JP6587962B2 - タンパク質及びペプチドのCα−C結合及び側鎖の特異的切断方法、及びアミノ酸配列決定方法 - Google Patents
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Description
[1] 1,5−DANはc-series,又はz-series及び/又はw-seriesイオン種を生成させる(a-series及び/又はd-seriesイオン種の生成が困難である)。
[2] 1,5−DANは発癌性が疑われている。
[3] 1,5−DANは真空中で昇華しやすい。そうすると、1,5−DANを用いると、測定時間が限られ、定量性も損なわれやすい。また、昇華した1,5−DANが他の測定時に混入するキャリーオーバーが発生しやすい。
[4] 1,5−DANは溶液状態で劣化(酸化)しやすい。例えば、溶媒に用いる水又はアセトニトリル中の酸素などで劣化しやすい。そうすると、溶液状態での1,5−DANのストックが困難である。
[5] 1,5−DANを用いると、サンプル/マトリックス溶液混合滴下乾固後のサンプルプレート上での残渣の表面均一性が低く、位置による厚みの違いの差が大きい。そうすると、Rasterで良好なデータが得られ難くなり、TOFでは分解能の低下を招く。
[6] 1,5−DANマトリックス由来のクラスターイオンの多量生成により、ペプチド鎖N末端側(通常は、N末端側の数残基)の情報が得られ難い。
(1) 下記構造式で示される3−ヒドロキシ−4−ニトロ安息香酸の存在下で、タンパク質又はペプチドにレーザー光を照射することを含む、ペプチド主鎖のCα−C結合及び/又は側鎖結合を特異的に切断する方法。
生成したフラグメントイオンを質量分析法により分析することを含む、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法。
生成したフラグメントイオンをMALDI質量分析法により分析することを含む、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法。
a−系列イオン種及び/又はx−系列イオン種
を分析する、上記(2)又は(3)に記載のタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法。
a−系列イオン種及びd−系列イオン種
を分析する、上記(2)又は(3)に記載のタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法。
本発明において、マトリックスとしての3−ヒドロキシ−4−ニトロ安息香酸の存在下で、タンパク質又はペプチドサンプルにレーザー光を照射する。上記スキーム(b)に従って、ペプチド主鎖のCα−C結合及び/又は側鎖結合が特異的に切断される。以下にさらに詳細な化学スキームを示す。
質量分析用結晶は、分析対象のタンパク質又はペプチドと3−ヒドロキシ−4−ニトロ安息香酸マトリックスとを溶媒中に少なくとも含む混合液の液滴を質量分析用ターゲットプレート上に形成する工程と、形成された前記混合液の液滴から前記溶媒を除去し、前記混合液中の不揮発分(すなわち少なくとも分析対象、及びマトリックス)を残渣として得る工程とによって得ることができる。得られた残渣が、すなわち質量分析用結晶である。本明細書においては、質量分析用結晶と残渣とは同義である。
本発明において使用される質量分析装置としては、MALDI(マトリックス支援レーザー脱離イオン化)イオン源が組み合わされたものであれば特に限定されない。例えば、MALDI−TOF(マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間) 型質量分析装置、MALDI−QIT(マトリックス支援レーザー脱離イオン化−四重極イオントラップ)型質量分析装置、MALDI−QIT−TOF(マトリックス支援レーザー脱離イオン化−四重極イオントラップ−飛行時間)型質量分析装置、MALDI−FTICR(マトリックス支援レーザー脱離イオン化−フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴)型質量分析装置などが挙げられる。
N-Acetyl-Renin Substrate (アミノ酸配列:Ac-DRVYIHPFHLLVYS)(配列番号1)
ACTH[18-39] (アミノ酸配列:RPVKVYPNGAEDESAEAFPLEF)(配列番号2)
3H4NBA(3-hydroxy-4-nitrobenzoic acid)本発明
質量分析装置:MALDI飛行時間型質量分析計[AXIMA-Performance(登録商標),島津製作所製]を用いた。
ペプチドサンプル:N-Acetyl-Renin Substrate(Ac-DRVYIHPFHLLVYS)(配列番号1)
マトリックス:
3H4NBA(3-hydroxy-4-nitrobenzoic acid)本発明
1,5−DAN(1,5-Diaminonaphthalene)比較用
(1)ペプチド試料溶液として、上記N-Acetyl-Renin Substrateの20 pmol/μL waterを作成した。
(2)マトリックス溶液として、3H4NBAの10mg/mL 75% ACN, waterを作成し、比較用として、1,5−DANの10 mg/mL 75% ACN, waterを作成した。
(3)MALDIサンプルプレート上に、(1)の試料溶液0.5 μLを滴下した後、(2)のマトリックス溶液を0.5 μL滴下した(on-target mix法)。1ウェル当たりのペプチド試料の量は、10pmolであった。
(4)溶媒が揮発した後、MALDI TOFMS [AXIMA Performance(登録商標), 島津製作所製)]の、ポジティブイオンモード、リフレクトロンモ−ドで、プレート上の残渣の広がりに応じて正方形1辺1.2mm〜1.7mm内を40×40=1,600点、ラスタ−分析により計測した。
図1は、マトリックスとして3H4NBA(上段)及び1,5−DAN(下段)を用いた場合のN-Acetyl-Renin substrate のISDマススペクトル全体図であり、図2は、図1の低質量域部分拡大図であり、図3は、図1の高質量域部分拡大図である。
ペプチドサンプル:ACTH[18-39](アミノ酸配列:RPVKVYPNGAEDESAEAFPLEF)(配列番号2)
マトリックス:
3H4NBA(3-hydroxy-4-nitrobenzoic acid)本発明
5−NSA(5-nitrosalicylic acid)比較用
5−FSA(5-formylsalicylic acid)比較用
(1)ペプチド試料溶液として、上記ACTH[18-39]の20pmol/μL 50%ACN 0.1%TFA waterを作成した。
(2)マトリックス溶液として、3H4NBAの10 mg/mL 50%ACN 0.1%TFA waterを作成し、比較用として、5−FSA、又は5−NSAの10 mg/mL 50%ACN 0.1%TFA waterを作成した。
(3)MALDIサンプルプレート上に、(1)の試料溶液0.5 μLを滴下した後、(2)のマトリックス溶液を0.5 μL滴下した(on-target mix法)。1ウェル当たりのペプチド試料の量は、10pmolであった。
(4)溶媒が揮発した後、MALDI TOFMS [AXIMA Performance(登録商標), 島津製作所製)]の、ポジティブイオンモード、リフレクトロンモ−ドで、プレート上の残渣の広がりに応じて正方形1辺1.2mm〜1.7mm内を40×40=1,600点、ラスタ−分析により計測した。
図5は、マトリックスとして3H4NBA(上段)、5−NSA(中段)及び5−FSA(下段)を用いた場合のACTH[18-39] のISDマススペクトル全体図であり、図6は、図5の低質量域部分拡大図であり、図7は、図5の中質量域部分拡大図であり、図8は、図5の高質量域部分拡大図である。
マトリックスとして3H4NBAを用いた場合のさらなる利点を図9(A)及び(B)を用いて示す。
Claims (6)
- 下記構造式で示される3−ヒドロキシ−4−ニトロ安息香酸の存在下で、タンパク質又はペプチドにレーザー光を照射することを含む、ペプチド主鎖のCα−C結合及び/又は側鎖結合を特異的に切断する方法。
- 下記構造式で示される3−ヒドロキシ−4−ニトロ安息香酸の存在下で、タンパク質又はペプチドにレーザー光を照射して、ペプチド主鎖のCα−C結合及び/又は側鎖結合を特異的に切断し、
生成したフラグメントイオンを質量分析法により分析することを含む、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法。
- マトリックスとしての3−ヒドロキシ−4−ニトロ安息香酸の存在下で、タンパク質又はペプチドにレーザー光を照射して、ペプチド主鎖のCα−C結合及び/又は側鎖結合を特異的に切断し、
生成したフラグメントイオンをMALDI質量分析法により分析することを含む、タンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法。 - 前記生成したフラグメントイオンとして、
a−系列イオン種及び/又はx−系列イオン種
を分析する、請求項2又は3に記載のタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法。 - 前記生成したフラグメントイオンとして、
a−系列イオン種及びd−系列イオン種
を分析する、請求項2又は3に記載のタンパク質又はペプチドのアミノ酸配列決定方法。 - 下記構造式で示される3−ヒドロキシ−4−ニトロ安息香酸を含む、タンパク質又はペプチド主鎖のCα−C結合及び/又は側鎖結合を特異的に切断する試薬。
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