JPH06322274A - マトリックス援用レーザー脱離質量分析のためのマトリックス - Google Patents
マトリックス援用レーザー脱離質量分析のためのマトリックスInfo
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- C12Q1/6872—Methods for sequencing involving mass spectrometry
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Abstract
(57)【要約】
【目的】正確な質量測定ができる、オリゴヌクレオチド
イオンのレーザー脱離のための新しいマトリックスを提
供すること。 【構成】 被分析材の分子イオンのレーザー脱離のため
のマトリックスとして用いる組成物であって、（ａ）無
機酸又は有機酸の少なくとも一つのアンモニウム塩、
（ｂ）式（Ｉ）： 【化７】 （式中、Ｒは、炭素原子数１ないし１２の脂肪族炭化水
素基又は−Ｏ−原子で中断された炭素原子数２ないし１
２の脂肪族炭化水素基であり、そしてｎは１ないし５の
整数である）で示される化合物、及び（ｃ）ポリヌクレ
オチド、オリゴ糖、蛋白質及び大環状金属錯体よりなる
群から選ばれる高分子量化合物の少なくとも一つを含む
ことを特徴とする組成物及び該組成物を用いるオリゴヌ
クレオチドの分子量分析方法。
イオンのレーザー脱離のための新しいマトリックスを提
供すること。 【構成】 被分析材の分子イオンのレーザー脱離のため
のマトリックスとして用いる組成物であって、（ａ）無
機酸又は有機酸の少なくとも一つのアンモニウム塩、
（ｂ）式（Ｉ）： 【化７】 （式中、Ｒは、炭素原子数１ないし１２の脂肪族炭化水
素基又は−Ｏ−原子で中断された炭素原子数２ないし１
２の脂肪族炭化水素基であり、そしてｎは１ないし５の
整数である）で示される化合物、及び（ｃ）ポリヌクレ
オチド、オリゴ糖、蛋白質及び大環状金属錯体よりなる
群から選ばれる高分子量化合物の少なくとも一つを含む
ことを特徴とする組成物及び該組成物を用いるオリゴヌ
クレオチドの分子量分析方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、フェニル核が置換され
たフェノン、アンモニウム塩及び高分子量化合物を含む
組成物に関し、オリゴヌクレオチド配列のマトリックス
援用レーザー脱離質量分析法のための該組成物の用途に
関する。
たフェノン、アンモニウム塩及び高分子量化合物を含む
組成物に関し、オリゴヌクレオチド配列のマトリックス
援用レーザー脱離質量分析法のための該組成物の用途に
関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】マトリ
ックス援用レーザー脱離質量分析法は、数百ないし１０
００００ダルトン以上のペプチド及び蛋白質の分子量を
決定することを可能にする。この用途のために、蛋白質
が埋入されるマトリックスは、重要な要素である。西独
特許第（Ａ）−４０１７８０４ 号明細書及びＷＯ第91
/04570号は、生体分子のレーザー脱離質量分析法におい
てマトリックスとして用いられる化合物を開示してい
る。オリゴヌクレオチドの分子量を決定する同様な実験
は、現在まで、限られた成功しかしておらず、就中、G.
R. Parr et al., Rapid Communications in Mass Spec
trometry,6, 369-372(1992)及びK. Tang et al., Rapid
Communications in Mass Spectrometry, 6, 365-368(1
992) に記載されているにすぎない。これらの文献に記
載されている方法においては、レーザー脱離がともかく
達成されたとしても、小さいオリゴヌクレオチドの場合
には、Ｎａ+ 及びＫ+ を含む付加体の形成によって説明
される多くの質量ピークが観察され、比較的大きなオリ
ゴヌクレオチドの場合には、幅広いピークが観察され、
非常に不正確な質量測定しかできない。従って、オリゴ
ヌクレオチドイオンのレーザー脱離のための新しいマト
リックスを提供することは強い関心事である。
ックス援用レーザー脱離質量分析法は、数百ないし１０
００００ダルトン以上のペプチド及び蛋白質の分子量を
決定することを可能にする。この用途のために、蛋白質
が埋入されるマトリックスは、重要な要素である。西独
特許第（Ａ）−４０１７８０４ 号明細書及びＷＯ第91
/04570号は、生体分子のレーザー脱離質量分析法におい
てマトリックスとして用いられる化合物を開示してい
る。オリゴヌクレオチドの分子量を決定する同様な実験
は、現在まで、限られた成功しかしておらず、就中、G.
R. Parr et al., Rapid Communications in Mass Spec
trometry,6, 369-372(1992)及びK. Tang et al., Rapid
Communications in Mass Spectrometry, 6, 365-368(1
992) に記載されているにすぎない。これらの文献に記
載されている方法においては、レーザー脱離がともかく
達成されたとしても、小さいオリゴヌクレオチドの場合
には、Ｎａ+ 及びＫ+ を含む付加体の形成によって説明
される多くの質量ピークが観察され、比較的大きなオリ
ゴヌクレオチドの場合には、幅広いピークが観察され、
非常に不正確な質量測定しかできない。従って、オリゴ
ヌクレオチドイオンのレーザー脱離のための新しいマト
リックスを提供することは強い関心事である。
【０００３】
【課題を解決しようとする手段】一つの特徴において、
本発明は、（ａ）無機酸又は有機酸のアンモニウム塩の
少なくとも一つ、（ｂ）式（Ｉ）：
本発明は、（ａ）無機酸又は有機酸のアンモニウム塩の
少なくとも一つ、（ｂ）式（Ｉ）：
【０００４】
【化５】
【０００５】（式中、Ｒは炭素原子数１ないし１２の脂
肪族炭化水素基又は−Ｏ−原子で中断された炭素原子数
２ないし１２の脂肪族炭化水素基であり、そしてｎは１
ないし５の整数である）で示される化合物、及び（ｃ）
ポリヌクレオチド、オリゴ糖、蛋白質及び大環状金属錯
体よりなる群から選ばれる高分子量化合物の少なくとも
一つ、よりなることを特徴とする組成物に関する。
肪族炭化水素基又は−Ｏ−原子で中断された炭素原子数
２ないし１２の脂肪族炭化水素基であり、そしてｎは１
ないし５の整数である）で示される化合物、及び（ｃ）
ポリヌクレオチド、オリゴ糖、蛋白質及び大環状金属錯
体よりなる群から選ばれる高分子量化合物の少なくとも
一つ、よりなることを特徴とする組成物に関する。
【０００６】式（Ｉ）の化合物とアンモニウム塩は、好
適には１：５ないし１：２０、最も好適には１：８ない
し１：１２のモル比である。高分子量化合物と式（Ｉ）
の化合物は、好適には１：５ｘ１０3 ないし１：５ｘ１
０5 、最も好適には１：１０4 ないし１：５ｘ１０5 の
モル比で用いられる。
適には１：５ないし１：２０、最も好適には１：８ない
し１：１２のモル比である。高分子量化合物と式（Ｉ）
の化合物は、好適には１：５ｘ１０3 ないし１：５ｘ１
０5 、最も好適には１：１０4 ないし１：５ｘ１０5 の
モル比で用いられる。
【０００７】高分子量化合物は、代表的にはＲＮＡ及び
ＤＮＡ型のポリ−及びオリゴヌクレオチド、グリコシド
結合によって好適には２〜１０の糖単位よりなるオリゴ
糖、天然由来及び／又は合成的に作られたアミノ酸より
なるペプチド及び蛋白質、又はヘテロ原子を含む大環状
配位子、代表的にはクラウンエーテル及びＮａ+ イオノ
フォアのノナクチン、との金属錯体である。天然又は合
成ヌクレオシド基又はこのようなヌクレオシド基の混合
物よりなるポリ−及びオリゴヌクレオチドを用いるのが
特に好ましい。使用されるオリゴヌクレオチドは、２な
いし２００個、好適には２ないし１００個、より特に２
ないし６０個、最も好適には２ないし４０個のヌクレオ
シド残基よりなる。ヌクレオシド残基が天然由来である
か又は合成的に修飾されたヌクレオシド残基であるかは
重要でない。天然のヌクレオシド残基は、アデノシン、
グアノシン、シチジン、ウリジン、２’−デオキシアデ
ノシン、２’−デオキシチミジン、２’−デオキシグア
ノシン及び２’−デオキシシチジンである。修飾された
ヌクレオシド残基のうち、アデニン、Ｎ−メチルアデニ
ン、２−アミノアデニン、６−ヒドロキシプリン、２−
アミノ−６−クロロプリン、２−アミノ−６−メチルチ
オプリン、グアニン、７−デアザグアニン、Ｎ−イソブ
チリルグアニン、ウラシル、チミン、シトシン、５−フ
ルオロウラシル、５−クロロウラシル、５−ブロモウラ
シル、ジヒドロウラシル及び５−メチルシトシンから誘
導されるヌクレオシド残基、並びにそれらのホスホナー
ト類、ホスホロチオアート類、ホスホロアミダート類、
デホスホ誘導体類及び炭素環状誘導体類は重要である。
合成ヌクレオシド残基の大多数は公知であり、就中、E.
Uhlmann et al., Chemical Reviews, 90, 543-584(199
0); V. Marquez et al.,Medicinal Research Reviews,
6, 1-40(1986); 及びU. Englisch et al., Angewandte
Chemie, 6, 629-739(1991) に記載されている。
ＤＮＡ型のポリ−及びオリゴヌクレオチド、グリコシド
結合によって好適には２〜１０の糖単位よりなるオリゴ
糖、天然由来及び／又は合成的に作られたアミノ酸より
なるペプチド及び蛋白質、又はヘテロ原子を含む大環状
配位子、代表的にはクラウンエーテル及びＮａ+ イオノ
フォアのノナクチン、との金属錯体である。天然又は合
成ヌクレオシド基又はこのようなヌクレオシド基の混合
物よりなるポリ−及びオリゴヌクレオチドを用いるのが
特に好ましい。使用されるオリゴヌクレオチドは、２な
いし２００個、好適には２ないし１００個、より特に２
ないし６０個、最も好適には２ないし４０個のヌクレオ
シド残基よりなる。ヌクレオシド残基が天然由来である
か又は合成的に修飾されたヌクレオシド残基であるかは
重要でない。天然のヌクレオシド残基は、アデノシン、
グアノシン、シチジン、ウリジン、２’−デオキシアデ
ノシン、２’−デオキシチミジン、２’−デオキシグア
ノシン及び２’−デオキシシチジンである。修飾された
ヌクレオシド残基のうち、アデニン、Ｎ−メチルアデニ
ン、２−アミノアデニン、６−ヒドロキシプリン、２−
アミノ−６−クロロプリン、２−アミノ−６−メチルチ
オプリン、グアニン、７−デアザグアニン、Ｎ−イソブ
チリルグアニン、ウラシル、チミン、シトシン、５−フ
ルオロウラシル、５−クロロウラシル、５−ブロモウラ
シル、ジヒドロウラシル及び５−メチルシトシンから誘
導されるヌクレオシド残基、並びにそれらのホスホナー
ト類、ホスホロチオアート類、ホスホロアミダート類、
デホスホ誘導体類及び炭素環状誘導体類は重要である。
合成ヌクレオシド残基の大多数は公知であり、就中、E.
Uhlmann et al., Chemical Reviews, 90, 543-584(199
0); V. Marquez et al.,Medicinal Research Reviews,
6, 1-40(1986); 及びU. Englisch et al., Angewandte
Chemie, 6, 629-739(1991) に記載されている。
【０００８】式（Ｉ）で表される化合物において、Ｒ
は、線状又は分岐状の、Ｃ1 −Ｃ12アルキル、Ｃ1 −Ｃ
12ヒドロキシアルキル、又はＣ5 −Ｃ7 シクロアルキル
若しくはＣ5 −Ｃ7 ヒドロキシシクロアルキル、又は−
Ｏ−原子で中断された線状若しくは分岐状の、Ｃ2 −Ｃ
12アルキル若しくはＣ2 −Ｃ12ヒドロキシアルキル、又
は−Ｏ−原子で中断されたＣ5 −Ｃ7 シクロアルキル若
しくはＣ5 −Ｃ7 ヒドロキシシクロアルキル、又は水素
である。式（Ｉ）の好適な化合物は、Ｒが線状若しくは
分岐状の、アルキル又はシクロアルキルである化合物で
ある。線状又は分岐状のＣ1 −Ｃ4 アルキルは、特に好
ましい。式（Ｉ）の化合物の典型的な例は、２，４，６
−トリヒドロキシアセトフェノン、２，４，５−トリヒ
ドロキシブチロフェノン、並びに２，４−、２，５−及
び２，６−ジヒドロキシアセトフェノンである。
は、線状又は分岐状の、Ｃ1 −Ｃ12アルキル、Ｃ1 −Ｃ
12ヒドロキシアルキル、又はＣ5 −Ｃ7 シクロアルキル
若しくはＣ5 −Ｃ7 ヒドロキシシクロアルキル、又は−
Ｏ−原子で中断された線状若しくは分岐状の、Ｃ2 −Ｃ
12アルキル若しくはＣ2 −Ｃ12ヒドロキシアルキル、又
は−Ｏ−原子で中断されたＣ5 −Ｃ7 シクロアルキル若
しくはＣ5 −Ｃ7 ヒドロキシシクロアルキル、又は水素
である。式（Ｉ）の好適な化合物は、Ｒが線状若しくは
分岐状の、アルキル又はシクロアルキルである化合物で
ある。線状又は分岐状のＣ1 −Ｃ4 アルキルは、特に好
ましい。式（Ｉ）の化合物の典型的な例は、２，４，６
−トリヒドロキシアセトフェノン、２，４，５−トリヒ
ドロキシブチロフェノン、並びに２，４−、２，５−及
び２，６−ジヒドロキシアセトフェノンである。
【０００９】驚くべきことに、無機酸又は有機酸のアン
モニウム塩の存在が、この新規な組成物の重要な成分で
あることが分った。このアンモニウム塩は、ハロゲン化
水素酸、過塩素酸、カルコゲン酸、硝酸、亜硝酸、カル
ボン酸及びホウ酸、並びにヒドロキシポリカルボン酸、
又は式ＨＯＯＣ−Ｒ1 −ＣＯＯＨ（式中、Ｒ1 は、１な
いし３個の水酸基を有する、Ｃ1 −Ｃ8 アルキレン、Ｃ
5 −Ｃ6 シクロアルキレン、フェニレン又はナフタレン
である）で示される酸のアンモニウム塩である。オリゴ
ヌクレオチド及び式（Ｉ）の化合物と共に、これらは、
塩基配列とは無関係にオリゴヌクレオチドイオンのレー
ザー脱離を可能にするのみならず、同時に、例えばＮａ
+ 及びＫ+ を含む付加体の生成を阻止する。マトリック
ス援用レーザー脱離質量分析に新規な組成物を用いる場
合、この特徴はオリゴヌクレオチドイオンの鋭い分子ピ
ークを生じ、その相当する分子質量は正確に決定するこ
とができる。硫酸、硝酸、タルトロン酸、リンゴ酸、酒
石酸、クエン酸、並びに式ＨＯＯＣ−Ｒ1 −ＣＯＯＨ
（式中、Ｒ1 は、１ないし３個の水酸基を有する、Ｃ1
−Ｃ8 アルキレン、Ｃ5 −Ｃ6 シクロアルキレン、フェ
ニレン又はナフタレンである）で示される化合物の塩を
用いるのが好ましい。これらの塩のうち、硫酸、酒石酸
及びクエン酸のアンモニウム塩は、特に好ましい。
モニウム塩の存在が、この新規な組成物の重要な成分で
あることが分った。このアンモニウム塩は、ハロゲン化
水素酸、過塩素酸、カルコゲン酸、硝酸、亜硝酸、カル
ボン酸及びホウ酸、並びにヒドロキシポリカルボン酸、
又は式ＨＯＯＣ−Ｒ1 −ＣＯＯＨ（式中、Ｒ1 は、１な
いし３個の水酸基を有する、Ｃ1 −Ｃ8 アルキレン、Ｃ
5 −Ｃ6 シクロアルキレン、フェニレン又はナフタレン
である）で示される酸のアンモニウム塩である。オリゴ
ヌクレオチド及び式（Ｉ）の化合物と共に、これらは、
塩基配列とは無関係にオリゴヌクレオチドイオンのレー
ザー脱離を可能にするのみならず、同時に、例えばＮａ
+ 及びＫ+ を含む付加体の生成を阻止する。マトリック
ス援用レーザー脱離質量分析に新規な組成物を用いる場
合、この特徴はオリゴヌクレオチドイオンの鋭い分子ピ
ークを生じ、その相当する分子質量は正確に決定するこ
とができる。硫酸、硝酸、タルトロン酸、リンゴ酸、酒
石酸、クエン酸、並びに式ＨＯＯＣ−Ｒ1 −ＣＯＯＨ
（式中、Ｒ1 は、１ないし３個の水酸基を有する、Ｃ1
−Ｃ8 アルキレン、Ｃ5 −Ｃ6 シクロアルキレン、フェ
ニレン又はナフタレンである）で示される化合物の塩を
用いるのが好ましい。これらの塩のうち、硫酸、酒石酸
及びクエン酸のアンモニウム塩は、特に好ましい。
【００１０】この発明の典型的な組成物は、ｐＨ約６の
弱酸性であり、例えば硫酸、酒石酸又はクエン酸のアン
モニウム塩の少なくとも一つ、式（Ｉ）の化合物とし
て、例えば２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノ
ン、２，４，５−トリヒドロキシブチロフェノン、又は
２，４−、２，５−若しくは２，６−ジヒドロキシアセ
トフェノン、並びに天然若しくは合成ヌクレオシド残基
又は該ヌクレオシド残基の混合物よりなるオリゴヌクレ
オチドの少なくとも一つを含む。
弱酸性であり、例えば硫酸、酒石酸又はクエン酸のアン
モニウム塩の少なくとも一つ、式（Ｉ）の化合物とし
て、例えば２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノ
ン、２，４，５−トリヒドロキシブチロフェノン、又は
２，４−、２，５−若しくは２，６−ジヒドロキシアセ
トフェノン、並びに天然若しくは合成ヌクレオシド残基
又は該ヌクレオシド残基の混合物よりなるオリゴヌクレ
オチドの少なくとも一つを含む。
【００１１】オリゴヌクレオチドのマトリックス援用レ
ーザー脱離質量分析のための新規な組成物の用途は、特
に重要である。
ーザー脱離質量分析のための新規な組成物の用途は、特
に重要である。
【００１２】別の特徴において、本発明は、被分析材の
分子イオンのレーザー脱離のためのマトリックスとして
用いられる組成物であって、（ａ）無機酸又は有機酸の
アンモニウム塩の少なくとも一つ、及び（ｂ）式
（Ｉ）：
分子イオンのレーザー脱離のためのマトリックスとして
用いられる組成物であって、（ａ）無機酸又は有機酸の
アンモニウム塩の少なくとも一つ、及び（ｂ）式
（Ｉ）：
【００１３】
【化６】
【００１４】（式中、Ｒ及びｎは、上記と同義である）
で示される化合物よりなることを特徴とする組成物に関
する。式（Ｉ）の化合物に対するアンモニウム塩の比
は、好適には１：５ないし１：２０であるが、最も好適
には１：８ないし１：１２である。
で示される化合物よりなることを特徴とする組成物に関
する。式（Ｉ）の化合物に対するアンモニウム塩の比
は、好適には１：５ないし１：２０であるが、最も好適
には１：８ないし１：１２である。
【００１５】この発明は、さらに、マトリックス援用レ
ーザー脱離質量分析による２ないし２００個、好適には
２ないし１００個、そしてより特に２ないし６０個、最
も好適には２ないし４０個のヌクレオシド残基を含むオ
リゴヌクレオチドの分子量を決定する方法に関し、上記
の新規組成物がレーザー脱離のマトリックスとして用い
られる。この方法は、式（Ｉ）の化合物、アンモニウム
塩及びオリゴヌクレオチドを溶媒中で混合し、この溶液
の一部で試料担体を被覆し、最後に溶媒を徐々に蒸発さ
せて除くことよりなる。次いで、結晶化した試料を、好
適には３３７nmの波長を放出する窒素レーザーによるマ
トリックス援用レーザー脱離質量分析に用いられる。ヌ
クレオチドの量は、好適には、式（Ｉ）の化合物に対す
るオリゴヌクレオチドのモル比が１：５ｘ１０3 ないし
１：５ｘ１０5 、最も好適には１：１０4 ないし１：１
０5 であるように選ばれるのが好ましい。本発明のマト
リックスは、分子量測定値と計算値との良い一致を可能
にする。驚くべきことに、ｎが２である式（Ｉ）の化合
物は、２５個以上のヌクレオチド単位を含むオリゴヌク
レオチド及びホスホロチオアート類の分子量を測定する
のに特に適している。
ーザー脱離質量分析による２ないし２００個、好適には
２ないし１００個、そしてより特に２ないし６０個、最
も好適には２ないし４０個のヌクレオシド残基を含むオ
リゴヌクレオチドの分子量を決定する方法に関し、上記
の新規組成物がレーザー脱離のマトリックスとして用い
られる。この方法は、式（Ｉ）の化合物、アンモニウム
塩及びオリゴヌクレオチドを溶媒中で混合し、この溶液
の一部で試料担体を被覆し、最後に溶媒を徐々に蒸発さ
せて除くことよりなる。次いで、結晶化した試料を、好
適には３３７nmの波長を放出する窒素レーザーによるマ
トリックス援用レーザー脱離質量分析に用いられる。ヌ
クレオチドの量は、好適には、式（Ｉ）の化合物に対す
るオリゴヌクレオチドのモル比が１：５ｘ１０3 ないし
１：５ｘ１０5 、最も好適には１：１０4 ないし１：１
０5 であるように選ばれるのが好ましい。本発明のマト
リックスは、分子量測定値と計算値との良い一致を可能
にする。驚くべきことに、ｎが２である式（Ｉ）の化合
物は、２５個以上のヌクレオチド単位を含むオリゴヌク
レオチド及びホスホロチオアート類の分子量を測定する
のに特に適している。
【００１６】この方法によって、オリゴヌクレオチドの
分子量のみならず、そのヌクレオシド残基の正確な配列
順序をも決定することができる。この目的のために、オ
リゴヌクレオチドは、別々の反応で５’末端及び３’末
端から選択的にヌクレオチドの一つづつが減成される。
これは、酵素、いわゆる５’−エキソヌクレアーゼ及び
３’−エキソヌクレアーゼを用い、水中又は所要の緩衝
液中の何れかで行なわれる。子牛脾臓リン酸ジエステラ
ーゼ及びヘビ毒リン酸ジエステラーゼを用いるのが特に
好適である。この減成は、反応時間により、長さの異な
るオリゴヌクレオチドの各種の混合物を生成させる。酵
素が所要の緩衝液中で用いられる場合、これらのヌクレ
オチド混合物は、この技術分野で一般に公知の方法、例
えばミクロ透析によって脱イオン化される。その後、混
合物はマトリックス援用レーザー脱離質量分析によって
特性が明らかにされる。個々の分子ピーク間の質量差か
ら、脱離したヌクレオチドを推定し、完全なヌクレオチ
ドの配列順序を決定することができる。分子生物学の別
の配列順序決定法と比較すると、新規な方法は、一面で
はその速さが際立っており、他面では毒性がなく又は放
射性物質を必要としない。
分子量のみならず、そのヌクレオシド残基の正確な配列
順序をも決定することができる。この目的のために、オ
リゴヌクレオチドは、別々の反応で５’末端及び３’末
端から選択的にヌクレオチドの一つづつが減成される。
これは、酵素、いわゆる５’−エキソヌクレアーゼ及び
３’−エキソヌクレアーゼを用い、水中又は所要の緩衝
液中の何れかで行なわれる。子牛脾臓リン酸ジエステラ
ーゼ及びヘビ毒リン酸ジエステラーゼを用いるのが特に
好適である。この減成は、反応時間により、長さの異な
るオリゴヌクレオチドの各種の混合物を生成させる。酵
素が所要の緩衝液中で用いられる場合、これらのヌクレ
オチド混合物は、この技術分野で一般に公知の方法、例
えばミクロ透析によって脱イオン化される。その後、混
合物はマトリックス援用レーザー脱離質量分析によって
特性が明らかにされる。個々の分子ピーク間の質量差か
ら、脱離したヌクレオチドを推定し、完全なヌクレオチ
ドの配列順序を決定することができる。分子生物学の別
の配列順序決定法と比較すると、新規な方法は、一面で
はその速さが際立っており、他面では毒性がなく又は放
射性物質を必要としない。
【００１７】さらに、この方法は、オリゴヌクレオチド
の特性を明らかにする新規でまだ知られていない可能性
を広げる。かくして、例えば配列順序が既知のオリゴヌ
クレオチドの簡単な分子量を決定することにによって、
修飾又は合成したヌクレオシド残基の存在を早急かつ決
定的に検出することができる。５’−又は３’−エキソ
ヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドの減成後、この
技術分野に精通した技術者によって容易に確かめ得る特
定の条件下で、エキソヌクレアーゼは、通常、非天然型
の修飾されたヌクレオシド残基を減成することができな
いので、オリゴヌクレオチド内の修飾された塩基の位置
を決定することもしばしば可能である。この場合、修飾
されたヌクレオシド残基においてオリゴヌクレオチドの
減成は行き止まりになり、それにより質量スペクトルに
おいて相当するオリゴヌクレオチドフラグメントの単一
シグナルを生じる。
の特性を明らかにする新規でまだ知られていない可能性
を広げる。かくして、例えば配列順序が既知のオリゴヌ
クレオチドの簡単な分子量を決定することにによって、
修飾又は合成したヌクレオシド残基の存在を早急かつ決
定的に検出することができる。５’−又は３’−エキソ
ヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドの減成後、この
技術分野に精通した技術者によって容易に確かめ得る特
定の条件下で、エキソヌクレアーゼは、通常、非天然型
の修飾されたヌクレオシド残基を減成することができな
いので、オリゴヌクレオチド内の修飾された塩基の位置
を決定することもしばしば可能である。この場合、修飾
されたヌクレオシド残基においてオリゴヌクレオチドの
減成は行き止まりになり、それにより質量スペクトルに
おいて相当するオリゴヌクレオチドフラグメントの単一
シグナルを生じる。
【００１８】
【実施例】以下の実施例により、本発明をより詳細に説
明する。
明する。
【００１９】Ａ）製造実施例 組成物の製法 実施例Ａ１：２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノ
ンの１M 溶液５μl 、硫酸アンモニウムの０．１M 溶液
５μl 及びエタノール５μl を、５’−ＡＧＣＴＡＧＣ
Ｔ−３’の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドＡの５
０μM 溶液１μl と混合した。この溶液の１μl を試料
担体に塗布し、溶媒を真空中で徐々に除去した。このよ
うにして調製した組成物は、マトリックス援用レーザー
脱離質量分析に使用することができる。
ンの１M 溶液５μl 、硫酸アンモニウムの０．１M 溶液
５μl 及びエタノール５μl を、５’−ＡＧＣＴＡＧＣ
Ｔ−３’の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドＡの５
０μM 溶液１μl と混合した。この溶液の１μl を試料
担体に塗布し、溶媒を真空中で徐々に除去した。このよ
うにして調製した組成物は、マトリックス援用レーザー
脱離質量分析に使用することができる。
【００２０】実施例Ａ２：２，４，６−トリヒドロキシ
アセトフェノンの１M 溶液５μl 、二水素クエン酸アン
モニウムの０．１M 溶液５μl 及びエタノール５μl
を、５’−ｄ（ＡＡＴＣＡＧＧＴＡＡＣＣＣＧＣＡＴＡ
ＧＴＧＡＡＧＴＡＴＡＧＣＴＴＣＧＡＣＣＴＡ）−３’
の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドＢの５０μM 溶
液１μl と混合した。この溶液１μl を試料担体に塗布
し、溶媒を真空中で徐々に除去した。このようにして調
製した組成物は、マトリックス援用レーザー脱離質量分
析に使用することができる。
アセトフェノンの１M 溶液５μl 、二水素クエン酸アン
モニウムの０．１M 溶液５μl 及びエタノール５μl
を、５’−ｄ（ＡＡＴＣＡＧＧＴＡＡＣＣＣＧＣＡＴＡ
ＧＴＧＡＡＧＴＡＴＡＧＣＴＴＣＧＡＣＣＴＡ）−３’
の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドＢの５０μM 溶
液１μl と混合した。この溶液１μl を試料担体に塗布
し、溶媒を真空中で徐々に除去した。このようにして調
製した組成物は、マトリックス援用レーザー脱離質量分
析に使用することができる。
【００２１】実施例Ａ３：２，６−ジヒドロキシアセト
フェノンの１M 溶液５μl 、二水素クエン酸アンモニウ
ムの０．１M 溶液５μl 及びエタノール５μl を、５’
−ｄ（ＡＴＴＣＡＧＧＴＡＡＣＣＣＧＣＡＴＡＧＴＧＡ
ＡＧＴＡＴＡＧＣＴＴＣＧＡＣＣＴＡ）−３’の塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドＢの５０μM 溶液１μl
と混合した。この溶液１μl を試料担体に塗布し、溶媒
を真空中で徐々に除去した。このようにして調製した組
成物は、マトリックス援用のレーザー脱離質量分析に使
用することができる。
フェノンの１M 溶液５μl 、二水素クエン酸アンモニウ
ムの０．１M 溶液５μl 及びエタノール５μl を、５’
−ｄ（ＡＴＴＣＡＧＧＴＡＡＣＣＣＧＣＡＴＡＧＴＧＡ
ＡＧＴＡＴＡＧＣＴＴＣＧＡＣＣＴＡ）−３’の塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドＢの５０μM 溶液１μl
と混合した。この溶液１μl を試料担体に塗布し、溶媒
を真空中で徐々に除去した。このようにして調製した組
成物は、マトリックス援用のレーザー脱離質量分析に使
用することができる。
【００２２】実施例Ａ４：２，６−ジヒドロキシアセト
フェノンの１M 溶液５μl 、二水素クエン酸アンモニウ
ムの０．１M 溶液５μl びエタノール５μl を、５’−
ｄ（ＴＴＡＣＧＣＣＴＡＡＣＡＧＣＧＡＴＡＴＣＡＧＧ
ＡＣＴＴＣＡＧＣＧＴＡＣＡＧＣＡＴＴＡＣＣＡＧＴＡ
ＴＡＧＣＣＴＴＡＧＡＧＣ）−３’の塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドＣの５０μM 溶液１μl と混合し
た。この溶液の１μl を試料担体に塗布し、溶媒を真空
中で徐々に除去した。このようにして調製した組成物
は、マトリックス援用のレーザー脱離質量分析に使用す
ることができる。
フェノンの１M 溶液５μl 、二水素クエン酸アンモニウ
ムの０．１M 溶液５μl びエタノール５μl を、５’−
ｄ（ＴＴＡＣＧＣＣＴＡＡＣＡＧＣＧＡＴＡＴＣＡＧＧ
ＡＣＴＴＣＡＧＣＧＴＡＣＡＧＣＡＴＴＡＣＣＡＧＴＡ
ＴＡＧＣＣＴＴＡＧＡＧＣ）−３’の塩基配列を有する
オリゴヌクレオチドＣの５０μM 溶液１μl と混合し
た。この溶液の１μl を試料担体に塗布し、溶媒を真空
中で徐々に除去した。このようにして調製した組成物
は、マトリックス援用のレーザー脱離質量分析に使用す
ることができる。
【００２３】Ｂ）使用実施例 分子量決定 実施例Ｂ１：分子量を決定するため、ビール酵母からの
フェニルアラニル−ｔＲＮＡを、実施例Ａ１に記載の方
法により合成し、次いで、波長３３７nmのレーザーによ
り、マトリックス援用レーザー脱離質量分析により解析
した。
フェニルアラニル−ｔＲＮＡを、実施例Ａ１に記載の方
法により合成し、次いで、波長３３７nmのレーザーによ
り、マトリックス援用レーザー脱離質量分析により解析
した。
【００２４】質量スペクトルは、２４８７７．３g/mol
に主ピーク、及び１２５７８．０g/mol に二次ピークを
示した。主ピークは１価の電荷を有するフェニルアラニ
ル−ｔＲＮＡの分子イオンに相当し、二次ピークは２価
の電荷を有する分子イオンに相当する。
に主ピーク、及び１２５７８．０g/mol に二次ピークを
示した。主ピークは１価の電荷を有するフェニルアラニ
ル−ｔＲＮＡの分子イオンに相当し、二次ピークは２価
の電荷を有する分子イオンに相当する。
【００２５】実施例Ｂ２：分子量を決定するため、５’
−ｄ（ＡＡＴＣＡＧＧＴＡＡＣＣＣＧＣＡＴＡＧＴＧＡ
ＡＧＴＡＴＡＧＣＴＴＣＧＡＣＣＴＡ）−３’の塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドＢを、実施例Ａ２に記載
の方法により合成し、次いで、波長３３７nmのレーザー
により、マトリックス援用レーザー脱離質量分析により
解析した。
−ｄ（ＡＡＴＣＡＧＧＴＡＡＣＣＣＧＣＡＴＡＧＴＧＡ
ＡＧＴＡＴＡＧＣＴＴＣＧＡＣＣＴＡ）−３’の塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドＢを、実施例Ａ２に記載
の方法により合成し、次いで、波長３３７nmのレーザー
により、マトリックス援用レーザー脱離質量分析により
解析した。
【００２６】質量スペクトルは、１２２７２．１（分子
−１プロトン）の計算質量に相当する１２１２２．３3g
/molにピークを示した。
−１プロトン）の計算質量に相当する１２１２２．３3g
/molにピークを示した。
【００２７】実施例Ｂ３：分子量を決定するため、５−
ｄ（ＡＡＴＣＡＧＧＴＡＡＣＣＣＧＣＡＴＡＧＴＧＡＡ
ＧＴＡＴＡＧＣＴＴＣＧＡＣＣＴＡ）−３’の塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドＢを、実施例Ａ３に記載の
方法により合成し、次いで、波長３３７nmのレーザーに
より、マトリックス援用レーザー脱離質量分析により解
析した。
ｄ（ＡＡＴＣＡＧＧＴＡＡＣＣＣＧＣＡＴＡＧＴＧＡＡ
ＧＴＡＴＡＧＣＴＴＣＧＡＣＣＴＡ）−３’の塩基配列
を有するオリゴヌクレオチドＢを、実施例Ａ３に記載の
方法により合成し、次いで、波長３３７nmのレーザーに
より、マトリックス援用レーザー脱離質量分析により解
析した。
【００２８】質量スペクトルは、１２２７４．１（分子
＋１プロトン）の計算質量に相当する１２２７８．３g/
mol にピークを示した。
＋１プロトン）の計算質量に相当する１２２７８．３g/
mol にピークを示した。
【００２９】実施例Ｂ４：分子量を決定するため、５’
−ｄ（ＴＴＡＣＧＣＣＴＡＡＣＡＧＣＧＡＴＡＴＣＡＧ
ＧＡＣＴＴＣＡＧＣＧＴＡＣＡＧＣＡＴＴＡＣＣＡＧＴ
ＡＴＡＧＣＣＴＴＡＧＡＧＣ）−３’の塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチドＣを、実施例Ａ４に記載の方法に
より合成し、次いで、波長３３７nmのレーザーにより、
マトリックス援用レーザー脱離質量分析により解析し
た。
−ｄ（ＴＴＡＣＧＣＣＴＡＡＣＡＧＣＧＡＴＡＴＣＡＧ
ＧＡＣＴＴＣＡＧＣＧＴＡＣＡＧＣＡＴＴＡＣＣＡＧＴ
ＡＴＡＧＣＣＴＴＡＧＡＧＣ）−３’の塩基配列を有す
るオリゴヌクレオチドＣを、実施例Ａ４に記載の方法に
より合成し、次いで、波長３３７nmのレーザーにより、
マトリックス援用レーザー脱離質量分析により解析し
た。
【００３０】質量スペクトルは、１８４５３．１（分子
＋１プロトン）の計算質量に相当する１８４５３．１g/
mol にピークを示した。
＋１プロトン）の計算質量に相当する１８４５３．１g/
mol にピークを示した。
【００３１】Ｃ）配列順序決定 実施例１Ｃ：別々の反応において５’末端及び３’末端
の両方から、エキソヌクレアーゼによる減成反応を行
い、オリゴヌクレオチドＡ（５’−ＡＧＣＴＡＧＣＴ−
３’）の配列順序を決定した。
の両方から、エキソヌクレアーゼによる減成反応を行
い、オリゴヌクレオチドＡ（５’−ＡＧＣＴＡＧＣＴ−
３’）の配列順序を決定した。
【００３２】５’末端からの減成のためには、オリゴヌ
クレオチドＡの５０μM 溶液２０μl 及び子牛脾臓リン
酸ジエステラーゼ酵素（２ｘ１０-3U/μ l）溶液１μl
の混合物を３７℃で反応した。実施例Ａ１に記載の方法
で調製した試料１μl を１５分毎に取り出し、次いで、
マトリックス援用レーザー脱離質量分析により特性を明
らかにした。
クレオチドＡの５０μM 溶液２０μl 及び子牛脾臓リン
酸ジエステラーゼ酵素（２ｘ１０-3U/μ l）溶液１μl
の混合物を３７℃で反応した。実施例Ａ１に記載の方法
で調製した試料１μl を１５分毎に取り出し、次いで、
マトリックス援用レーザー脱離質量分析により特性を明
らかにした。
【００３３】３’末端からの減成のためには、オリゴヌ
クレオチドＡの５０μM 溶液２０μl 及びヘビ毒リン酸
ジエステラーゼ（３ｘ１０-3U/μ l）溶液１μl の混合
物を３７℃で反応した。実施例Ａ１に記載の方法で調製
した試料１μl を１５分毎に取り出し、次いで、マトリ
ックス援用レーザー脱離質量分析により特性を明らかに
した。
クレオチドＡの５０μM 溶液２０μl 及びヘビ毒リン酸
ジエステラーゼ（３ｘ１０-3U/μ l）溶液１μl の混合
物を３７℃で反応した。実施例Ａ１に記載の方法で調製
した試料１μl を１５分毎に取り出し、次いで、マトリ
ックス援用レーザー脱離質量分析により特性を明らかに
した。
【００３４】得られた結果を第１表に示した。
【００３５】
【表１】
【００３６】 期待した配列：５’−ＡＧＣＴＡＧＣＴ−３’ 決定した配列：５’−ＡＧＣＴＡＧＣＴ−３’
【００３７】実施例Ｃ２：別々の反応において５’末端
及び３’末端の両方から、エキソヌクレアーゼによる減
成反応を行い、オリゴヌクレオチドＤ（５’−ｄ（ＡＡ
ＴＣＡＧＧＴＡＡＣＣＣＧＣＡＴＡＧＴＧＡＡＧＴＡＴ
ＡＧＣＴＴＣＧ）−３’の配列順序を決定した。
及び３’末端の両方から、エキソヌクレアーゼによる減
成反応を行い、オリゴヌクレオチドＤ（５’−ｄ（ＡＡ
ＴＣＡＧＧＴＡＡＣＣＣＧＣＡＴＡＧＴＧＡＡＧＴＡＴ
ＡＧＣＴＴＣＧ）−３’の配列順序を決定した。
【００３８】５’末端からの減成のためには、オリゴヌ
クレオチドＤの５０μM 溶液２０μl 及び子牛脾臓リン
酸ジエステラーゼ酵素（２ｘ１０-3U/μl ）溶液１μl
の混合物を３７℃で反応した。実施例Ａ３に記載の方法
で調製した試料１μl を３分及び１３分後に取り出し、
次いで、マトリックス援用レーザー脱離質量分析により
特性を明らかにした。
クレオチドＤの５０μM 溶液２０μl 及び子牛脾臓リン
酸ジエステラーゼ酵素（２ｘ１０-3U/μl ）溶液１μl
の混合物を３７℃で反応した。実施例Ａ３に記載の方法
で調製した試料１μl を３分及び１３分後に取り出し、
次いで、マトリックス援用レーザー脱離質量分析により
特性を明らかにした。
【００３９】３’末端からの分解のためには、オリゴヌ
クレオチドＤの５０μM 溶液２０μl 及びヘビ毒リン酸
ジエステラーゼ（３ｘ１０-3U/μl ）溶液１μl の混合
物を３７℃で反応した。実施例Ａ３に記載の方法で調製
した試料１μl を３分、３０分及び６０分後に取り出
し、次いで、マトリックス援用レーザー脱離質量分析に
より特性を明らかにした。
クレオチドＤの５０μM 溶液２０μl 及びヘビ毒リン酸
ジエステラーゼ（３ｘ１０-3U/μl ）溶液１μl の混合
物を３７℃で反応した。実施例Ａ３に記載の方法で調製
した試料１μl を３分、３０分及び６０分後に取り出
し、次いで、マトリックス援用レーザー脱離質量分析に
より特性を明らかにした。
【００４０】得られた結果を第２表に示した。
【００４１】
【表２】
【００４２】
【表３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 27/64 Ｂ 7414−2Ｊ
Claims (19)
- 【請求項１】 （ａ）無機酸又は有機酸のアンモニウム
塩の少なくとも一つ、（ｂ）式（Ｉ）： 【化１】 （式中、Ｒは、炭素原子数１ないし１２の脂肪族炭化水
素基又は−Ｏ−原子で中断された炭素原子数２ないし１
２の脂肪族炭化水素基であり、そしてｎは１ないし５の
整数である）で示される化合物、及び（ｃ）ポリヌクレ
オチド、オリゴ糖、蛋白質及び大環状金属錯体よりなる
群から選ばれる高分子量化合物の少なくとも一つ、を含
むことを特徴とする組成物。 - 【請求項２】 アンモニウム塩及び式（Ｉ）の化合物
が、１：５ないし１：２０のモル比で存在する請求項１
記載の組成物。 - 【請求項３】 高分子量化合物及び式（Ｉ）の化合物
が、１：５ｘ１０3 ないし１：５ｘ１０5 のモル比で存
在する請求項１記載の組成物。 - 【請求項４】 高分子量化合物が、２ないし１０００個
のヌクレオシド残基よりなるオリゴヌクレオチドである
請求項１記載の組成物。 - 【請求項５】 式（Ｉ）のＲが、線状又は分岐状のアル
キル、又はシクロアルキルである請求項１記載の組成
物。 - 【請求項６】 式（Ｉ）のＲが、線状又は分岐状のＣ1
−Ｃ4 アルキルである請求項５記載の組成物。 - 【請求項７】 式（Ｉ）の化合物として、２，４，６−
トリヒドロキシアセトフェノン、２，４，５−トリヒド
ロキシブチロフェノン又は２，４−、２，５−若しくは
２，６−ジヒドロキシアセトフェノンを含む請求項１記
載の組成物。 - 【請求項８】 硫酸、硝酸、タルトロン酸、リンゴ酸、
酒石酸及びクエン酸の系列並びに式ＨＯＯＣ−Ｒ1 −Ｃ
ＯＯＨ（式中、Ｒ1 は、１ないし３個の水酸基を有す
る、Ｃ1 −Ｃ8 アルキレン、Ｃ5 −Ｃ6 シクロアルキレ
ン、フェニレン又はナフチレンである）で示される酸の
アンモニウム塩の少なくとも一つを含む請求項１記載の
組成物。 - 【請求項９】 高分子量化合物が、天然のヌクレオシド
残基である、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリ
ジン、２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシチミ
ジン、２’−デオキシグアノシン又は２’−デオキシシ
チジンを含むオリゴヌクレオチドである請求項１記載の
組成物。 - 【請求項１０】 高分子量化合物が、天然のヌクレオシ
ド残基の他に、アデニン、Ｎ−メチルアデニン、２−ア
ミノアデニン、６−ヒドロキシプリン、２−アミノ−６
−クロロプリン、２−アミノ−６−メチルチオプリン、
グアニン、７−デアザグアニン、Ｎ−イソブチリルグア
ニン、ウラシル、チミン、シトシン、５−フルオロウラ
シル、５−クロロウラシル、５−ブロモウラシル、ジヒ
ドロウラシル若しくは５−メチルシトシンから誘導され
るヌクレオシド残基、又はそれらのホスホナート類、ホ
スホロチオアート類、ホスホロアミダート類、デホスホ
誘導体類若しくは炭素環式誘導体類を含むオリゴヌクレ
オチドである請求項１記載の組成物。 - 【請求項１１】 （ａ）硫酸、酒石酸及びクエン酸より
なる系列のアンモニウム塩の少なくとも一つ、（ｂ）式
（Ｉ）の化合物として、２，４，６−トリヒドロキシア
セトフェノン、２，４，５−トリヒドロキシブチロフェ
ノン又は２，４−、２，５−若しくは２，６−ジヒドロ
キシアセトフェノン、及び（ｃ）天然若しくは合成ヌク
レオシド残基又は該ヌクレオシド残基の混合物よりなる
オリゴヌクレオチドの少なくとも一つ、よりなる請求項
１記載の組成物。 - 【請求項１２】 被分析物の分子イオンのレーザー脱離
のためのマトリックスとして用いる組成物であって、
（ａ）無機酸又は有機酸のアンモニウム塩の少なくとも
一つ、及び（ｂ）式（Ｉ）の化合物： 【化２】 （式中、Ｒは、炭素原子数１ないし１２の脂肪族炭化水
素基又は−Ｏ−原子で中断された炭素原子数２ないし１
２の脂肪族炭化水素基であり、そしてｎは１ないし５の
整数である）で示される化合物、よりなることを特徴と
する組成物。 - 【請求項１３】 式（Ｉ）の化合物に対するアンモニウ
ム塩の比が、１：５ないし１：２０である請求項１２記
載の組成物。 - 【請求項１４】 ２ないし２００個の天然又は合成ヌク
レオシド残基又はそのようなヌクレオシド残基の混合物
よりなるオリゴヌクレオチドの分子量を決定する方法で
あって、（ａ）無機酸又は有機酸のアンモニウム塩の少
なくとも一つ、及び（ｂ）式（Ｉ）： 【化３】 （式中、Ｒは、炭素原子数１ないし１２の脂肪族炭化水
素基又は−Ｏ−原子で中断された炭素原子数２ないし１
２の脂肪族炭化水素基であり、そしてｎは１ないし５の
整数である）で示される化合物よりなる組成物に、該ヌ
クレオチド又はそれらの混合物を埋め込み、ついでこれ
らをマトリックス援用レーザー脱離質量分析により特性
を明らかにすることを特徴とする方法。 - 【請求項１５】 オリゴヌクレオチドが、２ないし１０
０個のヌクレオシド残基よりなり、式（Ｉ）の化合物に
対して１：５ｘ１０3 ないし１：５ｘ１０５のモル比で
ある請求項１４記載の方法。 - 【請求項１６】 オリゴヌクレオチドの塩基配列を決定
する方法であって、個別の反応において、５’−エキソ
ヌクレアーゼ及び３’−エキソヌクレアーゼにより両末
端から選択的に該オリゴヌクレオチドを減成し、この減
成生成物を、（ａ）無機酸又は有機酸のアンモニウム塩
の少なくとも一つ、及び（ｂ）式（Ｉ）： 【化４】 （式中、Ｒは、炭素原子数１ないし１２の脂肪族炭化水
素基又は−Ｏ−原子で中断された炭素原子数２ないし１
２の脂肪族炭化水素基であり、そしてｎは１ないし５の
整数である）で示される化合物よりなる組成物に埋め込
み、ついでそれらをマトリックス援用レーザー脱離質量
分析により特性を明らかにすることを特徴とする方法。 - 【請求項１７】 オリゴヌクレオチドが、２ないし１０
０個のヌクレオシド残基よりなる請求項１６記載の方
法。 - 【請求項１８】 ５’−エキソヌクレアーゼとして子牛
脾臓リン酸ジエステラーゼ、及び３’−エキソヌクレア
ーゼとしてヘビ毒リン酸ジエステラーゼを用いる請求項
１６記載の方法。 - 【請求項１９】 分子イオンの形態でそれに含まれる高
分子量化合物のレーザー脱離のための、請求項１ないし
１１の何れか１項記載の組成物の用途。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH59193 | 1993-02-26 | ||
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