓｉＲＮＡ）

試験物質の説明：ＣＡＳＰ２＿４＿Ｓ５１０：Ｓ−逆方向−無塩基５’−ｃａｐ、Ｌ−ＤＮＡ１８／ＡＳ−ＡＬ。５’−ｃａｐとしての逆方向無塩基、センス鎖の１８番目の位置のＬ−ＤＮＡ、およびアンチセンス鎖上の位置２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、および１９における交互の２’−ＯＭｅを有する１９−ｍｅｒの安定化された二本鎖ＲＮＡ。

保存条件：−８０℃

ＰＢＳ中に処方されたｓｉＲＮＡ ＰＢＳ中の３３．３ｍｇ／ｍｌ ＣＡＳＰ２＿４＿Ｓ５１０（点眼用の溶液）

試験物質の説明：滅菌条件下で、３００ｍｇの乾燥ＣＡＳＰ２＿４＿Ｓ５１０ ｓｉＲＮＡを１５ｍｌの滅菌再蒸留水に溶解させて、透明な２０ｍｇ／ｍｌ溶液を得た。この溶液を、使用するまで−８０℃で保存した。その後、再蒸留水中の２０ｍｇ／ｍｌストック溶液を、以下のように、ＰＢＳ中、１００μｇ／３μｌの作業濃度にした。

１．７ｍｇ ＣＡＳＰ２＿４＿Ｓ５１０ ｓｉＲＮＡ：８５μｌの２０ｍｇ／ｍｌストックのＣＡＳＰ２＿４（１．７ｍｇ）を０．１５ＭのＮａＣｌおよびＥｔＯＨにより沈殿させ、組織培養用のラミナーの下で乾燥させた（滅菌条件）。

ｓｉＲＮＡ溶液３３．３ｍｇ／ｍｌ：１．７ｍｇの乾燥ｓｉＲＮＡをＰＢＳ×１に溶解させて、５１μｌを得た。

調製量：ＰＢＳ ５１μｌ中１．７ｍｇ １チューブ

保存条件：新たに調製する

市販の潤滑溶液シスタン（登録商標）中に処方されたｓｉＲＮＡ：シスタン中の３３．３ｍｇ／ｍｌ ＣＡＳＰ２＿４＿Ｓ５１０（点眼用の溶液）−第ＩＩ群。Ａｌｃｏｎｅ Ｉｎｃ．から購入；バッチ＃：ロット１６５２２８Ｆ。

試験物質の説明：滅菌条件下で、３００ｍｇのＣＡＳＰ２＿４＿Ｓ５１０粉末（Ａｌｉｇｅｎｔ，バッチ＃Ｑ０２Ｆ０８００２Ｎ）を１５ｍｌの滅菌再蒸留水に溶解させて、透明な２０ｍｇ／ｍｌ溶液を得た。この溶液を、使用するまで−８０℃で保存した。その後、再蒸留水中の２０ｍｇ／ｍｌストック溶液を、以下のように、製剤中、１００μｇ／３μｌの作業濃度にした。

１．７ｍｇ ＣＡＳＰ２＿４＿Ｓ５１０ ｓｉＲＮＡ：８５μｌの２０ｍｇ／ｍｌストックのＣＡＳＰ２＿４＿Ｓ５１０（１．７ｍｇ）を０．１５ＭのＮａＣｌおよびＥｔＯＨにより沈殿させ、組織培養用のラミナーの下で乾燥させた（滅菌条件）。

ｓｉＲＮＡ溶液３３．３ｍｇ／ｍｌ：１．７ｍｇの乾燥ｓｉＲＮＡを５１μＬの市販の潤滑溶液（すなわち、シスタン（登録商標））に溶解させた。

調製量：シスタン（登録商標）５１μｌ中１．７ｍｇのｓｉＲＮＡ １バイアル

グリセロール＋ＥＤＴＡ溶液中およびメチルセルロース（ＭＣ）溶液中に処方されたｓｉＲＮＡ：グリセロール＋ＥＤＴＡ製剤中、および０．５％、２％、または３％（ｗ／ｖ）メチルセルロースおよび１％（ｖ／ｖ）滅菌グリセロールおよび０．０１％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ溶液を含むパイロジェンを含まない水中の、３３．３ｍｇ／ｍｌのＣＡＳＰ２＿４＿Ｓ５１０ ｓｉＲＮＡ溶液−第ＩＩＩ群〜第ＶＩ群

試験物質の説明：滅菌条件下で、３００ｍｇのＣＡＳＰ２＿４＿Ｓ５１０粉末（Ａｌｉｇｅｎｔ，バッチ＃Ｑ０２Ｆ０８００２Ｎ）を１５ｍｌの滅菌再蒸留水に溶解させて、透明な２０ｍｇ／ｍｌ溶液を得た。この溶液を、使用するまで−８０℃で保存した。その後、再蒸留水中の２０ｍｇ／ｍｌストック溶液を、以下のように、製剤中、１００μｇ／３μｌの作業濃度にした。

７バイアルの１．７ｍｇ ＣＡＳＰ２＿４＿Ｓ５１０ ｓｉＲＮＡ：８５μｌの２０ｍｇ／ｍｌストックのＣＡＳＰ２＿４＿Ｓ５１０（１．７ｍｇ）を０．１５ＭのＮａＣｌおよびＥｔＯＨにより沈殿させ、組織培養用のラミナーの下で乾燥させた（滅菌条件）。

第ＩＩＩ群：０．５％ＭＣ製剤：溶液Ａと溶液Ｂの１：７混合物［１２．５μＬの溶液Ａを５０μＬの溶液Ｂおよび３７．５μｌのＷＦＩと混合して、パイロジェンを含まない水中の０．５％メチルセルロースおよび１％ｖ／ｖ滅菌グリセロールおよび０．０１％ｗ／ｖ ＥＤＴＡ溶液を得た（最終ｐＨは約７．４であり、モル浸透圧濃度はヒト涙液膜と同様であった）]。

０．５％ＭＣ製剤中に処方されたｓｉＲＮＡ ３３．３ｍｇ／ｍｌ：１．７ｍｇの乾燥ｓｉＲＮＡを、記載した通りに調製した０．５％ＭＣ製剤に溶解させて、０．５％ＭＣ製剤中５１μＬの処方されたｓｉＲＮＡ溶液を得た。

第ＩＶ群：１％ＭＣ製剤：溶液Ａと溶液Ｂの１：３混合物［２５μＬの溶液Ａを５０μＬの溶液Ｂおよび２５μｌのＷＦＩと混合して、パイロジェンを含まない水中の１％メチルセルロースおよび１％ｖ／ｖ滅菌グリセロールおよび０．０１％ｗ／ｖ ＥＤＴＡ溶液を得た（最終ｐＨは約７．４であり、モル浸透圧濃度はヒト涙液膜と同様であった）]。

１％ＭＣ製剤中に処方されたｓｉＲＮＡ溶液３３．３ｍｇ／ｍｌ：１．７ｍｇの乾燥ｓｉＲＮＡを、記載した通りに調製した１％ＭＣ製剤に溶解させて、１％ＭＣ製剤中５１μＬの処方されたｓｉＲＮＡ溶液を得た。

第Ｖ群：２％ＭＣ製剤：溶液Ａと溶液Ｂの１：１混合物［５０μＬの溶液Ａを５０μＬの溶液Ｂと混合して、パイロジェンを含まない水中の１％メチルセルロースおよび１％ｖ／ｖ滅菌グリセロールおよび０．０１％ｗ／ｖ ＥＤＴＡ溶液を得た（最終ｐＨは約７．４であり、モル浸透圧濃度はヒト涙液膜と同様であった）］。

２％ＭＣ製剤中に処方されたｓｉＲＮＡ溶液３３．３ｍｇ／ｍｌ：１．７ｍｇの乾燥ｓｉＲＮＡを、記載した通りに調製した２％ＭＣ製剤に溶解させて、２％ＭＣ製剤中５１μＬの処方されたｓｉＲＮＡ溶液を得た。

第ＶＩ群：３％ＭＣ製剤：溶液Ａと溶液Ｃの１：１混合物［５０μＬの溶液Ａを５０μＬの溶液Ｃと混合して、パイロジェンを含まない水中の３％メチルセルロースおよび１％ｖ／ｖ滅菌グリセロールおよび０．０１％ｗ／ｖ ＥＤＴＡ溶液を得た（最終ｐＨは約７．４であり、モル浸透圧濃度はヒト涙液膜と同様であった）]。

３％ＭＣ製剤中に処方されたｓｉＲＮＡ溶液 ３３．３ｍｇ／ｍｌ：１．７ｍｇの乾燥ｓｉＲＮＡを、記載した通りに調製した３３％ＭＣ製剤に溶解させて、４％ＭＣ製剤中５１μＬの処方されたｓｉＲＮＡ溶液を得た。

第ＶＩＩ群：グリセロール＋ＥＤＴＡ製剤：５０μＬのＷＦＩ（Ｎｏｒｂｒｏｏｋ）を５０μＬの溶液Ｂと混合して、パイロジェンを含まない水中の１％ｖ／ｖ滅菌グリセロールおよび０．０１％ｗ／ｖ ＥＤＴＡ溶液を得た。

グリセロール＋ＥＤＴＡ製剤中に処方されたｓｉＲＮＡ溶液３３．３ｍｇ／ｍｌ：１．７ｍｇの乾燥ｓｉＲＮＡを、記載した通りに調製したグリセロール＋ＥＤＴＡ製剤に溶解させて、グリセロール＋ＥＤＴＡ製剤中５１μＬの処方されたｓｉＲＮＡ溶液を得た。

調製量：以下の通り、７バイアル：
ＰＢＳ製剤５１μＬ中１．７ｍｇのｓｉＲＮＡ １バイアル
シスタン（登録商標）製剤５１μＬ中１．７ｍｇのｓｉＲＮＡ １バイアル
０．５％ＭＣ製剤５１μＬ中１．７ｍｇのｓｉＲＮＡ １バイアル
１％ＭＣ製剤５１μＬ中１．７ｍｇのｓｉＲＮＡ １バイアル
２％ＭＣ製剤５１μＬ中１．７ｍｇのｓｉＲＮＡ １バイアル
３％ＭＣ製剤５１μＬ中１．７ｍｇのｓｉＲＮＡ １バイアル
グリセロール＋ＥＤＴＡ製剤５１μＬ中１．７ｍｇのｓｉＲＮＡ １バイアル

保存条件：新たに調製する

対照品
１．ＰＢＳ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（製造元カタログ＃０２−０２３−５Ａ（１０×ＰＢＳの場合）；バッチ＃６１９１１３）により供給された。
２．シスタン（登録商標）−市販の点眼溶液；Ａｌｃｏｎにより供給；バッチ＃：ロット１６５２２８Ｆ；供給量：１５ｍｌ；保存条件：ＲＴ；有効期限：０２／２０１１。

製剤溶液Ａ−パイロジェンを含まない水中のメチルセルロース溶液
溶液Ａ）０．４ｇのメチルセルロース２５（ＳｃｉｅｎｃｅＬａｂ．ｃｏｍ，Ｃａｔ＃ ＳＬＭ２０５０）を最終容量１０ｍｌの高温沸騰水（８０〜９０℃）（Ｎｏｒｂｒｏｏｋ）に溶解させ、室温まで冷却したもの。

製剤溶液Ｂ−パイロジェンを含まない水中の滅菌グリセロールおよびＥＤＴＡ溶液
溶液Ｂ）９．６６６ｍｌのＷＦＩ（Ｎｏｒｂｒｏｏｋ）中の３３２μｌの６０％グリセロール（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ＃ Ｇ６２７９）および２μｌのＥＤＴＡ溶液 ｐＨ８（Ｓｉｇｍａ製，Ｃａｔ＃ Ｅ９８８４）。

製剤溶液Ｃ−パイロジェンを含まない水中の濃縮メチルセルロース溶液
溶液Ｃ）０．６ｇのメチルセルロース２５（ＳｃｉｅｎｃｅＬａｂ．ｃｏｍ，Ｃａｔ＃ ＳＬＭ２０５０）を最終容量１０ｍｌの高温沸騰水（８０〜９０℃）（Ｎｏｒｂｒｏｏｋ）に溶解させ、室温まで冷却したもの。

上記のメチルセルロース製剤中のｓｉＲＮＡ化合物の安定性試験：
Ｃａｓｐ２＿４ Ｑ０２Ｆ０８００２Ｎ ｓｉＲＮＡの安定性を、以下のプロトコルに従って、メチルセルロース製剤中で試験した。

ｓｉＲＮＡを、最終濃度７μｍ ｓｉＲＮＡとなるように、メチルセルロースを含む様々な製剤に希釈した。０％、０．５％、１％、２％、および３％ＭＣ製剤を室温でインキュベートした。さらに、３％ＭＣ製剤を、ヌクレアーゼ阻害剤ありとヌクレアーゼ阻害剤なしで、３７℃でもインキュベートした。

各々の溶液の５μＬアリコートを、インキュベーション後、以下の時点：０分、１０分、０．５時間、１時間、１．５時間、３時間、６時間で、１５μＬの１０×ＴＢＥ−ローディング緩衝液に移した。その後、この溶液を液体窒素中で凍結させ、−２０℃で保存した。

各試料４μＬを非変性２０％ポリアクリルアミドゲルに充填し、８０Ｖで２．５時間電気泳動を行なった。

ｓｉＲＮＡを可視化するために、ゲルをエチジウムブロマイド溶液（１．０μｇ／μＬ）で染色した。

分解されていないｓｉＲＮＡのゲル移動についての陽性対照として、ＰＢＳ中５μＬの７μＭ試験済みｓｉＲＮＡ溶液を１５μＬの１０×ＴＢＥ−ローディング緩衝液に移し、ゲルに充填した。その後、試料を液体窒素中で凍結させ、−２０℃で保存した。

分解された一本鎖（ｓｓ）ｓｉＲＮＡの移動パターンの参照として、無関係な一本鎖ｓｉＲＮＡを調製した。

結果：Ｃａｓｐ２＿４ ｓｉＲＮＡ化合物は全ての製剤中で安定であった。

インビボ研究：
試験系：
使用した動物：ラット；系統：成体、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ；修飾：ＳＤ
供給源：Ｈａｒｌａｎ，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ Ｉｓｒａｅｌ
年齢：８〜１０週齢；体重範囲：２２０〜２７０ｇ
性別：オス；群サイズ：ｎ＝６；動物の総数：５４匹
動物管理：食餌：動物には市販の齧歯類用食餌を自由に与え、飲料水を自由に飲ませた。
環境：
（ｉ）少なくとも５日の順化。
（ｉｉ）動物は全て、研究期間中ずっと、環境制御された収容条件で、アクセスが制限された施設に閉じ込められ、承認された標準操作手順（ＳＯＰ）に従って維持された。動物には市販の齧歯類用食餌（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ ２０１８Ｓ Ｇｌｏｂａｌ １８％タンパク質齧歯類用食餌）と、濾過し、塩素消毒し、酸性化した水とを自由に与えた。

フィルタートップ付きのマイクロアイソレーターケージに、ラット１〜６匹／ケージでラットを入れた。ケージは、試験期間中、制御された環境−制御コンピュータでモニタリングされた、温度（２０〜２４℃）、相対湿度（３０〜７０％）、１２時間明／１２時間暗周期という条件の下で維持した。

実験デザイン
実験設定には、９つの実験群（群１つ当たり６匹のラット）が含まれた。ＥＤを両側性に適用した。様々な製剤を用いた（研究デザイン 表Ｃ１１）。ｓｉＲＮＡ投与後の終了時点（３時間）：終了設定は、表Ｃ１１の研究デザインに従って行なわれた。ＣＡＳＰ２＿４ ｓｉＲＮＡの網膜濃度をｑＰＣＲで測定した。
^＊グリセロール＋ＥＤＴＡ製剤（ＭＣを含まない製剤）＝パイロジェンを含まない水中の１％ｖ／ｖ滅菌グリセロールおよび０．０１％ｗ／ｖ ＥＤＴＡ溶液。

麻酔：実験の経過において、全ての動物にエキセジン（Ｉ．Ｐ．４ｍｌ／ｋｇ）で麻酔をかけた。

点眼送達 ３μｌ試験容量の試験品またはビヒクルを、とがっていないピペットチップ（フィルターチップ １０μｌ 滅菌（短い））で、麻酔した動物の角膜表面に両側性に適用した。麻酔誘発低体温を防ぐために、動物を暖かい環境に置いた。全ての研究群の動物の屠殺は研究デザインに従うものであった（時点 ３時間）。研究デザインに従って組織を回収した。

計画的安楽死：研究デザイン（表Ｃ１１、終了）に従って、全ての動物に深く麻酔をかけ、安楽死させた。

灌流設定：ラットに経心的にＰＢＳ（２〜３分後、２０〜５０ｒｐｍ／分）を灌流させた。

組織回収：灌流後、両眼（左右）をＰＢＳで洗浄し、除核し、氷上で保存した。双眼顕微鏡を用いて、これらの眼を解剖し、場合により、試料等級分け尺度に従って、肉眼的病理を等級分けした。角膜を縁に沿って切断して解剖し、水晶体を丁寧に取り出し、網膜と硝子体を強膜から慎重に切り離した。網膜と硝子体（液）の全体を、適切にマーキングされた２本の別々の適当な試験チューブに回収した。解剖された網膜を（各々の網膜を新鮮なＰＢＳを含む別々の試験チューブに入れて）大量のＰＢＳ中で洗浄し、余分な液体をキムワイプで除去し、網膜を液体窒素で瞬間凍結させた。網膜と硝子体の試料をＲＮＡ抽出にかけた。

評価：
ＲＮＡ抽出：網膜：ＲＮＡを、二重抽出により、各々の網膜試料から（左右）１つずつ抽出した。ＲＮＡをｃＤＮＡ調製とｑＰＣＲ解析に移した。

硝子体：硝子体由来のＣａｓｐ２＿４＿Ｓ５１０ ｓｉＲＮＡ検出用の材料を、以下のプロトコルを用いて得た：ラット硝子体は各々、約１０μｌであった。５００μｌの試薬Ａ ＥＺ−ＲＮＡＩＩ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｃａｔ ｎｏ．２０−４１０−１００）を各々の硝子体に添加した。試料をホモジナイズし、１０μｇのｔＲＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌストックから１μｌ）を添加した。試料を室温で５分間保存した。その後、ＥＺ−ＲＮＡＩＩ Ｂ：４００μｌとＥＺ−ＲＮＡＩＩ Ｃ：９０μｌを添加し、よく混合した。試料を室温で１０分間保存した後、４℃で１５分間、１２０００ｇで遠心分離した。

上部相を新鮮なチューブに移し、そこに、イソプロパノール：５００μｌとリニアアクリルアミド：５μｌを添加した。試料を−２０℃で一晩保存し、４℃で２０分間、１２０００ｇで遠心分離し、７５％エタノールで２回洗浄した。ペレットを１５μｌのＤＤＷに溶解させた。

ｓｉＲＮＡ定量：網膜および硝子体液中のｓｉＲＮＡの量（ｓｉＲＮＡ定量は硝子体ごとに行なった）を、Ｑｕａｒｋの標準操作手順に従って、ｑＰＣＲ ｓｉＲＮＡで調べた。

結果
本研究により、以下の量のｓｉＲＮＡが、様々な製剤とともにインビボで非侵襲的に投与されたｓｉＲＮＡの適用の３時間後に、ラット網膜で検出されることが示された。

結論：ＣＡＳＰ２ ｓｉＲＮＡで処置された群は全て、標的網膜組織中で正のｓｉＲＮＡ量（>４ｆｍｏｌｅ）を示した。製剤群間に有意差は見られなかった（Ｐ値＝０．８４２５）。

非侵襲的に投与されたｓｉＲＮＡは標的眼組織でのアポトーシスと関連する標的遺伝子のインビボノックダウン（ＫＤ）を誘導する
実施例８：ラット網膜での点眼による非侵襲的投与のために調製されたｐ５３に対するｓｉＲＮＡのインビボノックダウン活性の測定（ＭＣ２％中に処方されたｓｉＲＮＡ化合物（製剤「Ａ」）
目的
本研究の目的は、ラット神経網膜のｐ５３ ｍＲＮＡを標的とする非侵襲的に送達されるｓｉＲＮＡ化合物のノックダウン活性を測定することであった。ｓｉＲＮＡ化合物を点眼による非侵襲的投与用に処方した。ノックダウン活性は、ＥＬＩＳＡ法を用いたタンパク質レベル測定で評価した。

試験品
ａ．物質（未処方ｓｉＲＮＡ化合物）：ＱＭ５（マウス／ラットｐ５３に対するｓｉＲＮＡ）
ｂ．非侵襲的（点眼）送達用の処方されたｓｉＲＮＡ化合物（表Ｃ１３の第２および５群）：２％（ｗ／ｖ）メチルセルロースおよび１％（ｖ／ｖ）グリセロールおよび０．０１％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ溶液を含むパイロジェンを含まない水中の１００μｇ／３μｌのＱＭ５ ｓｉＲＮＡ溶液
ｃ．硝子体内注射用の処方されたｓｉＲＮＡ化合物（表Ｃ１３の第１および４群）：ＰＢＳ １４０μｌ中の２８０μｇのＱＭ５ ｓｉＲＮＡ
ｄ．非侵襲的（点眼）送達用の処方されたビヒクル溶液（表Ｃ１３第３および６群）：パイロジェンを含まない水中の２％メチルセルロースおよび１％ｖ／ｖ滅菌グリセロール&０．０１％ｗ／ｖ ＥＤＴＡ溶液。

試験系：
成体オス、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット Ｈａｒｌａｎ，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ Ｉｓｒａｅｌ，６〜８週齢、各々１６０〜１８０ｇ。

実験デザイン
研究デザイン：第１群〜第６群の各々の動物で片側性軸索切断（左眼、ＯＳ）を行なった。

第２、３、５および６：試験化合物（処方されたビヒクル３μｌ中１００μｇの試験品−第２群&第５群）または処方されたビヒクルのみ（第３群および第６群）を、０日目（軸索切断後すぐ）から毎日点眼薬として適用した。これらの実験群を表Ｃ１３に従って屠殺した。第７群の左右の眼試料は無傷の正常対照としての役割を果たした。

第１群および第４群：軸索切断の３分後（０日目）、ＰＢＳビヒクル１０μｌ中２０μｇのｓｉＲＮＡ化合物をマイクロインジェクションで硝子体に適用した。硝子体へのマイクロインジェクションは、インスリン用マイクロインジェクター（０．３ｍｌ）を用いて、強膜に対して垂直に行なった。動物は表Ｃ１３に従って屠殺した。

腎臓Ｗ．Ｃ．Ｅ標準曲線によるｐ５３シグナル

結論：これらの研究により、ラット神経網膜のｐ５３ ｍＲＮＡを標的とする非侵襲的に送達されたｓｉＲＮＡ化合物は、ｐ５３タンパク質のノックダウンを誘導することが示された。

ｓｉＲＮＡ化合物は眼神経細胞損傷の動物モデルにおいてインビボで眼神経保護を誘導する
実施例９：ＩＶＴ注射後のＯＣＮモデルにおけるカスパーゼ２を標的とするｓｉＲＮＡ化合物による眼神経保護誘導の評価
研究目的：硝子体内注射後のＯＣＮモデルにおけるカスパーゼ２を標的とするｓｉＲＮＡの眼神経保護効力を評価すること。

方法
ＲＧＣの逆行性標識
Ｆｌｕｏｒｏｇｏｌｄトレーサーは、ＲＧＣ軸索に沿って（脳から眼へ）逆行性に輸送されて、全てのＲＧＣを完全かつ特異的に標識する。この研究のために、逆行性トレーサーＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄ（２％，Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，ＣＯ）を上丘に適用することによって、ＲＧＣを標識した。簡潔には、ブレグマから吻側に６ｍｍ、両半球の正中線から外側に１．２ｍｍの座標上で頭蓋骨にドリルで孔を開けた。Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジを用いて、３μｌのＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄを、骨表面下３．８ｍｍ、４ｍｍ、および４．２ｍｍの位置で、３つの深さの各々において１μｌ／分の速度で、上丘に注射した。次に、針をゆっくりと抜き、皮膚を縫合した。成体ラットでは、この手順後に全てのＲＧＣの完全な標識を得るのに要した時間は、約１週間であった。このため、ＯＮＣは、ＲＧＣの逆行性標識の１週間後に行なわれた。

視神経挫滅。麻酔した成体Ｗｉｓｔａｒラットの眼窩視神経（ＯＮ）を眼窩上からのアプローチによって露出させ、髄膜を切り取り、視神経（ＯＮ）内の全ての軸索を、目盛り付き鉗子で１０秒間押し潰すことによって篩板から２ｍｍの位置で切断した。

硝子体内（ＩＶＴ）注射。２０μｇ（ＰＢＳ １０μｌ中）の１または２用量の試験もしくは対照ｓｉＲＮＡまたはＰＢＳビヒクル１０μｌを、ガラスマイクロピペットを用いて、神経頭の前方２ｍｍの位置で、強膜と垂直に硝子体に微量注射した。ＩＶＴ投与は、対照としておよびまたは標的遺伝子の最初の確認のために示される。

ＲＧＣ生存の定量。屠殺時に、４％パラホルムアルデヒドを実験動物に経心的に灌流させた。視神経の付いた眼を除核し、角膜を刃で解剖し、水晶体／硝子体を丁寧に取り出した。両方の網膜を摘出し、さらに３０分間固定し、神経節細胞層の検査のために硝子体側を上にしてスライドガラス上に伸展標本を作成した。ＲＧＣをＵＶフィルター（３６５／４２０ｎｍ）付きの蛍光顕微鏡下で調べた。逆行性に標識されたＲＧＣの数は、２人の異なる、独立かつ「何も知らされていない」研究者が、１６カ所の異なる部位（網膜半径の１／６、１／２、および５／６という３つの異なる離心率で網膜四分円につき４カ所）でそれらを計数することによって測定された。死にかけているＲＧＣの貪食後にＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄを取り込んだ可能性のあるミクログリアは、その特徴的形態によって区別され、定量的解析から除外された。

第１部
試験品：ＣＡＳＰ２＿４ ｓｉＲＮＡ−両方の鎖上の２’Ｏ−メチル化により化学修飾された二本鎖１９−ｍｅｒオリゴヌクレオチド。他の化合物には、センス鎖の３’末端においてＬ−ＤＮＡでまたは３’末端において２’５’架橋で化学修飾されたｓｉＲＮＡが含まれた。複数の種のカスパーゼ２遺伝子を標的とする。

対照物質：ＰＢＳ

デザイン：まず、逆行性トレーサーＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄを上丘に適用することにより、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を選択的に標識した。１週間後、動物に視神経挫滅損傷（ＯＣＮ）を受けさせた。生存ＲＧＣの定量を、伸展標本化された網膜上のＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄ標識ＲＧＣを計数することにより、ＯＮＣの７および３０日後に行なった。表Ｃ１８に、処置群を示す。

結果：２０μｇのＣａｓｐ２＿４ ｓｉＲＮＡで処置され、視神経挫滅を受けた眼の生存ＲＧＣの平均数は、損傷後７日で２０４０±３５細胞／ｍｍ^２、および損傷後３０日で２９８±２５細胞／ｍｍ^２であった。これらの数は、ＰＢＳで処置され、神経挫滅を受けた眼の平均ＲＧＣ数（７日で９４１±２７細胞／ｍｍ^２、および３０日で４１±７細胞／ｍｍ^２）よりも有意に多かった。手術していない対照眼では、ＲＧＣの平均数は、２２５３±１０４細胞／ｍｍ^２であったが、これは、文献で報告されたＲＧＣの平均数と同程度である。表Ｃ１９に、この研究の結果を示す。

データは全て平均±標準偏差として示されている。値は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて比較し、Ｐ<０．０２で有意差とみなした。

結論：同じように麻酔された対照群の動物のＲＧＣ数がＣａｓｐ２＿４ ｓｉＲＮＡ処置群の動物よりも有意に少なかったので、ＲＧＣの生存の増加は、麻酔の神経保護効果によるものではなく（ケタミンはＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体のアンタゴニストであり、キシラジンはα２−アドレナリン受容体アゴニストである）、カスパーゼ２遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ化合物での処置による、ＯＮＣ損傷後のアポトーシス促進性カスパーゼ２の活性化と上方調節のサイレンシングの神経保護効果によるものであった。

第２部
試験品：ＣＡＳＰ２＿４Ｌ ｓｉＲＮＡ−アンチセンス鎖上の２’Ｏ−メチル化およびセンス鎖上のＬ−ＤＮＡにより化学修飾された二本鎖１９−ｍｅｒオリゴヌクレオチド。複数の種のカスパーゼ２遺伝子を標的とする。

対象物質：
−ＰＢＳ
−ＧＦＰを標的とするｓｉＲＮＡ−両方の鎖上の２’Ｏ−メチル化により安定化された二本鎖２１−ｍｅｒオリゴヌクレオチド。
−ＣＮＬ−哺乳動物の既知のどの転写物ともマッチしないｓｉＲＮＡ；両方の鎖上の２’Ｏ−メチル化により化学修飾された二本鎖１９−ｍｅｒオリゴヌクレオチド。

デザイン。まず、逆行性トレーサーＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄを上丘に適用することにより、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を選択的に標識した。１週間後、動物に視神経挫滅損傷（ＯＣＮ）を受けさせた。生存ＲＧＣの定量を、伸展標本化した網膜上のＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄ標識ＲＧＣを計数することにより、ＯＮＣの７日後に行なった。ＯＮＣの時点で試験品または対照品を注射した。点眼で投与されたｓｉＲＮＡの活性および効力を試験するために、同様の実験を行なった（次の実施例参照）。表Ｃ２０に処置群を示す。

結果：２０μｇのＣａｓｐ２＿４ ｓｉＲＮＡで処置され、視神経挫滅を受けた眼の生存ＲＧＣの平均数は、損傷後７日で２０８５±４０細胞／ｍｍ^２であった。これらの数は、ＰＢＳまたはＧＦＰ ｓｉＲＮＡまたはＣＮＬ＿１ ｓｉＲＮＡのいずれかで処置され、神経挫滅を受けた眼の平均ＲＧＣ数（７日で、それぞれ、９０１±５０細胞／ｍｍ^２、９２２±３８細胞／ｍｍ^２、８９８±４２細胞／ｍｍ^２）よりも有意に多かった。手術していない対照眼では、ＲＧＣの平均数は、２１９６±１１０細胞／ｍｍ^２であったが、これは、文献で報告されたＲＧＣの平均数と同程度である。表Ｃ２１に結果を示す。データは全て平均±標準偏差として示されている。値は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて比較し、Ｐ<０．０１で有意差とみなした。

結論：ＲＧＣの生存の増加は、カスパーゼ２遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡでの処置による、ＯＮＣ損傷後のアポトーシス促進性カスパーゼ２の活性化と上方調節のサイレンシングの神経保護効果によるものであった。異なる構造修飾／モチーフを有するＣａｓｐ２＿４ ｓｉＲＮＡ分子は、ＲＧＣ生存範囲に対する同様の神経保護効果を示す。

実施例１０：ＩＯＰモデルにおけるカスパーゼ２を標的とするｓｉＲＮＡ化合物の眼神経保護効力の評価
本研究の目的は、前臨床ラット緑内障ＩＯＰモデルにおける２０μｇのＣＡＳＰ２＿４化合物または陰性対照ＧＦＰ ｓｉＲＮＡの単回注射の神経保護効果を立証することであった。

研究概要
全ての研究群の動物で、両方の上丘に適用される蛍光トレーサーＤｉＩ（１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン）を用いて、ＲＧＣを逆行性標識した。１週間後、ＩＯＰは、第２群〜第５群の動物の左眼で片側性に増加した。ＩＯＰを、手術した（左の）眼および対側の（右の）眼において１日おきに２週間モニタリングした。高張食塩水注射の２週間後、ビヒクル（ＰＢＳ）またはｓｉＲＮＡ（ＰＢＳ中２０μｇ、Ｃａｓｐ２を標的とするｓｉＲＮＡもしくは非哺乳動物遺伝子の緑色蛍光タンパク質を標的とする陰性対照ｓｉＲＮＡのいずれか）を、左の（手術した）眼への硝子体内（ＩＶＴ）注射により投与した。対側の手術していない眼は、ＩＶＴ注射を受けなかった。さらに、ｓｉＲＮＡ注射の時点でのＲＧＣ損失の程度を評価するために、高張食塩水注射の２週間後、第２群の動物を屠殺し、ＤｉＩ標識されたＲＧＣを、蛍光顕微鏡検査下、左網膜の伸展標本で計数した。ＩＶＴ注射を受けた全ての群について、手術した眼におけるその上昇状態を確認するために、実験の第３週目にＩＯＰを１回測定した。ＩＯＰ上昇後３週で、または試験品および対照品の注射後１週で、動物を屠殺し、ＤｉＩ標識されたＲＧＣを、蛍光顕微鏡検査下、左網膜の伸展標本で計数した。右網膜は、標識の質の内部対照の役割を果たした。正常なＲＧＣ密度の参照を提供するために、実験開始時にＲＧＣを逆行性標識した別の無処置ラット群を無傷対照として用いた。この群の４匹のラットを高眼圧症発症後２週で（第２群と一緒に）屠殺し、残りの９匹のラットを３週で（第３群〜第５群と一緒に）屠殺した。この実験デザインを下記の表Ｃ２２に示す。

材料および機器
物質（未処方化合物） ＣＡＳＰ２＿４＿Ｓ５１０（ＣＡＳＰ２＿４；ＣＡＳＰ２ＳＩＲＮＡ；カスパーゼ２ ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ）
Ａｇｉｌｅｎｔにより供給された
試験物質の説明：式Ｉに示すような、センス鎖（ＳＥＮ）が、未修飾リボヌクレオチド（大文字）、位置１８のＬ−デオキシリボヌクレオチド（太字、下線付き）、およびＳＥＮ鎖の５’末端に存在する逆方向デオキシ無塩基部分（ｉＢ）を含み；かつアンチセンス鎖（ＡＳ）が、未修飾リボヌクレオチド（大文字）、および位置２、４、６、８、１１、１３、１５、１７、および１９の２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチド（小文字）を含む、２つの別々の鎖を有する１９−ｍｅｒの化学修飾平滑末端二重鎖。
供給量：３００ｍｇ
保存条件：−８０℃

対照物質（未処方化合物） ＧＦＰ＿５＿Ｓ７６３（ＧＦＰ ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ）
外注（製造業者名）：Ａｇｉｌｅｎｔ
製造元のカタログ＃ Ｎ／Ａ
供給量：２２０．８１５０ｍｇ
保存条件：−８０℃；有効期限：日付なし

試験／対照品（処方物） ＣＡＳＰ２＿４／ＧＦＰ＿５ ２０μｇ／５μＬのＰＢＳ
０．５ｍｇを１２５μｌ中に希釈して、４μｇ／μｌのストック溶液を得た。その後、これらをチューブ１本当たり５μｌになるように分注し、−８０℃で保存した。

ビヒクル−ＰＢＳ。

マルチセルリン酸緩衝食塩水、溶液１倍、カルシウム不含、マグネシウム不含（ＣＡＴ．Ｎｏ：３１１−０１０−ＥＬ）。

Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｋｏｐ ２ Ｐｌｕｓ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｃａｎａｄａ，Ｋｉｒｋｌａｎｄ，ＱＣ）を用いて蛍光顕微鏡検査を行ない、ＣＣＤカメラ（Ｒｅｔｉｇａ，Ｑｉｍａｇｉｎｇ）で画像を取得し、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ画像解析ソフトウェア（Ｅｍｐｉｘ Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）で処理した。顕微鏡写真を倍率２５倍で撮影した。

実験手順
ケタミン（１００ｍｇ／ｍｌ）、キシラジン（２０ｍｇ／ｍｌ）、およびアセプロマジン（１０ｍｇ／ｍｌ）からなる１ｍＬ／Ｋｇの標準ラットカクテルの腹腔内注射によって全身麻酔を受けた、繁殖期間を終えた１０〜１２カ月齢（３００〜４００ｇ）の成体オスＢｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙラットで手術を行なった。

高眼圧症手術：房水流出路の遮断を引き起こす、強膜上静脈への高張食塩水の注射を伴う、Ｍｏｒｒｉｓｏｎモデルを用いて、片側性でかつ慢性的なＩＯＰ上昇を誘導した。この手順によって、眼圧の漸増とＲＧＳの段階的な死がもたらされる。この研究における動物は全て、１回分の食塩水静脈注射しか受けなかった。この手順用に選択された眼を、眼球赤道に当てたプラスチック製リングを用いて、食塩水の注射を縁叢に限定するように合わせた。微小針（直径３０〜５０μｍ）を用いて、５０μＬの滅菌１．８５ＭのＮａＣｌ溶液を１つの強膜上静脈から注射した。このプラスチック製リングは、他の強膜上静脈を一時的に遮断し、食塩水溶液をシュレム管に押し込んで、孤立性の瘢痕を生じさせた。ＩＯＰ日内変動を安定化するために、動物は、一定の弱い蛍光灯（４０〜１００ルクス）が点いた部屋に置かれた（８）。

眼圧（ＩＯＰ）の測定：緑内障眼および正常（対側）眼のＩＯＰを、校正された眼圧計（ＴｏｎｏＰｅｎ ＸＬ，Ｍｅｄｏｔｒｏｎｉｃ Ｓｏｌａｎ，Ｊａｃｋｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＦＬ）を用いて覚醒動物で測定した。ＩＯＰを、高眼圧症手術後の最初の２週間１日おきに；および高眼圧症手術後の２週目と３週目の間に少なくとも１度測定した。高いＩＯＰの条件における眼内注射の後、眼が脆くなり始めるので、ＩＯＰ測定の回数を制限した。それは、信頼性のある測定値を得るためには、角膜にさらなる圧力をかけることが必要とされるからである。圧力上昇の発症以降、眼１つ当たりの平均ＩＯＰ（ｍｍＨｇ±標準誤差）を全てのＩＯＰ測定値の平均とみなした。緑内障眼または正常対側眼という、各々の個々の眼における最大ＩＯＰ測定値をピークＩＯＰと定義し、この値を用いて、各々の群についての平均ピークＩＯＰを推定した。

眼圧（ＩＯＰ）の算出：圧力上昇の発症以降、眼１つ当たりの平均ＩＯＰ（ｍｍＨｇ±標準誤差）を全てのＩＯＰ測定値の平均とみなした。緑内障眼または正常対側眼という、各々の個々の眼における最大ＩＯＰ測定値をピークＩＯＰと定義し、この値を用いて、各々の群についての平均ピークＩＯＰを推定した。正の積分ＩＯＰは、緑内障眼におけるＩＯＰ曲線下面積から、高眼圧症手術から安楽死へと至るまでの同類の正常眼のＩＯＰ曲線下面積を引いたものとして算出した。積分ＩＯＰは、実験全体にわたる合計の累積ＩＯＰ曝露に相当する。

研究デザイン：
緑内障誘導の１週間前に、両方の上丘に適用される蛍光トレーサーＤｉＩを用いて、ＲＧＣを逆行性に標識した。

１週間後、強膜上静脈への高張食塩水溶液の注射によって片側性のＩＯＰ上昇を誘導した。この手順を高眼圧症手術と呼んだ。

第１の実験では、効力研究の前に、高眼圧症手術後２および３週での「無注射」群（ラット４匹／群、合計＝８匹のラット）のＲＧＣ損失の状態を評価した。

高眼圧症手術からちょうど２週間後、各々のｓｉＲＮＡの単回硝子体内注射を行なった。

高眼圧症手術からちょうど３週間後、ＲＧＣ生存を解析するために、動物を安楽死させ、網膜を調製した。

生存ＲＧＣの密度を１２カ所の標準的な網膜部位で定量した。

ＲＧＣ細胞体の定量：ＲＧＣ体の定量は、２つ１組で、盲検の形態で行なった。ＲＧＣ密度を測定するために、ラットに深く麻酔をかけ、その後、０．１Ｍリン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を経心的に灌流させて、両眼をすぐに除核した。網膜を解剖し、神経節細胞層側を上にしてスライドガラス上に伸展標本を作成した。ＤｉＩ標識ニューロンを、蛍光顕微鏡検査下、記載した通りに１２カ所の標準的な網膜部位で計数した。

結果&考察

ＰＢＳ処置群との比較
ＩＯＰが上昇したＣＡＳＰ２＿４ ｓｉＲＮＡ処置眼でのＲＧＣの保持は、ＰＢＳ処置群での保持よりも有意に良好であった（ＰＢＳの結果よりも１．３１倍高い；ｐ値＝０．０５）。ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ処置群では、ＰＢＳ処置群に対して有意な差が見られなかった（ｐ値＝０．６８）。

ＰＢＳで処置したＩＯＰ（２週）とＩＯＰ（３週）の間には有意差がなかった（ｐ値＝０．１９）。

ＩＯＰ（２週）群との比較
無傷群は、ＩＯＰ（２ｗ）群よりも有意に高いＲＧＣ密度／ｍｍ^２を有している（ｐ値＝０．００）。ＩＯＰ（２ｗ）群と３週後に屠殺された他のＩＯＰ群との間では、ＲＧＣ密度／ｍｍ^２における有意差が見られなかった（ｐ値は０．１６〜０．４４の範囲である）。

無傷群との比較
無傷群は、ＰＢＳ、ＧＦＰ ｓｉＲＮＡで処置されたＩＯＰ群、および無処置のＩＯＰ（２ｗ）よりも有意に高いＲＧＣ密度／ｍｍ^２を有している（ｐ値<０．０１）。無傷群と比較してＣＡＳＰ２＿４ ｓｉＲＮＡで処置されたＩＯＰ群では、ＲＧＣ密度／ｍｍ^２における有意差が見られなかった（ｐ値＝０．０６）。

これらのデータは、カスパーゼ２を標的とするｓｉＲＮＡによって、眼圧の上昇により誘導される傷害からＲＧＣが保護され、ＩＯＰの上昇から２週後のその投与によって、さらなるＲＧＣ損失が止まることを示している。

ＩＯＰ測定は、上記の通りに実施された。

ＩＯＰ：これらの結果をＰＢＳ処置群と比較するために、Ｄｕｎｎｅｔｔ法を用いた。さらなるパラメータ：測定期間中のＡＵＣ（曲線下面積）、平均ＩＯＰ、および最大（ＩＯＰ）を算出および解析した。

ほとんどの動物は、高眼圧症手術後１〜２週でＩＯＰの有意な上昇を示す。

処置群の手術した眼では、ＩＯＰレベルにおける有意差が見られなかった（０．７７４６）。同様に、処置群と無傷群の対側眼では、ＩＯＰレベルにおける有意差が見られなかった。

これらの結果は、ＩＯＰが全ての処置群で上昇したままであっても、Ｃａｓｐ２ ｓｉＲＮＡによって、神経保護が誘導されたことを示している。

結果：３つ全ての算出されたＩＯＰパラメータで、群間の有意差が見られなかった。

実施例１１：軸索切断モデルにおけるカスパーゼ２を標的とするｓｉＲＮＡ化合物の眼神経保護効力の評価
本効力研究の目的は、成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける視神経（ＯＮ）の軸索切断によって誘導されるＲＧＣアポトーシスのモデルを使用することであった。このモデル系におけるＲＧＣ死の発症と動態は極めて再現性がよく、インビボでのＣａｓｐ２＿４ ｓｉＲＮＡの神経保護効力の立証を可能にする。この方法を用いると、ＲＧＣ死の時間経過は予測通りの経過をたどる、すなわち、細胞死が５日目に始まり、２週目までに、これらのニューロンの９０％よりも多くの速やかな損失へと進行する。

方法
ＲＧＣの逆行性標識：この研究のために、逆行性トレーサーＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄ（２％，Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，ＣＯ）を上丘に適用することにより、ＲＧＣを標識した。簡潔には、両方の上丘を露出させ、それらの表面にＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄに浸したゲルフォームの小片を適用した。成体ラットでは、この手順後に全てのＲＧＣの完全な標識を得るのに要する時間は、約１週間である。このため、視神経軸索切断とｓｉＲＮＡ分子の眼内注射は、ＲＧＣの逆行性標識の１週間後に行なわれた。

視神経軸索切断：眼の近く（０．５〜１ｍｍ）の視神経を切断することにより、全てのＲＧＣの軸索を切断した。手術後の網膜循環の完全性を調べるために、各々の軸索切断後、網膜底検査をルーチンに行なった。血液供給の不全の兆候を示す動物を研究から除外した。

硝子体内注射のために、各々ＰＢＳ ５μｌ中１０μｇの、Ｃａｓｐ２＿４ ｓｉＲＮＡまたはＧＦＰ ｓｉＲＮＡのいずれかの試薬を、手術の時点である０日目に、ガラスマイクロピペットを用いて、神経頭の前方２ｍｍの位置で、強膜と垂直に硝子体に微量注射し、その後、７日目に繰り返した。

ＲＧＣ生存の定量：視神経軸索切断の１４日後に、実験動物および対照動物に、４％パラホルムアルデヒドを経心的に灌流させた。神経節細胞層を調べるために、左網膜（処置済み）および右網膜（無処置対照）を摘出し、さらに３０分間固定し、硝子体側を上にしてスライドガラス上に伸展標本を作成した。ＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄを逆行性に充填されたＲＧＣを１２カ所の標準的な網膜部位で計数した。死にかけているＲＧＣの貪食後にＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄを取り込んだ可能性のあるミクログリアは、その特徴的形態によって区別され、定量的解析から除外された。

実験デザイン
試験品：ＣＡＳＰ２＿４Ｌ ｓｉＲＮＡ：アンチセンス鎖上の糖残基の２’Ｏ−メチル化およびセンス鎖上のＬ−ＤＮＡにより化学修飾された二本鎖１９−ｍｅｒオリゴヌクレオチド。複数の種のカスパーゼ２遺伝子を標的とする。

対照品
ＰＢＳ
ＧＦＰを標的とするｓｉＲＮＡ−両方の鎖上の２’Ｏ−メチル化により化学修飾された二本鎖２１−ｍｅｒオリゴヌクレオチド。
ＣＮＬ−哺乳動物の既知のどの転写物ともマッチしないｓｉＲＮＡ；両方の鎖上の２’Ｏ−メチル化により化学修飾された二本鎖１９−ｍｅｒオリゴヌクレオチド。表Ｃ２４に処置群を示す。

結果：１０μｇ Ｃａｓｐ２＿４ ｓｉＲＮＡの２回の硝子体内注射で処置され、軸索切断を受けた眼の生存ＲＧＣの平均数は、損傷後１４日で５３３±２４細胞／ｍｍ^２であった。これらの数は、ＧＦＰ ｓｉＲＮＡによって同様のレジメンで処置され、軸索切断を受けた眼の平均ＲＧＣ数（１４日で１３０±７細胞／ｍｍ^２）よりも有意に多かった。手術していない対照眼では、ＲＧＣの平均数は、２１３８±９１細胞／ｍｍ^２であったが、これは、文献で報告されたＲＧＣの平均数と同程度である。

データ解析と統計は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｉｎｓｔａｔソフトウェアを用いて、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により行なった。データは全て平均±標準誤差として示し、Ｐ<０．０２で有意差とした。

結論：ＲＧＣの生存の増加は、カスパーゼ２遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡでの処置による、軸索切断後のアポトーシス促進性カスパーゼ２の活性化と上方調節のサイレンシングによる神経保護効果によるものであった。

考察：本研究において、Ｃａｓｐ２＿４ ｓｉＲＮＡは、視神経挫滅モデルでは少なくとも３０日間、およびＲＧＣ損失の軸索切断モデルでは１４日間、神経を保護した。視神経挫滅実験と軸索切断実験により、急性眼神経症の実際的なモデルが提供される。

ｓｉＲＮＡ化合物の非侵襲的投与は、眼神経細胞損傷の動物モデルにおいてインビボで眼神経保護を誘導する
実施例１２：ＯＣＮモデルにおけるカスパーゼ２を標的とする非侵襲的に投与されるｓｉＲＮＡ化合物の眼神経保護効力の評価
試験品：ＣＡＳＰ２＿４ ｓｉＲＮＡ（式Ｉの化合物）

対照品：
−メチルセルロース
−ＣＮＬ−哺乳動物の既知のどの転写物ともマッチしないｓｉＲＮＡ；両方の鎖上の２’Ｏ−メチル化により安定化された二本鎖１９−ｍｅｒオリゴヌクレオチド。

デザイン：まず、逆行性トレーサーＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄを上丘に適用することにより、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を選択的に標識した。１週間後、動物に視神経挫滅損傷（ＯＣＮ）を受けさせた。点眼薬を１日おきに１週間適用した（全部で３回）。１００μｇ／３μｌのＣＮＬ＿１もしくはＣａｓｐ２＿４ ｓｉＲＮＡまたは３μｌのＭＣビヒクルを適用し、第１の用量をＯＮＣの１０分後に適用した。生存ＲＧＣの定量を、伸展標本化した網膜上のＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄ標識ＲＧＣを計数することにより、ＯＮＣの７日後に行なった。

結果：２０μｇのＣａｓｐ２＿４ ｓｉＲＮＡで処置され、視神経挫滅を受けた眼の生存ＲＧＣの平均数は、損傷後７日で４４５±１７細胞／ｍｍ^２であった。この数は、ＰＢＳまたはＣＮＬ＿１ ｓｉＲＮＡのいずれかで処置され、神経挫滅を受けた眼の平均ＲＧＣ数（７日で、それぞれ、３３７±１１細胞／ｍｍ^２、３４１．６±１３細胞／ｍｍ^２）よりも有意に多かった。表Ｃ２６に結果を示す。データは全て平均±標準偏差として示されている。値は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて比較し、Ｐ<０．０１で有意差とみなした。

結論：ＲＧＣの生存の増加は、メチルセルロース製剤中の、カスパーゼ２遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを含む点眼薬での処置によるＯＮＣ損傷後のアポトーシス促進性カスパーゼ２のサイレンシングの神経保護効果によるものであった。

実施例１３：ＩＯＰモデルにおけるカスパーゼ２を標的とする非侵襲的に投与されるｓｉＲＮＡ化合物の眼神経保護効力の評価
実験設定：
実験動物：動物手順は全て、実験動物の使用に関するＣａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅの指針（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｃａｃ．ｃａ／）に従って行なわれた。ケタミン（１００ｍｇ／ｍｌ）、キシラジン（２０ｍｇ／ｍｌ）、およびアセプロマジン（１０ｍｇ／ｍｌ）からなる１ｍＬ／Ｋｇの標準ラットカクテルの腹腔内注射によって全身麻酔を受けた、繁殖期間を終えた１０〜１２カ月齢（３００〜４００ｇ）の成体オスＢｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙラットで手術を行なった。

ＲＧＣの逆行性標識：ニューロン生存実験のために、退色または漏出することなく数カ月間持続しかつ標識された細胞の機能を妨害しない蛍光カルボシアニンマーカーである、３％のＤｉＩ（１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチル−インドカルボシアニン過塩素酸塩；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｊｕｎｃｔｉｏｎ Ｃｉｔｙ，ＯＲ）でＲＧＣを逆行性に標識する。逆行性標識のために、脳のＲＧＣの主な標的である、両方の上丘を露出させ、それらの表面にＤｉＩに浸したゲルフォーム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ａｎｄ Ｕｐｊｏｈｎ Ｉｎｃ．，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）の小片を適用する。ＤｉＩ適用から７日（全てのＲＧＣの完全な標識を得るのに要する時間）後、動物に、以下に記載するような高眼圧症手術を受けさせる。

高眼圧症手術：強膜上静脈への高張食塩水溶液の注射を伴う方法を用いて、片側性でかつ慢性的なＩＯＰ上昇を誘導する。この研究における動物は全て、１回分の食塩水静脈注射しか受けない。この手順用に選択された眼を、眼球赤道に当てたプラスチック製リングを用いて、食塩水の注射を縁叢に限定するように合わせる。微小針（直径３０〜５０μｍ）を用いて、５０μｌの滅菌１．８５ＭのＮａＣｌ溶液を１つの強膜上静脈から注射する。このプラスチック製リングは、他の強膜上静脈を一時的に遮断し、食塩水溶液をシュレム管に押し込んで、孤立性の瘢痕を生じさせる。ＩＯＰ日内変動を安定化するために、動物は、一定の弱い蛍光灯（４０〜１００ルクス）が点いた部屋に置かれる。

眼圧（ＩＯＰ）の測定：緑内障眼および正常（対側）眼のＩＯＰを、校正された眼圧計（ＴｏｎｏＰｅｎ ＸＬ，Ｍｅｄｏｔｒｏｎｉｃ Ｓｏｌａｎ，Ｊａｃｋｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＦＬ）を用いて覚醒動物で測定する。ＩＯＰを、高眼圧症手術後の最初の２週間１日おきに；および高眼圧症手術後の２週目と３週目の間に少なくとも１度測定する。高いＩＯＰの条件（下記参照）における眼内注射の後、眼が脆くなり始めるので、ＩＯＰ測定の回数を制限することが望ましい。それは、信頼性のある測定値を得ためには、角膜にさらなる圧力をかけることが必要とされるからである。圧力上昇の発症以降、眼１つ当たりの平均ＩＯＰ（ｍｍＨｇ±標準誤差）を全てのＩＯＰ測定値の平均とみなす。緑内障眼または正常対側眼という、各々の個々の眼における最大ＩＯＰ測定値をピークＩＯＰと定義し、この値を用いて、各々の群についての平均ピークＩＯＰを推定する。正の積分ＩＯＰは、緑内障眼におけるＩＯＰ曲線下面積から、高眼圧症手術から安楽死へと至るまでの同類の正常眼のＩＯＰ曲線下面積を引いたものとして算出する。積分ＩＯＰは、実験全体にわたる合計の累積ＩＯＰ曝露に相当する。

ｓｉＲＮＡ分子の眼内注射：各々のｓｉＲＮＡ化合物を２０μｇの濃度で左眼の硝子体腔に注入することにより、眼内注射を行なう（総注射容量：５μｌ）。右眼は対側対照としての役割を果たす。さらに、実験に使われていないラットの手術していない眼を無傷対照として用いる。約３２ゲージのガラス針で構成された１０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを用いて、硝子体内注射を行なう。針先を、強膜から水晶体に４５度の角度で、経毛様体扁平部の深さで、眼の上半球に挿入する。この投与経路は、網膜剥離、または水晶体や虹彩をはじめとする、ＲＧＣの再生や生存を誘導する因子を放出することができる、眼構造の損傷を防ぐ。注射を２分間かけて行ない、針をさらに２分間その場所で保ち、その後、そっと抜く。手術用の糊（Ｉｎｄｅｒｍｉｌｌ，Ｔｙｃｏ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて、注射部位を塞ぐ。

ｓｉＲＮＡ分子の局所点眼薬による滴下：
ＩＯＰ誘導後の３週目に毎日、３μｌ試料容量のｓｉＲＮＡ １００μｇを、とがっていないピペットチップ（フィルターチップ １０μｌ 滅菌（短い））で、麻酔した動物の角膜表面に両側性に適用する。麻酔誘発低体温を防ぐために、動物を暖かい環境に置く。

生存ＲＧＣ細胞体の定量：ＲＧＣ体の定量は、２つ１組で、盲検の形態で行なう。ＲＧＣ密度を測定するために、ラットに深く麻酔をかけ、その後、０．１Ｍリン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を経心的に灌流させて、両眼をすぐに除核する。網膜を解剖し、神経節細胞層側を上にしてスライドガラス上に伸展標本を作成する。ＤｉＩ標識ニューロンを、蛍光顕微鏡検査下、記載した通りに１２カ所の標準的な網膜部位で計数する。

ＩＯＰ（眼内圧）を誘導し、２週間経過観察する。その後、表Ｃ２７の研究デザインに詳細に記載されるように、点眼（２％メチルセスルース製剤中のｓｉＲＮＡ）またはＩＶＴ（ＰＢＳ中のｓｉＲＮＡ）のいずれかによって、ＣＡＳＰ２＿４または対照ｓｉＲＮＡを投与する。

これらの結果は、２％メチルセルロース製剤中に処方されたｓｉＲＮＡの非侵襲的送達によって神経保護がもたらされ、ニューロンの生存が増加することを示している。

実施例１４：ラット視神経挫滅（ＯＣＮ）モデル：硝子体内ｓｉＲＮＡ送達と局所点眼送達との比較
視神経切断のために、麻酔したラットの眼窩視神経（ＯＮ）を眼窩上からのアプローチによって露出させ、髄膜を切り取り、ＯＮ内の全ての軸索を鉗子で１０秒間押し潰すことによって篩板から２ｍｍの位置で切断する。

ｓｉＲＮＡ化合物を、単独でまたは５μＬ容量（２０μｇ／μＬ）と組み合わせて、点眼薬として送達する。視神経挫滅（ＯＣＮ）の後すぐに、２０μｇ／１０μｌの試験ｓｉＲＮＡまたは１０μｌのＰＢＳを、成体Ｗｉｓｔａｒ ｒａｔの一方または両方の眼にＩＶＴで投与する。その後、ｓｉＲＮＡを１日おきにＥＤで眼に適用し、注射後５時間および１日で、ならびに後に２日、４日、７日、１４日、および２１日で、摘出および瞬間凍結された網膜全体に取り込まれたｓｉＲＮＡのレベルを測定する。点眼で投与されたｓｉＲＮＡの活性および効力を試験するために、同様の実験を行なう。

下記の表Ｃ２８には、ＯＣＮモデルにおける単独または組み合わせた試験ｓｉＲＮＡ（ｓｉＴＥＳＴ１；ｓｉＴＥＳＴ２）の効力を決定するための実験手順が示されている。さらなる投与パラメータ、濃度、終了スケジュール、製剤などが企図されている。

結果：この研究で得られる結果によれば、標的遺伝子を下方調節するよう設計されたｓｉＲＮＡ化合物の非侵襲的送達によって、網膜での神経保護がもたらされ、ニューロンの生存が増加する。

表Ｂ１〜Ｂ２６には、未修飾または化学修飾ｓｉＲＮＡ化合物を合成するときに有用なセンス核酸とアンチセンス核酸のオリゴヌクレオチド対が開示されている。これらの表には、少なくとも１つの変異体を示す、ｍＲＮＡ中のセンス鎖の位置が開示されている。

Claims (17)

1. 以下の構造を有する二本鎖ＲＮＡ化合物
   ５’ ｉＢ−ＧＣＣＡＧＡＡＵＧＵＧＧＡＡＣＵＣＣＵ ３’
   （センス鎖、配列番号９０１５）
   ３’ ＣＧＧＵＣＵＵＡＣＡＣＣＵＵＧＡＧＧＡ ５’
   （アンチセンス鎖、配列番号９５１６）
   ［ここで、
   各連続するＡ、Ｃ、Ｇ、または、Ｕは、次のＡ、Ｃ、Ｇ、またはＵに、ホスホジエステル結合によって、結合されており、
   センス鎖は、５’末端から数えて、
   １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７および１９の位置に未修飾リボヌクレオチドを、
   １８の位置にＬ−デオキシシチジンを、および、
   逆方向無塩基５’−ｃａｐ（ｉＢ）
   を含み、
   アンチセンス鎖は、
   ５’末端から数えて、２、４、６、８、１１、１３、１５、１７および１９の位置に２’ＯＭｅ糖修飾リボヌクレオチドを、および、
   １、３、５、７、９、１０、１２、１４、１６、および１８の位置に未修飾リボヌクレオチド
   を含む］
   または、その塩。
2. 請求項１に記載の化合物またはその塩を含むことを特徴とする、医薬組成物。
3. ＣＡＳＰ２遺伝子の発現を下方制御する医薬組成物であって、請求項１に記載の化合物またはその塩を含むことを特徴とする、医薬組成物。
4. 対象の網膜神経節細胞の損失または当該細胞への障害を阻害または予防するための眼科用組成物であって、請求項１に記載の化合物またはその塩を含むことを特徴とする、組成物。
5. 請求項４に記載の組成物であって、前記対象が人間であることを特徴とする、組成物。
6. 請求項４または５に記載の組成物であって、
   前記「網膜神経節細胞の損失または当該細胞への障害の阻害または予防」が、
   当該網膜神経節細胞の損傷または死を遅延させるか、
   当該網膜神経節細胞の損傷または死を予防するか、
   当該網膜神経節細胞を損傷または死から救うか、および／または、
   当該網膜神経節細胞の生存を促進させるか、
   であることを特徴とする、組成物。
7. 請求項４または５に記載の組成物であって、
   前記「網膜神経節細胞の損失または当該細胞への障害」が、眼圧（ＩＯＰ）の上昇によ
   り仲介されることを特徴とする、
   組成物。
8. 請求項２に記載の組成物であって、
   眼の疾患、眼の障害、眼の損傷、若しくは、視野損失に苦しんでいるか、または、眼の疾患、眼の障害、眼の損傷、若しくは、視野損失を発症するリスクがある、対象の治療を治療するため、
   または、眼神経保護を提供するため
   のものである、ことを特徴とする、
   組成物。
9. 請求項８に記載の組成物であって、
   前記「眼の疾患、眼の障害、眼の損傷」が、視覚系の組織の病的異常／変化と関連することを特徴とする、
   組成物。
10. 請求項８に記載の組成物であって、
    前記「眼の疾患、眼の障害、眼の損傷」が、神経変性を含むことを特徴とする、
    組成物。
11. 請求項８に記載の組成物であって、
    前記「眼の疾患、眼の障害、眼の損傷」が、網膜神経節細胞損失または網膜神経節細胞傷害と関連することを特徴とする、
    組成物。
12. 請求項８に記載の組成物であって、
    前記「眼の疾患、眼の障害、または、眼の損傷」が、眼神経症、眼圧（ＩＯＰ）の上昇、緑内障、原発開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）、開放隅角緑内障、閉塞隅角緑内障、正常眼圧緑内障、先天性緑内障、続発性緑内障、ドライアイ、シェーグレン症候群、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、視神経炎、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分岐閉塞症、虚血性視神経症（ＩＯＮ）、視神経損傷、未熟児網膜症（ＲＯＰ）、網膜色素変性症（ＲＰ）、網膜神経節変性症、黄斑変性症、遺伝性視神経症、レーベル遺伝性視神経症、代謝性視神経症、毒物による神経症、および、有害な薬物反応もしくはビタミン欠乏により引き起こされる神経症からなる群から選択される、
    組成物。
13. 請求項１２に記載の組成物であって、
    前記虚血性視神経症（ＩＯＮ）が、前部虚血性視神経症および／または後部虚血性視神経症を含む
    ことを特徴とする、
    組成物。
14. 請求項２に記載の組成物であって、
    前記化合物が、約５μｇ／μｌ〜約６０μｇ／μｌの最終濃度で存在することを特徴とする、
    組成物。
15. 請求項２〜１４のいずれか１項に記載の組成物であって、
    前記組成物が、液体溶液（liquid solution）として処方されることを特徴とする、
    組成物。
16. 請求項２〜１４のいずれか１項に記載の組成物であって、
    前記組成物が、点眼薬として処方されることを特徴とする、
    組成物。
17. 請求項１５に記載の組成物であって、
    前記液体溶液が、硝子体内注射用に調製されることを特徴とする、
    組成物。