RU2109750C1 - Визуализирующий агент и способ обнаружения материала, содержащего фибрин - Google Patents
Визуализирующий агент и способ обнаружения материала, содержащего фибрин Download PDFInfo
- Publication number
- RU2109750C1 RU2109750C1 RU92016360/13A RU92016360A RU2109750C1 RU 2109750 C1 RU2109750 C1 RU 2109750C1 RU 92016360/13 A RU92016360/13 A RU 92016360/13A RU 92016360 A RU92016360 A RU 92016360A RU 2109750 C1 RU2109750 C1 RU 2109750C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fbd
- polypeptide
- polypeptides
- fibrin
- plasmid
- Prior art date
Links
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 title claims abstract description 58
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 57
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 title claims abstract description 56
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 title claims abstract description 56
- 239000000463 material Substances 0.000 title claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 54
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 227
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 227
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 227
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims abstract description 79
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 74
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 claims abstract description 49
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 28
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 11
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 10
- 238000012800 visualization Methods 0.000 claims description 6
- GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N Technetium-99 Chemical group [99Tc] GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N 0.000 claims description 4
- 229940056501 technetium 99m Drugs 0.000 claims description 4
- PNDPGZBMCMUPRI-HVTJNCQCSA-N 10043-66-0 Chemical compound [131I][131I] PNDPGZBMCMUPRI-HVTJNCQCSA-N 0.000 claims description 3
- ZCYVEMRRCGMTRW-AHCXROLUSA-N Iodine-123 Chemical group [123I] ZCYVEMRRCGMTRW-AHCXROLUSA-N 0.000 claims description 3
- FHNFHKCVQCLJFQ-NJFSPNSNSA-N Xenon-133 Chemical compound [133Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-NJFSPNSNSA-N 0.000 claims description 3
- 229940044173 iodine-125 Drugs 0.000 claims description 3
- 229940106670 xenon-133 Drugs 0.000 claims description 3
- GYHNNYVSQQEPJS-OIOBTWANSA-N Gallium-67 Chemical compound [67Ga] GYHNNYVSQQEPJS-OIOBTWANSA-N 0.000 claims description 2
- 229940006110 gallium-67 Drugs 0.000 claims description 2
- 229910052738 indium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N indium atom Chemical group [In] APFVFJFRJDLVQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- NNQHEEQNPQYPGL-FXQIFTODSA-N Gln-Ala-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O NNQHEEQNPQYPGL-FXQIFTODSA-N 0.000 claims 1
- YLLWCSDBVGZLOW-CIUDSAMLSA-N Met-Gln-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YLLWCSDBVGZLOW-CIUDSAMLSA-N 0.000 claims 1
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 claims 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-YPZZEJLDSA-N iodine-125 Chemical compound [125I] ZCYVEMRRCGMTRW-YPZZEJLDSA-N 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 17
- 230000003143 atherosclerotic effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 105
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 78
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 53
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 52
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 41
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 39
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 35
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 32
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 31
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 31
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 30
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 18
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 18
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 17
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 14
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 13
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 12
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 11
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 10
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 208000023697 ABri amyloidosis Diseases 0.000 description 9
- 201000000162 ITM2B-related cerebral amyloid angiopathy 1 Diseases 0.000 description 9
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 9
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 9
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 description 9
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 8
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 8
- UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N gamma-carboxy-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 8
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 7
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 7
- 239000012216 imaging agent Substances 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 239000012217 radiopharmaceutical Substances 0.000 description 7
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 6
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 6
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 6
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 6
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 6
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 6
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 5
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 5
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 4
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 4
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 4
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 4
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 4
- RAZLJUXJEOEYAM-UHFFFAOYSA-N 2-[bis[2-(2,6-dioxomorpholin-4-yl)ethyl]azaniumyl]acetate Chemical compound C1C(=O)OC(=O)CN1CCN(CC(=O)O)CCN1CC(=O)OC(=O)C1 RAZLJUXJEOEYAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 3
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 3
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000010405 reoxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 3
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 2
- 229910021617 Indium monochloride Inorganic materials 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- CSMFSDCPJHNZRY-UHFFFAOYSA-M decyl sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O CSMFSDCPJHNZRY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000002059 diagnostic imaging Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- APHGZSBLRQFRCA-UHFFFAOYSA-M indium(1+);chloride Chemical compound [In]Cl APHGZSBLRQFRCA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940055742 indium-111 Drugs 0.000 description 2
- APFVFJFRJDLVQX-AHCXROLUSA-N indium-111 Chemical compound [111In] APFVFJFRJDLVQX-AHCXROLUSA-N 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- XMBWDFGMSWQBCA-YPZZEJLDSA-N iodane Chemical compound [125IH] XMBWDFGMSWQBCA-YPZZEJLDSA-N 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- CSMFSDCPJHNZRY-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid monodecyl ester Natural products CCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O CSMFSDCPJHNZRY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000007039 two-step reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 5-[(1r)-1-hydroxy-2-[4-[(2r)-2-hydroxy-2-(4-methyl-1-oxo-3h-2-benzofuran-5-yl)ethyl]piperazin-1-yl]ethyl]-4-methyl-3h-2-benzofuran-1-one Chemical compound C1=C2C(=O)OCC2=C(C)C([C@@H](O)CN2CCN(CC2)C[C@H](O)C2=CC=C3C(=O)OCC3=C2C)=C1 OCKGFTQIICXDQW-ZEQRLZLVSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical group OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000583080 Bunodosoma granuliferum Delta-actitoxin-Bgr2a Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- UJKPHYRXOLRVJJ-MLSVHJFASA-N CC(O)C1=C(C)/C2=C/C3=N/C(=C\C4=C(CCC(O)=O)C(C)=C(N4)/C=C4\N=C(\C=C\1/N\2)C(C)=C4C(C)O)/C(CCC(O)=O)=C3C Chemical class CC(O)C1=C(C)/C2=C/C3=N/C(=C\C4=C(CCC(O)=O)C(C)=C(N4)/C=C4\N=C(\C=C\1/N\2)C(C)=C4C(C)O)/C(CCC(O)=O)=C3C UJKPHYRXOLRVJJ-MLSVHJFASA-N 0.000 description 1
- 108010092265 CCWGG-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101100191514 Caenorhabditis elegans pfn-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000004434 Calcinosis Diseases 0.000 description 1
- 101000666165 Cavia cutleri Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010038061 Chymotrypsinogen Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 229910052692 Dysprosium Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 229910052691 Erbium Inorganic materials 0.000 description 1
- 101900264058 Escherichia coli Beta-galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 229940090397 Factor XIII inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010000196 Factor XIIIa Proteins 0.000 description 1
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010036162 GATC-specific type II deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229910052688 Gadolinium Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229910052689 Holmium Inorganic materials 0.000 description 1
- 101001053641 Homo sapiens Plasma serine protease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N Manganese(2+) Chemical compound [Mn+2] WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N Nickel(2+) Chemical compound [Ni+2] VEQPNABPJHWNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 229910052777 Praseodymium Inorganic materials 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 1
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101150095510 TMEM35A gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052771 Terbium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- 229910052769 Ytterbium Inorganic materials 0.000 description 1
- LGDAGYXJBDILKZ-UHFFFAOYSA-N [2-methyl-1,1-dioxo-3-(pyridin-2-ylcarbamoyl)-1$l^{6},2-benzothiazin-4-yl] 2,2-dimethylpropanoate Chemical compound CC(C)(C)C(=O)OC=1C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)N(C)C=1C(=O)NC1=CC=CC=N1 LGDAGYXJBDILKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000029586 bacterial cell surface binding Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- BFGKITSFLPAWGI-UHFFFAOYSA-N chromium(3+) Chemical compound [Cr+3] BFGKITSFLPAWGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N cobalt(2+) Chemical compound [Co+2] XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 238000011961 computed axial tomography Methods 0.000 description 1
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- KBQHZAAAGSGFKK-UHFFFAOYSA-N dysprosium atom Chemical compound [Dy] KBQHZAAAGSGFKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UYAHIZSMUZPPFV-UHFFFAOYSA-N erbium Chemical compound [Er] UYAHIZSMUZPPFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000002594 fluoroscopy Methods 0.000 description 1
- UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N gadolinium atom Chemical compound [Gd] UIWYJDYFSGRHKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 210000003709 heart valve Anatomy 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012145 high-salt buffer Substances 0.000 description 1
- KJZYNXUDTRRSPN-UHFFFAOYSA-N holmium atom Chemical compound [Ho] KJZYNXUDTRRSPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000049532 human SERPINA5 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- VCMGMSHEPQENPE-UHFFFAOYSA-N ketamine hydrochloride Chemical compound [Cl-].C=1C=CC=C(Cl)C=1C1([NH2+]C)CCCCC1=O VCMGMSHEPQENPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DNNSSWSSYDEUBZ-OIOBTWANSA-N krypton (81mKr) gas Chemical compound [81Kr] DNNSSWSSYDEUBZ-OIOBTWANSA-N 0.000 description 1
- 229960001299 krypton (81mkr) gas Drugs 0.000 description 1
- -1 krypton-81M Chemical compound 0.000 description 1
- 238000002350 laparotomy Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- QEFYFXOXNSNQGX-UHFFFAOYSA-N neodymium atom Chemical compound [Nd] QEFYFXOXNSNQGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000013421 nuclear magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229960003330 pentetic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002186 photoactivation Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- PUDIUYLPXJFUGB-UHFFFAOYSA-N praseodymium atom Chemical compound [Pr] PUDIUYLPXJFUGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 230000010349 pulsation Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- DOSGOCSVHPUUIA-UHFFFAOYSA-N samarium(3+) Chemical compound [Sm+3] DOSGOCSVHPUUIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- AGDSCTQQXMDDCV-UHFFFAOYSA-M sodium;2-iodoacetate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)CI AGDSCTQQXMDDCV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- GZCRRIHWUXGPOV-UHFFFAOYSA-N terbium atom Chemical compound [Tb] GZCRRIHWUXGPOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 229960000103 thrombolytic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N xylazine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- NAWDYIZEMPQZHO-UHFFFAOYSA-N ytterbium Chemical compound [Yb] NAWDYIZEMPQZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
- A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/6415—Toxins or lectins, e.g. clostridial toxins or Pseudomonas exotoxins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/0002—General or multifunctional contrast agents, e.g. chelated agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
- A61K51/082—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins the peptide being a RGD-containing peptide
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
- A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
- A61K51/04—Organic compounds
- A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
- A61K51/088—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins conjugates with carriers being peptides, polyamino acids or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
- A61M25/00—Catheters; Hollow probes
- A61M25/0043—Catheters; Hollow probes characterised by structural features
- A61M25/0045—Catheters; Hollow probes characterised by structural features multi-layered, e.g. coated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
- C07K14/3153—Streptokinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2123/00—Preparations for testing in vivo
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pathology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Anesthesiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Визуализирующий агент может быть использован для обнаружения содержащего фибрин материала, а именно тромба или атеросклеротической бляшки. Агент представляет собой меченный визуализирующим маркером рекомбинантный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, идентичную области связывания природного человеческого фибронектина с фибрином. Маркером является радиоактивный изотоп, элемент, непрозрачный для рентгеновских лучей, или парамагнитный ион. Визуализирующий агент применим для раннего обнаружения внутрисосудистых атеросклеротических изменений и тромбов. 2 с. и 12 з.п. ф-лы, 29 ил., 5 табл.
Description
Изобретение относится к диагностике и лечению таких заболеваний, как атеросклероз и тромбоз.
Большинство существующих процедур для диагностики и лечения атеросклероза и тромбоза являются инвазивными, дорогостоящими и имеют ограниченную эффективность у существенной доли пациентов.
Известны методы, в основе которых лежит принцип "усиления" бляшек при помощи красителей, который был предложен Spears, J. и др. (J. Clin. Invest. т. 71, с. 395-399, 1983). Такие красители метят поверхность бляшек флуоресцентным соединением. Abela, G. и др. (Am.J.Cardiol., 50, с. 1199-1205, 1982) предложили разрушение бляшек фотоактивацией производных гематопорфирина, осуществляемой с помощью внутрипросветного передающего излучения лазера, оптического волокна. Кроме того, было также предложено использование тетрациклиновых красителей (Murphy-Chutorian, D. и др., Am. J. Cardiol., т. 55, с. 1293-1297, 1985).
Указанные выше красители выбирают по их способности связываться с компонентами атеросклеротической бляшки. Далее краситель абсорбирует лазерный свет, концентрируя его на окрашенной поверхности. Однако имеет место некоторое окрашивание и здоровой ткани, что приводит к идентификации окружающей ткани как поврежденной.
Предложены несколько экспериментальных подходов для неинвазивного обнаружения тромбов при помощи использования радиофармацевтических агентов, но ни один не получил широкого клинического признания ввиду специфических недостатков, характерных для каждого агента.
Основные характеристики радиофармацевтических агентов для раннего обнаружения внутрисосудистых атеросклеротических изменений и тромбов состоят в следующем: высокое сродство к компонентам тромба; относительно высокая фармакокинетическая скорость очищения крови; безопасность: нетоксичность и неимуногенность; простота получения и использования.
В литературе описаны различные визуализирующие агенты этой категории. Недостатки их состоят в следующем: а) аутогенные тромбоциты, меченные 1111п: эта процедура очень трудоемкая, продолжительная по времени, а время очищения крови относительно большое, а именно 2 дня [2]; б) 1311-фибриноген: анализ основан на сродстве инъектируемого радиомеченного фибриногена относительно тромба, но он не пригоден для испытаний на быструю визуализацию из-за большого времени пребывания в крови, не пригоден для старых тромбов и не может использоваться в присутствии гепарина [3, 36]; в) фрагмент Е1 человеческого фибрина: представляется наиболее подходящим для фибриногена, но его трудно получать в достаточных количествах для широкого клинического применения [4]; г) мышиные антифибриновые моноклональные антитела: являются специфическими и имеют высокое сродство относительно тромба, но характеризуются относительно продолжительным временем очищения крови и потенциально являются иммуногенными для человеческого организма [5, 33, 34]; д) мышиные моноклональные антитела, специфические относительно активированных тромбоцитов [6, 7]: те же недостатки, что в случае г); е) меченый фибронектин [1] (прототип): фибронектин имеет сродство сразу к нескольким материалам, содержащимся в тромбе, но отличается довольно продолжительным временем очищения крови и небольшим содержанием радиоактивности в тромбе. Таким образом, в этой области техники ощущается необходимость в специфических относительно тромбов радиофармацевтических агентах для быстрой визуализации тромба.
В патенте США N 4343734 (Lian и др.) предложены специфические антитела к гамма-карбоксиглютаминовой кислоте (ГЛК), которые могут быть помечены флюоресцирующим агентом для иммунофлюоресцентного окрашивания ткани с целью установления присутствия в ней ГЛК. Специфические ГЛК-антитела связываются с ГЛК, которая содержится в развивающейся атеросклеротической бляшке, имеющей отложения кальция. Lian и др. утверждают, что ГЛК не обнаруживается в некальцинированных бляшках и что ГЛК не обнаруживается в сердечных клапанах и аорте, а также в таких циркулирующих протеинах, как протромбин, факторы свертывающей системы крови VII, IX и X, протеин C и протеин S. Кроме того, антитела, связывающие ГЛК, не обеспечивают селективного связывания с атеросклеротическими бляшками.
Фибронектин является гликопротеином, состоящим из двух идентичных субблоков, каждый из которых имеет мол. м. приблизительно 220000. Человеческими клетками в культуре и in vivo продуцируются и секретируются две основные формы фибронектина [8]. Фибронектин, ассоциированный с клеткой, слабо растворим и принимает участие в адгезии клеток, заживлении ран, дифференцировке клеток и фагоцитозе. Фибронектин плазмы, продуцируемый в основном в печени, является растворимым протеином сыворотки с биологическими свойствами, аналогичными биологическим свойствам клеточного фибронектина.
Фибронектин представляет собой многофункциональный модулятор, так как ограниченное протеолитическое расщепление продуцирует полипептиды с различными активностями. Были получены основные функциональные области молекулы фибронектина при помощи частичного протеолитического переваривания, они включают домены, связывающие гепарин, ДНК, фибрин, коллаген или желатин и клетки [8-13].
Baralle, F. E. в европейской патентной публикации N 207751, опубликованной 7 января 1989 г., описал полную кДНК-последовательность фибронектина. Он также описывает экспрессию слитых белков, содержащих часть связывающей коллаген области фибронектина, и β -галактозидазу Escherichia coli. Аналогичные слитые протеины предложены Owens и Baralle [14]. Obara и др. (1987) описана экспрессия части связывающей клетки области человеческого фибронектина, слитой с β -галоктозидазой Escherichia coli. Obara и др. также (1988) описывают экспрессию частей связывающей клетки области, слитых с β-галактозидазой после предварительного сайт-специфического мутагенеза [16]. Карбокси-конец связывающей фибрин области человеческого фибронектина экспрессировали в L-клетках мыши как протеин слияния с сигнальной последовательностью ингибитора человеческого протеина C [17].
Ни в одной из вышеупомянутых ссылок, однако, не описывается экспрессия N-терминальной части связывающей фибрин области фибронектина; кроме того, все рекомбинантные протеины, которые описаны ранее, являются слитыми протеинами.
В соответствии с изобретением предлагаются визуализирующие агенты на основе полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность, которая по существу соответствует N-терминальной части связывающей фибрин области фибронектина. Эти полипептиды имеют приблизительные мол. м. 31, 20, 18,5 и 12 кД, определенные при помощи маркеров сравнения на SDS-гелях в восстанавливающих условиях. Они обладают следующими характеристиками, которые делают их перспективными фармацевтическими агентами: содержат аминокислотную последовательность, которая содержится в человеческом протеине и, таким образом, является неимуногенной; обладают специфичностью относительно фибрина, которая базируется на их способности к ковалентному перекрестному связыванию в катализируемой транс-глютаминазой реакции с образующимся, а также с образованным ранее тромбом (сгустком); связываются с внеклеточной матрицей, что дает возможность обнаружить атеросклеротические бляшки; обладают относительно коротким периодом очищения крови; включаются в сгустки в присутствии гепарина; продуцируются при помощи рекомбинантных приемов и могут быть, таким образом, получены в больших количествах. Указанные полипептиды для получения визуализирующих агентов метят визуализируемым маркером.
В соответствии с изобретением предлагается недорогой, точный способ визуализации содержащих фибрин материалов, т.е. тромбов и атеросклеротических бляшек как in vitro, так и in vivo. Он включает контактирование содержащего фибрин материала, подлежащего визуализации, с визуализирующим агентом, описанным выше, при таких условиях, что агент связывается с содержащим фибрин материалом, и визуализацию связанного агента, обеспечивающую одновременное обнаружение содержащего фибрин материала.
На фиг. 1-29 описана конструкция плазмид, экспрессирующих полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность, по существу соответствующую амино-терминальной части, связывающей фибрин области (FBD) фибронектина. FBD начинается с аминокислоты под номером 1 зрелого фибронектина, которой является глютамин, и соответствует четвертой аминокислоте (Q), представленной на фиг. 2. Таким образом, N-окончанием FBD-последовательности является Q-A-Q-Q-(глютамин-аланин-глютамин-глютамин); соответствующий первый нуклеотид в кДНК-последовательности на фиг. 2 имеет, следовательно, номер 14, указанный стрелкой. Все рекомбинантные FBD-полипептиды, приведенные на фиг. и в тексте описания, нумеруются от этого первого глютамина, а все соответствующие кДНК-последовательности пронумерованы, как это показано на фиг. 2-9.
Определение полипептидов, экспрессируемых в форме 31, 20, 18,5, 12 кД, является оперативным определением, основанным на их приблизительной молекулярной массе, определяемой на SDS-полиакриламидных гелях в восстанавливающих условиях путем сравнения с маркерами с известной молекулярной массой.
На фиг. 1 приведено изображение различных областей фибронектина и конструируемых рекомбинантных полипептидов; на фиг. 2-9 - нуклеотидная последовательность кДНК человеческого фибронектина.
На фиг. 10 и 11 получают семь пар химически синтезированных олигомеров. Синтетические олигомеры кодируют первые 153 N-терминальные аминокислоты человеческого фибронектина (FN), на фиг. 10 и 11 приведена последовательность этих 7 пар синтетических олигомеров.
На фиг. 12 представлен ДНК-фрагмент, кодирующий аминокислоты с 1 по 153 N-терминальной области человеческого FN, составленный из 7 пар химически синтезированных олигомеров, представленных на фиг. 10 и 11. Синтез может быть описан следующим образом.
а) Олигомеры 3/4, 5/6, 7/8 и 9/10 (каждая пара в отдельной пробирке) подвергают отжигу, а затем фосфорированию на 5'-конце, используя фермент Т4-полинуклеотидкиназу.
б) На второй стадии пары 3/4 и 5/6 подвергают лигированию друг с другом, используя ДНК-лигазу Т4. Аналогичным образом реакционные пары 7/8 и 9/10 подвергают лигированию друг с другом. После каждого шага лигирования порцию смеси лигирования анализируют на геле, чтобы определить размер вновь образованных фрагментов и эффективность связывания.
в) На третьей стадии две вышеупомянутые смеси лигирования смешивают вместе, и в смесь добавляют пару 6, олигомеры 11/12, которые предварительно отожгли и фосфорилировали в отдельной пробирке. ДНК-фрагмент из 326 пар оснований, полученный из вышеупомянутой смеси, изолируют из агарозного геля и подвергают очистке.
Очищенный синтетический 326-фрагмент добавляли к двум дополнительным парам синтетических линкеров: пара 1, олигомеры 1/2, и пара 7, олигомеры 13/14. В паре 1 только олигомер 2 фосфорилирован в 5'-конце, а в паре 7 только олигомер 13 фосфорилирован в 5'-конце.
После лигирования ДНК-лигазой Т4 смесь без какой-либо дополнительной изоляции добавляли в ДНК вектора pBR322, переваренную эндонуклеазами EcoRI и BamHI.
Полученная плазмида, обозначенная pFN 932-18, содержала полный синтетический фрагмент EcoRI (5'-конец)-BamHI (3'-конец), кодирующий N-терминальные 153 аминокислоты человеческого FN, в векторе pBR322.
На фиг. 13 представлена экспрессия N-терминальной последовательности из 153 аминокислоты FN.
Плазмиду pFN 932-18 переваривали эндонуклеазами NdeI и BamHI. ДНК-фрагмент NdeI-BamHI, кодирующий FN (первые 153 аминокислоты + дополнительный N-терминальный метионин), изолировали и подвергали лигированию с большим фрагментом, полученным при помощи переваривания плазмиды pTУ301 эндонуклеазами NdeI и BgII. (Плазмида pTУ301 экспрессирует человеческий гормон роста (hGH) при регулировании промотором λPL и RBS CII).
Полученную плазмиду обозначали как pFN 949-2.
На фиг. 14 представлена вставка терминирующего кодона TAA в 3'-конец N-терминальной области FN (в положении, соответствующем аминокислоте 262).
Синтетический олигонуклеотид, содержащий терминирующий кодон TAA и сайт Bgl II, имеющий следующую последовательность:
лигировали с 3'-концом (сайт PvuII) EcoRI-PvuII, NF-фрагмента, выделенного из КДНК-плазмиды p931-5, переваренной ферментами EcoRI и PvuII. Лигирование осуществляли в присутствии плазмиды PBR322, переваренной ферментами EcoRI и BamHI (большой фрагмент). Полученную плазмиду обозначали как PFN935-12.
лигировали с 3'-концом (сайт PvuII) EcoRI-PvuII, NF-фрагмента, выделенного из КДНК-плазмиды p931-5, переваренной ферментами EcoRI и PvuII. Лигирование осуществляли в присутствии плазмиды PBR322, переваренной ферментами EcoRI и BamHI (большой фрагмент). Полученную плазмиду обозначали как PFN935-12.
На фиг. 15 представлены рекомбинатные полипептиды областей фибронектина в сравнении с фибронектином полной длины.
Фиг. 15 показывает соотношение кДНК-клонов, кодирующих рекомбинантные полипептиды друг с другом, а также с последовательностью полной длины кДНК-фибронектина и общей схемой доменов, содержащихся внутри молекулы человеческого фибронектина.
На фиг. 16 представлена конструкция плазмиды pFN 196-2, которая экспрессирует полипептид FBD r12 кД.
Большой фрагмент BspMI-HindIII, полученный при помощи переваривания плазмиды PFN 975-25 с использованием BspMI и HindIII, подвергали лигированию с использованием ДНК-лигазы T4 с синтетической парой линкеров A (фиг. 18). Полученную плазмиду PFN 196-2 трансформировали в штамм Escherichia coli A1645, а затем переносили в штамм Escherichia coli A4255. Плазмида PFN 196-2 содержит 5'-терминальную последовательность кДНК-фибронектина от нуклеотида 14 до нуклеотида 340, т.е. она кодирует первые 109 аминокислот FBD-фибронектина, заканчивающиеся аргининовым остатком. В конечном полипептиде содержится дополнительный N-терминальный метионин. Плазмида pFN 196-2 дает хорошую экспрессию FBD-полипептида r12 кД под контролем λ -промотора и сайта связывания рибосом β -лактамазы: она сдана на хранение в ATCC под шифром хранения N 68328.
На фиг. 17 представлена конструкция плазмиды pFN 197-10, которая экспрессирует модифицированный FBD-полипептид 12 кД (12 кД').
Плазмиду pFN 975-25 обрабатывали, как это представлено на фиг. 16, за тем исключением, что использовали другую пару линкеров B (фиг. 18). Лигирование давало плазмиду pFN 197-10, которая кодирует N-терминальную последовательность FBD FN; однако модификация после нуклеотида 340 с целью получения сайта NdeI (CATATG) перед стоп-кодоном приводит к кодированию полипептида, содержащего 111 аминокислот, где первые 109 аминокислот соответствуют аминокислотам полипептида r12 кД, а два дополнительных аминокислотных остатка представлены гистидином и метионином. В конечном полипептиде также содержится дополнительный N-терминальный метиониновый остаток. Плазмиду pFN 197-10 трансформировали в штамм Escherichia coli A1645, а затем в штамм Escherichia coli A4255 и получали хорошую экспрессию модифицированного FBD-полипептида r12 кД (12 кД') под контролем λ-промотора и связывания рибосом β-лактамазы.
На фиг. 18 представлены олигонуклеотидные линкеры, используемые в конструкции плазмид.
Получали две пары химически синтезированных олигомеров (A, B) и использовали их при конструировании плазмид, как это показано на фиг. 16 и 17 соответственно.
На фиг. 19 представлено сравнение меченых FBD-полипептидов r12 кД, r20 кД и r31 кД в модели венозного тромба у крыс.
Столбцы и вертикальные консоли представляют среднее значение ± средняя стандартная ошибка (N = 5) удельной радиоактивности, ассоциированной с изолированными тромбами (T) или кровью (B) через 24 ч после применения 125I-меченых рекомбинантных полипептидов, как это указано.
На фиг. 20 представлено связывание полипептидов области связывания фибрина с фибрином сгустков.
Этот эксперимент осуществляли по существу, как это описано для двухстадийной реакции 11 (пример 6). 0,15 μМ 125I одного из полипептидов области, связывающей фибрин, как это указано выше, инкубировали при 37oC с предварительно образованными фибриновыми сгустками, полученными из 20 μл обработанной цитратом цельной крови. Связывание измеряли в присутствии 5 мМ CaCl2 и 0,02 единиц/мл транс-глютаминазы. Реакцию прекращали спустя 45 мин инкубирования центрифугированием; осадок промывали три раза с использованием фосфатно-солевого буфера (PBS), а радиоактивность измеряли в гамма-счетчике.
1. Плазматическая FBD 31 кД (p 31 кД)
2. r12 кД
3. r20 кД
4. r21 кД (Порция A)
5. r31 кД (Порция B)
6. r31 кД (Порция C)
На фиг. 21 представлены скручивание и очистка полипептида r20 кД, наблюдаемые при помощи профилей элюирования из колонки типа Superose 12 [соединенной с ЖХВД (жидкостная хроматография высокого давления)].
2. r12 кД
3. r20 кД
4. r21 кД (Порция A)
5. r31 кД (Порция B)
6. r31 кД (Порция C)
На фиг. 21 представлены скручивание и очистка полипептида r20 кД, наблюдаемые при помощи профилей элюирования из колонки типа Superose 12 [соединенной с ЖХВД (жидкостная хроматография высокого давления)].
Порции в 200 μл полипептида r20 кД на различных стадиях процедур скручивания и очистки инъецировали в верхнюю часть колонки Superose 12 (соединенной с ЖХВЖ). Колонку уравновешивали и элюировали раствором 150 мМ NaCl (20 мМ Трис HCl, pH 7,8) с объемной скоростью потока 0,8 мл/мин. A. Осадок полипептида r20 кД солюбилизировали в 6 М гуанидин-HCl и восстанавливали 50 мм β-меркаптоэтанолом. B. Ренатурировали и окисляли воздухом полипептид r20 кД. C. Полипептиды, отделенные от очищенного r20 кД, связывали с Q-сефарозой. D. Поток через колонку из Q-сефарозы. E. Поток через колонку гепарин-сефарозы материала, отделенного от очищенного r20 кД. F. Очищали полипептид в 20 кД (время удерживания 18,16 мин), элюировали из колонки гепарин-сефарозы при помощи 0,5 М NaCl. Пик со временем удержания 18,16 мин отсутствовал в профиле A, где материал находится в восстановленной форме, а также и в профилях C и E, которые содержат неправильно образованные формы полипептиды в 20 кД.
На фиг. 22 представлены ренатурация и очистка полипептида r12 кД по данным профилей элюирования с колонки Superose 12 (соединенной с системой ЖХВД Уотерз).
Порции в 25 - 100 μл полипептида r12 кД на различных стадиях процессов ренатурации и очистки инъецировали в верхнюю часть колонки Superose 12, соединенной с системой ЖХВД Уотерз. Колонку уравновешивали и элюировали раствором 150 мМ NaCl/20 мМ Трис HCl, pH 7,8, с объемной скоростью потока 0,8 мл/мин. A. Осадок полипептида r12 кД солюбилизировали в 6 М гуанидин-HCl и восстанавливали 50 мМ β-меркаптоэтанолом. B. Полипептид r12 кД ренатурировали и окисляли воздухом. C. Полипептиды связывали с Q-сефарозой (материалы, которые отделяли от r12 кД). D. Пропускали поток через колонку Q- и гепарин-сефарозы (в этом случае колонки соединяли последовательно и поток через сефарозу автоматически загружался на колонку гепарин-сефарозы). E. Очищали полипептид r12 кД (время удерживания 18,83 мин), элюировали с колонки гепарин-сефарозы 0,5 М раствором NaCl. Пик со временем удерживания 18,83 мин отсутствовал в профиле A, где материал находится в восстановленной форме, а также и в профилях C и D, которые содержат неправильно сформированные формы полипептида r12 кД.
На фиг. 23 представлена конструкция плазмиды pFN 208-13.
Две порции плазмиды pFN 975-25 (ATCC N 67832) отдельно переваривали ферментами Xmn I и XbaI-StyI соответственно. Большие фрагменты выделяли из каждой переваренной смеси и смешивали вместе с синтетическим олигомером, приведенным на фиг. 16. Затем эту смесь кипятили в течение 2,5 мин, постепенно охлаждали 60 мин до 30oC, затем 60 мин до 40oC и, наконец, 30 мин до 0oC. ДНК, подвергнутую повторному отжигу, достраивали фрагментом Кленова и подвергали лигированию с использованием ДНК-лигазы T4. Эту ДНК трансформировали в E. coli A1645, а трансформированные клетки проверяли на наличие клонов, положительных относительно содержания олигомера. Плазмиду из положительного клона обозначали pFN 208-13 (она сдана на хранение в ATCC в хозяине E.coli A4255 под шифром хранения N 68456). Эта плазмида экспрессирует полипептид N-конца FBD размером в 18,5 кД под управлением PL-промотора λ и сайта связывания рибосом β -лактамазы.
На фиг. 24 представлен синтетический линкер, используемый в конструкции плазмиды pFN 208-13.
На этой фигуре представлен синтетический олигомер, используемый в конструкции плазмиды pFN 208-13 (фиг. 23).
На фиг. 25 представлена конструкция плазмиды pFN 201-3.
Большой фрагмент изолировали из HindIII - StyI-перевара плазмиды pFN 949-2 (ATCC, шифр хранения N 67831) и подвергали лигированию с малым фрагментом, изолированным из HindIII - StyI-перевара плазмиды pFN 196-2 (ATCC, шифр хранения N 68328). Полученная в результате плазмида, обозначенная pFN 201-3, экспрессирует полипептид FBD 12 кД под контролем PL-промотора λ и сайта связывания рибосом СII.
На фиг. 26 представлена конструкция плазмиды pFN203-2.
Большой фрагмент изолировали из смеси Ndel - HindIII-перевара плазмиды pMLK-100 (сданной на хранение в E.coli 4300 в ATCC под шифром хранения N 68605) и подвергали лигированию с малым фрагментом, изолированным из смеси Ndel - HindIII-перевара плазмиды pFN 201-3. В результате получали плазмиду, обозначенную pFN 203-2, которая экспрессирует полипептид FBD 12 кД под контролем PL-промотора λ, сайта связывания рибосом CII и содержит последовательность окончания транскрипции trp ("ter"). Названная плазмида сдана на хранение в ATCC в E.coli A4255 под шифром хранения ATCC N 68606. Плазмида pFN 203-2 известна также как pFN 203-2-3.
На фиг. 27 представлено связывание фрагментов различных полипептидов с предварительно полученными фибриновыми сгустками.
На этой фигуре представлена специфичность различных полипептидов FBD к предварительно образованному фибриновому сгустку, как это описано в примере 8. Испытывали полипептиды FBD: 31 кД, 20 кД, 18,5 кД и 12 кД. Кроме того, испытывали слитый полипептид 45 кД, состоящий из фрагмента FBD 12 кД и CBD 33 кД. В качестве контроля использовали полипептид CBD 33 кД (описанный в PCT-публикации N WO/90/07577, с. 62-64, тах же заявителей). Все испытываемые полипептиды FBD, включая слитый полипептид 45 кД, связывались с предварительно образованным сгустком в аналогичных пропорциях (25-38% связывание).
На фиг. 28 представлено введение метки в тромбы in vivo с использованием фрагментов полипептидов FBD 12 кД и 18,5 кД (примере 10). На фиг. 28 представлены данные удельной радиоактивности тромба (заштрихованные столбцы) и крови (незаштрихованные столбцы) у крыс с индуктором из нержавеющей стали спустя 24 ч после внутривенного применения IIIIп-меченных рекомбинантных протеинов FBD. Прямоугольники и вертикальные отрезки представляют средние значения и средние значения стандартного отклонения числа отсчетов в 1 мин/г влажной массы соответственно. Отношения тромб/кровь приведены на фиг. 29.
На фиг. 29 представлены отношения удельной радиоактивности "тромб/кровь" спустя 24 ч после применения IIIIп-меченных 12 кД, 18,5 кД- и 31 кД- FBD в модели, снабженной индуктором крысы, показанной на фиг. 28.
Плазмиды pFN 975-25, pFN 949-2, pFN 137-2 и pFN 196-2 сданы на хранение в соответствии с условиями и требованиями Будапештского договора в Американскую коллекцию типовых культур (ATCC) под шифрами хранения NN 67832, 67831, 67910 и 68328 соответственно. Аналогичным образом сданы на хранение другие ATCC-депозиты, на которые имеется ссылка в настоящей патентной заявке.
Основная последовательность человеческого фибронектина, как было показано, организована из трех типов гомологичных повторов (типов I, II и III). Область, связывающая фибрин (FBD), состоящая из 259 аминокислот со средней мол. м. 31 кД, составлена из пяти повторов типа I ("пальцев"), каждый из которых состоит примерно из 45 аминокислот и включает две дисульфидные связи.
Общее схематическое представление структуры областей фибронектина и рекомбинантных молекул, конструируемых в соответствии с настоящим изобретением, дано на фиг. 1.
Рекомбинантные полипептиды, входящие в состав визуализирующего агента, предлагаемого в соответствии с изобретением, по аминокислотной последовательности по существу идентичны соответствующим фрагментам области связывания.
Во всех полученных полипептидах содержится дополнительный Met на N-конце.
Полипептид r31 кД содержит пять гомологичных петель типа I или "пальцев", упомянутых выше (т.е. 10 дисульфидных связей), полипептид r20 кД и полипептид r18,5 кД, которые содержат три петли (т.е. 6 дисульфидных связей) и полипептид r12 кД имеет две петли (т.е. 4 дисульфидные связи). Присутствие этих дисульфидных связей определяет необходимость, а также трудность процедуры восстановления конформации полипептида соответствующей нативности. Правильно ренатурированные FBD-полипептиды являются биологически активными, т.е. могут связываться с фибрином.
Исходно рекомбинантные FBD-полипептиды продуцируются в виде тел включения, образующих после разрушения клеток нерастворимый осадок.
В соответствии с изобретением предлагается продуцирование рекомбинантных полипептидных фрагментов области связывания фибрина (FBD) для использования при визуализации тромбов и предотвращения их образования. Эти полипептидны могут быть также связаны с тромболитическим агентом для доставки агента к тромбу.
Рекомбинантными клетками, которые продуцируют полипептидные фрагменты FBD, могут быть любые клетки, в которые при помощи приемов рекомбинантной ДНК была введена ДНК-последовательность, кодирующая фрагмент полипептида FBD, которые способны ее экспрессировать. Это может быть клетка млекопитающего, дрожжевая клетка или бактериальная клетка.
Бактериальная клетка может принадлежать любому штамму, включая ауксотрофные, прототрофные и литические штаммы, F+- и F--штаммы; штаммы, несущие последовательность репрессора c1857 λ-профага; штаммы с удаленными репрессорами или геном deo.
Примерами используемых штаммов Escherichia coli дикого типа являются прототроф ATCC N 12435 и ауксотроф MC1061 (шифр хранения N 67361).
Примерами штаммов Escherichia coli, которые несут последовательность репрессора λ c1857, являются ауксотроф A1645, несущий плазмиду pTYR 279-8 (ATCC N 53216), A1637, несущий плазмиду pTY 104/2 (ATCC N 39384) и A2097: несущий плазмиду pSOD α 2 (ATCC N 39786), прототроф A4255, несущий плазмиду pFN 975-25 (ATCC N 67832) и независимый от биотина A4346, несущий плазмиду pHG 44 (ATCC N 53218).
Примером пригодного литического штамма Escherichia coli является A4048, который несет плазмиду pHG 44 (ATCC N 53217).
Примерами F--штаммов является Escherichia coli Sφ 930 (F-), несущий плазмиду pMF 5534, сданный на хранение под шифром ATCC N 67703, и Escherichia coli W31100 (F-), несущий плазмиду pMFS 929, сданный на хранение под шифром ATCC N 67705.
Примерами штаммов Escherichia coli с удаленным геном deo или репрессором deo являются Sφ 732, несущий плазмиду pMF 2005 (ATCC N 67362), Sφ 540, несущий плазмиду pJBF 5401 (ATCC N 67359), и Sφ 930, несущий плазмиду pEFF 920 (ATCC N 67706) (см. публикацию европейской патентной заявки N 0303972, опубликованную 22 февраля 1989 г.).
В качестве клетки-хозяина для плазмид можно также использовать и другие штаммы Escherichia coli, а также другие бактерии. К таким бактериям относятся Pseudomonas aeruginosa и Bacillus subtilis.
Плазмиды, используемые для продуцирования FBD-полипептидов, могут нести самые разнообразные промоторы, такие, как промотор для промотора deo.
Среди плазмид, которые можно использовать для продуцирования FBD-полипептидов, можно указать следующие:
a) плазмида pFN 975-25, которая экспрессирует FBD r31 кД и которая сдана на хранение в штамме A4255 Escherichia coli ATCC N 67832;
b) плазмида pFN 949-2, которая экспрессирует FBD r20 кД и которая сдана на хранение в штамме A4255 Escherichia coli ATCC N 67831;
c) плазмида pFN 196-2, которая экспрессирует FBD r12 кД и которая сдана на хранение в штамме A4255 Escherichia coli ATCC N 68328;
d) плазмида pFN 197-10, которая экспрессирует модифицированный полипептид FBD 12 кД и которая показана на фиг. 17;
e) плазмида pFN 201-3, которая экспрессирует фрагмент полипептида FBD 12 кД под контролем λPL и CIIrbs сайта связывания рибосом и которая показана на фиг. 25;
f) плазмида pFN 203-2, которая экспрессирует фрагмент полипептида FBD 12 кД под контролем λPL и CIIrbs и дополнительно содержит терминатор транскрипции, обозначаемый "ter", и которая показана на фиг. 26 (сдана на хранение в штамме A4255 Escherichia coli под шифром хранения N 68606);
h) плазмида pFN 208-13, которая экспрессирует фрагмент полипептида FBD 18,5 кД и которая показана на фиг. 23 (сдана на хранение в штамме A4255 Escherichia coli в ATCC под шифром хранения N 68456);
В соответствии с изобретением предлагается визуализирующий агент, который содержит полипептид, меченный визуализируемой меткой/маркером.
a) плазмида pFN 975-25, которая экспрессирует FBD r31 кД и которая сдана на хранение в штамме A4255 Escherichia coli ATCC N 67832;
b) плазмида pFN 949-2, которая экспрессирует FBD r20 кД и которая сдана на хранение в штамме A4255 Escherichia coli ATCC N 67831;
c) плазмида pFN 196-2, которая экспрессирует FBD r12 кД и которая сдана на хранение в штамме A4255 Escherichia coli ATCC N 68328;
d) плазмида pFN 197-10, которая экспрессирует модифицированный полипептид FBD 12 кД и которая показана на фиг. 17;
e) плазмида pFN 201-3, которая экспрессирует фрагмент полипептида FBD 12 кД под контролем λPL и CIIrbs сайта связывания рибосом и которая показана на фиг. 25;
f) плазмида pFN 203-2, которая экспрессирует фрагмент полипептида FBD 12 кД под контролем λPL и CIIrbs и дополнительно содержит терминатор транскрипции, обозначаемый "ter", и которая показана на фиг. 26 (сдана на хранение в штамме A4255 Escherichia coli под шифром хранения N 68606);
h) плазмида pFN 208-13, которая экспрессирует фрагмент полипептида FBD 18,5 кД и которая показана на фиг. 23 (сдана на хранение в штамме A4255 Escherichia coli в ATCC под шифром хранения N 68456);
В соответствии с изобретением предлагается визуализирующий агент, который содержит полипептид, меченный визуализируемой меткой/маркером.
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения используются полипептиды 20 кД, 18,5 кД и 12 кД.
Визуализируемый маркер, используемый в соответствии с изобретением, может быть выбран по обстоятельствам, однако в предпочтительном варианте таким маркером является радиоактивный изотоп, элемент, который является непрозрачным для X-лучей, или парамагнитный ион.
Среди радиоактивных изотопов предпочтительными маркерами являются индий-111, технеций-99М, иод-123, иод-125, иод-131, криптон-81М, ксенон-133, гелий-67 или их смеси. В наиболее предпочтительном варианте маркером является технеций-99М или индий-111.
Примерами парамагнитных ионов являются ионы следующих металлов: хрома (III), марганца (II), железа (III), железа (II), кобальта (II), никеля (II), меди (II), празеодима (III), неодима (III), самария (III), гадолиния (III), тербия (III), диспрозия (III), гольмия (III), эрбия (III), иттербия (III) или их смеси.
Полипептид 20 кД соответствует аминокислотной последовательности фрагмента области связывания фибрина человеческого фибронектина, охватывающей аминокислотные остатки 1-153, как это показано на фиг. 2-9, и имеет примерно 20 дополнительных аминокислот; полипептид 18,5 кД соответствует аминокислотной последовательности фрагмента области связывания фибрина человеческого фибронектина от 1 до 154 аминокислотного остатка, как это показано на фиг. 2-9; полипептид 12 кД соответствует аминокислотной последовательности фрагмента области связывания фибрина человеческого фибронектина от 1 до 109 аминокислотного остатка, как это показано на фиг. 2-9. При помощи частичного анализа аминокислотной последовательности заявитель показал, что полипептиды 12 кД и 20 кД, а также полноразмерный полипептид 31 кД содержат дополнительный N-терминальный метионин.
Однако область притязаний изобретения включает также полипептиды без дополнительного N-терминального метионина.
В соответствии с изобретением предлагается также способ визуализации содержащих фибрин материалов, а именно тромбов или атеросклеротических бляшек, который предполагает контактирование содержащего фибрин материала, подлежащего визуализации, с агентом, описанным выше, в подходящих для их связывания условиях и визуализацию связанного агента с соответствующей визуализацией содержащего фибрин материала.
Визуализация может быть осуществлена любым известным приемом, которые знакомы любому специалисту в этой области техники. Эти приемы включают (но ими не исчерпывается полный список) рентгеновский анализ, CAT-сканирование (компьютерная аксиальная томография), PET-сканирование, NMRI, флюороскопия. В предпочтительном варианте визуализацию фибринсодержащего материала при помощи вышеупомянутых приемов осуществляют с использованием гамма-камеры.
Все ссылки на позиции нуклеотидов соответствуют позициям в нуклеотидной последовательности кДНК человеческого фибронектина, приведенной на фиг. 2-9 (см. также фиг. 10 и 11 у Баралла Ф.Е., Публикация европейского патента N 207751, опубликованного 7 января 1987 г.).
Настоящая патентная заявка направлена на визуализирующие агенты, содержащие полипептиды, соответствующие N-концевой области домена связывания фибрина (FBD). Экспериментальные результаты с полипептидом 31 кД представлены с целью сравнения с более короткими фрагментами.
Пример 1. Получение кДНК-библиотеки фибронектина.
КДНК-библиотеку получали в λgtII из поля A + мРНК, изолированной из человеческой печени в соответствии с опубликованными процедурами (13, 14). КДНК-фрагменты клонировали с использованием EcoRI-линкеров и отбирали положительные относительно FBD-плазмиды, применяя следующие синтетические ДНК-зонды:
(3') GGGGGTCGGAGGGATACCGGTGACACAGTCTTAA (817-850)
(3') CGACGGGTGCTCCTTTAGACGTGTTGGTTACTTCCCCAGTAC (1310-1340)
Положительные кДНК-клоны субклонировали в сайте EcoRI в pB R322.
(3') GGGGGTCGGAGGGATACCGGTGACACAGTCTTAA (817-850)
(3') CGACGGGTGCTCCTTTAGACGTGTTGGTTACTTCCCCAGTAC (1310-1340)
Положительные кДНК-клоны субклонировали в сайте EcoRI в pB R322.
Пример 2. Экспрессия и очистка полипептидов области связывания фибрина (FBD).
A. Экспрессия частичного полипептида FBD в 20 кД.
Клоны кДНК, полученные, как это описано в примере 1 и изображено на фиг. 15, не включают ДНК, кодирующую аминокислоты 1 - 190 молекулы FN. Эти аминокислоты являются частью FBD. ДНК, соответствующую нуклеотидам с 14 по 472 и кодирующую аминокислоты 1-153 (фиг. 2), конструировали при помощи лигирования 7 пар химически синтезированных нуклеотидов (фиг. 10 и 11). Синтетический ДНК-фрагмент сконструировали так, что он содержал кодон инициирования ATG на 5'-конце, а также удобные сайты рестрикции для введения в различные векторы экспрессии. Чтобы иметь возможность дальнейшего манипулирования с ДНК-последовательностью, кодирующей FBD, нуклеотид номер 19, тимидин (T), заменили на аденин (A), исключая при этом сайт рестрикции DdeI и не изменяя аминокислотную последовательность (сайт изменения нуклеотида обозначается звездочкой в линкере # 1, показанном на фиг. 10). Различные стадии клонирования вышеупомянутого синтетического ДНК-фрагмента в векторе плазмиды pBR 322, переваренной ферментами EcoRI и BamHI, описаны на фиг. 11. Полученную плазмиду обозначали pFN 932-18. ДНК-фрагмент, кодирующий первые 153 N-терминальные аминокислоты фибронектина из плазмиды pFN 932-18, вставляли в pTY 301, вектор экспрессии λPL, между сайтами NdeI и BglII, заменяя ДНК-последовательность, кодирующую человеческий гормон роста (hGH) в плазмиде pTY 301 (фиг. 12).
Полученную в результате плазмиду, pFN 949-2, сдали на хранение в Американскую коллекцию типовых культур (ATCC) под шифром хранения N 67831. Плазмиду pFN 949-2 использовали для трансформации прототрофа Escherichia coli A4255. Эти трансформированные клетки Escherichia coli, как было установлено, экспрессируют частичный FBD-полипептид в количествах, составляющих примерно 5% от общего клеточного протеина. Этот полипептид имеет подвижность, соответствующую примерно 20 кД, на SDS-полиакриламидных гелях в восстанавливающих условиях. Он содержит первые 153 аминокислоты фибронектина с последующими 4 аминокислотами, кодирующими синтетический линкер, и несколькими аминокислотами, полученными в результате считывания в векторе pBR322, т.е. всего 153 аминокислоты плюс менее 20 дополнительных аминокислот и дополнительный N-терминальный метионин. На протяжении патентного описания полипептид именуется r20 кД или FBD r20 кД.
B. Экспрессия "полного" полипептида.
Для того, чтобы получить экспрессию полного FBD-полипептида, содержащего аминокислоты 1-262, конструировали следующие плазмиды.
1. Вставка терминирующего кодона TAA на 3'-конце.
Синтетический олигонуклеотид, содержащий терминирующий кодон TAA и BglII, имеющий следующую последовательность:
подвергали лигированию с 3'-концом фрагмента EcoRI - PvuII, выделенного из p931-5 кДНК-клона FN, и с вектором pBR322, переваренным EcoRI и MamHI, как это описано на фиг. 14. Полученную плазмиду обозначали pFN 935-12.
подвергали лигированию с 3'-концом фрагмента EcoRI - PvuII, выделенного из p931-5 кДНК-клона FN, и с вектором pBR322, переваренным EcoRI и MamHI, как это описано на фиг. 14. Полученную плазмиду обозначали pFN 935-12.
2. Субклонирование карбокси-терминальной области FBD в векторе экспрессии λPL.
ДНК-фрагмент EcoRI-HincII, кодирующий карбокси-терминальную область FBD, изолировали из плазмиды pFN 935-12 и подвергали лигированию с плазмидой pTY 194-80, переваренной ферментами EcoRI и SmaI, как это описано в публикации PCT N WO90/07577 настоящего заявителя (рисунок 46). Полученную плазмиду обозначали pFN 946-12.
3. Синтез и клонирование ДНК, соответствующей нуклеотидам 468-599 в FN.
Три пары химически синтезированных нуклеотидов подвергали лигированию с EcoRI-DdeI-фрагментом FN, изолированным из плазмиды pFN 932-18 (фиг. 11) в присутствии ДНК вектора pUС19 (полученной от фирмы GIBCO BRL CO,), переваренной ферментами EcoRI и XbaI, как это описано подробно в вышеупомянутой публикации РСТ (рисунок 47). Полученную плазмиду обозначали pFN 938-4.
4. Конструкция плазмиды, кодирующей полную FBD-область.
Для того, чтобы сконструировать плазмиду, которая кодирует полную FBD, от аминокислоты 1 до аминокислоты 262, ДНК-фрагмент EcoRI-XbaI, кодирующий FN, изолировали из плазмиды pFN 948-4 и вставляли в плазмиду pFN 946-12, переваренную EcoRI- и XbaI, как это описано в вышеупомянутой публикации РСТ (рисунок 48). Полученную плазмиду обозначали pFN-957. Эта плазмида содержит полную кодирующую последовательность для FBD, но не экспрессирует этот FBD-полипептид, так в ней отсутствует сайт связывания рибосом (RBS).
5. Экспрессия FBD под контролем R1 промотора λ в RBS СII.
NdeI-HindIII-фрагмент, содержащий FBD-кодирующую область и терминаторы транскрипции T1T2, изолировали из плазмиды pFN-957 и вставляли в плазмиду pTY 301, переваренную ферментами NdeI и HindIII, как это описано в вышеупомянутой публикации РСТ (рисунок 49). Полученная в результате плазмида, обозначаемая pFN 962-3, направляет экспрессию FBD-полиперптида под контролем PL промотора λ и сайта связывания рибосом CII. Штаммы Escherichia coli Al645 и A4255, трансформированные этой плазмидой экспрессировали только небольшие количества FBD-полипептида. Экспрессия FBD-полипептида обнаруживается только при помощи анализа пятен Уэстерна с использованием поликлональных антител, направленных против FN, получаемого из человеческой плазмы.
6. Экспрессия FBD-полипептида под контролем PL промотора λ , промотора β - лактамазы и сайта связывания рибосом.
Так как уровень экспрессии FBD-полипептида, полученный при помощи плазмиды pFN-3, был низким, заявитель добавил ДНК-фрагмент, кодирующий промотор β-лактамазы и RBS β-лактамазы (PBLA). ДНК-фрагмент, кодирующий PBLA, изолировали из плазмиды PBLAll (шифр хранения АТСС N 39788) и вставляли в плазмиду pFN 962-3, переваренную ферментом NdeI, достраивали ферментом Кленова и переваривали EcoRl (см. вышеупомянутую публикацию РСТ). Полученную плазмиду, обозначенную pFN 975-25, сдали на хранение в Американскую коллекцию типовых культур под шифром хранения АТСС N 67832. Эту плазмиду использовали для трансформации прототрофа Escherichia coli A4255 (F+).
Эти клетки Eschericnia coli, как было установлено, экспрессировали "полный" FBD-полипептид в концентрациях, составляющих примерно 5-8% от общего клеточного протеина. Полипептид мигрировал на SDS-PAGE гелях при восстанавливающих условиях со средней мол. м. 31 кД, поэтому его в дальнейшем обозначали как полипептид 31 кД FBD r31 кД.
С. Условия ферментации и роста
Клон, экспрессирующий FBD-полипептид r31 кД, подвергали ферментации в обогащенной среде (экстракт дрожжей и гидролизат казеина), содержащей ампициллин. Выращивание осуществляли при 30oC. Экспрессию получали при индукции при 42oC в течение 2 ч, а затем отделяли осадок бактериальных клеток, содержащий FBD-полипептид r31 кД. Точно так же клон, экспрессирующий FBD r20 кД, подвергали ферментации и получали осадок бактериальных клеток, содержащих FBD-полипептид r20 кД.
Клон, экспрессирующий FBD-полипептид r31 кД, подвергали ферментации в обогащенной среде (экстракт дрожжей и гидролизат казеина), содержащей ампициллин. Выращивание осуществляли при 30oC. Экспрессию получали при индукции при 42oC в течение 2 ч, а затем отделяли осадок бактериальных клеток, содержащий FBD-полипептид r31 кД. Точно так же клон, экспрессирующий FBD r20 кД, подвергали ферментации и получали осадок бактериальных клеток, содержащих FBD-полипептид r20 кД.
D. Ренатурация и очистка рекомбинантного полипептида (r31 кД) области связывания фибрина.
Вся процедура состояла из трех стадий.
1. Грубая обработка бактериального осадка.
2. Ренатурация/повторное окисление.
3. Очистка.
1. Грубая обработка.
Осадок cначала суспендировали в 5 объемах 50 мМ Трис-HCl/50 мМ Na-ЭДТД, pH 8 (буфер 1); затем обрабатывали 1,2 объемами буфера 1, содержащего 100 мг/л лизоцима (2 ч перемешивали при 37oC). В полученную в результате суспензию добавляли Тритон Х-100 (до 1%), спустя 30 мин при комнатной температуре суспензию центрифугировали, а осадок снова суспендировали и промывали дважды водой. r31 кД оставался в осадке, как было установлено при помощи SDS-PAGE гелей.
Промытый осадок суспендировали в 14 объемах 10 мМ Трис-HCl/5 мМ, ЭДТА/ 2 мМ PMSF/2 мМ 6-аминокапроат, pH 7,5 (буфер А), а затем последовательно обрабатывали буфером А, содержащим: а) 1% децил сульфата; б) 1% децил сульфата/5% глицерина; в) 5% глицерина. Финальную обработку осуществляли буфером А без добавок.
2. Ренатурация/повторное окисление
Принцип: осадок растворяли в 6 м гуанидин-HCl (GuCl) в присутствии восстанавливающего (тиол)агента, такого, как глютатион (GSH), и ренатурировали/повторно окисляли при более низкой концентрации CUCl путем добавления окисленного глютатиона (GSSG).
Принцип: осадок растворяли в 6 м гуанидин-HCl (GuCl) в присутствии восстанавливающего (тиол)агента, такого, как глютатион (GSH), и ренатурировали/повторно окисляли при более низкой концентрации CUCl путем добавления окисленного глютатиона (GSSG).
Промытый осадок со стадии 1 (выше) растворяли в 150-700 объемах 6 М GuCl/3 мМ GSH в буфере А. Концентрацию GuCl постепенно снижали сначала до 2 м, а затем до 1 м и 0,5 м, одновременно сохраняя концентрацию всех других компонент постоянной (объем на этой стадии соответствовал 500 - 1000-кратному объему осадка). При одной из промежуточных концентраций GuCl, а именно между 0,5 и 2 м, инициировали восстановление конформации при помощи добавления 0,3 мМ GSSG и инкубирования при комнатной температуре в течение 24 - 28 ч. Ренатурированный 31 кД затем подвергали диализу против буфера А без добавок.
3. Очистка.
Концентрация: большой объем реактивированного 31 кД сначала подвергали центрифугированию, чтобы удалить нерастворимую часть, которая не содержит 31 кД, а затем перед концентрированием и первичной очисткой на колонке с гепарин-сефарозой подвергали диализу против Трис-HCl, pH 7,8.
Усовершенствованные процедуры для реактивации и очистки фрагментов полипептида описаны в примере 5.
Пример 3. Фармакодинамика фрагментов полипептида области связывания фибрина r 31 кД, r 20 кД, r 18,5 кД и r12 кД.
Интенсивность и разрешение изображения сгустка ( тромба) регулируется взаимодействием скорости включения радиофармацевтического агента и скоростью очищения от него крови. Для того чтобы выявить метаболическое поведение области связывания фибрина r 31 кД и сравнить его с фибронектином (FN), в область связывания фибрина r31 кД и фибронектина плазмы включали 125I при помощи ICI-процедуры (24) и меченые формы вводили внутривенным способом крысам.
Установлено, что скорости очищения двух радиоактивных молекул различны, и спустя 5 ч циркулирует только 3% FBD r31 кД, но 20% FN.
Несколько крыс держали в отдельных метаболических клетках, а накопившуюся мочу и испражнения собирали через 7 ч и 24 ч. Примерно 30% инъецированной радиоактивности 1251-r31 кД выводилось с мочой в течение первых 7 ч, а спустя 24 ч выводилось более 90%. Вся радиоактивность в моче была растворима в трихлоруксусной кислоте, что является указанием на протеолитическое разрушение. Анализ различных органов (почки, желудок, печень, легкие, матка, яичники, надпочечники, толстая кишка, подвздошная кишка, кожа, головной мозг, глаза, мускулы, мочевой пузырь, сердце, селезенка, трахея, аорта и полая вена) не обнаружил какого-либо специфического накопления. В большинстве органов удельная радиоактивность (число отсчетов /мин/г/ткани) было ниже, чем для сыворотки.
Эти результаты указывают на то, что экзогенный рекомбинантный амино-терминальный полипептид FBD размером 31 кД постепенно разрушается и выводится из тела. Фармакологическое поведение не согласуется с кинетикой первого порядка, что может указывать на то, что этот полипептид умеренно распределяется в тканях и частях тела, отличных от крови. Это также следует из обнаруженного факта, состоящего в том, что степень разрушения не увеличивается в течение периода в 4 - 24 ч, что может быть результатом постепенного высвобождения полипептида из отдельных частей тела. Характерное и относительно раннее появление метаболитов в моче указывает на то, что этот полипептид легко выводится через почки. Отсутствие накопления материала в печени может служить указанием на то, что этот орган не является основным местом такого разрушения и не включается в детоксификацию.
Относительно короткий период полураспада FBD 31 кД является важным фактором для его использования с целью диагностической визуализации тромба. В рекомбинатный FBD 31 кД (r31 кД) можно включить радиоактивную метку или метку другого типа, а затем ввести его в кровь с целью визуализации тромба.
Более короткий период полураспада молекулы также является важным фактором, когда его используют для предотвращения образования сгустков. Необходимо отметить, что гепарин, терапевтический агент, используемый в настоящее время для этих целей, "страдает" слишком большим периодом полураспада.
Аналогичный эксперимент осуществляли с использованием иодированной области связывания фибрина 31 кД плазматического фибронектина: при этом отмечали те же фармакокинетики и распределения радиоактивности.
Заметим, что плазматический FBD в 31 кД содержит первые 259 аминокислот FN, в то время как рекомбинантный FBL 21 кД содержит перовые 262 аминокислоты FN и дополнительный N-концевой метионин.
Фармакокинетики полипептидов области связывания фибрина r20 кД, r18,5 кД и r12 кД.
Аналогичные эксперименты осуществляли с использованием полипептидов области связывания фибрина r20 кД, r18,5 кД и r 12 кД, полученных, как это описано в примерах 2, 4 и 5. Как было установлено, фармакокинетики этих полипептидов очень похожи на фармакокинетику полипептида r 31 кД.
Пример 4. Экспрессия и ферментация других полипептидов области связывания фибрина (FBD).
В примере 2 описана экспрессия частичного FBD r20 кД и FBD полной длины r31 кД, а в публикации РСТ N WO 90/07577 заявителя (примере 24) предложена улучшенная процедура для реактивации и очистки FBD 31 кД. Далее описывается конструкция плазмид для экспрессии других полипептидных фрагментов FBD.
А. Экспрессия полипептидов FBD r12 кД.
Плазмида pFN 975-25 (FNCC N 67832) экспрессирует FBD фибронектина полной длины r 31 кД. Из нее плазмиду pFN 196-2, которая экспрессирует часть FBD, конструировали, как это показано на фиг. 16. Этой плазмидой трансформировали штамм Escherichia coli A 1645, а затем штамм Escherichia coli A 4255, она сдана на хранение в штамме А 4255 в АТСС под шифром хранения N 68328. Эти трансформированные клетки эффективно экспрессируют часть полипептида FBD в количествах, составляющих примерно 5% от общего клеточного протеина. Этот полипептид имеет мобильность, соответствующую примерно 14,4 кД на SDS-полиакриламидных гелях в восстанавливающих условиях. Он содержит первые 109 аминокислот фибронектина и дополнительный метиониновый остаток на N-конце. На протяжении этой патентной заявки такой полипептид именуется как фрагмент полипептида r12 кД или FBD r12 кД.
B. Улучшенная экспрессия полипептида FBD в 12 кД.
Плазмида pFN 196-2 (ATCC N 68328), экспрессирующая фрагмент полипептида FBD 12 кД (2 "пальца") под контролем промотора λPL и сайта связывания рибосом β-лактамазы, была описана выше. Для того, чтобы повысить скорость экспрессии фрагмента 12 кД, плазмиду pFN 203-2 конструировали так, как это показано на фиг. 25 и 26 и указано в описании фигур. Плазмида pFN 203-2 экспрессирует фрагмент 12 кД под контролем λPL-промотора сайта связывания рибосом CII и последовательности завершения транскрипции trp размером 36 по. Плазмида pFN 203-2 сдана на хранение в ATCC в E. coli A4255 под шифром хранения N 68606. Эти трансформированные клетки, как было установлено, экспрессируют фрагмент полипептида FBD 12 кД в количествах, составляющих примерно 12 - 18% общего клеточного протеина.
Условия ферментации и роста.
Клон, экспрессирующий полипептид FBD r12 кД, ферментировали в обогащенной среде (экстракт дрожжей и гидролизат казеина), содержащий ампициллин. Выращивание осуществляли при 30oC. Экспрессию получали индукцией при 42oC в течение 2 ч, а затем получали лепешку бактериальных клеток, содержащих полипептид FBD r12 кД. Аналогичным образом получали осадок клеток, содержащих другие протеины.
C. Экспрессия модифицированного FBD-полипептида 12 кД (12 кД').
Плазмиду pFN 975-25 (ATCC N 67832), которая обеспечивает экспрессию FBD полной длины (r31 кД), использовали для конструирования плазмиды pFN 197-10, которая экспрессирует модифицированный полипептид r12 кД (r12 кД'), как это показано на фиг. 17. Последовательность FBD-фибронектина модифицировали для того, чтобы получить сайт NdeI сразу же после нуклеотида 340. Этой плазмидой трансформировали штамм Escherichia coli A1645, а затем штамм Escherichia coli A4255. Эти трансформированные клетки, как было показано, эффективно экспрессируют модифицированный r12 кД в количествах, составляющих примерно 5% общего клеточного протеина. Этот полипептид имеет мобильность, аналогичную немодифицированному FBD 12 кД (устанавливали на восстановленных SDS-полиакриламидных гелях). Он содержит первые 109 аминокислот фибронектина, а затем дополнительные аминокислоты, гистидин и метионин. На N-окончании полипептида имеется дополнительный метионин. Этот полипептид обозначали как полипептид r12 кД' или FBD r12 кД'.
D. Экспрессия полипептида FBD 18,5 кД.
Как описано выше (пример 2A), фрагмент FBD 20 кД, экспрессируемый плазмидой pFN 949-2 (ATCC N 68456), содержит до 20 дополнительных аминокислот из вектора pBR 322 из-за считывания после окончания гена FN в отсутствие правильно расположенного кодона завершения транскрипции TAA. Для того, чтобы обеспечить более аутентичный "3-пальцевый" фрагмент полипептида FBD, конструировали плазмиду, кодирующую полипептид FBD 18,5 кД.
Эта конструкция приведена на фиг. 23 и описана в описании фигуры. Полученная в результате плазмида, обозначенная pFN 208-13, экспрессирует фрагмент полипептида FBD 18,5 кД под контролем PL-промотора и сайта связывания рибосом β -лактамазы. Плазмида pFN 208-13 сдана на хранение в ATCC в A4255 E. coli под шифром хранения N 68456. Эта плазмида экспрессирует первые 154 аминокислоты фибронектина с дополнительным N-концевым метионином.
Пример 5. Восстановление конформации и очистка рекомбинантных полипептидов 20 кД и 12 кД области связывания фибрина в фибронектине.
Процедура восстановления структуры и очистки полипептидов r20 кД и r12 кД состоит из трех стадий:
1. Грубая обработка бактериального осадка.
1. Грубая обработка бактериального осадка.
2. Реактивация/повторное окисление.
3. Очистка.
1. Грубая обработка.
1.1. Промывка и экстрагирование осадка.
Осадок бактериальных клеток, полученный, как это описано в примере 2 для полипептида r20 кД и как это описано в примере 4 для полипептида r12 кД, разрушали и промывали по существу так же, как для полипептида r31 кД (см. публикацию PCT N WO 90/07577 заявителя, с. 121 и след.); однако в процедуру экстрагирования, используемую как для полипептида r20 кД, так и r12 кД, вносили изменения. Ниже приведен пример процедуры промывки и экстрагирования, осуществляемых на осадке клеток, содержащих полипептид r20 кД; полипептид r12 кД экстрагировали аналогичным образом.
1.2. Методика.
Бактериальный осадок, содержащий полипептид r20 кД, получали, как это описано в примере 2, используя для ферментации штамм Escherichia coli A4255, несущий плазмиду pFN 949-2. Часть осадка (14,8 г) суспендировали в 10 объемах 50 мМ Трис-HCl, 50 мМ ЭДТА (буфер B), pH 7,5. Суспензию гомогенизировали в течение 15 - 30 с со средней скоростью, обрабатывали ультразвуком 3 раза по 4 мин с пульсациями и центрифугировали со скоростью 15000 об/мин в течение 30 мин. Осадок снова суспендировали в 2,4 объемах (36 мл) буфера B. Добавляли лизоцим (0,1 мг/мл) и суспензию инкубировали в водяной ванне при 37oC в течение 2 ч при перемешивании. Добавляли Тритон X-100 до финальной концентрации 1%, перемешивали при комнатной температуре 30 мин и центрифугировали. Осадок снова суспендировали три раза в 148 мл воды (т.е. 10 объемах исходного осадка), гомогенизировали, перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре и центрифугировали. Результирующий осадок имел массу приблизительно 1,5 г, т.е. только 10% от исходной массы, однако оба полипептида r20 кД и r12 кД остаются в этом объеме, что было установлено при помощи электрофореза в SDS-полиакриламином геле. Промытый и экстрагированный осадок хранили в замороженном виде при -20oC до последующей обработки.
2. Солюбилизация и ренатурация полипептида.
2.1. Используемые реагенты и процедура отличаются в этом случае от тех, что использовались для полипептида r31 кД. Осадок полипептида r20 кД или r12 кД растворяли в 6 М гуанидин-HCl (GuCl) в присутствии 50 мМ β-меркаптоэтанола, а затем после десятикратного разбавления подвергали окислению воздухом.
2.2. Методика.
Замороженный осадок r20 кД (1,5 г) подвергали солюбилизации и гомогенизации в 10 объемах 10 мМ Трис-HCl, 5 мМ ЭДТА (буфер C), pH 8,0, содержащих дополнительно 6 М гуанидин-HCl. Образец восстанавливали добавлением 57 μл неразбавленного β-меркаптоэтанола (финальная концентрация 50 мМ) и перемешивали в герметически закрытом сосуде в течение 30 мин. Затем его по каплям (со скоростью примерно 5 мл/мин) добавляли в 10 объемов (148 мл) буфера C, pH 8,0 и давали возможность окислиться. При этом содержимое постоянно и осторожно перемешивали (в открытом химическом стакане) в течение 48 - 72 ч при комнатной температуре. В качестве алтернативы окисление осуществляли в закрытом сосуде в присутствии 0,3 мМ GSSG. Хотя на этой стадии уже наблюдается некоторое осаждение полипептида, суспензию, содержащую осадок, подвергали диализу в течение 24 ч против 15 объемов буфера C, pH 8,5 с тремя заменами буфера. Диализат затем подвергали центрифугированию в течение 45 мин со скоростью 15000 об/мин (22500 • g) в высокоскоростной центрифуге Бекмана, снабженной двигателем JA-17. При этом удаляются многие загрязняющие протеины и агрегаты r20 кД или r12 кД, которые продуцируются во время окисления.
3. Очистка и характеристика полипептида.
Так как расположение сайта связывания гепарина внутри области связывания фибрина неизвестно, не было уверенности, что новые, более короткие, полипептиды r20 кД и r12 кД будут связываться с гепарином-сефарозой. Однако заявитель обнаружил, что более короткие молекулы обладают этим свойством.
Заявитель установил, что колонка из фенил-сефарозы, как в случае r31 кД, для очистки окисленных полипептидов r20 кД или r12 кД не нужна. Здесь значительное улучшение в том, что касается удаления примесей, неправильно восстановленных молекул и димеров, достигается, если образец подвергнуть хроматографии на колонке из Q-сефарозы, причем перед тем, как осуществить хроматографию на колонке из гепарин-сефарозы. В некоторых случаях полипептид концентрировали на системе типа Pellicon (фирма Millipore Corp.), используя мембраны с соответствующим ограничением, а именно 10 кД для полипептида r20 кД и 3 кД для полипептида r12 кД, перед тем как загрузить материал на колонку из Q-сефарозы. Колонку гепарин-сефарозы также использовали для концентрирования обоих полипептидов. Ниже приведен пример процедуры очистки, используемой в случае полипептида r20 кД.
3.1. Хроматография на Q-сефарозе.
Одну треть окисленного r20 кД (47 мл) наносили на 10 мл проточную колонку из Q-сефарозы, которую предварительно уравновешивали буфером C, pH 8,5 (скорость потока 1,2 мл/мин). Вытекающую фракцию собирали и хранили (70 мл). Полипептиды, связанные с колонкой, элюировали буфером C, pH 8,5, содержащим 0,5 М NaCl, а колонку регенерировали при помощи 0,5 М NaOH.
3.2. Хроматография на гепарин-сефарозе.
Поток, прошедший через колонку Q-сефарозы, наносили на 10 мл колонку гепарин-сефарозы, предварительно уравновешенную буфером pH 8,5 (объемная скорость 0,5 мл/мин). Вытекающая фракция содержала главным образом примеси и неправильно ренатурированный полипептид r20 кД. Очищенный (до чистоты более 95%) полипептид r20 кД элюировали буфером C, pH 8,5, содержащим 0,5 NaCl, а колонку регенерировали в том же буфере, содержащем доолнительно 6 М гуанидина-HCl. Приведены таблицы для общей очистки r20 кД (табл. 1) и r12 кД (табл. 2).
3.3. Характеристика полипептидов.
Супернатант после отделения бактериального осадка для получения полипептидов r20 кД и r12 кД, а также порции последовательных фракций с колонки анализировали на наличие полипептида и анализировали также при помощи электрофореза в SDS-полиакриламидном геле; профили их элюирования получали на колонке из Superose 12, соединенной либо с FPLC, либо с ЖХВД. Эти профили на различных стадиях реактивации, а также очистки приведены для r20 кД (фиг.21) и для r12 кД (фиг. 22). Очищенные полипептиды r20 кД или r12 кД элюируют в виде отдельных четких полос. Эти профили подтверждают результаты, полученные в SDS-PAGE-гелях при невосстанавливающих условиях; полосы для образцов обоих полипептидов (r20 кД и r12 кД) являются недиффузионными, что указывает на наличие одной молекулярной формы. В случае r20 кД полоса невосстановленного полипептида проступает (как в случае полипептида r31 кД) быстрее, чем полоса для восстановленной формы. Такого различия, однако, не было отмечено в случае полипептида r12 кД. Дополнительные подробности о свойствах полипептидов FBD приведены в примере 9.
Эти FBD-полипептиды пригодны для радиомечения с целью использовать их в качестве радиофармацевтических агентов для визуализации тромбов и атеросклеротических патологий.
Преимущества использования для вышеупомянутых целей меньших по сравнению с r31 кД FBD-полипептидов (r20 кД и r12 кД) послужили причиной направленного поиска заявителем более простого способа их получения. Приемы, которые описаны выше, являются более оперативными и более простыми по сравнению с приемами, предложенными для реактивации и очистки полипептида r31 кД. Кроме того, предлагаемые процедуры приводят к более высокому выходу, чем процедура для полипептида r31 кД, и к более высокому выходу полипептида (до 10 мг/мл).
Пример 6. Биологическая активность полипептидов области связывания фибрина r31 кД, r20 кД и r12 кД.
Биологическая активность полипептида FBD r31 кД, которая касается его связывания со сгустками фибрина in vivo и in vitro связывания с бактерией и связывания с внеклеточной матрицей, описана в публикации PCT N WO 90/07577 заявителя, с. 134 и след. В этом примере приводятся сведения о биологической активности FBD-полипептидов r20 кД и r12 кД.
А. Сравнение связывания с предварительно образованным фибриновым сгустком 125I-меченых r31 кД, r20 кД, r12 кД и плазматического FBD.
Связывание с фибриновыми сгустками определяли следующим образом (реакция II).
Стадия 1. Образование фибринового сгустка.
Его можно получить с использованием одной из двух следующих процедур .
а) При помощи инкубирования при 37oC 20 μл обработанной цитратом цельной человеческой крови с 5 мМ CaCl2, 1 ед/мл тромбина и PBS в финальном объеме 250 μл. Реакцию прекращали спустя 45 мин при помощи центрифугирования и промывки осадка (дважды) 1 мл PBS.
b) При помощи инкубирования при 37oC 20 μл не обработанной цитратом цельной человеческой крови. Реакцию прекращали спустя 150 мин при помощи центрифугирования и промывки, как в процедуре а).
Стадия 2. Связывание 125I-FBD-полипептида с предварительно образованным фибриновым сгустком.
Сгустки инкубировали при 37oC в конечном объеме 260 μл PBS с 125I-rFBD-полипептидом. Как указано в каждом эксперименте, можно добавлять другие компоненты. Реакцию связывания прекращали спустя 45 мин при помощи центрифугирования и промывки три раза PBS. Пробирки, содержащие осадок 125I-rFBD-фибрина, измеряли на радиоактивность при помощи гамма-счетчика.
Результаты.
Полученные результаты показывают (фиг. 20), что плазматический 31 кД связывается в той же степени, что r31 кД, в то время как полипептиды r20 кД и r12 кД связываются только примерно в половине случаев по сравнению с полноразмерной (31 кД) молекулой. Однако уровень связывания полипептидов r20 кД и r12 кД все-таки достаточно высок, чтобы обеспечить возможность применения радиомеченных полипептидов r20 кД и r12 кД в качестве радиофармацевтических агентов для визуализации тромбов.
B. Связывание 125I-r12 кД со свежими или замороженными сгустками.
Для того, чтобы изучить эффект замораживания сгустков перед использованием в экспериментах со связыванием с FBD-полипептидами, осуществляли следующий эксперимент. Фибриновые сгустки либо использовали свежими, либо после хранения при -70oC в двухстадийной реакции связывания с 125I-r12 кД FBD, полученным, как это описано в примере 6.
Этот эксперимент осуществляли в присутствии трансглютаминазы или без нее. Результаты показали, что имеется лишь незначительный эффект замораживания на способность сгустков связывать FBD r12 кД. В общем случае замороженные сгустки без добавления трансглютаминазы дают результаты, аналогичные свежим сгусткам в присутствии трансглютаминазы; эффект на реакцию связывания экзогенной трансглютаминазы при использовании замороженных сгустков отсутствует.
C. Сравнение рекомбинантных FBD-полипептидов 12 кД, 20 кД и 31 кД в модели венозного тромба, индуцированного спиралью из нержавеющей стали.
Три рекомбинантных полипептида, меченных 125I, как это описано в примере 3, использовали в модели крысы, описанной ниже.
Самок крыс Вистар (200-250 г) подвергали анестезии при помощи введения Кетамина HCl и Ксилазина HCl. Делали срединную лапаротомию и вскрывали внутреннюю полую вену. Спираль из проволоки из нержавеющей стали вставляли в просвет вены в точке, расположенной несколько ниже соединения, и разрез зашивали. Каждое вставленное средство отдельно взвешивали перед вставкой и каждый вес фиксировали. Через 3 ч после операции животным внутривенным способом вводили 1 мл 0,9% раствора NaI для того, чтобы насытить иодидом щитовидную железу. Один час спустя крысам вводили внутривенным способом 125-I-rFBD/5 • 106 отсчетов/мин; 100 μг/кг). Полипептид метили, как это описано в примере 3. Через 24 ч после применения меченого полипептида брали кровь при помощи укола в сердце, после чего крыс усыпляли. Сегмент вены, несущей спираль, удаляли. В одной группе сегменты, несущие спираль, взвешивали как таковые и использовали для изменения радиоактивности (группа "Тромб на месте"). В другой группе разрезали вену в продольном направлении и спирали, несущие тромбы, аккуратно извлекали, взвешивали и измеряли радиоактивность. Уровни радиоактивности крови измеряли, используя периферийную кровь.
Результаты, приведенные на фиг. 19 показывают, что каждая из трех молекул специфически локализована в сгустках. Оказалось, что удельная радиоактивность сгустков выше для более длинных молекул, чем для более коротких полипептидов (143 000, 78500 и 63 000 отсчетов/мин/г для сгустков с r31 кД, r20 кД и r12 кД полипептидов соответственно), но эти отличия не были статистически значимыми. Значения удельных радиоактивностей для крови (спустя 24 ч) точно также связаны с молекулярным размером (7040, 5016 и 3300 отсчетов/мин/г для полипептидов r31 кД, r20 кД и r12 кД соответственно) и могут отражать различия в скорости очищения крови этих молекулярных видов. Следовательно, вычисления отношения удельных радиоактивностей сгустка к крови давали результаты, значения которых похожи для трех различных полипептидов и изменяются в области вблизи 20. Эти результаты указывают на то, что все три вида FBD (или другие фрагменты FBD) могут служить для визуализации тромбов.
Пример 7. Введение метки в полипептиды с целью применения для визуализации атеросклеротических поражений и тромбов.
В полипептиды области связывания фибрина, описанные в этой патентной заявке (полипептиды r31 кД, r20 кД и r12 кД), может быть введена радиоактивная метка. В примере 3 описана процедура введения метки в три указанных полипептида при помощи иода 125 (125I), который имеет большой период полураспада (60 дней).
Другим радиоактивным иодом, который можно использовать для введения метки в FBD-полипептиды, используя известные приемы, например, тот, что описан Уехарой и др. (1), является иод 131 (131I). 131I также имеет относительно продолжительный период полураспада (8 дней).
В оптимальном случае радиофармацевтический агент для клинической визуализации атеросклеротических повреждений и тромбов должен давать положительные результаты в течение первых нескольких часов после инъекции (33). Поэтому для такого испытания можно использовать более коротко живущие радиометки, например индий-III (IIIIn) или технеций-99М (99мТc) (период полураспада 67 ч и 6 ч соответственно (32).
Введение метки в FBD-полипептиды при помощи 99мTc может быть осуществлено с использованием известных приемов (21, 33, 34, 35). 99мTc является весьма эффективным диагностическим радионуклеотидом ввиду его короткого периода полураспада, уровня обнаружения в 140 KeB на гамма-счетчике, отсутствия облучения другими частицами, дешевизны и широкой доступности.
Другой коротко живущей меткой с низкой энергией является иод-123 (123I) с периодом полураспада 13,3 ч.
можно использовать для введения в FBD-полипептиды также криптон-81м (81мKr) и ксенон-133 (133Xe), которые имеют период полураспада 5,3 дня, как это указано Найтом (4). Потенциальной радиометкой является галлий-67 (67Ga): как указано Ямамото (36), 67Ga имеет период полураспада 78 ч. В одном из вариантов воплощения заявитель вводил метки в r31 КД, r20 кД, r18,5 кД и r12 кД полипептиды и плазматический фрагмент в 31 кД с использованием IIIIn, следуя процедуре, описанной для альбумина человеческой сыворотки в Hnatowich, D.J., Layne, W.W. и Chilcs, R.L., J.Appl. Radiat.Inst., т. 33, с. 327, (1982). Предварительные эксперименты показали, что меченые IIIIn FBD - полипептиды связываются с образованными ранее тромбами in vitro (измерения осуществляли при помощи двухстадийной реакции, пример 6) и с тромбами in vivo (измерения осуществляли при помощи модели, описанной в примере 6.C). Выявлено высокое отношение тромб:кровь в области 80 - 200 спустя 24 ч.
Процедура радиомечения протеинов 12 кД и 18,5 кД.
ДТПК - модификацию (диэтилентриаминпентауксусной кислотой) фрагментов полипептида FBD в 12 кД и 18,5 кД осуществляли в целом в соответствии с известными приемами (Hnatowich, D. J. Layne, W.W. and Childs, R.L. (1982) Int. J.Appl.Radiat-Isot т. 33, стр. 327-332; Knight, L.C. и др. (1987) Biochim, Biophys. Acta т. 924, с. 45-53), используя циклический ангидрид ДТПК. Порции раствора сухого хлороформа, содержащие рассчитанные количества ДТПК-эквивалентов, выпаривали и осуществляли реакцию с протеинами в забуференном либо фосфатом, либо бикарбонатом физрастворе (pH 7,4 и 8,0 ± 0,2 соответственно). Избыток (гидрализованной) ДТПК удаляли при помощи глубокого диализа. Мечение осуществляли при помощи не содержащего носителя IIIIn в HCl-растворе, нейтрализованном до примерно pH 6 при помощи ацетата натрия. В одном эксперименте (в PBS) метили полипептид 12 кД, получаемый в соответствии с описанием из примера 5, что давало отношение содержания тромб/кровь (в модели крысы), равное 86. При этом использовали расчетный молярный избыток ДТПК, равный 5, т.к. в прототипе 12 кД имеются 5 лизиловых ε -амино групп и 1 α -амино группа. При мечении при помощи IIIIn концентрацию свободного (несвязанного) IIIIn оценивали как менее 15% (при помощи TCX).
В другой серии экспериментов (в BBS) использовали отношение между ангидридом ДТПК и либо протеином 12 кД, либо протеином 18,5 кД 1:1.
Для того, чтобы оценить число ДТПК-остатков, включаемых в каждую молекулу полипептида 12 кД, ДТПК - модифицированный протеин (перед отделением избытка ДТПК) метили при помощи IIIIn (Найт и др., см. выше). Число включаемых ДТПК-остатков, как было установлено, составляет 0,12 на молекулу полипептида 12 кД. ДТПК-меченые фрагменты FBD r12 кД и r18,5 кД имели идентичные профили элюирования на Superose 12 (гель-фильтрация) с профилем элюирования для контрольного модифицированного протеина (времена удерживания 19,17 мин и 18,29 мин соответственно - контрольные значения приведены в табл.4). При введении метки IIIIn, после отделения избытка ДТПК было установлено, что количество свободного (несвязанного) IIIIn составляет 28 и 29% протеина 12 кД и 18,5 кД соответственно. Этим обеспечивается отношение тромб/кровь (в модели крысы) соответственно 27 и 25.
Визуализация с использованием металлов вместе с ионным ЯМР, ультразвуковым и рентгеновским облучением описана в патенте США N 4647447. Кроме того, в столбце 7, строка 42, упомянуто связывание антитела с хелатами металлов. Моноклональные антитела, меченные полимерными парамагнитными хелатами, и их использование в соответствии с приемами ИЯМР (ионного ядерного магнитного резонанса) также известны (Shreve, P. и др., Magnetic Resonance in Medicine, т. 3, с. 336-340. 1986 и Brady, T. и др., Proceedings of the Society of Magnetic Resonance in Medicine, Second Annual Meetinge, Soc. of Magnetic Resonance in Medicine, Inc. San Fransisco 1983, где содержится ссылка на Koutcher, J. и др. J.Nucl.Med., т. 25, с. 506-513, 1984).
Пример 8. Дополнительные эксперименты, подтверждающие биологическую активность различных FBD-полипептидов.
Биологическая активность FBD-полипептидов r31 кД, r20 кД, r12 кД описана в примере 6. В этом примере будут приведены дополнительные результаты, полученные с использованием фрагмента FBD 12 кД, который был получен в соответствии в описанием, приведенным в примерах 4 и 5, и фрагмента FBD 18,5 кД, полученного как это описано в примере 4.
I. Связывание с фибриновым сгустком.
Образование сгустка и FBD-связывание осуществляли, как это описано ниже (модифицированная версия двустадийной реакции, описанной в примере 6). Чтобы избежать артефактов агрегации и осаждения FBD-полипептидов, финальную стадию центрифугирования исключали, а сгусток переносили в новую пробирку и тщательно промывали.
а. Коагуляция "предварительно образованного сгустка".
Реакционные смеси (300 μл), полученные в силиконизированных пластиковых пузырьках (7 мл) от гамма-счетчика, содержали 150 μл смеси 1, состоящей из 0,2 X буфера Тирода ("1 x буфер Тирода": 1 мМ Хепес, pH 7,35, декстроза 0,2%, 27 мМ NaCl, 0,76 мМ NaH2PO4, 0,54 мМ KCl, 0,2 мМ MgCl2), 3 ед/мл Тромбина (фирма Сигма), 0,6% БСА (фирма Сигма), 15 мМ CaCl2, 150 мМ NaCl, 20 mM NaHCO3, pH 8,0, и 150 μл свежей, обработанной цитратом, человеческой крови.
Инкубирование проводили при 37oC в течение 3 ч. Сыворотку удаляли под вакуумом, а пробирки, содержащие фибриновый сгусток, хранили замороженными при -70oC. Предварительно образованные сгустки можно использовать в течение нескольких месяцев.
в. Связывание FBD с "предварительно образованным сгустком".
В пузырьки, содержащие "предварительно образованные сгустки" (после оттаивания при комнатной температуре), добавляли 300 μл 150 мМ NaCl, 20 мМ NaCOH3, pH 8,0, содержащих 1 • буфер Тирод, 0,6: БСА, 5 мМ CaCl2, и 0,15 μМ 125I-FBD. Реакцию связывания осуществляли (в отсутствии или присутствии 0,03% иодацетата натрия, который можно добавить в эту смесь, чтобы ингибировать активность эндогенной трансглютаминазы, фактора XIIIa) при 37oC в течение 18 ч. Далее сгусток переносили в силиконизированный пузырек, промывали 3 раза 1 мл "промывочного буфера" (20 мМ NaCHO3, 1% БСА, 1 мМ PMSF, 2 мМ ЭДТА) и проводили подсчет в гамма-счетчике.
Результаты сравнения плазматического и рекомбинантного 31 кД с рекомбинантным 18,5 кД, 12 кД, 45 кД (FBD в 12 кД, слитый с CBD 33 кД, полученный, как это показано на фиг.20) и CBD 33 кД приведены на фиг. 27. Все фрагменты FBD-полипептида связывались в одинаковой степени в то время, как CBD-полипептид связывался только в очень небольшой степени. 50 - 75% ингибирование, вызванное добавлением ингибитора фактора XIII иодацетата, показывает, что трансглютаминаза является активной в реакции связывания. Отсутствие эффекта ингибитора на связывание CBD 33 кД со сгустком указывает на то, что связывание CBD со сгустками происходит согласно другому, возможно, неспецифическому механизму.
II. Связывание с сосудистыми компонентами.
В дополнение к специфическому связыванию с фибрином FBD-полипептиды также демонстрируют некоторую степень неспецифического связывания с другими сосудистыми компонентами, с которыми они вступают в контакт. Примерами таких сосудистых компонент являются эндотелиальные клетки (EC), внеклеточная матрица (ECM) и даже сам фибронектин (FN). Это неспецифическое связывание является одним из факторов, который определяет "уровень отсчета" при осуществлении процедур диагностической визуализации. Чем ниже неспецифическое связывание, тем более эффективна визуализация и тем меньше необходимо применять радиоактивного реагента к пациенту. Было проведено сравнение неспецифического связывания с сосудистыми компонентами фрагмента FBD 12 кД и FBD-полипептида 31 кД.
Порции, содержащие 0,3 М 125I - 12 кД или 125I - 31 кД (5 • 105 отсчетов/мин μг и 7,5 • 105 отсчетов/мин μг соответственно в 1 мл PBS, включающего 0,1% BCA, добавляли в сдвоенном анализе в 35 мм чашки Петри (фирма Falcon), содержащие конфлюент эндотелиальных клеток (EC), внеклеточную матрицу (ECM), (Eldor и др., Blood, т. 65, с.1477, 1985) или иммобилизованный человеческий фибронектин (FN) (1 мл наносили на пластинку с PBS, содержащую 50 μг/мл FB, после инкубирования при 4oC в течение ночи, и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре с 1 мл PBS, содержащим 1% BCA для блокировки). Символ "+TG" означает, что пластинки содержали также трансглютаминазу в концентрации 0,02 Ед/мл (фирма Сигма). Экспериментальные пластинки инкубировали 60 мин при 37oC в CO2-инкубаторе, промывали 3 раза 1 мл "промывочного раствора" (PBS, содержащий 2 мМ PMSF и 2 мМ ЭДТА). Затем связанную радиоактивность экстрагировали инкубированием 60 мин с "экстрагирующим раствором" (промывочный раствор, содержащий 1% дезоксихолата Na, 2 мМ PMSF, 2 мМ ЭДТА, 2 мМ NME и 2 мМ иодуксусной кислоты). Этот раствор затем переносили в пробирки и радиоактивность измеряли в гамма-счетчике.
Результаты показывают, что FBD-полипептид 12 кД связывается с сосудистыми компонентами (эндотелиальными клетками, внеклеточной матрицей и фибронектином) значительно слабее, чем 31 кД.
III. Бактериальное связывание.
Связывание FBD-полипептида 31 кД с S. aureus ранее было описано (см. Публикацию PCT WO 90/07577 заявителя с. 146 - 153). Аналогичные эксперименты, описанные ниже, показывают, что в контрасте с полипептидом FBD 31 кД фрагменты полипептидов FBD в 12кД и 18,5 кД не связываются с S. aureus непосредственно и не ингибируют связывание S. aureus с эндотелиальными клетками. Однако полипептид 20 кД несколько снижает связывание S. aureus, что можно объяснить дополнительными (неаутентичными) C-терминальными аминокислотами (см. пример 2), которые могут нарушать его активность.
В табл. 3 суммированы и сравниваются различные активности фрагментов FBD по изобретению.
Таким образом, очевидно, что фрагменты полипептида FBD в 18,5 кД и 12 кД обладают высокой специфичностью ковалентного связывания для фибрина вместе с более узким спектром активностей и более узкой по сравнению с 31 кД специфичностью по отношению к другим лигандам, таким, как сосудистые компоненты и бактерии. Это является предпочтительной характеристикой для агента визуализации тромба, которая гарантирует, что как диагностический реагент он обладает высоким сродством в отношении фибринсодержащего тромба и дает низкие уровни фона.
Пример 9. Характеристика фрагментов FBD.
I. Процедуры.
Фрагменты полипептидов FBD, полученные в соответствии с предлагаемыми в настоящей патентной заявке способами, анализировали и сравнивали в серии испытаний, осуществляемых при помощи следующих приемов, хорошо известных в этой области техники.
1. SDS - PAGE+ ME (β-меркаптоэтанол).
На 12,5% акриламидные плоские гели загружали протеин, который предварительно обрабатывали при помощи кипячения в течение 5 мин в буфере образца, содержащем 1% SDS - при восстанавливающих условиях (+1% ME). Электрофорез осуществляли с использованием 20 μг на полоску, а гели окрашивали бриллиантовой синью кумасси. Измеряли следующие параметры: a) мобильность, которая при сравнении с маркерами молекулярной массы (94, 67, 43, 30, 20,1 и 14,4 кД) может быть выражена в виде средней молекулярной массы для изучаемого протеина; b) однородность или чистоту, которую можно получить из относительных интенсивностей сильных и слабых полос.
2. SDS - PAGE - ME. На 12,5% акриламидные плоские гели нагружали протеин, который предварительно обрабатывали в течение 5 мин в буфере образца, содержащем 1% SDS - при невосстанавливающих условиях (-ME). Электрофорез осуществляли с использованием 20 μг на полоску и гели окрашивали бриллиантовой синью кумасси. Измеряли следующие параметры: a) мобильность, которая при сравнении с маркерами молекулярной массы (94, 67, 43, 30, 20,1 и 14,4 кД) можно выразить в виде средней молекулярной массы для изучаемого протеина; b) однородность или чистоту, которые можно получить из относительных интенсивностей сильных и слабых полос (в частности, при этих условиях можно оценить количества димеров, связанных дисульфидной связью).
3. Гель-фильтрация на Superose 12. Среднюю молекулярную массу и однородность препаратов протеина оценивали из профилей элюирования, полученных на колонке Superose 12 (HR10) 30, фирма Pharmacia Fine Chemicals, соединенной либо с аппаратом FPLC (жидкостной хроматографии с программированием скорости потока), снабженным контроллером для жидкостей хроматографии LCC-500 и записывающим средством (фирма Pharmacia Fine Chemicals), либо с системой ЖХВД (фирма Waters Associates), состоящей из 2 насосов (модели 501), инжектора (модели U6K) и автоматизированного контроллера градиента (модели 580), снабженного детектором с переменной длиной волны - Spectro - Monitor 3000 (LDC/Milton Roy) - и хромато-интегратором (фирма Merck-Hitachi, модели 2000). Эту колонку подвергали калибровке при помощи следующих стандартов молекулярной массы, для которых определяли время удерживания: БСА (67 кД), яичный альбумин (43 кД), химотрипсиноген (25 кД) и рибонуклеаза (13,7 кД). Объемные скорости составляли 0,8 мл/мин (использовался стандартный рабочий буфер, а именно 150 мМ NaCl - 20 мМ Трис.HCl, pH 7,8 - 8,0). Наблюдали за двумя параметрами: время удерживания и ширина полосы половинной высоты.
4. УФ-спектроскопия. Спектры получали при комнатной температуре в BBS или PBS при концентрациях 0,2 - 1 кг/мл на спектрофотометре (сканирующем) типа Филипс УФ/Вис модели РУ8720 (ширина полосы 2 нм), снабженном принтером/плоттером. Спектры измеряли на силикагелях типа Pye Unicam UV с длиной пробега 10 мм. Наблюдали за двумя параметрами: коэффициентом поглощения, а именно ε1% в λмакс спектров и отношением между поглощениями в λмакс и λмин.
5. Собственная флуоресценция. Данные получали на спектрофлуорометре модели ФП-770 при 25 ± 0,1oC. Длина волны возбуждения составляла 2250 нм и обе щели для возбуждения и эмиссии устанавливали на 5 нм. Концентрация протеина в анализе составляла 8 - 25 μг/мл либо в PBS, либо в свежем BBS, pH 7,5. Имеется заметная pH-зависимость обоих измеряемых параметров, т.е. λмакс (длина волны максимума спектра) и удельной интенсивности (интенсивность флуоресценции в максимуме спектра, нормализованная концентрацией протеина в мг/мл).
6. Аминокислотный состав. Это испытание осуществляли в соответствии с общепринятой методологией Стейна и Мура для аминокислотного анализа.
Использовали анализатор типа Biotronic LC 5000, серийный номер 515-01. Параметром, анализируемым этим методом, является число остатков каждой аминокислоты, исключая Cys и Trp.
7. Хроматография на гепарин-сефарозе. Образцы до 200 μл инъецировали в аналитическую колонку из гепарин-сефарозы (5,5 • 0,5 см), соединенную с ЖХВД-системой (фирма Waters Associates). Колонку предварительно уравновешивали 10 мМ фосфатом натрия, pH 6,5 мМ NaCl с объемной скоростью 0,5 мл/мин и промывали в течение 5 мин тем же буфером. Протеины элюировали в линейном градиенте от 75 до 500 мМ NaCl в буфере на 37,5 мин. Анализировали два параметра: время удержания (ret.time) и ширину полосы половинной высоты (half-ht.b.w.), которая определяет однородность пика.
8. Обращенно-фазовая ЖХВД хроматография. Образцы инъецировали на аналитическую колонку для обращенно-фазовой хроматографии типа Waters C18 Bondapak (30 • 0,39 см), соединенной с системой ЖХВД, которую предварительно уравновешивали 80% H2O, 0,1% ТФК% ацетонитрилом, 0,08% ТФК с объемной скоростью 1 мл/мин и промывали в течение 5 мин при помощи тех же растворителей. Протеины элюировали в линейном градиенте до 40% H2O - 0,1% ТФК: 60% ацетонитрила - 0,08% ТФК на 40 мин. Анализировали два параметра: время удерживания (ret.time) и ширину полосы половинной высоты (half-ht.b.w.), которая определяет однородность пика.
9. Триптические карты. Образцы 200 μг с различных режимов получения образцов переваривали в течение 10 мин при 37oC при различных долях трипсина (м/м в %: 0,25, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 и 10,0. Реакцию прекращали добавлением 5 мМ PMSF и последующим выдерживанием 30 мин на льду; затем пробу обрабатывали буферами образцов ± МЕ (см. разделы 1.1 и 1.2) и анализировали на 20% акриламидных плоских гелях, как это описано выше. Степень эквивалентности между структурами полос оценивали после окрашивания бриллиантовой синью кумасси.
10. Метод Эллмэна для определения тиола в протеинах. Такое определение осуществляли на денатурированных протеинах для того, чтобы обеспечить полный доступ к тиоловым группам.
Растворы 1. Гуанидин-HCl (самого чистого доступного качества) 7,2 М в 10 мМ Трис-HCl, pH 8 (GuCl).
2. DTNB (реагент Эллмэна) 5 • 10-3М в 100 мМ К-фосфатном буфере, pH 7.
Метод. Образцы протеина, содержащие 10 - 100 μМ тиоловых групп, доводили до объема 0,15 мл; добавляли чистый DTNB (без следов протеина) и 0,75 мл GuCl 7,5 М (финальная концентрация 6 м). После инкубирования в течение 15-30 мин при комнатной температуре "заготовку" протеиновых растворов анализировали в области 412 нм. 100 μл DTNB затем добавляли до конечной концентрации 5 • 10-4 М. После инкубирования в течение 30 мин при комнатной температуре образцы считывали в области 412 нм относительно "чистого" DTNB. Концентрацию вычисляли, используя ε = 13600 М-1 см-1.
11. Осаждение/адсорбция.
Пробиркам Эппендорфа, содержащим замороженный 125I-FBD, давали возможность оттаять при комнатной температуре, а затем резко перемешивали. Две порции по 5 μл брали для анализа радиоактивности. Раствор центрифугировали на высокой скорости в центрифуге Эппендорфа, в верхний слой сливали в другую силиконизированную пробирку. Две порции по 5 μл снова анализировали на количество отсчетов. Различия между радиоактивностью, полученной до и после центрифугирования, представляют "процент осаждения".
Если 125I-FBD хранят замороженным (при 70oC) в силиконизированных пробирках и буфере с высоким содержанием соли (0,6 М NaCl), протеин оказывается весьма стабильным. Однако, если хранение осуществляли в несиликонизированных пробирках в буфере с низким содержанием солей (150 мМ NaCl), 125I-FBD-осаждение может достигать 60-80% в течение 2-3 дней. При этих условиях и осаждение и адсорбция в пробирке являются существенными.
12. Реакция полипептидов FBD с 14С- путресцином.
Метод. Реакционные смеси (100 μл) в силиконизированных пробирках Эппендорфа содержат: 10 мМ CaCl2, 50 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 5 мМ ДТТ, 120 μМ 14С-путресцина (фирма Сигма), 6 μM FBD и 0,05 ед/мл трансглютаминазы печени морской свинки (сигма). После инкубирования при комнатной температуре в течение 0,15, 30 и 60 мин порции (10 μл) добавляли в пробирки, содержащие 200 μл стоп-реагента (0,4 мг/мл БСА, 50 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 20 мМ NaHCO, pH 8,0) при 0oC (на льду). Добавляли холодную 20% ТХУ (250 μл) и затем инкубировали 10 мин на льду, добавляли еще 3 мл холодной 20% ТХУ и содержимое пробирки фильтровали на фильтре из стекловолокна (Whatmab GF\C). Фильтры промывали 3 раза холодной 20% ТХУ и один раз 70% этанолом. Осаждаемый ТХУ радиоактивный материала анализировали в бета-счетчике. Доступность Gln#3 FBD для трансглютаминирования вычисляли на основе удельной активности 14С-путресцина и концентрации FBD в реакционной смеси; включение 5% от общего количества отсчетов эквивалентно 100% доступности.
13. Самоассоциация.
Реакцию осуществляли в 300 μл 150 мМ NaCl - 20 мМ NaHCO3, pH 8,0, содержащего также 0,1 х буфер Тирода; 0,6% БСА; 5 мМ CaCl2; 0,15 μМ 125I-FBD, 6 μл трансглютаминазы (0,02 ед/мл) (см. раздел 12).
Реакционные смеси инкубировали при 37oC в течение 18 ч, затем осуществляли вакуумную вытяжку реакционного раствора, промывали 3 раза 1 мл "промывочного буфера" и измеряли радиоактивность на гамма-счетчике.
II. Результаты.
Все FBD-полипептиды содержат дополнительный метионин на амино-окончании, а вместо пироглютаматного остатка, который является блокированным N-окончанием в p31 кД (полученным в результате пост-трансляционной модификации из кодированного Gln) за N-концевым Met следует остаток Gln. Положительная идентификация FBD-фрагментов также подтверждается анализом пятен Уэстерна на гелях, которые проявляются под действием анти-20 кД.
В табл. 4 приведены результаты измерений для анализируемых FBD-полипептидов (r12 кД и r18,5 кД получены в результате экспрессии плазмид pFN 203-2 и pFN 208-13 соответственно).
Пример 10. Мечение in vivo тромбов при помощи IIIIn FBD 12 кД и 18,5 кД в модели крысы со спиралью из нержавеющей стали.
Используемая модель является по существу той же, что была описана в примере 6.С. Фрагменты рекомбинантного полипептида в 12 кД, 18,5 кД и 31 кД метили с использованием IIIIn при помощи ДТПК - процедуры (пример 7). Меченые материалы (с удельной активностью приблизительно 5 106 отсчетов/мин/μг) вводили внутривенным способом (5 • 106 отсчетов/мин/крысу) несущим спираль крысам через 5 ч после введения спиралей. Спирали, несущие тромбы, удаляли и осуществляли подсчет через 24 ч после применения метки. На фиг. 28 приведены результаты удельной радиоактивности в спиралях и крови, а на фиг. 29 приведены соответствующие отношения тромба в крови. Наиболее высокие значения обнаруживали в тромбах группы с FBD 31 кД (по сравнению с группами, содержащими фрагменты FBD в 12 кД и 18,5 кД). Однако отношения тромб/кровь выше для FBD-фрагментов 12 кД и 18,5 кД благодаря более низким значениям для крови по сравнению с FBD 31 кД. Это может быть объяснено узким спектром специфичностей и активностей более коротких фрагментов по сравнению с полипептидом 31 кД (пример 8, табл. 3).
Пример 11. Использование IIIIn-ДТПК-модифицрованных FBD-протеинов с высокой радиохимической чистотой для того, чтобы получить высокие отношения тромба к крови в модели крысы.
1. Модификация и радиомечение ДТПК-модифицированных протеинов FBD.
Методологию ДТПК-модификации и радиомечения ДТПК-модифицированных протеинов FBD, описанную в примере 7, предварительно усовершенствовали. Это позволило получать высокие отношения тромб/кровь в модели крысы с введенной спиралью.
1.1. ДТПК-модификации. Все три рекомбинантные молекулы (r31 кД, r18 кД и r12 кД) модифицировали при помощи 20-кратного избытка ДТПК в 0,1 М HEPES-буфере, pH 7,0, а избыток ДТПК удаляли при помощи гелевой фильтрации.
1.2. Введение радиоактивной метки. Одно из изменений, введенных в процедуру, заключалось во введении радиометки при помощи IIIInCl3 при низком pH (0,2 М цитратный буфер, pH 5,7) (для уменьшения минимального количества радиоколлоидов).
Для удаления ионов тяжелых металлов, которые могут вытеснить желатный IIIIn из ДТПК-модифицированного протеина, осуществляли замену буферов раствора радиомеченного FBD на обработанные chelex-100 буферы.
2. Протокол модификации и введения радиометки в протеины FBD.
Подробное описание усовершенствованной процедуры ДТПК-модификации и введения радиометки в полипептиды r31 кД, r18,5 кД и r12 кД FBD приведено ниже.
2.1. Обессоливание. Протеины (все в 0,5 м NaCl в присутствии ЭДТА и других ингибиторов протеаз) обессоливали и переносили в буфер HEPES (0,1 М, pH 7). FBD 31 кД (27 мл, 0,6 мг/мл) обессоливали при помощи диализа, в то время как полипептиды FBD 18,5 кД (5 мл, 8,7 мг/мл) и 12 кД (5 мл, 5,6 мг/мл) обессоливали на колонках гель-фильтрации типа PD-10.
2.2. ДТПК-модификация. Ее осуществляли с 20-кратным избытком ангидрида ДТПК в течение 1 ч при комнатной температуре в объеме 27 мл в случае FBD 31 кД и 7 мл в случае FBD 12 кД и 18,5 кД. Порции (100 μл) модифицированной смеси брали с целью определения количества ДТПК-остатков, которые были включены в протеины, а свободную ДТПК удаляли из оставшегося материала при помощи гель-фильтрации на колонке Sephadex G-25, 2,6 • 60 см, которую предварительно уравновешивали буфером HEPES. Фракции (30 мл), содержащие протеины, собирали и получали концентрации фрагментов в 0,35 мг/мл, 0,8 мг/мл и 0,9 мг/мл для FBD r31 кД, r18?5 кД и r12 кД соответственно. Как было установлено, степень модификации, которую определяли при помощи ТСХ на силикагеле (проявляли в 85% метаноле), составляла 1,1, 0,8 и 1,6 для вышеуказанных полипептидов соответственно. ДТПК-модифицированные фрагменты FBD хранили замороженными при -10oC, и оттаявшие порции давали воспроизводимые результаты при введении радиометки с использованием IIIIn.
2.3. Введение радиометки. Мечение осуществляли с использованием IIIIn-Cl3, который предварительно переводили в 0,2 М цитрат натрия, pH 5,7, при помощи добавления 125 μл 1 М цитрата натрия, pH 5,7, в 500 μл не содержащего носителя сырьевого раствора IIIInCl3(IIIIn: 3,2 мCi/мл). Реакционная смесь для введения метки содержала (конечные концентрации): FBD-полипептид 0,2 μг/мл, HEPES 60 мМ, HCl 10 мМ, цитрат натрия 0,2 М и IIIIn 0,8 μCi/μл. Реакции давали возможность протекать в течение 1 ч при комнатной температуре. Радиохимическую чистоту анализировали при помощи ТСХ на силикагеле (проявляли в 85% метаноле), и для всех фрагментов FBD-полипептидов она изменяется в области 91-95%. Таким образом, удельная активность радиомеченных протеинов FBD составляет примерно 3,6 μCi/μг. Так как ионы металлов, потенциально содержащиеся в качестве следовых примесей в буферах, используемых в процессе введения радиометки, могут вытеснять IIIIn, который связан с ДТПК-модифицированными FBD-фрагментами, радиомеченные полипептиды пропускали через слой 10 мл Sephadex-25, который предварительно уравновешивали и проявляли при помощи БСА-содержащего буфера, BBS, обработанного Chelex-100 (чтобы удалить примеси ионов металлов).
3. Биологическая активность.
Биологическую активность испытывали in vitro при помощи связывания IIIIn-меченого, ДТПК-модифицированного FBD с предварительно образованными сгустками, а также in vivo на крысах (в модели с индуцированными спиралью венозными тромбами).
3.1. Связывание с предварительно образованными сгустками.
Это испытание осуществляли так же, как оно описано в примере 6 для иодированного FBD. Удельная активность трех IIIIn-меченых ДТПК-модифицированных фрагментов FBD составила 6 • 106отсчетов/мин μг протеина. Результаты экспериментов приведены в табл. 5 (второй столбец).
3.2. Венозные тромбы у крыс.
Используемая модель (венозные тромбы, вызванные спиралью) описана в примере 6.С. В этих экспериментах каждая группа состояла из 7 крыс, которым инъецировали 5 • 106 отсчетов/мин IIIIn-меченого, ДТПК-модифицированного фрагмента FBD с удельной активностью 6 • 106 отсчетов/мин/μг. Результаты этих экспериментов приведены в табл. 5.
IIIIn-меченого ДТПК-модифицированного фрагмента FBD (с удельной активностью 6 • 106 отсчетов/мин/μг белка).
Результаты приведены в табл. 5 (3 последних столбца).
Литература
1. Uehara, A., et al., J. Nuclear Med. 29: 1264-1267, 1988.
1. Uehara, A., et al., J. Nuclear Med. 29: 1264-1267, 1988.
2. Zoqhbi, S.S., et al., Invest. Radio. 20: 198-202, 1985.
3. Kakkar, V.V., et al., Lancet 1: 540-542, 1970.
4. Knight, L.C., Nuclear Med. Commun. 9: 849-857, 1988.
5. Knight, L.C., Nuclear Med. Commun. 9: 823-829, 1988.
6. Som. P., et al., J. Nuc. Med. 27: 1315-1320, 1986.
7. Palabrica, T.M., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 1036-40, 1989.
8. Akiyama, S.K. and Yamada, K.M., Adv. Enzymol. 57: 1-57, 1987.
9. Pierschbacher, M.D., et al., J. Biol. Chem. 257: 9593-9597, 1982.
10. Pande, H. and Shively, J.E., Arch. Biochem. Biophys. 213: 258- 265, 1982.
11. Hayashi, M. and Yamada, K.M., J. Biol. Chem. 258: 3332-3340, 1983.
12. Sekiguchi, K. and Hakomori, S.-I., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 2661-2665, 1980.
13. Ruoslahti, E., et al., J. Biol. Chem. 256: 7277-7281, 1981.
14. Owens, R.J. and Baralle, F.E., EMBO J. 5: 2825-2830, 1988.
15. Obara, M., et al., FEBS Letters 213: 261-264, 1987.
16. Obara, M., et al., Cell 53: 699, 1988.
17. Ichihara-Tanaka, K., et al., J. Biol. Chem. 265: 401-407, 1990.
18. Mandel, et al. , Principal and Practice of Infectious Disease 2: 1531-1552, 1979.
19. Proctor, R.A., et al., J. Biol. Chem. 255: 1181-1188, 1980.
20. Eldor, A., et al., Thrombosis and Haemostatis 56(3): 333-339, 1986.
21. Fritzberg, A.R., Nucl. Med. 26: 7-12, 1987.
22. Young, R. A. and Davis, R.W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1194- 1198, 1983.
23. Hugh, T., et al., In DNA Cloning: A Practical Approach (D. Glover, ed.), IRL Press, Oxford, 1984.
24. Vogel, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 3180-3184, 1972.
25. Bagly, D., et al., Methods in Enzymol. 45: 669-678 1976.
26. Wagner and Hynes, J. Biol. Chem. 254: 6746-6754, 1979.
27. McDonagh, R.P., et al., FEBS Lett. 127: 174-178, 1981.
28. Mosher, et al., J. Biol. Chem. 255: 1181-1188 (1980).
29. Russel, P.B., et al., J. Clin. Micro. 25: 1083-1087, 1987.
30. Bolton, A. E. and Hunter, W.M., Biochem. J. 133: 529, 1973.
31. Obara, et al., Cell 53: 649-657, 1988.
32. Fritzberg, A. R. , et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 4025- 4029, 1988.
33. Knight, L.C., et al., Radiology 173: 163-169, 1989.
34. Wasser, M.N.J.M., et al., Blood 74: 708-714, 1989.
35. Burger, J.J., et al., Methods in Enzymology 112: 43-56, 1985.
36. Yamamoto, K., et al., Eur. J. Nucl. Med. 14: 60-64, 1988.
37. Peterson, et al., in Fibronectin, edited by Moshen, Academic Press, USA, 1989: p. 1-24, particularly figure 2 on page 5.
Claims (15)
1. Визуализирующий агент, представляющий собой меченый визуализирующим маркером рекомбинантный полипептид, обладающий следующими свойствами: имеет аминокислотную последовательность, по существу идентичную последовательности области связывания природного человеческого фибронектина с фибрином, способен связываться с фибрином, имеет мол.м. 12 - 20 кД, имеет аминокислотную последовательность gln - Ala - gln - gln или met - gln - ala - gln - gln на N-конце.
2. Агент по п.1, отличающийся тем, что полипептид содержит внутримолекулярные дисульфидные связи, характерные для природного человеческого фибронектина.
3. Агент по п.1, отличающийся тем, что полипептид имеет мол.м. примерно 12 кД или более.
4. Агент по п.1, отличающийся тем, что полипептид имеет мол.м. примерно 20 кД или менее.
5. Агент по п.1, отличающийся тем, что полипептид имеет мол.м. примерно 18,5 кД или менее.
6. Агент по п.1, отличающийся тем, что маркером является радиоактивный изотоп, элемент, не прозрачный для рентгеновских лучей, или парамагнитный ион.
7. Агент по п.6, отличающийся тем, что маркером является радиоактивный изотоп.
8. Агент по п.7, отличающийся тем, что радиоактивным изотопом является индий-III.
9. Агент по п.7, отличающийся тем, что радиоактивным изотопом является технеций-99М.
10. Агент по п.7, отличающийся тем, что радиоактивным элементом является иод-123, иод-125, иод-131, криптон-81М, ксенон-133 или галлий-67.
11. Способ обнаружения материала, содержащего фибрин, предусматривающий контактирование исследуемого материала с визуализирующим агентом, визуализацию материала с последующей регистрацией, отличающийся тем, что в качестве визуализирующего агента используют агент по п.1.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что исследуемым материалом является тромб.
13. Способ по п.11, отличающийся тем, что исследуемым материалом является атеросклеротическая бляшка.
14. Способ по п.11, отличающийся тем, что маркером является радиоактивный изотоп, элемент, не прозрачный для Х-лучей, или парамагнитный ион.
15. Способ по п.11, отличающийся тем, что визуализацию осуществляют с использованием гамма-камеры.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US526397 | 1990-05-21 | ||
US07/526,397 US5270030A (en) | 1988-12-29 | 1990-05-21 | Fibrin binding domain polypeptide and method of producing |
US526.397 | 1990-05-21 | ||
PCT/US1991/003584 WO1991017765A1 (en) | 1990-05-21 | 1991-05-21 | Fibrin binding domain polypeptides and uses and methods of producing same |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU92016360A RU92016360A (ru) | 1996-04-20 |
RU2109750C1 true RU2109750C1 (ru) | 1998-04-27 |
Family
ID=24097174
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU92016360/13A RU2109750C1 (ru) | 1990-05-21 | 1991-05-21 | Визуализирующий агент и способ обнаружения материала, содержащего фибрин |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US5270030A (ru) |
EP (1) | EP0651799B1 (ru) |
JP (1) | JP3419772B2 (ru) |
AT (1) | ATE183545T1 (ru) |
AU (1) | AU660618B2 (ru) |
CA (1) | CA2083271C (ru) |
DE (1) | DE69131539T2 (ru) |
DK (1) | DK0651799T3 (ru) |
ES (1) | ES2137928T3 (ru) |
FI (1) | FI108298B (ru) |
GR (1) | GR3031708T3 (ru) |
HK (1) | HK1013255A1 (ru) |
HU (1) | HU216302B (ru) |
IL (1) | IL98197A0 (ru) |
NO (1) | NO310559B1 (ru) |
NZ (1) | NZ238208A (ru) |
RU (1) | RU2109750C1 (ru) |
WO (1) | WO1991017765A1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2525196C2 (ru) * | 2009-03-27 | 2014-08-10 | ДжиИ ХЕЛТКЕР ЛИМИТЕД | Трициклические индольные производные в качестве лигандов pbr |
Families Citing this family (93)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5972890A (en) * | 1988-05-02 | 1999-10-26 | New England Deaconess Hospital Corporation | Synthetic peptides for arterial imaging |
US5270030A (en) * | 1988-12-29 | 1993-12-14 | Bio-Technology General Corp. | Fibrin binding domain polypeptide and method of producing |
US7087722B1 (en) * | 1988-12-29 | 2006-08-08 | Savient Pharmaceuticals, Inc. | Fibrin binding domain polypeptides and uses and methods of producing same |
US5679320A (en) * | 1988-12-29 | 1997-10-21 | Bio-Technology General Corp. | Fibrin binding domain polypeptides and uses and methods of producing same |
US6034233A (en) * | 1990-05-04 | 2000-03-07 | Isis Pharmaceuticals Inc. | 2'-O-alkylated oligoribonucleotides and phosphorothioate analogs complementary to portions of the HIV genome |
US5792742A (en) * | 1991-06-14 | 1998-08-11 | New York University | Fibrin-binding peptide fragments of fibronectin |
US5668104A (en) * | 1992-03-31 | 1997-09-16 | Toray Industries, Inc. | Hematopoietic stem cell growth-promoting compositions containing a fibroblast-derived fragment of fibronectin and a growth factor, and methods employing them in vitro or in vivo |
US5968476A (en) * | 1992-05-21 | 1999-10-19 | Diatide, Inc. | Technetium-99m labeled peptides for thrombus imaging |
DK145092D0 (ru) * | 1992-12-03 | 1992-12-03 | Novo Nordisk As | |
US5750088A (en) | 1993-03-30 | 1998-05-12 | The Dupont Merck Pharmaceutical Company | Stable hydrazones linked to a peptide moiety as reagents for the preparation of radiopharmaceuticals |
US5879657A (en) * | 1993-03-30 | 1999-03-09 | The Dupont Merck Pharmaceutical Company | Radiolabeled platelet GPIIb/IIIa receptor antagonists as imaging agents for the diagnosis of thromboembolic disorders |
US6218529B1 (en) * | 1995-07-31 | 2001-04-17 | Urocor, Inc. | Biomarkers and targets for diagnosis, prognosis and management of prostate, breast and bladder cancer |
CA2255669A1 (en) * | 1996-05-16 | 1997-11-20 | The Texas A & M University System | Collagen binding protein compositions and methods of use |
US20030176663A1 (en) * | 1998-05-11 | 2003-09-18 | Eidgenossische Technische Hochscule | Specific binding molecules for scintigraphy |
DE69937996T2 (de) * | 1998-05-15 | 2009-01-02 | Ge Healthcare Ltd., Little Chalfont | Markierte glutamin- und lysinanaloge |
IN190822B (ru) | 1998-12-24 | 2003-08-23 | Council Scient Ind Res | |
US6808698B1 (en) | 1999-03-26 | 2004-10-26 | Bristol-Myers Squibb Pharma Company | Method for localization of blood clots |
US6426145B1 (en) | 1999-05-20 | 2002-07-30 | Scimed Life Systems, Inc. | Radiopaque compositions for visualization of medical devices |
US6254852B1 (en) | 1999-07-16 | 2001-07-03 | Dupont Pharmaceuticals Company | Porous inorganic targeted ultrasound contrast agents |
US6685914B1 (en) * | 1999-09-13 | 2004-02-03 | Bristol-Myers Squibb Pharma Company | Macrocyclic chelants for metallopharmaceuticals |
EP1259548A1 (en) * | 2000-02-24 | 2002-11-27 | Eidgenössische Technische Hochschule Zürich | Antibody specific for the ed-b domain of fibronectin, conjugates comprising said antibody, and their use for the detection and treatment of angiogenesis |
HUP0300935A3 (en) * | 2000-09-07 | 2005-09-28 | Schering Ag | Receptor in the edb fibronectin domain |
US6714808B2 (en) * | 2000-10-03 | 2004-03-30 | University Of Arkansas | Method for detecting and excising nonpalpable lesions |
US7226739B2 (en) | 2001-03-02 | 2007-06-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc | Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations |
US7666588B2 (en) | 2001-03-02 | 2010-02-23 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy |
US20040121311A1 (en) | 2002-12-06 | 2004-06-24 | Ecker David J. | Methods for rapid detection and identification of bioagents in livestock |
US20040121314A1 (en) * | 2002-12-06 | 2004-06-24 | Ecker David J. | Methods for rapid detection and identification of bioagents in containers |
US20030027135A1 (en) | 2001-03-02 | 2003-02-06 | Ecker David J. | Method for rapid detection and identification of bioagents |
WO2002074324A1 (en) * | 2001-03-15 | 2002-09-26 | The Texas A & M University System | Collagen-binding adhesin from staphylococcus epidermidis and method of use |
US7217510B2 (en) | 2001-06-26 | 2007-05-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for providing bacterial bioagent characterizing information |
US8073627B2 (en) | 2001-06-26 | 2011-12-06 | Ibis Biosciences, Inc. | System for indentification of pathogens |
US20030224476A1 (en) * | 2002-03-01 | 2003-12-04 | Szu-Yi Chou | Method of producing transglutaminase reactive compound |
JP2006516193A (ja) | 2002-12-06 | 2006-06-29 | アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド | ヒトおよび動物における病原体の迅速な同定方法 |
US8046171B2 (en) | 2003-04-18 | 2011-10-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and apparatus for genetic evaluation |
US8057993B2 (en) | 2003-04-26 | 2011-11-15 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of coronaviruses |
US7964343B2 (en) | 2003-05-13 | 2011-06-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
US8158354B2 (en) | 2003-05-13 | 2012-04-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
US7319149B2 (en) * | 2003-06-13 | 2008-01-15 | Bristol-Myers Squibb Pharma Company | Chelants and macrocyclic metal complex radiopharmaceuticals thereof |
US7317104B2 (en) | 2003-06-13 | 2008-01-08 | Bristol-Myers Squibb Pharma Company | Chelants and macrocyclic metal complex radiopharmaceuticals thereof |
US8097416B2 (en) | 2003-09-11 | 2012-01-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
US8394945B2 (en) | 2003-09-11 | 2013-03-12 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of bacteria |
US8546082B2 (en) | 2003-09-11 | 2013-10-01 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
JP4755113B2 (ja) | 2004-01-30 | 2011-08-24 | クアーク・ファーマスーティカルス、インコーポレイテッド | 線維性状態およびその他の疾患の治療のための、オリゴリボヌクレオチドおよびその使用方法 |
US7666592B2 (en) | 2004-02-18 | 2010-02-23 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent |
US8119336B2 (en) | 2004-03-03 | 2012-02-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of alphaviruses |
EP1766659A4 (en) | 2004-05-24 | 2009-09-30 | Ibis Biosciences Inc | MASS SPECTROMETRY WITH SELECTIVE ION FILTRATION THROUGH DIGITAL THRESHOLD COMPARISON |
US20050266411A1 (en) | 2004-05-25 | 2005-12-01 | Hofstadler Steven A | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA |
US7811753B2 (en) | 2004-07-14 | 2010-10-12 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for repairing degraded DNA |
US7741299B2 (en) | 2004-08-16 | 2010-06-22 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Therapeutic uses of inhibitors of RTP801 |
WO2006135400A2 (en) | 2004-08-24 | 2006-12-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for rapid identification of recombinant organisms |
BRPI0516177B8 (pt) | 2004-09-28 | 2021-05-25 | Quark Biotech Inc | oligorribonucleotídeos, uso dos mesmos, uso de um composto sirna eficaz para inibir 0 p53 humano e composição farmacêutica que os contém, bem como método para diminuição da expressão do gene p53 |
US8084207B2 (en) | 2005-03-03 | 2011-12-27 | Ibis Bioscience, Inc. | Compositions for use in identification of papillomavirus |
WO2006094238A2 (en) | 2005-03-03 | 2006-09-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions for use in identification of adventitious viruses |
EP1891244B1 (en) * | 2005-04-13 | 2010-10-06 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of adenoviruses |
US7414254B2 (en) * | 2005-06-28 | 2008-08-19 | United Pharmacy Partners, Inc. | Tungsten pig for radio-pharmaceuticals |
WO2007014045A2 (en) | 2005-07-21 | 2007-02-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for rapid identification and quantitation of nucleic acid variants |
DOP2007000015A (es) | 2006-01-20 | 2007-08-31 | Quark Biotech Inc | Usos terapéuticos de inhibidores de rtp801 |
CA2663029C (en) | 2006-09-14 | 2016-07-19 | Ibis Biosciences, Inc. | Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens |
JP2010507387A (ja) | 2006-10-25 | 2010-03-11 | クアーク・ファーマスーティカルス、インコーポレイテッド | 新規のsiRNAおよびその使用方法 |
JP5680304B2 (ja) | 2007-02-23 | 2015-03-04 | アイビス バイオサイエンシズ インコーポレイティッド | 迅速な法医学的dna分析法 |
US9598724B2 (en) | 2007-06-01 | 2017-03-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids |
RU2487716C2 (ru) | 2007-10-03 | 2013-07-20 | Кварк Фармасьютикалс, Инк. | Новые структуры малых интерферирующих рнк (sirna) |
US8253725B2 (en) * | 2007-12-28 | 2012-08-28 | St. Jude Medical, Atrial Fibrillation Division, Inc. | Method and system for generating surface models of geometric structures |
US8431692B2 (en) | 2008-06-06 | 2013-04-30 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for treatment of ear disorders |
US8148163B2 (en) | 2008-09-16 | 2012-04-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Sample processing units, systems, and related methods |
US8534447B2 (en) | 2008-09-16 | 2013-09-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Microplate handling systems and related computer program products and methods |
WO2010033599A2 (en) | 2008-09-16 | 2010-03-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, systems, and methods |
US8864821B2 (en) | 2008-11-26 | 2014-10-21 | Visen Medical, Inc. | Methods and compositions for identifying subjects at risk of developing stent thrombosis |
WO2010080452A2 (en) | 2008-12-18 | 2010-07-15 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | siRNA COMPOUNDS AND METHODS OF USE THEREOF |
EP2396803A4 (en) | 2009-02-12 | 2016-10-26 | Ibis Biosciences Inc | IONIZATION PROBE ASSEMBLIES |
US8950604B2 (en) | 2009-07-17 | 2015-02-10 | Ibis Biosciences, Inc. | Lift and mount apparatus |
US9194877B2 (en) | 2009-07-17 | 2015-11-24 | Ibis Biosciences, Inc. | Systems for bioagent indentification |
EP3225695A1 (en) | 2009-10-15 | 2017-10-04 | Ibis Biosciences, Inc. | Multiple displacement amplification |
AU2010324658A1 (en) | 2009-11-26 | 2012-05-03 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | siRNA compounds comprising terminal substitutions |
US8778904B2 (en) | 2009-12-09 | 2014-07-15 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for treating diseases, disorders or injury of the CNS |
WO2011084193A1 (en) | 2010-01-07 | 2011-07-14 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide compounds comprising non-nucleotide overhangs |
CA2801928C (en) | 2010-06-24 | 2018-04-10 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Double stranded rna compounds to rhoa and use thereof |
EP2649181B1 (en) | 2010-12-06 | 2016-04-27 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Double stranded oligonucleotide compounds comprising positional modifications |
US9796979B2 (en) | 2011-03-03 | 2017-10-24 | Quark Pharmaceuticals Inc. | Oligonucleotide modulators of the toll-like receptor pathway |
AU2012223366B2 (en) | 2011-03-03 | 2017-02-23 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide modulators of the toll-like receptor pathway |
SG11201401648RA (en) | 2011-11-03 | 2014-05-29 | Quark Pharmaceuticals Inc | Methods and compositions for neuroprotection |
WO2013070821A1 (en) | 2011-11-08 | 2013-05-16 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for treating diseases, disorders or injury of the nervous system |
US20140364484A1 (en) | 2012-01-12 | 2014-12-11 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Combination therapy for treating hearing and balance disorders |
JP6364009B2 (ja) | 2012-09-12 | 2018-07-25 | クォーク ファーマシューティカルズ インコーポレーティッドQuark Pharmaceuticals,Inc. | P53に対する二本鎖オリゴヌクレオチド分子、およびその使用方法 |
ES2704855T3 (es) | 2012-09-12 | 2019-03-20 | Quark Pharmaceuticals Inc | Moléculas de oligonucleótido de doble cadena para p53 y métodos de uso de las mismas |
US9611473B2 (en) | 2012-09-12 | 2017-04-04 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Double-stranded nucleic acid compounds |
US9889200B2 (en) | 2013-07-31 | 2018-02-13 | Qbi Enterprises Ltd. | Sphingolipid-polyalkylamine-oligonucleotide compounds |
WO2015015498A1 (en) | 2013-07-31 | 2015-02-05 | Qbi Enterprises Ltd. | Methods of use of sphingolipid polyalkylamine oligonucleotide compounds |
US9459201B2 (en) | 2014-09-29 | 2016-10-04 | Zyomed Corp. | Systems and methods for noninvasive blood glucose and other analyte detection and measurement using collision computing |
US9554738B1 (en) | 2016-03-30 | 2017-01-31 | Zyomed Corp. | Spectroscopic tomography systems and methods for noninvasive detection and measurement of analytes using collision computing |
EP3671511B1 (en) | 2018-12-19 | 2022-07-06 | Rohde & Schwarz GmbH & Co. KG | Communication system and method |
EP3922720A1 (en) | 2020-06-09 | 2021-12-15 | Universidad de Murcia | Therapy to prevent adverse cardiac remodeling following an acute myocardial infarction |
ES2894201B2 (es) * | 2020-08-05 | 2022-09-29 | Fundacion Para La Investig Biomedica Del Hospital Gregorio Maranon | Compuestos radioactivos basados en proteinas selectivas de bacterias para la deteccion no invasiva de focos infecciosos |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4315906A (en) * | 1979-05-21 | 1982-02-16 | New England Nuclear Corporation | Cold insoluble globulin, its purification and use |
US4455290A (en) * | 1981-04-02 | 1984-06-19 | Research Corporation | Inhibition of fibrin polymerization by a peptide isolated from fibrin Fragment D1 |
US4663146A (en) * | 1983-07-29 | 1987-05-05 | Codon Genetic Engineering Laboratories | Methods and compositions for the diagnosis of bloodclots using plasminogen activator |
US4587122A (en) * | 1985-04-23 | 1986-05-06 | The Green Cross Corporation | Fibronectin-dextran-drug complex and method of preparation thereof |
GB8516421D0 (en) * | 1985-06-28 | 1985-07-31 | Biotechnology Interface Ltd | Fibronectins |
US4734362A (en) * | 1986-02-03 | 1988-03-29 | Cambridge Bioscience Corporation | Process for purifying recombinant proteins, and products thereof |
JPH02500803A (ja) * | 1987-07-07 | 1990-03-22 | サイトアールエックス バイオプール リミテッド | フィブリンに結合する化合物および方法 |
US4839464A (en) * | 1987-08-25 | 1989-06-13 | Regents Of The University Of Minnesota | Polypeptides with fibronectin activity |
JP2561122B2 (ja) * | 1988-04-13 | 1996-12-04 | 寳酒造株式会社 | 機能性ポリペプチド |
JP2561131B2 (ja) * | 1988-06-30 | 1996-12-04 | 寳酒造株式会社 | 細胞接着活性ポリペプチド |
WO1990007577A1 (en) * | 1988-12-29 | 1990-07-12 | Bio-Technology General Corp. | Cloning and production of polypeptide analogs of human fibronectin and method of using such polypeptide analogs |
US5270030A (en) * | 1988-12-29 | 1993-12-14 | Bio-Technology General Corp. | Fibrin binding domain polypeptide and method of producing |
US5026537A (en) * | 1989-04-06 | 1991-06-25 | Centocor, Inc. | Methods for imaging atherosclerotic plaque |
-
1990
- 1990-05-21 US US07/526,397 patent/US5270030A/en not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-05-21 WO PCT/US1991/003584 patent/WO1991017765A1/en active IP Right Grant
- 1991-05-21 AT AT91911888T patent/ATE183545T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-05-21 AU AU80760/91A patent/AU660618B2/en not_active Expired
- 1991-05-21 HU HU9203516A patent/HU216302B/hu unknown
- 1991-05-21 CA CA002083271A patent/CA2083271C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-21 DE DE69131539T patent/DE69131539T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-21 EP EP91911888A patent/EP0651799B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-21 DK DK91911888T patent/DK0651799T3/da active
- 1991-05-21 JP JP51119791A patent/JP3419772B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-21 IL IL98197A patent/IL98197A0/xx unknown
- 1991-05-21 ES ES91911888T patent/ES2137928T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-05-21 RU RU92016360/13A patent/RU2109750C1/ru active
- 1991-05-21 NZ NZ238208A patent/NZ238208A/xx not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-11-13 NO NO19924405A patent/NO310559B1/no not_active IP Right Cessation
- 1992-11-20 FI FI925296A patent/FI108298B/fi active
-
1993
- 1993-05-04 US US08/058,241 patent/US5455158A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-03-24 US US08/409,750 patent/US5965383A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-08-11 US US08/909,140 patent/US6121426A/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-12-22 HK HK98114600A patent/HK1013255A1/xx not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-11-03 GR GR990402800T patent/GR3031708T3/el unknown
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Uehara A., et al. J. Nuclear Med., v.29, p.1264 - 1267, 1988. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2525196C2 (ru) * | 2009-03-27 | 2014-08-10 | ДжиИ ХЕЛТКЕР ЛИМИТЕД | Трициклические индольные производные в качестве лигандов pbr |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0651799B1 (en) | 1999-08-18 |
AU8076091A (en) | 1991-12-10 |
WO1991017765A1 (en) | 1991-11-28 |
EP0651799A1 (en) | 1995-05-10 |
JP3419772B2 (ja) | 2003-06-23 |
IL98197A0 (en) | 1992-06-21 |
EP0651799A4 (en) | 1993-10-05 |
US5270030A (en) | 1993-12-14 |
HK1013255A1 (en) | 1999-08-20 |
NZ238208A (en) | 1993-01-27 |
NO924405L (no) | 1993-01-13 |
FI108298B (fi) | 2001-12-31 |
NO924405D0 (no) | 1992-11-13 |
FI925296A0 (fi) | 1992-11-20 |
CA2083271C (en) | 2002-04-09 |
DE69131539D1 (de) | 1999-09-23 |
DE69131539T2 (de) | 2000-05-04 |
HU9203516D0 (en) | 1993-04-28 |
DK0651799T3 (da) | 2000-03-06 |
CA2083271A1 (en) | 1991-11-22 |
GR3031708T3 (en) | 2000-02-29 |
HUT66189A (en) | 1994-10-28 |
ATE183545T1 (de) | 1999-09-15 |
AU660618B2 (en) | 1995-07-06 |
JPH05508766A (ja) | 1993-12-09 |
ES2137928T3 (es) | 2000-01-01 |
US5965383A (en) | 1999-10-12 |
NO310559B1 (no) | 2001-07-23 |
HU216302B (hu) | 1999-06-28 |
FI925296A (fi) | 1992-11-20 |
US5455158A (en) | 1995-10-03 |
US6121426A (en) | 2000-09-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2109750C1 (ru) | Визуализирующий агент и способ обнаружения материала, содержащего фибрин | |
US5011686A (en) | Thrombus specific conjugates | |
US6045774A (en) | J chain polypeptide targeting molecule linked to an imaging agent | |
TWI290146B (en) | Binding moieties for fibrin | |
Hernan et al. | Multiple epitope tagging of expressed proteins for enhanced detection | |
US20030143158A1 (en) | Fibrin binding moieties useful as imaging agents | |
CA2432474C (en) | Fibrin binding polypeptides useful inter alia in medical imaging processes | |
MX2010010759A (es) | Mutantes de estreptocinasa y sus formas covalentemente modificadas. | |
JPH05508664A (ja) | リン脂質標的血栓溶解剤 | |
JP6018585B2 (ja) | 心血管イメージングに関連する材料および方法 | |
US20240166762A1 (en) | Methods and compositions related to antibody fragments that bind to tumor-associated glycoprotein 72 (tag-72) | |
US5679320A (en) | Fibrin binding domain polypeptides and uses and methods of producing same | |
US20230211023A1 (en) | Reporter system for radionuclide imaging | |
US7087722B1 (en) | Fibrin binding domain polypeptides and uses and methods of producing same | |
KR100219115B1 (ko) | 피브린 결합 도메인 폴리펩티드, 그의 용도 및 그의 제조방법 | |
US7575738B2 (en) | Heat shock protein as a targeting agent for endothelium-specific in vivo transduction | |
JPS6360938A (ja) | 修飾組織型プラスミノ−ゲン活性化因子およびその製造方法 | |
JP3095771B2 (ja) | ヒトフィブロネクチンポリペプチド類似体のクローニング及び製造並びにこのようなポリペプチド類似体の使用法 | |
Yue et al. | Site-Specific 68Ga Radiolabeling of Trastuzumab Fab via Methionine for ImmunoPET Imaging | |
Ezov et al. | Recombinant polypeptides derived from the fibrin binding domain of fibronectin are potential agents for the imaging of blood clots | |
Cook | The Development of Novel Platforms for the Imaging of Cancer by Positron Emission Tomography | |
CN118059269A (zh) | St14特异性分子影像探针及其制备方法与应用 | |
Leth et al. | Targeted imaging of uPAR expression in vivo with cyclic AE105 variants | |
CN118317972A (zh) | 成纤维细胞活化蛋白(fap)的特异性结合分子 | |
AU2022397890A1 (en) | Specific binding molecules for fibroblast activation protein (fap) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD4A | Correction of name of patent owner |