JP5980517B2 - 質量分析用マトリックスの添加剤 - Google Patents
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Description
本発明は、医療及び創薬分野において応用されうるＭＡＬＤＩ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析）アプリケーションに関する。より具体的には、本発明は、質量分析用マトリックスの添加剤となる化合物に関する。
ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）質量分析法において、測定対象分子の効率的なイオン化を実現する条件が探索されている。
例えば、特開２００５−３２６３９１号公報（特許文献１）に、疎水性ペプチドを予め２−ニトロベンゼンスルフェニル基によって修飾し、α−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸（3-CHCA）、３−ヒドロキシー４−ニトロ安息香酸（3H4NBA）、又はそれらの混合物をマトリックスとして用いた質量分析を行うことで、一般的マトリックスであるα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（4-CHCA）や２，５−ジヒドロ安息香酸（DHB）に比べ、疎水性ペプチドを効率よくイオン化する方法が記載されている。
例えば、特開２００５−３２６３９１号公報（特許文献１）に、疎水性ペプチドを予め２−ニトロベンゼンスルフェニル基によって修飾し、α−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸（3-CHCA）、３−ヒドロキシー４−ニトロ安息香酸（3H4NBA）、又はそれらの混合物をマトリックスとして用いた質量分析を行うことで、一般的マトリックスであるα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（4-CHCA）や２，５−ジヒドロ安息香酸（DHB）に比べ、疎水性ペプチドを効率よくイオン化する方法が記載されている。
上記のＭＡＬＤＩ質量分析法においては、測定対象分子の修飾が行われる場合にはある程度のイオン化促進効果が得られるが、修飾が行われない場合には、イオン化効率は十分でない。
このように、特に疎水性ペプチドのようなＭＡＬＤＩイオン化が難しい分子種は、従来の方法によってもイオン化効率が低いという問題がある。
本発明の目的は、測定対象分子の修飾を行うことなく、容易に且つ効率よく、質量分析におけるイオン化効率を向上させることができる物質を提供することにある。
このように、特に疎水性ペプチドのようなＭＡＬＤＩイオン化が難しい分子種は、従来の方法によってもイオン化効率が低いという問題がある。
本発明の目的は、測定対象分子の修飾を行うことなく、容易に且つ効率よく、質量分析におけるイオン化効率を向上させることができる物質を提供することにある。
本発明者らは、鋭意検討の結果、ヒドロキシケイ皮酸の類似化合物であって、ある程度の炭素数を有するアルキルオキシ基を有する化合物が、マトリックスとしては機能しないものの、マトリックスの添加剤として用いられることによって本発明の目的を達成することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下の発明を含む。
（１）
下記式（I）：
（式中、Ｒは炭素数４〜１６のアルキル基を表し、−ＯＲ基と−ＣＨ＝Ｃ（ＣＮ）ＣＯＯＨ基とは互いにメタ位又はパラ位に置換している。）で示される、質量分析用マトリックスの添加剤。
（１）
下記式（I）：
（式中、Ｒは炭素数４〜１６のアルキル基を表し、−ＯＲ基と−ＣＨ＝Ｃ（ＣＮ）ＣＯＯＨ基とは互いにメタ位又はパラ位に置換している。）で示される、質量分析用マトリックスの添加剤。
（２）
シナピン酸、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸及びα−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸からなる群から選ばれる質量分析用マトリックスに添加される、（１）に記載の添加剤。
シナピン酸、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸及びα−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸からなる群から選ばれる質量分析用マトリックスに添加される、（１）に記載の添加剤。
（３）
疎水性ペプチドの質量分析に用いられる、（１）又は（２）に記載の添加剤。
なお、本発明においては、ペプチドにはタンパク質も含まれる。
疎水性ペプチドの質量分析に用いられる、（１）又は（２）に記載の添加剤。
なお、本発明においては、ペプチドにはタンパク質も含まれる。
（４）
（１）〜（３）のいずれかに記載の質量分析用マトリックスの添加剤を用いた質量分析法。
（１）〜（３）のいずれかに記載の質量分析用マトリックスの添加剤を用いた質量分析法。
下記式（I）：
（式中、Ｒは炭素数４〜１６のアルキル基を表し、−ＯＲ基と−ＣＨ＝Ｃ（ＣＮ）ＣＯＯＨ基とは互いにメタ位又はパラ位に置換している。）で示される質量分析用マトリックス添加剤と、シナピン酸、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸及びα−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸からなる群から選ばれる質量分析用マトリックスとを含む、質量分析用マトリックス組成物。
（式中、Ｒは炭素数４〜１６のアルキル基を表し、−ＯＲ基と−ＣＨ＝Ｃ（ＣＮ）ＣＯＯＨ基とは互いにメタ位又はパラ位に置換している。）で示される質量分析用マトリックス添加剤と、シナピン酸、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸及びα−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸からなる群から選ばれる質量分析用マトリックスとを含む、質量分析用マトリックス組成物。
（５）
下記式（I）：
（式中、Ｒは炭素数４〜１６のアルキル基を表し、−ＯＲ基と−ＣＨ＝Ｃ（ＣＮ）ＣＯＯＨ基とは互いにメタ位又はパラ位に置換している。）で示される化合物。
下記式（I）：
（式中、Ｒは炭素数４〜１６のアルキル基を表し、−ＯＲ基と−ＣＨ＝Ｃ（ＣＮ）ＣＯＯＨ基とは互いにメタ位又はパラ位に置換している。）で示される化合物。
本発明により、質量分析測定対象分子（特に疎水性ペプチド）のイオン化効率を向上させることができるマトリックス添加剤を提供することができる。
本発明により、質量分析測定対象分子（特に疎水性ペプチド）の質量分析測定による検出感度向上を達成することができることができる。
本発明により、質量分析測定対象分子（特に疎水性ペプチド）の質量分析測定による検出感度向上を達成することができることができる。
本発明は、下記式（I）で示される化合物である。
式（I）中、Ｒは炭素数４〜１６、好ましくは８〜１６のアルキル基を表す。アルキル基は、直鎖及び分岐を問わない。また、−ＯＲ基と−ＣＨ＝Ｃ（ＣＮ）ＣＯＯＨ基とは互いにメタ位又はパラ位に置換している。また、シス型及びトランス型を問わない。
式（I）中、Ｒは炭素数４〜１６、好ましくは８〜１６のアルキル基を表す。アルキル基は、直鎖及び分岐を問わない。また、−ＯＲ基と−ＣＨ＝Ｃ（ＣＮ）ＣＯＯＨ基とは互いにメタ位又はパラ位に置換している。また、シス型及びトランス型を問わない。
上記式（I）で示される化合物は、例えば、Ｒ−Ｘ（Ｒは炭素数４〜１６のアルキル基、Ｘはハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）その他の脱離基を表す。）で示されるアルキル化剤を用い、α−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸又はα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸にアルキル基を導入することで合成することができる。
この場合、アルキル化剤Ｒ−Ｘは、α−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸又はα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸の１．０〜２．０当量用いることができる。溶媒としては、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミドなどを用いることができる。反応条件としては、加熱還流条件（例えば反応温度が５０〜１７０℃）、反応時間は２時間以上でありうる。
式（I）の化合物は、マトリックスレーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析におけるマトリックスの添加剤として有用である。本発明の化合物は、単独では測定対象のイオン化能力はないため、マトリックスとしては機能しない。しかしながら、マトリックスと混合して使用されることによって、マトリックスによる測定対象のイオン化能力を増強し、検出限界の向上を図ることができる。
本発明の添加剤と共に使用されるマトリックスとしては特に限定されない。一般的なマトリックスから当業者によって適宜選択されてよいが、例えば、シナピン酸、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸及びα−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸から選ばれることができる。
本発明の添加剤を用いる質量分析対象は特に限定されない。例えば、分子量が５００〜３００００、好ましくは１０００〜１００００の分子でありうる。好ましくは、質量分析対象は疎水性物質である。
疎水性物質の疎水性の程度としては特に限定されるものではなく、様々な公知の疎水性指標や疎水性度算出法に基づいて、疎水性と判断し得る程度であればよい。
例えば、疎水性物質の疎水性の程度は、当業者がＢＢインデックス（Bull and Breese Index）によって疎水性と判断しうる程度であればよい。より具体的には、ＢＢインデックスは例えば１０００以下、好ましくは−１０００以下でありうる。
あるいは、疎水性物質の疎水性の程度は、当業者がＨＰＬＣインデックスによって疎水性と判断しうる程度であればよい。HPLCインデックスは、C.A.Brownw, H.P.J.Bennett, S.SolomonによりAnalytical Biochemistry, 124, 201-208, 1982で報告された、0.13%ヘプタフルオロ-n-酪酸（HFBA）を含むアセトニトリル水溶液を溶離液として使用した逆相HPLC保持時間に基づく疎水性指数で、HPLC/HFBA retentionとも称される。より具体的には、ＨＰＬＣインデックスは例えば５０以上、好ましくは１００以上でありうる。
疎水性物質の疎水性の程度としては特に限定されるものではなく、様々な公知の疎水性指標や疎水性度算出法に基づいて、疎水性と判断し得る程度であればよい。
例えば、疎水性物質の疎水性の程度は、当業者がＢＢインデックス（Bull and Breese Index）によって疎水性と判断しうる程度であればよい。より具体的には、ＢＢインデックスは例えば１０００以下、好ましくは−１０００以下でありうる。
あるいは、疎水性物質の疎水性の程度は、当業者がＨＰＬＣインデックスによって疎水性と判断しうる程度であればよい。HPLCインデックスは、C.A.Brownw, H.P.J.Bennett, S.SolomonによりAnalytical Biochemistry, 124, 201-208, 1982で報告された、0.13%ヘプタフルオロ-n-酪酸（HFBA）を含むアセトニトリル水溶液を溶離液として使用した逆相HPLC保持時間に基づく疎水性指数で、HPLC/HFBA retentionとも称される。より具体的には、ＨＰＬＣインデックスは例えば５０以上、好ましくは１００以上でありうる。
本発明においては、特に疎水性ペプチド（本発明においては、ペプチドにはタンパク質も含まれる）のイオン化能増強効果が高い。
疎水性ペプチドであるか否かについても、上述のＢＢインデックスあるいはHPLCインデックスを指標とすることができるが、具体的には、ペプチドを構成するアミノ酸に、より疎水性度の高いアミノ酸残基を、より多く含むものであってよい。例えば疎水性アミノ酸としては、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、トリプトファン、グリシンなどが挙げられる。また、システイン、チロシンなどを含むこともある。
疎水性ペプチドは、このようなペプチドの１次構造のみによらず、より疎水性度の高い高次構造を持つものでもありうる。例えば、逆相HPLCカラムが使用される疎水性の固定相表面と相互作用が起こりやすい構造を持つペプチドが挙げられる。
疎水性ペプチドであるか否かについても、上述のＢＢインデックスあるいはHPLCインデックスを指標とすることができるが、具体的には、ペプチドを構成するアミノ酸に、より疎水性度の高いアミノ酸残基を、より多く含むものであってよい。例えば疎水性アミノ酸としては、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、トリプトファン、グリシンなどが挙げられる。また、システイン、チロシンなどを含むこともある。
疎水性ペプチドは、このようなペプチドの１次構造のみによらず、より疎水性度の高い高次構造を持つものでもありうる。例えば、逆相HPLCカラムが使用される疎水性の固定相表面と相互作用が起こりやすい構造を持つペプチドが挙げられる。
本発明の添加剤とマトリックスとの組み合わせの比率は特に制限はないが、例えば、添加剤が質量分析用マトリックスの０．０１〜５０倍、好ましくは０．０１〜１倍のモル比の量的関係となるように組み合わせることができる。
本発明の添加剤は、通常、マトリックスとの混合溶液に調製される。マトリックスと添加剤との混合溶液は、通常、マトリックス溶液と添加剤溶液とをそれぞれ調製しておき、両溶液を混合することによって調製することができる。溶媒としては、例えば、アセトニトリル（ACN）−トリフルオロ酢酸（TFA）水溶液、アセトニトリル水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液などを用いることができる。アセトニトリル−トリフルオロ酢酸水溶液におけるアセトニトリルの濃度は例えば１０〜９０体積％であり、トリフルオロ酢酸の濃度は例えば０．０５〜１体積％でありうる。
添加剤は、例えば、０．５〜５０ｍｇ/ｍｌ、好ましくは５〜１０ｍｇ/ｍｌ、例えば５ｍｇ/ｍｌの溶液に調製することができる。マトリックスは、例えば、１ｍｇ/ｍｌ〜飽和濃度、好ましくは１〜１０ｍｇ/ｍｌ、例えば１０ｍｇ/ｍｌの溶液に調製することができる。これら添加剤溶液及びマトリックス溶液は、例えば、１０：１〜１：１０、例えば１：１の体積比で混合することができる。
本発明の添加剤を用いて使用される質量分析装置としては、MALDIイオン源と組み合わされたものであれば特に限定されない。例えば、MALDI-TOF（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間）型質量分析装置、MALDI-IT（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ）型質量分析装置、MALDI-IT-TOF（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ−飛行時間）型質量分析装置、MALDI-FTICR（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）型質量分析装置等が挙げられる。
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
［実施例１：添加剤化合物(E )-2-Cyano-3-(4-(octyloxy)phenyl)acrylic acidの合成］
［実施例１：添加剤化合物(E )-2-Cyano-3-(4-(octyloxy)phenyl)acrylic acidの合成］
α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸(5.29×10-3mol)をアセトン(10mL)に溶解し、NaOH水溶液 (5M, 10mL) を加えた。これに1-ブロモオクタン (5.33×10-3mol) のアセトン溶液（10mL）を滴下し、3時間還流した。冷却後、溶媒を減圧下で留去し、これに希HClを加えてpHを3とし、酢酸エチル40mLで3回抽出した。酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を除去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー (SiO2150 g, 0.06-0.2 mm, 70 cmカラム、展開溶媒はヘキサン：酢酸エチル＝8:2 v/v）により精製し、黄色の結晶を得た（収量：0.80g（2.65×10-3mol）, 収率50％；1H NMR(400MHz, CDCl3) d 7.49 (s, 2H), 7.46(d, J=7.80 Hz, 2H), 6.90 (d, J=8.9 Hz, 2H), 6.60 (d, J=7.0 Hz, 2H), 3.98 (t, J=6.7 Hz, 2H), 1.79 (tt, J=7.0 Hz, 2H), 1.20- 1.50 (m, 10H), 0.88 (t, J=6.96 Hz, 3H)）。
得られた化合物の1H-NMRスペクトルを図１に、プロトン帰属結果を図２に示す。
得られた化合物の1H-NMRスペクトルを図１に、プロトン帰属結果を図２に示す。
［実施例２］
本実施例においては、実施例１で得られた化合物（以下、C8-ACHCA）を、マトリックスであるシナピン酸（SA）の添加剤として用い、疎水性ペプチド（Humanin；ＢＢインデックスは-5800）の測定を行った。比較用として、シナピン酸（SA）を単独マトリックスとして用いた測定も行った。
本実施例においては、実施例１で得られた化合物（以下、C8-ACHCA）を、マトリックスであるシナピン酸（SA）の添加剤として用い、疎水性ペプチド（Humanin；ＢＢインデックスは-5800）の測定を行った。比較用として、シナピン酸（SA）を単独マトリックスとして用いた測定も行った。
（１）SAの10mg/mL (50%ACN/0.05%TFA水溶液中(%は体積を基準とする。以下において同様))溶液と、C8-ACHCAの5mg/mL(50%ACN/0.05%TFA水溶液中)溶液とを1:1(v/v)で混合してマトリックス溶液を作成した。添加剤C8-ACHCAを混合された状態のマトリックスSAを、C8-ACHCA/SAと記載する。
（２）疎水性ペプチドHumaninの1f〜2pmol/μL（50%ACN/0.05%TFA水溶液中）溶液を作成した。
（３）MALDIプレ−ト上に(2)の試料溶液と(1)のマトリックス溶液とを0.5μLずつ滴下し混合した(on-target mix法)。
（４）AXIMA Performance(登録商標) (島津製作所)のリニアTOF、ポジティブ及びネガティブモ−ドで計測した。
（２）疎水性ペプチドHumaninの1f〜2pmol/μL（50%ACN/0.05%TFA水溶液中）溶液を作成した。
（３）MALDIプレ−ト上に(2)の試料溶液と(1)のマトリックス溶液とを0.5μLずつ滴下し混合した(on-target mix法)。
（４）AXIMA Performance(登録商標) (島津製作所)のリニアTOF、ポジティブ及びネガティブモ−ドで計測した。
（比較用）
（１）SA (Laser Bio)の10 mg/mL (50%ACN/0.05%TFA水溶液中)溶液を作成した。
（２）疎水性ペプチドHumaninの1f〜2pmol/μL（50%ACN/0.05%TFA水溶液中）溶液を作成
した。
（３）MALDIプレ−ト上に(2)の試料溶液と(1)のマトリックス溶液とを0.5μLずつ滴下し混合した(on-target mix法)。
（４）AXIMA Performance(登録商標) (島津製作所)のリニアTOF、ポジティブ及びネガティブモ−ドで計測した。
（１）SA (Laser Bio)の10 mg/mL (50%ACN/0.05%TFA水溶液中)溶液を作成した。
（２）疎水性ペプチドHumaninの1f〜2pmol/μL（50%ACN/0.05%TFA水溶液中）溶液を作成
した。
（３）MALDIプレ−ト上に(2)の試料溶液と(1)のマトリックス溶液とを0.5μLずつ滴下し混合した(on-target mix法)。
（４）AXIMA Performance(登録商標) (島津製作所)のリニアTOF、ポジティブ及びネガティブモ−ドで計測した。
表１に、実施例２における、C8-ACHCA/SAを用いた場合とSAを単独で用いた場合(比較)との検出限界についてまとめた。上記表１に示すように、SA単独で使用した場合に比べ、C8-ACHCAを添加剤として使用することにより、ポジティブモード（pos）及びネガティブモード（neg）の両方で、感度向上が確認された。具体的には、検出限界（fmol/ウェル）が1/10となり、すなわち10倍の感度向上効果が確認された。
［実施例３］
本実施例においては、実施例１で得られたC8-ACHCAを、マトリックスであるα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（4-CHCA）の添加剤として用い、疎水性ペプチド（Humanin）の測定を行った。比較用としてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（4-CHCA）を単独マトリックスとして用いた測定も行った。
本実施例においては、実施例１で得られたC8-ACHCAを、マトリックスであるα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（4-CHCA）の添加剤として用い、疎水性ペプチド（Humanin）の測定を行った。比較用としてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（4-CHCA）を単独マトリックスとして用いた測定も行った。
（１）4-CHCAの10mg/mL (50%ACN/0.05%TFA水溶液中)溶液と、C8-ACHCAの5mg/mL(50%ACN/0.05%TFA水溶液中)溶液とを1:1(v/v)で混合してマトリックス溶液を作成した。添加剤C8-ACHCAを混合された状態のマトリックスCHCAを、C8-ACHCA/CHCAと記載する。
（２）疎水性ペプチドHumaninの1f〜2pmol/μL（50%ACN/0.05%TFA水溶液中）溶液を作成した。
（３）MALDIプレ−ト上に(2)の試料溶液と(1)のマトリックス溶液とを0.5μLずつ滴下し混合した(on-target mix法)。
（４）AXIMA Performance(登録商標) (島津製作所)のリニアTOF、ポジティブ及びネガティブモ−ドで計測した。
（２）疎水性ペプチドHumaninの1f〜2pmol/μL（50%ACN/0.05%TFA水溶液中）溶液を作成した。
（３）MALDIプレ−ト上に(2)の試料溶液と(1)のマトリックス溶液とを0.5μLずつ滴下し混合した(on-target mix法)。
（４）AXIMA Performance(登録商標) (島津製作所)のリニアTOF、ポジティブ及びネガティブモ−ドで計測した。
（比較用）
（１）4-CHCA (Laser Bio)の10 mg/mL(50%ACN/0.05%TFA水溶液中)溶液を作成した。
（２）疎水性ペプチドHumaninの1f〜2pmol/μL（50%ACN/0.05%TFA水溶液中）溶液を作成した。
（３）MALDIプレ−ト上に(2)の試料溶液と(1)のマトリックス溶液とを0.5μLずつ滴下し混合した(on-target mix法)。
（４）AXIMA Performance (登録商標) (島津製作所)のリニアTOF、ポジティブ及びネガティブモ−ドで計測した。
（１）4-CHCA (Laser Bio)の10 mg/mL(50%ACN/0.05%TFA水溶液中)溶液を作成した。
（２）疎水性ペプチドHumaninの1f〜2pmol/μL（50%ACN/0.05%TFA水溶液中）溶液を作成した。
（３）MALDIプレ−ト上に(2)の試料溶液と(1)のマトリックス溶液とを0.5μLずつ滴下し混合した(on-target mix法)。
（４）AXIMA Performance (登録商標) (島津製作所)のリニアTOF、ポジティブ及びネガティブモ−ドで計測した。
表２に、実施例３における、C8-ACHCA/4-CHCAを用いた場合と、4-CHCAを単独で用いた場合の検出限界についてまとめた。上記表２に示すように、4-CHCA単独で使用した場合に比べ、C8-ACHCAを添加剤として使用することにより、ポジティブモード（pos）及びネガティブモード（neg）の両方で、感度向上が確認された。具体的には、検出限界（fmol/ウェル）が1/2となり、すなわち2倍の感度向上効果が確認された。
Claims (5)
- 下記式（I）：
（式中、Ｒは炭素数４〜１６のアルキル基を表し、−ＯＲ基と−ＣＨ＝Ｃ（ＣＮ）ＣＯＯＨ基とは互いにメタ位又はパラ位に置換している。）で示される、質量分析用マトリックスの添加剤。 - シナピン酸、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸及びα−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸からなる群から選ばれる質量分析用マトリックスに添加される、請求項１に記載の添加剤。
- 疎水性ペプチドの質量分析に用いられる、請求項１又は２に記載の添加剤。
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載の質量分析用マトリックスの添加剤を用いた質量分析法。
- 下記式（I）：
（式中、Ｒは炭素数４〜１６のアルキル基を表し、−ＯＲ基と−ＣＨ＝Ｃ（ＣＮ）ＣＯＯＨ基とは互いにメタ位又はパラ位に置換している。）で示される化合物。
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