JP5727407B2 - 質量分析用マトリックスの添加剤 - Google Patents

質量分析用マトリックスの添加剤 Download PDF

Info

Publication number
JP5727407B2
JP5727407B2 JP2012055344A JP2012055344A JP5727407B2 JP 5727407 B2 JP5727407 B2 JP 5727407B2 JP 2012055344 A JP2012055344 A JP 2012055344A JP 2012055344 A JP2012055344 A JP 2012055344A JP 5727407 B2 JP5727407 B2 JP 5727407B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
matrix
mass spectrometry
additive
solution
acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2012055344A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2013190250A (ja
Inventor
裕子 福山
裕子 福山
俊輔 泉
俊輔 泉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shimadzu Corp
Hiroshima University NUC
Original Assignee
Shimadzu Corp
Hiroshima University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shimadzu Corp, Hiroshima University NUC filed Critical Shimadzu Corp
Priority to JP2012055344A priority Critical patent/JP5727407B2/ja
Publication of JP2013190250A publication Critical patent/JP2013190250A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5727407B2 publication Critical patent/JP5727407B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Description

本発明は、医療及び創薬分野において応用されうるMALDI−MS(マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析)アプリケーションに関する。より具体的には、本発明は、質量分析用マトリックスの添加剤となる化合物に関する。
MALDI(マトリックス支援レーザー脱離イオン化)質量分析法において、測定対象分子の効率的なイオン化を実現する条件が探索されている。
例えば、特開2005−326391号公報(特許文献1)に、疎水性ペプチドを予め2−ニトロベンゼンスルフェニル基によって修飾し、α−シアノ−3−ヒドロキシケイ皮酸(3-CHCA)、3−ヒドロキシー4−ニトロ安息香酸(3H4NBA)、又はそれらの混合物をマトリックスとして用いた質量分析を行うことで、一般的マトリックスであるα−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸(4-CHCA)や2,5−ジヒドロキシ安息香酸(DHB)に比べ、疎水性ペプチドを効率よくイオン化する方法が記載されている。
J. Agric. Food Chem., 2004, 52 (16), pp 5011-5020(非特許文献1)に、食品添加物として、3,4−ジヒドロキシ安息香酸のアルキルエステルが開示されている。
Biotechnology Letters, Vol.19, No.6, June 1997, pp.529-532(非特許文献2)に、2,5−ジヒドロキシ安息香酸とオクタノールとのエステル化収率について開示されている。
特開2005−326391号公報
ジャーナル・オブ・アグリカルチュラル・アンド・フード・ケミストリ(Journal of Agricultural and Food Chemistry)、2004年、第52巻、第16号、p.5011−5020 バイオテクノロジー・レターズ、1997年6月、第19巻、第6号、p.529−532
上記のMALDI質量分析法においては、測定対象分子の修飾が行われる場合にはある程度のイオン化促進効果が得られるが、修飾が行われない場合には、イオン化効率は十分でない。
このように、特に疎水性ペプチドのようなMALDIイオン化が難しい分子種は、従来の方法によってもイオン化効率が低いという問題がある。
本発明の目的は、測定対象分子の修飾を行うことなく、容易に且つ効率よく、質量分析におけるイオン化効率を向上させることができる物質を提供することにある。
本発明者らは、鋭意検討の結果、ある程度の炭素数のアルキル基を有する2,5−ジヒドロキシ安息香酸エステルが、マトリックスとしては機能しないもののマトリックスの添加剤として用いられることによって本発明の目的を達成することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下の発明を含む。
(1)
下記式(I):

(式中、Rは炭素数4〜14のアルキル基を表す。)で示される2,5−又は3,5−ジヒドロキシ安息香酸エステルである、質量分析用マトリックスの添加剤。
(2)
α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸、シナピン酸、2,5−ジヒドロキシ安息香酸及び1,5−ジアミノナフタレンからなる群から選ばれる質量分析用マトリックスに添加される、(1)に記載の添加剤。
(3)
疎水性ペプチドの質量分析に用いられる、(1)又は(2)に記載の添加剤。
なお、本発明においては、ペプチドにはタンパク質も含まれる。
(4)
(1)〜(3)のいずれかに記載の質量分析用マトリックスを用いた質量分析法。
下記式(I):

(式中、Rは炭素数4〜14のアルキル基を表す。)で示される質量分析用マトリックス添加剤と、α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸、シナピン酸、2,5−ジヒドロキシ安息香酸及び1,5−ジアミノナフタレンからなる群から選ばれる質量分析用マトリックスとを含む、質量分析用マトリックス組成物。
本発明により、質量分析測定対象分子(特に疎水性ペプチド)のイオン化効率を向上させることができるマトリックス添加剤を提供することができる。
本発明により、質量分析測定対象分子(特に疎水性ペプチド)の質量分析測定による検出感度向上を達成することができることができる。
本発明の質量分析用マトリックスの添加剤は、下記式(I)で示される2,5−又は3,5−ジヒドロキシ安息香酸エステルである。

式(I)中、Rは炭素数4以上、具体的には4〜14、好ましくは8〜14、より好ましくは8〜10のアルキル基を表す。アルキル基は、直鎖及び分岐を問わない。
上記式(I)で示される化合物は、2,5−又は3,5−ジヒドロキシ安息香酸又はその誘導体を用いたエステル化反応によって、当業者によって適宜合成される。例えば、例えば、R−X(Rは炭素数4〜14、好ましくは8〜14、より好ましくは8〜10のアルキル基、Xはハロゲン(F、Cl、Br、I)その他の脱離基を表す。)で示される求電子剤を用い、2,5−又は3,5−ジヒドロキシ安息香酸をエステル化することで合成することができる。この場合、求電子剤は、ジヒドロキシ安息香酸の1.0〜2.0当量用いることができる。溶媒としては、アセトン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミドなどを用いることができる。反応条件としては、加熱還流条件、2時間以上でありうる。
上記の化合物は、単独では測定対象のイオン化能力はないため、マトリックスとしては機能しない。しかしながら、マトリックスと混合して使用することによって、マトリックスによる測定対象のイオン化能力を増強し、検出限界の向上を図ることができる。
本発明の添加剤と共に使用されるマトリックスとしては特に限定されない。一般的なマトリックスから当業者によって適宜選択されてよいが、例えば、α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸、シナピン酸、2,5−ジヒドロキシ安息香酸及び1,5−ジアミノナフタレンから選ばれることができる。
本発明の添加剤を用いる質量分析対象は特に限定されない。例えば、分子量が500〜30000、好ましくは1000〜10000の分子でありうる。好ましくは、質量分析対象は疎水性物質である。
疎水性物質の疎水性の程度としては特に限定されるものではなく、様々な公知の疎水性指標や疎水性度算出法に基づいて、疎水性と判断し得る程度であればよい。
例えば、疎水性物質の疎水性の程度は、当業者がBBインデックス(Bull and Breese Index)によって疎水性と判断しうる程度であればよい。より具体的には、BBインデックスは例えば1000以下、好ましくは−1000以下でありうる。
あるいは、疎水性物質の疎水性の程度は、当業者がHPLCインデックスによって疎水性と判断しうる程度であればよい。HPLCインデックスは、C.A.Brownw, H.P.J.Bennett, S.SolomonによりAnalytical Biochemistry, 124, 201-208, 1982で報告された、0.13%ヘプタフルオロ-n-酪酸(HFBA)を含むアセトニトリル水溶液を溶離液として使用した逆相HPLC保持時間に基づく疎水性指数で、HPLC/HFBA retentionとも称される。より具体的には、HPLCインデックスは例えば50以上、好ましくは100以上でありうる。
本発明においては、特に疎水性ペプチド(本発明においては、ペプチドにはタンパク質も含まれる)のイオン化能増強効果が高い。
疎水性ペプチドであるか否かについても、上述のBBインデックスあるいはHPLCインデックスを指標とすることができるが、具体的には、ペプチドを構成するアミノ酸に、より疎水性度の高いアミノ酸残基を、より多く含むものであってよい。例えば疎水性アミノ酸としては、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、トリプトファン、グリシンなどが挙げられる。また、システイン、チロシンなどを含むこともある。
疎水性ペプチドは、このようなペプチドの1次構造のみによらず、より疎水性度の高い高次構造を持つものでもありうる。例えば、逆相HPLCカラムが使用される疎水性の固定相表面と相互作用が起こりやすい構造を持つペプチドが挙げられる。
本発明の添加剤とマトリックスとの組み合わせの比率は特に制限はないが、例えば、添加剤が質量分析用マトリックスの0.01〜50倍、好ましくは0.01〜1倍のモル比の量的関係となるように組み合わせることができる。
本発明の添加剤は、通常、マトリックスとの混合溶液に調製される。マトリックスと添加剤との混合溶液は、通常、マトリックス溶液と添加剤溶液とをそれぞれ調製しておき、両溶液を混合することによって調製することができる。溶媒としては、例えば、アセトニトリル(ACN)−トリフルオロ酢酸(TFA)水溶液、アセトニトリル水溶液、トリフルオロ酢酸水溶液などを用いることができる。アセトニトリル−トリフルオロ酢酸水溶液におけるアセトニトリルの濃度は例えば10〜90体積%であり、トリフルオロ酢酸の濃度は例えば0.05〜1体積%でありうる。
添加剤は、例えば、0.5〜50mg/ml、好ましくは5〜10mg/ml、例えば5mg/mlの溶液に調製することができる。マトリックスは、例えば、1mg/ml〜飽和濃度、好ましくは1〜10mg/ml、例えば10mg/mlの溶液に調製することができる。これら添加剤溶液及びマトリックス溶液は、例えば、10:1〜1:10、例えば1:1の体積比で混合することができる。
本発明の添加剤を用いて使用される質量分析装置としては、MALDIイオン源と組み合わされたものであれば特に限定されない。例えば、MALDI-TOF(マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間)型質量分析装置、MALDI-IT(マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ)型質量分析装置、MALDI-IT-TOF(マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ−飛行時間)型質量分析装置、MALDI-FTICR(マトリックス支援レーザー脱離イオン化−フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴)型質量分析装置等が挙げられる。
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
[実施例1:添加剤化合物の合成]
1‐オクタノール(10 mmol)を無水ピリジン(10mL)に溶解し、これに2,5-ヒドロキシ安息香酸クロリド(10 mmol)の無水エーテル溶液を滴下し、8時間室温で撹拌した。冷却後、1M塩酸水及び水で順次洗い、エーテル(100 mL)で2回抽出した。エーテル層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶媒を除去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒:ヘキサン:酢酸エチル=8:2(v/v))により精製し、黄白色の結晶を得た。収量:0.80g(3.0×10-3mol)、収率30%。
[実施例2]
本実施例においては、実施例1で得られた化合物(以下、C8-ADHB-ES)を、マトリックスであるα−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)の添加剤として用い、疎水性ペプチド(Humanin;BBインデックスは-5800)の測定を行った。比較用として、α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)を単独マトリックスとして用いた測定及びマトリックスを用いずC8-ADHB-ESのみを用いた測定も行った。
(1)CHCAの10mg/mL(50%ACN/0.05%TFA水溶液中(%は体積を基準とする。以下において同様))溶液と、C8-ADHB-ESの5mg/mL(50%ACN/0.05%TFA水溶液中)溶液とを10:1、1:1及び1:10(v/v)で混合した。得られたマトリックス溶液を、それぞれ、C8-ADHB-ES/CHCA(1/10)、C8-ADHB-ES/CHCA(1/1)及びC8-ADHB-ES/CHCA(10/1)と記載する。
(2)疎水性ペプチドHumaninの2a〜2pmol/μL(50%ACN/0.05%TFA水溶液中)溶液を作成した。
(3)MALDIプレ−ト上に(2)の試料溶液と(1)のマトリックス溶液とを0.5μLずつ滴下し混合した(on-target mix法)。
(4)AXIMA Performance (島津製作所)のリニアTOF、ポジティブ及びネガティブモ−ドで計測した。
(比較用)
(1)CHCA(Laser Bio)の10 mg/mL(50%ACN/0.05%TFA水溶液中)溶液を作成した。
(2)疎水性ペプチドHumaninの2a〜2pmol/μL(50%ACN/0.05%TFA水溶液中)溶液を作成した。
(3)MALDIプレ−ト上に(2)の試料溶液と(1)の溶液とを0.5μLずつ滴下し混合した (on-target mix法)。
(4)AXIMA Performance (島津製作所)のリニアTOF、ポジティブ及びネガティブモ−ドで計測した。
表1に示すように、添加剤混合マトリックスC8-ADHB-ES/CHCA(10/1)、C8-ADHB-ES/CHCA(1/1)及びC8-ADHB-ES/CHCA(1/10)を使用した全ての場合において、CHCA単独で使用した場合に比べ、ポジティブモード(pos)及びネガティブモード(neg)の両方で感度向上が確認された。より具体的には、C8-ADHB-ES/CHCA(1/1)を使用した場合が最も感度向上効果が高く、ポジティブとネガティブとの両方において、検出限界(fmol/ウェル)が1/100となり、すなわち100倍の感度向上効果が確認された。一方、C8-ADHB-ESを単独で使用した場合は、CHCA単独で使用した場合に比べ、ポジティブモード及びネガティブモードの両方で感度が低下した。
[実施例3]
本実施例においては、C8-ADHB-ESを、マトリックスである2,5−ジヒドロキシ安息香酸(DHB)、シナピン酸(SA)及び1,5−ジアミノナフタレン(DAN)それぞれの添加剤として用い、疎水性ペプチド(Humanin)の測定を行った。比較用として、2,5−ジヒドロキシ安息香酸(DHB)、シナピン酸(SA)及び1,5−ジアミノナフタレン(DAN)をそれぞれ単独マトリックスとして用いた測定も行った。
(1)マトリックス(DHB、SA及びDAN)の10mg/mL (50%ACN/0.05%TFA水溶液中)溶液とC8-ADHB-ESの5mg/mL(50%ACN/0.05%TFA水溶液中)溶液とを1:1(v/v)で混合してマトリックス溶液を作成した。得られたマトリックス溶液を、それぞれ、C8-ADHB-ES/DHB(1/1)、C8-ADHB-ES/SA(1/1)及びC8-ADHB-ES/DAN(1/1)と記載する。
(2)疎水性ペプチドHumaninの2a〜2pmol/μL(50%ACN/0.05%TFA水溶液中)溶液を作成
した。
(3)MALDIプレ−ト上に(2)の試料溶液と(1)のマトリックス溶液とを0.5μLずつ滴下し混合した(on-target mix法)。
(4)AXIMA Performance (島津製作所)のリニアTOF、ポジティブ及びネガティブモ−ドで計測した。
(比較用)
(1)(DHB、SA及びDAN)の10 mg/mL (50%ACN/0.05%TFA水溶液中)溶液を作成した。
(2)疎水性ペプチドHumaninの2a〜2pmol/μL(50%ACN/0.05%TFA水溶液中)溶液を作成した。
(3)MALDIプレ−ト上に(2)の試料溶液と(1)のマトリックス溶液とを0.5μLずつ滴下し混合した(on-target mix法)。
(4)AXIMA Performance (島津製作所)のリニアTOF、ポジティブ及びネガティブモ−ドで計測した。
表2中、アスタリスクでマークされた態様(C8-ADHB-ES/1,5-DAN)においては、マトリックス1,5-DANにC8-ADHB-ESを添加しなかった場合(1,5-DAN)に比べて、検出限界は同じであったが、S/Nにおいて5-8倍程度もの感度向上が達成できたことを確認した。
表2に示すように、添加剤混合マトリックスを使用した全ての場合において、マトリックス単独使用の場合に比べ、ポジティブとネガティブとの両方において感度向上が確認された。より具体的には、C8-ADHB-ES/SA(1/1)を使用した場合にはポジティブモードで10倍、ネガティブモードで100倍の感度向上が確認され、C8-ADHB-ES/DHB(1/1)を使用した場合にはネガティブモードで10倍の感度向上が確認され、C8-ADHB-ES/DAN(1/1)を使用した場合にネガティブモードでS/Nの向上が確認された。
実施例2の結果及び実施例3の結果より、本発明の添加剤C8-ADHB-ESを組み合わせるマトリックスは、CHCA、SA、DHB及びDANの順で感度向上が確認された。

Claims (4)

  1. 下記式(I):

    (式中、Rは炭素数4〜14のアルキル基を表す。)で示される2,5−又は3,5−ジヒドロキシ安息香酸エステルである、質量分析用マトリックスの添加剤。
  2. α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸、シナピン酸、2,5−ジヒドロキシ安息香酸及び1,5−ジアミノナフタレンからなる群から選ばれる質量分析用マトリックスに添加される、請求項1に記載の添加剤。
  3. 疎水性ペプチドの質量分析に用いられる、請求項1又は2に記載の添加剤。
  4. 請求項1〜3のいずれか1項に記載の質量分析用マトリックスの添加剤を用いた質量分析法。
JP2012055344A 2012-03-13 2012-03-13 質量分析用マトリックスの添加剤 Active JP5727407B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012055344A JP5727407B2 (ja) 2012-03-13 2012-03-13 質量分析用マトリックスの添加剤

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012055344A JP5727407B2 (ja) 2012-03-13 2012-03-13 質量分析用マトリックスの添加剤

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2013190250A JP2013190250A (ja) 2013-09-26
JP5727407B2 true JP5727407B2 (ja) 2015-06-03

Family

ID=49390683

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2012055344A Active JP5727407B2 (ja) 2012-03-13 2012-03-13 質量分析用マトリックスの添加剤

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP5727407B2 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9453846B2 (en) 2013-03-08 2016-09-27 Shimadzu Corporation Mass spectrometry method using matrix
US9885725B2 (en) 2014-03-27 2018-02-06 Shimadzu Corporation MALDI analysis of hydrophobic compounds using 2(3),5-dihydoxybenzoate with a long alkyl chain as an additive to MALDI matrix
US10481163B1 (en) 2018-05-31 2019-11-19 Shimadzu Corporation Mass spectrometry method using mixed matrix

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0612994A3 (de) * 1993-02-26 1996-03-06 Ciba Geigy Ag Matrix für die matrix-unterstützte Laserdesorptions-Massenspektroskopie.
JP3908654B2 (ja) * 2002-12-13 2007-04-25 独立行政法人科学技術振興機構 表面微小領域質量分析装置
US8119416B2 (en) * 2004-01-13 2012-02-21 Wuxi WeiYi Zhinengkeji, Inc. MALDI analysis using modified matrices with affinity groups for non-covalent binding with analytes
US7550301B2 (en) * 2003-01-13 2009-06-23 Tianxin Wang MALDI analysis based on derivatized matrices forming covalent bonds with analyte molecules
JP5365547B2 (ja) * 2010-02-25 2013-12-11 株式会社島津製作所 Maldi−ms用試料調製方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2013190250A (ja) 2013-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Köcher et al. Fragmentation of peptides in MALDI in-source decay mediated by hydrogen radicals
Clarke et al. Desalting large protein complexes during native electrospray mass spectrometry by addition of amino acids to the working solution
Matthiesen et al. Introduction to mass spectrometry-based proteomics
JP5727407B2 (ja) 質量分析用マトリックスの添加剤
JP5980517B2 (ja) 質量分析用マトリックスの添加剤
Stutzman et al. Covalent and non‐covalent binding in the ion/ion charge inversion of peptide cations with benzene‐disulfonic acid anions
US10481163B1 (en) Mass spectrometry method using mixed matrix
US20050224710A1 (en) Method for measuring hydrophobic peptides using maldi mass spectrometer
Chen et al. A pseudo MS3 approach for identification of disulfide-bonded proteins: uncommon product ions and database search
US20140084152A1 (en) Matrix additive for mass spectrometry
WO2011007743A1 (ja) ペプチド主鎖N-Cα結合の特異的切断方法
US9885725B2 (en) MALDI analysis of hydrophobic compounds using 2(3),5-dihydoxybenzoate with a long alkyl chain as an additive to MALDI matrix
Sonsmann et al. Investigation of the influence of charge derivatization on the fragmentation of multiply protonated peptides
JP5885567B2 (ja) 質量分析用マトリックスの添加剤
JP6085083B2 (ja) 質量分析用マトリックスの添加剤
JP5706597B2 (ja) マトリックスを用いる質量分析法
JP6134164B2 (ja) マトリックス添加剤を用いる質量分析法
He et al. 157 nm photodissociation of a complete set of dipeptide ions containing C-terminal arginine
JP6135814B2 (ja) 親水性チオールプローブ
JP6155995B2 (ja) リン酸化ペプチド及び糖鎖の質量分析法
JP6478048B2 (ja) 混合マトリックスを用いる質量分析法
Song et al. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry peptide sequencing utilizing selective N-terminal bromoacetylation
Ramesh et al. Mass spectral study of hybrid peptides derived from (R)-aminoxy ester and β-amino acids: The influence of aminoxy peptide bond (CO–NH–O) on peptide fragmentation under electrospray ionization conditions
JP6530657B2 (ja) 質量分析方法
Prabhakar et al. Acetone chemical ionization studies. Acetone chemical ionization studies—IX: amino acids and nucleobases

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20141203

A871 Explanation of circumstances concerning accelerated examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871

Effective date: 20141205

A975 Report on accelerated examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005

Effective date: 20141219

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20150113

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20150324

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20150402

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5727407

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250