CN103038253A - 作为用来稳定生物屏障的活性剂的肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及化合物，尤其是肽，其能够稳定上皮和内皮的屏障功能。本发明的肽和其它化合物可用于治疗和预防与上皮和内皮屏障功能的局部或全身衰竭相关的疾病或病症。借助于本文提供的肽或其它化合物、方法和应用加以治疗和/或预防的特定疾病和病症是烧伤、急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、通气机引起的肺损伤(VILI)、全身炎症反应综合征(SIRS)、急性肾损伤(AKI)、脓毒病、多器官功能障碍综合征(MODS)、或水肿。

Description

作为用来稳定生物屏障的活性剂的肽
本发明涉及化合物，尤其是肽，其能够稳定上皮和内皮的屏障功能。本发明的肽和其它化合物可用于治疗和预防与上皮和内皮屏障功能的局部或全身衰竭（系统衰竭，系统破坏，系统崩溃，systemic breakdown）相关的疾病或病症（障碍）。借助于本文提供的肽或其它化合物、方法和应用加以治疗和/或预防的特定疾病和病症是烧伤、急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、通气机引起的肺损伤(VILI)、全身炎症反应综合征(SIRS)、急性肾损伤(AKI)、脓毒病、多器官功能障碍综合征(MODS)、或水肿。
Rho GTP酶控制细胞行为的许多方面如细胞骨架的组构、细胞迁移、细胞周期进展、细胞增殖、细胞分化、基因表达、细胞存活和凋亡(Nature(2006),440(7087):1069-1072;Curr Drug Targets(2010),11(9):1043-1058)。它们的功能的一个主要方面是控制血管表面的通透性(Cardiovasc Res(2010),87(2):243-253;Thromb Haemost(2010),103(1):40-55;Am J PhysiolLung Cell Mol Physiol(2005),288(2):L294-L306)和上皮表面的通透性(AmJ Pathol(2010),177(2):512-524;Physiology(Bethesda)(2010),25(1):16-26)。由于它们在调节通透性方面的重要作用，所以Rho GTP酶的激活对于与上皮和内皮屏障功能的衰竭相关的许多病理生理过程是决定性的。这样的病理过程可以是病症和疾病，其包括烧伤、急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、通气机引起的肺损伤(VILI)、全身炎症反应综合征(SIRS)、急性肾损伤(AKI)、脓毒病、多器官功能障碍综合征(MODS)(Med Sci Monit(2010),16(4):112-118;Microvasc Res(2009),77(1):39-45;Anesthesiology(2010),113:1134-1143;Curr Pharm Des(2009),15(27):3108-3115;Mol Interventions(2004),4(6):349-357;Circ Res(2006),98(3):322-334;Am J Physiol Renal Physiol(2009),297(2):F316-F326;Exp CellRes(2011),317(6):859-872;Transl Res(2010),155(1):44-54;Burns(2003),29(8):820-827)或水肿，尤其是与进行性组织水肿相关的疾病(N Engl J Med(2010),363:689-691)。对于这些疾病的治疗，Rho GTP酶以及随后Rho-激酶的药理抑制是有前途的方法(Trends Cell Biol(2008),18:210-219)。斯达汀和二膦酸盐是这样的物质，其影响类异戊二烯的生物合成，因而防止Rho GTP酶的脂质修饰，其是它们的激活所必要的，如下所述。斯达汀和二膦酸盐在临床研究中被测试作为抵抗癌症和心脏疾病的药物，以及被测试它们改善病症的血管和上皮屏障功能的能力。例如，法舒地尔是Rho-激酶抑制剂，其用于脑动脉的血管痉挛和肺高血压。另外，已描述了，通过抑制Rho GTP酶RhoA，VE-钙黏着蛋白结合、血纤蛋白衍生的蛋白质，Bβ15-42，可以稳定内皮屏障(PloS ONE(2009),4(4):e5391)。
由于它们在细胞生物学中的重要作用，所以Rho GTP酶的活性受到严格控制。Rho GTP酶在无活性的、GDP结合状态和活性的GTP结合状态之间循环。Rho GTP酶可以与它们的效应物分子相互作用并仅以GTP-结合形式影响它们的功能。大多数活性形式的GTP酶被结合于细胞膜。这种膜靶向是由C端多碱区和Rho GTP酶的翻译后异戊二烯化所介导。活性形式仅存在有限的时间，这是因为，由于Rho GTP酶的水解活性，结合的GTP被迅速转化成GDP。GDP-结合状态是更加稳定的，因此细胞RhoGTP酶的主要部分是无活性的。所谓的胍解离抑制剂(GDI)掩蔽RhoGTP酶的膜靶向序列并稳定GDP-结合构象。RhoGTP酶的激活是通过特定的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)介导的，其催化GDP交换为GTP；还参见下文。GEF可以增强GDP的离解速率并稳定Rho GTP酶的核苷酸游离形式。因为GTP以高分子过量存在于细胞中，所以有利于GTP的结合。GTP-结合会诱发Rho GTP酶的构象变化，使得GEF解离。通过另一组调节蛋白，GTP酶-激活蛋白(GAP)，来进一步调节在活性和无活性RHO GTP酶之间的平衡。GAP会增加Rho GTP酶的内源性Rho GTP酶水解活性，因而有利于它们的失活(Trend Cell Biol(2008),18:210-219)。在它们的活性形式中，Rho GTP酶以高亲和力与多种下游效应物之一相互作用。活性状态是非常短暂的；它是由GTP到GDP的水解（由GAP刺激的反应）所终止。另外，鸟嘌呤核苷酸解离因子会稳定Rho GTP酶的无活性形式(Genes Dev.1997;11:2295-2322;Biochem Soc Trans(2005);33:891-895;Cell(2004);116:167-179)。
用来控制邻近特异性（context-speciFIc）Rho GTP酶活性的一种可能性是经由鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)。GEF是RhoGTP酶活性的上游调节子。GEF以时空和部分邻近特异性方式来控制Rho GTP酶活性(NatureCell Biol(2011),13:159-166)。换句话说，GEF允许在给定的细胞内在限定的时间和位置中来激活Rho。它们整合和处理多个外部信号并且它们本身受到严格控制。它们表现得像将输入信号连接于某种RhoGTP酶驱动的细胞生物反应的界面(Trends Cell Biol 2008;18:210-19)。GEF的调节特点是起因于它们的多域结构。第一Rho GEF分离自淋巴瘤细胞作为转化基因并且被命名为Dbl(Nat Rev Mol Cell Biol(2005),6(2):167-180)。此外，Dbl同源家族包含超过70种蛋白。大多数GEF包含高度保守的约200个氨基酸的同源结构域，其介导在Rho GTP酶中的GDP和GTP的交换。该域被指定为DH-域。该DH域赋予GEF对单个或一组GTP酶的特异性。N端域是自抑制的，即，在无活性状态中，N端被磷酸化并与DH-域相互作用。在去磷酸化以后，自动抑制被消除(Trend Cell Biol(2008),18:210-219;Protein Sci(2011),20:107-111)。另外，存在GEF的第二亚家族，其包括11个成员，它们并不携带DH域。代替DH域，它们包含两个同源区，即DHR1和DHR2(停靠同源区1和2)(Trends Cell Biol(2008),18:210-219;J Cell Sci(2005),118:4937-4946;Nat Rev Mol Cell Biol(2005),6(2):167-180)。借助于它们的同源域，GEF结合Rho GTP酶，因而有助于GDP与GTP的交换。
GEF包含靠近DH域的Pleckstrin-域(PH-域)。PH域涉及蛋白-蛋白相互作用的催化活性和介导。DH和PH域一起提供为GTP酶激活所需要的最小结构。PH-域涉及GEF的亚细胞分布以及涉及调节活性(Genes Dev(2002),16:1587-1609;Nat Rev Mol Cell Biol(2005),6(2):167-180)。例如，当它与微管蛋白和紧密连接相关时，GEF-H1是无活性的。在活性状态中，GEF-H1重新定位到细胞质中(Mol Biol Cell(2008),19(5):2147-2153;DevCell(2005),8:777-786)。
通过分子内抑制来控制GEF活性。GEF的N端域用作自动抑制剂，其中通过磷酸化来中和分子内相互作用。因此，目标GTP酶可以与DH域相互作用。在特定亚细胞区的Rho GEF的靶向也是GEF活性的重要的控制机制。例如，无活性的GEF-H1与微管蛋白相关，其中它结合于内膜。在活性状态中，GEF-H1解离并重新定位在细胞质中(Trends in Cell Biol(2008),18:210-219)。
GEF/RhoGTP酶途径调节许多中心细胞生物过程如细胞骨架的组构、基因表达、细胞周期进展和细胞分化以及凋亡和非凋亡过程和细胞迁移、抗原呈递、上皮和内皮通透性(Cardiovasc Res(2010),87(2):243-253;Thromb Haemost(2010),103(1):40-55;Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol(2005),288(2):L294-L306;Am J Pathol(2010),177(2):512-524;Physiology(Bethesda)(2010),25(1):16-26)。由于它在细胞生理学中的重要作用，所以GEF/RhoGTP酶途径的调节异常是在炎性疾病、内皮和上皮屏障功能病症以及癌症中病理生理信号转导的主要成分。
GEF-H1/RhoA-途径激活由肌动蛋白和肌球蛋白组成的细胞收缩装置并且是接头解离所需要的(Mol Biol Cell(2007),18:3429-3439)。相反地，p114RhoGEF诱导的RhoA激活是紧密连接装配所需要的(Nat Cell Biol(2011),13(2):159-166)。对于生理屏障如上皮和内皮层的维持，RhoA的部位及邻近特异性调节是决定性的。内皮和上皮细胞形成分别内衬血管的内腔或内脏腔的连续层。它们形成半渗透屏障并调节邻近组织的流体和营养物质的交换。平衡的RhoA活性对于生理上皮和内皮屏障功能是关键的。静止内皮和上皮细胞显示基底RhoA活性，肌动蛋白纤维和肌球蛋白束被限于细胞边境以稳定组织(Endothelial Biomedicine,Cambridge Press(2007),696-706;J Cell Biol(1996),133:1403-1415)。促炎剂或促血栓形成剂的刺激导致GEF/RhoA途径的激活，其又诱导细胞骨架激活(J Cell Biol(1996),133:1403-1415)。肌动蛋白和肌球蛋白形成收缩束，由于细胞收缩，其遍及细胞，从而相邻细胞松开它们的接触。细胞-细胞边境的打开是重要的生理过程，例如，在用来促进炎性细胞迁移的组织增生和炎症过程中。但异常的GEF/RhoA过度激活导致上皮和/或内皮屏障的衰竭并且是许多严重疾病的病理生理学的主要贡献者(Adv Drug Deliv Rev(2000),41:329-40;Ann NY Acad Sci(2008),1123:134-45;Trends Cell Biol(2008),18:210-219)。例如，在小鼠模型中GEF-H1抑制可以预防由机械通气引起的急性肺损伤(ALI)(Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol(2010),298(6):L837-L848)。
急性肺损伤(ALI)是由双侧肺浸润和缺氧定义的严重病症(N Engl JMed(2005),353(16):1736-8;Am J Resp Crit Care Med(1994),149:818-824)。急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是ALI的严重形式。ALI是重症监护治疗病房(ICU)中的主要问题，其中发生率为79/100.000以及死亡率为40%。ALI是由对肺的影响(如肺炎、酸吸入、烟吸入、机械通气)所诱导或发展为脓毒病和创伤的后遗症。即使ALI发展自不同的病因，但所有患者显示共同症状如富含蛋白质的水肿和在肺中炎性细胞的浸润(N Engl JMed(2000);342(18):1334-1349;Am J Respir Cel Mol Biol(2005),33(4):319-327)。啮齿动物的LPS吸入模型广泛用于寻找ALI的治疗性干预的可能性。LPS吸入会诱导富含蛋白质的水肿和细胞炎症，这是由于内皮和上皮屏障的衰竭(Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol(2008),295(3):L379-L399;Jama(2003),289(16):2104-2112;Nature(2005),436:112-116)。GEF-H1抑制可以减小在通气机引起的肺损伤(VILI)的小鼠模型中的肺损伤(Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol(2010),298(6):L837-L848)并改善内皮屏障功能病症(Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol(2006),290(3):L540-L548)。
侵袭大于15%的总体表面积的主要皮肤烧伤(热灼伤和化学烧伤)不仅导致局部组织损伤而且还导致广泛的全身性炎症如全身炎症反应综合征(SIRS)，其引起在烧伤部位远侧的器官系统损害。SIRS还包括水肿、微血管通透性过高、低血容量性休克和多器官功能衰竭(多器官功能障碍综合征)以及ARDS(JAm Coll Surg(2001),192:241-254)。烧伤的最具破坏性的效应之一是全身性炎症，其在发生以后的最初3h内达到高峰并在以后的24–48h期间下降(Clin Plast Surg(2000),27:11-22;World J Surg(1992),16:2-9)。
研究GEF/RhoA途径在疾病（病症）如重度烧伤的病理生理学中的作用的研究数目是非常有限的。但有研究表明肌球蛋白轻链激酶(MLCK)和Rho激酶对烧伤以后的SIRS和毛细血管渗漏的发展的贡献。两种分子，MLCK和Rho激酶，均是RhoA的下游效应物。已表明，在用分离自烧伤大鼠的血浆重新温育以后，内皮细胞松弛了它们的屏障功能。通过用MLCK抑制剂来处理内皮细胞，可以恢复内皮通透性过高(AM J PhysiolLung Cell Mol Physiol(2004),286:L841-L847)。在烫伤以后，MLCK的药理学抑制可以改善体内结果(Shock(2003),20:363-368)。在烧伤的小鼠模型中，在小鼠中MLCK-210的敲除会减少毛细血管渗漏并改善存活(Shock(2007),28:589-595)。在烫伤以后，Rho激酶的抑制会体内降低血管渗漏(Burns(2003),29(8):820-827)。
因此，在治疗与Rho GTP酶的高活性相关的病症和疾病中，降低RhoGTP酶活性可以是有用的策略。当旨在抑制GEF功能（用于减少Rho GTP酶）时，主要问题是在时间和位置方面实现特异性以及靶向蛋白-蛋白相互作用位点。然而，仍未完全明了这些相互作用位点的复杂特性。事实上，已知的Rho GTP酶抑制剂和Rho-激酶抑制剂全身起作用，即，它们也在健康的细胞/组织中影响Rho-GTP酶和Rho-激酶，因而可以意味着严重的副作用如中毒性肌病(对于斯达汀而言)并且可以引起低血压(法舒地尔)(Surg Neurol(2007),68(2):126-131)。另外，斯达汀必须被提供为预防性治疗，即，需要院前治疗(Crit Care Med(2011),39(6):1343-1350)。这也适用于法舒地尔，其中在动物模型中需要预处理(Life Sci(2011),88(1-2):104-109)。
因此，需要特异性Rho GTP酶抑制剂。
通过本文提供的和如在所附实施例和在权利要求中提供的实施方式已解决了上述技术问题。
本发明描述并提供了包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的肽
GX1RPX2X3X4X5GGX6(SEQ ID NO:1)
其中
X1是选自由R和A组成的组的氨基酸；
X2缺失（不存在）或者是选自由L和V组成的组的氨基酸；
X3缺失（不存在）或者是由1至5个氨基酸组成的氨基酸序列；
X4缺失（不存在）或者是由GG组成的氨基酸序列；
X5表示选自由A、I和S组成的组的两个氨基酸；以及
X6缺失（不存在）或者是由1至5个氨基酸组成的氨基酸序列。
在某些情况下，X6还可以包含如下文描述的多于5个的氨基酸或者由多于5个的氨基酸组成。
本发明的肽优选包含以下氨基酸或者由以下氨基酸组成：不多于19个氨基酸，更优选不多于14个氨基酸，最优选不多于11个氨基酸或不多于9个氨基酸。在一种实施方式中，本发明的肽包含11个氨基酸或由11个氨基酸组成。
如在本文中所使用的，术语“氨基酸”是指本领域已知的任何氨基酸并且包括如本领域中已知的蛋白原氨基酸和非蛋白原氨基酸。蛋白原氨基酸（proteinogenic amino acids）包括丙胺酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)、谷氨酰胺(Gln；Q)、谷氨酸(Glu；E)、甘氨酸(Gly；G)、组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、蛋氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸(Thr；T)、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)、缬氨酸(Val；V)、硒代半胱氨酸(Sec；U)以及吡咯赖氨酸(Pyl；O)。用于非蛋白原氨基酸的非限制性实例是羟脯氨酸、硒代蛋氨酸、肉碱、γ-氨基丁酸(GABA)、羊毛硫氨酸、脱氢丙氨酸、鸟氨酸、或瓜氨酸。如本领域技术人员很容易明了的，在一些情况下，非蛋白原氨基酸还可以是蛋白质的一部分。在本文中通过单字母代码或三字母代码来简称氨基酸，如本领域中通常使用的以及如下文陈述的。
如在本发明的范围内已经令人惊奇地发现，本文描述和提供的肽能够抑制GTP酶。这已在所附的关于RhoA的实施例中得到示例性地证明。特别是，如本文中描述和举例说明的，这些本发明的肽可用于治疗或预防由Rho GTP酶的异常激活所引起的疾病或病症。这样的疾病和病症（障碍）尤其包括与内皮和/或上皮屏障功能的丧失有关的炎性疾病。例如，本发明的肽表明可以降低与较少肺损伤相关的肺部炎症和降低肺水肿；参见图1。内皮和/或上皮屏障的衰竭（降低）是与上皮或内皮屏障功能的局部或全身衰竭相关的疾病或病症的病理生理学的主要成分。通过本发明的方式和方法可治疗或可预防的疾病或病症尤其包括烧伤、急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、通气机引起的肺损伤(VILI)、全身炎症反应综合征(SIRS)、急性肾损伤(AKI)、脓毒病、多器官功能障碍综合征(MODS)或水肿。如已经提到的，按照本发明，SIRS还包括水肿、微血管通透性过高、和低血容量性休克。在本发明的范围内，通过如本文提供的方式和方法可治疗和/或可预防的水肿可以特别是与进行性组织水肿相关的疾病，如在本领域中已知的以及如例如在N Engl J Med(2010),363:689-691中所描述的。本文提供的肽通过它们的以下能力来起作用：稳定内皮和上皮屏障，从而减少水肿形成和炎症，进而改善器官功能。因此，本文描述和提供的方式和方法特别可用于治疗和/或预防与上皮或内皮屏障功能的局部或全身衰竭相关的疾病或病症。尤其是，本发明的肽和方法可用于治疗和/或预防烧伤、急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、通气机引起的肺损伤(VILI)、全身炎症反应综合征(SIRS)、急性肾损伤(AKI)、脓毒病、多器官功能障碍综合征(MODS)或水肿。
在本发明中描述和提供的肽源自扣带蛋白，一种已知的GEF-H1抑制剂(NY Acad Sci(2009),1165:88-98;Dev Cell(2005),8:777-786;Dev Cell(2007),12:699-712)。
另外，本文中描述和提供的肽显示与VE-钙黏着蛋白结合和RhoA-抑制蛋白Bβ15-42的序列相似性(PLoS ONE(2009),4(4):e5391)。Bβ15-42的活性已重复被描述为强烈地依赖于最初的4个氨基酸(Int J Cancer(2009),125:577-584)。尤其是，Bβ15-42的His16(Bβ15-42的第二位置)和Arg17(Bβ15-42的第三位置)已被描述为对于Bβ15-42的功能是关键的(Biochemistry(2002),41:4107-4116)。与此相反，在本发明中描述和提供的肽并不具有在第二位置处的His，然而显示具有强RhoA-抑制效应。此外，本文描述的肽靶向内皮和上皮细胞，后者缺少VE-钙黏着蛋白。另外，在本发明中已经令人惊奇地发现，本文描述和提供的肽比Bβ15-42显著更有效，如利用ALI的动物模型示例性地证明的(参见，例如，实施例6)。
本文中描述和提供的肽可以进一步包含在C端的X7，其中X7是这样的部分，该部分适合于延迟原发性肾过滤，延长血清半衰期和/或防止本文提供的肽的蛋白水解降解(尤其是肽酶)。这样的部分在本领域中是已知的。这样的部分的非限制性实例是NH2、白蛋白、聚乙二醇、葡聚糖、铁蛋白、羟乙基淀粉和抗体的Fc部分。X7还可以是或包含氨基酸一段序列（aminoacid stretch），其能够延长血清半衰期，如在例如WO 08/155134中所描述的，或氨基酸序列，如在WO 07/103515或在Nat Biotechnol(2009),27:1186-1190中所描述的。
在下文中，描述了本文中描述和提供的肽的通用序列的变量（变体）X1至X6的非限制性实例。本发明的肽可以包含变量的以下具体实例之一或其两种、三种或更多种的组合。X1例如是R。X2可以是L或V，例如L。X3可以缺失或者可以是PPP，例如缺失。X4可以是GG。X5可以是IS或AS，例如IS。X6可以缺失或可以是另外的氨基酸或氨基酸一段序列。X6的所述1至5个氨基酸可以选自如本文描述的任何氨基酸。另外，在某些情况下，X6可以包含多于5个的氨基酸或由多于5个的氨基酸组成。还预期，X6可以包括较长的氨基酸一段序列，甚至大于15个氨基酸的氨基酸一段序列。这样的一段序列（stretch）还可以包含这样的氨基酸一段序列，其延长血清半衰期（如上文针对X7所描述的），如在WO 08/155134中提供的“PAS”序列、或在WO 07/103515中或在Nat Biotechnol (2009),27:1186-1190中提供的肽序列。然而，X6还可以缺失。在一种实施方式中，本发明的肽包含氨基酸序列GRRPLX4ISGG(SEQ ID NO:2)或由氨基酸序列GRRPLX4ISGG(SEQ ID NO:2)组成，例如，GRRPLGGISGG(SEQ ID NO:3)或GRRPLISGG(SEQ ID NO:4)。在另一种实施方式中，本发明的肽包含氨基酸序列GRRPVX4ISGG(SEQ ID NO:5)或由氨基酸序列GRRPVX4ISGG(SEQ ID NO:5)组成，例如，GRRPVGGISGG(SEQ ID NO:6)或GRRPVISGG(SEQ ID NO:7)。在一种具体实施方式中，本发明的肽包含氨基酸序列GRRPLGGISGG(SEQ ID NO:3)或由氨基酸序列GRRPLGGISGG(SEQ ID NO:3)组成。
本发明涉及用于本文中描述和提供的肽的以下非限制性具体实例。尤其是，本发明的肽可以包含以下序列中的任何一种或由以下序列中的任何一种组成：
GRRPLGGISGG(SEQ ID NO:3)；
GRRPVGGISGG(SEQ ID NO:6)；
GRRPLISGG(SEQ ID NO:4)；
GRRPVISGG(SEQ ID NO:7)；
GRRPLPPPISGG(SEQ ID NO:8)；
GRRPVPPPISGG(SEQ ID NO:9)；
GRRPLGGAAGG(SEQ ID NO:10)；
GRRPVGGAAGG(SEQ ID NO:11)；
GRRPLPPPAAGG(SEQ ID NO:12)；
GRRPVPPPAAGG(SEQ ID NO:13)；
GRRPLGGASGG(SEQ ID NO:14)；
GRRPVGGASGG(SEQ ID NO:15)；
GRRPLPPPASGG(SEQ ID NO:16)；
GRRPVPPPASGG(SEQ ID NO:17)；
GRRPLGGIAGG(SEQ ID NO:18)；
GRRPVGGIAGG(SEQ ID NO:19)；
GRRPLPPPIAGG(SEQ ID NO:20)；
GRRPVPPPIAGG(SEQ ID NO:21)；
GARPLGGISGG(SEQ ID NO:22)；
GARPVGGISGG(SEQ ID NO:23)；
GARPLPPPISGG(SEQ ID NO:24)；
GARPVPPPISGG(SEQ ID NO:25)；
GARPLGGAAGG(SEQ ID NO:26)；
GARPVGGAAGG(SEQ ID NO:27)；
GARPLPPPAAGG(SEQ ID NO:28)；
GARPVPPPAAGG(SEQ ID NO:29)；
GARPLGGASGG(SEQ ID NO:30)；
GARPVGGASGG(SEQ ID NO:31)；
GARPLPPPASGG(SEQ ID NO:32)；
GARPVPPPASGG(SEQ ID NO:33)；
GARPLGGIAGG(SEQ ID NO:34)；
GARPVGGIAGG(SEQ ID NO:35)；
GARPLPPPIAGG(SEQ ID NO:36)；或
GARPVPPPIAGG(SEQ ID NO:37)。
如已经提到的，按照本发明，包含上述特定序列的任何之一或由上述特定序列的任何之一组成的肽可以进一步包含在C端的部分X7，如本文所定义的。
用于合成肽的方法是本领域中已知的，并且包括，例如，如在文献中描述的标准FMOC合成(例如，固相肽合成-“A practical approach“by E.Atherton,R.C.Sheppard,Oxford University press 1989)，或液相合成，其中利用混合策略并通过BOC化学和片段缩合法来组装肽，如在文献中描述的(E.Wünsch,"Synthese von Peptiden"in"Methoden der organischenChemie"(Houben-Weyl),15Ausg.4,Teil 1und 2Thieme,Stuttgart,1974)。
本文中描述和提供的肽能够抑制Rho GTP酶，例如，RhoA，的活性。用于评估Rho GTP酶活性的方法是本领域中已知的并且如本文中描述和举例说明的。适用于评估Rho GTP酶活性的方法的非限制性实例包括全局Rho GTP酶活性的确定，如在J Biol Chem(2004),279:7169-7179中所描述的。这样的测定可以通过利用标记有GST的Rho底物(例如，Rhotekin)来进行，其被混合到细胞裂解液中，接着是利用抗GST抗体的下拉。可以通过凝胶电泳和蛋白质印迹并利用抗Rho抗体（如本领域中已知的）来进行检测。评估Rho GTP酶活性的另一种适宜的方法是G-LISA测定，如在Basic Res Cardiol(2009),104:333-340中所描述的。用来评估Rho GTP酶活性的又一种方式可以是在给定细胞内的位点时空RHO激活的确定，其中通过利用Rho GTP酶激活生物传感器如GFP-效应物传感器或单分子或双分子FRET传感器（转染或重组表达在给定细胞中）。这些生物传感器允许单个活性Rho GTP酶的体内时空成像(J Cell Science(2010),123:1841-1850)。此外，可获得用于评估RhoGTP酶活性的商业化试剂盒，如，例如，来自Cytoskeleton,Inc.的“RhoGEF Exchange Assay Biochem Kit”。例如，给定肽可以被认为是本发明的肽，(1)如果它包含或由如本文所定义的序列组成，以及(2)与未用肽处理的参比细胞(属于相同细胞系)的各自的Rho GTP酶活性(例如，RhoA)相比，如果它降低测试细胞的Rho GTP酶(例如，RhoA)的活性至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍或至少3倍。
本发明还涉及编码本文中描述和提供的肽的多核苷酸。这些多核苷酸可以是核酸类似物如，例如，DNA分子、RNA分子、寡核苷酸硫代磷酸、取代的核糖寡核苷酸、LNA分子、PNA分子、GNA(二醇核酸)分子、TNA(苏糖核酸)分子、或吗啉代多核苷酸。另外，在本发明的范围内，术语“多核苷酸”被认为与术语“核酸分子”等效并且尤其可以是指DNA、RNA、PNA或LNA或它们的杂交体或它们的本领域中已知的任何修饰(关于修饰的实例，参见，例如，US 5,525,711、US 4,711,955、US 5,792,608或EP 302175)。由本文描述和提供的多核苷酸构成的核酸残基可以是天然存在的核酸残基或人工合成的核酸残基。用于核酸残基的实例是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)、黄嘌呤(X)、和次黄嘌呤(HX)。如本领域技术人员明了的，可以互换使用胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)，其取决于多核苷酸的各自类型。例如，如技术人员明了的，作为DNA的一部分的胸腺嘧啶(T)对应于作为相应转录的mRNA的一部分的尿嘧啶(U)。本文描述和提供的多核苷酸可以是单链或双链的、线性或环状的、天然的或合成的。
另外，根据本发明，可以将本文描述和提供的多核苷酸克隆到载体中。因此，本发明还涉及包含如本文描述和提供的多核苷酸的载体。如在本文中所使用的，术语“载体”特别是指质粒、黏粒、病毒、噬菌体和通常用于基因工程的其它载体。在一种优选的实施方式中，这些载体适合于转化细胞，如真菌细胞，微生物的细胞如酵母或原核细胞。在一种特别优选的实施方式中，这样的载体适合于细菌细胞的稳定转化，例如从而表达本发明的多核苷酸。
因此，在本发明的一个方面中，如提供的载体是表达载体。通常，在文献中，已广泛地描述了表达载体。通常，在所选的宿主中，它们不仅可以包含选择标记基因和复制起点以确保复制，而且还可以包含启动子，以及在大多数情况下，用于转录的终止信号。在启动子和终止信号之间优选存在至少一个限制位点或多接头，其使得能够插入所期望表达的核酸序列/分子。
应当明了，当通过利用在现有技术中已知的已经包含启动子（其适合用于本发明的范围，例如如上所述的多核苷酸的表达）的表达载体来产生本文描述和提供的载体时，以一种方式将核酸构建体插入上述载体中，使得产生的载体仅包含适合用于本发明的范围的一种启动子。技术人员知道如何可以实施这样的插入。例如，在连接以前，启动子可以切除自核酸构建体或切除自表达载体。
其中克隆有本文描述和提供的多核苷酸的载体的非限制性实例是腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体、基于HIV的慢病毒载体、或非病毒小环载体。适合于包含本发明的多核苷酸以形成本文描述的载体的载体的另外的实例在本领域中是已知的并且是，例如，用于细菌和真核表达系统的其它载体。
另外，在本发明的范围内，可以将本文描述和提供的多核苷酸和/或载体转导、转化或转染或用其它方式引入宿主细胞中。因此，本发明还涉及包含如本文描述和提供的多核苷酸和/或载体的宿主细胞。例如，宿主细胞是原核细胞，例如，细菌细胞。作为非限制性实例，宿主细胞还可以是哺乳动物细胞。本文描述的宿主细胞旨在特别可用于产生本文中描述和提供的肽。通常，本文描述的宿主细胞可以是原核或真核细胞，其包含本文描述和提供的多核苷酸或载体，或源自上述细胞并且包含核酸构建体或载体的细胞。在一种实施方式中，宿主细胞包含，即，以这样的方式用本文描述和提供的多核苷酸或载体加以基因修饰，使得它包含整合到基因组中的多核苷酸。例如，本文描述的这样的宿主细胞可以是细菌、酵母、或真菌细胞。在一个特定方面，宿主细胞能够表达本发明的多核苷酸。待用于产生本文描述的宿主细胞的不同的相应表达系统的实例的概述，例如，包括在Methods in Enzymology 153(1987),385-516、Bitter(Methods inEnzymology 153(1987),516-544)、Sawers(Applied Microbiology andBiotechnology 46(1996),1-9)、Billman-Jacobe(Current Opinion inBiotechnology 7(1996),500-4)、Hockney(Trends in Biotechnology 12(1994),456-463)、和Griffiths(Methods in Molecular Biology 75(1997),427-440)中。可以通过标准方法来进行具有本文描述和提供的多核苷酸或载体的宿主细胞的转化或基因工程，如例如在Sambrook and Russell(2001),MolecularCloning:A Laboratory Manual,CSH Press,Cold Spring Harbor，NY，USA;Methods in Yeast Genetics,A Laboratory Course Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,1990中描述的。
本发明进一步涉及组合物，该组合物包含如本文描述和提供的肽、多核苷酸、载体和/或宿主细胞。可以以约1ng/kg体重至约100mg/kg体重的量，将这样的组合物给予需要医疗干预的受试者（主体）。这样的受试者可以是哺乳动物，例如，人类，其需要加以治疗或其中需要预防如本文描述的与异常GTP酶活性相关的病症。如所提到的，在本发明的范围内，与异常的GTP酶活性相关的疾病或病症的实例是与上皮或内皮屏障功能的局部或全身衰竭（系统衰竭）相关的疾病。在该背景下，待治疗和/或预防的特定疾病和病症是烧伤、急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、通气机引起的肺损伤(VILI)、全身炎症反应综合征(SIRS)、急性肾损伤(AKI)、脓毒病、多器官功能障碍综合征(MODS)、或水肿。本文描述和提供的组合物可以包含本发明的肽，含量为约1μg/kg体重至约40mg/kg体重/天、或约1mg/kg体重至约30mg/kg体重、或约1mg/kg体重至约20mg/kg体重/天、或约1mg/kg体重至约15mg/kg体重/天、或约1mg/kg体重至约10mg/kg体重/天、或约10mg/kg体重至约15mg/kg体重/天。
在本发明的范围内，包含如本文描述和提供的肽、多核苷酸、载体和/或宿主细胞的组合物可以进一步包含药用载体。因此，本发明还涉及药物组合物，该药物组合物包含如本文描述和提供的肽、多核苷酸、载体和/或宿主细胞，以及可选地，进一步包含药用载体、赋形剂和/或稀释剂。通常，适宜的药物载体的实例是本领域中众所周知的并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳状液如油/水乳状液、不同类型的湿润剂、无菌溶液等。可以通过众所周知的常规方法来配制包含上述载体的组合物。可以以适宜的剂量，即，约1μg/kg体重至约40mg/kg体重/天、或约1mg/kg体重至约30mg/kg体重、或约1mg/kg体重至约20mg/kg体重/天、或约1mg/kg体重至约15mg/kg体重/天、或约1mg/kg体重至约10mg/kg体重/天、或约10mg/kg体重至约15mg/kg体重/天，将这些药物组合物给予受试者。可以通过不同途径来实现(药物)组合物的给予或给予(药物)组合物，例如，胃肠道外途径(例如，静脉内途径、皮下途径、经皮途径、肌内途径或腹腔内途径)、通过吸入(例如，支气管内途径)、作为由可生物降解聚合物(例如，聚乳酸酯或聚甘醇酸酯)构成的可溶蚀性植入物、肠途径(例如，丸剂、片剂(口腔、舌下、口服、崩解、胶囊剂、薄膜、液体溶液或悬浮液)、散剂、固体晶体或液体)、直肠途径(例如，栓剂、灌肠剂)、经皮途径、局部途径、阴道途径、表皮途径、或鼻内途径。将由主治医师和临床因素来确定剂量方案。如在医学领域中众所周知的，用于任何一位患者的剂量取决于许多因素，包括患者体型、体表面积、年龄、待给予的特定化合物、性别、给予的时间和途径、一般健康、和同时给予的其它药物。可以局部或全身给予包含如本文描述和提供的肽、多核苷酸、载体和/或宿主细胞的(药物)组合物。将优选以胃肠道外途径给予本发明的肽，例如，静脉内途径或皮下途径。还可以将包含如本文描述和提供的肽、多核苷酸、载体和/或宿主细胞的(药物)组合物直接给予目标部位，例如，通过生物导弹递送到内部或外部目标部位或通过导管递送到在动脉中的部位。用于胃肠道外给予的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液、和乳状液。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，以及注射用有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳状液或悬浮液，其包括盐水和缓冲介质。胃肠道外赋形剂包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏、或固定油。静脉内赋形剂包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(如那些基于林格氏葡萄糖的电解质补充剂)等。还可以存在防腐剂和其它添加剂如，例如，抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂、和惰性气体等。另外，尤其是考虑到上述因素，还设想低于或高于上述示例性范围的剂量。还可以以本文提供的两种或更多种肽的组合来使用本发明的肽。因此，本发明的组合物可以包含本文提供的两种或更多种肽，可选地还连同本文描述和提供的其它化合物。另外，本发明的肽可以用于联合疗法，其中连同血管活性药剂如氧化氮、前列环素、外源性表面活性剂、抗凝血剂、靶向组织因子活性的药剂、有潜力改善肺泡液体清除的药剂如β2-激动剂、抑制TNF作用的药剂、抗IL-8和抗CD40L疗法(Curr Med Chem(2008),15(19):1911-1924)、吸入的激活蛋白C(Crit Care(2010),14(2):R70)、免疫抑制剂如糖皮质激素或环孢霉素、抗生素、HES溶液、用于容积膨胀的胶体(EmergMed J(2003),20:306-315)、或靶向肾素-血管紧张素系统的病理性失衡的药剂。
技术人员知道，给予个体的药物组合物的有效量将尤其取决于化合物的特性。例如，如果所述化合物是如本文描述的肽，则胃肠道外给予的每剂量的药物组合物的总药物有效量可以为约1μg/kg/天至100mg/kg患者体重/天、或1μg/kg体重至约40mg/kg体重/天、或约1mg/kg体重至约30mg/kg体重、或约1mg/kg体重至约20mg/kg体重/天、或约1mg/kg体重至约15mg/kg体重/天、或约1mg/kg体重至约10mg/kg体重/天、或约10mg/kg体重至约15mg/kg体重/天，但是，如上所述，这将取决于治疗酌情决定。然而，取决于治疗酌情决定，可以进一步减小或增加这种剂量，特别是如果同时施加某些脂质或如果肽经受某些化学修饰。可通过本领域技术人员众所周知的常规试验来确定特定量。
还可以通过缓释系统来适当地给予本文描述和提供的药物组合物。缓释组合物的适宜实例包括成形物品形式的半渗透聚合物基质，例如，薄膜、或微胶囊。缓释基质包括聚交酯(美国专利号3,773,919、EP-A1 58481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Biopolymers(1983),22:547-556)、聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)(J Biomed Mater Res(1981),15:167-277;Langer,Chem Tech(1982),12:98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer,loc.cit.)或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP-A1 133988)。缓释药物组合物还可以包括脂质体截留化合物。可以通过本领域已知的方法来制备包含药物组合物的脂质体，如在DE 3218121；Proc Natl Acad Sci USA(1985),82:3688-3692；Proc NatlAcad Sci USA 77:4030-4034(1980)；EP-A1 52322；EP-A1 36676；EP-A188046；EP-A1 143949；EP-A1 142641；日本专利申请83-118008；美国专利号4,485,045和4,544,545；以及EP-A1 102324中描述的。
在本发明的范围内，可以通过用液体载体或细分的固体载体或两者均匀地和紧密地接触药物组合物的成分来制备本文描述的剂型（配方）。然后，如有必要，可以将产物成型为所期望的剂型。载体可以是胃肠道外载体，例如，与受体血液等渗的溶液。上述载体赋形剂的实例包括水、盐水、林格氏液、和葡萄糖溶液。本文中还可以使用非水载体如固定油和油酸乙酯，以及如本文描述的脂质体。载体可以适当包含少量的添加剂如增强等渗性和化学稳定性的物质。这样的材料优选在所采用的剂量和浓度下对受体是无毒的，并且可以包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸、和其它有机酸或它们的盐；抗氧化剂如抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)(多)肽，例如，聚精氨酸或三肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、或精氨酸；单糖、二糖、和其它糖类，包括纤维素或它的衍生物、葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；抗衡离子如钠；和/或非离子型表面活性剂如聚山梨酯、泊洛沙姆、或PEG。
在本发明的范围内，待用于治疗给予的药物组合物的成分优选为无菌的。可以借助于，例如，通过无菌过滤膜(例如，0.2微米膜)的过滤来容易地实现无菌性。可以将药物组合物的治疗性成分放入具有无菌入口的容器，例如，静脉内溶液袋或小瓶，其具有通过皮下注射针可穿透的瓶塞。通常可以将药物组合物的成分贮存在单位或多剂量容器，例如，密封的安瓿或小瓶中，作为水溶液或作为冻干制剂，用于再构成。作为冻干制剂的非限制性实例，10-ml小瓶可以填充有5ml的无菌过滤的1%(w/v)水溶液，然后可以冷冻干燥所得物。可以通过使用抑制细菌的注射用水来再构成（重组）一种或多种冷冻干燥化合物来制备输注溶液。
在本发明的范围内，本文描述和提供的肽、多核苷酸、载体、宿主细胞、组合物和药物组合物可以用于治疗或预防与异常的GTP酶活性相关的疾病或病症。与异常的GTP酶活性相关的疾病和病症的非限制性实例是与上皮或内皮屏障功能的局部或全身衰竭相关的疾病。特定疾病和病症包括烧伤、急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、通气机引起的肺损伤(VILI)、全身炎症反应综合征(SIRS)、急性肾损伤(AKI)、脓毒病、多器官功能障碍综合征(MODS)、或水肿。
例如，本发明涉及包含序列GRRPLGGISGG(SEQ ID NO:3)或由序列GRRPLGGISGG(SEQ ID NO:3)组成的肽，用于治疗或预防疾病或病症，该疾病或病症选自由与上皮或内皮屏障功能的局部或全身衰竭相关的疾病组成的组。通过本文提供的方式和方法加以治疗和/或预防的特定疾病和病症包括烧伤、急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、通气机引起的肺损伤(VILI)、全身炎症反应综合征(SIRS)、急性肾损伤(AKI)、脓毒病、多器官功能障碍综合征(MODS)、或水肿。
本发明进一步涉及用于治疗或预防与上皮或内皮屏障功能的局部或全身衰竭相关的疾病或病症的方法。在本发明的范围内，通过本文提供的方法或通过本文提供的化合物加以治疗和/或预防的特定疾病和病症特别包括烧伤、急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、通气机引起的肺损伤(VILI)、全身炎症反应综合征(SIRS)、急性肾损伤(AKI)、脓毒病、多器官功能障碍综合征(MODS)、或水肿。这样的方法特别包括将有效剂量的本文描述和提供的一种或多种肽、一种或多种多核苷酸、一种或多种载体、一种或多种宿主细胞、一种或多种组合物和/或一种或多种药物组合物给予受试者。在一种实施方式中，受试者是人。
附图示出：
图1:通气机引起的肺损伤(VILI)
总细胞计数、中性粒细胞计数、蛋白质和IgM含量作为替代参数来评估屏障功能病症。(*p>0.05**p>0.01；***p>0.001)。缩写是：LPS：LPS吸入；LVt：低量潮通气；HVt：高量潮通气；sc：杂乱肽GGGGGSRRIPL(SEQ ID NO:38)；XIB1-b：GRRPLGGISGG(SEQ ID NO:3)。
图1比较了在用sc或XIB1-b治疗的动物中并在支气管肺泡灌洗中LPS激发、接着LVt或HVt对总细胞计数、中性粒细胞计数、总蛋白含量和IgM含量的影响。在所有组中，XIB1-b降低所有参数。获得如由星号表示的显著性(*p<0.5,***p<0.01)。
以下实施例说明本发明。
实施例1：肽
对于以下示例性研究，本发明的具有氨基酸序列GRRPGGASGG(SEQ ID NO:39；称作XIB1-a)和GRRPLGGISGG(SEQ IDNO:3；称作XIB1-b)的肽被用作活性剂。为了对照的目的，使用了氨基酸序列为GGGGGLSRRIP(SEQ ID NO:40)的随机肽或溶剂对照(0,9%NaCl)。这些肽以及要求的所有其它肽的合成是通过标准FMOC合成，如在文献(例如，solid phase peptide synthesis（固相肽合成）-“A practicalapproach“by E.Atherton,R.C.Sheppard,Oxford University press 1989)中描述的，或通过液相合成来合成，其中利用混合策略并通过BOC-化学和片段缩合法来组装肽，如在文献(E.Wünsch,"Synthese von Peptiden"in"Methoden der organischen Chemie"(Houben-Weyl),15Ausg.4,Teil 1und 2Thieme,Stuttgart,1974)中描述的。
实施例2：GEF活性的抑制
为了测量GEF-抑制效应，使用了以下细胞系：Caco-2(来自腺癌的上皮细胞)、ECV304(来自膀胱癌的上皮细胞)和HpMec(内皮细胞，永生化肺微血管细胞)。在标准条件(37°C、5%CO2和95%相对湿度(rH))下生长所有细胞。使用了培养基，对于Caco-2为DMEM+1mM丙酮酸钠+20%FCS+1%青霉素链霉素；对于ECV 304为RPMI 1640+10%FCS+1%青霉素链霉素；以及对于HpMec为IMDM+25mM Hepes+10%人血清+1%青霉素链霉素+1%L-谷氨酰胺+ECGS/肝素2ml。在实验以前4小时，通过血清清除来饥饿细胞。为了诱导GEF活性，在有或没有50μg/mlXIB1-a或XIB1-b存在的条件下，用凝血酶、脂多糖(LPS)或PMA刺激细胞指定的时间。在刺激以后，通过利用来自Biochain Institutes的市售“Compartemental Protein Extraction Kit”来制备膜部分。按照制造商的说明来制备膜部分。通过利用来自Cytoskeleton Inc.的“RhoGEF ExchangeAssay Biochem Kit”并按照制造商的说明来确定在膜裂解液中的GEF活性。利用来自Thermo Electron公司的Fluoroskan Ascent FL 2.6，测量GEF活性为荧光。将激发滤光片波长设定为355nm并将发射滤光片波长设定为460nm。
表1
与未刺激对照相比的相对值；(*)p<0.05，比较于测试w/o XIB1-a或XIB1-b
Figure BDA00002602632900191
如从表1可以看到的，在ECV304细胞中，与未经处理的对照细胞相比，凝血酶和LPS刺激导致GEF活性的增加。与单独用凝血酶或LPS进行的处理相比，在XIB1-a或XIB1-b存在的条件下，用凝血酶或LPS刺激的ECV 304细胞显示GEF活性的显著降低。
在CaCo-2细胞中，1分钟PMA刺激导致GEF活性增加2.5倍。当用PMA和XIB1-a或XIB1-b共同处理CaCo-2细胞时，显著降低了GEF激活的大小。
在HepMec细胞中，在刺激1分钟以后，凝血酶诱导GEF活性的3.5倍增加，并且在刺激5分钟以后导致3倍的增加。用XIB1-b共同处理细胞1分钟和5分钟以后会显著降低GEF活性的大小。单独用XIB1-a或XIB1-b进行的处理并不改变基本的GEF活性。
结果表明，本发明的肽如XIB1-a和XIB1-b会降低在上皮和内皮细胞中由不同的刺激剂诱导的GEF活性，但并不改变在未刺激细胞中的基本的GEF活性。这表明，本发明的肽可用于与异常的GTP酶活性相关的疾病或病症的治疗或预防。在该背景下，特定病症和疾病可以是烧伤、急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、通气机引起的肺损伤(VILI)、全身炎症反应综合征(SIRS)、急性肾损伤(AKI)、脓毒病、多器官功能障碍综合征(MODS)、或水肿。
实施例3：GTP相关的RhoA的减少
为了测量GTP相关的活性RhoA，使用了以下细胞系：Caco-2、ECV304和HpMec。在标准条件(37°C、5%CO2和95%rH)下生长所有细胞。在实验以前4h，通过血清撤除来饥饿细胞。为了诱导GEF活性，在有或没有50μg/ml XIB1-a或XIB1-b存在的条件下，用凝血酶、LPS或PMA刺激细胞指定的时间。在刺激以后，通过利用来自Biochain Institutes的市售“Compartemental Protein Extraction Kit“来制备膜部分。按照制造商的说明来制备膜部分。用15%聚丙烯酰胺凝胶并按照凝胶电泳的标准程序来分离膜部分。之后用硝酸纤维素膜并按照蛋白质印迹法的标准程序来印迹凝胶。利用来自NewEast Inc.的RhoA-GTP单克隆抗体并以1:5000的稀释度来检测GTP结合的RhoA。借助于Dolphin-1D Gel分析系统(Wealtec)来分析蛋白条带。
表2
与未刺激对照相比的相对值；(*)p<0.05，比较于测试w/o XIB1-a或XIB1-b
Figure BDA00002602632900211
Figure BDA00002602632900221
如从表2可以看到的，在ECV304细胞中，与未经处理的对照细胞相比，凝血酶和LPS刺激导致RhoA活性的增加。与单独用凝血酶或LPS进行的处理相比，在XIB1-a或XIB1-b存在的条件下，用凝血酶或LPS刺激的ECV 304细胞显示RhoA活性的显著降低。
在CaCo-2细胞中，在刺激1分钟以后，PMA刺激导致RhoA活性增加2,3倍，并且在刺激5分钟以后导致RhoA活性增加2倍。当用PMA和XIB1-a或XIB1-b共同处理CaCo-2细胞时，在1和5分钟以后，RhoA激活的大小显著降低。
在HepMec细胞中，在1分钟的刺激以后，凝血酶诱导RhoA活性的3.8倍增加，并且在5分钟的刺激以后，诱导RhoA活性的3.2倍增加。在1分钟以后和在5分钟以后，用XIB1-b对细胞的共同处理显著降低RhoA活性的大小。单独用XIB1-a或XIB1-b进行的处理并不改变基本的RhoA活性。
这些结果表明，本发明的肽如XIB1-a或XIB1-b会降低在上皮和内皮细胞中通过不同刺激剂诱导的RhoA活性，但在未刺激细胞中并不改变基本的GEF活性。RhoA活性由如上所述的GEF激活控制。结果表明，通过抑制GEF活性，XIB1-a和/或XIB1-b可以降低RhoA活性，因而可用于与上皮或内皮屏障功能的局部或全身衰竭相关的疾病或病症的治疗和/或预防。特别是，本文提供的肽可用于治疗和/或预防疾病和病症如烧伤、急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、通气机引起的肺损伤(VILI)、全身炎症反应综合征(SIRS)、急性肾损伤(AKI)、脓毒病、多器官功能障碍综合征(MODS)、或水肿。
实施例4：磷酸化的肌球蛋白轻链(MLC)和肌动蛋白应力纤维形成
为了测量MLC磷酸化和肌动蛋白应力纤维形成，使用了以下细胞系：Caco-2、ECV304和HpMec。在标准条件(37°C、5%CO2和95%rH)下，生长所有细胞。使用的培养基：对于Caco-2为DMEM+1mM丙酮酸钠+20%FCS+1%青霉素链霉素；对于ECV 304为RPMI 1640+10%FCS+1%青霉素链霉素；以及对于HpMec为IMDM+25mM Hepes+10%人血清+1%青霉素链霉素+1%L-谷氨酰胺+ECGS/肝素2ml。在实验以前4小时，通过血清撤除来饥饿细胞。为了诱导GEF活性，在有或没有50μg/ml XIB1-a或XIB1-b存在的条件下，用凝血酶、LPS或PMA刺激细胞指定的时间。在刺激以后，利用4%PFA来固定细胞。通过利用来自Chemicon的“兔抗磷酸肌球蛋白轻链抗体“并以在补充有0.1%TritonX-100的PBS(Gibco)中的3μl/ml的浓度来检测磷酸基MLC。作为检测抗体，使用了来自Invitrogen的Alexa 448标记的“抗兔IgG抗体“，其浓度为在补充有0,1%Triton X-100的PBS(Gibco)中的0.5μl/ml。利用在补充有0,1%Triton的PBS(Gibco)中的浓度为0.5μl/ml的TRITC标记的鬼笔环肽（毒伞素）来检测Aktin。通过利用Zeiss Laser Scan显微镜来分析染色细胞。由对条件不知情的两位独立观察者来评估细胞骨架激活。评估标准设置如下：
肌动蛋白：平行肌动蛋白束不存在=0；明显的束形成=1；显著的平行束=2；磷酸基MLC：存在于细胞极处=0；与肌动蛋白束轻微共定位=1；与肌动蛋白束显著共定位=2。
表3
与未刺激对照相比的相对值；(*)p<0.05，与测试w/o XIB1-a或XIB1-b相比；(*)p<0.05，与测试w/o XIB1-a或XIB1-b相比
Figure BDA00002602632900241
Figure BDA00002602632900251
如从表3可以看到的，在ECV304细胞中，凝血酶和LPS刺激会诱导MLC磷酸化和肌动蛋白应力纤维形成。与单独用凝血酶或LPS进行的处理相比，在XIB1-a或XIB1-b存在的条件下，用凝血酶或LPS刺激的ECV 304细胞显示MLC磷酸化和肌动蛋白应力纤维形成的显著降低。
在CaCo-2细胞中，在刺激1分钟和5分钟以后，PMA刺激会诱导MLC磷酸化和肌动蛋白应力纤维形成的增加。当用PMA和XIB1-a或XIB1-b共同处理CaCo-2细胞时，在1和5分钟以后，细胞骨架激活的大小显著降低。
在HepMec细胞中，在刺激的1分钟和5分钟以后，凝血酶诱导MLC磷酸化和肌动蛋白应力纤维形成的增加。在用XIB1-a或XIB1-b共同处理细胞1分钟和5分钟以后会显著降低细胞骨架激活的大小。单独用XIB1-a或XIB1-b进行的处理并不改变基本的细胞骨架活性。
结果表明，本发明的肽如XIB1-a或XIB1-b会降低在上皮和内皮细胞中由不同刺激剂诱导的MLC磷酸化和肌动蛋白应力纤维形成。MLC磷酸化和肌动蛋白应力纤维形成受如上所描述的RhoA活性控制。结果表明，通过抑制GEF活性和随后的RhoA活性，本发明的肽如XIB1-a和/或XIB1-b会降低MLC磷酸化和肌动蛋白应力纤维，因而可用于与上皮或内皮屏障功能的局部或全身衰竭相关的疾病或病症的治疗和/或预防。特定疾病和病症包括烧伤、急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、通气机引起的肺损伤(VILI)、全身炎症反应综合征(SIRS)、急性肾损伤(AKI)、脓毒病、多器官功能障碍综合征(MODS)、或水肿。
实施例5：内皮和上皮通透性
为了测量穿过内皮和上皮屏障的通透性，使用了以下细胞系：Caco-2、ECV304和HpMec。在标准条件下用孔径大小为4μm的反孔系统(Costar)来生长所有细胞至汇合。在实验开始时，撤除生长培养基并用Hank氏缓冲盐溶液代替。上室补充有2mg/ml FITC标记的葡聚糖(Sigma Aldrich)。如表4所示，刺激细胞。收集来自下室的30分钟样品并确定荧光(FlouroscanAscent FL,Thermo Electron)。在指示处，添加50μg/ml XIB1-a和XIB1-b。
表4
与未刺激对照相比的相对值；(*)p<0.05，与测试w/o XIB1-a或XIB1-b相比；(*)p<0.05，与测试w/o XIB1-a或XIB1-b相比
Figure BDA00002602632900261
Figure BDA00002602632900271
如从表4可以看到的，在ECV304细胞中，凝血酶和LPS刺激会增加屏障通透性。与单独用凝血酶或LPS进行的处理相比，在XIB1-a或XIB1-b存在的条件下，用凝血酶或LPS刺激的ECV 304细胞显示屏障通透性的显著降低。
在CaCo-2细胞中，PMA刺激会诱导屏障通透性的增加。当用PMA和XIB1-a或XIB1-b共同处理CaCo-2细胞时，会显著改善屏障功能。
在HepMec细胞中，凝血酶诱导屏障通透性的增加。用XIB1-a或XIB1-b对细胞的处理会显著降低凝血酶诱导的屏障通透性。单独用XIB1-a或XIB1-b或对照肽进行的处理并不改变屏障功能。
这些结果表明，本发明的肽如XIB1-a或XIB1-b可以降低在上皮和内皮细胞中由不同刺激剂诱导的屏障通透性。屏障通透性和屏障功能受肌动蛋白和肌球蛋白纤维控制。这种细胞骨架成分的激活导致细胞收缩和细胞变圆。相邻细胞失去接触，从而增加组织通透性。因此，实验表明，本发明的肽如XIB1-a和/或XIB1-b会降低在上皮和内皮细胞中由不同药剂诱导的屏障通透性，因而可用于与上皮或内皮屏障功能的局部或全身衰竭相关的疾病或病症的治疗和/或预防。特定疾病和病症包括烧伤、急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、通气机引起的肺损伤(VILI)、全身炎症反应综合征(SIRS)、急性肾损伤(AKI)、脓毒病、多器官功能障碍综合征(MODS)、或水肿。
实施例6：LPS诱导的肺损伤
雄性C57Bl/6小鼠(Charles River，德国)被保持在维也纳医科大学的实验动物设施，喂养有标准饮食并随意提供水。按照AAALAC(实验动物管理的评估和认可协会（Association for Assessment and Accreditation ofLaboratory Animal Care）)的准则进行所有干预。所有实验得到维也纳医科大学的伦理委员会的认可。用异氟醚麻醉小鼠并通过鼻内给予100ng的LPS(E.coli O55:B5，Sigma Aldrich)加以治疗。腹腔内途径(2x2mg/kg)或通过吸入(2x4mg/kg)来给予XIB1-a或XIB1-b，与LPS给予同时地进行首次给予，在LPS吸入以后的1小时进行第二次给予。
支气管肺泡灌洗
在6小时以后，用氯胺酮(Pfizer，Vienna，奥地利)麻醉小鼠并通过下腔静脉出血加以处死。通过正中切口来暴露气管并插入无菌的20-规格导管(BD VenflonTM，Becton Dickinson Infusion Therapy，Helsingborg，瑞典)。通过滴注两个0.5ml等分部分的无菌盐水来获得双侧支气管肺泡灌洗液(BALF)。每只小鼠回收大约0.9-1ml BALF。利用血细胞计数器(Türckchamber)来计数每个样品的总细胞数，用染色有吉姆萨（Giemsa）的细胞离心涂片制剂来进行BALF分类细胞计数。对于蛋白质测量，用缓冲液1:2稀释BALF，所述缓冲液包含300mM NaCl、30mM Tris、2mM MgCl2、2mM CaCl2、以及抑胃酶肽A、亮肽素和抑肽酶(均为20ng/ml；pH 7.4)。利用BCA蛋白试剂盒并按照制造商的说明(Pierce,Rockford,IL)来测量在BALF中的蛋白水平。
表5
支气管肺泡灌洗的中性粒细胞计数和白蛋白含量作为屏障功能病症的替代参数
n=20/实验组，腹腔内给予XIB1-b
数值表示在给予LPS以后6小时，在BALF中的中性粒细胞的计数/ml(x103)(平均值+/SD)。在XIB1-b与对照之间的差异是显著的(p<0.05)。
LPS+NaCl LPS+对照肽 LPS+XIB1-b
85+/-29 88+/-33 25+/-22
n=20/实验组，腹腔内给予XIB1-a或XIB1-b
数值表示在给予LPS以后6小时，BALF的白蛋白含量(μg/ml；平均值+/SD)。在XIB1-b与对照之间的差异是显著的(p<0.05)
LPS+NaCl LPS+对照肽 LPS+XIB1-b
220+/-15 212-10 120+/-12
n=20/实验组，气管内给予XIB1-b
数值表示在给予LPS以后6小时，在BALF中的中性粒细胞的计数/ml(x103)(平均值+/SD)。在XIB1-b与对照之间的差异是显著的(p<0.05)
LPS+NaCl LPS+对照肽 LPS加上XIB1-b
80+/-28 90+/-30 28+/-23
n=20/实验组，气管内给予XIB1-a或XIB1-b
数值表示在给予LPS以后6小时，BALF的白蛋白含量(μg/ml；平均值+/SD)。在XIB1-b与对照之间的差异是显著的(p<0.05)。
LPS+NaCl LPS+对照肽 LPS加上XIB1-b
244+/-28 237+/-32 98+/-20
如从表5可以看到的，用LPS鼻内治疗小鼠会诱导在肺中的屏障功能病症，其产生自增加的中性粒细胞流入量和支气管肺泡空间中的白蛋白积累。用XIB1-b治疗小鼠会显著改善屏障功能，小鼠显示较少的中性粒细胞以及在BALF中白蛋白的减少。在腹腔内和气管内治疗的动物组中，XIB1-a或XIB1-b的有益效果是相等的。
用对照肽对小鼠的治疗并不改变中性粒细胞计数和BALF的白蛋白含量。
LPS吸入模型是用来模拟ALI/ARDS的接受的动物模型，因为关于在内皮和上皮细胞中的通透性变化和在支气管肺泡空间中的随后的中性粒细胞和白蛋白积累，它类似于人类疾病(Lung Cell Mol Physiol(2008),295:L379-L399)。在LPS吸入模型中XIB1-a或XIB1-b的有益效果说明本发明的肽用来治疗和/或预防与上皮或内皮屏障功能的局部或全身衰竭相关的疾病或病症的有用性。具体地说，本发明的肽可用于治疗和/或预防疾病和病症如，例如，急性肺损伤(ALI)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。
XIB1-b与Bβ15-42的比较
另外，如上所述的相同设置用于相对于Bβ15-42(PLoS ONE(2009),4(4):e5391)，一种源自血纤蛋白并具有序列GHRPLDKKKREEAPSLRPAPPPISGGGYR(SEQ ID NO:41)的肽，来比较XIB1-b的影响。以与XIB1-b相同的方式添加Bβ15-42。再次，测量BALF的蛋白质含量和细胞计数。
表6
n=20/实验组，腹腔内给予XIB1-b或Bβ15-42
数值表示在给予LPS以后6小时在BALF中的中性粒细胞的计数/ml(x103)(平均值+/SD)。在XIB1-b与对照之间的差异是显著的(p<0.05)
Figure BDA00002602632900301
n=20/实验组，腹腔内给予XIB1-b或Bβ15-42
数值表示在给予LPS以后6小时，BALF的白蛋白含量(μg/ml；平均值+/SD)。在XIB1-b与对照之间以及在XIB1-b与Bβ15-42之间的差异是显著的(p<0.05)
Figure BDA00002602632900302
n=20/实验组，气管内加上腹腔内给予XIB1-b或Bβ15-42
数值表示在给予LPS以后6小时在BALF中的中性粒细胞的计数/ml(x103)(平均值+/SD)。在XIB1-b和对照之间以及在XIB1-b和Bβ15-42之间的差异是显著的(p<0.05)
Figure BDA00002602632900303
n=20/实验组，腹腔内给予XIB1-b或Bβ15-42
数值表示在给予LPS以后6小时，BALF的白蛋白含量(μg/ml；平均值+/SD)。在XIB1-b和对照之间以及在XIB1-b和Bβ15-42之间的差异是显著的(p<0.05)
Figure BDA00002602632900304
利用LPS吸入模型，比较了XIB1-b和Bβ15-42对在BALF中的中性粒细胞流入量和白蛋白积累的影响。在可比的范围内，用XIB1-b或Bβ15-42对小鼠进行的腹腔内治疗会降低在BALF中的中性粒细胞浸润。然而，如本文中惊讶地发现的，在降低BALF的白蛋白含量方面，XIB1-b比Bβ15-42显著更加有效。这清楚地表明，XIB1-b可以更有效地治疗和预防如本文描述的与上皮或内皮屏障功能的局部或全身衰竭相关的疾病或病症。特定疾病和病症包括烧伤、急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、通气机引起的肺损伤(VILI)、全身炎症反应综合征(SIRS)、急性肾损伤(AKI)、脓毒病、多器官功能障碍综合征(MODS)、或水肿。
实施例7：通气机引起的肺损伤(VILI)
用健康的C57BL/6(8-10周龄，体重为19-25g)进行实验。按照AAALAC的准则进行所有干预。所有实验得到阿姆斯特丹大学的伦理委员会的认可。
借助于LPS的预激发
在开始机械通气以前2小时，借助于鼻内注射，用LPS(剂量：50μg/小鼠)(或盐水)来激发小鼠，以诱导肺损伤。
XIB1-b或随机肽的给予
在开始机械通气以前10分钟，i.v.给予XIB1-1b(或随机肽)(剂量：4mg/kg负荷剂量)，接着i.v.注射1mg/kg/h。
在机械通气期间的仪器仪表和麻醉
在整个实验期间，利用升温路径，将直肠温度保持在36.5-37.5°C之间。通过腹腔内注射氯胺酮、美托咪定、和阿托品的混合物来实现麻醉。
机械通气策略
在全身麻醉下，将外径为1.0mm和内径为0.6mm的Y型管连接器外科插入气管。将小鼠置于仰卧位并连接于通气机。借助于10cm H2O的吸气压力(导致VT~7.5mL/kg；低VT，LVT)或18cm H2O的吸气压力(导致VT~15mL/kg；高VT，HVT)来压力受控通气小鼠。对于两种MV策略，呼气末正压(PEEP)均设定为2cm H2O。在整个实验过程中，将吸入氧气的分数保持为0.5。在整个实验过程中，将吸气与呼气比保持为1:1。
流体支持策略
在开始MV以前1小时，小鼠接受腹腔内推注正常盐水，接着经由腹腔内导管每30分钟接受推注正常盐水。
血流动力和通气监测
在整个完整实验期间，非侵入性地监测收缩期血压和心率。借助于呼吸测定系统，每小时检查VT。
测量
借助于22规格Abbocath–T导管(Abbott，Sligo，爱尔兰)并通过滴注3次0.5mL等分部分的盐水进入气管来获得BALF。近似地，每只小鼠回收1.0mL的BALF并利用血细胞计数器(Beckman Coulter,Fullerton,CA)来确定细胞计数。随后，用染色有改良吉姆萨染液，Diff-Quick(DadeBehring AG，Düdingen，瑞士)的细胞离心涂片制剂进行分类计数。将上清贮存在-80°C下。
测定
利用Bradford Protein Assay Kit(OZ Biosciences，Marseille，法国)，按照制造商的说明并使用牛血清白蛋白作为标准，来确定在BALF中的总蛋白水平。通过ELISA，通过利用抗小鼠IgM敏化96条微孔板，并按照制造商的说明(IMMUNO-TEK试剂盒，来自ZeptoMetrix)，来确定小鼠IgM。
因此，表明，XIB1-b可以降低相关于较少肺损伤的肺部炎症并且减小肺水肿；参见图1。
在该实验中，通过将小鼠预暴露于LPS，接着具有高或低潮气量的机械通气，来诱导肺损伤。用XIB1-b或杂乱肽来治疗小鼠。在最具攻击性的实验方案(LPS-HTV)中，用XIB1-b对小鼠的治疗导致在BALF中总细胞计数、中性粒细胞计数、总蛋白含量和IgM含量的显著减少。通过利用杂乱肽，没有观测到改善。利用温和的实验方案，与杂乱肽相比，XIB1-b(LPS+LTV)显著降低在BALF中的总细胞计数和中性粒细胞计数。温和的治疗方案并不引起总蛋白含量和IgM含量的显著增加，因而不能观测到XIB1-b的影响。
本动物模型类似于发展ALI/ARDS作为肺炎的后遗症的患者的临床情况。使用XIB1-b所获得的积极效果证明了本发明的肽适用于治疗或预防与上皮或内皮屏障功能的局部或全身衰竭相关的疾病或病症。特定疾病和病症包括烧伤、急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、通气机引起的肺损伤(VILI)、全身炎症反应综合征(SIRS)、急性肾损伤(AKI)、脓毒病、多器官功能障碍综合征(MODS)、或水肿。
Figure IDA00002602633300011
Figure IDA00002602633300021
Figure IDA00002602633300041
Figure IDA00002602633300051
Figure IDA00002602633300061
Figure IDA00002602633300071
Figure IDA00002602633300081
Figure IDA00002602633300091

Claims (21)

1.一种肽，包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：
GX1RPX2X3X4X5GGX6(SEQ ID NO:1)
其中
X1是选自由R和A组成的组的氨基酸；
X2缺失或者是选自由L和V组成的组的氨基酸；
X3缺失或者是由1至5个氨基酸组成的氨基酸序列；
X4缺失或者是由GG组成的氨基酸序列；
X5表示选自由A、I和S组成的组的两个氨基酸；以及
X6缺失或者是由1至5个氨基酸组成的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的肽，所述肽能够抑制Rho GTP酶的活性。
3.根据权利要求1或2所述的肽，进一步包括在所述序列的C端的X7，其中X7是选自由NH2、白蛋白、聚乙二醇、葡聚糖、铁蛋白、羟乙基淀粉和抗体的Fc部分组成的组中的部分。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的肽，其中，X1是R。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的肽，其中，X2是L或V。
6.根据权利要求5所述的肽，其中，X2是L。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的肽，其中，X3是PPP。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的肽，其中，X4是GG。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的肽，其中，X5是IS或AS。
10.根据权利要求9所述的肽，其中，X5是IS。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的肽，其中，X6缺失。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的肽，其中，X1是R，X2是L，X3缺失，X5是IS并且X6缺失，或者其中X1是R，X2是V，X3缺失，X5是IS并且X6缺失。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的肽，其中，所述肽包括选自由下述组成的组中的氨基酸序列或者由选自由下述组成的组中的氨基酸序列构成：
GRRPLGGISGG(SEQ ID NO:3)；
GRRPVGGISGG(SEQ ID NO:6)；
GRRPLISGG(SEQ ID NO:4)；
GRRPVISGG(SEQ ID NO:7)；
GRRPLPPPISGG(SEQ ID NO:8)；
GRRPVPPPISGG(SEQ ID NO:9)；
GRRPLGGAAGG(SEQ ID NO:10)；
GRRPVGGAAGG(SEQ ID NO:11)；
GRRPLPPPAAGG(SEQ ID NO:12)；
GRRPVPPPAAGG(SEQ ID NO:13)；
GRRPLGGASGG(SEQ ID NO:14)；
GRRPVGGASGG(SEQ ID NO:15)；
GRRPLPPPASGG(SEQ ID NO:16)；
GRRPVPPPASGG(SEQ ID NO:17)；
GRRPLGGIAGG(SEQ ID NO:18)；
GRRPVGGIAGG(SEQ ID NO:19)；
GRRPLPPPIAGG(SEQ ID NO:20)；
GRRPVPPPIAGG(SEQ ID NO:21)；
GARPLGGISGG(SEQ ID NO:22)；
GARPVGGISGG(SEQ ID NO:23)；
GARPLPPPISGG(SEQ ID NO:24)；
GARPVPPPISGG(SEQ ID NO:25)；
GARPLGGAAGG(SEQ ID NO:26)；
GARPVGGAAGG(SEQ ID NO:27)；
GARPLPPPAAGG(SEQ ID NO:28)；
GARPVPPPAAGG(SEQ ID NO:29)；
GARPLGGASGG(SEQ ID NO:30)；
GARPVGGASGG(SEQ ID NO:31)；
GARPLPPPASGG(SEQ ID NO:32)；
GARPVPPPASGG(SEQ ID NO:33)；
GARPLGGIAGG(SEQ ID NO:34)；
GARPVGGIAGG(SEQ ID NO:35)；
GARPLPPPIAGG(SEQ ID NO:36)；从及
GARPVPPPIAGG(SEQ ID NO:37)。
14.一种多核苷酸，编码根据权利要求1至13中任一项所述的肽。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的肽或根据权利要求14所述的多核苷酸，用作药物。
16.一种药物组合物，包含根据权利要求1至13或15中任一项所述的肽和/或根据权利要求14或15所述的多核苷酸，可选地进一步包含药用载体和/或稀释剂。
17.根据权利要求1至13或15中任一项所述的肽，根据权利要求14或15所述的多核苷酸，或者根据权利要求16所述的药物组合物，用于治疗或预防与上皮或内皮屏障功能的局部或全身衰竭相关的疾病或病症。
18.根据权利要求1至13、或15中任一项所述的肽，根据权利要求14或15所述的多核苷酸，根据权利要求16所述的药物组合物，用于治疗和/或预防选自由急性肺损伤(ALI)、急性肾损伤(AKI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、通气机引起的肺损伤(VILI)、全身炎症反应综合征(SIRS)、脓毒病、烧伤和多器官功能障碍综合征(MODS)组成的组中的疾病或病症。
19.一种通过将有效剂量的根据权利要求1至13、15或17中任一项所述的肽，根据权利要求14、15或17中任一项所这的多核苷酸，或者根据权利要求16或17所述的药物组合物给予受试者来治疗或预防与上皮或内皮屏障功能的局部或全身衰竭相关的疾病或病症的方法。
20.一种通过将有效剂量的根据权利要求1至13、15或18中任一项所述的肽，根据权利要求14、15或18中任一项所述的多核苷酸，或者根据权利要求16或18所述的药物组合物给予受试者来治疗或预防疾病或病症的方法，所述疾病或病症选自由急性肺损伤(ALI)、急性肾损伤(AKI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、通气机引起的肺损伤(VILI)、全身炎症反应综合征(SIRS)、脓毒病、烧伤和多器官功能障碍综合征(MODS)组成的组。
21.根据权利要求1至13、15、17或18中任一项所述的肽，根据权利要求14、15、17或18中任一项所述的多核苷酸，根据权利要求16、17或18中任一项所述的药物组合物或者根据权利要求19或20所述的方法，其中，给予的途径是胃肠道外途径或口服途径。
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