JP5706597B2

JP5706597B2 - マトリックスを用いる質量分析法

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Publication number: JP5706597B2
Application number: JP2014558343A
Authority: JP
Inventors: 裕子福山; 俊輔泉
Original assignee: Shimadzu Corp; Hiroshima University NUC
Current assignee: Shimadzu Corp; Hiroshima University NUC
Priority date: 2013-03-08
Filing date: 2014-03-04
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2034-03-04
Also published as: EP2950092A4; EP2950092A1; WO2014136779A1; JPWO2014136779A1; US9453846B2; US20160011205A1; EP2950092B1

Description

本発明は、医療及び創薬分野において応用されうる質量分析法、特に、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析）アプリケーションに関する。より詳しくは、本発明は、特定化合物をマトリックスとして用いる質量分析法、及び質量分析用マトリックスに関する。

ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）質量分析法において、測定対象分子の効率的なイオン化を実現する条件が探索されている。例えば、特開２００５−３２６３９１号公報（特許文献１）に、疎水性ペプチドを予め２−ニトロベンゼンスルフェニル基によって修飾し、α−シアノ−３−ヒドロキシケイ皮酸（３−ＣＨＣＡ）、３−ヒドロキシー４−ニトロ安息香酸（３Ｈ４ＮＢＡ）、又はそれらの混合物をマトリックスとして用いた質量分析を行うことで、一般的マトリックスであるα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（４−ＣＨＣＡ）や２，５−ジヒドロ安息香酸（ＤＨＢ）に比べ、疎水性ペプチドを効率よくイオン化する方法が記載されている。

特開２００５−３２６３９１号公報

上記のＭＡＬＤＩ質量分析法においては、測定対象分子の修飾が行われる場合にはある程度のイオン化促進効果が得られるが、修飾が行われない場合には、イオン化効率は十分でない。このように、特に疎水性ペプチドのようなＭＡＬＤＩイオン化が難しい分子種は、ＭＡＬＤＩ質量分析法においてイオン化効率が低いという問題がある。

本発明の目的は、測定対象分子の修飾（具体的には、標識又はラベル化等）を行うことなく、容易に且つ効率よく、質量分析におけるイオン化効率を向上させることができるマトリックスを用いる質量分析法、及び質量分析用マトリックスを提供することにある。とくに、本発明の目的は、測定対象分子の修飾（具体的には、標識又はラベル化等）を行うことなく、容易に且つ効率よく、ＭＡＬＤＩ質量分析におけるイオン化効率を向上させることができるマトリックスを用いる質量分析法、及びＭＡＬＤＩ質量分析用マトリックスを提供することにある。

本発明者らは鋭意検討の結果、特定の２，４，６−トリヒドロキシアルキルフェノンが、質量分析法におけるマトリックスとして機能し、疎水性化合物のようなイオン化が難しい分子種をも効率よくイオン化できることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明は、以下の発明を含む。
（１）下記一般式（Ｉ）：
（式中、Ｒは、炭素数４〜１２のアルキル基を表す。）
で示される２，４，６−トリヒドロキシアルキルフェノンをマトリックスとして用いる質量分析法。

（２）分析対象が、疎水性化合物である、上記（１）に記載の質量分析法。

（３）分析対象が、疎水性ペプチドである、上記（１）又は（２）に記載の質量分析法。本明細書において、ペプチドにはタンパク質も含まれる。

（４）前記一般式（Ｉ）おいてＲが炭素数８のアルキル基を表す、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の質量分析法。

・下記一般式（Ｉ）：
（式中、Ｒは、炭素数４〜１２のアルキル基を表す。）
で示される２，４，６−トリヒドロキシアルキルフェノンである、質量分析用マトリックス。

・疎水性化合物の質量分析に用いられる、上記の質量分析用マトリックス。

・疎水性ペプチドの質量分析に用いられる、上記の質量分析用マトリックス。

・前記一般式（Ｉ）おいてＲが炭素数８のアルキル基を表す、上記の質量分析用マトリックス。

本発明において、炭素数４〜１２のアルキル基（一般式（Ｉ）おけるＲ）を有する２，４，６−トリヒドロキシアルキルフェノンを質量分析のマトリックスとして用いる。炭素数４〜１２のアルキル基を有する２，４，６−トリヒドロキシアルキルフェノンを質量分析のマトリックスとして用いると、疎水性化合物、特に疎水性ペプチドのようなイオン化が難しい分子種のイオン化効率を向上させることができる。そのため、本発明によれば、測定対象分子のイオン化効率を向上させることができるマトリックスを用いる質量分析法、及び質量分析用マトリックスが提供される。本発明は、特にＭＡＬＤＩ質量分析法に向けられ、分析対象が疎水性化合物である場合に適しており、疎水性ペプチドである場合に特に適している。

本発明により、測定対象分子（特に疎水性ペプチド）の質量分析測定による検出感度向上を達成することができる。

実施例２におけるＣ８−ＡＴＨＡＰをマトリックスとして用いた場合の疎水性ペプチドHumanin及び親水性ペプチドβ-amyloid 1-11の混合物のマススペクトル結果を示す。横軸は質量／電荷（ｍ／ｚ）、縦軸はイオンの相対強度（％Ｉｎｔ．）を表す。実施例２における４−ＣＨＣＡをマトリックスとして用いた場合の疎水性ペプチドHumanin及び親水性ペプチドβ-amyloid 1-11の混合物のマススペクトル結果を示す。実施例３におけるＭＡＬＤＩプレ−ト上のウェル内の結晶の写真、疎水性ペプチドHumaninの質量イメージング画像、及び親水性ペプチドβ-amyloid 1-11の質量イメージング画像を示す。実施例５におけるＣ８−ＡＴＨＡＰをマトリックスとして用いた場合のマススペクトル結果（ａ）、及び、４−ＣＨＣＡをマトリックスとして用いた場合のマススペクトル結果（ｂ）を示す。

［マトリックス］
本発明は、下記一般式（Ｉ）で示される２，４，６−トリヒドロキシアルキルフェノンをマトリックスとして用いる質量分析法である。式中、Ｒは、炭素数４〜１２のアルキル基を表す。本明細書において、一般式（Ｉ）で示される化合物（Ｒ＝炭素数Ｃ４〜１２のアルキル基）をＡＴＨＡＰ（Alkylated trihdroxyalkylyphenone）と表記することがある。例えば、Ｒ＝炭素数Ｃ４〜１２のアルキル基がオクチル基（Ｃ８）の場合、Ｃ８−ＡＴＨＡＰと表記する。また、一般式（Ｉ）の範囲外の化合物２’，４’，６’−トリヒドロキシアセトフェノン（Ｒ＝ＣＨ₃基）をＴＨＡＰと表記する。

一般式（Ｉ）においてＲが表す炭素数Ｃ４〜１２のアルキル基としては、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基が挙げられる。これらのアルキル基は直鎖状であってもよいし、又は分岐状であってもよい。分岐状のものとしては、例えば、２−エチルヘキシル基などが挙げられる。これらのうち、炭素数Ｃ６〜１２のアルキル基が好ましく、炭素数Ｃ６〜１０のアルキル基がより好ましく、炭素数Ｃ８のアルキル基が特に好ましい。分析対象が疎水性化合物である場合には、疎水性化合物のイオン化のために、Ｒが表すアルキル基がある程度の疎水性を有することが必要であると考えられる。

本発明において、一般式（Ｉ）で示されるマトリックスＡＴＨＡＰ（Ｒ＝Ｃ４〜１２）を含むマトリックス溶液濃度は、例えば、3ｍｇ／ｍＬ〜飽和濃度とするとよいが、この範囲内のより小さな濃度でも分析対象のイオン化効率を向上させることができる。例えば、１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ程度とするとよく、1〜８ｍｇ／ｍＬ程度としてもよく、1〜５ｍｇ／ｍＬ程度としてもよい。

［質量分析対象］
本発明のマトリックスを用いる質量分析対象は特に限定されない。例えば、分子量が５００〜３０，０００、好ましくは１，０００〜１０，０００の分子でありうる。好ましくは、本発明のマトリックスは、疎水性物質のイオン化を促進できるので、疎水性物質の質量分析に用いられる。この場合、試料中には、分析対象としての疎水性物質以外に、他の物質（例えば親水性物質）が混在していてもよい。本発明のマトリックスは、実施例で示すように、従来のマトリックスであるα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（４−ＣＨＣＡ）を用いた場合と比べ、親水性物質のイオン化を促進せず、疎水性物質のイオン化を選択的に促進することができる。このため、試料中に疎水性物質と親水性物質とが混在していても、疎水性物質を容易に分析することができる。この点から、本発明のマトリックスは、疎水性物質の質量分析に好適に適用できる。

疎水性の程度としては特に限定されるものではなく、様々な公知の疎水性指標や疎水性度算出法に基づいて、疎水性と判断し得る程度であればよい。例えば、疎水性物質の疎水性の程度は、当業者がＢＢインデックス（Bull and Breese Index）によって疎水性と判断しうる程度であればよい。より具体的には、ＢＢインデックスは、例えば１０００以下、好ましくは−１０００以下でありうる。

あるいは、疎水性物質の疎水性の程度は、当業者がＨＰＬＣインデックスによって疎水性と判断しうる程度であればよい。ＨＰＬＣインデックスは、C.A.Brownw, H.P.J.Bennett, S.SolomonによりAnalytical Biochemistry, 124, 201-208, 1982で報告された、0.13%ヘプタフルオロ-n-酪酸（HFBA）を含むアセトニトリル水溶液を溶離液として使用した逆相ＨＰＬＣ保持時間に基づく疎水性指数で、HPLC/HFBA retentionとも称される。より具体的には、ＨＰＬＣインデックスは、例えば４０以上、例えば４０〜１０，０００、好ましくは１００〜１，０００でありうる。

さらに、本発明における疎水性物質の疎水性の程度は、当業者がＳＳＲＣａｌｃＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙによって疎水性と判断しうる程度であればよい。ＳＳＲＣａｌｃＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙは、Oleg V. Krokhin によりAnalytical Biochemistry, 78, 7785-7795, 2006に報告されている。ＳＳＲＣａｌｃＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙは、ペプチドのＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）の保持時間に対するペプチド配列特異的なアルゴリズムsequence-specific retention calculator (SSRCalc)に基づく疎水性指標である。ＨＰＬＣインデックスあるいはＢＢインデックスがアミノ酸組成情報のみを基に保持時間を推算するのに対し、ＳＳＲＣａｌｃＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙはペプチドの一次構造・二次構造までを含めて保持時間を推算する。本発明において、分析対象が、疎水性ペプチドである場合には、疎水性の程度は、ＳＳＲＣａｌｃＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙを指標とすることが適している。より具体的には、ＳＳＲＣａｌｃＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙは、例えば３０以上、好ましくは４０〜７０でありうる。

本発明においては、特に疎水性ペプチド（本発明においては、ペプチドにはタンパク質も含まれる）のイオン化能増強効果が高い。疎水性ペプチドであるか否かについては、ＢＢインデックス、ＨＰＬＣインデックス、又はＳＳＲＣａｌｃＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ、好ましくはＳＳＲＣａｌｃＨｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙを指標とすることができるが、具体的には、ペプチドを構成するアミノ酸に、疎水性度のより高いアミノ酸をより多く含むものであってよい。例えば疎水性アミノ酸としては、イソロイシン、ロイシン、バリン、アラニン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、トリプトファン、グリシンなどが挙げられる。また、システイン、チロシンなどを含むこともある。疎水性ペプチドは、このようなペプチドの一次構造のみによらず、より疎水性度の高い高次構造を持つものでもありうる。例えば、逆相ＨＰＬＣカラムが使用される疎水性の固定相表面と相互作用が起こりやすい構造を持つペプチドが挙げられる。

［質量分析用結晶の作成］
質量分析用結晶は、分析対象とマトリックスとを溶媒中に少なくとも含む混合液の液滴を質量分析用ターゲットプレート上に形成する工程と、形成された前記混合液の液滴から前記溶媒を除去し、前記混合液中の不揮発分（すなわち少なくとも分析対象、及びマトリックス）を残渣として得る工程とによって得ることができる。得られた残渣が、すなわち質量分析用結晶である。本明細書においては、質量分析用結晶と残渣とは同義である。

質量分析用ターゲットとしては、通常ＭＡＬＤＩ質量分析用として用いられる導電性を有する金属製プレートを使用することができる。具体的には、ステンレス製又は金製のプレートを用いることができる。

前記混合液の液滴をターゲットプレート上に用意する具体的方法としては特に限定されない。例えば、まず、分析対象を含む試料溶液とマトリックス溶液とをそれぞれ別々に調製する。次に、それら溶液を混合させて混合液を得て、得られた混合液をターゲットプレート上に滴下する。又は、それら溶液をそれぞれターゲットプレート上の同じ位置に滴下することにより、ターゲットプレート上で混合させる（on-target mix法）。on-target mix法の場合、溶液の滴下順序は任意である。

前記混合液の溶媒としては、アセトニトリル（ＡＣＮ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、メタノール（ＭｅＯＨ）、エタノール（ＥｔＯＨ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスホキシド（ＤＭＳＯ）及び水などからなる群から選ばれうる。より具体的には、混合液の溶媒としては、例えば、ＡＣＮ−ＴＦＡ水溶液、ＡＣＮ水溶液、ＭｅＯＨ−ＴＦＡ、ＭｅＯＨ水溶液、ＥｔＯＨ−ＴＦＡ水溶液、ＥｔＯＨ水溶液、ＴＨＦ−ＴＦＡ水溶液、ＴＨＦ水溶液、ＤＭＳＯ−ＴＦＡ水溶液、ＤＭＳＯ水溶液などが用いられ、より好ましくは、ＡＣＮ−ＴＦＡ水溶液やＡＣＮ水溶液を用いることができる。ＡＣＮ−ＴＦＡ水溶液におけるＡＣＮの濃度は例えば１０〜９０体積％、好ましくは２５〜７５体積％であり、ＴＦＡの濃度は例えば０．０５〜１体積％、好ましくは０．０５〜０．１体積％でありうる。

前記混合液の液滴の体積としては特に限定されず、当業者が適宜決定することができる。ターゲットプレート上にウェルが設けられている場合、混合液の液滴は、ウェル内に形成することができる。この場合、液滴は、当該ウェル内に収まる程度の体積をもって形成される。具体的には、０．１μＬ〜２μＬ程度、例えば０．５μＬ程度の液滴を形成することができる。

次に、ターゲットプレート上の混合液の液滴から溶媒を除去する。溶媒の除去には溶媒の自然蒸発が含まれる。蒸発によって生じる残渣（すなわち質量分析用結晶）１個当たりに含まれるマトリックスの量は、例えば１〜１，０００ｎｍｏｌ、好ましくは１０〜１００ｎｍｏｌを目安にすることができる。分析対象の量は、例えば、マトリックス１０ｎｍｏｌに対し、５０ａｍｏｌ〜１００ｐｍｏｌ、又は１００ａｍｏｌ〜５０ｐｍｏｌの範囲で許容される。

残渣は、ターゲットプレートとの接触面において、略円の形状をなす。すなわち、残渣の外縁は略円の形状である。前記の略円の平均直径は、試料量、滴下量、マトリックス量及び溶媒組成等によって異なりうるが、例えば１〜３ｍｍ、好ましくは１〜２ｍｍである。なお、平均直径とは、１個の残渣において、前記の略円の重心を通る直線が残渣の外縁で切り取られた線分の長さの平均である。

溶媒の除去によって得られる略円形の残渣において、分析対象物質は略円に均一的に存在する。そのため、イオン化の際のレーザー照射位置を特定することなく、分析対象物質のイオン化を容易に行うことができる。残渣の全領域をレーザー照射の標的とすることができることは、略円形の残渣において疎水性物質が円形の外縁部領域に局在化（すなわち、リング状に局在化）してしまう場合に比べて、質量分析測定上の利点である。

［質量分析装置］
本発明において使用される質量分析装置としては、ＭＡＬＤＩ(マトリックス支援レーザー脱離イオン化)イオン源が組み合わされたものであれば特に限定されない。例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ(マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間) 型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−ＩＴ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−ＩＴ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−イオントラップ−飛行時間）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ−ＦＴＩＣＲ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）型質量分析装置などが挙げられる。

以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

［実施例１：検出限界の評価］
本実施例においては、一般式（Ｉ）で示される各化合物Ｃ６−ＡＴＨＡＰ（Ｒ：ｎ−ヘキシル基）、Ｃ８−ＡＴＨＡＰ（Ｒ：ｎ−オクチル基）、Ｃ１０−ＡＴＨＡＰ（Ｒ：ｎ−デシル基）、及びＣ１２−ＡＴＨＡＰ（Ｒ：ｎ−ドデシル基）をマトリックスとして用いた。

（１）各マトリックスＣ６−ＡＴＨＡＰ、Ｃ８−ＡＴＨＡＰ、Ｃ１０−ＡＴＨＡＰ、及びＣ１２−ＡＴＨＡＰの5 mg/mL溶液 (75%ACN/0.1%TFA water) (%は体積を基準とする。以下において同様)を作成した。
（２）試料溶液として、疎水性ペプチド Humaninの0.2 fmol〜2 pmol/μL溶液 (50%ACN/0.1%TFA water)を作成した。
（３）ＭＡＬＤＩターゲットプレ−ト（ＭＡＬＤＩプレ−ト：sample plate 2.8 mm ring x 384 well(Shimadzu/Kratos, UK)上に（２）の試料溶液と（１）のマトリックス溶液を0.5μL ずつ滴下し混合した(on-target mix法)。
（４）AXIMA Performance（登録商標）（島津製作所）のリニアＴＯＦ、ポジティブイオンモ−ドで計測した。そして、検出限界を評価した。

（比較用）
（１）マトリックス溶液として、４−ＣＨＣＡ (Laser Bio) の10 mg/mL (50%ACN/0.1%TFA water)溶液、及び2,4,6-trihydroxyacetophenone（ＴＨＡＰ）の10 mg/mL溶液(50%ACN/0.1%TFA water)を作成した。
（２）試料溶液として、疎水性ペプチド Humanin の0.2 fmol〜2 pmol/μL(50%ACN/0.1%TFA water)を作成した。
（３）ＭＡＬＤＩターゲットプレ−ト上に（２）の試料溶液と（１）のマトリックス溶液を0.5μL ずつ滴下し混合した(on-target mix法)。
（４）AXIMA Performance（登録商標）（島津製作所）のリニアＴＯＦ、ポジティブイオンモ−ドで計測した。そして、検出限界を評価した。

表１に示すように、Ｃ６−ＡＴＨＡＰ、Ｃ１０−ＡＴＨＡＰ、又はＣ１２−ＡＴＨＡＰをマトリックスとして用いると、４−ＣＨＣＡ、又はＴＨＡＰを用いた場合と同等の検出限界を示した。特に、Ｃ８−ＡＴＨＡＰを用いると、４−ＣＨＣＡ、又はＴＨＡＰに対し検出限界が1/10、すなわち、感度が10倍向上したことを確認した。

［実施例２：疎水性ペプチド／親水性ペプチド混合試料の測定］
（１）マトリックス溶液として、Ｃ８−ＡＴＨＡＰの5 mg/mL溶液 (75%ACN/0.1%TFA water) を作成した。また、比較用マトリックス溶液として、４−ＣＨＣＡの10 mg/mL溶液 (50%ACN/0.1%TFA water)を作成した。
（２）疎水性ペプチドHumaninの400 fmol/μL 溶液 (50%ACN/0.1%TFA water)、及び親水性ペプチドβ-amyloid 1-11の400 fmol/μL 溶液 (50%ACN/0.1%TFA water)を１：１ (v/v)で混合し、試料混合液(すなわち、Humaninの200 fmol/μL 溶液、β-amyloid 1-11の200 fmol/μL 溶液)を作成した。
（３）ＭＡＬＤＩターゲットプレ−ト上に（２）の試料混合溶液と（１）のマトリックス溶液又は比較用マトリックス溶液を0.5μL ずつ滴下し混合した(on-target mix法)。すなわち、１ウェル当たりの試料の量は、Humanin：100 fmol/well、β-amyloid 1-11：100 fmol/wellであった。
（４）AXIMA Performance（登録商標）（島津製作所）のリニアＴＯＦ、ポジティブイオンモ−ドで計測した。

疎水性ペプチドHumanin (BB Index：-5800, HPLC Index：117.4, SSRCalc Hydrophobicity: 50.0)
親水性ペプチドβ-amyloid 1-11(BB Index：+2510, HPLC Index：1.4, SSRCalc Hydrophobicity: 13.5)

図１に、Ｃ８−ＡＴＨＡＰをマトリックスとして用いた場合のマススペクトル結果を示す。図２に、４−ＣＨＣＡをマトリックスとして用いた場合のマススペクトル結果を示す。これらから、４−ＣＨＣＡをマトリックスとして用いた場合は、疎水性ペプチドHumanin及び親水性ペプチドβ-amyloid 1-11をともに検出し、むしろ、親水性ペプチドβ-amyloid 1-11を優先的に検出した。これに対して、Ｃ８−ＡＴＨＡＰをマトリックスとして用いた場合は、親水性ペプチドβ-amyloid 1-11は検出されず、疎水性ペプチドHumaninのみを高感度で検出した。なお、図１中の“ＮＤ”はイオン不検出を表す。

このように、Ｃ８−ＡＴＨＡＰをマトリックスとして用いると、親水性ペプチドβ-amyloid 1-11のＭＡＬＤＩイオン化を促進せずあるいは抑制し、疎水性ペプチドHumaninのＭＡＬＤＩイオン化を促進し、疎水性ペプチドHumaninのみを高感度で検出できることが示された。

なお、Ｃ６−ＡＴＨＡＰ、Ｃ１０−ＡＴＨＡＰ、又はＣ１２−ＡＴＨＡＰをマトリックスとして用いた場合においても、Ｃ８−ＡＴＨＡＰをマトリックスとして用いた場合と同様に、親水性ペプチドβ-amyloid 1-11のＭＡＬＤＩイオン化を促進せずあるいは抑制し、疎水性ペプチドHumaninのＭＡＬＤＩイオン化を促進し、疎水性ペプチドHumaninのみを高感度で検出できることが確認された。

［実施例３：ターゲットプレ−ト上でのＭＳイメージング］
（１）マトリックス溶液として、Ｃ８−ＡＴＨＡＰの5 mg/mL溶液 (75%ACN/0.1%TFA water) を作成した。
（２）疎水性ペプチドHumaninの400 fmol/μL 溶液 (50%ACN/0.1%TFA water)、及び親水性ペプチドβ-amyloid 1-11の400 fmol/μL 溶液 (50%ACN/0.1%TFA water)を１：１ (v/v)で混合し、試料混合液(すなわち、Humaninの200 fmol/μL 溶液、β-amyloid 1-11の200 fmol/μL 溶液)を作成した。
（３）ＭＡＬＤＩターゲットプレ−ト（ＭＡＬＤＩプレ−ト：sample plate 2.8 mm ring x 384 well(Shimadzu/Kratos, UK)上に（２）の試料混合溶液と（１）のマトリックス溶液を0.5μL ずつ滴下し混合した(on-target mix法)。すなわち、１ウェル当たりの試料の量は、Humanin：100 fmol/well、β-amyloid 1-11：100 fmol/wellであった。
（４）AXIMA Performance（登録商標）（島津製作所）のリニアＴＯＦ、ポジティブイオンモ−ドでＭＳイメージング（MS imaging）を行った(ラスター: 4000μｍ×4000μｍ with 50μｍ (81×81 lattice), 6561 points)。すなわち、ＭＳイメージングは、ラスター走査（残渣の一定領域を一定間隔毎に自動でレーザー照射する方法）により、ウェル上の残渣全領域を含む4000μｍ×4000μｍの範囲を、50μｍ間隔で、81点×81点の計6561点を、２ショットずつ、レーザ−照射することで行った。

図３に、ＭＡＬＤＩプレ−ト上のウェル内の結晶の写真、ポジティブモードにおける疎水性ペプチドHumaninのＭＳイメージング（MS imaging）画像、及びポジティブモードにおける親水性ペプチドβ-amyloid 1-11のＭＳイメージング（MS imaging）画像を示す。

図３から、Ｃ８−ＡＴＨＡＰをマトリックスとして用いた場合には、親水性ペプチドβ-amyloid 1-11を検出せず、疎水性ペプチドhumaninをウェル内において比較的均一に検出した。

［実施例４：検出限界の評価］
本実施例においては、Ｃ８−ＡＴＨＡＰ（一般式（Ｉ）においてＲ：ｎ−オクチル基）をマトリックスとして用いて、疎水度の異なる種々のペプチドについて、検出限界を評価した。

（１）マトリックス溶液として、Ｃ８−ＡＴＨＡＰの5 mg/mL溶液 (75%ACN/0.1%TFA water) を作成した。また、比較用マトリックス溶液として、４−ＣＨＣＡ (Laser Bio) の10 mg/mL (50%ACN/0.1%TFA water)溶液を作成した。
（２）試料溶液として、各ペプチド NF-kB inhibitor、OVA-BIP hybrid peptide、Humanin、β-amyloid 22-42、catestatin、ACTH 18-39、nocistatin、neuropeptide S、β-amyloid 1-16、β-amyloid 1-11、β-amyloid 165-178の0.2 fmol〜2 pmol/μL溶液 (50%ACN/0.1%TFA water)をそれぞれ作成した。
（３）ＭＡＬＤＩターゲットプレ−ト（ＭＡＬＤＩプレ−ト：sample plate 2.8 mm ring x 384 well(Shimadzu/Kratos, UK)上に（２）の試料溶液と（１）のマトリックス溶液又は比較用マトリックス溶液を0.5μL ずつ滴下し混合した(on-target mix法)。
（４）AXIMA Performance（登録商標）（島津製作所）のリニアＴＯＦ、ポジティブイオンモ−ドで計測した。そして、各マトリックスを用いた場合の検出限界を評価した。
（５）４−ＣＨＣＡを用いて得られた検出限界を、Ｃ８−ＡＴＨＡＰを用いて得られた検出限界で割り、得られた値を、Ｃ８−ＡＴＨＡＰによる感度向上率(倍)とした。

感度向上率＝［４−ＣＨＣＡを用いて得られた検出限界］／［Ｃ８−ＡＴＨＡＰを用いて得られた検出限界］

表２に示すように、Ｃ８−ＡＴＨＡＰを用いると、SSRCalc Hydrophobicity 42.4以上の疎水性ペプチドに対し、４−ＣＨＣＡに対し検出限界が1/10、すなわち、感度が10倍向上したことを確認した。

一方、表２に示すように、Ｃ８−ＡＴＨＡＰを用いると、SSRCalc Hydrophobicity 22.3以下の親水性ペプチドに対し、４−ＣＨＣＡに対し検出限界が10倍〜10,000倍、すなわち、感度が1/10〜1/10,000倍低下したことを確認した。

［実施例５：消化物の評価]
本実施例においては、Ｃ８−ＡＴＨＡＰ（一般式（Ｉ）においてＲ：ｎ−オクチル基）をマトリックスとして用いた。

（１）マトリックス溶液として、Ｃ８−ＡＴＨＡＰの5 mg/mL溶液 (75%ACN/0.1%TFA water) を作成した。また、比較用マトリックス溶液として、４−ＣＨＣＡ (Laser Bio) の10 mg/mL (50%ACN/0.1%TFA water)溶液を作成した。
（２）試料溶液として、タンパク質 Phosphorylase bのLys-C消化物 (2 pmol/μL)を作成した。
（３）ＭＡＬＤＩターゲットプレ−ト（ＭＡＬＤＩプレ−ト：sample plate 2.8 mm ring x 384 well(Shimadzu/Kratos, UK)上に（２）の試料溶液と（１）のマトリックス溶液又は比較用マトリックス溶液を0.5μL ずつ滴下し混合した(on-target mix法)。
（４）AXIMA Performance（登録商標）（島津製作所）のリニアＴＯＦ、ポジティブイオンモ−ドで計測した。そして、各マトリックスを用いた場合のマススペクトルを評価した。
（５）また、各マトリックスを用いて検出されたペプチドイオンについて、Ｓ／Ｎ≧５で検出された場合を”＋＋”、Ｓ／Ｎ＝２〜５で検出された場合を”＋”、検出されなかった場合を”−”で示し、表３にまとめた。

図４に、Ｃ８−ＡＴＨＡＰをマトリックスとして用いた場合のマススペクトル結果（ａ）、及び、４−ＣＨＣＡをマトリックスとして用いた場合のマススペクトル結果（ｂ）を示す。

表３に示すように、Ｃ８−ＡＴＨＡＰを用いると、SSRCalc Hydrophobicity 30.4以上のペプチドを検出し、４−ＣＨＣＡを用いると、SSRCalc Hydrophobicity 33.4以下のペプチドを検出した。Ｃ８−ＡＴＨＡＰを用いることにより、４−ＣＨＣＡを用いて検出されなかった疎水性ペプチドを検出することができた。

Claims

下記一般式（Ｉ）：
（式中、Ｒは、炭素数４〜１２のアルキル基を表す。）
で示される２，４，６−トリヒドロキシアルキルフェノンをマトリックスとして用いる質量分析法。
分析対象が、疎水性化合物である、請求項１に記載の質量分析法。
分析対象が、疎水性ペプチドである、請求項１又は２に記載の質量分析法。
前記一般式（Ｉ）おいてＲが炭素数８のアルキル基を表す、請求項１〜３のいずれかに記載の質量分析法。