CN108027366A

CN108027366A - 屏障功能测量

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Publication number: CN108027366A
Application number: CN201680052551.XA
Authority: CN
Inventors: P·沃特; S·J·特里奇; H·L·兰茨; M·K·弗门
Original assignee: Tasmania Mime Co
Current assignee: Tasmania Mime Co
Priority date: 2015-07-09
Filing date: 2016-07-08
Publication date: 2018-05-11
Anticipated expiration: 2036-07-08
Also published as: WO2017007325A1; RU2017146805A; US20180196035A1; KR20180028503A; BR112018000452A2; EP3320338B1; NL2015130B1; JP2018522586A; KR102579749B1; CN108027366B; US11662342B2; DK3320338T3; RU2752085C2; RU2017146805A3; EP3320338A1; CA2991876A1; AU2016291078B2; AU2016291078A1; JP6838749B2

Abstract

本发明涉及用于测量化合物对上皮细胞屏障功能的调节作用的改进的方法。所述方法允许单独或组合的试验化合物的高通量筛选。改进上皮屏障功能的化合物或负面地影响上皮屏障功能的化合物可使用本文所述的方法分析。

Description

屏障功能测量

背景技术

上皮组织包含四种基本组织类型之一(上皮组织、结缔组织、肌肉组织、和神经组织)。上皮细胞在动物(脊椎动物和无脊椎动物两者)以及植物中发现，并且在生物体的生理中起重要作用。

上皮细胞衬贴(line)在身体的腔道(cavity)和内腔(lumen)的外部和内部两者。内皮(血管、心脏、和淋巴管的内衬)和间皮(形成心包、胸膜、和腹膜的壁)是上皮的特化形式。

上皮细胞形成作为内部身体的防护的上皮屏障。细胞和它们形成的屏障分隔身体的内部和外部腔道，并且为身体提供选择性吸收和分泌特定物质的手段。由于该原因，上皮屏障和上皮细胞在例如化学和营养吸收、跨细胞转运、感觉的觉察、废物排泄、和保护免受微生物感染等的多种生物过程中是重要的。所有上皮通常通过胞外纤维基底膜与下面的组织分隔开。

作为实例，上皮形成肺的结构，包括肺泡或气囊，并且衬贴多数器官，例如胃和小肠、肾、和胰腺。它们还衬贴食管，并且在管和腺例如胆管和唾液腺中发现。它们形成味蕾，衬贴鼻、耳和眼以及皮肤。

内皮是衬贴血管和淋巴管的内表面的内皮细胞薄层，在内腔中的循环血液或淋巴与管壁的剩余部分之间形成界面，例如血脑屏障。

间皮细胞形成衬贴身体的浆液腔(serous cavity)和内部器官的特化扁平样(pavement-like)细胞单层。称为间皮的该层的主要功能是提供滑的、非粘附的、和保护性的表面。然而，间皮细胞起其他关键作用，包括跨浆膜腔(serosal cavity)的流体和细胞运输、抗原呈递、炎症和组织修复、凝血和纤维蛋白溶解以及肿瘤细胞粘附。

上皮细胞由多种可区别特性表征。上皮细胞在称为上皮的组织片中结合在一起。这些片通过多种类型的相互作用保持在一起，所述相互作用包括紧密连接(tightjunction)、粘着连接(adheren)、桥粒(desmosome)、和间隙连接(gap junction)。紧密连接起着上皮细胞的顶(上部)和基部(下部)区域之间的划定以及两个区域之间的极化的作用。上皮在基部侧(basal side)通过称为基部层(basal lamina)的基部膜支撑。

如所述的，一个区别特征是将极化的上皮细胞的质膜分隔为顶部和基底侧部的紧密连接的形成。细胞的顶部(apical portion)是当例如在组织培养板上、在体外生长的细胞单层中取向时细胞的暴露部分或顶部部分(top portion)。在体内的上皮细胞片(epithelial cell sheet)的上下文中，顶面将暴露于由上皮衬贴的内腔。细胞的基底侧面由底部或基部以及侧(side)部或侧向(lateral)部构成。在组织培养板上生长的细胞的上下文中，细胞的基底侧膜是接触组织培养板的细胞部和位于紧密连接下的细胞侧部。在体内的上皮细胞片的上下文中，细胞的基底侧面将暴露于由上皮衬贴的身体的内部部分。多种蛋白质特异性地定位于顶膜或基底侧膜。

鉴于重要性，上皮细胞(包括内皮细胞和间皮细胞)广泛用于研究多种生物过程并不奇怪。所述细胞非常适用于例如分子细胞生物学、(微生物)发病机制、药理学、和毒理学等领域的研究。

已开发多种模型系统来研究上皮细胞和屏障功能。研究上皮细胞通常需要进入或改变与上皮细胞的顶面或基底侧面接触的培养基的能力。由于标准组织培养装置不允许这类操作，已开发特化细胞培养装置。用于多数体外模型系统的主要装置是可渗透组织培养板插入物(insert)，例如(Corning,Inc.,Lowell,Mass.)。这些装置提供可插入组织培养板的孔中的人造的可渗透生长支撑体(permeable growth support)。通过穿过可渗透生长支撑体的表面培养极化的细胞单层，所述极化的细胞单层将起到分隔组织培养孔的顶室和基底侧室的选择性屏障的作用。

这类模型系统在新药物的开发、理解多种疾病、和理解试剂的毒性作用中起重要作用。

例如，在药物开发过程中，在得到许可和随后的商业化之前，应表明潜在的治疗剂或药物候选物对它们的预期用途是安全且有效的。多种药物已知负调节上皮屏障功能(参见例如，Youmba等人J Pediatr Gastroenterol Nutr2012；54:463–70)。另一方面，例如通过暂时打开屏障来调节上皮细胞的屏障功能的化合物可用于改善对体循环和对器官的药物递送(Deli,Biochimica et Biophysica Acta–Biomembranes 1788(4)2009,892–910)。同样地，暂时打开血脑屏障可用于对脑的药物递送。此外，这类系统对于理解包括在食物、化妆品、和饮料中发现的那些的各种化合物对屏障功能的作用是重要的。例如，艰难梭菌(Clostridium difficile)毒素通过改变紧密连接蛋白的膜微区(membrane microdomain)定位来干扰上皮屏障功能(Nusrat等人Infect Immun.2001Mar；69(3):1329-36.)，而其他组分可增加或补充上皮屏障功能。

虽然目前的上皮细胞模型系统对于药物发现有用，但是由于该操作需要的高度均匀的细胞单层，在这些系统中操作细胞已证明是困难的。实验工作需要选择正确的细胞类型，产生多种均匀的细胞单层，并且确保细胞单层完整性足以进行实验。此外，所有这些应是完善确立的，从而允许实验上可接受结果的重复产生。这些困难可使开发期望的上皮细胞模型系统成为需要数月或数年工作的艰巨过程。

因此，对可快速提供大量不同化合物的上皮屏障功能的数据的新的高通量筛选分析的开发存在较大兴趣。因此提供导致更好地理解化合物对上皮屏障功能的作用的改进分析是本发明的目标。

发明内容

定义

在整个说明书和权利要求中使用关于本发明的方法、组合物、用途、和其他方面的各种术语。除非另有指明，应赋予这类术语本发明所属领域的普通含义。其他具体定义的术语应以与本文提供的定义一致的方式解释。虽然可在本发明的试验的实践中使用与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料，但本文描述优选的材料和方法。

“一个/种(a,an)”和“所述(the)”：除非内容清楚地另有指明，这些单数形式术语包括复数指示物。因此，例如，提及“一个/种细胞”包括两个/种以上细胞的组合等。

“约(about,approximately)"：当指可测量值例如量、和持续时间等时，这些术语意为涵盖从特定值的±20％或±10％、更优选±5％、甚至更优选±1％、仍更优选±0.1％的变化，因为这类变化适用于进行所公开的方法。

“含有”：该术语解释为是包含性的和开放的，并且不是排除性的。具体地，所述术语和其变化意为包括具体特征、步骤或组分。这些术语不应解释为排除其他特征、步骤或组分的存在。

“示例性”：该术语意为“作为实例、例子或说明”，并且不应解释为排除本文公开的其他配置。

“微流体系统(microfluidic system)”：该术语指的是配置为包含、流动、处理或另外操纵例如为亚皮升至亚毫升、或毫升范围的小体积的液体的装置、或装置的流体部件。在一些实例实施方案中，微流体特征例如微流体通道的最大截面尺寸可小于1mm、小于500微米、小于100微米、小于50微米、或小于25微米。

“发光探针”：该术语指的是发射光的任何探针或分子。发光的类型包括生物发光、化学发光、电化学发光、电致发光、和光致发光。探针本身可以是发光的，发光可为涉及发光探针的化学或酶反应的结果，或可为用光激发探针、然后通过探针在不同波长下的光发射的结果。后者还称为荧光。荧光是一种发光，并且是光子的吸收的结果，因此是一种光致发光。在本发明的上下文中，在术语“发光探针”下还包括比色探针。

探针：该术语指的是存在或不存在可检测(定量和/或定性)的系统、组合物或分子，例如可检测的分子、标记物或物质。在本发明的上下文中，探针用于测量上皮屏障功能。通过提供探针和测量在顶侧、基底侧或两侧由探针产生的信号，得到上皮屏障功能的量度。例如，如果在细胞层的一侧提供探针，探针在另一侧的出现表明探针穿过了细胞层。增加的出现速率表明增加的跨细胞层“渗漏”。换言之，在本发明的上下文中，探针指的是可检测的某物；例如，提供信号或可诱导从而提供信号。本领域技术人员理解，在本发明的上下文中，这可为允许例如在上皮层的细胞的顶端、基底侧，或甚至在这些细胞中检测的任何类型的物质、分子或系统。例如，基于监测探针的分布、或可检测探针的再分布的速率，可测定上皮屏障功能。例如，如可从现有技术观察到的，探针还可称为(可检测)标记物、物质、标记物质(marker substance)、试剂、标签、或分子。可容易地检测和测定的探针的实例包括但不限于，发光物质和化合物、染料、荧光团、放射性化合物、和传感分子(sensor molecule)等。然而，还设想可在顶侧(apical side)和/或基底侧(basolateral side)(或在细胞内)检测其存在的其他分子。本领域技术人员理解探针提供的信号的检测将取决于使用的探针或标记物质的类型。例如，在探针是荧光探针的情况下，可测定荧光。例如在探针是放射性探针的情况下，可测定放射性。例如，在探针是酶底物的情况下，可通过对样品进行酶分析来测定探针。本领域技术人员理解探针提供的信号将取决于使用的探针的类型。本领域技术人员理解本公开不特别限于使用的探针的类型，只要其可在本发明的上下文内合适地使用即可。

优选地，探针是光学探针，即探针产生或提供的信号可使用光学手段检测(例如测量吸收、荧光、或化学发光)。允许光学监测的广泛公知的探针包括但不限于发光探针(包括荧光探针)、染料、和比色探针。探针还可由在细胞的一侧(顶侧或基底侧)提供的传感分子或组合物、和在细胞的另一侧提供的其他分子或组合物组成，其中当与所述其他分子或组合物接触时，组合物或传感分子是优选光学地可检测的。检测到的信号表明其他分子或组合物已穿过细胞，指示上皮屏障功能。

具体实施方式

公开的是用于测定试验化合物对上皮屏障功能的调节作用的体外方法。上皮屏障不是固定的、静态的结构。它们可响应于各种不同的刺激而变得更漏或更少渗漏。疾病过程和药剂可使屏障衬里(barrier linings)更漏，这类渗漏的位点通常在例如紧密连接处(Mullin等人(2005)Drug Discov.Today,10:395-408)。

因为渗透性是动态现象，对一种刺激增加和/或对另一刺激减少，任何给定上皮组织中的上皮屏障的基部状态(basal state)可通常调整为变得更紧密或调整为变得更漏。

通常，增加的渗漏是有害的，而减少的渗漏生理上或免疫上对生物体有益。

现在本发明的方法使得可以测定、测量、分析、预测或建立化合物对上皮屏障功能的负或正作用。在一些实施方案中，所述方法使得可以获得化合物对上皮屏障功能的调节作用的详细启示。所述方法使得可以比较不同的化合物、化合物浓度或不同的条件对上皮屏障功能的作用。特别地，所述方法允许研究或建立作为时间的函数的化合物对上皮屏障功能的调节作用。本发明的方法使得可以区别例如紧密连接的干扰(disruption)、在细胞层/膜中针孔的出现、由于不完整单层附着而从侧面渗漏等的细胞层(或单层)中发生的多种渗漏现象；上述全部在本领域的方法例如对Transwell系统下是不可能的。重要地，本发明的方法允许对上皮屏障功能的调节作用的实时监测；实时监测使得能够测定渗漏时间(time to leak)；对于化合物所具有的对细胞层的上皮屏障功能的作用，这是比荧光强度好很多的值，因为后者还包含例如由于液位引起的施加压力等方面。

因为实验可由实时成像跟踪，本发明的方法在使用中较简单，而对于Transwell系统，必须从孔随时间取等份，并且与Transwell系统分开测量。此外，由于本发明的方法处理微流体通道中的小体积，可观察到荧光的甚至最轻微的变化；这与低量的荧光在大流体量中消失的Transwell系统相反。

在一些实施方案中，用本发明的方法得到的结果指示化合物的毒性作用。在一些实施方案中，用本发明的方法得到的结果指示试验化合物对暂时开放上皮屏障(即暂时减少屏障功能)的有用性。在一些实施方案中，用本发明的方法得到的结果指示化合物可发挥其毒性作用的机制(如何和多快)。在一些实施方案中，用本发明的方法得到的结果指示试验化合物的屏障功能改进作用。

所述方法是可靠的、简单的和高度可再现的，使其特别适用于筛选的目的。此外，本发明的方法允许快速识别得到的结果对于化合物对屏障功能的作用是否是代表性的、或者结果是否应作为由于实验缺陷的错误而拒绝。本发明的方法允许实时测量。

所述方法依靠测量探针从微流体系统中培养的细胞的上皮层的一侧(顶侧或基底侧)至上皮层的另一侧的运动(被动的或主动的；例如在实践中可施加超压从而增加化合物通过上皮屏障至另一侧的流入；凝胶允许通过凝胶的间质流动)(或者，在探针包含传感子(sensor)和本文所述的其他分子或组合物的情况下，所述其他分子或组合物的运动)。随时间、并且在不存在或存在试验化合物下进行测量。运输的速率、或随时间的运输的量、或特别是完成某种水平(相对的或绝对的)的运输的时间在试验化合物对所述方法所使用的上皮细胞的作用中提供新的启示。

用于测定试验化合物对上皮屏障功能的调节作用的体外方法描述为包括以下阶段或步骤的方法：

a)提供包含多个中空微流体通道的微流体系统，其中所述通道至少部分由凝胶填充；

b)将上皮细胞引入微流体通道，并且允许上皮细胞接触凝胶；

c)培养引入微流体通道的上皮细胞，由此允许所述细胞在凝胶上形成具有顶侧和基底侧的细胞层，优选由此允许细胞在微流体通道中形成具有腔侧和基底外侧的管状结构；

d)向微流体通道中的上皮细胞提供探针和试验化合物，其中探针和试验化合物独立地提供至顶侧、基底侧、或顶侧和基底侧两者；

e)在各时间点处测定由微流体通道中、或凝胶中、或微流体通道和凝胶两者中的探针提供或产生的信号。

惊人地发现步骤e)中测定的、特别是在各时间点的、信号的绝对值、值的变化、或值之比是化合物对上皮细胞的屏障功能的作用的高度可再现的指示。所述值可例如用于表达化合物对上皮细胞或对上皮屏障的毒性作用。

在第一步骤中，提供包含多个中空微流体通道的微流体系统。显然，微流体系统需要适用于培养上皮细胞。此外，微流体系统应提供进入腔侧(apical)或基底外侧(basolateral)的通路，但在优选实施方案中，一旦在微流体系统中培养上皮细胞，则进入顶侧和基底侧二者。

适用于培养细胞的微流体系统是本领域技术人员已知的，并且指的是配置为用于含有，流动，处理，或另外操纵例如为亚皮升至亚毫升、或毫升范围的小体积的液体的装置，或装置的流体部件。

本发明的方法中使用的微流体系统适用于体外细胞培养支持，并且可通过例如由被动方式如被动矫平(leveling)或由使用主动泵如注射泵等提供流(flow)的微流体通道系统对活细胞提供主动支持(active support)。流(flow)属于活细胞的支持系统，其中流体通过使用外部主动或被动压力源例如压力泵、加压罐、或真空泵等递送至或提取自一些或全部通道。主动支持涉及用于活细胞的支持系统，其中一些或全部通道接收主动微流体流。主动微流体系统可与使用其中流体循环由天然存在的机制如重力、毛细作用、或表面张力等推动从而驱动流的被动微流体流的系统相反。本发明的方法中的微流体系统可提供流或无流操作。

使用的微流体系统可向其中细胞位于整个微流体通道系统的微流体通道中培养的细胞提供流，由此向细胞提供合适的流体环境。

微流体系统可包括基本上均匀口径的通道，或可包括具有包括如流体流动动力学所需要的收缩和扩张的变化口径的通道。

本发明的方法中使用的微流体系统不特别限于任何特定微流体系统。示例性微流体装置在S.J.Trietsch,G.D.J.Joore,T.Hankemeier,P.Vulto,Microfluidictiter plate for stratified 3D cell culture,Lab Chip 2013,vol.13,no.18,pp.3548-3554、Edinson Lucumi Moreno,Siham Hachi,Kathrin Hemmer,SebastiaanJ.Trietsch,Aidos S.Baumuratov,Thomas Hankemeier,Paul Vulto,Jens C.Schwamborn和Ronan M.T.Fleming,Differentiation of neuroepithelial stem cells intofunctional dopaminergic neurons in 3D microfluidic cell culture,Lab Chip,Vol.15,No.11,pp.2419-2428、WO2012120102、WO2014038943、Mu等人,Lab on a Chip,2013,13,1612-1618、或Jang等人,integr biol,2013,5,1119中描述。然而，后两者不允许高通量筛选，并且是较不优选的。

WO2012120102中描述的装置例如包括中空体积，所述中空体积(a)通过在体积内部形成的至少两个相位引导件(phaseguide)内部地分为至少第一、第二、和第三子体积，和(b)包括当参照体积中的弯月面或主体液体(bulk liquid)的运动进行判断时为相对上游和相对下游的部分。所述装置至少包括连接从而允许体积的上游外部和相应的所述子体积之间的流体连通的第一、第二和第三流体导管；和连接从而允许体积的下游外部和所述子体积之间的流体连通的至少一其他导管。第一所述子体积可包含在凝胶或凝胶样物质中或由凝胶或凝胶样物质支撑的细胞；第二子体积与第一子体积连通从而允许第一和第二子体积之间的物质运输，并且包含至少一种凝胶或凝胶样物质。在其中所述的一些实施方案中，第三子体积至少与第一子体积连通从而允许第一和第三子体积之间的物质运输，并且其中所述第三子体积包含灌注液。

优选微流体板或系统包含多个微流体网络和提供进入微流体网络的入口。各微流体网络包含毛细管压力屏障。各入口由具有底面的入口室形成。

在实践中，有具有用于分配流体的末端的分配部的流体分配器用于将液体和/或凝胶和/或凝胶前体插入微流体网络，由此通过毛细管压力屏障的方式停止或图案化(patterning)液体/凝胶/凝胶前体的至少一种。微流体板可用于研究流体或其内容物或评估流体或其内容物之间的相互作用。

毛细管压力屏障可例如将微流体网络的微流体室分为第一室部分和第二室部分。具有基于生命的颗粒例如细胞的流体、凝胶或凝胶前体可通过入口中的流体分配器的分配部排出。所述液体或凝胶(前体)将从入口流动至微流体室的第一室部分并且停止，其前进由于毛细管压力屏障的存在而控制或图案化。液体或凝胶(前体)可由毛细力、重力或其他驱动力运输通过微流体网络。

这类毛细管压力屏障的使用的实例是用第一流体例如凝胶等选择性地填充微流体网络。用所述第一流体填充微流体网络的程度通过停止网络中流体的前进的毛细管压力屏障来确定。在凝胶化时，微流体网络的剩余部分可用第二流体填充，从而发生两种流体之间的交换、或发生流体或其组分之间的反应。示出的其实例是在两侧是介质(medium)灌注流的胞外基质凝胶中的细胞的3D培养。这在S.J.Trietsch,G.D.J.Joore,T.Hankemeier,P.Vulto,Microfluidic titer plate for stratified 3D cell culture,Lab Chip 2013,vol.13,no.18,pp.3548-3554中详尽描述。

使用毛细管压力屏障的其他实例在C.Phurimsak,E.Yildirim,M.D.Tarn,S.J.Trietsch,T.Hankemeier,N.Pamme,P.Vulto,Phaseguide assisted liquidlamination for magnetic particle-based assays,Lab Chip,2014,vol.14,no.13,pp.2334-2343、P.Vulto,G.Dame,U.Maier,S.Makohliso,S.Podszun,P.Zahn,G.A.Urban,Amicrofluidic approach for high efficiency extraction of low molecular weightRNA,Lab Chip,2010,vol.10,no.5,pp.610-6、Edinson Lucumi Moreno,Siham Hachi,Kathrin Hemmer,Sebastiaan J.Trietsch,Aidos S.Baumuratov,Thomas Hankemeier,Paul Vulto,Jens C.Schwamborn和Ronan M.T.Fleming,Differentiation ofneuroepithelial stem cells into functional dopaminergic neurons in 3Dmicrofluidic cell culture,Lab Chip,Vol.15,No.11,pp.2419-2428、US020070280856A1、US020040241051A1、US000004761381A、US000006271040B1、WO2006074665、US6601613B2、US6637463B1中给出。毛细管压力屏障可为疏水补片(hydrophobic patch)或条带(stripe)、相对于后续的网络材料较不亲水的补片或条带、通道扩展、衬贴于通道或室中的一个或多个柱(pillar)或杆(post)、通道或室基片(substrate)中的槽、和材料向室容积中的凸入物等的任何一种。

特别优选的是Mimetas的OrganoPlates(http://mimetas.com/products.php)。

存在使得能够培养和筛选宽范围的生理上相关的器官和组织模型的基于微流体学的培养板。

这类微流体系统的微流体网络通常包含通道、室、多个通道或室，或其组合，其中至少一个通道或室的至少一种尺寸通常并且优选小于1毫米。

微流体网络通常构建为包含底部基体、含有微流体网络的层和顶部基体的水平分层结构(horizontally layered setup)。微流体层还可图案化至顶部或底部基体之一或两者中或上。微流体网络包含聚合物或玻璃顶部和底部基体。微流体网络可通过将网络蚀刻至任一基体或在任一基体的顶部上的聚合物层中图案化来构建。在特定实施方案中，顶部或底部基体的至少一种由玻璃或亲水性聚合物构成，从而流体运输可仅通过毛细力实现。微流体板(系统)可使用光刻技术、热压印(hot-embossing)技术、软压印(soft embossing)技术、蚀刻技术、复制成形(replication moulding)或注射成形技术构建。

通道的壁可为任何类型的材料，包括但不限于玻璃，聚合物如苯乙烯、PMMA、COC，弹性体如硅橡胶、聚二甲硅氧烷，陶瓷，金属。

通道至少部分由凝胶优选水凝胶填充。本领域技术人员理解不同种类的的凝胶是合适的，并且可用于本发明的上下文中，包括常规用于细胞培养技术的那些，只要所述凝胶允许在本发明的上下文中的上皮细胞的培养即可。的确，实验显示可使用不同凝胶，例如本文特别提及的那些。的确，本领域技术人员选择合适的凝胶将没有困难。凝胶可提供至如上所述的通道。提供凝胶后，其在引入其他流体前引起凝胶化。该流体通常为提供营养和氧气的生长介质。通过该流体，可引入细胞从而使其靠(aginst)凝胶沉积，并且允许细胞形成细胞层。在这些细胞引入培养时，它们通常形成可通过管腔(lumen of the tube)灌注有流的管。因此，将凝胶提供至通道，从而凝胶化后，上皮细胞可通过介质例如培养基的方式引入通道，允许细胞与细胞接触，并且在凝胶上形成细胞层(例如小管/脉管)，由此产生顶侧和基底侧。

例如，凝胶前体(通常来自胞外基质(extracellular matrix，ECM)凝胶，例如胶原、纤维蛋白原、纤连蛋白、基底膜提取物如基质胶(Matrigel)或合成凝胶)可用移液管(通常为重复移液管(repeating pipette)例如EppendorfM4(Eppendorf AG，德国，目录号4982 000.012)与Eppendorf Combitips(Eppendorf AG，德国，目录号0030 089.405)组合)引入微流体板的入口。凝胶前体可进一步含有产生细胞悬浮液的细胞，但细胞还可在之后提供。将凝胶前体释放至微流体板的入口。通过潜在地由重力辅助的毛细力将凝胶前体运输至微流体网络。随后凝胶由基本上为跨越微流体室的整个宽度的毛细管压力屏障的相位引导件停止。在引入第二流体前，引起凝胶前体凝胶化。该第二流体通常为提供营养和氧气的生长介质。在流的情况下，生长介质还可移除或稀释如细胞产生的废代谢产物。

以与上述实例类似的方式，可将细胞引入第二流体，由此将所述细胞靠凝胶沉积。在这些细胞引入培养时，它们通常形成可通过管腔灌注有流的管。

在又一实施方案中，多种凝胶可彼此相邻地图案化。多种凝胶可通过注射凝胶前体、通过毛细管压力屏障停止前体的前进、并且引起前体在网络的不同部分依次地凝胶化来图案化。第一细胞类型在第一凝胶前体中悬浮，然后第二细胞类型在第二凝胶前体中悬浮导致所谓的分层共培养，其中细胞类型彼此相邻地培养。

凝胶优选与通道壁接触/靠通道壁沉积。

凝胶定义为基本上稀释的交联系统，其在稳态时不显示流动。凝胶通常为通过流体在整个体积中膨胀的非流体胶体网络或聚合物网络。水凝胶(hydrogel,aqua gel)是溶胀剂为水的凝胶。在本发明的方法的上下文中，凝胶材料可为优选不溶于水但含有水从而具有二维或三维支撑结构的含水凝胶。在本发明中，使用的凝胶允许物质、特别是探针(或本文定义的其他化合物)和/或试验化合物(参见以下)在所述凝胶中或上的扩散。实例包括基质胶和胶原基凝胶。

本发明中使用的凝胶不特别限制，只要层具有上述性质并且允许上皮细胞层在凝胶上形成(以下描述)即可。通常使用的凝胶包括来自生物来源的凝胶，包括层粘连蛋白、纤连蛋白、纤维蛋白原、基质胶和/或琼脂糖，和基于多种支架的合成凝胶，例如PEG(聚乙二醇)、肽、PLLA(聚-L-丙交酯)、PLGA(聚(乳酸-共-乙醇酸(lactic-co-glycolic acid))。

多种技术可用于图案化凝胶，即用凝胶填充微流体通道的部分，包括但不限于光固化凝胶的光刻图案化，使用例如柱、疏水补片或相位引导件的基于毛细力的图案化，和选择性沉积。

向包含中空微流体通道并且这类通道中至少部分用凝胶填充的微流体系统提供上皮细胞。细胞可通过任何合适的方式引入通道，只要细胞可在微流体通道中与凝胶接触即可。

在本发明的上下文中，术语上皮细胞指的是上皮细胞、内皮细胞或间皮细胞，后两者为上皮细胞的特化形式。引入通道的细胞的数量应允许细胞在合适的介质中培养后在凝胶上形成细胞层，并且取决于使用的细胞类型、使用的凝胶类型和使用的介质类型。本领域技术人员熟知达到这些要求需要哪些条件或如何建立这些。

一旦细胞已引入微流体通道，允许细胞生长、扩增、分裂，从而允许细胞在凝胶上形成具有顶侧和基底侧的细胞层。在本发明的上下文中，细胞的顶侧是面向微流体通道的内部的侧，而基底侧是面向凝胶(或与凝胶接触)的细胞的侧。在本发明的上下文中，细胞的基底侧面向的一侧表示为基底外侧(basolateral)，而细胞的顶侧面向的一侧表示为腔侧(apical)。

在优选实施方案中，将细胞培养足够的时间以使细胞在微流体通道中形成管状结构，再次限定如本文所定义的腔侧和基底外侧。

将细胞在介质中、适用于选择的特定细胞的条件下、并且使用本领域技术人员熟知的方法培养。

对于具有顶侧和基底侧的细胞层的形成，在优选实施方案中所述层为汇合的。在本发明的上下文中，汇合相对于微流体通道中的凝胶材料的表面表示。汇合是通常用作估计微流体装置中贴壁细胞的数量的术语，指的是由细胞覆盖的表面的比例。例如，50％汇合意为大致上覆盖凝胶表面的一半。当层称为汇合的时，约100％的凝胶表面由细胞覆盖，并且没有更多空间留给细胞来生长为单层。

当细胞层例如单层相对于与凝胶接触的部分为汇合的时，发现单层不渗漏。的确，上皮屏障功能可在本文公开的上下文中基于探针(或探针系统的部分)从上皮细胞层的一侧(腔侧或基底外侧)扩散或漂移(drift)至上皮细胞层的另一侧(基底外侧、相应地腔侧)的速率来定义。对于完全功能的上皮屏障功能，该速率将接近零，而在不存在任何上皮屏障功能下，速率将接近或为在不存在任何细胞的给定系统中的速率。本领域技术人员已知在给定情况下，由于顶部压力和基部压力的差异造成的间质流动将影响运输，并且可因此在进行实验时考虑。这些极端值之间的任何值说明变化水平的上皮屏障功能，接近零的值表明发挥更大功能的上皮屏障功能。

换言之，在这些条件下，探针(或探针系统的部分)在例如加入顶侧时，将不会或仅非常有限地从细胞的顶侧移动或扩散或漂移至基底侧，表示完全功能的上皮屏障。当腔侧地给予时，探针将不在凝胶中积累。

在本发明的上下文中，当加入后5、10、20或30分钟内，小于约10％、优选小于约5％、甚至更优选小于约1％的信号在与提供探针(或在使用传感子的情况下为其他化合物；如本文定义)的侧(在该实例中为基底外侧)相反的侧(例如腔侧)出现时，可认为上皮细胞层是不渗漏的。在优选实施方案中，当5分钟的时段出现小于1％的信号时，认为上皮层是不渗漏的。该数量将部分取决于使用的探针以及使用的细胞的类型。

然而令人惊讶地发现对于本发明的方法，不要求层的至少与凝胶接触的部分需要相对于探针是基本上不渗漏的。在实践中，从实验的开始将允许渗漏的某种水平。换言之，本发明的方法允许在实验的开始处，在不存在试验化合物下，探针由于非不渗漏的上皮层例如由于细胞在层中相对于凝胶的减少的汇合，在某种程度上从一侧向另一侧移动。

实际上，在一些实施方案中，优选这类非不渗漏的上皮细胞，因为这允许例如通过测量探针从一侧向另一侧随时间的扩散/移动速率的减少，对于上皮屏障增强性质研究或筛选化合物。

在实验的开始处可因此干扰的上皮屏障功能的程度基本上取决于实验的目的。明显地，探针从一侧向另一侧的扩散(在本发明的上下文中，并且在本文的每个实施方案中，还包括在传感系统用作探针的情况下其他分子或组合物的运动；如本文定义)不应等于在不存在任何细胞下、在给定系统中的速率。在一些实施方案中，实验的开始处、并且在向细胞提供任何试验化合物前的移动或扩散优选为在相同系统中、在不存在任何细胞下观察到的移动/扩散速率的至多50％、40％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或更低。

对于在一些实施方案中可得到的管状结构，优选至少管状结构相对于凝胶定位的、或与凝胶接触的部分是汇合的。

基于本文的公开，本领域技术人员将理解对于在凝胶上形成的细胞层的非不渗漏性仍可接受哪些。同时，所述方法因此允许快速测定或建立细胞层是否可合适地使用或应由于减少的或甚至不存在的上皮屏障功能而拒绝。

在允许细胞形成具有顶侧和基底侧的细胞层后，向微流体通道中的细胞提供探针。可向腔侧介质或基底外侧介质、腔侧和基底外侧介质两者提供探针。后者可例如涉及加入两种不同的或可区分的探针。探针优选为光学探针；即可用光学方法监测。光学探针优选为发光探针。如本文所述，发光探针包括本身发射光、或由于涉及发光探针的化学或酶反应发射或产生光、或在激发时发射光(荧光)的任何探针。如果，例如发光探针需要辅助因子或底物从而发射光，可将这类辅助因子或底物在顶侧、基底侧、或两者处加入介质。应注意当使用辅助因子或底物时，探针不需要本身实际上发射光，但应为激活发光过程(luminogenic process)的重要部分，例如在发光探针的存在下辅助因子的荧光部分可为非淬灭的。

如果辅助因子或底物在细胞层的相反侧处选择性地提供给探针，由于没有光将在没有辅助因子或底物的侧产生，扩散的或漂移的探针的量度将为与顶光和基部光之间的比率相反的所产生光的绝对量。

还向细胞提供待试验的化合物。将化合物独立于探针提供至细胞的顶侧、基底侧或顶侧和基底侧两者。化合物(试验剂)可在向细胞提供探针的同时、或之前或之后加入。化合物可为待试验调节上皮屏障功能的能力的药剂。上皮屏障功能的调节可涉及增加的上皮屏障功能、减少的屏障功能、或补充的上皮屏障功能(其中化合物本身不增加上皮屏障功能，但例如作为上皮细胞层的涂覆剂，并且由此补充这种上皮屏障功能)。化合物对于上皮屏障功能的活性可为已知的或未知的。待试验的化合物可包括但不限于抗体、小分子抑制剂、药物、天然或合成粘膜保护剂、细胞因子、生长因子、抗氧化剂、抗蛋白酶、天然或合成上皮分泌物和表面活性剂的模拟物(mimetics)或任何其他干预。

如上所述，特别感兴趣的是将或怀疑增加、补充或减少上皮屏障功能的化合物。

在本发明的方法的下一阶段中，由探针或探针系统产生或提供的信号在多个时间点测定。信号可在顶侧、基底侧、或顶侧和基底侧两者处测定。例如，当探针在基底侧处提供时，探针至顶侧的运动可通过在顶侧处测量信号来测量，其中信号的增加表明至顶侧的扩散。然而，在该实例中，在一些实施方案中，扩散或漂移至顶侧还可通过在基底侧处测量信号来测定，其中信号的减小表示至顶侧的扩散。还可在两个隔室(compartment)即在腔侧或基底外侧两者的介质或凝胶中测量信号。如以下将详细解释的，在基底侧处测量信号可包括在凝胶中测量信号，但还可包括在接触(has access to)基底外侧凝胶的介质中测量信号，其中探针可从凝胶积累。在本发明的上下文中，因此在凝胶中测量基底外侧信号包括在凝胶中、或在所述介质中、或在两者中测量。

用于测量信号的方法取决于本发明的方法中使用的特定探针。基于使用的探针，本领域技术人员已知使用哪些方法。例如，在荧光探针的情况下，使用任何合适的方法测定探针的荧光。

探针优选为光学探针，优选发光探针，优选荧光探针。注意到探针、光学探针、发光探针、荧光探针还可包括一旦由其他分子或组合物接触时提供信号的传感分子或组合物。通过在一侧提供传感子和在另一侧提供其他分子或组合物，可通过测量在由其他分子或组合物接触时由传感子产生/提供的信号来检测渗漏。

优选在多于一个时间点处测定信号。在实践中，在第一时间点处，可测定不存在试验化合物下的信号，从而得到第一对照值。在本发明的实践中，并且在一个或多个通道上试验所述试验化合物对上皮屏障功能的作用的同时，包含细胞层的一个或多个通道将用作对照，即在其中随时间和在相同条件下、但在不存在一个或所述试验化合物下，将测定或测量由探针提供的信号。的确，并且可应用于本发明的全部实施方案，可在处理后改变介质，从而修改培养物暴露于物质的持续时间。此外，通常但不必需地，与试验培养物一起运行对照或标准，从而测定是否存在温育条件的问题。除未干扰并且不使用待试验的物质处理以外，对照是与用于试验的相同的细胞培养物。

得到的结果可以以不同方式使用。例如，化合物对上皮屏障功能的调节作用可表达为在顶侧、基底侧、或两者处随时间的信号的绝对或相对变化。可选地，结果可与在相同条件、但不存在试验化合物下进行的对照实验比较。另外，可比较试验化合物的多种浓度(例如，1、2、3、4、5…10种不同的浓度)。还可表示在顶侧相对于基底侧的信号，以及相反的方式(但为绝对值以及相对变化)。数据还可表示为每时间单位的信号的变化(绝对的、相对的)。

可进一步分析探针穿过上皮细胞层扩散或漂移的速率，从而得到特定探针的细胞层的表观渗透性(P_app)。该值是上皮层的屏障功能的通常可接受的描述符(descriptor)。为了计算该值，可例如监测探针穿过靠支撑凝胶的细胞层的扩散或漂移，并且对于在具有凝胶而没有细胞的对照装置中观察到的扩散或漂移校正。可用于这类计算的式可为

其中t为时间，A为探针可穿过的细胞层的面积，V_受池是探针向其扩散或漂移的装置部分的体积，C_受池是探针向其扩散或漂移至的装置部分中的探针浓度，C_{供池，初始}是探针扩散出的隔室中的探针的初始浓度。

为了细胞层的渗透性与凝胶的分开，可使用式：

其中P_app测定是凝胶上的细胞的P_app，P_单层是细胞层的P_app，P_无细胞是具有凝胶而没有细胞的对照装置的P_app。该式可重新排列为

为了使用该方法，探针的漂移或扩散应监测其中信号的增加仍为约线性的一段时间。例如，实验可包括不同单层暴露于不同化合物或化合物的浓度不同量的时间。该暴露后，可将探针加入单层和对照装置，并且在5和60分钟之间监测探针的漂移。然后应用上述式将得到不同处理后细胞单层的表观渗透性。

在一些实施方案中，在相同通道中依次试验不同化合物。在这类实施方案中，特定通道中的细胞首先与第一化合物接触，并且在一些时间后，加入待试验的其他化合物，或者细胞首先与第一化合物接触，然后移除第一化合物，并且向通道中的相同细胞提供待试验的第二化合物。

本发明的方法还允许试验化合物的混合物。在这类实施方案中，向包含细胞的微流体通道提供化合物的混合物。

在一些实施方案中，介质的连续流可沿与细胞单层相反的凝胶和沿单层提供。这类流可除去完全地穿过凝胶扩散或漂移的任何探针。在优选实施方案中，在凝胶后方的流和体积为使溶解在其中的探针浓度从不达到显著水平的流和体积，有效产生恒定沉入(constant sink)的情况。在其他实施方案中，连续流还在细胞层的相反侧提供。含有探针的流体的流和体积优选为使探针的浓度由于穿过细胞层的扩散或漂移从不显著减小的流和体积，有效产生恒定源(constant source)。如果存在恒定源和恒定沉入两者，事实是通过凝胶的扩散或漂移是恒定的，影响凝胶内部的探针浓度的唯一因素是穿过细胞层的扩散或漂移。这使得能够仅通过测量凝胶区域中的探针的浓度，直接估计探针的通量和因此的细胞层的屏障功能。与测量探针浓度随时间的增加的一些其他实施方案相反，使用恒定流从而实现恒定源和沉入的该实施方案允许在任何时间点处的屏障功能的直接和动态测量。

在优选实施方案中，可比较优选不同浓度下的各种试验化合物或试验化合物的混合物，例如2、3、4、5、…..10种不同的试验化合物的混合物。特别地，后者对药理学、营养和/或化妆品领域中的应用可为重要的。作为实例，目前的患者通常在相同时间或在一天中服用不同药物。理解这类组合对上皮屏障功能的作用可为重要的。例如，在哮喘中，一方面可给予药物从而提高或补充肺中的上皮屏障功能，而另一方面这类患者可接受无意地取消或对抗这类提高的药物。

通常，由在与探针加入侧相反的一侧的给定探针提供或产生的信号的增加说明不完全不渗漏的上皮屏障。增加越强，上皮屏障功能越少。

使用本发明的方法，现已变得可以得到关于化合物对上皮屏障功能的作用的更详细信息。一个原因是，相比于主要依赖可渗透组织培养板插入物例如(Corning,Inc.,Lowell,Mass.；这类插入物提供可插入组织培养板的孔的人造可渗透生长支撑物)的使用的本领域内的方法，本发明的方法中使用的上皮细胞代表体内状态的更代表性的模型。第二个原因是，在很多时间点处、并且对于一个实验中的细胞层可实时监测信号。第三个原因是，使用本发明的方法，变得可以识别化合物调节上皮屏障功能的机制的特性。例如，本发明的方法使得可以建立是否试验化合物的作用在向细胞提供该化合物后可立刻观察到，或是否存在加入该化合物的时刻与屏障功能的调节发生之间的延迟时间。此外，本发明的方法可用于建立比存活/死亡作用更精细的化合物对细胞的作用。在化合物加入时测量上皮屏障功能、即边界完整性给出比这类存活/死亡评估精细很多的毒性值。试验化合物可例如妨碍细胞层的紧密连接、或抑制或减少细胞层或管状结构的自我再生能力、以及杀死细胞(但不是它们的全部)。

使用本发明的方法解决的问题是，当处理流系统、即如在本发明方法中使用的微流体系统时，存活/死亡分析如果不是不可能的、就是难以量化的。在流的存在下，冲走死细胞，而同时上皮屏障具有弥补细胞的杀死的某种再生能力。测量屏障完整性，由此给出使用本发明的方法可直接测量的功能丧失、再生能力、或细胞死亡的清楚指示。

在实践中还发现，影响边界完整性的毒性作用不是即时事件，但可在某个时间点处发生。还发现边界完整性削弱的时间点与加入的化合物的浓度有关。实际上，本发明人相信，化合物的浓度影响细胞死亡与再生能力之比、或作为时间的函数的紧密连接。化合物施加和可测量屏障完整性丧失的不利作用的点之间的时间因此是某种浓度下化合物的毒性作用的重要度量。在本发明的方法的高度优选的实施方案中，所述方法因此进一步包括以下步骤：

f)从步骤e)中得到的信号测定，从向上皮细胞提供试验化合物和/或探针的时间点到达到微流体通道中和/或凝胶中的荧光的预定值或值的预定变化的时间点、或者到达到微流体通道(顶侧)中和凝胶(基底侧)中的荧光之比的预定值或值的预定变化的时间点所经过的时间。

在该优选实施方案中，对试验的浓度下的试验化合物计算提供试验化合物和/或向上皮细胞提供探针与在顶侧、基底侧、或顶侧和基底侧两者处达到信号的某个预定值或值的变化的时刻之间的时间。

由此得到的值是“渗漏时间”的量度，并且可例如通过比较从加入试验化合物和/或探针至试验化合物的不同试验浓度的预定值的时间在不同试验条件之间比较。如所解释的，这类数据是在某种浓度下的化合物的毒性作用的重要量度，并且在本发明的方法下使其首次成为可能。预定值将取决于使用的细胞的类型，并且可经验地测定。例如预定值可基于使用参考化合物得到的结果、或可基于用对照得到的结果。例如，当对于参考化合物A已知在给定浓度下顶侧和基底侧处的信号之间的某个比(例如通道中的介质中的信号与凝胶中的信号之比)例如在20分钟后达到，这种比可用作用于试验其他化合物的调节作用的基准。此外，试验化合物的不同浓度的渗漏时间可用本发明的方法比较。

的确在本发明的方法的一些实施方案中，对试验化合物的多于一种浓度进行所述方法，优选其中步骤f)对多于一种浓度的试验化合物测定。在这些实施方案中，可比较试验化合物的多种浓度(例如，1、2、3、4、5…10种不同浓度)。此外，并且在一些实施方案中，可优选在不同浓度下比较多种试验化合物或试验化合物的混合物，例如2、3、4、5、…..10种不同试验化合物的混合物。

还提供本发明的方法，其中试验化合物对上皮屏障功能的作用优选同时地、即在相同实验中在多于一个的包含培养的上皮细胞的微流体通道中测定，优选其中多于一种浓度的试验化合物对上皮屏障功能的作用同时地、即在一个和相同的实验中测定。在实践中，在这类实施方案中不同通道中提供的信号依次地测量，其中试验化合物对上皮屏障功能的作用优选同时测定。

使用本发明的方法，已变得可以在一个和相同实验中随时间并且在不同条件下测定试验化合物的调节作用。因此，在一些实施方案中，在相同实验中向多于一个微流体通道(或通道网络)提供试验化合物。在一些实施方案中，向不同通道提供的试验化合物的浓度是相同的，在其他实施方案中，向不同通道提供的试验化合物的浓度每通道而不同。本发明的方法允许在一个实验中并且因此使用全部在相同条件下得到的上皮细胞层，测定化合物在一种浓度下随时间对上皮屏障功能的作用、或从包含细胞层的一个或多个通道得到的不同浓度随时间的作用。这允许提供良好质量和代表性的数据。

本领域技术人员将理解，基于使用者的期望，本发明的方法还可用于在一种或不同浓度下、随时间在一个和相同实验中(即同时地)试验不同化合物。在一些实施方案中，因此提供本发明的方法，其中独立地，多于一种试验化合物对上皮屏障功能的作用在包含培养的上皮细胞的多个微流体通道(或通道网络)的至少部分中同时地、即在相同实验中测定。

在这类实施方案中，用不同试验化合物处理在相同条件但在不同通道中、优选在相同微流体系统中生长的细胞(或在给定情况下，一个通道中的试验化合物的混合物、或细胞依次暴露于不同化合物)，并且在优选实施方案中在不同浓度下，随时间测定作用。

如本文所述，虽然优选地与凝胶接触的细胞层是不渗漏的、即探针不从或仅有限程度地从一侧向另一侧(例如从顶侧至基底侧)扩散或移动，这对本发明的方法不是必需的。实际上，在一些实施方案中，优选某个(有限的)扩散水平，因为这允许研究化合物是否可通过恢复(如通过探针的扩散减少来测量)来调节上皮屏障功能。可选地，提供本发明的方法，其中在步骤d)之前或同时，干扰屏障功能。

根据本发明，可在(优选汇合的)细胞层中产生(优选可重复的)干扰。形成干扰的一种方法是通过冷冻细胞层中的部分细胞，或例如使用激光、某些化合物、超声或声音信号、气泡内爆或爆炸、研磨珠，或通过加入基于自己的经验或基于文献显示为可再现地干扰细胞层的化合物来另外破坏(destruction)这类部分。

接下来，加入试验化合物从而开始试验。通常，处理紧接培养物的干扰后，但偶尔在干扰前用待试验的材料处理培养物从而测定特定类型的作用。为了该过程的目的，处理可为将培养物暴露于试验的化合物的任何手段。处理的具体方法根据物质的性质变化。

如本文所述，物质抑制、刺激或另外影响干扰的结束的水平的测定通过例如使用连续稀释比较不同量的物质的作用来实现。

在一些实施方案中，在向细胞层提供探针前向细胞提供试验化合物。在一些实施方案中，在向细胞层提供探针后向细胞提供试验化合物。在一些实施方案中，与向细胞层提供探针的同时提供试验化合物。如前所述，优选细胞为小管或脉管的形式。当处理血管或淋巴管或小管如近端小管时，这类小管或脉管代表更生理上相关的状态。原因是细胞经历的机械信号(mechanical cue)与体内的那些相同，并且它们具有它们可经历流动的清晰的腔体侧(luminal side)(但不严格必需)。虽然可向相同侧(即顶侧、基底侧、或两者)提供试验化合物和探针，但还可向不同侧提供它们(例如在基底侧提供试验化合物，而向顶侧、或如果期望则向顶侧和基底侧提供待试验的化合物)。因此提供本发明的方法，其中在探针之前、之后、或同时向细胞提供试验化合物。提供试验化合物和探针之间的时间可根据实验设置不同。在一些实施方案中，时间段小于1、5、10或30分钟。在其他实施方案中，时间段为约10、30、60秒，或约5、10、30、60分钟，或约1、2、6、12、24或48小时。

在一些实施方案中，向细胞提供多于一种类型的探针。在一些实施方案中，在提供试验化合物后提供探针。在一些实施方案中，在提供第一探针和试验化合物后、例如在向细胞提供试验化合物和第一探针一段时间后提供另一探针。这类实施方案可例如用于目标为以下的实验：首先用第一探针检测上皮细胞层(包括小管)的干扰或恢复，然后例如在第一试验化合物的移除后、或在暴露于试验化合物的一段时间后通过第二探针测定干扰的恢复(例如细胞的测量适应性等)。

在一些实施方案中，向细胞提供多于一种试验化合物。可试验化合物的混合物，例如从而测定是否试验混合物中的一种化合物与混合物中的另一化合物相互作用，由此调节所述混合物对上皮屏障功能的作用。混合物中的试验化合物还可协同地作用于屏障功能，或可相互拮抗。

的确，虽然细胞层不必需为不渗漏的，并且探针的一些扩散在实验的开始(即当加入试验化合物时)是可允许的，在优选实施方案中，细胞层是不渗漏的，即，在不存在试验化合物下，当向细胞提供时几乎没有或基本上没有观察到探针的扩散。因此本发明还提供本发明的方法，其中步骤c)中培养的细胞形成单层，优选其中所述单层基本上不允许探针从顶侧向基底侧和/或从顶侧向基底侧扩散。在本发明的上下文中，当小于约10％、优选小于约5％、甚至更优选小于约1％、0.1％、0.01％的信号在加入后5、10、20或30分钟内从一侧(例如腔侧)扩散至另一侧(在该实例中，基底外侧)时，可认为上皮细胞层是不渗漏的。该数字将部分取决于使用的探针以及使用的细胞的类型。在一些实施方案中，优选在实验开始处、并且在向细胞提供任何试验化合物前的扩散或漂移为在相同系统中、不存在任何细胞下观察到的扩散速率的至多50％、40％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或更低。在实践中，通常施加探针侧的流体的(稍微)过压，从而加速“化合物渗漏”，并且因此具有较清晰的信号。由于在凝胶中存在间质流动，这是可能的。例如，可向与细胞层/小管的内腔侧(lumenside)连通的储槽(reservoir)加入100微升包含试验化合物和探针的介质，并且向连通至小管的另一侧的储槽介入仅20微升介质。因此在腔体侧产生稍微的过压，在发生屏障干扰时给出清晰的信号。

如本文所公开的，在步骤e)中包括在各时间点处测定由微流体通道中、或凝胶中、或者微流体通道和凝胶两者中的探针提供的信号。本领域技术人员理解，在各时间点处测定表示在(在实验/方法中的)至少两个时间点处，探针(还称为标记物质)在例如细胞的顶侧和/或基底侧中(或甚至在具有细胞的情况下)测定。换言之，随时间、并且至少在两个不同时刻处测定探针(探针提供的信号)。本领域技术人员理解，基于例如实验或分析的目标，可改变第一测量/测定的时刻、两次测量之间的时间、测量的总数、一次测量的时段、测量的总长度等。例如可在加入试验化合物前、提供试验化合物后1秒、1小时、12小时、1天、3天等进行第一测量。例如可每1秒、每1分钟、和每1小时、每6小时、每天、每周、或每月、以及根据期望的上述之间和高于上述的任何来测量。例如可测量小于1秒或大于1秒，小于或大于1分钟，小于或大于1小时，小于或大于6小时，小于或大于1天、周或月。例如两次测量之间的时间可小于或大于1秒，或小于或大于1分钟，小于或大于1小时，小于或大于6小时，小于或大于1天、周或月等。

还提供本发明的方法，其中步骤e)中的两个连续的时间点彼此在1秒至24小时内。在本发明的方法中，探针提供的信号在各时间点处测定。两个时间点之间的时段可变化。例如，第一和第二时间点之间的时段可为5秒，而第二和第三时间点之间的时段为10分钟。原则上，两个时间点之间的时间段可为任何合适的时段。然而，在实践中，时间点之间的时间应如此选取从而得到各时间点的可靠的数据。例如，在第一观察时间点(first view timepoint)之间的时段可相对较短，而较晚的时间点之间的时间段可相对较长。然而，如果从得到的实验数据来看，上皮屏障功能的变化似乎在两个时间点之间的时段相对较长的间隔中发生，则可用所述间隔中的更短时间段重复实验，从而更精确地测定上皮屏障功能的变化。通常两个时间点之间的时段可彼此在1秒和24小时、例如1秒和20分钟之间。再次注意到，不是两个时间点之间的每个时段都应为相同的、或应在给定范围内。

还提供本发明的方法，其中步骤e)中的各时间点在10分钟和4周之间、并且包括10分钟和4周的时段内(例如28天)。虽然可继续实验并且可在很多不同时间点处进行测量，发现通常化合物对上皮屏障功能特别是毒性作用的调节作用在试验化合物的加入后较快速地发生。因此在一些实施方案中，在不同时间点处测定信号的总时段可在10分钟和4周之间、并且包括10分钟和4周(例如28天)。

在这方面，应注意，不必需在向细胞提供化学化合物和/或探针后立刻进行第一测量。如所指出的，可例如在提供探针前数分钟或小时向细胞提供试验化合物，例如从而允许试验化合物发挥其关于上皮屏障功能的作用。在这类实施方案中，第一测量可在试验化合物的加入后数小时进行，并且可持续例如10分钟至4周(例如28天)。

还提供本发明的方法，其中凝胶附近存在与凝胶接触的通道，其中所述通道不与包含培养的上皮细胞的微流体通道直接接触。

所述其他通道与凝胶直接接触，但通过所述凝胶(和在所述凝胶上形成单层的细胞)与包含培养的上皮细胞的微流体通道分隔。所述其他通道因此是基底侧的部分，并且如本文所述可用于测量由探针提供的信号、或用于向细胞的基底侧加入试验化合物或其他化合物。试验化合物和探针可通过凝胶扩散，从而达到细胞的基底侧，或可通过凝胶扩散，从而达到其他通道中的液体。

还提供上述的方法，其中所述其他通道中存在从凝胶移除探针的流，并且优选其中由步骤e)中的凝胶中的探针提供的信号的测定包括测量存在于所述其他通道中的流中和/或凝胶中的信号。

通常，并且对于本文所述的各种实施方案，可在微流体装置中以多种方式进行测量。例如，可应用以下：

1)在通道中、即在提供探针的侧(供池(donor)侧)的恒定流。在这类实施方案中，这在例如基底侧或顶侧处引起探针的恒定源。在这类实施方案中，优选基于在另一侧得到的信号进行测量。

2)可选地，不在供池侧施加流，即不存在探针的恒定源。在这类静态实施方案中，探针向另一侧(即向微流体通道中的基底侧/凝胶/其他通道或向顶侧/介质)的扩散导致提供探针的通道中的探针水平的减少，当解释得到的数据时应考虑这些。

3)可不在受池(acceptor)侧(即当向相反侧加入时，探针可扩散至的顶侧或基底侧(腔侧至基底外侧；基底外侧至腔侧))施加流。这将导致探针在这一侧随时间的积累、和因此渗漏对测量的时间间隔的积分。当基底侧(即凝胶)用作受池侧时，可特别地使用该实施方案。

4)可在受池侧施加恒定流。这不在受池侧引起积累(和探针至供池侧的可能的重新分布)。在这种情况下，可在受池侧(例如如以上所讨论地在凝胶中、与其他通道结合)测定每时间点的渗漏、或每时间点的时间渗漏(time leakage)。

在优选实施方案中，向供池侧或受池侧、或两者施加流。在另一优选实施方案中，在一侧而不在另一侧施加流。在优选实施方案中，在基底侧施加流。在另一实施方案中，在顶侧施加流。在一个实施方案中，仅在供池侧施加流。在其他实施方案中，向不施加流的侧加入试验化合物。在其他实施方案中，向施加流的侧加入试验化合物。在其他实施方案中，当将试验化合物加入施加流的侧时，流在提供化合物的侧提供恒定浓度。在另一实施方案中，当将试验化合物加入施加流的侧时，在试验化合物的初始提供后，流不含有或以较低浓度含有试验化合物；引起试验化合物在提供化合物侧的浓度的降低。在甚至其他实施方案中，在试验化合物的初始提供后，流含有变化的浓度或增加的浓度的化合物，因此导致试验化合物在提供试验化合物侧的变化的浓度或增加的浓度。

本发明的方法不仅允许随时间和/或在不同浓度下测定一种试验化合物或不同试验化合物的调节作用，还允许以可重复方式、在一种或多种浓度下、随时间试验一种试验化合物或不同试验化合物对不同上皮细胞或上皮细胞层的不同组合物的调节作用。因此，还提供本发明的方法，其中在步骤b)中，在相同微流体通道中引入不同类型的上皮细胞，和/或其中在步骤b)中，向不同微流体通道提供不同类型的上皮细胞。本领域技术人员熟知如何制备包含多于一种类型的上皮细胞的微流体装置。该实施方案允许检测例如试验化合物的上皮细胞类型特异性作用。

用于本发明的方法的凝胶可为任何合适的凝胶，只要提供的上皮细胞类型可在凝胶上形成具有顶侧和基底侧的细胞层即可。例如，凝胶可含有合成聚合物、天然聚合物或生物聚合物，包括琼脂糖、明胶、葡聚糖、脱乙酰壳多糖，和硅胶等。

然而，在优选实施方案中，凝胶含有一种或多种生长和/或分化基体，例如胶原、胶原I、胶原IV、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、D-赖氨酸、巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfide proteoglycans)、相似组织培养基体，或其组合。

在另一实施方案中，凝胶含有基底膜提取物、人类或动物组织或细胞培养物源胞外基质、动物组织源胞外基质、合成胞外基质、水凝胶、胶原、软琼脂、蛋清、和商购可得的产品例如基质胶。基底膜是在体内在上皮细胞下的薄胞外基质，并且包含胞外基质例如蛋白质和蛋白聚糖。虽然上皮细胞层、多层、或单层作为屏障防止外源材料从外部世界的入侵，基底膜本身还可作为物理屏障。因此，组成上皮组织的上皮细胞与基底膜合作，从而形成固体屏障，并且保护内部重要活性。

它们由胶原IV、层粘连蛋白、巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、和很多其他次要组分构成(Quaranta等人,Curr.Opin.Cell Biol.6,674-681,1994)。单独的这些组分以及完整的基底膜是生物活性的并且促进细胞粘附、迁移、和在很多情况下的生长和分化。基于基底膜的凝胶的实例称为基质胶(US 4829000)。该材料在体外作为上皮细胞的基层(substratum)是非常生物活性的。

用于本发明的方法的很多不同的合适的凝胶是商购可得的，并且包括但不限于包含以下的那些：基质胶rgf、BME1、BME1rgf、BME2、BME2rgf、BME3(所有基质胶变体)、胶原I、胶原IV、胶原I和IV的混合物、或胶原I和IV以及胶原II和III的混合物、puramatrix、水凝胶、Cell-Tak^TM、胶原I、胶原IV、Matrix、纤连蛋白、明胶、层粘连蛋白、骨桥蛋白、聚-赖氨酸(PDL、PLL)、PDL/LM和PLO/LM、或玻连蛋白。

在一个优选实施方案中，基质组分以商购可得的Matrix(Corning,NY 14831,USA)获得。

Matrx提取自Engelbreth-Holm-Swarm(“EHS”)小鼠肿瘤，即富含基底膜的肿瘤。主要基质组分为层粘连蛋白、胶原IV、巢蛋白、和硫酸肝素蛋白聚糖(heparin sulfate proteoglycan，“HSPG”)。基质还含有生长因子、基质金属蛋白酶(胶原酶)、和其他蛋白酶(纤溶酶原激活物)、以及一些至今未定义的胞外基质组分。在室温下，Matrx凝胶化从而形成重组基底膜。

因此在本发明的方法的优选实施方案中提供的是如下方法：在该方法中凝胶含有基底膜提取物、胞外基质组分、胶原、胶原I、胶原IV、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、D-赖氨酸、巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、或其组合物，并且优选其中凝胶与细胞层在没有任何物理膜分隔两者下直接接触。

与本领域中的方法相反，本发明不依赖具有可渗透支撑体的组织培养插入物，例如本文已描述的插入物的使用。这类插入物通常由聚碳酸酯、聚酯、聚四氟乙烯、聚苯乙烯、或聚对苯二甲酸乙二酯、以及其他相似的物质制成。由于制备这些插入物的材料对于例如本发明的方法中使用的探针是不可进入的(inaccessible)，这类支撑体因此形成扩散屏障。令人惊讶地发现，通过在允许凝胶与细胞层直接接触、并且不在细胞层和凝胶之间形成物理的和不可渗透的膜的本发明的方法中使用凝胶，避免了这类不可渗透的和非天然层的存在的负作用。发现当相比于依赖使用含有不可渗透材料的这类支撑体或插入物从而提供支撑并且由此对至少部分细胞产生物理屏障的分析时，这特别地提供化合物对上皮屏障功能的调节作用的更敏感的测量。

如可从显示可在微流体系统的通道中培养的多种类型和种类的上皮细胞的本文的实例观察到的，本发明的方法可用于任何类型的上皮细胞(包括内皮细胞和间皮细胞)。细胞可为动物上皮细胞、动物上皮细胞系细胞、动物上皮初级细胞(animal epithelialprimary cells)、哺乳动物上皮细胞、哺乳动物上皮细胞系细胞、哺乳动物上皮初级细胞、人类上皮细胞、人类上皮细胞系细胞、或人类上皮初级细胞。上皮细胞的实例由本文所用的术语涵盖，包括但不限于前列腺细胞、乳腺细胞、肝细胞、包括β细胞的胰岛细胞、肺上皮细胞、肾细胞、膀胱细胞、胃上皮细胞、大肠和小肠上皮细胞、尿道上皮细胞、睾丸上皮细胞、卵巢上皮细胞、宫颈上皮细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾上腺细胞、胸腺细胞、胆囊细胞、垂体细胞。如本文所述，细胞可来自任何动物，包括但不限于任何哺乳动物，例如小鼠、大鼠、犬科、猫科、牛科、马科、猪科、非人类和人类灵长类动物。特别适用于本发明的介质的哺乳动物细胞包括人源上皮细胞，其可为源自例如但不限于乳腺、前列腺、肝、胰腺、肾、支气管和气管等组织的初级细胞。此外，还可使用转化的细胞或建立的细胞系。本发明中使用的细胞可为未患病或未遗传上改变的正常的、健康的细胞，或可为患病的或遗传上改变的细胞。

在本发明的上下文中，细胞系指的是持续生长的或无限增殖的细胞。有时也称为“无限增殖的细胞系”，细胞系是通常不无限地增殖、但由于突变而规避正常细胞衰亡并且相反可保持进行分裂的来自多细胞生物体的细胞群。本领域技术人员熟知所述术语。细胞系细胞因此表示属于这类细胞系的细胞。适用于本发明的方法的上皮细胞系的实例包括LLC-PK1(猪肾细胞)细胞、Madin-Darby犬肾细胞例如MDCKI细胞、MDCKII细胞、A549、HMEC-1、ECV304、EaHy926、Caco-2细胞、CEBBe1细胞、HT-29细胞、T84细胞、和SK-CO15细胞、或衍生细胞例如遗传工程的上皮细胞，等等。

在本发明的上下文中，初级细胞是直接取自活组织(例如活组织检查材料)并且建立用于体外生长的细胞。这些细胞经历很少的群体倍增，并且因此相比于连续(肿瘤或人工地无限增殖的)细胞系，更代表它们源自的组织的主要功能组分，因此代表了更具代表性的体内状态模型。

初级上皮细胞和上皮细胞系细胞两者可从多种商购来源包括从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATTC)获得。

还提供根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤e)中由所述探针提供的信号的测定包括使用成像装置、显微镜、自动显微镜、高内涵成像器(high contentimager)、读板器、或多模式读取器测量。

选择合适的方法是没有问题的本领域技术人员熟知用于测量信号的合适的方法和装置。高内涵成像装置可例如从Molecular Devices(Sunnyvale,USA)或其他获得。

还提供本发明的方法，其中微流体装置提供至微流体通道和/或至凝胶和/或至其他通道的不间断的光学路径。这将允许在顶侧、基底侧、或两侧的信号的不间断测量。

调节作用可为在根据本发明的微流体系统中增加细胞层的上皮屏障功能的作用或可为减少细胞层的上皮屏障功能。提供本发明的方法，其中调节作用为干扰或恢复上皮屏障功能。在这方面，令人感兴趣地注意到，进行的实验显示最初化合物降低上皮屏障功能(如通过在受池侧(在该情况下在凝胶中/在基底侧处)的信号的变化所观察到的)，而即使在所述化合物的存在下，在稍后的时间点处上皮屏障功能再次提高。这说明本发明的方法相比于本领域的那些方法，允许更精确地检测化合物对屏障功能的调节作用。

还提供本发明的方法，其中在步骤d)中，在提供试验化合物前向上皮细胞提供探针；并且优选其中在提供探针后，在各时间点处并且在提供试验化合物前测定由在微流体通道中、或在凝胶中、或在微流体通道和凝胶两者中的探针提供的信号。

这类实施方案用于提供作为对照的比较用数据，或用于确定细胞层是否可用于测定试验化合物对屏障功能的作用的数据。例如，如果没有试验化合物的测量已揭示存在探针的高运输，可拒绝在本发明的方法中进一步使用细胞层。同时，该实施方案允许确定“背景”活性。

使用本发明的方法，现已使得可以同步地(simultaneously)/同时地(concurrently)(即在一个和相同的实验中)测量很多不同试验条件，允许用于筛选的方法。本领域技术人员理解词语“同步地”或“同时地”在此表示在相同实验中。在相同的实验中的信号的测量可根据需要依次或平行进行。

因此可使用包含上皮细胞的多个微流体通道同时进行本发明的方法。在优选实施方案中，所述方法是如下的方法，在所述方法中微流体系统包含至少3个、优选大于10个、甚至更优选约40、96、256、384个微流体通道，优选其中包含上皮细胞层或管的至少3个、优选大于10个、甚至更优选约40、96、256、384个微流体通道同时、依次、或平行地测量。

本发明的方法中使用的探针可为可适用于测定如本文所定义的上皮屏障功能的任何探针。本领域技术人员熟知用于检测穿过上皮细胞层的扩散的探针。这类探针的熟知的实例包括荧光黄，荧光标记的葡聚糖类或菊粉类，例如荧光素或罗丹明缀合的葡聚糖类或菊粉类、FITC-缀合的葡聚糖、TRITC-缀合的葡聚糖和FITC-缀合的菊粉，其具有各种分子量。对于FITC葡聚糖通常使用的分子量为6kDA,75kDA、150kDa或400kDA，但还可使用其他分子量。

在一些实施方案中，使用多于一种探针，并且其中例如各探针由不同尺寸和/或由不同可检测标签表征。例如可使用不同大小的葡聚糖类或菊粉类，其缀合不同的荧光团，例如FITC(异硫氰酸荧光素)、纳米点(nanodot)、和罗丹明(四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothiocyanate,TRITC)等。

显然，任何类型的报道分子可在本发明的方法的上下文中使用，例如，具有任何荧光团的荧光标记的探针(例如Alexa350、Alexa647,OregonAlexa405、Alexa680、荧光素(FITC)、Alexa488、Alexa750、Alexa532、Pacific Blue^TM、Pacific Orange^TM、Alexa546、香豆素、四甲基罗丹明(TRITC)、Alexa555、FL、(Texas)、Alexa568、Pacific Green^TM、Alexa594、DNA染料、DAPI、绿、9、TO-P-3、碘化丙啶、探针、525、565、605、655、705、800、荧光蛋白标记、R-藻红蛋白(R-PE)、别藻蓝蛋白(APC)，表达的荧光蛋白、CFP、GFP(emGFP)、RFP(tagRFP))等。

合适的非荧光发光探针包括GSH-Glo、MAO-Glo、Pgp-Glo、BacTiter-Glo、ViralTox、GloNAD、(P)H-Glo、GSH-Glo等。

比色探针包括AEC、AEC+、BCIP/NBT、DAB+、Fuchsin+、永久红(Permanent Red)、阿尔玛蓝(alamar blue)、MTT、格里斯(Griess)等。

本领域技术人员熟知如何选择用于本发明的方法的合适的探针。

就上述而言，在优选实施方案中，不同大小的探针在步骤d)中提供，优选其中各不同大小的探针用不同的荧光标签来标记。

还提供本发明的方法，其中将过压施加于提供探针的侧(基底侧或顶侧)，优选其中过压通过向提供探针的侧或向对应于提供探针的侧的储槽加入相比于另一侧、或在对应于另一侧的储槽中的流体的量更大量的流体。

还提供本发明的方法，其中凝胶在微流体通道中借助毛细管压力技术例如柱、脊、槽、在主要地更亲水的通道中的疏水补片或较不亲水的补片来结构化。

还提供本发明的方法，优选如所提交的根据权利要求19所述的方法，向上皮细胞与试验化合物一起、或在试验化合物和第一探针加入后的时间点提供一种或多种探针，其中所述一种或多种探针优选通过光学方式可区别于所述第一探针。

现已总体上描述了本发明，通过参考以下实施例将更容易理解本发明，这些实施例是以说明的方式提供的，并且不旨在限制本发明。

实施例

图1示出在微流体平台中与外基质相对的屏障的接种：

A)相对于胞外基质(ECM)接种细胞的示意图。在2道微流体平台中，在凝胶通道中接种ECM。在ECM的硬化后，在培养通道中的培养基中接种细胞。将板在一侧温育，从而允许细胞通过重力沉降(settle)在ECM上。在细胞的粘附后，开始灌注流。依赖于细胞类型的、细胞屏障相对于ECM形成，或覆盖整个介质灌注通道形成管状结构。B)管状结构在介质灌注通道中的形成的实例。猪近端小管细胞LLC-PK1相对于ECM接种于介质灌注通道。接种后1天，通过紧靠ECM的相差显微镜观察到细胞层。在第4天，细胞靠介质灌注通道的全部4侧生长。在第6天，到处形成汇合单层。

图2示出2-道微流体芯片中的屏障的3D共焦图像：

将犬近端小管细胞MDCK靠ECM接种于如图1中描述的2道微流体装置。在通过相差显微镜观察到屏障形成后，用死活细胞鉴定染料(viability dye)钙黄绿素-AM(LifeTechnologies,C1430)染色细胞，将活细胞荧光地标记绿色。固定后，用ActinRed(LifeTechnologies,R37112)染色细胞，并且通过共焦显微镜(Leica,TCS SP5STED)成像。使用3D查看器Fiji插件产生3D投影(Schindelin,J.；Arganda-Carreras,I.&Frise,E.等人(2012),"Fiji:an open-source platform for biological-image analysis",Naturemethods 9(7):676-682,PMID22743772.)。切片显示靠ECM的细胞的汇合屏障的形成。屏障的顶侧可通过介质灌注通道进入，而基部侧具有从凝胶通道的自由进入。

图3：屏障完整性分析：

例如如在图1和2中所述培养的细胞屏障的完整性可通过由含有500μg/mL FITC-葡聚糖150kDa(Sigma,46946)的介质替换灌注通道中的介质来探测。A)如果细胞通道是不渗漏的，荧光信号将包含在灌注通道中，而在凝胶通道中没有细胞、仅有ECM的微流体芯片中，荧光信号将进入ECM，并且将在数分钟内饱和。灌注和凝胶通道中的荧光信号可使用缩时荧光显微镜(time-lapse fluorescent microscopy)例如使用ImageXpress Micro(Molecular Devices)实时监测。

B)FITC-葡聚糖150kDa的荧光信号强度在顶部灌注通道中和凝胶通道中使用FIJI分析软件量化(Schindelin,J.；Arganda-Carreras,I.&Frise,E.等人(2012),"Fiji:anopen-source platform for biological-image analysis",Nature methods 9(7):676-682,PMID 22743772.)。C)凝胶通道的强度除以顶部灌注通道的强度，并且将比相对于荧光报道分子加入的时间作图。没有细胞屏障下，ECM在染料加入后数分钟内饱和，而只要细胞屏障是完整的则保持接近零的比。

图4示出星形孢菌素暴露下的屏障完整性分析LLC-PK1：

将猪近端小管细胞系LLC-PK1(ATCC，CL-101，传代210)以10*10⁶细胞/mL在200μm3道OrganoPlate^TM的顶部灌注通道中靠胶原I ECM(Cultrex,Amsbio,3447-020-01,4mg/mL)接种。将60μL的介质加入顶部灌注通道的介质入口和出口。板在其一侧过夜温育，从而允许细胞沉降在ECM上。在接种后第1天，将60μL介质加入底部灌注通道的介质入口和出口，并且将板平放在培养器中。在接种后第4天，将板置于用于连续介质灌注的摇床平台(rockerplatform)上(角度7°，每8min倾斜)。在接种后的第6天，通过由含有500μg/mL FITC-葡聚糖150kDa(Sigma,46946)的介质替换顶部灌注通道中的介质来试验LLC-PK1小管的不渗漏性。在顶部灌注通道中体积为60μL/40μL，在中间ECM通道中为0μL/0μL，在底部灌注通道中为40μL/40μL标准培养基。认为加入后15min不在ECM中示出FITC-葡聚糖信号的小管是不渗漏的，并且选择用于星形孢菌素暴露。顶部灌注通道中的介质由含有500μg/mL FITC-葡聚糖150kDa和0、1、5或10μM的全激酶抑制剂(pan-kinase inhibitor)星形孢菌素(Sigma,S4400)的介质替换。顶部灌注通道中体积为60μL/40μL，中间ECM通道中为0μL/0μL，底部灌注通道中为40μL/40μL标准培养基。将板置于5％CO2、37℃、湿润温育条件下的EVOS FLauto(Live Technologies)。将微流体芯片用4x物镜每15min相差和荧光(FITC)成像16小时。示出代表性时间点。不暴露于星形孢菌素，LLC-PK1管在实验长度中保持不渗漏。在增加浓度的星形孢菌素下，LLC-PK1屏障的完整性在较早的时间点处破坏。

图5示出使用星形孢菌素暴露的屏障完整性分析LLC-PK1的量化：FITC-葡聚糖150kDa的荧光信号强度在图4的顶部灌注通道中和在凝胶通道中使用FIJI分析软件量化(Schindelin,J.；Arganda-Carreras,I.&Frise,E.等人(2012),"Fiji:an open-sourceplatform for biological-image analysis",Nature methods 9(7):676-682,PMID22743772.)。凝胶通道的强度除以顶部灌注通道的强度，并且将比相对于星形孢菌素暴露开始后的时间作图。比的增加意为凝胶通道中的荧光信号的增加，暗示LLC-PK1屏障完整性的破坏。

图6示出与图4所述相似的、使用不同来源的肾小管细胞系的实验。将MDCK(犬)细胞系以10*10⁶细胞/mL靠胶原I ECM(Cultrex,Amsbio,3447-020-01,4mg/mL)接种于400μm3道的顶部灌注通道中。将60μL的介质加入顶部灌注通道的介质入口和出口。将板在一侧温育3小时，从而允许细胞沉降在ECM上。接种后3小时，将60μL介质加入底部灌注通道的介质入口和出口，并且将板置于用于连续介质灌注的摇床平台上(角度7°，每8min倾斜)。在接种后的第5天，通过由含有500μg/mL FITC-葡聚糖150kDa(Sigma,46946)的介质替换顶部灌注通道中的介质试验MDCK小管的不渗漏性。顶部灌注通道中体积为40μL入口/30μL出口，中间ECM通道中为0μL入口/0μL出口，底部灌注通道中为20μL入口/20μL出口标准培养基。认为在加入后15min不在ECM中显示FITC-葡聚糖信号的小管是不渗漏的，并且选择用于星形孢菌素暴露。顶部灌注通道中的介质由含有500μg/mL FITC-葡聚糖150kDa和0、1、4、7或10μM的全激酶抑制剂星形孢菌素(Sigma,S4400)的介质替换。顶部灌注通道中体积为40μL入口/30μL出口，中间ECM通道中为0μL入口/0μL出口，底部灌注通道中为20μL入口/20μL出口标准培养基。

将板置于5％CO2、37℃、和湿润温育条件下的高内涵筛选ImageXpress Micro XLS(Molecular Devices)上。微流体芯片用4x物镜每小时荧光(FITC)成像15小时。示出代表性时间点。不暴露于星形孢菌素，MDCK管在实验的长度中保持不渗漏。随着增加星形孢菌素的浓度，MDCK屏障的完整性在较早的时间点处破坏。

图7示出使用来自图6的星形孢菌素暴露的MDCK的屏障完整性分析的量化。FITC-葡聚糖150kDa的荧光信号强度在图4的顶部灌注通道和凝胶通道中使用FIJI分析软件量化(Schindelin,J.；Arganda-Carreras,I.&Frise,E.等人(2012),"Fiji:an open-sourceplatform for biological-image analysis",Nature methods 9(7):676-682,PMID22743772.)。凝胶通道的强度除以顶部灌注通道的强度，并且将比相对于星形孢菌素暴露开始后的时间作图。比的增加意为凝胶通道中的荧光信号的增加，暗示MDCK屏障完整性的破坏。渗漏时间浓度测定：可对强度比设定阈值，例如0.4。将各暴露的化合物浓度的对应于该比的时间点相对于浓度作图。可测定基于渗漏时间、与IC50值可比较的化合物特性浓度。渗漏时间值(例如化合物加入后2小时)将需要基于验证实验测定，从而确保最大体内相关性。该渗漏时间的时间点可对所有化合物设为相同值(如其是对于IC50值的)，或可使所述时间点取决于例如化合物的半衰期。

图8示出图7中图片的其他数据解释。在管经过荧光阈值比(在此设为0.4)的时间点处，认为管破坏。屏障完整性的丧失可在如在此描述的所谓残存曲线(survival plot)(卡普兰-迈耶(Kaplan Meier)曲线)中作图。在没有足够的数据点可用于精确EC50测定时该方法特别有用。其实例在图11中给出。

图9显示在每个时间处提取的对暴露于星形孢菌素的人类肠小管的渗漏时间屏障完整性分析的剂量反应曲线。将Caco-2细胞系(Sigma，人类结肠癌细胞)以10E6细胞/mL接种于400μm 3道在用于细胞-ECM粘附侧放置2小时，然后置于用于连续介质灌注的改良摇床平台上。在接种后3天，通过用含有0.25mg/mL TRITC葡聚糖150kDa的介质替换顶部灌注通道中的介质来试验Caco-2小管的不渗漏性。认为30min不显示荧光染料渗漏至ECM隔室的小管是不渗漏的，并且用于化合物暴露。顶部介质通道中的介质用具有TRITC-葡聚糖和增加浓度的阿司匹林的介质替换。将板在控制温度和CO2的条件下置于ImageXpress Micro XLS中，并且每小时成像荧光(TRITC)信号13小时。可从暴露的Caco-2管的缩时的每个时间点处提取剂量反应曲线。GraphPad Prism 6(GraphPad SoftwareInc.,La Jolla,CA)用于基于化合物浓度的对数相对于归一化荧光的非线性回归来拟合剂量反应曲线，假设顶部和底部坪值在0和100％荧光下。在增加的暴露时间(exposuretimes)下，观察到向较低化合物浓度的偏移。

图10示出来自图9的Caco-2管的剂量曲线的EC50值随时间的指数降低。这在提取的EC50值相对于时间作图时观察到。提取的EC50值的95％置信区间表示3和13小时的暴露之间的稳健数据(robust data)。

图11描述暴露于阿司匹林的肠小管的屏障功能的丧失。将Caco-2细胞系(Sigma，人类结肠癌细胞)以10E6细胞/mL接种于400μm 3道在用于细胞-ECM粘附侧放置2小时，然后置于用于连续介质灌注的改良的摇床平台上。在接种后3天，通过用含有0.25mg/mL TRITC葡聚糖150kDa的介质替换顶部灌注通道中的介质来试验Caco-2小管的不渗漏性。认为30min不显示荧光染料渗漏至ECM隔室的小管是不渗漏的，并且用于化合物暴露。顶部介质通道中的介质用具有TRITC-葡聚糖和增加浓度的阿司匹林的介质替换。将板在控制温度和CO2的条件下置于ImageXpress Micro XLS中，并且每小时成像荧光(TRITC)信号24小时。虽然阿司匹林对肠道是较不强力的毒物，荧光数据显示40mM和12.12mM浓度下的屏障功能丧失。然而，具有最大反应的浓度的数据缺失妨碍精确的EC50估计。然而在此描述的卡普兰-迈耶曲线显示在较高浓度下屏障功能的丧失的高度显著的趋势(对于曲线差异(curve difference)和趋势显著性两者，P<0.0001)。在基于的分析中，我们观察到清楚的在40和12mM浓度下和甚至在3.7mM下屏障完整性的丧失。虽然不能精确地拟合真实的剂量反应曲线，对于40mM在10小时的暴露下、和12mM在20小时的暴露下观察到50％作用。

图12示出暴露于两性霉素B的人类肾近端小管的屏障完整性的药物诱导丧失的卡普兰-迈耶曲线。将人类近端小管细胞(RPTEC,Sigma)以20E6细胞/mL接种于400μm 3道在用于细胞-ECM粘附侧放置过夜，然后置于用于连续介质灌注的改良的摇床平台上。培养8天后，通过向腔体隔室中的介质加入FITC-葡聚糖150kDa，>95％的接种的小管显示为不渗漏的。管中的介质使用含有增加浓度的肾毒性两性霉素B和荧光FITC-葡聚糖的介质替换。将板在控制温度和CO2的条件下置于ImageXpress Micro XLS中，每小时成像荧光(FITC)信号60小时。在此描述的管完整性的残存(survival)在未暴露的(介质，载体对照(vehicle control)1和载体对照2)和暴露的管之间显示显著不同。IC表示3种流出转运蛋白抑制剂的抑制剂混合物(inhibitor cocktail)。

图13示出当小管仅从顶(腔体)侧或基底外侧暴露于毒性化合物渗漏时间的差异。3道提供仅从管状结构的腔侧或基底外侧加入化合物的独特可能性。可通过扩散被动进入细胞的化合物(例如星形孢菌素)不具有细胞摄取的方向性。主动运输的化合物可在跨细胞运输中具有方向性，例如在肾近端小管中的情况，其中从管的顶侧至基底侧、或以相反方向特异性地移动化合物是肾过滤功能的一部分。这说明通过近端小管细胞主动运输的毒性化合物可具有取决于暴露位置的不同作用。抗癌药物顺氯氨铂(cisplatin)通过在上皮单层的基部侧表达的OCT-2运输蛋白被细胞摄取。

将MDCK细胞靠胶原I ECM以10E6细胞/mL接种于200μm 3道的顶部通道。接种后3天，MDCK小管通过用具有顺氯氨铂的介质替换顶部介质通道、或底部介质通道中的介质从顶侧或基部侧暴露于增加浓度的顺氯氨铂。在暴露的开始，还向顶部通道中的介质提供荧光渗漏标记物、FITC-葡聚糖150kDa。将板在控制温度和CO2的条件下置于ImageXpress Micro XLS中，并且每30min荧光(FITC)信号成像16小时。从基部侧暴露的管的渗漏时间显著早于顶端暴露的管。

图14a显示暴露于增加浓度的替诺福韦(tenofovir)6天的肾近端小管的屏障完整性。在暴露和管完整性的荧光读取(read out)后，管中的介质用具有新鲜毒性化合物的介质替换，并且如图14a中的相同管、和先前未暴露的管的完整性在图14b所示的72小时暴露后测定。

图15描述在一种3道中两种管状结构的共培养，肾近端小管在顶部介质通道中培养，在接种后9天用荧光FITC-葡聚糖150kDa通过替换管腔中的介质来探测。底部通道中的管包含内皮细胞(HUVEC)，在第9天所述管的完整性用TRITC-葡聚糖150kDa探测。荧光探针至中间通道中的ECM的渗漏在图15中绘出。

图16示出，在接种后不同天、在400μm 2道中靠胶原I ECM培养的内皮管的不渗漏性显示超过25天的相同管的不渗漏曲线。不渗漏性由两种不同尺寸的荧光标记的葡聚糖(FITC-葡聚糖150kDa和TRITC-葡聚糖20kDa)探测，示出不同尺寸的化合物的屏障功能的不同。

现已完整地描述本发明，本领域技术人员将理解，在不偏离本发明的精神和范围内可在宽范围的等同参数、浓度、和条件内相同进行，并且没有过度的实验。

虽然已结合具体实施方式说明本发明，将理解其可进一步改变。本申请旨在涵盖通常遵循本发明的原则的任何变化、使用、或修改，并且包括本发明所属领域内的公知或惯用的实践中与本公开的这类偏离，以及可应用于所附权利要求的范围内在上文中如本文所述的基本特征的与本公开的这类偏离。

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具体实施方案的前述描述将完全揭示本发明的一般性质，从而其他人可通过应用本领域技术中的知识(包括本文引用的参考的内容)，对于各种应用容易地改变和/或修改这类具体实施方案，而没有过度实验，不偏离本发明的一般概念。因此，这类修改和改变旨在在基于本文存在的教导和指导的公开的实施方案的等同的含义和范围内。应理解，本文的措辞或术语是为了描述而不是限制的目的，从而本说明书的术语或措辞应由本领域技术人员根据本文存在的教导和指导、结合本领域普通技术人员的指示来解释。

Claims

1.一种用于测定试验化合物对上皮屏障功能的调节作用的体外方法，所述方法包括以下步骤

a)提供包含多个中空微流体通道的微流体系统，其中所述通道至少部分用凝胶填充；

b)将上皮细胞引入所述微流体通道，并允许所述上皮细胞接触所述凝胶；

c)培养引入所述微流体通道的所述上皮细胞，由此允许所述细胞在所述凝胶上形成具有顶侧和基底侧的细胞层，由此优选允许细胞在所述微流体通道中形成具有腔侧和基底外侧的管状结构；

d)向所述微流体通道中的所述上皮细胞提供探针和所述试验化合物，其中所述探针和所述试验化合物独立地提供至所述顶侧、所述基底侧、或所述顶侧和所述基底侧两者；

e)在各时间点测定由所述微流体通道中、或所述凝胶中、或所述微流体通道和所述凝胶两者中的所述探针提供的信号。

2.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤

f)从步骤e)中得到的所述信号测定，从向所述上皮细胞提供所述试验化合物和/或所述探针的时间点至达到所述微流体通道中和/或所述凝胶中的荧光的预定值或值的预定变化的时间点、或者到达到所述微流体通道中和所述凝胶中的荧光之比的预定值或值的预定变化的时间点所经过的时间。

3.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述方法对多于一种浓度的所述试验化合物进行，优选其中步骤f)对多于一种浓度的所述试验化合物测定。

4.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中试验化合物对所述上皮屏障功能的作用在多于一个的包含培养的上皮细胞的所述微流体通道中同时测定，优选其中同时测定多于一种浓度的所述试验化合物对所述上皮屏障功能的作用。

5.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在多个包含培养的上皮细胞的所述微流体通道的至少部分中独立地同时测定多于一种试验化合物对所述上皮屏障功能的作用。

6.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤d)之前或同时干扰所述屏障功能。

7.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在所述探针之前、之后或同时向所述细胞提供所述试验化合物。

8.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤c)中培养的细胞形成单层，优选其中所述单层基本上不允许所述探针从顶侧向基底侧和/或从顶侧向基底侧扩散。

9.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤e)中的两个连续时间点彼此在1秒至24小时内。

10.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤e)中的各时间点在10分钟-4周之间的并且包括10分钟-4周的时段内。

11.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述凝胶附近存在与所述凝胶接触的其他通道，其中所述通道不与包含培养的上皮细胞的所述微流体通道直接接触。

12.根据权利要求11所述的方法，其中在所述其他通道中存在将所述探针从所述凝胶移除的流，优选其中在步骤e)中所述凝胶中的由所述探针提供的信号的测定包括测量所述其他通道中存在的所述流中的信号。

13.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤b)中，将不同类型的上皮细胞引入相同的微流体通道，和/或其中在步骤b)中，不同的微流体通道提供有不同类型的上皮细胞。

14.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述凝胶为基底膜提取物、胞外基质组分、胶原、胶原I、胶原IV、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、D-赖氨酸、巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，或其组合，优选其中所述凝胶不含有人造膜或扩散屏障，和/或其中所述凝胶在没有分隔两者的任何物理膜下与所述细胞层直接接触。

15.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述上皮细胞为动物上皮细胞、动物上皮细胞系细胞、动物上皮初级细胞、哺乳动物上皮细胞、哺乳动物上皮细胞系细胞、哺乳动物上皮初级细胞、人类上皮细胞、人类上皮细胞系细胞、或人类上皮初级细胞。

16.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤e)中由所述探针提供的信号的测定包括使用成像装置、显微镜、自动显微镜、高内涵成像器、读板器、或多模式读取器测量。

17.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微流体装置提供至所述微流体通道和/或至所述凝胶和/或至所述其他通道的不间断光学路径。

18.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述调节作用为干扰或修复上皮屏障功能。

19.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤d)中，在提供所述试验化合物前向所述上皮细胞提供所述探针；优选其中在提供所述探针后，在各时间点处并且在提供所述试验化合物前测定在所述微流体通道中、或在所述凝胶中、或在所述微流体通道和所述凝胶两者中提供的信号。

20.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微流体系统包含至少3个、优选多于10个、甚至更优选约40、96、256、384个微流体通道，优选其中至少3个、优选多于10个、甚至更优选约40、96、256、384个包含所述上皮细胞的微流体通道同时、依次或平行测量。

21.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在步骤d)中提供不同尺寸的探针，优选其中各不同尺寸的探针用不同的荧光标签来标记。

22.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中将过压施加于提供所述探针的侧(基底侧或顶侧)，优选其中所述过压通过向提供所述探针的侧或向对应于提供所述探针的侧的储槽加入相比于另一侧、或在对应于所述另一侧的储槽中的流体的量更大量的流体。

23.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述凝胶在所述微流体通道中借助毛细管压力技术例如柱、脊、槽、在主要地更亲水的通道中的疏水补片或较不亲水的补片来结构化。

24.根据权利要求19所述的方法，其中向所述上皮细胞与所述试验化合物一起、或在所述试验化合物加入后的时间点提供一种或多种探针，其中所述一种或多种探针优选通过光学方式可区别于第一探针。