DE69326335T2

DE69326335T2 - Technetium-99M-markierte peptide zur Bilderzeugung

Info

Publication number: DE69326335T2
Application number: DE69326335T
Authority: DE
Inventors: Scott Buttram; Edgar Civitello; Richard Dean; John Lister-James; William Mcbride
Original assignee: Diatech Inc
Current assignee: CIS Bio International SA
Priority date: 1992-04-30
Filing date: 1993-04-19
Publication date: 2000-02-03
Anticipated expiration: 2013-04-20
Also published as: DE69326335T3; US5780007A; US5922303A; CA2111863A1; KR100320629B1; US6093383A; US5965107A; US5776428A; WO1993021962A1; CA2111863C; KR940701275A; ATE184203T1; EP0637968B2; AU681080B2; AU4107693A; EP0637968A1; EP0637968B1; US6086849A; US5720934A; JPH07506111A

Description

Diese Erfindung betrifft radiodiagnostische Reagenzien und Peptide, und Verfahren zur Herstellung markierter radiodiagnostischer Mittel. Insbesondere betrifft die Erfindung Peptide, Verfahren und Kits zur Herstellung derartiger Peptide, und Verfahren zur Verwendung derartiger Peptide zur Abbildung bzw. Darstellung von Steilen in einem Säugerkörper, markiert mit Technetium-99 m (Tc-99 m) über eine Radiomarkierungs-bindende Gruppe, die mit Tc-99 m einen neutralen Komplex bildet.
Auf dem Gebiet der Nuklearmedizin werden durch Bestimmen der Verteilung geringer Mengen innerlich verabreichter radioaktiv markierter Nachweis- bzw. Tracerverbindungen (genannt Radiotracer oder Radiopharmazeutika) bestimmte pathologische Zustände lokalisiert oder ihr Ausmaß bestimmt. Verfahren zum Nachweis dieser Radiopharmazeutika sind im allgemeinen als Darstellungs- oder Radiodarstellungsverfahren bekannt.
Bei der Radiodarstellung ist die Radiomarkierung ein gamma-Strahlung emittierendes Radionuklid und der Radiontracer wird unter Verwendung einer gamma-Strahlung erfassenden Kamera lokalisiert (dieses Verfahren wird häufig als gamma-Szintigraphie bezeichnet). Die dargestellte Stelle ist nachweisbar, da der Radiotracer entweder derart ausgewählt wird, daß er sich an einer pathologischen Stelle anreichert (genannt positiver Kontrast), oder alternativ wird der Radiotracer derart ausgewählt, daß er sich nicht an pathologischen Stellen anreichert (genannt negativer Kontrast).
Für optimale Radiodarstellung in Menschen müssen eine Reihe von Faktoren berücksichtigt werden. Um die Nachweiseffizienz zu maximieren, ist ein Radionuklid, welches gamma-Energie im Bereich von 100 bis 200 keV emittiert, bevorzugt. Um die durch den Patienten absorbierte Strahlungsdosis zu minimieren sollte die physikalische Halbwertszeit des Radionuklids so kurz sein, wie es das Darstellungsverfahren erlaubt. Damit Untersuchungen an jedem Tag und jederzeit während des Tages durchgeführt werden können, ist es vorteilhaft, daß am Ort der Klinik eine Quelle des Radionuklids immer verfügbar ist.
Es ist eine Vielzahl von Radionukliden bekannt, die zur Radiodarstellung geeignet sind, umfassend &sup6;&sup7;Ga, 99mTc (Tc-99 m), ¹¹¹In, ¹²³I, ¹²&sup5;I, ¹&sup6;&sup9;Yb oder ¹&sup8;&sup6;Re. Tc-99 m ist ein bevorzugtes Radionuklid, da es gamma-Strahlung bei 140 keV emittiert, es hat eine physikalische Halbwertszeit von 6 Stunden, und es ist vor Ort leicht verfügbar unter Verwendung eines Molybdän-99/Technecium-99 m Generators.
Die Empfindlichkeit von Darstellungsverfahren unter Verwendung radioaktivmarkierter Peptide ist wesentlich höher als mit anderen in der Technik bekannten Radiopharmazeutika, da die spezifische Bindung des radioaktiven Peptids das radioaktive Signal am interessierenden Gebiet konzentriert. Kleine synthetische Peptide, die spezifisch an interessierende Ziele binden, können vorteilhaft als Basis für Radiotracer verwendet werden. Der Grund dafür ist: 1. Sie können chemisch synthetisiert werden (im Gegensatz zu einem Erfordernis ihrer Produktion in einem biologischen System wie etwa Bakterien oder Säugerzellen, oder ihrer Isolierung aus einer Substanz biologischen Ursprungs wie etwa einem Proteinfragment), 2. sie sind klein, daher wird nicht an das Ziel gebundener Radiotracer rasch aus dem Körper eliminiert, wodurch Hintergrundradioaktivität (nicht-zielgebunden) verringert wird und eine gute Bestimmung des Ziels möglich wird, und 3. kleine Peptide können leicht chemisch manipuliert werden um ihre Affinität für eine bestimmte Bindungsstelle zu optimieren.
Kleine, einfach zu synthetisierende markierte Peptidmoleküle sind als Radiopharmazeutika zur routinemäßigen Verwendung bevorzugt. Es besteht klar ein Bedarf für kleine, synthetische markierte Peptide, die einem Patienten direkt injiziert werden können und pathologische Stellen durch Lokalisierung an solchen Stellen darstellen. Kleine, Tc-99 m markierte synthetische Peptide bieten klare Vorzüge als Radiotracer für die gamma-Szintigraphie, aufgrund der Eigenschaften von Tc-99 m als ein Radionuklid zur Darstellung und der Brauchbarkeit von spezifisch bindenden kleinen synthetischen Peptiden als Radiotracer-Molekülen.
Radiomarkierte Peptide sind im Stand der Technik beschrieben worden.
Ege et al., US-Patent Nr. 4,832,940 lehren radiomarkierte Peptide zur Darstellung lokalisierter T-Lymphozyten.
Olexa et al., 1982, europäische Patentanmeldung Nr. 823017009 offenbaren ein pharmazeutisch akzeptables radiomarkiertes Peptid, ausgewählt aus Fragment E&sub1;, isoliert aus quervernetztem Fibrin, Fragment E&sub2;, isoliert aus quervernetztem Fibrin, und Peptiden mit einer Aminosäuresequenz zwischen der der Fragmente E&sub1; und E&sub2;.
Ranby et al., 1988, WO89/00051 (PCT/US88/02276) offenbaren ein Verfahren zur Bestimmung von Fibrinablagerungen in einem Tier, umfassend das kovalente Binden einer radioaktiv markierten Verbindung an Fibrin.
Hadley et al., 1988, WO89/02752 (PCT/US88/03318) offenbaren ein Verfahren zur Bestimmung eines Fibrin-Blutplättchen Gerinnsels in vivo, umfassend die Schritte (a) Verabreichen eines markierten attenuierten thrombolytischen Proteins an einen Patienten, wobei die Markierung selektiv an einem anderen Teil des thrombolytischen Proteins als der Fibrin-Bindedomäne angebracht ist, und (b) Bestimmen des Verteilungsmusters des markierten thrombolytischen Proteins in dem Patienten.
Lees et al., 1989, WO89/10760 (PCT/US89/01854) lehren radiomarkierte Peptide zur Darstellung von Arterien.
Sobel, 1989, WO89/12680 (PCT/US89/02656) offenbart ein Verfahren zur Lokalisierung der Position eines oder mehrerer Blutgerinnsel in einem Tier unter Verwendung von radiomarkiertem, enzymatisch inaktivem Gewebeplasminogenaktivator.
Stuttle, 1990, WO90/15818 (PCT/GB9O/00933) offenbart radioaktiv markierte, 3 bis 10 Aminosäuren enthaltende Peptide, umfassend die Sequenz Arginin-Glycin- Asparaginsäure (RGD), mit der Fähigkeit zu einer Bindung an eine RGD-Stelle in VIVO.
Maraganore et al., 1991, WO91/02750 (PCT/US910/04642) offenbaren einen radiomarkierten Blutgerinnselinhibitor, umfassend (a) eine Inhibitorgruppe, (b) eine Linkergruppe und (c) eine Gruppe für eine Anionenbindungsstelle.
Rodwell et al., 1991, WO91/7173 (PCT/US91/03116) offenbaren Konjugate von "molekularen Erkennungseinheiten" mit "Effektordomänen".
Tubis et al., 1968, Int. J. Appl. Rad. Isot. 19: 835-840 beschreiben die Markierung eines Peptids mit Technetium-99 m.
Sundrehagen, 1983, Int. J. Appl. Rad. Isot. 34: 1003 beschreibt die Markierung von Polypeptiden mit Technetium-99 m.
Die Verwendung von Komplexbildnern zur Radiomarkierung von Polypeptiden, und Verfahren zur Markierung von Peptiden und Polypeptiden mit Tc-99 m sind im Stand der Technik bekannt und sind in den ebenfalls anhängigen US-Patenten Nrn. 5,561,220 (07/653,012) und 5,443,815 (07/807,062) offenbart.
Obwohl Tc-99 m zur Radioabbildung optimal ist, wurde seine Chemie nicht so gründlich untersucht wie die Chemie anderer Elemente und aus diesem Grund gibt es keine große Anzahl von Verfahren zur Radiomarkierung mit Technetium. Tc-99 m wird normalerweise als Tc-99 m Pertechnetat (TcO&sub4;&supmin;, Technetium im Oxidationszustand +7) erhalten, üblicherweise aus einem Molybdän-99/Technetium 99 m Generator. Pertechnetat bindet jedoch nicht gut an andere Verbindungen. Um ein Peptid radioaktiv zu markieren, muß Tc-99 m Pertechnetat daher in eine andere Form überführt werden. Da Technetium in wässriger Lösung kein stabiles Ion bildet, muß es in solchen Lösungen in Form eines Koordinationskomplexes gehalten werden, der ausreichend kinetische und thermodynamische Stabilität hat um eine Zersetzung und infolgedessen Überführung von Tc-99 m entweder in unlösliches Technetiumdioxid oder zurück zum Pertechnetat zu verhindern.
Derartige Koordinationskomplexe von Tc-99 m (in den Oxidationszuständen +1 bis +6) sind bekannt. Aufgrund der molekularen Geometrie des Koordinationskomplexes sind jedoch viele dieser Komplexe zur Radiomarkierung ungeeignet. Für den Zweck der Radiomarkierung ist es besonders vorteilhaft, daß der Koordinationskomplex in Form eines Chelat vorliegt, worin alle der das Technetiumion umgebenden Donorgruppen durch einen einzigen Chelatliganden bereitgestellt werden. Dies ermöglicht die kovalente Bindung des als Chelat vorliegenden Tc-99 m an ein Peptid durch einen einzigen Linker zwischen dem Chelatbildner und dem Peptid.
Diese Liganden werden manchmal als bifunktionelle Chelatbildner, mit einem chelatbildenden Teil und einem Linker-Teil, bezeichnet. Derartige Verbindungen sind im Stand der Technik bekannt.
Byrne et al., US-Patent Nr. 4,434,151 beschreiben von Homocystein-Thiolacton abgeleitete bifunktionelle Chelatbildner, die Radionuklide an Verbindungen mit einer terminalen Aminogruppe, die zur Lokalisierung in einem darzustellenden Organ oder Gewebe fähig sind, koppeln können.
Fritzberg, US-Patent Nr. 4,444,690 beschreibt eine Reihe von Technetium- Chelatbildnern auf Basis von 2,3-Bis(mercaptoacetamido)propanoat.
Byrne et al., US-Patent Nr. 4,571,430 beschreiben neue bifunktionelle Homocystein- Thiolacton Chelatbildner zur Komplexierung von Radionukliden, die Radionuklide an Verbindungen mit einer terminalen Aminogruppe, die zur Lokalisierung in einem darzustellenden Organ oder Gewebe fähig sind, koppeln können.
Byrne et al., US-Patent Nr. 4,575,556 beschreiben neue bifunktionelle Homocystein- Thiolacton Chelatbildner zur Komplexierung von Radionukliden, die Radionuklide an Verbindungen mit einer terminalen Aminogruppe, die zur Lokalisierung in einem darzustellenden Organ oder Gewebe fähig sind, koppeln können.
Davison et al. US-Patent Nr. 4,673,562 beschreiben Technetium-Chelatkomplexe von Bisamido-Bisthiol Liganden und Salze davon, die vorwiegend als Mittel zur Überwachung der Nierenfunktion verwendet werden.
Nicolotti et al., US-Patent Nr. 4,861,869 beschreiben bifunktionelle Kopplungsmittel, die zur Bildung von Konjugaten mit biologischen Molekülen wie etwa Antikörpern geeignet sind.
Fritzberg et al., US-Patent Nr. 4,965,392 beschreiben verschiedene S-geschützte Chelatbildner auf Basis von Mercaptoacetylglycylglycin zur Markierung von Proteinen.
Fritzberg et al., europäische Patentanmeldung Nr. 0 188 258 (86100360.6) beschreiben Dithiol-, Diamino-, oder Diamidocarbonsäure- oder aminkomplexe, die zur Herstellung von Technetium-markierten Darstellungs- bzw. Bilderzeugungsmitteln geeignet sind.
Dean et al., 1989, WO89/12625 (PCT/US89/02634) beschreiben bifunktionelle Kopplungsmittel zur Radiomarkierung von Proteinen und Peptiden.
Flanagan et al., europäische Patentanmeldung Nr. 0 403 243 (90306428.5) offenbaren eine Tc-99 m Markierung synthetischer Peptidfragmente über einen Satz von organischen Chelatbildnermolekülen.
Albert et al., PCT Anmeldung Nr. WO 91/01144, offenbaren Radiodarstellung unter Verwendung radiomarkierter Peptide, die mit Wachstumsfaktoren, Hormonen, Interferonen und Cytokinen verwandt sind, und die aus einem spezifischen Erkennungspeptid, das kovalent an eine ein Radionuklid komplexierende Gruppe gebunden ist, bestehen.
Dean, ebenfalls anhängiges US-Patent Nr. 5,561,220 (07/653,012) lehrt Reagenzien und Verfahren zur Herstellung von Peptiden, die eine kovalent an ein spezifisches Bindepeptid gebundene, Tc-99 m komplexierende Gruppe umfassen, zur Radiodarstellung in vivo.
(Es ist zu bemerken, daß bei all diesen Verfahren erwartungsgemäß anionische Komplexe von Technetium im Oxidationszustand +5 gebildet würden).
Baidoo & Lever, 1990, Bioconjugate Chem.: 1: 132-137 beschreiben ein Verfahren zur Markierung von Biomolekülen unter Verwendung einer Bisamin-Bisthiol-Gruppe, die einen kationischen Technetiumkomplex ergibt.
Es ist möglich ein Peptid radioaktiv zu markieren, einfach durch Hinzufügen einer Thiol-enthaltenden Gruppe wie etwa Cystein oder Mercaptoessigsäure. Derartige Verfahren sind im Stand der Technik beschrieben worden.
Schochat et al., US-Patent Nr. 5,061,641 offenbaren eine direkte Radiomarkierung von Proteinen, die mindestens eine "anhängige" Sulfhydrylgruppe umfassen.
Dean et al., US-Patent Nr. 5,443,815 (07/807,062) lehren eine Radiomarkierung von Peptiden über angebrachte Gruppen, welche freie Thiole enthalten.
Goedemans et al., PCT Anmeldung Nr. WO 89/07456 beschreiben eine Radiomarkierung von Proteinen unter Verwendung von zyklischen Thiolverbindungen, insbesondere von 2-Iminothiolan und Derivaten.
Thornback et al., EPC Anmeldung Nr. 90402206.8 beschreiben die Herstellung und Verwendung von radiomarkierten Proteinen oder Peptiden unter Verwendung Thiolenthaltender Verbindungen, insbesondere 2-Iminothiolan.
Stuttle, PCT Anmeldung Nr. WO 90/15818 beschreibt eine Tc-99 m Markierung von RGD-enthaltenden Oligopeptiden.
Es ist nochmals anzumerken, daß in all diesen Fällen die erwartete Tc-99 m markierte Spezies ein anionischer Komplex wäre.
Die Bindung bestimmter Peptide an ihre Zieleinheiten ist gegenüber einer Modifizierung der Ladung des Peptids empfindlich. Es ist daher in manchen Fällen nachteilig, ein Peptid über einen Chelatbildner, der einen geladenen Tc-99 m Komplex bilden wird, mit Tc-99 m radioaktiv zu markieren. In bestimmten Fällen ist es vorteilhaft, einen Chelatbildner zu verwenden, der einen elektrisch neutralen oder ungeladenen Tc-99 m Komplex bilden wird.
Diese Erfindung stellt Chelatbildner für Tc-99 m bereit, die zur Herstellung von Tc- 99 m markierten Peptiden, worin das Tc-99 m als neutraler Chelatkomplex vorliegt, verwendet werden können.
Im Stand der Technik wurden einige Komplexbildner beschrieben, die angeblich neutrale Tc-99 m Komplexe bilden.
Burns et al., 1985, europäische Patentanmeldung 0 163 119 (85104959.3) beschreiben Bisamin-Bisthiol Verbindungen zur Herstellung kleiner neutraler Te-99 m Gehirn-Darstellungsmittel.
Kung et al., 1986, europäische Patentanmeldung 0 200 211 (86105920.2) beschreiben Bisamin-Bisthiol Verbindungen zur Herstellung kleiner neutraler Tc-99 m Darstellungsmittel.
Bergstein et al., 1988, europäische Patentanmeldung 0 279 417 (88102252.9) beschreiben Bisamin-Bisthiol Verbindungen zur Herstellung kleiner neutraler Tc-99 m Gehirn-Darstellungsmittel.
Bryson et al., 1988, Inorg. Chem. 27: 2154-2161 beschreiben neutrale Technetium- 99 Komplexe, die gegenüber einem Überschuß an Ligand instabil sind.
Misra et al., 1989, Tet. Let. 30: 1885-1888 beschreiben Bisamin-Bisthiol Verbindungen für Radiomarkierungszwecke.
Bryson et al., 1990, Inorg. Chem. 29: 2948-2951 beschreiben Chelatbildner, enthaltend zwei Amidgruppen, eine Thiolgruppe und ein substituiertes Pyridin, welche neutrale Tc-99 Komplexe bilden können.
Taylor et al., 1990, J. Nucl. Med. 31: 885 (Abst) beschreiben einen neutralen Tc-99 m Komplex zur Gehirndarstellung.
Fig. 1 zeigt hypercholesterinämische und normale Kaninchen-Aortae, gefärbt mit Sudan IV.
Fig. 2 zeigt hypercholesterinämische und normale Kaninchen-Aortae, dargestellt in vivo mit P215 während 2,5 h.
Fig. 3 zeigt hypercholesterinämische und normale Kaninchen-Aortae, dargestellt ex corpora mit P215.
Fig. 4 zeigt einen Thrombus, dargestellt in vivo in einem Hundebein mit Tc-99 m markiertem P357.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt Reagenzien bereit zur Herstellung szintigraphischer Bilderzeugungsmittel zur Darstellung von Stellen innerhalb eines Säugerkörpers, die radioaktiv markierte Peptide sind. Die erfindungsgemäßen Reagenzien bestehen aus Peptiden, die 3 bis 100 Aminosäuren enthalten, wobei die Peptide in vivo spezifisch an ein Ziel binden und kovalent an eine von Radiomarkierung freie Radiomarkierungs-bindende Gruppe gebunden sind, wobei die Gruppe zur Bildung eines Komplexes mit einem Radioisotop fähig ist. Ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß ein Komplex aus der Radiomarkierungsbindenden Gruppe und der Radiomarkierung elektrisch neutral ist, wodurch eine Beeinflussung der spezifischen Bindeeigenschaften des spezifischen Bindepeptids durch den kovalent gebundenen radiomarkierten Komplex vermieden wird.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das Peptid über eine Aminosäure, am meisten bevorzugt Glycin, kovalent an die Radiomarkierungs-bindende Gruppe gebunden. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist die Radiomarkierung Technetium-99 m.
Die Erfindung umfaßt Reagenzien zur Herstellung szintigraphischer Bilderzeugungsmittel zur Darstellung von Stellen innerhalb eines Säugerkörpers, umfassend ein spezifisches Bindepeptid und eine von Radiomarkierung freie Radiomarkierungs-bindende Gruppe nach der Formel:
[für diese Erfindung werden Radiomarkierungs-bindende Gruppen mit dieser Struktur als Gruppen auf Basis von Picolinsäure (Pic) bezeichnet]
oder
[für diese Erfindung werden Radiomarkierungs-bindende Gruppen mit dieser Struktur als Gruppen auf Basis von Picolylamin (Pica) bezeichnet],
worin X H oder eine Schutzgruppe ist, (Aminosäure) eine beliebige Aminosäure ist, die Radiomarkierungs-bindende Gruppe kovalent an das Peptid gebunden ist und zur Bildung eines elektrisch neutralen Komplexes mit einem Radioisotop fähig ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Aminosäure Glycin und X ist eine Acetamidomethyl-Schutzgruppe. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist das Peptid über eine Aminosäure, am meisten bevorzugt Glycin kovalent an die Radiomarkierungs-bindende Gruppe gebunden, und die Radiomarkierung ist Technetium-99 m.
In einer nochmals weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Reagenz bereitgestellt zur Herstellung eines szintigraphischen Bilderzeugungsmittels zur Darstellung von Stellen innerhalb eines Säugerkörpers, umfassend ein spezifisches Bindepeptid mit einer 3 bis 100 Aminosäuren umfassenden Aminosäuresequenz, und eine von Radiomarkierung freie Radiomarkierungs-bindende Bisamino-Bisthiol Gruppe, die kovalent an das Peptid gebunden ist, wobei die Radiomarkierungsbindende Gruppe zur Bildung eines elektrisch neutralen Komplexes mit einem Radioisotop fähig ist. Die Radiomarkierungs-bindende Bisamino-Bisthiol Gruppe in dieser Ausführungsform der Erfindung hat eine Formel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
worin R jeweils unabhängig voneinander H, CH&sub3; oder C&sub2;H&sub5; sein kann, (pgp)S jeweils unabhängig voneinander eine Thiol-Schutzgruppe oder H sein kann; m, n und p unabhängig voneinander 2 oder 3 sind; A lineares oder zyklisches niederes Alkyl, Aryl, Heterocyclyl, Kombinationen oder substituierte Derivate davon ist; und X Peptid ist,
worin R jeweils unabhängig voneinander H, CH&sub3; oder C&sub2;H&sub5; ist; m, n und p unabhängig voneinander 2 oder 3 sind; A lineares oder zyklisches niederes Alkyl, Aryl, Heterocyclyl, Kombinationen oder substituierte Derivate davon ist; V H oder CO-Peptid ist; R' H oder Peptid ist, mit der Maßgabe, daß wenn V H ist, R' Peptid ist, und wenn R' H ist, V CO-Peptid ist [In dieser Erfindung werden Radiomarkierungsbindende Gruppen mit diesen Strukturen als "BAT"-Gruppen bezeichnet]. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Peptid über eine Aminosäure, am meisten bevorzugt Glycin, kovalent an die Radiomarkierungs-bindende Gruppe gebunden, und die Radiomarkierung ist Technetium-99 m.
In den vorstehend genannten Ausführungsformen dieser Erfindung ist die spezifische Bindeverbindung ein Peptid, bestehend aus zwischen 3 und 100 Aminosäuren. Die am meisten bevorzugte Ausführungsform der Radiomarkierung ist Technetium-99 m.
Spezifische Bindepeptide, die bei der Erfindung geeignet sind, umfassen sind aber nicht beschränkt auf Peptide mit den nachfolgenden Sequenzen:
Formyl-MLF
(VGVAPG)&sub3;amid
(VPGVG)&sub4;amid
RALVDTLKFVTQAEGAKamid
RALVDTEFKVKQEAGAKamid
PLARITLPDFRLPEIAIPamid
GQQHHLGGAKAGDV
PLYKKIIKKLLES
LRALVDTLKamid
GGGLRALVDTLKamid
GGGLRALVDTLKFVTQAEGAKamid
GGGRALVDTLKALVDTLamid
GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGGGYR
PSPSPIHPAHHKRDRRQamid
GGGFD.Cpa.YWDKTFTamid
[SYNRGDSTC]&sub3;-TSEA
GGGLRALVDTLKamid
GCGGGLRALVDTLKamid
GCYRALVDTLKFVTQAEGAKamid
GC(VGVAPG)&sub3;amid
Es können erfindungsgemäße Reagenzien gebildet werden, bei denen die spezifischen Bindeverbindungen oder die Radiomarkierungs-bindenden Gruppen kovalent an eine mehrwertige Linkergruppe gebunden sind. Erfindungsgemäße mehrwertige Linkergruppen bestehen aus mindestens 2 identischen Linkerfunktionellen Gruppen, die zu einer kovalenten Bindung an spezifische Bindeverbindungen oder Radiomarkierungs-bindende Gruppen fähig sind. Bevorzugte Linker-funktionelle Gruppen sind primäre oder sekundäre Amine, Hydroxylgruppen, Carbonsäuregruppen oder Thiol-reaktive Gruppen. In bevorzugten Ausführungsformen bestehen die mehrwertigen Linkergruppen aus Bissuccinimidylmethylether (BSME), 4-(2,2-Dimethylacetyl)benzoesäure (DMAB), Tris(succinimidylethyl)amin (TSEA) und N-[2-(N',N'-bis(2- succinimidoethyl)aminoethyl)]-N&sup6;,N&sup9;-bis(2-methyl-2-mercaptopropyl)-6,9- diazanonanamid (BAT-BS).
Die Erfindung umfaßt auch Komplexe der erfindungsgemäßen Reagenzien mit Tc- 99 m und Verfahren zur Radiomarkierung der erfindungsgemäßen Reagenzien mit Tc-99 m. Radiomarkierte Komplexe, die durch die Erfindung bereitgestellt werden, werden gebildet durch Umsetzen der erfindungsgemäßen Reagenzien mit Tc-99 m in der Gegenwart eines Reduktionsmittels. Bevorzugte Reduktionsmittel umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Dithionit-Ion, Zinn(II)ion und Eisen(II)ion. Erfindungsgemäße Komplexe werden auch gebildet durch Markieren der erfindungsgemäßen Reagenzien mit Tc-99 m durch Ligandenaustausch mit einem zuvor reduzierten Tc-99 m Komplex, wie hierin bereitgestellt.
Die Erfindung stellt auch Kits zur Herstellung der erfindungsgemäßen, mit Tc-99 m radiomarkierten Komplexe bereit. Kits zur Markierung der erfindungsgemäßen Reagenzien mit Tc-99 m umfassen ein geschlossenes Gefäß, welches eine vorbestimmte Menge eines erfindungsgemäßen Reagenzes enthält, und eine ausreichende Menge Reduktionsmittel, um das Peptid mit Tc-99 m zu markieren.
Diese Erfindung stellt Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Reagenzien bereit, wobei ein Peptid durch chemische Synthese in vitro hergestellt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Peptid durch Festphasen-Peptidsynthese hergestellt.
Diese Erfindung stellt Verfahren unter Verwendung Tc-99 m markierter Peptide zur Darstellung einer Stelle innerhalb eines Säugerkörpers, indem gammaszintigraphische Abbildungen in vivo erhalten werden, bereit. Diese Verfahren umfassen das Verabreichen einer wirksamen diagnostischen Menge eines erfindungsgemäßen Tc-99 m radiomarkierten Reagenzes und das Nachweisen der durch das Tc-99 m, das an der Stelle innerhalb des Säugerkörpers lokalisiert ist, emittierten gamma-Strahlung.
Stoffzusammensetzungen, umfassend Radiomarkierungs-bindende Gruppen, die mit einem Radioisotop einen elektrisch neutralen Komplex bilden, werden von der Erfindung ebenfalls bereitgestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Radioisotop Tc-99 m. Weitere bevorzugte Ausführungsformen umfassen hierin beschriebene Bisamin-Bisthiol Derivate und Picolinsäure- und Picolylamin-Derivate.
Eine bevorzugte Ausführungsform ist eine Stoffzusammensetzung, umfassend
(i) eine Radiomarkierungs-bindende Gruppe der Formel
oder
worin X = H oder eine Schutzgruppe,
(Aminosäure) = eine beliebige Aminosäure, und
wobei die Radiomarkierungs-bindende Gruppe zur Bildung eines Komplexes mit einem Radioisotop fähig ist, und der Komplex aus der Radiomarkierungsbindenden Gruppe und dem Radioisotop elektrisch neutral ist, oder
(ii) eine Radiomarkierungs-bindende Bisamino-Bisthiol Gruppe mit einer Formel, ausgewählt aus:
worin R jeweils unabhängig voneinander H, CH&sub3; oder C&sub2;H&sub5; ist, aber wenn X = H, ein R = Y,
(pgp)N = eine Amin-Schutzgruppe oder H,
(pgp)S jeweils unabhängig voneinander eine Thiol-Schutzgruppe oder H ist,
m, n und p unabhängig voneinander 2 oder 3 sind,
X = H oder -A-COOH, aber wenn X = H, ein R = Y und (pgp)N ist nicht H,
Y = -A-COOH,
A = lineares oder zyklisches niederes Alkyl, Aryl, Heterocyclyl, Kombinationen oder substituierte Derivate davon,
worin R jeweils unabhängig voneinander H, CH&sub3; oder C&sub2;H&sub5; ist, aber wenn Z = H, ein R = Y,
(pgp)N jeweils eine Amin-Schutzgruppe oder H ist,
(pgp)S jeweils unabhängig voneinander eine Thiol-Schutzgruppe oder H ist,
m, n und p unabhängig voneinander 2 oder 3 sind,
Z = H oder -A-CH(V)NH(pgp)&sub2;N, aber wenn Z = H, ein R = Y,
Y = -A-CH(V)NH(pgp)&sub2;N,
A = lineares oder zyklisches niederes Alkyl, Aryl, Heterocyclyl, Kombinationen oder substituierte Derivate davon,
V = H oder COOH,
und worin, wenn (pgp)N und V H sind, (pgp)S nicht H ist, und wenn (pgp)S und V H sind, (pgp)N nicht H ist, und wenn V H ist, (pgp)&sub1;N nicht H ist,
und
worin R jeweils unabhängig voneinander H, CH&sub3; oder C&sub2;H&sub5; ist und ein R = (pgp)N jeweils eine Amin-Schutzgruppe oder H ist,
(pgp)S jeweils unabhängig voneinander eine Thiol-Schutzgruppe oder H ist,
m, n und p unabhängig voneinander 2 oder 3 sind,
Y = -A-CH(V)NH(pgp)&sub2;N,
A = lineares oder zyklisches niederes Alkyl, Aryl, Heterocyclyl, Kombinationen oder substituierte Derivate davon,
V = H oder COOH,
und worin, wenn (pgp)&sub2;N und V H sind, (pgp)S nicht H ist, und wenn (pgp)S und V H sind, (pgp)&sub2;N nicht H ist, und mindestens eine (pgp)&sub1;N Gruppe nicht H ist, wobei die Radiomarkierungs-bindende Gruppe zur Bildung eines Komplexes mit einem Radioisotop fähig ist, und der Komplex aus der Radiomarkierungsbindenden Gruppe und dem Radioisotop elektrisch neutral ist.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist eine Stoffzusammensetzung, umfassend
(i) eine Radiomarkierungs-bindende Gruppe der Formel
oder
worin X = H oder eine Schutzgruppe,
(Aminosäure) = eine beliebige Aminosäure, und
wobei die Radiomarkierungs-bindende Gruppe einen Komplex mit einem Radioisotop bildet, und der Komplex aus der Radiomarkierungs-bindenden Gruppe und dem Radioisotop elektrisch neutral ist, oder
(ii) eine Radiomarkierungs-bindende Bisamino-Bisthiol Gruppe mit einer Formel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
worin R jeweils unabhängig voneinander H, CH&sub3; oder C&sub2;H&sub5; ist, aber wenn X = H, ein R = Y,
(pgp)N = eine Amin-Schutzgruppe oder H,
(pgp)S jeweils unabhängig voneinander eine Thiol-Schutzgruppe oder H ist,
m, n und p unabhängig voneinander 2 oder 3 sind,
X = H oder -A-COOH, aber wenn X = H, ein R = Y und (pgp)N ist nicht H,
Y = -A-COOH,
A = lineares oder zyklisches niederes Alkyl, Aryl, Heterocyclyl, Kombinationen oder substituierte Derivate davon,
worin R jeweils unabhängig voneinander H, CH&sub3; oder C&sub2;H&sub5; ist, aber wenn Z = H, ein R = Y,
(pgp)N jeweils eine Amin-Schutzgruppe oder H ist,
(pgp)S jeweils unabhängig voneinander eine Thiol-Schutzgruppe oder H ist,
m, n und p unabhängig voneinander 2 oder 3 sind,
Z = H oder -A-CH(V)NH(pgp)&sub2;N, aber wenn Z = H, ein R = Y,
Y = -A-CH(V)NH(pgp)&sub2;N,
A = lineares oder zyklisches niederes Alkyl, Aryl, Heterocyclyl, Kombinationen oder substituierte Derivate davon,
V = H oder COOH,
und worin, wenn (pgp)N und V H sind, (pgp)S nicht H ist, und wenn (pgp)S und V H sind, (pgp)N nicht H ist, und wenn V H ist, (pgp)&sub1;N nicht H ist, und
worin R jeweils unabhängig voneinander H, CH&sub3; oder C&sub2;H&sub5; ist und ein R = Y, (pgp)N jeweils eine Amin-Schutzgruppe oder H ist,
(pgp)S jeweils unabhängig voneinander eine Thiol-Schutzgruppe oder H ist,
m, n und p unabhängig voneinander 2 oder 3 sind,
Y = -A-CH(V)NH(pgp)&sub2;N,
A = lineares oder zyklisches niederes Alkyl, Aryl, Heterocyclyl, Kombinationen oder substituierte Derivate davon,
V = H oder COOH,
und worin, wenn (pgp)&sub2;N und V H sind, (pgp)S nicht H ist, und wenn (pgp)S und V H sind, (pgp)&sub2;N nicht H ist, und mindestens eine (pgp)&sub1;N Gruppe nicht H ist, wobei die Radiomarkierungs-bindende Gruppe einen Komplex mit einem Radioisotop bildet, und der Komplex aus der Radiomarkierungs-bindenden Gruppe und dem Radioisotop elektrisch neutral ist.
Spezifische bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden ausführlicheren Beschreibung bestimmter bevorzugter Ausführungsformen und den Ansprüchen ersichtlich werden.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt Tc-99 m markierte Peptide bereit, zur Darstellung von Zielstellen innerhalb eines Säugerkörpers, umfassend eine kovalent an eine Radiomarkierungs-bindende Gruppe gebundene Aminosäure-Sequenz, wobei die Radiomarkierungs-bindende Gruppe ein Radioisotop bindet und einen elektrisch neutralen Komplex bildet. Insbesondere stellt die Erfindung ein Reagens zur Herstellung eines szintigraphischen Bilderzeugungsmittels zur Darstellung von Stellen innerhalb eines Säugerkörpers bereit, umfassend ein spezifisches Bindepeptid mit einer 3 bis 100 Aminosäuren umfassenden Aminosäuresequenz, und eine kovalent daran gebundene, von Radiomarkierung freie Radiomarkierungs bindende Gruppe, wobei die Radiomarkierungs-bindende Gruppe zur Bildung eines elektrisch neutralen Komplexes mit einem Radioisotop fähig ist.
Eine Markierung mit Tc-99 m ist ein Vorteil von bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, da die nuklearen und radioaktiven Eigenschaften dieses Isotops es zu einem idealen szintigraphischen Bilderzeugungsmittel machen. Dieses Isotop hat eine Einzelphotonenenergie von 140 keV und eine radioaktive Halbwertszeit von etwa 6 Stunden, und es ist aus einem &sup9;&sup9;Mo-99mTc Generator leicht erhältlich. Andere im Stand der Technik bekannte Radionuklide haben beträchtlich längere effektive Halbwertszeiten (beispielsweise ¹¹¹In, das eine Halbwertszeit von 67,4 h hat) oder sind toxisch (beispielsweise ¹²&sup5;I).
In den durch die Erfindung bereitgestellten Radiomarkierungs-bindenden Gruppen und an derartige Gruppen kovalent gebundenen Peptiden, die ein kovalent an eine Thiol-Schutzgruppe [(pgp)S] gebundenes Thiol-enthalten, können die Thiol- Schutzgruppen gleich oder verschieden sein und können sein, sind aber nicht beschränkt auf:
-CH&sub2; Aryl(Aryl ist Phenyl oder Alkyl- oder Alkoxy-substituiertes Phenyl),
-CH-(Aryl)&sub2;(Aryl ist Phenyl oder Alkyl- oder Alkoxy-substituiertes Phenyl),
-C-(Aryl)&sub3;(Aryl ist Phenyl oder Alkyl- oder Alkoxy-substituiertes Phenyl),
-CH&sub2;-(4-Methoxyphenyl),
-CH-(4-Pyridyl)(phenyl)&sub2;,
-C(CH&sub3;)&sub3;,
-9-Phenylfluorenyl,
-CH&sub2;NHCOR (R ist unsubstituiertes oder substituiertes Alkyl oder Aryl),
-CH&sub2;-NHCOOR (R ist unsubstituiertes oder substituiertes Alkyl oder Aryl),
-CONHR (R ist unsubstituiertes oder substituiertes Alkyl oder Aryl),
-CH&sub2;-S-CH&sub2; Phenyl.
Bevorzugte Schutzgruppen haben die Formel -CH&sub2;-NHCOR, worin R ein Niederalkyl mit zwischen 1 und 8 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder mit Niederalkyl, Hydroxyl, Niederalkoxy, Carboxy oder Niederalkoxycarbonyl substituiertes Phenyl ist. Die am meisten bevorzugte Schutzgruppe ist eine Acetamidomethyl-Gruppe.
Jede Ausführungsform der Erfindung, die ein spezifisches Bindepeptid enthält, umfaßt eine Aminosäuresequenz. Der Begriff Aminosäure, wie in dieser Erfindung verwendet, soll alle natürlich vorkommenden und anderen L- und D-Aminosäuren umfassen.
Die Peptide können in vitro chemisch synthetisiert werden. Die Peptide können im allgemeinen vorteilhaft mittels eines Aminosäure-Synthesizers hergestellt werden. Unter Verwendung von Techniken, die dem Fachmann gut bekannt sind, können erfindungsgemäße Peptide synthetisiert werden, wobei die Radiomarkierungsbindende Gruppe während einer chemischen Synthese in vitro kovalent an das Peptid gebunden werden. Derartige, während der Synthese kovalent an die Radiomarkierungs-bindende Gruppe gebundene Peptide sind vorteilhaft, da spezifische Stellen für die kovalente Bindung bestimmt werden können.
Erfindungsgemäße Radiomarkierungs-bindende Gruppen können während der Peptidsynthese in das spezifische Zielpeptid eingeführt werden. Für Ausführungsformen, die Picolinsäure (Pic-) [z. B. Pic-Gly-Cys(Schutzgruppe)-] umfassen, kann die Radiomarkierungs-bindende Gruppe als der letzte (d. h. Aminoterminale) Rest während der Synthese synthetisiert werden. Zusätzlich kann die Picolinsäure-enthaltende Radiomarkierungs-bindende Gruppe kovalent mit der &epsi;- Amingruppe von Lysin verbunden werden, wobei beispielsweise αN(Fmoc)-Lys-&epsi;N- [Pic-Gly-Cys(Schutzgruppe)] erhalten wird, das an beliebiger Stelle in die Peptidkette eingebaut werden kann. Diese Abfolge ist besonders vorteilhaft, da sie eine einfache Art des Einbaus in das Ziel-Bindepeptid liefert.
In ähnlicher Weise kann die Picolylamin (Pica) -enthaltende Radiomarkierungsbindende Gruppe [-Cys-(Schutzgruppe)-Gly-Pica] während der Peptidsynthese hergestellt werden durch Aufnahme der Sequenz [-Cys-(Schutzgruppe)-Gly-] am Carboxy-Terminus der Peptidkette. Nach der Abspaltung des Peptids vom Harz wird der Carboxy-Terminus des Peptids aktiviert und an Picolylamin gekoppelt. Dieser Syntheseweg erfordert, daß reaktive Funktionalitäten in den Seitenketten maskiert (geschützt) bleiben und während der Konjugation des Picolylamins nicht reagieren.
Beispiele von kleinen synthetischen Peptiden, die Pic-Gly-Cys- und -Cys-Gly-Pica Chelatoren enthalten, sind in den Beispielen hierin nachstehend angegeben. Diese Erfindung sorgt für den Einbau dieser Chelatoren in nahezu jedes Peptid, was zu einem radiomarkierten Peptid führt, worin Tc-99 m als neutraler Komplex vorliegt.
Diese Erfindung stellt auch spezifisch bindende kleine synthetische, Bisamin-Bisthiol (BAT) Chelatoren beinhaltende Peptide bereit, die mit Tc-99 m markiert werden können, was zu einem radiomarkierten Peptid führt, worin Tc-99 m als neutraler Komplex vorliegt. Beispiele von kleinen synthetischen Peptiden, die diese BAT- Chelatoren als Radiomarkierungs-bindende Gruppe enthalten, sind in den Beispielen hierin nachstehend angegeben.
Bei der Bildung eines Komplexes aus radioaktivem Technetium mit den erfindungsgemäßen Reagenzien wird der Technetium-Komplex, bevorzugt ein Salz von Tc-99 m Pertechnetat, in der Gegenwart eines Reduktionsmittels mit den erfindungsgemäßen Peptiden umgesetzt. Bevorzugte Reduktionsmittel sind Dithionit-, Zinn(II)- und Eisen(II)ionen, das am meisten bevorzugte Reduktionsmittel ist Zinn(II)chlorid. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Reduktionsmittel ein Festphasen-Reduktionsmittel. Komplexe und Mittel zur Herstellung derartiger Komplexe werden günstig in Form eines Kits bereitgestellt, umfassend ein geschlossenes Gefäß, welches eine vorbestimmte Menge eines erfindungsgemäßen, zu markierenden Peptids enthält, und eine ausreichende Menge Reduktionsmittel, um das Peptid mit Tc-99 m zu markieren. Alternativ kann der Komplex gebildet werden durch Umsetzen eines erfindungsgemäßen Peptids mit einem vorgebildeten labilen Komplex aus Technetium und einer anderen, als Transfer-Ligand bezeichneten Verbindung. Dieses Verfahren ist als Ligandenaustausch bekannt und dem Fachmann gut bekannt. Der labile Komplex kann unter Verwendung solcher Transferliganden wie beispielsweise Tartrat, Citrat, Gluconat oder Mannitol gebildet werden. Zu den bei der vorliegenden Erfindung geeigneten Tc-99 m Pertechnat-Salzen gehören die Alkalimetallsalze wie etwa das Natriumsalz, oder Ammoniumsalze oder Niederalkylammoniumsalze.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Kit zur Herstellung Technetium-markierter Peptide bereitgestellt. Die in der Erfindung geeigneten Peptide können unter Verwendung von Verfahren und Mitteln, die dem Fachmann gut bekannt sind und nachstehend hierin beschrieben werden, chemisch synthetisiert werden. Derart hergestellte Peptide umfassen zwischen 3 und 100 Aminosäurereste und sind kovalent an eine Radiomarkierungs-bindende Gruppe gebunden, wobei die Radiomarkierungs-bindende Gruppe ein Radioisotop bindet. Eine geeignete Menge des Peptids wird in ein Gefäß eingebracht, das ein Reduktionsmittel wie etwa Zinn(11)chlorid oder ein Festphasen-Reduktionsmittel enthält, in einer ausreichenden Menge um das Peptid mit Tc-99 m zu markieren. Es kann auch eine geeignete Menge eines Transferliganden wie beschrieben (wie etwa Tartrat, Citrat, Gluconat oder Mannitol) aufgenommen werden. Technetium-markierte Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung können durch die Zugabe einer geeigneten Menge von Tc-99 m oder Tc-99 m Komplex zu den Gefäßen und Umsetzung unter Bedingungen wie in Beispiel 3 hierin nachstehend beschrieben, hergestellt werden.
Durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte radioaktiv markierte Peptide werden mit einem geeigneten Radioaktivitätsgehalt bereitgestellt. Bei der Bildung radioaktiver Tc-99 m Komplexe ist es im allgemeinen bevorzugt, radioaktive Komplexe in Lösungen zu bilden, die Radioaktivität in Konzentrationen von etwa 0,01 Millicurie (mCi) bis 100 mCi pro ml enthalten.
Technetium-markierte Peptide, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, können zur Visualisierung von Stellen in einem Säugerkörper verwendet werden. Gemäß dieser Erfindung werden die Technetium-markierten Peptide oder neutralen Komplexe davon in einer injizierbaren Einzeldosis verabreicht. Jeder der üblichen, dem Fachmann bekannten Träger, wie etwa sterile Salzlösung oder Plasma, können nach der Radiomarkierung verwendet werden, um die injizierbare Lösung zur diagnostischen Darstellung verschiedener Organe, Tumore und dergleichen gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen. Im allgemeinen hat die zu verabreichende Einzeldosis eine Radioaktivität von etwa 0,01 mCi bis etwa 100 mCi, bevorzugt 1 mCi bis 20 mCi. Die für eine Einzeldosis zu injizierende Lösung hat ein Volumen von etwa 0,01 ml bis etwa 10 ml. Nach intravenöser Verabreichung kann die Darstellung des Organs oder Tumors in vivo innerhalb weniger Minuten stattfinden. Falls gewünscht kann das Darstellen jedoch nach Stunden oder sogar länger, nachdem das radiomarkierte Peptid dem Patienten injiziert worden ist, stattfinden. In den meisten Fällen wird sich eine ausreichende Menge der verabreichten Dosis innerhalb etwa 0,1 Stunden in dem dazustellenden Bereich anreichern, um die Aufnahme von Szintigraphien zu gestatten. Jedes herkömmliche szintigraphische Darstellungsverfahren für diagnostische Zwecke kann mit dieser Erfindung verwendet werden.
Die Technetium-markierten Peptide und Komplexe, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, können intravenös in jedem herkömmlichen Medium für intravenöse Injektion, wie etwa wässriges Salzmedium, oder in Blutplasmamedium, verabreicht werden. Ein solches Medium kann auch herkömmliche pharmazeutische Hilfsstoffe enthalten, wie beispielsweise pharmazeutisch akzeptable Salze um den osmotischen Druck einzustellen, Puffer, Konservierungsstoffe und dergleichen. Zu den bevorzugten Medien gehören physiologische Kochsalzlösung und Plasma.
Die Verfahren zur Herstellung und Markierung dieser Verbindungen werden in den nachfolgenden Beispielen ausführlicher erläutert. Diese Beispiele erläutern bestimmte Aspekte des vorstehend beschriebenen Verfahrens und vorteilhafte Ergebnisse. Diese Beispiele werden als Erläuterung und keinesfalls als Einschränkung gezeigt.

BEISPIEL 1

Synthese von BAT-Chelatoren

A. Synthese von N-Boc-N'-(5-carboxypentyl)-N,N'-bis(2-methyl-2- triphenylmethylthiopropyl)ethylendiamin

a. 2-Methyl-2-(triphenylmethylthio)propanal

Triphenylmethylmercaptan (362,94 g, 1,31 Mol, 100 Mol-%), aufgelöst in wasserfreiem THF (2 l) wurde unter Argon in einem Eisbad gekühlt. Natriumhydrid (60% in Öl, 54,39 g, 1,35 Mol, 104 Mol-%) wurde über 20 min in Teilmengen zugegeben. Danach wurde 2-Brom-2-methylpropanal (206,06 g, 1,36 Mol, 104 Mol- %; siehe Stevens & Gillis, 1957, J. Amer. Chem. Soc. 79: 3448-51) langsam über 20 min zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und 12 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde mit Wasser (1 l) gequencht und mit Diethylether (3 · 1 l) extrahiert. Die Etherextrakte wurden kombiniert, mit gesättigter NaCl-Lösung (500 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel wurde unter Unterdruck entfernt, wobei ein dickes orangefarbenes Öl erhalten wurde. Das rohe Öl wurde in Toluol (200 ml) gelöst und mit heißen Hexanen auf 2 l verdünnt. Das Gemisch wurde durch eine Glasfilternutsche filtriert und 12 Stunden bei -5ºC gekühlt. Der weiße kristalline Feststoff, der sich gebildet hatte, wurde durch Filtration entfernt, wobei 266,36 g (59 % Ausbeute) der Titelverbindung erhalten wurden. Der Schmelzpunkt der entstandenen Verbindung wurde zu 83-85ºC bestimmt. Magnetische Kernresonanz- Experimente zur Charakterisierung ergaben die folgenden molekularen Kennzeichen:
¹H NMR (300 MHz, CDCl&sub3;): δ 1.24 (s, 6H, 2CH&sub3;), 7.2-7.35 (m, 9H), 7.59-7.62 (m, 6H), 8.69 (s, H, -COH)
¹³C NMR (75 MHz, CDCl&sub3;): δ 22.86, 55.66, 67.48, 126.85, 127.75, 129.72, 144.79, 197.31.

b. N,N'-bis(2-methyl-2-triphenylmethylthiopropyl)ethylendiamin

Ethylendiamin (1,3 ml, 0,0194 Mol, 100 Mol-%) wurde zu 2-Methyl-2- (triphenylmethylthio)propanal (13,86 g, 0,0401 Mol, 206 Mol-%), aufgelöst in Methanol (40 ml) und wasserfreiem THF (40 ml) unter Argon zugegeben, und der pH-Wert wurde durch Zutropfen von Essigsäure auf pH 6 eingestellt. Die Lösung wurde 20 min bei 20ºC gerührt. Natriumcyanborhydrid (1,22 g, 0,0194 Mol, 100 Mol- %) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Zusätzliches Natriumcyanborhydrid (1,08 g) wurde zugegeben und die Reaktion wurde 17 Stunden bei 20ºC gerührt. Eine letzte Teilmenge Natriumcyanborhydrid (1,02 g) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch unter Argon 6 Stunden unter Rückfluß erwärmt. Die Reaktion wurde mit 0,5 M HCl (100 ml) gequencht und mit Ethylacetat (2 · 100 ml) extrahiert. Die organischen Extrakte wurden kombiniert, nacheinander mit 2 M NaOH (60 ml), gesättigter NaCl-Lösung (60 ml) gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und filtriert. Das Lösungsmittel wurde unter Unterdruck entfernt, wobei 16,67 g Rohprodukt erhalten wurden, das aus Toluol/Hexanen kristallisiert wurde, wobei 10,20 g (73% Ausbeute) weiße Kristalle der Titelverbindung erhalten wurden. Der Schmelzpunkt der entstandenen Verbindung wurde zu 83-86ºC bestimmt. FABMS-Analyse ergab ein m/z von 721 (MH+). Magnetische Kernresonanz-Experimente zur Charakterisierung ergaben die folgenden molekularen Kennzeichen:
¹H NMR (300 MHz, CDCl&sub3;): δ 1.12 (s, 12H, 4CH&sub3;), 1.64 (s, 4H, N-CH&sub2;C(Me)&sub2;-S), 2.52 (s, 4H, N-CH&sub2;-CH&sub2;-N), 5.31 (s, 2H, 2-NH), 7.12-7.30 (m, 18H, Ar), 7.62-7.65 (m, 12H, Ar).

c. N-(5-carboethoxypentyl)-N,N'-bis(2-methyl-2- triphenylmethylthiopropyl)ethylendiamin

K&sub2;CO&sub3; (1,92 g, 13,9 mMol, 100 Mol-%) wurde zu N,N'-bis(2-methyl-2- triphenylmethylthiopropyl)ethylendiamin (10,03 g, 13,9 mMol) in CH&sub3;CN (60 ml) zugegeben, gefolgt von Ethyl-5-bromvalerat (3,30 ml, 20,8 mMol, 150 Mol-%). Die Reaktion wurde unter Argon über Nacht unter Rückfluß erwärmt. Die Lösung wurde danach zu einer Paste eingeengt und zwischen 0,25 M KOH (100 ml) und Ethylacetat (100 ml) verteilt. Die wässrige Phase wurde mit Ethylacetat (1 · 50 ml) extrahiert und die kombinierten Ethylacetat-Phasen wurden mit 50 ml Wasser und NaCl-Lösung (2 · 50 ml) gewaschen, mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zu einem orangefarbenen Öl eingeengt. Reinigung mittels Flash-Chromatographie (300 g Flash-Siliziumoxid, 100% CHCl&sub3; bis 5% MeOH/CHCl&sub3;) ergab reine Titelverbindung (7,75 g, 66% Ausbeute). FABMS-Analyse ergab ein (MH+) von 849 (im Vergleich zu einem berechneten Molekulargewicht von 849,24 für die Verbindung C&sub5;&sub5;H&sub6;&sub4;N&sub2;O&sub2;S&sub2;).

d. N-Boc-N'-(5-carboxypentyl)-N,N'-bis(2-methyl-2- triphenylmethylthiopropyl)ethylendiamin

Zu N-(5-carboethoxypentyl)-N,N'-bis(2-methyl-2-triphenylmethylthiopropyl)- ethylendiamin (7,75 g, 9,13 mMol) in Dioxan (200 ml) wurde 1 M KOH (25 ml, 25,0 mMol, 274 Mol-%) zugegeben, gefolgt von Wasser (250 ml). Danach wurde unter Rühren Dioxan zugetropft, bis eine homogene Lösung erhalten wurde. Die Reaktion wurde über Nacht unter leichtem Rückfluß erwärmt. Der Großteil des Dioxans wurde durch Rotationsverdampfen entfernt und der pH-Wert der Lösung wurde mit 1 M KH&sub2;PO&sub4; und gesättigter NaHCO&sub3; auf ~7-8 eingestellt. Die Lösung wurde danach mit Ethylacetat (3 · 75 ml) extrahiert, und die kombinierten organischen Phasen wurden mit NaCl-Lösung (50 ml) gewaschen, mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zu einem Schaum/Feststoff (6,35 g, 85% Ausbeute) eingeengt.
Zu dem Rohprodukt aus der obigen Reaktion wurden (BOC)&sub2;O (3,35 g, 15,4 mMol, 200 Mol-%), CH&sub3;CN (50 ml) und Methylenchlorid (50 ml), gefolgt von Triethylamin (1,0 ml, 7,2 mMol, 93 Mol-%) zugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur unter Argon über Nacht gerührt. Die Reaktionslösung wurde danach eingeengt und zwischen Wasser (100 ml) und Ethylacetat (50 ml) verteilt. Die wässrige Phase wurde mit Ethylacetat (1 · 50 ml) extrahiert und die kombinierten Ethylacetat-Phasen wurden mit 5% Zitronensäure und NaCl-Lösung (jeweils 50 ml) gewaschen, danach getrocknet(Na&sub2;SO&sub4;) und zu einem orangefarbenen Öl eingeengt. Reinigung mittels Flash-Chromatographie (200 g Flash-Siliziumoxid, 100% CDCl&sub3; bis 5% Methanol/Chloroform) ergab reine Titelverbindung (2,58 g, 36% Ausbeute). FABMS- Analyse ergab ein (MH+) von 921 (im Vergleich zum berechneten Wert von 921,31 für die Verbindung C&sub5;&sub8;H&sub6;&sub8;N&sub2;O&sub4;S&sub2;).

B. Synthese von N-Boc-N'-(5-carboxypentyl)-N,N'-bis[2-(4- methoxybenzylthio)-2-methylpropyl]ethylendiamin

a. N,N'-bis[2-(4-methoxybenzylthio)-2-methylpropyl]ethylendiamin

Eine Lösung von N,N'-bis(2-mercapto-2-methylpropyl)ethylendiamin (11,23 g, 47,5 mMol; siehe DiZio et al., 1991, Bioconjugate Chem. 2: 353, und Corbin et al., 1976, J. Org. Chem. 41: 489) in Methanol (500 ml) wurde in einem Eis/Wasser-Bad gekühlt und danach über 45 min mit gasförmigem Ammoniak gesättigt. 4- Methoxybenzylchlorid (17,0 ml, 125 mMol, 264 Mol-%) wurde dazu zugegeben. Die Reaktion wurde unter Rühren über Nacht unter Argon auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Die Lösung wurde zu einer Paste eingeengt und danach zwischen Diethylether (150 ml) und 0,5 M KOH (200 ml) verteilt. Die wässrige Phase wurde weiter mit Diethylether(2 · 50 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden mit NaCl-Lösung gewaschen und zu einem klaren farblosen Öl eingeengt. Das Öl wurde in Diethylether (200 ml) aufgelöst und danach mit 4,0 M HCl in Dioxan angesäuert, bis kein weiteres Präzipitieren beobachtet wurde. Das weiße Präzipitat wurde durch Filtration gesammelt und mit Diethylether gewaschen. Der weiße Feststoff wurde bei einem pH-Wert von -2 aus heißem Wasser umkristallisiert. Der weiße Feststoff wurde durch Filtration gesammelt, wobei 29,94 g als ein Gemisch von mono- und di-HCl-Salzen erhalten wurden. Die HCl-Salze wurden zwischen 1 m KOH (100 ml) und Ethylacetat (100 ml) verteilt. Die wässrige Phase wurde mit Ethylacetat (2 · 30 ml) extrahiert und die kombinierten organischen Phasen wurden mit NaCl-Lösung gewaschen, mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und eingeengt, wobei reines Produkt in Form der freien Base als ein hellgelbes Öl (18,53 g, 82% Ausbeute) erhalten wurde. Magnetische Kernresonanz-Experimente zur Charakterisierung ergaben die folgenden molekularen Kennzeichen:
¹H NMR (300 MHz, CDCl&sub3;): δ 7.25 (d, 4H, J = 9), 6.83 (d, 4H, J = 9), 3.78 (s, 6H), 3.67 (s, 4H), 2.63 (s, 4H), 2.56 (s, 4H), 1.34 (s, 12H).

b. N-(5-carboethoxypentyl)-N,N'-bis[2-(4-methoxybenzylthio)-2- methylpropyl]ethylendiamin

Zu N,N'-bis[2-(4-methoxybenzylthio)-2-methylpropyl]ethylendiamin (4,13 g, 8,66 mMol) in CH&sub3;CN (50 ml) wurde K&sub2;CO&sub3; (1,21 g, 8,75 mMol, 101 Mol-%) zugegeben, gefolgt von Ethyl-5-bromvalerat (2,80 ml, 17,7 mMol, 204 Mol-%). Die Reaktion wurde über Nacht unter Rückfluß gerührt und danach unter Vakuum zu einer Paste eingeengt. Der Rückstand wurde zwischen Ethylacetat (100 ml) und 0,5 M KOH (100 ml) verteilt. Die wässrige Phase wurde mit Ethylacetat (1 · 50 ml) extrahiert und die kombinierten organischen Phasen wurden mit NaCl-Lösung (50 ml) gewaschen, mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zu einem gelben Öl (~6 g) eingeengt. Reinigung mittels präparativer Normalphasen-HPLC (100% CHCl&sub3; bis 5% Methanol/Chloroform über 25 min) ergab reine Titelverbindung (1,759 g, 34% Ausbeute). FABMS-Analyse ergab ein (MH+) von 605 (im Vergleich zu einem für C&sub3;&sub3;H&sub5;&sub2;N&sub2;O&sub4;S&sub2; berechneten Wert von 604,90). Magnetische Kernresonanz-Experimente zur Charakterisierung ergaben die folgenden molekularen Kennzeichen:
¹H NMR (300 MHz, CDCl&sub3;): δ 7.25 (d, 4H, J = 8,5), 6.83 (d, 4H, J = 8,5), 4.13 (q, 2H, J = 7), 3.793 (s, 3H), 3.789 (s, 3H), 3.74 (s, 2H), 3.67 (s, 2H), 2.6 (m, 10H), 2.31 (t, 2H, J = 7), 1.6 (m, 2H), 1.5 (m, 2H), 1.34 (s, 12H), 1.28 (t, 3H, J = 7).

c. N-Boc-N'-(5-carboxypentyl)-N,N'-bis[2-(4-methoxybenzylthio)-2- methylpropyl]ethylendiamin

Zu N-(5-carboethoxypentyl)-N,N'-bis[2-(4-methoxybenzylthio)-2- methylpropyl]ethylendiamin (586 mg, 0,969 mMol) in THF (40 ml) wurde Wasser (30 ml) und 1 M KOH (2,5 ml, 2,5 mMol, 260 Mol-%) zugegeben. Die homogene Lösung wurde über Nacht unter leichtem Rückfluß erwärmt. Die Lösung wurde danach auf Raumtemperatur gekühlt und das THF wurde durch Rotationsverdampfen entfernt. Der Rückstand wurde mit H&sub2;O auf 50 ml verdünnt und der pH-Wert wurde mit 1 M HCl auf ~2-3 eingestellt. Die Lösung wurde mit Ethylacetat (3 · 30 ml) extrahiert, und die kombinierten organischen Phasen wurden mit NaCl-Lösung (50 ml) gewaschen, mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und eingeengt, wobei die rohe Säure (422 mg, 75% Ausbeute) erhalten wurde.
Zu dem Rohprodukt aus der obigen Reaktion wurden CH&sub3;CN (40 ml) und (BOC)&sub2;O (240 mg, 1,10 mMol, 150 Mol-%), gefolgt von Triethylamin (0,200 ml, 1,43 mMol, 196 Mol-%) zugegeben. Die homogene Lösung wurde bei Raumtemperatur unter Argon über Nacht gerührt. Die Lösung wurde danach zu einer Paste eingeengt und zwischen Ethylacetat (25 ml) und 1 M KH&sub2;PO&sub4; (25 ml) verteilt. Die organische Phase wurde mit 5% Zitronensäure (2 · 25 ml) und NaCl-Lösung (25 ml) gewaschen, mit Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zu einem gelben Öl eingeengt. Reinigung mittels Flash- Chromatographie (50 ml Flash-Silicagel, 100% Chloroform bis 15% Methanol/Chloroform) ergab reine Titelverbindung (344 mg, 70% Ausbeute). FABMS-Analyse ergab ein (MH+) von 677 (im Vergleich zu dem für die Verbindung C&sub3;&sub6;H&sub5;&sub6;N&sub2;O&sub6;S&sub2; berechneten Wert von 676,97). Magnetische Kernresonanz- Experimente zur Charakterisierung ergaben die folgenden molekularen Kennzeichen:
¹H NMR (300 MHz, CDCl&sub3;): δ 7.20 (d, 4H, J = 7), 6.79 (d, 4H, J = 7), 3.75 (s, 3H), 3.74 (s, 3H), 3.68 (m, 4H), 3.35 (m, 4H), 2.65 (m, 2H), 2.53 (m, 4H), 2.31 (m, 2H), 1.59 (m, 2H), 1.43 (s, 11H), 1.30 (s, 6H), 1.26 (s, 6H).

C. Synthese von BAT-BM (N-[2-(N',N'-bis(2-maleimidoethyl)aminoethyl)]- N&sup6;,N&sup9;-bis(2-methyl-2-triphenylmethylthiopropyl)-6,9-diazanonanamid)

BAT-BM wurde wie folgt hergestellt. BAT-Säure (N&sup9;-(t-butoxycarbonyl)-N&sup6;,N&sup9;-bis(2- methyl-2-triphenylmethylthiopropyl)-6,9-diazanonansäure) (10,03 g, 10,89 mMol) und 75 ml trockenes Methylenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;) wurden in einem mit einem mit Magnetrührstab und Argonballon ausgestatteten 250 ml Rundkolben vorgelegt. Zu dieser Lösung wurde Diisopropylcarbodiimid (3,40 ml, 21,7 mMol, 199 Mol-%), gefolgt von N-Hydroxysuccinimid (3,12 g, 27,1 mMol, 249 Mol-%) zugegeben. Es wurde festgestellt, daß diese Lösung innerhalb 1 h trübe wurde, und sie wurde unter Rühren bei Raumtemperatur weiter inkubiert, während eines Zeitraums von insgesamt 4 h. Danach wurde eine Lösung von Tris(2-aminoethyl)amin (30 ml, 200 mMol, 1840 Mol-%) in 30 ml Methylenchlorid zugegeben und das Rühren über Nacht fortgesetzt. Danach wurde das Reaktionsgemisch unter Unterdruck eingeengt, und der Rückstand wurde zwischen Ethylacetat (150 ml) und 0,5 M Kaliumcarbonat (K&sub2;CO&sub3;, 150 ml) verteilt. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit Salzlösung gewaschen und eingeengt, wobei das Rohprodukt N-[2-(N',N'-bis(2- aminoethyl)aminoethyl)]-N&sup9;-(t-butoxycarbonyl)-N&sup6;,N&sup9;-bis(2-methyl-2- triphenylmethylthiopropyl)-6,9-diazanonanamid als ein Schaum/Öl erhalten wurde.
Dieses Rohprodukt wurde in einem mit Magnetrührstab ausgestatteten 1000 ml Rundkolben, der 300 ml THF enthielt, gegeben und danach wurden 30 ml gesättigtes Natriumbicarbonat (NaHCO&sub3;), 100 ml Wasser und N- methoxycarbonylmaleimid (6,13 g, 39,5 mMol, 363 Mol-%) zugegeben. Dieses heterogene Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. THF wurde durch Rotationsverdampfen aus dem Gemisch entfernt und der wässrige Rückstand wurde zweimal mit Ethylacetat (2 · 75 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen dieser Extraktionen wurden mit Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, durch eine mittlere Nutsche filtriert und auf etwa 12 g Rohprodukt eingeengt. Reinigung durch Flüssigchromatographie (250 g Siliziumdioxid / eluiert mit einem Gradienten von Chloroform → 2% Methanol in Chloroform) ergab 5,3 g reines Produkt (N-[2-(N',N'-bis(2-maleimidoethyl)aminoethyl)]-N&sup9;-(t-butoxycarbonyl)- N&sup6;,N&sup9;-bis(2-methyl-2-triphenylmethylthiopropyl)-6,9-diazanonanamid (entsprechend 40% Ausbeute), zusammen mit annähernd 5 g Rohprodukt, die einer weiteren Aufreinigung zugeführt werden können um Reinprodukt zu erhalten. Die chemische Analyse des gereinigten Produkts bestätigte dessen Identität als BAT-BM wie folgt:
¹H NMR (200 MHz, CDCl&sub3;): δ 0.91 (12H, s), 1.38 (9H, s), 1.2-1.6 (4H, m), 2.06 (2H, s), 2.18 (2H, t, J = 7), 2.31 (4H, m), 2.55 (2H, t, J = 5), 2.61 (4H, t, J = 6), 2.99 (2H, s), 3.0-3.3 (4H, m), 3.46 (4H, t, J = 6), 6.49 (-NH, t, J = 4), 6.64 (4H, s), 7.1-7.3 (18H, m), 7.6 (12 H, t, J = 17).

D. Synthese von [BAT]-konjugiertem (&epsi;N) Lys(αN-Fmoc) [N-&epsi;-(N&sup9;-t- butoxycarbonyl)-N&sup6;,N&sup9;-bis[2-methyl-2-(triphenylmethylthio)propyl]-6,9- diazanonanoyl]-N-α-Fmoc-Lysin

In einem mit Rührstab und Argonballon ausgestatteten 100 ml Einhals-Rundkolben wurde N&sup9;-(t-butoxycarbonyl)-N&sup6;,N&sup9;-bis[2-methyl-2-(triphenylmethylthio)propyl]-6,9- diazanonansäure (BAT-Säure, 3,29 g, 3,57 mMol) in 50 ml CH&sub2;Cl&sub2; bei Raumtemperatur vorgelegt. Dazu wurde Diisopropylcarbodiimid (DIC, 580 ul, 3,70 mMol, 104 Mol-%), unmittelbar gefolgt von N-Hydroxysuccinimid (HOSu, 432 mg, 3,75 mMol, 105 Mol-%) zugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt, wobei sich während dieses Zeitraums ein weißer Niederschlag bildete. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat zu einem festen Schaum eingeengt. Der rohe Schaum wurde in einem 100 ml Rundkolben in 75 ml eines 2 : 1 Gemisches von Dimethoxyethan und Wasser aufgelöst. Zu dieser homogenen Lösung wurde N-α-Fmoc-Lysin Hydrochlorid (1,52 g, 3,75 mMol, 105 Mol-%), gefolgt von K&sub2;CO&sub3; (517 mg, 3,74 mMol, 105 Mol-%) zugegeben, und die gelbe Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde die Lösung in einen 250 ml Erlenmeyer-Kolben, der 100 ml Ethylacetat und 100 ml Wasser enthielt, gegossen. Die organische Phase wurde abgetrennt und die wässrige Phase mit 50 ml Ethylacetat weiter extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden ein Mal mit Salzlösung (100 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zu einem gelben Feststoff eingeengt. Dieses Rohprodukt wurde durch Niederdruck- Flüssigchromatographie gereinigt (150 g SiO&sub2;, Elution mit CHCl&sub3; → 10% Methanol in CHCl&sub3;). Auf diese Weise wurden 3,12 g der angegebenen Verbindung hergestellt (69 % Ausbeute). Die chemische Analyse des gereinigten Produkts bestätigte dessen Identität wie folgt:
¹H NMR (300 MHz, CDCl&sub3;): δ 0.88 (12H, s, breit), 1.05-1.45 (19H, m), 1.8-2.1 (4H, m), 1.8-2.47 (4H, m), 2.75-3.2 (6H, m), 3.9-4.3 (4H, m), 7.2 (22H, m), 7.6 (16H, s, gebunden). FABMS MH+ wurde vorhergesagt bei 1270,6 und gefunden bei 1272.

E. Synthese von BAM (N¹-(t-butoxycarbonyl)-N¹,N&sup4;-bis[2-methyl-2- (triphenylmethylthio)propyl]-1,4,10-triazadecan)

In einem mit Rührstab, Rückflußkühler und Argonballon ausgestatteten 250 ml Einhals-Rundkolben wurde N¹,N&sup4;-bis[2-methyl-2-(triphenylmethylthio)propyl]- ethylendiamin (BAT-I, 10,0 g, 14,01 mMol) in 50 ml CH&sub3;CN und 30 ml Dioxan vorgelegt. Dazu wurde N-(5-Brompentyl)phthalimid (8,04 g, 27,1 mMol, 194 Mol-%), gefolgt von K&sub2;CO&sub3; (2,95 g, 21,3 mMol, 152 Mol-%) zugegeben. Das Gemisch wurde unter Argon während zwei Tagen unter Rückfluß erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde danach eingeengt und der Rückstand zwischen 150 ml Wasser und 150 ml Ethylacetat verteilt. Die organische Phase wurde abgetrennt und die wässrige Phase (bei einem pH-Wert von etwa 10) mit 50 ml Ethylacetat weiter extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden ein Mal mit Salzlösung (75 ml) gewaschen, über Na&sub2;CO&sub3; getrocknet und zu einem Öl eingeengt. Reinigung durch Niederdruck-Flüssigchromatographie (300 g SiO&sub2;, CHCl&sub3; → 2% Methanol in CHCl&sub3;) ergab 9,20 g 9-Phthalimido-N¹,N&sup4;-bis[2-methyl-2-(triphenylmethylthio)propyl]-1,4- diazanonan als einen gelben Schaum (70% Ausbeute). Die chemische Analyse des gereinigten Produkts dieses Zwischenschritts bestätigte dessen Identität wie folgt:
¹H NMR (300 MHz, CDCl&sub3;): δ 1.01 (6H, s), 1.03 (6H, s), 1.15-1.4 (2H, t), 1.98 (2H, s), 2.10 (2H, s), 2.28 (2H, m), 2.45 (3H, m), 3.68 (2H, t), 7.15-7.35 (18H, m), 7.62 (12H, t), 7.72 (2H, m), 7.85 (2H, m),. FABMS MH+ war vorhergesagt bei 935,4 und wurde gefunden bei 936.
In einem mit Rührstab ausgestatteten 500 ml Einhals-Rundkolben wurde 9- Phthalimido-N¹,N&sup4;-bis[2-methyl-2-(triphenylmethylthio)propyl]-1,4-diazanonan (8,83 g, 9,43 mMol) in 75 ml CH&sub3;CN und 20 ml CH&sub2;Cl&sub2; vorgelegt. Dazu wurde K&sub2;CO&sub3; (1,30 g, 9,41 mMol, 100 Mol-%), gefolgt von Di-tert-butyldicarbonat (2,15 g, 9,85 mMol, 104 Mol-%) zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde danach eingeengt und zwischen jeweils 100 ml Wasser und Ethylacetat verteilt. Die organische Phase wurde abgetrennt und die wässrige Phase wurde mit 50 ml Ethylacetat weiter extrahiert Die kombinierten organischen Phasen wurden ein Mal mit Salzlösung (75 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und eingeengt, wobei 9,69 g rohes 9- Phthalimido-N¹-(t-butoxycarbonyl)-N¹,N&sup4;-bis[2-methyl-2-(triphenylmethylthio)propyl]- 1,4-diazanonan als gelber Schaum erhalten wurden (99% Rohausbeute). Dieses Rohprodukt wurde ohne weitere Reinigung verwendet.
In einem mit Rührstab und Rückflußkühler ausgestatteten 250 ml Einhals- Rundkolben wurde 9-Phthalimido-N¹-(t-butoxycarbonyl)-N¹,N&sup4;-bis[2-methyl-2- (triphenylmethylthio)propyl]-1,4-diazanonan (5,50 g, 5,319 mMol) in 25 ml THF vorgelegt. Dazu wurden 100 ml Ethanol und 5 ml Wasser zugegeben. Die Wasserzugabe verursachte ein Ausfallen des Ausgangsmaterials aus der Lösung. Hydrazinhydrat (1,2 ml, 24,7 mMol, 466 Mol-%) wurde zugegeben und die Reaktion während zwei Tagen unter Rückfluß erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde eingeengt und zwischen jeweils 100 ml Wasser und 0,25 M K&sub2;CO&sub3; verteilt. Die organische Phase wurde abgetrennt und ein Mal mit Salzlösung (75 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und zu einem festen Schaum eingeengt. Reinigung des Rohprodukts durch Niederdruck-Flüssigchromatographie (100 g SiO&sub2;, CHCl&sub3; → 5% Methanol in CHCl&sub3;, die Säule war mit 200 ml 2% Triethylamin in CHCl&sub3; vorbehandelt worden) ergab 3,27 g reines N¹-(t-butoxycarbonyl)-N¹,N&sup4;-bis[2-methyl-2- (triphenylmethylthio)propyl]-1,4,10-triazadecan als gelben Schaum (68% Ausbeute). Die chemische Analyse des gereinigten Produkts bestätigte dessen Identität wie folgt:
¹H NMR (300 MHz, CDCl&sub3;): δ 0.9 (12H, s), 1.2 (6H, s), 1.36 (9H, s), 2.05 (4H, m), 2.24 (2H, t), 2.31 (2H, t), 2.62 (3H, t), 3.0 (2H, s, breit), 3.1 (2H, s, breit), 7.2 (18H, m) , 7.6 (12H, t). FABMS MH+ war vorhergesagt bei 905,5 und wurde gefunden bei 906,5.

BEISPIEL 2

Festphasen-Peptidsynthese

Festphasen-Peptidsynthese (SPPS, solid phase peptide synthesis) wurde durchgeführt im 0,25 Millimol (mMol) Maßstab unter Verwendung eines Applied Biosystems Model 431A Peptid-Synthesizers und unter Verwendung von 9- Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) als Aminoterminale Schutzgruppe, Kupplung mit Dicyclohexylcarbodiimid/Hydroxybenzotriazol oder 2-(1H-benzotriazol-1-yl)- 1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorophosphat/Hydroxybenzotriazol (HBTU/HOBT), und unter Verwendung von p-Hydroxymethylphenoxymethylpolystyrol (HMP) Harz für Carboxy-terminale Säuren oder Rink-Amidharz für Carboxy-terminale Amide. Harz-gebundene Produkte wurden routinemäßig abgespalten unter Verwendung einer Lösung, bestehend aus Trifluoressigsäure, Wasser, Thioanisol, Ethandithiol und Triethylsilan, hergestellt in Verhältnissen von 100 : 5 : 5 : 2,5 : 2, während 1,5 bis 3 h bei Raumtemperatur.
Wenn αN-Formylgruppen eingeführt wurden, erfolgte dies durch Behandlung des abgespaltenen Peptids ohne Schutzgruppe mit einem Überschuß von Essigsäureanhydrid in 98% Ameisensäure und Rühren während etwa 18 Stunden, gefolgt von HPLC-Reinigung. Wenn N-terminale Acetylgruppen eingeführt wurden, erfolgte dies durch Behandlung des harzgebundenen Aminopeptids mit freiem N- terminus mit 20% v/v Essigsäureanhydrid in NMP (N-Methylpyrrolidinon) während 30 min. Wenn 2-Chloracetyl- und 2-Bromacetylgruppen eingeführt wurden, erfolgte dies unter Verwendung der jeweiligen 2-Halogenessigsäure als letzten anzukuppelnden Rest während der SPPS oder durch Behandlung des harzgebundenen Aminopeptids mit freiem Nterminus mit entweder 2- Halogenessigsäure/Diisopropylcarbodiimid/N-Hydroxysuccinimid in NMP oder 2- Halogenessigsäureanhydrid/Diisopropylethylamin in NMP. Wenn HPLC-gereinigte 2- Halogen-acetylierte Peptide cyclisiert wurden, erfolgte dies durch Rühren in einer 0,1 -1,0 mg/ml Lösung in Bicarbonat oder Ammoniumpuffer (pH 8) mit oder ohne 0,5 - 1,0 mM EDTA während 1-48 Stunden, gefolgt von Ansäuern mit Essigsäure, Lyophylisierung und HPLC-Reinigung. Wenn Cys-Cys Disulfidbrücken- Cyclisierungen durchgeführt wurden, erfolgte dies durch Behandlung der Cysteinfreien Thiol-Ausgangspeptide in einer Konzentration von 0,1 mg/ml in einem Puffer mit einem pH-Wert von 7 mit Aliquots von 0,006 M K&sub3;Fe(CN)&sub6; bis eine gelbe Farbe stabil blieb. Das überschüssige Oxidationsmittel wurde mit einem Überschuß an Cystein reduziert, das Gemisch wurde lyophylisiert und danach mittels HPLC gereinigt.
Wenn die "Pica"-Gruppe eingeführt wurde, erfolgte dies durch Konjugation von Picolylamin an ein Vorläuferpeptid unter Verwendung von Diisopropylcarbodiimid und N-Hydroxysuccinimid. Wenn BAT-Liganden eingeführt wurden, erfolgte dies entweder unter Verwendung der entsprechenden BAT-Säure als letzten anzukuppelnden Rest während der SPPS oder durch Behandlung des harzgebundenen Peptids mit freier N-terminaler Aminogruppe mit BAT-Säure/Diisopropylcarbodiimid/N-Hydroxysuccinimid in NMP. Wenn [BAM] an das Peptid konjugiert wurde, erfolgte dies durch zunächst Aktivieren der Peptidcarboxylatgruppe mit einem Gemisch aus Diisopropylcarbodiimid/N-Hydroxysuccinimid oder HBTU/HOBt in DMF, NMP oder CH&sub2;Cl&sub2;, gefolgt von Kupplung in der Gegenwart von Diisopropylethylamin; nach der Kupplung wurde die Schutzgruppe des Konjugats entfernt wie vorstehend beschrieben.
Wenn BSME-Addukte hergestellt wurden, erfolgte dies durch Umsetzen von ein einzelnes Thiol-enthaltenden Peptiden (5 bis 50 mg/ml in 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8) mit 0,5 Moläquivalenten BMME (Bismaleimidomethylether), der zuvor in Acetonitril aufgelöst worden war, während 1 -18 Stunden bei Raumtemperatur. Die Lösung wurde eingeengt und das Produkt mittels HPLC gereinigt.
Wenn TSEA-Addukte hergestellt wurden, erfolgte dies durch Umsetzen eines ein einzelnes Thiol enthaltenden Peptids (in Konzentrationen von 10 bis 100 mg/ml Peptid in DMF, oder von 5 bis 50 mg/ml Peptid in 50 mM Natriumphosphat (pH 8)/Acetonitril oder THF) mit 0,33 Moläquivalenten TMEA (Tris(2- maleimidoethyl)amin; Beispiel 2), das zuvor in Acetonitril oder DMF aufgelöst worden war, mit oder ohne 1 Moläquivalent Triethanolamin, während annähernd 1-18 Stunden bei Raumtemperatur. Derartige Addukte enthaltende Reaktionsgemische wurden eingeengt und die Addukte wurden danach unter Verwendung von HPLC gereinigt.
Wenn BAT-BS Addukte hergestellt wurden, erfolgte dies durch Umsetzen eines ein einzelnes Thiol enthaltenden Peptids (in Konzentrationen von 2 bis 50 mg/ml Peptid in 50 mM Natriumphosphat (pH 8)/Acetonitril oder THF) mit 0,5 Moläquivalenten BAT-BM (N-[2-(N',N'-bis(2-maleimidoethyl)aminoethyl)]-N&sup9;-(t-butoxycarbonyl)-N&sup6;,N&sup9;- bis(2-methyl-2-triphenylmethylthiopropyl)-6,9-diazanonanamid; Beispiel 1), das zuvor in Acetonitril oder THF aufgelöst worden war, während annähernd 1-18 Stunden bei Raumtemperatur. Die Lösung wurde danach zur Trockene eingedampft und Schutzgruppen von [BAT-BS]-Peptid Konjugaten wurden durch Behandlung mit 10 ml TFA und 0,2 ml Triethylsilan während 1 h entfernt. Die Lösung wurde eingeengt, die Produkt-Addukte mit Ether präzipitiert und danach mittels HPLC gereinigt.
Rohe Peptide wurden gereinigt mittels präparativer Hochdruck- Flüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Waters Delta Pak C18 Säule und einem Elutionsgradienten unter Verwendung von 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser, modifiziert mit Acetonitril. Acetonitril wurde aus den eluierten Fraktionen abgedampft, die dann lyophylisiert wurden. Die Identität jedes Produkts wurde bestätigt durch Massenspektroskopie unter Beschuß mit energiereichen Atomen (FABMS, fast atom bombardment mass spectroscopy).

BEISPIEL 3

Allgemeines Verfahren zur Radiomarkierung mit Tc-99 m

0,1 mg eines wie in Beispiel 2 hergestellten Peptids wurden in 0,1 ml Wasser oder 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH = 5,6 oder 7,4) aufgelöst. Tc-99 m Gluceptat wurde hergestellt durch Rekonstitution eines Glucoscan-Gefässes (E. I du Pont de Nemours, Inc.) mit 1,0 ml Tc-99 m Natriumpertechnetat, das bis zu 200 mCi enthielt, und Stehen Lassen bei Raumtemperatur während 15 Minuten. 25 ul Tc-99 m Gluceptat wurden dann zu dem Peptid zugegeben und die Reaktion wurde 15-30 min bei Raumtemperatur oder 100ºC laufen gelassen, und danach wurde durch ein 0,2 um Filter filtriert.
Die Reinheit des Tc-99 m markierten Peptids wurde mittels HPLC unter Verwendung der nachfolgenden Bedingungen bestimmt: eine Waters DeltaPure RP-18, 5u, 150 mm · 3,9 mm analytische Säule wurde jeweils mit radioaktiv markiertem Peptid beladen und die Peptide eluierten mit einer Lösungsmittel-Fließrate von gleich 1 ml/min. Gradientenelution wurde durchgeführt beginnend mit 10% Lösungsmittel A (0,1% CF&sub3;COOH/H&sub2;O) bis 40% Lösungsmittel B&sub9;&sub0; (0,1% CF&sub3;COOH/90% CH&sub3;CN/H&sub2;O) im Verlauf von 20 Minuten.
Radioaktive Komponenten wurden nachgewiesen mittels eines zwischengeschalteten radiometrischen Detektors, der mit einer Integrations- Aufzeichnungsvorrichtung verbunden war. Tc-99 m Gluceptat und Tc-99 m Natriumpertechnetat eluieren unter diesen Bedingungen nach 1 bis 4 Minuten, während das Tc-99 m markierte Peptid nach einem erheblich längeren Zeitraum eluierte.
Die nachfolgende Tabelle veranschaulicht die erfolgreiche Tc-99 m Markierung von gemäß Beispiel 2 hergestellten Peptiden unter Verwendung des hierin beschriebenen Verfahrens.
* die nachfolgenden Markierungsbedingungen wurden mit den entsprechenden Peptiden verwendet:
1. Das Peptid wird in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4) aufgelöst und bei Raumtemperatur markiert.
2. Das Peptid wird in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4) aufgelöst und bei 100ºC markiert.
3. Das Peptid wird in Wasser aufgelöst und bei Raumtemperatur markiert. 4. Das Peptid wird in Wasser aufgelöst und bei 100ºC markiert.
5. Das Peptid wird in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6,0) aufgelöst und bei 100ºC markiert.
6. Das Peptid wird in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 5,0) aufgelöst und bei Raumtemperatur markiert.
**HPLC-Methoden
allgemein: Lösungsmittel A = 0,1% CF&sub3;COOH/H&sub2;O
Lösungsmittel B&sub7;&sub0; = 0,1% CF&sub3;COOH/70% CH&sub3;CN/H&sub2;O
Lösungsmittel B&sub9;&sub0; = 0,1% CF&sub3;COOH/90% CH&sub3;CN/H&sub2;O
Lösungsmittel-Fließrate = 1 ml/min
Vydak-Säule = Vydak 218TP54 RP-18, 5u · 220 mm · 4,6 mm analytische Säule mit Schutzsäule
Brownlee-Säule = Brownlee Spheri-5 RP-18, 5u · 220 mm · 4,6 mm Säule
Waters-Säule = Waters Delta-Pak C-18, 5 um, 39 · 150 mm
Methode 1: Brownlee-Säule 100% A bis 100% B&sub7;&sub0; in 10 min
Methode 2: Vydak-Säule 100% A bis 100% B&sub9;&sub0; in 10 min
Methode 3: Vydak-Säule 100% A bis 100% B&sub7;&sub0; in 10 min
Methode 4: Brownlee-Säule 100% A bis 100% B&sub9;&sub0; in 10 min
Methode 5: Waters-Säule 100% A bis 100% B&sub9;&sub0; in 10 min
Ein-Buchstaben-Abkürzungen für Aminosäuren können gefunden werden in G. Zubay, Biochemistry (2. Auflage), 1988 (MacMillen Publishing: New York), Seite 33; Ac = Acetyl, Pic = Picolinoyl (Pyridin-2-carbonyl) = 6-Aminocapronsäure, Hly = Homolysin, Acm = Acetamidomethyl, pGlu = Pyro-Glutaminsäure, Mob = 4- Methoxybenzyl, Pica = Picolylamin (2-(Aminomethyl)pyridin), Apc = L-[S-(3- aminopropyl)cystein, FD = D-Phenylalanin, WD=D-Tryptophan, YD = D-Tyrosin, Cpa = L-(4-Chlorphenyl)alanin, Thp = 4-Amino-tetrahydrothiopyran-4-carbonsäure, ma = Mercaptoessigsäure, D-Nal = D-2-Naphthylalanin, Dpg = Dipropylglycin, Nle = Norleucin,
BAT = N&sup6;,N&sup9;-bis(2-mercapto-2-methylpropyl)-6,9-diazanonansäure, BAT-Säure (geschützt) = N&sup9;-(t-butoxycarbonyl)-N&sup6;,N&sup9;-bis(2-methyl-2-triphenylmethylthiopropyl)- 6,9-diazanonansäure, BAM = N¹,N&sup4;-bis(2-mercapto-2-methylpropyl)-1,4,10- triazadecan, BAM (geschützt) = N¹-(t-butoxycarbonyl)-N¹,N&sup4;-bis(2-methyl-2- triphenylmethylthiopropyl)-1,4,10-triazadecan, [BAT-BM] = N-[2-(N',N'-bis(2- maleimidoethyl)aminoethyl)]-N&sup9;-(t-butoxycarbonyl)-N&sup6;,N&sup9;-bis(2-methyl-2- triphenylmethylthiopropyl)-6,9-diazanonanamid, [BAT-BS] = N-[2-(N',N'-bis(2- succinimidoethyl)aminoethyl)]-N&sup6;,N&sup9;-bis(2-mercapto-2-methylpropyl)-6,9- diazanonanamid, [BMME] = Bismaleimidomethylether, [BSME] = Bissuccinimidomethylether, [DTPA] = Diethylentriaminpentaessigsäure.

BEISPIEL 4

Lokalisierung und in vivo Darstellung von atherosklerotischen Plaques unter Verwendung von Tc-99 m markierter Verbindung P215 im Hypercholesterin - Kaninchen-Modell

Zweiundzwanzig New Zealand White (NZW) Kaninchen beiden Geschlechts und mit einem Gewicht von 2-3 kg wurden in zwei Gruppen unterteilt. Die Kontrollgruppe bestand aus 6 Kaninchen, die untergebracht wurden und mit kommerziell erhältlichem Kaninchenfutter (Purina) gefüttert wurden. Sechzehn Kaninchen, die Gruppe HC, wurden von einem Alter von sieben Wochen an bis zu einem Alter von 28 Wochen mit einer standardisierten, Cholesterin-reichen Nahrung gefüttert (Kaninchenfutter, auf eine Konzentration von 1% w/w Cholesterin gemischt). Allen Tieren wurde Wasser ad libitum gegeben.
Tc-99 m markiertes P215 ([BAT]RALVDTLKFVTQAEGAK.amid) wurde wie vorstehend beschrieben hergestellt. Etwa 250-400 ug des Peptids wurden mit 140- 160 mCi Tc-99 m markiert und in Einzeldosen von 7-8 mCi (12,5-20,0 ug/Kaninchen, 6-7 ug/kg) in Volumendosen von 0,2 ml zubereitet. Das Tc-99 m markierte Peptid wurde ausgewachsenen Kaninchen durch langsame Bolusinfusion intravenös in eine laterale Ohrvene verabreicht (annähernd 0,1 ml/min). Eine gamma-Kamera war mit einem Lochkollimator versehen (5 mm Blende) und ein Energiefenster für Tc-99 m wurde eingestellt und zur Zählung von 500.000 counts oder Abtasten für einen gewünschten Zeitraum programmiert. Kurz vor der Darstellung wurden die Tiere mit einem Gemisch aus Ketamine und Xylazine (5 : 1, 1 ml/kg intramuskulär) anästhesiert.
Gamma-Kamera-Darstellungen wurden aufgenommen bei 40º-45º direkt oberhalb des Herzens (linke vordere Schrägansicht [LAO, left anterior oblique]), um den Aortenbogen darzustellen und die absteigende Aorta zu visualisieren. Darstellungen wurden aufgenommen nach 1 h und 2 h und manchmal nach 3 h und 5 h nach Injektion. Nach Bedarf wurde vor jeder Datensammlung zur Darstellung eine zusätzliche Anästhesie durch Injektion durchgeführt.
Zum Zeitpunkt 2,5 Stunden (nach einer 2-stündigen Abtastung) wurden die Tiere mit einer intravenösen Dosis Natriumpentobarbital geopfert. Bei der Obduktion wurde die Aorta entfernt und abzweigende Gefässe von der Aortenklappe bis zur mittleren Bauchregion freipräpariert. Unter Verwendung eines Parallel-Lochkollimators wurde die Aorta ex corpora dargestellt. Danach wurden die Aortae in Längsrichtung geöffnet und mit Sudan IV angefärbt, wodurch die atherosklerotischen Plaques eine intensive ziegelrote Farbe annehmen. Von Fetten freies und unverletztes Aortenendothel behält unter diesen Bedingungen sein normales, glänzend weiß-rosa Aussehen bei.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in den Fig. 1-3 gezeigt. Beide Gruppen von Kaninchen zeigten eine rasche systemische Clearance von Tc-99 m P215. Die szintigraphischen Darstellungen deuten darauf hin, daß das Leber- und Galle- System den hauptsächlichen Clearance-Weg ausmachen. Kontroll-Aortae (Plaquefrei) waren nur für einen kurzen Zeitraum nach der Injektion sichtbar, infolge von im Blut zirkulierender Radioaktivität. Bei der Abbildung ex corpora zeigten die Aortae aus den HC-gefütterten NZW-Kaninchen jeweils ein einzigartiges Muster und eine einzigartige Intensität der Plaque-Verteilung. Alle HC-Aortae hatten variable Mengen von akkumulierter Radioaktivität aber zeigten durchwegs die größte Ablagerung im Bereich des Aortenbogens, mit niedrigeren Akkumulationsgraden in den distalen und proximalen Aortensegmenten.
Zwischen den in vivo und ex corpora Tc-99 m P215 Abbildungen und den Ablagerungsmustern von Sudan IV in den HC-behandelten Kaninchenaorten wurden positive Korrelationen beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigte keine Kontrollaorta eine regionale Aufnahme von markiertem Peptid. Fig. 1 zeigt das Ablagerungsmuster von Sudan IV in Aortae aus 1 HC-behandelten und 4 Kontroll- Kaninchen. Die dunklen Bereiche zeigen die Lokalisierung von atherosklerotischen Plaques. Die Fig. 2 und 3 zeigen die entsprechenden in vivo bzw. ex corpora Abbildungen.
Diese Ergebnisse zeigen, daß Tc-99 m markiertes P215 atherosklerotische Plaques in einem Tier darstellen kann, bei hoher Aufnahme und rascher Clearance, was eine Frühbeobachtung erleichtert. Zusätzlich zeigt normales Aortengewebe eine minimale Aufnahme von markiertem P215, wodurch die Wahrscheinlichkeit falsch-positiver szintigraphischer Darstellungen reduziert wird.

BEISPIEL 5

In vivo Darstellung von Tiefenvenenthrombose unter Verwendung von Tc-99 m markierter Verbindung P357 in einem Hunde-Modell

Mischlingshunde (25-35 Ib., über Nacht gefastet) wurden mit einer Kombination von Ketamine und Aceprozamine intramuskulär sediert und danach mit Natriumpentobarbital intravenös anästhesiert. In jedes Tier wurde ein Angiokatheter mit einer Feinheit von 18 in die distale Hälfte der rechten Oberschenkelvene gelegt und eine 8 mm mit Dacron® verwobene Edelstahl-Embolisationsspule (Cook, Co., Bloomington IN) wurde in der Oberschenkelvene etwa im mittleren Oberschenkelbereich plaziert. Der Katheter wurde entfernt, die Wunde genäht und die Plazierung der Spule mittels Röntgen-Aufnahmen dokumentiert. Danach ließ man die Tiere sich über Nacht erholen.
Am Tag nach dem Einbringen der Spule wurde jedes der Tiere erneut anästhesiert, intravenöse Salzlösungs-Tropfinfusionen in jedem Vorderbein plaziert, und ein Harnblasenkatheter gelegt, um Urin zu sammeln. Das Tier wurde auf dem Rücken liegend unter einer gamma-Kamera plaziert, die mit einem Niederenergie- Allzweckkollimator ausgestattet war, und Tc-99 m Peaks wurden photographisch aufgenommen. Darstellungen wurden auf einem NucLear Mac Computersystem erhalten.
Tc-99 m markiertes P357 [(CH&sub2;CO-YD.Apc.GDCGGCAcmGCAcm,GGC.amid)&sub2;-[BAT-BS]] [185-370 mBq (5-10 mCi) Tc-99 m und 0,2-0,4 mg P357] wurde in einen intravenösen Einlauf am Vorderbein an seiner Insertionsstelle injiziert. Der zweite Einlauf wurde für die Blutentnahme beibehalten. Vordere Darstellungen der Beine wurden erhalten für 500.000 counts oder 20 min (je nachdem, welcher Zeitraum kürzer war), nach annähernd 10-20 min und nach annähernd 1, 2, 3 und 4 h nach Injektion. Nach der Sammlung der Daten für die letzte Abbildung wurde jedes Tier mit Pentobarbital tief anästhesiert. Zwei Blutproben wurden entnommen mittels Herzpunktur unter Verwendung einer heparinisierten Spritze, gefolgt von einer euthanisierenden Dosis gesättigter Kaliumchloridlösung, die durch interkardiale Injektion oder intravenöse Bolusinjektion verabreicht wurde. Die den Thrombus enthaltende Oberschenkelvene und Wadenmuskel-Proben wurden danach sorgfältig heraus seziert. Der Thrombus wurde danach von dem Gefäß frei seziert und in ein vorgewogenes Testgefäß gegeben. Die Thrombusproben wurden danach gewogen und in einem Gamma-Zählrohr mit Probenkanal im Tc-99 m Kanal gezählt. Bekannte Fraktionen der injizierten Dosen wurden ebenfalls gezählt.
Gewicht von frischem Thrombus, Prozent injizierte Dosis (%ID)/g im Thrombus und direkt vor der Euthanasie erhaltenes Blut, und die Verhältnisse Thrombus/Blut und Thrombus/Muskel wurden ermittelt. Thrombus/Hintergrund-Verhältnisse wurden ermittelt durch Analyse der Counts/Pixel, gemessen in interessierenden Bereichen (ROI, regions-of-interest) über den Thrombus hinweg, und von angrenzendem Muskel, aus Computer-gespeicherten Abbildungen.
Das Darstellen von Tiefenvenenthromben wurde in insgesamt acht Hunden untersucht. Gewebedaten aus diesen Experimenten sind in der nachfolgenden Tabelle gezeigt. Repräsentative Beispiele von Darstellungen, die in einer vorderen Ansicht über die Hinterbeine eines Hunds zum Zeitpunkt 23, 71, 139, 208 und 222 min erhalten worden waren, sind in Fig. 4 gezeigt. Diese Darstellungen zeigen Anzeichen für eine Aufnahme von markiertem Peptid nach bereits 23 min nach Injektion, mit einer zweifelsfreien Lokalisierung nach 71 min. die bis zum Ende des Abbildungszeitraums bestehen blieb.
Diese Ergebnisse zeigen, daß Tiefenvenenthromben in vivo rasch und effizient lokalisiert werden können. Innerhalb 1 h nach Injektion war die Lokalisierung deutlich ersichtlich erfolgt, und sie blieb bei zunehmendem Kontrast und Fokussierung über nahezu 4 h nach Injektion bestehen.
Gezeigte Werte sind der Mittelwert ± mittlere Standardabweichung; [* = n = 1]
Der in der Tabelle gezeigte IC&sub5;&sub0; Wert wurde wie folgt bestimmt. Plättchenaggregations-Studien wurden im wesentlichen durchgeführt wie von Zucker (1989, Methods in Enzymol. 169: 117-133) beschrieben. In kurzen Worten wurde die Aggregation von Plättchen getestet mit oder ohne Verbindungen, die mutmaßlich die Aggregation von Plättchen hemmen, unter Verwendung von frischem Plättchenreichem Humanplasma, umfassend 300.000 Plättchen pro Mikroliter. Aggregation von Plättchen wurde induziert durch die Zugabe einer Adenosindiphosphatlösung bis zu einer Endkonzentration von 10 bis 15 mikromolar, und das Ausmaß der Plättchenaggregation wurde überwacht unter Verwendung eines Bio/Data Aggregometers (Bio/Data Corp., Horsham, PA). Die verwendeten Konzentrationen von Verbindungen, die die Aggregation von Plättchen hemmen, wurden von 0,1 bis 500 ug/ml variiert. Die Konzentration an Inhibitor, der das Ausmaß der Plättchenaggregation um 50% verringerte (definiert als der IC&sub5;&sub0;-Wert) wurde bestimmt aus Auftragungen der Inhibitorkonzentration gegen das Ausmaß der Plättchenaggregation. Eine Inhibierungskurve für das Peptid RGDS wurde für jeden Satz getesteter Plättchen als eine positive Kontrolle bestimmt.

Claims

1. Reagenz zur Herstellung eines szintigraphischen Bilderzeugungsmittels zur Darstellung von Stellen innerhalb eines Säugerkörpers, umfassend ein spezifisches Bindepeptid mit einer 3 bis 100 Aminosäuren umfassenden Aminosäuresequenz und kovalent damit verbunden eine von Radiomarkierung freie Radiomarkierungs-bindende Gruppe, wobei die Radiomarkierungsbindende Gruppe zur Bildung eines elektrisch neutralen Komplexes mit einem Radioisotop fähig ist.

2. Reagenz nach Anspruch 1, wobei das spezifische Bindepeptid und die Radiomarkierungs-bindende Gruppe durch etwa eine bis etwa 20 Aminosäuren kovalent miteinander verbunden sind.

3. Reagenz nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Radioisotop Technetium-99 m ist.

4. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das spezifische Bindepeptid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Peptiden mit den Aminosäuresequenzen:

Formyl-MLF

(VGVAPG)&sub3;amid

(VPGVG)&sub4;amid

RALVDTLKFVTQAEGAKamid

RALVDTEFKVKQEAGAKamid

PLARITLPDFRLPEIAIPamid

GQQHHLGGAKAGDV

PLYKKIIKKLLES

LRALVDTLKamid

GGGLRALVDTLKamid

GGGLRALVDTLKFVTQAEGAKamid

GGGRALVDTLKALVDTLamid

GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGGGYR

PSPSPIHPAHHKRDRRQamid

GGGFD.Cpa.YWDKTFTamid

[SYNRGDSTC]&sub3;-TSEA

GGGLRALVDTLKamid

GCGGGLRALVDTLKamid

GCYRALVDTLKFVTQAEGAKamid

GC(VGVAPG)&sub3;amid

5. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Reagenz weiterhin eine mehrwertige Linkergruppe umfaßt, die kovalent mit mehreren spezifischen Bindeverbindungen verbunden ist und auch kovalent mit mehreren Radiomarkierungs-bindenden Gruppen verbunden ist, so daß es ein Reagenz zur, Herstellung eines multimeren mehrwertigen szintigraphischen Bilderzeugungsmittels umfaßt, wobei das Molekulargewicht des multimeren mehrwertigen szintigraphischen Bilderzeugungsmittels weniger als etwa 20.000 Dalton beträgt.

6. Reagenz nach Anspruch 5, wobei die mehrwertige Linkergruppe Bissuccinimidylmethylether, 4-(2,2-Dimethylacetyl)benzoesäure, N-[2-(N',N'- bis(2-succinimidoethyl)amidoethyl)]-N&sup6;,N&sup9;-bis(2-methyl-2-mercaptopropyl)-6,9- diazanonanamid, Tris(succinimidylethyl)amin oder ein Derivat davon ist.

7. Reagenz zur Herstellung eines szintigraphischen Bilderzeugungsmittels zur Abbildung von Stellen innerhalb eines Säugerkörpers, umfassend ein spezifisches Bindepeptid mit einer 3 bis 100 Aminosäuren umfassenden Aminosäuresequenz und eine von Radiomarkierung freie Radiomarkierungsbindende Gruppe der Formel

oder

worin X = H oder eine Schutzgruppe,

(Aminosäure) = eine beliebige Aminosäure,

wobei die Radiomarkierungs-bindende Gruppe kovalent mit dem Peptid verbunden ist und zur Bitdung eines elektrisch neutralen Komplexes mit einem Radioisotop fähig ist.

8. Reagenz nach Anspruch 7, worin die Aminosäure Glycin ist und worin X eine Acetamidomethyl-Schutzgruppe ist.

Reagenz nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, weiterhin umfassend das Merkmal bzw. die Merkmale eines oder mehrerer der Ansprüche 2, 3, 4, 5 oder 6.

10. Reagenz zur Herstellung eines szintigraphischen Bilderzeugungsmittels zur Abbildung von Stellen innerhalb eines Säugerkörpers, umfassend ein spezifisches Bindepeptid mit einer 3 bis 100 Aminosäuren umfassenden Aminosäuresequenz und kovalent damit verbunden eine von Radiomarkierung freie Radiomarkierungs-bindende Bisamino-Bisthiol Gruppe, wobei die Radiomarkierungs-bindende Gruppe zur Bildung eines elektrisch neutralen Komplexes mit einem Radioisotop fähig ist, wobei die Radiomarkierungsbindende Bisamino-Bisthiol Gruppe eine Formel hat, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

worin R jeweils unabhängig voneinander H, CH&sub3; oder C&sub2;H&sub5; ist, (pgp)S jeweils unabhängig voneinander eine Thiol-Schutzgruppe oder H ist,

m, n und p unabhängig voneinander 2 oder 3 sind,

A = lineares oder zyklisches niederes Alkyl, Aryl, Heterocyclyl, Kombinationen oder substituierte Derivate davon,

und

worin R jeweils unabhängig voneinander H, CH&sub3; oder C&sub2;H&sub5; ist,

m, n und p unabhängig voneinander 2 oder 3 sind,

V = H oder -CO-Peptid,

R' = H oder Peptid,

mit der Maßgabe, daß wenn V = H, R' = Peptid, und wenn R' = H, V = -CO-Peptid.

11. Reagenz nach Anspruch 10, weiterhin umfassend das Merkmal bzw. die Merkmale eines oder mehrerer der Ansprüche 2, 3, 4, 5 oder 6.

12. Szintigraphisches Bilderzeugungsmittel, umfassend ein Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 11 und Technetium-99 m oder eine andere Radiomarkierung an die Radiomarkierungs-bindende Gruppe gebunden, wobei ein elektrisch neutraler Komplex gebildet wird.

13. Komplex, gebildet durch

(i) Umsetzen eines Reagenzes nach einem der Ansprüche 1 bis 11 mit Technetium-99 m in der Gegenwart eines Dithionit-Ions, eines Zinn(II)ions oder eines Eisen(II)ions oder eines anderen Reduktionsmittels, oder

(ii) Markieren eines Reagenzes nach einem der Ansprüche 1 bis 11 mit Technetium-99 m durch Ligandenaustausch mit einem präreduzierten Tc- 99 m Komplex.

14. Kit zur Herstellung eines radiopharmazeutischen Präparats, umfassend ein verschlossenes Gefäß, das eine vorbestimmte Menge eines Reagenzes nach einem der Ansprüche 1 bis 11 enthält, und eine ausreichende Menge Reduktionsmittel, um das Reagenz mit Technetium-99 m zu markieren.

15. Verfahren zum Darstellen einer Stelle innerhalb eines Säugerkörpers, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge eines mit Technetium - 99 m markierten Reagenzes nach einem der Ansprüche 1 bis 11 und das Nachweisen des an der Stelle innerhalb des Säugerkörpers lokalisierten Tc- 99 m.

16. Verfahren zur Herstellung des Reagenzes nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Peptid

(i) in vitro chemisch synthetisiert wird, oder

(ii) in vitro durch Festphasen-Peptidsynthese chemisch synthetisiert wird.

17. Stoffzusammensetzung, umfassend

(i) eine Radiomarkierungs-bindende Gruppe der Formel

oder

worin X = H oder eine Schutzgruppe,

(Aminosäure) = eine beliebige Aminosäure, und

wobei die Radiomarkierungs-bindende Gruppe zur Bildung eines Komplexes mit einem Radioisotop fähig ist, und der Komplex aus der Radiomarkierungs-bindenden Gruppe und dem Radioisotop elektrisch neutral ist,

oder

(ii) eine Radiomarkierungs-bindende Bisamino-Bisthiol Gruppe mit einer Formel, ausgewählt aus:

worin R jeweils unabhängig voneinander H, CH&sub3; oder C&sub2;H&sub5; ist, aber wenn X = H, ein R = Y,

(pgp)N = eine Amin-Schutzgruppe oder H,

(pgp)S jeweils unabhängig voneinander eine Thiol- Schutzgruppe oder H ist,

m, n und p unabhängig voneinander 2 oder 3 sind,

X = H oder -A-COOH, aber wenn X = H, ein R = Y und (pgp)N ist nicht H,

Y = -A-COOH,

worin R jeweils unabhängig voneinander H, CH&sub3; oder C&sub2;H&sub5; ist, aber wenn Z = H, ein R = Y,

(pgp)N jeweils eine Amin-Schutzgruppe oder H ist,

(pgp)S jeweils unabhängig voneinander eine Thiol- Schutzgruppe oder H ist,

m, n und p unabhängig voneinander 2 oder 3 sind,

Z = H oder -A-CH(V)NH(pgp)&sub2;N, aber wenn Z = H, ein R = Y,

Y = -A-CH(V)NH(pgp)&sub2;N,

V = H oder COOH,

mit der Maßgabe, daß wenn (pgp)N und V H sind, (pgp)S nicht H ist, und wenn (pgp)S und V H sind, (pgp)N nicht H ist, und wenn V H ist, (pgp),N nicht H ist,

und

worin R jeweils unabhängig voneinander H, CH&sub3; oder C&sub2;H&sub5; ist und ein R = Y,

(pgp)N jeweils eine Amin-Schutzgruppe oder H ist,

(pgp)S jeweils unabhängig voneinander eine Thiol- Schutzgruppe oder H ist,

m, n und p unabhängig voneinander 2 oder 3 sind,

Y = -A-CH(u)NH(pgp)&sub2;N,

V = H oder COOH,

mit der Maßgabe, daß wenn (pgp)&sub2;N und V H sind, (pgp)S nicht H ist, und wenn (pgp)S und V H sind, (pgp)&sub2;N nicht H ist, und mindestens eine (pgp)&sub1;N Gruppe nicht H ist,

wobei die Radiomarkierungs-bindende Gruppe zur Bildung eines Komplexes mit einem Radioisotop fähig ist, und der Komplex aus der Radiomarkierungsbindenden Gruppe und dem Radioisotop elektrisch neutral ist.

18. Zusammensetzung nach Anspruch 17(i), worin die Aminosäure Glycin ist und worin X eine Acetamidomethyl-Schutzgruppe ist.

19. Stoffzusammensetzung, umfassend [N-&epsi;-(N&sup9;-t-butoxycarbonyl)-N&sup6;,N&sup9;-bis[2- methyl-2-(triphenylmethylthio)propyl]-6,9-diazanonanoyl]-N-α-Fmoc-Lysin oder eine andere Verbindung nach Anspruch 17(ii) an die &epsi;-Aminogruppe eines N-α- geschützten Lysins gebunden.

20. Stoffzusammensetzung, umfassend

(i) eine Radiomarkierungs-bindende Gruppe der Formel

oder

worin X = H oder eine Schutzgruppe,

(Aminosäure) = eine beliebige Aminosäure, und

wobei die Radiomarkierungs-bindende Gruppe einen Komplex mit einem Radioisotop bildet, und der Komplex aus der Radiomarkierungsbindenden Gruppe und dem Radioisotop elektrisch neutral ist,

oder

(ii) eine Radiomarkierungs-bindende Bisamino-Bisthiol Gruppe mit einer Formel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

(pgp)N = eine Amin-Schutzgruppe oder H,

(pgp)S jeweils unabhängig voneinander eine Thiol- Schutzgruppe oder H ist,

m, n und p unabhängig voneinander 2 oder 3 sind,

X = H oder -A-COOH, aber wenn X = H, ein R = Y und (pgp)N ist nicht H,

Y = -A-COOH,

(pgp)N jeweils eine Amin-Schutzgruppe oder H ist,

(pgp)S jeweils unabhängig voneinander eine Thiol- Schutzgruppe oder H ist,

m, n und p unabhängig voneinander 2 oder 3 sind,

Z = H oder -A-CH(V)NH(pgp)&sub2;N, aber wenn Z = H, ein R = Y,

Y = -A-CH(V)NH(pgp)&sub2;N,

V = H oder COOH,

mit der Maßgabe, daß wenn (pgp)N und V H sind, (pgp)S nicht H ist, und wenn (pgp)S und V H sind, (pgp)N nicht H ist, und wenn V H ist, (pgp)&sub1;N nicht H ist,

und

(pgp)N jeweils eine Amin-Schutzgruppe oder H ist,

(pgp)S jeweils unabhängig voneinander eine Thiol- Schutzgruppe oder H ist,

m, n und p unabhängig voneinander 2 oder 3 sind,

Y = -A-CH(V)NH(pgp)&sub2;N,

V = H oder COOH,

wobei die Radiomarkierungs-bindende Gruppe einen Komplex mit einem Radioisotop bildet, und der Komplex aus der Radiomarkierungs-bindenden Gruppe und dem Radioisotop elektrisch neutral ist.