DE3382782T2 - Markierte modifizierte Nukleotide und Polynukleotide und Verfahren zu deren Herstellung, Verwendung und Detektion. - Google Patents

Markierte modifizierte Nukleotide und Polynukleotide und Verfahren zu deren Herstellung, Verwendung und Detektion.

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DE3382782T2
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Description

  • Die Herstellung von Nucleotiden und Polynucleotiden, die radioaktiv markiert sind, z.B. mit Isotopen oder Wasserstoff (³H), Phosphor (³²P), Kohlenstoff (¹&sup4;C) oder Iod (¹²&sup5;I), ist bekannt. Solche radioaktiv markierten Verbindungen sind nützlich, um Nucleinsäuren und andere Moleküle von wissenschaftlichem oder klinischem Interesse nachzuweisen, zu überwachen, zu lokalisieren und zu isolieren. Unglücklicherweise jedoch birgt die Verwendung von radioaktiv markierten Substanzen wegen der Strahlung Risiken. Auch wegen der verhältnismäßig kurzen Halbwertszeit der radioaktiven Substanzen, die zur Markierung solcher Verbindungen oder Substanzen eingesetzt werden, weisen die so erhaltenen markierten Verbindungen oder Substanzen eine entsprechende verhältnismäßig kurze Haltbarkeit auf.
  • Es wurde vorgeschlagen, Verbindungen von Interesse, wie Nucleotide und Polynucleotide, chemisch zu markieren, so daß die Risiken und Schwierigkeiten überwunden oder vermieden werden, die mit der radioaktiven Markierung solcher Verbindungen oder Substanzen verbunden sind. In dem Artikel von P.R. Langer, A.A. Waldrop und D.C. Ward, mit dem Titel "Enzymatic Synthesis of Biotin-Labeled Polynucleotides: Novel Nucleic Acid Affinity Probes", in Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Bd. 78, Nr. 11 (November 1981), 6633-6637, werden Analoge von dUTP und UTP beschrieben, die ein Biotin-Molekül enthalten, das über eine Alkylamin-Brücke an die C&sup5;-Position des Pyrimidinrings gebunden ist. Biotin-markierte Nucleotide sind in vitro für eine Vielzahl von DNA- und RNA-Polymerasen wirksame Substrate. Polynucleotide, die einen geringen Grad an Biotin- Substitution aufweisen (50 Moleküle oder weniger pro Kilobase), weisen ähnliche Denaturierungs-, Reassoziations- und Hybridisierungseigenschaften auf wie unsubstituierte Kontrollen. Biotin-markierte Polynucleotide, sowohl einzel- als auch doppelsträngig, werden selektiv und quantitativ auf Avidin- Sepharose zurückgehalten, sogar nach gründlichem Waschen mit 8 M Harnstoff, 6 M Guanidinhydrochlorid oder 99%igem Formamid. Ergänzend hierzu können Biotin-markierte Nucleotide in Gegenwart eines Antibiotin-Antikörpers und Protein A von Staphylococcus aureus immunpräzipitiert werden. Diese einzigartigen Merkmale Biotin-markierter Polynucleotide legen nahe, daß sie nützliche Affinitätssonden zum Nachweis und zur Isolierung von spezifischen DNA- und RNA-Sequenzen sind.
  • Der Gegenstand des Artikels ist in der EP-A2-0063879 umfaßt, in der zusätzlich offenbart ist, daß die Verbindungen die Struktur aufweisen:
  • in der B eine Purin-, Deazapurin- oder Pyrimidineinheit darstellt, die kovalent an die C1'-Position der Zuckereinheit gebunden ist, mit der Maßgabe, daß, wenn B ein Purin oder 7-Deazapurin ist, diese an die N&sup9;-Position des Purins oder Deazapurins gebunden ist, und wenn B ein Pyrimidin ist, es an die N¹-Position gebunden ist;
  • in der A eine Einheit darstellt, die aus mindestens drei Kohlenstoffatomen besteht, die einen nachweisbaren Komplex mit einem Polypeptid bilden können, wenn die Verbindung in eine doppelsträngige Ribonucleinsäure, einen Desoxyribonucleinsäureduplex oder ein DNA-RNA-Hybrid eingebaut ist;
  • in der die gestrichelte Linie eine chemische Bindung darstellt, die B und A miteinander verbindet, mit der Maßgabe, daß, wenn B ein Purin ist, die Bindung an der 8-Position des Purins erfolgt, wenn B ein 7-Deazapurin ist, die Bindung an der 7-Position des Deazapurins erfolgt, und wenn B ein Pyrimidin ist, die Bindung an der 5-Position des Pyrimidins erfolgt; und
  • in der x, y und z jeweils
  • darstellen, entweder direkt, oder wenn in Oligo- und Polynucleotide eingebaut, Sonden bereitstellen, die vielseitig verwendbar sind.
  • Die in der EP-A2-0063879 offenbarten Anwendungen umfassen den Nachweis und die Lokalisierung von Polynucleotidsequenzen in Chromosomen, fixierten Zellen, Gewebeschnitten und Zellextrakten. Spezifische Anwendungen umfassen die chromosomale Karyotypisierung, klinische Diagnose von Nucleinsäureenthaltenden Krankheitserregern, z.B. Bakterien, Viren oder Pilze, und die Diagnose von genetisciien Störungen.
  • Ergänzend zur Verwendung der Biotin-Polynucleotide des vorstehend aufgeführten Artikels von Langer et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), beschreibt die Veröffentlichung von P.R. Langer-Safer, M. Levine und D.C. Ward in Genetics, mit dem Titel "An Immunological Method for Mapping Genes on Drosophila Polytene Chromosomes" ein Verfahren, das biotinierte Nucleotide als eine Sonde zur Lokalisierung von DNA-Sequenzen einsetzt, die in situ an Polytänchromosomen von Drosophila hybridisieren. Bei dieser Anwendung werden diese Sonden unter Verwendung eines Affinität-gereinigten Kaninchen-Antibiotin- Antikörpers als Primärantikörper und eines Fluorescein-markierten Ziegen-Antikaninchen-Antikörpers als Sekundärantikörper nachgewiesen.
  • Andere Techniken, in denen Biotin-markierte Reagenzien mit Avidin oder Enzym-markierten Avidin-Reagenzien verwendet werden, sind für den Nachweis und die Bestimmung von Liganden in einem Flüssigmedium bekannt, vgl. US-Patent 4,228,237. Es ist auch eine wirksame Genanreicherung basierend auf Avidin- Biotin-Wechselwirkungen bekannt, insbesondere wie sie bei ribosomalen RNA-Genen von Drosophila angewendet wird, vgl. die Veröffentlichung von J. Manning, M. Pellegrini und N. Davidson in Biochemistry, Bd. 16, Nr. 7 (1977), 1364-1369. Andere Veröffentlichungen, die in Hinsicht auf die erfindungsgemäßen Verfahren einen interessanten Hintergrund bieten, umfassen den Artikel von D.J. Eckermann und R.H. Symons mit dem Titel "Sequence at the Site of Attachment of an Affinity-Label Derivate of Puromycin on 23-S Ribosomal RNA of Escherichia coli Ribosomes", J. Biochem 82 (1978), 225-234; den Artikel von S.B. Zimmermann, S.R. Kornberg und A. Kornberg mit dem Titel "Glucosylation of Deoxyribonucleic Acid-II-Glucosyl Transferases from T2- und T6-Infected Escherichia coli", in The Journal of Biological Chemistry, Bd. 237, Nr. 2, Februar 1962, und der Artikel von J. Josse und A. Kornberg "III. α- and β-Glucosyl Transferases from T4-Infected Escherichia coli", ebenfalls erschienen in The Journal of Biological Chemistry, Bd. 237, Nr. 6, Juni 1962.
  • Von weiterem Interesse in Verbindung mit den erfindungsgemäßen Verfahren sind die in J. Biol. Chem., Bd. 236, Nr. 5, Mai 1961, 1487-1493; gleiche Zeitschrift, Bd. 237, Nr. 4 (1962), 1251-1259; gleiche Zeitschrift, Bd. 239, Nr. 9 (1964), 2957-2963, erschienenen Veröffentlichungen. Von besonderem Interesse ist der in The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, Bd. 27, Nr. 8 (1979), 1131-1139, und in Nucleic Acids Research, Bd. 5, Nr. 9 (1977), 2961-2973, erschienene Artikel. Ebenfalls von Interesse ist der in Biochimica et Biophysica Acta erschienene Artikel von A. De Waard, mit dem Titel "Specificity Difference Between the Hydroxymethylcytosine β-Glucosyl-Transferases Induced by Bacteriophages T2, T4 und T6", 286-304, und auch der Artikel von T.W. North und C.K. Mathews, mit dem Titel "T4 Phage-Coded Deoxycytidylate Hydroxymethylase: Purification and Studies in Intermolecular Interactions", veröffentlicht durch Academic Press, 1977, 898- 904, und der Artikel von E.A. Bayer und M. Wilchek, mit dem Titel "The Use of Avidin-Biotin Complex as a Tool in Molecular Biology" in Methods of Biochemical Analysis, Bd. 26 (1980), 1- 45.
  • Andere für die erfindungsgemäßen Verfahren nützliche Techniken umfassen eine Nicktranslation der DNA durch eine DNA-Polymerase. Eine Technik zur wirksamen Nicktranslation wird in dem Artikel von P.W. Rigby, M. Dieckmann, C. Rhodes und P. Berg, mit dem Titel "Labeling Deoxyribonucleic Acid to High Specific Activity in vitro by Nick Translation with DNA Polymerase", in J. Mol. Biol. 113 (1977), 237-251, offenbart. Im Hinblick auf die Gewinnung von Streptavidin, z.B. aus einer Kulturbrühe von Streptomyces avidinii, offenbart der Artikel von K. Hofmann, S.W. Wood, C.C. Brinton, J.A. Montibeller und F.M. Finn, mit dem Titel "Iminobiotin Affinity Columns and their Application to Retrieval of Streptavidin", in Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Bd. in (1980), Nr. 8, 4666-4668, ein geeignetes Verfahren zur Gewinnung von Streptavidin aus einem Streptavidin enthaltenden Material, z.B. aus einer Kulturbrühe. Streptavidin ist in einem der erfindungsgemäßen Verahren als ein Reagenz nützlich.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleotide, die modifiziert wurden, z.B. an der 5-Position des Pyrimidins oder der 7-Position des Purins, und die Vorbereitung für die Herstellung von Nucleotidsonden daraus, die zur Bindung an oder zum Einbau in die DNA oder ein anderes Nucleinsäurematerial geeignet sind. In den erfindungsgemäßen Verfahren werden Nucleotide, d.h. Nucleinsäuren, vorzugsweise in einer nichtdisruptiven Weise modifiziert, so daß die erhaltenen modifizierten Nucleotide in Nucleinsäuren eingebaut werden können, und die einmal in Nucleinsäuren eingebauten modifizierten Nucleotide die Bildung oder Stabilisierung der von den erhaltenen Nucleinsäuren, die die modifizierten Nucleotide enthalten, gebildeten Doppelhelix nur in geringem Maße stören. Die nicht-disruptive Modifikation von Nucleotiden und Nucleinsäuren, in die solche modifizierten Nucleotide einbaut sind, steht im Gegensatz zu solchen Nucleotidmodifikationen, die als eine disruptive Modifikation gekennzeichnet sind, da die erhaltenen disruptiv modifizierten Nucleotide und die diese enthaltenden Nucleinsäuren die richtige Doppelhelixbildung blockieren. In den erfindungsgemäßen Verfahren werden die Nucleotide bevorzugt an der 5-Position des Pyrimidins oder der 7-Position des Purins modifiziert. Die so modifizierten Nucleotide sind nicht-disruptiv modifiziert und Nucleinsäuren, die solche Nucleotide enthalten, können eine Doppelhelix-Anordnung bilden. Erfindungsgemäß werden die Nucleotide auch in den disruptiven Positionen modifiziert, wie in der nun folgenden Beschreibung dargelegt wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Nucleotid, an das kovalent eine Einheit gebunden ist, die mit einem Ion ein Chelat bilden kann, wobei das Nucleotid ausgewählt wird aus:
  • (i) ein Nucleotid mit der Formel
    • P-S-B-Sig
  • wobei P eine Phosphateinheit, S eine Zuckereinheit, B eine Pyrimidin-, Purin- oder 7-Deazapurineinheit ist, Sig eine Einheit umfaßt, die mit einem nachweisbaren Ion ein Chelat bilden kann, P an die 3'- oder 5'-Position von S gebunden ist, wenn das Nucleotid ein Desoxyribonucleotid ist, und an die 2'-, 3'- oder 5'-Position, wenn das Nucleotid ein Ribonucleotid ist, B über die N¹-Position an die 1'-Position von S gebunden ist, wenn B ein Pyrimidin ist, oder über die N&sup9;-Position, wenn B ein Purin oder ein 7-Deazapurin ist, und Sig direkt oder indirekt an B an eine Position gebunden ist, die nicht die C&sup5;-Position ist, wenn B ein Pyrimidin ist, die nicht die C&sup8;-Position ist, wenn B ein Purin ist, und die nicht die C&sup7;-Position ist, wenn B ein 7-Deazapurin ist;
  • (ii) ein Ribonucleotid mit der Formel
  • P - - B
  • wobei P ein Phosphateinheit, S eine Zuckereinheit, B eine Pyrimidin-, Purin- oder 7-Deazapurineinheit ist und Sig eine Einheit umfaßt, die mit einem nachweisbaren Ion ein Chelat bilden kann, P an die 2'-, 3'- oder 5'-Position von S gebunden ist, B über die N¹-Position an die 1'-Position von S gebunden ist, wenn B ein Pyrimidin ist, oder über die N&sup9;-Position, wenn B ein Purin oder 7-Deazapurin ist; und Sig direkt oder indirekt an S gebunden ist; und
  • (iii) ein Nucleotid mit der Formel
  • S - B
  • wobei P eine Phosphateinheit, S eine Zuckereinheit, B eine Pyrimidin-, Purin- oder 7-Deazapurineinheit ist, Sig eine Einheit umfaßt, die mit einem nachweisbaren Ion ein Chelat bilden kann, P an die 3'- oder die 5'-Position von S gebunden ist, wenn das Nucleotid ein Desoxyribonucleotid ist, und an die 2'-, 3'- oder 5'-Position, wenn das Nucleotid ein Ribonucleotid ist, B über die N¹-Position an die 1'-Position von S gebunden ist, wenn B ein Pyrimidin ist, oder über die N&sup9;-Position, wenn B ein Purin ist, und Sig direkt oder indirekt an P gebunden ist.
  • Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in der folgenden Aufzählung erläutert.
  • 1. Nucleotid mit der allgemeinen Formel P-S-B-Sig, wobei P die Phosphorsäureeinheit, S die Zucker- oder Monosaccharideinheit, B die Baseneinheit ist, die Phosphorsäureeinheit an die 3'- und/oder die 5'-Position der Zuckereinheit gebunden ist, wenn das Nucleotid ein Desoxyribonucleotid ist, und an die 2'-, 3'- und/oder 5'-Position, wenn das Nucleotid ein Ribonucleotid ist, die Base ein Purin oder Pyrimidin ist, die Base über die N¹-Position oder die N&sup9;-Position an die 1'-Position der Zuckereinheit gebunden ist, wenn die Base ein Pyrimidin oder Purin ist, und Sig eine Einheit umfaßt, die mit einem nachweisbaren Ion ein Chelat bilden kann.
  • 2. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei das Nucleotid ein Desoxyribonucleotid ist.
  • 3. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei das Nucleotid ein Ribonucleotid ist.
  • 4. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei die chemische Einheit Sig chemisch an die N&sup7;-Position von B gebunden ist, wenn B ein 7-Deazapurin ist, an die C&sup5;-Position, wenn B ein Pyrimidin ist, und an die C&sup8;-Position, wenn B ein Purin ist.
  • 5. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei Sig so an eine Position von B gebunden ist, daß ein dieses Nucleotid enthaltendes Oligonucleotid oder Polynucleotid eine doppelsträngige Ribonucleinsäure, eine doppelsträngige Desoxyribonucleinsäure oder ein DNA-RNA-Hybrid bilden kann, oder wenn das Nucleotid in das Oligonucleotid oder Polypeptid eingebaut ist.
  • 6. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei Sig so an eine Position von B gebunden ist, daß das Nucleotid eingebaut werden kann oder eine doppelsträngige Ribonucleinsäure, eine doppelsträngige Desoxyribonucleinsäure oder ein doppelsträngiges Desoxyribonucleinsäure-Ribonucleinsäure-Hybrid bilden kann.
  • 7. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei Sig so an eine Position von B gebunden ist, daß, wenn das Nucleotid in eine doppelsträngige Desoxyribonucleinsäure oder doppelsträngige Ribonucleinsäure oder ein DNA-RNA-Hybrid eingebaut oder daran gebunden oder damit verbunden ist, die chemische Einheit Sig selbst ein Signal aus senden kann oder sich selbst nachweisen kann oder ihre Anwesenheit bekannt machen kann.
  • 8. Oligonucleotid oder Polydesoxyribonucleotid, uuifassend ein oder mehrere Nucleotide gemäß Punkt 1.
  • 9. Oligonucleotid oder Polyribonucleotid, umfassend ein oder mehrere Nucleotide gemäß Punkt 1.
  • 10. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei Sig an die Base B an die C&sup5;- Position gebunden ist, wenn die Base B ein Pyrimidin ist, oder an die C&sup7;-Position, wenn die Base B ein Deazapurin ist.
  • 11. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei die Base B ein Pyrimidin ist und die chemische Einheit Sig an das Pyrimidin an die N³-Position gebunden ist.
  • 12. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei die Base B ein Pyrimidin ist und die chemische Einheit Sig an das Pyrimidin an die C&sup5;-Position gebunden ist.
  • 13. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei die Base B ein Pyrimidin ist und die chemische Einheit Sig an das Pyrimidin an die C&sup6;-Position gebunden ist.
  • 14. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei die Base B ein Purin ist und die chemische Einheit Sig an das Purin an die N¹-Position gebunden ist.
  • 15. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei die Base B ein Purin ist und die chemische Einheit Sig an das Purin an die C²-Position gebunden ist.
  • 16. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei die Base B ein Purin ist und die chemische Einheit Sig an das Purin an die N³-Position gebunden ist.
  • 17. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei die Base B ein Purin ist und die chemische Einheit Sig an das Purin an die N&sup7;-Position gebunden ist.
  • 18. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei die Base B ein Purin ist und die chemische Einheit Sig an das Purin an die C&sup8;-Position gebunden ist.
  • 19. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei der Zucker S eine Pentose ist.
  • 20. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei die Base B ein 7-Deazapurin ist und die chemische Einheit Sig an das 7-Deazapurin an die Ca-Position gebunden ist.
  • 21. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei die chemische Einheit Sig ein radioaktives Isotop einschließt oder umfaßt.
  • 22. Nucleotid gemäß Punkt 21, wobei das radioaktive Isotop radioaktives Kobalt ist.
  • 23. Einzelsträngiges Polynucleotid, umfassend ein oder mehrere Nucleotide gemäß Punkt 1.
  • 24. Einzelsträngiges Polynucleotid gemäß Punkt 23, wobei das einzel strängige Polynucleot id ein Polydesoxyribonucleotid ist.
  • 25. Einzelsträngiges Polynucleotid gemäß Punkt 23, wobei das einzelsträngige Polynucleotid ein Polyribonucleotid ist.
  • 26. Doppelsträngiges Polynucleotid, umfassend ein oder mehrere Nucleotide gemäß Punkt 1.
  • 27. Doppelsträngiges Polynucleotid gemäß Punkt 26, wobei das doppelsträngige Polynucleotid eine doppelsträngige Desoxyribonucleinsäure ist.
  • 28. Doppelsträngiges Polynucleotid gemäß Punkt 26, wobei das doppelsträngige Polynucleotid eine doppelsträngige Ribonucleinsäure ist.
  • 29. Doppelsträngiges Polynucleotid gemäß Punkt 26, wobei das doppelsträngige Polynucleotid ein doppelsträngiges Desoxyribonucleinsäure-Ribonucleinsäure-Hybrid ist.
  • 30. Einzelsträngiges Polynucleotid, umfassend mindestens 12 Nucleotide, wobei mindestens eines dieser Nucleotide ein Nucleotid gemäß Punkt 1 ist.
  • 31. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei die Base B Cytosin ist.
  • 32. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei die Base B Uracil ist.
  • 33. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei die Base B Thymin ist.
  • 34. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei die Base B Adenin ist.
  • 35. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei die Base B Guanin ist.
  • 36. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei die Base B 2-Methyladenin ist.
  • 37. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei die Base B 1-Methylguanin ist.
  • 38. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei die Base B 5-Methylcytosin ist.
  • 39. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei die Base B 5-Hydroxymethylcytosin ist.
  • 40. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei die chemische Einheit Sig einen Chelatbildner umfaßt.
  • 41. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei die Base B Deazaadenin ist.
  • 42. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei die Base B Deazaguanin ist.
  • 43. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei die chemische Einheit Sig über eine chemische Bindung an die Base B gebunden ist.
  • 44. Nucleotid gemäß Punkt 43, wobei die chemische Bindung eine olefinische Bindung an der α-Position relativ zur Base B umfaßt.
  • 45. Nucleotid gemäß Punkt 43, wobei die chemische Bindung die Einheit -CH&sub2;-NH- umfaßt.
  • 46. Nucleotid gemäß Punkt 43, wobei die chemische Bindung -CH=CH-CH&sub2;-NH- ist.
  • 47. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei die chemische Einheit -CH=CH-CH&sub2;-O-CH&sub2;- -CH&sub2;-NH- ist.
  • 48. Nucleotid gemäß Punkt 46, wobei die chemische Einheit Sig an die -NH-Gruppe der chemischen Bindung gebunden ist.
  • 49. Ribonucleotid der allgemeinen Formel
  • P - B
  • wobei P eine Phosphateinheit, S eine Zuckereinheit, B eine Pyrimidin-, Purin- oder 7-Deazapurineinheit ist, und Sig eine Einheit umfaßt, die mit einem nachweisbaren Ion ein Chelat bilden kann, P an die 2'-, 3'- oder 5'-Position von S gebunden ist, B über die N¹-Position an die 1'-Position von S gebunden ist, wenn B ein Pyrimidin ist, oder über die N&sup9;-Position, wenn B ein Purin oder 7-Deazapurin ist, und Sig direkt oder indirekt an S gebunden ist.
  • 50. Ribonucleotid gemäß Punkt 49, wobei die chemische Einheit Sig an die C2'-Position der Zuckereinheit gebunden ist.
  • 51. Ribonucleotid gemäß Punkt 49, wobei die chemische Einheit Sig an die C3'-Position der Zuckereinheit gebunden ist.
  • 52. Ribonucleotid gemäß Punkt 49, wobei die chemische Einheit Sig an die Zuckereinheit S gebunden ist, so daß ein Oligoribonucleotid oder Polyribonucleotid, das dieses Ribonucleotid enthält, eine doppelsträngige Ribonucleinsäure oder ein DNA-RNA-Hybrid bilden kann, wenn das Ribonucleotid in das Gligonucleotid oder Polynucleotid eingebaut ist.
  • 53. Polyribonucleotid, umfassend mindestens ein Ribonucleotid gemäß Punkt 49.
  • 54. Ribonucleotid gemäß Punkt 1, wobei die Base B ein Pyrimidin ist.
  • 55. Ribonucleotid gemäß Punkt 49, wobei die Base B ein Purin ist.
  • 56. Ribonucleotid gemäß Punkt 49, wobei die Base B Uracil ist.
  • 57. Ribonucleotid gemäß Punkt 49, wobei die Base B Adenin ist.
  • 58. Ribonucleotid gemäß Punkt 49, wobei die Base B Guanin ist.
  • 59. Ribonucleotid gemäß Punkt 49, wobei die Base B Cytosin ist.
  • 60. Ribonucleotid gemäß Punkt 49, wobei die Base B ein 7-Deazapurin ist.
  • 61. Ribonucleotid gemäß Punkt 49, wobei die chemische Einheit Sig eine radioaktive Isotopenkomponente einschließt oder umfaßt.
  • 62. Ribonucleotid gemäß Punkt 61, wobei die radioaktive Isotopenkomponente radioaktives Kobalt ist.
  • 63. Einzelsträngiges Polyribonucleotid, umfassend ein oder mehrere Ribonucleotide gemäß Punkt 49, wobei das einzelsträngige Polyribonucleotid mindestens drei Ribonucleotide umfaßt.
  • 64. Einzelsträngiges Polyribonucleotid, umfassend mindestens zwölf Ribonucleotide, davon mindestens ein Ribonucleotid gemäß Punkt 49.
  • 65. Nucleotid der allgemeinen Formel
  • - S - B
  • wobei P eine Phosphateinheit, S eine Zuckereinheit, B eine Pyrimidin-, Purin- oder 7-Deazapurineinheit ist, Sig eine Einheit umfaßt, die mit einem nachweisbaren Ion ein Chelat bilden kann, P an die 3'- oder die 5'-Position von S gebunden ist, wenn das Nucleotid ein Desoxyribonucleotid ist, und an die 2'-, 3'- oder 5'-Position, wenn das Nucleotid ein Ribonucleotid ist, B über die N¹-Position an die 1'-Position von S gebunden ist, wenn B ein Pyrimidin ist, oder über die N&sup9;-Position, wenn B ein Purin ist, und Sig direkt oder indirekt an P gebunden ist.
  • 66. Nucleotid gemäß einem der vorstehenden Punkte, wobei der Chelatbildner die chemische Einheit
  • umfaßt, wobei M ein Wasserstoffatom oder ein substituierbares Metall ist.
  • 67. Nucleotid gemäß Punkt 6, wobei das Metall Magnesium ist oder ein Metall, das durch Kobalt ersetzbar ist.
  • 68. Polynucleotid, das ein oder mehrere Nucleotide gemäß Punkt 1 oder Punkt 49 oder Punkt 65 enthält, wobei die chemische Einheit Sig einen Chelatbildner umfaßt.
  • 69. Polynucleotid, das ein Nucleotid gemäß Punkt 1 oder Punkt 49 oder Punkt 65 enthält, wobei die chemische Einheit Sig einen Chelatbildner gemäß Punkt 66 umfaßt.
  • 70. Nucleotid gemäß Punkt 66, wobei das Metall ein katalytisch aktives Metall ist.
  • 71. Nucleotid gemäß Punkt 66, wobei das Metall ein Schwermetall ist.
  • 72. Nucleotid gemäß Punkt 66, wobei das Metall radioaktives Kobalt ist.
  • 73. Nucleotid gemäß Punkt 66, wobei das Metall Magnesium ist.
  • 74. Ribonucleotid gemäß Punkt 1 oder Punkt 49 oder Punkt 65, wobei die chemische Einheit Sig einen Chelatbildner umfaßt.
  • 75. Desoxyribonucleotid gemäß Punkt 1 oder Punkt 49 oder Punkt 65, wobei die chemische Einheit Sig einen Chelatbildner umfaßt.
  • 76. Nucleotid gemäß Punkt 66, wobei das Metall M ein radioaktives Isotop ist.
  • 77. Nucleotid gemäß Punkt 66, wobei das Metall Platin ist.
  • 78. Nucleotid gemäß Punkt 66, wobei M ein Wasserstoffatom oder ein substituierbares Metall oder eine radioaktives Element ist.
  • 79. Die Verbindung
  • wobei M ein Wasserstoffatom oder ein Metall ist.
  • 80. Die Verbindung
  • wobei M ein Wasserstoffatom oder ein Metall ist.
  • 81. Verbindung gemäß Punkt 80, wobei das Nucleotid ein Desoxyribonucleotid ist.
  • 82. Verbindung gemäß Punkt 80, wobei das Nucleotid ein Ribonucleotid ist.
  • 83. Die Verbindung
  • wobei M ein Wasserstoffatom oder ein Metall ist.
  • 84. Nucleotid gemäß den Punkten 1, 49 oder 65, wobei die chemische Einheit Sig die chemische Einheit
  • umfaßt.
  • 85. Polynucleotid, das ein oder mehrere Nucleotide gemäß Punkt 84 enthält.
  • 86. Polynucleotid gemäß Punkt 85, wobei das Polynucleotid ein einzelsträngiges Desoxyribonucleotid oder ein einzelsträngiges Ribonucleotid oder eine doppelsträngige DNA, RNA oder ein DNA-RNA-Hybrid ist.
  • 87. Nucleotid gemäß Punkt 1, wobei die Sig-Komponente einen radioaktiven Bestandteil umfaßt.
  • 88. Einzelsträngiges Polynucleotid, umfassend ein oder mehrere Nucleotide gemäß Punkt 1, wobei die Sig-Komponente radioaktiv ist.
  • 89. Doppelsträngiges Polynucleotid, umfassend ein oder mehrere Nucleotide gemäß Punkt 1, wobei die Sig-Komponente radioaktiv ist.
  • 90. Nucleotid gemäß Punkt 49, wobei die Sig-Komponente eine radioaktive Einheit umfaßt.
  • 91. Polynucleotid, umfassend ein Ribonucleotid gemäß Punkt 49, wobei die Sig-Einheit radioaktiv markiert ist.
  • 92. Nucleotid gemäß Punkt 65, wobei die Sig-Einheit radioaktiv markiert ist.
  • 93. Polynucleotid, umfassend ein oder mehrere Nucleotide gemäß Punkt 65, wobei die Sig-Einheit radioaktiv markiert ist.
  • Von besonderer Wichtigkeit und Bedeutung bei den erfindungsgemäßen Verfahren ist die Verwendung von selbst ein Signal aussendenden oder selbst anzeigenden oder selbst nachweisenden Nucleinsäuren, insbesondere von solchen Nucleinsäuren, die in doppelsträngige DNA oder ähnliches eingebaut werden können. Solche selbst ein Signal aussendenden oder selbst nachweisenden Nucleinsäuren können durch kovalente Bindung eines Moleküls, das mit spezifischen Ionen, z.B. Schwermetallen, Seltenen Erden, etc., ein Chelat bilden kann, an einen Allylamin-Substituenten, der ein erfindungsgemäßes modifiziertes Nucleotid darstellt, erzeugt werden. Im allgemeinen kann das im Chelat gebundene Ion entweder (a) durch radioaktive Emission oder (b) durch die Verwendung des Ions zur Katalyse einer chromogenen oder fluorogenen Reaktion nachgewiesen werden.
  • Beispielsweise wird eine Lösung von 3,4-Dinitrophenol zu 3,4-Diaminocyclohexan reduziert.
  • Diese Substanz wird dann bromiert,
  • wobei 3,4-Diaminobromcyclohexan (dABCH) erzeugt wird. Diese Verbindung wird mit einer mit einem Halogenid (Cl, Br, I) substituierten Carboxymethyl-Verbindung umgesetzt, wobei ein Tetracarboxylmethylderivat oder dABCH (TCM-dABCH) hergestellt wird:
  • Das Brom wird durch eine Aminogruppe unter Verwendung von Iöslichem Ammoniak substituiert:
  • Diese Verbindung wird dann mit Chlorthiophosgen umgesetzt, wobei das Isothiocyanatderivat von (TCM-dANCH) hergestellt wird.
  • Schließlich wird diese Verbindung mit dem dUTP-Allylaminderivat umgesetzt, wobei das modifizierte dUTP hergestellt wird.
  • Kobalt- oder andere Schwermetallionen oder andere Seltene Erden-Ionen können nach dem vorstehenden Schritt 3 mit der Verbindung ein Chelat bilden. Oder die Nucleinsäure kann mit diesem Addukt substituiert und dann das Ion zugesetzt werden (zum Beispiel wird Kobalt bei ph 6 zugegeben, wo die Bindungskonstante 10&supmin;¹&sup9;M beträgt).
  • Kobalt kann durch Radioaktivität nachgewiesen werden. Es kann auch durch seine Fähigkeit nachgewiesen werden, in Gegenwart von molekularem Sauerstoff Methylenblau zur farblosen Form zu oxidieren. Es kann dazu verwendet werden, lösliche Sulfhydrylgruppen wieder in Gegenwart von molekularem Sauerstoff zu Disulfidbrücken zu oxidieren.
  • Diese Art eines selbst ein Signal aussendenden Moleküls kann dazu verwendet werden, jede Nucleinsäure-Hybridisierungsreaktion zu überwachen. Es ist insbesondere wichtig zur Nachweis von Nucleinsäuren in Gelen (zum Beispiel Sequenzierungsgele).
  • In Hinblick auf seine radioaktive Verwendung, kann es zur Herstellung des benötigten Isotops verwendet werden, d.h., wenn ein schwacher oder starker β- oder γ-Strahler benötigt wird, kann dieses Isotop mit einem Chelatbildner umgesetzt werden. Beispiele verwendbarer Isotope sind unmittelbar nachstehend aufgeführt.
  • Antimon-124
  • Antimon-125
  • Arsen-74
  • Barium-133
  • Barium-140
  • Beryllium-7
  • Wismut-206
  • Wismut-207
  • Cadmium-109
  • Cadmium-115m
  • Calcium-15
  • Kohlenstoff-14
  • Cerium-139
  • Cerium-141
  • Cerium-144
  • Cäsium-134
  • Cäsium-137
  • Chlor-36
  • Chrom-51
  • Kobalt-56
  • Kobalt-57
  • Kobalt-58
  • Kobalt-60
  • Erbium-169
  • Europium-152
  • Gadolinium-153
  • Gold-195
  • Gold-199
  • Hafnium-175
  • Hafnium-175 + 181
  • Hafnium-181
  • Wasserstoff-3, vgl.
  • Tritium
  • Iod-125
  • Iod-131
  • Iod-132
  • Iridium-192
  • Eisen-55
  • Eisen-59
  • Krypton-85
  • Blei-210
  • Lutecium-177
  • Mangan-54
  • Quecksilber-197
  • Quecksilber-203
  • Molybdän-99
  • Neodymium-147
  • Neptunium-237
  • Nickel-63
  • Niobium-95
  • Osmium-185+191
  • Palladium-103
  • Platin-195m
  • Praseodynium-143
  • Promethium-147
  • Protactinium-233
  • Radium-226
  • Rhenium-186
  • Rubidium-86
  • Ruthenium-103
  • Ruthenium-106
  • Scandium-44
  • Scandium-46
  • Selen-75
  • Silber-110m
  • Silber-111
  • Natrium-22
  • Strontium-85
  • Strontium-89
  • Strontium-90
  • Schwefel-35
  • Tantal-182
  • Technetium-99
  • Tellur-125m
  • Tellur-132
  • Terbium-160
  • Thallium-204
  • Thorium-228
  • Thorium-232
  • Thulium-170
  • Zinn-113
  • Titan-44
  • Tritium
  • Wolfram-185
  • Vanadium-48
  • Vanadium-49
  • Ytterbium-169
  • Yttrium-88
  • Yttrium-90
  • Yttrium-91
  • Zink-65
  • Zirkon-95
  • Ein anderer Gesichtspunkt der erfindungsgemäßen Verfahren, der insbesondere vorteilhaft ist, ist die Durchführung des Nachweises oder der Hybridisierung zwischen der gesuchten DNA, die nachgewiesen werden soll, und der DNA-Nachweisonde in der flüssigen Phase. In diesem Flüssigphasen-System sind das nachzuweisende DNA-Molekül und die geeignete DNA-Nachweissonde nicht an ein unlösliches Substrat oder eine unlösliche chemische Einheit gebunden. Die Vorteile des Flüssigphasen-Nachweissystems liegen in der Geschwindigkeit der Hybridisierung oder Hybridbildung zwischen der nachzuweisenden DNA und der dafür geeigneten DNA-Sonde. Beispielsweise ist in einem Fest- Flüssig-System der Zeitraum, der für eine wirksame Erkennung und eine Hybridisierungsbildung benötigt wird, etwa zehnmal größer, als wenn dies in einem vollständigen Flüssig-System durchgeführt wird, d.h. die nachzuweisende DNA und die Nachweis-DNA sind nicht an eine unlösliche Einheit gebunden.
  • Die Sonden, die gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, sind für die Verwendung beim Nachweis von Viren und Bakterien in Flüssigkeiten, wie vorstehend angedeutet, adaptierbar. Wenn die zu untersuchenden Flüssigkeiten keine großen Proteinmengen enthalten, können die Viren darin durch Absorption an Hydroxyapatit konzentriert und in einer kleinen Menge Phosphatpuffer eluiert werden. Enthält die zu untersuchende Flüssigkeit große Proteinmengen, können die Viren durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation konzentriert werden. Wenn Antikörper verfügbar sind, ist eine Absorption an eine Affinitätssäule und eine Elution mit Säure vorzuziehen, da es möglich wäre, viele Sonden gemäß der erfindungsgemäßen Verfahren gleichzeitig einzusetzen. Die zu untersuchenden Bakterien werden üblicherweise leicht durch Zentrifugation konzentriert.
  • Erfindungsgemäß wird die Identifizierung oder Charakterisierung der isolierten Partikel, Viren und Bakterien durch Hybridisierung der charakterisierenden oder identifizierenden DNA dafür mit einer einzelsträngigen DNA-Sonde erfolgen, die erfindungsgemäß hergestellt wurde. Nach der Hybridisierung wird der Überschuß nicht-hybridisierter Sonden-DNA mit der S&sub1;-Nuclease und Exonuclease I aus E. coli bei einem hohen Salzgehalt gespalten, wobei die Einzelstrangbruchaktivität der S&sub1;-Nuclease unterdrückt wird, vgl. Vogt, Methods in Enzymology, Bd. 65 (1980), 248-255. Diese Nucleasebehandlung stellt aus der überschüssigen nicht-hybridisierten einzelsträngigen DNA-Sonde Mononucleotide her, läßt aber die doppelsträngige hybridisierte DNA intakt. Diese wird dann bei einem hohem Salzgehalt an einen Dowex-Anionenaustauscher absorbiert (bei einer hohen Salzkonzentration binden die Nucleotide und die geringe Menge der Oligonucleotide nicht an das Harz). Die so erhaltene hybridisierte DNA wird dann durch verschiedene, auf die erfindungsgemäßen Verfahren anwendbare, Verfahren identifiziert oder charakterisiert.
  • Die besonderen erfindungsgemäßen Nucleotide umfassen eine Phosphorsäureeinheit P, eine Zucker- oder Monosaccharideinheit S, eine Baseneinheit B, ein Purin oder Pyrimidin, und eine Signal aussendende chemische Einheit Sig, die daran kovalent gebunden ist, entweder an die P-, S- oder B-Einheit. Nachfolgend sind Strukturformeln verschiedener Baseneinheiten B und Nucleotide aufgeführt, die gemäß der erfindungsgemäßen Verfahren modifiziert wurden. Die wichtigsten Purine Adenin (6 -Aminopurin) Guanin (2-Amino-6-oxypurin) Zwei weitere Purine 2-Methyladenin 1-Methylguanin Die wichtigsten Pyrimidine Cytosin (2-Oxy-4-Aminopyrimidin) Uracil (2, 4-Dioxypyrimidin) Thymin (5-Methyl-2,4-dioxypyrimidin) Zwei weitere Pyrimidine 5-Methylcytosin 5-Hydroxymethylcytosin PYRIMIDIN PURIN
  • Die wichtigsten Ribonucleotide und Desoxyribonucleotide Ribonucleosid-5'-monophosphate 2'-Desoxyribonucleosid-5'-monophosphate Base Allgemeine Struktur Allgemeine Struktur Bezeichnungen Adenosin-5'-phosphorsäure (Adenylsäure, AMP) Guanosin-5'-phosphorsäure (Guanylsäure, GMP) Cytidin-5'-phosphorsäure (Cytidylsäure, CMP) Uridin-5'-phosphorsäure (Uridylsäure, UMP) Desoxyadenosin-5'-phosphorsäure (Desoxyadenylsäure, dAMP) Desoxyadenosin-5'-phosphorsäure (Desoxyadenylsäure, dGMP) Desoxyadenosin-5'-phosphorsäure (Desoxyadenylsäure, dCMP) Desoxyadenosin-5'-phosphorsäure (Desoxyadenylsäure, dTMP)
  • Die besonderen erfindungsgemäßen Nucleotide, wie vorstehend aufgeführt, umfassen zusätzlich zu den P-, S- und B-Einheiten eine chemische Einheit Sig, die kovalent an die P-, S- und/oder B-Einheiten gebunden ist. Erfindungsgemäß von besonderem Interesse sind solche Nucleotide, die die allgemeine Formel
  • P-S-B-Sig
  • aufweisen, wobei P die Phosphorsäureeinheit, einschließlich Mono-, Di-, Tri- oder Tetraphosphat, S die Zuckermonosaccharideinheit und B die Baseneinheit ist, entweder ein Purin oder ein Pyrimidin. Die Phosphorsäureeinheit P ist kovalent an die 3'- und/oder 5'-Position der S-Einheit gebunden, wenn das Nucleotid ein Desoxyribonucleotid ist, und an die 2'-, 3'- und/oder 5'-Position, wenn das Nucleotid ein Ribonucleotid ist. Die Baseneinheit B ist über die N¹-Position oder die N&sup9;-Position an die 1'-Position der S-Einheit gebunden, wenn die Baseneinheit ein Pyrimidin oder Purin ist. Die Sig-Einheit ist kovalent an die B-Einheit des Nucleotids gebunden, und wenn sie so gebunden ist, kann sie selbst Signale aussendenoder ihren eigenen Nachweis selbst durchführen oder ihre Gegenwart bekannt machen. Wünschenswerterweise oder vorzugsweise erlaubt sie den Einbau des erhaltenen Nucleotids P-S-B-Sig in oder die Bildung einer doppelsträngigen helikalen DNA oder RNA oder eines DNA-RNA-Hybrids und/oder den Nachweis darin.
  • Ein anderes besonderes erfindungsgemäßes Nucleotid ist gekennzeichnet durch die allgemeine Formel:
    • P - - B
  • Solche erfindungsgemäßen Nucleotide werden als Ribonucleotide charakterisiert. Die Phosphorsäureeinheit ist an die 2'-, 3'- und/oder 5'-Position der Zuckereinheit S gebunden, und die Base B ist über die N¹-Position oder die N&sup9;-Position an die 1'-Position der Zuckereinheit S gebunden, wenn die Base ein Pyrimidin oder Purin ist. Die chemische Einheit Sig ist kovalent an die Zuckereinheit S gebunden, und die chemische Einheit Sig kann, wenn sie an die S-Einheit gebunden ist, selbst Signale aussenden oder ihren eigenen Nachweis selbst durchführen oder ihre Gegenwart bekannt machen. Sie erlaubt insbesondere den Einbau des Ribonucleotids in seine entsprechende doppelsträngige RNA oder ein DNA-RNA-Hybrid.
  • Solche Nucleotide P - - B haben bevorzugt die chemische Einheit Sig an die C2'-Position der S-Einheit oder an die C3'-Position der S-Einheit gebunden.
  • Ferner umfassen die Nucleotide gemäß der erfindungsgemäßen Verfahren Nucleotide mit der Formel:
  • - S - B
  • wobei P die Phosphorsäureeinheit, S die Zuckereinheit und B die Baseneinheit ist. In diesen besonderen Nucleotiden ist die P-Einheit an die 3'- und/oder die 5'-Position der S-Einheit gebunden, wenn das Nucleotid ein Desoxyribonucleotid ist, und an die 2'-, 3'- und/oder 5'-Position, wenn das Nucleotid ein Ribonucleotid ist. Die Base B ist entweder ein Purin oder ein Pyrimidin, und die B-Einheit ist über die N¹- oder die N&sup9;-Position an die 1'-Position der Zuckereinheit gebunden, wenn die B-Einheit ein Pyrimidin oder Purin ist. Die chemische Einheit Sig ist kovalent über die chemische Bindung
  • an die Phosphorsäureeinheit P gebunden. Sig kann, wenn es an die P-Einheit gebunden ist, selbst Signale aussenden oder seinen eigenen Nachweis selbst durchführen oder seine Gegenwart bekannt machen. Es ist erwünscht, daß das Nucleotid in ein doppelsträngiges Polynucleotid, wie DNA, RNA oder ein DNA-RNA- Hybrid, eingebaut werden kann, und daß es, wenn es darin eingebaut ist, es sich immer noch selbst nachweisen kann.
  • Es wird darauf hingewiesen, daß die beschriebenen oder vorstehend durch die allgemeine Formel P-S-B-Sig definierten besonderen erfindungsgemäßen Nucleotide auch Nucleotide umfassen, bei denen die chemische Einheit Sig kovalent an die B-Einheit an die N&sup6;- oder die Position der 6-Aminogruppe gebunden ist, wenn die B-Einheit Adenin ist, oder an die N²- oder die Position der 2-Aminogruppe, wenn die B-Einheit Guanin ist, oder an die N&sup4;- oder die Position der 4-Aminogruppe, wenn die B-Einheit Cytosin ist. Die so erhaltenen Nucleotide, die die daran gebundene Sig-Einheit enthalten, können selbst Signale aus senden oder ihren eigenen Nachweis selbst durchführen oder ihre Gegenwart bekannt machen, und sie sind als doppelsträngige DNA oder RNA oder als ein DNA-RNA-Hybrid nachweisbar.
  • Zusammenfassend, im Hinblick auf die vorstehend aufgeführten verschiedenen besonderen erfindungsgemäßen Nucleotide, umfassen die besonderen Nucleotide eine Phosphorsäureeinheit P, eine Zuckereinheit S und eine Baseneinheit B, ein Purin oder Pyrimidin, deren Kombination P-S-B im Hinblick auf Nucleotide gut bekannt ist und Nucleotide definiert, sowohl Desoxyribonucleotide als auch Ribonucleotide. Die Nucleotide werden dann erfindungsgemäß durch die kovalente Bindung einer chemischen Einheit Sig an die P-Einheit und/oder die S-Einheit und/oder die B-Einheit modifiziert. Die so an das Nucleotid P-S-B gebundene chemische Einheit Sig kann dem so erhaltenen Nucleotid, das nun P-S-B mit der Sig-Einheit gebunden an eine oder mehrere der anderen Einheiten umfaßt, die Eigenschaft verleihen, seinen eigenen Nachweis selbst durchzuführen oder selbst Signale auszusenden oder seine Gegenwart per se bekannt zu machen, wenn es in ein Polynucleotid, insbesondere ein doppelsträngiges Polynucleotid, wie eine doppelsträngige DNA, doppelsträngige RNA oder ein doppelsträngiges DNA-RNA-Hybrid, eingebaut wird. Die Sig-Einheit sollte vorzugsweise die Fähigkeit des Nucleotids nicht beeinträchtigen, ein doppelsträngiges Polynucleotid zu bilden, das das besondere Sig-enthaltende erfindungsgemäße Nucleotid enthält, und das Sig-enthaltende Nucleotid kann, wenn es so darin eingebaut ist, nachgewiesen, lokalisiert oder beobachtet werden.
  • Die Sig-Komponente der erfindungsgemäßen Nucleotide und die Nucleotide und Polynucleotide, in die die erfindungsgemäßen die Sig-Komponente enthaltenden Nucleotide eingebaut sind, sind äquivalent zu und sind für die gleichen Zwecke nützlich, wie die in der EP-A2-0063879 beschriebenen Nucleotide.
  • Insbesondere entspricht die in der EP-A2-0063879 beschriebene chemische Einheit A funktionell der Sig-Komponente oder der chemischen Einheit der besonderen erfindungsgemäßen Nucleotide. Demgemäß kann die Sig-Komponente oder die chemische Einheit der erfindungsgemäßen Nucleotide, wie in der EP-A2-0063879 beschrieben, direkt an die P-, S- oder B-Einheiten gebunden werden oder daran über eine chemische Bindung oder Brücke gebunden werden, wie durch die gestrichelte Linie, die B und A verbindet, der Nucleotide der EP-A2-0063879 angezeigt wird. Die verschiedenen in der EP-A2-0063879 identifizierten Brücken oder Bindungen sind bei der Herstellung der besonderen erfindungsgemäßen Nucleotide anwendbar und nützlich.
  • Ein besonders wichtiger und nützlicher Gesichtspunkt der besonderen erfindungsgemäßen Nucleotide ist die Verwendung solcher Nucleotide bei der Herstellung von DNA- oder RNA-Sonden. Solche Sonden enthalten eine Nucleotidsequenz, die im wesentlichen komplementär zu der DNA- oder RNA-Sequenz des zu lokalisierenden und/oder zu identifizierenden genetischen Materials ist. Die Sonde enthält ein oder mehrere der besonderen erfindungsgemäßen Nucleotide. Eine Sonde, die eine gewünschte Nucleotidsequenz aufweist, wie ein einzelsträngiges Polynucleotid, entweder eine DNA- oder RNA-Sonde, wird dann mit dem zu identifizierenden genetischen DNA- oder RNA-Material in Kontakt gebracht. Nach der Lokalisierung der Sonde und der Bildung eines doppelsträngigen Polynucleotids, das die Sonde und das zu identifizierende passende DNA- oder RNA-Material enthält, wird das erhaltene gebildete doppelsträngige DNA- oder RNA-enthaltende Material dann beobachtbar und identifiziert. Eine erfindungsgemäße Sonde kann im wesentlichen jede Anzahl von Nucleotideinheiten enthalten, die benötigt wird, von etwa 5 Nucleotiden bis zu etwa 500 oder mehr. Zwölf passende, vorzugsweise aufeinanderfolgende Nucleotideinheiten sind ausreichend, um eine Identifizierung des größten Teils des zu untersuchenden oder identifizierenden DNA- oder RNA- Materials zu bewirken, wenn die Sequenz aus 12 Nucleotiden der Sonde zu einer entsprechenden kooperativen Sequenz im zu untersuchenden oder zu identifizierenden DNA- oder RNA-Material paßt. Wie aufgeführt, können solche Sonden eine oder mehrere besondere Sig-enthaltende erfindungsgemäße Nucleotide enthalten, vorzugsweise mindestens ein besonderes Nucleotid pro 5-10 der Nucleotide in der Sonde.

Claims (20)

1. Nucleotid, an das kovalent eine Einheit gebunden ist, die mit einem Ion ein Chelat bilden kann.
2. Nucleotid nach Anspruch 1, das
(i) ein Nucleotid init der Formel
P-S-B-Sig
ist, wobei P eine Phosphateinheit, S eine Zuckereinheit, B eine Pyrimidin-, Purin- oder 7- Deazapurineinheit ist, Sig eine Einheit umfaßt, die mit einem nachweisbaren Ion ein Chelat bilden kann, P an die 3'- oder 5'-Position von S gebunden ist, wenn das Nucleotid ein Desoxyribonucleotid ist und an die 2'-, 3'- oder 5'-Position, wenn das Nucleotid ein Ribonucleotid ist, B über die N¹-Position an die 1'-Position von S gebunden ist, wenn B ein Pyrimidin ist und über die N&sup9;-Position, wenn B ein Purin oder ein 7-Deazapurin ist, und Sig direkt oder indirekt an B an eine Position gebunden ist, die nicht die C&sup5;-Position ist, wenn B ein Pyrimidin ist, die nicht die C&sup8;-Position ist, wenn B ein Purin ist, und die nicht die C&sup7;-Position ist, wenn B ein 7-Deazapurin ist;
(ii) ein Ribonucleotid mit der Formel
ist, wobei P eine Phosphateinheit, S eine Zuckereinheit, B eine Pyrimidin-, Purin- oder 7- Deazapurineinheit ist und Sig eine Einheit umfaßt, die mit einem nachweisbaren Ion ein Chelat bilden kann, P an die 2'-, 3'- oder 5'-Position von S gebunden ist, B über die N¹-Position an die 1'-Position von S gebunden ist, wenn B ein Pyrimidin ist, oder über die N&sup9;-Position, wenn B ein Purin oder 7-Deazapurin ist; und Sig direkt oder indirekt an S gebunden ist; oder
(iii) ein Nucleotid mit der Formel
ist, wobei P eine Phosphateinheit, S eine Zuckereinheit, B eine Pyrimidin-, Purin- oder 7- Deazapurineinheit ist, Sig eine Einheit umfaßt, die mit einem nachweisbaren Ion ein Chelat bilden kann, P an die 3'- oder die 5'-Position von S gebunden ist, wenn das Nucleotid ein Desoxyribonucleotid ist, und an die 2'-, 3'- oder 5'-Position, wenn das Nucleotid ein Ribonucleotid ist, B über die N¹-Position an die 1'-Position von S gebunden ist, wenn B ein Pyrimidin ist, oder über die N&sup9;-Position, wenn B ein Purin ist, und Sig direkt oder indirekt an P gebunden ist.
3. Nucleotid nach Anspruch 2, wobei die Einheit, die mit Ionen Chelate bilden kann, zwei Stickstoffe und vier carboxylhaltige Gruppen umfaßt, und wobei zwei der carboxylhaltigen Gruppen an jeden der Stickstoffe gebunden sind.
4. Nucleotid nach Anspruch 3, wobei die Einheit, die mit Ionen Chelate bilden kann, ein carboxyl-substituiertes Diamin ist.
5. Nucleotid nach Anspruch 4, wobei die Einheit, die mit Ionen Chelate bilden kann, die folgende Strukturformel aufweist:
wobei M ein Wasserstoffatom oder ein geeignetes Kation ist.
6. Nucleotid nach Anspruch 5, wobei die Einheit, die mit Ionen Chelate bilden kann, die folgende Strukturformel aufweist:
wobei M ein Wasserstoffatom oder ein geeignetes Kation ist.
7. Nucleotid nach Anspruch 6, wobei die Einheit, die mit Ionen Chelate bilden kann, die folgende Strukturformel aufweist
wobei M ein Wasserstoffatom oder ein geeignetes Kation ist.
8. Nucleotid nach Anspruch 1, wobei das Ion ein Ion eines radioaktiven Metalls, ein Ion eines Metalls, das eine chromogene oder fluorogene Reaktion katalysieren kann, oder ein Ion eines Metalls ist, das allein oder, wenn es in Kombination mit einem anderen Stoff vorliegt, fluoreszieren oder chemilumineszieren kann.
9. Nucleotid nach Anspruch 1, wobei die Einheit, die mit Ionen Chelate bilden kann, mit der Baseneinheit, Zuckereinheit oder Phosphor-enthaltenden Einheit kovalent über eine Brückengruppe gebunden ist, die Brückengruppe eine olefinische Bindung an der α-Position relativ zur Bindungsstelle an das Nucleotid und/oder eine -CH&sub2;NH-Einheit enthält, die die kennzeichnende Fähigkeit der Einheit, mit Ionen Chelate zu bilden, nicht wesentlich stört.
10. Nucleotid nach Anspruch 1, das ferner ein Schwermetall- oder Seltene Erden-Ion umfaßt, wobei das Ion mit der Einheit ein Chelat bildet, die mit Ionen Chelate bilden kann.
11. Nucleotid nach Anspruch 9, wobei die Brückengruppe eine Allylaminogruppe umfaßt.
12. Verbindung
in der M ein Wasserstoffatom oder ein geeignetes Kation ist.
13. Verbindung
in der M ein Wasserstoffatom oder ein geeignetes Kation ist.
14. Oligo- oder Polynucleotid, gekennzeichnet durch mindestens eine Einheit, die mit Ionen Chelate bilden kann, wobei die Einheit an mindestens ein Nucleotid des Oligo- oder Polynucleotids gebunden ist.
15. Oligo- oder Polynucleotid nach Anspruch 14, wobei die Einheit, die mit Ionen Chelate bilden kann, zwei Stickstoffe und vier carboxylhaltige Gruppen umfaßt und zwei der vier carboxylhaltigen Gruppen an jeden der Stickstoffe gebunden sind.
16. Nucleotid nach Anspruch 10, wobei das Ion ein Ion eines radioaktiven Metalls, ein Ion eines Metalls, das eine chromogene oder fluorogene Reaktion katalysieren kann oder ein Ion eines Metalls ist, das allein oder, wenn es in Kombination mit einem anderen Stoff vorliegt, fluoreszieren oder chemilumineszieren kann.
17. Nucleotid nach Anspruch 16, wobei das radioaktive Metall ein Wismut-, Nickel, Zinn-, Technetium-, Quecksilber- oder Kobaltisotop ist.
18. Nucleotid nach Anspruch 16, wobei das katalysierende Metall Kobalt ist.
19. Nucleotid nach Anspruch 1, wobei die Phosphor-enthaltende Einheit ein Mono-, Di- oder Triphosphat ist und die chemische Einheit über einen Sauerstoff des Phosphats kovalent an die Phosphor-enthaltende Einheit gebunden ist.
20. Nucleotid nach Anspruch 1, wobei das Ion ein nachweisbares Ion umfaßt.
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