JP4186532B2 - 新規な金属錯体、及びそれを用いるタンパク質のアミノ酸配列決定方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定試薬として有用な新規な金属錯体、及びそれを用いるタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質のＮ末端からのアミノ酸配列決定法として、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）でタンパク質のＮ末端アミノ酸を標識し、Ｎ末端アミノ酸を２−アニリノ−５−チアゾリノン誘導体として脱離させ、これを３−フェニルチオヒダントイン誘導体（ＰＴＨアミノ酸）に変換し、この最終生成物である３−フェニルチオヒダントイン誘導体を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析してアミノ酸を同定する各工程を有するエドマン法が一般的に行われている。ＨＰＬＣによるアミノ酸のフェニルチオヒダントイン誘導体の分析は、通常２６９ｎｍのＵＶ吸収を用いて行われるが、その吸光係数が小さく検出感度は低い。また、エドマン反応自身が時間を要するものである。
【０００３】
また、エドマン法の改良法として、ＰＩＴＣの代わりにフルオレセインイソチオシアネートなどの蛍光物質を用いて、タンパク質のＮ末端アミノ酸を標識し、タンパク質のＮ末端からのアミノ酸配列を決定する方法も報告されている。しかし、この方法においても、蛍光物質による標識後に得られる最終生成物の蛍光強度が小さく検出感度が低いという問題や、最終生成物の安定性が低いという問題がある。
【０００４】
一方、質量分析装置を用いるタンパク質のアミノ酸配列決定法としては、ＬＣＭＳのタンデムマススペクトロメトリー（ＣＩＤ）による de novo配列解析や、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦＭＳのＰＳＤ (Post Source Decay)による de novo配列解析が活発に研究されている。例えば、Charge Remote Fragmentation of PeptidesFollowing Attachment of a Fixed Positive Charge: A Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Postsource Decay Study, Pao-Chi Liao et al., J Am Soc Mass Spectrom 1997, 8, 501-509 、A method for high-sensitivity peptide sequencing using postsource decay matrix-assisted laser desorption ionization, T.Keough et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 96, pp. 7131-7136 (1999)、Peptide sequencing of charged derivatives by postsource decay MALDI mass spectrometry, B. Spengler et al., International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes 169/170(1997) 127-140 等である。しかしながら、従来の質量分析装置を用いる方法では、目的とするイオンのみを、種々生成する可能性のあるイオン種（ｂ、ｙ、ｃ、ｚ、ａ、ｘ）の中から高感度に検出する方法は未だ完成されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このような情況から、質量分析装置を用いて、迅速且つ高感度なタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列を決定する方法の開発が望まれる。
【０００６】
本発明の目的は、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定試薬として有用な新規な金属錯体を提供することにある。また、本発明の目的は、新規な金属錯体を含むタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定試薬を提供することにある。さらに、本発明の目的は、新規な金属錯体を用いるタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討した結果、アミノ酸配列決定試薬として、タンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基あるいはＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基と共有結合を形成可能な官能基を有する金属錯体を用いて、金属錯体の官能基と、タンパク質又はペプチドの前記アミノ基あるいは前記カルボキシル基とが、質量分析におけるイオン化の段階で開裂しない共有結合を形成した金属錯体誘導体を得て、得られた金属錯体誘導体を質量分析法により解析することによって、迅速且つ高感度な解析が行い得ることを見いだし、本発明に到達した。
【０００８】
本発明には、次の発明が含まれる。
（１） タンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基あるいはＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基と共有結合を形成可能な官能基を有し、
タンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基あるいはＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基と、前記官能基との間で形成される共有結合は、質量分析におけるイオン化の段階で開裂しないものである金属錯体。
【０００９】
（２） タンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基あるいはＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基と共有結合を形成可能な官能基を有する配位子を有する、前記（１）の金属錯体。
【００１０】
（３） 金属錯体の金属元素は、遷移金属及び典型金属から選ばれる、前記（１）又は（２）の金属錯体。
（４） 金属錯体の配位数は、２、３、４、５又は６である、前記（１）〜（３）のうちのいずれかの金属錯体。
（５） 金属錯体の配位子は、単座配位子又は多座配位子である、前記（１）〜（４）のうちのいずれかの金属錯体。
【００１２】
（６） タンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基と共有結合を形成可能な官能基が、前記アミノ基の求核反応により共有結合を形成可能な官能基である、前記（１）〜（５）のうちのいずれかの金属錯体。
【００１３】
（７） タンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基と共有結合を形成可能な官能基が、−ＣＯ−ＯＲ１基（ここで、Ｒ１はＨ又は活性エステル形成基を表す。）である、前記（１）〜（６）のうちのいずれかの金属錯体。
【００１４】
（８） 下記一般式（Ｉ）：
（Ｌ２）m Ｍ（Ｌ１） （Ｉ）
〔式中、Ｍは遷移金属を表し、Ｌ１は置換基：−ＣＯ−ＯＲ１基（ここで、Ｒ１はＨ又は活性エステル形成基を表す。）又は−Ｒ２−ＣＯ−ＯＲ１基（ここで、Ｒ２はアリーレン基又はアルキレン基を表し、Ｒ１はＨ又は活性エステル形成基を表す。）を有する配位子を表し、Ｌ２は配位子を表し、ｍはＬ２の数であり０、１、２、３、４又は５を表す。〕
で示される、前記（１）〜（７）のうちのいずれかの金属錯体。
【００１５】
（９） 下記一般式（II）：
【化３】
〔式中、Ｍは遷移金属を表し、Ｒ１はＨ又は下記式：
【化４】
のいずれかで表される活性エステル形成基を表す。〕
で示される、前記（１）〜（８）のうちのいずれかの金属錯体。
【００１６】
（１０） タンパク質又はペプチドのＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基と共有結合を形成可能な官能基が、前記カルボキシル基への求核反応により共有結合を形成可能な官能基である、前記（１）〜（５）のうちのいずれかの金属錯体。
【００１７】
（１１） タンパク質又はペプチドのＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基と共有結合を形成可能な官能基が、−ＮＨ２基又は−ＮＨＮＨ２基である、前記（１）〜（５）、（１０）のうちのいずれかの金属錯体。
【００１８】
（１２） 下記一般式(III) ：
（Ｌ２）m Ｍ（Ｌ３） (III)
〔式中、Ｍは遷移金属を表し、Ｌ３は置換基：−ＮＨ２基、−ＮＨＮＨ２基、−Ｒ２−ＮＨ２基又は−Ｒ２−ＮＨＮＨ２基（ここで、Ｒ２はアリーレン基又はアルキレン基を表す。）を有する配位子を表し、Ｌ２は配位子を表し、ｍはＬ２の数であり０、１、２、３、４又は５を表す。〕
で示される、前記（１）〜（５）、（１０）、（１１）のうちのいずれかの金属錯体。
【００１９】
（１３） 前記（１）〜（１２）のうちのいずれかの金属錯体を含む、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定試薬。
【００２０】
（１４） 前記（１）〜（１２）のうちのいずれかの金属錯体を用いて、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
【００２１】
（１５） 前記（１）〜（１２）のうちのいずれかの金属錯体をアミノ酸配列を決定すべきタンパク質又はペプチド（Ａ）と反応させ、金属錯体の官能基と、タンパク質又はペプチド（Ａ）のＮ末端アミノ酸残基のアミノ基あるいはＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基とが共有結合を形成した金属錯体誘導体（Ｂ）を得て、
金属錯体誘導体（Ｂ）を質量分析法により解析し、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明は、錯体１分子中に、タンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基あるいはＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基と共有結合を形成可能な１つの官能基を有する金属錯体であり、通常は、前記官能基は金属錯体の配位子中に含まれる。例えば、前記官能基は、フェニレン基等のアリーレン基や、アルキレン基等を介して金属錯体の配位子中に含まれる。
【００２３】
金属錯体の金属元素は遷移金属及び典型金属の中から選ばれる。遷移金属としては、例えば、Ｓｃ、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｏ、Ｔｃ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｔａ、Ｗ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ等が挙げられる。典型金属としては、例えば、Ｚｎ、Ａｌ、Ａｓ、Ｓｉ、Ｐ等が挙げられる。これらのうち、好ましい金属としては、Ｒｕ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ等が挙げられる。
【００２４】
金属錯体の配位数は、２、３、４、５又は６のいずれでもよいが、錯体の安定性の観点から、配位数６が好ましい。
【００２５】
また、金属錯体の配位子は、単座配位子又は多座配位子のいずれでもよい。単座配位子としては、アミン（イミダゾール等の環状アミンを含む）、ピリジン、、カルボン酸などのオキソ配位子、ハロゲン等が挙げられる。多座配位子のうち、二座配位子としては、ビピリジン、シッフ塩基、フェナントリン、オルトベンゾキノン誘導体、核酸塩基等が挙げられる。三座配位子としては、ジエチレントリアミン、ターピリジン、シッフ塩基、トリアザシクロアルカン、テトラキス（2'−アミノエチル）−1,2 −ジアミノプロパン、オクタアザビシクロ[6.6.6] アイコサン等が挙げられる。四座配位子としては、ポルフィリン及びその誘導体、フタロシアニン及びその誘導体、テトラアザシクロアルカン等が挙げられる。五座配位子としては、アミノアルキル・テトラアザシクロアルカン等が挙げられる。６座配位子としては、トリ（アミノアルキル）トリアザシクロアルカン、1,14−ジアミノ−3,6,9,12−テトラアザテトラデカン等が挙げられる。これらのうち、前記官能基を導入しやすく好ましい配位子として、ターピリジン、ビピリジン、ポルフィリン及びその誘導体（例えば、テトラフェニルポルフィリン）、フタロシアニン及びその誘導体等が挙げられる。
【００２６】
本発明において、タンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基あるいはＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基と、前記官能基との間で形成される共有結合は、質量分析におけるイオン化の段階で開裂しないものである。イオン化の段階で開裂する共有結合であれば、後述する本発明の質量分析法を用いたアミノ酸配列決定方法に利用することは困難である。
【００２７】
まず、タンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基と共有結合を形成可能な官能基を有する金属錯体（第１タイプ）について説明する。
【００２８】
この場合、金属錯体の官能基は、タンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基の求核反応により共有結合を形成可能なものである。例えば、金属錯体の官能基は、−ＣＯ−ＯＲ1基で表される。ここで、Ｒ1はＨ又は活性エステル形成基である。
【００２９】
従って、例えば、金属錯体は、一般式（Ｉ）で示される。
（Ｌ2）m Ｍ（Ｌ1） （Ｉ）
式（Ｉ）中、Ｍは上記の遷移金属を表し、Ｌ1は置換基：−ＣＯ−ＯＲ1基（ここで、Ｒ1は前記と同義である。）又は−Ｒ2−ＣＯ−ＯＲ1基（ここで、Ｒ2はアリーレン基又はアルキレン基を表し、Ｒ1は前記と同義である。）を有する配位子を表し、Ｌ2は配位子を表し、ｍはＬ2の数であり０、１、２、３、４又は５を表す。Ｒ2のアリーレン基としては、フェニレン基が挙げられ、アルキレン基としては、メチレン、エチレン、プロピレン基等の低級アルキレン基が挙げられる。アミノ基からの求核反応の受けやすさを考慮すると、Ｒ2はフェニレン基が好ましい。好ましい金属としては、Ｒｕ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ等が挙げられる。
【００３０】
好ましい金属錯体として、一般式（II）で示されるものが挙げられる。
【００３１】
【化５】
【００３２】
式（II）中、Ｍは上記の遷移金属を表し、Ｒ1はＨ又は次に例示する活性エステル形成基を表す。活性エステル形成基は、アミノ基からの求核反応が起こればよく、これらに限定されることはない。好ましい金属としては、Ｒｕ、Ｏｓ、Ｒｈ等が挙げられる。
【００３３】
【化６】
【００３４】
金属錯体の官能基として、イソシアネート基、イソチオシアネート基も考えられるが、これら官能基とタンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基との間で形成される共有結合は、質量分析におけるイオン化の段階で開裂しやすく、後述する本発明の質量分析法を用いたアミノ酸配列決定方法に利用するには不向きである。
【００３５】
本発明の上記官能基を有する金属錯体は、まず、１つの上記官能基を有する配位子を調製し、次に、この配位子と、必要により上記官能基を有しない他の配位子とを、金属に配位させて合成することができる。例えば、前記一般式（II）に示される金属錯体の場合、まず、ｐ−カルボキシルフェニル基が、４位に導入された2,2':6'2''−ターピリジンを調製する。次に、カルボキシルフェニル基が導入された2,2':6'2''−ターピリジンと、官能基が導入されていない2,2':6'2''−ターピリジンとを、金属Ｍに配位させて、カルボキシルフェニル基を有するビス（ターピリジン）金属錯体（一般式（II）においてＲ1＝Ｈ）を得る。一般式（II）においてＲ1＝活性エステル形成基の金属錯体を得るには、得られたＲ1＝Ｈの金属錯体に、カルボキシル基を活性エステル化する試薬（一般式Ｒ1−ＯＨ、具体的には例えば、Ｎヒドロキシスクシンイミド等）を縮合剤を用いて縮合させるとよい。
【００３６】
本発明の金属錯体の同定は、核磁気共鳴スペクトル、可視紫外吸収スペクトル、質量分析等により行うことができる。
【００３７】
次に、タンパク質又はペプチドのＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基と共有結合を形成可能な官能基を有する金属錯体（第２タイプ）について説明する。
【００３８】
この場合、金属錯体の官能基は、タンパク質又はペプチドのＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基への求核反応により共有結合を形成可能なものである。例えば、金属錯体の官能基は、−ＮＨ2基又は−ＮＨＮＨ2基である。
【００３９】
従って、例えば、金属錯体は、一般式(III) で示される。
（Ｌ2）m Ｍ（Ｌ3） (III)
式(III) 中、Ｍは上記の遷移金属を表し、Ｌ3は置換基：−ＮＨ2基、−ＮＨＮＨ2基、−Ｒ2−ＮＨ2基又は−Ｒ2−ＮＨＮＨ2基（ここで、Ｒ2はアリーレン基又はアルキレン基を表す。）を有する配位子を表し、Ｌ2は配位子を表し、ｍはＬ2の数であり０、１、２、３、４又は５を表す。Ｒ2のアリーレン基としては、フェニレン基が挙げられ、アルキレン基としては、メチレン、エチレン、プロピレン基等の低級アルキレン基が挙げられる。カルボキシル基への求核反応の容易さを考慮すると、Ｒ2は低級アルキレン基が好ましい。好ましい金属としては、Ｒｕ、Ｏｓ、Ｒｈ等が挙げられる。従って、好ましい金属錯体としては、Ｌ3：４位にアミノエチル基を有する2,2':6'2''−ターピリジン、Ｌ2：2,2':6'2''−ターピリジン（ｍ＝１）、Ｍ：Ｒｕ、Ｏｓ又はＲｈであるものが挙げられる。また、Ｌ3：４位にアミノフェニル基を有する2,2':6'2''−ターピリジン、Ｌ2：2,2':6'2''−ターピリジン（ｍ＝１）、Ｍ：Ｒｕ、Ｏｓ又はＲｈであるものも、好ましい金属錯体として挙げられる。
【００４０】
本発明の上記官能基を有する金属錯体（第２タイプ）の合成及び同定は、上記第１タイプの金属錯体の場合と同様に行うことができる。
【００４１】
本発明の前記官能基を有する金属錯体は、質量分析法による、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定試薬として非常に有用である。すなわち、本発明は、前記官能基を有する金属錯体を用いて、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列を決定する方法にも関する。
【００４２】
本発明のアミノ酸配列決定方法は、本発明の前記官能基を有する第１タイプの金属錯体をアミノ酸配列を決定すべきタンパク質又はペプチド（Ａ）と反応させ、金属錯体の官能基と、タンパク質又はペプチド（Ａ）のＮ末端アミノ酸残基のアミノ基とが共有結合を形成した金属錯体誘導体（Ｂ）を得て、得られた金属錯体誘導体（Ｂ）を質量分析法により解析し、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列を決定する方法である。
【００４３】
本発明のアミノ酸配列決定方法は、本発明の前記官能基を有する第２タイプの金属錯体をアミノ酸配列を決定すべきタンパク質又はペプチド（Ａ）と反応させ、金属錯体の官能基と、タンパク質又はペプチド（Ａ）のＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基とが共有結合を形成した金属錯体誘導体（Ｂ）を得て、得られた金属錯体誘導体（Ｂ）を質量分析法により解析し、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列を決定する方法である。
【００４４】
第１タイプの金属錯体を用いたアミノ酸配列決定方法についてより詳しく説明する。次の化学式には、金属錯体として、一般式（II）に属するルテニウム錯体(1) を用いた場合が示される。
【００４５】
【化７】
【００４６】
ルテニウム錯体(1) とアミノ酸配列を決定すべきタンパク質又はペプチド（Ａ）とをジメチルホルムアミド等の適切な溶媒中で反応させ、ルテニウム錯体(1)の活性エステル基と、タンパク質又はペプチド（Ａ）のＮ末端アミノ酸残基のアミノ基とがアミド結合を形成したルテニウム錯体誘導体（Ｂ）を得る。得られたルテニウム錯体誘導体（Ｂ）を含む反応溶液をメタノール等の適切な希釈溶媒で希釈して、質量分析法により測定する。ルテニウム錯体誘導体（Ｂ）の形成されたアミド結合はイオン化の段階で開裂せず、ルテニウム錯体含有イオンのイオン化効率が高いためａ系列及びｂ系列イオンが主として観測される。ルテニウム原子の同位体分布の特徴からａ系列及びｂ系列イオンが非常に見やすい。
【００４７】
質量分析法としては、特に限定されないが、ＬＣＭＳ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法を採用するとよい。ＬＣＭＳ法：液体クロマトグラフィー質量分析法、ＭＡＬＤＩ法：マトリックス支援レーザー脱離イオン化法 (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization)、ＴＯＦＭＳ法：飛行時間型質量分析法 (Time of Flight Mass Spectrometry)
【００４８】
第２タイプの金属錯体を用いた場合には、金属錯体の−ＮＨ2基又は−ＮＨＮＨ2基等の官能基と、タンパク質又はペプチドのＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基とが求核反応により共有結合を形成し、ルテニウム錯体誘導体（Ｂ）を得る。ルテニウム錯体誘導体（Ｂ）を含む反応溶液をメタノール等の適切な希釈溶媒で希釈して、質量分析法により測定する。ルテニウム錯体誘導体（Ｂ）の形成された共有結合はイオン化の段階で開裂せず、ルテニウム錯体含有イオンのイオン化効率が高いためｚ系列及びｙ系列イオンが主として観測される。ルテニウム原子の同位体分布の特徴からｚ系列及びｙ系列イオンが非常に見やすい。
【００４９】
本発明のアミノ酸配列決定方法は、エドマン反応による配列解析法に比べ、非常に迅速且つ高感度（約１００ｆｍｏｌ）である。
【００５０】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５１】
［実施例１：金属錯体の合成］
この例では、前記化７の式(1) に示されるルテニウム錯体を以下のようにして合成した。2,2':6'2''−ターピリジンをｔｐｙと表記する。
【００５２】
[(tpy)ＲｕＣｌ３]を文献（D.P.Sullivan et al., Inorg. Chem., 1980, 19, 1404-1407）の方法により合成した。4'-(4-カルボキシルフェニル）−2,2':6'2''−ターピリジン（tpy-C6H4-COOH ）を文献（G.D.Storrier et al., Inorg. Chim. Acta., 1999, 284, 76-84 ）の方法により調製した。
【００５３】
[(tpy)ＲｕＣｌ３] ２００ｍｇ（０．４５ｍｍｏｌ）、tpy-C6H4-COOH １６０ｍｇ（０．４５ｍｍｏｌ）、及びトリエチルアミン１．０ｍＬ（７．２ｍｍｏｌ）をエタノール１００ｍＬ中で、アルゴン雰囲気下、１８時間還流した。得られた反応液を減圧濃縮・乾固した。これにメタノールを注ぎ、メタノール可溶部を集め、セファデックスSephadex LH-20 のカラムを用いて精製した。精製物を一旦乾固し、水に溶解させ、その後、この水溶液にＮＨ4ＰＦ6水溶液を加え、生じた沈殿を濾取し、水洗後乾燥し、[(tpy)Ｒｕ(tpy-C6H4-COOH)](PF6)2（１１５ｍｇ、収率４５％）を得た。
【００５４】
[(tpy)Ｒｕ(tpy-C6H4-COOH)](PF6)2 ３０ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）と、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド３０ｍｇ（０．２６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル３ｍＬに溶解し、この溶液にＷＳＣＤ ０．１ｍＬ（０．５５ｍｍｏｌ）を氷冷下加え、一夜間攪拌した。得られた反応液を減圧濃縮し、その後、濃縮物に酢酸エチルを加え、生じた沈殿を濾取し、酢酸エチルで洗浄後、減圧乾燥し、[(tpy)Ｒｕ(tpy-C6H4-CO-NSu)](PF6)2（３０ｍｇ、収率９０％）を得た。
【００５５】
なお、ＷＳＣＤは水溶性カルボジイミドであって、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドである。−ＮＳｕはスクシンイミド基を表す。
【００５６】
[(tpy)Ｒｕ(tpy-C6H4-CO-NSu)](PF6)2の同定データ：
1Ｈ ＮＭＲ（３０３Ｋ、dimethyl sulfoxide-d6）：δ２．９４（brs,4H,HSU）,７．２７（m,4H,H5A,H5B）,７．４６（d,2H,J=5.6Hz,H6A）,７．５４（d,2H,J=5.2Hz,H6B）,８．０２（t,2H,J=8.0Hz,H4A）,８．０８（t,2H,J=7.6Hz,H4B）,８．４６（d,2H,J=8.4Hz,HO),８．５５（t,1H,J=8.0Hz,H4'B),８．７０（d,2H,J=8.8Hz,Hm),８．８４（d,2H,J=8.4Hz,H3B）,９．１１（t,2H,J=7.6Hz,H3A,H3 'B),９．５８（s,2H,H3'A)
ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ for Ｃ41Ｈ29Ｎ7Ｏ4Ｒｕ Ｍ2+ calcd. ３９２．４，found.３９２．４， [Ｍ＋ＰＦ6]+ calcd. ９２９．７，found.９２９．７
【００５７】
［実施例２：アミノ酸配列決定］
この例では、実施例１で合成されたＲｕ錯体(1) を用いて、アミノ酸配列決定を行った。アミノ酸サンプルとして、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−ＯＨを用いた。
【００５８】
化７を参照して、試薬（Ｒｕ錯体(1) ）と、当量のＨ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−ＯＨとをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し、室温で一夜間攪拌し、反応させた。
【００５９】
式(B) で示されるＲｕ錯体誘導体を含む反応溶液をメタノールで希釈し、ＬＣＭＳ（ＥＳＩＭＳ）測定した。図１〜４に得られたＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータ（イオントラップ）チャートを示す（縦軸：相対強度（％））。これらの図中の表記、及び以下の説明については、化７に示されているように、式(B) のＲｕ錯体誘導体のフェニレン基を含む配位子までの部分が便宜的にＲｕとして表されている。
【００６０】
図１において、（ａ）は、上記で調製されたＲｕ錯体誘導体(B) Ｒｕ−ＣＯ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−ＯＨのＥＳＩＭＳチャートであり、（ｂ）は、このピークをペアレントイオン（親イオン）としてＭＳ2を行った結果のチャートである。
図２において、（ａ）は、ＭＳ2のチャートであり、（ｂ）は、ＭＳ2のピークをペアレントイオンとしてＭＳ3を行った結果のチャートである。
同様に、図３において、（ａ）は、ＭＳ3のチャートであり、（ｂ）は、ＭＳ3のピークをペアレントイオンとしてＭＳ4を行った結果のチャートである。
同様に、図４において、（ａ）は、ＭＳ4のチャートであり、（ｂ）は、ＭＳ4のピークをペアレントイオンとしてＭＳ5を行った結果のチャートである。
【００６１】
これらの結果から、実施例１で合成されたＲｕ錯体(1) を用いて、アミノ酸配列決定が容易に高感度に行えることが明らかである。
【００６２】
【発明の効果】
本発明によれば、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定試薬として有用な新規な金属錯体が提供され、新規な金属錯体を含むタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定試薬が提供される。
【００６３】
さらに、本発明によれば、新規な金属錯体を用いる質量分析法によるタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法が提供される。本発明のアミノ酸配列決定方法は、迅速に且つ高感度で行うことができる点で非常に優れている。
【００６４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例で得られたＥＳＩＭＳチャートである。
【図２】 実施例で得られたＥＳＩＭＳチャートである。
【図３】 実施例で得られたＥＳＩＭＳチャートである。
【図４】 実施例で得られたＥＳＩＭＳチャートである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定試薬として有用な新規な金属錯体、及びそれを用いるタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質のＮ末端からのアミノ酸配列決定法として、フェニルイソチオシアネート（ＰＩＴＣ）でタンパク質のＮ末端アミノ酸を標識し、Ｎ末端アミノ酸を２−アニリノ−５−チアゾリノン誘導体として脱離させ、これを３−フェニルチオヒダントイン誘導体（ＰＴＨアミノ酸）に変換し、この最終生成物である３−フェニルチオヒダントイン誘導体を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分析してアミノ酸を同定する各工程を有するエドマン法が一般的に行われている。ＨＰＬＣによるアミノ酸のフェニルチオヒダントイン誘導体の分析は、通常２６９ｎｍのＵＶ吸収を用いて行われるが、その吸光係数が小さく検出感度は低い。また、エドマン反応自身が時間を要するものである。
【０００３】
また、エドマン法の改良法として、ＰＩＴＣの代わりにフルオレセインイソチオシアネートなどの蛍光物質を用いて、タンパク質のＮ末端アミノ酸を標識し、タンパク質のＮ末端からのアミノ酸配列を決定する方法も報告されている。しかし、この方法においても、蛍光物質による標識後に得られる最終生成物の蛍光強度が小さく検出感度が低いという問題や、最終生成物の安定性が低いという問題がある。
【０００４】
一方、質量分析装置を用いるタンパク質のアミノ酸配列決定法としては、ＬＣＭＳのタンデムマススペクトロメトリー（ＣＩＤ）による de novo配列解析や、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦＭＳのＰＳＤ (Post Source Decay)による de novo配列解析が活発に研究されている。例えば、Charge Remote Fragmentation of PeptidesFollowing Attachment of a Fixed Positive Charge: A Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Postsource Decay Study, Pao-Chi Liao et al., J Am Soc Mass Spectrom 1997, 8, 501-509 、A method for high-sensitivity peptide sequencing using postsource decay matrix-assisted laser desorption ionization, T.Keough et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 96, pp. 7131-7136 (1999)、Peptide sequencing of charged derivatives by postsource decay MALDI mass spectrometry, B. Spengler et al., International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes 169/170(1997) 127-140 等である。しかしながら、従来の質量分析装置を用いる方法では、目的とするイオンのみを、種々生成する可能性のあるイオン種（ｂ、ｙ、ｃ、ｚ、ａ、ｘ）の中から高感度に検出する方法は未だ完成されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このような情況から、質量分析装置を用いて、迅速且つ高感度なタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列を決定する方法の開発が望まれる。
【０００６】
本発明の目的は、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定試薬として有用な新規な金属錯体を提供することにある。また、本発明の目的は、新規な金属錯体を含むタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定試薬を提供することにある。さらに、本発明の目的は、新規な金属錯体を用いるタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討した結果、アミノ酸配列決定試薬として、タンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基あるいはＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基と共有結合を形成可能な官能基を有する金属錯体を用いて、金属錯体の官能基と、タンパク質又はペプチドの前記アミノ基あるいは前記カルボキシル基とが、質量分析におけるイオン化の段階で開裂しない共有結合を形成した金属錯体誘導体を得て、得られた金属錯体誘導体を質量分析法により解析することによって、迅速且つ高感度な解析が行い得ることを見いだし、本発明に到達した。
【０００８】
本発明には、次の発明が含まれる。
（１） タンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基あるいはＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基と共有結合を形成可能な官能基を有し、
タンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基あるいはＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基と、前記官能基との間で形成される共有結合は、質量分析におけるイオン化の段階で開裂しないものである金属錯体。
【０００９】
（２） タンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基あるいはＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基と共有結合を形成可能な官能基を有する配位子を有する、前記（１）の金属錯体。
【００１０】
（３） 金属錯体の金属元素は、遷移金属及び典型金属から選ばれる、前記（１）又は（２）の金属錯体。
（４） 金属錯体の配位数は、２、３、４、５又は６である、前記（１）〜（３）のうちのいずれかの金属錯体。
（５） 金属錯体の配位子は、単座配位子又は多座配位子である、前記（１）〜（４）のうちのいずれかの金属錯体。
【００１２】
（６） タンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基と共有結合を形成可能な官能基が、前記アミノ基の求核反応により共有結合を形成可能な官能基である、前記（１）〜（５）のうちのいずれかの金属錯体。
【００１３】
（７） タンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基と共有結合を形成可能な官能基が、−ＣＯ−ＯＲ１基（ここで、Ｒ１はＨ又は活性エステル形成基を表す。）である、前記（１）〜（６）のうちのいずれかの金属錯体。
【００１４】
（８） 下記一般式（Ｉ）：
（Ｌ２）m Ｍ（Ｌ１） （Ｉ）
〔式中、Ｍは遷移金属を表し、Ｌ１は置換基：−ＣＯ−ＯＲ１基（ここで、Ｒ１はＨ又は活性エステル形成基を表す。）又は−Ｒ２−ＣＯ−ＯＲ１基（ここで、Ｒ２はアリーレン基又はアルキレン基を表し、Ｒ１はＨ又は活性エステル形成基を表す。）を有する配位子を表し、Ｌ２は配位子を表し、ｍはＬ２の数であり０、１、２、３、４又は５を表す。〕
で示される、前記（１）〜（７）のうちのいずれかの金属錯体。
【００１５】
（９） 下記一般式（II）：
【化３】
【化４】
で示される、前記（１）〜（８）のうちのいずれかの金属錯体。
【００１６】
（１０） タンパク質又はペプチドのＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基と共有結合を形成可能な官能基が、前記カルボキシル基への求核反応により共有結合を形成可能な官能基である、前記（１）〜（５）のうちのいずれかの金属錯体。
【００１７】
（１１） タンパク質又はペプチドのＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基と共有結合を形成可能な官能基が、−ＮＨ２基又は−ＮＨＮＨ２基である、前記（１）〜（５）、（１０）のうちのいずれかの金属錯体。
【００１８】
（１２） 下記一般式(III) ：
（Ｌ２）m Ｍ（Ｌ３） (III)
〔式中、Ｍは遷移金属を表し、Ｌ３は置換基：−ＮＨ２基、−ＮＨＮＨ２基、−Ｒ２−ＮＨ２基又は−Ｒ２−ＮＨＮＨ２基（ここで、Ｒ２はアリーレン基又はアルキレン基を表す。）を有する配位子を表し、Ｌ２は配位子を表し、ｍはＬ２の数であり０、１、２、３、４又は５を表す。〕
で示される、前記（１）〜（５）、（１０）、（１１）のうちのいずれかの金属錯体。
【００１９】
（１３） 前記（１）〜（１２）のうちのいずれかの金属錯体を含む、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定試薬。
【００２０】
（１４） 前記（１）〜（１２）のうちのいずれかの金属錯体を用いて、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
【００２１】
（１５） 前記（１）〜（１２）のうちのいずれかの金属錯体をアミノ酸配列を決定すべきタンパク質又はペプチド（Ａ）と反応させ、金属錯体の官能基と、タンパク質又はペプチド（Ａ）のＮ末端アミノ酸残基のアミノ基あるいはＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基とが共有結合を形成した金属錯体誘導体（Ｂ）を得て、
金属錯体誘導体（Ｂ）を質量分析法により解析し、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明は、錯体１分子中に、タンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基あるいはＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基と共有結合を形成可能な１つの官能基を有する金属錯体であり、通常は、前記官能基は金属錯体の配位子中に含まれる。例えば、前記官能基は、フェニレン基等のアリーレン基や、アルキレン基等を介して金属錯体の配位子中に含まれる。
【００２３】
金属錯体の金属元素は遷移金属及び典型金属の中から選ばれる。遷移金属としては、例えば、Ｓｃ、Ｔｉ、Ｖ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｏ、Ｔｃ、Ｒｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｔａ、Ｗ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ、Ａｕ等が挙げられる。典型金属としては、例えば、Ｚｎ、Ａｌ、Ａｓ、Ｓｉ、Ｐ等が挙げられる。これらのうち、好ましい金属としては、Ｒｕ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ等が挙げられる。
【００２４】
金属錯体の配位数は、２、３、４、５又は６のいずれでもよいが、錯体の安定性の観点から、配位数６が好ましい。
【００２５】
また、金属錯体の配位子は、単座配位子又は多座配位子のいずれでもよい。単座配位子としては、アミン（イミダゾール等の環状アミンを含む）、ピリジン、、カルボン酸などのオキソ配位子、ハロゲン等が挙げられる。多座配位子のうち、二座配位子としては、ビピリジン、シッフ塩基、フェナントリン、オルトベンゾキノン誘導体、核酸塩基等が挙げられる。三座配位子としては、ジエチレントリアミン、ターピリジン、シッフ塩基、トリアザシクロアルカン、テトラキス（2'−アミノエチル）−1,2 −ジアミノプロパン、オクタアザビシクロ[6.6.6] アイコサン等が挙げられる。四座配位子としては、ポルフィリン及びその誘導体、フタロシアニン及びその誘導体、テトラアザシクロアルカン等が挙げられる。五座配位子としては、アミノアルキル・テトラアザシクロアルカン等が挙げられる。６座配位子としては、トリ（アミノアルキル）トリアザシクロアルカン、1,14−ジアミノ−3,6,9,12−テトラアザテトラデカン等が挙げられる。これらのうち、前記官能基を導入しやすく好ましい配位子として、ターピリジン、ビピリジン、ポルフィリン及びその誘導体（例えば、テトラフェニルポルフィリン）、フタロシアニン及びその誘導体等が挙げられる。
【００２６】
本発明において、タンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基あるいはＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基と、前記官能基との間で形成される共有結合は、質量分析におけるイオン化の段階で開裂しないものである。イオン化の段階で開裂する共有結合であれば、後述する本発明の質量分析法を用いたアミノ酸配列決定方法に利用することは困難である。
【００２７】
まず、タンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基と共有結合を形成可能な官能基を有する金属錯体（第１タイプ）について説明する。
【００２８】
この場合、金属錯体の官能基は、タンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基の求核反応により共有結合を形成可能なものである。例えば、金属錯体の官能基は、−ＣＯ−ＯＲ1基で表される。ここで、Ｒ1はＨ又は活性エステル形成基である。
【００２９】
従って、例えば、金属錯体は、一般式（Ｉ）で示される。
（Ｌ2）m Ｍ（Ｌ1） （Ｉ）
式（Ｉ）中、Ｍは上記の遷移金属を表し、Ｌ1は置換基：−ＣＯ−ＯＲ1基（ここで、Ｒ1は前記と同義である。）又は−Ｒ2−ＣＯ−ＯＲ1基（ここで、Ｒ2はアリーレン基又はアルキレン基を表し、Ｒ1は前記と同義である。）を有する配位子を表し、Ｌ2は配位子を表し、ｍはＬ2の数であり０、１、２、３、４又は５を表す。Ｒ2のアリーレン基としては、フェニレン基が挙げられ、アルキレン基としては、メチレン、エチレン、プロピレン基等の低級アルキレン基が挙げられる。アミノ基からの求核反応の受けやすさを考慮すると、Ｒ2はフェニレン基が好ましい。好ましい金属としては、Ｒｕ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｏｓ、Ｉｒ、Ｐｔ等が挙げられる。
【００３０】
好ましい金属錯体として、一般式（II）で示されるものが挙げられる。
【００３１】
【化５】
式（II）中、Ｍは上記の遷移金属を表し、Ｒ1はＨ又は次に例示する活性エステル形成基を表す。活性エステル形成基は、アミノ基からの求核反応が起こればよく、これらに限定されることはない。好ましい金属としては、Ｒｕ、Ｏｓ、Ｒｈ等が挙げられる。
【００３３】
【化６】
金属錯体の官能基として、イソシアネート基、イソチオシアネート基も考えられるが、これら官能基とタンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基との間で形成される共有結合は、質量分析におけるイオン化の段階で開裂しやすく、後述する本発明の質量分析法を用いたアミノ酸配列決定方法に利用するには不向きである。
【００３５】
本発明の上記官能基を有する金属錯体は、まず、１つの上記官能基を有する配位子を調製し、次に、この配位子と、必要により上記官能基を有しない他の配位子とを、金属に配位させて合成することができる。例えば、前記一般式（II）に示される金属錯体の場合、まず、ｐ−カルボキシルフェニル基が、４位に導入された2,2':6'2''−ターピリジンを調製する。次に、カルボキシルフェニル基が導入された2,2':6'2''−ターピリジンと、官能基が導入されていない2,2':6'2''−ターピリジンとを、金属Ｍに配位させて、カルボキシルフェニル基を有するビス（ターピリジン）金属錯体（一般式（II）においてＲ1＝Ｈ）を得る。一般式（II）においてＲ1＝活性エステル形成基の金属錯体を得るには、得られたＲ1＝Ｈの金属錯体に、カルボキシル基を活性エステル化する試薬（一般式Ｒ1−ＯＨ、具体的には例えば、Ｎヒドロキシスクシンイミド等）を縮合剤を用いて縮合させるとよい。
【００３６】
本発明の金属錯体の同定は、核磁気共鳴スペクトル、可視紫外吸収スペクトル、質量分析等により行うことができる。
【００３７】
次に、タンパク質又はペプチドのＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基と共有結合を形成可能な官能基を有する金属錯体（第２タイプ）について説明する。
【００３８】
この場合、金属錯体の官能基は、タンパク質又はペプチドのＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基への求核反応により共有結合を形成可能なものである。例えば、金属錯体の官能基は、−ＮＨ2基又は−ＮＨＮＨ2基である。
【００３９】
従って、例えば、金属錯体は、一般式(III) で示される。
（Ｌ2）m Ｍ（Ｌ3） (III)
式(III) 中、Ｍは上記の遷移金属を表し、Ｌ3は置換基：−ＮＨ2基、−ＮＨＮＨ2基、−Ｒ2−ＮＨ2基又は−Ｒ2−ＮＨＮＨ2基（ここで、Ｒ2はアリーレン基又はアルキレン基を表す。）を有する配位子を表し、Ｌ2は配位子を表し、ｍはＬ2の数であり０、１、２、３、４又は５を表す。Ｒ2のアリーレン基としては、フェニレン基が挙げられ、アルキレン基としては、メチレン、エチレン、プロピレン基等の低級アルキレン基が挙げられる。カルボキシル基への求核反応の容易さを考慮すると、Ｒ2は低級アルキレン基が好ましい。好ましい金属としては、Ｒｕ、Ｏｓ、Ｒｈ等が挙げられる。従って、好ましい金属錯体としては、Ｌ3：４位にアミノエチル基を有する2,2':6'2''−ターピリジン、Ｌ2：2,2':6'2''−ターピリジン（ｍ＝１）、Ｍ：Ｒｕ、Ｏｓ又はＲｈであるものが挙げられる。また、Ｌ3：４位にアミノフェニル基を有する2,2':6'2''−ターピリジン、Ｌ2：2,2':6'2''−ターピリジン（ｍ＝１）、Ｍ：Ｒｕ、Ｏｓ又はＲｈであるものも、好ましい金属錯体として挙げられる。
【００４０】
本発明の上記官能基を有する金属錯体（第２タイプ）の合成及び同定は、上記第１タイプの金属錯体の場合と同様に行うことができる。
【００４１】
本発明の前記官能基を有する金属錯体は、質量分析法による、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定試薬として非常に有用である。すなわち、本発明は、前記官能基を有する金属錯体を用いて、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列を決定する方法にも関する。
【００４２】
本発明のアミノ酸配列決定方法は、本発明の前記官能基を有する第１タイプの金属錯体をアミノ酸配列を決定すべきタンパク質又はペプチド（Ａ）と反応させ、金属錯体の官能基と、タンパク質又はペプチド（Ａ）のＮ末端アミノ酸残基のアミノ基とが共有結合を形成した金属錯体誘導体（Ｂ）を得て、得られた金属錯体誘導体（Ｂ）を質量分析法により解析し、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列を決定する方法である。
【００４３】
本発明のアミノ酸配列決定方法は、本発明の前記官能基を有する第２タイプの金属錯体をアミノ酸配列を決定すべきタンパク質又はペプチド（Ａ）と反応させ、金属錯体の官能基と、タンパク質又はペプチド（Ａ）のＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基とが共有結合を形成した金属錯体誘導体（Ｂ）を得て、得られた金属錯体誘導体（Ｂ）を質量分析法により解析し、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列を決定する方法である。
【００４４】
第１タイプの金属錯体を用いたアミノ酸配列決定方法についてより詳しく説明する。次の化学式には、金属錯体として、一般式（II）に属するルテニウム錯体(1) を用いた場合が示される。
【００４５】
【化７】
ルテニウム錯体(1) とアミノ酸配列を決定すべきタンパク質又はペプチド（Ａ）とをジメチルホルムアミド等の適切な溶媒中で反応させ、ルテニウム錯体(1)の活性エステル基と、タンパク質又はペプチド（Ａ）のＮ末端アミノ酸残基のアミノ基とがアミド結合を形成したルテニウム錯体誘導体（Ｂ）を得る。得られたルテニウム錯体誘導体（Ｂ）を含む反応溶液をメタノール等の適切な希釈溶媒で希釈して、質量分析法により測定する。ルテニウム錯体誘導体（Ｂ）の形成されたアミド結合はイオン化の段階で開裂せず、ルテニウム錯体含有イオンのイオン化効率が高いためａ系列及びｂ系列イオンが主として観測される。ルテニウム原子の同位体分布の特徴からａ系列及びｂ系列イオンが非常に見やすい。
【００４７】
質量分析法としては、特に限定されないが、ＬＣＭＳ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法を採用するとよい。ＬＣＭＳ法：液体クロマトグラフィー質量分析法、ＭＡＬＤＩ法：マトリックス支援レーザー脱離イオン化法 (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization)、ＴＯＦＭＳ法：飛行時間型質量分析法 (Time of Flight Mass Spectrometry)
【００４８】
第２タイプの金属錯体を用いた場合には、金属錯体の−ＮＨ2基又は−ＮＨＮＨ2基等の官能基と、タンパク質又はペプチドのＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基とが求核反応により共有結合を形成し、ルテニウム錯体誘導体（Ｂ）を得る。ルテニウム錯体誘導体（Ｂ）を含む反応溶液をメタノール等の適切な希釈溶媒で希釈して、質量分析法により測定する。ルテニウム錯体誘導体（Ｂ）の形成された共有結合はイオン化の段階で開裂せず、ルテニウム錯体含有イオンのイオン化効率が高いためｚ系列及びｙ系列イオンが主として観測される。ルテニウム原子の同位体分布の特徴からｚ系列及びｙ系列イオンが非常に見やすい。
【００４９】
本発明のアミノ酸配列決定方法は、エドマン反応による配列解析法に比べ、非常に迅速且つ高感度（約１００ｆｍｏｌ）である。
【００５０】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５１】
［実施例１：金属錯体の合成］
この例では、前記化７の式(1) に示されるルテニウム錯体を以下のようにして合成した。2,2':6'2''−ターピリジンをｔｐｙと表記する。
【００５２】
[(tpy)ＲｕＣｌ３]を文献（D.P.Sullivan et al., Inorg. Chem., 1980, 19, 1404-1407）の方法により合成した。4'-(4-カルボキシルフェニル）−2,2':6'2''−ターピリジン（tpy-C6H4-COOH ）を文献（G.D.Storrier et al., Inorg. Chim. Acta., 1999, 284, 76-84 ）の方法により調製した。
【００５３】
[(tpy)ＲｕＣｌ３] ２００ｍｇ（０．４５ｍｍｏｌ）、tpy-C6H4-COOH １６０ｍｇ（０．４５ｍｍｏｌ）、及びトリエチルアミン１．０ｍＬ（７．２ｍｍｏｌ）をエタノール１００ｍＬ中で、アルゴン雰囲気下、１８時間還流した。得られた反応液を減圧濃縮・乾固した。これにメタノールを注ぎ、メタノール可溶部を集め、セファデックスSephadex LH-20 のカラムを用いて精製した。精製物を一旦乾固し、水に溶解させ、その後、この水溶液にＮＨ4ＰＦ6水溶液を加え、生じた沈殿を濾取し、水洗後乾燥し、[(tpy)Ｒｕ(tpy-C6H4-COOH)](PF6)2（１１５ｍｇ、収率４５％）を得た。
【００５４】
[(tpy)Ｒｕ(tpy-C6H4-COOH)](PF6)2 ３０ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）と、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド３０ｍｇ（０．２６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル３ｍＬに溶解し、この溶液にＷＳＣＤ ０．１ｍＬ（０．５５ｍｍｏｌ）を氷冷下加え、一夜間攪拌した。得られた反応液を減圧濃縮し、その後、濃縮物に酢酸エチルを加え、生じた沈殿を濾取し、酢酸エチルで洗浄後、減圧乾燥し、[(tpy)Ｒｕ(tpy-C6H4-CO-NSu)](PF6)2（３０ｍｇ、収率９０％）を得た。
【００５５】
なお、ＷＳＣＤは水溶性カルボジイミドであって、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドである。−ＮＳｕはスクシンイミド基を表す。
【００５６】
[(tpy)Ｒｕ(tpy-C6H4-CO-NSu)](PF6)2の同定データ：
1Ｈ ＮＭＲ（３０３Ｋ、dimethyl sulfoxide-d6）：δ２．９４（brs,4H,HSU）,７．２７（m,4H,H5A,H5B）,７．４６（d,2H,J=5.6Hz,H6A）,７．５４（d,2H,J=5.2Hz,H6B）,８．０２（t,2H,J=8.0Hz,H4A）,８．０８（t,2H,J=7.6Hz,H4B）,８．４６（d,2H,J=8.4Hz,HO),８．５５（t,1H,J=8.0Hz,H4'B),８．７０（d,2H,J=8.8Hz,Hm),８．８４（d,2H,J=8.4Hz,H3B）,９．１１（t,2H,J=7.6Hz,H3A,H3 'B),９．５８（s,2H,H3'A)
ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ for Ｃ41Ｈ29Ｎ7Ｏ4Ｒｕ Ｍ2+ calcd. ３９２．４，found.３９２．４， [Ｍ＋ＰＦ6]+ calcd. ９２９．７，found.９２９．７
【００５７】
［実施例２：アミノ酸配列決定］
この例では、実施例１で合成されたＲｕ錯体(1) を用いて、アミノ酸配列決定を行った。アミノ酸サンプルとして、Ｈ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−ＯＨを用いた。
【００５８】
化７を参照して、試薬（Ｒｕ錯体(1) ）と、当量のＨ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−ＯＨとをＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解し、室温で一夜間攪拌し、反応させた。
【００５９】
式(B) で示されるＲｕ錯体誘導体を含む反応溶液をメタノールで希釈し、ＬＣＭＳ（ＥＳＩＭＳ）測定した。図１〜４に得られたＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータ（イオントラップ）チャートを示す（縦軸：相対強度（％））。これらの図中の表記、及び以下の説明については、化７に示されているように、式(B) のＲｕ錯体誘導体のフェニレン基を含む配位子までの部分が便宜的にＲｕとして表されている。
【００６０】
図１において、（ａ）は、上記で調製されたＲｕ錯体誘導体(B) Ｒｕ−ＣＯ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−ＯＨのＥＳＩＭＳチャートであり、（ｂ）は、このピークをペアレントイオン（親イオン）としてＭＳ2を行った結果のチャートである。
図２において、（ａ）は、ＭＳ2のチャートであり、（ｂ）は、ＭＳ2のピークをペアレントイオンとしてＭＳ3を行った結果のチャートである。
同様に、図３において、（ａ）は、ＭＳ3のチャートであり、（ｂ）は、ＭＳ3のピークをペアレントイオンとしてＭＳ4を行った結果のチャートである。
同様に、図４において、（ａ）は、ＭＳ4のチャートであり、（ｂ）は、ＭＳ4のピークをペアレントイオンとしてＭＳ5を行った結果のチャートである。
【００６１】
これらの結果から、実施例１で合成されたＲｕ錯体(1) を用いて、アミノ酸配列決定が容易に高感度に行えることが明らかである。
【００６２】
【発明の効果】
本発明によれば、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定試薬として有用な新規な金属錯体が提供され、新規な金属錯体を含むタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定試薬が提供される。
【００６３】
さらに、本発明によれば、新規な金属錯体を用いる質量分析法によるタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法が提供される。本発明のアミノ酸配列決定方法は、迅速に且つ高感度で行うことができる点で非常に優れている。
【００６４】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例で得られたＥＳＩＭＳチャートである。
【図２】 実施例で得られたＥＳＩＭＳチャートである。
【図３】 実施例で得られたＥＳＩＭＳチャートである。
【図４】 実施例で得られたＥＳＩＭＳチャートである。
Claims (15)
- タンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基あるいはＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基と共有結合を形成可能な官能基を有し、
タンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基あるいはＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基と、前記官能基との間で形成される共有結合は、質量分析におけるイオン化の段階で開裂しないものである金属錯体。 - タンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基あるいはＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基と共有結合を形成可能な官能基を有する配位子を有する、請求項１に記載の金属錯体。
- 金属錯体の金属元素は、遷移金属及び典型金属から選ばれる、請求項１又は２に記載の金属錯体。
- 金属錯体の配位数は、２、３、４、５又は６である、請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載の金属錯体。
- 金属錯体の配位子は、単座配位子又は多座配位子である、請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の金属錯体。
- タンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基と共有結合を形成可能な官能基が、前記アミノ基の求核反応により共有結合を形成可能な官能基である、請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の金属錯体。
- タンパク質又はペプチドのＮ末端アミノ酸残基のアミノ基と共有結合を形成可能な官能基が、−ＣＯ−ＯＲ１基（ここで、Ｒ１はＨ又は活性エステル形成基を表す。）である、請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の金属錯体。
- 下記一般式（Ｉ）：
（Ｌ２）m Ｍ（Ｌ１） （Ｉ）
〔式中、Ｍは遷移金属を表し、Ｌ１は置換基：−ＣＯ−ＯＲ１基（ここで、Ｒ１はＨ又は活性エステル形成基を表す。）又は−Ｒ２−ＣＯ−ＯＲ１基（ここで、Ｒ２はアリーレン基又はアルキレン基を表し、Ｒ１はＨ又は活性エステル形成基を表す。）を有する配位子を表し、Ｌ２は配位子を表し、ｍはＬ２の数であり０、１、２、３、４又は５を表す。〕
で示される、請求項１〜７のうちのいずれか１項に記載の金属錯体。 - 下記一般式（II）：
で示される、請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の金属錯体。 - タンパク質又はペプチドのＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基と共有結合を形成可能な官能基が、前記カルボキシル基への求核反応により共有結合を形成可能な官能基である、請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の金属錯体。
- タンパク質又はペプチドのＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基と共有結合を形成可能な官能基が、−ＮＨ２基又は−ＮＨＮＨ２基である、請求項１〜５、１０のうちのいずれか１項に記載の金属錯体。
- 下記一般式(III) ：
（Ｌ２）m Ｍ（Ｌ３） (III)
〔式中、Ｍは遷移金属を表し、Ｌ３は置換基：−ＮＨ２基、−ＮＨＮＨ２基、−Ｒ２−ＮＨ２基又は−Ｒ２−ＮＨＮＨ２基（ここで、Ｒ２はアリーレン基又はアルキレン基を表す。）を有する配位子を表し、Ｌ２は配位子を表し、ｍはＬ２の数であり０、１、２、３、４又は５を表す。〕
で示される、請求項１〜５、１０、１１のうちのいずれか１項に記載の金属錯体。 - 請求項１〜１２のうちのいずれか１項に記載の金属錯体を含む、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定試薬。
- 請求項１〜１２のうちのいずれか１項に記載の金属錯体を用いて、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
- 請求項１〜１２のうちのいずれか１項に記載の金属錯体をアミノ酸配列を決定すべきタンパク質又はペプチド（Ａ）と反応させ、金属錯体の官能基と、タンパク質又はペプチド（Ａ）のＮ末端アミノ酸残基のアミノ基あるいはＣ末端アミノ酸残基のカルボキシル基とが共有結合を形成した金属錯体誘導体（Ｂ）を得て、
金属錯体誘導体（Ｂ）を質量分析法により解析し、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列を決定する方法。
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