JP5864312B2 - S−ニトロソ物質の質量分析法 - Google Patents
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最近では、S−ニトロシル化は、代謝、細胞骨格の形成、シグナリング等に関わるタンパク質(酵素)の活性を調節する翻訳後修飾の1つの態様であることがわかってきた。例えば、家族性のパーキンソン病の原因遺伝子として同定されたParkinは、S−ニトロシル化により活性が低下するということが報告されている(非特許文献1)。このように、S−ニトロシル化の詳細解析は、リン酸化や糖鎖付加等の翻訳後修飾と同様に、生命現象や疾患のメカニズムの解析に非常に重要な意味を持つと考えられる。
非特許文献5においては、ビオチン置換法におけるS−NO基に対する還元反応の特異性に疑いがあることが報告されている。つまり、タンパク質の還元反応において、S−NO基だけでなくジスルフィド結合(−S−S−)も還元されることがわかっている。このため、S−NO基由来のチオール基だけでなくジスルフィド基由来のチオール基もビオチン置換されてしまう。結果として、S−NO基を有していないシステインをS−ニトロシル化システインとして誤同定してしまう可能性がある。
非特許文献6の方法においては、IR−MALDIがUV−MALDIに比べて感度が低く、装置自体も大型であるという問題がある。
(1)
S−ニトロソ物質の質量分析法であって、
マトリックス添加剤としてポルフィリン化合物又はレチノイン酸を用い、且つ、マトリックス支援紫外レーザー脱離イオン化質量分析により、前記S−ニトロソ物質に由来するS−ニトロシル基含有イオンを検出する方法。
(2)
前記S−ニトロソ物質がS−ニトロシル化ペプチド又はS−ニトロシル化タンパク質である、(1)の方法。
(3)
前記ポルフィリン化合物がテトラフェニルポルフィリンである、(1)又は(2)の方法。
(4)
前記ポルフィリン化合物が、2,5−ジヒドロキシ安息香酸及び3−ヒドロキシ−4−ニトロ安息香酸からなる群から選ばれるマトリックスとともに用いられる、(1)〜(3)のいずれかの方法。
(5)
前記レチノイン酸が、2,5−ジヒドロキシ安息香酸及び3−ヒドロキシ4−ニトロ安息香酸からなる群から選ばれるマトリックスとともに用いられる、(1)又は(2)の方法。
ポルフィリン化合物は、ポルフィリン環を基本骨格とする化合物であればよく、無置換体及び置換体を問わない。ポルフィリン化合物が置換体である場合、置換基としては、置換又は非置換のアリール基(例えばフェニル基、ジカルボキシフェニル基等)が挙げられる。一例として、ポルフィリン化合物は、テトラフェニルポルフィリンでありうる。また、ポルフィリン化合物は金属錯体であってもよい。この場合、金属としては、鉄、マグネシウム及びマンガン等が挙げられる。
レチノイン酸は、シス型及びトランス型を問わない。
レチノイン酸は、単独でもマトリックスとして機能することもあるが、レチノイン酸以外のマトリックスと混合して添加剤として使用されることによって、測定対象であるS−ニトロソ物質のイオン化において、S−ニトロシル基の脱離を抑制することができる。
本発明の測定対象となるS−ニトロソ物質に特に制限はない。例えば、S−ニトロソ物質は分子量100〜1,000,000の分子であり、生体分子及び非生体分子を問わない。より好ましくは、S−ニトロソ物質は、S−ニトロシル化システイン残基を含むペプチド又はS−ニトロシル化システイン残基を含むタンパク質(以下、S−ニトロシル化ペプチド又はS−ニトロシル化タンパク質と表記する)でありうる。S−ニトロシル化ペプチド又はS−ニトロシル化タンパク質におけるS−ニトロシル基は、翻訳後修飾によって生じたものであってよい。S−ニトロシル化ペプチド又はS−ニトロシル化タンパク質は、例えば分子量が500〜3,000、好ましくは500〜10,000でありうる。また、S−ニトロソ物質は、例えば分子量が100〜1,000、さらには100〜700の低分子物質であってもよい。
本発明において使用される質量分析装置としては、UV−MALDI(マトリックス支援紫外レーザー脱離イオン化)法に基づくイオン源と組み合わされたものであれば特に限定されない。例えば、UV−MALDI−TOF(マトリックス支援紫外レーザー脱離イオン化−飛行時間)型質量分析装置、UV−MALDI−IT(マトリックス支援紫外レーザー脱離イオン化−イオントラップ)型質量分析装置、UV−MALDI−IT−TOF(マトリックス支援紫外レーザー脱離イオン化−イオントラップ−飛行時間)型質量分析装置、等が挙げられる。
配列VFDARDC(NO)RSAQ(N末端から7番目のシステイン残基がニトロシル化されている)(配列番号1)を有するS−ニトロシル化ペプチドをイオン交換水に溶解し、5 pmol/μLのサンプル溶液を調製した。
別途、DHBA (2,5-dihydroxybenzoic acid) 溶液(0.5 mg/mL、50v/v% アセトニトリル水溶液中)に対してテトラフェニルポルフィリン溶液(1 mg/mL、ヘキサン中)を等量添加し、マトリックス溶液(ポルフィリン添加マトリックス溶液)を調製した。
MALDIプレート上に上記サンプル溶液0.5 μLと上記マトリックス溶液0.5 μLとを塗布して乾燥した後、UV-MALDI-TOF MS(AXIMA Performance, Shimadzu/Kratos, UK)によるMS測定を行った。測定モードはReflectron mode (positive ion mode)であった。
図に示されるように、ポルフィリン添加マトリックス溶液を用いた場合(図1(a))、NO基の脱離ピーク(m/z 1267.7)も観測されたものの、目的のNO基非脱離ピーク(m/z 1296.7)についての検出を確認した。一方、ポルフィリン無添加の場合(図1(b)、(c))においては、NO基非脱離ピークが全く検出されないことを確認した。この場合、MS/MS解析においてもNO基非脱離ピークが全く検出されないことを確認した。)
得られたMS/MSスペクトルを図2(a)に示す。図2においては、比較用として、ニトロシル化されていないペプチド(VFDARDCRSAQ(配列番号2))のMS/MSスペクトルも図2(b)に示している。S-ニトロシル化ペプチドのMS/MSスペクトルにおいて、y5、y6、y8及びy10フラグメントイオンが29 Daのマスシフトを示していたのに対して、y4フラグメントイオンはそのようなマスシフトを示していなかった。このことは、このマスシフトがシステイン残基に由来し、システイン残基がS-ニトロシル化されていることを示している。つまり、MS/MS解析することによって、S-ニトロシル化修飾部位を同定できることを確認した。
S−ニトロシル化ペプチドとして、配列EMFTYIC(NO)NHIK(N末端から7番目のシステイン残基がニトロシル化されている)(配列番号3)を用いたことを除いて、実施例1と同じ操作を行った。
得られたMS/MSスペクトルを図4(a)に示す。図4においては、図2と同様に、比較用として、ニトロシル化されていないペプチド(EMFTYICNHIK(配列番号4))のMS/MSスペクトル図4(b)も示している。S-ニトロシル化ペプチドのMS/MSスペクトルにおいて、y5、y6、y7、y8及びy9フラグメントイオンが29 Daのマスシフトを示していたのに対して、y4フラグメントイオンはそのようなマスシフトを示していなかった。このことは、このマスシフトがシステイン残基に由来し、システイン残基がS-ニトロシル化されていることを示している。つまり、MS/MS解析することによって、S-ニトロシル化修飾部位を同定できることを確認した。
マトリックス溶液として、DHBA (2,5-dihydroxybenzoic acid) 溶液(0.5 mg/mL、50v/v% アセトニトリル水溶液中)に対してレチノイン酸飽和溶液(50v/v% アセトニトリル水溶液中)を等量添加して調製したマトリックス溶液(レチノイン酸添加マトリックス溶液)を用いたことを除いて、配列VFDARDC(NO)RSAQ(7番目のシステイン残基がニトロシル化されている)(配列番号1)を有するS−ニトロシル化ペプチドについて実施例1と同じ操作を行った。
得られたMS/MSスペクトルを図6(a)に示す。図6においては、図2と同様に比較用のMS/MSスペクトル図6(b)も示している。図に示されるように、S-ニトロシル化修飾部位を同定できることを確認した。
S−ニトロシル化ペプチドとして、配列EMFTYIC(NO)NHIK(7番目のシステイン残基がニトロシル化されている)(配列番号3)を用い、マトリックス溶液として、DHBA (2,5-dihydroxybenzoic acid) 溶液(0.5 mg/mL、50v/v% アセトニトリル水溶液中)に対してレチノイン酸飽和溶液(50v/v% アセトニトリル水溶液中)を等量添加して調製したマトリックス溶液(レチノイン酸添加マトリックス溶液)を用いたことを除いて、実施例1と同じ操作を行った。
得られたMS/MSスペクトルを図8(a)に示す。図8においては、図4と同様に比較用のMS/MSスペクトル図8(b)も示している。図に示されるように、S-ニトロシル化修飾部位を同定できることを確認した。
Claims (5)
- S−ニトロソ物質の質量分析法であって、
マトリックス添加剤としてポルフィリン化合物又はレチノイン酸を用い、且つ、マトリックス支援紫外線紫外レーザー脱離イオン化質量分析により、前記S−ニトロソ物質に由来するS−ニトロシル基含有イオンを検出する方法。 - 前記S−ニトロソ物質がS−ニトロシル化ペプチド又はS−ニトロシル化タンパク質である、請求項1の方法。
- 前記ポルフィリン化合物がテトラフェニルポルフィリンである、請求項1又は2の方法。
- 前記ポルフィリン化合物が、2,5−ジヒドロキシ安息香酸及び3−ヒドロキシ4−ニトロ安息香酸からなる群から選ばれるマトリックスとともに用いられる、請求項1〜3のいずれか1項の方法。
- 前記レチノイン酸が、2,5−ジヒドロキシ安息香酸及び3−ヒドロキシ4−ニトロ安息香酸からなる群から選ばれるマトリックスとともに用いられる、請求項1又は2の方法。
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