JP4165502B2

JP4165502B2 - Ｍａｌｄｉ質量分析によって混合物から特定の物質を選択的に測定する方法

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Publication number: JP4165502B2
Application number: JP2004368508A
Authority: JP
Inventors: 英一松尾; 千香子戸田; 真渡辺; 紀西村; 典行尾島
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 2004-05-24
Filing date: 2004-12-20
Publication date: 2008-10-15
Anticipated expiration: 2024-12-20
Also published as: JP2006010672A

Description

本発明はMALDI（マトリックス支援レーザー脱離イオン化（Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization））法による質量分析、及び定量的プロテオーム解析に関する。

＜MALDI法による質量分析＞
MALDI型質量分析装置では、試料に混ぜられたマトリックスと呼ばれる分子（一般的に有機化合物）がレーザー光のエネルギーを吸収することで加熱され、気化すると共にイオン化される。試料分子を取り囲んでいたマトリックスが瞬時に気化することで、結果として試料分子もほぼ同時に気相に放出されることになる（この時、試料分子とマトリックスとの間で電子やプロトンの受け渡しが行われ、試料分子のイオン化が達成される）。MALDI法による質量分析においては、測定する試料ごとに最適とされる有機化合物が検索され、用いられている。例えば、ペプチドを測定する際には、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（4-CHCA）や２，５−ジヒドロキシ安息香酸（DHB）が一般的に用いられている。

＜プロテオーム解析＞
プロテオーム解析（タンパク質の網羅的解析）分野においては、これまで二次元電気泳動と質量分析装置とを組み合わせたPMF（ペプチドマスフィンガープリンティング）解析法が主流であった。これに代わる次世代のプロテオーム解析法として、例えば、Nature Biotechnology, 994-999, 17, 1999、Molecular & Cellular PROTEOMICS, 299-314, 2, 2003 、及びCurrent Opinion in Chemical Biology, 70-77, 7, 2003に記載されているような、安定同位体を用いた手法が考案されている。

また、Rapid Communications in Mass Spectrometry, 1642-1650, 17, 2003及び国際公報第２００４／００２９５０号パンフレットには、本発明者らによって開発された手法（NBS法）が記載されている。NBS法においては、２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリド(NBSCl)の安定同位体標識体（２−ニトロ［¹³Ｃ₆］ベンゼンスルフェニルクロリド）及びその非標識体（２−ニトロ［¹²Ｃ₆］ベンゼンスルフェニルクロリド）を用いる。すなわち、(1)解析すべきタンパク質試料Iとその対照タンパク質試料IIとの２種類の状態のタンパク質試料を用意し、(2)前記タンパク質試料Iを、２−ニトロ［¹³Ｃ₆］ベンゼンスルフェニルクロリド及び２−ニトロ［¹²Ｃ₆］ベンゼンスルフェニルクロリドのいずれか一方を用いてラベル化し、別途、前記タンパク質試料IIを、２−ニトロ［¹³Ｃ₆］ベンゼンスルフェニルクロリド及び２−ニトロ［¹²Ｃ₆］ベンゼンスルフェニルクロリドのいずれか他方を用いてラベル化し、(3)ラベル化されたタンパク質試料I及びラベル化されたタンパク質試料IIを混合し、(4)脱塩カラムを用いて未反応の試薬を除き、(5)得られたラベル化タンパク質混合物を還元・アルキル化した後、ラベル化ペプチド断片と非ラベル化ペプチド断片とを含むペプチド混合物へ消化し、(6)ペプチド混合物からラベル化ペプチド断片を、疎水クロマトグラフィーカラムを用いて濃縮分離し、(7)質量分析を行う。

＜ニトロチロシン＞
生体内において、一酸化窒素（NO）や、それから生じるより反応性の高い窒素酸化物（パーオキシナイトライトなど）が、タンパク質や核酸と反応してニトロ化物を生成することが知られている。例えばタンパク質の場合には、チロシンの側鎖であるフェニル基に対して反応し、3-ニトロチロシンが生成する。チロシン残基は生体内でしばしばリン酸化を受けるが、リン酸化はシグナル伝達や細胞死など生体内の重要なイベントにおけるスイッチ的役割を果たしている。このような理由から、ニトロチロシンを有する生体関連物質は、生体内における反応性窒素酸化物生成の指標（バイオマーカー）としてのみならず、生物活性という視点からも注目されている。

なお、タンパク質のチロシン残基のニトロ化の方法は、Journal of the American Chemical Society 1966, 88, 4104-4105や、Biochemistry 1966, 5, 3582-3589に記載されている。

スティーブン・Ｐ・ギジ（Steven P. Gygi）、ビート・リスト（Beate Rist）、スコット・Ａ・ゲーバー（Scott A. Gerber）、フランチシェク・タレチェク（Frantisek Turecek）、ミヒャエル・Ｈ・ゲルブ（Michael H. Gelb）、及びルディー・エバーソルド（Ruedi Aebersold）著、同位体コードしたアフィニティータグを用いた複雑なタンパク質混合物の定量解析（Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags）、「ネイチャー・バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）」、１９９９年、第１７巻、ｐ．９９４−９９９カーク・Ｃ・ハンセン（Kirk C. Hansen）、ジェロルド・シュミット−ウルムス（Gerold Schmitt-Ulms）、ロバート・Ｊ・チョークレー（Robert J. Chalkley）、ヤン・ヒルシュ（Jan Hirsch）、ミヒャエル・Ａ・ボールドウィン（Michael A. Baldwin）、及びＡ・Ｌ・バーリンガム（A. L. Burlingame）著、開裂可能な13Ｃ同位体コードされたアフィニティータグと多次元クロマトグラフィーとを用いた質量分析による低レベルタンパク質混合物の解析（Mass Spectrometric Analysis of Protein Mixtures at Low Levels Using Cleavable 13C-Isotope-coded Affinity Tag and Multidimensional Chromatography）、「モレキュラー・アンド・セルラー・プロテオミクス（Molecular & Cellular PROTEOMICS）」、２００３年、第２巻、ｐ．２９９−３１４サルバトーレ・セチ（Salvatore Sechi）及びヨシヤ・オダ（Yoshiya Oda）著、マススペクトロメトリーを用いた定量的プロテオミクス（Quantitative proteomics using mass spectrometry ）、「カレント・オピニオン・イン・ケミカル・バイオロジー（Current Opinion in Chemical Biology）」、（英国）、２００３年、第７巻、ｐ．７０−７７九山浩樹（Hiroki Kuyama）、渡辺真（Makoto Watanabe）、戸田千香子（Chikako Toda）、安藤英治（Eiji Ando）、田中耕一（Koichi Tanaka）及び西村紀（Osamu Nishimura）著、トリプトファン残基のラベル化による定量的プロテオーム解析法（An Approach to Quantitative Proteome Analysis by Labeling Tryptophan Residues）「ラピッド・コミュニケーションズ・イン・マス・スペクトロメトリー（Rapid Communications in Mass Spectrometry）」、２００３年、第１７巻、ｐ．１６４２−１６５０チロシン及びタンパク質中のチロシン残基のニトロ化のための試薬（A reagent for the nitration of tyrosine and tyrosyl residues of proteins）、「ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（Journal of the American Chemical Society）」、１９６６年、第８８巻、ｐ．４１０４−４１０５タンパク質中のチロシン残基のニトロ化のための試薬（A reagent for the nitration of tyrosyl residues in proteins）、「バイオケミストリー（Biochemistry）」、１９６６年、第５巻、ｐ．３５８２−３５８９国際公報第２００４／００２９５０号パンフレット

MALDI法ではレーザー光の照射で試料・マトリックス混合物の気化およびイオン化を行うが、一回（1ショット）でイオン化できる分子の数には限度がある。そのため、測定する試料に複数の分子種が混在している場合、存在量の多い分子種が確率的に多くイオン化し、存在量の少ない分子は、たとえ検出限界以上の試料が存在していても、確率的に検出されにくくなってしまう。また、測定する試料分子間に「イオン化されやすさ」の差がある場合も、イオン化されにくい分子は測定の感度が下がってしまうことになる。このように、イオン化されにくい分子種や存在量の少ない分子種を検出するためには、あらかじめ目的とする分子の濃縮を行っておくことが重要である。

定量性が必要となるような解析の中でもNBS法の場合、濃縮せずに目的分子であるNBS修飾分子の検出は可能であるが、関係のない分子と重なってしまうと定量性が下がってしまうことがある。従って、この場合でも、定量性の向上という観点から、濃縮によりあらかじめNBSで修飾されていない分子種を除いておく方が好ましいと考えられる。

本発明の目的は、質量分析において目的の物質を主として検出することができる、より簡便、安価で且つ感度の良い検出方法を提供することにある。

本発明は以下の発明を含む。
（１）質量分析において、測定すべき特定の物質と前記特定の物質以外の物質とを含む混合物サンプルに含まれる、前記特定の物質を、
前記特定の物質以外の物質よりも、前記特定の物質をよりイオン化させやすいマトリックスを用いることによって特異的にイオン化し、混合物から特定の物質を選択的に測定する質量分析方法であって、
前記特定の物質が疎水性物質であり、
前記マトリックスが疎水性物質であり、且つ、前記特定の物質との間で電荷の授受を行うための官能基と、前記マトリックス自身に疎水性を与えるための官能基とを有する、ベンゼン環又はベンゼン環以外の芳香環の置換体である、質量分析方法。
すなわち、本発明におけるマトリックスは、特定の物質を主としてイオン化し、且つ前記特定の物質以外の物質をイオン化しにくいため、特定の物質を特異的にイオン化することができる。また、本発明においては、測定すべき特定の物質とマトリックスとの疎水性相互作用を利用する。

（２）前記特定の物質が生体関連物質である、（１）に記載の質量分析方法。
（３）前記生体関連物質が、タンパク質、ペプチド、糖及び脂質から選ばれる、（２）に記載の質量分析方法。
（４）前記特定の物質が同位体標識されている、（１）〜（３）のいずれかに記載の質量分析方法。

（５）前記マトリックスが、前記特定の物質とファンデルワールス相互作用することができる物質である、（１）〜（４）のいずれかに記載の質量分析方法。

（６）前記特定の物質がπ電子含有物質であり、且つ前記マトリックスがπ電子含有物質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の質量分析方法。
すなわち本発明のこの形態においては、測定すべき特定の物質とマトリックスとのπ−π電子相互作用を利用する。

（７）前記特定の物質が、疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質である、（１）〜（６）のいずれかに記載の質量分析方法。
（８）前記疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質が、ベンゼン環及び/又はベンゼン環以外の芳香環を有する、（７）に記載の質量分析方法。
（９）前記疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質が、さらにニトロ基を有する、（７）又は（８）に記載の質量分析方法。
（１０）前記疎水性ペプチド又はタンパク質が、ニトロベンゼンスルフェニル基又はニトロフェニル基を有する、（７）〜（９）のいずれかに記載の質量分析方法。

（１１）前記疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質が、ベンゼン環、ベンゼン環以外の芳香環、及び/又はニトロ基を有する疎水性化合物を用いて、前記疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質に対応するペプチド又はタンパク質を化学修飾することによって得られる、（７）〜（１０）のいずれかに記載の質量分析方法。
ここで、疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質に対応するペプチド又はタンパク質としては、それ自体が疎水性である場合も含まれる。すなわち、疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質が、疎水性化合物を用いた化学修飾によって、より疎水性の高いペプチド又はタンパク質に誘導体化される場合も含まれる。
（１２）前記疎水性化合物が、スルフェニル化合物である、（１１）に記載の質量分析方法。
（１３）前記スルフェニル化合物が２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリドである、（１１）又は（１２）に記載の質量分析方法。

（１４）前記電荷の授受を行うための官能基がカルボキシル基、水酸基、アミノ基、硫酸基、硝酸基及びアルデヒド基から選ばれる、（１）〜（１３）のいずれかに記載の質量分析方法。
（１５）前記疎水性を与えるための官能基がニトロ基である、（１）〜（１４）のいずれかに記載の質量分析方法。

（１６）前記マトリックスがニトロ安息香酸誘導体又はニトロフェノール誘導体である、（１）〜（１５）のいずれかに記載の質量分析方法。
（１７）前記マトリックスがヒドロキシニトロ安息香酸誘導体である、（１）〜（１６）のいずれかに記載の質量分析方法。
（１８）前記マトリックスがヒドロキシニトロ安息香酸の位置異性体から選ばれる、（１）〜（１７）のいずれかに記載の質量分析方法。
（１９）前記マトリックスが、４−ニトロアニリン、２，４−ジニトロアニリン、２−ブロモ−４，６−ジニトロアニリン、４−ニトロフェノール、２−ニトロフェノール、２，５−ジニトロフェノール、４−ニトロ安息香酸、３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸、及び３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸から選ばれる、（１）〜（１５）のいずれかに記載の質量分析方法。

（２０）前記マトリックスにα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を組み合わせた混合マトリックスを用いる、（１）〜（１９）のいずれかに記載の質量分析方法。

（２１）前記マトリックスを、１ｍｇ/ｍｌ〜飽和濃度の溶液として用いる、（１）〜（２０）のいずれかに記載の質量分析方法。

（２２）前記α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を、１ｍｇ/ｍｌ〜飽和濃度の溶液として用いる、（２０）又は（２１）に記載の質量分析方法。
（２３）前記マトリックスの溶液と、前記α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸の溶液とを、１：１０〜１０：１の体積比で用いる、（２２）に記載の質量分析方法。

本発明によると、測定すべき目的の物質の濃縮工程を行わなくとも、質量分析において目的の物質を主として検出することができる方法を提供することができる。

以下に、本発明を詳細に説明する。なお、MALDI法のイオン化機構は完全に解明されているとはいえない。本明細書において示す考え方は現在有力に支持されている考え方に基づいているが、あくまで推定の域を出ない。

本発明において質量分析の対象となるサンプルは、測定すべき特定の物質とそれ以外の物質とを含む混合物である。そして、測定すべき特定の物質を、それ以外の物質よりもイオン化しやすいマトリックスを用いる。好ましくは、主として測定すべき特定の物質をイオン化し、それ以外の物質はほとんどイオン化しないマトリックスを用いる。（以下において、それ以外の物質をその他の物質と表記することがある。）

MALDI法においては、試料分子とマトリックスとがほぼ同時に気化・イオン化される。すなわちマトリックスには、試料分子のイオン化を補助する働きと同時に、試料分子を分子レベルで分散させる働きもある。試料分子の効率良い気化・イオン化にはマトリックスと試料分子との親和性が重要であると考えられている。両者の親和性が高いと、マトリックスに試料分子が分子レベルで一様に分散されやすい、あるいは一様な混合結晶を形成しやすいと考えられる。

従って、イオン化と親和性との関係という観点からいうと、本発明においては、マトリックスは、特定の物質と親和する構造を有するものであり、特定の物質は、マトリックスと親和する構造を有するものであり、その他の物質は、そのような構造を有しないものであることが好ましい。本発明においては、このように特定の物質とマトリックスとの親和性という観点から両者を組み合わせることによって、特定の物質を特異的にイオン化する。

特定の物質としては、特に限定されないが、タンパク質、ペプチド、糖、脂質などの生体関連物質が挙げられる。特定の物質に対してその他の物質は、マトリックスと親和する構造を有しないものであれば特に限定されない。本発明においては通常、特定の物質が生体関連物質であれば、その他の物質は上記構造を有しない以外は特定の物質と同様のカテゴリーの生体関連物質である。例えば、特定の物質がペプチドである場合、その他の物質は、上記構造を有しないペプチドであることが多い。また本発明においては、その他の物質には、特定の物質の調製過程において混在した物質や副生成物などが含まれることもある。

なお、本明細書においてタンパク質、ペプチド、糖、及び脂質には、これらの修飾体も含まれる。また修飾体には、化学修飾体も含まれる。修飾体が特定の物質に相当する場合、上記修飾体は、マトリックスと親和する構造を含む基を有するものであり、上記化学修飾体は、上記構造を有する基で化学修飾することにより得られるものである。

また、特定の物質は、同位体標識されていても良い。さらにこの場合は、特定の物質は、同位体標識された物質とそれに対応する非標識体との混合物であっても良い。

質量分析の対象となる混合物サンプルの一例としては、従来技術において述べたNBS法などで得られるような、ラベル化ペプチドと非ラベル化ペプチドとの混合物が挙げられる。この混合物サンプルにおいては、ラベル化ペプチドを特定の物質として選択的に検出する。上述のように、NBS法では、検出すべき特定の物質としてのラベル化ペプチドは、基本的に安定同位体(¹³C)標識化合物でラベル化されたペプチド及び非標識化合物でラベル化されたペプチドとの混合物である。本発明においては、ラベル化ペプチドを主としてイオン化し、非ラベル化ペプチドをほとんどイオン化しないマトリックスを用いることによって、ラベル化ペプチドを特異的にイオン化させることができる。このように本発明を用いると、ラベル化ペプチドと非ラベル化ペプチドとを分離することなく混合物の状態であっても、質量分析でラベル化ペプチドを選択的に検出することができる。

すでに述べたように、本発明は、マトリックスと試料分子との親和性を利用する。すなわち、このような親和性をもたらす相互作用として、ファンデルワールス相互作用、π−π電子相互作用、（[参考記載]親水性相互作用、）疎水性相互作用などを利用する。そして、測定するサンプルに応じ、サンプル中の特定の物質と上記相互作用することが可能な物質をマトリックスとして選択する。例えば、特定の物質がπ電子含有化合物である場合には、マトリックスとしてπ電子含有化合物を選択し、両者のπ−π電子相互作用を利用することができる。また、特定の物質が疎水性化合物である場合、マトリックスとして疎水性化合物を選択し、両者の疎水性相互作用を利用することができる。（[参考記載]さらに、特定の物質が親水性化合物である場合、マトリックスとして親水性化合物を選択し、両者の親水性相互作用を利用することができる。）上述の相互作用が組み合わされるように測定すべき特定の物質及びマトリックスの種類を選択すると良い。このようにして選択されたマトリックスは、特定の物質と上記相互作用を介して一様に混ざり合うか、あるいは一様な混合結晶を形成し、自身の気化・イオン化とともに特定の物質を優先的に気化・イオン化することが可能となると考えられる。

以下に、測定すべき特定の物質が疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質である本発明における、測定すべき特定の物質について説明する。本発明において疎水性ペプチド・疎水性タンパク質とは、ペプチド・タンパク質の組成アミノ酸残基のうち、疎水性のアミノ酸、特に疎水性の高いアミノ酸の含量が比較的高いもの、下記の基を有するもの、及び下記の化学修飾を受けたものをいう。疎水性の高いアミノ酸としては、例えば、トリプトファン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、ロイシン、バリン、メチオニンなどを挙げることができる。さらに、アラニン、グリシン、プロリンなども疎水性のアミノ酸とみなすこともある。疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質は、ベンゼン環及び/又はベンゼン環以外の芳香環を有していることが好ましく、ニトロ基を有していることが好ましい。

特に本発明は、ニトロ基を置換基として有するベンゼン及び/又はベンゼン環以外の芳香環を含有する疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質に有用に用いられる。より具体的には、疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質は、ニトロベンゼンスルフェニル基（NBS基：NO₂PhS基(Ph：フェニレン基) ）やニトロフェニル基などを有していることがより好ましい。例えば、ニトロチロシン残基、ニトロフェニルアラニン残基、NBS基を置換基として有するトリプトファン残基、NBS基を置換基として有するシステイン残基などを含むタンパク質又はペプチドが挙げられる。

疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質は、対応するペプチド又はタンパク質を疎水性化合物によって化学修飾することによって得たものでもよい。ここで、対応するペプチド又はタンパク質としては、それ自体が疎水性である場合も含まれる。すなわち、疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質が、疎水性化合物を用いた化学修飾によって、より疎水性の高いペプチド又はタンパク質に誘導体化される場合も含まれる。疎水性化合物としては、ベンゼン環、ベンゼン環以外の芳香環、及び/又はニトロ基を有する疎水性化合物が挙げられる。本発明においては、疎水性化合物がスルフェニル化合物であることが好ましい。なお、スルフェニル化合物は、ペプチド又はタンパク質中のトリプトファン残基及びシステイン残基を特異的に修飾する化合物である。スルフェニル化合物の特に好ましい例として、２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリド（NBS試薬）が挙げられる。すなわち、本発明において好ましい疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質の一例としては、トリプトファン残基やシステイン残基を有するペプチド又はタンパク質をNBS試薬を用いて化学修飾することによって得たものが挙げられる。

また、疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質は、対応するペプチド又はタンパク質を、ニトロ化することによって得たものでも良い。すでに述べたように、対応するペプチド又はタンパク質としては、それ自体が疎水性である場合も含まれる。本発明において好ましい疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質の他の一例として、ベンゼン環及び/又はベンゼン環以外の芳香環を有するペプチド又はタンパク質に対し、通常行われる方法を用いた芳香族求電子置換反応によるニトロ化によって得たものが挙げられる。

このような疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質とともに用いられるマトリックスは、測定すべき特定の物質との間で電荷の授受を行うための官能基とマトリックス分子自体に疎水性を与えるための官能基とを有する芳香族置換体である。芳香族置換体としては、ベンゼン置換体が好ましい。電荷の授受を行うための官能基とは、電子やプロトンの受け渡しを行うための官能基であり、このような官能基としては、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、硫酸基、硝酸基、アルデヒド基などが挙げられる。疎水性を与えるための官能基としては、ニトロ基などが挙げられる。

このような芳香族置換体の中でも、本発明においてはニトロ安息香酸誘導体、ニトロフェノール誘導体、ヒドロキシニトロ安息香酸誘導体が好ましい。特に、ヒドロキシニトロ安息香酸（HNBA）の１０個の芳香族位置異性体から選ばれるものが好ましい。

本発明のマトリックスの具体例としては、４−ニトロアニリン（4NA；下記式(I)）、２，４−ジニトロアニリン（2,4DNA；下記式(II)）、２−ブロモ−４，６−ジニトロアニリン（2B4,6DNA；下記式(III)）、４−ニトロフェノール（4NP；下記式(IV)）、２−ニトロフェノール（2NP；下記式(V)）、２，５−ジニトロフェノール（2,5DNP；下記式(VI)）、４−ニトロ安息香酸（4NBA；下記式(VII)）、３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸（3H4NBA；下記式(VIII)）、３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸（3H2NBA；下記式(IX)）などが挙げられる。これらの構造式を以下に示す。

これらの化合物は、質量分析用マトリックスとして用いるという目的において、当業者が適宜その使用形態を決定することができる。たとえば、これら化合物は、溶液として用いることが好ましい。例えば、１ｍｇ/ｍｌ〜飽和濃度の溶液として用いることができる。

このような溶液の調製に用いられる溶媒としては、アセトニトリル水溶液、トリフルオロ酢酸（TFA）水溶液、又はアセトニトリル−トリフルオロ酢酸（TFA）水溶液を用いることが好ましい。アセトニトリル水溶液又はアセトニトリル−TFA水溶液を用いる場合、アセトニトリルの濃度は特に限定されないが、９０％以下、好ましくは５０％程度用いることができる。TFA水溶液又はアセトニトリル−TFA水溶液を用いる場合、TFAの濃度も特に限定されないが、１％以下、好ましくは０．１％程度用いることができる。

そして、２，４−ジニトロアニリン、２−ブロモ−４，６−ジニトロアニリン、３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸、４−ニトロ安息香酸、及び３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸は、このような溶媒に溶解させることにより、特に限定されないが例えば１ｍｇ/ｍｌ〜飽和濃度、好ましくは１０ｍｇ/ｍｌのマトリックス溶液として用いることができる。
また、４−ニトロアニリン、４−ニトロフェノール、２−ニトロフェノール、２，５−ジニトロフェノール、及び３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸は、このような溶媒に溶解させることにより、特に限定されないが例えば１ｍｇ/ｍｌ〜飽和濃度のマトリックス溶液として、好ましくは、飽和濃度のマトリックス溶液として用いることができる。

なお、本明細書における、％で表された量の基準に関しては、特に断りのない限りv/v％とする。

本発明において、測定すべき特定の物質とマトリックスとの特に好ましい組み合わせは、NBS試薬で修飾されたペプチド又はタンパク質と、ニトロ基を有する芳香族置換体との組み合わせである。ここに挙げた測定すべき特定の物質とマトリックスとは、双方がニトロベンゼン構造を有する。

すでに述べたように、MALDI法では試料はマトリックスとほぼ同時に気化・イオン化されるため、試料の検出においては、試料とマトリックスとの一様な混合結晶形成に必要とされる両者の親和性が関わっていると考えられている。ニトロ基を有する芳香族置換体をマトリックスとして用いた、NBS修飾ペプチド又はタンパク質の特異的検出においては、このような試料とマトリックスとの組み合わせは、両者の疎水性相互作用及びπ−π電子相互作用に起因する親和力に加え、ニトロ基の存在も関わっていると考えられる。

このように測定すべき特定の試料とマトリックスとが好ましく組み合わされるため、本発明は、濃縮分離などの処理を行わない測定サンプルに対して特に有用に用いられる。濃縮分離は、時として困難であったり不十分であったりすることもあり、測定までの処理工程の増加及びそれに伴う試料のロスの増加や、時間、費用などの増加につながることがあるため、本発明の方法は非常に簡便且つ安価な方法といえる。なお、感度の良い特異的検出を行うことが可能な本発明の方法が、濃縮分離などの処理を行った測定サンプルに対しても有用に用いられることはいうまでもない。

さらに、本発明においては、以上に述べたような化合物をそれぞれ単独でマトリックスとして用いることのほかに、以下のような混合マトリックスを用いることも好ましい。
本発明の混合マトリックスは、以上に述べたマトリックスとα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（4-CHCA；下記式(X)）とを混合させたものである。α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸は、従来からペプチドを測定する際に広く一般的に用いられるマトリックスである。（以下本明細書において、4-CHCAを組み合わせて用いずに単独で使用するマトリックスと、4-CHCAを組み合わせて用いる混合マトリックスとを、単にマトリックスと記載することがある。）

マトリックスと4-CHCAとの組み合わせの比率は、特に制限はないが、例えば以下のような量的関係で組み合わせることができる。

マトリックスは、すでに述べたような量で調製することができる。すなわち、１ｍｇ/ｍｌ〜飽和濃度の溶液として調製することができる。例えば、２，４−ジニトロアニリン、２−ブロモ−４，６−ジニトロアニリン、３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸、４−ニトロ安息香酸、及び３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸は、アセトニトリル水溶液、TFA水溶液、又はアセトニトリル−TFA水溶液を溶媒として用いた場合、１ｍｇ/ｍｌ〜飽和濃度、好ましくは飽和濃度のマトリックス溶液として調製することができる。また例えば、４−ニトロアニリン、４−ニトロフェノール、２−ニトロフェノール、２，５−ジニトロフェノール、及び３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸は、上記水溶液を溶媒として用いた場合、１ｍｇ/ｍｌ〜飽和濃度、好ましくは１０ｍｇ/ｍｌマトリックス溶液として調製することができる。

一方、4-CHCAは、１ｍｇ/ｍｌ〜飽和濃度の溶液として調製することができる。上記マトリックスとして用いられるときと同様の、アセトニトリル水溶液、TFA水溶液、又はアセトニトリル−TFA水溶液を溶媒として用いた場合、１ｍｇ/ｍｌ〜飽和濃度、好ましくは１０ｍｇ/ｍｌの4-CHCA溶液として調製することができる。

以上のように調製された双方の溶液を、好ましくは１：１０〜１０：１、より好ましくは１：３〜３：１、例えば１：１の体積比で混合して用いる。

従来のマトリックス4-CHCAは、例えば濃縮処理を行っていない測定試料の質量分析測定において、必ずしも特定の物質を特異的に検出することはできない。しかしながら、測定の感度には優れており、また、質量分析試料においてレーザーを当てる最適スポットを探すのが容易であるという利点を有する。

一方、４−ニトロアニリン、２，４−ジニトロアニリン、２−ブロモ−４，６−ジニトロアニリン、４−ニトロフェノール、２−ニトロフェノール、２，５−ジニトロフェノール、４−ニトロ安息香酸、３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸、及び３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸として例示される、ニトロベンゼン誘導体などの本発明のマトリックスは、すでに述べたように、本発明の測定試料中の特定の物質との親和性に優れていると考えられ、そのため、特定の物質の効率的なイオン化を達成することができるという利点を有する。そして、これらのマトリックスが、混合マトリックスとして4-CHCAと組み合わされることによって、双方のマトリックスが有する利点の相乗効果が奏される。すなわち、これらのマトリックスが単独でも有する特異的検出能を実用レベルで損ねることなく、4-CHCAが有する高感度検出能が相伴い、より解析効率に優れた質量分析を行うことが可能になる。

本発明によると、目的の物質を選択的に検出することができる。本発明は特に、上述のNBS法において、NBSラベル化ペプチドと非ラベル化ペプチドを含む混合サンプルから目的のNBSラベル化ペプチドを検出するときに有用に用いられる。この場合、基本的に、２−ニトロ［¹³Ｃ₆］ベンゼンスルフェニルクロリドでラベル化されたペプチドと２−ニトロ［¹²Ｃ₆］ベンゼンスルフェニルクロリドでラベル化されたペプチドとに由来するペアピークが特異的に検出される。

本発明によると、元の解析すべきサンプル又は対照サンプルのどちらか片方にのみ含まれていたタンパク質も容易に認識することが可能である。例えば、上述のNBS法の (6)の工程において本発明の方法を用いると、以下のようにして片方にのみ含まれていたタンパク質を認識することができる。直前の(5)の工程を行うことによって得られた質量分析用サンプルには、解析すべきタンパク質試料I及びIIの両方のサンプルに含まれるタンパク質に由来するラベル化ペプチド（それぞれをA、A’とする。）と、どちらか片方に含まれるタンパク質に由来するラベル化ペプチド（Bとする。）とが含まれる。ここで、質量分析用サンプルには、濃縮分離が不十分だと除かれ損ねたラベル化されていないペプチド(Cとする。)がさらに含まれる。従来におけるマトリックス（例えば4-CHCA）を用いて質量分析すると、A及びA’はペアピークとして検出されるが、B及びCのペプチドはシングルピークとして検出され、なおかつBとCとでラベル化・非ラベル化の区別がつかない。しかし、本発明におけるマトリックスを用いると、ラベル化されたA、A’及びBが優先的に検出され、Cについてはほとんど検出されなくなる。そして、優先的に検出されたピークの中でも、ペアピークは両方のサンプルに含まれていたタンパク質に由来するラベル化ペプチドA及びA’であり、シングルピークは片方のサンプルに含まれていたタンパク質に由来するラベル化ペプチドBということが分かる。つまり、従来におけるマトリックスを用いた質量分析の結果、シングルピークとして検出されたもののうち、本発明におけるマトリックスを用いた質量分析においても検出されたBは、片方のサンプルにのみ含まれていたタンパク質に由来するラベル化ペプチドであり、ほとんど検出されなかったCは、非ラベル化ペプチドである、という区別をつけることができる。

また、従来法のようにたとえばNBSラベル化ペプチドを4-CHCAをマトリックスとして用いて解析すると、目的のペプチドのピークからm/z=16小さい位置にもピークが観察される。また、目的のペプチドのピークからm/z=32小さい位置にも微小なピークが観察されることもある。さらに、測定するペプチドによっては、目的のペプチドのピークからm/z=155（NBSCl (light)（島津製作所製）でラベル化した場合）小さい位置にもピークが検出される。本発明を用いると、これらのピークがほとんど見られなくなり、マスピークがシンプルになるため、解析が容易になる。

以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。すでに述べたように、％で表された量の基準に関しては、特に断りのない限りv/v％とする。また、実施例においては、NBS試薬によるラベル化を修飾又はNBS修飾と表記することがある。

［実施例１］
本実施例においては、ACTH(5-10)ペプチド(BACHEM社から購入)と、２−ニトロ［¹²Ｃ₆］ベンゼンスルフェニルクロリド（NBS Reagent (light)；島津製作所製）でラベル化したACTH(5-10)ペプチドとの混合物を測定サンプルに用い、本発明のマトリックス3H4NBA（３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸）及び4H3NBA（４−ヒドロキシ−３−ニトロ安息香酸）、及び比較用の従来のマトリックスとしてDHB（２，５−ジヒドロキシ安息香酸）及び4-CHCA（α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸）を用いて、質量分析装置にて測定を行った。

以下に測定サンプルの調製方法を述べる。
ペプチドのラベル化は、ACTH 10μgを、50μlの70％酢酸水溶液中に20当量のNBS Reagent (light)を加えた試薬溶液中で１時間反応させることにより行った。反応後、ZipTip(μC18)を用いて脱塩し、ラベル化体のサンプルとした。一方、ACTH 10μgをNBS Reagent (light)を含まない50μlの70％酢酸水溶液中で１時間撹拌する処理を行ったものを、上述と同様に脱塩し、非ラベル化体のサンプルとした。得られたラベル化体サンプルと非ラベル化体サンプルとを等量混ぜ合わせ、質量分析用サンプルとした。

マトリックスとして、DHB、4-CHCA、及び、HNBAの異性体２種すなわち3H4NBA及び4H3NBAの４種を用意した。これらマトリックスは、0.1％TFAを含む50％アセトニトリル水溶液に溶解し、4-CHCA、DHB及び4H3NBAは10 mg/ml、3H4NBAは飽和溶液としたものを用いた。

上記測定サンプルを0.5μlとってマスプレート上に滴下し乾燥させ、次に、マトリックス溶液を0.5μlとって、先に乾燥させたサンプルの上に滴下し、乾燥させた。（以下、すべての実施例において同じ操作を行った。）これを、４種のマトリックスについて同様に行った。このようにして得られたマスプレートを用い、AXIMA-CFR装置（島津製作所製）にて測定を行った。

このとき得られたスペクトルを図１に示す。図１中、横軸は質量／電荷(Mass/Charge)、縦軸はイオンの相対強度を表す（以下、すべての図において横軸は質量／電荷(Mass/Charge; m/z)、縦軸はイオンの相対強度を表す）。(a)は、DHBをマトリックスに用いたときのスペクトル、(b)は、4-CHCAをマトリックスに用いたときのスペクトル、(c)は、3H4NBAをマトリックスに用いたときのスペクトル、(d)は、4H3NBAをマトリックスに用いたときのスペクトルである。また、太矢印はNBSラベル化されたACTHペプチドすなわち目的のペプチド、細矢印はラベル化されていないACTHペプチドのピークの位置を表す。図１が示すように、本発明のマトリックスを用いた(c)及び(d)において、選択的に目的のラベル化ペプチドが検出された。

［実施例２］
本実施例においては、標識修飾されたタンパク質と非標識修飾されたタンパク質との混合物を測定サンプルに用い、本発明のマトリックス3H4NBA及び比較用の従来のマトリックス4-CHCAを用いて、質量分析装置にて測定を行った。

精製タンパク質４種類（オボアルブミン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェイトデヒドロゲナーゼ、リゾチーム、α−ラクトアルブミン；全てSIGMA社製）を25μgずつ混合し合計100μgとしたものを２つ用意した。「¹³CNBS Isotope Labeling キット」（島津製作所製）のプロトコルに従って、２つの混合物のうち一方を２−ニトロ［¹³Ｃ₆］ベンゼンスルフェニルクロリド（NBS Reagent ( heavy)；島津製作所製）で、他方を２−ニトロ［¹²C₆］ベンゼンスルフェニルクロリド（NBS Reagent (light)；島津製作所製）で修飾した。修飾された２つの試料を混合し、脱塩した後、還元アルキル化・トリプシン消化を行った。サンプルを凍結乾燥し、50 μlの0.1％TFA水溶液に再懸濁したものをZipTip(μC18)で脱塩処理した。これを測定サンプルとし、マトリックスとして実施例１と同じ4-CHCA溶液及び3H4NBA溶液を用い、実施例１と同様にして質量分析装置にて測定を行った。

このとき得られたスペクトルを図２に示す。図２中、(a)は、4-CHCAをマトリックスに用いたときのスペクトル、(b)は、3H4NBAをマトリックスに用いたときのスペクトルである。図２においては、(a)で検出されたピークのうち、修飾に用いた２つの試薬NBS Reagent (heavy)（２−ニトロ［¹³C₆］ベンゼンスルフェニルクロリド）とNBS Reagent (light)（２−ニトロ［¹²C₆］ベンゼンスルフェニルクロリド）との質量差又はその倍数の差に相当する、m/z=6又はm/z=12の差を有する目的の修飾ペプチドのペアピークが、本発明のマトリックスを用いた(b)において選択的に検出された。

［実施例３］
本実施例においては、DSIPペプチド (delta sleep-inducing peptide(ペプチド研究所製); 500 fmol）とNBS Reagent (light)でラベル化したDSIPペプチド（500 fmol）との混合物を測定サンプルに用い、本発明のマトリックス3H4NBA及び比較用の従来のマトリックス4-CHCAを用いて、質量分析装置にて測定を行った。

ラベル化のためのサンプルとしてDSIPペプチドを用いた以外は、実施例１と同様にラベル化を行い、測定サンプルを得た。マトリックスとして実施例１と同じ3H4NBA溶液及び4-CHCA溶液を用いて、実施例１と同様にして質量分析装置にて測定を行った。このとき得られたスペクトルを図３に示す。図３中、(a)は、4-CHCAをマトリックスに用いたときのスペクトル、(b)は、3H4NBAをマトリックスに用いたときのスペクトルである。また、太矢印は、NBSラベル化されたDSIPペプチドの位置を表し、楕円で囲んだ部分は、矢印が示すピークよりそれぞれm/z=16, 32, 155小さいピークを表す。(a)において見られるこれらのピークは、本発明のマトリックスを用いた(b)においてはほとんど検出されず、これによって、目的のペプチドのピークが選択的に検出されたことが示された。

［実施例４］
本実施例においては、リゾチーム（Lysozyme）を還元・アルキル化し、さらにニトロ化した後、トリプシン消化した。これにより得られた消化物を測定サンプルに用い、本発明のマトリックス3H4NBA、及び比較用の従来のマトリックス4-CHCAを用いて質量分析装置にて測定を行った。

以下に測定サンプルの調製方法を述べる。
まず、1 mgのLysozymeを定法に従って還元・アルキル化処理した。次に、Riordan J.F. et al., 1966; Sokolovsky M. et al., 1966に記載の方法に従い、テトラニトロメタンを用いてニトロ化を行った。その後、定法に従ってトリプシンを加えてペプチド断片へと消化した。得られた消化物のうちの14μg相当を分取して凍結乾燥させた。これを50 μlの0.1％のTFA水溶液に再溶解させた後、ZipTip μ_-C18を用いて脱塩した。このようにして得られた消化物を、測定サンプルとした。この測定サンプルにおいて、ペプチドフラグメントのチロシン残基は、一部がニトロ化されている。つまり、ニトロチロシンを含むペプチドフラグメント、ニトロ化されていないチロシンを含むペプチドフラグメント、及びチロシンを含まないペプチドフラグメントの混合物となっている。

マトリックスとしては、比較用の従来の4-CHCA（α-cyano-4-hydroxy cinnamic acid；SIGMA社から購入）、又は3H4NBA（3-hydroxy-4-nitrobenzoic acid；ALDRICH社から購入）を用いた。これらマトリックスは、0.1％TFAを含む50％アセトニトリル水溶液に溶解し、4-CHCAは10 mg/ml、3H4NBAは飽和溶液としたものを用いた。

上記マトリックスを用いて、上記測定サンプルを質量分析装置AXIMA-CFR（島津製作所製）を用いてリフレクトロンモードでのMS測定を行った。（以下のすべての実施例においても、AXIMA-CFRを用いたリフレクトロンモードでのMS測定を行った。）このとき得られたスペクトルを、図４及び図５（Ａ及びＢ）に示す。図５のＡは、図４のm/z=850-960の部分の拡大図、図５のＢは図４のm/z=1740-1820の部分の拡大図である。図４及び図５（Ａ及びＢ）において、(a)は、マトリックスとして4-CHCAを用いて測定したスペクトル、(b)は、マトリックスとして3H4NBAを用いて測定したスペクトルである。

さらに、黒矢印で示されたピーク（(2*)：m/z=1798.83；
Asn-Thr-Asp-Gly-Ser-Thr-Asp-Tyr*-Gly-Ile-Leu-Gln-Ile-Asn-Ser-Arg（配列番号１）、及び(8*)：m/z=919.41；His-Gly-Leu-Asp-Asn-Tyr*-Arg（配列番号２）、ここでTyr*は、ニトロ化されたチロシン残基を示す）は、目的のニトロ化されたチロシン残基を含むトリプシン消化ペプチドのピークである。
白矢印で示されたピーク（(2) ：m/z=1753.84；Asn-Thr-Asp-Gly-Ser-Thr-Asp-Tyr-Gly-Ile-Leu-Gln-Ile-Asn-Ser-Arg（配列番号３）及び(8) ：m/z=874.42；His-Gly-Leu-Asp-Asn-Tyr-Arg（配列番号４））は、ニトロ化されなかった以外は上記目的の消化ペプチドと同じ配列を有する消化ペプチドである。
矢印が付されていない(3)：m/z=1675.80；Ile-Val-Ser-Asp-Gly-Asn-Gly-Met-Asn-Ala-Trp-Val-Ala-Trp-Arg（配列番号５）、(5)：m/z=1268.61；Gly-Tyr-Ser-Leu-Gly-Asn-Trp-Val-Cys-Ala-Ala-Lys（配列番号６）及び(6) ：m/z=1045.54；Gly-Thr-Asp-Val-Gln-Ala-Trp-Ile-Arg（配列番号７）は、Lysozyme由来のトリプシン消化ペプチドのピークである
破線の楕円で囲まれたピークは、上記目的の消化ペプチドのピークよりm/z=16又はm/z=32小さいピークでる。

これらの図が示すように、マトリックスとして3H4NBAを用いた場合にのみ、目的のニトロ化されたチロシン残基を含むペプチドフラグメントのピークがはっきりと検出され、ニトロ化されていないチロシン残基を含むペプチドフラグメントのピークや前記のm/z=16、m/z=32小さいピークがほとんど検出されなくなった。つまり、3H4NBAをマトリックスとして用いることで、選択的に目的のピークのみが検出された。

［実施例５］
本実施例においては、NBS試薬（2-nitrobenzenesulfenyl chloride (MW = 189.62)；島津製作所製）でシステインをラベル化したペプチドと、ラベル化していないペプチドとの混合物を測定サンプルに用い、本発明のマトリックス3H4NBA、及び比較用の従来のマトリックス4-CHCAを用いて質量分析装置にて測定を行った。

以下に測定サンプルの調製方法を述べる。
まず、ペプチドIRRP1（Cys-Leu-Lys-Asp-Arg-His-Asp（配列番号８）；BACHEM社から購入）10 μgを、0.1％TFAを含む50％アセトニトリル水溶液を用いて分注し、凍結乾燥させた。これを15μlのMilli-Q水（ミリポア社製）に溶解し、これと35μlのNBS試薬溶液（NBS試薬0.17 mgを35μlの酢酸に溶解したもの）とを混合して室温で一時間反応させた。これをZipTip μ_-C18を用いて脱塩したものを、ラベル化ペプチドサンプルとした。
別途、10μgのペプチドIRRP1を15μlのMilli-Q水に溶解し、35μlの酢酸と混合して室温で一時間静置し、ZipTip μ_-C18を用いて脱塩したものを、非ラベル化ペプチドサンプルとした。
ラベル化ペプチドサンプルと非ラベル化ペプチドサンプルとを等量混合し、測定サンプルとした。

マトリックスとしては、実施例４と同じものを調製して用い、上記測定サンプルを質量分析装置にて測定を行った。このとき得られたスペクトルを、図６に示す。図６において、「×5」で示したm/z=845-940に相当する範囲は、縦方向に５倍に拡大表示している。図６中、(a)は、マトリックスとして4-CHCAを用いて測定したスペクトル、(b)は、マトリックスとして3H4NBAを用いて測定したスペクトルである。さらに、黒矢印で示されたピーク（m/z=1038.40）は、目的のラベル化ペプチドサンプルのピーク、白矢印で示されたピーク（m/z=886.42）は、非ラベル化ペプチドサンプルのピーク、破線の楕円で囲まれたピークは、目的のペプチドのピークよりm/z=16小さいピークである。

これらの図が示すように、マトリックスとして3H4NBAを用いた場合にのみ、目的のラベル化ペプチドサンプルのピークがはっきりと検出され、4-CHCAを用いた場合に検出されていた非ラベル化ペプチドのピーク及び上記のm/z=16 小さいピークが検出されなくなった。つまり、3H4NBAをマトリックスとして用いることで、選択的に目的のピークのみが検出された。

［実施例６］
本実施例においては、p-ニトロフェニルアラニンを含むペプチドを測定サンプルに用い、本発明のマトリックス3H4NBA、及び比較用の従来のマトリックス4-CHCAを用いて質量分析装置にて測定を行った。

以下に測定サンプルの調製方法を述べる。
ペプチドHIV subIII（His-Lys-Ala-Arg-Val-Leu-Phe*-Glu-Ala-nLeu-Ser-NH₂（配列番号９）；Phe * = p-ニトロフェニルアラニン、nLeu =ノルロイシン、Ser-NH₂=カルボキシル基がアミド化されたセリン； BACHEM社から購入）10 μgを、0.1％TFAを含む50％アセトニトリル水溶液を用いて分注し、凍結乾燥させた。これを50μlの0.1％ TFA水溶液に溶解し、ZipTipμ_-C18を用いて処理したものを、測定サンプルとした。

マトリックスとしては、実施例４と同じものを調製して用い、上記測定サンプルを質量分析装置にて測定を行った。このとき得られたスペクトルを、図７に示す。図７中、(a)は、マトリックスとして4-CHCAを用いて測定したスペクトル、(b)は、マトリックスとして3H4NBAを用いて測定したスペクトルである。さらに、黒矢印で示されたピーク（m/z=1314.73）は、目的のペプチドHIV subIIIのピーク、破線の楕円で囲まれたピークは、目的のペプチドのピークよりm/z=16小さいピークである。

これらの図が示すように、マトリックスとして3H4NBAを用いた場合にのみ、目的のHIV subIIIのピークのみが検出され、4-CHCAを用いた場合に検出されていたm/z=16 小さいピークが検出されなくなった。つまり、3H4NBAをマトリックスとして用いることで、選択的に目的のピークが検出された。

［実施例７］
本実施例においては、NBS試薬（2-nitrobenzenesulfenyl chloride (MW = 189.62)；島津製作所製）でラベル化したACTHと、ラベル化していないACTHとの混合物を測定サンプルに用い、本発明のマトリックスである2,4DNA（２，４−ジニトロアニリン）、2B4,6DNA（２−ブロモ−４，６−ジニトロアニリン）、4NA （４−ニトロアニリン）、4NBA（４−ニトロ安息香酸）、2NP（２−ニトロフェノール）、及び2,5DNP（２，５−ジニトロフェノール）と、比較用の従来のマトリックス4-CHCAとを用いて、質量分析装置にて測定を行った。

以下に測定サンプルの調製方法を述べる。測定サンプルは、濃度の違うものを２種用意した。
ZipTipμ_-C18による脱塩処理の代わりにC18カラム（YMC-Pack Pro C18；YMC社製）を用いたクロマトグラフィーによる精製を行った以外は、実施例１と同様にしてラベル化ペプチドサンプル（ラベル化ACTH）を調製した。このラベル化ペプチドサンプルと、非ラベル化ペプチドサンプル（ラベル化していないACTH）とを等モルずつ混合して、それぞれの濃度が0.5 pmol/μl又は5 pmol/μlとなるように0.1％TFAを含む50％アセトニトリル水溶液に溶解させて調製した測定サンプルを得た。

マトリックスとしては、2,4DNA、2B4,6DNA、4NA、4NBA、2NP、及び2,5DNP（4NAはSIGMA社から、その他は全てALDRICH社から購入した）をそれぞれ、0.1％ TFAを含む50％アセトニトリル水溶液に溶解させた。4NA、2NP、2,5DNPはそれぞれ10 mg/ml、2,4DNA、2B4,6DNA、4NBAは飽和溶液としたものを用いた。比較用の従来の4-CHCAは、10 mg/mlとしたものを用いた。

上記マトリックスを用いて、上記測定サンプルを質量分析装置にて測定を行った。このとき得られたスペクトルを、図８及び図９に示す。

図８中(a)は、マトリックスとして4-CHCAを用いて測定したスペクトル、(b)は、マトリックスとして2,4DNAを用いて測定したスペクトル、(c)は、マトリックスとして2B4,6DNAを用いて測定したスペクトルである。これらのスペクトルは、ラベル化ペプチド及び非ラベル化ペプチドの濃度をそれぞれ0.5 pmol/μlに調製した測定サンプルのものである。

図９中、(a)は、マトリックスとして4-CHCAを用いて測定したスペクトル、(b)は、マトリックスとして4NAを用いて測定したスペクトル、(c)は、マトリックスとして4NBAを用いて測定したスペクトル、(d) は、マトリックスとして2NPを用いて測定したスペクトル、(e) は、マトリックスとして2,5DNPを用いて測定したスペクトルである。これらのスペクトルは、ラベル化ペプチド及び非ラベル化ペプチドの濃度をそれぞれ5 pmol/μlに調製した測定サンプルのものである。

さらに、黒矢印で示されたピーク（m/z=983.37）は、目的のラベル化ペプチドサンプルのピーク、白矢印で示されたピーク（m/z=831.39）は、非ラベル化ペプチドサンプルのピーク、破線の楕円で囲まれたピークは、目的のペプチドのピークよりm/z=16又はm/z=32小さいピークである。

これらの図が示すように、本発明のマトリックスとして用いた場合はいずれも、4-CHCAを用いたときに検出されていた非ラベル化ペプチドのピークや、目的のペプチドのピークよりm/z=16及びm/z=32小さいピークが検出されなくなり、主にラベル化ペプチドのピークのみが検出されるようになった。つまり、本発明のマトリックスを用いることで、選択的に目的のピークのみが検出されるようになったことがわかる。

［実施例８］
本実施例においては、NBS試薬によって修飾されたペプチドと非修飾ペプチドとの混合物を測定サンプルに用い、本発明のマトリックスである、4-CHCAと3H4NBAとの混合マトリックス、4-CHCAと3H2NBA（３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸）との混合マトリックス、4-CHCAと2,4DNAとの混合マトリックス、4-CHCAと4NAとの混合マトリックス、4-CHCAと4NP（４−ニトロフェノール）との混合マトリックス、及び3H4NBA単独使用のマトリックスと、比較用の従来のマトリックス4-CHCAとを用いて、質量分析装置にて測定を行った。

精製タンパク質４種類（オボアルブミン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェイトデヒドロゲナーゼ、リゾチーム、α−ラクトアルブミン；全てSIGMA社製）を25μgずつ混合し合計100μgとしたものを２つ用意した。変性剤として終濃度8Mの尿素を用いてそれぞれの混合物について変性を行った以外は、「¹³CNBS Isotope Labeling キット」（島津製作所製）のプロトコルに従い、一方をNBS Reagent (heavy)（２−ニトロ［¹³C₆］ベンゼンスルフェニルクロリド）で標識修飾し、他方をNBS Reagent (light)（２−ニトロ［¹²C₆］ベンゼンスルフェニルクロリド）で非標識修飾し、両修飾試料の混合、還元、アルキル化、及びトリプシン消化を行った。消化後のサンプルをZipTipμ-C18で脱塩処理し、0.1％TFAを含む50％アセトニトリル水溶液により溶出し、得られた溶出液を測定サンプルとした。この溶出液を0.1％TFAを含む50％アセトニトリル水溶液を用いて10倍に希釈し、そのうち0.5μlを、マスプレート上に塗布した。

マトリックスとしては、以下のように調製したものを用いた。0.1％TFAを含む50％アセトニトリル水溶液を溶媒とし、4-CHCA、3H4NBA、3H2NBA、2,4DNA、4NA、4NPをそれぞれ溶解させた。4-CHCA、3H2NBA、4NA、及び4NPはそれぞれ10 mg/mlの溶液、3H4NBA及び2,4DNAはそれぞれ飽和溶液とした。混合マトリックスについては、このように調製した溶液を、１：１の体積比で混合して使用した。3H4NBA単独使用のマトリックスと、比較用の従来のマトリックス4-CHCAとについては、このように調製した溶液をそのまま用いた。

あらかじめ用意しておいた、測定サンプルの塗布を行ったマスプレート上に、上記マトリックスの溶液0.5μlを添加し、乾燥した後、質量分析装置にて測定を行った。このとき得られたスペクトルを、図１０に示す。図１０中、(a)は4-CHCAと3H4NBAとの混合マトリックス（+3H4NBA）を、(b)は 4-CHCAと3H2NBAとの混合マトリックス（+3H2NBA）を、(c)は 4-CHCAと2,4DNAとの混合マトリックス（+2,4DNA）を、(d)は4-CHCAと4NAとの混合マトリックス（+4NA）を、(e)は4-CHCAと4NPとの混合マトリックス（+4NP）を、(f)は比較用の従来のマトリックス4-CHCAを、(g)は3H4NBA単独使用のマトリックスをそれぞれ用いて測定したスペクトルである。さらに、黒矢印で示されたピーク対は、目的のNBS修飾ペプチドのものであることを示している。なお、この目的の修飾ペプチドフラグメントのペアピークは、修飾に用いた２つの試薬NBS Reagent (heavy)（２−ニトロ［¹³C₆］ベンゼンスルフェニルクロリド）とNBS Reagent (light)（２−ニトロ［¹²C₆］ベンゼンスルフェニルクロリド）との質量差又はその倍数の差に相当する、m/z=6 又はm/z=12の質量差を有する。

図１０が示すように、(a)〜(e)のように混合マトリックスを用いた場合は、(f)のように4-CHCAを単独で用いた場合に比べて目的のピークが特異的に検出されていることがわかる。さらに、混合マトリックスを用いた(a)〜(e)においては、(g)のように3H4NBAを単独で用いた場合よりも、目的のピークの検出感度がより良くなっていることもわかる。つまり、本発明のマトリックスの中でも混合マトリックスを用いた(a)〜(e)は、(g)のように本発明のマトリックスの中でも単独の化合物を用いる場合に達成されるような目的物質に対する特異的イオン化能力を残しつつ、従来から用いられてきた4-CHCAと同程度に検出感度が向上する、という好ましい測定条件であるといえる。

測定サンプルを、ACTHペプチドと、NBS Reagent (light)でラベル化したACTHペプチドとの混合物とした場合の、従来法によって得られたマススペクトル（(a)及び(b)）、及び、本発明によって得られたマススペクトル（(c) 及び(d)）である。測定サンプルを、精製タンパク質４種類（オボアルブミン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェイトデヒドロゲナーゼ、リゾチーム、α−ラクトアルブミン）のNBS Reagent (heavy)による標識ラベル化物とNBS Reagent (light)による非標識ラベル化物との１：１混合物を消化したものとした場合の従来法によって得られたマススペクトル(a)、及び本発明によって得られたマススペクトル(b)である。測定サンプルを、DSIPペプチドとNBS Reagent (light)でラベル化したDSIPペプチドとの混合物とした場合の、従来法によって得られたマススペクトル(a)、及び本発明によって得られたマススペクトル(b)である。測定サンプルを、リゾチームをニトロ化しトリプシン消化して得られた混合物とした場合の、従来法によって得られたマススペクトル(a)、及び本発明によって得られたマススペクトル(b)である。図４の部分拡大図である。測定サンプルを、NBS Reagent (light)でラベル化したペプチドIRRP1とラベル化していないペプチドIRRP1との混合物とした場合の、従来法によって得られたマススペクトル(a)、及び本発明によって得られたマススペクトル(b)である。測定サンプルを、p-ニトロフェニルアラニンを含むペプチドHIV subIIIとした場合の、従来法によって得られたマススペクトル(a)、及び本発明によって得られたマススペクトル(b)である。測定サンプルを、NBS Reagent (light)でラベル化したACTHとラベル化していないACTHとの混合物とした場合の、従来法によって得られたマススペクトル(a)、及び本発明によって得られたマススペクトル（(b)及び(c)）である。測定サンプルを、NBS Reagent (light)でラベル化したACTHとラベル化していないACTHとの混合物とした場合の、従来法によって得られたマススペクトル(a)、及び本発明によって得られたマススペクトル（(b)、(c)、(d)及び(e)）である。測定サンプルを、精製タンパク質４種類（オボアルブミン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェイトデヒドロゲナーゼ、リゾチーム、α−ラクトアルブミン）のNBS Reagent (heavy)によるラベル化物とNBS Reagent (light)によるラベル化物との１：１混合物を消化したものとした場合の、従来法によって得られたマススペクトル(f)、及び本発明によって得られたマススペクトル（(a)、(b)、(c)、(d)、(e)及び(g)）である。

配列番号８及び９は、合成ペプチドである。

Claims

質量分析において、測定すべき特定の物質と前記特定の物質以外の物質とを含む混合物サンプルに含まれる、前記特定の物質を、
前記特定の物質以外の物質よりも、前記特定の物質をよりイオン化させやすいマトリックスを用いることによって特異的にイオン化し、混合物から特定の物質を選択的に測定する質量分析方法であって、
前記特定の物質が疎水性物質であり、
前記マトリックスが疎水性物質であり、且つ、前記特定の物質との間で電荷の授受を行うための官能基と、前記マトリックス自身に疎水性を与えるための官能基とを有する、ベンゼン環又はベンゼン環以外の芳香環の置換体である、質量分析方法。
前記特定の物質が生体関連物質である、請求項１に記載の質量分析方法。
前記生体関連物質が、タンパク質、ペプチド、糖及び脂質から選ばれる、請求項２に記載の質量分析方法。
前記特定の物質が同位体標識されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の質量分析方法。
前記マトリックスが、前記特定の物質とファンデルワールス相互作用することができる物質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の質量分析方法。
前記特定の物質がπ電子含有物質であり、且つ前記マトリックスがπ電子含有物質である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の質量分析方法。
前記特定の物質が、疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の質量分析方法。
前記疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質が、ベンゼン環及び/又はベンゼン環以外の芳香環を有する、請求項７に記載の質量分析方法。
前記疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質が、さらにニトロ基を有する、請求項７又は８に記載の質量分析方法。
前記疎水性ペプチド又はタンパク質が、ニトロベンゼンスルフェニル基又はニトロフェニル基を有する、請求項７〜９のいずれか１項に記載の質量分析方法。
前記疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質が、ベンゼン環、ベンゼン環以外の芳香環、及び/又はニトロ基を有する疎水性化合物を用いて、前記疎水性ペプチド又は疎水性タンパク質に対応するペプチド又はタンパク質を化学修飾することによって得られる、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の質量分析方法。
前記疎水性化合物が、スルフェニル化合物である、請求項１１に記載の質量分析方法。
前記スルフェニル化合物が２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリドである、請求項１１又は１２に記載の質量分析方法。
前記電荷の授受を行うための官能基がカルボキシル基、水酸基、アミノ基、硫酸基、硝酸基及びアルデヒド基から選ばれる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の質量分析方法。
前記疎水性を与えるための官能基がニトロ基である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の質量分析方法。
前記マトリックスがニトロ安息香酸誘導体又はニトロフェノール誘導体である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の質量分析方法。
前記マトリックスがヒドロキシニトロ安息香酸誘導体である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の質量分析方法。
前記マトリックスがヒドロキシニトロ安息香酸の位置異性体から選ばれる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の質量分析方法。
前記マトリックスが、４−ニトロアニリン、２，４−ジニトロアニリン、２−ブロモ−４，６−ジニトロアニリン、４−ニトロフェノール、２−ニトロフェノール、２，５−ジニトロフェノール、４−ニトロ安息香酸、３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸、及び３−ヒドロキシ−２−ニトロ安息香酸から選ばれる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の質量分析方法。
前記マトリックスにα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を組み合わせた混合マトリックスを用いる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の質量分析方法。
前記マトリックスを、１ｍｇ/ｍｌ〜飽和濃度の溶液として用いる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の質量分析方法。
前記α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を、１ｍｇ/ｍｌ〜飽和濃度の溶液として用いる、請求項２０又は２１に記載の質量分析方法。
前記マトリックスの溶液と、前記α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸の溶液とを、１：１０〜１０：１の体積比で用いる、請求項２２に記載の質量分析方法。