DE60216111T2

DE60216111T2 - Peptidkonjugate, deren derivate mit metallischen komplexen und deren verwendung zur bildgebenden magnetischen resonanz

Info

Publication number: DE60216111T2
Application number: DE60216111T
Authority: DE
Inventors: Silvio Aime; Eliana Gianolio; Giancarlo Morelli; Carlo Pedone; Diego Tesauro; Luciano Lattuada; Massimo Visigalli; Lucio Pier ANELLI
Original assignee: Bracco Imaging SpA
Current assignee: Bracco Imaging SpA
Priority date: 2001-08-03
Filing date: 2002-07-26
Publication date: 2007-04-05
Anticipated expiration: 2022-07-27
Also published as: ITMI20011708A1; DE60216111D1; WO2003014157A2; WO2003014157A3; ATE345355T1; JP2005510461A; US20050008573A1; EP1412383B1; JP4216715B2; EP1412383B9; AU2002328981A1; EP1412383A2; ITMI20011708A0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Klasse von Kontrastmitteln zur Verwendung bei der magnetischen Resonanzabbildung (MRI) zur Identifizierung und Lokalisierung von primären humanen Tumoren und ihren Metastasen, die Cholecystokininrezeptoren vom CCK A-Typ und/oder -B-Typ und/oder Somatostatinrezeptoren vom SSTR 1-5-Typ über-exprimieren.
In der medizinischen Diagnostik werden bei Anwendung der magnetischen Resonanzabbildung, die als äußerst wirksame diagnostische Verfahrensweise in der klinischen Praxis angewendet wird, hauptsächlich paramagnetische pharmazeutische Zusammensetzungen verwendet, die vorzugsweise Komplexchelate von zwei-dreiwertigen paramagnetischen Metallionen mit Polyaminopolycarbonsäuren und/oder Derivaten oder Analogen enthalten.
Einige davon werden derzeit in der Klinik als Kontrastmittel für M.R.I. (Gd-DTPA, N-Methylglucaminsalz des Gadoliniumkomplexes mit Diethylentriaminopentaessigsäure, MAGNEVIST^®; Gd-DOTA, N-Methylglucaminsalz des Gadoliniumkomplexes mit 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure, DOTAREM^®; Gd-HPDO3A, Gadoliniumkomplex mit 10-(2-Hydroxypropyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure, PROHANCE^®; Gd-DTPA-BMA, Gadoliniumkomplex mit Diethylentriaminopentaessigsäurebis(methylamid), OMNISCAN^®) verwendet.
Die genannten Kontrastmittel und ihre Derivate werden in den folgenden Druckschriften beschrieben: EP 715 64 , DE-A-3401052, EP 130 934 , US 4 639 365 , US 4 615 879 , EP 65 728 , EP 299795 , EP 230 893 , WO8905802, EP 258 616 , US 4 826 673 . Weitere einschlägige Verbindungen werden in der EP-A-607103, der WO-A-90/2050 und der WO-A-200030688 beschrieben.
Die oben aufgeführten, im Handel erhältlichen Kontrastmittel sind für die gesamte allgemeine Verwendung gestaltet. Tatsächlich wird nach der Verabreichung das MRI-Kontrastmittel in den extracellulären Räumen in verschiedenen Teilen des Körpers verteilt, bevor es ausgeschieden wird. In diesem Sinne verhalten sich diese Mittel in ähnlicher Weise wie iodierte Verbindungen, die für die medizinische Röntgenstrahldiagnose zum Einsatz kommen.
Derzeit besteht ein erhöhter Bedarf für Kontrastmittel mit Zielrichtung auf spezielle Organe. Dieser Bedarf wird durch die derzeit im Handel erhältlichen Produkte noch nicht in angemessener Weise gedeckt.
Eine frühe wirksame Dosis ist in steigendem Ausmaß in der Onkologie erforderlich und eine solche kann nur dann erhalten werden, wenn sehr empfindliche diagnostische Methoden angewendet werden, die dazu imstande sind, pathologische Zustände in ihren sehr frühen Stufen zu erfassen.
In dieser Hinsicht könnte die Verwendung von geeigneten funktionalisierten Kontrastmitteln, die dazu imstande sind, sich selektiv an durch die Tumorzellen über-exprimierten Rezeptoren zu binden, eine äußerst gut geeignete empfindliche Diagnosemethode, die für onkolo gische Untersuchungen geeignet ist, ergeben und zwar insbesondere dann, wenn MRI-Techniken angewendet werden, die erwiesenermaßen empfindlich sind.
Das Somatostatin ist ein Tetradecapeptid, das durch den Hypothalamus erzeugt wird und das eine Anzahl von Aktivitäten auf das Zentralnervensystem, die Bauchspeicheldrüse und den Gastrointestinaltrakt ausübt. Insbesondere hemmt das Somatostatin die Freisetzung von Insulin und Glucagon aus der Bauchspeicheldrüse, die Freisetzung des Wachstumshormons durch den Hypothalamus und es verringert die Magensäuresekretion.
Das Somatostatin wurde zuerst im Jahre 1975 von Guillemin et al. (vergleiche US 3904594 ) charakterisiert und beschrieben. Dieses Tetradecapeptid ist durch eine cyclische Bindung zwischen zwei Sulfhydrylgruppen von zwei Cysteinresten an der 3- bzw. 14-Position des Peptids charakterisiert.
Das Somatostatin übt seine Wirkung durch Bindung an spezielle Rezeptoren aus, die auch an der Oberfläche von Tumorzellen der Bauchspeicheldrüse, des Magens und des Hypothalamus exprimiert sind. Die Somatostatinbindung an die genannten Rezeptoren kann daher für diagnostische und therapeutische Zwecke ausgenutzt werden.
In letzter Zeit sind mindestens fünf Somatostatinrezeptor-Unterklassen gefunden worden, die alle zu der Familie der mit G-Proteinen assoziierten Rezeptoren gehören (vergleiche z.B. US 5 436 155 ; WO 9714715; Biochemical and Biophysical Research Communications, 258, 689-694, 1999).
Weiterhin ist eine Überexpression der Somatostatinrezeptoren bei einer hohen Zahl von menschlichen Tumoren, wie primären oder metastatischen Neuroendocrin-Tumoren, in der Hypophyse, im zentralen Nervensystem, im gastroenteropankreatischen Bereich, in Brusttumoren sowie in Hodgkin- und Nicht-Hodgkin-Lymphomen gefunden worden.
Obgleich das Somatostatin eine weite therapeutische Anwendung hat, hat es doch in vivo eine niedrige Stabilität und seine schnelle Zersetzung in Gegenwart von Peptidasen schränkt seine Verwendbarkeit ein. Daher sind schon ausgedehnte Untersuchungen mit manchen Klassen von Peptidanalogen von Somatostatin, Octreotid, Vapreotid und Lanreotid, durchgeführt worden.
Das Octreotid, das in geeigneter Weise funktionalisiert ist und mit In-111 markiert ist, ist bereits erhältlich (Octreoscan^®) für szintigraphische Diagnose von Tumoren (vergleiche z.B. J. Nucl. Med. 41, 1704-1713, 2000; Current Medicinal Chemistry, 7, 971-994, 2000).
Die Cholecystokinine (CCKs) sind eine Familie von Peptidmolekülen, deren biologische Wirkung als Hormon und als Neurotransmitter erfolgt. Alle CCKs rühren von einem Fragmentierungsprozess her, der bei einem Prähormon, bestehend aus 115 Aminosäureresten, erfolgt, gefolgt von einem post-translationalen Verfahren der alpha-Amidierung des C-terminalen Phenylalaninrestes und manchmal einer Sulfatisierung des Tyrosinrestes, der in dem C-terminalen Teil enthalten ist.
Cholecystokinine liegen daher in verschiedenen molekularen Formen vor, wobei die wichtigsten eine Sequenz von 58, 39, 33 oder 8 Aminosäureresten haben, und sie haben alle die gleiche C-terminale Sequenz von 8 Aminosäureresten:
Asp-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-Amid,
worin der Tyrosinrest sulfatisiert sein kann. Das Octapeptid ist auch als CCK8 bekannt.
Die biologische Aktivität des Cholecystokinins hängt von dem Typ des Rezeptors ab, mit dem es eine Wechselwirkung eingeht. Es sind zwei Typen von Rezeptoren bekannt: Typ A (von Alimentär) und Typ B (vom Gehirn (Brain)). Bei nicht-pathologischen Bedingungen ist der Rezeptor vom Typ A im Gewebe von peripheren Organen, wie dem Magen, der Gallenblase, dem Darm und der Bauchspeicheldrüse, vorhanden. Die wichtigsten physiologischen Wirkungen, die auf eine Wechselwirkung des CCK-Peptidhormons mit dem Rezeptor vom Typ A zurückzuführen sind, sind Kontraktionen der Gallenblase, die Sekretion von pankreatischen Enzymen, die Regulierung der Sekretion und die Absorption im Gastrointestinaltrakt. Der Rezeptor vom Typ B ist hauptsächlich im zentralen Nervensystem vorhanden, wo eine Wechselwirkung mit dem Cholecystokinin eine Analgesie, Sättigung bzw. Übersättigung und Angstzustände hervorruft und die Freisetzung von Dopamin reguliert.
Beide Cholecystokininrezeptoren gehören zur Klasse der G-Protein-gekuppelten Rezeptoren (GPCRs), wobei die Membranrezeptoren mit sieben Transmembranhelices durch intra- und extracelluläre Schleifen mit dem extracellulären N-terminalen Arm und einem intracellulären C-terminalen Teil verknüpft sind. Beide Rezeptoren haben eine hohe Affinität gegenüber den verschiedenen Formen von Cholecystokinin; jedoch hat der Rezeptor vom Typ A eine größere Affinität gegenüber den sulfatisierten Formen von Cholecystokinin, nämlich solchen, die eine Sulfatgruppe auf dem Tyr 27-Rest enthalten, während der Rezeptor vom Typ B eine hohe Affinität gegenüber verschiedenen Formen von nicht-sulfatisierten Cholecystokininen und für Gastrin hat. Es ist schon eine Reihe von Peptid- und Nicht-Peptid-Cholecystokinin-analogen Molekülen mit einer agonistischen oder antagonistischen Aktivität gegenüber Rezeptoren vom Typ A und vom Typ B bekannt (P. De Tullio, Current Medicinal Chemistry, 6, 433, 1999; F. Noble, Progress in Neurobiology, 58, 349, 1999). Für keines dieser bekannten Moleküle ist aber aufgrund ihrer niedrigen Bioverfügbarkeit und ihrer niedrigen Löslichkeit oder ihrer hohen enzymatischen Zersetzung eine pharmakologische Antwort gefunden worden.
Die Cholecystokininrezeptoren sind oftmals in verschiedenen Tumoren über-exprimiert. Der Rezeptor vom Typ B ist häufig in medullären Schilddrüsentumoren, Tumoren der kleinen Lungenzellen, Astrocytomen, Eierstock-Stroma-Tumoren und in einem geringeren Ausmaß in gastroenteral-pankreatischen Tumoren (vergleiche z.B. WO9851337 und WO9835707), in Brust-, Endometrium- und in Eierstockadenokarzinomen über-exprimiert. Andererseits ist der. Rezeptor vom Typ A in gastroenteral-pankreatischen Tumoren, in Meningiomen und in einigen Neuroblastomen über-exprimiert.
Die Cholecystokininrezeptoren sind neuerdings in sowohl primären humanen Tumoren als auch Metastasen identifiziert worden (J.C. Reubi, Cancer Research, 57, 1377, 1997 und WO9731657). Die Verwendung von funktionellen Peptiden, die mit radioaktiven Metallen, wie ¹²⁵I (Biochemical Journal, 89, 114-123, 1963), ¹¹¹In oder ¹¹⁵In markiert sind, in der Nuklearmedizin zur Sichtbarmachung von menschlichen Tumoren wird ebenfalls von diesem Autor beschrieben. Die genannten Peptide werden mittels einer einzigen Chelat-bildenden Einheit markiert, die für die Radiotherapie oder für radiodiagnostische Zwecke ausreichend sein kann, die jedoch für MRI-Anwendungszwecke nicht ausreichend ist und zwar im Hinblick auf die niedrige Relaxivität, die durch nur ein paramagnetisches Metall, das durch die einzige Chelat-bildende Gruppierung cheliert worden ist, erhältlich ist.
Insbesondere werden unter den oben aufgeführten Tumoren, solche, die durch eine kleine Größe oder ein langsames Wachstum der Zellen charakterisiert sind, durch herkömmliche diagnostische Techniken kaum erfasst. Daher benötigt die Medizin einfache diagnostische Techniken, die sowohl in vitro als auch in vivo für einen oder mehrere Rezeptortypen selektiv sind und die es durch geeignete Bindung ermöglichen, den Tumor zu lokalisieren und die Diagnose hierfür zu erstellen.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung Kontrastmittel für in vivo erfolgende diagnostische Methoden, insbesondere für die MRI-Abbildung, die dadurch erhältlich sind, dass Peptide, abgeleitet von Somatostatin oder Cholecystokinin mit Komplexchelaten mit paramagnetischen Metallionen konjugiert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen der allgemeinen Formel (I): [A]_t[P] – [B]_v (I)worin:
B die folgenden Peptide bedeutet:
Die genannten Peptide werden unter Anwendung von bekannten Verfahren, wie synthetischen Peptid-Herstellungsverfahren, in fester Phase oder in Lösung hergestellt.
A die folgenden Chelat-bildenden Gruppen bedeutet: Ethylendiaminotetraessigsäure (EDTA), Diethylentriaminopentaessigsäure (DTPA), 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure (DOTA), 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure (DO3A), 10-(2-Hydroxypropyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure (HPDO3A), 4-Carboxy-5,8,11-tris(carboxymethyl)-1-phenyl-2-oxa-5,8,11-triazatridecan-13-onsäure (BOPTA), N-[2-[Bis(carboxymethyl)amino]-3-(4-ethoxyphenyl)propyl]-N-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl]glycin (EOB-DTPA), N,N-Bis[2-(carboxymethyl)[(methylcarbamoyl)methyl]amino]ethyl]glycin (DTPA-BMA), 2-Methyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure (MCTA), (α,α',α'',α''')-Tetramethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure (DOTMA); den Rest eines Polyaminophosphonsäureliganden und Derivate davon, Polyaminophosphinsäure und Derivate davon, insbesondere Ethylendinitrilotetrakis(methylphosphon)säure (EDTP); 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetrakis[methylen(methylphosphon)]säure und 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetrakis[methylen(methylphosphin)]säure; sowie den Rest von makrocyclischen Chelatbildnern, wie Texaphyrinen, Porphyrinen, Phthalocyaninen.
Weitere Beispiele für die in der WO 01/46207 beschriebenen Reste A werden durch die folgenden Formeln angegeben:
Weiterhin ist v eine ganze Zahl von 1 bis 5 und t ist eine ganze Zahl im Bereich von 3 bis 15.
Die Erfindung betrifft auch die Chelate der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) mit zwei-/dreiwertigen Ionen von Metallelementen mit Atomzahlen im Bereich von 21 bis 29, 42, 44 oder von 57 bis 71, mit paramagnetischen Metallen, insbesondere mit Fe, Cu, Cr, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Mn, sowie die Salze davon mit physiologisch verträglichen Basen oder Säuren.
Die Chelate von Fe(2+), Fe(3+), Cu(2+), Cr(2+), Cr(3+), Eu(3+), Gd(3+), Tb(3+), Dy(3+), Ho(3+), Er(3+), Yb(3+), Mn(2+) und Mn(3+) sowie die Salze davon mit physiologisch verträglichen Basen oder Säuren werden bevorzugt.
Besonders bevorzugt werden die Komplexe von zwei-/dreiwertigen Ionen von Eu(3+), Gd(3+), Dy(3+), Mn(2+) und Mn(3+) sowie die Salze davon mit physiologisch verträglichen Basen oder Säuren.
P ist ein Polylysin oder ein Poly-L-lysin oder ein Lys-β-Ala- oder ein Dap-β-Ala-Copolymeres.
Die Peptide der Formel (II) oder (III) binden selektiv an ein oder mehrere Rezeptoren, die als Rezeptoren vom SSTR-Typ 1-5 bekannt sind, und/oder Subtyp-Derivate davon und/oder einen oder mehrere Cholecystokininrezeptor(en) und Derivate davon, die als CCK-A- und/oder CCK-B-Rezeptoren bekannt sind, die auf einem bestimmten Typ von Zellen in einem Gewebe oder einem Organ eines Tieres oder eines Menschen in vitro und/oder in vivo über-exprimiert sind.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als Cholecystokinin-(Rezeptoren vom Typ A und/oder B) und/oder Somatostatin-(Rezeptoren vom SSTR-Typ 1-5)-Agonisten und/oder -Antagonisten sowie als diagnostische MRI-Mittel für Organe, Gewebe und Zellen des menschlichen oder des tierischen Körpers verwendet werden, um primäre Tumore und Metastasen davon, die die genannten Rezeptoren über-exprimieren, zu lokalisieren und zu erfassen.
Beispiele für besonders bevorzugte chelierende Gruppen sind im Schema 1 gezeigt, in dem sie in Form der „freien Säure" aufgeführt sind. Sie werden bei der Komplexbildung mit dem paramagnetischen Metall verwendet. Q bedeutet die bevorzugte Position für die kovalente Bindung mit dem Rest des Moleküls. Schema 1
Acyclische Chelat-bildende Gruppen der Formeln IV, V, VI und VII werden besonders bevorzugt.
Die Anzahl t der Chelat-bildenden Gruppierungen A beträgt vorzugsweise 3 bis 15, mehr bevorzugt 5 bis 10.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) enthalten Polymereinheiten P, die es beispielsweise durch Veränderung ihrer monomeren und/oder oligomeren Zusammensetzung während der Herstellung möglich machen, ihre chemisch-physikalischen Eigenschaften beispielsweise bezüglich der Viskosität, der Löslichkeit und der intrinsischen Stabilität zu beeinflussen, sowie eine hohe Anzahl von Chelat-bildenden Metalleinheiten im Molekül selbst zur Verfügung zu stellen.
Die verwendeten Polymerverbindungen schließen funktionelle wiederkehrende Einheiten, wie Carbonsäure-, Amino-, Hydroxygruppen ein, die mit den paramagnetischen Metall-Chelatbildnern A konjugiert werden können.
Dieser Typ von Verbindungen ist besonders für die MRI-Methode geeignet, da diese Verbindungen es gestatten, eine verhältnismäßig hohe Menge von paramagnetischen Metallionen pro Moleküleinheit zu der Rezeptorenstelle zu befördern, wodurch ein entsprechendes spezifisches Signal mit hoher Intensität selbst bei verhältnismäßig niedrigen molaren Dosierungen induziert wird.
Die Polymerverbindung P kann aus Polypeptiden, wie Polylysin, Polyornithin, Polyarginin, Polyserin, Polyglutaminsäure, Polyasparaginsäure; Polyaminen, wie Polyallylamin, Polyethylenimin; Polyacrylsäurederivaten, wie Poly-N-(2-aminoethyl)methacrylamid, Poly-N-(2-hydroxypropyl)methacrylamid (HPMA); Polyethyleniminopolyessigsäureesterderivaten, Poly(alkylenoxiden), alpha(Polyamino)poly(alkylenoxiden), Poly(ethylenoxid) (PEO), Poly(propylenoxid) (PPO), Poly(butylenoxid), Polyoxypropylenglykol, Polyoxyethylenglykol, Polyoxyalky lenglykol, Polyalkylestern, Polyalkylcyanoacrylaten, Polymethylcyanoacrylaten, Polyethylcyanoacrylaten, Polybutylcyanoacrylaten, Polyisobutylcyanoacrylaten ausgewählt werden. Die Bedeutungen von P schließen auch zusätzlich zu den oben aufgeführten Polymeren Copolymere ein, die beispielsweise durch eine Kombination der oben angegebenen Polymeren erhalten worden sind. Die Polymergruppierungen P sind so funktionalisiert, dass sie eine Bindung mit den Chelat-bildenden Einheiten A gestatten und sie werden mit der Peptidverbindung B konjugiert. Unter den Einheiten P, die mit mehreren Chelat-bildenden Einheiten A pro Molekül konjugiert sind, werden solche mit guter Wasserlöslichkeit sowie geeigneter Viskosität und Stabilität bevorzugt, weil diese Eigenschaften sie für die Konjugation mit dem Peptid B geeignet machen.
Bevorzugte Polymerverbindungen sind z.B. lineare oder verzweigte Polylysine, insbesondere Poly-L-lysine, enthaltend primäre Aminoreste, die diese Verbindungen für die kovalente Bindung mit den Chelat-bildenden Einheiten A direkt an den freien Aminogruppen geeignet machen.
Weitere bevorzugte Gruppen P umfassen Copolymere von zwei oder mehreren Aminosäuren, insbesondere Copolymere von beta-Alanin mit Lysin oder 2,3-Diaminopropionsäure (Dap), wie Lys-β-Ala- und Dap-β-Ala-Copolymere.
Vorzugsweise umfassen die polymeren oder copolymeren Gruppierungen P 2 bis 15, mehr bevorzugt 3 bis 1 monomere oder dimere Einheiten.
Wenn die Polymerverbindung P eine Wiederkehr von Dipeptideinheiten, wie β-Ala-Dap, darstellt, dann wird die Endverbindung, in die die Chelat-bildende Subeinheit bereits eingearbeitet worden ist, durch eine in fester Phase erfolgende Peptidsynthese unter Verwendung des Fmoc-Protokolls und der im Schema 2 angegebenen Untereinheiten bzw. Subeinheiten durchgeführt. Schema 2 H₂N-Gly-geschütztes-CCK8
In dieser Hinsicht wird ein besonders gut geeigneter Baublock dadurch erhalten, dass eine α-Fmoc-geschützte Diaminosäure (wie Dap) mit dem Penta-t-Bu-Ester von DTPA-GLU gekuppelt wird (vergleiche Beispiel 9). Die so erhaltene funktionalisierte Fmoc-geschützte Aminosäure bietet den Vorteil einer gleichzeitigen Einführung der Chelat-bildenden Subeinheit während der Kupplung der Aminosäure mit dem Fmoc-Protokoll. Die genannten Baublöcke, die durch die Formel A'-Dap-Fmoc angegeben werden können, worin A' eine Einheit der Formel A wie oben definiert bedeutet, wobei die Carboxy- oder Phosphongruppierungen in geeigneter Weise geschützt sind, und Dap eine Diaminosäure, speziell die 2,3-Diaminopropionsäure, bedeutet und Fmoc(9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl bedeutet, sind geeignete Zwischenprodukte, die ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind.
Die Komplexe der Verbindungen der Formel (I) mit den oben definierten Metallionen werden nach bekannten Verfahrensweisen hergestellt, zum Beispiel durch Umsetzung der Verbindung, die eine oder mehrere Chelat-bildende Einheiten A enthält, mit dem Oxid oder Halogenid des ausgewählten Metallions.
Insbesondere wird dieses Verfahren in Wasser oder in einem geeigneten Wasser/Alkohol-Gemisch bei Temperaturen im Bereich von 25°C bis 100°C, vorzugsweise 25°C bis 80°C, durchgeführt.
Wenn der resultierende Komplex in dem Reaktionslösungsmittel unlöslich ist, dann wird das feste Produkt abfiltriert. Wenn der Komplex löslich ist, dann kann dieser in geeigneter Weise dadurch gewonnen werden, dass das Lösungsmittel unter Erhalt eines festen Rückstands abgedampft wird, beispielsweise durch Anwendung von Sprühtrocknungstechniken nach der Entsalzung des Gemisches mittels Nanofiltration oder Chromatographie durch ein geeignetes Harz.
Wenn der resultierende Komplex freie Säuregruppen enthält, dann werden solche Gruppen durch Umsetzung mit einer organischen oder einer anorganischen Base in ein Salz überführt. Die resultierende Lösung kann danach konzentriert werden und der resultierende Komplex kann in geeigneter Weise durch Insolubilisierungs- oder Kristallisationstechniken gewonnen werden.
Die Auswahl des Metallions und irgendwelcher neutralisierender Ionen steht in engem Zusammenhang mit dem beabsichtigten Verwendungszweck des Komplexes.
Das untenstehende Schema 3 zeigt die Herstellung der Verbindung (DTPA-GLU₄(Lys)₂Lys-Gly-Vapreotid, die in Beispiel 3 beschrieben wird, wobei das konjugierte Peptid cyclisch ist und vier DTPA-GLU-Einheiten, die als paramagnetische Metallchelatbildungsgruppen verwendet werden, im Molekül vorhanden sind.
Schema 3
Beispiele für bevorzugte Verbindungen der Formel (I) werden untenstehend aufgeführt:
(DTPA-GLU)₄(Lys)₂Lys-Gly-CCK8
(DTPA-GLU)₃(Lys)₂Lys-Gly-CCK8
(DTPA-GLU)₄(Lys)₂Lys-Gly-Vapreotid
(DO3A-Ar)₄(Lys)₂Lys-Gly-Vapreotid
(Lys(DTPA-GLU)-βAla)₄Lys(DTPA-GLU)-Gly-CCK8
(Lys(DTPA-GLU)-βAla)₉Lys(DTPA-GLU)-Gly-CCK8
(Lys(DTPA-GLU)-βAla)₄Lys(DTPA-GLU)-Gly-Vapreotid
(Lys(DTPA-GLU)-βAla)₉ Lys(DTPA-GLU)-Gly-Vapreotid
(Dap(DTPA-GLU)-βAla)₄-Dap(DTPA-GLU)-Gly-CCK8
(Dap(DTPA-GLU)-βAla)₉-Dap(DTPA-GLU)-Gly-CCK8
(Dap(DTPA-GLU)-βAla)₄-Dap(DTPA-GLU)-Vapreotid
(Dap(DTPA-GLU)-βAla)₉-Dap(DTPA-GLU)-Vapreotid
Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben sich als geeignete MRI-Kontrastmittel erwiesen, und zwar insbesondere für die Abbildung von pathologischen Tumoren bzw. Tumorpathologien und nicht-tumorartigen pathologischen Zuständen, die durch eine Überexpression vom CCK A- und/oder B-Typ und/oder Somatostatin-Typ SSTR-1-5-Rezeptoren charakterisiert sind.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden sowohl bei diagnostischen Methoden in vivo und in vitro, hauptsächlich in Tumorzellen und vorzugsweise in menschlichen Tumorzellen bei Abbildungsverfahren eingesetzt.
Es sollte betont werden, dass sich an die Bindung ein Interrialisierungsprozess anschließen kann.
Die in vitro verwendeten Verbindungen der allgemeinen Formel (I) sind durch hohe Relaxationswerte im Vergleich zu den bekannten, im Handel erhältlichen Kontrastmitteln charakterisiert. Die selektive Bindung des Kontrastmittels an die oben genannten Rezeptoren sowie die Bindung an Makromoleküle, die im umgebenden Medium und/oder im exo- und/oder endocellulären System, in dem die Verbindung vorhanden ist, vorliegen, beispielsweise mit Plasmaproteinen, im cellulären oder intracellulären interstitiellen Raum tragen zu einer hohen Relaxationsfähigkeit bei.
Eine Wechselwirkung mit Makromolekülen kann entweder zuerst mit einer Rezeptorbindung des Kontrastmittels oder in darauf folgenden Phasen nach der Wechselwirkung mit den Komponenten P, B und A erfolgen, die in den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) vorhanden sind. In diesem Sinne kann die Wechselwirkung zwischen dem Kontrastmittel und den Makromolekülen auch durch die Anwesenheit in vivo von Enzymen und/oder von Mikroorganismen (z.B Hydrolasen, Peptidasen, Proteasen, Esterasen und/oder Viren, Bakterien, Hefen) beeinflusst werden, was zu einer in situ erfolgenden Modifizierung des Kontrastmittels führen kann, wodurch die Bindung der Makromoleküle selbst und an die oben genannten Rezeptoren beeinflusst wird.
Weitere Beispiele für Proteine, die dieses Phänomen zeigen, sind z.B. Humanserumalbumin (HSA; sowohl vorhanden im Plasma als auch im interstitiellen Raum, obgleich mit nied rigerer Konzentration), Glutathion-S-Transferase (GST oder Ligandin), Fettsäure-bindende Proteine (FABP, Z-Protein) und alpha-1-Säureglycoprotein (AAC). Die Bindung des Kontrastmittels an das Makromolekül bewirkt in der Tat eine Verringerung der Flexibilität des Moleküls im gebundenen Zustand, und daher des Parameters, der bei der MRI-Analyse als Rotations-Taumel-Zeit oder als Rotations-Korrelations-Zeit bezeichnet wird, was eine Erhöhung der Relaxationsfähigkeit induziert.
Die Wechselwirkung zwischen dem Kontrastmittel und beispielsweise den Proteinkom ponenten auf der Oberfläche von (z.B. mit den oben angegebenen Rezeptoren) oder im Inneren der Zellen beinhaltet eine Erhöhung der Relaxationsrate, die für den MRI-Kontrast typisch ist, wodurch in signifikanter Weise der Gewebekontrast erhöht wird, der in dem MRI-Bild sichtbar gemacht werden kann.
Die bei in vitro-Assays der Verbindungen der Formel (I) erhaltenen Werte der Relaxationsfähigkeit gestatten es, potentielle Anwendungen dieser Verbindungen als Kontrastmittel für die magnetische Resonanzanalyse für die in vivo erfolgende Abbildung von Zellen, Geweben oder Organen, in denen primäre Tumore oder tumorartige pathologische Zustände oder Metastasen vorhanden sind, in Betracht zu ziehen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) in geeigneter Formulierung für die Abbildung von beispielsweise Pankreas- und Ösophagus-Tumoren und von anderen Tumoren mit einer Überexpression von Cholecystokininrezeptoren vom Typ-A, Tumoren der Lunge, des Colons, des Gastrointestinaltrakts, von medullärem Schilddrüsenkarzinom, Astrocytomen, Eierstock-Stroma-Tumoren und anderen Tumoren, bei denen Cholecystokininrezeptoren vom Typ-B über-exprimiert sind. Weiterhin sind sie für die Abbildung von Tumoren (und Metastasen davon) geeignet, bei denen eine Überexpression von Somatostatinrezeptoren vom SSTR-Typ 1-5 erfolgte, wie z.B.: Neuroendokrintumore, Hypophysentumore, Tumore des zentralen Nervensystems, Hodgkin'sche und Nicht-Hodgkin'sche-Lymphome sowie Brust- und gastro-enteropankreatische Tumore.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine MRI-Verfahrensweise, umfassend die Verabreichung einer geeigneten Menge eines erfindungsgemäßen paramagnetischen Komplexes für die Abbildung und Aufzeichnung von Bildern, beispielsweise von Organen von untersuchten Patienten.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind für die orale oder enterale Verabreichung geeignet.
Für die parenterale Verabreichung können sie vorzugsweise als sterile wässrige Lösungen oder Suspensionen formuliert werden, deren pH-Werte im Bereich von 6,0 bis 8,5 liegen können. Diese wässrigen Lösungen oder Suspensionen können in Konzentrationen im Bereich von 0,002 M bis 1,0 M verabreicht werden.
Diese Zubereitungen können lyophilisiert und als solche vertrieben werden, die kurz vor dem Einsatz rekonstituiert werden. Für die GI-Verwendung oder zur Injizierung in Körperhöh len können diese Mittel als Lösungen oder Suspensionen formuliert werden, die geeignete Additive enthalten, beispielsweise zur Kontrolle der Viskosität.
Für die orale Verabreichung können sie nach routinemäßig in der pharmazeutischen Technik verwendeten Herstellungsmethoden formuliert werden oder sie können als beschichtete Zubereitungen formuliert werden, um einen zusätzlichen Schutz vor dem sauren pH-Wert des Magens zu erzielen, wodurch die Freisetzung der Chelat-bildenden Metallionen gehemmt wird.
Die erfindungsgemäßen Zubereitungen umfassen nicht-kovalente Aggregate, wie Micellen, kolloidale Dispersionen, Öl-in-Wasser-Emulsionen, Liposomen, Nanokapseln, Mikroperlen, Einschlussverbindungen, feste Lipid-Nanoteilchen oder Prodrugs, deren Herstellung die Funktionalisierung mit kovalenten Bindungen für geeignete Schutzsysteme erfordert.
Die Herstellung von Liposomen, die die paramagnetischen Kontrastmittel enthalten können, wird in der EP 354 855 , der US 5 013 556 , der WO0011007, der US 6 060 040 , der US 702 722 , der US 5 833 948 , der EP 759 785 , auf die hierin Bezug genommen wird, beschrieben.
Unter der hierin verwendeten Bezeichnung „Prodrugs" sollen Kontrastmittelvorläufer verstanden werden, die nach der Verabreichung die in vivo erfolgende Freisetzung der Verbindung durch einen chemischen und/oder physiologischen Prozess, die eine enzymatische Hydrolyse oder eine Veränderung des pH-Werts ergeben.
Beispiele für Prodrugs sind Verbindungen, bei denen die Carboxylsäurefunktion durch eine Ester- oder Amidogruppe substituiert ist, eine Alkoholfunktion derivatisiert worden ist, um einen Ester oder Ether zu erhalten, eine Aminfunktion mit einer geeigneten Schutzgruppe, die für die in vitro erfolgende Freisetzung des Produkts geeignet ist, substituiert ist. Ein weiteres Beispiel für Prodrugs sind Verbindungen, resultierend aus einer Konjugation in Form von PEG-Derivaten (vergleiche z.B. Biomaterials, 22, 405-417, 2001). Polyethylenglykol (PEG), das in geeigneter Weise mit dem Peptid oder einer funktionellen Gruppe, die in den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) vorhanden sind, konjugiert ist, induziert eine Veränderung ihrer Eigenschaften unter Aufrechterhaltung ihrer biologischen Eigenschaften, wie eine selektive Rezeptorenbindung, eine erhöhte Stabilität gegenüber einem enzymatischen Abbau durch proteolytische Enzyme, chemo-physikalische, Bioverteilungs- und Löslichkeitseigenschaften.
Die pharmazeutische Zubereitung kann weiterhin herkömmliche Exzipientien, wie Süßungsmittel und/oder Aromatisierungsmittel, enthalten.
Die erfindungsgemäßen Zubereitungen sollten in jedem Fall eine Kontrastmittelkonzentration unterhalb der Toxizitätsgrenzen gewährleisten und sie umfassen gegebenenfalls sowohl nicht-kovalente Aggregate (Micellen, feste Lipid-Nanoteilchen, Liposomen, Einschlussverbindungen) und Prodrugs, die durch kovalente Bindung an geeignete Schutzsysteme (z.B. Pegylation) hergestellt werden können.
Bevorzugte Kationen von anorganischen Basen, die für eine Salzbildung mit den erfindungsgemäßen Komplexen geeignet sind, schließen insbesondere Alkali- oder Erdalkalimetallionen, wie von Kalium, Natrium, Calcium und Magnesium, ein.
Bevorzugte Kationen von organischen Basen umfassen solche von primären, sekundären und tertiären Aminen, wie Ethanolamin, Diethanolamin, Morpholin, Glucamin, N-Methylglucamin, N,N-Dimethylglucamin.
Bevorzugte Anionen von anorganischen Säuren, die für eine Salzbildung der erfindungsgemäßen Chelatkomplexe geeignet sind, schließen insbesondere die Ionen von Halogensäuren, wie Chlorid-, Bromid-, Iodid- oder andere Ionen, wie Sulfationen, ein.
Bevorzugte Anionen von organischen Säuren für die oben angegebenen Zwecke schließen solche von Säuren ein, die in herkömmlicher Weise in der pharmazeutischen Technik für die Salzbildung von basischen Substanzen verwendet werden, wie beispielsweise Acetat, Succinat, Citrat, Fumarat, Maleat und Oxalat.
Bevorzugte Kationen und Anionen der Aminosäuren schließen z.B. solche von Taurin, Glycin, Lysin, Arginin oder Ornithin oder solche von Asparaginsäuren und Glutaminsäuren ein.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Ezperimenteller Abschnitt
Benzotriazol-1-yloxytrispyrrolidinophosphoniumhexafluorphosphat (PyBop), 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt), alle Fmoc-Aminosäurederivate (Fmoc = 9-Flurenylmethyloxycarbonyl) und die Rink-Amid-MBHA-Harze wurden von der Firma Calbiochem-Novabiochem (Laufelfingen, CH) gekauft. [O-(7-Azobenzotriazol-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium]hexafluorphosphat (HATU) wurde von Applied Biosystem gekauft. N,N-Bis[2-[bis[2-(1,1-dimethylethoxy)-2-oxoethyl]amino]ethyl]-L-glutaminsäure-1-(1,1-dimethylethyl)ester (das geschützte DTPA-GLU) wurde in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellt. Alle anderen Chemikalien wurden von der Firma Aldrich (Milwaukee, WI, USA) erhalten und, wenn nichts anderes angegeben wird, ohne weitere Reinigung eingesetzt.
Die in der festen Phase erfolgende Peptidsynthese wurde mit einem vollständig automatisierten Synthesegerät mit der Bezeichnung Shimadzu SPPS-8 (Kyoto, Japan) und einem Gerät mit der Bezeichnung ABI Perseptive Biosystem 433 durchgeführt. Die analytischen RP-HPLC-Stufen wurden mit einem Gerät mit der Bezeichnung Shimadzu Modell 10A-LC unter Verwendung einer C₁₈-Säule mit den Abmessungen 4,6 × 250 mm der Firma Phenomex (Torrance, CA, USA) durchgeführt, unter Elution mit H₂O/0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) (A). Die linearen CH₃CN/0,1% TFA (B)-Gradienten betrugen 5% bis 70% B über einen Zeitraum von 30 min bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 mm/min. Präparative RP-HPLC-Stufen wurden mit einem Gerät der Firma Waters (Milford, MA, USA) mit der Bezeichnung Delta Prep 4000 durchgeführt. Letzteres war mit einem UV-Detektor mit der Bezeichnung Lambda-Max Modell 481 ausgerüstet, wobei weiterhin eine C₁₈-Säule mit den Abmessungen 22 × 250 mm mit der Bezeichnung Vydac (Hesperia, CA, USA) verwendet wurde. Es wurde ein linearer Gradient von 20% bis 80% B über einen Zeitraum von 40 min bei einer Fließgeschwindigkeit von 20 ml/min angewendet.
Die Massenspektren wurden unter Verwendung eines Geräts mit der Bezeichnung Maldi-Tof Vojager-DE (Perseptive Biosystem, Foster City, CA, USA) erhalten. Beispiel 1 Synthese des Gadoliniumkomplexes von (DTPA-GLU)₄(Lys)₂Lys-Gly-CCK8
A) Synthese von (DTPA-GLU)₄(Lys)₂Lys-Gly-CCK8
Die Gly-CCK8 (Sequenz: H-Gly-Asp-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH₂)-Synthese wurde in fester Phase unter Verwendung von Standardbedingungen unter Anwendung des Fmoc-Protokolls durchgeführt. Das Rink-Amid-MBHA-Harz (0,54 mmol/g, 54 μmol-Maßstab, 0,100 g) wurde verwendet. Es wurden Doppelkupplungen durchgeführt, wobei zu jedem Zeitpunkt vier Äquivalente von N-geschützten Aminosäuren, aktiviert durch PyBop und HOBt, und acht Äquivalente N,N-Diisopropylethylamin (DIPEA) in DMF zugegeben wurden und wobei 60 min lang gerührt wurde. Nach Beendigung der Peptid-Gly-CCK8-Synthese wurde das Harz in ein Gefäß für die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe überführt, wobei zweimal 1,5 ml eines Gemisches von DMF/Piperidin 70/30 eingesetzt wurden. Vier Äquivalente von Fmoc-Lys(Fmoc)-OH, aktiviert durch PyBop und HOBt, und acht Äquivalente N,N-Diisopropylethylamin (DIPEA) wurden in DMF zugesetzt. Nach der Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppen wurden zwei Reste von Fmoc-Lys(Fmoc)-OH auf die gleiche Weise an die zwei Lysinaminofunktionen gekuppelt, wodurch das vollständig geschützte (Fmoc-Lys(Fmoc))₂Lys-Gly-CCK8-Harz erhalten wurde. Eine kleine Menge des Produkts wurde zur Abspaltung der Schutzgruppe und zur Spaltung behandelt und das rohe Peptid (Lys)₂Lys-Gly-CCK8 wurde durch Analyse des Massenspektrums und durch HPLC analysiert. Nach Bestätigung der Peptididentität wurde das vollständig geschützte (Fmoc-Lys(Fmoc))₂Lys-Gly-CCK8-Harz einer Abspaltung der Fmoc- Schutzgruppen unterworfen und es erfolgte eine DTPA-GLU-Kupplung. Die DTPA-GLU-Kupplung wurde unter Verwendung von 2 Äquivalenten N,N-Bis[2[2-(1,1-dimethylethoxy)-2-oxoethyl]amino]ethyl]-L-glutaminsäure-1-(1,1-dimethylethyl)ester (geschütztes DTPA-GLU), aktiviert durch PyBop und HOBt, und von 4 Äquivalenten DIPEA in DMF durchgeführt; die Rührzeit bei einer einzigen Kupplung betrug 8 Stunden. Für die Abspaltung der Schutzgruppe und die Spaltung wurde das vollständig geschützte konjugierte Peptidharz mit TFA, enthaltend Triisopropylsilan (2,0%), Ethandithiol (2,5%) und Wasser (1,5%) behandelt. Die Rohprodukte wurden durch tropfenweise erfolgende Zugabe von Diethylether bei 0°C ausgefällt. Die Reinigung der rohen Gemische erfolgte durch RP-HPLC und lieferte zwei Hauptprodukte.
(DTPA-GLU)₃(Lys)₂Lys-Gly-CCK8, Rt = 23,6 min
(DTPA-GLU)₄(Lys)₂Lys-Gly-CCK8, Rt = 24,0 min
Die Massenspektren bestätigten die Produktidentitäten:
(DTPA-GLU)₃(Lys)₂Lys-Gly-CCK8, MG = 2843 (berechnet 2842);
(DTPA-GLU)₄(Lys)₂Lys-Gly-CCK8, MG = 3293 (berechnet 3292);
B) Synthese des Gadoliniumkomplexes der Verbindung (DTPA-GLU)₄(Lys)₂Lys-Gly-CCK8.
Eine 1 mM-Lösung von GdCl₃ wurde zu der in der obigen Stufe A erhaltenen Lösung der Verbindung bei Raumtemperatur gegeben, wobei der pH-Wert der Lösung durch weitere Zugabe einer Lösung von NaOH kontinuierlich kontrolliert wurde.
Der MS-Wert bzw. die Massenspektren war im Einklang mit der angegebenen Struktur.
Beispiel 2
Synthese des Gadoliniumkomplexes von (DTPA-GLU)₃(Lys)₂Lys-Gly-CCK8
Eine 1 mM-Lösung von GdCl₃ wurde zu der Lösung von (DTPA-GLU)₃(Lys)_ZLys-Gly-CCK8 (hergestellt wie im obigen Beispiel 1, Stufe A) angegeben) bei Raumtemperatur gegeben, wobei kontinuierlich der pH-Wert der Lösung durch weitere Zugabe einer Lösung von NaOH kontrolliert wurde.
Der MS-Wert war im Einklang mit der angegebenen Struktur.
Beispiel 3 Synthese des Gadoliniumkomplexes von (DTPAGLU)₄(Lys)₂Lys-Gly-Vapreotid
A) Synthese von (DTPAGLU)₄(Lys)₂Lys-Gly-Vapreotid
Es wurde die gleiche Verfahrensweise wie in Beispiel 1 verwendet. (Vapreotidsequenz: D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH₂, Cys²-Cys⁷-S-S-Brücke). Die Cyclisierung der Cysteinbrücke erfolgte in einer wässrigen 0,5 mM-Lösung von Dimethylsulfoxid (DMSO). Die Reinigung des rohen Gemisches wurde durch RP-HPLC durchgeführt und ergab (DTPA-GLU)₄ (Lys)₂Lys-Gly-Vapreotid als Hauptprodukt.
(DTPA-GLU)₄(Lys)₂Lys-Gly-Vapreotid Rt = 25,0 min; MG = 3336 (berechnet 3335).
Der MS-Wert stand im Einklang mit der angegebenen Struktur.
B) Synthese des Gadoliniumkomplexes von (DTPAGLU)₄(Lys)₂Lys-Gly-Vapreotid
Eine 1 mM Lösung von GdCl₃ wurde zu einer Lösung der Verbindung des Beispiels 3A mit Raumtemperatur gegeben. Unter weiterer Zugabe einer NaOH-Lösung wurde der pH-Wert der Lösung kontinuierlich kontrolliert.
Der MS-Wert stand im Einklang mit der angegebenen Struktur.
Die Relaxationsfähigkeit des Komplexes betrug 15 mM^–1 s^–1.
Beispiel 4 Synthese des Gadoliniumkomplexes (DO3A-Ar)₄(Lys)₂Lys-Gly-Vapreotid
A) Synthese von 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure-tris(1,1-dimethylethyl)ester
Das Titelprodukt wurde wie in der WO 95/27705 beschrieben erhalten. Das 10-Formylderivat des 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure-tris(1,1-dimethylethyl)esters (Inorg. Chem. 30, 1265-1269, 1991) wurde mit Hydroxylaminhydrochlorid in rückfließendem wasserfreiem EtOH deformyliert, wodurch das DO3A-Tris(1,1-dimethylethyl)estermonohydrochlorid erhalten wurde.
Dieses Produkt wurde in CH₂Cl₂ und einer wässrigen K₂CO₃-Lösung aufgelöst. Die organische Phase wurde abgetrennt, auf Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und eingedampft, wodurch der DO3A-Tris(1,1-dimethylethyl)ester als freie Base erhalten wurde.
B) Synthese des 10-[[4-(Carboxymethyl)phenyl]methyl]-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure-tris(1,1-dimethylethyl)esters
Eine Suspension von DO3A-Tris(1,1-dimethylethyl)ester wurde in 5 ml Ethanol zu einer Lösung von 4-(Brommethyl)phenylessigsäure (0,934 mmol, 214 mg) in 5,0 ml Ethanol, enthaltend 0,234 ml 4MKOH-Lösung, gegeben. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von 4M KOH-Lösung auf einem Wert von 10-11 gehalten und das Reaktionsgemisch wurde 18 Stunden lang auf 70°C erwärmt. Nach Entfernung des Lösungsmittels unter Vakuum, wurde das Rohprodukt auf Silicagel unter Verwendung eines Gemisches von CH₂Cl₂ und Methanol (90:10) als Elutionsmittel gereinigt. Das Produkt wurde in Form eines weißen Pulvers erhalten (Ausbeute: 80%). Der MS- und der ¹H-NMR-Wert standen im Einklang mit der angegebenen Struktur.
C) Synthese des Gadoliniumkomplexes von (DO3A-Ar)₄(Lys)₂Lys-Gly-Vapreotid
Die Chelat-bildende Verbindung und der entsprechende Gadoliniumkomplex wurden nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren erhalten.
Der MS-Wert stand im Einklang mit der angegebenen Struktur.
Beispiel 5 Synthese des Gadoliniumkomplexes von (Lys(DTPA-GLU)-βAla)₄Lys(DTPA-GLU)-Gly-CCK8
A) Synthese von (Lys(DTPA-GLU)-βAla)₄Lys(DTPA-GLU)-Gly-CCK8 (Sequenz: H-Gly-Asp-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH₂). Die Synthese wurde in fester Phase und bei Standardbedingungen unter Anwendung des Fmoc-Protokolls durchgeführt. Das Rink-Amid-MBHA-Harz (0,54 mmol/g, 54 μmol-Maßstab, 0,100 g) wurde verwendet. Es wurden Doppelkupplungen durchgeführt, wobei jedes Mal vier Äquivalente N-geschützte Aminosäure, aktiviert durch PyBop und HOBt, und acht Äquivalente N,N-Diisopropylethylamin (DIPEA) in DMF zugegeben wurden und wobei 60 min lang gerührt wurde. Nach beendigter Synthese des Peptids GlyCCK8 wurde das Harz in ein Gefäß für die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe überführt und es wurden vier Äquivalente von Fmoc-Lys(Mtt)-OH, aktiviert durch PyBop und HOBt, und acht Äquivalente N,N-Diisopropylethylamin (DIPEA) in DMF zugesetzt. Die Mtt-Lys-Seitenkette-Schutzgruppe wurde durch Behandlung mit einem TFA/Triisopropylsilan/CH₂Cl₂-Gemisch (1:5:94) entfernt; dann wurden der N,N-Bis[2[bis[2-(1,1-dimethylethoxy)-2-oxoethyl]amino]ethyl]-L-glutaminsäure-1-(1,1-dimethylethyl)ester (das geschützte DTPA-GLU), aktiviert durch HATU, und 4 Äquivalente DIPEA in DMF an die Lys-ε-Aminogruppe gekuppelt. Die Fmoc-Schutzgruppe wurde entfernt und es wurden vier Äquivalente FmocβAla-OH, aktiviert durch PyBop und HOBt, und acht Äquivalente N,N-Diisopropylethylamin (DIPEA) in DMF zugesetzt. Die gleiche Verfahrensweise, beginnend mit dem Fmoc-Lys(Mtt)-OH wurde jeweils viermal wiederholt, wodurch das vollständig geschützte Produkt (Lys)(DTPA-GLU)-βAla)₄-Lys(DTPA-GLU)-Gly-CCK8 erhalten wurde [oder neun Mal wiederholt, um das vollständig geschützte Produkt (Lys(DTPA-GLU)-βAla)₉-Lys(DTPA-GLU)-Gly-CCK8, vergleiche Beispiel 6 zu erhalten]. Zur Abspaltung der Schutzgruppe und zur Spaltung wurden die vollständig geschützten konjugierten Peptidharze mit TFA behandelt, das Triisopropylsilan (2,0%), Ethandithiol (2,5%) und Wasser (1,5%) enthielt. Die Rohprodukte wurden bei 0°C durch tropfenweise erfolgende Zugabe von Diethylether ausgefällt. Die Reinigungen der rohen Gemische erfolgten durch RP-HPLC unter Verwendung der angegebenen Verfahren. Die Verbindung (Lys(DTPA-GLU)-βAla)₄-Lys(DTPA-GLU)-Gly-CCK8 wurde mit guter Ausbeute (40% für die durch HPLC gereinigte Verbindung) und mit hoher Reinheit (95% durch HPLC) erhalten.
(Lys(DTPA-GLU)-βAla)₄-Lys(DTPA-GLU)-Gly-CCK8 Rt = 23,5 min
Der MS-Wert stand im Einklang mit der angegebenen Struktur.
B) Synthese des Gadoliniumkomplexes von (Lys(DTPA-GLU)-βAla)₄-Lys(DTPA-GLU)-Gly-CCK8
Die Herstellung des Gadoliniumkomplexes erfolgte gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren.
Der MS-Wert stand im Einklang mit der angegebenen Struktur.
Beispiel 6 Synthese des Gadoliniumkomplexes von (Lys(DTPA-GLU)-βAla)₉Lys(DTPA-GLU)-Gly-CCK8
Das (Lys(DTPA-GLU)-βAla)₉-Lys(DTPA-GLU)-Gly-CCK8 wurde nach der in Beispiel 5 im Detail beschriebenen Verfahrensweise mit einer Ausbeute von 20% hergestellt.
(Lys(DTPA-GLU)-βAla)₉-Lys(DTPA-GLU)-Gly-CCK8 Rt = 32,0 min
Der MS-Wert stand im Einklang mit der angegebenen Struktur.
Beispiel 7 Synthese des Gadoliniumkomplexes von (Lys(DTPA-GLU)-βAla)₄Lys(DTPA-GLU)-Gly-Vapreotid
Die Chelat-bildende Verbindung und der entsprechende Gadoliniumkomplex wurden nach der Verfahrensweise hergestellt, die im Detail in Beispiel 5 beschrieben wurde.
Der MS-Wert stand im Einklang mit der angegebenen Struktur.
Beispiel 8 Synthese des Gadoliniumkomplexes von (Lys(DTPA-GLU)-βAla)₉Lys(DTPA-GLU)-Gly-Vapreotid
Die Chelat-bildende Verbindung und der entsprechende Gadoliniumkomplex wurden nach der Verfahrensweise hergestellt, die in Beispiel 5 beschrieben wurde.
Der MS-Wert stand im Einklang mit der angegebenen Struktur.
Beispiel 9 Synthese des Gadoliniumkomplexes von (Dap(DTPA-GLU)-βAla)₄Dap(DTPA-GLU)-Gly-CCK8
A) Herstellung von 3-[[(4S)-4-[Bis[2-[bis[2-(1,1-dimethylethoxy)-2-oxoethyl]amino]ethyl]amino]-5-(1,1-dimethylethoxy)-1,5-dioxopentyl]amino]-N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-L-alanin
Eine Lösung von N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDCI) (2,30 g; 12 mmol) in CH₂Cl₂ (40 ml) wurde zu einer Lösung von N,N-Bis[2-[bis[2-(1,1-dimethylethoxy)-2-oxoethyl]amino]ethyl]-L-glutaminsäure-1-(1,1-dimethylethyl)ester (7,46 g; 10 mmol) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) (1,38 g; 12 mmol), die bei 0–5°C gerührt wurde, zugegeben. Nach 18 h bei Raumtemperatur wurde die Lösung mit H₂O gewaschen, getrocknet, (Na₂SO₄) und eingedampft, wodurch der aktivierte Ester als Zwischenprodukt erhalten wurde. Der Letztgenannte wurde in DMF (100 ml) aufgelöst und es wurden 1,01 g Triethylamin zugesetzt. Dann wurde tropfenweise eine Lösung von 3-Amino-N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbo nyl]-L-alanin (Fmoc-L-Dap) (3,26 g; 10 mmol) in DMF (100 ml) im Verlauf von 40 min zugesetzt, wobei das Reaktionsgemisch bei 10–15°C gehalten wurde. Nach 18 h bei Raumtemperatur wurde die Lösung mit CH₂Cl₂ (300 ml) verdünnt und mit einer Lösung von 0,1 M HCl und H₂O und dann mit H₂O gewaschen.
Nach dem Trocknen wurde die Lösung eingedampft, wodurch ein Rohprodukt erhalten wurde, das durch Flashchromatographie gereinigt wurde. Auf diese Weise wurde die Titelverbindung (7,76 g; 7,4 mmol) in Form eines weißlichen Feststoffs mit einer Ausbeute von 74% erhalten.
Die IR-, ¹H-NMR- und MS-Werte standen mit der angegebenen Struktur im Einklang.
B) Synthese von (Dap(DTPA-GLU)-βAla)₄-Dap(DTPA-GLU)-Gly-CCK8
Die Verbindung wurde gemäß der in Beispiel 5 beschriebenen Verfahrensweise unter Verwendung des Fmoc-Protokolls und alternativ der Verbindung in A) des vorliegenden Beispiels und von Fmoc-βAla hergestellt.
Der MS-Wert stand im Einklang mit der angegebenen Struktur
C) Synthese des Gadoliniumkomplexes von (Dap(DTPA-GLU)-βAla)₄-Dap(DTPA)-Gly-CCK8.
Der Komplex wurde nach der im Detail in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise hergestellt.
Der MS-Wert stand im Einklang mit der angegebenen Struktur.
Beispiel 10 Synthese des Gadoliniumkomplexes von (Dap(DTPA-GLU)-βAla)₉Dap(DTPA-GLU)-Gly-CCK8
Die Titelverbindung wurde nach der Verfahrensweise des Beispiels 9 hergestellt.
Der MS-Wert stand im Einklang mit der angegebenen Struktur.
Beispiel 11 Synthese des Gadoliniumkomplexes von (Dap(DTPA-GLU)-βAla)₄Dap(DTPA-GLU)-Vapreotid
Die Titelverbindung wurde nach der Verfahrensweise des Beispiels 9 hergestellt. Die Cyclisierung der Cysteinbrücke erfolgte nach der in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrensweise.
Der MS-Wert stand im Einklang mit der angegebenen Struktur.
Beispiel 12 Synthese des Gadoliniumkomplexes von (Dap(DTPA-GLU)-βAla)₉Dap(DTPA-GLU)-Vapreotid
Die Titelverbindung wurde nach der in den Beispielen 9 und 11 beschriebenen Verfahrensweise hergestellt.
Der MS-Wert stand im Einklang mit der angegebenen Struktur.
Beispiel 13 Synthese des Gadoliniumkomplexes der Formel
Die Verbindung wurde nach der in Beispiel 5 angegebenen Verfahrensweise hergestellt, wobei die folgende geschützte Chelat-bildende Verbindung verwendet wurde:
Der MS-Wert stand im Einklang mit der angegebenen Struktur.
Beispiel 14 Synthese des Gadoliniumkomplexes der Formel
Die Verbindung wurde nach der in Beispiel 5 angegebenen Verfahrensweise hergestellt, wobei die folgende geschützte Chelat-bildende Verbindung verwendet wurde:
Der MS-Wert stand im Einklang mit der angegebenen Struktur.

Claims

Verbindungen der allgemeinen Formel (I): [A]_t[P] – [B]_v(I) worin: A aus der Gruppe, bestehend aus: Ethylendiaminotetraessigsäure (EDTA), Diethylentriaminopentaessigsäure (DTPA), 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure (DOTA), 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure (DO3A), [10-(2-Hydroxypropyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7-triessigsäure (HPDO3A), 4-Carboxy-5,8,11-tris(carboxymethyl)-1-phenyl-2-oxa-5,8,11-triazatridecan-13-onsäure (BOPTA), N-[2-[Bis(carboxymethyl)amino]-3-(4-ethoxyphenyl)propyl]-N-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethylglycin (EOB-DTPA), N,N-Bis[2-(carboxymethyl)[(methylcarbamoyl)methyl]amino]ethyl]glycin (DTPA-BMA), 2-Methyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure (MCTA), (α,α',α'',α''')-Tetramethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure (DOTMA); dem Rest eines Polyaminophosphonsäureliganden und Derivaten davon, Polyaminophosphinsäure und Derivaten davon, insbesondere Ethylendinitrilotetrakis(methylphosphon)säure (EDTP); 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetrakis[methylen(methylphosphon)]säure und 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetrakis[methylen(methylphosphin)]säure, ausgewählt ist; t eine ganze Zahl im Bereich von 3 bis 15 ist; B ein Peptid, ausgewählt aus:
ist, v eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist; P ein Polylysin oder ein Poly-L-lysin oder ein Lys-β-Ala- oder ein Dap-β-Ala-Copolymeres ist.
Verbindungen nach Anspruch 1 in der Form von Komplexen mit zwei-/dreiwertigen Ionen von Metallelementen mit Atomzahlen im Bereich von 21 bis 29, 42, 44 oder von 57 bis 71, mit paramagnetischen Metallen, insbesondere mit Fe, Cu, Cr, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Mn, sowie die Salze davon mit physiologisch verträglichen Basen oder Säuren.
Verbindungen nach Anspruch 2 in Form von Komplexen mit den zwei-/dreiwertigen Ionen von Fe(2+), Fe (3+), Cu(2+), Cr(2+), Cr(3+), Eu(3+), Gd(3+), Tb(3+), Dy(3+), Ho(3+), Er(3+), Yb(3+), Mn(2+) und Mn(3+) sowie die Salze davon mit physiologisch verträglichen Basen oder Säuren.
Verbindungen nach Anspruch 3 in Form von Komplexen, erhalten mit zwei-/dreiwertigen Ionen von Eu(3+), Gd(3+), Dy(3+), Mn(2+) und Mn(3+) sowie die Salze davon mit physiologisch verträglichen Basen oder Säuren.
Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei A aus:
ausgewählt ist.
Verbindungen nach einem der obigen Ansprüche, nämlich solche, ausgewählt aus: (DTPA-GLU)₄(Lys)₂Lys-Gly-CCK8 (DTPA-GLU)₃(Lys)₂Lys-Gly-CCK8 (DTPA-GLU)₄(Lys)₂Lys-Gly-Vapreotid (DO3A-Ar)₄(Lys)₂Lys-Gly-Vapreotid (Lys(DTPA-GLU)-βAla)₄Lys(DTPA-GLU)-Gly-CCK8 (Lys(DTPA-GLU)-βAla)₉Lys(DTPA-GLU)-Gly-CCK8 (Lys(DTPA-GLU)-βAla)₄Lys(DTPA-GLU)-Gly-Vapreotid (Lys(DTPA-GLU)-βAla)₉Lys(DTPA-GLU)-Gly-Vapreotid (Dap(DTPA-GLU)-βAla)₄-Dap(DTPA-GLU)-Gly-CCK8 (Dap(DTPA-GLU)-βAla)₉-Dap(DTPA-GLU)-Gly-CCK8 (Dap(DTPA-GLU)-βAla)₄-Dap(DTPA-GLU)-Vapreotid (Dap(DTPA-GLU)-βAla)₉-Dap(DTPA-GLU)-Vapreotid
Pharmazeutische und diagnostische Zusammensetzung, enthaltend eine Verbindung nach den Ansprüchen 1 bis 6 im Gemisch mit einem geeigneten Träger.
Verwendung der Verbindungen nach den Ansprüchen 1 bis 6 und der Salze davon zur Herstellung von diagnostischen Zubereitungen, die für MRI-Untersuchungen zur Abbildung und Aufzeichnung von Bildern von Organen und/oder Geweben verwendet werden.
Verwendung nach Anspruch 8 für das in vitro und/oder in vivo erfolgende Abbilden und Aufzeichnen von Bildern von Zellen, Geweben oder Organen, in denen Tumore oder primäre pathologische Tumorzustände oder Metastasen vorhanden sind.
Verbindungen der Formel: A'-Dap-Fmoc worin A' eine Einheit der oben angegebenen Formel A, bei der die Carboxy- oder Phosphongruppierungen in geeigneter Weise geschützt sind, bedeutet, Dap für eine Diaminosäure, speziell 2,3-Diaminopropionsäure, steht und Fmoc für (9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl steht.
Verbindung nach Anspruch 10, nämlich 3-[[(4S)-4-[Bis[2-[bis[2-(1,1-Dimethylethoxy)-2-oxoethyl]amino]ethyl]amino]-5-(1,1-dimethylethoxy)-1,5-dioxopentyl]amino]-N-[(9H-fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl]-L-alanin.