DE19850594A1 - Verfahren zur Markierung von Nukleinsäuren - Google Patents

Verfahren zur Markierung von Nukleinsäuren

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur Markierung von Nukleinsäuren zum Nachweis von Nukleinsäuren in der Nukleinsäurenanalytik vorgeschlagen, bei dem an der Position 5 der Nukleinsäurekette ein Polymer aus einem Nukleotid und einer Alkylgruppe mit einer Hydroxyl-, einer Sulfhydroxyl- oder einer Aminogruppe als funktionale Gruppe eingebaut wird.

Description

Stand der Technik
Die Erfindung geht aus von einem Verfahren zur Markierung von Nukleinsäuren nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
Durch den stetig wachsenden Biotechnologiemarkt für Nukleinsäureanalysen zur Lösung biotechnologischer Fragestellungen ist ein ständig wachsender Bedarf an DNA- Modifikationen durch den Einbau von artifiziellen Basenanaloga in Nukleinsäureketten erkennbar.
Basenanaloga werden prinzipiell durch zwei verschiedene Verfahren in die Nukleinsäureketten eingebaut.
Hierbei unterscheidet man den Einbau von Nukleotid- bzw. Amiditanalogen bereits bei der chemischen Einzelstrang-DNA- Synthese, wobei meistens PCR-Primer terminal modifiziert werden.
Andererseits kann der Einbau von analogen Nukleotidtriphosphaten bei der enzymatischen Polymerisation erfolgen.
An den heterozyclischen Purinderivaten und Pyrimidinderivaten, welche die natürlichen Basen Adenosin, Guanosin, Thymidin und Cytosin bilden, sind an der Basenpaarung in der Doppelhelix nur einige der intro- und exocyclischen funktionellen Gruppen und Heteroatome direkt an der Basenpaarung beteiligt. Die am heterozyclischen Ringsystem den an der Basenpaarung gegenüberstehenden, aus der Helix herauszeigenden Gruppen sind meistens für Modifikationen tolerant und zeigen bei einer moderaten Modifikation keine Interferenz mit der Basenpaarung der komplementären Nukleotide und damit mit der zwangslosen, spezifischen Interaktion hybridisierender DNA-Sequenzen.
Die Position 5 des Pyrimidinringes ist hierfür ein herausragendes Beispiel, da hier das desoxyUracil als Modifikation eine Methylgruppe trägt, die bei der DNA- Polymerisationsreaktion in der Form des Thymidins natürlicherweise sehr gut eingebaut wird.
In den Genomen von Pflanzen und Säugetieren finden sich verschiedene DNA-Modifikationen.
DNA-modifizierende Systeme wie die Restriktions-/­ Modifikationssysteme bei Bakterien und Phagen verwenden bei der enzymatischen Modifikation verschiedene Positionen der heterocyclischen Ringsysteme der natürlich vorkommenden Nukleinsäurebasen, die mit den ungestörten Basenpaarungen kompatibel sind bei der Hybridisierung der DNA. Eine systematische und vergleichende Analyse dieser Systeme zeigt, daß an allen der natürlichen Basen solche Modifikationen möglich sind.
In der Molekularbiologie haben DNA-modifizierende Enzymsysteme und chemisch modifizierte Basenanaloga die Bioanalytik revolutioniert.
Der Einbau von Radioaktivität und modifizierten Basen ermöglichte die Detektion und den Nachweis spezifischer DNA- Sequenzen in einer bislang nicht bekannten Präzison.
Bei der Markierung von Nukleinsäuremolekülen durch den enzymatischen Einbau von Basenanaloga während der DNA- Polymerisationsreaktionen unterscheidet man den indirekten und den direkten Nachweis von Sondenmaterial. Im ersten Fall werden in der Regel haptenmodifizierte Nukleotide wie Biotin, Digoxygenin, Dinitrophenol und Fluorescein eingebaut und dann sekundär mit beispielsweise fluoreszenzmodifizierten Antikörpern oder anderen Proteinen mit hoher Affinität zu den genannten niedermolekularen Verbindungen nachgewiesen.
Beim direkten Nachweis werden bei der enzymatischen DNA- Polymerisation fluorochrommarkierte Nukleotidanaloga direkt eingebaut, wie beispielsweise 5-Fluoresceinallyl-DesoxyUracil. Hier tritt ein Problem auf, das darin besteht, daß die Einbaueffizienz der teilweise sehr voluminösen Fluorochrommoleküle unbefriedigend ist. Dies ist beispielsweise bei Carbocyanin Cy5 und anderen Fluorochromen zu beobachten. Im allgemeinen führen nur Gemische aus natürlichen und analogen Nukleotiden zu einem Einbau der Analogen über die ganze Länge der DNA-Fragmente, da die Nukleotidanalogen die Polymerisationsreaktion terminieren können. Jedoch läßt sich auch hier eine Einbaueffizienz von 100% häufig nicht erreichen. Als nachteilig erweist sich außerdem, daß häufig keine Enzyme vorliegen, die diese natürlichen Nukleotidanaloga mit guter Effizienz akzeptieren.
Die Erfindung und ihre Vorteile
Demgegenüber hat das erfindungsgemäße Verfahren mit den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruchs 1 den Vorteil, daß zur Markierung einer Nukleinsäure an der Position 5 der Nukleinsäurekette ein Polymer aus einem Nukleotid und einer Alkylgruppe mit einer Hydroxyl-, einer Sulfhydroxyl- oder einer Aminogruppe als funktionale Gruppe eingebaut wird. Dieses Gemisch aus einem Nukleotid und einer Akylgruppe mit einer funktionalen Gruppe führt zu einem hohen Einbaueffizienz. Ein mögliches derartiges Polymer ist 5-HydroxylmethylCytosin. Durch den Einbau erfolgt eine chemische Modifikation der Hydroxygruppe. 5-HydroxymethylUracil stellt ein in der Natur, in den Phagen der geraden T-Reihe (T2, T4, T6 . . .) vorkommendes natürliches Nukleotidanalogon dar. Die geringe Größe der Hydroxymethyl-Modifikation provoziert die Bezeichnung dieses Nukleotids als Minimalnukleotidanalogon mit funktioneller Gruppe. Die Verbindung 5-HydroxymethylUracil wird in phagenbefallenen Zellen als Triphosphat bereitgestellt und dort anstelle von Cytosin in die DNA zu 100% eingebaut. Damit beträgt die Einbaueffizienz von 5-HydroxylmethylCytosin 100%. 5-HydroxylmethylCytosin kann für alle Arten von verschiedenen Markierungsreaktionen zum Nachweis von Nukleinsäuren in der Nukleinsäurediagnostik eingesetzt werden.
Der Einbau des Polymers in die Nukleinsäurekette kann beispielsweise bei einer enzymkatalysierten Polymerisationsreaktion oder bei einer chemischen Synthese von Oligonukleotiden als Amidit erfolgen.
Vorteilhafterweise ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Post-PCR-Labelling möglich.
Nach einer vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird zum Einbau des 5-HydroxylmethylCytosins in die Nukleinsäure als Enzym T4-DNA-Polymerase verwendet. Daneben können auch andere Polymerasen, wie beispielsweise die Taq-Polymerase das 5-HydroxylmethylCytosin einbauen.
Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird das in die Nukleinsäurekette eingebaute 5- HydroxymethylUracil in der Zelle quantitativ durch eine phagencodierte Glycosyltransferase glycosyliert. Diese Glycosyltransferase kann zum spezifischen Einbau von Glucose beispielsweise in einer postPCR-Reaktion, bei der chemisch hergestellte 5-HydroxymethylUraciltriphosphate verwendet werden, eingesetzt werden.
Glucose und deren Derivate können als Haptene verwendet werden zur Antikörperproduktion. Glucose und ihre Derivate sind auch zur chemischen Modifikation geeignet, wobei gleich mehrere funktionale Gruppen mit beispielsweise Fluorochromen belegt werden könnten.
Nach einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird das Verfahren auf einem DNA-Array durchgeführt. In der DNA-Array-Technologie mit DNA-Mustern von teilweise sehr hoher Dichte unter Verwendung sehr komplexer Sondensysteme hat die Auflösung der Nukleinsäureanalytik eine sehr wesentliche Bedeutung. Das erfindungsgemäße Verfahren erfüllt die hohen Ansprüche an die im Bereich der DNA-Array- Technologie sehr hohen Ansprüche an die Markierbarkeit der Sonden. Wegen des hohen dynamischen Bereiches ist die Detektion von Nukleinsäuren mit Fluorochromen ein heute besonders geschätztes Nachweisverfahren.
Der Einbau des Polymers kann auch in Lösung erfolgen.
Weitere Vorteile und vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind den Ansprüchen entnehmbar.
Alle in der Beschreibung und in den nachfolgenden Ansprüchen dargestellten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination miteinander erfindungswesentlich sein.

Claims (9)

1. Verfahren zur Markierung von Nukleinsäuren zum Nachweis von Nukleinsäuren in der Nukleinsäurenanalytik, dadurch gekennzeichnet, daß an der Position 5 der Nukleinsäurekette ein Polymer aus einem Nukleotid und einer Alkylgruppe mit einer Hydroxyl-, einer Sulfhydroxyl- oder einer Aminogruppe als funktionale Gruppe eingebaut wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß 5- HydroxylmethylCytosin in die Nukleinsäurekette eingebaut wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer bei einer enzymkatalysierten Polymerisationsreaktion eingebaut wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer bei einer chemischen Synthese von Oligonukleotiden als Amidit eingebaut wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet daß zum Einbau als Enzym T4-DNA- Polymerase verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß zum Einbau als Enzym Taq-Polymerase verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäurekette mit dem eingebauten 5-HydroxylmethylCytosin durch phagenkodierte Glycosyltransferase glycosyliert wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es auf einem DNA-Array durchgeführt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es in Lösung durchgeführt wird.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989002475A1 (en) * 1987-09-17 1989-03-23 Thomas Lee Mattson Polyaldehydic polynucleotides in use as probes, their preparation and use
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