DE69526203T2

DE69526203T2 - Biologische zielgerichtete mittel

Info

Publication number: DE69526203T2
Application number: DE69526203T
Authority: DE
Inventors: Robert Bower; Michael Forster; Leonard Riley; Eamon Storey
Original assignee: Amersham PLC
Current assignee: GE Healthcare Ltd
Priority date: 1994-01-12
Filing date: 1995-01-11
Publication date: 2002-11-28
Anticipated expiration: 2015-01-12
Also published as: DE69526203D1; EP0738158B1; EP0738158A1; WO1995019187A1; US5705143A; CA2179990A1

Description

Die Konjugierung von Chelatbildungsgruppen zu Proteinen und Polypeptiden und die anschließende Komplexbildung mit verschiedenen Radiometallen ist ein eingeführtes Verfahren für radiopharmazeutisches Design. Die Chelatbildungsgruppe wird herkömmlicherweise durch Umsetzung geeigneter funktioneller Gruppen in dem Liganden entweder mit Amin- oder Thiolgruppen des Proteins gebunden. Solche Funktionalität beinhaltende Liganden sind als 'bifunktionelle Chelate' beschrieben.
Die US 4 479 930 offenbart, dass DTPA-bis-anhydrid zur Anbindung von DTPA an Proteine oder Polypeptide verwendet werden kann. Die Säureanhydridgruppe wird durch die Protein-Amin-Gruppen ringgeöffnet, um den Liganden in situ zu erzeugen. DTPA-Protein-Konjugate sind nicht ideal für die Technetium-Markierung, da ein nicht-spezifisches Anbinden an das Protein festzustellen ist, d. h. der Ligand ist für das Radiometall nicht genug avide. Weitere Entwicklungen führten zu bifunktionelles Thiol enthaltenden Liganden, da Thiole eine höhere Affinität zu bestimmten Metallen (z. B. Technetium) haben als die freien -NH&sub2;-, -OH- oder -CO&sub2;H- Gruppen des Protein-Hauptgerüsts.
Verschiedene funktionelle Gruppen sind für die Konjugation an die Protein-Amin- oder - Thiolgruppen verwendet worden und schließen ein:
Aktiven Ester z. B. US 4 897 255
Isothiocyanatmaleimid z. B. US 4 659 839
Thiolacton z. B. US 5 095 111 und US 4 434 151
Die US 4 741 900 offenbart, dass Proteinkohlenhydratrückstände oxidiert werden können, um Aldehydeinheiten zu erzeugen, die mit Amin-funktionalisierten Liganden unter Erhalt von Imin-gebundenen Konjugaten derivatisiert werden können. Die Iminbindung kann zu einem Amin reduziert werden, um die Stabilität zu erhöhen.
Die US 5 234 820 beschreibt die ortsspezifische Markierung von Proteinen/Peptiden am C-Terminus unter Verwendung von Peptidasen, mit der Betonung auf Protein-Markierung. Der C-Terminus soll als eine von der aktiven Stelle des Protein entfernt gelegene Stelle nützlich sein. Das Beispiel 10 verdeutlicht, dass die Basis der Erfindung eine Transamidierung ist, d. h. die terminale Aminosäure wird ausgetauscht (z. B. gegen eine markierte). Dies unterscheidet sich in signifikanter Weise von der einfachen Bindung an eine terminale Carboxylgruppe. Es werden keine Chelatkonjugate beschrieben.
Das Interesse verlagerte sich neuerdings von hochmolekulargewichtigen Proteinen oder monoklonalen Antikörpern zu viel kleineren Peptiden als Targeting-Einheiten für Radiopharmazeutika.
Wie obenstehend beschrieben, wurde ein ganzer Bereich an bifunktionellen Chelatbildungsgruppen für die Konjugierung zu Proteinamin- oder -thiolgruppen entwickelt. Es war daher gängige Praxis, die gleichen bifunktionellen Liganden zu verwenden, um an Peptidamingruppen anzukoppeln. Diese Verfahrensweise wird durch herkömmliche Festphasen-Peptid-Syntheseverfahren verstärkt. Diese verankern normalerweise eine Aminosäurecarboxylgruppe an dem Harz, wobei die Amingruppe frei mit einer zweiten (N-geschützten) Aminosäure reagieren gelassen wird. Die Entschützung des resultierenden harzgebundenen Peptids ermöglicht den sequentiellen Aufbau der gewünschten Peptidkette. Das harzgebundene Carboxyl wird auf diese Weise wirksam geschützt, obwohl es nicht völlig unreaktiv ist. Zum Beispiel führt die Behandlung des Harzes mit einer starken Lösung eines organischen Amins (RNH&sub2;) für einen längeren Zeitraum zu einer Amidbildung, d. h. der Freisetzung von Peptid-CONHR.
Die GB 2 225 579 verwendet herkömmliche Schutzgruppentechnologie, um sicherzustellen, dass die Chelatbildungsgruppe an das terminale Amin eines Somatostatinpeptids gebunden wird, und nicht an den Lysin-Rest, der bekanntermaßen bei der Rezeptorbindung beteiligt ist. Die WO 93/15770 erzielt die gewünschte Selektivität durch Regulierung des pH-Wertes während der Konjugierungsreaktion.
Die WO 91/01144 beschreibt einen Bereich an Chelatkonjugaten von Peptiden, Hormonen, Wachstumsfaktoren etc. In allen Fällen ist der Ligand an eine Amingruppe des Peptids gebunden.
Macke et al.(19) offenbaren Chelatkonjugate des Somatostatin-Analogs Octreotid. Wiederum sind die Liganden mit den Peptiden über Peptidamingruppen verbunden.
Die EP 515313 beschreibt weiter Somatostatin-Analoge mit einer Vielzahl an Chelatbildungsgruppen, die an die terminale Aminposition des Peptids gebunden sind.
Sowohl in der WO 91/01144 als auch der GB 2 225 579 wird ein weiter Bereich an Spacergruppen zwischen dem Peptid und Liganden beansprucht, doch es ist kein besonderer Vorteil für irgendeine spezielle Bindung aufgezeigt.
Die WO 93/09816 beschreibt α-Emitter-Konjugate von Wachstumsgruppen für das Targeting einer definierten Population von Krebszellen. Die Konjugation erfolgt über einen Liganden oder ein Maskierungsmittel, wobei Kronenether bevorzugt sind. Es wird in Aussicht genommen, dass der Ligand entweder an dem Amin- oder Carboxyterminus des Wachstumsfaktors wahlweise unter Verwendung einer Linkergruppe gebunden werden kann. Die Rolle der Linkergruppe (S. 12) läßt sich als Minimierung von sterischen Wechselwirkungen zwischen dem Wachstumsfaktor - α-Emitter-Komplex und dem Target vorstellen. Bevorzugte Linker schließen Disulfide, Dicarbonsäuren und modifizierte oder unmodifizierte Kohlenwasserstoffketten ein. Es wird erwartet, dass der bevorzugte Linker mindestens 6 Methyleneinheiten einschließt. Die spezifische Beschreibung ist auf die Radioiodierung von EGF (epidermaler Wachstumsfaktor) beschränkt, d. h. es werden de facto keine Chelat-Peptid-Konjugate hergestellt.
Die WO 93/17719 beschreibt Ligand-Peptid-Konjugate zur Bildung von 99mTc- Komplexen für bildgebende Stellen von Infektion oder Entzündung. Ein Bereich von Liganden ist unter Einschluss von zweizähnigen NS, N&sub2;S&sub2;-Diamindithiolen oder Diamiddithiolen oder N&sub3;S-Diamidpyridinthiolen beschrieben. Die Liganden können an eine Amin- oder eine Carboxylgruppe des Peptids wahlweise unter Verwendung einer Linkergruppe gebunden werden. Es ist kein Vorteil für irgendeine spezielle Bindungsstelle, Linker oder Ligand aufgezeigt.
Die US 4 707 440 und US 4 943 523 beschreiben Moleküle der Form:
[Targeting-Molekül]-LINKER-E-Ligand,
worin E = -O-, -NH- oder -S-
Linker = -NCO-, -N = N-, -N-, -CH&sub2;NH...etc.
Damit kann der Ligand an das Targetingmolekül oder Polypeptid über eine weitreichende Funktionaliätsanordnung gebunden werden, doch es ist kein spezifischer Vorteil für irgendein spezielles Peptid, Bindung oder Ligand aufgezeigt.
Gestin et al.(1) vergleichen die Bioverteilung in Mäusen eines Bereichs von monoklonalen Antikörper-(Ab-)Konjugaten von ¹¹¹In-Komplexen der Liganden:
Der Ligand wird an die Proteinamingruppen mittels einer Mischung von Amid- und Alkylenbindungen gebunden, wobei ein Teil des Spacers, R, variiert wird. Die landläufige Erkenntnis ist, dass metabolisierbare Bindungen bei der Verbesserung der Hintergrund-Clearance von radiomarkierten MAbs(2), zum Beispiel durch eine erhöhte Leber-Clearance, nützlich sind. In diesem Fall jedoch ergab die Alkylen-(CH&sub2;)&sub6;-Bindung eine überlegene Leber- Clearance. Das wurde auf eine Kombination aus Metabolismus an den 3 Amidbindungen in dem gesamten Spacer oder dem Leber-Cytochrom-P450-Abbau der aliphatischen Struktur zurückgeführt (S. 770).
Yokoyama et al.(3) untersuchten ¹¹¹In Komplexe von MAb-Konjugaten, die abgeleitet sind von den Liganden:

EDTA-Benzyl-ILINKERI-Maleimid

Ein Alkylen-Linker ergab eine bessere Tumoraufnahme als eine abspaltbare Diesterbindung bei einer Untersuchung der Bioverteilung bei Mäusen.
Babich et al.(4,20) untersuchten 99mTc-Komplexe von Hydrazonnicotinamid-(HYNIC)- Derivaten von 4 chemotaktischen Peptiden zum Infektions- Imaging. Der HYMC ist mittels Reaktion einer Peptidamingruppe mit einem aktiven HYNIC-Ester gebunden, außer im Fall von HP3 (siehe untenstehend), das carboxylgebunden ist.
fNIeLFK - HYNIC (HP1) f = Formyl
fMLEK - HYNIC (HP2) Nle = Norleucyl
fMLFNH(CH&sub2;)&sub6;NH-HYNIC (HP3) L = Leu
fMLF-D-K-HYNIC (HP4) K = Lys
M = Met
F = Phe
Babich et al. weisen nach, dass dann, wenn die Peptidkonjugate unmarkiert sind, HP3 eine marginal bessere in-vitro-Rezeptor-Bindungsaffinität besitzt als HP2, das einen Lysin- (K-)Aminosäure-"Linker" besitzt. Allerdings ist HP2 aktiver bei der Induzierung der Superoxidbildung. Die verminderte Rezeptor-Bindungsaffinität von 99mTc-markiertem HP2 (S. 1967) verglichen mit unmarkiertem HP2 bedeutet, dass die Technetium-Markierung eine schädliche Auswirkung auf das Binden besitzt. Es sind keine Daten zur Bindungsaffinität von 99mTc HP3 angegeben. Babich et al. untersuchen nicht die metabolische Stabilität eines der Konjugate oder geben irgendeinen Hinweis darauf, dass vorteilhafte Eigenschaften auf die Carboxylbindung oder metabolische Stabilität zurückzuführen sind. Die Ergebnisse der in-vivo-Bioverteilungsexperimente zeigen nicht irgendeinen Vorteil beim Binden des HYNIC über eine spezielle Gruppe auf dem Peptid. Der HYNIC-Ligand ist einzähnig und lässt den Rest der Metallkoordinierungssphäre möglicherweise für die ungewünschte Koordinierung durch den Rest des Peptids, das zu markieren ist, verfügbar.

Die Erfindung

Die Erfindung weist nach, dass es möglich ist, Radiometallkomplexe an den Carboxylterminus oder eine andere Carboxylgruppe eines biologisch aktiven Peptids ohne eine Beeinträchtigung der Rezeptoraffinität zu binden. In der Tat kann die Anbindung des Radiometallkomplexes an den C-Terminus positive Vorteile haben, dadurch dass die Carboxypeptidase- Abspaltung blockiert wird, womit das Peptid gegen eine rasche metabolische Aufspaltung geschützt ist (und damit einen Verlust der Rezeptor-Bindungsaffnität). Ein weiterer Vorteil ist, dass die Biolokalisierungseigenschaften eines derartigen Radiometall-Peptid-Konjugats modifiziert werden können, so dass die Rezeptoraffinität zumindest beibehalten wird, aber die Hintergrund- Clearance (z. B. Leber- oder Nierenausscheidung) erhöht werden kann. Dies führt zu einem Radiopharmazeutikum mit überlegenen Charakteristika gegenüber denjenigen des Stammpeptids oder der Targetingeinheit. Dies ist untenstehend im Fall von Somatostatin erläutert.
Die Erfindung stellt ein Konjugat bereit, welches ein lineares oder cyclisches synthetisches Peptid aus 3-50 Aminosäuren umfasst, das über eine seiner Carboxylgruppen und wahlweise über eine Verbindungsgruppe an eine mehrzähnige Metall-Chelatbildungsgruppe gebunden ist, mit dem Resultat, dass endo- oder exo-Peptidasemetabolismus des Peptids im Wesentlichen inhibiert wird, mit der Maßgabe, dass:
a) die Peptidkette eine biologische Targeting-Sequenz enthält, welche biologisch aktiv ist;
b) wenn der Spacer abwesend ist, die Metall-Chelatbildungsgruppe nicht alleine Peptideinheiten umfasst;
c) die Metall-Chelatbildungsgruppe keine Thioldonoren enthält.
Vorzugsweise besitzt das Konjugat die Formel:
[Peptid-CONR-(A)p]q-L
worin: L die Metall-Chelatbindungsgruppe ist;
p 0 bis 10 ist;
q 1 bis 3 ist;
A gleich oder verschieden ist und unabhängig gewählt ist, so dass A -CR&sub2;- sein kann
AA -(CO)NR-, NR(CO)- oder -CR=CR- sein kann
AAA -CR&sub2;QCR&sub2;- ist; worin Q=O, S oder NR;
R unabhängig H, linearer oder verzweigter C&sub1;&submin;&sub6;-Kohlenwasserstoff, welcher Alkyl oder ein oder mehrere Alkenyl sein kann; Alkoxy; Alkoxyalkyl; primäres, sekundäres oder tertiäres Amid; primäres, sekundäres oder tertiäres Amin; Hydroxy; Hydroxyalkyl; Carbonsäure; Aryl oder Heteroaryl oder 2 R-Gruppen zusammen mit den Atomen, an welche sie gebunden sind bilden einen carbocyclischen, heterocyclischen, gesättigten oder ungesättigten Ring bilden.
Bevorzugte Metall-Chelatbildungsgruppen sind vierzähnige Liganden, wie Diamindioxime der Formel:
worin
R wie obenstehend definiert ist;
n 2 bis 5 ist;
m 1 oder 2 ist;
mit der Maßgabe, dass:
eine oder beide der Amingruppen ein Amiddonor sein können;
1 bis 3 der R-Gruppen -(A)pNR(CO)-Peptid ist.
Die Erfindung stellt auch Komplexe bereit, die ein Konjugat wie hierin beschrieben und ein durch die Metall-Chelatbildungsgruppe cheliertes Metallatom umfassen.
Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Komplexe wie obenstehend beschrieben zur Verwendung in der Medizin bereit.
Gemäß einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung die Verwendung eines Konjugats oder Komplexes wie hierin beschrieben zur Herstellung eines Arzneimittels für die Radioabbildung vor.
Die Bezeichnung Metallatom wird hierin zur Beschreibung der Metallspezies verwendet, die in einer Vielzahl von Oxidationszuständen vorliegen kann, oder sogar in Verbindung mit O, OH, Cl ete. je nach deren Chemie. Die durch den Liganden chelierte Metallspezies ist vorzugsweise radioaktiv, obgleich nicht-radioaktive Metalle nützlich sein können, z. B. als Kontrastmittel in NMR in einigen Fällen. Bevorzugte radioaktive Metalle schließen 99mTc, ¹&sup8;&sup6;Re, ¹&sup8;&sup8;Re, &sup6;&sup7;Cu und ¹&sup0;&sup7;Ag ein.
Sandostatin (Octreotid) ist ein synthetisches cyclisches Octapeptid, das für die Bindung an Somatostatin-Rezeptorstellen entworfen ist, aber mit einer viel längeren biologischen Halbwertszeit als natürliches Somatostatin (siehe untenstehend). Octreotid wurde mit DTPA an der terminalen Aminposition konjugiert und mit ¹¹¹In als Radiotracer von Somatostatin-Rezeptoren, die auf einer Reihe von Tumortypen(5) exprimiert wurden, markiert. Versuche zur Markierung von DTPA-Octreotid mit 99mTc hatten keinen Erfolg(6), vermutlich weil der DTPA-Ligand eine unzureichende Affinität zu Technetium besitzt. Die GB 2 225 579 (siehe obenstehend) beschreibt die Idee der Bindung verschiedener anderen Liganden und/oder Verbindungsgruppen an den Aminterminus von Somatostatin-Analoga.
Macke et al., wie obenstehend bestätigt, beschreiben &sup6;&sup7;Ga und &sup6;&sup8;Ga-Desferrioxaminoctreotid und ein 99mTc-markiertes PnAO-Octreotid, die beide über die Octreotid-(D)Phe- Amingruppe verbunden sind. Macke et al. deuten an, dass die hohe hepatobiliäre Ausscheidung des 99mTc-PnAO-Octreotid-Konjugats jeglichen Vorteil zunichte macht, den 99mTc gegenüber dem ¹¹¹In-DTPA des Stands der Technik möglicherweise gehabt hat. Eine andere Interpretation ist die, dass diese Beobachtungen nicht notwendigerweise dem Te-PnAO-Komplex eigen sind, sondern der verwendeten Phenylthioharnstoffbindung.
Die durch diese Bindung verliehene Lipophilizität ist wahrscheinlich größtenteils für die unerwünschte hepatobiliäre Ausscheidung verantwortlich.
Andere Versuche mit der Markierung von Somatostatin oder Analoga, welche Cys-Cys- Bindungen mit Technetium enthalten, wandten 'Direkt-Markierungs-Verfahren' an, d. h. die Reduktion der Disulfidbindung entweder mit Ascorbinsäure(7) oder festem Reduktionsmittel(8) unter Erzeugung freier Thiolgruppen für die Metallkoordinierung. Eine derartige Abspaltung der Peptid-Disulfid-Bindung bringt die Konformation des Polypeptids zu Fall und führt zu einer verminderten Rezeptoraffinität. Versuche wurden auch zur Bindung von Thiolgruppen an den Aminterminus von Somatostatin unter Verwendung des bekannten Derivatisierungsmittels 2- Iminothiolan(9) unternommen.
Somatostatin-14 (SS-14) ist besonders für Metabolismus durch Carboxypeptidasen aufgrund seines freien Cys-Carboxy-Terminus(10) empfänglich, doch beinhaltet das synthetische Analog Octreotid eine reduzierte Thr(ol)-Einheit am C-Terminus, um Metabolismus zu blockieren. Die vorliegende Erfindung offenbart, dass die Bindung eines Liganden über einen geeigneten Linker an den C-Terminus von Somatostatin-Analoga radiomarkierte Peptide entstehen lässt, welche sowohl ihre biologische Aktivität beibehalten als auch gegenüber einer metabolischen Abspaltung resistent sind.
Die biologische Aktivität dieser Konjugate ist überraschend im Hinblick auf frühere SAR-Studien, die darauf hinweisen, dass der C-Terminus des Peptids relativ empfindlich gegenüber einer strukturellen Veränderung für das gezeigte Octreotid-Analog ist(10).

B Relative Wirkungsstärke (%) der Wachstumshormoninhibierung in vivo*

-Phe(ol) 650
- D-Thr(ol) 1100
- D-Thr(NH&sub2;) 1160
- Ser(ol) 2800
- Thr(ol)* 7000
* bezogen auf Somatostatin = 100%
In der vorliegenden Erfindung wurden die untersuchten Peptide entweder mit ¹²³I oder 99mTc radiomarkiert, und ihre Bioverteilungen bei Ratten wurde untersucht, wobei Organe von besonderem Interesse die Nebennieren und das Pankreas sind. Dies liegt daran, dass Somatostatin-Rezeptoren, wie gezeigt wurde, sich in vitro bei einer Reihe von Geweben einschließlich der Nebennieren(11,12), des Pankreas(13,14), der Hirnanhangdrüse(11,14) und des Gehirns(15) anreicherten. Die Aufnahme von Somatostatin und Analoga in die Nebennieren und die Hirnanhangdrüse sind in vivo(16,17,18) nachgewiesen worden. Die Gehirn-Somatostatin-Rezeptoren werden nicht visualisiert, wenn die Verbindung in vivo verabreicht wird. In dieser Studie war die Messung der Aufnahme in der Hirnanhangdrüse nicht empfindlich genug, um zwischen spezifischen und nichtspezifischen Wirkungen zu unterscheiden.
Man stellt sich vor, dass die Rolle des Linkers zwischen dem Radiometallkomplex und dem Targetingpeptid die ist, den relativ sperrigen Metallkomplex von der aktiven Bindungsstelle des Peptids entfernt zu halten, so dass die Rezeptorbindung nicht beeinträchtigt wird. Dies kann durch eine Kombination aus Flexibilität (z. B. einfache Alkylenketten), so dass die sperrige Gruppe die Freiheit besitzt, sich entfernt von der aktiven Stelle zu positionieren, und/oder Starrheit, wie einen Cycloalkyl- oder Arylspacer, welcher den Komplex von der aktiven Stelle weg ausrichtet, erreicht werden. Nicht-Peptid-Linker, wie Alkylengruppen, haben den Vorteil, dass es keine signifikanten Wasserstoffbindungswechselwirkungen mit dem konjugierten Polypeptid gibt, so dass der Linker sich nicht um das Peptid legt. Ein solches Einhüllen kann die bevorzugte Konformation der biologisch aktiven Sequenz des Peptids nachteilig beeinflussen. Dies kann aus sterischen Wechselwirkungen mit dem (relativ großen) Metallkomplex, oder elektronischen Wechselwirkungen, die aus der Elektronenhülle um das Metall entstehen, resultieren. Eindeutig wird ein noch dramatischerer Einfluss erwartet, wenn der Metallkomplex geladen ist.
Der Linker sollte auch gegenüber einer metabolischen Abspaltung (inbesondere durch Peptidasen) resistent sein, welche die Radiomarkierung von dem gewünschten Targeting-Peptid abtrennen würde. Somit ist es vorteilhaft, wenn von natürlich vorkommenden (L)-Aminosäuren abgeleitete einfache Peptidbindungen von dem Linker ausgeschlossen werden. Andere Funktionalitäten, die von dem Linker ausgeschlossen werden sollten, sind: Ester und Disulfid.
Eine weitere wichtige Charakteristik des Linkers ist, dass er keine signifikante Metall- Koordinierungsfähigkeit zeigen sollte, d. h., er darf nicht wirksam mit dem konjugierten Liganden um das Radiometall konkurrieren. Somit sollten Heteroatome, wie Ether-, Thioether-, Amin- oder Amidgruppen, obwohl diese in den Linker eingebunden sein können, nicht so konfiguriert sein, um potenzielle 5- oder 6-Ring-Chelate bei der Koordinierung an ein Metall zu ergeben.
Somit sind Peptid-Linker nicht bevorzugt, da diese eine Kette von potenziellen Amiddonoren liefern, die bei Koordinierung 5-Ring-Chelate ergeben würden.
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Metall-Chelatbildungs-Ligand muss in der Lage sein, wirksam mit dem Polypeptid um das Radiometall während der Radiomarkierung des Chelat-Peptid-Konjugats zu konkurrieren. Dies bedeutet, dass der Ligand eine günstigere Markierungskinetik aufweisen muss als die Anordnung von Amid-, Carboxyl-, Amin- und möglicherweise Thioldonoren, wie sie durch das Targeting-Polypeptid geboten werden. Eindeutig neigt eine nicht-spezifische Bindung des Radiometalls an den Peptidteil des Chelat-Peptid- Konjugats dazu, die Rezeptoraffinität drastisch zu vermindern. Nach seiner Bildung muss der Radiometallkomplex thermodynamische Stabilität besitzen, so dass das Radiometall sich nicht anschließend entweder mit dem Polypeptid des Konjugats oder mit endogenen Proteinen etc. in vivo austauscht. Die Notwendigkeit der Stabilität verlangt, dass der Ligand mehrzähnig und vorzugsweise vierzähnig ist.
Der verwendete Metall-Chelatbildungs-Ligand sollte auch die Fähigkeit zur Koordinierung des Radiometalls bei sehr geringen Ligand-Konzentrationen haben. Solche geringen Konzentrationen sind notwendig, um die Inhibierung der Rezeptor- oder Targetaufnahme durch das freie Chelat-Peptid-Konjugat und/oder das an nicht-radioaktive Metalle komplexierte Konjugat zu minimieren. Der Bedarf an geringen Konzentrationen ist weiter im Fall von Targeting- Peptiden mit tiefen biologischen Auswirkungen zur Minimierung der Toxizität veranschaulicht, zum Beispiel bestimmten N-Formyl-peptiden, die Leukozyten targetieren, die aber auch dafür bekannt sind, dass sie Neutropenie verursachen.
Wo das gewünschte Targeting-Peptid cyclisch ist aufgrund von einer oder mehreren Disulfidbindungen, ist es bevorzugt, dass der Ligand keine Thiolgruppen enthält. Dies kommt daher, dass Thiole dafür bekannt sind, dass sie zur Reduktion von Disulfidbindungen zu freien Thiolen fähig sind mit dem Resultat, dass der Ligand ein Verwerfen der Struktur und/oder der aktiven Konformation des Targeting-Peptids mit dem sich daraus ergebenden Verlust der Rezeptoraffinität bewirken kann.
Die folgenden Liganden sollen in der vorliegenden Erfindung von Nutzen sein:

i) Peptide mit mindestens einer Disulfidbindung

- Diamindioxime
plus Varianten der Obenstehenden, wenn ein Amin/beide Amine ein Amiddonor ist/sind.
- Bis-dithiosemicarbazone
- Makrocyclische Liganden, in welche Amin-, Ether oder Thioetherdonoren, z. B. Cyclam, eingebunden sind
- Polyaminocarboxylat-Liganden, wie DOTA, TETA, EDTA, DTPA oder IDA
- Offenkettige Tetraamine

ii) Peptide ohne Disulfidbindungen

Alle in (i) weiter oben erläuterten Liganden plus:
- N&sub2;S&sub2;- und N&sub3;S-Liganden, wie: BAT (Kung, EP 0 200 211 A); Liganden, die in der US 4 925 650 und Brandau et al., J. Nucl. Med., 33, 919 (1992) beschrieben sind; S- funktionalisierte N&sub2;S&sub2;-Thioether-Liganden, wie in der US-4 746 505 beschrieben; die Liganden DADS und MAG&sub3; (Fritzberg, US 4 980 147). Ebenfalls eingeschlossen sind Diamindithiole, Diaminthioetherthiole, Diamiddithiole, Amidamindithiole (Monoaminmonoamid - MAMA) und Triamidthiole.
Diamindioxim-Liganden sind bevorzugt für Chelat-Peptid-Konjugate. Erstens enthalten solche Liganden keine Thiole und sind somit mit jedem Peptid kompatibel. Zweitens bilden sie stabile Metallkomplexe mit Radiometallen, wie 99mTc. Drittens zeigte sich bei PnAO und dessen aminfunktionalisiertem Derivat, dass sie erfolgreich Technetium bei sehr niedrigen Ligandenspiegeln (1-4 · 10&supmin;&sup8; Mol) markieren. Diese letzte Beobachtung widerspricht der herkömmlichen Erkenntnis, wonach Thioldonoren für Technetium am avidesten sind.
Geeignete Peptide zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf:
- Somatostatin- und Octreotid-Analoga für die Krebsdiagnose
- Laminin-Fragmente, z. B. YIGSR, PDSR IKVAV, LRE und KCQAGTFALRGDPQG
- N-Formyl-peptide für Targetingstellen der Leukozyten -Akkumulation
- PF4 für das Imagingvon Infektionen
- RGD enthaltende Peptide für das Targeting von Plättchen
Diese und andere Targeting-Peptide von Interesse sind in der WO 92/13572 (Diatech), EP 527 056 (LDV, Antisoma) und WO 92/18534 (EPPT, Antisoma) beschrieben.

Referenzen

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20. J. W. Babich et al. J. Nucl. Med., 34, 1964 (1993) VERBINDUNGS STRUKTUREN
5 (Verbindung 3) -Ala-Gly-Gly-Gly- [Liqand 7]
6 (Verbindung 3) -NH(CH&sub2;)&sub6;CO-[Ligand 7]

VERSUCHE

Abkürzungen tBOC = (tert-Butoxy)oxycarbonyl
BOP = Benzotriazolyl-N-oxy-tris(dimethylamino)phosphonium-hexafluorphosphat
TFA = Trifluoressigsäure
SS-14 = Somatostatin
FAB = Schnelles Atombombardement
DMSO = Dimethylsulfoxid

Beispiel 1: Synthese der Verbindung 1

Dieses Peptid wurde durch Standardverfahren der Festphasen-Synthese mit Hilfe einer tBOC-Strategie für den Aminschutz synthetisiert.
Das Produkt wurde durch Massenspektroskopie (FAB) charakterisiert und zeigt einen (M + H)&spplus;-Peak bei 1035,5 (Theoretisch = 1035,5). Die HPLC-Analyse (System A) zeigt 95% Reinheit (Rt = 9,1 min).

Beispiel 2: Synthese der Verbindung 2

Die Verbindung 2 wurde mit Hilfe von Standard-Festphasenverfahren synthetisiert.
Das Produkt wurde durch FAB-Massenspektroskopie charakterisiert und zeigt einen (M + H)&spplus;-Peak bei 1306,2 (Theoretisch = 1306,5). Die HPLC-Analyse zeigt einen Peak bei 8,92 Minuten (95% Reinheit) (System B).

Beispiel 3: Synthese der Verbindung 3

Diese wurde durch Entschützung der Verbindung 2 mit TFA/H&sub2;O (95 : 5) hergestellt.

Beispiel 4: Synthese der Verbindung 4

Diese wurde durch BOP-Kopplung der Verbindung 2 und der Verbindung 7 in DMSO, gefolgt von einer Entschützung unter Verwendung von TFA/H&sub2;O (95 : 5) hergestellt. Das Produkt wurde durch HPLC (System C) gereinigt unter Erhalt eines einzelnen Peaks bei 14,4 Minuten von 99+% Reinheit. Die FAB-MS des Produkts zeigte (M+H)+ bei 1404,0 (Theoretisch = 1403).

Beispiel 5: Synthese der Verbindung 5

BOC-Ala-Gly-Gly-Gly wurde an die Verbindung 7 unter Verwendung von BOP gekoppelt und danach unter Verwendung von TFA entschützt. Die Ala-Gly-Gly-Gly-Verbindung 7 wurde danach unter Verwendung von BOP an die Verbindung 2 gekoppelt, unter Verwendung von TFA entschützt und HPLC-gereinigt. Die HPLC-Analyse (System D) zeigte eine Reinheit von 98%. Die Elektrospray-Massenspektroskopie zeigte zwei Hauptpeaks, einen bei 549,8 und einen bei 824,0 entsprechend:
Dies ergibt eine experimentelle Molekularmasse von 1646,2 (Theoretisch = 1645,7).

Beispiel 6: Synthese der Verbindung 6

Diese wurde hergestellt durch Koppeln von BOC-6-aminohexansäure an die Verbindung 7 unter Verwendung von BOP und Entschützen mit TFA. Diese wurde anschließend an die Verbindung 2 unter Verwendung von BOP gekoppelt, mit TFA entschützt und durch HPLC gereinigt. Die Elektrospray-Massenspektroskopie des Produkts zeigte 2 Hauptpeaks bei 506,85 und 769,51 entsprechend:
unter Erhalt einer experimentellen Molekularmasse von 1517,3 (Theoretisch = 1516,8).

Beispiel 7: Synthese der Verbindung 7

Die Verbindung 8 (22,76 g, 194 mMol) wurde mit 2-Chlor-2-methyl-3-nitrosobutan (51,49 g, 0,38 mMol) in trockenem Methanol (120 ml) bei 0ºC gemischt. Die Mischung wurde 15 Minuten lang umgerührt, danach auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Sie wurde dann auf 60ºC erwärmt, wobei eine exotherme Reaktion erfolgte. Den Reaktionsansatz ließ man bei Raumtemperatur 72 Stunden lang rühren, für weitere 3 Stunden refluxieren, danach wurde das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfung entfernt. Der Rückstand wurde in 2 M HCl (200 ml) gelöst und mit Diethylether (3 · 200 ml) gewaschen. Die wässrige Schicht wurde auf einen pH- Wert von 10,0 mit 6 M Natriumhydroxid basisch gemacht und mit Dichlormethan extrahiert. Nach dem Stehen lassen über Nacht wurden Kristalle von dieser und der wässrigen Schicht abgeschieden.
¹H NMR (CDCl&sub3;) δ (ppm) 0,8(3H,s, CCH&sub3;),
1,2 (12H,s,C(CH&sub3;)&sub2;)
1,8 (6H,s,H&sub3; CC=N) 2,35 (4H,q,CH&sub2;NH), 2,8 (2H,s,CH&sub2;NH&sub2;)

Beispiel 8: Synthese von 2-(Aminomethyl)-2-methyl-1,3-diaminopropan

(Verbindung 8)

Diese wurde aus dem entsprechenden Triol mittels Umwandlung zu dem Trimesylat, nukleophile Verdrängung der Mesylatgruppen durch Azid (Vorsicht) und Reduktion mit Wasserstoff/Palladium-Katalysator zu dem Triamin synthetisiert.

Beispiel 9: HPLC

System A:

Säule: Nukleosil C-18 150 · 4,6 mm
Strömung: 1,2 ml min&supmin;¹
Detektion: UV 210 nm
Eluiermittel A: 0,1% wässriges Triethylammoniumphosphat
Eluiermittel B: Acetonitril
Gradient: 5 bis 65% B über 20 Minuten

System B:

Wie System A, aber der Gradient = 40 bis 100% B über 20 Minuten.

System C:

Säule: HICHROM RP8 250 · 10 mm
Strömung: 2,5 ml min&supmin;¹
Detektion: UV 215 nm
Eluiermittel A: 0,1% Triethylaminacetat pH-Wert 4,5
Eluiermittel B: Acetonitril
Gradient: 0 bis 10% B über 2 min
10% B für 5 min
10 bis 50% B für 3 min
50% B für 5 min
50 bis 80% B über 3 min
80% B für 5 min

System D:

wie System A, aber Gradient = 10 bis 60% B über 25 Minuten.

Beispiel 10: Iod-123-Markierung von Peptiden und der Verbindungen 1, 3, 4, 5 und 6

Peptide wurden mit ¹²³I unter Anwendung des Chloramin-T-Verfahrens markiert. Eine Lösung des Peptids (20 ug in 20 ul Wasser) wurde mit Phosphatpuffer (pH-Wert 7,4, 0,5 M, 100 ul), danach mit trägerfreier Na ¹²³I- Lösung (in 0,02M NaOH-Lösung, 200-400 MBq, 20-100 ul) und danach mit Chloramin-T-Lösung (0,2 mg/ml in WO, 20 ul) gemischt und bei RT für ungefähr 30 Sekunden inkubiert. Die Iodierungsreaktion wurde unter Verwendung einer gesättigten wässrigen L-Tyrosin-Lösung (20 ul) abgeschlossen.
Das rohe markierte Peptid wurde von unmarkiertem Peptid und Iodierungsnebenprodukten durch HPLC (Verfahren untenstehend beschrieben) gereinigt. HPLC-gereinigtes Material wurde in silanisierten 10-ml-P6-Vials bzw. Gläschen gesammelt. Die das gewünschte iodierte Peptid enthaltende Fraktion wurde in vacuo bei Labor-Umgebungstemperatur verdampft, um organisches HPLC-Eluiermittel zu entfernen, und dann mit Phosphatpuffer (0,2 M, pH-Wert 7,4) verdünnt, wodurch etwa 2 ml einer Lösung mit einem geeigneten pH-Wert für biologische Tests bereitgestellt wurden.
Die radiochemische Reinheit (RCP) der gereinigten iodierten Peptide wurde durch HPLC (Verfahren untenstehend beschrieben) sobald wie möglich vor und nach Injektionen bei Tieren bewertet.

Beispiel 11: Trägerwirkung auf ¹²³I-Verbindungen 1 und 6

Für ¹²³I-Verbindungen 1 und 6 wurde die Wirkung von Trägerpeptid auf die Bioverteilung des trägerfreien ¹²³I-Peptids durch Herstellen einer 2-ml-Phosphatpufferlösung von HPLC- gereinigtem, trägerfreien, iodierten Peptid wie obenstehend beschrieben, aber danach durch Subdispensierung von 1 ml dieser Lösung in ein zweites Trägerpeptid enthaltendes Vial bewertet. Der Anteil des hinzugefügten Trägerpeptids (1,5 bis 2 · 10&supmin;&sup8; Mol) war mit demjenigen der Trägerpeptide in Tc-markierten Präparaten vergleichbar; siehe untenstehend. Das Vorhandensein dieses Anteils an Trägerpeptid verringerte in signifikanter Weise die Aufnahme des radioiodierten Peptids in Rezeptorgewebe in vivo.
Ein ähnlicher Trägereffekt wird für Technetium-markierte Peptide erwartet, deshalb ist der einzige gültige Vergleich von Bioverteilungsdaten für 99mTc- und ¹²³I markierte Peptide, wenn beide über Träger zugesetzt (CA) sind.

Beispiel 12 : 99mTc-Markierung der Verbindungen 3, 4, 5 und 6

Eine Lösung des Peptids in MeOH oder H&sub2;O (1, 2 bis 3,6 · 10&supmin;&sup8;) wurde in ein mit N&sub2; gefülltes 10-ml-P6-Vial übertragen, gefolgt von 1 ml desoxidierter Kochsalzlösung (0,9% w/v) und 20 ul wässrigem NaOH (01M). Dieser Lösung wurden 1 ml Technetium-99m-Generatorelulat (etwa 0,2 GBq) und danach 0,1 ml (10 ug) wässrige SnCl&sub2;-Lösung zugegeben. Der Markierungs-pH war 9,0-10,0. Die Vials wurden bei Labor-Umgebungstemperatur 1 bis 2 Stunden inkubiert, um das Markieren durchzuführen. Es erfolgte keine HPLC-Reinigung.

Beispiel 13: Charakterisierungs- und Reinigungsverfahren

Iodierte Peptide

Die Bestimmung der radiochemischen Reinheit (RCP) und die Reinigung von iodierten Peptiden wurden unter Anwendung der folgenden HPLC-Systeme durchgeführt:

Verbindungen 1 und 3-6

Säule C18 Nova-Pak 150 · 3,9 mm, 4 um Packung
Gradient 10-70% B in 20 min
Eluiermittel A 0,1% TFA in H&sub2;O
Eluiermittel B 0,1% TFA in Acetonitril
Strömungsrate 11 ml/min

Somatostatin-14 (SS-14)

Säule Nova-Pak C18 150 · 3,9 mm, 4 um Packung
Gradient To 25% BT&sub5;, 30% B T&sub2;&sub5;, 40% B
Eluiermittel A und B, Strömungsrate und Nachweis des aktiven Peaks wie obenstehend dargestellt
Iod-123-Spezies und Trägerpeptide wurden unter Anwendung der In-line-γ bzw. UV- Detektion nachgewiesen. (UV-Detektor auf λ = 215 nm eingestellt). Die Lösungsmittelregulierung wurde unter Einsatz von Gilson-Gradient-Manager-Software erreicht.
Die RCP-Daten für die den Tiertests vorgelegten Präparate sind in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1
CA = über Träger zugegeben, siehe Beispiel 11
CF = Trägerfrei, siehe Beispiel 11
aMischung von Mono- und Diiodpeptid

99mTc-markierte Peptide

Die radiochemische Reinheit wurde unter Anwendung der Dünnschicht-Chromatographie (TLC)- und HPLC-Systeme, wie untenstehend beschrieben, bewertet. TLC:
i) ITLC SG 2 cm · 20 cm, eluiert mit 0,9%iger w/v Salzlösung
ii) ITLC SG 2 cm · 20 cm, eluiert mit Butan-2-on
iii) Whatman Nr. 1, 2 cm · 20 cm, eluiert mit 50 : 50 v/v Acetonitril: H&sub2;O
ITLC SG = sofortige Dünnschicht-Chromatographie, mit Silicagel imprägnierte Blätter von Gelman.
Die markierte Spezies verbleibt am Ursprung oder nahe bei diesem bei den TLC- Systemen (i) und (ii) und verlagert sich nahe an die Lösungsmittelfront in dem System (iii).
HPLC: Säule: Hamilton PRP-1 150 · 4,1 mm, 10 um Packung
Gradient: Eluierungsprofil 0-100% B in 17'
Eluiermittel A: pH-Wert 5, 6, 50 mM Acetatpuffer
Eluiermittel B: Tetrahydrofuran unstabilisiert
Strömungsrate: 2 ml/min
99mTc-Spezies wurden unter Verwendung der In-line-γ-Detektion nachgewiesen.
Die RCP-Daten für die 99mTc-markierten Verbindungen 3, 4, 5 und 6 sind untenstehend in Tabelle 2 kurz dargestellt. Tabelle 2: RCP
(a) Präparat filtriert; sh = Schulter; CA = über Träger zugesetzt. Die Hauptverunreinigung in jedem Präparat ist reduziertes hydrolysiertes Technetium.

Beispiel 14: Konkurrierende Markierung von PnAO und der Verbindung 3 mit Technetium-99m

Lösungen von PnAO (3 · 10&supmin;&sup8; Mol, 8 ug in 8 ul MeOH) und Verbindung 3 (3,6 · 10&supmin;&sup8; mol, 40 ug in 40 ul H&sub2;O) wurden in ein mit N2 gefülltes P6-Vial übertragen, gefolgt von 1 ml desoxidierter Salzlösung (0,9% w/v) und 20 ul wässrigem NaOH (0,1 M). Dieser Lösung wurde 1 ml Technetium-Generatorelulat (0,2 GBq), gefolgt von 0,1 ml wässriger SnCl&sub2;-Lösung (10 ug) zugegeben. Der pH-Wert der Markierungslösung war 9,0.
Die RCP der Markierungsmischung (gemessen durch die obenstehend beschriebenen TLC- und HPLC-Systeme) lieferte einen Nachweis lediglich für 99mTc-PnAO.

Beispiel 15: Bioverteilung bei Ratten

Männliche Wistar-Ratten wurden intravenös unter leichter Anästhesie mit dem Testmittel injiziert. 2 Minuten, 1 Stunde und 4 Stunden nach der Injektion wurden Tiere durch Halswirbelverrenkung geopfert, und es wurden verschiedene Organe und Gewebeproben für einen Assay des radioaktiven Gehalts entfernt. Der Prozentsatz der injizierten Dosis bei allen sezierten Organen wurde berechnet. Zudem wurde die % Dosis/Gramm Gewebe und die relative Konzentration an Aktivität für ausgewählte Organe berechnet. Die relative Konzentration ist der Anteil der Gesamtaktivität in dem Organ, geteilt durch den Anteil an Körpergewicht, den das Organ ausmacht. Falls somit eine Verbindung gleichmäßig über den Körper entsprechend dem Gewebegewicht verteilt wird, besitzt das spezielle Organ eine relative Konzentration = 1. Eine relative Konzentration > 1 bedeutet die Maskierung und/oder Retention der Verbindung und ist eine nützliche Kennzahl, wo die absolute Aufnahme (% injizierte Dosis pro Organ) gering ist.
Organe, in welchen das Testmittel gesucht wurde, schlossen die Nebennieren und das Pankreas ein, wo Somatostatin-Rezeptoren bekanntermaßen angereichert sind (siehe obenstehend). Eine Zusammenfassung der Bioverteilungsdaten ist in Tabelle 3 angegeben.

Beispiel 16: Metabolische Stabilität

Rattenhirn und -nierenhomogenate wurden durch Homogenisieren des Hirns (1,71 g) und der Nieren (2,41 g) in 10 Vol. Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung und Zentrifugieren bei 2000 U/min während 5 Minuten hergestellt. Die Verbindung 4 (50 ug) wurde durch Zinnreduktion von 99mTcO&sub4;-(0,2 GBq) bei einem pH-Wert von 9,0 radiomarkiert.
99mTc-Verbindung-4-Lösung (200 ul) wurde mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (800 ul, Kontrolle) Rattennierenhomogenat (800 ul) und Rattenhirnhomogenat (800 ul) gemischt und bei 37ºC inkubiert. HPLC-Analysen unter Einsatz des in Beispiel 13 beschriebenen Systems für 99mTc-markierte Peptide wurden mit jeder einzelnen Probe bei etwa 1 und 3 Stunden nach dem Mischen durchgeführt.
Die Chromatogramme zeigen nur wenig Unterschied zwischen der ursprünglichen markierten Verbindung 4, der verdünnten Kontrolle und den Homogenatproben. Es kommt zu einer minimalen Zersetzung bei 3 h bei der Nierenprobe im Vergleich mit den Kontrollen.

Erörterung

Zusammenfassend lässt sich bei Verwendung der Nebennieren- und Pankreasaufnahme und -retention als Indikatoren der Somatostatin-Rezeptoraffinität und metabolischen Stabilität erkennen, dass die Verwendung eines flexiblen Linkers, welcher nicht einer Peptidase-Abspaltung zwischen dem Peptid und Radiometallkomplex unterliegt, dramatisch die Rezeptorretention der Radiomarkierung erhöht. Daher zeigt die 99mTc-Verbindung 6 eine hervorragende Nebennieren- und Pankreasaufnahme und -retention, wohingegen eine direkte Verbindung (99mTc-Verbindung 4) oder die Verwendung eines metabolisierbaren Tetrapeptid-Spacers (99mTc- Verbindung 5) eine deutlich herabgesetzte Retention der Aktivität zeigen. Die metabolische Stabilität der 99mTc-Verbindung 4 wurde weiter in vitro bei Rattennierenhomogenat untersucht (Beispiel 16). Die Resultate sind in Fig. 1 gezeigt. Es lässt sich erkennen, dass die 99mTc- Verbindung eine metabolische Stabilität vergleichbar mit Octreotid zeigt (wo der Carboxy- Terminus durch Reduktion zu einem Alkohol blockiert wurde), wohingegen Somatostatin rasch metabolisiert wird.
Anhand von Tabelle 3 kann man ersehen, dass eine Somatostatin-Rezeptor-Bindung von ¹²³I-SS14 in den Nebennierendrüsen und dem Pankreasgewebe nachgewiesen werden kann. Einige Unterschiede zwischen der relativen Nebennieren- und Pankreaskonzentration des Tracers können auf das Vorliegen unterschiedlicher Rezeptor-Untertypen in dem Gewebe zurückzuführen sein. Alternativ kann der Wert für die Aufnahme in dem Pankreas einen Grad der Unsicherheit infolge der größeren Schwierigkeit bei der Darstellung des Gewebes während der Sezierung beinhalten.
Es lässt sich erkennen, dass es eine deutliche SS-ähnliche Bindung von ¹²³I-SS14 bei 2 Minuten nach Injektion (p.i.) gab, doch wurde diese Aktivität bei 1 und 4 Stunden p.i. nicht beibehalten. Die ¹²³I-Verbindung 1, die bekanntermaßen eine höhere in-vivo-Stabilität besitzt, zeigt eine SS-Bindung bei 2 min und 1 Stunde p.i., dabei eine Abnahme bei 4 Stunden. Die Zusetzung von Trägerpeptid vermindert die SS-Rezeptor-Bindung in den Nebennieren um 50-60%.
Die ¹²³I-Verbindung 3 zeigt SS-Rezeptor-Bindungsaktivität bei 2 min p.i., allerdings wurde diese nicht bei 1 und 4 Stunden aufrechterhalten. Da die ¹²³I-Verbindung 3 einen ungeschützten Carboxyterminus besitzt, nahm man an, dass die Abnahme der Bindung bei 1 und 4 Stunden wie im Falle von SS-14 auf den in-vivo-Metabolismus durch Carboxypeptidasen zurückzuführen war. Dies zeigt sich in dem gestiegenen Anteil an freiem, in vivo erzeugtem Iod, der durch die Schilddrüse bei 4 Stunden p.i. aufgenommen wurde.
Die Verbindung 3 kann Technetium-markiert sein, doch zeigt die Tc-Verbindung 3 keine spezifische Rezeptor-Bindungsaktivität, was nahe legt, dass eine direkte Markierung des Peptids das Bindungsepitop stören kann.
Die I-Verbindung 4 zeigt eine deutlich verminderte Bindung trotz der Stabilisierung des Carboxyterminus des Peptids. Die Tc-markierte Verbindung 4 zeigt ebenfalls eine geringe spezifische Bindungsaktivität. Dies soll auf die sterische Behinderung der SS-Rezeptor-Bindung durch die Technetium-Chelatbildungseinheit zurückzuführen sein.
Der Einschluss eines Linkers zwischen dem Peptid und dem Chelat stellt die SS- Rezeptor-Bindungsaktivität bei der I-Verbindung 5 und der I-Verbindung 6 wieder her. Beide Verbindungen zeigten eine anfängliche Aufnahme vergleichbar der I-SS14- und I-Verbindung 1, wohingegen die Retention bei 1 und 4 Stunden p.i. vermutlich größer ist als diejenige der I- Verbindung 1.
Allerdings zeigt die Tc-Verbindung-5-Aufnahme in den Nebennieren kein Anzeichen von SS-Bindungsaktivität, obwohl die I-Verbindung 5 einen relativ hohen prozentualen Nebennieren- und Pankreas-Injektionsdosisprozentsatz aufweist. Da der Linker in Verbindung 5 ein Tripeptid ist, ist es möglich, dass das Technetium und die Chelatbildungseinheit von dem Bindungspeptid in vivo abgespalten werden. Es ist unwahrscheinlich, dass freies Technetium von dem Chelat freigesetzt wird, da es kein Anzeichen für eine Pertechnetat-Aufnahme durch die Schilddrüse gibt.
Die Verwendung eines weniger labilen Linkers in der Verbindung 6 scheint das Peptid- Chelat gegen diesen in-vivo-Metabolismus zu stabilisieren, so dass die Tc-Verbindung 6 vermutlich durch das Vorhandensein der Träger- Verbindung 6, die in dem Präparat vorliegt, verringert wird. Wenn eine vergleichbare Menge an Träger der I-Verbindung 6 zugesetzt wird, wird dieselbe Menge an Aktivität in den Nebennieren und dem Pankreas wie für die Technetiummarkierte Verbindung 6 wiedergewonnen. Tabelle 3

Claims

1. Konjugat, umfassend ein lineares oder cyclisches synthetisches Peptid aus 3-50 Aminosäuren, das über eine seiner Carboxylgruppen und wahlweise über eine Verbindungsgruppe an eine mehrzähnige Metall-Chelatbildungsgruppe gebunden ist, mit dem Resultat, daß endo- oder exo- Peptidasemetabolismus des Peptids im wesentlichen inhibiert ist, mit den Maßgaben, daß:

a) die Peptidkette eine biologische Targeting-Sequenz enthält, welche biologisch aktiv ist;

b) wenn der Spacer abwesend ist, die Metall-Chelatbildungsgruppe nicht nur alleine Peptidgruppen umfaßt;

c) die Metall-Chelatbildungsgruppe keine Thioldonoren enthält.

2. Konjugat nach Anspruch 1 der Formel:

(Peptid-CONR-(A)p)q-L

worin bedeuten: L die Metall-Chelatbildungsgruppe;

p 0 bis 10;

q 1 bis 3;

A gleich oder verschieden ist und unabhängig gewählt ist, so daß

A -CR&sub2;- sein kann

AA -(CO)NR-, -NR(CO)- oder -CR=CR- sein kann

AAA -CR&sub2;QCR&sub2;- ist; worin Q=O, S oder NR;

R unabhängig H, linearer oder verzweigter C&sub1;&submin;&sub6;-Kohlenwasserstoff, welcher Alkyl oder ein oder mehrere Alkenyl sein kann; Alkoxy; Alkoxyalkyl; primäres, sekundäres oder tertiäres Amid; primäres, sekundäres oder tertiäres Amin; Hydroxy; Hydroxyalkyl; Carbonsäure; Aryl oder Heteroaryl ist; oder 2 R-Gruppen zusammen mit den Atomen, an welche sie gebunden sind, einen carbocyclischen, heterocyclischen, gesättigten oder ungesättigten Ring bilden.

3. Konjugat nach den Ansprüchen 1 und 2, wobei die Metall-Chelatbildungsgruppe vierzähnig ist.

4. Konjugat nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei die Metall-Chelatbildungsgruppe ein Diamindioxin der Formel ist:

worin R wie oben in Anspruch 2 definiert ist.

n 2 bis 5 ist,

m 1 oder 2 ist,

mit den Maßgaben, daß:

- eine oder beide der Amingruppen ein Amiddonor sein können;

- 1 bis 3 der R-Gruppen -(A)pNR(CO)-Peptid ist.

5. Komplex, umfassend ein Konjugat nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4 und ein durch die Metall-Chelatbildungsgruppe chelatisiertes Metallatom.

6. Komplex nach Anspruch 5 zur Verwendung in der Medizin.

7. Verwendung eines Konjugats oder Komplexes nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Herstellung eines Arzneimittels für die Radioabbildung.