JP3419772B2 - フィブリン結合ドメインポリペプチド及びその使用，並びにその製造方法 - Google Patents

フィブリン結合ドメインポリペプチド及びその使用，並びにその製造方法

Info

Publication number
JP3419772B2
JP3419772B2 JP51119791A JP51119791A JP3419772B2 JP 3419772 B2 JP3419772 B2 JP 3419772B2 JP 51119791 A JP51119791 A JP 51119791A JP 51119791 A JP51119791 A JP 51119791A JP 3419772 B2 JP3419772 B2 JP 3419772B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
polypeptide
fbd
fibrin
binding
plasmid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP51119791A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH05508766A (ja
Inventor
ボーゲル、ティクバ
レバノン、アビグドル
ウエルベル、モシェ
ガイ、ラチェル
パネト、アモス
ハートマン、ジャコブ
シャケド、ハダッサ
Original Assignee
バイオ ― テクノロジー・ジェネラル・コーポレイション
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by バイオ ― テクノロジー・ジェネラル・コーポレイション filed Critical バイオ ― テクノロジー・ジェネラル・コーポレイション
Publication of JPH05508766A publication Critical patent/JPH05508766A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3419772B2 publication Critical patent/JP3419772B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0002—General or multifunctional contrast agents, e.g. chelated agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/082—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins the peptide being a RGD-containing peptide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/088—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins conjugates with carriers being peptides, polyamino acids or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M25/00—Catheters; Hollow probes
    • A61M25/0043—Catheters; Hollow probes characterised by structural features
    • A61M25/0045—Catheters; Hollow probes characterised by structural features multi-layered, e.g. coated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C07K14/3153—Streptokinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2123/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Description

【発明の詳細な説明】 この出願は、1990年５月21日に出願された米国特許出
願第526,397号の一部継続出願である。
〔発明の背景〕
この出願の全体を通して、括弧内に記載したアラビア
数字によって種々の刊行物が参照される。これら参照文
献の完全な引用は、請求の範囲の直前の明細書末尾に記
載してある。これら刊行物の開示は、本発明が属する技
術の状況をより完全に記載するために、その全体が参考
として本出願に組み込まれる。
内皮損傷は血栓形成の最初のステップと考えられてお
り、例えば血行力学的緊張、高コレステロール血症、高
血圧および免疫複合疾患によって惹起され得る。内皮損
傷は内膜の肥厚、細胞の増殖、コレステロールの蓄積お
よび結合組織繊維の形成を導く。損傷された内皮細胞お
よび非内皮化された内膜におけるIgGおよび補体因子C3
の蓄積が観察されている。血液由来の単核細胞のまた、
アテローム硬化病巣における細胞ポピュレーションの一
部である。プレーク形成のメカニズムは完全には知られ
ていないが、可能なメカニズムは次ぎの通りである。即
ち、Ｔ細胞および単球由来マクロファージからなる初期
病巣、脂肪線条（fatty streaks）が内皮下層を形成
し、続いて種々のサイトカイニン類が分泌されて、内膜
中への平滑細胞の移行および蓄積が導かれる。
アテローム硬化および血栓の診断および治療のために
現在存在する方法の殆どは、侵襲的で費用が高く、かな
りの比率の患者において効果に制限がある。
染色の適用によるプラーク増強の概念が報告されてい
る（Spears,J.et al.,J.Clin.Invest.71:395−399（198
3））。これら染色によって、プラーク表面は蛍光化合
物でマークされる。管内レーザ伝送光ファイバーを用い
た、ヘマトポルフィリン誘導体の光活性化によるプラー
クの崩壊が示唆されている（Abela,G.et al.,Am.J.Card
io.50:1199−1205（1982））。更に、テトラサイクリン
染色が示唆されている（Murphy−Chutorian,D.et al.,A
m.J.Cardiol.55:1293−1297（1985））。
上記で確認された染色は、アテローム硬化性プラーク
の成分に対するその結合能力のために選択される。原理
的には、該染色はレーザ光を吸収し、該レーザ光を染色
された表面に集中させる。健康な組織の染色は、周囲の
組織に対して損傷を伴う染色を惹起する。レーザ光の波
長は染色の吸収波長に限定されるから、最良の制御され
た破壊を与えるためには、レーザ光の最適吸収を与える
発色団を使用しなければならない。
冠動脈血栓、肺動脈塞栓、深部静脈血栓およびアテロ
ーム効果病巣の画像化および検出は、特に最近開発され
ている新規血栓溶解剤の観点から、臨床的に極めて重要
である。放射性薬剤を用いることによる、血栓の非侵襲
的検出のための幾つかの実験的アプローチが報告されて
いる。しかし、夫々の薬剤に伴う固有の欠点のために、
何れも臨床的に広く認知されてはいない。血管内のアテ
ローム硬化病巣および血栓を初期に検出するために用い
られる放射性薬剤の基本的な特徴は次の通りである：
（ｉ）血栓成分に対する高い親和性；（ii）比較的迅速
な薬力学的血液クリアランス速度［血液中（非結合）に
対する血栓中（結合）の、放射能でラベルされたトレー
サの高い比率を得るため］；（iii）安全性（非毒性お
よび非免疫原性）；および（iv）製造および使用の簡便
性。
文献に記載された、血栓を画像化するための種々の薬
剤とその欠点は次の通りである：（ａ）111Inでラベル
された自己由来の血小板：操作が繁雑で、長時間を要
し、且つ血液クリアランス時間が２日と比較的長い
（２）；（ｂ）131I−フィブリノーゲン：この試験は、
放射能でラベルされた注射されたフィブリノーゲンの血
栓に対する（低い）親和性に基づいているが、その血中
滞留時間が長し、更には古い血栓中には取り込まれず、
加えてヘパリンの存在下では取り込まれないため（3,3
6）、迅速な画像化試験には適していない；（ｃ）ヒト
・フィブリンのE1フラグメント：フィブリノーゲンより
優れているように思えるが、広範は臨床的使用のために
充分な量を製造するのは困難である（４）；（ｄ）マウ
ス抗フィブリンモノクローナル抗体：血栓に対して特異
的で且つ高い親和性を有しているが、血液クリアランス
時間が比較的長く、またヒト対象に対して免疫原となり
得る（5,33,34）；（ｅ）活性化された血小板に対して
特異的なマウス・モノクローナル抗体（6,7）：（ｄ）
と同様の欠点を有する；（ｆ）ラベルされたフィブロネ
クチン：フィブロネクチンは血栓中に存在する多くの物
質に対して親和性を有しているが（以下を参照のこ
と）、血液クリアランス時間が比較的長く、また血栓中
における放射活性の増大が遅い。このように、当該技術
分野においては、血栓の迅速な画像化のために、血栓特
異性の放射性薬剤が要望されている。
米国特許第4,343,732号（Lian et al.）には、組織を
免疫蛍光染色して該組織におけるGLAの存在を検出する
ために、フルオレセインでラベルされ得る特異的なガン
マ−カルボキシグルタミン酸（GLA）抗体が記載されて
いる。特異的GLA抗体は、カルシウムが沈着したアテロ
ーム硬化プラーク中に予め存在するGLAに結合する。Lia
n等は、カルシウム沈着のないプラーク中ではGLAが発見
されないこと、また心臓弁および大動脈中、並びにプロ
トロンビン、凝固因子VII、同IX、同Ｘ、プロテインＣ
およびプロテンＳのような循環系タンパク中にGLAが発
見されることを報告している。しかし、Lian等のGLA結
合抗体は、アテローム硬化性プラークに対して選択的に
は結合しない。
フィブロネクチンは、夫々が略220,000の分子量を有
する同一の二つのサブユニットで構成される糖タンパク
である。フィブロネクチンの二つの主な形態が、培養お
よびin vivoのヒト細胞によって産生され、分泌され
る。細胞結合性フィブロネクチン（cell−associated f
ibronectin）は相対的に不溶性であり、細胞付着、創傷
治癒、細胞分化およびファゴサイトーシスに関与する。
主に肝臓で産生されるプラズマ・フィブロネクチンは、
細胞フィブロネクチンと同様の生物学的性質をもった可
溶性の血清タンパクである。
フィブロネクチンは、限定的タンパク分解開裂によっ
て異なった活性のポリペプチドを生成するため、多機能
的調節タンパクと考えられる。フィブロネクチン分子の
主要な機能ドメインは、部分的タンパク分解消化によっ
て得られ且つ定義されており、ヘパリン、DNA、フィブ
リン、コラーゲン若しくはゼラチン、および細胞結合性
ドメインを含んでいる（８−13）。
1989年１月７日に発行されたBaralle,F.E.のヨーロッ
パ特許公報第207,751号には、フィブロネクチンの完全
なcDNA配列が開示されている。Baralleは又、Escherich
a coliタンパクであるβ−ガラクトシダーゼに融合され
たフィブロネクチンの、コラーゲン結合性ドメインの一
部を含んだ融合タンパクの発現を開示している。Owens
およびBaralleによって、同様の融合タンパクが開示さ
れている（14）。Obara等（1987）は、Eschericha coli
β−ガラクトシダーゼに融合されたヒト・フィブロネク
チンの、細胞結合性ドメインの一部の発現を開示してい
る（15）。加えて、Obara等（1988）は、β−ガラクト
シダーゼに融合した細胞結合性ドメインの一部の突然変
異誘発された発現、即ち、細胞結合性ドメインの一部の
部位特異的欠落（site specific deletion）が融合タン
パクとして得られたことを開示している（16）。ヒト・
フィブロネクチンのカルボキシ末端フィブリン結合性ド
メインは、マウスＬ細胞において、ヒト・プロテインＣ
阻害剤のシグナル配列をもった融合タンパクとして発現
されている（17）。
上記参照文献は何れも、フィブロネクチンのＮ末端フ
ィブリン結合性ドメインの発現を開示していない；更
に、これらが開示する組換タンパクは全て融合タンパク
である。
本発明は、フィブロネクチンのＮ末端フィブリン結合
性ドメインに実質的に存在するアミノ酸配列をもったポ
リペプチドを提供する。これらポリペプチドは、還元条
件下でのSDSゲル上のマーカの比較により定義されるも
のとして、略31kD,20kD,18.5kDおよび12kDの分子量を有
し、薬剤として有望視するに足る次の特徴を有する：
（ｉ）ヒト・タンパクに存在するアミノ酸配列を有し、
従って免疫原性ではないと思われる；（ii）トランスグ
ルタミナーゼに触媒された反応において初期の並びに予
備形成された血栓（血餅）に対して共有結合的に架橋さ
れる能力に基づき、フィブリンに対して特異性を有す
る；（ii）細胞外マトリックスに結合し、この性質はア
テローム硬化性プラークの検出に利用し得る；（iv）相
対的に短い血液クリアランス時間を有する；（ｖ）ヘパ
リンの存在下で血餅中に取り込まれる；（vi）組換技術
によって製造され、従って大規模に製造することが可能
性である。
本発明はフィブリン含有物質、即ち、血栓およびアテ
ローム硬化性プラークを、in vitroおよびin vivoで画
像化するための費用のかからない正確な方法を提供す
る。加えて、本発明は天然に生じるヒト・フィブロネク
チンのフィブリン結合性ドメインに実質的に存在するア
ミノ酸配列を有し、ラベルされるフィブリンに結合する
ことができ、フィブリン含有物質の画像化に用いられる
ポリペプチドを発現するためのプラスミドと、該ポリペ
プチドの製造方法を提供する。
〔発明の概要〕
本発明は、画像化可能なマーカ（標識）でラベルされ
たポリペプチドを具備した画像化剤であって、前記ポリ
ペプチドは天然に生じるヒト・フィブロネクチンのフィ
ブリン結合性ドメインに実質的に存在するアミノ酸配列
を有し、且つフィブリンに結合できることを特徴とする
画像化剤を提供する。
更に、フィブリン含有物質、即ち、血栓またはアテロ
ーム硬化性プラークを画像化する方法であって、画像化
すべき前記フィブリン含有物質と上記画像化剤とを、該
画像化剤が前記フィブリン含有物質に結合する条件下で
接触させることと、結合された前記画像化剤を画像化す
ることにより、前記フィブリン含有物質を画像化するこ
ととを具備した方法が提供される。
また、天然に生じるヒト・フィブロネクチンのフィブ
リン結合性ドメインに実質的に存在するアミノ酸配列を
有し、且つフィブリンに結合できるポリペプチドの発現
のためのプラスミドであって、前記ポリペプチドをコー
ドするDNAと、適切なホスト細胞中で前記ポリペプチド
を発現させるように該ポリペプチドをコードする前記DN
Aに対して位置付けられた、適切な調節要素をコードす
るDNAとを具備したプラスミドが提供される。
本発明はまた、ヒト起源の他の物質を実質的に含まな
い精製されたポリペプチドであって、天然に生じるヒト
・フィブロネクチンのフィブリン結合性ドメインに実質
的に存在するアミノ酸配列を有し、且つフィブリンに結
合できる精製されたポリペプチドを提供する。
更に、上記のようなポリペプチドを回収し、再折畳み
し、再酸化する方法、並びにこのようなポリペプチドを
用いた治療方法を提供する。
〔図面の簡単な説明〕 添付の図面において、示された所定の制限酵素部位に
隣接した括弧内の数字は、図２に示されたヒト・フィブ
ロネクチンcDNAのヌクレオチド配列に沿って同じ番号を
付した位置に対応する（1989年１月７日に発行されたBa
ralle,F.E.のヨーロッパ特許公報第207,751号の図３も
参照のこと）。
以下の図は、フィブロネクチンのアミノ末端フィブリ
ン結合ドメイン（RFD）に実質的に存在するアミノ酸配
列を有するポリペプチドを発現するプラスミドの構築を
説明するものである。FBDは成熟フィブロネクチンのア
ミノ酸番号１（これはグルタミンであり、図2Aに示され
た第４番目のアミノ酸（Ｑ）に対応する）に始まる。即
ち、FBD配列のＮ末端はＱ−Ａ−Ｑ−Ｑ（グルタミン−
アラニン−グルタミン−グルタミン）である；従って、
図2AのcDNA配列中の対応する第一番目のヌクレオチド
は、矢印で示す番号14である。これらの図および明細書
の全体を通して記載される全ての組換FBDポリペプチド
は、アミノ酸番号１のこの第一番目のグルタミンから番
号が付され、また全ての対応するcDNA配列は図２に示す
ように番号が付される。
幾つかの図は、そのＣ末端でフィブロネクチンの細胞
結合性ドメイン（CBD）の部分に結合した、FBDポリペプ
チドを発現するプラスミドの構築を記載している。出願
人がクローン化し且つ発現させたCBDに対応するcDNA配
列は、Baralleのマップ（図２参照）には含まれている
ヌクレオチド4811からヌクレオチド5080に亘る270塩基
対のエクストラドメイン（ED）セグメントが喪失されて
いる。従って、Baralleのマップ上ではヌクレオチド331
7からヌクレオチド5566に亘ると言われているcDNA配列
は、EDセグメントの270ヌクレオチド、即ちヌクレオチ
ド4811−5080を含むもの（この領域は当該技術分野にお
いてED−Ａ領域としても知られている）が喪失されてい
るため、1980ヌクレオチドしか含んでいない。ヌクレオ
チド5081がＧからＡに変化しているため、アミノ酸1690
はアラニンからスレオニンに変化されている。同様に、
Baralleのマップ上ではアミノ酸1102からアミノ酸1851
をコードするであろうこのDNAフラグメントによって発
現されたポリペプチドは、ED領域によりコードされる90
個のアミノ酸（即ちアミノ酸1600−1689）が喪失される
から、660アミノ酸しか含んでいない。このことは、こ
の出願において記載される全てのED領域に亘るCBDポリ
ペプチドについて真実である（なお、当該技術分野にお
いてED−Ｂ領域として知られる領域は、Baralleの配列
および出願人のDNAの両者において喪失されている）。
31kD,20kD,18.5kD,12kDおよび33kDとして表現される
ポリペプチドの定義は、還元条件下でのSDSポリアクリ
ルアミドゲル上において、分子量既知のマーカとの比較
により決定されたその概略分子量に基づいた操作上の定
義である。
図 1:この図は、種々のフィブロネクチンドメインおよ
び組換ポリペプチドの構成を模式的に示す図である。
図 2:この図は、ヒト・フィブロネクチンcDNAのヌクレ
オチド配列を示している。
図 3:7対の化学的に合成されたオリゴマーが製造され
た。これらの合成オリゴマーは、ヒト・フィブロネクチ
ン（FN）の最初の153のＮ末端アミノ酸をコードする。
この図は、これら７対の合成オリゴマーの配列を示して
いる。
図 4:ヒト・FNのＮ末端ドメインのアミノ酸１−153を
コードするDNAフラグメントが、図３に示す７対の化学
的に合成されたオリゴマーから次ぎのようにして組み立
てられた： オリゴマー3/4,5/6,7/8,9/10の夫々の対を別々のチュ
ーブ内でアニールし、次いでT4ポリヌクレオチドキナー
ゼ酵素を用いて５′末端をリン酸化した。
第二段階において、T4DNAリガーゼを用い、3/4対およ
び5/6対を相互にライゲートした。同様にして、反応対7
/8,9/10を相互いにライゲートした。夫々のライゲーシ
ョンの後、ライゲーション混合物の一部をゲル上で分析
して、新たに形成されたフラグメントの寸法およびライ
ゲーションの効率を決定した。
第三段階において、上記二つのライゲーション混合物
を一緒に混合し、また別のチューブ内で予めアニールし
且つリン酸化しておいたオリゴマー対６、即ちオリゴマ
ー11/12を加えた。アガロースゲルを用いて、上記ライ
ゲーション混合物から326塩基対のDNAフラブメントが単
離され、精製された。
この精製された326塩基対の合成フラグメントに対し
て、更に二つの合成リンカー対が添加された：即ち、対
１のオリゴマー1/2と、対７のオリゴマー13/14である。
対１はオリゴマー２だけがを５′末端でリン酸化され、
対７はオリゴマー13のみが５′末端でリン酸化された。
T4DNAリガーゼでライゲーションした後、その混合物
を更に単離することなく、EcoR I及びBamH Iエンドヌク
レアーゼで消化されたpBR322ベクターDNAに添加した。
得られたプラスミドはpFN932−18と命名された。該プ
ラスミドは、pBR322ベクター中に、ヒトFNのＮ末端153
アミノ酸をコードする合成されたEcoR I（５′末端）−
BamH I（３′末端）制限フラグメントを含んでいる。
図 5:FNのＮ末端153アミノ酸配列の発現 プラスミドpFN932−18をNde I−BamH Iエンドヌクレ
アーゼで消化した。FN（最初の153アミノ酸＋追加のＮ
末端メチオニン）をコードする該Nde I−BamH IのDNAフ
ラグメントは単離され、プラスミドpTV301をNde I及びB
gl IIエンドヌクレアーゼで消化することによって得ら
れた大きい方のフラグメント中にライゲートされた（プ
ラスミドpTV301は、λPLプロモータ及びc IIRBSの制御
下でヒト成長ホルモンhGHを発現する）。
得られたプラスミドはpFN949−２と命名された。
図 6:FNのＮ末端ドメインの３′末端（アミノ酸262）
における停止コドンTAAの挿入 TAA停止コドンを含み、且つ下記の配列を有するBgl I
I部位を含んだ合成オリゴヌクレオチドが、 EcoR IおよびPvu IIで消化したcDNAプラスミドp931−５
（図６参照）から単離したEcoR I−Pvu II・FNフラグメ
ントの３′末端（Pvu II部位）にライゲートされた。こ
のライゲーションは、EcoR IおよびBamH Iで消化された
DNAベクタープラスミドpBR322（大きい方のフラグメン
ト）の存在下で行われた。得られたプラスミドは、pFN9
35−12と命名された。
図 7:ラットにおけるフィブロネクチン（FN）およびr3
1kD FBDの薬力学的比較 125I−FN（0.1mg/kg;5×106cpm）または125I−r31FBD
（0.1mg/kg;5×106cpm）が静脈内に注射され、その時に
指示された血液サンプルが抜き取られた。トリクロロ酢
酸沈殿法によって、血液中の不溶性放射能が測定され
た；時間ゼロにおける100％値は、FNについては40,000c
pm/ml、FBDについては46,000cpm/mlを表わす。
図 8:カテーテルへのS.aureusの結合 方法において説明するようにして、3.0×106PFU/mlの
125I−S.aureus（1 CPM/3 PFU）の、FNでコートされた
「Uno」プラスチック気管支カテーテル（２回の夫々の
反応について3cm）への結合が行われた。拮抗反応が予
形成されたとき、バクテリア及び添加されたタンパク
は、方法のセクションで説明するように、室温で30分間
プレインキュベートされ、次いでカテーテルに添加され
て更にインキュベーションされた。
拮抗反応で用いたポリペプチドは、Ｐ−31（p31k
D）、ｒ−20（組換20kD FBDポリペプチドフラグメン
ト）およびｒ−31（再酸化され再折畳みされたr31kD）
であった。幾つかの反応（図参照）は、５μＭヘパリン
（ブタの腸粘膜から採取、分子量−10,000;シグマ社）
の存在下で測定された。拮抗物（インプット・バクテリ
アの8.8％）の不存在下における「対照」反応の結合が1
00％に正規化された。
図 9:完全な長さのフィブロネクチンと比較された、フ
ィブロネクチン・ドメインの組換ポリペプチド この図は、種々の組換ポリペプチドをコードするcDNA
クローン相互間での相対的な配置、並びにフィブロネク
チンcDNAの完全な長さの配列およびヒト・フィブロネク
チン分子に存在する種々のドメインの図式的表現に対す
るこれらクローンの相対的な配置を示している。、 図10:r12kD FABポリペプチドを発現するプラスミドpFN1
96−２の構築 BspM I及びHind IIIでプラスミドpFN975−25（図10）
を消化して得たラージBspM I−Hind IIIフラグメント
を、T4DNAリガーゼによって、合成リンカーＡ（図15参
照）の対にライゲートした。プラスミドpFN196−２が製
造され、Escherichia coli株A1645中に形質転換され、E
scherichia coli株A4255中に再形質転換された。プラス
ミドpFN196−２は、フィブロネクチンcDNAのヌクレオチ
ド14からヌクレオチド340までの５′末端配列を含み、
これはアルギニンで終端するフィブロネクチンのRBDの
最初の109アミノ酸をコードする。最終的なポリペプチ
ドには、追加のＮ末端メチオニンが存在する。プラスミ
ドpFN196−２は、λプロモータ及びβ−ラクタマーゼ・
リボゾーム結合部位の制御下において、r12kD FBDポリ
ペプチドの良好な発現を与える。このプラスミドは、受
付番号68328でATCCに寄託されている。
図11:修飾された12kD FBDポリペプチド（12kD′）を発
現するプラスミドpFN197−10の構築 プラスミドpFN975−25が、異なったリンカー対Ｂ（図
15参照）を用いたことを除き、図10で説明したようにし
て処理された。このライゲーションによって、FNのFBD
のＮ末端配列をコードするプラスミドpFN197−10が製造
された。しかし、停止コドンの前にDde I部位を生じさ
せるようなヌクレオチド340の後の修飾により、最初の1
09アミノ酸がr12kDポリペプチドに対応し、且つこれに
追加のアミノ酸残基であるヒスチジン及びメチオニンが
続いている111アミノ酸を含んだポリペプチドのコーデ
ィングがもたらされる。最終的なポリペプチドには、追
加のＮ末端メチオニン残基が存在する。プラスミドpFN1
97−10はEscherichia coli株A1645中に、次いでEscheri
chia coli株A4255中に形質転換されることにより、λプ
ロモータ及びβ−ラクタマーゼ・リボゾーム結合部位の
制御下において、修飾されたr12kD（12kD′）FBDポリペ
プチドの良好な発現を与えた。
図12:フィブロネクチンのr33kD細胞結合性ドメイン（CB
D）に融合されたr12kD′FBDを発現するプラスミドpFN20
2−５の構築 プラスミドpFN197−10をNde I及びHind IIIで消化し
た後に製造されたラージフラグメントが、T4 DNAリガー
ゼによって、プラスミドpFN137−２のNde I−Hind III
・CBD（細胞結合性ドメイン）フラグメントにライゲー
トされた。受付番号67910でATCCに寄託されたプラスミ
ドpFN137−２は、親出願である米国特許第345,952に記
載されている。r33kD CBD配列には、ED−Ａ領域（図面
の簡単な説明の項の序文参照）によってコードされる16
00−16891の番号が付された90個のアミノ酸を除き、329
−1722の番号が付されたフィブロネクチンのアミノ酸
（図２参照）が含まれている。
得られたプラスミドであるpFN202−５は、Escherichi
a coli株A1645中に、次いでEscherichia coli株A4255中
に形質転換された。プラスミドpFN202−５は、プラスミ
ドpFN197−10によってコードされる111アミノ酸のcDNA
と、これに続くセリン（r33kD CBDの最初のアミノ酸）
のためのコドンに一致したr33kD CBDのためのcDNA配列
を含んでいる。このプラスミドは、フィブロネクチンの
r12kDフィブリン結合性ドメイン及び33kD細胞結合性ド
メインを具備した、略45kDポリペプチドの良好な発現を
与えた。この融合ポリペプチドは、λプロモータ及びβ
−ラクタマーゼ・リボゾーム結合部位の制御下において
発現された。
図13:DGRGDS配列に融合されたr31kD FABを発現するプラ
スミドpFN195−４の構築 プラスミドpFN975−25をPvu II及びHind IIIで消化す
ることによって得られたラージフラグメントが単離さ
れ、T4 DNAリガーゼによって、合成リンカー対Ｃ（図15
参照）にライゲートされた。得られたプラスミドpFN195
−４と命名され、これはEscherichia coli株A1645中
に、次いでEscherichia coli株A4255中に形質転換され
た。プラスミドpFN195−４は、ヌクレオチド14からヌク
レオチド793の完全な長さのFBD・cDNA配列（260アミノ
酸をコードする）と、これに続くasp−gly−arg−gly−
asp−serをコードする配列とを含み、コードされるポリ
ペプチドは合計で260個のアミノ酸と、これに続く配列D
GRGDSとを有している。最終的なポリペプチドには追加
のＮ末端メチオニン残基が存在する。プラスミドpFN195
−４は、λプロモータ及びβ−ラクタマーゼ・リボゾー
ム結合部位の制御下において、配列asp−gly−arg−gly
−asp−ser（DGRGDS）に融合されたr31kDフィブリン結
合性ドメインの良好な発現体である。
図14:31kD FBD−33kd CBDポリペプチド融合ポリペプチ
ドを発現するプラスミドpFN194−２の構築 プラスミドpFN975−25をPvu II及びHind IIIで消化す
ることによって製造されたたラージPvu II−Hind IIIフ
ラグメントが単離され、T4 DNAリガーゼによって、合成
リンカー対Ｄ（図15参照）にライゲートされ、次いでプ
ラスミドpFN137−２（ATCC受付番号No.67910）をNde I
及びHind IIIで消化することにより得られた細胞結合性
ドメイン（CBD）フラグメントにライゲートされた。DBD
ドメインの定義については図12を参照のこと。得られた
プラスミドはpFN194−２と命名され、Escherichia coli
株A1645中に、次いでEscherichia coli株A4255中に形質
転換された。プラスミドpFN194−２は、λPLプロモータ
及びβ−ラクタマーゼ・リボゾーム結合部位の制御下に
おいて、分子量約64kDのr31kD FBD−r33kD CBD融合ポリ
ペプチドの低発現体である。このポリペプチドをコード
するプラスミドpFN194−２は、メチオニンコドンに融合
されたフィブロネクチンの最初の256アミノ酸をコード
するDNAと、これに続いて、CBDの位置１におけるアミノ
酸セリンのためのコドンで始まるフィブロネクチンのた
めのcDNA配列とを含む。
当業者は、プラスミドpFN194−２によって発現される
ポリペプチドの高発現を達成する方法を知っている。こ
のような高発現体の一例は、図25に記載されたプラスミ
ドpFN205−５である。
図15:プラスミド類の構築に用いられるオリゴヌクレオ
チドリンカー類 ４対の化学的に合成されたオリゴマー（A,B,C及び
Ｄ）が製造され、図10,11,13及び14に夫々記載したよう
にして、プラスミドの構築に用いられた。
図16:ステンレス鋼コイルで誘導された静脈血栓による
ラベルされたr31kD FBDの取込み バー及び垂直なブラケットは、125I−31kD FBDを投与
した24時間後における、単離された血栓（Ｔ）、血栓を
保持する静脈切片（in−situ血栓）または抹消血液サン
プルに関連した特異的放射能の平均±SEM（Ｎ＝10）を
表わしている。詳細は例7,セクションＡを参照のこと。
図17:ラット静脈血栓モデルにおける、ラベルされたr12
kD,r20kD及びr31kD FBDポリペプチドの比較 バー及び垂直なブラケットは、図に示すように、125I
でラベルされた組換ポリペプチドを投与した24時間後に
おける、単離された血栓（Ｔ）または血液に関連した特
異的放射能の平均±SEM（Ｎ＝10）を表わしている。詳
細は例7,セクションＢを参照のこと。
図18:ラットにおける、125I−ラベルされたr31kD FBDの
代謝的安定性 図７で説明したのと同様の実験において、125I−r31k
D FBD（５×106cpm/rat）をラットに静脈注射した。図
に示した時間間隔で血液サンプルを採取し、クエン酸ナ
トリウムを含有するチューブ内に入れ（最終クエン酸ナ
トリウム濃度＝0.38％）、得られた血液の一部に次の何
れかの処理を施した：（ａ）20％TCAで処理し、TCA不溶
性のカウント（TCA沈殿の後）を測定した；または
（ｂ）予形成された血餅（対照ラットから得た20μｌの
全血を用いた）と共にインキュベートし、二段階反応II
（例６）の条件下において、125I−r31kD FBDの予形成
された血餅に対する結合を測定した。放射活性はガンマ
カウンタで測定し、夫々のサンプルの活性は、反応混合
物中に存在する全cpmのパーセンテージとして計算し
た。（正常なTCA沈殿法には、全cpmがカウントされるフ
ィルター上にサンプルを置くことと、該フィルターを20
％TCAで３回洗浄し、続いて20％エタノールで２回洗浄
してTCAを抽出することと、TCA不溶性カウントについて
フィルターを再カウントし、これによりTCA不溶性カウ
ントのパーセンテージの計算を可能とすることとが含ま
れる。） 図19:フィブリン結合性ドメインポリペプチドのフィブ
リン血餅への結合 この実験は、二段階反応II（例６）について説明した
のと実質的に同様にして行った。下記に示す0.15μＭ−
125Iの一つのフィブリン結合性ドメインポリペプチド
を、37℃において、20μｌのクエン酸化全血から誘導し
た予形成されたフィブリン血餅と共にインキュベートし
た。この結合は、5mMのCaCl2及び0.02単位/mlのトラン
スグルタミナーゼの存在下で測定された。45分間のイン
キュベーションの後、この反応は遠心分離によって停止
され、ペレットをPBSで３回洗浄し、放射活性をガンマ
カウンタで測定した。
1.血漿性の31kD FBD（p31kD） 2.r12kD 3.r20kD 4.r31kD（バッチＡ） 5.r31kD（バッチＢ） 6.r31kD（バッチＣ） 図20:125I−r12kDの新鮮なフィブリン血餅および凍結さ
れたフィブリン血餅に対する結合の比較 この実験は、二段階反応II（例６）について説明した
のと実質的に同様にして行った。20μｌのクエン酸化ヒ
ト全血から誘導した予形成されたフィブリン血餅が、−
71℃で７日凍結され（凍結血餅）またはその形成後直ち
に（新鮮血餅）使用された。
これらのフィブリン血餅は、0.02単位/mlのモルモッ
ト肝臓トランスグルタミナーゼ（シグマ社）の存在下ま
たは非存在下において、0.15μM 125I−r12kDと共にイ
ンキュベートされた。フィブリン血餅への結合は、例６
に記載したようにして測定された。
図21:スペロース12カラム（FPLCに付設されたもの）か
らの溶出プロファイルによりモニターされたr20kDポリ
ペプチドの再折畳みおよび精製 再折畳みおよび精製プロセスの種々の段階における20
0μｌのr20kDポリペプチド部分を、スペロース12カラム
（superose 12 column）上に注入した。該カラムは、15
0mM NaCl/20mM Tris HCl,pH 7.8を用い、0.8ml/minの速
度で平衡化され、溶出された。FPLCコントローラLCC−5
00から、低トレースが得られた。A.6Mグアニジン−HCl
中に溶解され、50mMのβ−メルカプトエタノールで還元
されたr20kDポリペプチドのペレット;B.再折畳みされ且
つ空気再酸化されたr20kDポリペプチド;C.Q−セファロ
ース結合ポリペプチド、即ち、精製されたr20kDから分
離された物質;D.Q−セファロースカラムからの流出物;
E.ヘパリン−セファロースカラムからの流出物、即ち、
精製されたr20kDから分離された物質;F.0.5M NaClでヘ
パリン−セファロースカラムから溶出された、精製され
たr20kDポリペプチド（保持時間＝18.16分）。なお、こ
の18.16分の保持時間においては、プロファイルＡ（当
該物質は還元形である）ではピークが存在せず、またプ
ロファイルＣ及びＥ（不正確に折畳まれた形のr20kDポ
リペプチドを含む）においてもピークは存在しない。
図22:スペロース12カラム（ウオーターFPLCシステムに
付設されたもの）からの溶出プロファイルによりモニタ
ーされたr12kDポリペプチドの再折畳みおよび精製 再折畳みおよび精製プロセスの種々の段階における25
−100μｌのr12kDポリペプチド部分を、スペロース12カ
ラム（Waters HPLC systemに付設されたもの）上に注入
した。該カラムは、150mM NaCl/20mM Tris HCl,pH 7,8
を用いて、0.8ml/minの速度で平衡化され、溶出され
た。A.6Mグアニジン−HCl中に溶解され、50mMのβ−メ
ルカプトエタノールで還元されたr12kDポリペプチドの
ペレット;B.再折畳みされ且つ空気再酸化されたr12kDポ
リペプチド;C.Q−セファロース結合ポリペプチド、即
ち、精製されたr12kDから分離された物質;D.Q−及びヘ
パリン−セファロースカラムからの流出物（この場合、
これらカラムは直列に接続され、Ｑ−セファロースカラ
ムからの流出物は自動的にパリン−セファロースカラム
にかけられる）、即ち、精製されたr12kDから分離され
た物質;E.0.5M NaClでヘパリン−セファロースカラムか
ら溶出された、精製されたr12kDポリペプチド（保持時
間＝18.83分）。なお、この18.83分の保持時間において
は、プロファイルＡ（当該物質は還元形である）ではピ
ークが存在せず、またプロファイルＣ及びＤ（不正確に
折畳まれた形のr12kDポリペプチドを含む）においても
ピークは存在しない。
図23:プラスミドpFN208−13の構築 プラスミドpFN975−25（ATCC No.67832）の二つのア
リコートが、Xmn IおよびXba I−Sty Iで夫々別々に消
化された。夫々の消化物からラージフラグメントを単離
し、これらを一緒にして、図８に示す合成オリゴマーと
混合した。次に、該混合物を2.5分間煮沸し、60分かけ
て徐々に30℃に冷却し、続いて60分で４℃に、最後に30
分で０℃に冷却した。こうして再アニールされたDNA
は、次いでクレノウフラグメントで満たされ、T4 DNAリ
ガーゼによってライゲートされた。該DNAはE.Coli A164
5中に形質転換され、形質転換体を前記オリゴマー陽性
のクローンについてスクリーニングした。陽性クローか
ら得られたプラスミドはpFN208−13と命名され、宿主の
E.Coli A4255中に導入された形で、受付番号68456でATC
Cに寄託された。このプラスミドは、λPLプロモータ及
びβ−ラクタマーゼ・リボゾーム結合部位の制御下にお
いて、分子のアミノ末端の18.5kD FBDポリペプチドを発
現する。
図24:プラスミドpFN208−13の構築に用いられる合成リ
ンカー この図は、プラスミドpFN208−13（図23）の構築に用
いられる合成オリゴマーを示している。
図25:プラスミドpFN205−５の構築 プラスミドpFN194−２（図14）のXba I−Hind IIIに
よる消化物からスモールフラグメントが単離された。プ
ラスミドpFN962−３（同時譲渡された特許出願PCT/US89
/05875および1990年７月12に発行された国際公開w0/90/
07577の図45−49、並びにこれらの図の説明に開示され
ている）のNde I−Hind III消化物から、スモールフラ
グメントが単離された。これら二つのフラグメントは、
次いで、プラスミドpMLK−100（ATCC受付番号68605）の
Nde I−Hind III消化物から単離されたラージフラグメ
ントとライゲートされた。pFN205−５と命名されたここ
で得られたプラスミドは、構造遺伝子の直ぐ下流にある
「ter」と称されるtrp転写ターミネータを含んでおり、
λPLプロモータ、C IIリボゾーム結合部位の制御下で、
33kD CBDに融合された31kD FBDを含む64kDポリペプチド
の高発現体である。このポリペプチドは、上記で引用し
たPCT公報に開示された31kD FBDポリペプチドについて
記載されているのと同様にして、精製および再折畳みさ
れた。
図26:プラスミドpFN201−３の構築 プラスミドpFN949−２（ATCC受付番号67831）のHind
III−Sty I消化物からラージフラグメントが単離され、
これはプラスミドpFN196−２（ATCC受付番号68328）のH
ind III−Sty I消化物から単離されたスモールフラグメ
ントとライゲートされた。pFN201−３と命名されたこの
得られたプラスミドは、λPLプロモータ及びC IIリボゾ
ーム結合部位の制御下において、12kD FBDポリペプチド
を発現する。
図27:プラスミドpFN203−２の構築 プラスミドpMLK100（E.Coli4300中において、ATCC受
付番号68605で寄託された）のNde I−Hind III消化物か
らラージフラグメントが単離され、該フラブメントはプ
ラスミドpFN201−３のNde I−Hind III消化物から単離
されたスモールフラグメントとライゲートされた。ここ
で得られたプラスミドはpFN203−２と命名され、λPLプ
ロモータ、C IIリボゾーム結合部位および「ter」と称
されるtrp転写停止配列の制御下において、12kD FBDポ
リペプチドを発現する。このプラスミドは、E.Coli A42
55中に導入された形で、ATCC受付番号68606で寄託され
た。プラスミドpFN203−２は又、pFN203−２−３として
も知られている。
図28:FBDポリペプチドフラグメントの血管成分への結合 この図は、例９において説明される31kDとの比較にお
いて、内皮細胞、細胞外マトリックス及び結合されたフ
ィブロネクチンのような血管成分に対する12kDポリペプ
チドの低い結合性を示している。外因性トランスグルタ
ミナーゼの添加に伴って12kDの結合性は増大するが、そ
の場合でも、31kDに比較すると未だ低い値に止まる。
図29:S.aureusの内皮細胞（EC）への結合に対する種々
のFBDポリペプチドフラグメントの影響 ラベルされたS.aureusの調製および内皮細胞（EC）結
合試験が例９に記載される。S.aureusのECへの結合に対
する、血漿31kD、組換31kD、組換18.5kD及び組換12kDの
阻害効果がテストされた。
この図は、子ウシ血清（FCS）の存在下または非存在
下での、４℃におけるS.aureusの内皮細胞への結合に対
する異なったFBDポリペプチドの投与効果を示してい
る。（先の実験は、37℃及びFCSの存在下でのS.aureus
のECへの結合においては２−３倍の劇的な増大を示した
が、４℃では僅かな増大を示したに過ぎなかった。この
増大は、多分、FCS中における血漿フィブロネクチンの
存在によるものである。）４℃で行われた今回の実験に
おいては、FCS添加の結合に対する顕著な影響はなかっ
た。血漿31kD及び組換31kDは両者共に、強い投与量依存
性の結合阻害を示したが、組換18.5kD及び12kDポリペプ
チドは、実際上全く結合能力の阻害を生じず、これらが
S.aureus結合親和性をもたないか、或いは該結合親和性
が極めて僅かであることを示した。
図30:予形成されたフィブリン血餅に対する異なったFBD
ポリペプチドフラグメントの結合（反応II） この図は、例９に記載されるような予形成されたフィ
ブリン血餅に対する異なったFBDポリペプチドの特異性
を示している。試験されたFBDポリペプチドは31kD、20k
D、18.5kD及び12kDでった。加えて、33kD CBDに融合さ
れた12kD FBDフラグメントの45kD融合ポリペプチド（例
40）が試験された。対照として、33kD CBDポリペプチド
（同時譲渡されたPCT公開WO/90/07577第62−64頁）が含
められた。試験された全てのFBDポリペプチドは、45kD
融合ポリペプチドを含めて、同様の比率（25−38％結
合）で、予形成されたフィッブリン血餅に結合した。33
kD CBDだけは少ない比率で血餅に結合した。トランスグ
ルタミナーゼ阻害剤のヨードアセテート（IAC）は結合
を50−57％阻害し、トランスグルタミナーゼが結合反応
の活性成分であることを示した。33kD CBDポリペプチド
の結合は、ヨードアセテートによって認め得る程には影
響されず、異なったメカニズムによって結合することを
示した。
図31:12kD及び18.5kDのFBDポリペプチドフラグメントを
用いたin vivoでの血栓ラベリングが、例13に記載され
る。この図は、上記の結果を、111Inラベルされた組換F
BDタンパクを静脈内投与した24時間後での、ステンレス
鋼コイルを装着したラットにおける血栓（斜線を付した
バー）及び血液（白抜きのバー）の特異的放射活性とし
て示している。これらのバーおよび垂直ブラケットは、
cpm/gウエット重量の平均およびSEMを表わしている。血
栓：血液の比は図32に示される。
図32:図31に記載したラット・コイルモデルにおいて、
111Inラベルされた12kD−、18.5kD−および31kD−FBDを
投与した24時間後における、特異的放射活性の血液に対
する血栓の比。
図33:SKまたはFBD−SK複合体の何れかを活性化剤に用い
た、pH7.4および37℃における、ヒト・Glu−プラスミノ
ーゲン活性化速度論のLineweaver−Burkeプロット。96
ウエルのプレート内の200μｌ容量において、プラスミ
ノーゲン基質濃度は0.9×10-6及び2.7×10-6Mの間で変
化した。Ｓ−2251基質（Ｈ−Ｄ−Val−Leu−Lys−pNA）
の最終濃度は５×10-4Mであり、活性化剤の最終濃度は
２×10-9Mであった。反応速度ｖは、時間Δｔ（分）当
たりの405nmにおける吸光度の変化ΔＡ（吸光度単位）
を表わす。
図34:全てpH7.4のイミダゾール緩衝生理食塩水中に溶解
された5mlのフィブリノーゲン（2mg/ml）、5mlのノーブ
ル寒天（0.4％）、0.5mlのCaCl2（1M）および0.5mlのト
ロンビン（10u/ml）を混合することにより、フィブリン
−寒天プレートが調製された。重合させた後、パスツー
ルピペット及びバキュームを用いて小さなウエルを形成
し、その中に、102−104ng/mlの濃度でSKまたはFBD−SK
複合体を添加した。37℃で一晩インキュベーションした
後、溶解ゾーンを測定した。
図35:モルモット・トランスグルタミナーゼに触媒され
た、［14C］プトレシンのFBDまたはFBD−SK複合体中へ
の取り込み 試験は６μＭのFBD、SKまたはFBD−SK複合体、0.05u/
mlのトランスグルタミナーゼ、６μＭの［14C］プトレ
シン（putrescine）、６μＭのコールド・プトレシン、
50mMのTris HCl pH7.5及び10mMのCaCl2を用いて、室温
で30分まで行われた。20mMのEDTA（点線）または5mMのD
TT（鎖線）での対照群も含められた。（Δ）SK、 （□）FBD−SK複合体。
〔発明の詳細な説明〕
プラスミドpFN975−25、pFN949−２、pFN137−２及び
pFN196−２は、特許手続きのための微生物の寄託の国際
的承認に関するブダペスト条約の規定に従い、これを満
たすために、アメリカ合衆国20852メリーランド州ロッ
クウイル12301パークローンドライブに所在するアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）に対
して、受付番号67832,67831,67910及び68328夫々寄託さ
れた。同様に、本出願において言及される他の多くのAT
CC寄託もまた、ブダペスト条約の規定に従い、これを満
たすために寄託された。
ヒトフィブロネクチンの主要な配列は、三つのタイプ
の相同性リピート、即ちタイプＩ、IIおよびIIIに組織
されることが示されている。見掛けの分子量が31kDの25
4アミノ酸を具備したフィブリン結合性ドメイン（FBD）
は、夫々が二つのジスルフィド結合をもった約45アミノ
酸長である五つのタイプＩリピート（「フィンガー」）
から成っており、また該タンパクのＮ末端およびＣ末端
において、夫々約20アミノ酸の二つの伸展部分に結合し
ている。
図１は、フィブロネクチンの該ドメイン及び構築され
た組換分子における全体構造の模式図を示している。
ここで権利請求される組換えフィブリン結合性ドメイ
ン（FBD）ポリペプチドは、フィブリン結合性ドメイン
のポリペプチドフラグメント（r20kD,r18.5kD,及びr12k
D）を具備している。これらポリペプチドは30kDポリペ
プチドよりも小さく、フィブリン結合性ドメインの配列
の一部を構成する。フィブリン結合性ドメインの他の多
くのポリペプチドが、この出願に記載したプラスミドか
ら、当該技術分野で公知の方法を用いて構築された追加
のプラスミドによって発現され得、またこれらポリペプ
チドはこの出願に記載した方法を用いて再折畳みされ、
再酸化され、精製され得る。
この出願に記載される完全な長さの組換フィブリン結
合性ドメイン（r31kDポリペプチド）は、フィブロネク
チンの最初の262アミノ酸を具備すると共に、そのカル
ボキシ末端にはarg−ala−ala−val配列を有している。
FBDの最終的なポリペプチド及びポリペプチドフラグメ
ントの全のアミノ末端には、追加のメチオニン残基が存
在する。血漿フィブロネクチンのトリプシン消化によっ
て誘導された血漿フィブリン結合性ドメインは、フィブ
ロネクチンの最初の259アミノ酸を具備し、カルボキシ
末端にはアルギニンを有し、コードされた第一のアミノ
酸であるグルタミンがピログルタメート残基に転化され
ている。
r31kDポリペプチドは、上述した五つのタイプＩ相同
性ループまたはフィンガー（即ち、10のスルフィド結
合）を有し、r20kDポリペプチド及びr18.5kDポリペプチ
ドは両者とも三つのループ（即ち、６スルフィド結合）
を有し、r12kDポリペプチドは二つのループ（即ち、４
ジスルフィド結合）を有している。これらジスルフィド
結合の存在は、正しいジスルフィド結合をもった正確に
折畳まれたFBDポリペプチドを得てこれを精製するため
に、再折畳み／再酸化の操作を開発することの必要性お
よび困難性を示している。正しく折畳まれたFBDポリペ
プチド類は生物学的に活性である。即ち、これらはフィ
ブリンに結合することができる。加えて、r31kDポリペ
プチドはStaphylococcus aureusに結合することができ
る。
組換FBDポリペプチドは、細胞ケーキを粉砕した後に
製造されるペレット中に得られた包接体中に製造され
る。
本発明は、血栓の画像化および血栓形成の防止に用い
るための、フィブロネクチン・フィブリン結合性ドメイ
ン（FBD）の組換ポリペプチドフラグメントの製造を開
示する。こいれらのポリペプチドはまた、血栓溶解剤を
血栓にターゲットさせるために該血栓溶解剤に結合され
得る。
FBDのポリペプチドフラグメントを産生する組換細胞
は、組換DNA技術によってFBDポリペプチドフラグメント
をコードするDNA配列が導入された何れの細胞でもよ
い。この細胞は、該DNA配列を発現することができ、ま
た該ポリペプチド生成物を産生できるものでなければな
らない。該細胞は哺乳動物細胞、酵母細胞のような菌細
胞またはバクテリア細胞であり得る。
バクテリア細胞は、栄養要求株、原栄養価部および溶
菌株、F+およびF-株、λファージのcI875リプレッサー
配列を内包する株、並びにdeoリプレッサー又はdeo遺伝
子を欠失した株を含む何れの株であってもよい。
野生型Escherichia coli株の例としては、ATCC番号12
435の原栄養株および栄養要求株MC1061（ATCC受付番号6
7361）がある。
λcI875リプレッサー配列を内包したEscherichia col
i株の例は、プラスミドpTVR279−８を内包する栄養要求
株A1645（ATCC番号53216）、プラスミドpTV104（２）を
内包する栄養要求株A1637（ATCC番号39384）、プラスミ
ドpSODα２を内包する栄養要求株A2097（ATCC番号3978
6）、プラスミドpFN975−25を内包する原栄養株A4255
（ATCC番号67832）、及びプラスミドpHG44を内包するビ
オチン独立性A4346（ATCC番号53218）である。
溶菌性Escherichia coli株の例は、プラスミドpHG44
を内包するA4048（ATCC番号53217）である。
F-株の例は、ATCC番号67703で寄託されたプラスミドp
MF5534を内包するEscherichia coli Aφ930（F-）、ATC
C番号67705で寄託されたプラスミドpMFS929を内包するE
scherichia coli W31100（F-）である。
deo遺伝子又はdeoリプレッサーを欠失したEscherichi
a coli株の例は、プラスミドpMF2005を内包するＳφ732
（ATCC番号67362）、プラスミドpJBF5401を内包するＳ
φ540（ATCC番号67359）、及びプラスミドpEFF920を内
包するＳφ930（ATCC番号67706）である（1989年２月22
日に発行されたヨーロッパ特許出願公報0303972を参照
のこと）。
本発明のプラスミドは適切なバクテリアホスト細胞、
好ましくはEscherichia coli内に導入され得る。このよ
うな適切なEscherichia coli細胞の一例はA4255（F+）
株［ATCC受付番号67832］であるが、他のEscherichia c
oli株および他のバクテリアもまた前記プラスミドのた
めのホスト細胞として用いることができる。このような
バクテリアには、Pseudomonas aeruginosa及びBacillus
aubtilisが含まれる。
上記全てのEscherichia coliホスト株は、当該技術分
野で周知の方法、例えば臭化エチジウム法（P.P.Novic
k,Bacterol,Rev,33;210（1969））によって、その内包
しているプラスミドを取り出され得る。
バクテリア細胞は、プラスミドのようなベクターDNA
分子中に、FBDポリペプチドをコードするFBD配列を含み
得る。ベクターまたはプラスミドは、該分子の適切な位
置にFBDポリペプチドをコードする配列が取り込まれる
ように、組換DNA技術によって構築される。
FBDポリペプチドの製造に用いられるプラスミドは、
λプロモータまたはdeoプロモータのような種々のプロ
モータを内包し得る。
FBDポリペプチドの製造に用いられ得るプラスミドに
は、次のものが含まれる。
ａ）プラスミドpFN975−25:これはr31kD FBDを発現する
ものであり、またEscherichia coli株A4255中に導入さ
れた形で、受付番号67832の下にATCCに寄託されてい
る。
ｂ）プラスミドpFN949−2:これはr20kD FBDを発現する
ものであり、またEscherichia coli株A4255中に導入さ
れた形で、受付番号67831の下のATCCに寄託されてい
る。
ｃ）プラスミドpFN196−2:これはr12kD FBDを発現し、
またEscherichia coli株A4255中に導入された形で、受
付番号68328の下にATCCに寄託されている。
ｄ）プラスミドpFN197−10:これは修飾されたr12kD FBD
ポリペプチドを発現するもので、この出願の図11に記載
されている。
ｅ）プラスミドpFN195−4:これは配列DGRGDSに融合され
たr31kDポリペプチドを発現するものであり、この出願
の図13に記載されている。
ｆ）プラスミドpFN201−3:これはλPLおよびC II rbsの
制御化において12kD FBDポリペプチドフラグメントを発
現するものであり、この出願の図26に記載されている。
ｇ）プラスミドpFN203−2:これはλPLおよびC II rbsの
制御化において12kD FBDポリペプチドフラグメントを発
現し、加えて「ter」と称する転写ターミネータを含む
ものであり、この出願の図27に記載されている。また、
Escherichia coli株A4255中に導入された形で、受付番
号68606の下にATCCに寄託されている。
ｈ）プラスミドpFN205−5:これはフィブロネクチン・細
胞結合性ドメイン（CBD）の33kDフラグメントに融合さ
れた31kDの完全な長さのFBDポリペプチドを具備した64k
Dのポリペプチドを発現するものであり、この出願の図2
5に記載されている。
ｉ）プラスミドpFN208−13:これは本出願の図23に記載
されている18.5kD FBDポリペプチドフラグメントを発現
するものであり、またEscherichia coli株A4255中に導
入された形で、受付番号68456の下にATCCに寄託されて
いる。
ｊ）上記プラスミドから誘導され、且つ上記プラスミド
のFBDコードィング配列を含む何れかのプラスミド。
ｋ）上記プラスミドのFBDコードィング配列を含む何れ
かのプラスミド。
本発明は、画像化可能なマーカでラベルされたポリペ
プチドを含有する画像化剤であって、該ポリペプチドは
天然に存在するヒト・フィブロネクチンのフィブリン結
合性ドメインに実質的に存在するアミノ酸配列を有し、
フィブリンに結合することができる画像化剤を提供す
る。また、画像化に有効な量の上記画像化剤および生理
学的に許容可能な担体を含有する組成物が提供される。
画像化可能なマーカでラベルされるポリペプチドは、
ヒト・フィブロネクチンにおけるフィブリン結合性ドメ
インのペプチドフラグメントであり得る；これらは組換
DNA技術を用いて製造され得る；またはDNA合成器で合成
された遺伝子によってコードされる。出願人はこのよう
なポリペプチドの三つの例を提供しており、その好まし
い例は、18.5kDおよび12kDのポリペプチドである。当業
者によって理解されるように、「天然に存在するヒト・
フィブロネクチンのフィブリン結合性ドメインに実質的
に存在するアミノ酸配列を有する」とは、天然に存在す
る対立遺伝子変異体および部位指向性突然変異のような
組換変異体を包含する。出願人の「ポリペプチド」はこ
れら全てを包含するものであり、唯一の制限は、フィブ
リンに対する結合能力である。
使用する画像化可能なマーカは、当業者の選択事項で
ある。該マーカは放射性アイソトープ、Ｘ線を透過しな
い元素、または強磁性体イオンであるのが好ましい。放
射性アイソトープは医薬において通常用いられるもので
あり、当業者には周知である。現在のところ、該マーカ
はインジウム−111、テクネチウム−99m、ヨウ素−12
3、ヨウ素−125、ヨウ素−131、クリプトン−81m、キセ
ノン−133若しくはガリウム−67、またはこれらの混合
物であるのが好ましい。最も好ましくは、該マーカはテ
クネチウム−99mまたはヨウ素−111である。
また、検出可能なマーカは強磁性体イオンであっても
よい。強磁性体イオンもまた、医薬において通常用いら
れる。このようなマーカには、クロム（III）、マンガ
ン（II）、鉄（III）、鉄（II）、コバルト（II）、ニ
ッケル（II）、銅（II）、プラセオジム（III）、ネオ
ジム（III）、サマリウム（III）、ガドリニウム（II
I）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホ
ルミウム（III）、エルビウム（III）、イッテルビウム
（III）またはこれらの混合物が含まれる。
好ましくは、前記画像化剤は、ヒト・フィブロネクチ
ンのフィブリン結合性ドメインに存在するアミノ酸配列
に対応し、且つ図２に示したアミノ酸１−153のアミノ
酸配列を有する20kDポリペプチドを含有する；或いは、
ヒト・フィブロネクチンのフィブリン結合性ドメインに
存在するアミノ酸配列に対応し、且つ図２に示したアミ
ノ酸１−154のアミノ酸配列を有する18.5kDポリペプチ
ドを含有する；或いは、ヒト・フィブロネクチンのフィ
ブリン結合性ドメインに存在するアミノ酸配列に対応
し、且つ図２に示したアミノ酸１−109のアミノ酸配列
を有する12kDポリペプチドを含有する。部分的なアミノ
酸配列分析によって、我々は、12kDおよび20kDのポリペ
プチド、並びに31kDのポリペプチドが全て追加のＮ末端
メチオニンを含んでいることを示した。FBDの全てのポ
リペプチドフラグメントは同一のＮ末端アミノ酸配列を
有しているから、18.5kD、45kDおよび64kDのポリペプチ
ドもまた追加のＮ末端メチオニンを有していると思われ
る。しかし、ここに権利請求される発明は、追加のＮ末
端メチオニンをもたないポリペプチド類をも含むもので
ある。
本発明はまた、フィブリン含有物質、即ち、血栓また
はアテローム硬化性プラークを画像化するための方法で
あって、画像化すべきフィブリン含有物質と上記画像化
剤とを、該画像化剤が前記フィブリン含有物質に結合す
るような条件下で接触させることと、結合された画像化
剤を画像化することにより前記フィブリン含有物質を画
像化することととを具備した方法を提供する。
更に、下記の（ａ）〜（ｃ）のステップを具備した、
対象におけるフィブリン含有物質を画像化する方法が提
供される： （ａ）上記に開示した画像化剤組成物に含まれる画像化
剤が血流中に導入され、血管に存在するフィブリンに結
合される条件下において、対象に対して前記画像化剤組
成物を投与することと、 （ｂ）血管内の結合された前記画像化剤を画像化するこ
とと、 （ｃ）これによって、前記フィブリン含有物質を画像化
すること。
好ましくは、上記フィブリン含有物質の画像化方法に
用いられる前記画像化剤のポリペプチドは、ヒト・フィ
ブロネクチンのフィブリン結合性ドメインに存在するア
ミノ酸配列に対応し、且つ図２に示したアミノ酸１−15
3のアミノ酸配列を有する20kDポリペプチドである。こ
の20kDポリペプチドは約20未満の追加のアミノ酸を具備
する；或いは、ヒト・フィブロネクチンのフィブリン結
合性ドメインに存在するアミノ酸配列に対応し、且つ図
２に示したアミノ酸１−154のアミノ酸配列を有する18.
5kDポリペプチドである；或いは、ヒト・フィブロネク
チンのフィブリン結合性ドメインに存在するアミノ酸配
列に対応し、且つ図２に示したアミノ酸１−109のアミ
ノ酸配列を有する12kDポリペプチドである。
上記フィブリン含有物質を画像化する方法において用
いられる好ましいマーカは、放射性アイソトープ、Ｘ線
を透過しない元素、または強磁性体イオンである。最も
好ましいマーカーは、インジウム−111、テクネチウム
−99m、ヨウ素−123、ヨウ素−125、ヨウ素−131、クリ
プトン−81m、キセノン−133およびガリウム−67のよう
な放射性アイソトープである。
画像化は、当業者に公知の何れかの方法を用いて行な
い得る。これらの方法には、Ｘ線、CATスキャン、PETス
キャン、NMRIおよびフルオロスコピーが含まれるが、こ
れらに限定されるものではない。好ましくは、上記方法
によるフィブリン含有物質の画像化は、ガンマ線カメラ
を用いて行われる。
更に、天然に存在するヒト・フィブロネクチンのフィ
ブリン結合性ドメインに実質的に存在するアミノ酸配列
を有し、且つフィブリンに結合できるポリペプチドを発
現するためのプラスミドであって、該ポリペプチドをコ
ードするDNAと、該ポリペプチドを適切なホスト細胞中
で発現させるように前記ポリペプチドをコードするDNA
に対して相対的に位置付けられた、適切な調節要素をコ
ードするDNAとを具備するプラスミドが提供される。
出願人は、フィブロネクチンのフィブリン結合性ドメ
インにおけるポリペプチドフラグメントの三つの例を提
供した。これらには、r20kD、r18.5kD及びr12kDのポリ
ペプチドが含まれる。これらのポリペプチドは、天然に
存在するヒト・フィブロネクチンの各部分の性質である
結合特性および付着特性を示す。これら三つのFBDポリ
ピペプチドは好ましい態様を示す例に過ぎず、本出願の
権利請求の範囲はこれに限定されるものではない。
好ましい実施例において、当該ポリペプチドは、ヒト
・フィブロネクチンのフィブリン結合性ドメインに存在
するアミノ酸配列に対応した約20kDのポリペプチド；ヒ
ト・フィブロネクチンのフィブリン結合性ドメインに存
在するアミノ酸配列に対応した約18.5kDのポリペプチ
ド；またはヒト・フィブロネクチンのフィブリン結合性
ドメインに存在するアミノ酸配列に対応した約12kDのポ
リペプチドである。
より好ましい実施例におては、当該ポリペプチドは、
フィブリン結合性ドメインに存在するアミノ酸配列に対
応し、且つ図２に示したアミノ酸１−154のアミノ酸配
列を有する18.5kDポリペプチドである；或いは、ヒト・
フィブロネクチンのフィブリン結合性ドメインに存在す
るアミノ酸配列に対応し、且つ図２に示したアミノ酸１
−153のアミノ酸配列を有する20kDポリペプチドであ
る。この20kDポリペプチドは約20未満の追加のアミノ酸
を具備している；或いは、ヒト・フィブロネクチンのフ
ィブリン結合性ドメインに存在するアミノ酸配列に対応
し、且つ図２に示したアミノ酸１−109のアミノ酸配列
を有する12kDポリペプチドである。上記のように、これ
らポリペプチドは追加のＮ末端メチオニンを有し得る。
しかし、ここに権利請求される発明は、この追加のＮ末
端アミノ酸をもたないポリペプチドをも含むものであ
る。
天然に存在するヒト・フィブロネクチンとは、ヒトの
体内（血漿中）に存在するものである。
この出願を通して用いられるとき、実質的な部分と
は、少なくとも５分の１（1/5）である。天然に存在す
るヒト・フィブロネクチンにおけるフィブリン結合性ド
メインの生物学的活性を有するポリペプチドは、このよ
うな活性が試験または測定されるとき、天然に存在する
ヒト・フィブロネクチンにおけるフィブリン結合性ドメ
インの結合および付着特性と同様の特性を示す。
本発明において、種々の機能ドメインのアミノ酸配列
は、該ドメインをコードするcDNAの制限酵素を用いた開
裂によって決定され、フィブロネクチンのタンパク分解
消化によって得られるドメインのアミノ酸配列とは必ず
しも対応しない。
本発明のプラスミドは、更に、適切なホスト細胞内で
当該ポリペプチドを発現するように該ポリペプチドをコ
ードするDNAに対して相対的に位置付けられた、プロモ
ータ類およびオペーレータ類（例えばλPLOL）、リボゾ
ーム結合部位（例えばCII）並びにリプレッサ類のよう
な適切な調節要素を具備する。
適切な調節要素は、適切なバクテリアホスト細胞内で
当該ポリペプチドを発現するように、該ポリペプチドを
コードするDNAに対して相対的に位置付けられる。本発
明の好ましい実施例において、これら調節要素は、当該
ポリペプチドをコードするDNAの上流に近接して配置さ
れる。
更に、pFN949−２と命名され、Escherichia coli株A1
645中に導入された形でATCC受付番号67831の下に寄託さ
れたプラスミドが提供される。プラスミドpFN949−２
は、図２のアミノ酸１−153を具備し、且つ追加のＮ末
端メチオニン及び20未満の追加のアミノ酸を伴った、ヒ
ト・フィブロネクチンにおけるフィブリン結合性ドメイ
ンの20kDポリペプチドフラグメントをコードする。
また、pFN196−２と命名され、Escherichia coli株A4
255中に導入された形でATCC受付番号68328の下に寄託さ
れたプラスミドが提供される。プラスミドpFN196−２
は、アミノ酸１−109を具備した、ヒト・フィブロネク
チンにおけるフィブリン結合性ドメインの12kDポリペプ
チドフラグメントをコードする。
また、pFN208−13と命名され、Escherichia coli株A4
255中に導入された形でATCC受付番号68456の下に寄託さ
れたプラスミドが提供される。プラスミドpFN208−13
は、図２のアミノ酸１−154を具備し、且つ上記追加の
Ｎ末端メチオニンを有すると思われる、ヒト・フィブロ
ネクチンにおけるフィブリン結合ドメインの18.5kDポリ
ペプチドフラグメントをコードする。
また、pFN203−２と命名され、且つEscherichia coli
株A4255中に導入された形でATCC受付番号68606の下に寄
託されたプラスミドが提供される。プラスミドpFN203−
２は、図２のアミノ酸１−109を具備し、且つ追加のＮ
末端メチオニンを伴った、ヒト・フィブロネクチンにお
けるフィブリン結合性ドメインの12kDポリペプチドフラ
グメントを発現する。
また、pFN205−５と命名されたプラスミドであって、
64kDポリペプチド（これはフィブロネクチンCBDの33kD
フラグメントに融合した31kDの完全な長さのFBDポリペ
プチドを具備する）を発現するプラスミドが提供され
る。
上述したように、本発明のプラスミドによって製造さ
れる全てのポリペプチド類は、追加のＮ末端メチオニン
を含んでいると思われる。
好ましい実施例において、本発明はpFN975−25と命名
されたプラスミドを含むEscherichia coli細胞であっ
て、ATCC受付番号67832の下に寄託された細胞;pFN949−
２と命名されたプラスミドを含むEscherichia coli細胞
であって、ATCC受付番号67831の下に寄託された細胞;pF
N196−２と命名されたプラスミドを含むEscherichia co
li細胞であって、ATCC受付番号68328の下に寄託された
細胞;pFN203−２と命名されたプラスミドを含むEscheri
chia coli細胞であって、ATCC受付番号68606の下に寄託
された細胞；およびpFN208−13と命名されたEscherichi
a coli細胞であって、ATCC受付番号68456の下に寄託さ
れた細胞を提供する。
本発明は、天然に存在するヒト・フィブロネクチンの
フィブリン結合性ドメインに実質的に存在するアミノ酸
配列を有し、且つフィブリンに結合することができるポ
リペプチドの製造方法であって、該ポリペプチドをコー
ドするDNAを有するプラスミドを含んだ細胞を、このDNA
が該ポリペプチドの発現を指令するように処理すること
と、こうして発現された該ポリペプチドを前記細胞から
回収することとを具備した方法を提供する。
好ましくは、こうして製造されたポリペプチドは、フ
ィブリン結合性ドメインの18.5kD、20kDまたは12kDポリ
ペプチドフラグメントである。
更に、ヒト起源の他の物質を実質的に含まない精製さ
れたポリペプチドであって、天然に存在するヒト・フィ
ブロネクチンのフィブリン結合性ドメインに実質的に存
在するアミノ酸配列を有し、且つフィブリンに結合する
ことができるポリペプチドが提供される。
好ましくは、当該ポリペプチドは、ヒト・フィブロネ
クチンのフィブリン結合性ドメインに存在するアミノ酸
配列に対応し、且つ図２に示したアミノ酸１−153のア
ミノ酸配列を有する20kDポリペプチドである。この20kD
ポリペプチドは約20未満の追加のアミノ酸を具備してい
る；或いは、ヒト・フィブロネクチンのフィブリン結合
性ドメインに存在するアミノ酸配列に対応し、且つ図２
に示したアミノ酸１−154のアミノ酸配列を有する18.5k
Dポリペプチドである；或いは、ヒト・フィブロネクチ
ンのフィブリン結合性ドメインに存在するアミノ酸配列
に対応し、且つ図２に示すアミノ酸１−109のアミノ酸
配列を有する12kDポリペプチドである。上記のように、
これらポリペプチドは追加のＮ末端メチオニンを有し得
る。しかしながら、ここに権利請求される発明は、この
追加のＮ末端アミノ酸をもたないポリペプチドをも含む
ものである。
これらの短いFBDポリペプチドフラグメント、即ち、2
0kD、18.5kD及び12kDは、31kD FBDポリペプチドよりも
有利である。31kDに比較して、これらは再折畳みが容易
であり、バクテリア結合性ドメインが欠失しており、ま
た内皮細胞、細胞外マトリックス及びフィブロネクチン
のような他の血管成分に対する結合特異性が大幅に低下
している。他方、これらは31kDポリペプチドと同様のフ
ィブリン結合活性を保持している。
本発明は更に、第二のポリペプチドに融合された、ヒ
ト起源の他の物質を実質的に含まない精製された上記ポ
リペプチドであって、前記第二のポリペプチドが天然に
存在するヒト・フィブロネクチンの細胞結合性ドメイン
におけるアミノ酸配列の実質的一部分であるポリペプチ
ドを提供する。
好ましくは、この融合されたポリペプチドは45kDの融
合ポリペプチドであって、その場合に前記精製されたポ
リペプチドは12kDポリペプチドであり、また天然に存在
するヒト・フィブロネクチンの細胞結合性ドメインの実
質的部分を具備した前記第二のポリペプチドは33kDポリ
ペプチドである。融合されたポリペプチドは又、31kDの
精製されたポリペプチドと、アミノ酸配列DGRGDSを含む
第二のポリペプチドとを具備し得る。他の好ましい融合
されたポリペプチドは、64kDの融合ポリペプチドであっ
て、その場合に前記精製されたポリペプチドは31kDポリ
ペプチドであり、また天然に存在するヒト・フィブロネ
クチンの細胞結合性ドメインの実質的部分を具備した前
記第二のポリペプチドは33kDポリペプチドである。
本発明は又、上記45kDの融合ポリペプチドを発現する
ための、pFN202−５と命名されたプラスミド；上記31kD
/GRGDS融合ポリペプチドを発現するためのpFN195−４と
命名されたプラスミド；及びで上記64kDの融合ポリペプ
チドを発現するための、pFN194−２と命名されたプラス
ミドを提供する。
この出願において用いられるとき、「融合された」ま
たは「結合された」の用語は、共有結合的、非共有結合
的または共役して結合されたポリペプチドを包含する。
これらのポリペプチド類は、本発明の属する技術分野に
おいて用いられ且つ当業者に周知の、アミノ酸またはポ
リペプチド架橋リンカーを含む他の化学的部分を介して
結合され得る。
当該技術分野においては、放射性ラベリング（アイソ
トープ類の核薬剤用途）、放射能を透過しないラベリン
グ（例えばCATスキャン）および磁気共鳴画像化（MRI）
のような、血栓を検出するための多くの方法が知られて
いる。これら何れのラベリング方法も、血栓を検出する
ための本発明の方法において使用され得る。これら検出
方法の夫々において、ポリペプチドは血栓を検出するた
めの診断薬として用いられる。
また、天然に存在するヒト・フィブロネクチンのフィ
ブリン結合性ドメインに実質的に存在するアミノ酸配列
を有するが、天然に存在するヒト・フィブロネクチンの
ジスルフィド結合を欠失し、且つフィブリンに結合でき
るポリペプチドを再折畳みし、または再酸化する方法で
あって、該ポリペプチドをジスルフィドの存在下または
非存在下でチオール含有化合物と接触させ、該ポリペプ
チドを再折畳み及び再酸化することを具備した方法が提
供される。
好ましくは、該チオール含有化合物はグルタチオン、
チオレドキシン、β−メルカプトエタノール及びシステ
インからなる群から選択される。
好ましくは、該チオール含有化合物はβ−メルカプト
エタノールであり、また該ジスルフィドは空気の導入に
よってその場で生成される。
好ましくは、該ポリペプチドは18.5kDポリペプチド、
20kDポリペプチド、12kDポリペプチド及び45kDポリペプ
チドからなる群から選択される。33kD CBDに融合された
12kD FBDからなる45kDのキメラポリペプチドは、小さい
FBDポリペプチドと全く同じ方法を用いて、再折畳み及
び再酸化された。
再折畳み及び再酸化の方法は、更に、該ポリペプチド
を変性剤と接触させることを具備し得る。好ましい変性
剤は、グアニジン塩酸塩および尿素である。
好ましくは、該ポリペプチドは、例えば1,000μg/ml
未満のような低濃度である。
本発明はまた、天然に存在するヒト・フィブロネクチ
ンのフィブリン結合性ドメインに実質的に存在するアミ
ノ酸配列を有し、且つフィブリンに結合できる精製され
た生物学的に活性なポリペプチドを回収する方法であっ
て、下記の（ａ）〜（ｉ）を具備した方法を提供する： （ａ）バクテリア細胞内において、前記ポリペプチドを
コードするDNAを含んだプラスミドの発現により、前記
ポリペプチドのアミノ酸配列を有し、且つジスルフィド
結合を欠失した第一のポリペプチドを産生させること； （ｂ）前記細胞を破壊して、前記第一のポリペプチドを
含有する溶解産物（lysate）を製造すること； （ｃ）該溶解産物を遠心分離して、前記第一のポリペプ
チドを濃縮すること； （ｄ）こうして濃縮された第一のポリペプチドを分離す
ること； （ｅ）この濃縮され、分離された第一のポリペプチドを
可溶化すること； （ｆ）該可溶化された第一のポリペプチドの再折畳み及
び再酸化を行ない、生物学的に活性なポリペプチドを形
成すること； （ｇ）この再折畳み及び再酸化された生物学的に活性な
ポリペプチドを分離すること； （ｈ）精製された、再折畳み及び再酸化された生物学的
に活性なポリペプチドを回収すること； （ｉ）こうして回収された生物学的に活性なポリペプチ
ドを精製すること。
好ましくは、前記再折畳み及び再酸化は、ジスルフィ
ドの存在下または非存在下で、該ポリペプチドを再折畳
みし且つ再酸化するように、チオール含有化合物と接触
させることを具備する。好ましくは、該チオール含有化
合物はグルタチオン、チオレドキシン、β−メルカプト
エタノール及びシステインからなる群から選択される。
一つの好ましい実施例において、該チオール含有化合
物はβ−メルカプトエタノールであり、また該ジスルフ
ィドは空気の導入によってその場で生成される。
好ましくは、該ポリペプチドは18.5kDポリペプチド、
20kDポリペプチド、12kDポリペプチド及び45kDポリペプ
チドからなる群から選択される。上記のように、33kD C
BDに融合された12kD FBDからなる45kDのキメラポリペプ
チドは、小さいFBDポリペプチド類と全く同じ方法を用
いて、再折畳み及び再酸化された。
前記方法は、更に、該ポリペプチドをグアニジン塩酸
塩または尿素のような変性剤と接触させることを具備し
得る。
好ましくは、該ポリペプチドは、例えば1,000μg/ml
未満のような低濃度である。
好ましくは、前記ステップ（ｃ）における濃縮された
ポリペプチドの分離には、クロマトグラフィー、好まし
くはヘパリン−セファロース・クロマトグラフィーが含
まれる。
本発明は又、血栓が形成され易い対象における血栓形
成を阻害する方法であって、該対象に対し、血栓形成を
阻害するために有効な量のポリペプチド（上記で開示し
たポリペプチド及び融合ポリペプチドから選択される）
を投与することを具備した方法を提供する。該ポリペプ
チドは還元され、或いは（再酸化を防止するために、例
えばカルボキシメチル化またはカルボキサミドメチル化
によって）SH基がブロックされ得る。
本発明は又、血栓溶解剤をターゲッティングするため
に、血栓溶解剤に結合された上記ポリペプチドを提供す
る。この血栓溶解剤は、組織プラスミノーゲン活性化剤
（TPA）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、プロウ
ロキナーゼ、アニソイル化プラスミノーゲン−ストレプ
トキナーゼ活性化剤複合体（エミナーゼTM）、TPA類似
体またはプロテアーゼから選択され得る。
本発明の一つの実施例において、前記ポリペプチドは
天然に存在するヒト・フィブロネクチンのフィブリン結
合性ドメインに実質的に存在するアミノ酸配列を有し、
且つフィブリンに結合できるものであって、約6kDより
大きく且つ約20kDよりも小さい分子量を有し、該ポリペ
プチドのＮ末端にgln−ala−gln−gln若しくはmet−gln
−ala−gln−glnのアミノ酸配列を有する。また、この
場合に前記血栓溶解剤はストレプトキナーゼである。
好ましい実施例において、前記ポリペプチドは12kDポ
リペプチドであり、また前記血栓溶解剤はストレプトキ
ナーゼである。
更に、血栓の血栓溶解を達成するための方法であっ
て、対象に対して、血栓溶解を達成するために有効な量
の、血栓溶解剤に結合された前記ポリペプチドを投与す
ることを具備した方法が提供される。
本発明は又、創傷をもった対象を治療する方法であっ
て、該対象に対し、前記創傷を治療するために有効な量
の精製されたポリペプチドを投与することを具備した方
法が提供される。該精製されたポリペプチドは、ヒト起
源の他の物質を実質的に含有せず、天然に存在するヒト
・フィブロネクチンのフィブリン結合性ドメインに実質
的に存在するアミノ酸配列を有し、且つフィブリンに結
合することができる。この精製されたポリペプチドは、
天然に存在するヒト・フィブロネクチンの細胞結合性ド
メインの実質的部分を具備するポリペプチドと共に投与
される。この方法の一つの実施例において、前記細胞結
合性ドメイン・ポリペプチドは、40kDポリペプチド、ま
たは33kDポリペプチドである。
更に、創傷をもった対象を治療する方法であって、該
対象に対し、対象を治療するために有効な量の、精製さ
れたポリペプチドの融合ポリペプチドを投与することを
具備した方法が提供される。該精製されたポリペプチド
は、ヒト起源の他の物質を実質的に含有せず、天然に存
在するヒト・フィブロネクチンのフィブリン結合性ドメ
インに実質的に存在するアミノ酸配列を有し、且つフィ
ブリンに結合することができるものであり、天然に存在
するヒト・フィブロネクチンの細胞結合性ドメインのア
ミノ酸配列の実質的部分を具備した第二のポリペプチド
に融合されている。この方法の一つの実施例において、
前記融合ポリペプチドは45kDポリペプチドであり得る。
この場合、前記ポリペプチドは12kDポリペプチドであ
り、前記第二のポリペプチドは33kDポリペプチドであ
る。他の実施例において、前記融合ポリペプチドは64kD
の融合ポリペプチドであり得る。この場合、前記ポリペ
プチドは31kDポリペプチドであり、前記第二のポリペプ
チドは33kDポリペプチドである。
本発明の方法によって治療される創傷は、切開創傷、
皮膚欠損創傷、皮膚移植創傷、または火傷創傷のような
皮膚創傷であり得る。該創傷はまた、眼科創傷であって
もよい。その場合、眼科創傷は角膜上皮創傷または角膜
間質創傷（corneal stromal wound）である。更に、前
記創傷は腱損傷であり得る。
実施例 位置をマッピングするための全ての参照符号は、図２
に示すヒトフィブロネクチンcDNAのヌクレオチド配列
（1987年１月７日に公開されたBaralle,F.E.の欧州特許
公開第207,751号の図３も参照）に沿って数字をふられ
た位置に等しく対応する。
この特許出願は、Ｎ−末端フィブリン結合ドメイン
（FBD）のポリペプチド断片に関する。31kDポリペプチ
ドを用いた実験の結果をより短い断片との比較のために
示す。記述された蛋白質のいくつかは、そのＣ−末端で
細胞結合ドメイン（CBD）の断片のＮ−末端に結合したF
BD断片を含む融合蛋白質である。
出願人がクローニングを行い発現させたCBDに相当す
るcDNA配列は、バラレ（Baralle）マップ（図２参照）
におけるヌクレオチド4811ないし5080を包含する270bp
のエクストラドメイン（ED）セグメントを欠いている。
このように、270bpのEDセグメント、すなわちヌクレオ
チド4811ないし5080を欠いているために、バラレマップ
上でヌクレオチド3317から5566まで続く前述のcDNAは19
80個のヌクレオチドを含むのみである。この欠けた領域
は、当該分野においてED−Ａ領域としても知られてい
る。ヌクレオチド5081がＧからＡに変更されているため
に、アミノ酸1690はアラニンからトレオニンに変化して
いる。同様に、このDNA断片によって発現したポリペプ
チドはバラレマップのアミノ酸1102ないしアミノ酸1851
をコードするが、ED領域によってコードされる90個のア
ミノ酸、すなわちアミノ酸1600−1689を欠き、したがっ
て660個のアミノ酸を含むのみであろう。これは、この
出願に記載された、ED領域にまたがる全てのCBD断片に
ついて真実である。（当該分野においてED−Ｂ領域とし
て知られるこの領域は、バラレ配列および出願人のcDNA
の両者において欠けている） 位置3317に示されるEcoR I切断部位は、EcoR Iリンカ
ーを用いることによりクローニング処理の間に出願人に
よって構築されたものである。位置3313ないし3318のGA
ATTC配列は、対応するバラレ配列GATTCとはヌクレオチ
ド１個が異なる。これは、ヌクレオチド3315の１個のヌ
クレオチドのＣからＡへの変化を導く。これは、対応す
るアミノ酸1100をThrからAsnに変化させる。
例 １ フィブロネクチンcDNAライブラリーの調製 公開されている手順（13、14）に従い、ヒト肝臓から
単離したポリＡ＋mRNAからλgt11中にcDNAライブラリー
を調製した。EcoR Iリンカーを用いてcDNA断片のクロー
ニングを行い、下記合成DNAプローブを用いてフィブロ
ネクチン（FN）陽性プラスミドについてcDNAライブラリ
ーのスクリーニングを行った。
フィブリン、コラーゲン、ヘパリンおよび細胞結合ド
メインを包括する一連のFNcDNAクローンが同定され、単
離された（図９）。このcDNA断片をpBR322のEcoR I部位
にサブクローニングした（subcloned）。
FNのmRNAの二者択一的な接合が行われ、その結果異な
る長さのcDNAが文献に報告されている。細胞結合ドメイ
ンに相当する出願人のcDNAは、FN物理マップ上の塩基48
11ないし塩基5080の270塩基対が削除されている。
例 ２ フィブリン結合性ドメイン（FBD）ポリペプチドの発現
および精製 A.部分FBD20kDポリペプチドの発現 例１に記載した通りに得られ、図９に示されるFNcDNA
クローンは、FN分子のアミノ酸１−190をコードするDNA
を含まない。これらのアミノ酸はFBDの一部である。７
対の化学的に合成したヌクレオチド（図３および４）を
連結することにより、ヌクレオチド14ないし472に対応
し、アミノ酸１−153（図2A）をコードするDNAを構築し
た。この合成DNA断片は、種々の発現ベクターへの導入
に都合のよい制限部位の他に、５′末端にATG開始コド
ンを有するように設計された。FBDをコードするDNA配列
のさらなる操作を可能にするために、ヌクレオチド番号
19のチミジン（Ｔ）をアデニン（Ａ）に変更し、これに
よりアミノ酸配列を変更することなくDde I制限部位を
除去した。（ヌクレオチドを変更した部位は、図3Aに示
すリンカー＃１のアストリクスによって示される）EcoR
IおよびBamH Iで切断されたpBR322プラスミドへの上記
合成DNA断片のクローニングの種々の工程を図４に記載
する。得られたプラスミドをpFN932−18と名付けた。フ
ィブロネクチンの最初の153個のＮ−末端アミノ酸をコ
ードする、プラスミドpFN932−18からのDNA断片を、λP
L発現ベクターであるpTV301のNde IおよびBgl II部位の
間に挿入し、プラスミドpTV301におけるヒト成長ホルモ
ン（hGH）をコードするDNA配列と置き換えた（図５）。
得られたプラスミド、pFN949−２は、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクションに受入番号67831号で
寄託された。プラスミドpFN949−２を大腸菌プロトトロ
フA4255の形質転換に用いた。これらの形質転換大腸菌
細胞は、総計で全細胞性蛋白質の約５％の部分FBDポリ
ペプチドを発現することが見出された。このポリペプチ
ドは、サイズマーカーの移動性から決定すると、還元SD
Sポリアクリルアミドゲル上で約20kDの移動性を有して
いる。このポリペプチドは、フィブロネクチンの最初の
153個のアミノ酸と、合成リンカーによってコードされ
る、続く４個のアミノ酸、およびTAA停止コドンの欠損
によるpBR322への読み込みに起因するいくつかのアミノ
酸、すなわち、合計153個のアミノ酸に加えてさらに20
個未満のアミノ酸、並びにさらなるＮ−末端メチオニン
を含む。この明細書を通して、このポリペプチドはr20k
Dポリペプチドもしくはr20kD FBDと呼ばれる。
B.「完全」FBDポリペプチドの発現 アミノ酸１ないし262を含む全FBDポリペプチドの発現
を得るために、以下のプラスミドを構築した。
1. 3′末端への停止コドンTAAの挿入 TAA停止コドンおよび下記配列を有するBgl IIを含む
合成オリゴヌクレオチドを、図６に示すように、FNcDNA
クローンp931−５から単離されたEcoR I−Pvu II断片の
３′末端、並びにEcoR IおよびBamH Iで切断したpBR322
ベクターに連結した。得られたプラスミドをpFN935−12
と名付けた。
2.λPL発現ベクターにおけるFBDのカルボキシ末端領域
のサブクローニング 共に譲渡されたPCT公開公報WO90/07577に記載されて
いるように、FBDのカルボキシ末端領域をコードするEco
R I−Hinc II DNA断片をプラスミドpFN935−12から単
離し、EcoR IおよびSma Iで切断したプラスミドpTV194
−80に連結させた（図46）。得られたプラスミドをpFN9
46−12と名付けた。
3.FNのヌクレオチド468−599に対応するDNAの合成およ
びクローニング 上で参照したPCT公開公報に詳細に記述されているよ
うに、化学的に合成した３対のヌクレオチドを、EcoR I
およびXba Iで切断されたpUC19ベクターDNA（GIBCO BRL
CO.より購入）の存在下において、プラスミドpFN932−
18（図４）から単離したEcoR I−Ddel FN断片に連結し
た（図47）。得られたプラスミドをpFN948−４と名付け
た。
4.完全FBD領域をコードするプラスミドの構築 完全FBD、アミノ酸１ないしアミノ酸262、をコードす
るプラスミドを構築するために、上で参照したPCT公開
公報に開示されているように、FNをコードするEcoR I−
Xba I DNA断片をプラスミドpFN948−４から単離し、Ec
oR IおよびXba Iで切断したプラスミドpFN946−12に挿
入した（図48）。得られたプラスミドをpFN−957と名付
けた。このプラスミドは、FBDの完全コード領域を有し
ているが、リボソーム結合部位（RBS）を欠いているた
めにFBDポリペプチドを発現することはない。
5.λPLプロモーターおよびc II RBSの下でのFBDの発現 上で参照したPCT公開公報に記述されているように、F
BDコード領域およびT1T2転写ターミネーターを有するNd
e I−Hind III断片をプラスミドpFN−957から単離し、N
de IおよびHind IIIで切断したプラスミドpTV301に挿入
した（図49）。得られたプラスミド（pFN962−３と名付
けられた）は、λPLプロモーターおよびc IIリボソーム
結合部位の制御の下で、FBDポリペプチドの発現を導
く。このプラスミドで形質転換した大腸菌株A1645およ
びA4255は、わずかに小量のFBDポリペプチドを発現し
た。FBDポリペプチドの発現は、ヒト血漿由来FNに対す
るポリクローナル抗体を用いるウェスタンブロット分析
によってのみ検出可能であった。
6.λPLプロモーターおよびβ−ラクタマーゼプロモータ
ーおよびリボソーム結合部位の下でのFBDポリペプチド
の発現 プラスミドpFN962−３を用いて得られるFBDポリペプ
チドの発現のレベルが低かったので、我々はβ−ラクタ
マーゼプロモーターおよびβ−ラクタマーゼRBS（PBL
A）をコードするDNA断片を加えた。PBLAをコードするDN
A断片をプラスミドpBLA11（ATCC受入番号39788）から単
離し、Nde Iで切断され、クレノウ酵素で埋められ、か
つEcoR Iで切断されたプラスミドpFN962−３に挿入した
（上で参照したPCT公開公報を参照）。得られたプラス
ミド（pFN975−25と名付けられた）は、ATCC受入番号67
832でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
に寄託された。このプラスミドを大腸菌プロトトロフA4
255（Ｆ＋）の形質転換に用いた。
これらの大腸菌細胞は、全細胞性蛋白質の約５−８％
のレベルで「完全」FBDポリペプチドを発現することが
見出された。このポリペプチドは、還元条件下のSDS−P
AGEゲル上で見かけ上の分子量31kDで移動した。このた
め、これを31kDポリペプチドまたはr31kD FBDと呼ぶ。
C.発酵および増殖条件 r31kD FBDポリペプチドを発現するクローンを、アン
ピシリンを含有する富化培地（イーストエクストラクト
およびカゼイン加水分解物）において発酵させた。30℃
で増殖させた。42℃で２時間インキュベートすることに
より発現させ、続いてr31kD FBDポリペプチドを含有す
る菌細胞固形物を得た。同様に、r20kD FBDを発現する
クローンを発酵させ、r20kD FBDポリペプチドを含有す
る菌細胞固形物を得た。
D.組換えフィブリン結合ドメイン（r31kD）ポリペプチ
ドの再折込みおよび精製 この過程は３段階からなる。
1.細菌固形物の粗製処理 2.再折込み／再酸化 3.精製 1.粗製処理 まず、５容量の50mMトリス−HCl/50mM Na−EDTA、pH
8（緩衝液１）中で固形物を破砕する。次いで、このペ
レットを、100mg/lリゾチームを含有する1.2容量の緩衝
液１で処理する（37℃で２時間撹拌）。得られた懸濁液
にトリトンX100を添加し（１％まで）、室温で30分後に
懸濁液を遠心にかけ、ペレットを再懸濁して水で２回洗
浄する。これら全ての工程はペレットの破砕および遠心
により行われ、SDS−PAGEゲルから明らかなように、31k
Dがペレット中に留まる。
洗浄したペレットを14容積の10mMトリス−HCl/5mM E
DTA/2mM PMSF/2mM ６−アミノカプロエート、pH7.5
（緩衝液Ａ）に懸濁し、次いで１％硫酸デシル、１％硫
酸デシル/5％グリセロールおよび５％グリセロールを含
有する緩衝液Ａで連続的に処理する。最終処理を添加物
なしで緩衝液Ａを用いて行う。
2.再折込み／再酸化 原理：グルタチオン−GSHのようなチオール還元剤の
存在下において、ペレットを6Mグアニジン−HClに溶解
し、酸化されたグルタチオン−GSSGを添加することによ
って低GuCl濃度で再折込み／再酸化すること。
上記工程１からの洗浄したペレットを緩衝液Ａ中の15
0−700容量の6M GuCl/3mM GSHに溶解する。GuClの濃
度を、他の全ての成分の濃度を一定に保ちつつ徐々に、
すなわち、最初に2M,次いで1M、さらに0.5Mに低下させ
る。ただし容積は除く。この段階における容積は、ペレ
ットの容積の500−1000倍とする。GuClの中間濃度の１
つ、すなわち0.5ないし2Mの間で、0.3mM GSSGを添加
し、室温で24−48時間インキュベートすることにより再
折込みを開始する。次いで、再折込みをした31kDを添加
物なしで緩衝液Ａに対して透析する。
3.精製 濃縮：濃縮し、ヘパリン−セファロースカラムで精製
する前に、まず大容量の再折込みをした31kDを遠心した
31kDを含まない不溶ペレットを除去し、次いでトリス−
HCl、pH7.8に対して透析する。
FBDのポリペプチド断片の再折込み／再酸化および精
製の改良手順を例５および10に記述する。
実施例３ r31kD、r20kD、r18.5kD、およびr12kDフィブリン結合
ドメインポリペプチド分画の薬力学 クロット（血栓）画像の強度および解像度は、放射能
薬剤の導入速度と血液クレアランス速度との相互作用に
より支配される。r31kDフィブリン結合ドメインの代謝
行動を説明し、それをフィブロネクチン（FN）と比較す
るため、r31kDフィブリン結合ドメインおよび血漿フィ
ブロネクチンをICI法（24）により125Iでヨー素化し、
ラットに静脈注射した。その結果を125I−r31kD FBDお
よび125I−FNの薬力学的行動を示す図７に示す。血液サ
ンプルはこのグラフに示した回数で取出した。
図７は２つの放射性分子のクレアランス速度が異な
り、５時間後にはr31kD FBDの僅か３％、FNの20％がそ
れぞれ循環に残存している。
ラットのいくつかを個々の新陳代謝ケージに収容し、
蓄積された尿および糞便を７時間後および24時間後に集
めた。注射された125I−r31kD放射能の約30％を最初の
７時間の間に尿に排泄され、90％以上が24時間後に尿に
排泄された。尿の放射能のすべてはトリクロロ酢酸に可
溶で、たんぱく質加水分解による分解を示唆していた。
種々の器官（肝臓、胃、腎臓、肺、子宮、筋肉、膀胱、
心臓、ひ臓、気管、大動脈、大静脈）の分析によって
も、特異的蓄積は認められず、放射能の消失行動は血液
の場合と同様のパターンを示した。これら器官のほとん
どにおいて、比放射能（cmp/g組織）は血清のものより
低いものであった。
これらの結果は、FNの外因性組換型r31kDアミノ末端
ポリペプチドがわずかに劣化し体内に排泄されているこ
とを示している。その薬力学的行動は第１次運動力学と
一致せず、これはこのポリペプチドが血液以外の他の組
織、身体部位に僅かに分布していることを示している。
また、この結果から劣化の程度は４ないし24時間の間に
増大せず、したがって身体部位からポリペプチドが徐々
に解放されていることを示唆している。代謝物が尿に排
他的および比較的早期に現れたことは、このポリペプチ
ドが腎臓を介して容易に排泄されることを示している。
この物質が肝臓にほとんど蓄積されないことは肝臓が劣
化の主たる場所でなく解毒に関与しないことを示してい
る。
r31kD FBDの比較的短い半減期は血栓の診断的画像化
での使用の可能性の点から重要である。この組換型r31k
D FBD（r31kD）は放射能、その他の手段でラベリング
し、ついで血栓画像化の目的で血液に導入することがで
きる。
この分子の比較的短い半減期は、これをクロット形成
防止のために利用するときに重要となる。これとは対象
的に、現在治療薬として用いられているヘパリンは非常
に長い半減期のため好ましくない。
同様の実験が血漿フィブロネクチンのヨー素化31kDフ
ィブリン結合ドメインを用いて行われ、同様の薬力学お
よび放射能分布が観察された。
r31kDポリペプチドは血漿FNの開裂により以下のよう
にして得られる。まず血漿FNをゼラチンセファロースカ
ラムにより精製し、溶出させ、1Mグアニジニウム塩素酸
塩に貯蔵した。のちに、FN206mgを10mMのトリス−HClに
対し透析したのち、0.01％TPCK−トリプシンを用い37℃
で５分間、消化させた。このトリプシン消化物をDE52カ
ラム（6ml）に充填し、その流通分画（50ml）の1/5をCM
−セファロースカラム（3ml）に適用し、NaCl勾配剤
（０−0.5M）で溶出させた。このポリペプチドの約80％
を塩勾配剤（約220mMでピーク）中に回収させた。この
塩を除去するため透析ののち、このポリペプチドの約1/
2をヘパリン−セファロースカラム（1.5ml）に充填し、
0.5MのNaClで溶出させた。このポリペプチドの約75％、
すなわち、約1mg（理論収率の約40％）をこの分画中に
回収した。この分画は純度90％以上のr31kDポリペプチ
ドであり、上述の方法によりヨー素化した。さらに改良
した例においてはCM−セファロースが省略され、ヘパリ
ン−セファロース工程がDE52カラムののちに直接行われ
た。
血漿31kD FBDがFNの最初の259アミノ酸を含み、組換
型r31kD FBDがFNの最初の262アミノ酸およびＮ−末端
メチオニンをさらに含んでいることが注目される。
r20kD、r18.5kD、およびr12kDフィブリン結合ドメイン
ポリペプチドの薬力学 実施例２、４、５および10で作られた標識r20kD、r1
8.5kD、およびr12kDフィブリン結合ドメインポリペプチ
ドを用いて行われた。これらのポリペプチドの薬力学は
r31kDポリペプチドの場合と極めて類似していた。
実施例４ 追加のフィブリン結合ドメイン（FBD）ポリペプチドの
発現および発酵 実施例２において部分的r20kD FBDおよび全長r31kD
FBDが記載された。本出願人に係わるPCT公開No.WO 90
/07577の実施例24において31kD FBDのリホールデング
および精製の手法が開示されている。FBDの追加のポリ
ペプチド分画の発現のためのプラスミドの構造について
記載する。
A.r12kD FBDポリペプチドの発現 プラスミドpFN 975−25、ATCC No.67832にフィブロ
ネクチンの全長31kD FBDを表し、これからプラスミドp
FN 196−２（部分的FBDを表す）が図10に示すように構
成された。このプラスミドはEscherichia coli菌株A164
5に変換され、ついでEscherichia coli菌株A4255に変換
され、受入れNo.68328としてATCCにA4255で寄託され
た。これらの変換細胞は全細胞質たんぱく質の約５％の
量を有する部分的FBDポリペプチドの良好な発現体であ
ることが見出された。このポリペプチドはSDSポリアク
リルアミドゲル上にて還元条件下で約14.4kDの運動性
（サイズマーカーの運動性から判定して）を有してい
た。このポリペプチドはフィブロネクチンの最初の109
アミノ酸からなる。さらに他のメチオニン残渣が最終ポ
リペプチドのＮ−末端に存在している。本明細書におい
てこのポリペプチドはr12kDポリペプチド分画またはr12
kD FBDとして参照する。
B.変性12kD（12kD′）部分的FBDポリペプチドの発現 全長r31kD FBDを表すプラスミドpFN 975−25（ATCC
No.67832）を、図11に示すように変性12kD（12kD′）
を表すプラスミドpFN197−10を構築するために用いた。
フィブロネクチンFBD配列を変性し、ヌクレオチド340の
直後にNde I位置を形成した。このプラスミドをEscheri
chia coli菌株A1645に変換し、ついでEscherichia coli
菌株A4255に変換した。これらの変換された細胞は全細
胞質たんぱく質の約５％の量を有する変性12kD部分的FB
Dの良好な発現体であることが見出された。このポリペ
プチドは還元SDSポリアクリルアミドゲル上にて変性12k
D FBDと同様の運動性を有していた。このポリペプチド
はフィブロネクチンの最初の109アミノ酸からなり、さ
らにアミノ酸ヒスチジンおよびメチオニン続いている。
さらに他のメチオニン残渣が最終ポリペプチドのＮ−末
端に存在している。本明細書においてこのポリペプチド
はr12kDポリペプチド分画またはr12kD′ポリペプチドま
たはr12kD′ FBDとして参照する。
C.33kD細胞結合ドメインに融合された変性12kD′ FBD
の発現 変性12kD FBDの３′末端にNde I位置を有するプラス
ミドpFN 197−10を用い、pFN 202−５と命名されたプ
ラスミドを構築した。このプラスミドは33kD細胞結合ド
メイン（CBD）に融合された変性12kD FBDをコード化し
ている。この構築は図12に示すように行われ、ここで33
kD CBD分画はプラスミドpFN 137−２（ATCC受入れNo.
67910としてATCCに寄託された）から採取された。この
プラスミドpFN 202−５はEscherichia coli菌株A1645
に変換され、ついでEscherichia coli菌株A4255に変換
され、これは良好な発現体（全たんぱく質の８％）であ
る。45kDポリペプチドは、33kD CBD（FBDの最初の109
アミノ酸からなり、さらにアミノ酸残渣ヒスチジンおよ
びメチオニン続き、さらにセリーンで始まるCBDにより
続く。他のメチオニン残渣が最終ポリペプチドのＮ−末
端に存在している）に融合された12kD′ FBDからな
る。
D.アミノ酸配列DGRGDSに融合された31kD FBDポリペプ
チドの発現 配列、asp−gly−arg−gly−asp−ser（DGRGDS）にカ
ルボキシ末端で融合された31kD FBDポリペプチドの発
現を得るため、以下の構築がなされた。31kD FBDを発
現するプラスミドpFN975−25をpvu IIおよびHind IIIで
消化させ、図13に示すように合成リンカーにくくった。
pFN 202−５と命名されたプラスミドをEscherichia co
li菌株A1645に変換させ、ついでEscherichia coli菌株A
4255に変換させた。これらの変換された細胞は全細胞質
たんぱく質の約８％のレベルで31kDDGRGDSBDポリペプチ
ドの良好な発現体であることが見出された。このポリペ
プチドの配列は図13に記載されている。
E.融合31kD FBD−33kD CBDの発現 r33kD CBDに融合された“全長"r31kD FBDポリペプ
チドの発現を得るため、以下の構築がなされた。
31kD FBDを表すプラスミドpFN 975−25をpvu IIお
よびHind IIIで消化させ、得られた大きな分画を合成リ
ンカーにくくり、ついでNde IおよびHind III消化後、
プラスミドpFN 137−２から得られたr33kD細胞結合ド
メインにくくった（図14に示すように）。pFN 194−２
と命名されたこの得られたプラスミドは、33kD CBDに
連結されたr31kD FBDをコード化する。プラスミドpFN
194−２はEscherichia coli菌株A1645に変換させ、つ
いでEscherichia coli菌株A4255に変換させた。これら
の変換された細胞は64kDポリペプチドの低い発現体であ
り、これは33kD CBDに融合された31kD FBDからなるも
のである。このポリペプチドの配列は図14に記載されて
いる。
発酵および成長条件 r12kD FBDポリペプチドを発現するクローンをアンン
ピシリンを含むリッチメジウム（イースト抽出物および
カゼイン加水分解物）内で発酵させた。成育は30℃で行
われた。42℃で２時間の分化誘導により発現を得、のち
にr12kD FBDポリペプチドを含むバクテリア細胞ケーキ
を得た。同様にして上述の他のたんぱく質を含む細胞ケ
ーキを得た。
F.その他のプラスミド構築 1. 18.5kD FBDポリペプチド分画： 上述のごとくプラスミドpFN 949−２（ATCC No.684
56）で発現された20kD FBD分画（実施例2A）は、正し
く位置されたTAA転写終止コードンの非存在下でFN遺伝
子の末端を通過して読み取るため、pBR322ベクトルの追
加の20以下のアミノ酸を含んでいる。実施例2Aの20kD分
画よりさらに真正な“３−フィンガード"FBDポリペプチ
ド分画を与えるため、18.5kD FBDポリペプチドをコー
ド化するプラスミドを構築した。
この構築は図23、およびその説明に示されている。そ
のpFN 208−13と命名された得られたプラスミドは、PL
プロモータおよびβ−ラクタマーゼ・リポゾーム結合部
位の制御下で18.5kD FBDポリペプチド分画を発現す
る。プラスミドpFN 208−13はEscherichia coli菌株A4
255に受入れNo.68456としてATCCに寄託された。このプ
ラスミドは追加のＮ−末端メチオニンを有するフィbrオ
ネクチンの最初の154アミノ酸を発現している。
2. 12kD FBDポリペプチド分画の改良された発現体 λPLプロモータおよびβ−ラクタマーゼ・リポゾーム
結合部位の制御下で12kD FBDポリペプチド分画（“３
−フィンガード”）を発現するプラスミドpFN 196−２
（ATCC No.68328）が先に記載した。この12kD分画の発
現レベルをさらに改良するため、プラスミドpFN 203−
２を図26、27およびその説明に記載するように構築し
た。このプラスミドpFN 203−２はλPLプロモータ、C
IIリポゾーム結合部位およぎ36bp trp転写終止配列の
制御下で12kD分画を発現する。プラスミドpFN 203−２
はEscherichia coli菌株A4255に受入れNo.68606としてA
TCCに寄託された。これらの変換された細胞は全細胞質
たんぱく質の約18％からなる量で12kD FBDポリペプチ
ド分画の良好な発現体であることが見出された。
3.融合31kD FBD−33kD CBDポリペプチドの高い発現 λPLプロモータおよびβ−ラクタマーゼ・リポゾーム
結合部位の制御下で64kD融合FBD−CBDポリペプチドの低
レベル発現体であるプラスミドpFN 1994−２を先に記
載した。λPLプロモータ、C IIリポゾーム結合部位およ
び36bp trp転写終止配列の制御下で高レベルの64kDポ
リペプチドを発現し得るプラスミドを構築した。このプ
ラスミドはpFN 205−５と命名され、図25、およびその
説明に示されているように構築された。
これら全ての発現プラスミド（１−３）についての発
酵および成長は他のFBDポリペプチド（実施例2C参照）
の生成に対してと実質的に同じである。また精製および
リホールデングは実施例５および実施例10に記載した通
りである。
実施例５ フィブロネクチンの組換型20kDおよび12kDフィブリン−
結合ポリペプチドのリホールデングおよび精製 このr20kDおよびr12kDポリペプチドのリホールデング
および精製のための方法は３段階で行った。
1.バクテリアケーキの粗製 2.リホールデングおよび再酸化 3.精製 1.粗製 1.1 ペレットの洗浄および抽出 バクテリアセルケーキ（r20kDポリペプチドについて
は実施例２記載のようにして得られたもの、r12kDポリ
ペプチドについては実施例４記載のようにして得られた
もの）を、r31kDポリペプチドの場合と同様にして（本
出願人の出願に係わるPCT公開公報No.WO90/07577、第12
1頁以降参照）粉砕し、洗浄した。しかし、この場合、r
20kDおよびr12kDポリペプチドについて用いられた抽出
法については変更を行った。以下にr20kDポリペプチド
のバクテリアセルケーキについて行われた洗浄および抽
出方法の例について説明する。r12kDポリペプチドにつ
いても同様にして行った。
1.2 方法 r20kDポリペプチドを含むバクテリアセルケーキを、
プラスミドpFN949−２を含むEscherichia coli菌株A425
5の発酵により実施例２と同様にして作成した。このバ
クテリアセルケーキの一部を50mMトリスHCl、50mM EDT
A（緩衝液Ｂ）、pH7.5の10容量部に懸濁させた。この懸
濁液を中間速度で15−20秒間、均一化させ、パルスによ
り４分間、３回音波処理し、15,000rpmで30分遠心分離
した。そのペレットを緩衝液B2.4容量部（36ml）に再懸
濁させた。リソジム（0.1mg/ml）を添加し、この懸濁液
を攪拌下で37℃で２時間、水バス中で培養した。トリト
ンＸ−100を１％の最終濃度のものに添加し、室温で30
分攪拌し、遠心分離した。このペレットを水148ml中
（すなわち、最初のペレットの10容量倍）に３回再懸濁
させ、混合し、室温で30分攪拌し、遠心分離した。最終
的に得たペレットの重量は1.5gで当初の重量の10％に過
ぎなかった。しかしr20kDおよびr12kDポリペプチドの双
方はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動から明らかな
ようにペレット内に含まれていた。この洗浄および抽出
されたペレットは次の処理のため−20℃で冷凍保存され
た。
2.抽出されたペレットの可溶化およびリホールデング 2.1 この場合に可溶化およびリホールデングに用い
られた試薬および手法はr31kDポリペプチドについて用
いられたものと異なる。抽出されたr20kDおよびr12kDポ
リペプチドを50mMのβ−メルカプトエタノールの存在下
で6Mのグアニジン−HCl（GuCl）に溶解させ、ついで10
倍の希釈ののち、空気中で再酸化させた。
2.2 手法 凍結r20kDペレット（1.5g）を10mMのトリスHCl、5mM
EDTA（緩衝液Ｃ）、pH8.0と、さらに6Mのグアニジン
−HClを含む液の10容量部に溶解、混合させた。各サン
プルを未希釈のβ−メルカプトエタノール57μｌの添加
（最終濃度50mM）により還元させ、密封容器内にて空気
の非存在下で、30分攪拌させた。ついで、緩衝液Ｃ、pH
8.0の10容量部（148ml）中に約5ml/分の割合で滴下し、
開放ビーカ内で室温で一定に静かに48−72時間攪拌しな
がら酸化させた。その他、酸化は0.3mMGSSGの存在下で
密閉容器内で行われた。この段階でいくらかのポリペプ
チド析出がすでに生じていたが、この析出物を含めて懸
濁液を、pH8.5緩衝液Ｃの15容量部に対し、緩衝液を３
回換えながら24時間、透析をおこなった。ついでJA−17
ロータを備えた高速ベックマン遠心分離機を用い、この
透析物を15,000rpm（22,500xG）で45分間遠心分離し
た。これにより多くの汚染たんぱく質および再酸化の間
に生成されたr20kDおよびr12kDの凝集体を除去した。
3.精製および特性付与 フィブリン結合ドメイン内のヘパリン結合位置が知ら
れていないため、新規なより短いr20kDおよびr12kDポリ
ペプチドがヘパリン−セファロースに結合するか否か事
前に知ることができなかった。しかし、この短い分子が
実際にヘパリン−セファロースに結合することが見出さ
れた。
再酸化されたr20kDおよびr12kDポリペプチドを精製す
るために、r31kDの場合のように、フェニル−セファロ
ースカラムを必要としないことが見出された。実際に、
この物質はヘパリン−セファロース上で直接精製するこ
とができた。しかし、サンプルをヘパリン−セファロー
スカラムでクロマトグラフィを行う前にＱ−セファロー
スカラムでクロマトグラフィを行ったとき、汚染物、正
しくなくホールドされた分子、ダイマーの除去に関し、
可なりの改良が達成された。ある場合には、このポリペ
プチドは、Ｑ−セファロースカラムに充填する前に、適
当な切断ポイントを有するメンブランを用い（すなわ
ち、r20kDポリペプチドについては10kD、r12kDポリペプ
チドについては3kD）、ペリコンシステム（ミリポア
社）で濃縮された。ヘパリン−セファロースカラムも双
方のポリペプチドを濃縮するために用いられた。次にr2
0kDポリペプチドの場合に用いられる精製法の例を示
す。
3.1 Ｑ−セファロース・クロマトグラフィ 再酸化されたr20kD（47ml）の1/3をＱ−セファロース
・ファーストフローカラムの10mlカラムに適用した。こ
のカラムは、1.2ml/分の流量でpH8.5緩衝液Ｃ内で予め
平衡させたものである。この流通分画を集め蓄えた（70
ml）。このカラムに付着したこのポリペプチドを0.5MNa
Clを含むpH8.5緩衝液Ｃで溶出し、このカラムを0.5MNaO
Nで再生させた。
3.2 ヘパリン−セファロース・クロマトグラフィ Ｑ−セファロースカラムからの流通物を0.5ml/分の流
量でpH8.5緩衝液内で予め平衡させたヘパリン−セファ
ロースの10mlカラムに適用した。この流通分画はほとん
ど汚染物、正しくなくホールドされたr20kDポリペプチ
ドを含んでいた。精製された（＞95％）r20kDポリペプ
チドを0.5MNaClを含むpH8.5緩衝液Ｃで溶出し、このカ
ラムを6Mのグアニジン−HClをさらに含む同じ緩衝液で
再生させた。r20kD（表Ａ）およびr12kD（表Ｂ）につい
ての代表的精製表が示されている。
3.3 特性付与 r20kDおよびr12kDポリペプチドについてのバクテリア
ケーキの処理から得られる上澄液、およびのちのカラム
分画からの少量をポリペプチドについて評価し、SDSポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、これらの
溶出液プロフィールをFPLCまたはHPLCに取付けられたス
ペロース12カラム上で得た。リホールデングの種々の段
階でのこれらのプロフィール、および精製がr20kDにつ
いては図21、r12kDについては図22に示されている。精
製されたr20kDまたはr12kDポリペプチドは単一のシャー
プなバンドとして溶出する。これらのプロフィールは非
還元条件でSDS−PAGEゲルで見られる結果を確証してい
る。r20kDまたはr12kDポリペプチドサンプルの双方のバ
ンドは非拡散であり、単一分子型を示唆している。r20k
Dの場合、非還元ポリペプチドのバンドはr31kDポリペプ
チドの場合と同様に還元型のものより早く移行する。こ
れはr31kDポリペプチドの場合に見られるものと同様の
作用である。しかし、このような差異はr12kDポリペプ
チドの場合には見られない。FBDポリペプチドの特性付
与について実施例11にさらに詳述する。
これらのFBDポリペプチドは、血栓およびアテローム
硬化病変の画像化のための放射能薬剤として用いるため
の放射能ラベリングに有用である。
より小さいFBDポリペプチド（r20kDおよびr12kD）を
上記目的のために使用する利点は、より大きいr31kDポ
リペプチドを使用するのと異なり、より小さい分子の製
造のためにより簡単な方法を開発し得たことである。r2
0kDおよびr12kDポリペプチドのリホールデングおよび精
製のための上記方法はr31kDポリペプチドをリホールデ
ングおよび精製するための方法より早く、簡単である。
さらに、これらの方法はr31kDポリペプチドについての
方法より収率が高く、ポリペプチドのより高い濃度を、
より短いFBDポリペプチド分画について達成することが
できる（10mg/ml以下）。
FBDポリペプチド分画のリホールデングおよび精製の
ためのこの方法の改良された例を実施例10に示す。
これは実施例５、第２、３項の方法で処理されたr20k
Dポリペプチドのリホールディングおよび精製について
の代表的精製表である。
これは実施例５、第２、３項の方法で処理されたr20k
Dポリペプチドのリホールディングおよび精製について
の代表的精製表である。
実施例６ r31kD、r20kDおよびr12kDフィブリン結合ドメインポリ
ペプチドの生物学的活性 r31kD FBDの生物学的活性が本出願人の出願に係わる
PCT公開公報No.WO90/07577、第134頁以降に記載されて
いる。すなわち、生体内および生体外でのフィブリンク
ロットへの結合、バクテリアへの結合、細胞外マトリッ
クスへの結合に関連して記載されている。本実施例は、
r31kDポリペプチドに関するその他の結果とともに、r20
kDおよびr12kDポリペプチドの生物学的活性を証明する
ものである。
本実施例において、フィブリンクロットへの組換型フ
ィブリン結合ドメインの結合は以下のように測定され
た。125 I−rFBD（r31kD、r20kDまたはr12kD）の予め形成さ
れたフィブリンクロットへの結合（２段反応II） 工程1:フィブリンクロットの形成 これは２通りのいずれかにより行う事ができる。
（ａ）5mM CaCl2、１単位/mlトロンビンおよび最終容
量が250μｌとなるPBSとともに20μｌのクエン酸塩添加
ヒト全血を37℃で培養し、45分間の遠心分離および1ml
のPBSでペレットの洗浄（２回）により反応を終了す
る。
（ｂ）20μｌのクエン酸塩無添加ヒト全血（純真な血）
を37℃で培養し、150分間の遠心分離および1mlのPBSで
ペレットの洗浄（２回）により反応を終了する。
工程2:125 I−FBDポリペプチドの予め形成されたフィブリンク
ロットへの結合 クロットは最終容量が250μｌのPBS中で125I−FBDポ
リペプチドで37℃で培養する。他の成分は各実験で指示
された通り添加された。この結合反応は45分間の遠心分
離および３回のPBSでの洗浄により終了する。125I−rFB
D−フィブリンペレットを含む試験管をガンマーカウン
ターで放射能について測定した。
結果 ラットにおける125I−標識r31kD FBDの代謝安定性：フ
ィブリンへの生体外結合対TCA不溶性 図18に記載されているように、ラットを125Iで標識さ
れたr31kD FBDで静脈注射し、間隔をおいて血液サンプ
ルをクエン酸ナトリウムに添加した。この血液の一部は
以下のようにして処理した。すなわち、（ａ）20％のTC
Aで処理し、TCA不溶カウントを測定し；または（ｂ）予
め形成されたクロット（対照ラットからの全血20μｌを
用いて）で培養した。予め形成されたクロットへの125I
−r31kD FBDの結合は上述の２段反応IIの条件下で測定
した。
放射能はガンマーカウンターで測定し、各サンプルの
活性は反応混合物中の全cpmの百分率として計算した。
図18に示された結果は、r31kDの物理的崩壊（TCA不溶
性の減少により測定）と、機能的崩壊（予め形成された
フィブリンクロットへのr31kDの生体外結合の減少によ
り測定）と深く関連することを示している。しかし、比
較研究の最初の段階では顕著な差異が存在する。すなわ
ち、30分では、機能的崩壊は物理的崩壊の数倍高い。機
能的安定性の減少が物理的崩壊より著しく早いというこ
れらの結果は、以下のように説明することができる。す
なわち、FBDのフィブリンクロットとの共有反応のため
の主たる部位はアミノ酸no.3でのFBD分子のアミノ最末
端に位置しているグルタミン残渣であるため、タイプ１
相同構造の外側の20アミノ酸配列（ストレッチ）に位置
しているこのグルタミン残渣が三次構造により崩壊から
保護されていないからである。これはFBDドメインの他
のものについても典型的なものである。
B.フィブリンに対するr31kDの結合特異性：トランスグ
ルタミナーゼの作用 クロット中におけるフィブリンに対する原形質性フィ
ブロネクチンのフィブリン結合ドメインの共有結合は、
主としてフィブロネクチン（グルタミン）のアミノ酸n
o.3のフィブリンとの反応によるものである。この結合
反応はトランスグルタミナーゼにより酵素的に制御され
る。これはこのグルタミン残渣を含むアミノ酸配列を認
識させる。
以下の実験は組換型r31kD FBDのクロットに対する結
合にトランスグルタミナーゼが関与しているか否かを調
査するためにおこなわれた。本明細書の実験に用いられ
た全ての外因性トランスグルタミナーゼはモルモット肝
臓トランスグルタミナーゼ（Sigma）である。
ヒト全血20μｌから得られた予め形成されたフィブリ
ンクロットに対する以下の分子の0.3μＭ溶液の結合
は、上記２段反応IIを用い、トランスグルタミナーゼの
存在下および非存在下で測定された：すなわち、上記分
子は14C−プトレシン−r31kD FBD、125I−r31kD FBD
および125I−組換型ウシホル成長モルモン（対照）であ
る。14C−プトレシン−r31kDたんぱく質錯体で、３位に
あるグルタミン残渣が14C−プトレシンとの共有反応に
よりブロックされたものは、以下のようにして作られ
た。
r31kD FBD、0.3μＭ、CaCl2、10mM、トランスグルタ
ミナーゼ、0.015単位/mlおよび14C−プトレシン（比放
射能100mc/mmole）、60μＭを含む溶液を37℃で５時間
培養した。この31kD FBDに導入された14C−プトレシン
の量は、この反応溶液の少量のTCA析出により測定さ
れ、r31kDたんぱく質への14C−プトレシンの2.8−３μ
Ｍ溶液当量分の導入を実証した。これは、このFBDの３
位のグルタミンの90％以上が14C−プトレシンと共有反
応したことを示している。この14C−プトレシン−r31kD
物質を０℃で貯蔵し、さらに処理することなしに数日の
うちに使用した。r31kD FBDおよびEPO公開番号、No.13
1843に記載されている方法により作られた対照組換型ウ
シホル成長モルモン類似体（bGH）を実施例３記載のICI
法により125Iで標識した。
結果 トランスグルタミナーゼの存在下および非存在下で上
記２段反応IIで結合されたカウントが得られ、トランス
グルタミナーゼの存在下および非存在下で結合されたカ
ウントの比が試験された各ポリペプチドについて計算さ
れた。この比は無傷r31kD FBDをプトレシン−FBD（ブ
ロック化FBD）と比較したとき、または対照bGHと比較し
たとき著しい差がみられた。
この２つの後者のケースにおいて、カウントの比は１
に近く、これはトランスグルタミナーゼが結合に影響を
与えないことを意味し、クロットに存在する全cpmは反
応中の全cpmの10−15％であった。無傷r31kD FBDの場
合は、この比は１より可なり高く（別の実験では、この
比は血液およびトランスグルタミナーゼの品質および新
鮮度にもよるが1.8−７の間で変化した）、クロットに
存在する全cpmは反応中の全cpmの40−70％であった。す
なわち、トランスグルタミナーゼはクロットに対するr3
1kD FBDポリペプチドの結合を著しく増大させた。
これらの結果は、トランスグルタミナーゼの存在下に
おけるフィブリンクロットへのr31kD FBDポリペプチド
の結合に対し、３位の非ブロック化グルタミンの強い作
用を示している。
その他の実験も、上記２段反応IIのトランスグルタミ
ナーゼの添加が、このクロットへのr20kDおよびr12kDポ
リペプチドの結合を増大させ、これがr31kDで見られる
作用と比較し得るものであることを示している。
C.SDSポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によるr31kDた
んぱく質錯体の特徴 フィブリンクロットへのr31kDの結合により形成され
た錯体の寸法を判定するため以下の一連の実験を行っ
た。クロットをヒト全血（Ａ）20μｌまたはヒトフィブ
リノーゲン（Ｂ）0.8μＭの溶液250μｌから得た。幾つ
かのフィブリノーゲンの実験においては歯科用コイル
（実施例７に記載したような）をフィブリノーゲンとと
もに試験管に加えた。
フィブリンクロットへの125I−r31kD FBDの結合は、
0.15μＭの125I−r31kD FBDおよび5mMのCaCl2の存在下
で上述の２段反応IIを用いて測定された。この反応はPB
Sで３回洗浄することにより終了した。以下の種々の処
理ののち、ペレットを遠心分離し、上澄液（すなわち、
可溶物質）15μｌずつを、分子量106以上、分子量105以
上およびそれ以下の分子量に分けるポリアクリルアミド
上で電気泳動させた。ついで、オートラジオグラムを作
った結果、トランスグルタミナーゼの存在下でr31kD−
フィブリン錯体の高分子形が現われ、これが強イオン性
洗浄SDSおよびＳ−Ｓ結合を減少させるβ−メルカプト
エタノールの存在下で煮沸に対し抵抗を有することを示
した。
さらに、4M尿素をこの煮沸反応に加えたとき、高分子
フィブリンクロットの疎水結合凝集体について予想され
たように非常に大きい分子量形のもの（＞106）が定量
的に中間分子量形のもの（＞105）に変換した。クロッ
ト中におけるr31kDポリペプチドの量は小さい。これは
ホスフェート−食塩水緩衝液のみと煮沸したときに解放
された物質である。中間分子量形が尿素でさらに処理す
ることに対し抵抗を有することは、125I−r31kDとフィ
ブリンとの間の共有結合が関与していることを証明して
いる。
D.125I−r31kDの予め形成されたフィブリンクロットへ
の結合に対するフィブロネクチンおよびヘパリンの作用 （ｉ）フィブロネクチン（FN）の作用 ヒト血漿は可なりの量のFN（300μg/ml）を含み、こ
れは予め形成されたクロットへの125I−r31kDポリペプ
チドの結合と潜在的に競合しうる。このような競合はク
ロットの放射能ラベリングの効率に影響を及ぼし、その
結果画像プロセスに影響を与える。FNの作用を試すた
め、125I−r31kD（0.15μＭ）を精製FN（１μＭ）とと
もにPBS中にて事前形成クロットに添加した。FNは125I
−r31kDに対し７モル過剰に加えたが、この後者のペプ
チドの結合はわずかに影響されたに過ぎない（20％抑
制）。過剰のFNが125I−r31kD結合と競合しないという
観測は２通りに解釈することができる。すなわち、クロ
ットへの架橋のための部位の数はFNおよび125I−FBDの
双方を収容しても余りあるか、あるいはクロットへのFB
Dの親和性はFNのそれよりも可なり大きい。いくつかの
観測の結果、過剰の結合部位および125I−r31kDの高い
親和性が、FNの血漿濃縮の存在下で、クロットへのその
結合を可能にしていると考えられる。
（ii）ヘパリンの作用 放射線シンチグラフィ剤、例えば111In−標識血小板
および標識フィブリノーゲンは治療ヘパリンの存在下で
は効果がない。したがって、クロットへの125I−r31kD
の導入に対するヘパリンの作用を分析することは重要で
ある。ヘパリンは事前成形クロットへの125I−r31kDの
結合に対し有意な作用を示さないことが結果的に判明し
た。他の実験によれば、同じ量のヘパリンがフィブリン
クロットへのr31kDの結合に（その形成の間すなわち反
応Ｉの間に）、顕著な作用を及ぼすことを示している。
E.事前形成クロットへの種々の組換型FBDポリペプチド
および血漿FBDの結合についての比較 事前形成クロットへの種々の組換型FBDポリペプチド
（r31kD、r20kD、r12kD）および血漿31kD FBDの結合に
ついて比較するため、２段反応IIを用いた実験を図19に
記載されたようにして行った。その結果、血漿31kDはk3
1kDと同程度に結合し、r20kDおよびr12kDポリペプチド
は双方とも大きい（31kD）分子の場合の約半分程度の結
合を示した。それでもr20kDおよびr12kDポリペプチドの
結合レベルは可なり高く、放射線ラベルr20kDおよびr12
kDポリペプチドの血栓画像法のための放射性薬剤として
の能力を実証した。同様の実験をr31kD−DGRDGSポリペ
プチド（実施例４、Ｄおよび図13）を用いて行ったとこ
ろ、r31kDの場合と同程度の結合を示した。
F.125I−r12kDの新鮮または凍結クロットへの結合 FBDポリペプチドを用いての結合実験において、使用
前のクロットの凍結の効果を研究するため、以下の実験
を行った。フィブリンクロットを新鮮のまま、または−
70℃に凍結したのち、実施例５で作られた125I−r12kD
を用いての２段反応II結合実験で使用した。
この実験は図15に記載されているようにしてトランス
グルタミナーゼの存在下、または非存在下で行った。図
20はクロットの凍結がr12kD FBDへの結合に対するクロ
ットの能力に有意な影響を与えないことを示している。
通常、トランスグルタミナーゼを添加しない凍結クロッ
トはトランスグルタミナーゼの存在下での新鮮なクロッ
トと同様の結合結果を与え、外因性トランスグルタミナ
ーゼを凍結クロットに添加しても結合反応に影響を与え
ない。これは多分、凍結赤血球から外因性トランスグル
タミナーゼが解放されるためと思われる。
上記Ｂに示したように、反応IIにおいて外因性トラン
スグルタミナーゼの添加に対する応答は広範囲のものと
なっている。
G.事前形成クロットへの125I−r31kD FBDの結合のため
の条件 事前形成クロットへの125I−r31kD FBDの結合のため
の条件を調査するため、以下の一連の実験を行った。く
えん酸塩添加または“純真”血液から形成された事前形
成クロットに対する125I−r31kDポリペプチドの結合
を、上記２段反応II法を用い、種々の成分（カルシウ
ム、ヒルジン、トランスグルタミナーゼ）の存在下で試
験した。このくえん酸塩添加または“純真”血液クロッ
トを用いての結果のパターンは、r31kDポリペプチドは
高い結合を示したが、くえん酸塩添加血液の場合と同様
であった。
ヒルジン（シグマ）は全てのトロンビン媒介反応の特
異的阻害因子であり、そのためヒルジンは結合反応（段
階２）に対するトロンビンの作用を調査するために添加
された。しかしヒルジンの作用は認められず、そのため
トロンビンはクロットに対するr31kDポリペプチドの結
合に対する効果は全くない。しかし、フィブリンがフィ
ブリノーゲンから形成される段階１で添加したとき、予
想されたように同じ量のヒルジンが結合を全面的に抑制
した。
これらの結果は、外因性トランスグルタミナーゼがク
ロットに対するr31kD FBDの結合を増大させ、このトラ
ンスグルタミナーゼ反応がカルシウムイオンの存在に依
存していることを示している。用いられた外因性トラン
スグルタミナーゼが組織トランスグルタミナーゼ（活性
状態の）であるため、血清トランスグルタミナーゼ、フ
ァクターXIII（ファクターXIII aを形成するためにトロ
ンビンにより活性化されなければならない）はヒルジン
抑制に対し感応性が高いことが予想される。
H.事前形成クロットへの125I−r31kD FBDの結合のため
の条件 内皮細胞（ECM）の細胞外細胞マトリックスへの125I
−r31kDの結合が本出願人に係わるPCT公開公報No.WO90/
07577、第144頁にて記載されている。この結合が外因性
トランスグルタミナーゼの存在下または非存在下でのEC
Mに対する0.3μM125I−r31kD FBDの結合実験によりさ
らに特徴づけられた。さらに、ヘパリン、フィブロネク
チンまたはスペルミジンの存在下かつトランスグルタミ
ナーゼの存在下での結合が実験された。
これらの実験の結果は、トランスグルタミナーゼの添
加によりECMに対するr31kD FBDの結合が増大すること
を示している。ヘパリンはこの結合に対して有意な結果
を示さず、スペルミジン（トランスグルタミナーゼに対
する公知の阻害因子）は結合を抑制する。コラーゲンも
結合を抑制し、コラーゲンがアクセプター分子として内
皮細胞のマトリックスに関与している可能性を示してい
る。フィブロネクチンはこの結合反応に対し影響を示さ
ない。
これらの結果は、放射能標識組換FBDポリペプチドが
裸出血管における初期プラーク形成を画像化するための
放射性薬剤として有効に使用しうることを示している。
フィブロネクチンのFBDの種々のポリペプチド分画の
生物学的活性を実証する実験を実施例９に示す。
実施例７ ラットにおけるステンレススチールコイル−誘導静脈血
栓による組換型125I−31kD FBDおよびその分画の摂取 ラットにおけるステンレススチールコイル−誘導静脈
血栓モデルを用い、標識r31kD、r20kDおよびr12kD FBD
ポリペプチドの摂取を研究した。使用されたモデルはMa
ffrand et al（Thromvbosis and Haemostasis 59:
225−230（1988））により記載されたものである。
実験の詳細 A.ステンレススチールコイル−誘導静脈血栓による125I
−31kDの摂取の調査 ウイスタ種メスラット（200−250g）をケタミンHClお
よびキシラジンHClで麻酔させた。中央腹部切開をおこ
ない、内部大静脈を露出させた。ステンレススチールワ
イヤーコイル（歯科用ペースキャリア、ファインNo.3
1、長さ21mm）を結合部の直下の静脈内に挿入し、切開
部を縫合した。各挿入装置をそれぞれ挿入前に重量測定
し、記録した。手術の３時間後、動物に、甲状腺ヨー化
物プールを飽和させるため0.9％Na I溶液1mlを静脈注射
した。１時間後、125I−31kD FBD（５×106cpm;100μg
/kg）をラットに静脈注射した。r31kDポリペプチドは実
施例３のようにしてラベリングした。このラベリングし
たポリペプチドを投与した後24時間において、心臓穿刺
により採血し、ラットは死亡させた。このコイルが挿入
された静脈部分を、残留血液を排出させるようにして取
除いた。１つのグループにおいて、コイルが挿入された
静脈部分を重量測定し、放射能を測定した（“in Situ
血栓”グループ）。他のグループでは、静脈部分を長手
方向に切開した。血栓を持つコイルを注意深く取除き、
重量測定し、放射能を測定した。血液放射能レベルを抹
消血液を用いて測定した。
結果の計算 ２つのグループにおいて、各コイルの最初の重量を最
終重量から差し引き、各ケースの比放射能をcpm値を正
味重量で割ることにより計算した。抹消血液サンプルの
比放射能も計算した。
結果 24時間目において、血液の放射能レベルは約5000−1
0,000cmp/gであり、他方、分離された血液クロットにお
いては比放射能は約300,000cmp/g、30ないし60倍高かっ
た（図16参照）。クロットを有する静脈の全体区分を分
析に含め、いわゆる“比放射能”値を計算した。得られ
た値は血液の４ないし５倍高かった。これは標識r31kD
FBDを用い、生体中での血液クロットのガンマーカメ
ラ画像化のために良好なシグナル−ノイズ比が得られる
可能性を示唆している。
ヘパリン予備処置の作用がこのモデルで研究された。
この種の実験は必須である。なぜならば血栓画像をとる
べき患者は通常この抗凝固剤で処置されるからである。
この問題を研究するため、ラットのグループを、標識ポ
リペプチドの投与の10分前にヘパリン（500単位／ラッ
ト、静脈内）で処置した。このヘパリン処置は24時間の
のちの測定でもラベルの摂取に影響を及ぼさなかった。
これらの結果は、ヘパリンの存在下でFNのFBDを用
い、血栓画像化を行うことができることを実証してい
る。
B.ステンレススチールコイル−誘導静脈血栓モデルにお
ける組換型12kD、20kDおよび31kD−FBDポリペプチドの
比較 ３つの組換型ポリペプチドを実施例３のように125Iで
ラベリングし上記Ａのようにラットモデルに用いた。そ
の結果は図17に示すように比放射能を比較することによ
り、その３つの分子のそれぞれが血液に比較してクロッ
ト内に特異的に局在化されたことを示している。このク
ロットの比放射能は、短いポリペプチドよりも長い分子
で高いように思われる（r31kD、r20kD、r12kDポリペプ
チドについてそれぞれ、143,000;78,500;63,000cmp/gク
ロット）。
しかし、その違いは統計的に有意ではない。血液（24
時間後）についての比放射能値は同様に分子の大きさに
関連し（r31kD、r20kD、r12kDポリペプチドについてそ
れぞれ、7040;5016;3300cmp/g）、これらの分子種の血
液クレアランス速度の差を反映していると思われる。す
なわち、クロット対血液比放射能の割合の計算の結果は
３つの異なるポリペプチドについて同様であり、約20の
範囲に亘っていた。これらの結果から３つのFBD種のす
べて（または他のFBBD分画）が血栓画像化に役立つこと
を示唆している。
実施例８ アテローム硬化病変および血栓の画像化のためのフィブ
リン結合ドメインポリペプチドのラベリング ここに記載されているフィブリン結合ドメインポリペ
プチド（r31kD、r20kD、r12kDポリペプチド）またはFBD
の他のポリペプチド分画は血栓に対する放射能トレーサ
を持たせるため放射能でラベリングすることができ、こ
れによりガンマーカメラ画像による外部的探知が可能と
なる。実施例３では半減期が60日のヨー素−125
（125I）による３つのポリペプチドのラベリングを開示
している。
他の放射性ヨー素はヨー素−131（13l I）であり、Ue
hara et al（１）に記載された公知の方法によりFBD
ポリペプチドをラベリングするのに用いることができ
る。しかし13l Ｉも比較的長い８日の半減期を有す
る。
好ましくはアテローム硬化病変および血栓の医療画像
化のための放射性薬剤は注射後最初の数時間内で陽性の
結果を生じさせる（33）。このようなテストのため、よ
り短い寿命の放射能ラベルを用いることができる。最近
の研究は、インジウム−111（111In）またはテクネチウ
ム−99m（99mTc）が放射能トレーサとしてより適してい
ることを示している。なぜならば、これらは、半減期が
それぞれ67時間および６時間であるからである。他の短
い寿命の低エネルギー標識はヨー素−123（123I）であ
り、その半減期は13.3時間である。
99mTcによるFBDポリペプチドのラベリングは公知の方
法でおこなうことができる（21、33、34、35）。99mTc
はその短い半減期のため非常に好ましい治療用単一フォ
トン放射性核種であり、ガンマーカウンターで140KeVの
検出レベルを有し、粒状放射がなく、安価で、かつ入手
が容易である。１日当たり30m Ciの投与が可能で、こ
れにより高いフォトン−婦ラックスレベルが得られ、病
変の検知が、単一フォトンエミッション・コンピュータ
化断層写真により容易に可能となる（32、35）。
FBDポリペプチドのラベリングに用いられる他の放射
能ラベルはKnight（４）により検討されているようにク
リプトン−81m（81mKr）および半減期が5.3日のキセノ
ン−133（133Xe）である。他の潜在的放射能ラベルはYa
mamoto（36）により記載されているようにガリウム−67
（67Ga）でり、67Gaは78時間の半減期を有する。
我々はr31kD、r20kD、r18.5kD、およびr12kDポリペプ
チド、さらに原形質性31kD分画を、ヒト血清アルブミン
についての方法を用い111Inによりラベリングした（Hna
towich,D.J.,Layne,W.W.およびChilds,R.L.,J.Appl.Rad
iat.Inst.33:327（1982））。予備的実験によればラベ
リングされたFBDポリペプチドは２段反応IIの測定によ
れば生体中で事前形成血栓に結合し、実施例７のモデル
の測定によれば生体中で血栓に結合する。これにより24
時間後80−200の高い血栓：血液比を与える。
18.5kD、および12kDたんぱく質の放射能ラベリング FBDの18.5kD、および12kDポリペプチド分画のDTPA変
性を公知の方法（Hnatowich,D.J.Layne,W.W.およびChil
ds,R.L.（1982）Int.J.Appl.Radiat−Isot.33 327−33
2;Knight,L.C.Kollman,M.Maurer,A.H.およびBudzynski,
A.Z（1987）Biochim,Biophys,Acta 924 45−53）によ
り、DTPAの環式無水物を用いて行なった。DTPA当量の計
算された量を含む乾燥クロロホルム溶液の少量を蒸発さ
せ、ホスフェート−または重炭酸塩−緩衝塩溶液中（そ
れぞれpH7.4および8.0±0.2）で蛋白質と反応させた。
過剰の（加水分解）DTPAを透析により除去した。ラベリ
ングは担体なしの111Inにより、酢酸ナトリウムでpH6に
中和したHCl溶液中で行った。１つの実験（PBS内）にお
いて、実施例５で作られた12kDポリペプチドをラベリン
グし、これにより血栓が血液比（ラットモデルにおい
て）が86（下記参照）となり、12kDたんぱく質を越えた
５の過剰のモルのDTPAを用いた（12kDたんぱく質には５
リシル ε−アミノ基と１αアミノ基がある）。111In
でラベリングののち、遊離111Inは15％以下であること
が予想された（TLCによる）。
他の一連の実験（BBS中で）においては、無水DTPA
と、12kDたんぱく質または18.5kDたんぱく質が用いられ
た。
12kDの１分子に導入されたDTPA残渣の数を予測するた
め、DTPA−変性たんぱく質（過剰のDTPAを分離する前）
を111Inでラベリングした（上記Knight et al参
照）。導入されたDTPA残渣の数は12kDの１分子当たり0.
12であることが見出された。DTPA−ラベル化12kDたんぱ
く質および18.5kDたんぱく質は、対照非変性たんぱく質
のものと同じセペロース12（ゲル濾過）溶出液プロフィ
ールを有していた（保持時間はそれぞれ19.17分、18.29
分、対照値は表Ｅに示されている）。過剰のDTPAを分離
し、111Inでラベリングののち、遊離111Inは、12kDたん
ぱく質については28％、18.5kDたんぱく質については29
％ｍであることが見出された。これにより血栓が血液比
（ラットモデルにおいて）がそれぞれ27、25となった。
金属キレートによるNMRI、超音波およびＸ線画像が米
国特許No.4,647,447に記載されている。さらに金属キレ
ートとの抗体結合が第７欄第42行目に記載されている。
ポリマー性パラマグネチックキレートでラベリングされ
たモノクローン抗体と、NMRI法での使用も記載されてい
る（Shreve,P.et.al.,Magnetic Resonance in Medic
ine ３:336−340（1986）およびBrady,T.et.al.Procee
dings of the Society of Magnetic Resonance
in Medicine,Second Annual Meeting,Soc.of Magne
tic Resonance in Medicine,Inc.,San Francisco,p
10,1983,Koutcher,J.et.al.,J.Nucl,Med.25:506−513
（1984））。
実施例９ 種々のFBDポリペプチドの生物学的活性を実証する実験 r31kD、r20kDおよびr12kDポリペプチドの生物学的活
性が実施例６に記載されている。この実施例はFBDポリ
ペプチド分画を用いて見られる結果を示す。これらは実
施例４および５のようにして得られた12kDであり、実施
例４および10に示すようにして構築され、酸化／リホー
ルデングされ、精製された18.5kDである。
I.フィブリンクロットに対する結合 クロット形成およびFBD結合は以下に記載のように実
施例６の２段反応IIの改良型で行った。凝集の生成物お
よびFBDポリペプチドの析出を回避するため、最終遠心
分離工程は省略し、クロットは新たな管に移され、つい
でよく洗浄した。
a.“事前形成されたクロット”のクロッテング ガンマーカウンターのシリコーン化プラスチックびん
（7ml）中でつくられた反応混合物（300μｌ）は150μ
ｌのMix I［0.2×Tyrodeの緩衝液（１×Tyrodeの緩衝
液:1mMのHepes pH7.35;デキストロール0.2％;27mMのNa
Cl;0.76mMのNaH2PO4;0.54mMのKCl;0.2mMのMgCl2）、3U/
mlのトロンビン（シグマ）、0.6％のBSA（シグマ）、15
mMのCaCl2、150mMのNaCl、20mMのNaHCO3、pH8.0］と150
μｌの新鮮な食えん酸塩添加ヒト全血を含んでいた。
実験記録 37℃で３時間培養。血清は真空により除去し、フィブ
リンクロットを収容した管は−70℃で凍結保存した。こ
の事前形成クロットは数か月使用可能である。
b.“事前形成クロット”へのFBDの結合 “事前形成クロット”（室温で解凍）を収容するびん
に対し、150mMのNaCl、20mMのNaHCO3、pH8.0で:1×Tyro
deの緩衝液;0.6％BSA;5mMのCaCl2;0.5μＭの125I−FBD
を含む溶液300μｌを加えた。結合反応は37℃で18時間
（0.03％ヨード酢酸ナトリウムをこの混合物に添加して
内因性トランスグルタミナーゼ、ファクターXIII aの活
性を抑制してもよい）行われた。このクロットについで
シリコーン化びんに移し、1mlの洗浄緩衝液（20mMNaHCO
3、１％BSA;1mMのPMSF、2mMのEDTA）で３回洗浄し、ガ
ンマーカウンターで測定した。
原形質性および組換型31kDを組換型18.5kD、12kD、45
kD（図12に示すように33kD CBDに融合した12kD FB
D）、および33kD CBDと比較した結果を図30に示す。
全てのFBDポリペプチド分画は同程度に結合し、CBDポ
リペプチドはきわめて僅かに結合したにすぎなかった。
トランスグルタミナーゼ（ファクターXIII）インヒビタ
ーヨードアセテートの添加により生じた50−75％抑制は
トランスグルタミナーゼが結合反応において活性である
ことを示している。クロットに対する33kD CBDの結合
作用の欠乏はクロットへのCBD結合が別の非特異的機構
により多分媒介されることを示している。本出願人の出
願に係わるPCT公開公報No.WO90/07577、第138頁第１−2
4行目に示すように、FBDはフィブリンクロットに共有結
合で結合している。このようなトランスグルタミナーゼ
の関与および125I−FBD−フィブリン錯体の生化学的特
徴は少なくとも70％のFBDポリペプチドがフィブリンに
共有結合していることを示している。
II.血管成分への結合 フィブリンへの特異的結合のほかに、FBDポリペプチ
ドは他の血管成分と接したとき、これらに非特異的にあ
る程度、結合することを示している。血管成分の例とし
ては、内皮細胞（EC）、細胞外マトリックス（ECM）、
フィブロネクチン自体（FN）である。この非特異的結合
は、診断画像処理を行うときのグラウンドレベルを決定
するファクターの１つである。非特異的結合が低ければ
画像化がより効果的になり、患者に投与する放射性薬剤
の総量が少なくて済む。そのため、血管成分に対する12
kD FBD分画および31kD FBDポリペプチドの非特異的結
合を比較する実験が行われた。
0.3μＭの125I−12kDまたは125I−31kDの1ml分画（0.
1％BSAを含むPBS内にてそれぞれ５×105cpm/μｇおよび
7.5×105cpm/μｇ）を、融合性内皮細胞（“EC"）、細
胞外マトリックス（“ECM"）（Eldor et al,Blood 6
5:1477（1985））または固定化ヒトフィブロネクチン
（“FN"）（１プレート当たり50μg/mlのFNを含むPBS
1ml）を収容した35mmペトリ皿（Falcon）に２回加え、
４℃で１晩培養し、ついでブロッキングのため１％BSA
を含むPBS 1mlを用い室温で２時間培養した。“＋TG"
を示したとき、プレートに0.02U/mlのトランスグルタミ
ナーゼ（シグマ）を含んでいた。実験プレートをCO2培
養器内で37℃で60分培養し、1mlの“洗浄液”（2mMのPM
SFおよび2mMのEDTAを含むPBSで３回洗浄した。結合され
た放射能は、“抽出溶液”（１％のデオキシコレート、
2mMのPMSF、2mMのEDTA、2mMのNMEおよび2mMのヨード酢
酸を含む）を用いて60分、培養することにより抽出させ
た。この溶液をついで管に移し、ガンマーカウンターで
放射能を測定した。
図28に要約した結果は、31kD FBDポリペプチドの結
合に比較して、12kD FBDポリペプチドが血管成分、内
皮細胞、細胞外マトリックス、フィブロネクチンに対し
弱く結合するに過ぎないことを示している。
III.バクテリアの結合 フィブロネクチンが広範囲のグラム陽性バクテリアに
よる傷への付着、侵入に関与していることはよく知られ
ている（18）．真正血漿誘導FNのフィブリン結合ドメイ
ンがバクテリアの表面の特定のレセプターに対し高い親
和性を以て相互作用することが示された。Staphylococc
us aureusが一般に感染を開始させる部位はFN、例えば
血液クロットおよび内皮下層に富んでいる。さらに外因
性FNがこれらの部位へのバクテリアの付着を促進させ
る。FNは飽和性特異的表面たんぱく質レセプターを介し
てStaphylococcus aureusに結合する。スキャチャー分
析によれば、結合常数５×10-9Mを有する高親和性レセ
プターと、バクテリア１個当たり100−20,000のレセプ
ターの存在を示している（19）。FNレセプターの発現は
臨床分離株の侵入性および病原性と関連している。Stap
hylococcus aureusからのFNレセプターの機械的または
抗生物質の存在下でのバクテリアの成長による除去は、
これらのFNへの付着能力を減少させる。FNは多官能性ド
メインからなる２価の分子であり、バクテリア結合性の
他、細胞結合性およびコラーゲン結合性を有するので、
細胞外マトリックスの種々の成分、組織細胞内のFNレセ
プターを介してバクテリアを傷口に固着させることがで
きる。
FNとStaphylococcus aureusとの相互作用を理解する
他のアプローチは、FBDポリペプチド分画による内皮細
胞へのStaphylococcus aureusの結合抑制を介してであ
る。
31kD FBDポリペプチドのStaphylococcus aureusに対
する結合は以前に開示されている（本出願人の出願に係
わるPCT公開公報No.WO90/07577、第146頁以降）。下記
の同様の実験は31kD FBDポリペプチドとは対照的に12k
Dおよび18,5kD FBDポリペプチド分画が結合実験におい
てStaphylococcus aureusに対し結合させず、Staphyloc
occus aureusを抑制しないことを示している。しかし、
20kD FBDポリペプチドはStaphylococcus aureusの結合
を抑制し（図８参照）；これは追加の（非真正）Ｃ−末
端アミノ酸に起因するものと思われる（実施例２参
照）。このＣ−末端アミノ酸はある種の特異的リホール
デングを介して直接または間接的にその活性に影響を与
える。
以下に31kD FBDポリペプチドと他のFBDポリペプチド
分画とをStaphylococcus aureusに対する直接的結合、
内皮細胞へのStaphylococcus aureusの結合抑制に関し
て比較した例について説明する。
物質および方法 A.バクテリアへの標識FNまたはFBDの結合 1.溶液における直接的結合 125I−r31kD FBDまたは125I−FNの種々の濃度のもの
を、0.1％Tweenおよび１％BSAを含むPBS溶液にて５×10
8Staphylococcus aureusバクテリアに添加した。最終容
量は1mlとした。反応における全放射能はバクテリアの
添加直後に取り出した20μｌを用いて評価した。
この混合物を揺らしながら、20℃で２時間培養した。
結合の量はこの培養混合物の100μｌを除去し、5mlのシ
リコーン化試験管にて3mlの10％Percoll−0.15M NaCl
上に積層させたPBS 0.5mlの表面にこれを層状に置くこ
とにより評価した。ついでこれを1,350×ｇ（SWバケッ
トロータ内で4,000rpm）で20℃、15分間遠心分離した。
この上澄液を吸引し、そのペレットを放射能について評
価した。
2.非標識FN、FBDおよび関連する分子との競合 ３μg/mlの125I−p31kDを用い、競合分子（FNまたはF
BD）の特定量を当初の結合混合物に添加した以外は上記
手法と同様にした処理した。
3.固定化FNに対する放射能標識バクテリアの結合 プラスチックびんをFN、50μg/mlまたは１％BSAで塗
布した。
試験管を攪拌しながら４℃で１晩培養した。これら試
験管をついで5mlのPBSで３回洗浄した。次にPBS中の１
％BSA、0.3mlを添加し、試験管を攪拌しながら20℃で２
−３時間培養した（遊離部位をブロッキングするた
め）。
間接結合実験において、バクテリアを抑制剤とともに
４℃で２時間予備培養した。
このバクテリア（４×106pfu/ml,3pfu/cpm）をこのび
んに、図の索引に示す濃度で添加した。この分析混合物
の最終容量は0.3ml PBSであった。この混合物を４℃で
ゆっくりと90−120分間攪拌した。
ついでこれら試験管をデカンテーションし、5mlのPBS
で３回洗浄した。
5mlのシンチレーション液を加え、3H−標識バクテリ
アの結合について評価した。
B.FBD分画によるS.aureusの内皮細胞に対する結合の抑
制 I.S.aureusのヨウ素化 S.aureus SA113（ATCC受入れNo.35556）を、１ １発
酵培養を用いてトリプシン大豆肉汁（Difco Laborator
ies,U.S.A.）中で37℃で成育させた。バクテリアを光学
密度が2.30OD（660nm）に達したとき対数期の中間で採
取した。このバクテリアペレットを5mMのPMSFを含むPBS
の500ml中で再懸濁させ、３回洗浄した。この細胞を1mM
のPMSF、5mM NEM（Ｎ−エチルマレイミド、シグマＥ−
3876）とともにPBS、100mlに懸濁させ、ついで88℃、20
分で熱不活性化させた。固定のため、氷水中で冷却し−
20℃で少量づつにして貯蔵した。使用前において、この
バクテリアの濃度を５×109PFU/mlにした。たんぱく質
ヨウ素化のためのボルトン−ハンター試薬の100μCiを
氷上のガラス試験管中で蒸発させた。この蒸発させた試
薬にバクテリア懸濁物（1ml）を添加し、氷上で静かに
混合させた。この反応は、50mMの燐酸カリウム緩衝液pH
8.5に溶かした0.2Mグリシン、1mlを添加することにより
終了させた。この反応混合物を1mMのPMSFを含むPBS、20
mlに懸濁させた。５℃で3,000rpmで10分、遠心分離した
のち、２回洗浄した。最終のペレットを1mMのPMSFを含
むPBS、2.2mlに懸濁させ、−20℃で貯蔵した。この比活
性はほぼ20−100PFU/cmpであった。
II.内皮細胞の成長 ウシ大動脈内皮細胞A5P7（A.Eldor,Hadassa Hospita
l,エルサレムから得たもの）を、上述のように組織培養
中に保った（Ogawa S.K.et al 1985 Infect.Immuno
l.50:218−224）。この培養媒体はDMEM/＋１％Ｄ−グル
コースおよび10％FCS（双方ともBiological Industrie
s,kibbutz Beth−Haemek,イスラエルから得たもの）を
含み、これにＬ−グルタミンおよびゲンタミシン（それ
ぞれ7mMおよび5mg、Sigma Chemical社）を補充した。
細胞を150ml組織培養フラスコ（Falcon）中で37℃、
5.5％CO2で保持した。
結合実験のための融合性単一層は24穴組織培養プレー
トまたは35mm組織培養プレート（コーニング・グラスウ
エア社、N.Y.）中でつくられた。この穴およびプレート
は細胞懸濁物を添加する前に、0.5mlまたは1ml完全媒体
で30分予備培養した。典型的な実験において、穴および
プレートに、５×104および105細胞でそれぞれ接種し、
３−４日後培養細胞が融合性になったとき、使用した。
III.内皮細胞に対する125I−S.aureusの結合 この手法は上記引用文献（Ogawa S.K.et al 198
5）と同様にしておこなった。上述のようにして作られ
た標識S.aureusをPBS中に108/mlに稀釈し、3.5μｌの標
識バクテリアを、200uL DMEM＋10％FCS、20mMNaHCO3を
含む33uL 150mM NaCl、および17μｌのPBSまたはテス
トされるべき競合物を含む混合物に添加し、ついで静か
に攪拌しながら２時間培養した。ついで、バクテリアを
予め成長させた内皮細胞の融合性単一層に加えた。この
内皮細胞を評価をおこなう直前に食塩水で洗浄した。こ
の混合物を４℃で１時間静かに攪拌しながら培養し、ま
たは５％CO2中、37℃で攪拌なしに培養した。結合され
ない標識バクテリアを、2mM PMSFおよび2mM EDTAを含
む冷PBSで３回洗浄することにより除去した。結合され
た標識バクテリアは１％デオキシコレート、20mMトリス
HCl、pH8.3、2mM PMSF、2mM EDTA、2mM NEM、および
2mMヨード酢酸を含むPBS中にて、室温で１時間撹拌しな
がら抽出した。この抽出は１度繰り返した。この抽出物
を一緒にし、ガンマーカウンターで測定した。
結果 A.溶液中における125I−FNまたはFBDへのバクテリアの
結合 1.直接結合 懸濁されたS.aureusバクテリアに対する125I−FNまた
は125I−rFBDの結合を判定するために、この実験が行わ
れた。放射性FNまたはrFBDの種々の量を、２時間培養さ
れた５×108バクテリアに添加した。ついで10％Percll
−食塩水溶液により遠心分離した。放射能はこのペレッ
トにモニターされた。
その結果、125I−FNの結合との比較において、懸濁バ
クテリアに対する125I−rFBD（r31kD）の結合の増大が
認められた。
125I−FNの結合と比較して、このS.aureusバクテリア
に対する125I−rFBDの結合の増大は、無傷の血漿FNの２
価のマルチドメインに比較して、１価のドメインのより
高い親和性に起因するものと考えられる。同様の実験が
12kDおよび18.5kD FBD分画について行われたが、全く
結合を示さなかった。
2.“天然”非標識FN、FBDおよび関連分子との競合 125I−p31 kD（３μg/ml）の一定量を、競合体とし
て増加量の種々のFBD分子の存在下で５×108バクテリア
で培養させた。
その結果、“天然”非標識FNおよび正しくホールドさ
れたp31 kDまたはr31kD FBDはS.aureusバクテリアに
対する125I−p31kDの結合を同様にして抑制した。これ
は組換型31kDが天然の血漿誘導分子と同様に活性に有す
ることを示している。しかし、組換型または血漿誘導FB
Dの還元型（スクランブルされた）のものはバクテリア
に対する125I−FBDの結合を僅かに抑制するに過ぎな
く、結合のためには正しいホールデングが必要であるこ
とを示唆している。さらに、r12kDおよびr18.5kD FBD
ポリペプチドはCBDポリペプチド（FNの33kD細胞結合ド
メイン）と同様にS.aureusバクテリアに対する125I−FB
Dの結合と競合しなかった。これは完全31kD FBDドメイ
ンのみがバクテリア結合活性を有し、より短いFBD分画
はバクテリアを結合しないことを結論づけている。
B.固定FNに対する標識S.aureusの結合 傷の細胞外マトリックスに対するバクテリアの付着を
干渉しないrFBD（r31kD）の能力を見積もるため、競合
評価が開発された。この評価法において、FNで塗布され
たプラスチック表面に対するS.aureusの付着およびFBD
の結合に対する干渉が測定された。
その結果、FN塗布プラスチックびんへのS.aureusの付
着は、FN、pFBD（31kD）またはrFBD（31kD）を用いたS.
aureusの予備培養にしたがって抑制されることが実証さ
れた。これらの分子の抑制の程度はほぼ同じである。関
連のないたんぱく質、BSA（S.aureus結合部位を有しな
い）は、FN塗布プラスチックびんへの放射性標識S.aure
usの付着を何ら抑制させなかった。
同様の実験が、12kD FBD分画についても行われた
が、固定FNに対するS.aureusの付着抑制は認められなか
った。
C.内皮細胞に対するS.aureusの結合抑制 図29は上述のように内皮細胞に対するS.aureusの結合
のFBD分画による抑制を示している。31kDは内皮細胞に
対するS.aureusの結合について、劇的および投与量依存
的効果を示した。しかし、18.5kDも12kDも抑制効果を全
く示さなかった。これは、S.aureusレセプタについても
FBD上の結合部位が18.5kDおよび12kD分画に見出だせな
いことを示している。これはフィブロネクチンのFBDの
バクテリア結合ドメインがS.aureus結合ドメインから分
離することができることを最初に証明するものであり、
驚くべきことである。
要約および結論 表Ｃは上述のように種々のFBDポリペプチド分画の活
性を要約、比較するものである。
これから18.5kDおよび12kDポリペプチド分画は、31kD
に比較してより狭い活性スペクトルと血管成分およびバ
クテリアのような他のリガンドについてより低い特異性
を有するとともに、フィブリンに対し高い共有結合特異
性を有することが分かる。これは血栓画像薬剤について
の有利な特性であり、診断試薬としてフィブリン含有血
栓に対し、低いバックグランドレベルを保持しながら高
い親和性を有することを確証するものである。このもの
の生体内実施例が実施例13に示されている。
例 10 短FBDポリペプチド断片の再折込み／再酸化および精製
の改良法 組換えFBD蛋白質−r31kD（“５フィンガー”）、18.5
kD（前述の20kDよりも確実な“３フィンガー”の変形）
およびr12kD（“２フィンガー”）−を、精製して均質
にする（純度＞98％）前に、大腸菌内において発現さ
せ、再折込み／再酸化する。完全31kD FBDポリペプチ
ド（５−フィンガー）および短12kDおよび18.5kD FBD
ポリペプチド断片（２−および３−フィンガー）に用い
られる再折込み／再酸化処理は異なり、例２および５に
記述されている。例５の方法は、その時点までに再折込
みされている全ての２−および３−フィンガーFBD蛋白
質に適用可能ではあるが、５−フィンガー蛋白質、31kD
には、精製血清由来31kDに対して（再酸化が後に続く）
還元が行なわれている場合、すなわち蛋白質を“開き”
および再折込みする場合にさえも適用できないことが見
出されている。最近、この手順が、再折込み処理の原理
に影響を与えることなく改良され、この改良手順が12k
D、18.5kDおよび20kDポリペプチド、並びに45kD FBD−
CBDハイブリッド・ポリペプチド（12kD−33kD）に適用
可能ではあるが、31kDポリペプチドには適用できないこ
とが見出されている。
この処理は本質的には例５の記載と同様である。以下
の記載は12kDポリペプチドに関し、18.5kD FBDポリペ
プチドおよび45kD FBD−CBDハイブリッド・ポリペプチ
ドについても同様の結果が得られた。これらのポリペプ
チドは、それぞれプラスミドpFN203−２（図27）、pFN2
08−13（図23）およびプラスミドpFN202−５（図12）に
よって発現した。
（図27に記述されているように）プラスミドpFN203−
２に臓する大腸菌株A4255の発酵により、例２に記述す
る通りに細菌固形物を製造する。
A.細菌固形物の粗製処理:2−および３−フィンガーFBD
蛋白質と同様の方法で、ペレットの洗浄および抽出を行
なった（例５参照）。細菌固形物を20容量の50mMトリス
HCl、50mM EDTA、pH7.4に懸濁させた。15分間攪拌した
後、この懸濁液をディノミルkD ５ビードミル（Dynomi
ll kD 5 bead mill）に50リットル／時間で２回通すこ
とにより破砕した。破砕した懸濁液を遠心した（セパ10
1（Cepa 101）遠心分離機内において、供給速度80リッ
トル／時間で、14000×ｇ）。このペレットを、元の細
菌固形物の乾燥細胞重量の容積の10倍の最終容積まで上
記緩衝液に懸濁させた。この懸濁液を37℃とし、リゾチ
ームと添加した（2500単位/ml）。37℃で２時間撹拌し
た後、トリトンＸ−100（１％）を添加し、室温で連続
して30分間撹拌しながらインキュベートした。次いで、
この懸濁液を等容積の脱イオン水で希釈し、W370ソニケ
ーターで超音波処理して上と同じ条件下に14000×ｇで
遠心した。ペレットを、脱イオン水に再懸濁することに
より２回洗浄し、細菌固形物乾燥重量の容積の16倍の最
終容積とし、室温においてpH7.4で15分間撹拌した。撹
拌の後、W370ソニケーターで超音波処理し、上と同様の
条件下において14000×ｇで遠心した。FBDポリペプチド
封入体を有する、線状かつ抽出済みのペレットを、さら
なる処理まで−20℃で冷凍状態にする。
B.再折込み／再酸化：得られた洗浄済封入体（100g−1
9.2gの乾燥重量を表わす）を、6MグアニジンHClをさら
に含有する、５容量の10mMトリスHCl、pH8.0、5mM EDT
A、1mMフェニルメタンスルホニルフルオライド（PMS
F）、10mMε−アミノカプロン酸に可溶化した（最終容
積600ml）。2.27mlのβ−メルカプトエタノール（最終
濃度:50mM）を添加することにより試料を還元し、空気
の非存在下、すなわち密封容器内において室温で90分間
拡販した。還元した蛋白質を0.54MグアニジンHCl中にお
いて、（0.81mg/mlのタンパク濃度で）以下の通り再酸
化した。還元蛋白質の溶液に、撹拌しながら、酸化され
たグルタチン（GSSG）をされに含有する酸化緩衝液（10
mMトリスHCl、pH8.0、5mM EDTA、1mM PMSF、10mMε−
アミノカプロン酸）を150ml/分で添加した。この酸化処
理は、一定かつ穏やかに撹拌しながら、密閉容器中にお
いて室温で65時間続けた。グアニジンHCl、β−メルカ
プトエタノールおよびGSSGを除去するために、再酸化さ
れた蛋白質の溶液をワットマンNo.3ろ紙を通して濾過す
ることにより沈殿を除き、3kD MWカットオフメンブラ
ンを備えたペリカン接線流れ限外濾過ユニット（Pellic
on tangential flow ultrafiltration unit）で10倍に
濃縮し、同じメンブラン上でジアフィルト（diafiltere
d）した。４℃で一晩静置することで生じたさらなる沈
殿は、22,500×ｇで45分間遠心することにより除去し
た。（18.5kDおよび45kDポリペプチドのために、限外濾
過およびジアフィルトレーションは10kD分子量カットオ
フメンブランを用いて行なった） C.精製：濃縮された透明溶液（700ml）を、10mMトリスH
Cl、5mM EDTA、1mM PMSF、10mMε−アミノカプロン
酸、pH8.0で平衡にしたＱ−セファロアースカラム（2.5
×28.5cm）にかけた。45kDを含有するカラムの通過液
（170−350mgである一部）を、10mMトリスHCl、pH8.0、
5mM EDTAで平衡にしたヘパリン−セファロースカラム
にかけた。この緩衝液で非結合蛋白質を洗浄した後、さ
らに500mM NaClを含有する同じ緩衝液で結合蛋白質を
溶出させた。溶出液は貯留し、−20℃で凍結状態を保っ
た。
上述のように、この手順は、わずかな変形を伴って1
8.5kDポリペプチドおよび45kD FBD−CBDハイブリッド
ポリペプチドの両方に適用された。これら両方のポリペ
プチドに対する結果は、12kDポリペプチドについて得ら
れたものと非常に似ていた。
少なくとも0.5M NaClを含有する緩衝液をヘパリン−
セファロースからの溶出に使用することおよび保存がポ
リペプチドの安定性を確実にするために必要であり、さ
もなければそれらの活性を急速に失う傾向にあることが
見出された。これは、特に31kDポリペプチドに当てはま
る。
例11 FBDポリペプチドフラグメントの特徴 I.手段 本出願の方法で生産されるFBDポリペプチドフラグメ
ントは、当分野で公知の以下の方法による一連の特性試
験で評価し、比較した。
1.SDS−PAGE ＋ME（ME＝β−メルカプトエタノー
ル）： 12.5％のアクリルアミドスラブゲルに、１％のSDSを
含有する還元条件下（＋１％ME）、サンプルバッファー
中で５分間煮沸することによってあらかじめ処理された
蛋白を埋め込んだ。電気泳動を、１レーン当たり20μ
ｇ、及びクーマーシーブリリアントブルーで着色された
ゲルを用いて行った。測定されたパラメーターは、 ａ）移動度、これは、分子量マーカー（94、67、43、3
0、20.1及び14.4kD）と比較したときに、検査された蛋
白の明確な分子量によって表わされ得る； ｂ）均質性又は純度、これは主バンド及び副バンドの相
対強度から評価される； である。
2.SDS−PAGE −ME: 12.5％のアクリルアミドスラブゲルに、１％のSDSを
含有する非還元条件下（−１％ME）、サンプルバッフア
ー中で５分間煮沸することによってあらかじめ処理され
た蛋白を埋め込んだ。電気泳動を、１レーン当たり20μ
ｇ、及びクーマーシーブリリアントブルーで着色された
ゲルを用いて行った。測定されたパラメーターは、 ａ）移動度、これは分子量マーカー（94、67、43、30、
20.1及び14.4kD）と比較したときに、検査された蛋白の
明確な分子量によって表わされ得る； ｂ）均質性又は純度、これは主バンド及び副バンドの相
対強度から評価される； である。特にこれらの条件下で、ジスルフィド結合した
二量体の量を評価することができる。
3.スペロース（superose）12によるゲル濾過： 蛋白製剤の明確な分子量及び均質性を、スペロース12
カラム（HR10/30、ファルマシアファインケミカル）で
得られた溶出曲線（elution protiles）から評価した。
ここで、スペロース12カラムは、液体クロマトグラフィ
ーコントローラーLCC500及びレコーダー（ファルマシア
ファインケミカル）を取付けたFPLC装置か、あるいは、
２ポンプで構成されたHPLCシステム（waters Associat
es）、注入器（モデルU6K）、並びに多波長検出器−ス
ペクトロモニター3000（LDC/Milton Roy）−及びクロ
マト積分計（Merch−Hitachi、モデル2000）を取付けた
自動グラジェントコントローラー（モデル580）が接続
されている。カラムは、以下の分子量標準によって測定
し、その保持時間を決定した：ウシ血清アルブミン（67
kD）、オボアルブミン（43kD）、キモトリプシノーゲン
（25kD）及びリボ核酸（13.7kD）。流速は、0.8ml/min
であり、標準ランニングバッファー、即ち150mMNaCl−2
0mMトリス・HCl、pH7.8−8.0を使用した。保持時間及び
半値幅の二つのパラメーターをモニターした。
4.UVスペクトル分析： スペクトルは、0.2−1mg/mlの濃度で、BBS又はPBS
中、室温で、プリンター／プロッターを接続したフィリ
ップスUV/Vis走査型スペクトル分光計モデルPU8720（バ
ンド長2nm）により得られた。スペクトルは、10mmの光
路長のパイユニカム（Pye Unicam）UV石英セルで測定
した。吸光係数、即ちスペクトルのλmaxでのε１％、
及びλmaxとλmin間の吸光度の比の両方をモニターし
た。
5.自発蛍光： データは、分光蛍光計、モデルFP−770により、25℃
±0.1℃で得られた。励起波長は280nmであり、励起及び
放射スリットは、両方とも5nmにセットした。アッセイ
の際の蛋白の濃度は、PBS又は新鮮なBBSのどちらかで８
−25μg/mlであり、pH7.5であった。両測定パラメータ
ー、即ちλmax（スペクトルの最大値の波長）及び比強
度（mg/mlの蛋白濃度によって規格化されたスペクトル
の最大値での蛍光強度）のpH依存性が記録された。
6.アミノ酸組成： 本試験は、ステイン＆ムーア（Stein ＆ Moore）が試
験したアミノ酸分析の方法論に従って行った。蛋白の加
水分解は、Speed Wac遠心分離器（Savant）中で、乾燥
蛋白に以下の処理をすることによっておこなった:6.0NH
Clを、各々のmgの蛋白当たり1ml加える；窒素を連続的
に排気し、流し込むことによって空気を窒素に置換し
た。管を密封し、110±0.1℃で22時間加熱した。広く使
用される方法は、基本的には、バイオテクノロジーで誘
導された生成物のUSPドラフト、1989USP Convention,I
nc.、＜954＞ページ96−98に従っている。使用される分
析器は、バイオトロニック（Biotronic）LC5000、登録
番号515−01である。本方法で評価されたパラメーター
は、Cys及びTrp以外の各々のアミノ酸残基の数である。
7.ヘパリン−セファロースクロマトグラフィー： 200μｌまでのサンプルを分析用ヘパリン−セファー
ロースカラム（5.5×0.5cm）に注入した。このカラムに
は、２ポンプで構成されたHPLCシステム（waters Asso
ciates）、注入器（モデルU6K）、並びに多波長検出器
−スペクトロモニター3000（LDC/Milton Roy）−及び
クロマト積分計（Merck−Hitachi、モデル2000）を取付
けた自動グラジェントコントローラー（モデル580）が
接続されている。カラムは、10mMのNa−燐酸塩pH6.5、7
5mMNaCl中で、0.5ml/minの流速で予平衡化され、同じバ
ッファーで５分間洗浄した。蛋白は、バッファー中で75
から500mMNaClのリニアーグラジェントで35分で溶出し
た。蛋白が溶出する塩濃度に比例した保持時間（ret.ti
me）及びピークの均質性を表わす半値幅（half−ht.b.
w.）の二つのパラメーターを評価した。
8.逆相−HPLCクロマトグラフィー： 試料を、1.7節のようなHPLCシステムに接続した分析
用のWaters C18 Bondapak逆相カラム（30×0.39cm）に
注入した。カラムは、80％H2O、0.1％TFA/20％アセトニ
トリル、0.08％TFAで、1ml/minの流速で前平衡化され、
同じ溶媒で５分間洗浄した。蛋白は、60％アセトニトリ
ル−0.08％TFAから40％H2O−0.1％TFAまでのリニアーグ
ラジェントで溶出した。ピークの均質性を表わす保持時
間（ret.time）及び半値幅（half−ht.b.w.）の二つの
パラメーターを評価した。
9.トリプシンマップ： 200μｇの種々のバッチの試料を、種々のトリプシンw
/w比、即ち、％で、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0＆10.0で
37℃で10分間温浸した。反応を5mM PMSFで停止し、次
いで30分間氷上でサンプルバッファー±ME（1.1＆1.2節
参照）で処理し、上述のように20％アクリルアミドゲル
に通した。クーマーシーブリリアントブルーで着色した
後、バンドパターン間の平衡の度合いを評価した。
10.蛋白中のチオール測定のためのエルマンズ法： チオール基の完全な露出を可能にするために、測定は
変性蛋白で行なわれた。
貯蔵溶液:1.グアニジン−HCl（入手できる最も純度の
良い品質のもの）10mMトリス−HCl中7.2M、pH8（GuC
l）； 2.DTNB（エルマンズ試薬）100mMK−燐酸バッファー中５
×10-3M、pH7。
方法:10−100μＭのチオール基を含有する蛋白試料を
0.15mlに調製した;DTNBブランク（即ち、蛋白を含まな
いもの）;0.75mlのGuCl7.2Mを加え、6Mの最終濃度を得
た。15から30分室温で培養した後、蛋白溶液のブランク
を412nmで読んだ。次に、100μｌのDTNBを５×10-4の最
終濃度まで加えた。30分室温で培養した後、DTNBブラン
クに対して、サンプルを412nmで読んだ。濃度をε＝13,
600M-1cm-1、即ち、100μＭのチオール基を用いて計算
し、1.36の吸光度値を得た。
11.沈殿／吸着 凍結した125Iを含有するFBDエッペンドルフ管を室温
で解かし、次いで渦によって混合した。２つの５μｌの
アリコートを放射能の測定用に除去した。高く特徴的な
活性の125I−FBDが使用されたとき、高食塩バッファー
の（0.6MNaCl−20mMNaHCO3pH8−９）を用いた珪素化さ
れた管中での希釈が、カウントする前に行なわれるべき
である。２つの５μｌアリコートを再度カウントした。
遠心分離の前後で得られた放射能間の差を「パーセント
沈殿」と表現する。
125I−FBDが、珪素化された管中、及び高食塩（0.6MN
aCl）バッファー中で凍結（−70℃で）されたままであ
ると、蛋白は全く安定である。我々は、２週間以内に０
−７％の125I−FBDの最小の沈殿のみを見い出した。し
かし、硅素化されていない管中、及び低食塩（150mMNaC
l）バッファー中でに保存すると、125I−FBDの沈殿は、
２−３日で60−80％程度の高さになる。これらの条件下
で、管への沈殿及び吸着は確実である。
12.FBDと14C−プトレッシンとの反応 反応は、トランスフェラーゼ反応のファクターXIII
a）に対するFBDのGln＃３の接近性を測定した。
方法：硅素化されたエッペンドルフ管中の混合物（10
0μｌ）には、10mMCaCl2、50mMトリス−HCl（pH7.5）、
5mMDTT、120μM14C−プトレッシン（シグマ）、６μMFB
D及び0.05U/mlてんじくねすみの肝臓トランスグルタミ
ナーゼ（シグマ）が含有されている。室温で、０、15、
30、及び60分培養した後、アリコート（10μｌ）を、20
0μｌの停止剤（0.4mg/mlBSA、50mMEDTA、150mMNaCl、2
0mMNaHCO3、pH8.0）を含有する管に加えた。冷20％TCA
（250μｌ）を加え、次の10分間氷上で培養し、追加の3
ml冷20％TCAを添加し、管の内容物を硝子繊維フィルタ
ー（ワットマンGF/C）で濾過した。フィルターを、冷20
％TCAで３回、70％エタノールで１回洗浄した。TCAで沈
殿可能な放射性物質をベータカウンターでモニターし
た。トランスグルタミネーションに対するFBD中のGln＃
３の接近性は、14C−プトレッシンの活性、及び反応混
合物中のFBDの濃度を基にして計算された。全カウント
の５％の取り込みが、100％の接近性と等価である。
13.自己会合 反応は、0.1xタイロードバッファー;0.6％BSA;5mMCaC
l2;0.15μM125I−FBD;6μｌトランスグルタミナーゼ
（0.02U/ml）をも含有する300μｌの150mMNaCl−20mMNa
HCO3中で行なわれた。
反応混合物は、37℃で18時間培養し、次いで反応液を
真空に吸引し、1mlの「洗浄バッファー」で３回洗浄
し、ガンマーカウンターで放射能を測定した。
II.結果 FBD蛋白は、全てアミノ末端で特別なメチオニンを含
有し、ブロック化されたp31kD（コード化されたGlnから
翻訳後変換によって得られる）のＮ−末端であるピログ
ルタメート残基の代わりに、これらのＮ−末端MetにGln
残基が続く。FBD蛋白の同定も抗−20kDでゲル展開され
たウェスタンブロット分析によって確認された。45kD
は、抗−20kD及び抗−33kDの細胞結合ドメインの両方で
このブロットを展開することによって同定された。
FBDフラグメント及び、45kDのFBD−CBDハイブリッド
は、以下の多様性によって特徴付けられる。
ａ）31kDと比較した上記のような物理化学的試験（表Ｃ
及びＤ参照）。
ｂ）in vitroでの生化学及び生物学的試験：即ち、トラ
ンスグルタミナーゼ触媒トランスアミド化に対するGln
＃３の接近性（表Ｃ及びＤ参照）、及び自己会合：実施
されたフィブリン血餅への結合を例９で説明する。
ｃ）in vivoでの生物学的試験；ラットの静脈血栓への
結合を例13で説明する。
表Ｄに、FBDポリペプチド及びFBD−CBDハイブリッド
の化学的及び物理化学的な確認においてアッセイされた
パラメーターを列挙した。12kD、18.5kD、及び45kDのポ
リペプチドは、それぞれプラスミドpFN203−２、pFN208
−13、及びpFN202−５によって生産される。
表Ｅには、アッセイされたFBDポリペプチドの実際に
測定された値を示した。
例12 FBD−SK複合体を使用した選択的（directed）血栓崩壊 I.序論 簡単かつ効果的なフィブリン−選択的血栓溶解剤は、
薬学産業の主なゴールである。我々のそのような薬剤の
開発へのアプローチは、フィブロネクチン（FDB）の領
域に結合したＮ末端フィブリンが、XIII a因子により特
異的にフィブリン血餅に架橋し得るという所見に基づい
ている。新しく形成された血栓が活性化された因子XIII
が豊富化された環境でのみ存在するので、FBDが古い血
栓よりも新しい血栓に優先的に結合することをはっきり
と示し、最終標的媒介物になり得る。従って、我々は、
化学的架橋により、FBD−ストレプトキナーゼ結合体を
生成し、血餅溶解活性を分析した。
組織プラスミノーゲンアクチベーター（TPA）および
ストレプトキナーゼ（SK）が、心血管治療に使用される
最高のフィブリン溶解剤として知られている。TPAおよ
びSKはいずれもフィブリンを退化させるが、作用の仕方
が異なっている。TPAは、フィブリン−選択制プロスミ
ノーゲン活性化作用を示す。TPAの選択性は、その分子
のアミノ末端領域にフィブリン結合部位が存在するため
である。TPAは0.16μＭのKdでフィブリンに結合する。
フィブリンに結合する場合、プラスミノーゲンのプラス
ミンへの酵素的変換が有効になる結果、プラスミノーゲ
ン活性化作用のプロセスのためのKmが、83μＭから0.18
μＭに減少する。
SKは、プラスミノーゲンと相互に作用し合い、プラス
ミンの形成を触媒することができる活性化複合体を形成
する。この相互作用はフィブリンの結合に依存しない。
血流中の活性化されたSK−プラスミノーゲン複合体は、
プラスミノーゲンからプラスミンに循環する系統的な変
換を触媒する。活性化されたプラスミンはα２−アンチ
プラスミンにより好適に阻害する。一旦、阻害剤の能力
が使い尽くされると、遊離のふぃブリノーゲン、フィブ
リンおよびその他の血漿タンパクがプラスミンにより退
化する。この結果によるフィブリノーゲンの崩壊が通常
の結合メカニズムの分裂を起こし、これにより、出血の
危険性が増加する。
TPAのフィブリンに対する親和性により、フィブリン
に結合しないSKと比較してフィブリン溶解剤として優れ
ていることが仮定される。最近、TPAおよびSKは、幾つ
かの大規模な人の臨床試験において、両者の治療学的効
果について比較されている。蓄積されたデータによれ
ば、SKは、ほとんどの患者のために選択される薬剤であ
る（Script No.1597,p.22−23,March 8,1991）。主な興
味は、選択的にフィブリンを増加させる、改良されたフ
ィブリン溶解剤の開発において今なお存在する。化学的
架橋および組換えDNA方法のいずれも、所望する分子を
設計するのに使用できる。TPAの触媒領域に結合するい
くつかの血漿由来タンパク質または抗フィブリンモノク
ローナル抗体の種々の高親和性フィブリン結合領域を含
むいくつかのキメラのプラスミノーゲンアクチベーター
分子が組立てられている。これらの分子は、いくつかの
製薬会社により、これらの治療上の効果について分析さ
れている。
活性化されたXIII因子（トランスグルタミナーゼ）
は、フィブリン分子の架橋を血液凝固の最終工程におい
て触媒する。これにより、血餅の機械的安定性が増加す
る。例6Bに記載されている通り、完全な血漿フィブロネ
クチン（FN）は、XIII a因子によりフィブリンにも同様
に架橋する。
例２および４に記載されているように、出願人は、FN
のFBDポリペプチドフラグメントを複製し、発現させて
いる（12kD,18.5kD,20kDおよび31kD）。これらのポリペ
プチドは、インビトロおよびインビボにおいて、これら
のXIII a因子の存在下でのフィブリン血餅および血栓へ
の共有結合になる能力について研究されている（例6,9,
13）。我々は、FBD分子の本質的な能力がこれらのフィ
ブリンへの共有結合に比較して有利であること、およ
び、SKを血栓に標的を合わせるために、化学的架橋（ま
たは組換えDNA法）によりキメラなFBD−SK分子を生成す
ることを解決し、これにより、出血の危険を減少させ
た。
II.FBDおよびSKの化学的誘導化および架橋 FBDポリペプチドおよびFNのアミノ末端領域を補って
いるフラグメントを、Ｎ−サクシニミジル−３−（２−
ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）−ヘテロニ官
能性架橋剤を用いて誘導した。
SPDPはアルカリ性pHにおいて一級アミンと反応してタ
ンパク質中に２−ピリジル−ジスルフイド基を導入す
る。このpHの範囲内で変性されたFBDの還元の後に放出
されるチオピリジン基に特異的である343nmでの吸光度
を測定することにより、FBD分子に対する架橋剤基の数
を計算した。血漿性31kDFBD分子については、非常に少
ない反応生成物が得られた。生成物は化学的変性条件下
で沈殿する傾向にあった。さらに、実験は、プラスミド
pFN196−２（図10）により生成された組換え12kDFBD分
子について行った。各12kDFBD分子あたり約２つの架橋
剤の残基が誘導されることがわかった。
システイン残基が欠損したSKを２−イミノチオランに
より誘導した。この試薬は一級アミンと反応してチオー
ル基を末端とする電荷を帯びたスペーサーを導入した。
SK分子に導入されたチオール基の数は、エルマン試薬
（Ellman′s reagent）を使用して決定した。変性条件
下で、SK1分子あたり約２つのチオール基が導入された
ことがわかった。
二つの誘導されたポリペプチドを混合することによ
り、遊離のチオール基を２−ピリジル−スルフィド基で
交換して、２つのタンパク質の間にジスルフィド結合を
形成し、ピリジン−２−チオールを放出した。結合体
は、誘導されたFBDが４〜８倍モル過剰であることが最
適であることがわかった。これらの条件下では、実質的
に全ての誘導されたSK分子がFBD分子と反応した。結合
プロセスは、SDS−PAGEおよびスペロース（Sperose）12
を取付けたFPLCでのゲルろ過により分析した。複合体形
成は、約10分間で完了し、可変的なFBDおよびSK濃度を
有する分子混合物を得た。
化学的変性および架橋反応は、ルンゲ（Runge）らのP
NAS,USA,84:7659−1662（1987）に従って行った。
化学的変性反応のために確立された最適な条件下で
は、FBDおよびSK分子の夫々の上のピリジル−ジスルフ
ィドおよびチオール基の計算値は約２である。形成され
た結合体混合物は、好ましい1:1ハイブリッドを主に含
有していた。
FBD−SK複合体の単離 結合したSKおよびFBD分子および遊離したSKおよびFBD
分子との分離は次の２つの工程で行った。まず、スペロ
ース６でのゲルろ過を過剰な12kD FBDを分離するため
に行った。二番目に、ヘパリン−セファロース上でのク
ロマトグラフィーを用いて、遊離のストレプトキナーゼ
を25mM NaCl,10mMトリス／塩酸（pH7.4）で樹脂に結合
した結合体から分離し、次いで、同様の緩衝液中0.5mM
NaClで溶出させた。遊離のSKによる汚染は、ゲル電気泳
動により判定されるように、最終的な製剤の５％未満の
割合を示す。
FBD−SK複合体の機能的特徴 ヘパリン−セファロースクロマトグラフィーにより精
製した架橋したFBD−SK複合体を、次の基準を使用して
天然のSKと比較した。
1. プラスミン（図33）の色素産性基質Ｓ−2251を使用
したプラスミノーゲン活性化作用の動態 2. Neville Marsh,Fibrinolysis,1981に従ったフィブ
リン−血小板アッセイ（図34）を用いたフィブリン溶解
活性 3. 血餅形成に125I−フィブリノーゲンを用いたヒト血
漿血餅溶解 この結果は、複合体がSKと同等のプラスミノーゲンア
クチベーター活性の水準を維持したことを示した。図33
から明らかなように、プラスミノーゲン基質についての
みかけのKm値（Kplg）は、SKおよびFBD−SK複合体につ
いて夫々3.1x10-6Mおよび1.8x10-6Mであった。ここで、
複合体についての平均触媒率（ｋplg）は、２つの要因
のためにSKのものよりも低いことがわかった。さらに、
図34は、SKまたはFBD−SK複合体により一晩のインキュ
ベーションの後に形成される溶解領域（lysis zone）の
間の顕著な違いを示す。
さらに、14C−プトレスシンを、モルモット肝トラン
スグルタミナーゼを用いて、12kD FBDに結合させた濃
度（図35）の約40％まで複合体に結合させ、例11の表５
と比較する。DTTは、複合体への結合を140％まで増加さ
せた。SKへの結合は認められなかった。これらの結果
は、FBD−SK複合体が活性化されたXIII因子により血栓
への架橋になる可能性を維持していることを示す。
出願人は、さらに、組換えプラスミドによりエンコー
ドされたキメラなFBD−SKポリペプチドの構造を予見す
る。
例13 ラット ステンレス−鉄コイルモデルにおける111Inで
標識された12kDおよび18.5kD−FBDによるインビボでの
血栓の標識 使用したモデルは、実質的に例７に記載されたもので
ある。組換え12kD−,18.5kD−および31kD−FBDポリペプ
チドフラグメントを111Inを用いてDTPA法（例８）によ
り標識した。標識された物質（特異的活性約5x106cpm/
μｇ）を、コイルを身につけたラット（例７）にコイル
を挿入して５時間後に血管内投与した。血栓を帯びたコ
イルを除去し、投与24時間後の濃度を測定した。図31
は、血餅および血液中の特異的放射能の結果を示し、図
32は、血液に対する血栓の相対比を示す。示されている
ように、高い血栓に特異的な放射能の値が３つの化合物
により得られた。31kD FBD基の血栓中のほうが、12kD
−および18.5kD−FBDフラグメントとの血栓中よりも高
い値であることがわかった。しかしながら、12kDおよび
18.5kD−FBDフラグメントの方が、31kD−FBDと比較して
血液濃度が低いため、血液対血栓比は高い。このこと
は、31kDポリペプチド（例９、表Ｃ）と比較してより短
いフラグメントの特異性および活性のスペクトルが狭い
ためであろう。
例14 創傷治癒におけるFBDポリペプチドの使用 創傷治癒の早期の段階において、ラミニンおよびIV型
コラーゲンのような永久基底膜成分が再形成される前
に、フィブリンおよびフィブロネクチンのゲル層の上を
上皮が遊走する。フィブリンおよびフィブロネクチンを
両方とも含有する最初の血漿由来ゲルが、繊維芽細胞に
より容易に侵され、止血および接着作用を提供して、細
胞遊走のための暫定的な間隙および走性および成長因子
（創傷ホルモン類）の保有体を提供する。急速に格子を
形成するフィブリン血管外ゲルはフィブロネクチンに結
合する。繊維芽細胞がインビボで最初にフィブロネクチ
ンによりフィブリン格子に付着することが明らかになっ
ている［グリンネル（Grinnell）.Fら（1980）のCell 1
9 517−525,コルビン（Colvin）,R.Bら，（1979）Lab I
nvest.41 464−473;ノックス（Knox）,Pら（1986）,J.C
ell Biol.102 2318−2323］。従って、創傷治癒の早期
段階でフィブリン結合および細胞結合領域の両方が必要
であることが信じられる。フィブロネクチンのフィブリ
ンへの付着が、おそらく、トランスグルタミナーゼで触
媒されたフィブロネクチンのGln−３のフィブリンリジ
ン残基へのアミド基転移により起こるため、Gln−３を
取り囲む領域の完全な構造を含むいずれかのフィブリン
結合領域ポリペプチドがこの系において作用できるに違
いない。すなわち、出願人の、FBDの12kDおよび18.5kD
ポリペプチドフラグメントは、CBDポリペプチドと共
に、創傷治癒を高めるために同様に使用できる。r33kD
およびr40kDのような組換えCBDが使用できるとういう記
録がPCT出願No.WO90/07577に記載されていた。
ヒトフィブロネクチンのFBDの創傷治癒を促進する可
能性を評価するために、細胞拡散アッセイについて試験
した。このアッセイでは、繊維芽細胞をガラスカバース
リップの上に拡散させる。ガラスカバースリップには、
CBDポリペプチドを、FBDポリペプチドの非存在下又は存
在下において吸収させた。すなわち、FBD領域ポリペプ
チドを、副物質としてフィブロネクチン細胞結合領域と
共に、細胞病巣（focal）接着性の促進剤として作用す
る能力について試験した。子ウシ血漿フィブロネクチン
から誘導された75kD細胞結合領域（CBD）と組み合せて
使用した場合、血漿由来FBD（p31kD）、および、組換え
FBD（r31kD）（両方ともヒト由来）が、NRK繊維芽細胞
の病巣接着性を促進する能力について区別ができないこ
とがわかった。ヒトタンパク質領域は、いずれも、同じ
濃度（例えば、10μg/mlのFBDおよびCBDタンパク質の1:
1混合物100μｌ）で使用した場合（以降の実験の詳細に
示されている）、対応するフラグメントよりもさらに効
果があった。75kD CBD単独で用いた場合とFBDと組合せ
て用いた場合とでの効果の違いは著しい。75kD CBD単
独により拡散した細胞の干渉反射顕微鏡（IRM）は、無
定型の「灰色」の斑および点［腹膜複製の電子顕微鏡
（EM）から、クラスチン−ベース構造で結合しているこ
とがわかった。］だけを示したが、副物質としてFBD
（組換えまたは血漿由来）の結合体は、明瞭に規定され
た病巣接着構造の形成を促進し、IRMにおいて濃い黒い
すじ（基質の腹表面の密着した接触を示す色の密度）と
して可視化された。IRM/EMの相互関係は、これらの強固
かつ整理された接着が、細胞骨格応力繊維（cytoskelta
l stress fibers）末端に対応することを示した。
さらに、創傷治癒に対するFBFおよびCBDの共同効果の
研究については、45kDポリペプチド（12kD FBD−33kD
CBD）および64kD ポリペプチド（31kD FBD−33kD
CBD）を合成した（夫々図12および25）。同様のハイブ
リッドポリペプチドは、31kD FBDに代えて12kDまたは1
8.5kD FBDを使用すること、および、33kD CBDに代え
て40kD CBDを使用することが予見される。
実験の詳細 p75kD CBD（子ウシ由来）および31kD FBD（組換え
ヒト由来）ポリペプチドの両方を、PBS中10μg/mlの濃
度で全量100μｌを、13mmのガラスカバースリップ（Cha
nce Propper Ltd,Warley,UK）に、湿潤大気圧下で１時
間吸収させた。ガラスカバーストリップは、濃H2SO4で
一晩処理し、蒸留水で広く濯いだ。次に、PBS（pH7.1）
洗浄した後、非特的な付着を減少させるために、カバー
ストリップを、卵白アルブミン（PBS中1mg,Sigma Chemi
cak Co,）と共に、10分間室温でインキュベートした。
0.1mg/mlのTPCK−トリプシン（Siguma Chemical Co.）
により分離し、カルシウム含有イーグル最少必須培地
（EMEM）に37゜で20分間再懸濁させる前に、拡散アッセ
イをNRK細胞を用いて行った。皮下注射針を取付けた5ml
シリンジ中に吸い取ることにより、これらの細胞が単一
細胞懸濁物中に得られ、次いで、2w/v％の卵白アルブミ
ンを含有するEMEMで３回洗浄した。細胞の拡散は、洗浄
したNRK細胞を、カバースリップの上に、タンパク質基
質と共に、1x104細胞/cm2の密度で再懸濁させることに
よりモニターした。これらは、干渉反射および位相差顕
微鏡により試験し、x50/1.0およびx100/1.32 PHACO RK
対物レンズおよび写真機を備えたレイツオルトラクスII
（Leitz Ortholux II）顕微鏡を使用して、干渉反射お
よび位相差顕微鏡法により試験し、写真を撮影した（コ
ダック テクニカル パン2415 35mmフィルム）。２時
間後、生きた細胞を、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液
中2.5v/v％のグルタルアルデヒド（TAAB Labs,Reading,
Beaks,U.K.）を用いて固定し、固定した細胞をEMにより
試験した。
例15:ラットモデルにおける高い血液対血栓比を得るた
めの高い放射線化学的純度を有する111In−DTPA変性PBD
タンパク質の使用 1.DTPA変性FBDタンパク質の変性および放射線標識 DTPA変性および例８に記載したDTPA変性FBDタンパク
質の方法論を改良している。これらの改良は、ラット中
のコイルモデルにおける高い血液対血栓比を得ることを
可能にしている。
1.1 DTPA変性：全ての組換え分子（r31kD,r18.5kDお
よびr12kD）を、0.1M HEPES緩衝液（pH7.0）中で20倍
過剰のDTPAを用いて変性し、過剰なDTPAをゲルろ過によ
り除去した。
1.2 放射線標識：導入された電荷のひとつに対し
て、放射線コロイドの量を最小値まで減少させるために
低pH（0.5Mクエン酸緩衝液（pH5.7））で111Inを用いた
放射線標識を行った。追加の予防の測定を行って、重金
属イオンの混入を除去することを保証する。重金属イオ
ンは、キレックス（Chelex）−100−処理緩衝液で放射
線標識したFBD溶液を置き換えることにより、キレート
化した111InをDTPA変性タンパク質から置換することが
できる。
2.FBDタンパク質の変性および放射線標識のためのプロ
トコル FBDのr31kD,18.5kDおよびr12kDポリペプチドフラグメ
ントのDTPA変性および放射線標識のための詳細な改良さ
れた手順を以下に示す。
2.1 脱塩：タンパク質（全て、0.5M NaCl中、数ミ
リモル濃度のEDTAおよびその他のプロテアーゼ酵素を含
有する。）を脱塩し、HEPES緩衝液（0.1M,pH7）に移し
た。31kD FBD（27ml,0.6mg/ml）を透析により脱塩し、
18.5kD FBD（5ml,8.7mg/ml）および12kD FBD（5ml,5.
6mg/ml）の両者をPD−ゲルろ過カラム上で脱塩した。
2.2 DTPA変性:DTPA変性は、31kD FBDの場合には容
量27mlで、12kDおよび18.5kD FBDタンパク質の両者の
場合には容量7mlで、20倍過剰量のDTPA無水物を用いて
１時間室温で行った。変性混合物の一部（100μｌ）
を、タンパク質に結合するDTPA残基の数の決定のために
別に取り分けて、遊離のDTPAを、2.6x60cmセファデック
ス（Sephadex）Ｇ−25カラム上でのゲルろ過により、こ
の混合物の残りから除去した。このカラムは、HEPES緩
衝液で予備平衡し、展開した。タンパク質を含有するフ
ラクション（30ml）を集めて、得られたタンパク質濃縮
物は、31kD、12kDおよび18.5kD FBDタンパク質に対し
て、夫々、0.35mg/ml、0.8mg/mlおよび0.9mg/mlであっ
た。シリカケゲル上でのTLC（85％メタノールで展開し
た）により決定した変性度は、上述のFBDタンパク質に
対して、1.1、0.8および1.6であることがわかった。DTP
A変性FBDタンパク質は、−20℃で凍結して保存し、その
一部を溶解し、111Inによる放射線標識に再生成可能な
結果物として提供した。
2.3 放射線標識:125μｌの1Mクエン酸ナトリウム（p
H5.7）を、無担体111InCl3貯蔵溶液（111In:3.2mCi/m
l）500μｌに添加することにより0.2Mクエン酸ナトリウ
ム（pH5.7）にした111InCl3を用いて標識を行った。標
識された反応溶液は、FBDタンパク質0.2μg/μｌ、HEPE
S60mM、HCl 10mM、クエン酸ナトリウム0.2Mおよび111I
n0.8mCi/ml（最終濃度）を含んでいた。反応は、室温で
１時間続けさせた。放射線化学的純度を、シキカゲル上
のTLC（85％メタノールで展開）により分析し、全てのF
BDのポリペプチドフラグメントについて、この純度は91
％〜95％の範囲内であった。すなわち、標識されたFBD
タンパク質の放射能は、約3.6μCi/μｇ（~8x106cpm/μ
ｇ）であった。標識の間使用した緩衝液中に少量の混入
物として潜在的に存在する重金属イオンが、DTPA変性FB
Dタンパク質に結合した111Inを置換できた。放射線標識
されたPBDタンパク質は、キレックス−100により予め処
理された（金属イオン混入物を除去するため）BSA含有B
BS緩衝液により、予備平衡及び展開されたセファデック
スＧ−2510mlのベッドを通過した。
3.生物学的活性 生物学的活性を、インビトロで、111Inで標識されたD
TPA変性FBDを予め形成した血餅に結合させて、並びに、
インビボで、ラットのスチールコイルを挿入した静脈血
栓モデルにおいて試験した。
3.1 予め形成した血餅への結合 この試験は、ヨウ素化したFBDのための例６に記載し
たとおりに正確に行った。３つの111Inで標識されたDTP
A変性FBDタンパク質の放射能は、6x106cpm/μｇであっ
た。この実験の結果は、表Ｆ（第２欄）に示す。
3.2 ラットの静脈血栓 使用したモデル（ラット中のコイル挿入静脈血栓）は
例７に記載している。本例の実験では、各群は、７匹の
ラットからなり、各群に、111Inで標識されたDTPA変性F
BDタンパク質5x106cpm（6x106cpm/μｇタンパク質の放
射能を有する）を注射した。実験の結果を、表Ｆ（最後
の第３欄）に示す。
参照文献 1. Uehara,A.,et al.,J.Nuclear Med.29:1264−1267
（1988）． 2. Zoghbi,S.S.,et al.,Invest.Radio.20:198−202（1
985）． 3. Kakkar,V.V.,et al.,Lancet １:540−542（197
0）． 4. Knight,L.C.,Nuclear Med.Commun.９:849−857（19
88）． 5. Knight,L.C.,Nuclear Med.Commun,９:823−829（19
88）． 6. Som.P.,et al.,J.Nuc.Med.27:1315−1320（−198
6）． 7. Palabrica,T.M.,et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 8
6:1036−40（1989）． 8. Akiyama,S.K.and Yamada,K.M.,Adv.Enzymol.57:1−
57（1987）． 9. Pierschbacher,M.D.,et al.,J.Biol,Chem.257:9593
−9597（1982）． 10. Pande,H.and Shively,J.E.,Arch.Biochem.Biophy
s.213:258−265（1982）． 11. Hayashi,M.and Yamada,K.M.,J.Biol.Chem.258:333
2−3340（1983）． 12. Sekiguchi,K.and Hakomori,S.−I.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 77:2661−2665（1980）． 13. Ruoslahti,E.,et al.,J.Biol,Chem.256:7277−728
1（1981）． 14. Owens,R.J.and Baralle,F.E.,EMBO J.５:2825−28
30（1988）． 15. Obara,M.,et al.,FEBS Letters 213:261−264（−
1987）． 16. Obara,M.,et al.,Cell 53:699（1988）． 17. Ichihara−Tanaka,K.,et al.,J.Biol.Chem.265:40
1−407（1990）． 18. Mandel,et al.,Principal and Practice of Infec
tious Disease ２:1531−1552（1979）． 19. Proctor,R.A.,et al.,J.Biol,Chem.255:1181−118
8（1980）． 20. Eldor,A.,et al.,Thrombosis and Haemostatis 56
（３）:333−339（1986）． 21. Fritzberg,A.R.,Nucl.Med.26:7−12（1987）． 22. Young,R.A.and Davis,R.W.,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 80:1194−1198（1983）． 23. Hugh,T.,et al.,In DNA Cloning:A Practical App
roach（D.Glover,ed.）,IRL Press,Oxford（1984）． 24. Vogel,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69:3180−
3184（1972）． 25. Bagly,D.,et al.,Methods in Enzymol.45:669−67
8（1976）． 26. Wagner and Hynes,J.Biol.Chem.254:6746−6754
（1979）． 27. McDonagh,R.P.,et al.,FEBS Lett.127:174−178
（1981）． 28. Mosher,et al.,J.Biol.Chem.255:1181−1188（198
0）． 29. Russel,P.B.,et al.,J.Clin.Micro.25:1083−1087
（1987）． 30. Bolton,A.E.and Hunter,W.M.,Biochem.J.133:529
（1973）． 31. Obara,et al.,Cell 53:649−657（1988）． 32. Fritzberg,A.R.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.85:4
025−4029（1988）． 33. Knight,L.C.,et al.,Radiology 173:163−169（−
1989）． 34. Wasser,M.N.J.M.,et al.,Blood 74:708−714（−1
989）． 35. Burger,J.J.,et al.,Methods in Enzymology 112:
43−56（1985）． 36. Yamamoto,K.,et al.,Eur.J.Nucl.Med.14:60−64
（1988）． 37. Peterson,et al.,in Fibronectin,edited by Mosh
en,Academic Press,USA,1989:page 1−24,particularly
Figure 2 on page 5.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６８３２８ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６８６０５ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６８６０６ (72)発明者 ウエルベル、モシェ イスラエル国、テル・アビブ、ブルラ・ ストリート 36 (72)発明者 ガイ、ラチェル イスラエル国、レホボト、ミラー・スト リート 23 (72)発明者 パネト、アモス イスラエル国、エルサレム、ハラブ・シ ュリム・ストリート 11 (72)発明者 ハートマン、ジャコブ イスラエル国、ホロン、ケドシェイ・カ ヒア・ストリート 30 (72)発明者 シャケド、ハダッサ イスラエル国、ラマト・ガン、ティル ザ・ストリート ３ (56)参考文献 特開 昭62−89699（ＪＰ，Ａ) 特表 平２−500803（ＪＰ，Ａ) 特表 昭63−502957（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−505698（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．29 （1988），Ｎｏ．７，ｐ．1264−1267 ＥＭＢＯ Ｊ．，Ｖｏｌ．４ （1985），Ｎｏ．７，ｐ．1755−1759 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．231 （1987），Ｎｏ．２，ｐ．261−264 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 260（1985），Ｎｏ．24，ｐ．946−952 Ｂｌｏｏｄ．Ｖｏｌ．66（1985），Ｎ ｏ．４．ｐ．946−952 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 A61K 49/00 C07K 14/00 C07K 7/00 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (18)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】画像化可能な標識でラベルされたポリペプ
    チドを含有する画像化剤であって、該ポリペプチドは天
    然に存在するヒト・フィブロネクチンのＮ末端フィブリ
    ン結合性ドメインに存在するアミノ酸配列を有し、フィ
    ブリンに結合することができ、6kDより大きく且つ20kD
    より小さい分子量を有し、Ｎ末端にgln−ala−gln−gln
    またはmet−gln−ala−gln−glnのアミノ酸配列を有す
    る画像化剤。
  2. 【請求項２】請求項１に記載の画像化剤であって、前記
    ポリペプチドが12kD以上の分子量、または18.5kD以下の
    分子量を有する画像化剤。
  3. 【請求項３】請求項１または２に記載の画像化剤であっ
    て、前記標識が放射性アイソトープ、Ｘ線を透過しない
    元素、もしくは強磁性体イオンであり、または前記標識
    が、好ましくはインジウム−111、テクネチウム−99m、
    ヨウ素−123、ヨウ素−125、ヨウ素−131、クリプトン
    −81m、キセノン−133およびガリウム−67からなる群か
    ら選択される放射性アイソトープである画像化剤。
  4. 【請求項４】請求項１または２に記載の画像化剤であっ
    て、前記ポリペプチドが12kDのポリペプチドまたは18.5
    kDのポリペプチドであり、そのヒト・フィブロネクチン
    のＮ末端フィブリン結合性ドメインに存在するアミノ酸
    配列が、それぞれ図２に示したアミノ酸１−109または
    １−154の配列である画像化剤。
  5. 【請求項５】フィブリン含有物質を画像化するための方
    法であって、画像化すべきフィブリン含有物質と請求項
    １〜４の何れか１項に記載の画像化剤とを、該画像化剤
    が前記フィブリン含有物質に結合するような条件下で接
    触させ、前記フィブリン含有物質に結合した前記画像化
    剤を画像化することにより、前記フィブリン含有物質を
    画像化することを含む方法。
  6. 【請求項６】天然に存在するヒト・フィブロネクチンの
    Ｎ末端フィブリン結合性ドメインに存在するアミノ酸配
    列を有し、フィブリンに結合でき、6kDよりも大きく且
    つ20kDよりも小さい分子量を有し、Ｎ末端にgln−ala−
    gln−glnまたはmet−gln−ala−gln−glnのアミノ酸配
    列を有するポリペプチドを発現するためのプラスミドで
    あって、前記ポリペプチドをコードするDNAと、該ポリ
    ペプチドを適切なホスト細胞中で発現させるように、前
    記ポリペプチドをコードするDNAに対して相対的に位置
    付けられた適切な調節要素をコードするDNAとを具備す
    るプラスミド。
  7. 【請求項７】請求項６に記載のプラスミドであって、前
    記ポリペプチドがヒト・フィブロネクチンのＮ末端フィ
    ブリン結合性ドメインに存在するアミノ酸配列に対応し
    た12kDまたは18.5kDのポリペプチドであるプラスミド。
  8. 【請求項８】請求項７に記載のプラスミドであって、該
    プラスミドがpFN949−２と命名され、Escherichia coli
    株A1645中に導入された形でATCC受付番号67831の下に寄
    託されたプラスミド;pFN196−２と命名され、Escherich
    ia coli株A4255中に導入された形でATCC受付番号68328
    の下に寄託されたプラスミド；またはpFN203−２と命名
    され、且つEscherichia coli株A4255中に導入された形
    でATCC受付番号68606の下に寄託されたプラスミドであ
    るプラスミド。
  9. 【請求項９】請求項６〜８の何れか１項に記載のプラス
    ミドを具備する細胞。
  10. 【請求項１０】請求項９に記載のEscherichia coli細胞
    であって、前記プラスミドがpFN949−２と命名されたも
    のであり、また該細胞はATCC受付番号67831の下に寄託
    された細胞；またはpFN196−２と命名されたものであ
    り、また該細胞はATCC受付番号68328の下に寄託された
    細胞である細胞。
  11. 【請求項１１】天然に存在するヒト・フィブロネクチン
    のフィブリン結合性ドメインに存在するアミノ酸配列を
    有し、且つフィブリンに結合することができるポリペプ
    チドの製造方法であって、請求項９または10に記載の細
    胞を、該細胞に含まれる請求項６〜８に記載のプラスミ
    ドの前記DNAが、前記ポリペプチドの発現を指令し且つ
    該細胞が前記ポリペプチドを発現するように処理するこ
    とと、こうして発現された前記ポリペプチドを前記細胞
    から回収することとを具備した方法。
  12. 【請求項１２】天然に存在するヒト・フィブロネクチン
    のフィブリン結合性ドメインに存在するアミノ酸配列に
    対応した12kDまたは18.5kDのポリペプチドフラグメント
    の製造方法であって、請求項６〜８項の何れか１項に記
    載のプラスミドを具備したEscherichia coli細胞を、そ
    の前記DNAが前記ポリペプチドの発現を指令し且つ該細
    胞が前記ポリペプチドを発現するように処理すること
    と、こうして発現された前記ポリペプチドを前記細胞か
    ら回収することとを具備した方法。
  13. 【請求項１３】ヒト起源の他の物質を実質的に含まない
    精製されたポリペプチドであって、天然に存在するヒト
    ・フィブロネクチンのアミノ末端のフィブリン結合性ド
    メインに存在するアミノ酸配列を有し、且つフィブリン
    に結合することができるポリペプチドであって、6kDを
    超え、20kD未満の分子量を有し、また該ポリペプチドの
    Ｎ末端にgln−ala−gln−glnまたはmet−gln−ala−gln
    −glnのアミノ酸配列を有するポリペプチド。
  14. 【請求項１４】請求項13に記載のポリペプチドであっ
    て、該ポリペプチドは、12kDポリペプチドまたは18.5kD
    ポリペプチドであり、それぞれ図２に示したアミノ酸１
    −109または１−154のアミノ酸配列を有し、また該ポリ
    ペプチドのＮ末端にgln−ala−gln−glnまたはmet−gln
    −ala−gln−glnのアミノ酸配列を有するポリペプチ
    ド。
  15. 【請求項１５】請求項13または14に記載のポリペプチド
    を再折畳みする方法であって、前記ポリペプチドをチオ
    ール含有化合物およびジスルフィドと接触させて、前記
    ポリペプチドを再折畳みおよび再酸化することを含む方
    法。
  16. 【請求項１６】請求項13または14に記載の精製された生
    物学的に活性なポリペプチドを回収する方法であって、 （ａ）バクテリア細胞内において、前記ポリペプチドを
    コードするDNAを含んだプラスミドの発現により、前記
    ポリペプチドのアミノ酸配列を有し、且つジスルフィド
    結合を欠失した第一のポリペプチドを産生させること
    と、 （ｂ）前記細胞を破壊して、前記第一のポリペプチドを
    含有する溶解産物（lysate）を製造することと、 （ｃ）該溶解産物を遠心分離して、前記第一のポリペプ
    チドを濃縮することと、 （ｄ）こうして濃縮された第一のポリペプチドを分離す
    ることと、 （ｅ）この濃縮され、分離された第一のポリペプチドを
    可溶化することと、 （ｆ）該可溶化された第一のポリペプチドの再折畳み及
    び再酸化を行ない、生物学的に活性なポリペプチドを形
    成することと、 （ｇ）この再折畳み及び再酸化された生物学的に活性な
    ポリペプチドを分離することと、 （ｈ）精製された、再折畳み及び再酸化された生物学的
    に活性なポリペプチドを回収することと、 （ｉ）こうして回収された生物学的に活性なポリペプチ
    ドを精製することとを具備した方法。
  17. 【請求項１７】血栓形成を防止するための薬学的組成物
    であって、血栓形成を阻害するために有効な量の請求項
    13または14に記載のポリペプチドを含有する組成物。
  18. 【請求項１８】請求項17に記載の薬学的組成物であっ
    て、前記ポリペプチドは血栓溶解剤に結合しており、前
    記血栓溶解剤は組織プラスミノーゲン活性化剤（TP
    A）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、プロウロキ
    ナーゼ、アニソイル化プラスミノーゲン−ストレプトキ
    ナーゼ活性化剤複合体（エミナーゼTM）、TPA類似体お
    よびプロテアーゼからなる群から選択される組成物。
JP51119791A 1990-05-21 1991-05-21 フィブリン結合ドメインポリペプチド及びその使用，並びにその製造方法 Expired - Lifetime JP3419772B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/526,397 US5270030A (en) 1988-12-29 1990-05-21 Fibrin binding domain polypeptide and method of producing
US526,397 1990-05-21
PCT/US1991/003584 WO1991017765A1 (en) 1990-05-21 1991-05-21 Fibrin binding domain polypeptides and uses and methods of producing same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH05508766A JPH05508766A (ja) 1993-12-09
JP3419772B2 true JP3419772B2 (ja) 2003-06-23

Family

ID=24097174

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP51119791A Expired - Lifetime JP3419772B2 (ja) 1990-05-21 1991-05-21 フィブリン結合ドメインポリペプチド及びその使用，並びにその製造方法

Country Status (18)

Country Link
US (4) US5270030A (ja)
EP (1) EP0651799B1 (ja)
JP (1) JP3419772B2 (ja)
AT (1) ATE183545T1 (ja)
AU (1) AU660618B2 (ja)
CA (1) CA2083271C (ja)
DE (1) DE69131539T2 (ja)
DK (1) DK0651799T3 (ja)
ES (1) ES2137928T3 (ja)
FI (1) FI108298B (ja)
GR (1) GR3031708T3 (ja)
HK (1) HK1013255A1 (ja)
HU (1) HU216302B (ja)
IL (1) IL98197A0 (ja)
NO (1) NO310559B1 (ja)
NZ (1) NZ238208A (ja)
RU (1) RU2109750C1 (ja)
WO (1) WO1991017765A1 (ja)

Families Citing this family (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5972890A (en) * 1988-05-02 1999-10-26 New England Deaconess Hospital Corporation Synthetic peptides for arterial imaging
US7087722B1 (en) * 1988-12-29 2006-08-08 Savient Pharmaceuticals, Inc. Fibrin binding domain polypeptides and uses and methods of producing same
US5270030A (en) * 1988-12-29 1993-12-14 Bio-Technology General Corp. Fibrin binding domain polypeptide and method of producing
US5679320A (en) * 1988-12-29 1997-10-21 Bio-Technology General Corp. Fibrin binding domain polypeptides and uses and methods of producing same
US6034233A (en) * 1990-05-04 2000-03-07 Isis Pharmaceuticals Inc. 2'-O-alkylated oligoribonucleotides and phosphorothioate analogs complementary to portions of the HIV genome
US5792742A (en) * 1991-06-14 1998-08-11 New York University Fibrin-binding peptide fragments of fibronectin
WO1993020228A1 (en) * 1992-03-31 1993-10-14 Toray Industries, Inc. Novel, physiologically active protein and hemopoietic stem cell growth promoter
US5968476A (en) * 1992-05-21 1999-10-19 Diatide, Inc. Technetium-99m labeled peptides for thrombus imaging
DK145092D0 (ja) * 1992-12-03 1992-12-03 Novo Nordisk As
US5750088A (en) 1993-03-30 1998-05-12 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Stable hydrazones linked to a peptide moiety as reagents for the preparation of radiopharmaceuticals
US5879657A (en) * 1993-03-30 1999-03-09 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Radiolabeled platelet GPIIb/IIIa receptor antagonists as imaging agents for the diagnosis of thromboembolic disorders
US6218529B1 (en) * 1995-07-31 2001-04-17 Urocor, Inc. Biomarkers and targets for diagnosis, prognosis and management of prostate, breast and bladder cancer
DE69734601T2 (de) * 1996-05-16 2006-08-03 The Texas A & M University System, College Station Zusammensetzung von kollagenbindungsprotein und verfahren zu deren verwendungen
US20030176663A1 (en) * 1998-05-11 2003-09-18 Eidgenossische Technische Hochscule Specific binding molecules for scintigraphy
RU2205186C2 (ru) * 1998-05-15 2003-05-27 Амершам Плк Меченые аналоги глутамина и лизина
IN190822B (ja) 1998-12-24 2003-08-23 Council Scient Ind Res
US6808698B1 (en) 1999-03-26 2004-10-26 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Method for localization of blood clots
US6426145B1 (en) 1999-05-20 2002-07-30 Scimed Life Systems, Inc. Radiopaque compositions for visualization of medical devices
US6254852B1 (en) 1999-07-16 2001-07-03 Dupont Pharmaceuticals Company Porous inorganic targeted ultrasound contrast agents
US6685914B1 (en) * 1999-09-13 2004-02-03 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Macrocyclic chelants for metallopharmaceuticals
EP1259548A1 (en) * 2000-02-24 2002-11-27 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich Antibody specific for the ed-b domain of fibronectin, conjugates comprising said antibody, and their use for the detection and treatment of angiogenesis
AU1218202A (en) * 2000-09-07 2002-03-22 Schering Ag Receptor in the ED<sub>b</sub> fibronectin domain
WO2002028267A2 (en) * 2000-10-03 2002-04-11 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Method for detecting and excising nonpalpable lesions
US20040121314A1 (en) * 2002-12-06 2004-06-24 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bioagents in containers
US20030027135A1 (en) 2001-03-02 2003-02-06 Ecker David J. Method for rapid detection and identification of bioagents
US7666588B2 (en) 2001-03-02 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy
US7226739B2 (en) 2001-03-02 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations
US20040121335A1 (en) 2002-12-06 2004-06-24 Ecker David J. Methods for rapid detection and identification of bioagents associated with host versus graft and graft versus host rejections
WO2002074324A1 (en) * 2001-03-15 2002-09-26 The Texas A & M University System Collagen-binding adhesin from staphylococcus epidermidis and method of use
US7217510B2 (en) * 2001-06-26 2007-05-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for providing bacterial bioagent characterizing information
US8073627B2 (en) 2001-06-26 2011-12-06 Ibis Biosciences, Inc. System for indentification of pathogens
US20030224476A1 (en) * 2002-03-01 2003-12-04 Szu-Yi Chou Method of producing transglutaminase reactive compound
EP1578399A4 (en) * 2002-12-06 2007-11-28 Isis Pharmaceuticals Inc METHODS FOR RAPID IDENTIFICATION OF PATHOGENS IN HUMANS AND BEETS
US8046171B2 (en) 2003-04-18 2011-10-25 Ibis Biosciences, Inc. Methods and apparatus for genetic evaluation
US8057993B2 (en) 2003-04-26 2011-11-15 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of coronaviruses
US7964343B2 (en) 2003-05-13 2011-06-21 Ibis Biosciences, Inc. Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US8158354B2 (en) 2003-05-13 2012-04-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture
US7317104B2 (en) 2003-06-13 2008-01-08 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Chelants and macrocyclic metal complex radiopharmaceuticals thereof
US7319149B2 (en) * 2003-06-13 2008-01-15 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Chelants and macrocyclic metal complex radiopharmaceuticals thereof
US8242254B2 (en) 2003-09-11 2012-08-14 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of bacteria
US8097416B2 (en) 2003-09-11 2012-01-17 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US8546082B2 (en) 2003-09-11 2013-10-01 Ibis Biosciences, Inc. Methods for identification of sepsis-causing bacteria
US8163895B2 (en) 2003-12-05 2012-04-24 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of orthopoxviruses
EP1758998B1 (en) 2004-01-30 2010-12-15 Quark Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides and methods of use thereof for treatment of fibrotic conditions and other diseases
US7666592B2 (en) 2004-02-18 2010-02-23 Ibis Biosciences, Inc. Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent
US8119336B2 (en) 2004-03-03 2012-02-21 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of alphaviruses
WO2005117270A2 (en) 2004-05-24 2005-12-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Mass spectrometry with selective ion filtration by digital thresholding
US20050266411A1 (en) 2004-05-25 2005-12-01 Hofstadler Steven A Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA
US7811753B2 (en) 2004-07-14 2010-10-12 Ibis Biosciences, Inc. Methods for repairing degraded DNA
CN101123994B (zh) 2004-08-16 2012-11-14 夸克医药公司 Rtp801的抑制剂的治疗性用途
MX2007003795A (es) 2004-09-28 2007-07-11 Quark Biotech Inc Oligoribonucleotidos y metodos de uso de los mismos para tratamiento de la alopecia, insuficiencia renal aguda y otras enfermedades.
US20060205040A1 (en) 2005-03-03 2006-09-14 Rangarajan Sampath Compositions for use in identification of adventitious viruses
US8084207B2 (en) 2005-03-03 2011-12-27 Ibis Bioscience, Inc. Compositions for use in identification of papillomavirus
EP1891244B1 (en) * 2005-04-13 2010-10-06 Ibis Biosciences, Inc. Compositions for use in identification of adenoviruses
US7414254B2 (en) * 2005-06-28 2008-08-19 United Pharmacy Partners, Inc. Tungsten pig for radio-pharmaceuticals
CA2616281C (en) 2005-07-21 2014-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapid identification and quantitation of mitochondrial dna variants
NL2000439C2 (nl) 2006-01-20 2009-03-16 Quark Biotech Therapeutische toepassingen van inhibitoren van RTP801.
US9149473B2 (en) 2006-09-14 2015-10-06 Ibis Biosciences, Inc. Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens
JP2010507387A (ja) 2006-10-25 2010-03-11 クアーク・ファーマスーティカルス、インコーポレイテッド 新規のｓｉＲＮＡおよびその使用方法
US8871471B2 (en) 2007-02-23 2014-10-28 Ibis Biosciences, Inc. Methods for rapid forensic DNA analysis
WO2008151023A2 (en) 2007-06-01 2008-12-11 Ibis Biosciences, Inc. Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids
CN101815521B (zh) 2007-10-03 2014-12-10 夸克制药公司 新siRNA结构
US8253725B2 (en) * 2007-12-28 2012-08-28 St. Jude Medical, Atrial Fibrillation Division, Inc. Method and system for generating surface models of geometric structures
WO2009147684A2 (en) 2008-06-06 2009-12-10 Quark Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of ear disorders
WO2010033625A1 (en) 2008-09-16 2010-03-25 Ibis Biosciences, Inc. Microplate handling systems and related computer program products and methods
WO2010033599A2 (en) 2008-09-16 2010-03-25 Ibis Biosciences, Inc. Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, systems, and methods
US8148163B2 (en) 2008-09-16 2012-04-03 Ibis Biosciences, Inc. Sample processing units, systems, and related methods
US8864821B2 (en) * 2008-11-26 2014-10-21 Visen Medical, Inc. Methods and compositions for identifying subjects at risk of developing stent thrombosis
WO2010080452A2 (en) 2008-12-18 2010-07-15 Quark Pharmaceuticals, Inc. siRNA COMPOUNDS AND METHODS OF USE THEREOF
WO2010093943A1 (en) 2009-02-12 2010-08-19 Ibis Biosciences, Inc. Ionization probe assemblies
GB0905328D0 (en) * 2009-03-27 2009-05-13 Ge Healthcare Ltd Indole derivatives
WO2011008971A1 (en) 2009-07-17 2011-01-20 Ibis Biosciences, Inc. Lift and mount apparatus
EP2454000A4 (en) 2009-07-17 2016-08-10 Ibis Biosciences Inc SYSTEMS FOR IDENTIFYING BIOLOGICAL SUBSTANCES
EP2488656B1 (en) 2009-10-15 2015-06-03 Ibis Biosciences, Inc. Multiple displacement amplification
TW201124160A (en) 2009-11-26 2011-07-16 Quark Pharmaceuticals Inc SiRNA compounds comprising terminal substitutions
EP2862929B1 (en) 2009-12-09 2017-09-06 Quark Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating diseases, disorders or injury of the CNS
WO2011084193A1 (en) 2010-01-07 2011-07-14 Quark Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compounds comprising non-nucleotide overhangs
US9045755B2 (en) 2010-06-24 2015-06-02 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double stranded RNA compounds to RhoA and use thereof
US20130324591A1 (en) 2010-12-06 2013-12-05 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double stranded oligonucleotide compounds comprising positional modifications
JP6132775B2 (ja) 2011-03-03 2017-05-24 クォーク ファーマシューティカルズ インコーポレーティッドＱｕａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． Ｔｏｌｌ様受容体経路のオリゴヌクレオチド修飾因子
US9796979B2 (en) 2011-03-03 2017-10-24 Quark Pharmaceuticals Inc. Oligonucleotide modulators of the toll-like receptor pathway
SG11201401648RA (en) 2011-11-03 2014-05-29 Quark Pharmaceuticals Inc Methods and compositions for neuroprotection
US20140323549A1 (en) 2011-11-08 2014-10-30 Quark Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating diseases, disorders or injury of the nervous system
CN104080912A (zh) 2012-01-12 2014-10-01 夸克制药公司 用于治疗听力和平衡障碍的组合疗法
US9611473B2 (en) 2012-09-12 2017-04-04 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded nucleic acid compounds
JP6364009B2 (ja) 2012-09-12 2018-07-25 クォーク ファーマシューティカルズ インコーポレーティッドＱｕａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． Ｐ５３に対する二本鎖オリゴヌクレオチド分子、およびその使用方法
EP2895608B1 (en) 2012-09-12 2018-12-05 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded oligonucleotide molecules to p53 and methods of use thereof
WO2015015498A1 (en) 2013-07-31 2015-02-05 Qbi Enterprises Ltd. Methods of use of sphingolipid polyalkylamine oligonucleotide compounds
CN105452465B (zh) 2013-07-31 2019-06-21 奇比艾企业有限公司 鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物
WO2016054079A1 (en) 2014-09-29 2016-04-07 Zyomed Corp. Systems and methods for blood glucose and other analyte detection and measurement using collision computing
US9554738B1 (en) 2016-03-30 2017-01-31 Zyomed Corp. Spectroscopic tomography systems and methods for noninvasive detection and measurement of analytes using collision computing
EP3671511B1 (en) 2018-12-19 2022-07-06 Rohde & Schwarz GmbH & Co. KG Communication system and method
EP3922720A1 (en) 2020-06-09 2021-12-15 Universidad de Murcia Therapy to prevent adverse cardiac remodeling following an acute myocardial infarction
ES2894201B2 (es) * 2020-08-05 2022-09-29 Fundacion Para La Investig Biomedica Del Hospital Gregorio Maranon Compuestos radioactivos basados en proteinas selectivas de bacterias para la deteccion no invasiva de focos infecciosos

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4315906A (en) * 1979-05-21 1982-02-16 New England Nuclear Corporation Cold insoluble globulin, its purification and use
US4455290A (en) * 1981-04-02 1984-06-19 Research Corporation Inhibition of fibrin polymerization by a peptide isolated from fibrin Fragment D1
US4663146A (en) * 1983-07-29 1987-05-05 Codon Genetic Engineering Laboratories Methods and compositions for the diagnosis of bloodclots using plasminogen activator
US4587122A (en) * 1985-04-23 1986-05-06 The Green Cross Corporation Fibronectin-dextran-drug complex and method of preparation thereof
GB8516421D0 (en) * 1985-06-28 1985-07-31 Biotechnology Interface Ltd Fibronectins
US4734362A (en) * 1986-02-03 1988-03-29 Cambridge Bioscience Corporation Process for purifying recombinant proteins, and products thereof
WO1989000051A1 (en) * 1987-07-07 1989-01-12 Cytrx Biopool Ltd. Fibrin-binding compound and method
US4839464A (en) * 1987-08-25 1989-06-13 Regents Of The University Of Minnesota Polypeptides with fibronectin activity
JP2561122B2 (ja) * 1988-04-13 1996-12-04 寳酒造株式会社 機能性ポリペプチド
JP2561131B2 (ja) * 1988-06-30 1996-12-04 寳酒造株式会社 細胞接着活性ポリペプチド
JP3095771B2 (ja) * 1988-12-29 2000-10-10 バイオ―テクノロジー・ジエネラル・コーポレイシヨン ヒトフィブロネクチンポリペプチド類似体のクローニング及び製造並びにこのようなポリペプチド類似体の使用法
US5270030A (en) * 1988-12-29 1993-12-14 Bio-Technology General Corp. Fibrin binding domain polypeptide and method of producing
US5026537A (en) * 1989-04-06 1991-06-25 Centocor, Inc. Methods for imaging atherosclerotic plaque

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｂｌｏｏｄ．Ｖｏｌ．６６（１９８５），Ｎｏ．４．ｐ．９４６−９５２
ＥＭＢＯ Ｊ．，Ｖｏｌ．４（１９８５），Ｎｏ．７，ｐ．１７５５−１７５９
ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．２３１（１９８７），Ｎｏ．２，ｐ．２６１−２６４
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２６０（１９８５），Ｎｏ．２４，ｐ．９４６−９５２
Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．２９（１９８８），Ｎｏ．７，ｐ．１２６４−１２６７

Also Published As

Publication number Publication date
RU2109750C1 (ru) 1998-04-27
FI925296A (fi) 1992-11-20
EP0651799B1 (en) 1999-08-18
NO924405L (no) 1993-01-13
JPH05508766A (ja) 1993-12-09
AU8076091A (en) 1991-12-10
ATE183545T1 (de) 1999-09-15
DK0651799T3 (da) 2000-03-06
WO1991017765A1 (en) 1991-11-28
CA2083271C (en) 2002-04-09
CA2083271A1 (en) 1991-11-22
HU9203516D0 (en) 1993-04-28
HUT66189A (en) 1994-10-28
EP0651799A1 (en) 1995-05-10
IL98197A0 (en) 1992-06-21
FI925296A0 (fi) 1992-11-20
FI108298B (fi) 2001-12-31
US5455158A (en) 1995-10-03
AU660618B2 (en) 1995-07-06
US5965383A (en) 1999-10-12
US5270030A (en) 1993-12-14
US6121426A (en) 2000-09-19
DE69131539D1 (de) 1999-09-23
ES2137928T3 (es) 2000-01-01
HU216302B (hu) 1999-06-28
NO924405D0 (no) 1992-11-13
NZ238208A (en) 1993-01-27
DE69131539T2 (de) 2000-05-04
NO310559B1 (no) 2001-07-23
HK1013255A1 (en) 1999-08-20
GR3031708T3 (en) 2000-02-29
EP0651799A4 (en) 1993-10-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3419772B2 (ja) フィブリン結合ドメインポリペプチド及びその使用，並びにその製造方法
US4427646A (en) Use of radiolabeled peptide derived from crosslinked fibrin to locate thrombi in vivo
JP2801236B2 (ja) フィブリン結合性蛋白質を用いる血餅の診断方法
US4916070A (en) Fibrin-specific antibodies and method of screening for the antibodies
KR102574537B1 (ko) 인간화된 안티 칼리크레인-2 항체
US5371184A (en) Radiolabelled peptide compounds
MX2010010759A (es) Mutantes de estreptocinasa y sus formas covalentemente modificadas.
JP3991086B2 (ja) 造影剤として有用なフィブリン結合部分
JPS61239889A (ja) 物質の部位−特異的活性化方法及びその用途
US5679320A (en) Fibrin binding domain polypeptides and uses and methods of producing same
US5237050A (en) Bacterial plasmin receptors as fibrinolytic agents
US5474766A (en) Methods and compositions for inhibition of hepatic clearance of tissue-type plasminogen activator
Holvoet et al. Binding properties of monoclonal antibodies against human fragment D-dimer of cross-linked fibrin to human plasma clots in an in vivo model in rabbits
WO1989012680A1 (en) USE OF MODIFIED tPA TO DETECT BLOOD CLOTS
US7087722B1 (en) Fibrin binding domain polypeptides and uses and methods of producing same
JP2002516296A (ja) 凝塊形成を阻害する方法
WO1991017775A1 (en) 99mTcN3S-CONJUGATED ANTI-FIBRIN MONOCLONAL ANTIBODY AS AN IN VIVO DIAGNOSTIC AGENT FOR IMAGING
JP3095771B2 (ja) ヒトフィブロネクチンポリペプチド類似体のクローニング及び製造並びにこのようなポリペプチド類似体の使用法
US5165912A (en) Method for the detection of fibrinolytic activity
KR100219115B1 (ko) 피브린 결합 도메인 폴리펩티드, 그의 용도 및 그의 제조방법
Ezov et al. Recombinant polypeptides derived from the fibrin binding domain of fibronectin are potential agents for the imaging of blood clots
WO1992013557A1 (en) Stabilized antibody fragments
JPS63267734A (ja) 腫瘍および炎症用診断薬
McAfee et al. Monoclonal antibody against human fibrin for imaging thrombi
Wasser Detection of thrombi using a Tc-99m labelled antifibrin monoclonal antibody (MoAb)

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080418

Year of fee payment: 5

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090418

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100418

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100418

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110418

Year of fee payment: 8

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110418

Year of fee payment: 8

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120418

Year of fee payment: 9

EXPY Cancellation because of completion of term
FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120418

Year of fee payment: 9