ES2486321T3 - Péptidos como agentes activos para estabilizar barreras biológicas - Google Patents

Péptidos como agentes activos para estabilizar barreras biológicas Download PDF

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Abstract

Péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos GX1RPX2X3X4 X5GGX6 (SEC ID Nº: 1) en la que X1 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R y A; X2 tanto se omite como es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L y V; X3 tanto se omite como es una secuencia de aminoácidos que consiste en 1 a 5 aminoácidos; X4 tanto se omite como es una secuencia de aminoácidos que consiste en GG; X5 representa dos aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en A, I y S; y X6 tanto se omite como es una secuencia de aminoácidos que consiste en 1 a 5 aminoácidos.

Description

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actividad de GEF se midió como fluorescencia usando Fluoroskan Ascent FL 2.6 de Thermo Electron Corporation. La longitud de onda del filtro de excitación se fijó a 355 nm y la longitud de onda del filtro de emisión a 460 nm.
Tabla1
Valores relativos en comparación con control sin estimular; (*) p < 0,05 en comparación con pruebas sin XIB1-a o XIB1-b
Células ECV 304
Media DE
Péptido de control 1 min
1 0,5
Péptido de control 5 min
1 0,5
XIB1-a o XIB1-b 1 min
1 0,4
XIB1-a o XIB1-b 5 min
1 0,3
Trombina 1 U/ml 1 min
5 1,1
Trombina 1 U/ml 5 min
3,4 0,9
Trombina 1 U/ml + XIB1-a o XIB1-b; 1 min
2,5* 1
Trombina 1 U/ml + XIB1a o XIB1-b; 5 min
1,5* 0,2
LPS 100 µg/ml, 1 min
3,2 1,1
LPS 100 µg/ml, 5 min
3,2 1,1
LPS 100 µg/ml + XIB1-a o XIB1-b, 1 min
1,7* 0,9
LPS 100 µg/ml + XIB1a o XIB1-b, 5 min
1,3* 0,8
CaCo-2
Media DE
Péptido de control 1 min
1 0,2
Péptido de control 5 min
1 0,3
XIB1-a o XIB1-b 1 min
1 0,5
XIB1-a o XIB1.b 5 min
1 0,5
PMA 1 µg/ml 1 min
2,5 0,5
PMA 1 µg/ml 5 min
1,8 0,8
PMA 1 µg/ml + XIB1-a o XIB1-b; 1 min
1,4* 0,2
PMA 1 µg/ml + XIB1a o XIB1-b; 5 min
1,5 0,3
14
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Tabla2
Valores relativos en comparación con control sin estimular; (*) p < 0,05 en comparación con pruebas sin XIB1-a o XIB1-b
Células ECV 304
Media DE
Péptido de control 1 min
1 0,1
Péptido de control 5 min
1 0,3
XIB1-a o XIB1-b 1 min
1 0,5
XIB1-a o XIB1-b 5 min
1 0,4
Trombina 1 U/ml 1 min
4,3 1,1
Trombina 1 U/ml 5 min
3,2 1,3
Trombina 1 U/ml + XIB1-a o XIB1-b; 1 min
2,1* 0,5
Trombina 1 U/ml + XIB1-a o XIB1-b; 5 min
1,9* 0,4
LPS 100 µg/ml; 1 min
2,7 1,1
LPS 100 µg/ml; 5 min
2,9 1,1
LPS 100 µg/ml + XIB1-a o XIB1-b, 1 min
1, 6* 1,6
LPS 100 µg/ml + XIB1-a o XIB1-b 5 min
1,7* 1
CaCo-2
Media DE
Péptido de control 1 min
1 0,3
Péptido de control 5 min
1 0,2
XIB1-a o XIB1-b 1 min
1 0,4
XIB1-a o XIB1-b 5 min
1 0,2
PMA 1 µg/ml 1 min
2,3 1,2
PMA 1 µg/ml 5 min
2,0 0,6
PMA 1 µg/ml + XIB1-a o XIB1-b 1 min
1,4* 0,5
PMA 1 µg/ml + XIB1-a o XIB1-b 5 min
1,3* 0,1
HpMec
Media DE
Péptido de control 1 min
1 0,3
Péptido de control 5 min
1 0,2
XIB1-a o XIB1-b 1 min
1 0,4
XIB1-a o XIB1-b 5 min
1 0,2
Trombina 1 U/ml 1 min
3,8 1,1
Trombina 1 U/ml 5 min
3,2 1,2
Trombina 1 U/ml + XIB1-a o XIB1-b 1 min
2,1* 0,3
Trombina 1 U/ml + XIB1-a o XIB1-b 5 min
1,3* 0,4
Como puede sacarse de la Tabla 2, en células ECV 304, la estimulación de trombina y LPS produjo un aumento de la actividad de RhoA en comparación con células de control sin tratar. Las células ECV 304 estimuladas con trombina o LPS en presencia de XIB1-a o XIB1-b muestran una reducción significativa en la actividad de RhoA en comparación con
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(continuación)
Células ECV 304
Media DE
Trombina 1 U/ml 5 min
4 1,4
Trombina 1 U/ml + XIB1-a o XIB1-b; 1 min
1* 0,3
Trombina 1 U/ml + XIB1-a o XIB1-b; 5 min
1* 1,1
LPS 100 µg/ml 1 min
3 1,2
LPS 100 µg/ml 5 min
3 1,3
LPS 100 µg/ml + XIB1-a o XIB1-b, 1 min
1* 1,1
LPS 100 µg/ml + XIB1-a o XIB1-b, 5 min
1* 1,2
CaCo-2
Media DE
Péptido de control 1 min
0 0
Péptido de control 5 min
0 0
XIB1-a o XIB1-b 1 min
0 0
XIB1-a o XIB1-b 5 min
0 0
PMA 1 µg/ml 1 min
3 0,3
PMA 1 µg/ml 5 min
3 1,2
PMA 1 µg/ml + XIB1-a o XIB1-b; 1 min
1* 1,1
PMA 1 µg/ml + XIB1-a o XIB1-b; 5 min
2* 1,3
HpMec
Media DE
Péptido de control; 1 min
0 0
Péptido de control ; 5 min
0 0
XIB1-a o XIB1-b 1 min
0 0
XIB1-a o XIB1-b 5 min
0 0
Trombina 1 U/ml 1 min
4 2
Trombina 1 U/ml 5 min
4 1,8
Trombina 1 U/ml + XIB1-a o XIB1-b; 1 min
1* 0,5
Trombina 1 U/ml + XIB1-a o XIB1-b; 5 min
0,3* 0,3
Como puede sacarse de la Tabla 3, en células ECV 304, la estimulación de trombina y LPS indujo fosforilación de MLC y formación de fibras de tensión de actina. Las células ECV 304 estimuladas con trombina o LPS en presencia de XIB1-a o XIB1-b muestran una reducción significativa en la fosforilación de MLC y formación de fibras de estrés de actina en comparación con el tratamiento con trombina o LPS solo.
En células CaCo-2, un estímulo con PMA indujo un aumento en la fosforilación de MLC y formación de fibras de estrés de actina después de 1 min y después de 5 min de estimulación. La magnitud de la activación citoesquelética después de 1 y después de 5 min se redujo significativamente cuando las células CaCo-2 se co-trataron con PMA y XIB1-a o XIB1-b.
En células HepMec, la trombina indujo un aumento en la fosforilación de MLC y formación de fibras de estrés de actina
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después de 1 min y después de 5 min de estimulación. El co-tratamiento de células con XIB1-a o XIB1-b redujo significativamente la magnitud de la activación citoesquelética después de 1 min y después de 5 min. El tratamiento con XIB1-a o XIB1-b solo no alteró la actividad citoesquelética básica.
Los resultados demuestran que los péptidos de la presente invención tales como XIB1-a o XIB1-b reducen la fosforilación
5 de MLC y formación de fibras de estrés de actina inducida por diferentes agentes estimulantes en células epiteliales y endoteliales. La fosforilación de MLC y la formación de fibras de estrés de actina están controladas por la actividad de RhoA como se ha descrito anteriormente. Los resultados demuestran que los péptidos de la presente invención tales como XIB1-a y/o XIB1-b están disminuyendo la fosforilación de MLC y la fibra de tensión de actina inhibiendo la actividad de GEF y posterior la actividad de RhoA y así son útiles en el tratamiento y/o prevención de enfermedades o trastornos
10 asociados a una rotura localizada o sistémica de funciones de la barrera epitelial o endotelial. Enfermedades y trastornos particulares comprenden quemaduras, lesión pulmonar aguda (LPA), síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), lesión pulmonar inducida por el respirador (LPIR), síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS), lesión renal aguda (LRA), septicemia, síndrome de disfunción multiorgánica (SDMO) o edema.
Ejemplo 5: Permeabilidad endotelial y epitelial
15 Para medir la permeabilidad a través de las barreras endoteliales y epiteliales se usaron las siguientes líneas celulares: Caco-2, ECV 304 y HpMec. Todas las células se cultivaron a confluencia a condiciones estándar sobre un sistema Transwell (Costar) con un tamaño de poro de 4 µm. Al inicio del experimento, los medios de crecimiento se retiraron y se sustituyeron con disolución salina tamponada con Hank. La cámara superior se complementó con 2 mg/ml de dextrano marcado con FITC (Sigma Aldrich). Las células se estimularon como se indica en la Tabla 4. Muestras de 30 min de las
20 cámaras inferiores se recogieron y se determinaron para fluorescencia (Fluoroskan Ascent FL, Thermo Electron). 50 µg/ml de XIB1-a y XIB1-b se añadieron cuando se indicó.
Tabla4
Valores relativos en comparación con control sin estimular; (*) p < 0,05 en comparación con pruebas sin XIB1-a o XIB1-b; (*) p < 0,05 en comparación con pruebas sin XIB1-a o XIB1-b
Células ECV 304
Media DE
Péptido de control
1 0,1
XIB-1b
1 0,3
Trombina 1 U/ml
3 1,3
Trombina 1 U/ml + XIB1-a o XIB1-b
1,5* 1
LPS 100 µg/ml
2,3 1
LPS 100 µg/ml + XIB1
1,1* 0,6
CaCo-2
Media DE
Péptido de control
1 0,3
XIB1-a o XIB1-b
1 0,3
PMA 1 µg/ml 1 min
2,5 1
PMA 1 µg/ml + XIB1-a o XIB1-b
1,4* 0,6
HpMec
Media DE
Péptido de control
1 0
XIB1-a o XIB1-b
1 0,5
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imagen17

Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
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