DE60217854T2

DE60217854T2 - Herstellung von agonisten und antagonisten von cholecystokinin und ihre therapeutische und diagnostische verwendung

Info

Publication number: DE60217854T2
Application number: DE60217854T
Authority: DE
Inventors: Michele Saviano; Stefania De Luca; Giancarlo Morelli; Diego Tesauro; Carlo Pedone
Original assignee: Bracco Imaging SpA
Current assignee: Bracco Imaging SpA
Priority date: 2001-05-22
Filing date: 2002-05-21
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2022-05-22
Also published as: WO2002094873A3; JP2005503350A; JP4264263B2; AU2002339007A1; ITMI20011057A1; ATE352567T1; US20040254339A1; US7329644B2; DE60217854D1; ITMI20011057A0; WO2002094873A2; EP1390405A2; EP1390405B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft zyklische und verzweigte Peptide der allgemeinen Formel (II) und ihre mit einem Abstandshaltermolekül Y und einem mit einem paramagnetischen oder radioaktiven Metall markierten Chelatbildner C konjugierten Derivate.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden als Diagnostika verwendet, um primäre menschliche Tumore und ihre Metastasen, die Typ A- und/oder Typ B-Cholecystokinin-Rezeptoren überexprimieren, zu identifizieren und zu lokalisieren und als Therapeutika und Cholecystokinin-Agonisten und -Antagonisten eingesetzt.
Cholecystokinine (CCKs) sind eine Familie von Peptidmolekülen, die ihre biologische Wirkung als Hormon und Neurotransmitter erfüllen. Alle CCKs entstehen aus einem Fragmentierungsprozess von einem aus 115 Aminosäureresten bestehenden Prohormon, gefolgt von einem posttranslationalen Prozess, bei dem der C-terminale Phenylalaninrest alpha-amidiert und bisweilen der im C-terminalen Teil enthaltene Tyrosinrest sulfatiert wird. Die Cholecystokinine existieren daher in verschiedenen molekularen Formen; die wichtigsten besitzen eine Sequenz von 58, 39, 33 oder 8 Aminosäureresten und sie besitzen alle dieselbe C-terminale Sequenz von 8 Aminosäureresten:
Asp-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-amid.
Die Form, die nur diese Sequenz enthält, ist als CCK8 bekannt.
Die biologische Aktivität von Cholecystokinin hängt von der Art des Rezeptors ab, mit dem es interagiert. Zwei Arten von Rezeptoren sind bekannt: Typ A und Typ B. In nicht-pathologischen-Situationen ist der Typ A-Rezeptor in den Geweben der periphären Organe vorhanden, wie dem Magen, der Gallenblase, dem Darm und dem Pankreas. Die wichtigsten physiologischen Wirkungen auf Grund der Interaktion des CCK-Peptidhormons mit dem Typ A-Rezeptor sind die Kontraktion der Gallenblase, die Sekretion von Pankreas-Enzymen, die Regulation der Sekretion und die Aufnahme im Magen-Darm-Trakt. Der Typ B-Rezeptor ist hauptsächlich im Zentral-Nervensystem vorhanden, wo die Interaktion mit Cholecystokinin Analgesie, Sättigung und Angst verursacht und die Freisetzung von Dopamin reguliert.
Beide Cholecystokinin-Rezeptoren gehören zur Klasse der G-Protein-gekoppelten-Rezeptoren (GPCRs), Membranrezeptoren mit sieben Transmembranhelices, die durch intra- und extrazelluläre Schleifen mit einem extrazellulären N-terminalen Arm und einem intrazellulären C-terminalen Teil verbunden sind. Beide Rezeptoren besitzen hohe Affinitäten für die verschiedenen Formen des Cholecystokinins; jedoch besitzt der Typ A-Rezeptor eine größere Affinität für die sulfatierten Formen des Cholecystokinins, nämlich zu denen, die eine Schwefelsäuregruppe am Tyr 27-Rest enthalten, während der Typ B-Rezeptor eine hohe Affinität für die verschiedenen Formen des nicht-sulfatierten Cholecystokinins und für Gastrin besitzt. Es ist eine Reihe von peptidischen und nicht-peptidischen Cholecystokininanalogen Molekülen mit agonistischer oder antagonistischer Wirkung für Typ A- und Typ B-Rezeptoren bekannt (P. De Tullio, Current Medicinal Chemistry, 6, 433, 1999; F. Noble, Progress in Neurobiology, 58, 349, 1999). Auf Grund ihrer geringen Bioverfügbarkeit und geringen Löslichkeit oder auf Grund des hohen enzymatischen Abbaus wurde keine pharmakologische Anwendung für eines der bekannten Moleküle gefunden.
Kürzlich sind Cholecystokinin-Rezeptoren in primären menschlichen Tumoren und Metastasen identifiziert worden (J.C. Reubi, Cancer Research, 57, 1377, 1997, WO9731657). Die in der Nuklearmedizin zur Visualisierung von menschlichen Tumoren eingesetzte Verwendung von funktionalen, mit radioaktiven Metallen, wie ¹²⁵I (Biochemical Journal, 89, 114-123, 1963), ¹¹¹In oder ¹¹⁵In markierten Peptiden wird insbesondere in diesem Artikel und in dem von J.C. Reubi zitierten Patent beschrieben.
Der Typ A-Rezeptor wird insbesondere in Pankreas- und Oesophagus-Tumoren überexprimiert, während eine Überexpression des Typ-B-Rezeptors im Haferzelltumor, in Tumoren des Dickdarms und des Magen-Darm-Trakts, in medullären Schilddrüsentumoren, in Astrozytomen und in Bindegewebstumoren des Eierstocks gefunden wurde.
Einige der mit Chelatbildnern von radioaktiven oder paramagnetischen Metallen modifizierten, von Cholecystokinin abgeleiteten Peptide wurden in klinischen Studien untersucht. Insbesondere wurden CCK8-Derivate, welche die Chelatbildner DTPA oder DOTA enthalten, die radioaktive Metalle, wie ¹¹¹In und ⁹⁰Y komplexieren, und ihre Anwendung zur Identifizierung und Behandlung von Tumoren, die den Typ-B-Cholecystokinin-Rezeptor überexprimieren, beschrieben (M. De Jong, Journal of Nuclear Medicine, 40, 2082, 1999).
Kürzlich wurde die NMR-Struktur des Komplexes zwischen dem nicht-sulfatierten CCK8-Peptid und dem N-terminalen Teil des Typ A-Cholecystokinin-Rezeptors, der für die Wechselwirkung mit dem Peptidhormon verantwortlich ist, veröffentlicht (M. Pellegrini, Biochemistry, 38, 14775, 1999). Der N-terminale Teil des Rezeptors (Rezeptorfragment) besteht aus 47 Aminosäuren und verkörpert den extrazellulären N-terminalen Arm und den ersten Teil der Transmembranhelix 1 des Typ A-Rezeptors. Dieses Fragment enthält nicht den auf der Transmembranschleife vorhandenen Rest Arg 197, der für die Wechselwirkung mit der Schwefelsäuregruppe am Tyr 27 des CKK8 verantwortlich ist, mit dem Ergebnis, dass das CCK8-Peptid nicht in der sulfatierten Form verwendet wird (V. Gigoux, Protein Science, 8, 2347, 1999). Zusätzlich zu der ausführlichen, in der NMR-Studie gezeigten, strukturellen Information bestätigte eine kürzlich durchgeführte Studie die Bindung mittels der Beobachtung der Schwankungen der Fluoreszenz des im Rezeptorfragment und im Peptid vorhandenen Tryptophanrests (R. Ragone, Biopolymers, 47-53, 56, 2001) und ermöglichte die Bestimmung der Affinitäts-Konstante zwischen dem nicht-sulfatierten CCK8 und dem Rezeptorfragment.
Kwekkeboom D.J. et al. (Eur. J. of Nuclear Med., vol. 27, No. 9, Sept. 2000 (2000-09), Seiten 1312-1317) zeigen die Abbildung eines Cholecystokinin-Rezeptors unter Verwendung eines Octapeptid-DTPA-CCK-Analogons in Patienten mit einem medullären Schilddrüsenkarzinom.
Beschreibung der Erfindung
Die Verbindungen des Gegenstands der vorliegenden Erfindung sind die zyklischen Peptide der allgemeinen Formel (II)
worin:
Xaa1 und/oder Xaa2 fehlen können; sofern sie vorhanden sind, stellen sie unabhängig voneinander eine beliebige Aminosäure dar, umfassend mindestens einen der folgenden Reste: Methionin, Tyrosin, Tyrosinsulphonat, Lysin, Ornithin, Asparaginsäure, Glutaminsäure;
Xaa3 für Asp oder Glu steht;
Xaa4 für Tyr oder SO₃H-Tyr steht;
Xaa10 für Phe oder eine aus Leu, Ile, Val, Ala, Trp, Gly und Pro ausgewählte Aminosäure steht.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Verbindungen der Formel (II), die entweder unter Verwenndung eines Chelatbildners oder direkt mit radioaktiven oder paramagnetischen Metallen oder radioaktiven Halogenen und den Salzen davon mit physiologisch verträglichen, organischen oder anorganischen Basen oder mit Anionen physiologisch verträglicher organischer oder anorganischer Säuren markiert sind.
Wenn die Sulfatgruppe am Tyrosinrest vorhanden ist (Tyr oder SO₃H-Tyr) wird die Wechselwirkung mit dem Typ A-Cholecystokinin-Rezeptor unterstützt; umgekehrt kann ein nicht-sulfatierter Tyrosinrest (Tyr oder SO₃H-Tyr) die Wechselwirkung mit dem Typ B-Cholecystokinin-Rezeptor mitunter begünstigen.
Der oben verwendete Begriff „beliebige Aminosäure" bezieht sich auf die L- und D-Isomere der natürlichen Aminosäuren und „nicht-Protein"-Aminosäuren, die allgemein in der Peptidchemie eingesetzt werden, um synthetische Analoga der natürlichen Peptide herzustellen, wie an alpha- und beta-Positionen substituierte und nichtsubstituierte alpha-Aminosäuren der L- und D-Konfigurationen und ungesättigte alpha/beta-Aminosäuren.
Beispiele für „nicht-Protein"-Aminosäuren sind Norleucin, Norvalin, Alloisoleucin, Allothreonin, Homoarginin, Thioprolin, Dehydroprolin, Hydroxyprolin, Pipecolinsäure, Azetidinsäure, Homoserin, Cyclohexylglycin, alpha-Amino-n-Buttersäure, Cyclohexylalanin, Aminophenylbuttersäure, an den ortho-, meta- und para-Positionen des aromatischen Rings mono- und di-substituiertes Phenylalanin, O-alkylierte Derivate von Serin, Threonin und Tyrosin, S-alkyliertes Cystein, epsilon-alkyliertes Lysin, delta-alkyliertes Ornithin, an den meta- oder para-Positionen des Ring substituierte aromatische Aminosäuren, wie Phenylalaninnitrat, -sulfat, -phosphat, -acetat, -carbonat, -methylsulfonat, -methylphosphonat, Tyrosinsulfat, -phosphat, -sulfonat, -phosphonat, para-Amido-phenylalanin, C-alpha,alpha-dialkylierte Aminosäuren, wie alpha,alpha-Dimethylglycin (Aib), alpha-Aminocyclopropan-carbonsäure (Ac3c), alpha-Aminocyclobutan-carbonsäure (Ac4c), alpha-Aminocyclopentan-carbonsäure (Ac5c), alpha-Aminocyclohexan-carbonsäure (Ac6c), Diethylglycin (Deg), Dipropylglycin (Dpg), Diphenylglycin (Dph). Beispiele für beta-Aminosäuren sind beta-Alanin (beta-Ala), cis- und trans-2,3-Diaminopropionsäure (Dap).
Andere nicht-Protein-Aminosäuren sind auf der Webseite http://CHEMLIBARY.BRI.NRC.CA/ aufgezeigt.
Insbesondere sind die Peptide der Formel (III-VIII) bevorzugt:
Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden mittels bekannter Verfahren, wie Festphasen-Peptid-Synthese, Peptid-Synthese in Lösung, Syntheseverfahren der organische Chemie oder einer beliebigen Kombination dieser Verfahren synthetisiert. Auf geeigneten Kombinationen der Festphasen-Techniken und der herkömmlichen Verfahren in Lösung, die vor allem im industriellen Maßstab niedrige Produktionskosten verursachen, beruhende Syntheseverfahren werden vorzugsweise eingesetzt. Diese Verfahren umfassen die Festphasen-Synthese des Peptids, umfassend Verzweigungen unter Verwendung von geschützten Aminosäuren mit orthogonalen Funktionen, möglicherweise die Festphasen-Konjugation des Makrozyklus, die Spaltung des geschützten Pep tids vom Harz, die Zyklisierung in Lösung in verdünnten Konzentrationen und die Aufreinigung der Verbindung.
Die gemäß der allgemeinen Formel (II) hergestellten Verbindungen können mit radioaktiven oder paramagnetischen Metallen oder radioaktiven Halogenen entweder direkt oder unter Verwendung eines Chelatbildners markiert werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die Verbindungen der allgemeinen Formel (IX): A-[Y]_z-C (IX)worin
A ein Peptid der allgemeinen Formel (II) ist;
z eine ganze Zahl zwischen 0 und 5 ist;
Y eine Abstandshalterkette ist, jeweils gebunden an eine der an den Seitenketten der individuellen Aminosäuren vorhandenen Funktionalitäten, vorhanden in Peptid A, oder an eine N-terminale (-NH₂)-Gruppe oder an eine C-terminale (-CO₂H)-Gruppe von A und an C; wenn z eine ganze Zahl zwischen 2 und 5 ist, können die Einheiten Y gleich oder unterschiedlich voneinander sein;
C ein Chelatbildner ist, der kovalent an die Abstandshalter-Kette Y oder direkt an das Peptid A oder an mehr als eine der Aminosäureeinheiten des Peptids A gebunden ist, welcher in der Lage ist, ein paramagnetisches Metall oder Radioisotope zu komplexieren.
Y vorzugsweise eine Gruppe der Formel:
ist, worin
r, l und q jedes unabhängig voneinander 0 oder 1 sind und p zwischen 0 und 10 variieren kann unter der Voraussetzung, dass wenigstens eines von l, r und q anders als Null ist;
X ein O-Atom oder eine -NR-Gruppe ist, worin R ein H-Atom oder eine Alkylgruppe (C₁-C₅) ist;
K ein substituierter oder nicht-substituierter Benzolkern oder eine -CHR₁-Gruppe ist, worin R₁ ein Wasserstoffatom oder eine -COOH oder -SO₃H-Gruppe ist;
W eine -CO- oder eine -CS-Gruppe ist.
Die bevorzugten Verbindungen der Formel (IX) sind die, bei denen die Abstandshalter-Ketten [Y]_z durch die folgenden Formeln (X), (XI) und (XII) dargestellt werden.
Besonders bevorzugt werden die Verbindungen (IX), bei denen Y eine der folgenden Gruppen darstellt: -(CH₂)₂-CO-, -(CH₂)₄-NH-, -(CH₂)₄-NH-CO-(CH₂)₂-CO-, -CH₂-Ph-CH₂-CO-, -CH₂-Ph-NH-CS-.
C stellt vorzugsweise einen Chelatbildner dar, ausgewählt aus der Gruppe umfassend:
einen Rest einer Polyaminopolycarbonsäure und den Derivaten davon, insbesondere ausgewählt aus Diethylentriaminopentaessigsäure (DTPA), 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure (DOTA), 1,4,7,10-Tetraazacyclo dodecan-1,4,7-triessigsäure (DO3A), [10-(2-Hydroxypropyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure (HPDO3A), 4-Carboxy-5,8,11-tris(carboxymethyl)-1-phenyl-2-oxa-5,8,11-triazatridecan-13-säure (BOPTA), N-[2-[Bis-(carboxymethyl)amino]-3-(4-ethoxyphenyl)propyl]-N-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethylglycin (EOB-DTPA), N,N-Bis[2-[(carboxymethyl)[(methylcarbamoyl)methyl]amino]-ethyl]-glycin (DTPA-BMA), 2-Methyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure (MCTA), (α, α', α'', α''')-Tetramethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure (DOTMA); oder C ist der Rest von einem Polyaminophosphatsäure-Liganden oder von Derivativen davon, insbesondere N,N'-Bis-(pyridoxal-5-phosphat)ethylen-diamin-N,N'-diessigsäure (DPDP) und Ethylendinitriltetrakis(methylphosphon)säure (EDTP); oder C ist der Rest von einem Polyaminophosphonsäure-Liganden und von Derivativen davon oder Polyaminophosphinsäure und Derivative davon, insbesondere 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetrakis[methylen(methylphosphon)]säure und 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetrakis[methylen-(methylphosphin)]säure; oder C ist der Rest von makrozyklischen Chelaten, wie Texaphrine, Porphyrine, Phthalocyanine; oder C ist N,N-Bis[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl]L-Glutaminsäure (DTPA-GLU) oder mit Lys konjugierte DTPA (DTPA-Lys).
Das zyklische und/oder verzweigte Peptid A kann direkt über eine kovalente Bindung zwischen zwei funktionellen Gruppen von A und C mit dem Chelatbildner C verbunden werden oder über die Abstandshalter-Kette Y und dies kann beispielsweise mit den Säuregruppen des Liganden erreicht werden oder über eine geeignete im Ausgangsliganden vorhandene reaktive Gruppe, beispielsweise eine Aminogruppe oder eine an einem Phenyl etc. vorhandene funktionelle Gruppe.
Besonders bevorzugte, an C oder Y vorhandene reaktive Gruppen sind aus der Gruppe bestehend aus -CO₂H, -NH₂, -NCS, -NHCSNHNH₂, -NHCSNH(CH₂)₂NH₂, -NCO, -NHNH₂, -NHCONHNH₂, -CHO ausgewählt.
Besonders bevorzugt sind die Verbindungen der Formel (IX) in denen C eine Rest des Liganden DTPA, DO3A oder DOTA ist.
Weitere Beispiele für Chelatbildner C, die insbesondere als Chelatbildner für Radionuklide (wie Tc, Re, Cu, Ga) eingesetzt werden können, sind Amino/Amidthiol-Derivate, die durch die allgemeine Formel (XIII) dargestellt werden können, worin J im Bereich von 0 ÷ 2 liegt und im Allgemeinen einen einheitlichen Wert besitzt. (N-Amino/Amid)_4-j(S-Thiol-Derivat)_j (XIII)
Bevorzugte Chelatbildner der Formel (XIII) umfassen N₄-Aminopropylenoxime, Diamindioxime, Hydrazine, N₃S-Triamidmonothiole, N₂S₂-Diamiddithiole, Diamindithiole, Monoamidmonoamindithiole und Monoaminmonoamidithiole.
Eine große Anzahl an Anwendungen der mit Technetium oder Rhenium markierten Chelatbildner der Formel (XIII) sind aus der Literatur bekannt.
Bevorzugte Chelatbildner C der Formel (XIV a), (XIV b), (XIV c) und (XV) für Metallionen und insbesondere für Rhenium oder Technetium sind in EP 629 617 , EP 544 412 , US 5,663,307 bzw. US 5,651,954 offenbart, insbesondere sofern es die Definition der Gruppen Q, R, R*, G1, G2 und R1 betrifft.
Ein weiteres Beispiel für eine Verbindung, die als Chelatbildner C der Formel (XIII) verwendet werden kann, ist Dimethylglycin-L-serin-L-cysteinylglycinamid (XVI), für die gezeigt wurde, dass sie von beträchtlichem Interesse und zur Verwendung als ein bifunktionalisierter Ligand für die Konjugation an Peptide und Proteine und für die Komplexierung des Radionuklids ^99mTc oder ¹⁸⁸Re geeignet ist. Andere Derivate, die als Chelatbildner C eingesetzt werden können, sind in WO9933863 offenbart.
Die Funktionalisierung der Chelatbildner der Formel (XIII) ermöglicht, dass sie als mit kovalenten Bindungen gebundene Konjugate in einem weiten Bereich der biologisch aktiven Moleküle eingesetzt werden können.
Insbesondere in der Herstellung von in nuklearmedizinischen Diagnostiken verwendeten Verbindungen der Formel (IX), sind die Chelatbildner C so ausgewählt, dass entsprechende, stabile Komplexe mit Radioisotopen, die gamma-, beta- oder Positronstrahlung emittieren, unter Verwendung von beispielsweise den Radioisotopen von Tc, Re, Tl, In, Cu, Ga, Rb, oder Y erhalten werden.
Die Verwendung von ^99mTc in nuklearmedizinischen Diagnostiken ist bekannt und besitzt eine Anzahl von Vorteilen, die es zu einem der am häufigsten verwendeten Radionuklide macht. Seine 6-Stunden Halbwertszeit ist zur Verabreichung einer Strahlendosis kurz genug, die ohne Risiko für die Gesundheit des Patienten hochqualitative Bilder liefert.
Es sind ebenfalls viele Verfahren entwickelt worden, welche die Bindung von Tc an verschiedene Moleküle mit biologischer Aktivität, wie Antikörper, Proteine und Peptide ermöglicht.
Die Bindung zwischen dem Molekül und dem Radionuklid wird gewöhnlich durch eine der folgenden Methoden erreicht:

a) direkte Bindung des Radionuklids an das betroffene Molekül, die beispielsweise unter Verwendung eines Reduktionsmittels erfolgt, das die Disulfidbrücken eines Peptids oder eines Pro teins zu zwei Hydrosulfidgruppen reduziert, die Tc(V) direkt binden.
b) Verwendung eines im Allgemeinen bifunktionalisierten, oben beschriebenen Chelatbildners C, bei dem eine der funktionellen Gruppen für die direkte Bindung an das Peptid (oder an die mit A konjugierten Verbindung gemäß der allgemeinen Formel Y) und die andere zur Komplexierung des Radionuklids verwendet wird, was je nachdem vor oder nach der Bindung mit dem biologisch aktiven Molekül durchgeführt wird (vorgefertigtes Chelat oder Endschritt-Markierungs-Methode).

Der radioaktive Komplex wird mittels der in der Literatur beschriebenen Verfahren hergestellt, wie der Reaktion des funktionalisierten Chelatbildners mit einem Salz, wobei vorzugsweise Tc-99m-Pertechnetat verwendet wird, in der Anwesenheit eines geeigneten Reduktionsmittels.
Die verwendeten Reduktionsmittel umfassen die in der Literatur beschriebenen, wie Dithionit, Eisen- und Zinnionen (z.B. Tartrat, Chlorid und Fluorid) oder andere Festkörper-Reduktionsmittel.
Diese Art des Komplexes wird üblicherweise mit einem inaktiven, vorher unter aseptischen Bedingungen hergestellten, diagnostischen Kit hergestellt, der eine bestimmte Menge von der mit dem Chelatbildner konjugierten Verbindung in Form eines gefriergetrockneten Pulvers und von dem Reduktionsmittel enthält, die beide in Anwesenheit von geeigneten Stabilisierungsmitteln, Tensiden und/oder Puffern formuliert wurden, die zur Herstellung des pharmazeutischen Massenproduktes verwendet werden können.
Die den Chelatbildner enthaltende Lösung wird üblicherweise entsprechend formuliert und anschließend auf Fläschchen verteilt, die gefriergetrocknet und unter Stickstoffatmosphäre verschlossen werden, um sicherzustellen, dass die Eigenschaften des in der Zusammensetzung vorhandenen Reduktionsmittels (z.B. Zinnchlorid) erhalten bleiben.
Die derart hergestellten inaktiven Kits werden anschließend beispielsweise mit einer Natriumpertechnetat-Lösung wieder gelöst, um die entsprechenden Komplexe mit ^99mTc zu bilden, die in radiologischen Diagnostiken zu funktionellen und morphologischen Untersuchungen von Organen des menschlichen Körpers verwendet werden und insbesondere die erfindungsgemäßen Verbindungen, die zur Abbildung von Tumoren verwendet werden, die Cholecystokinin-Rezeptoren überexprimieren.
Wong et al. haben die Verwendung von radioaktiven Rhenium-Isotopen, vor allem im Koordinationszustand (V), als Alternative zu Technetium-Isotopen vorgeschlagen (Wong, Inorganic Chemistry, vol. 36, 5799-5808, 1997) und es wurde belegt, dass die Isotope ¹⁸⁶Re und ¹⁸⁸Re von besonderem Interesse in der Nuklearmedizin sind, da sie eine große Anzahl an Anwendungen in der radiopharmazeutischen Therapie besitzen.
Eine andere Klasse an Chelatbildnern C, die für die Konjugation mit den erfindungsgemäßen Verbindungen geeignet sind und nicht nur als Chelatoren von paramagnetischen Metallen (MRI), sondern auch von radioaktiven Metallen (Radiotherapie und Radiodiagnostiken) verwendet werden können, besteht aus den Polyazamakrozyklen der Formel (XVII). Diese Chelatbildner enthalten mindestens eine Amin-, Thiol-, Carboxyl- oder Carboxylderivat-Gruppe oder ein Thiocarboxylat, das als freie funktionelle Gruppe vorliegt und zur Verwendung in der Konjugationsreaktion mit der Abstandshalterkette Y oder mit dem Peptid A, gemäß der allgemeinen Formel (IX), geeignet ist.
Für eine vollständige Beschreibung der Verbindungen der Formel (XVII) siehe US 6,093,382 .
Die Verbindungen (II) und (IX) können Chelate mit den bitrivalenten Ionen der Metallelemente bilden, deren Ordnungszahl zwischen 20 und 31, 39, 42, 43, 44, 49 und zwischen 57 und 83 beträgt, mit radioaktiven Isotopen von Metallen oder Halogenen (¹²³I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ⁷⁴Br, ⁷⁷Br und ⁸²Br) oder paramagnetischen Metallen (^99mTc, ²⁰³Pb, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷²As, ¹¹¹In, ¹¹³In, ⁹⁰Yt, ⁹⁷Ru, ^82mRb, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁵²Fe, ^52mMn, ¹⁴⁰La, ¹⁷⁵Yb, ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ¹⁴⁹Pm, ¹⁷⁷Lu, ¹⁴²Pr, ¹⁵⁹Gd, ²¹²Bi, ⁴⁷Sc, ¹⁴⁹Pm, ⁶⁷Cu, ¹¹¹Ag, ¹⁹⁹Au, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁶Re, ¹⁶¹Tb und ⁵¹Cr), möglicherweise in Form von Salzen mit physiologisch verträglichen Basen oder Säuren.
Besonders bevorzugt sind die Komplexe mit Fe(²⁺), Fe(³⁺), Cu(²⁺), Cr(³⁺), Gd(³⁺), Eu(³⁺), Dy(³⁺), La(²⁺), Yb(³⁺) oder Mn(²⁺) oder mit Radioisotopen, wie ⁵¹Cr, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ¹¹¹In, ^99mTc, ¹⁴⁰La, ¹⁷⁵Yb, ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ⁹⁰Y, ¹⁴⁹Pm, ¹⁷⁷Lu, ⁴⁷Sc, ¹⁴²Pr, ¹⁵⁹Gd und ²¹²Bi.
Bevorzugte Kationen anorganischer Basen, die zur Salzbildung der erfindungsgemäßen Komplexe geeignet sind, umfassen insbesondere Alkali- oder Erdalkalimetallionen, wie Kalium, Natrium, Kalzium, Magnesium.
Bevorzugte Kationen organischer Basen umfassen die der primären, sekundären und tertiären Amine, wie Ethanolamin, Diethanolamin, Morpholin, Glucamin, N-Methylglucamin, N,N-Dimethylglucamin.
Bevorzugte Anionen anorganischer Säuren umfassen insbesondere die Ionen der Halosäuren, wie Chloride, Bromide, Iodide oder andere Ionen wie Sulfat.
Bevorzugte Anionen organischer Säuren umfassen die der Säuren, die konventionell in einem pharmazeutischen Verfahren zur Salzbildung von basischen Substanzen verwendet werden, wie Acetat, Succinat, Citrat, Fumarat, Maleat, Oxalat.
Bevorzugte Kationen und Anionen der Aminosäuren umfassen beispielsweise die von Taurin, Glycin, Lysin, Arginin oder Ornithin oder von den Asparagin- und Glutaminsäuren.
Die Verbindungen (II) und (IX) sind auch als Cholecystokinin-Agonisten oder -Antagonisten und nach der Markierung entweder unter Verwendung eines Chelatbildners oder direkt mit radioaktiven oder paramagnetischen Metallen oder radioaktiven Halogenen als Therapeutika und Diagnostika verwendbar, um primäre menschliche Tumore und ihre Metastasen, die Typ A- und/oder Typ B-Cholecystokinin-Rezeptoren überexprimieren, zu identifizieren und zu lokalisieren. Auf die Bindung an den Rezeptor kann ein Internalisierungsprozess in die Zelle folgen.
Insbesondere wurde gezeigt, dass die mit paramagnetischen Metallen markierten Verbindungen der Formel (IX), nützliche Kontrastmittel für die Magnetresonanz sind, vor allem für die Abbildung von tierischen Tumorzellen, die Typ A- und/oder Typ B-Cholecystokinin-Rezeptoren überexprimieren.
Die Verbindungen (II) besitzen besondere Merkmale, die sie für die oben beschriebenen Zwecke geeignet machen, wobei:

a) sie nehmen in Lösung eine derartige Struktur an, dass sie spezifisch mit Typ A- und/oder Typ B-Cholecystokinin-Rezeptoren interagieren können und mindestens eine vergleichbare Affinität bezüglich CCK8 haben;
b) als Ergebnis der Anwesenheit des Zyklus sind sie besonders stabil gegenüber enzymatischem Abbau unter physiologischen Bedingungen;
c) sie nehmen eine solche Konformation an, dass die Anwesenheit eines chelatierenden Substituenten nicht die Bindung an den Rezeptor behindert.

Verbindungen der Formel (IX) können mittels konventioneller Synthesemethoden hergestellt werden. Insbesondere kann eine Verbindung der Formel (IX) mittels der konvergenten Synthese erhalten werden, umfassend:

1) Synthese eines funktionalisierten Liganden, und zwar eines Liganden, der in der Lage ist ein paramagnetisches Metallion oder das Isotop eines radioaktiven Metalls zu koordinieren, der ebenso stabil, entweder direkt oder mittels einer geeigneten funktionellen Gruppe an das Peptid binden kann;
2) Synthese des Peptids;
3) Kopplungsreaktion zwischen den zwei verschiedenen Synthons, einschließlich der Verwendung der Abstandshaltereinheit Y;
4) Abspaltung jeglicher Schutzgruppen;
5) Komplexierung mit einem paramagnetischen oder radioaktiven Metallion.

Die zwei Synthons werden mittels verschiedener bekannter, weithin in der Synthese verwendeter Kopplungsverfahren konjugiert (siehe beispielsweise Brinkley, M., Bioconjugate Chem. 1992, 3, 2), die beispielsweise die Bildung eines Amids, eines Thioharnstoffs oder eines Esters umfassen.
In der Therapie und Diagnose verwendete radioaktive Halogene sind bekannt. Beispielsweise ist ¹²³I für seine Verwendung bei der Abbildung bekannt, während ¹³¹I nicht nur bei der Abbildung sondern vorzugsweise in der Therapie verwendet werden kann. Die Bromradionuklide ⁷⁵Br und ⁷⁶Br werden für die Diagnose verwendet, während ⁷⁷Br in der Radiotherapie verwendet wird. ¹⁸F und ²¹¹At werden in der Diagnose und in der Radiotherapie eingesetzt.
Wenn das Radionuklid ein Isotop eines radioaktiven Halogens ist, kann es direkt mittels der Reaktion mit einem Trp- oder Tyr-Rest an das Peptid (I) gebunden werden.
Die Verfahren zur Markierung mit Iodisotopen umfassen nicht nur die direkte Iodierung mittels oxidativer Verfahren, sondern auch die nukleophile Substitutionsreaktion und die Isotop-Austauschreaktion. Die Wahl der Markierungsmethode hängt in diesem Falle von der Struktur des Vorläufers, den mit den Reinigungsverfahren verknüpften Problemen und der Kosteneffizienz des verwendeten Verfahrens ab.
Ein Beispiel für ein indirektes Markierungsverfahren mit radioaktiven Halogenen, das bei Verbindungen der Formel (II) verwendet werden kann, wird in US 5,290,937 beschrieben, das es erlaubt, die radiomarkierten Proteine der Formel (XVIII) zu erhalten:
worin X ein aus ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹²³I, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br und ⁷⁷Br ausgewähltes Radionuklid ist und A die oben für Verbindungen der Formel (II) beschriebene Bedeutung hat.
Die Verwendung der entsprechenden, mit Radioisotopen markierten Verbindungen, die gamma-Strahlen oder alpha- oder beta-Teilchen emittieren, ermöglicht es, eine ausreichende Produktmenge mit einen zytotoxischen Effekt auf die fragliche Stelle zu übertragen. Der radioaktive Zerfall des Isotops wird an der Tumorbindungsstelle erzeugt und verursacht die Anwesenheit einer ausreichenden Menge lokaler, ionisierender Strahlung, die für die Tumorzellen toxisch ist.
Die Bindungsspezifität für die Zellen, die Cholecystokinin-Rezeptoren überexprimieren, ermöglicht es, mit diesen Verbindungen die Exposition der normalen Zellen mit den zytotoxischen Mitteln zu verringern, um somit eine erfolgreiche Behandlung mit geringeren Nebenwirkungen bereit zu stellen.
Im Falle von Verbindungen der Formel (II) und (IX) sind sowohl lösliche, als auch weniger lösliche Verbindungen für die orale oder parenterale Verabreichung geeignet.
Verbindungen für die parenterale Verabreichung werden vorzugsweise als sterile, wässrige Suspension oder Lösung formuliert, deren pH beispielsweise zwischen 6,0 und 8,5 schwanken kann.
Diese wässrigen Suspensionen oder Lösungen können in Konzentrationen, die zwischen 0,002 und 1,0 molar schwanken, verabreicht werden.
Diese Rezepturen können in Form von Pulvern gefriergetrocknet und zum Zeitpunkt der Verwendung wieder gelöst werden. Für die gastrointestinale Verwendung oder für die Injektion in Körperhöhlen können diese Mittel als Suspension oder Lösung formuliert werden, die geeignete Zusätze enthält, um beispielsweise ihre Viskosität zu regulieren.
Für die orale Verabreichung können sie in Übereinstimmung mit den üblicherweise in der pharmazeutischen Technik verwendeten Herstellungsverfahren formuliert werden, möglicherweise als beschichtete Rezeptur, um einen zusätzlichen Schutz gegen den sauren pH des Magens bereit zu stellen; dies verhindert die Freisetzung des chelatierten Metallions, die insbesondere bei den für den Magensaft typischen pH-Werten auftritt.
Andere Hilfsstoffe, wie Süßstoffe und/oder Aromastoffe können ebenfalls in Übereinstimmung mit den bekannten Techniken zugegeben werden.
Die entsprechend formulierten Verbindungen der Formel (II) und (IX) sind insbesondere zur Visualisierung von Pankreas- und Oesophagus-Tumoren und anderen Tumoren nützlich, die Typ A-Cholecystokinin-Rezeptoren überexprimieren und für Tumore der Haferzellen der Lunge, des Dickdarms und des Magen-Darm-Trakts, in medullären Schilddrüsentumoren, in Astrozytomen, in Bindegewebstumoren des Eierstocks und anderen Tumoren, die Typ B-Cholecystokinin-Rezeptoren überexprimieren.
Der experimentelle Teil beschreibt die Synthese der Verbindung der Formel (IV).
Die Verbindung der Formel (IV) zeigt ein Konformationsverhalten, dass dem des NMR-Komplexes zwischen dem CCK8-Peptid und dem CCK-A-Rezeptor ähnlich ist.
1 zeigt:

a) die Struktur des in dem Komplex mit dem N-terminalen Fragment 1 – 47 des Typ A-CCK-Rezeptors aufgenommenen CCK8-Peptids, wie von M. Pellegrini in Biochemistry, 38, 14775, 1999 berichtet wird und
b) die erwartete Struktur der zyklischen Verbindung der Formel (IV).

Die Struktur des Komplexes zwischen nicht-sulfatiertem CCK8-Peptid und dem für die Wechselwirkung mit dem Peptidhormon verantwortlichen N-terminalen Teil des Typ A-Cholecystokinin-Rezeptors ist in der Protein Daten Bank (http://www.rcsb.org) unter dem Code "pdb1D6G.ent" hinterlegt worden. Der N-terminale Teil des Rezeptors (Rezeptorfilament) besteht aus 47 Aminosäureresten und stellt den extrazellulären N-terminalen Arm und den ersten Teil der Transmembranhelix 1 des Typ A-Rezeptors dar.
Die mittels NMR-Spektroskopie durchgeführte Untersuchung der Struktur des Komplexes (Fragment 1 – 47 des Typ A-CCK-Rezeptors und CCK8-Peptid) und die anschließende mittels Fluoreszenz-Spektroskopie durchgeführte Bindungsstudie wurden mit dem CCK8-Peptid in der nicht-sulfatierten Form ausgeführt.
Liste der Abkürzungen
Für die Nomenklatur und die Abkürzungen der Aminosäuren wird auf die Empfehlungen der IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (Eur. J. Biochem. 1984, 138, p. 9) verwiesen; die Aminosäuren liegen in der L-Konfiguration vor, wenn es nicht anders angegeben wird.
Die anderen verwendeten Abkürzungen lauten:
Orn = Ornithin, Nle = Norleucin, Hyp = Hydroxyprolin, delta-Pro = Dehydroprolin, delta-Glu = alpha-beta-Dehydroglutaminsäure, alpha-Me-Glu = alpha-Methylglutaminsäure, Cha = Cyclohexylalanin, At = Alloisoleucin, Chg = Cyclohexylglycin, Sar = Sarcosin, Deg = Diethylglycin, Dpg = Dipropylglycin, Aib = alpha-Aminoisobuttersäure, Dap = 2,3-Diaminopropionsäure, Dab = 2,4-Diaminobuttersäure, epsilon-Aca = epsilon-Aminokapronsäure, delta-Ava = delta-Aminobaldriansäure, beta-Ala = beta-Alanin, Ac₃c = alpha-Aminocyclopropancarbonsäure, Ac₄c = alpha-Aminocyclobutancarbonsäure, Ac₅c = alpha-Aminocyclopentancarbonsäure, Ac₆c = alpha-Aminocyclohexancarbonsäure, alpha-Ac₅c = alpha-Aminocyclopentancarbonsäure, alpha-Ac₆c = alpha-Aminocyclohexancarbonsäure, NO₂-Phe = Nitrophenylalanin, SO₃H-Phe = sulfoniertes Phenylalanin, PO₃H₂-Phe = phosphoniertes Phenylalanin, PO₄H₂-Phe = Phenylalaninphosphat, SO₄H-Phe = Phenylalaninsulfat, SO₃H-Tyr = m-sulfoniertes Tyrosin, PO₃H₂-Tyr, = m-phosphoniertes Tyrosin, Boc = tert-Butoxycarbonyl, Fmoc = Fluorenylmethoxycarbonyl, TFA = Trifluoressigsäure, DCM = Dichlormethan, DIEA = Diisopropylethylamin, DMF = Dimethylformamid, Obzl = Benzylether, EDT = Ethandithiol, TIS = Triisopropylsilan, HATU = O-(7-Azabenzotriazol-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronimtetrafluorborat, PyBop = Benzotriazol-1-yl-oxitrispyrrolidiniumphosphoniumhexafluorphosphate, Trt = Trityl, Pmc = 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl, Mtt = 4-Methyltrityl, Dde = 1-(4,4-Dimethyl-2,6-dioxocyclohexylden)-ethyl, Opfp = Pentafluorphenylester, tBu = tert-Butylether, OtBu = tert-Butylester, Ac = Acetyl, HPLC = Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Erfindung weitergehend.
Beispiel 1
Synthese des zyklischen Peptids der Formel (IV):
Das Peptid der Formel (IV) enthält die nicht-natürliche Aminosäure Dap (2,3-Diaminopropionsäure) und dieser Rest wird verwendet, um das zyklische Peptid zu bilden, auf Grund der Bildung einer Amidbindung zwischen der C-terminalen Carboxylgruppe der Aminosäure Lysin und der Aminogruppe in Position 3 der 2,3-Diaminopropionsäure.
Das Peptid wurde mittels der Festphasen-Peptid-Synthese-Strategie synthetisiert unter Verwendung des automatischen Peptid-Synthetisierers für Chargensynthese von Shimadzu. Insbesondere wurde das Verfahren eingesetzt, das die Fmoc-Gruppe als Schutzgruppe der alpha-Aminofunktion verwendet. Die für die Synthese verwendete feste Phase war 2-Chlortritylchloridharz, das aus einem Polystyrolmedium mit 2 % Divinylbenzol besteht, das mit der Chloridgruppe des 2-Chlortrityls funktionalisiert ist; dieses Harz erlaubt es, das an den Seitenketten der Aminosäuren vollständig geschützte Carboxy-C-terminale Peptid mittels Hydrolyse in schwach sauren Bedingungen zu erhalten.
Es wurde ein Syntheserahmen von 0,176 mmol eingesetzt. Dieser Syntheserahmen wurde gemäß des folgenden Verfahrens unter Verwendung von 400 mg Harz erreicht, das vorher teilweise mit der ersten Aminosäure, Fmoc-Lys(Boc)- OH, funktionalisiert worden war. Es wurde ein manueller Chargenreaktor verwendet und der Mangel an Aminosäure (0,6 Äquivalente) im Bezug auf die auf dem Harz vorhandenen funktionellen Gruppen (0,83 mmol/g) wurde an DCM dazugegeben; eine äquivalente Menge an PyBop und 4 DIEA-Äquivalente, im Bezug auf die Menge der eingesetzten Aminosäuren, wurde dazugegeben. Die mMol-Anzahl der an das Harz gebundenen Aminosäure wurde an einem Aliquot abgeschätzt mittels der Bestimmung der Menge der an der alpha-Position der Aminogruppe des Lysinrests vorhandenen und mittels einer basischen, 20 %-igen (Volumenprozent) Piperidin-Lösung in DMF abgelösten Fmoc-Gruppe und der Messung der Absorption des in der UV-Region wirkenden Chromophors (lambda = 290, Epsilon₂₉₀ = 5 × 10³). Nach diesem Verfahren betrug der Grad an Substitution des 2-Chlortrityl-Lys(Boc)-Fmoc-Harzes 0,44 mmol/g. Die Synthese des Peptids wurde dann durch die Übertragung des an die erste Aminosäure (Fmoc-Lys(Boc)-) gebundenen Harzes in den Reaktor des Synthetisierers und mittels Programmierung der Synthese mit dem folgenden Verfahrenablauf vervollständigt: Überschuss der einzelnen Aminosäuren von 2,5 Äquivalenten, Aktivierungsmittel PyBop 1 Äquivalent im Bezug auf die Aminosäure, DIEA 1,5 Äquivalente im Bezug auf die Aminosäure und PyBob, wasserfreies DMF-Lösungsmittel, Kopplungszeit 60 Minuten (Einzelkopplung). Die in der Sequenz verwendeten Aminosäuren waren die folgenden: Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Dap(Dde)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH und Boc-Asp(OtBu)-OH. Wenn der Aufbau des Peptids am Harz abgeschlossen war, wurde die Dde-Schutzgruppe an der Seitenkette des Dap-Rests durch die Behandlung mit 4 %-iger Hydrazin-Lösung in DMF entfernt. Zwei aufeinander folgende Behandlungen von 10 Minuten wurden für diese Entschützungsreaktion verwendet. Als nächstes wurde die Abspaltungsreaktion des teilweise geschützten Peptids vom Harz durchgeführt; das Harz wurde auf ein poröses Septum gelegt und mit einer 0,5 %-igen Lösung (Volumenprozent) von TFA in Dichlormethan für 3-5-Minuten behandelt, wobei dieser Schritt 10 Mal wiederholt wurde. Die saure Waschlösung wurde in einem Kolben mit 10 %-igem Pyridin gesammelt. Nachdem 90 % des Startlösungsmittelvolumens mittels Verdampfen bei vermindertem Druck entfernt worden waren, wurde das Peptid durch Zugabe von kaltem Wasser ausgefällt und anschließend mit Wasser gewaschen. Nach der Kontrolle auf Anwesenheit des Peptids mit allen Schutzgruppen mit Ausnahme der an der Dap-Seitenkette mittels Maldi-Massenspektrometrie (Molekulargewicht 1691), wurde die Zyklisierungs-Reaktion durchgeführt. Die C-terminale Carboxylgruppe des Lysinrests bildete eine Amidbindung mit der Aminogruppe in Position 3 der 2,3-Diaminopropionsäure. Die Reaktion wurde in DMF bei einer Peptidkonzentration von 5 × 10^–4 M durchgeführt durch Zugabe des Aktivators der Carboxylfunktion HATU im Überschuss von 4 Äquivalenten und der DIEA-Base bis zu einem pH von 8,5. Die Mischung wurde unter Rühren für 5 Stunden bei 40 °C gehalten. Das Lösungsmittel wurde dann unter vermindertem Druck entfernt und die Schutzgruppen wurden gemäß des folgenden Verfahrens abgespalten. Das zyklische Peptid wurde in einem Kolben unter Rühren für 2 Stunden mit einer Mischung aus TFA, die EDT (2,5 %), TIS (1 %) und Wasser (2,5 %) enthält, behandelt. Die Homogenität des Rohprodukts wurde mittels analytischer HPLC überprüft; das Rohprodukt zeigte einen Hauptpeak mit einer Retentionszeit von 16,7 Minuten (Säule: Umkehrphase C18; Eluationsmittel: Wasser mit 1 % TFA und Acetonitril mit 1 % TFA; Eluationsgradient: Wasser-Prozentanteil von 80 % bis 20 % in 25 Minuten). Das Produkt wurde mittels präparativer HPLC mit demselben Trennungsverfahren, das auch im analytischen Maßstab verwendet wurde, aufgereinigt. Wie mittels analytischer HPLC bestätigt wurde, war die Reinheit des erhaltenen Produkts größer als 98 %, mit einer Ausbeute, die größer als 50 % der erwarteten theoretischen Ausbeute war. Die Identität des Produkts wurde mittels Maldi-Massenspektrometrie bestätigt, die einen Peak bei dem erwarteten Massenwert von 1202 zeigte.
Beispiel 2
Die Bestimmung der Bindung zwischen den Verbindungen der Formel (IV) und dem Fragment 1 – 47 des Typ A-Cholecystokinin-Rezeptors, CCK_A-R(1-47).
Die Bindung zwischen der wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellten Verbindung und dem Fragment 1 – 47 des Typ A-Cholecystokinin-Rezeptors wurde mittels Fluoreszenz-Spektroskopie untersucht. Obwohl die Verbindung der Formel (IV), da sie keine Sulfat-Funktionen an dem Tyrosinrest enthält, eine größere Affinität für den Typ-B-Cholecystokinin-Rezeptor haben sollte, sind das durchgeführte Experiment und die erhaltenen Ergebnisse vollkommen berechtigt, da das verwendete Rezeptor-Fragment keine Reste (Arg 197) enthält, die dafür bekannt sind, für die Wechselwirkung mit der Sulfatgruppe verantwortlich zu sein. Die Untersuchung der Struktur des Komplexes: Fragment 1-47 des Typ A-CCK-Rezeptors/CCK8-Peptid wurde mittels NMR-Spektroskopie durchgeführt und die anschließende mittels Fluoreszenz-Spektroskopie ausgeführte Bindungsstudie verwendete das CCK8-Peptid in der nicht-sulfatierten Form.
Es wurden das Fragment 1 – 47 des Typ A-Rezeptors, CCK_A-R(1 – 47), und die Verbindung der Formel (IV), beide mittels der Festphasen-Peptid-Synthese-Verfahren synthetisiert, eingesetzt. (Für die Synthese der Verbindung (IV) sollte auf Beispiel 1 verwiesen werden; für die Synthese des Rezeptor-Fragments, siehe R. Ragone, 47-53, 5-6, 2001, Biopolymers).
Die Wechselwirkung zwischen dem Rezeptor-Fragment CCK_A-R(1-47) und der Verbindung (IV) wurde mittels Beobachtung der Tryptophan-Fluoreszenz beobachtet. Die Emissionsspektren wurden bei Raumtemperatur unter Verwendung eines Jasco-FP-750-Spektrofluorimeters bei einer Anregungswellenlänge von 296 nm aufgenommen, um das Tryptophan gezielt anzuregen. Kleine Aliquots einer konzentrierten Lösung von in Phosphatpuffer bei pH 7,2 gelöster Verbindung (IV) wurden zu einem festgelegten Volumen der Lösung von im selben Lösungsmittel gelöstem CCK_A-R(1–47) gegeben, in Anwesenheit einer 10 mM Lösung von Natriumdodecylsulfat-Mizellen, die verwendet wurden, um die Zellmembran zu imitieren. Die für die Berechnungen verwendete Endspektren wurden für Verdünnung und die Verteilungen der einzelnen Moleküle getrennt berichtigt.
Wie in 2 gezeigt, ergibt die Auswertung des Graphen die Stärke der Bindung des Peptids der Formel (IV) an das Fragment 1 – 47 des Typ A-Cholecystokinin-Rezeptors, CCK_A-R(1 – 47), wobei die Rezeptorkonzentration 2,6 μM in 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,2 (Wert wurde mittels der Absorption bei 280 nm bestimmt) in Anwesenheit von 10 mM Lösung der SDS-Mizellen beträgt. Steigende Mengen der Verbindung der Formel (IV) wurden aus einer konzentrierten Master-Lösung, die 10 mM SDS-Mizellen enthält, zugegeben. Die Fluoreszenz wurde bei 335 nm gemessen und die sich aus dem Experiment ergebende Bindungskurve ergibt einen Wert von K_d = 255 nM.
Wie in 2, die eine typische Sättigungskurve veranschaulicht, zu sehen ist, wird das Fluoreszenzsignal als Folge der Bindung schrittweise gelöscht. Die Experimente wurden bei verschiedenen Rezeptorkonzentrationen durchgeführt und die Fluoreszenzlöschung wurde immer beobachtet. Es wurde für jedes gegebene Experiment die gleiche Titrationskurve gefunden, unabhängig von den zur Durchführung der Berechnungen ausgewählten Emissionswellenlänge. Um die durch die Bindung verursachten Veränderungen in der Fluoreszenz abzugrenzen, wurden die Beiträge zur Fluoreszenz vom Rezeptor und vom isolierten Peptid abgezogen und es wurde eine kleine Abweichung in der Fluoreszenz im Vergleich zu dem gemessenen Wert erhalten. Obwohl dies eine große statistische Abweichung umfasst, verhindert es nicht die richtige Bestimmung der Fluoreszenzlöschung. Die verwendeten Fitting-Verfahren ermöglichten die Ermittlung eines K_d-Werts im Bereich von 50-200 nM, mit einem Mittelwert von 120 nM (Standardabweichung ± 27 nM). Dieser Wert liegt in demselben submikromolaren Affinitätsbereich, der für die lineare Bindung des nicht-sulfatierten CCK8 an das Fragment 1 – 47 des Typ A-Rezeptors oder an den vollständigen Typ B-Rezeptor gefunden wurde.
Beispiel 3
Bestimmung der biologischen Aktivität des Peptids der Formel (IV).
Es wurden biologische Tests unter Verwendung von Neuronzellen, die den Typ A-Cholecystokinin-Rezeptor exprimie ren durchgeführt, um die Aktivität der zyklischen Verbindung der Formel (IV) zu bestätigen. Die Aktivität der Verbindung der Formel (IV) wurde mit dem CCK8-Peptid in der nicht-sulfatierten Form am Tyrosinrest verglichen. Beide Verbindungen sollten ein geringeres Aktivitätsniveau zeigen, als die entsprechenden, die Sulfatgruppe am Tyrosinrest enthaltenden Analoga. Die Tests auf biologische Aktivität umfassten die Verwendung von myenterischen Neuronen, als Rezeptor-exprimierende Zellen, und die Verwendung eines konfokalen Mikroskops mit einer geeigneten Software-Ausstattung, zur Messung von Peptidaktivität. Die Test beruhten auf den folgenden Annahmen:

1) Myenterische Neuronen (der Darmwand) exprimieren für gewöhnlich den Typ A-CCK-Rezeptor
2) Die Bindung zwischen CCK und dem Rezeptor umfasst die Erregung der Zelle (Änderung des Membranpotentials), was mittels elektrophysiologischer Untersuchungen aufgezeichnet werden kann
3) Die Erregung der Zelle ist mit dem Durchtritt von Kalzium von der Außenseite auf die Innenseite der Zelle durch spezifische Membrankanäle verbunden.
4) Wenn das Kalzium fluoreszent markiert wird (unter Verwendung von Kalzium-Chelatoren, welche die Emissionswellenlänge verändern, wenn sie bei einer besonderen Wellenlänge angeregt werden), kann die erhöhte Konzentration des intrazellulären Kalziums in Antwort auf einen Stimulus aufgezeichnet werden.
5) Die konfokale Laser Mikroskopie ermöglicht es daher mit Hilfe spezifischer Software diese Phänomene aufzuzeichnen und die Fluoreszenz in die intrazelluläre Kalziumkonzentration umzurechnen.

Wenn die Neuronen nicht-sulfatiertem CCK8-Peptid und dem in Beispiel 1 beschriebenen, zyklischen Analogon ausgesetzt waren (Perfusion für 60 Sekunden) wurde festgestellt, dass beide Substanzen einen Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration hervorrufen.
Das Testverfahren wird in 3 gezeigt. Der Graph, der zwei verschiedene Kurven zeigt, bezieht sich auf dieselbe Zelle zu zwei verschiedenen Zeitpunkten: bevor sie mit nicht-sulfatiertem CCK8-Peptid durchspült wurde und nach dem Waschen (ungefähr 5 Min.) mit dem in Beispiel 1 beschriebenen, zyklischen Peptid der Formel (IV). Die y-Achse zeigt die Fluoreszenzeinheiten und die x-Achse die Perfusionszeit (in Sekunden). Der Graph zeigt einen ersten Maximumpeak (Erregung nach der Perfusion mit 75 mM K⁺), der den verwendeten Stimulus zum Nachweis der Funktionalität der Neuronen darstellt, dann die Antwort auf die CCK8-Peptide und das zyklische Peptid der Formel (IV) und schließlich noch einmal 75 mM K⁺, um die Zell-Vitalität zu bestätigen.
Obwohl das Experiment nicht das Wirkungspotential der beiden Moleküle untersucht, zeigt das Ergebnis, dass das synthetisierte Analogon in der Lage ist, an den spezifischen Rezeptor zu binden und eine Zellantwort hervorzurufen.
Beispiel 4
Herstellung des funktionalisierten zyklischen Peptids der Formel (XIX).
Der Peptidbestandteil der Formel (XIX) ist derselbe, der in Beispiel 1 beschrieben wurde und die im Peptidteil der Verbindung der Formel (IV) vorhandene Seitenkette des Lysinrests und zwar N,N-Bis[2-[bis(carboxymethyl)amino)ethyl]L-Glutaminsäure (DTPA-GLU), wird auch verwendet, um den Chelatbildner kovalent zu binden.
Die Verbindung der Formel (XIX) wurde ähnlich wie Verbindung (IV) mittels der Festphasen-Peptidsynthese-Strategie synthetisiert und unter Verwendung von Synthese-Verfahren in manuellen Reaktoren, wie des automatischen-Peptid-Synthetisierers für die Chargen-Synthese von Shimadzu. Insbesondere wurde das Verfahren verwendet, das die Fmoc-Gruppe als Schutzgruppe für die alpha-Amino-Funktion benutzt. Die für die Synthese verwendete feste Phase war 2-Chlortritylchloridharz, das aus einem Polystyrolmedium mit 2 % Divinylbenzol besteht, das mit der Chloridgruppe des 2-Chlortrityls funktionalisiert ist; dieses Harz erlaubt es, das an den Seitenketten der Aminosäuren voll ständig geschützte Carboxy-C-terminale Peptid mittels Hydrolyse in schwach sauren Bedingungen zu erhalten.
Es wurde ein Syntheserahmen von 0,180 mmol verwendet. Dieser Syntheserahmen wurde in Übereinstimmung mit dem folgenden Verfahren unter Verwendung von 400 mg Harz, das vorher mit der ersten Aminosäure, Dde-Lys-(Fmoc)-OH teilfunktionalisiert wurde, erhalten. Es wurde ein manueller Chargenreaktor verwendet und der Mangel an Aminosäure (0,8 Äquivalente) im Bezug auf die auf dem Harz vorhandenen funktionellen Gruppen (1,08 mmol/g) wurde an DCM dazugegeben; eine äquivalente Menge an PyBop und 4 DIEA-Äquivalente, im Bezug auf die Menge der eingesetzten Aminosäuren, wurde dazugegeben. Die mMol-Anzahl der an das Harz gebundenen Aminosäure wurde an einem Aliquot abgeschätzt mittels der Bestimmung der Menge der an der epsilon-Position der Aminogruppe des Lysinrests vorhandenen und mittels einer basischen, 20 %-igen (Volumenprozent) Piperidin-Lösung in DMF abgelösten Fmoc-Gruppe und der Messung der Absorption des in der UV-Region wirkenden Chromophors (lambda = 290, Epsilon₂₉₀ = 5 × 10³). Nach diesem Verfahren betrug der Grad an Substitution des 2-Chlortrityl-Lys(Boc)-Fmoc-Harzes 0,44 mmol/g. Dann wurde die Fmoc-Schutzgruppe von der Aminofunktion in der epsilon-Position des Lysinrests mittels Behandlung mit einer 20 %-igen Piperidin-Lösung in DMF abgespalten. Zwei aufeinander folgende Behandlungen von 7 Minuten wurden für diese Entschützungsreaktion verwendet. In einem späteren Arbeitsschritt wurde die Kondensationsreaktion des an fünf seiner sechs Carboxylfunktionen mit tert-Butylgruppen geschützten Chelatbildners DTPA-GLU an seiner einzigen freien Carboxylgruppe mit der Aminogruppe an der epsilon-Position des an das Harz gebundenen Lysinrests durchgeführt. Die Reaktion wurde unter Verwendung von HA TU als Aktivator mit einem DTPA-GLU-Überschuss von 2,5 Äquivalenten unter Verwendung der DIEA-Base zur Stabilisierung des pH bei 8,5 durchgeführt. Der Kaiser-Test wurde durchgeführt, um zu bestätigen, dass die Kopplungsreaktion vollständig abgelaufen war. Dann wurde die an der Aminofunktion in der alpha-Position des Lysinrests vorhandene Dde-Schutzgruppe durch die Behandlung mit 4 %-iger Hydrazin-Lösung in DMF abgespalten. Zwei aufeinander folgende Behandlungen von 10 Minuten wurden für diese Entschützungsreaktion verwendet. Dies ermöglichte es, die anschließende Kopplungsreaktion der Aminosäure Fmoc-Phe-OH, wieder mit einem manuellen System, unter denselben Reaktionsbedingungen, wie sie für den Chelatbildner DTPA-GLU beschrieben wurden, durchzuführen. Der Kaiser-Test bestätigte wieder, dass die Kopplungsreaktion vollständig abgelaufen war.
Die Synthese des Peptids wurde dann durch die Übertragung des Lys(Glu-DTPA)-Phe-Fmoc-Harzes in den Reaktor des automatischen Synthetisierers und mittels Programmierung der Synthese mit dem folgenden Verfahrensablauf vervollständigt: Überschuss der einzelnen Aminosäuren von 2,5 Äquivalenten, Aktivierungsmittel PyBop 1 Äquivalent im Bezug auf die Aminosäure, DIEA 1,5 Äquivalente im Bezug auf die Aminosäure und PyBob, wasserfreies DMF-Lösungsmittel, Kopplungszeit 60 Minuten (Einzelkopplung). Die in der Sequenz verwendeten Aminosäuren waren Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Dap(Dde)-OH, Fmoc-Met-OH und Fmoc-Tyr(tBu)-OH und Boc-Asp(OtBu)-OH. Wenn der Aufbau des Peptids am Harz abgeschlossen war, wurde die Dde-Schutzgruppe an der Seitenkette des Dap-Rests durch die Behandlung mit 4 %-iger Hydrazin-Lösung in DMF entfernt. Zwei aufeinander folgende Behandlungen von 10 Minuten wurden für diese Entschützungsreaktion verwendet. Als nächstes wurde die Abspaltungsreaktion des teilweise geschützten Peptids vom Harz durchgeführt; das Harz wurde auf ein poröses Septum gelegt und mit einer 0,5 %-igen (Volumenprozent) TFA-Lösung in Dichlormethan für 3-5-Minuten behandelt, wobei dieser Schritt 10 Mal wiederholt wurde. Die saure Waschlösung wurde in einem Kolben mit 10 %-igem Pyridin gesammelt. Nachdem 90 % des Startlösungsmittelvolumens mittels Verdampfen bei vermindertem Druck entfernt worden waren, wurde das Peptid durch Zugabe von kaltem Wasser ausgefällt und anschließend mit Wasser gewaschen. Nach der Kontrolle auf Anwesenheit des Peptids mit allen Schutzgruppen mit Ausnahme der an der Dap-Seitenkette mittels Maldi-Massenspektrometrie (Molekulargewicht 2320), wurde die Zyklisierungs-Reaktion durchgeführt. Die C-terminale Carboxylgruppe des Lysinrests bildete eine Amidbindung mit der Aminogruppe in Position 3 der 2,3-Diaminopropionsäure. Die Reaktion wurde in DMF bei einer Peptidkonzentration von 5 × 10^–4 M durchgeführt durch Zugabe des Aktivators der Carboxylfunktion HATU im Überschuss von 4 Äquivalenten und der DIEA-Base bis zu einem pH von 8,5. Die Mischung wurde unter Rühren für 5 Stunden bei 40 °C gehalten. Das Lösungsmittel wurde dann unter vermindertem Druck entfernt und die Schutzgruppen an der Seitenkette der Aminosäuren und an den Carboxylfunktionen des DTPA-Chelatbildners wurden gemäß des folgenden Verfahrens abgespalten. Die Peptidverbindung wurde in einem Kolben unter Rühren für 2 Stunden mit einer Mischung aus TFA, die EDT (2,5 %), TIS (1 %) und Wasser (2,5 %) enthält, behandelt. Die Homogenität des Rohprodukts wurde mittels analytischer HPLC überprüft; das Rohprodukt zeigte einen Hauptpeak mit einer Retentionszeit von 16,3 Minuten (Säule: Umkehrphase C18; Eluationsmittel: Wasser mit 1 % TFA und Acetonitril mit 1 % TFA; Eluationsgradient: Wasser-Prozentanteil von 80 % bis 20 % in 25 Minuten). Das Produkt wurde mittels präparativer HPLC mit demselben Trennungsverfahren, das auch im analytischen Maßstab verwendet wurde, aufgereinigt. Wie mittels analytischer HPLC bestätigt wurde, war die Reinheit des erhaltenen Produkts größer als 98 %, mit einer Ausbeute, die größer als 50 % der erwarteten theoretischen Ausbeute war. Die Identität des Produkts wurde mittels Maldi-Massenspektrometrie bestätigt, die einen Peak bei dem erwarteten Massenwert von 1650 zeigte.
Beispiel 5
Herstellung des Indiumkomplexes mit Formel (XX)
Die Verbindung der Formel (XX) wurde mittels der Reaktion der wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellten Verbindung der Formel (XIX) mit Indiumtrichlorid synthetisiert. Das Indiumsalz (II) wurde in einer Lösung von 3 %-igem Zitratpuffer in Wasser gelöst und die sich ergebende Lösung wurde zu einer Lösung gegeben, welche die Verbindung der Formel (XX) und 0,5 Indium-Äquivalente in Wasser bei pH 7,8 enthält. Nach 24 Stunden wurde das Produkt mittels HPLC gereinigt und mittels Maldi-Massenspektrometrie charakterisiert, die einen Peak bei dem erwarteten Massenwert von 1762 zeigte.
Sequenzprotokoll

Claims

Verbindungen der allgemeinen Formel (II):
worin: Xaa1 und/oder Xaa2 fehlen können; sofern sie vorhanden sind, stellen sie unabhängig voneinander eine beliebige Aminosäure dar, umfassend mindestens einen der folgenden Reste: Methionin, Tyrosin, Tyrosinsulphonat, Lysin, Ornithin, Asparaginsäure, Glutaminsäure; Xaa3 für Asp oder Glu steht; Xaa4 für Tyr oder SO₃H-Tyr steht; Xaa10 gleich Phe oder eine Aminosäure ausgewählt aus Leu, Ile, Val, Ala, Trp, Gly und Pro ist, die entweder durch den Einsatz einer Chelat-bildenden Gruppe oder direkt mit radioaktiven oder paramagnetischen Metallen oder radioaktiven Halogenen und Salzen davon mit physiologisch verträglichen organischen oder anorganischen Basen oder mit Anionen physiologisch verträglicher organischer oder anorganischer Säuren markiert sein kann.
Verbindungen nach Anspruch 1, ausgewählt aus:
Verbindungen mit der allgemeinen Formel (IX): A-[Y]_z-C (IX)worin: A ein Peptid nach Ansprüchen 1-2 ist; z eine ganze Zahl zwischen 0 und 5 ist Y eine Abstandshalterkette ist, gebunden an eine der an den Seitenketten der individuellen Aminosäuren vorhandenen Funktionalitäten, vorhanden in Peptid A, oder an eine N-terminale (-NH₂) Gruppe oder an eine C-terminale (-CO₂H) Gruppe von A und an C; wenn z eine ganze Zahl zwischen 2 und 5 ist, können die Einheiten Y gleich oder unterschiedlich voneinander sein, C ein Chelatbildner ist, der kovalent an die Abstandshalter-Kette Y oder direkt an das Peptid A oder an eine Anzahl der Aminosäureeinheiten des Peptids A gebunden ist, welcher in der Lage ist, ein paramagnetisches Metall oder ein Radioisotop zu komplexieren, deren Komplexe mit radioaktiven Isotpen oder paramagnetischen Metallen und Salzen davon mit physiologisch verträglichen organischen oder anorganischen Basen oder mit Anionen physiologisch verträglicher organischer oder anorganischer Säuren.
Verbindungen nach Anspruch 3, worin C ausgewählt ist aus: EDTA, DTPA; EOB-DTPA; BOPTA; DTPA-BMA; DTPA-GLU; DTPA-Lys; DOTA; DOTMA; DO3A; HPDO3A; MCTA; DPDP; EDTP; 1,4,7,10-Tetraazacyclododecano-1,4,7,10-tetrakis[methylen(methylphosphin)]säure; 1,4,7,10-Tetraazacyclododecano-1,4,7,10-tetrakis[methylen-(methylphosphon)]säure; Texaphyrin, Porphyrin, Phthalocyanin, Verbindungen der Formel (XIII); (N-Amino/Amido)_4-j(S-Thiol-Derivat)_j (XIII), worin j einen ganzzahligen Wert von 0, 1 oder 2 hat.
Verbindungen nach Anspruch 3 oder 4, worin: Y eine Gruppe der Formel:
ist, worin r, l und q jedes unabhängig voneinander 0 oder 1 sind und p zwischen 0 und 10 variieren kann unter der Voraussetzung, dass wenigstens eines von l, r und q anders als Null ist; X ein O-Atom oder eine -NR-Gruppe ist, worin R ein H-Atom oder eine Alkylgruppe (C₁-C₅) ist; K ein substituierter oder nicht-substituierter Benzolkern oder eine -CHR₁-Gruppe ist, worin R₁ ein Wasserstoffatom oder eine -COOH oder -SO₃H-Gruppe ist; W eine -CO- oder eine CS-Gruppe ist.
Verbindungen nach Ansprüchen 3 und 4, worin die Abstandshalterkette [Y]z die folgende Formel (X) hat:
worin R, R₁ l, r, p, q und z die oben bestimmten Bedeutungen haben.
Verbindungen nach Ansprüchen 3 und 4 worin die Abstandshalterkette [Y]z die folgende Formel (XI) hat:
worin R, R₁, l, r, p, q und z die oben bestimmten Bedeutungen haben.
Verbindungen nach Ansprüchen 3 und 4, in denen die Abstandshalterkette [Y]z die folgende Formel (XII) hat.
worin R, R₁, W, l, r, p, q und z die oben bestimmten Bedeutungen haben.
Verbindungen nach Ansprüchen 3 bis 8, worin Y eine der folgenden Gruppen ist: -(CH₂)₂-CO-, -(CH₂)₄-NH-, -(CH₂)₄-NH-CO-(CH₂)₂-CO-, -CH₂-Ph-CH₂-CO-, -CH₂-Ph-NH-CS-.
Verbindungen nach Ansprüchen 3 bis 9, worin C ein Rest aus DTPA, DTPA-Lys, DTPA-Glu oder ein Derivat davon ist.
Verbindungen nach Ansprüchen 3 bis 9, worin C ein Rest aus DOTA oder DO3A oder ein Derivat davon ist.
Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 11 als Cholecystokinin-Agonisten oder -Antagonisten.
Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 11 für die Identifizierung und Lokalisierung primärer tierischer und menschlicher Tumore und deren Metastasen, die Typ A Cholecystokinin-Rezeptoren in größeren Mengen als in nicht pathologischen Situationen überexprimieren.
Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 11 für die Identifizierung und Lokalisierung primärer tierischer und menschlicher Tumore und deren Metastasen, die Typ B Cholecystokinin-Rezeptoren in größeren Mengen als in nicht pathologischen Situationen überexprimieren.
Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 11 für die Identifizierung und Lokalisierung primärer tierischer und menschlicher Tumore und deren Metastasen, die Typ A und/oder B Cholecystokinin-Rezeptoren in größeren Mengen als in nicht pathologischen Situationen überexprimieren.
Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 11 für die Behandlung menschlicher Tumore, die Typ A und/oder B Cholecystokinin-Rezeptoren in größeren Mengen als in nicht pathologischen Situationen überexprimieren.
Pharmazeutische oder diagnostische, Kontrastgraphische oder szintigraphische Zusammensetzung umfassend ein Chelat nach Ansprüchen 1 bis 11 oder ein Salz davon.
Diagnostischer Kit für die Herstellung einer radiopharmazeutischen Zusammensetzung, worin der Kit ein aseptisch verschlossenes Gefäß umfasst, welches eine vorbestimmte Menge einer Verbindung nach Ansprüchen 1 bis 11 enthält und eine ausreichende Menge an reduzierendem Mittel, welches benutzt wird, um das Reagenz mit Technetium-99m, Rhenium-186 oder Rhenium-188 zu markieren.
Gebrauch der Chelate der Verbindungen nach Ansprüchen 1 bis 11 oder der Salze davon, um diagnostische Rezepturen zu erstellen, um Bilder von Organen und/oder Geweben und/oder Zellen des menschlichen oder tierischen Körpers zu erzeugen, unter Verwendung der kernmagnetischen Resonanz oder der Szintigraphie.