DE69937996T2 - Markierte glutamin- und lysinanaloge - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Klasse von Verbindungen, die bei der Diagnose von Stellen venöser und arterieller Thrombose, Embolie oder Infektion von Nutzen sind, auf pharmazeutische Formulierungen, welche diese Verbindungen enthalten, auf deren Einsatz bei der Diagnose von Erkrankungen und auf Verfahren für deren Herstellung.
  • Frühere Herangehensweisen in Bezug auf Radiopharmaka zur Thrombus-Bildgebung umfassen radiomarkiertes Fibrinogen oder Plasminogen, radiomarkiertes Fragment E1 von humanem Fibrin, radiomarkierte Plasminogenaktivatoren, wie den Gewebeplasminogenaktivator (t-PA), und markierte Anti-Fibrin-Antikörper. Auch beschrieben sind Verfahren, die auf der Detektion von Stellen der Plättchenakkumulation beruhen, wie z. B. die Verabreichung radiomarkierter Plättchen (etwa mittels 111In-Oxin) oder radiomarkierter Anti-Plättchen-Antikörper. In jüngerer Zeit unternommene Anstrengungen konzentrierten sich auf radiomarkierte Peptide oder Polypeptide, z. B. das Zelladhäsionsmotiv RGD (mit R, G und D als den jeweiligen Standardabkürzungen für die Aminosäuren Arginin, Glycin und Asparaginsäure), auf Plättchenfaktor 4 oder Fragmente davon oder auch auf gerinnungshemmende Peptide, wie z. B. Disintegrine.
  • Bei Faktor XIII handelt es sich um ein Plasmaglykoprotein, das in Blut und bestimmten Geweben in katalytisch inaktiver (oder zymogener) Form vorhanden ist. In seine aktive Form Faktor XIIIa wird Faktor XIII durch Thrombin bei Vorhandensein von Calciumionen überführt. Faktor XIIIa ist auch als Plasmatransglutaminase, Fibrinoligase oder Fibrin-stabilisierender Faktor bekannt. Der letzte Schritt bei der Bildung eines Blut-Clots besteht in der kovalenten Quervernetzung des Fibrins, das durch die proteolytische Spaltung von Fibrinogen durch Thrombin gebildet wird. Fibrinmoleküle richten sich aus, und das Enzym Faktor XIIIa katalysiert jeweils die kovalente Quervernetzung der NH2- und CONH2-Gruppen von Lysyl- und Glutaminylresten und gibt dem Blut-Clot strukturelle Festigkeit. Die Quervernetzung stabilisiert die Fibrinclotstruktur und verleiht Widerstand gegenüber Fibrinolyse. Die Bildung der Quervernetzung stellt eine wichtige Facette sowohl normaler Blutkoagulation und Wundheilung als auch pathologischer Konditionen, etwa einer Thrombose, dar. Da atherothrombotische Gehirninfarkte ein verbreiteter Untertyp des Schlaganfalls sind, können Faktor-XIIIa-Substrate die Diagnose eines Schlaganfalls ermöglichen. Darüber hinaus kann ein Zusammenhang mit Atherosklerose, endzündlichen Prozessen, Tumorwachstum und Metastasen bestehen. WO 91/16931 offenbart, dass radiomarkierte Analoge von Faktor XIII (in denen die aktive Stelle durch Aminosäuresubstitution inaktiviert worden ist) als Radiopharmaka zur Thrombus-Bildgebung nützlich sind.
  • Des Weiteren ist von Faktor XIIIa bekannt, dass er die Eingliederung niedermolekularer Amine in die γ-Glutaminstellen von Proteinen katalysiert. In ähnlicher Weise katalysiert Faxtor XIIIa auch die Eingliederung niedermolekularer Glutaminanaloge in Lysylreste. So fungieren derartige niedermolekulare Amine (oder Glutaminanaloge) als kompetitive Inhibitoren der Faktor-XIIIa-induzierten Lysyl/Glutaminyl-Vernetzung von Proteinen.
  • Die Beschreibung einer Reihe synthetischer Amine wurde vorgenommen, welche kompetitive Inhibitoren der Aufnahme markierten Putrescins (1,4-Diaminobutan) in N,N'-Dimethylcasein sind, die durch Schweinelebertransglutaminase katalysiert wird [L. Lorand, u. a., Biochem., 18, 1756 (1979)].
  • WO 89/00051 (Cytrx Biopool Ltd.) beansprucht ein Verfahren zum Targeting von Fibrinablagerungen mittels einer markierten Verbindung, die durch Faktor XIIIa kovalent an Fibrin gebunden ist. Die Fibrin-bindende Verbindung wird angegeben als „beliebiges Peptid, das ein Substrat für das gemeinhin als Faktor XIIIa bekannte Blutenzym bildet". Über bevorzugte Peptide wird ausgesagt, dass sie die Tetrapeptidsequenz -Asn-Gln-Glu-Gln- (oder NQEQ in der standardisierten Abkürzungsschreibweise für Aminosäuren) beinhalten. Ferner ist die 12-mer-Peptidsequenz vom NH2-Terminus des Alpha-2-Antiplasminenzyms offenbart:
    NH2-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-OH
    gemeinsam mit einem synthetischen Analog:
    NH2-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Tyr-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-OH,
    (jeweils bezeichnet als NQEQVSPLTLTLLK und NQEQVSPYTLTLLK). Letztere Sequenz wurde mit 125I radiomarkiert, und es wurde nachgewiesen, dass sie in vitro in Thrombin-Clots aufgenommen wird.
  • Jetzt wurde herausgefunden, dass synthetische Analoge von Lysin und Glutamin, die mit einer geeigneten detektierbaren Einheit markiert sind, auch als Substrate für das Enzym Faktor XIIIa fungieren können. Die Verwendung zweckmäßiger Schutzgruppen liefert Verbindungen, die weniger anfällig sind für in vivo Metabolismus, insbesondere durch Peptidasen, und daher nützlichere Targeting-Mittel darstellen.
  • Die vorliegende Erfindung liefert die folgenden Verbindungen: Y-(CR2)n-X-NHJ wobei:
    X steht für C=O oder CR2;
    n eine ganze Zahl des Wertes 1 bis 6 ist;
    Y für R1R2CR- steht,
    wobei der eine von R1 und R2 für -NH(B)pZ1 steht und der andere für -CO(B)qZ2 steht,
    wobei p und q ganze Zahlen des Wertes 0 bis 45 sind, und
    jedes B unabhängig ausgewählt ist aus Q oder einem Aminosäurerest,
    wobei Q ein cyclisches Peptid ist;
    Z1 und Z2 Metallkomplexiermittel (L) oder andere Schutzgruppen sind, wie zuvor definiert, welche biokompatible Gruppen sind, die in vivo Metabolismus des Peptids inhibieren oder unterdrücken;
    J und jede R-Gruppe unabhängig ausgewählt sind aus H, C1-4-Alkyl, C1-4-Alkenyl, C1-4-Alkynyl, C1-4-Alkoxyalkyl oder C1-4-Hydroxyalkyl; mit den Maßgaben, dass:
    • (i) die Gesamtzahl der Aminosäurereste in den R1- und R2-Gruppen 45 nicht überschreitet;
    • (ii) wenn X für CR2 steht, Z2 ein Metallkomplexiermittel ist;
    • (iii) mindestens einer von R1 und R2 wenigstens eine detektierbare Einheit trägt, die für radiopharmazeutische Bildgebung geeignet und ausgewählt ist aus einem nichtmetallischen Radioisotop oder einem Radiometall;
    • (iv) R1 oder R2 eines oder mehrere Peptidfragmente von α2-Antiplasmin, Fibronektin, beta-Casein, Tetanus, Amyloid, Trappin und Polyglutamin-Resten umfasst, wobei das Peptidfragment mindestens drei Aminosäurereste enthält.
  • Des Weiteren umfasst die Erfindung Kits für die Herstellung der obigen, mit einer detektierbaren Einheit markierten Verbindungen und den Einsatz dieser und verwandter Verbindungen bei der Diagnose oder Therapie von Thrombose, Embolie, Atherosklerose, Entzündung oder Krebs.
  • Unter dem Begriff „zyklisches Peptid" ist eine Sequenz von 5 bis 15 Aminosäuren zu verstehen, bei der die beiden terminalen Aminosäuren durch eine kovalente Bindung aneinander gebunden sind, die eine Peptid- oder Disulfidbindung oder eine synthetische Nicht-Peptid-Bindung, z. B. eine Thioether-, Phosphodiester-, Disiloxan- oder Urethanbindung, sein kann.
  • Unter dem Begriff „Aminosäure" ist eine L- oder D-Aminosäure, ein Aminosäureanalog oder ein Aminosäuremimetikum zu verstehen, die natürlich auftreten oder rein synthetischer Herkunft sein können und die optische Reinheit besitzen können, d. h. ein einziges und daher chirales Enantiomer oder eine Mischung aus Enantiomeren. Vorzugsweise sind die Aminosäuren der vorliegenden Erfindung optisch rein. Unter dem Begriff „Aminosäuremimetikum" sind synthetische Analoge natürlich vorkommender Aminosäuren zu verstehen, welche Isostere sind, d. h. welche entworfen worden sind, um die sterische und elektronische Struktur der natürlichen Verbindung nachzuahmen. Fachleuten auf diesem Gebiet sind derartige Isostere wohlbekannt, ein-, aber nicht ausschließlich Depsipeptiden, Retro-Inverso-Peptiden, Thioamiden, Cycloalkanen oder 1,5-disubstituierten Tetrazolen [siehe M. Goodman, Biopolymers, 24, 137, (1985)].
  • Unter dem Begriff „Schutzgruppe" ist eine biokompatible Gruppe zu verstehen, die in vivo Metabolismus des Peptids oder der Aminosäure am Amino- oder Carboxyl-Terminus inhibiert oder unterdrückt. Derartige Gruppen sind Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt, und ihre Auswahl erfolgt zweckgemäß für den Amino-Terminus (Z') aus: Acetyl, Boc (wobei Boc tert-Butyloxycarbonyl ist), Fmoc (wobei Fmoc Fluorenylmethoxycarbonyl ist), Benzyloxycarbonyl, Trifluoracetyl, Allyloxycarbonyl, Dde [d. h. 1-(4,4-Dimethyl-2,6-dioxocyclohexyliden)ethyl], Npys (d. h. 3-Nitro-2-pyridinsulfenyl) oder einer Metallkomplexiergruppe; und ferner für den Carboxyl-Terminus (Z2) aus: einem Carboxamid, tert-Butylester, Benzylester, Cyclohexylester, Aminoalkohol oder einer Metallkomplexiergruppe. Bevorzugt handelt es sich bei der Schutzgruppe um eine Metallkomplexiergruppe, besonders bevorzugt um eine Metallkomplexiergruppe, die an ein Metall gebunden ist, d. h. um einen Metallkomplex. Der Carboxyl-Terminus von Peptiden ist besonders empfänglich für in vivo Spaltung durch Carboxypeptidasen. Folglich ist die Metallkomplexiergruppe oder der Metallkomplex vorzugsweise an den Carboxyl-Terminus angebunden. Wenn entweder R1 -NH(B)p-1QZ1 oder R2 -CO(B)q-1QZ2 ist, kann die Schutzgruppe die kovalente Bindung darstellen, die den zyklischen Peptid-(Q)-Ring schließt.
  • Bei einer „detektierbaren Einheit" handelt es sich um eine Einheit, die sich zur radiopharmazeutischen Bildgebung eignet und aus einem nichtmetallischen Radioisotop oder einem Radiometall ausgewählt wird.
  • Die Aminosäuresequenzen von α2-Antiplasmin, Fibronektin, beta-Casein, Fibrinogen und Thrombospondin sind in den folgenden Quellen zu finden: α2-Antiplasmin-Prekursor [M. Tone, u. a., J. Biochem, 102, 1033, (1987)], beta-Casein [L. Hansson, u. a., Gene, 139, 193, (1994)], Fibronektin [A. Gutman, u. a., FEBS Lett., 207, 145, (1996)], Thrombospondin-1-Prekursor [V. Dixit, u. a., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 83, 5449, (1986)], R. F. Doolittle, Ann. Rev. Biochem., 53, 195, (1984).
  • In Anspruch genommen wird vorzugsweise die Aminosäuresequenz des N-Terminus von:
    • (i) α2-Antiplasmin, d. h. NH2-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-OH oder Varianten davon, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren ausgetauscht, hinzugefügt oder entfernt worden ist bzw. sind, wie z. B. bei: NH2-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-leu-Leu-lys-Gly-OH, NH2-Asn-Gln-Glu-Ala-Val-Ser-Pro-Leu-Thr-Leu-Thr-Leu-Leu-Lys-Gly-OH, NH2-Asn-Gln-Glu-Gln-Val-Gly-OH; oder
    • (ii) Casein d. h. Ac-Leu-Gly-Pro-Gly-Gln-Ser-Lys-Val-lie-Gly.
  • Die Anzahl der Aminosäurereste beläuft sich bevorzugt auf 2 bis 30, besonders bevorzugt auf 3 bis 20 und ganz besonders bevorzugt auf 3 bis 15.
  • Bei bevorzugten Verbindungen ist J gleich H, was bedeutet, dass sie mit einer NH2-Gruppe enden. X ist vorzugsweise C=O, d. h. es werden Verbindungen der Formel Y-(CR2)n-CONH2 bevorzugt. Die am meisten bevorzugten Verbindungen sind jene der Formel Y-(CR2)x-(CH2)2CONH2 oder Y-(CR2)y-(CH2)4NH2, wobei x eine ganze Zahl mit einem Wert von 0 bis 4 und y eine ganze Zahl mit einem Wert von 0 bis 3 ist. Verbindungen, welche die gleiche Seitenkette aufweisen wie Glutamin, also Glutaminanaloge der Formel Y-(CR2)x-(CH2)2-CONH2, sind besonders bevorzugt.
  • Zu den nichtmetallischen Radioisotopen, die sich zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung eignen, gehören, wenn auch nicht ausschließlich: Radioiod, z. B. 121I, 125I, 131I, vorzugsweise 123I, Positronemitter, z. B. 18F, 11C oder 75Br, und Isotope für die Therapie, z. B. 211At.
  • An jene Verbindungen dieser Erfindung, welche Metallkomplexiermittel umfassen, ist vorzugsweise nur einer einziger Typ von Targeting-Molekül angebunden, d. h. der -(CR2)n-X-NHJ-Substituent. Zwar können weitere Substituenten auf dem Komplexiermittel vorhanden sein, aber der -(CR2)n-X-NHJ-Substituent ist jener, der in erster Linie für die Biolokalisationseigenschaften verantwortlich gehalten wird. Das Radiometall kann entweder ein Positronemitter (z. B. 68Ga oder 64Cu) oder ein γ-Emitter sein, z. B. 99mTc, 111In, 113In oder 67Ga.
  • Die Radiometalle, die für die diagnostische Bildgebung ganz besonders bevorzugt werden, sind γ-Emitter, vor allem 99mTc. Gleichgültig, auf welchen Metallkomplex die Wahl fällt, wird es stark bevorzugt, dass er an das Faktor-XIIIa-Substrat in solch einer Weise gebunden ist, dass er in Blut nicht einfach einen Metabolismus durchläuft mit dem Ergebnis, dass er vom Faktor-XIIIa-Substrat gespalten wird, bevor das markierte Faktor-XIIIa-Substrat die gewünschte in vivo Stelle erreicht hat, von der die Bildgebung erfolgen soll. Deshalb ist das Faktor-XIIIa-Substrat vorzugsweise kovalent an die Metallkomplexe der vorliegenden Erfindung gebunden.
  • Diese Metallionen werden mithilfe eines Metallkomplexiermittels oder stärker bevorzugt mittels eines Chelatbildners komplexiert. Die Chelatbildner umfassen 2–10 Metalldonoratome, die durch ein nicht koordinierendes Rückgrat kovalent miteinander verlinkt sind. Bevorzugte Chelatbildner besitzen 4–8 Metalldonoratome und weisen die Metalldonoratome in entweder einer offenen Kette oder einer makrozyklischen Anordnung oder auch in Kombinationen davon auf. Ganz besonders bevorzugte Chelatbildner haben 4–6 Metalldonoratome und bilden 5- oder 6-gliedrige Chelatringe, wenn sie in Bezug auf das Metallzentrum koordiniert werden. Derartige mehrzähnige und/oder makrozyklische Chelatbildner formen stabile Metallkomplexe, die einen Challenge um das Metall durch endogene konkurrierende Liganden, z. B. Transferrin oder Plasmaproteine, in vivo überleben können. Als Alternative dazu besteht die Möglichkeit, einzähnige Komplexiermittel einzusetzen, welche stabile Komplexe mit dem gewünschten Metallion bilden, obwohl sie keine Chelatringe nach Metallkoordination bilden. Beispiele für bekannte Komplexiermittel dieser Art, die sich besonders zur Verwendung mit 99mTc eignen, sind Hydrazine, Phosphine, Arsine oder Isonitrile.
  • Zu den Beispielen für geeignete Chelatbildner gehören zweizähnige, z. B. Diamine oder Diphosphine, dreizähnige, z. B. Monoamin-Dithiole, oder vierzähnige, z. B. Diamin-Dioxime ( US 4615876 ), oder solche Liganden, die Amiddonoren inkorporieren ( WO 94/08949 ); die vierzähnigen Liganden aus WO 94/22816 ; N2S2-Diamindithiole, Diamiddithiole oder Amidamindithiole; N3S-Thioltriamide; N4-Liganden, z. B. Tetraamine, makrozyklische Amin- oder Amid-Liganden, z. B. Cyclam, Oxocyclam (das einen neutralen Technetiumkomplex bildet) oder Dioxocyclam; oder auch Dithiosemicarbazon. Für Technetium eignen sich die oben beschriebenen Liganden in besonderem Maße, aber sie sind auch in Bezug auf andere Metalle von Nutzen. Weitere taugliche Liganden sind beschrieben in Sandoz WO 91/01144 , welches Liganden umfasst, die sich besonders für Indium, Yttrium und Gadolinium eignen, vor allem makrozyklisches Aminocarboxylat und Aminophosphonsäureliganden. Liganden, welche nichtionische (d. h. neutrale) Metallkomplexe von Gadolinium bilden, sind bekannt und beschrieben in US 4885363 . Der Ligand kann auch eine kurze Sequenz von Aminosäuren umfassen, wie z. B. das Cys/Aminosäure/Cys-Tripeptid aus WO 92/13572 oder die in EP 0719790 A2 beschriebenen Peptidliganden.
  • Bevorzugte Chelatbildner besitzen die Formel RN[(CR2)aN(CR2)bCR=NOH]2 wobei jedes a 2 oder 3 ist,
    jedes b 1 oder 2 ist,
    ein R Aminoalkylen ist, durch welches der Chelatbildner an den Rest des Moleküls gefügt ist,
    jedes weitere R unabhängig H, C1-C10-Hydrocarbyl, Alkoxy, Alkoxyalkyl, Amin, Amid, Hydroxyl, Hydroxyalkyl oder Carboxylat ist oder zwei R-Gruppen zusammen mit den Atomen, an die sie angebunden sind, einen carboxylischen, heterozyklischen, gesättigten oder ungesättigten Ring bilden.
  • Nicht-Peptid-basierte Metallchelatbildner bieten verbesserte Kontrolle über Anbindung und Freisetzung von Metallionen, weshalb sie bevorzugt werden.
  • Wohlbekannt ist die Herstellung von Chelatbildnern, an die eine funktionelle Gruppe angebunden ist („bifunktionelle Chelate"). Zu den funktionellen Gruppen, die an Chelatbildner angebunden werden, zählen: Amin, Carbonsäure, Cyanat, Thiocyanat, Maleimid und Aktivester, wie z. B. N-Hydroxysuccinimid. Beispiele von Chelat/Amin-Konjugaten für Diamindioximliganden sind in WO 95/19187 angeführt. Wenn es sich bei der gewünschten Faktor-XIIIa-Substrat-Funktionalität um ein Amin handelt, können die Liganden der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, indem eine bifunktionelle Verbindung umgesetzt wird, die nicht nur eine Amingruppe enthält (vorzugsweise geschützt durch Einsatz passender und Fachleuten auf diesem Gebiet bekannter Schutzgruppen), sondern auch eine reaktive Gruppe, z. B. ein Sulfonylchlorid, Säurechlorid, Aktivester oder Alkyl/Benzylhalid. Daraufhin lässt sich die reaktive Gruppe entweder an die Amin-Seitengruppe eines bifunktionellen Chelats koppeln oder zum Derivatisieren eines oder mehrerer Amindonoratome eines N-enthaltenden Liganden verwenden. Als Alternative dazu könnte ein monogeschütztes Diamin umgesetzt werden mit einem bifunktionellen Chelat mit einer Aktivester- oder Carboxyl-Seitengruppe, damit sich die geschützte Amingruppe ergibt, die mit dem Ligandensystem via eine Amidbindung verlinkt ist. Bei beiden synthetischen Routen, die oben umrissen sind, wird dem resultierenden Ligand-geschützten Aminkonjugat unter geeigneten Bedingungen der Schutz entzogen, damit sich der gewünschte Amin-funktionalisierte Ligand ergibt. Handelt es sich bei der gewünschten Faktor-XIIIa-Substrat-Funktionalität um eine Carboxamidgruppe, können die gewünschten Liganden z. B. dadurch hergestellt werden, dass ein Omega-Haloalkyl-Carboxamid von geeigneter Kettenlänge mit einem bifunktionellen Chelat mit einer Amin-Seitengruppe umgesetzt wird, so dass sich der gewünschte Carboxamidligand ergibt.
  • Die Metallkomplexe der vorliegenden Erfindung lassen sich herstellen, indem eine Lösung des Metalls im passenden Oxidationszustand mit dem Liganden beim geeigneten pH-Wert umgesetzt wird. Vorzugsweise kann die Lösung einen Liganden (z. B. Chlorid, Glukonat oder Zitrat) enthalten, der schwach mit dem Metall komplexiert, was bedeutet, dass der Metallkomplex durch Ligandenaustausch oder Transchelation zustandegebracht wird. Derartige Bedingungen sind nützlich, um unerwünschte Nebenreaktionen, wie die Hydrolyse des Metallions, zu unterdrücken. Handelt es sich beim Metallion um 99mTc, ist das Ausgangsmaterial gewöhnlich Natriumpertechnetat aus einem 99Mo-Generator. Technetium ist in 99mTc-Pertechnetat im Tc(VII)-Oxidationszustand vorhanden, der verhältnismäßig unreaktiv ist. Deshalb erfordert die Herstellung von Technetiumkomplexen mit niedrigerem Oxidationszustand, und zwar Tc(I) bis Tc(V), gewöhnlich die Zugabe eines zweckmäßigen Reduktionsmittels, z. B. Zinnion, um die Komplexbildung zu erleichtern. Weitere geeignete Reduktionsmittel sind unten beschrieben.
  • Ferner sollte der Metallkomplex vorzugsweise einen niedrigen nicht spezifischen Bluthintergrund aufweisen.
  • Somit bezieht sich die vorliegende Erfindung hauptsächlich auf diagnostische Mittel für Bildgebungsstellen im Körper von Säugern, an denen das Enzym Faktor XIII aktiviert ist und Blutproteine, wie z. B. Fibrin oder Collagen, abgelagert sind. Als besonders nutzbringend erweisen sich die vorliegenden Mittel für die diagnostische Bildgebung vom humanen Körper. Die Mittel umfassen Substrate für das Enzym Faktor XIIIa, die mit einem Metallkomplex markiert sind, der zur externen Bildgebung taugt, wie etwa ein Radiometall (zur Szintigraphie). Der Metallkomplex der vorliegenden Erfindung weist eine funktionelle Amino- oder Carboxamid-Seitengruppe auf, die zur Verfügung steht für das kovalente Verlinken mit jeweils Proteinglutamylcarboxamid- oder Lysylamingruppen durch das Enzym Faktor XIIIa. Das enge Verhältnis zwischen Fibrin und Faktor XIIIa kehrt die mögliche Verwendung der Mittel der vorliegenden Erfindung für die Diagnose von Erkrankungszuständen hervor, bei denen sowohl eine Fibrinablagerung oder -akkumulation als auch eine Aktivierung von Faktor XIII vorliegt. Eine erhöhte Fibrinablagerung ist als charakteristisch für Erkrankungen wie Thrombose, Atherosklerose, fibrotische Leber und verstreute intravaskuläre Koagulation bekannt. Außerdem lagert sich Fibrin in Zusammenhang mit etlichen Erkrankungsprozessen, wie z. B. Infektion, Autoimmunerkrankung oder Krebs, an Stellen einer Gewebeentzündung ab. Faktor XIII und Gewebetransglutaminase sind während bekannter physiologischer Bedingungen aktiviert. Erhöhte Levels der Enzyme sind während Apoptose und Erzeugung neuer Matrixproteinstrukturen zu beobachten. Somit können die vorliegenden Mittel auch zur Detektion von Apoptose und Erkrankungszuständen, wie z. B. Arthritis, genutzt werden, wo eine erhöhte Matrixproteinablagerung auftritt. Da Faktor XIII an der maßgeblichen Stelle in vivo aktiviert ist (d. h. Thrombus, Embolie, etc.), bietet dies einen Mechanismus für die Metallkomplexe der vorliegenden Erfindung. Die kovalent verlinkten Metallkomplexe lassen sich durch Radionuklidszintigraphie extern abbilden und stehen daher als nicht invasives Mittel zur Diagnostik der erkrankten Stelle zur Verfügung.
  • Des Weiteren bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Kits zur Herstellung von Metallkomplexen, die mit Faktor-XIIIa-Substraten verlinkt sind. Die Kits sind so gestaltet, dass sie sterile Produkte ergeben, die geeignet sind zur Verabreichung an den Menschen, z. B. via Injektion in den Blutkreislauf. Mögliche Ausführungsformen werden nachstehend erörtert. Handelt es sich bei der detektierbaren Einheit um 99mTc, umfasst der Kit ein Vial, das den freien Liganden oder den Chelatbildner für das Metall enthält zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Reduktionsmittel, z. B. Natriumdithionit, Natriumbisulfit, Ascorbinsäure, Formamidinsulfinsäure, Zinnion, Fe(II) oder Cu(I), vorzugsweise ein Zinnsalz wie Zinnchlorid oder Zinntartrat. Als Alternative dazu kann der Kit einen Metallkomplex enthalten, der nach Zugabe des Radiometalls eine Transmetallierung (z. B. Ligandenaustausch) durchläuft und das gewünschte Produkt ergibt. Für 99mTc ist der Kit vorzugsweise lyophilisiert und so entworfen, dass er mit sterilem 99mTc-Pertechnetat (TcO4 ) aus einem 99mTc-Radioisotopengenerator rekonstituiert wird, damit sich eine Lösung ergibt, die sich ohne weitere Bearbeitung zur Verabreichung an den Menschen eignet.
  • Ferner besteht die Möglichkeit, die Mittel der vorliegenden Erfindung in Form einer Dosiseinheit bereitzustellen, die für die Injektion beim Menschen gebrauchsfertig ist; beispielsweise könnten sie in einer vorgefüllten sterilen Spritze zur Verfügung gestellt werden.
  • Die Spritze, welche die Dosiseinheit enthält, wäre mit einem Schutzschild versehen (um den Bediener vor einer möglichen Strahlendosis zu schützen).
  • Die obigen Kits oder vorgefüllten Spritzen können gegebenenfalls weitere Inhaltsstoffe enthalten, wie z. B. Puffer, pharmazeutisch annehmbare Lösungsvermittler (z. B. Cyclodextrine oder Tenside, etwa Pluronic, Tween oder Phospholipide), pharmazeutisch annehmbare Stabilisatoren oder Antioxidantien (z. B. Ascorbinsäure, Gentisinsäure oder p-Aminobenzoesäure) oder Füllmittel zur Lyophilisierung (z. B. Natriumchlorid oder Mannitol).
  • Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung von Verbindungen der vorliegenden Erfindung und deren Anwendung bei der Bildgebung. In den Beispielen 1–9 sind die Synthesen bestimmter Verbindungen der vorliegenden Erfindung und in den Beispielen 10–12 deren Radiomarkierung mit 123I oder 99mTc aufgeführt. Verbindung 1 (aus dem Stand der Technik) ist als Vergleichsbeispiel einbezogen. Belege für erhöhte Plasmastabilität in vitro sind in Beispiel 13 angegeben, während Belege für die Aufnahme in Blut-Clots in vitro und in vivo jeweils in den Beispielen 15 und 17 vorgebracht werden, wobei die Bioverteilung der radiomarkierten Verbindungen bei normalen Ratten in Beispiel 16 dargelegt ist.
  • Die in vitro Plasmastabilität der 123I-Verbindung 1 ist schlecht (siehe Beispiel 13), was vermutlich durch Proteaseaktivität bedingt ist. Die Einbringung von Schutzgruppen sowohl am Carboxyl- als auch am Amino-Terminus der radiomarkierten Verbindungen 2–5 und 7–49 verschafft einen wesentlichen Anstieg der Plasmastabilität.
  • Die Mehrzahl der getesteten Verbindungen weist eine hohe in vitro Clot-Aufnahme und daher eine Avidität für den Clot auf. Die anderen Verbindungen besitzen geringere Potenz, wobei die Verbindungen 14, 16, 18, 31, 34, 46 und 48 eine signifikante Verringerung der Aufnahme zeigen. Die Entfernung des Gln-Rests von der 2-Position der α2-Antiplasmin-abgeleiteten Sequenzen, wie in Verbindung 14, verursacht einen großen Abfall der Aufnahme dieses Tracers, was stark vermuten lässt, dass Gln-2 eine wesentliche Aminosäure in diesem Sequenztyp darstellt.
  • Die Einzelheiten der Bioverteilung in normalen Ratten sowie in den frischen und gealterten Clot-Modellen sind in den Beispielen 16 und 17 aufgeführt. Die Blut-Clearance-Rate dieser Verbindungen ist mit biologischen Halbwertszeiten zwischen 1–2 Stunden verhältnismäßig schnell. Die Bioverteilung der 99mTc-Verbindung 3 ist als repräsentatives Beispiel angegeben, wobei in diesem Fall tN auf zwei Stunden geschätzt wird. Die schnelle Clearance aus Hintergrundgeweben, wie z. B. Blut, Lunge, Herz und Muskel, zeigt, dass die Mittel der vorliegenden Erfindung eine für die Bildgebung günstige Pharmakokinetik besitzen, und deutet auf deren Potential als Radiodiagnostika hin. Obgleich eine geringfügige hepatobiliäre Ausscheidung bei diesen Verbindungen zu beobachten ist, führt die Hauptausscheidungsroute über die Harnwege.
  • In den Rattenmodellen ist die Aufnahme in frische und gealterte Clots bei vielen der radiomarkierten Verbindungen sehr gut (relative Konzentration bzw. RK = 5–15), wobei die Clot-zu-Hintergrundgewebe-Verhältnisse für die Bildgebung sehr günstig ausfallen (> 5). Beispiel 18 zeigt, dass sich die 99mTc-Verbindung 5 zur Bildgebung von Clots im Rattenmodell eignet.
  • Im Vergleich zur 123I-Verbindung 1 (RK = 1,5) verfügen die 99mTc-Verbindungen 2–49 über eine erhöhte Plasmastabilität, die für die verbesserte in vivo Clot-Aufnahme verantwortlich sein kann, die bei diesen Verbindungen zu beobachten ist.
  • Aus dem Vergleich der Clot-Aufnahmeergebnisse für frische und gealterte Clots in Beispiel 17 ergibt sich, dass die vorliegenden Mittel eine Aufnahme aufweisen, die konstant und unabhängig vom Alter des Clots ist. Somit haben derartige Mittel eine verbesserte Bildgebungsfähigkeit bezüglich prä-existierender Clots, wie etwa jenen, die bei Lungenembolie zu finden sind.
  • VERSUCHSREIHE
  • In der folgenden Tabelle:
    ist Z Benzyloxycarbonyl,
    ist Fmoc Fluorenylmethoxycarbonyl,
    ist Ac Acetyl,
    ist Pn44
    Figure 00130001
    ist Pn216
    Figure 00140001
    ist Hynic
    Figure 00140002
    Figure 00140003
    Figure 00150001
    Figure 00160001
  • Alle Verbindungen, die gekennzeichneten ausgenommen, wurden mittels ES+-Massenspektrometrie analysiert. Die Analyse der durch a gekennzeichneten Verbindungen erfolgte mittels FAB- und jene der durch b gekennzeichneten Verbindungen mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie.
  • Beispiel 1: Synthesen der Verbindungen 1 und 2
  • Das geschützte Peptid Ac-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Val-Ser(tBu)-Pro-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Leu-Leu-Lys(Boc)-Gly-OH wurde auf ein 2-Chlorotritylharz gefügt, indem Fmoc-Lys(Boc) am Harz verankert wurde, woraufhin sukzessive Entschützungs-/Kopplungszyklen mit den geeigneten geschützten Aminosäuren durchgeführt wurden (wie beschrieben in P. Lloyd-Williams, F. Albericio und E. Girald; Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, CRC Press, 1997). Die Titelverbindung wurde durch Spaltung mittels 0,1% TFA in Dichlormethan, Entschützung und Reinigung durch RP-HPLC (System A) erhalten.
  • Beispiel 2: Synthesen der Verbindungen 3–9, 12–21, 28–33, 35, 37, 42 und 45–49
  • Das geeignete geschützte Peptid wurde wie in Beispiel 1 mit den entsprechenden geschützten Aminosäuren zusammengefügt. Das geschützte Fragment wurde vom Harz gespalten und dann unter Verwendung von BOP als Kopplungsmittel mit 6-Aminomethyl-3,3,6,9,9-pentamethyl-4,8-diazaundecan-2,10-diondioxim (hergestellt, wie in WO 95/19187 beschrieben), 3,3,11,11-Tetramethyl-7-aminoethyl-4,7,10-triazatridecan-2,12-diondioxim (hergestellt, wie in WO 98/31399 beschrieben) oder 6-Boc-hydrazinopyridin-3-carbonsäure-N-hydroxysuccinimidester (hergestellt, wie in US-Patent 5,206,370 beschrieben) in Lösung gekoppelt. Die Titelverbindungen wurden durch Entschützung in TFA/Wasser/Triethylsilan (90/5/5) erhalten und durch RP-HPLC (System A) gereinigt.
  • Beispiel 3: Synthesen der Verbindungen 22–27
  • In ein Eppendorf-Vial wurden Verbindung 5, 8 oder 9 (1 mg), Ammoniumacetatpuffer (400 μl, 0,2 M, pH-Wert 4), Natriumiodid (0,5 eq, 15 mg/10 ml in 0,1 M NaOH) und Peressigsäure (1,5 eq, 0.1 M Lösung) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde eine Minute lang gründlich gemischt, und die Mono- und Diiodprodukte wurden durch präparative HPLC getrennt und gesammelt. Das Verfahren wurde wiederholt, um ausreichende Mengen der isolierten Produkte zu erhalten.
  • Beispiel 4: Synthesen der Verbindungen 10 und 11
  • Fmoc-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Glu(tBu)-Gln(Trt)-Val-Ser(tBu)-Pro-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Leu-Leu-Lys(Boc)-Gly (200 mg, 0,73 mmol), Pn216 (30 mg, 0,87 mmol) und HBTU (33 mg, 0,87 mmol) wurden in wasserfreiem DMF (2,5 ml) gelöst. Der Lösung wurde Diisopropylethylamin (20 ml, 1,15 mmol) hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 1,75 Stunden lang gerührt. Daraufhin wurde das Reaktionsgemisch mit Piperidin (0,5 ml) behandelt, und bei Raumtemperatur wurde das Gemisch zwei Stunden lang gerührt. Das Produkt wurde durch semi-präparative HPLC gereinigt, um einen weißen Feststoff (171 mg, 82%) zu erhalten; ES+-MS: m/z 952,40 (M+3H+).
  • 1-Adamantancarbonsäure oder 3,5-bis(Trifluormethyl)benzoesäure (1,5 Moläquivalent), das geschützte Peptid Asn(Trt)-Gln(Trt)-Glu(tBu)-Gln(Trt)-Val-Ser(tBu)-Pro-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Leu-Leu-Lys(Boc)-Gly-Pn216 (1 Moläquivalent) und HBTU (1,2–1,5 Moläquivalent) wurden in wasserfreiem DMF (1 ml) gelöst. Diisopropylethylamin (11 Moläquivalente) wurde hinzugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt, bis die Reaktion mittels HPLC als vollständig beurteilt wurde. Daraufhin wurde das geschützte Peptidfragment mit 95% Trifluoressigsäure in CH2Cl2 behandelt. Bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch 2–4 Stunden lang gerührt. Das Produkt wurde aus dem Reaktionsgemisch durch RP-HPLC gereinigt.
  • Beispiel 5: Synthese der Verbindung 34
  • Beispielsweise mit Ausnahme von Fmoc-Asn(Trt)-Ψ(CH2NH)-Gln(Trt)-OH, erhalten in Übereinstimmung mit der klassischen Methode für die Synthese reduzierter Peptidbindungen, wurde das geschützte Peptid durch reduktive Aminierung von Gln(Trt) mit Fmoc-Asn(Trt)-abgeleitetem Aldehyd synthetisiert (siehe G. Guichard, u. a., Peptide Res., 6(3), 121 (1993) und Bezugnahmen darin).
  • Die daraus hervorgehende Verbindung wurde wie jene in Beispiel 2 vorbereitet und gereinigt.
  • Beispiel 6: Synthesen der Verbindungen 36, 38 und 39
  • Das geschützte Peptid wurde so synthetisiert wie in Beispiel 1, aber auf einem Rink-Harz. Nach der Entfernung des Glycin-N-Schutzes wurde das Peptid mit Glutarsäureanhydrid umgesetzt, während es sich nach wie vor auf dem Harz befand. Aktivierung mit BOP/HOBt der Glutarat-Carbonsäure und Kopplung mit 6-Aminomethyl-3,3,6,9,9-pentamethyl-4,8-diazaundecan-2,10-diondioxim oder 3,3,11,11-Tetramethyl-7-aminoethyl-4,7,10-triazatridecan-2,12-diondioxim auf dem Harz ergaben das geschützte Produkt. Die Spaltung mit TFA/Wasser (95/5) brachte das Rohmaterial hervor, das durch RP-HPLC (System A) gereinigt wurde.
  • Beispiel 7: Synthesen der Verbindungen 40 und 41
  • Eine Lösung mit dem erforderlichen Molekulargewicht aus α-N-(tert-butoxycarbonyl)-poly(ethylenglykol)amino-ω-succinimidylcarbonat und einem Moläquivalent von 6-Aminomethyl-3,3,6,9,9-pentamethyl-4,8-diazaundecan-2,10-diondioxim oder 3,3,11,11-Tetramethyl-7-aminoethyl-4,7,10-triazatridecan-2,12-diondioxim in wasserfreiem Tetrahydrofuran (5 ml) wurde fünf Stunden lang unter Stickstoff refluxiert. Das Reaktionsgemisch wurde in vacuo reduziert, was zu einem weißen Feststoff führte, der durch Flash-Chromatographie unter Verwendung von Isopropanol/Ammonium/Wasser 10:1:1 gereinigt wurde, um die Titelverbindung als weißen Feststoff zu erhalten. Die Boc-Schutzgruppe wurde mithilfe von 37% HCl entfernt, der tropfenweise zu einer eiskalten Lösung in Methanol hinzugegeben wurde. Dann wurde die Lösung bei Raumtemperatur vier Stunden lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Zugabe von 4 M NaOH (4,18 ml) auf den pH-Wert ~10 alkalisiert. Das Produkt wurde durch semi-präparative HPLC (System D) isoliert.
  • Der obige Feststoff wurde in DMF gelöst, und das geschützte Peptidfragment wurde ihm hinzugegeben. Diisopropylethylamin und HBTU wurden hinzugefügt, woraufhin das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur bis zum Abschluss der Reaktion gerührt wurde. Dann wurde das Produkt mittels HPLC (System E) gereinigt, um ein farbloses Gummi zu erhalten.
  • Dieses Gummi wurde in Dichlormethan (2 ml) gelöst, und die Lösung wurde fünf Stunden lang mit TFA (0,2 ml) behandelt. Die Reaktion wurde mit 1 M NaOH (2 ml) alkalisch gemacht, und flüchtige Stoffe wurden in vacuo entfernt. Dem Rest wurde MeOH (2,5 ml) hinzugegeben, und das Gemisch wurde unter Verwendung eines Acrodisc-Filters (LC13 PVDF 0,45 m) gefiltert. Aus der methanolischen Lösung wurde das Produkt mittels HPLC (System E) isoliert.
  • Beispiel 8: Synthese der Verbindung 43
  • 12-N-Fmoc-Aminododecansäure wurde an 3,3,11,11-Tetramethyl-7-aminoethyl-4,7,10-triazatridecan-2,12-diondioxim gekoppelt, wie zuvor beschrieben. Die Fmoc-Schutzgruppe wurde durch 20% Piperidin in DMF entfernt und das Produkt mittels HPLC (System F) gereinigt.
  • Das obige Produkt wurde mit dem geschützten Peptidfragment gekoppelt und anschließend entschützt, wie oben erläutert. Mittels HPLC (System G) wurde das Produkt gereinigt.
  • Beispiel 9: Synthese der Verbindung 44
  • Das teilweise entschützte Peptid H-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Gln(Trt)-Val-Ser(tBu)-Pro-Tyr(tBu)-Leu-Leu-Lys(Boc)-Gly-OH wurde mithilfe einer Fmoc-basierten Strategie auf ein 2-Chlortritylchloridharz gefügt, und zwar durch schrittweise Elongation mit BOP/HOBt. Der N-terminale Schutz wurde mittels Piperidinbehandlung entfernt, und durch eine Lösung mit 0,5% TFA in Dichlormethan wurde das teilweise geschützte Peptid vom festen Träger abgespalten.
  • Die Cyclisierung wurde in einer Lösung bei einer 10 mM Konzentration in DMF durchgeführt, wobei BOP als Kondensationsreagenz gedient hat und festes Natriumbicarbonat vorhanden war in Entsprechung zu einer bekannten Methode (siehe beispielsweise M. Rodriguez, u. a., Int. J. Pept. Protein Res., 35, 441, 1990).
  • Die endgültige Entschützung in einem Gemisch aus TFA/Wasser/Ethandithiol (90/5/5) brachte die rohe Titelverbindung hervor, die mittels RP-HPLC (System A) gereinigt wurde.
  • Beispiel 10: I-123-Markieren der Verbindungen 1–2 und der Verbindung 44
  • Ammoniumacetatpuffer (200 μl, 0,2 M, pH-Wert 4,0) wurde zu der Ligandenlösung (20 μl, 20 μg) und Na127I (10 μl, 1,5 μg) in ein Eppendorf-Tube gegeben. Die Lösung wurde sorgfältig vermischt, woraufhin Na123I (5–50 μl, 111 MBq) hinzugefügt wurde. Die Lösung wurde sorgfältig vermischt vor der Zugabe von PAA-Lösung (10 μl, 0,01 M), der ein weiteres Vermischen folgte. Die Aktivität des Präparats wurde gemessen. In allen Fällen wurde das benötigte Produkt von Reaktionsnebenprodukten und nicht markierten Substraten mittels HPLC getrennt.
  • Beispiel 11: Tc-99m-Markieren der Verbindungen 3, 5–43, 45–49
  • Ein 0,1 ml Aliquot der in H2O (1 mg/ml) gelösten Verbindung wurde zu einem mit Stickstoff gefüllten 10 ml Glasvial zusammen mit deoxygenierter Salzlösung (0,9% w/v, 1 ml) und 0,035 ml wässrigem NaOH (0,1 M) transferiert. Dieser Lösung wurde Technetium-Generatoreluat (1 ml, annähernd 0,4 GBq) und dann wässrige Zinnchloridlösung (0,1 ml, ca. 10 μg) hinzugegeben. Der Markierungs-pH-Wert belief sich auf 9,0–10,0. Vialen wurden bei Laborumgebungstemperatur (15–25°C) dreißig Minuten lang inkubiert, um die Markierung zu bewirken. Das daraus resultierende Präparat wurde entweder zur gewünschten radioaktiven Konzentration verdünnt, oder es wurde eine HPLC-Reinigung (System B) vorgenommen, um nicht markiertes Ausgangsmaterial und radioaktive Unreinheiten vor den Tests zu entfernen. Nach der Reinigung wurde das organische Lösungsmittel unter Vakuum entfernt, und die Probe wurde in etwa 5 ml 0,1 M Phospatpuffer mit einem pH-Wert von 7,4 erneut gelöst, um eine Arbeitskonzentration von 6–9 MBq/ml zu erhalten. Vor Verwendung wurde die radiochemische Reinheit durch Einsatz des nachstehend erläuterten Dünnschichtchromatographie(DC)-Systems beurteilt:
    • i) ITLC SG 2 cm × 20 cm, eluiert mit 0,9% w/v Salzlösung
    • ii) Whatman Nr. 12 cm × 20 cm, eluiert mit 50:50 v/v Acetonitril:H2O
  • Die markierten Substrate bleiben an, oder nahe bei, dem Ursprung im TLC-System (i) und bewegen sich nahe der Lösungsmittelfront im System (ii). Bei Analyse durch zweckmäßiges Detektionsgerät erweisen sich typischerweise über 85% der markierten Verbindung als radiochemisch rein.
  • Beispiel 12: Tc-99m-Markieren der Verbindung 4
  • Ein 0,1 ml Aliquot der in Wasser (1 mg/ml) gelösten Verbindung wurde zusammen mit in Wasser gelöstem Tricin (37,5 mg, 0,5 ml) und in Wasser gelöstem Phosphinidynetris(benzolsulfonsäure)tris-natriumsalz (10 mg/0,1 ml) zu einem mit Stickstoff gefüllten 10 ml Glasvial transferiert. Dieser Lösung wurde Technetium-Generatoreluat hinzugegeben (1 ml, annähernd 0,4 GBq) und dann eine Lösung aus Zinnchlorid in 0,1 M HCl (0,02 ml, ca. 2 μg). Der Markierungs-pH-Wert belief sich auf 4,5–5,5. Vialen wurden bei 60°C 30 Minuten lang inkubiert, um die Markierung zu bewirken. Die Reinigung und die Beurteilung der radiochemischen Reinheit wurden in gleicher Weise vorgenommen wie in Beispiel 10.
  • Beispiel 13: In vitro Plasmastabilität
  • Zu einem Teil der Verbindung (50 μl, 10 MBq/ml) wurde das gleiche Volumen Plasma (von Ratte oder Mensch) oder Salzlösung hinzugegeben. Die Gemische wurden bei 37°C inkubiert, und die Stabilität wurde nach 0,30 und 120 Minuten durch HPLC (System C) gemessen. Die saline Dilution fungierte als Kontrolle.
    Verbindung Gattung % intakt in 120. Minute
    123I-Vbdg. 1 (Stand der Technik) Mensch 0
    123I-Vbdg. 2 Mensch 98
    Ratte 99
    99mTc-Vbdg. 3, 4, 5, 7, 12, 16, 17; 123I-Vbdg. 44 Mensch > 90
    Ratte > 90
    99mTc-Vbdg. 8–11, 13–15, 19–21, 28–36, 38, 39, 45–49 Ratte > 90
    99mTc-Vbdg. 22–27 Ratte > 60
  • Beispiel 14: HPLC-Systeme
    • Flussrate: 1 ml/min in allen Systemen.
  • System A
    Säule Wasser C18 250 × 4,5 mm. Teilchengröße 4
    Mikron
    Gradient: Elutionsprofil 10–60%B in 25 min
    Eluent A: 0,1% wässrige TFA
    Eluent B: 0,1% TFA in Acetonitril
    System B
    Säule Wasser C18 150 × 3,9 mm. Teilchengröße 4
    Mikron
    Gradient: Elutionsprofil 0–100%B in 22 min
    Eluent A: 0,1% wässrige TFA
    Eluent B: 0,1% TFA in Acetonitril
    System C
    Säule Wasser C18 150 × 3,9 mm. Teilchengröße 4
    Mikron
    Gradient: Elutionsprofil 0–100%B in 20 min
    Eluent A: 50 mM NH4OAc Puffer (pH-Wert 5,6)
    Eluent B: Acetonitril
    System D
    Säule Hamilton PRP – 1,305 mm × 7,0 mm
    Gradient: Elutionsprofil 0–65%B in 10 min
    Eluent A: 5% wässriges Ammoniak
    Eluent B: Acetonitril
    System E
    Säule Hamilton PRP – 1,150 mm × 4,1 mm
    Gradient: Elutionsprofil 0–100%B in 15 min
    Eluent A: 5% wässriges Ammoniak
    Eluent B: Acetonitril
    System F
    Säule Polymer-Laboratorien PLRP-S, 150 mm × 2,5
    mm
    Gradient: Elutionsprofil 0–100%B in 15 min
    Eluent A: 5% wässriges Ammoniak
    Eluent B: Acetonitril
    System G
    Säule Hamilton PRP – 1,150 mm × 4,1 mm
    Gradient: Elutionsprofil 0–100%B in 15 min
    Eluent A: 0,1% wässrige TFA
    Eluent B: 0,1% TFA in Acetonitril
  • Beispiel 15: Inkorporation in humane Plasma-Clots
  • Die Inkorporation radiomarkierter Substrate in Fibrin wurde untersucht, indem ein in vitro humaner Plasma-Clot in der folgenden Weise induziert wurde. In ein silikonisiertes 5 ml Glas-Vial wurde Folgendes gegeben: (a) 800 μl Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-gepufferter Salzlösung, die den pH-Wert 7,5 aufwies und Calciumchlorid enthielt (50 mM Tris, 150 mM Natriumchlorid, 4 mM Calciumchlorid), (b) etwa 40 μl einer physiologischen Salzlösung, welche 100 Einheiten Thrombin pro ml enthielt, (c) etwa 400 μl humanen Plasmas, welches das radiomarkierte Substrat in einer Konzentration von typischerweise 10 kBq/ml enthielt. Um die Induktion eines Clots zu unterstützen, wurde dem Reaktionsvial eine aufgeraute Glasstange hinzugegeben. Kontrollvialen wurden in ähnlicher Weise vorbereitet, jedoch unter Verzicht auf Thrombin und Calciumchlorid.
  • Nach 60-minütiger Inkubation der Testlösung bei Laborumgebungstemperatur (ca. 20°C) wurde die Reaktion unterbrochen mit der Zugabe von etwa 400 μl einer kalten Lösung aus 33,5 mM Ethylendiamintetraessigsäuredinatriumsalz. Clots wurden vom Serum durch Vakuumfiltration auf 0,45 μM Nitrocellulosefiltern getrennt (voreingeweicht in 1,5% BSA/tris(hydroxymethyl)-aminoethan-gepufferter Salzlösung, die einen pH-Wert von 7,5 aufwies und 0,1% Twenn 20 enthielt) und gewaschen mit etwa 2 × 10 ml tris(hydroxymethyl)-aminomethan-gepufferter Salzlösung, die einen pH-Wert von 7,5 aufwies und Tween 20 enthielt, so dass sich eine endgültige Konzentration von 0,1% v/v ergab. Der Anteil der gesamten Radioaktivität wurde durch Zählung in einem zweckmäßigen Detektionsgerät berechnet.
  • Der Bruchteil der auf dem Filter zurückgehaltenen Radioaktivität stellt, nach Subtraktion der anhand der Kontrolle bestimmten nicht spezifischen Bindung, ein Maß für die Inkorporation in die gefilterten Clots dar.
    Verbindung % zurückgehalten (mit Thrombin) % zurückgehalten (ohne Thrombin) % spezifische Aufnahme
    123I-Vbdg. 1 14,6 2,0 12,6
    123I-Vbdg. 2 38,6 0,2 38,4
    99mTc-Vbdg. 3 39,3 0,3 39,0
    99mTc-Vbdg. 4 22,0 0,1 21,0
    99mTc-Vbdg. 5 35,5 0,2 35,3
    99mTc-Vbdg. 6 68,6 4,3 64,3
    99mTc-Vbdg. 7 41,3 0,7 40,6
    99mTc-Vbdg. 8 25,9 1,4 24,5
    99mTc-Vbdg. 9 44,5 2,7 42,8
    99mTc-Vbdg. 10 65,9 0,2 65,7
    99mTc-Vbdg. 11 68,1 1,2 66,9
    99mTc-Vbdg. 12 34,8 0,3 34,5
    99mTc-Vbdg. 13 57,0 0,2 56,8
    99mTc-Vbdg. 14 3,3 0,5 2,8
    99mTc-Vbdg. 15 55,6 0,4 55,2
    99mTc-Vbdg. 16 12,5 0,1 12,4
    99mTc-Vbdg. 17 41,3 0,7 40,6
    99mTc-Vbdg. 18 9,8 0,1 9,7
    99mTc-Vbdg. 19 48,2 0,2 48,0
    99mTc-Vbdg. 20 65,0 2,6 62,4
    99mTc-Vbdg. 21 60,6 0,5 60,1
    99mTc-Vbdg. 22 59,0 0,3 58,7
    99mTc-Vbdg. 23 63,8 0,1 63,7
    99mTc-Vbdg. 24 56,8 0,4 56,4
    99mTc-Vbdg. 25 68,0 4,3 63,7
    99mTc-Vbdg. 26 63,3 8,2 55,1
    99mTc-Vbdg. 27 nd nd nd
    99mTc-Vbdg. 28 42,1 0,2 41,9
    99mTc-Vbdg. 29 21,1 0,1 21,0
    99mTc-Vbdg. 30 14,9 0,2 14,7
    99mTC-Vbdg. 31 7,7 0,1 7,6
    99mTc-Vbdg. 32 20,2 0,4 19,8
    99mTc-Vbdg. 33 63,9 0,1 63,8
    99mTc-Vbdg. 34 5,5 0,1 5,4
    99mTc-Vbdg. 35 15,9 0,6 15,3
    99mTc-Vbdg. 36 8,7 0,1 8,6
    99mTc-Vbdg. 37 13,0 0,2 12,8
    99mTc-Vbdg. 38 21,0 0,7 20,3
    99mTc-Vbdg. 39 23,1 0,1 23,0
    99mTc-Vbdg. 40 13,3 0,1 13,2
    99mTc-Vbdg. 41 44,5 7,1 37,4
    99mTc-Vbdg. 42 14,2 0,2 14,0
    99mTc-Vbdg. 43
    121I-Vbdg. 44 14,1 0,3 13,8
    99mTc-Vbdg. 45 28,7 0,1 28,6
    99mTc-Vbdg. 46 6,3 0,2 6,1
    99mTc-Vbdg. 47 49,9 0,1 49,8
    99mTc-Vbdg. 48 10,6 0,1 10,5
    99mTc-Vbdg. 49 33,1 1,6 31,5
    *% zurückgehalten im Plasmaclot-Assay (mit Thrombin) – % zurückgehalten im Plasmaclot-Assay (ohne Thrombin)
  • Beispiel 16: Bioverteilung in normalen Ratten
  • Die Auflösung eines Clot-Bildes hängt von einer Kombination aus der Inkorporationsrate des Radiopharmakons und dessen Clearance-Rate aus Blut/Geweben ab. Aus diesem Grund wurde die Bioverteilung mehrerer Verbindungen in Ratten bestimmt. Männlichen Wistar-Ratten (100–150 g) wurde i. v. 0,1–0,2 ml radiomarkierter Tracer-Lösung (8 MBq/ml) injiziert, und nach der Injektion wurden sie zu unterschiedlichen Zeitpunkten seziert. In jedem der ausgewählten Gewebe wurde die %ID gemessen. Einige Tiere wurden in Metabolismuskäfigen gehalten, um die Möglichkeit zu schaffen, die in Urin und Kot ausgeschiedene %ID zu bestimmen. Die Sezierzeitpunkte, die für das Mittel gewählt wurden, betrugen 15, 30, 60, 240 min. Die Daten sind als Mittel von %ID (n = 3) dargestellt. 99mTc-Verbindung 3
    15 min 30 min 60 min 240 min
    Muskel 14,7 10,4 5,1 2,9
    Blut 5,3 1,8 1,6 0,6
    Niere 7,6 4,9 4,6 3,4
    Urin 14,9 34,3 37,0 42,0
    Lunge 0,7 0,4 0,3 0,3
    Leber 6,2 4,1 4,0 3,0
    GI-Trakt 13,5 15,1 18,0 20,7
    Herz 0,2 0,1 0,1 0,04
  • Beispiel 17: Inkorporation in Clots, die in ein Rattenmodell induziert sind
  • Rattenmodell – Vena Cava Inferior (VCI)
  • Die Ratten (männliche Wistar, 250–350 g) wurden mit 15% Urethan anästhesiert. Nach einer Laparotomie wurde die Vena cava isoliert und vom umgebenden Fettgewebe befreit. Ein Platindraht (1,5 cm × 0,5 mm) wurde in die Vena cava inferior eingeführt, und fünf Minuten nach dem Eingriff wurden 0,4 ml Ellagsäure (1,2 × 10–4 M) intravenös durch die zuvor mit Kanüle versehene Oberschenkelvene injiziert, um die Clot-Bildung zu ermöglichen. Das durchschnittliche Gewicht der in diesem Modell gebildeten Clots betrug ungefähr 27 mg, n = 32 (Bereich von 5–50 mg). Die Verbindungen wurden 5 min (frischer Clot) und 60 min (gealterter Clot) nach Induktion injiziert. Nach 60 min wurden die Tiere getötet; der Clot wurde entfernt und gewogen, und es wurde eine Zählung vorgenommen. An anderen Geweben, z. B. Blut, Lunge, Herz, erfolgten ebenfalls eine Sezierung und eine Zählung. Die Aufnahme des Tracers in den Clot wurde bestimmt als relative Konzentration (cpm/g des Clots gegenüber Dosis/g des Tiers) und anhand des Clot-zu-Hintergrundgewebes.
  • Ergebnisse:
  • Frische Clots
    %ID/g Rel. Konz. Clot/Blut Clot/Lunge Clot/Herz Clot/Leber
    123I-Vbdg. 1 0,5 ± 0,1 1,6 ± 0,4 1 nd nd nd
    123I-Vbdg. 2 4,9 ± 0,8 14,5 ± 2,2 7 10 19 21
    99mTc-Vbdg. 3 1,4 ± 0,4 5,1 ± 1,2 10 8 17 6
    99mTc-Vbdg. 4 2,0 ± 0,6 6,5 ± 2,0 6 8 15 20
    99mTc-Vbdg. 5 6,0 ± 2,1 16 ± 5,8 21 23 51 43
    99mTc-Vbdg. 7 4,8 ± 1,3 14,5 ± 4,4 15 11 21 6
    99mTc-Vbdg. 8 6,7 ± 1,7 21,0 ± 6,8 14 18 41 21
    99mTc-Vbdg. 9 8,8 ± 3,6 24,8 ± 9,6 13 12 32 13
    99mTc-Vbdg. 10 2,9 ± 0,5 6,5 ± 1,2 4 5 10 5
    99mTc-Vbdg. 11 1,1 ± 0,4 3,3 ± 1,1 10 11 24 11
    99mTc-Vbdg. 12 7,3 ± 4,1 19,8 ± 11,0 20 17 31 8
    99mTc-Vbdg. 13 3,4 ± 0,7 7,9 ± 1,6 7 8 18 18
    99mTc-Vbdg. 14 0,5 ± 0,1 1,2 ± 0,2 2 1,5 3 0,7
    99mTc-Vbdg. 15 3,6 ± 1,0 8,3 ± 2,2 4 6 12 11
    99mTc-Vbdg. 16 0,3 ± 0,1 1,0 ± 0,2 3 3 8 0,8
    99mTc-Vbdg. 17 1,2 ± 0,7 3,7 ± 2,3 7 12 18 5
    99mTc-Vbdg. 19 2,5 ± 0,3 7,1 ± 1,2 3 7 29 17
    99mTc-Vbdg. 20 2,3 ± 0,6 6,5 ± 1,3 12 11 30 18
    99mTc-Vbdg. 21 2,3 ± 1,3 7,4 ± 4,0 11 16 28 13
    99mTc-Vbdg. 22 3,8 ± 1,6 13,0 ± 5,5 11 13 28 25
    99mTc-Vbdg. 23 7,6 ± 1,8 18,2 ± 4,1 6 6 17 21
    99mTc-Vbdg. 24 4,0 ± 2,2 11,1 ± 6,7 10 10 21 11
    99mTc-Vbdg. 26 14,1 ± 10 41,4 ± 28 16 11 38 16
    99mTc-Vbdg. 28 3,5 ± 2,0 9,7 ± 5,0 13 19 31 35
    99mTc-Vbdg. 29 4,7 ± 1,9 13,0 ± 4,9 14 20 44 44
    99mTc-Vbdg. 31 0,3 ± 0,2 0,9 ± 0,6 0,6 1 2 3
    99mTc-Vbdg. 32 1,7 ± 0,7 4,6 ± 1,9 10 11 26 27
    99mTc-Vbdg. 33 2,7 ± 0,2 7,8 ± 0,6 11 16 32 28
    99mTc-Vbdg. 34 0,5 ± 0,2 1,8 ± 0,5 2 3 6 8
    99mTc-Vbdg. 35 1,2 ± 0,2 3,7 ± 0,8 2 2 4 2
    99mTc-Vbdg. 36 0,2 ± 0,1 0,7 ± 0,3 1 1 3 4
    99mTc-Vbdg. 37 0,4 ± 0,2 0,9 ± 0,4 0,6 0,7 1 1
    99mTc-Vbdg. 38 1,9 ± 0,5 5,4 ± 1,5 5 6 15 3
    99mTc-Vbdg. 39 2,5 ± 0,3 9,0 ± 1,1 9 14 29 31
    99mTc-Vbdg. 41 0,7 ± 0,1 2,2 ± 0,3 3 4 6 8
    99mTc-Vbdg. 42 0,3 ± 0,1 0,3 ± 0,2 2 0,3 1 63
    123I-Vbdg. 44 0,4 ± 0,1 1,1 ± 0,2 0,9 1,5 1 2
    99mTc-Vbdg. 45 2,0 ± 0,5 5,5 ± 1,3 6 5 10 3
    99mTc-Vbdg. 46 0,8 ± 0,4 2,0 ± 0,7 5 3 6 1
    99mTc-Vbdg. 47 0,8 ± 0,7 2,2 ± 2,0 0,8 1 3 1
    99mTc-Vbdg. 48 0,3 ± 0,2 1,0 ± 0,5 0,6 0,9 2 3
    99mTc-Vbdg. 49 2,6 ± 1,1 8,5 ± 3,7 4 6 16 4
    Rel. Konz. (RK) = % ID/g des Clots %ID/g im Rest des Körpers
    Gealterte Clots
    %ID/g Rel. Konz. Clot/Blut Clot/Lunge Clot/Herz Clot/Leber
    123I-Vbdg. 2 5,5 ± 1,7 14,5 ± 3,9 24 12 23 20
    99mTc-Vbdg. 3 2,1 ± 0,8 6,2 ± 2,2 8 11 23 5
    99mTc-Vbdg. 4 1,2 ± 1,1 4,1 ± 4,0 8 10 19 19
    99mTc-Vbdg. 5 3,6 ± 1,7 11 ± 5,1 13 31 33 24
    99mTc-Vbdg. 7 2,1 ± 0,3 6,5 ± 1,3 9 7 15 3
    99mTc-Vbdg. 8 5,3 ± 1,3 16,4 ± 4,3 10 9 24 16
    99mTc-Vbdg. 9 3,7 ± 0,4 11,4 ± 1,5 8 7 21 6
    99mTc-Vbdg. 10 2,9 ± 1,4 6,3 ± 2,7 6 6 16 5
    99mTc-Vbdg. 11 0,4 ± 0,3 1,2 ± 0,8 5 6 13 4
    99mTc-Vbdg. 12 4,1 ± 1,2 11,2 ± 3,4 19 15 75 7
    99mTc-Vbdg. 13 45 ± 1,5 10,4 ± 3,0 6 9 29 19
    99mTc-Vbdg. 14 0,6 ± 0,4 1,4 ± 0,8 1,4 1,3 2 0,7
    99mTc-Vbdg. 15 3,4 ± 0,6 7,6 ± 1,6 3 0,6 1 nd
    99mTc-Vbdg. 17 0,8 ± 0,1 2,7 ± 0,6 3 5 7 3
    99mTc-Vbdg. 19 3,2 ± 2,3 9,1 ± 7,1 14 5 13 6
    99mTc-Vbdg. 20 1,7 ± 0,5 4,9 ± 1,4 10 14 36 23
    99mTc-Vbdg. 21 2,7 ± 2,3 8,5 ± 6,8 31 13 32 31
    99mTc-Vbdg. 22 6,9 ± 2,5 22,7 ± 7,4 11 1 3 4
    99mTc-Vbdg. 23 7,5 ± 2,5 17,6 ± 4,6 13 1 1 1
    99mTc-Vbdg. 24 4,1 ± 2,5 11,9 ± 8,0 15 20 40 37
    99mTc-Vbdg. 26 4,0 ± 0,9 12,9 ± 3,5 7 12 31 54
    99mTc-Vbdg. 28 4,5 ± 1,1 13,1 ± 3,4 17 2 3 1
    99mTc-Vbdg. 29 3,8 ± 0,4 10,0 ± 1,7 11 30 67 29
    99mTc-Vbdg. 31 0,2 ± 0,1 0,6 ± 0,2 0,6 4 9 2
    99mTc-Vbdg. 32 0,7 ± 0,1 2,0 ± 0,4 3 15 43 21
    99mTc-Vbdg. 33 2,2 ± 0,6 6,7 ± 1,6 16 9 24 16
    99mTc-Vbdg. 34 0,4 ± 0,1 1,4 ± 0,4 3 - - 6
    99mTc-Vbdg. 35 0,6 ± 0,1 1,5 ± 0,4 1 0,5 1 2
    99mTc-Vbdg. 36 0,1 ± 0,02 0,2 ± 0,1 0,6 10 18 4
    99mTc-Vbdg. 37 0,2 ± 0,03 0,5 ± 0,1 0,4 1 2 9
    99mTc-Vbdg. 38 0,8 ± 0,3 2,4 ± 0,7 3 0,5 1 2
    99mTc-Vbdg. 39 2,4 ± 0,3 8,2 ± 1,1 15 12 43 11
    99mTc-Vbdg. 41 0,4 ± 0,1 1,1 ± 0,3 1 6 13 4
    99mTc-Vbdg. 42 0,4 ± 0,1 1,3 ± 0,3 5 7 21 6
    123I-Vbdg. 44 0,5 ± 0,03 1,2 ± 0,1 0,9 2 1 1
    99mTc-Vbdg. 45 2,0 ± 0,8 5,7 ± 2,3 8 5 11 3
    99mTc-Vbdg. 46 0,5 ± 0,2 1,3 ± 0,6 4 3 5 1
    99mTc-Vbdg. 47 0,5 ± 0,3 1,5 ± 0,8 1 124 46 44
    99mTc-Vbdg. 48 0,2 ± 0,04 0,8 ± 0,2 1 109 32 26
    99mTc-Vbdg. 49 1,2 ± 0,5 3,9 ± 1,6 4 9 29 19
  • Beispiel 18: Bildgebung von in ein Rattenmodell induzierten Clots
  • Clots wurden in männliche Wistar-Ratten (250–350 g) induziert, wie in Beispiel 17 beschrieben, jedoch mit der Ausnahme, dass für diese Versuche der Platindraht in der Jugularvene platziert wurde. Die Verbindungen wurden 60 min nach Injektion injiziert, und zwischen 15–180 min p. i. wurden planare Bilder erhalten. Eine medizinische Isocam I Gammakamera von Park wurde für diese Versuche verwendet, 300K oder 150K Zählungen wurden vom Thorax unter Verwendung eines LEUHR- oder LEPH-Kollimators gesammelt. Clots wurden von der 15. Minute p. i. an visualisiert. Das höchste Clot-zu-Hintergrund-Verhältnis wurde aufgrund der raschen Clearance der Verbindung bei 180 min p. i. erreicht.
  • Abkürzungen
    • Ac
      Acetyl
      Boc
      tert-Butyloxycarbonyl
      Vbdg.
      Verbindung
      DMF
      Dimethylformamid
      ES
      Elektrospray
      FAB
      Fast Atom Bombardment
      Fmoc
      Fluorenylmethoxycarbonyl
      HPLC
      Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
      MALDI-TOF
      Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation – (Flugzeit)
      Nal
      Naphthylalanin
      RCP
      radiochemische Reinheit
      RP-HPLC
      Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
      TFA
      Trifluoressigsäure
      DC
      Dünnschichtchromatographie

Claims (14)

  1. Verbindung der Formel: Y-(CR2)n-X-NHJ wobei X steht für C=O oder -CR2-; n eine ganze Zahl des Wertes 1 bis 6 ist; Y für R1R2CR- steht, wobei einer von R1 und R2 für -NH(B)pZ1 steht und der andere für -CO(B)qZ2 steht, wobei p und q ganze Zahlen des Wertes 0 bis 45 sind, und jedes B unabhängig ausgewählt ist aus Q oder einem Aminosäurerest, wobei Q ein cyclisches Peptid ist; Z1 und Z2 Metallkomplexiermittel (L) oder andere Schutzgruppen sind, wie zuvor definiert, die biokompatible Gruppen sind, die einen in-vivo-Metabolismus des Peptids inhibieren oder unterdrücken; J und jede R-Gruppe unabhängig ausgewählt sind aus H, C1-4-Alkyl, C1-4-Alkenyl, C1-4-Alkinyl, C1-4-Alkoxyalkyl oder C1-4-Hydroxyalkyl; mit der Massgabe, dass (i) die Gesamtzahl der Aminosäurereste in den R1- und R2-Gruppen 45 nicht überschreitet; (ii) wenn X für CR2 steht, Z2 ein Metallkomplexiermittel (L) ist; (iii) mindestens einer von R1 und R2 mindestens eine detektierbare Einheit trägt, die für radiopharmazeutische Bildgebung geeignet ist, ausgewählt aus einem nicht-metallischen Radioisotop oder einem Radiometall; (iv) R1 oder R2 eines oder mehrere Peptidfragmente von α2-Antiplasmin, Fibronektin, beta-Kasein, Tetanus, Amyloid, Trappin und Polyglutamin-Resten umfasst, wobei das Peptidfragment mindestens drei Aminosäurereste enthält.
  2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei das Peptidfragment der Massgabe (iv) von einem α2-Antiplasmin ist.
  3. Verbindung nach Anspruch 2, wobei die Aminosäure in der 2-Position von dem Peptid-N-Terminus Glutamin ist.
  4. Verbindung nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei J für H steht.
  5. Verbindung nach Anspruch 4 der Formel: Y-(CR2)x-(CH2)2CONH2 oder Y-(CR2)y-(CH2)4NH2 wobei x eine ganze Zahl des Wertes 0 bis 4 ist und y eine ganze Zahl des Wertes 0 bis 3 ist.
  6. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei mindestens eines von Z1 und Z2 ein Metallkomplexiermittel ist.
  7. Verbindung nach Anspruch 6, wobei Z2 ein Metallkomplexiermittel ist und Z1 kein Metallkomplexiermittel ist.
  8. Metallkomplex der Verbindungen nach Anspruch 6 oder Anspruch 7.
  9. Metallkomplex nach Anspruch 8, wobei das Metall ein Radiometall ist.
  10. Radiometallkomplex nach Anspruch 9, wobei das Radiometall für 99mTc steht.
  11. Präparat für Verabreichung an den Menschen, umfassend die Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
  12. Kit, umfassend die Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, nützlich in der Herstellung der Metallkomplexe nach einem der Ansprüche 8 bis 10.
  13. Verbindung der Formel: Y-(CR2)n-X-NHJ wobei: Y, X, R, n und J sind wie definiert in Anspruch 1, zur Verwendung als ein diagnostisches Mittel für Stellen der Thrombose oder Embolie.
  14. Radiometallkomplex der Verbindung nach Anspruch 10, wobei mindestes eines von Z1 und Z2 ein Metallkomplexiermittel ist; zur Verwendung als ein diagnostisches Mittel für Stellen der Thrombose oder Embolie.
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