DE3586629T2 - Nukleotidanaloga zur markierung von nukleinsaeuren und nachweis. - Google Patents
Nukleotidanaloga zur markierung von nukleinsaeuren und nachweis.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft Techniken zum Nachweisen der Hybridisierung von Nukleinsäureproben an gesuchte Nukleinsäuren. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zum Biotinylieren solcher Proben, so daß Biotin-Avidin- oder Biotin-Streptavidin-Bindung verwendet werden kann, um die gesuchte Sequenz zu lokalisieren und nachzuweisen.
- Die Nukleinsäurehybridisierung hat breite Anwendung in der genetischen Forschung, biomedizinischen Forschung und klinischen Diagnostik gefunden. Die Entwicklung einer Technologie für die "Hybridisierung in gemischten Phasen" (Hybridisieren von Proben an immobilisierte, nachzuweisende DNA) und für das Clonieren einmaliger genetischer Sequenzproben hat zu größten Fortschritten in Grundlagen- und angewandten Gebieten der Biochemie und Medizin (als Übersicht siehe: Meinhoth, J. und Wahl, G., (1984) Analytical Biochemistry 138, 267-284) geführt. In der Standard-Hybridisierungsreaktion wird eine mit einem Radioisotop markierte Probe an eine DNA- oder RNA-Probe hybridisiert (annealed), welche an einen inerten, festen Träger immobilisiert worden ist. Der Nachweis eines radioaktiven Signals durch Autoradiographie zeigt die Anwesenheit oder Abwesenheit der komplementären Nukleinsäuresequenz in der nachzuweisenden Probe an. In der Vergangenheit haben die potentiellen Gesundheitsgefährdungen, Lagerungsprobleme und die Instabilität der Radionukleotide der Verwendung von Nukleinsäureproben Einschränkungen auferlegt. Dies hat zu einem größeren Interesse für die Entwicklung alternativer DNA-Markierungs- und -Nachweissystemen geführt, die nicht die für die Verwendung von Radioisotopen charakteristischen Nachteile enthalten.
- EP-A-117440 offenbart nicht-radioaktive, chemisch markierte Polynukleotid-DNA-Proben und Verfahren zu deren Herstellung, welche aus einem nachweisbaren chemischen Anteil bestehen, der an die 5-Position eines Pyrimidin, die 8-Position eines Purin und die 7-Position eines Deazapurin gebunden ist. Zusätzlich ist die C-1-Position eines Zuckeranteils an die N&sup9;-Position eines Purins oder Deazapurins oder die N¹-Position eines Pyrimidins gebunden.
- WO-84/03285 offenbart modifizierte Nukleotideinheiten und Verfahren zu deren Herstellung, welche aus nachweisbaren Reportergruppen bestehen, die an die C-5-Position von auf Pyrimidin basierenden Nukleotiden oder die C-8-Position von auf Purin basierenden Nukleotiden gebunden sind.
- Die Entwicklung eines nicht-radioaktiven DNA-Nachweissystems erfordert ein Verfahren, die Nukleinsäureprobe zu markieren, und eine Vorrichtung, um das reassoziierte Hybrid aus Probe und gesuchter Sequenz zu erkennen und nachzuweisen. Die hohe Bindungskonstante und Spezifität von Biotin für Avidin oder Streptavidin (Übersicht in Green, M., (1975), Advances in Protein Chemistry, 29, 85-133) ist in verschiedenen Systemen verwendet worden, um eine breite Auswahl von gesuchten Molekülen zu lokalisieren und nachzuweisen.
- Das Prinzip der Biotin-Avidin-Wechselwirkung als Grundlage einer Probe-Liganden-Wechselwirkung in der Molekularbiologie wurde 1979 in einer Übersicht beschrieben von Bayer und Wilchek: "Folglich (zusätzlich zu Biotinbenötigenden Enzymen) können durch Biotin derivatisierte Hormone, Phagen, Lectine, Antikörper und andere Bindungsproteine mit Avidin wechselwirken; und, falls Avidin immobilisiert ist oder an eine potentielle nachweisbare Probe gebunden ist, kann der Avidin-Biotin-Komplex zur Lokalisierung oder Isolierung der vorstehenden Verbindungen und/oder ihrer Rezeptoren verwendet werden" (Bayer, E.A. und Wilchek, M. (1979), Methods in Biochemical Analysis 26, 1-45). Dieses Prinzip ist weiterhin beschrieben im US-Patent 4,228,237 (Hevey, R.C. und Malmros, M.K., 14. Oktober 1980), in welchem ein an Avidin gekoppeltes, signalisierendes Enzym verwendet wird, um ein mit Biotin markiertes Reagens nachzuweisen, welches spezifisch an den in Frage kommenden Liganden binden wird.
- Weitere Beispiele von für Proben angewendete Biotin- Avidin-Wechselwirkungen sind in einem Artikel von Langer et al. (Langer, P.R., Waldrop, A.A. und Ward, D.C. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 78 6633-6637) enthalten, der die Synthese von Biotin-UTP und Biotin-dUTP-Analogen beschreibt, die Substrate für verschiedene RNA- und DNA- Polymerasen sind. Die Offenbarungen in dieser Publikation wurden weiterhin dargelegt in der europäischen Patentanmeldung EP-A-0063879, in welcher beansprucht ist, daß Biotin covalent an die 8-Position einer Purinbase oder der 5-Position einer Pyrimidinbase in einem Nukleosidtriphosphat gebunden werden kann.
- Jedoch wird von Ward et al. in dieser Anmeldung festgestellt, daß " . . . Probeanteile nicht an Ringpositionen plaziert werden sollten, die sterisch oder auf eine andere Weise mit der normalen Watson-Crick Wasserstoffbindungsfähigkeit der Basen interferieren. Andererseits werden die Substituenten Verbindungen ergeben, die als Substrate für Polymerase inaktiv sind . . . Normalerweise schränken solche Überlegungen die Substitutionspositionen auf die 5-Position eines Pyrimidins und die 7-Position eines Purins oder eines 7-Deazapurins ein." (Die Ward-Offenbarung und Ansprüche zeigen, daß die 8-Position eines Purins bevorzugt war). Diese Feststellung spiegelt die allgemeine Vermutung wieder, daß, wenn Markierungen an Nukleotide an die Wasserstoffbindungspositionen gebunden werden, die modifizierten Nukleotide in Proben nicht verwendbar sein können.
- Trotz der Lehren von Ward und anderen haben die Erfinder hier gefunden, daß Nukleotid-Analoge, in welchen Biotin an die Wasserstoffsbindungsposition der Pur in- oder Pyrimidinbase gebunden ist, in Proben eingebaut werden können. Weiterhin werden auf diese Weise markierte Proben noch an "gesuchte" DNA hybridisieren und hoch-sensitive Nachweisprotokolle erlauben. Dieses Ergebnis hat die Herstellung einer neuen Klasse von markierten Nukleotiden verursacht, deren Nützlichkeit bisher ungeahnt war.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung werden dATP und dCTP am Amino-Stickstoff an den 6- bzw. 4-Positionen über einen Linker-Arm, der in der Länge von 3 bis 17 Atomen variiert, modifiziert. dGTP kann ähnlich an der 2-Position modifiziert werden. Die dadurch mit Biotin markierten Nukleotide sind für mindestens ein Jahr stabil, sie sind billig herzustellen und sind Substrate für die E. coli- DNA-Polymerase I. Nukleinsäureproben, die diese Analoge eingebaut tragen, können durch Standardprotokolle für Nick-Translation hergestellt und für einen nichtradioaktiven DNA-Nachweis verwendet werden, wenn sie mit Streptavidin-konjugierten Enzymen oder Enzym-Polymeren verwendet werden.
- Das gleiche Syntheseverfahren kann verwendet werden, um unmarkierte Nukleotidvorstufen herzustellen, die eine Verknüpfungsgruppe an den erwähnten Positionen enthalten. Die Markierungs- oder Reportergruppe wird nach dem Einbau zugefügt. "Kettenabbruch"-Nukleotidanaloge können ebenso synthetisiert werden. Demzufolge ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, verbesserte Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins eines spezifischen Polynukleotids oder spezifischer Nukleinsäuren zur Verfügung zu stellen.
- Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein neues Mittel zum Markieren von Polynukleotiden für den Nachweis spezifischer Sequenzen, für die Verwendung als Proben und ähnliches zur Verfügung zu stellen.
- Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue Klasse von Nukleotidanalogen zur Verfügung zu stellen, die in Nukleinsäuren eingebaut werden können, ohne mit der Hybridisierung an komplementäre Nukleinsäuren zu interferieren.
- Es ist noch eine weitere Aufgabe der Erfindung, Nukleotidanaloge zur Verfügung zu stellen, die allein an Biotin vor oder nach Einbau in Nukleinsäuren angeknüpft werden können.
- Andere Aufgaben können der Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen und den Ansprüchen entnommen werden, wie in der vollständigen Beschreibung erklärt, und in den Figuren, wobei
- Fig. 1 eine schematische molekulare Darstellung einiger typischer, gemäß der vorliegenden Erfindung synthetisierter Verbindungen zeigt;
- Fig. 2 eine schematische Darstellung der Synthese einiger dATP-Analogen der vorliegenden Erfindung zeigt;
- Fig. 3 eine schematische Darstellung anderer synthetischer Verfahren für dATP-Analoge der vorliegenden Erfindung zeigt;
- Fig. 4 eine schematische Darstellung eines synthetischen Verfahrens für die dCTP-Analogen der vorliegenden Erfindung zeigt;
- Fig. 5 einen den Einbau einiger dATP-Analogen der vorliegenden Erfindung in DNA veranschaulichenden Graph zeigt; und
- Fig. 6 einen Graph zeigt, welcher den Nukleotideinbau durch Messung mit verschiedenen radioaktiven Markierungsmaterial veranschaulicht.
- Wir haben zwei Ansätze für die Synthese der dATP-Analogen verwendet. In dem ersten wird eine modifizierbare Aminogruppe über eine Reaktion eines Chlorpurins mit einem Diaminoalkan eingeführt. Im zweiten Ansatz wird die Aminogruppe in der 6-Position durch eine modifizierbare Gruppe alkyliert. Im Fall von dCTP wird eine modifizierbare Aminogruppe durch Transaminierung eingeführt. dGTP-Analoge können auch durch die Reaktion von Diaminoalkan mit 2-Chlor-2'-desoxy-inosin gemäß einem Verfahren hergestellt werden, das ähnlich demjenigen ist, das für dATP beschrieben wurde. In allen Fällen wird die in die Watson-Crick-Wasserstoffbindung involvierte Aminogruppe vorzugsweise modifiziert.
- Aus praktischen Gründen werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
- B-NHS: N-Hydroxysuccinimid-biotinester
- CAB-NHS: N-Hydroxysuccinimid-caproylamidbiotin-ester
- CDI: Carbonyldiimidazol
- EDC: Ethyl-dimethylaminopropyl-carbodiimid
- DAE: 1,2-Diaminoethan
- DAH: 1,6-Diaminohexan
- TEAB: Triethylammonium-bicarbonat
- In einem ersten Ansatz geht die Synthese von der bekannten Verbindung 6-Chlorpurin-2'-desoxyribosid aus. Diese Verbindung wurde hergestellt (Fig. 2, (1)) ausgehend von 2'-Desoxyinosin unter Verwendung des Robin's Verfahrens in einer ungefähr 70% Ausbeute. (M.J. Robins & G.L. Basom in "Nucleic Acid Chemistry", Seite 602 (1978), herausgegeben von Townsend & Tipson). Sie wurde phosphoryliert (Fig. 2, (2)) unter Verwendung von POCl&sub3;/(EtO)&sub3;PO (M. Yoshikawa, T. Kato & T. Takenishi, Tetrahedron Lett. 5095 (1967)) in der Anwesenheit eines 4 Å Molekularsiebs. Das Vorhandensein des Molekularsiebs ist bevorzugt, da in dessen Abwesenheit die Reaktion eine Mischung von Produkten ergibt, wobei die gewünschte Verbindung nur eine geringe Komponente darstellt.
- Die resultierenden Monophosphate wurden dann (Fig. 2, (3)) mit Diaminoalkan behandelt, wobei sich das gewünschte N&sup6;-(n-aminoalkyl)dAMP ergibt. In unseren Beispielen wurden DAE (n = 2) und DAH (n = 6) verwendet, wobei aber n im Bereich von 2 bis 12 und wahrscheinlich darüber sein kann. N&sup6;-(6-aminohexyl)dAMP wurde in 60 bis 70% Ausbeute erhalten, wohingegen die Ausbeute von N&sup6;-(2-aminoethyl)dAMP sehr gering war. (Die Reaktionsbedingung wurde nicht optimiert, um die Ausbeute zu erhöhen).
- Die Biotinylierung (Ward et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 6633 (1981) wurde durch Behandlung von N&sup6;-(aminoalkyl)dAMP mit B-NHS (Fig. 2, (4a)) oder CAB-NHS (Fig. 2, (4b)) erreicht. (S.M. Costello, R.T. Felix & R.W. Giese, Clin. Chem. 25 1572 (1979). Bio-7-dAMP und Bio-14-dAMP wurde in 70 bis 90% Ausbeute erhalten. Bio-3-dAMP und Bio-10-dAMP wurde auch in hoher Ausbeute, ungefähr 50 bis 80%, erhalten. Anstatt CAB-NHS kann man den Biotinester jeder Säure der Form H&sub2;N(CH&sub2;)mCOOH verwenden, wobei m so gewählt wird, daß die vollständige Linker-Länge nicht 26 Atome überschreitet.
- Letztendlich wurden die Triphosphate (Fig. 2, (5a) und (5b)) unter Verwendung der Methode von Horard & Otts (D.E. Hoard & D.G. Otts, J. Am. Chem. Soc. 87, 1785 (1965)) hergestellt. Das heißt, die Monophosphate wurden mit CDI behandelt, gefolgt von Tributylammoniumpyrophosphat, wobei sich Bio-7-dATP, Bio-3-dATP, Bio-14-dATP und Bio-10-dATP ergab. Die Ausbeute variierte zwischen 30 und 80%.
- Bio-7-dATP wurde auch hergestellt (Fig. 2, Reaktionen (6) bis (9)) ausgehend von N&sup6;-(6-aminohexyl)dATP. Dieser Ansatz ist besonders nützlich für die Synthese von radiomarkierten biotinylierten Nukleotiden oder für das Anhängen anderer nachweisbarer Gruppen. Wo es gewünscht wird, die Vorstufenmoleküle vor der Markierung vollständig zu phosphorylieren, ist es bevorzugt, die Aminogruppe während des Phosphorylierungsschrittes zu schützen, da Trayer et al. (Trayer et al., Biochem J. 139, 609 (1974)) berichtet haben, daß die Anwendung des Hoard-Ott-Verfahrens auf das Riboseanaloge N&sup6;-(6-aminohexyl)-AMP zu einer komplizierten Mischung und einer niedrigen Ausbeute der gewünschten Verbindung führt. Dementsprechend wurde die Aminogruppe in N&sup6;-(6-aminohexyl)dAMP mit einer Trifluoracetyl-Gruppe durch Behandlung (Fig. 2, (6)) mit Ethyl-trifluoracetat nach dem Verfahren von Drayer et al. geschützt, wobei sich N&sup6;-(&sup6;-trifluoracetamidohexyl) dAMP ergibt, welches dann (Fig. 2, (7)) durch das Hoard und Ott-Verfahren zu dem Triphosphat umgewandelt wurde. Basische Hydrolyse (pH 11) der Schutzgruppe (Fig. 2, (8)) ergab N&sup6;-(6-aminohexyl)dATP. Dieses wurde dann mit B-NHS behandelt, wobei sich Bio-7-dATP ergab, (Fig. 2, (9a)), oder eine Behandlung mit CAB-NHS wird analog Bio-14-dATP (Fig. 2, (9b)) ergeben. Mit Tritium markiertes Bio-7-dATP wurde analog synthetisiert unter Verwendung von mit Tritium markiertem Biotin-NHS-Ester. (Kommerzielles Produkt von Amersham).
- In dem zweiten Ansatz, (siehe Fig. 3) wurde dATP an der N-1-Position mit Jodessigsäure bei pH 6,5 alkyliert (10) und anschließend bei pH 8,5, 90ºC, zur N-6-Position umgesetzt, wobei sich N&sup6;-Carboxymethyl-dATP ergab. (M. Lindeberg und K. Mosback Eur. J. Biochem. 53, 481 (1975)). Diese Verbindung wurde danach mit Diaminohexan unter Verwendung von EDC, einem wasserlöslichen Kupplungsagens kondensiert (12). Andere Diaminoalkane mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen können verwendet werden. Das Aminohexyl-Addukt wurde danach mit B-NHS (13a) oder CAB-NHS (13b) verknüpft, wobei sich die entsprechenden Bio-10'-dATP oder Bio-17-dATP ergaben.
- Diese Verbindungen wurden auch durch Bewirken der Alkylierung und des Umbaus von bzw. an dAMP hergestellt. Die biotinylierten Verbindungen wurden danach in Bio-10'-dATP bzw. Bio-17-dATP unter Verwendung des Hoard-Ott-Verfahrens umgewandelt.
- Gewöhnlich ist die Ausbeute des zweiten Ansatzes aufgrund der Depurinierung im ersten Schritt geringer.
- Die Synthese der dGTP-Analogen würde mit 2-Chlor-2'- desoxyinosin beginnen. Die Phosphorylierung dieser Verbindung durch das modifizierte Yoshikawa-Verfahren, gefolgt durch eine Behandlung mit Diaminoalkan, wird das entsprechende N²-(n-aminoalkyl)dGMP ergeben. Dieses wird danach derselben Behandlung ausgesetzt werden, wie im Fall des N&sup6;-(n-aminoalkyl)dAMP, wobei das entsprechende biotinylierte dGTP oder die N²(n-aminoalkyl)dGTP-Vorstuferhalten wird.
- Die Synthese von biotinyliertem dCTP (Fig. 4) folgt dem Verfahren, das von Draper (D.E. Draper, Nucleic Acid Res. 12, 989 (1984)) beschrieben wurde, wo eine durch Bisulfit katalysierte Transaminierung an der N-4-Position bewirkt wird. Behandlung von dCTP mit DAE oder DAH in Anwesenheit von Bisulfit bei einem pH von ungefähr 5,5, gefolgt durch eine Einstellung des pH auf ungefähr 8,5 (Fig. 4, (14)) ergab N&sup4;-(2-aminoethyl)dCTP bzw. N&sup4;-(6-aminohexyl)dCTP. Die Ausbeute war in beiden Fällen geringer als 50%. Die Nukleotide wurden danach (15 (a), (b)) mit B-NHS oder CAB-NHS behandelt, wobei sich die gewünschten Verbindungen ergaben.
- Wie den folgenden experimentellen Beispielen entnommen werden kann, können die modifizierten Nukleotide der vorliegenden Erfindung in Nukleinsäuren eingebaut werden. Ihr Vorhandensein ist mit einem hohen Grad an Sensitivität nachweisbar, und markierte Proben können verwendet werden, um unter Verwendung bestimmter Verfahren in einer Kopie vorhandene Gene nachzuweisen.
- Unter Verwendung der Reaktionen 1 bis 3 plus 6 bis 8, der Reaktion 14 oder der Reaktionen 10 bis 12 können auch zu Nukleotiden analoge Vorstufen dieser Verbindungen, (wie N&sup6;-(6-aminohexyl)dATP) synthetisiert werden. Sie können direkt in Nukleinsäureproben eingebaut und danach an Reportermoleküle geknüpft werden, wie Biotin oder aktivierte Enzyme (z. B. Enzyme, die mit aminoreaktiven, bifunktionalen, kreuzverknüpfenden Reagenzien, wie Bis(sulfosuccinimidyl)suberat oder Dimethylsuberimidat aktiviert wurden). Kürzlich ist gezeigt worden, daß an Protein geknüpfte einzelsträngige Proben in Standardhybridisierungsreaktionen (Renz, M. und Kurz, C. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 3435-3444) verwendet werden können. Es ist einem Fachmann auch klar, daß andere Reportergruppen, wie Tetramethylrhodamin-isothiocyanat, Fluorescein-isothiocyanat oder Dimethylaminoazobenzol-sulfonyl-chlorid mit der primären Aminogruppe der Nukleotid-analogen Vorstufen nach Einbau in eine Nukleinsäure (Richardson, R.W. und Gumport, R.I., (1983) Nucleic Acids Res. 11, 6167-6184) kondensiert werden können.
- Die gleichen, vorstehend beschriebenen, synthetischen Verfahren können ebenso verwendet werden, um die entsprechenden Kettenabbruchnukleotide, wie 3'-Desoxynukleosid-5'-triphosphat-Analoge oder 2'-3'-Didesoxynukleosid-5'-triphosphat-Analoge, zu synthetisieren. Die 3'-Desoxy-Analogen können bevor oder nachdem die Reportergruppe angefügt wird an das 3'-Ende einer Nukleinsäure durch chemische Mittel oder unter Verwendung der terminalen Desoxynukleotidyl-Transferase (TdT) (Tu, C.-P.D. und Cohen, S.P.(1980) Gene 10, 177-183) kondensiert werden. Dieses Zufügen eines einzelnen Biotin-Nukleotids an das 3'-Ende eines jeden DNA-Stranges wird die Markierung der Nukleinsäuren für den Nachweis von spezifischen Gensequenzen bei biomedizinischen und Forschungsanwendungen erlauben.
- Die speziellen "Linker", die wir beschrieben haben, sind zur Zeit bevorzugt, ebenso wie ihre Bindung an die Markierungs- oder die Reportergruppe über eine Amidogruppe. Jedoch kann der Linker jede geeignete Verbindung sein, die weder chemisch noch sterisch mit der gewünschten Anwendung interferiert; weitere Beispiele werden dem Fachmann offensichtlich sein. Aus praktischen Gesichtspunkten sollte seine Länge (d. h., die Anzahl der Atome zwischen der Aminogruppe der Base und der Reportergruppe) nicht größer als 26 sein. Ein Bereich von 3 bis 17 ist bevorzugt. Unsere Erfindung sieht auch die Verwendung anderer Bindungsgruppen, wie Ester und Thioester, vor. Zum Beispiel können Chlornukleotide mit Aminoalkohol (z. B. 6-Aminohexanol) behandelt werden, wobei sich N&sup6;-(n-Hydroxyalkyl)dATP ergibt, welches mit Biotin oder Analogen mit längerer Kette unter Verwendung von normalen Verknüpfungsmitteln, wie Dicyclohexylcarbodiimid, esterifiziert werden kann. Für den Thioester kann das Chlornukleotid mit Aminoalkanthiol behandelt werden, wobei sich N&sup6;-(n-Thioalkyl)dATP ergibt, welches auf die gleiche Weise esterifiziert wird.
- Der Zeitverlauf und die Einbauraten wurden als eine Funktion der Linkergröße untersucht.
- Unter Verwendung des BRL-Nick-Translationssystems wurden dATP und verschiedene Derivate in Plasmid-DNA eingebaut. Die 400 ul-Reaktionsmischung enthielt 50 mM Tris-HCl (pH 7,8), 5 mM MgCl&sub2;, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 10 ug/ml BSA, 20 uM von jeweils dGTP, dCTP, dTTP und dATP oder eines dATP-Derivats, 4 ug eines 5,4 kb-Plasmids, 10 uCi ³H-dGTP (12 Ci/mmol), 8 Einheiten DNA-Polymerase I und 0,8 ng DNase I. Die Reaktion wurde bei 15ºC ausgeführt. Zu jedem gewünschten Zeitpunkt wurden 2 ul aus der Reaktionsmischung entnommen, auf einen Glasfiberfilter (GF/C) aufgetropft, welcher in 10% Trichloressigsäure (TCE) einmal und in 5% TCE zweimal gewaschen wurde und nach Waschen in Alkohol getrocknet wurde. Die Filter wurden in einem Flüssig-Szintillationszähler gezählt.
- Fig. 5 zeigt den Zeitverlauf des Einbaus, gemessen als markierte Nukleotide, die pro Kilobase DNA eingebaut wurden, wenn entweder dATP, ein Vorstufenderivat N&sup6;-(6-Aminohexyl)dATP, biotinyliertes dATP mit verschiedenen Linkerlängen oder kein dATP in der Reaktionsmischung vorhanden war.
- Die relativen Einbauraten der modifizierten Nukleotide zum Zeitpunkt 90 Minuten werden in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt, in welcher die Daten aufgeführt sind als Prozent Einbau des in Spuren vorhandenen Radionukleotids (³H-dGTP) relativ zum Einbau, der aus einer Reaktionsmischung, die dNTP's oder keine Derivate enthält, resultiert. Ergebnisse für dCTP und Analoge sind ebenso aufgeführt.
- Nukleotide Prozenteinbau (90 Min)
- dATP 100
- N&sup6;-Amionhexyl-dATP 67, 75
- Biotin-7-dATP 53, 59
- Biotin-14-dATP 33, 39
- Biotin-3-dATP 29, 23
- Biotin-10-dATP 15, 17
- Biotin-10'-dATP 6,9 7,5
- Biotin-17-dATP 6,7 5
- kein ATP 6,5 6
- dCTP 100
- N&sup4;-(6-Aminohexyl)dCTP 74
- Biotin-7-dCTP 44
- Biotin-14-dCTP 42
- Biotin-10-dCTP 22
- Biotin-3-dCTP 12
- Unter Verwendung des gleichen Protokolls wurde dann unter Verwendung eines radiomarkierten Biotin-Nukleotids der Einbau durchgeführt. Folglich wurde die Rate des Biotin-Einbaus direkt bestimmt. 200 ul der Reaktionsmischung enthielten 10 uCi α-³²P-dCTP und entweder 20 uM dATP oder 20 uM [³H-Biotin]-7-dATP. Die obere Kurve von Fig. 6 zeigt den Zeitverlauf des Einbaus von ³²P-dCMP, wenn dATP in der Reaktionsmischung verwendet wurde. Die untere Kurve zeigt den Zeitver1auf des Einbaus von ³²P-dCMP und dem mit Tritium markierten und biotinyliertem Derivat von dAMP. Die enge Übereinstimmung dieser zwei Kurven zeigt an, daß die Rate des Biotin-Einbaus exakt durch den ³²P-dNMP-Einbau reflektiert wird.
- Um die Nachweis-Sensitivität der Proben, die ausgehend von den biotinylierten Nukleotiden der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, zu untersuchen, wurde der Einbau verschiedener Raten von Bio-7-dATP in Plasmid-DNA durch Nick-Translation durchgeführt, wie vorstehend offenbart.
- Das Reaktionsvolumen war 1 ml. Nach 10 Minuten, 30 Minuten und 90 Minuten wurden 200 ul der Reaktionsmischung entnommen und die Reaktion mit 30 mM EDTA gestoppt (quenched). Die DNA aus jeder Probe wurde über eine Sephadex® G-50-Säule gereinigt. Verschiedene Picogrammengen jeder Probe, wie aus Tabelle 2 entnommen werden kann, wurden auf einen Nitrozellulosefilter getropft und auf Sichtbarkeit nach Verwendung des DNA-Nachweissystems von BRL (ein Streptavidin-Biotin/ alkalische Phosphatase-System) und nach zweistündiger Entwicklungszeit geprüft. In Tabelle 2 zeigen "+" oder "-" das Vorhandensein bzw. die Abwesenheit sichtbarer Flecken an; es kann gesehen werden, daß ein hoher Grad an Sensitivität sogar bei einem relativ niedrigen Grad des Biotin-Einbaus existiert. Tabelle 2 Zeit, Min Probe
- Proben, die mit verschiedenen Linker-Längen biotinyliert wurden, wurden danach hinsichtlich der Nachweis-Sensitivität verglichen. Plasmid-DNA wurde gemäß dem beschriebenen Protokoll mit Biotin-n-dATP nick-translatiert, wobei n = 7, 14, 3 oder 10 ist. Die biotinylierten DNA's wurden danach von nicht-eingebauten Nukleotiden durch Gelfiltration über Sephadex® G-50 in 1·SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat), enthaltend 0,1% SDS gereinigt. Die biotinylierte DNA wurde in 6·SSC, enthaltend 0,2 ug/ul gescherte Heringsspermien-DNA verdünnt und auf Nitrozellulosepapier in dem Bereich von 50 ug/5 ul bis 1 ug/5 ul getropft. Nach 30-minütiger Inkubation in dem NBT-BCIP-Färbelösungsgemisch des DNA-Nachweissystems von BRL wurden 2 ug-Flecken der mit Bio-7, 14 oder 10-dATP markierten Probe und ein 5 ug-Fleck der mit Bio-3-dATP markierten Probe sichtbar. Nach 1,5 Stunden wurde der 1 ug-Fleck jeder mit Biotin-dATP markierten Probe sichtbar.
- Die mit Bio-10-dCTP markierte Probe zeigte ebenfalls eine 2 ug-Sensitivität nach 30 Minuten des Nachweises, und der 1 ug-Fleck war nach 1,5 Stunden sichtbar. Die mit sowohl Bio-7-dATP als auch Bio-10-dCTP markierte Probe wurde nicht mit einer höheren Sensitivität als die Probe, die mit dem jeweiligen Nukleotid einzeln markiert war, nachgewiesen.
- Ein Plasmid, enthaltend das 1,1 kb MstII-Fragment des menschlichen β-Globingens in der Eco RI-Stelle von pBR322 (erhalten von Dr. Y.W. Kan, UCSF) wurde entweder mit Biotin-n-dATP im Vorhandensein von dTTP, dCTP und dGTP oder Biotin-n-dCTP im Vorhandensein von dATP, dTTP und dGTP nicktranslatiert. Die Konzentration aller Nukleotide war 20 uM und die Reaktion wurde 90 Minuten lang durchgeführt. Die Bedingungen für die Nick-Translation der DNA-Probe und die Reinigung des mit Biotin markierten Materials sind in dem Handbuch des DNA-Nachweissystem vom BRL angegeben.
- Die biotinylierte Probe wurde an einen Southern-Blot von mit Eco RI gespaltener menschlicher DNA oder an einen Eco RI-Verdau von Plasmid-DNA hybridisiert. Die Probenkonzentration war 100 ng/ml und die Hybridisierung wurde 16 bis 24 Stunden lang unter Bedingungen, die von Leary et al. (Leary, J.J., Brigati, D.J. und Ward, D.C. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 4045-4049) beschrieben wurden, durchgeführt. Der Filter wurde mittels des BRL-Nachweissystems entwickelt, wie in dem Anleitungshandbuch des Systems beschrieben ist. Das in einer Kopie vorkommende β-Globin- Fragment bei 5,2 kb wurde für mit Biotin-n-dATP mit n = 3,7, 10 oder 14 und Biotin-n-dCTP mit n = 7 oder 10 markierten Proben innerhalb einer dreistündigen Färbung mittels dem NBT/BCIP-Färbelösungs system erkannt.
- Folglich kann Biotin-n-dATP mit n = 3,7, 10 oder 14 und Biotin-n-dCTP mit n = 7 oder 10 verwendet werden, um eine Nukleinsäureprobe zu markieren, welche dann eine in nur einer Kopie vorkommende Gensequenz in einem Southern Blot genomischer DNA erkennen wird. Das hybridisierte Hybrid aus Probe und gesuchter Sequenz kann dann mittels eines kommerziell erhältlichen DNA-Nachweissystems nachgewiesen werden.
- Es folgt ein Beispiel des zuerst beschriebenen synthetischen Verfahrens, durch welches Bio-7-dATP hergestellt wurde:
- Biotin (1,0 g, 4,1 mmol) wurde in 10 ml DMF (trocken) durch Erhitzen auf 80ºC in einem Ölbad gelöst. CDI (665 mg, 4,1 mmol) wurde zugefügt und die Mischung wurde auf 80ºC erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde bei 80ºC 30 Minuten lang gerührt, danach zwei Stunden lang bei Raumtemperatur; es bildete sich ein weißes Präzipitat. N-Hydroxysuccinimid (475 mg, 4,1 mmol) wurde zugefügt und die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. DMF wurde unter Vakuum mittels eines Rotationsverdampfers entfernt. Der feste Rückstand wurde in 250 ml Isopropanol unter Rückfluß gelöst, filtriert und über Nacht im Kühlraum aufbewahrt. Das Präzipitat wurde filtriert, einmal mit kaltem Isopropanol gewaschen und unter Vakuum bei 45ºC über Nacht getrocknet, wobei sich 870 mg (61% Ausbeute) des gewünschten Produkts ergab.
- 2'-Desoxyinosin (5,0 g, 0,02 M) in Methylenchlorid (100 ml) wurde auf 0ºC unter Stickstoff in einer Dreihals 3-Liter-Flasche gekühlt. Trifluoressigsäureanhydrid (45,0 g, 0,25 mmol) wurde zugefügt und 2 Stunden lang gerührt. Die Temperatur ließ man auf 15ºC ansteigen und ein Verdampfer wurde angeschlossen (eine Lösungsmittelfalle wurde verwendet) und der größte Teil des Methylenchlorids wurde bei Raumtemperatur entfernt. Eine Vakuumpumpe wurde angeschlossen und das restliche Trifluoressigsäureanhydrid und Methylenchlorid wurde entfernt (ca. 30 Minuten). Bei diesem Stadium wurde Schaum erhalten.
- Auf den Kolben wurde ein Tropftrichter, ein Kondensator und ein Glasdispersionseinlaßrohr gesetzt. Methylenchlorid (500 ml) wurde zugefügt und die Lösung bis zu einem leichten Rückfluß erhitzt und ein ständiger Stickstoffstrom wurde hindurchgeblasen. Eine Lösung frisch destillierten Thionylchlorids (16 ml) und DMF (8 ml) in Methylenchlorid (200 ml) wurden tropfenweise während einer zweistündigen Zeitspanne zugefügt. Die Reaktion wurde 5 Stunden lang (bis über Nacht) unter Rückfluß belassen, gekühlt und filtriert. Ein grau-weißer Feststoff von 0,5 g Hypoxanthin wurde erhalten. Die Lösung wurde langsam in eine heftig gerührte eiskalte Lösung von Natriumbicarbonat (30 g) in 500 ml H&sub2;O gegossen. Die zwei Phasen wurden getrennt und die wäßrige Schicht wurde mit zwei 250 ml-Teilen Methylenchlorid extrahiert. Die organische Phase wurde vereinigt, über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert. Der erhaltene halbfeste Stoff wurde in 10 ml Methanol gelöst, auf eine Säule aus neutralem Aluminiumoxid (2,5 cm·40 cm, 75 g) aufgetragen, und mit Methanol eluiert. Die ersten 75 ml wurden verworfen und die Säule mit 1 l Methanol gewaschen. Das Methanol wurde konzentriert und der entstehende Feststoff wurde aus Methanol/Ethylacetat (Gewicht = 3,8 g, Ausbeute = 70%, Schmelzpunkt = 138º bis 140ºC) kristallisiert. Die HPLC-Analyse zeigte, daß es eine einzige Verbindung war.
- Das Molekularsieb (4 Å, 5,0 mg) wurde zu einem groben Pulver zermahlen, zu Triethylphosphat (10 ml) zugefügt und heftig 10 Minuten lang gerührt. 6-Chlorpurin-2'- desoxyribosid (135 mg) wurde zugefügt und die Mischung auf 0ºC gekühlt. Phosphoroxychlorid (90 ul) wurde mit Wasser (9 ul) sehr vorsichtig bei 0ºC vorbehandelt und zu der Reaktionsmischung in einem Teil mittels einer ofentrockenen Glaspipette oder Glasspritze zugefügt. Die Reaktionsmischung wurde mittels HPLC auf das Erscheinen des Produkts und das Verschwinden des Ausgangsmaterials geprüft. Nach vollständigem Verschwinden des Ausgangsmaterials wurde die Reaktionsmischung filtriert und zu 20 ml Eiswasser zugefügt und der pH wurde mittels 1 M TEAB auf ungefähr 7,5 eingestellt. Die Lösung wurde mit Ether (4·50 ml) extrahiert.
- Die wäßrige Schicht wurde mittels eines Rotationsverdampfers konzentriert, um den restlichen Ether vollständig zu entfernen und mit Wasser auf 200 ml verdünnt. Er wurde auf eine Sephadex-Säule (HCO&sub3;&supmin;-Form, 70 ml äquilibriert mit 0,01 M TEAB) aufgetragen und mit 200 ml 0,01 M TEAB gewaschen. Es wurde dann mit einem Gradienten von 0,01 M bis 0,5 M TEAB (je 400 ml) eluiert.
- 20 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Die Fraktionen 24 bis 40 hatten UV-aktive Fraktionen; sie wurden vereinigt, konzentriert und zusammen mit Ethanol (4·100 ml) verdampft, wobei sich eine leicht bräunliche Paste ergab, die 245 mg (90%) wog.
- Diaminohexan (1,12 g) wurde in 5 ml H&sub2;O gelöst und der pH wurde auf ca. 9 bis 9,5 mit Kohlendioxid eingestellt. 6-Chlorpurin-2'-desoxyribosid-5'-monophosphat (204 mg) in 5 ml H&sub2;O wurde zugefügt und die Reaktionsmischung wurde auf 50ºC erhitzt und mittels HPLC überprüft bis zum vollständigen Verschwinden des Ausgangsmaterials (1,5 bis 3 Stunden). Es wurde auf Raumtemperatur gekühlt, mit Wasser auf 200 ml verdünnt und auf eine Sephadex-A-25-Säule (70 ml, 2,5 cm·45 cm, HCO&sub3;&supmin;-Form äquilibriert mit 0,01 M TEAB) aufgetragen. Die Säule wurde mit 400 ml 0,01 M TEAB, gefolgt von einem Gradienten von 0,01 M bis 0,5 M TEAB (jeweils 350 ml) gewaschen und 20 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Die Fraktionen 10 bis 20 enthielten die gewünschte Verbindung, welche konzentriert und zusammen mit Ethanol (4·100 ml) verdampft wurde, wobei sich ein grau-weißer Feststoff ergab, der 184 mg (70%) wog. Die HPLC-Analyse zeigte, daß er einem einzigen Peak entsprach.
- 6-Aminohexyl-dAMP (80 mg) wurde in 0,1 M Natriumborat (10 ml, pH 8,5) gelöst. Biotin-NHS wurde in DMF (1,5 ml) gelöst und zu dem Amin zugefügt. Die Mischung wurde heftig solange gerührt, bis die HPLC-Analyse das Verschwinden des Ausgangsmaterials (1 bis 4 Stunden) zeigte. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert, um DMF zu entfernen, und danach in 100 ml Wasser gelöst und auf eine Sephadex-A-25-Säule (HCO&sub3;&supmin;-Form, 30 ml, 1,5 cm·40 cm) aufgetragen. Die Säule wurde mit 100 ml 0,01 M TEAB gewaschen. Es wurde danach mit einem Gradienten von 0,1 M bis 0,5 M TEAB (jeweils 300 ml) eluiert; 18 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Die gewünschte Verbindung eluierte in die Fraktionen 20 bis 25. Die Fraktionen wurden vereinigt und konzentriert und zusammen mit Ethanol (4·100 ml) verdampft, wobei sich ein weißer Feststoff ergab, der 90 mg (81%) wog. Es war gemäß HPLC-Analyse eine einzige Verbindung und diese war positiv für Biotin.
- Bio-7-dAMP (45 mg) wurde zusammen mit wasserfreiem DMF (3·10 ml) eingedampft und letztendlich in 2 ml DMF gelöst. Carbonyldiimidazol (40 mg) wurde zugefügt und der Kolben wurde mit einem Stopfen fest verschlossen und heftig ca. 1 Stunde lang gerührt. Die HPLC-Analyse bestätigte, daß das Ausgangsmaterial verbraucht war. (Die Reaktion wird gestoppt, wenn das Ausgangsmaterial vollständig verbraucht ist. Dies kann 30 Minuten bis ungefähr 2 Stunden dauern). 15 ul Methanol wurde zugefügt und das Rühren wurde 30 Minuten lang fortgesetzt. Tributylammonium-pyrophosphat (1,3 ml einer 89 mg/ml DMF-Lösung) wurde zugefügt und das Rühren wurde über Nacht fortgesetzt. Das Material wurde filtriert. Das Filtrat wurde konzentriert und danach mit Wasser auf 100 ml verdünnt und auf Sephadex-A-25 (HCO&sub3;&supmin;-Form, 30 ml, 1,5·30 cm) aufgetragen. Es wurde mit 100 ml 0,01 M TEAB, danach mit einem Gradienten von 0,01 M bis 0,5 M TEAB (jeweils 200 ml) und danach mit jeweils 200 ml 0,5 M und 1,0 M TEAB gewaschen. 20 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Die Fraktionen 30 bis 38 enthielten die gewünschte Verbindung, die 40 mg (56%) wog. Gemäß HPLC war es eine einzige Verbindung.
- Die Erfindung wurde genau beschrieben mit besonderer Hervorhebung der bevorzugten Ausführungsformen; aber es sollte verständlich sein, daß ein Fachmann, an den sich die Erfindung richtet, Variationen und Modifikationen erkennt, die im Bereich der Erfindung liegen.
Claims (25)
1. Verfahren zum Nachweisen eines gesuchten
Polynucleotids, welches das Einbauen eines Desoxyribonucleotids,
welches durch eine daran angehängte Nachweisgruppe R
modifiziert ist, in ein zu dem gesuchten Polynucleotid
komplementäres Polynucleotid,
das Hybridisieren dieses komplementären Polynucleotids an
das gesuchte Polynucleotid und
das Nachweisen der Anwesenheit der Nachweisgruppe R
umfaßt;
dadurch gekennzeichnet, daß für dieses modifizierte
Desoxyribonucleotid eine Verbindung der Form
(d) BTP-NH-M,
verwendet wird, worin
(d) BTP für dATP, dCTP, dGTP, 3'-Desoxy-ATP,
3'-Desoxy-CTP, 3'-Desoxy-GTP, 2'-3'-Didesoxy-ATP,
2'-3'-Didesoxy-CTP oder 2'-3'-Didesoxy-GTP steht;
M über NH an die N&sup6;-Position von B gebunden ist, wenn B
für Adenosin steht, an die N&sup4;-Position von B, wenn B für
Cytidin steht, und an die N²-Position von B, wenn B für
Guanosin steht; und
M für einen Teil steht, der die Nachweisgruppe R enthält.
2. Verfahren nach Anspruch 1 und in dem (d)BTP für dATP
oder dCTP steht.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und in dem (d)BTP für dGTP
steht.
4. Verfahren nach Anspruch 1 und in dem M für eine
Verbindung der Form L-X-R steht, wobei X für eine Amid-,
Ester- oder Thioester-Gruppe steht, und L eine organische
Verbindung ist, die NH mit einem X über eine Kette von
zwischen 1 und 12 Atomen verbindet.
5. Verfahren nach Anspruch 4 und in dem X für NH steht
und L entweder für (CH&sub2;)n mit n so, daß 1 ≤ n ≤ 12 ist,
oder für (CH&sub2;)nNHCO(CH&sub2;)m mit n und m so, daß 2 ≤ n+m ≤ 24
ist, steht.
6. Verfahren zum Nachweisen eines gesuchten
Polynucleotids, welches das Einbauen eines Desoxyribonucleotids,
das durch das Anhängen einer Nachweisgruppe R
modifizierbar ist, in ein zu dem gesuchten Polynucleotid
komplementäres Polynucleotid,
das Anhängen dieser Nachweisgruppe R an das
modifizierbare Desoxyribonucleotid und das Hybridisieren des
komplementären Polynucleotids an das gesuchte Polynucleotid,
in jeder Reihenfolge, und
das Nachweisen der Anwesenheit dieser Nachweisgruppe R
umfaßt;
dadurch gekennzeichnet, daß für das
modifizierbare Desoxyribonucleotid eine Verbindung der Form
(d) BTP-NH-M
verwendet wird, worin
(d)BTP für dATP, dCTP, dGTP, 3'-Desoxy-ATP,
3'-Desoxy-CTP, 3'-Desoxy-GTP, 2'-3'-Didesoxy-ATP,
2'-3'-Didesoxy-CTP oder 2'-3'-Didesoxy-GTP steht;
M über NH an die N&sup6;-Position von B gebunden ist, wenn B
für Adenosin steht, an die N&sup4;-Position von B, wenn B für
Cytidin steht, und an die N²-Position von B, wenn B für
Guanosin steht; und
M für einen Teil steht, an den die Nachweisgruppe R
angehängt werden kann.
7. Verfahren nach Anspruch 6 und in dem (d)BTP für dATP
oder dCTP steht.
8. Verfahren nach Anspruch 6 und in dem (d)BTP für dGTP
steht.
9. Verfahren nach Anspruch 6 und in dem M für eine
Verbindung der Form L-X steht, wobei X für NH&sub2;, OH oder SH
steht, und L eine organische Verbindung ist, die NH mit
einem X über eine Kette von zwischen 1 und 12 Atomen
verbindet.
10. Verfahren nach Anspruch 9 und in dem X für NH&sub2; steht
und L entweder für (CH&sub2;)n mit n so, daß 1 ≤ n ≤ 12 ist,
oder für (CH&sub2;)nNHCO(CH&sub2;)m mit n und m so, daß
2 ≤ n+m ≤ 24 ist, steht.
11. Eine Verbindung mit der Struktur
(d) BTP-NH-L-NH-X,
worin
a) (d)BTP für dBTP (2'-Desoxy-BTP), 3'-Desoxy-BTP, oder
2'-3'-Desoxy-BTP, und B für Adenosin, Cytidin oder
Guanosin steht;
b) wenn B für Adenosin oder Guanosin steht, L über NH an
die N&sup6;-Position von Adenosin oder die N²-Position von
Guanosin gebunden ist und L entweder für (CH&sub2;)n mit n
so, daß 1 ≤ n ≤ 12 ist, für
(CH&sub2;)nNHCO(CH&sub2;)m mit n und m so, daß 2 ≤ n+m ≤ 24 ist,
für CH&sub2;CONH(CH&sub2;)n mit 1 ≤ n ≤ 12 oder mit
CH&sub2;CONH(CH&sub2;)nNHCO(CH&sub2;)&sub5; mit 1 ≤ n ≤ 12 steht;
c) wenn B für Cytidin steht, L über NH an die N&sup4;-Position
von B gebunden ist und L entweder für
(CH&sub2;)n mit n so, daß 1 ≤ n ≤ 12 ist, oder für
(CH&sub2;)nNHCO(CH&sub2;)m mit n und m so, daß 2 ≤ n+m ≤ 24 ist,
steht und
d) X entweder für H oder für einen Teil steht, welcher
einen nachweisbaren Komplex bilden kann, wenn die
Verbindung in eine Nucleinsäure eingebaut wird.
12. Verbindung nach Anspruch 11 und worin x Biotin ist.
13. Verbindung nach Anspruch 11 und worin X ein Protein
ist.
14. Verbindung nach Anspruch 11 und worin X eine
fluoreszierende Nachweisgruppe ist.
15. Verbindung nach Anspruch 11 und worin B entweder
Adenosin oder Cytidin ist.
16. Verbindung nach Anspruch 11 und worin (d)BTP entweder
dATP oder dCTP ist.
17. Eine Verbindung mit der Struktur
worin
a) (d)R für 2'-Desoxyribose,
3'-Desoxyribose oder 2'-3'-Didesoxyribose, steht
und entweder
b) B für Adenin oder Cytosin und L für (CH&sub2;)n mit
1 ≤ n ≤ 12, oder für (CH&sub2;)nNHCO(CH&sub2;)m, mit
2 ≤ n+m ≤ 24 steht, oder
c) B für Adenin und L für CH&sub2;CONH(CH&sub2;)n, mit
1 ≤ n ≤ 12 oder für CH&sub2;CONH(CH&sub2;)nNHCO(CH&sub2;)&sub5; mit
1 ≤ n ≤ 12, steht;
und worin,
wenn B für Adenin steht, L kovalent über NH an die
M&sup6;-Position von B gebunden ist, und wenn B für Cytosin
steht, L kovalent über NH an die N&sup4;-Position von B
gebunden ist.
18. Verfahren zum Herstellen einer Verbindung mit der
Struktur
(d) ATP-NH-L-NH-R
worin
a) (d)A für 2'-Desoxyadenosin, 3'-Desoxyadenosin oder
2'-3'-Didesoxyadenosin steht,
b) R für Biotin steht und
c) L über NH an die N&sup6;-Position von Adenosin gebunden
ist, und L für (CH&sub2;)nNHCO(CH&sub2;)&sub5; mit n so, daß
1 ≤ n ≤ 12 ist, steht;
wobei dieses Verfahren umfaßt
das Umsetzen des entsprechenden &sup6;-Chlorpurin-Nucleosids
mit Triethylphosphat und Phosphor-oxychlorid in Gegenwart
von Molekularsieben um
6-Chlorpurin-Nucleosid-5'-Monophosphat zu erhalten;
das Umsetzen dieses
6-Chlorpurin-Nucleosid-5'-Monophosphats mit H&sub2;N(CH&sub2;)nNH&sub2; um N&sup6;-(n-Aminoalkyl) (d)AMP
zu erhalten;
das Umsetzen des N&sup6;-Aminoalkyl (d)AMP mit
N-Hydroxysuccinimid-caproylamidobiotinester um
N&sup6;-Alkylcaproylamidobiotin-(d)AMP zu erhalten; und
das Umsetzen des N&sup6;-Alkylcaproylamidobiotin-(d)AMP mit
Carbonyldiimidazol, gefolgt von
Tributylammonium-pyrophosphat, um die erwünschte Verbindung zu erhalten.
19. Verfahren nach Anspruch 18 und in dem (d)ATP für
2'-Desoxy-ATP steht.
20. Verfahren zum Herstellen einer Verbindung mit der
Struktur
(d) ATP-NH-L-NH-R
worin
a) (d)A für 2'-Desoxyadenosin, 3'-Desoxyadenosin oder
2'-3'-Didesoxyadenosin steht,
b) R für Biotin steht und
c) L über NH an die N&sup6;-Position von Adenosin gebunden
ist, und L für (CH&sub2;)n mit n so, daß 1 ≤ n ≤ 12 ist,
steht;
wobei dieses Verfahren umfaßt:
das Umsetzen von 6-Chlorpurin-Nucleosid mit
Triethylphosphat und Phosphoroxychlorid in Gegenwart von
Molekularsieben, um 6-Chlorpurin-Nucleosid-5'-Monophosphat zu
erhalten;
das Umsetzen des 6-Chlorpurin-Nucleosid-5'-Monophosphat
mit H&sub2;N(CH&sub2;)nNH&sub2; um N&sup6;-(n-Aminoalkyl) (d)AMP zu erhalten;
das Umsetzen des N&sup6;-(n-Aminoalkyl) (d)AMP mit N-Hydroxy-
Succinimidbiotinester, um N&sup6;-Alkylamidobiotin-(d) AMP zu
erhalten; und
das Umsetzen des N&sup6;-Alkylamidobiotin-(d)AMP mit
Carbonyldiimidazol, gefolgt von Tributylammoniumpyrophosphat,
um die gewünschte Verbindung zu erhalten.
21. Verfahren nach Anspruch 20 und in dem (d)ATP für
2'-Desoxy-ATP steht.
22. Verfahren zum Herstellen einer Verbindung mit der
Struktur
(d) ATP-NH-L-NH-R
worin
a) (d)A für 2'-Desoxyadenosin, 3'-Desoxyadenosin oder
2'-3'-Didesoxyadenosin steht,
b) R für Biotin steht und
c) L über NH an die N&sup6;-Position von Adenosin gebunden
ist, und L für
1) (CH&sub2;)n mit n so, daß 1 ≤ n ≤ 12 ist; oder
2) (CH&sub2;)nNHCO(CH&sub2;)&sub5; mit n so, daß 1 ≤ n ≤ 12 ist,
steht;
wobei dieses Verfahren umfaßt:
das Umsetzen von 6-Chlorpurin-Nucleosid mit
Triethylphosphat und Phosphoroxychlorid in Gegenwart von
Molekularsieben, um 6-Chlorpurin-Nucleosid-5'-Monophosphat zu
erhalten;
das Umsetzen des 6-Chlorpurin-Nucleosid-5'-Monophosphat
mit H&sub2;N(CH&sub2;)nNH&sub2; um N&sup6;-(n-Aminoalkyl) (d)AMP zu erhalten;
das Umsetzen des N&sup6;-(n-Aminoalkyl) (d)AMP mit
Ethyltrifluorthiolacetat um N&sup6;-(n-Trifluoracetamidoalkyl) (d)AMP
zu erhalten;
das Umsetzen des N&sup6;-(n-Trifluoracetamidoalkyl) (d)AMP mit
Carbonyldiimidazol, gefolgt von
Tributylammoniumpyrophosphat, um N&sup6;-(n-Trifluoracetamidoalkyl)-(d)ATP zu
erhalten;
das Hydrolysieren der Trifluoracetyl-Gruppe bei hohem pH
um N&sup6;-(n-Aminoalkyl) (d)ATP zu erhalten; und
das Umsetzen das N&sup6;-(n-Aminoalkyl) (d)ATP mit
N-Hydroxysuccinimid-biotinester, um die gewünschte Verbindung (1)
zu erhalten, oder mit
N-Hydroxysuccinimid-caproylamidobiotinester um die gewünschte Verbindung (2) zu erhalten.
23. Verfahren nach Anspruch 22 und in dem (d)ATP für
2'-Desoxy-ATP steht.
24. Verfahren zum Herstellen einer Verbindung mit der
Struktur
(d) ATP-NH-L-NH-R
worin
a) (d)A für 2'-Desoxyadenosin, 3'-Desoxyadenosin oder
2'-3'-Didesoxyadenosin steht,
b) R für Biotin steht und
c) L über NH an die N&sup6;-Position von Adenosin gebunden
ist, und L für
1) CH&sub2;CONH(CH&sub2;)n mit n so, daß 1 ≤ n ≤ 12 ist;
oder
2) CH&sub2;CONH(CH&sub2;)nNHCO(CH&sub2;)&sub5; mit n so, daß
1 ≤ n ≤ 12 ist, steht;
wobei dieses Verfahren umfaßt:
das Umsetzen des (d)ATP mit Iodessigsäure bei pH 6,5 um
N'-Carboxymethyl (d)ATP zu erhalten, das Erhöhen des pH
auf 8,5 und der Temperatur auf 90ºC um N&sup6;-Carboxymethyl-
(d)ATP zu erhalten, das Umsetzen des
N&sup6;-Carboxymethyl(d)ATP mit H&sub2;N(CH&sub2;)nNH&sub2; in Gegenwart von
Ethyldimethylaminopropylcarbodiimid, um
N&sup6;-(n-Alkylamidocarboxymethyl) (d)ATP zu erhalten, und
das Umsetzen des N&sup6;-(n-Alkylamidocarboxymethyl) (d)ATP mit
N-Hydroxysuccinimid-biotinester um die gewünschte
Verbindung (1) zu erhalten, oder mit N-Hydroxysuccinimidcaproyl
amidobiotinester, um die gewünschte Verbindung (2) zu
erhalten.
25. Verfahren nach Anspruch 24 und in dem (d)ATP für
2'-Desoxy-ATP steht.
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