ES2899308T3 - Dendrímeros lipocatiónicos y usos de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un dendrímero de la fórmula: Grupo de núcleo-(unidad de repetición)n-terminación (I) en la que el núcleo está unido a la unidad de repetición mediante la eliminación de uno o más átomos de hidrógeno del núcleo y la sustitución del átomo de hidrógeno por la unidad de repetición y en la que: el núcleo tiene la fórmula: **(Ver fórmula)** en la que: X1 es amino o alquilamino(C<=12), dialquilamino(C<=12), heterocicloalquilo(C<=12), heteroarilo(C<=12), o una versión sustituida de los mismos; R1 es amino, hidroxi, o mercapto, o alquilamino(C<=12), dialquilamino(C<=12), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y a es 1, 2, 3, 4, 5 o 6; o el núcleo tiene la fórmula: **(Ver fórmula)** en la que: X2 es N(R5)y; R5 es hidrógeno, alquilo(C<=18), o alquilo sustituido(<=18); y y es 0, 1 o 2, siempre que la suma de y y z sea 3; R2 es amino, hidroxi, o mercapto, o alquilamino(C<=12), dialquilamino(C<=12), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; b es 1, 2, 3, 4, 5 o 6; y z es 1, 2, 3; siempre que la suma de z e y sea 3; o el núcleo tiene la fórmula: **(Ver fórmula)** en la que: X3 es -NR6-, donde R6 es hidrógeno, alquilo(C<=8), o alquilo sustituido(C<=18), -O-, o alquilaminodiilo(C<=8), alcoxidio(C<=8), arenodiilo(C<=8), heteroarenodiilo(C<=8), heterocicloalcanodiilo(C<=8), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; R3 y R4 son cada uno independientemente amino, hidroxi, o mercapto, o alquilamino(C<=12), dialquilamino(C<=12), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; o un grupo de la fórmula: -(CH2CH2N)e(Rc)Rd; en la que: e es 1, 2 o 3; Rc y Rd son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo(C<=6), o alquilo (C<=6) sustituido; c y d son cada uno independientemente 1, 2, 3, 4, 5 o 6; o el núcleo es alquilamina(C<=18)), dialquilamina(C<=36), heterocicloalcano(C<=12), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; en la que la unidad de repetición comprende un diacilo degradable y un enlazador; el grupo diacílico degradable tiene la fórmula: **(Ver fórmula)** en la que: A1 y A2 son cada uno independientemente -O- o -NRa-, donde: Ra es hidrógeno, alquilo(C<=6), o alquilo (C<=6) sustituido; Y3 es alcanodiilo(C<=12), alquenodiilo(C<=12), arenodiilo(C<=12), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; o un grupo de la fórmula: en la que: X3 y X4 son alcanodiilo(C<=12), alquenodiilo(C<=12), arenodiilo(C<=12), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; Y5 es un enlace covalente, alcanodiilo(C<=12), alquenodiilo(C<=12), arenodiilo(C<=12), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y R9 es alquilo(C<=8) o alquilo (C<=8) sustituido; el grupo enlazador tiene la fórmula **(Ver fórmula)** en la que: Y1 es alcanodiilo(C<=12), alquenodiilo(C<=12), arenodiilo(C<=12), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y en la que cuando la unidad de repetición comprende un grupo enlazador, entonces el grupo enlazador está unido a un grupo diacílico degradable tanto en el átomo de nitrógeno como en el átomo de azufre del grupo enlazador, donde el primer grupo de la unidad de repetición es un grupo diacílico degradable, donde para cada grupo enlazador, el siguiente grupo comprende dos grupos diacílicos degradables unidos al átomo de nitrógeno del grupo enlazador; y donde n es el número de grupos enlazadores presentes en la unidad de repetición; y el grupo de terminación tiene la fórmula **(Ver fórmula)** en la que: Y4 es un alcanodiilo(C<=18) o un alcanodiilo(C<=18) en la que uno o más de los átomos de hidrógeno del alcanodiilo(C<=18) han sido sustituidos por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -SCH3, o -OC(O)CH3; R10 es hidrógeno, carboxi, hidroxi, o arilo(C<=12), alquilamino(C<=12), dialquilamino(C<=12), N-heterocicloalquilo(C<=12), -C(O)N(R11)-alcanodiilo(C<=6)- heterocicloalquilo(C<=12), -C(O)-alquilamino(C<=12), -C(O)-dialquilamino(C<=12), -C(O)-N-heterocicloalquilo(C<=12), em la que: R11 es hidrógeno, alquilo(C<=6), o alquilo (C<=6) sustituido; en la que el último diacilo degradable de una cadena de unidades repetitivas está unido al grupo de terminación; y n es 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN
Dendrímeros lipocatiónicos y usos de los mismos
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
1. Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a los campos de los dendrímeros. En particular, se refiere a composiciones de nanopartículas de dendrímeros que comprenden un ácido nucleico. Más concretamente, se refiere a las composiciones de nanopartículas de dendrímero para el suministro del ácido nucleico. Más concretamente, se refiere a las composiciones de nanopartículas de dendrímeros para la administración de fármacos y otros excipientes.
2. Descripción de la técnica relacionada
Desde el descubrimiento del ARNi u otros agentes de ácidos nucleicos y el reconocimiento de su potencial terapéutico, ha habido una búsqueda continua de portadores de administración eficaces (Whitehead et al. , 2009; Kanasty et al ., 2013; Akinc et al ., 2008; Davis et al., 2010; Love et al., 2010; Siegwart et al., 2011; Jayaraman et al., 2012). Se ha avanzado en la eficacia de la administración de pequeños ARN en hígados sanos, pero la combinación clínicamente necesaria de alta potencia para los tumores y baja hepatotoxicidad para las células normales no se cumple actualmente con los vehículos de administración existentes. Lamentablemente, los cinco ensayos clínicos en humanos de fase III de fármacos de moléculas pequeñas para el tratamiento del carcinoma hepatocelular (HCC) fracasaron en los últimos cuatro años, en parte porque la disfunción hepática debilitante y en fase avanzada amplifica la toxicidad de los fármacos (Roberts, L.R., 2008; Scudellari, M., 2014). Los microARN (miARN) representan una estrategia alternativa prometedora porque pueden funcionar como supresores de tumores al dirigirse simultáneamente a múltiples vías implicadas en la diferenciación, la proliferación y la supervivencia de las células, pero estos agentes terapéuticos requieren portadores para ser eficaces (Ventura y Jacks, 2009; Kasinski and Slack, 2011; Ling et al., 2013; Cheng et al., 2015). El equilibrio entre la potencia y la toxicidad del portador del fármaco es un criterio útil, especialmente en el contexto del cáncer de hígado, donde la propia toxicidad del portador puede reducir la eficacia terapéutica de las terapias de ARN pequeño.
Para lograr este equilibrio de baja toxicidad y alta potencia, la influencia de la estructura química mediante la ampliación de la diversidad estructural y el tamaño molecular de los portadores de administración es útil para lograr un equilibrio terapéuticamente eficaz. Los dendrímeros son macromoléculas monodispersas compuestas por múltiples monómeros perfectamente ramificados que emanan radialmente de un núcleo central. Por tanto, los dendrímeros tienen el mismo alto grado de uniformidad molecular que las moléculas pequeñas y el amplio espacio teórico para el ajuste químico que los polímeros polidispersos (Bosman et al., 1999; Fréchet and Tomalia, 2002; Gillies y Frechet, 2002; Grayson y Fréchet, 2001). Estas características intrínsecas permiten que los dendrímeros tengan propiedades únicas (Murat and Grest, 1996; Percec et al., 2010; Duncan and Izzo, 2005) para diversas aplicaciones biomédicas (Stiriba et al., 2002; Lee et al., 2005; Wu et al., 2015). En la administración de genes, la mayoría de los estudios han utilizado el número limitado de dendrímeros comerciales para su posterior modificación química. (Kang et al., 2005; Taratula et al., 2009; Khan et al., 2014). La expansión de las aplicaciones de los dendrímeros depende, por tanto, de la capacidad de ajustar fácilmente el tamaño, la química, la topología y, en última instancia, las propiedades físicas de los dendrímeros mediante la síntesis química. Por ello, el desarrollo de nuevos dendrímeros que puedan actuar como portadores de ácidos nucleicos y otros fármacos es clínicamente útil.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención se define en las reivindicaciones. Cualquier asunto objeto que quede fuera se proporciona únicamente a título informativo. La presente divulgación proporciona dendrímeros de la fórmula:
Grupo de núcleo-(unidad de repetición)n-terminación (I)
en la que el núcleo está unido a la unidad de repetición mediante la eliminación de uno o más átomos de hidrógeno del núcleo y la sustitución del átomo por la unidad de repetición y en la que:
el núcleo tiene la fórmula:
X i > l R i ai»
en la que:
X1 es amino o alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), heterocicloalquilo(c<i2), heteroarilo(c<i2), o una versión sustituida de los mismos;
R1 es amino, hidroxi, o mercapto, o alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y
a es 1,2, 3, 4, 5 o 6; o
el núcleo tiene la fórmula:
Figure imgf000003_0001
en la que:
X2 es N(R5)y;
R5 es hidrógeno, alquilo(c<i8), o alquilo sustituido(c<i8); y
y es 0, 1 o 2, siempre que la suma de y y z sea 3;
R2 es amino, hidroxi, o mercapto, o alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
b es 1,2, 3, 4, 5 o 6; y
z es 1,2, 3; siempre que la suma de z e y sea 3; o
el núcleo tiene la fórmula:
Figure imgf000003_0002
en la que:
X3 es -NR6-, donde R6 es hidrógeno, alquilo(c<8), o alquilo(c<8) sustituido, -O-, o alquilaminodiilo(c<8), alcoxidio(c<8), arenodiilo(c<8), heteroarenodiilo(c<8), heterocicloalcanodiilo(c<8), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
R3 y R4 son cada uno independientemente amino, hidroxi, o mercapto, o alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; o un grupo de la fórmula: -(CH2CH2N)e(Rc)Rd; en la que:
e es 1, 2 o 3;
Rc y Rd son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo(c<6), o alquilo (c<6) sustituido;
c y d son cada uno independientemente 1,2, 3, 4, 5 o 6; o
el núcleo es alquilamina(c<i8), dialquilamina(c<36), heterocicloalcano(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
donde la unidad de repetición comprende un diacilo degradable y un enlazador;
el grupo diacílico degradable tiene la fórmula:
Figure imgf000003_0003
en la que:
A 1 y A2 son cada uno independientemente -O- o -NRa-, donde:
Ra es hidrógeno, alquilo(c<6), o alquilo (c<6) sustituido;
Y3 es alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; o un grupo de la fórmula:
en la que:
X3 y X4 son alcanodiilO(c<i2), alquenodiilO(c<i2), arenodiilO(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
Y5 es un enlace covalente, alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y
R9 es alquilo(c<8) o alquilo (c<8) sustituido;
el grupo enlazador tiene la fórmula
Figure imgf000004_0001
en la que:
Y1 es alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y
donde cuando la unidad de repetición comprende un grupo enlazador, entonces el grupo enlazador está unido a un grupo diacílico degradable tanto en el átomo de nitrógeno como en el átomo de azufre del grupo enlazador, donde el primer grupo de la unidad de repetición es un grupo diacílico degradable, donde para cada grupo enlazador, el siguiente grupo comprende dos grupos diacílicos degradables unidos al átomo de nitrógeno del grupo enlazador; y donde n es el número de grupos enlazadores presentes en la unidad de repetición; y
el grupo de terminación tiene la fórmula
Figure imgf000004_0002
en la que:
Y4 es un alcanodiilo(c<i8) o un alcanodiilo(c<i8) en la que uno o más de los átomos de hidrógeno del alcanodiilo(c<i8) han sido sustituidos por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -SH, -OCH3 , -OCH2CH3 , -SCH3 , o -OC(O)CH3 ; R10 es hidrógeno, carboxi, hidroxi, o
arilo(c<i2), alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), N-heterocicloalquilO(c<i2), -C(O)N(Rn)-alcanodiilo(c<6)-heterocicloalquilo(c<i2), -C(O)-alquilamino(c<i2), -C(O)-dialquilamino(c<i2), -C(O)-N-heterocicloalquilo(c<i2), donde:
R11 es hidrógeno, alquilo(c<6), o alquilo (c<6) sustituido;
en la que el diacilo degradable final de la cadena está unido a un grupo de terminación;
n es 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, la estructura del dendrímero se define además:
el núcleo tiene la fórmula:
Figure imgf000004_0003
en la que:
X1 es amino o alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), heterocicloalquilo(c<i2), heteroarilo(c<i2), o una versión sustituida de los mismos;
R1 es amino, hidroxi, o mercapto, o alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y
a es 1, 2, 3, 4, 5 o 6; y
donde la unidad de repetición comprende un diacilo degradable y un enlazador;
el grupo diacílico degradable tiene la fórmula:
Figure imgf000005_0001
en la que:
A 1 y A2 son cada uno independientemente -O- o -NRa-, donde:
Ra es hidrógeno, alquilo(c<6), o alquilo (c<6) sustituido;
Y3 es alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; o un grupo de la fórmula:
Figure imgf000005_0002
en la que:
X3 y X4 son alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
Y5 es un enlace covalente, alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y
R9 es alquilo(c<8) o alquilo (c<8) sustituido;
el grupo enlazador tiene la fórmula
Figure imgf000005_0003
en la que:
Y1 es alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y
donde cuando la unidad de repetición comprende un grupo enlazador, entonces el grupo enlazador está unido a un grupo diacílico degradable tanto en el átomo de nitrógeno como en el átomo de azufre del grupo enlazador, donde el primer grupo de la unidad de repetición es un grupo diacílico degradable, donde para cada grupo enlazador, el siguiente grupo comprende dos grupos diacílicos degradables unidos al átomo de nitrógeno del grupo enlazador; y donde n es el número de grupos enlazadores presentes en la unidad de repetición; y
el grupo de terminación, en la que el grupo de terminación tiene la fórmula:
Figure imgf000005_0004
en la que:
Y4 es un alcanodiilo(c<i8) o un alcanodiilo(c<i8) en la que uno o más de los átomos de hidrógeno del alcanodiilo(c<i8) han sido sustituidos por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -SH, -OCH3 , -OCH2CH3 , -SCH3 , o -OC(O)CH3 ; R10 es hidrógeno, carboxi, hidroxi, o
arilo(c<i2), alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), N-heterocicloalquilO(c<i2), -C(O)N(Rn)-alcanodiilo(c<6)-heterocicloalquilo(c<i2), -C(O)-alquilamino(c<i2), -C(O)-dialquilamino(c<i2), -C(O)-N-heterocicloalquilo(c<i2), donde:
R11 es hidrógeno, alquilo(c<6), o alquilo (c<6) sustituido;
en la que el diacilo degradable final de la cadena está unido a un grupo de terminación;
n es 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, el dendrímero tiene la fórmula:
Grupo de núcleo-(unidad de repetición)n-terminación (I)
en la que el núcleo está unido a la unidad de repetición mediante la eliminación de uno o más átomos de hidrógeno del núcleo y la sustitución del átomo por la unidad de repetición y en la que:
el núcleo tiene la fórmula:
Figure imgf000006_0001
en la que:
X2 es N(R5)y;
R5 es hidrógeno o alquilo(c<8), o alquilo sustituido(c<i8); y
y es 0, 1 o 2, siempre que la suma de y y z sea 3;
R2 es amino, hidroxi, o mercapto, o alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
b es 1,2, 3, 4, 5 o 6; y
z es 1,2, 3; siempre que la suma de z e y sea 3;
donde la unidad de repetición comprende un diacilo degradable y un enlazador;
el grupo diacílico degradable tiene la fórmula:
Figure imgf000006_0002
en la que:
A 1 y A2 son cada uno independientemente -O- o -NRa-, donde:
Ra es hidrógeno, alquilo(c<6), o alquilo (c<6) sustituido;
Y3 es alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; o un grupo de la fórmula:
Figure imgf000006_0003
en la que:
X3 y X4 son alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
Y5 es un enlace covalente, alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y
R9 es alquilo(c<8) o alquilo (c<8) sustituido;
el grupo enlazador tiene la fórmula
en la que:
Yi es alcanodiilO(c<i2), alquenodiilO(c<i2), arenodiilO(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y
donde cuando la unidad de repetición comprende un grupo enlazador, entonces el grupo enlazador está unido a un grupo diacílico degradable tanto en el átomo de nitrógeno como en el átomo de azufre del grupo enlazador, donde el primer grupo de la unidad de repetición es un grupo diacílico degradable, donde para cada grupo enlazador, el siguiente grupo comprende dos grupos diacílicos degradables unidos al átomo de nitrógeno del grupo enlazador; y donde n es el número de grupos enlazadores presentes en la unidad de repetición; y
el grupo de terminación, en la que el grupo de terminación tiene la fórmula:
A s^ 4 K 10 (VIH)
en la que:
Y4 es un alcanodiilo(c<i8) o un alcanodiilo(c<i8) en la que uno o más de los átomos de hidrógeno del alcanodiilo(c<i8) han sido sustituidos por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -SH, -OCH3 , -OCH2CH3 , -SCH3 , o -OC(O)CH3; R10 es hidrógeno, carboxi, hidroxi, o
arilo(c<i2), alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), N-heterocicloalquilO(c<i2), -C(O)N(Rn)-alcanodiilo(c<6)-heterocicloalquilo(c<i2), -C(O)-alquilamino(c<i2), -C(O)-dialquilamino(c<i2), -C(O)-N-heterocicloalquilo(c<i2), donde:
en la que el diacilo degradable final de la cadena está unido a un grupo de terminación;
n es 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En otras realizaciones, el dendrímero tiene la fórmula:
Grupo de núcleo-(unidad de repetición)n-terminación (I)
en la que el núcleo está unido a la unidad de repetición mediante la eliminación de uno o más átomos de hidrógeno del núcleo y la sustitución del átomo por la unidad de repetición y en la que:
el núcleo tiene la fórmula:
Figure imgf000007_0001
en la que:
X3 es -NR6-, donde R6 es hidrógeno, alquilo(c<8), o alquilo(c<8) sustituido, -O-, o alquilaminodiilo(c<8), alcoxidio(c<8), arenodiilo(c<8), heteroarenodiilo(c<8), heterocicloalcanodiilo(c<8), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
R3 y R4 son cada uno independientemente amino, hidroxi, o mercapto, o alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; o un grupo de la fórmula: -(CH2CH2N)e(Rc)Rd; en la que:
e es 1, 2 o 3;
Rc y Rd son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo(c<6), o alquilo (c<6) sustituido;
c y d son cada uno independientemente 1,2, 3, 4, 5 o 6; y
donde la unidad de repetición comprende un diacilo degradable y un enlazador;
el grupo diacílico degradable tiene la fórmula:
Figure imgf000007_0002
en la que:
Ai y A2 son cada uno independientemente -O- o -NRa-, donde:
Ra es hidrógeno, alquilo(c<6), o alquilo (c<6) sustituido;
Y3 es alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; o un grupo de la fórmula:
Figure imgf000008_0001
en la que:
X3 y X4 son alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
Y5 es un enlace covalente, alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y
R9 es alquilo(c<8) o alquilo (c<8) sustituido;
el grupo enlazador tiene la fórmula
Figure imgf000008_0002
en la que:
Y1 es alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y
donde cuando la unidad de repetición comprende un grupo enlazador, entonces el grupo enlazador está unido a un grupo diacílico degradable tanto en el átomo de nitrógeno como en el átomo de azufre del grupo enlazador, donde el primer grupo de la unidad de repetición es un grupo diacílico degradable, donde para cada grupo enlazador, el siguiente grupo comprende dos grupos diacílicos degradables unidos al átomo de nitrógeno del grupo enlazador; y donde n es el número de grupos enlazadores presentes en la unidad de repetición; y
el grupo de terminación, en la que el grupo de terminación tiene la fórmula:
Figure imgf000008_0003
en la que:
Y4 es un alcanodiilo(c<i8) o un alcanodiilo(c<i8) en la que uno o más de los átomos de hidrógeno del alcanodiilo(c<i8) han sido sustituidos por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -SH, -OCH3 , -OCH2CH3 , -SCH3 , o -OC(O)CH3; R10 es hidrógeno, carboxi, hidroxi, o
arilo(c<i2), alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), N-heterocicloalquilO(c<i2), -C(O)N(R11)-alcanodiilo(c<6)-heterocicloalquilo(c<i2), -C(O)-alquilamino(c<i2), -C(O)-dialquilamino(c<i2), -C(O)-N-heterocicloalquilo(c<i2), donde:
R11 es hidrógeno, alquilo(c<6), o alquilo (c<6) sustituido;
en la que el diacilo degradable final de la cadena está unido a un grupo de terminación;
n es 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6;
farmacéuticamente aceptable del mismo. En otras realizaciones, el dendrímero tiene la fórmula:
Grupo de núcleo-(unidad de repetición)n-terminación (I)
en la que el núcleo está unido a la unidad de repetición mediante la eliminación de uno o más átomos de hidrógeno del núcleo y la sustitución del átomo por la unidad de repetición y en la que:
el núcleo es alquilamina(c<i8), dialquilamina(c<36), heterocicloalcano(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y
donde la unidad de repetición comprende un diacilo degradable y un enlazador;
el grupo diacílico degradable tiene la fórmula:
Figure imgf000009_0001
en la que:
A 1 y A2 son cada uno independientemente -O- o -NRa-, donde:
Ra es hidrógeno, alquilo(c<6), o alquilo (c<6) sustituido;
Y3 es alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; o un grupo de la fórmula:
Figure imgf000009_0002
en la que:
X3 y X4 son alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
Y5 es un enlace covalente, alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y
R9 es alquilo(c<8) o alquilo (c<8) sustituido;
el grupo enlazador tiene la fórmula
Figure imgf000009_0003
en la que:
Y1 es alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y
donde cuando la unidad de repetición comprende un grupo enlazador, entonces el grupo enlazador está unido a un grupo diacílico degradable tanto en el átomo de nitrógeno como en el átomo de azufre del grupo enlazador, donde el primer grupo de la unidad de repetición es un grupo diacílico degradable, donde para cada grupo enlazador, el siguiente grupo comprende dos grupos diacílicos degradables unidos al átomo de nitrógeno del grupo enlazador; y donde n es el número de grupos enlazadores presentes en la unidad de repetición; y
el grupo de terminación, en la que el grupo de terminación tiene la fórmula:
A s^ 4 K 10 (V III)
en la que:
Y4 es un alcanodiilo(c<i8) o un alcanodiilo(c<i8) en la que uno o más de los átomos de hidrógeno del alcanodiilo(c<i8) han sido sustituidos por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -SH, -OCH3 , -OCH2CH3 , -SCH3 , o -OC(O)CH3 ; R10 es hidrógeno, carboxi, hidroxi, o
arilO(c<i2), alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), N-heterocicloalquilo(c<i2), -C(O)N(Rii)-alcanodiilO(c<6)-heterocicloalquilO(c<i2), -C(O)-alquilamino(c<i2), -C(O)-dialquilamino(c<i2), -C(O)-N-heterocicloalquilo(c<i2), donde:
R11 es hidrógeno, alquilo(c<6), o alquilo (c<6) sustituido;
en la que el diacilo degradable final de la cadena está unido a un grupo de terminación;
n es 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, el grupo de terminación se define además por la fórmula:
Figure imgf000010_0001
en la que:
Y4 es un alcanodiilo(c<i8) o un alcanodiilo(c<i8) en la que uno o más de los átomos de hidrógeno han sido sustituidos por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -SH, -OCH3 , -OCH2CH3 , -SCH3 , o -OC(O)CH3; y
R10 es hidrógeno.
En otras realizaciones, el grupo de terminación se define además por la fórmula:
Figure imgf000010_0002
en la que:
Y4 es alcanodiilo(c<i8); y
R10 es hidrógeno.
En algunas realizaciones, Y4 es alcanodiilo(C4-18). En otras realizaciones, el grupo de terminación se define además por la fórmula:
Figure imgf000010_0003
en la que:
Y4 es un alcanodiilo(c<i8) o un alcanodiilo(c<i8) en la que uno o más de los átomos de hidrógeno han sido sustituidos por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -SH, -OCH3 , -OCH2CH3 , -SCH3 , o -OC(O)CH3;
R10 es alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), N-heterocicloalquilO(c<i2).
En algunas realizaciones, el grupo de terminación se define además por la fórmula:
Figure imgf000010_0004
en la que:
Y4 es un alcanodiilo(c<i8) o un alcanodiilo(c<i8) en la que uno o más de los átomos de hidrógeno han sido sustituidos por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -SH, -OCH3 , -OCH2CH3 , -SCH3 , o -OC(O)CH3;
R10 es hidroxi.
En algunas realizaciones, el núcleo se define además por la fórmula:
*1^ MT^1
a (II)
en la que:
Xi es alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), heterocicloalquilO(c<i2), heteroarilO(c<i2), o una versión sustituida de los mismos;
R1 es amino, hidroxi, o mercapto, o alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y
a es 1,2, 3, 4, 5 o 6;
En algunas realizaciones, X1 es alquilamino(c<i2) o alquilamino(c<i2) sustituido. En algunas realizaciones, X1 es etilamino. En otras realizaciones, X 1 es dialquilamino(c<i2) o dialquilamino(c<i2) sustituido. En algunas realizaciones, X1 es dimetilamino. En otras realizaciones, X1 es heterocicloalquilo(c<i2) o heterocicloalquilo(c<i2) sustituido. En algunas realizaciones, X1 es 4-piperidinilo, N-piperidinilo, N-morfolinilo, N-pirrolidinilo, 2-pirrolidinilo, N-piperaziniloo N-4-metilpiperadizinilo. En otras realizaciones, X1 es heteroarilo(c<i2) o heteroarilo sustituido(c<i2). En algunas realizaciones, X1 es 2-piridinilo o N-imidazolilo. En algunas realizaciones, R1 es hidroxi. En otras realizaciones, R1 es amino. En otras realizaciones, R1 es alquilamino(c<i2) o alquilamino(c<i2) sustituido. En algunas realizaciones, R1 es alquilamino(c<i2). En algunas realizaciones, R1 es metilamino o etilamino. En algunas realizaciones, a es 1, 2, 3 o 4. En algunas realizaciones, a es 2 o 3. En algunas realizaciones, a es 2. En otras realizaciones, a es 3. En algunas realizaciones, el núcleo se define además como un compuesto de la fórmula:
Figure imgf000011_0001
En algunas realizaciones, el núcleo se define además como:
Figure imgf000011_0002
En otras realizaciones, el núcleo se define además por la fórmula:
Figure imgf000011_0003
en la que:
X2 es N(R5)y;
R5 es hidrógeno o alquilo(c<8), o alquilo sustituido(c<i8); y
y es 0, 1 o 2, siempre que la suma de y y z sea 3;
R2 es amino, hidroxi, o mercapto, o alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
b es 1,2, 3, 4, 5 o 6; y
z es 1,2, 3; siempre que la suma de z e y sea 3.
En algunas realizaciones, X2 es N. En otras realizaciones, X2 es NR5 , donde R5 es hidrógeno o alquilo(c<8). En algunas realizaciones, R5 es hidrógeno. En otras realizaciones, R5 es metilo. En algunas realizaciones, z es 3. En otras realizaciones, z es 2. En algunas realizaciones,R2 es hidroxi. En otras realizaciones,R2 es amino. En otras realizaciones,R2 es alquilamino(c<i2) o alquilamino(c<i2) sustituido. En algunas realizaciones,R2 es alquilamino(c<i2). En algunas realizaciones,R2 es metilamino. En otras realizaciones,R2 es dialquilamino(c<i2) o dialquilamino(c<i2) sustituido. En algunas realizaciones,R2 es dialquilamino(c<i2). En algunas realizaciones,R2 es dimetilamino. En algunas realizaciones, b es 1, 2, 3 o 4. En algunas realizaciones, b es 2 o 3. En algunas realizaciones, b es 2. En otras realizaciones, b es 3. En algunas realizaciones, el núcleo se define además como:
Figure imgf000012_0001
En algunas realizaciones, el núcleo se define además como:
Figure imgf000012_0002
En otras realizaciones, el núcleo se define además como:
Figure imgf000012_0003
en la que:
X3 es -NR6-, donde R6 es hidrógeno, alquilo(c<8), o alquilo(c<8) sustituido, -O-, o alquilaminodiilo(c<8), alcoxidio(c<8), arenodiilo(c<8), heteroarenodiilo(c<8), heterocicloalcanodiilo(c<8), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
R3 y R4 son cada uno independientemente amino, hidroxi, o mercapto, o alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; o un grupo de la fórmula: -(CH2CH2N)e(Rc)Rd; donde: e es 1, 2 o 3;
Rc y Rd son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo(c<6), o alquilo (c<6) sustituido;
c y d son cada uno independientemente 1,2, 3, 4, 5 o 6.
En algunas realizaciones, X3 es -O-. En otras realizaciones, X3 es -NR6-, donde R6 es hidrógeno, alquilo(c<8), o alquilo (c<8) sustituido. En algunas realizaciones, X3 es -NH- o -NCH3-. En otras realizaciones, X3 es alquilaminodiilo( C<8) o alquilaminodiilo(c<8) sustituido. En algunas realizaciones, X3 es -NHCH2CH2NH- o -NHCH2CH2NHCH2CH2NH-. En otras realizaciones, X3 es alcoxidilo(c<8) o alcoxidilo(c<8) sustituido. En algunas realizaciones, X3 es -OCH2CH2O-. En otras realizaciones, X3 es arenodiilo(c<8) o arenodiilo(c<8) sustituido. En algunas realizaciones, X3 es benzenediilo. En otras realizaciones, X3 es heterocicloalcanodiilo( C<8) o heterocicloalcanodiilo(c<8) sustituido. En algunas realizaciones, X3 es N,N'-piperazindiilo.
En algunas realizaciones, R3 es amino. En otras realizaciones, R3 es hidroxi. En otras realizaciones, R3 es alquilamino((c<i2) o alquilamino(c<i2) sustituido. En algunas realizaciones, R3 es alquilamino(c<i2). En algunas realizaciones, R3 es metilamino. En otras realizaciones, R3 es dialquilamino(c<i2) o dialquilamino(c<i2) sustituido. En algunas realizaciones, R3 es dialquilamino(c<i2). En algunas realizaciones, R3 es dimetilamino.
En algunas realizaciones, R4 es amino. En otras realizaciones, R4 es hidroxi. En otras realizaciones, R4 es alquilamino(c<i2) o alquilamino(c<i2) sustituido. En algunas realizaciones, R4 es alquilamino(c<i2). En algunas realizaciones, R4 es metilamino. En otras realizaciones, R4 es dialquilamino(c<i2) o dialquilamino(c<i2) sustituido. En algunas realizaciones, R4 es dialquilamino(c<i2). En algunas realizaciones, R4 es dimetilamino. En otras realizaciones, R4 es -(CH2CH2N)e(Rc)Rd: donde: e es 1,2, o 3; y Rc y Rd son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo(c<6), o alquilo (c<6) sustituido. En algunas realizaciones, e es 1 o 2. En algunas realizaciones, e es 1. En algunas realizaciones, Rc es hidrógeno. En algunas realizaciones, Rd es hidrógeno.
En algunas realizaciones, c es 1, 2, 3 o 4. En algunas realizaciones, c es 2 o 3. En algunas realizaciones, c es 2. En otras realizaciones, c es 3. En algunas realizaciones, d es 1,2, 3 o 4. En algunas realizaciones, d es 2 o 3. En algunas realizaciones, d es 2. En otras realizaciones, d es 3. En algunas realizaciones, el núcleo se define además como:
Figure imgf000013_0001
o
En algunas realizaciones, el núcleo se define además como:
Figure imgf000013_0002
En otras realizaciones, el núcleo es alquilamina(c<i8), dialquilamina(c<36), heterocicloalcano(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos. En algunas realizaciones, el núcleo es una alquilamina(C<18) o alquilamina sustituida(c<i8). En algunas realizaciones, el núcleo es octilamina, decilamina, dodecilamina, tetradecilamina, hexadecilamina y octadecilamina. En otras realizaciones, el núcleo es una dialquilamina(c<36) o dialquilamina sustituida(c<36). En algunas realizaciones, el núcleo es N-metil, N-dodecilamina, dioctilamina o didecylamina. En otras realizaciones, el núcleo es heterocicloalcano(c<i2) o heterocicloalcano sustituido(c<i2). En algunas realizaciones, el núcleo es 4-N-metilpiperazinilo. En algunas realizaciones, Y1 es alcanodiilo(c<8) o alcanodiilo(c<8) sustituido. En algunas realizaciones, Y1 es alkanediil(c<8). En algunas realizaciones, Y1 es -CH2CH2-. En algunas realizaciones, Y3 es alcanodiilo(c<8) o alcanodiilo(c<8) sustituido. En algunas realizaciones, Y3 es alkanediil(c<8). En algunas realizaciones, Y3 es -CH2CH2-. En otras realizaciones, Y3 es:
Figure imgf000014_0001
en la que:
X3 y X4 son alcanodiilO(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
Y5 es un enlace covalente, alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos.
En algunas realizaciones, X3 es alcanodiilo( C<12) o alcanodiilo(c<i2) sustituido. En algunas realizaciones, X3 es -CH2CH2-. En algunas realizaciones, X4 es alcanodiilo(c<i2) o alcanodiilo(c<i2) sustituido. En algunas realizaciones, X4 es -CH2CH2-. En algunas realizaciones, Y5 es un enlace covalente. En algunas realizaciones, Y3 es:
Figure imgf000014_0002
en la que:
X3 y X4 son alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
Y5 es un enlace covalente, alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos.
En algunas realizaciones, X3 es alcanodiilo( C<i2) o alcanodiilo(c<i2) sustituido. En algunas realizaciones, X3 es -CH2CH2-. En algunas realizaciones, X4 es alcanodiilo(c<i2) o alcanodiilo(c<i2) sustituido. En algunas realizaciones, X4 es -CH2CH2-. En algunas realizaciones, Y5 es un enlace covalente. En algunas realizaciones, Y5 es -CH2- o -C(CH3)2-. En algunas realizaciones,A1 es -O-. En otras realizaciones,A1 es -NRa-. En algunas realizaciones,Ra es hidrógeno. En algunas realizaciones,A2 es -O-. En otras realizaciones,A2 es -NRa-. En algunas realizaciones,Ra es hidrógeno. En algunas realizaciones, R9 es alquilo(c<8). En algunas realizaciones, R9 es metilo. En algunas realizaciones, n es 0, 1, 2, 3 o 4. En algunas realizaciones, n es 0, 1, 2 o 3. En algunas realizaciones, n es 0. En otras realizaciones, n es 1. En otras realizaciones, n es 2. En otras realizaciones, n es 3.
En otro aspecto más, la presente divulgación proporciona composiciones que comprenden:
(a) un dendrímero descrito en el presente documento; y
(b) un ácido nucleico.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico es un ARN de interferencia cortofp. ej. ARN de interferencia pequeña ) (ARNip), un microARN (miARN), un pri-miARN, un ARN mensajero (ARNm), un ácido nucleico relacionado con repeticiones palindrómicas cortas agrupadas interespaciadas con regularidad (CRISPR), un ARN guía simple (ARNsg), un CRISPR-ARN (ARNcr) un ARNcr transactivador (ARNtr), un ADN plasmídico (ADNp), un ARN de transferencia (ARNt), un oligonucleótido antisentido (ASO), un ARN guía, un ADN de doble cadena (ADNbc), un ADN de cadena simple (ADNmc), un ARN de cadena simple (ARNs) y un ARN de doble cadena (ARNd). En algunas realizaciones, el ácido nucleico es un ARNip, un ARNt o un ácido nucleico que puede utilizarse en un proceso CRISPR. El ácido nucleico puede ser un ARNip. En otras realizaciones, el ácido nucleico que puede utilizarse en un proceso CRISPR, como un ácido nucleico relacionado con epeticiones palindrómicas cortas agrupadas interespaciadas con regularidad (CRISPR), un ARN guía simple (ARNsg), un ARN c RiSPR (ARNcr) o un ARNcr transactivador (traARNcr). En algunas realizaciones, el ácido nucleico es un ARNip contra el Factor VII que comprende la secuencia:
5'-GGAucAucAAGucuuAc[dT][dT]-3' (SEQ ID NO: 1); o
3'-GuAAGAcuuGAGAuGAucc[dT][dT]-5' (SEQ ID NO: 2).
En otras realizaciones, el ácido nucleico es un miARN. En otras realizaciones, el ácido nucleico es un ARNm. En otras realizaciones, el ácido nucleico es un ARNt. En otras realizaciones, el ácido nucleico es un ARN guía. En algunas realizaciones, el ARN guía se utiliza en procesos CRISPR. En otras realizaciones, el ácido nucleico es un relación en peso.
En algunas realizaciones, el dendrímero y el ácido nucleico están presentes en una relación en peso de aproximadamente 100:1 a aproximadamente 1:5. En algunas realizaciones, la relación en peso entre el dendrímero y el ácido nucleico es de aproximadamente 50:1 a aproximadamente 2:1. En algunas realizaciones, la relación en peso entre el dendrímero y el ácido nucleico es de 25:1. En otras realizaciones, la relación en peso entre el dendrímero y el ácido nucleico es de 7:1. En algunas realizaciones, la composición comprende además uno o más lípidos auxiliares. En algunas realizaciones, el lípido auxiliar se selecciona entre un esteroide, un derivado de esteroide, un lípido PEG o un fosfolípido. En algunas realizaciones, el lípido auxiliar es un esteroide o un derivado esteroide. En algunas realizaciones, el esteroide es el colesterol. En algunas realizaciones, el esteroide o derivado esteroide y el dendrímero están presentes en una relación molar de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1:20. En algunas realizaciones, la relación molar del esteroide o derivado esteroide y el dendrímero es de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:10. En algunas realizaciones, la relación molar del esteroide o derivado esteroide y el dendrímero es de aproximadamente 38:50. En algunas realizaciones, la relación molar del esteroide o derivado esteroide y el dendrímero es de aproximadamente 1:5.
En otras realizaciones, el lípido auxiliar es un lípido PEG. En algunas realizaciones, el lípido PEG es un diacilglicerol PEGilado como un compuesto de la fórmula:
Figure imgf000015_0001
en la que:
R12 y R13 son cada uno independientemente alquilo(c<24), alquenilo(c<24), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
Re es hidrógeno, alquilo(c<8)o alquilo (c<8) sustituido; y
x es 1-250.
En algunas realizaciones, el lípido PEG es dimiristoil-sn-glicerol o un compuesto de la fórmula:
Figure imgf000015_0002
en la que:
n1 es 5-250; y
n2 y n3 son cada uno independientemente 2-25.
En algunas realizaciones, el lípido PEG y el dendrímero están presentes en una relación molar de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:250. En algunas realizaciones, la relación molar del lípido PEG y el dendrímero es de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1:125. En algunas realizaciones, la relación molar del lípido PEG y el dendrímero es de aproximadamente 1:20 a aproximadamente 1:50.
En otras realizaciones, el lípido auxiliar es un fosfolípido. En algunas realizaciones, el fosfolípido es 1,2-distearoil-snglicero-3-fosfocolina (DSPC). En otras realizaciones, el fosfolípido es 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE). En algunas realizaciones, el fosfolípido y el dendrímero están presentes en una relación molar de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1:20. En algunas realizaciones, la relación molar del fosfolípido y el dendrímero es de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:10. En algunas realizaciones, la relación molar del fosfolípido y el dendrímero es de aproximadamente 4:5. En algunas realizaciones, la relación molar del fosfolípido y el dendrímero es de aproximadamente 1:5. En algunas realizaciones, la composición consiste esencialmente en el dendrímero, el ácido nucleico y uno o más lípidos auxiliares.
En otro aspecto más, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende:
(a) una composición o dendrímero descrito en el presente documento; y
(b) un portador farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, el portador farmacéutico aceptable es un disolvente o solución. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica está formulada para su administración por vía oral, intraadiposa, intraarterial, intraarticular, intracraneal, intradérmica, intralesional, intramuscular, intranasal, intraocular, intrapericárdica, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrarrectal, intratecal, intratraqueal, intratumoral, intraumbilical, intravaginal, intravenosa, intravesicular, por vía intravítrea, por vía liposomal, por vía local, por vía mucosa, por vía parenteral, por vía rectal, por vía subconjuntival, por vía subcutánea, por vía sublingual, por vía tópica, por vía transbucal, por vía transdérmica, por vía vaginal, en cremas, en composiciones lipídicas, por medio de un catéter, por medio de un lavado, por medio de una infusión continua, por medio de una infusión, por medio de una inhalación, por medio de una inyección, por medio de una administración local o por medio de una perfusión localizada. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica está formulada para inyección intravenosa o intraarterial. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se formula como una dosis unitaria.
Los compuestos y las composiciones reivindicados pueden utilizarse en procedimientos de modulación de la expresión de un gen que comprenden la administración de un ácido nucleico a una célula, los procedimientos comprenden el contacto de la célula con una composición o una composición farmacéutica descrita en el presente documento en condiciones suficientes para provocar la captación del ácido nucleico en la célula. En algunas realizaciones, la célula es contactada in vitro. En otras realizaciones, la célula se pone en contacto in vivo. En otras realizaciones, la célula se pone en contacto ex vivo. En algunas realizaciones, la modulación de la expresión génica es suficiente para tratar una enfermedad o trastorno. En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno es el cáncer. En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno es el cáncer de hígado. En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno es el carcinoma hepatocelular.
Los compuestos y composiciones reivindicados también pueden utilizarse en procedimientos de tratamiento de una enfermedad o trastorno en un paciente que comprenden la administración al paciente que lo necesita de una cantidad farmacéuticamente eficaz de una composición o una composición farmacéutica descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno es el cáncer. En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno es el cáncer de hígado. En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno es el carcinoma hepatocelular. En algunas realizaciones, los procedimientos comprenden además la administración de una o más terapias adicionales contra el cáncer al paciente. En algunas realizaciones, la terapia contra el cáncer es un compuesto quimioterapéutico, cirugía, radioterapia o inmunoterapia. En algunas realizaciones, las composiciones o composiciones farmacéuticas se administran al paciente una vez. En otras realizaciones, las composiciones o composiciones farmacéuticas se administran al paciente dos o más veces. En algunas realizaciones, el paciente es un mamífero como un humano. En otro aspecto más, la presente divulgación proporciona dendrímeros de la fórmula
Grupo de núcleo-(unidad de repetición)n-terminación (I)
en la que el núcleo está unido a la unidad de repetición mediante la eliminación de uno o más átomos de hidrógeno del núcleo y la sustitución del átomo por la unidad de repetición y en la que:
el núcleo tiene la fórmula:
Figure imgf000016_0001
en la que:
X3 es -NR6-, donde R6 es hidrógeno, alquilo(c<8), o alquilo(c<8) sustituido, -O-, o alquilaminodiilo(c<8), alcoxidilo(c<8), arenodiilo(c<8), heteroarenodiilo(c<8), heterocicloalquenodiilo(c<8), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
R3 y R4 son cada uno independientemente amino, hidroxi, o mercapto, o alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
c y d son cada uno independientemente 1,2, 3, 4, 5 o 6; o
donde la unidad de repetición comprende un diacilo degradable y un enlazador;
el grupo diacílico degradable tiene la fórmula:
Figure imgf000016_0002
en la que:
A 1 y A2 son cada uno independientemente -O- o -NRa-, donde:
Ra es hidrógeno, alquilo(c<6), o alquilo (c<6) sustituido;
Y3 es alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y
R9 es alquilo(c<8) o alquilo (c<8) sustituido;
el grupo enlazador tiene la fórmula
Figure imgf000017_0001
en la que:
Y1 es alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y
donde cuando la unidad de repetición comprende un grupo enlazador, entonces el grupo enlazador está unido a un grupo diacílico degradable tanto en el átomo de nitrógeno como en el átomo de azufre del grupo enlazador, donde el primer grupo de la unidad de repetición es un grupo diacílico degradable, donde para cada grupo enlazador, el siguiente grupo comprende dos grupos diacílicos degradables unidos al átomo de nitrógeno del grupo enlazador; y donde n es el número de grupos enlazadores presentes en la unidad de repetición; y
el grupo de terminación tiene la fórmula
Figure imgf000017_0002
en la que:
Y4 es alcanodiilo(c<i8); y
R10 es hidrógeno;
en la que el diacilo degradable final de la cadena está unido a un grupo de terminación;
n es 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
Los términos "comprender" (y cualquier forma de comprender, como "comprende" y "comprendiendo"), "tener" (y cualquier forma de tener, como "tiene" y "teniendo"), "contener" (y cualquier forma de contener, como "contiene" y "conteniendo"), e "incluir" (y cualquier forma de incluir, como "incluye" e "incluyendo") son verbos de enlace abiertos. Como resultado, un procedimiento, composición, kit o sistema que "comprende", "tiene", "contiene" o "incluye" uno o más pasos o elementos citados posee esos pasos o elementos citados, pero no está limitado a poseer sólo esos pasos o elementos; puede poseerles decir, cubrir) elementos o pasos que no están citados. Del mismo modo, un elemento de un procedimiento, composición, kit o sistema que "comprenda", "tenga", "contenga" o "incluya" una o más características recitadas posee esas características, pero no está limitado a poseer sólo esas características; puede poseer características no recitadas.
Cualquier realización de cualquiera de los presentes procedimientos, composición, kit y sistemas puede consistir o consistir esencialmente en -en lugar de comprender/incluir/contenido/tener- los pasos y/o características descritos. Por lo tanto, en cualquiera de las reivindicaciones, el término "que consiste en" o "que consiste esencialmente en" puede sustituirse por cualquiera de los verbos de enlace abiertos citados anteriormente, con el fin de cambiar el alcance de una reivindicación dada de lo que sería de otro modo utilizando el verbo de enlace abierto.
El uso del término "o" en las reivindicaciones se utiliza para significar "y/o" a menos que se indique explícitamente que se refiere a las alternativas solamente o que las alternativas son mutuamente excluyentes, aunque la divulgación admite una definición que se refiere sólo a las alternativas y "y/o"
Obsérvese que el simple hecho de que un determinado compuesto se adscriba a una fórmula genérica concreta no significa que no pueda pertenecer también a otra fórmula genérica.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación y se incluyen para demostrar ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las realizaciones específicas presentadas en el presente documento.
Las FIGS. 1A-1D muestran que se requiere una combinación de alta potencia para las células tumorales y baja toxicidad para las células normales para las terapias de ARN pequeño en los cánceres de hígado vulnerables. Una estrategia modular para diversificar la funcionalidad química y el tamaño de los dendrímeros biocompatibles basados en ésteres permitió descubrir dendrímeros que equilibran una baja toxicidad y una alta potencia de administración de ARN pequeño in vivo . Las reacciones ortogonales aceleraron la síntesis de 1.512 dendrímeros modulares degradables G1, aumentando así el número, el tamaño y la diversidad química de las estructuras moleculares. La inclusión de enlaces de ésteres degradables en cada paso promovió una baja toxicidad. (FIG. 1A) Los ARN pequeños son demasiado grandes y aniónicos para entrar en las células por sí solos. Para utilizar eficazmente la maquinaria del ARNi, los portadores de administración deben chaperonear los ARN pequeños a través de numerosas barreras extracelulares e intracelulares. Se concibió un diseño modular que permitiera un ajuste fino de la identidad de los grupos funcionales y su colocación dentro de las arquitecturas de los dendrímeros. (FIG. 1B) La biblioteca se estableció mediante reacciones ortogonales secuenciales. En primer lugar, las aminas con una serie de centros de ramificación inicial (IBC) reaccionaron cuantitativa y selectivamente con los grupos de acrilato menos estéricamente obstaculizados de AEMA que contienen dos grupos éster degradables. A continuación, los productos se sometieron a una reacción catalizada por DMPP con varios tioles. (FIG. 1C) Para identificar dendrímeros degradables con estructuras topológicas optimizadas para mediar los ARN pequeños para superar las múltiples barreras de administración extracelular e intracelular, la biblioteca se divide en cuatro zonas: unión del núcleo - estabilización de la periferia (zona I), unión del núcleo - unión de la periferia (zona II), estabilización del núcleo - estabilización de la periferia (zona III), y estabilización del núcleo - unión de la periferia (zona IV). (FIG. 1D) Los dendrímeros se modulan independientemente con aminas y tioles químicamente diversos para los núcleos y las periferias. Las aminas seleccionadas se dividen en dos categorías: las aminas ionizables para la unión del ARN que generarán de una a seis especies ramificadas se etiquetan como 1A-6A y las aminas hidrófobas para la estabilización del PN se etiquetan como 1H-2H. Se espera que estas aminas aumenten la potencia con una mayor generación de dendrímeros. Las aminas alquílicas hidrófobas para la estabilización de NP se etiquetan como SC1-SC19 en función de la longitud del hidrocarburo. En el diseño de la biblioteca se incluyen tioles terminados en alcohol y ácido carboxílico (SO1-SO9) y tioles funcionalizados con amina (SN1-SN11 ) para aumentar la diversidad química. También se sintetizaron dendrímeros de generación superior G2-G4 con múltiples ramificaciones utilizando reacciones de expansión de generación (véase la FIG. 10B y FIG. 11).
La FIG. 2 muestra una alta selectividad de adición aza-Michael de la tris(2-aminoetil)amina 6A3 con metacrilato de 2-(acriloxi)etilo (AEMA) en presencia de un 5 % en moles de hidroxitolueno butilado (BHT) a 50 °C. Sin la adición de la tris(2-aminoetil)amina, el AEMA solo no reacciona después de 24 horas y su conversión es del 0 %. Tras añadir tris(2-aminoetil)amina, la conversión de AEMA es de alrededor del 82 % tras 2 horas y del 98 % tras 24 horas para generar un dendrímero de primera generación con seis ramas, 6A3-G1. Obsérvese que se añade un exceso de EAMA (6 * 0,05 eq.) con el fin de monitorizar fácilmente la reacción mediante el seguimiento por 1H RMN de EAMA. Si la conversión de EAMA se ha completado, debería quedar un 5 % de señal de Ha y Hb.
La FIG. 3 muestra una alta selectividad de adición aza-Michael de tetradecilamina 2H4 de cadena alquílica larga con metacrilato de 2-(acriloxi)etilo (AEMA) en presencia de 5 % en moles de hidroxitolueno butilado (BHT) a 50 °C. El AEMA solo no reacciona después de 24 horas y su conversión es del 0 %. Tras la adición de tetradecilamina, la conversión de AEMA es de alrededor del 97 % después de 24 horas para generar un dendrímero de primera generación con núcleo de cadena alquílica larga 2H4-G1. Obsérvese que se añade un exceso de EAMA (2 * 0,05 eq.) con el fin de controlar fácilmente la reacción mediante el rastreo de EAMA por 1H RMN. Si la conversión de EAMA se ha completado, debería quedar un 5 % de señal de Ha y Hb.
La FIG. 4 muestra la adición sulfa-Michael de 6A3-G1 (125 mM) con 2-(butilamino)etanotiol (6 * 1,2 eq.) o 1-tetradecanotiol (6 * 1,2 eq.) a 60 °C en 400 pL de DMSO-D6 durante 48 horas. Sin la adición de compuestos tiólicos, 6A3-G1 se mantiene igual a 60 °C en DMSO-D6 durante 48 horas. Con la adición de (5 % en moles) dimetilfenilfosfina (DMPP) como catalizador, el 6A3-G1 reacciona con el 1-tetradecanotiol con un rendimiento de conversión del 100 % a 60 °C en DMSO-D6 en 48 horas, mientras que el rendimiento de conversión del 6A3-G1 es sólo del 57 % sin DMPP. El rendimiento de conversión de 6A3-G1 con 2-(butilamino)etanotiol es casi cuantitativo con o sin la adición de DMPP, probablemente porque el grupo amina del 2-(butilamino)etanotiol puede actuar como catalizador. Obsérvese que se añade un exceso de tiol (6 * 0,2 eq.) porque 6A3-G1 contiene (6 * 0,05 eq.) EAMA que consume el reactivo tiol (6 * 0,1 eq.) con sus dos dobles enlaces.
La FIG. 5 muestra la adición sulfa-Michael de 2H4-G1 (125 mM) con 2-(butilamino)etanotiol (2 * 1,2 eq.) o 1-tetradecanotiol (2 * 1,2 eq.) a 60 °C en DMSO-D6 durante 48 horas. Sin la adición de compuestos tiólicos, el 2H4-G1 permanece igual a 60 °C en DMSO-D6 durante 48 horas. Con la adición de (5 % en moles) dimetilfenilfosfina (DMPP) como catalizador, el 2H4-G1 reacciona con el 1-tetradecanotiol con un rendimiento de conversión del 100 % a 60 °C en DMSO-D6 en 48 horas, mientras que el rendimiento de conversión del 2H4-G1 es sólo del 51 % sin DMPP. El rendimiento de conversión del 2H4-G1 con 2-(butilamino)etanotiol es cuantitativo con o sin la adición de DMPP, probablemente porque el grupo amina del 2-(butilamino)etanotiol puede actuar como catalizador. Obsérvese que se añade un exceso de tiol (2 * 0,2 eq.) porque el 2H4-G1 contiene (2 * 0,05 eq.) EAMA que consume el reactivo tiol (2 * 0,1 eq.) con sus dos dobles enlaces.
Las FIGS. 6A y 6B muestran que la biblioteca de 1.512 dendrímeros degradables de primera generación se estableció con alta eficiencia. (FIG. 6A) Las diferentes aminas C con varios centros de ramificación iniciales (IBC) reaccionaron con metacrilato de 2-(acriloxi)etilo (AEMA) a una equivalencia exacta de alimentación de 1:1 en presencia de 5 % en moles de hidroxitolueno butilado (BHT) a 50 °C durante 24 horas. El rendimiento de conversión de las 42 reacciones es casi cuantitativo por 1H r Mn . (FIG. 6B) Cada uno de los 42 C-L-G1 reaccionó con cada uno de los 36 tioles (P) en 66 |jL de DMSO con 5 % de DMPP a pequeña escala (~20 mg de media). La concentración de tiol es de 750 mM y la de 1An&1Hn, 2An&2Hn, 3An, 4An, 5An y 6An es de 750 mM, 275 mM, 250 mM, 187,5 mM, 150 mM y 125 mM, respectivamente. Sin añadir ningún compuesto tiol, los 42 C-L-G1 permanecieron estables a 60 °C durante 48 horas. Cada reacción de los 42 con SC4, SN8 y SO9 tiene una conversión casi cuantitativa (medida por 1H RMN).
Las FIGS. 7A-7C muestran que el cribado de administración de ARNsi in vitro de 1.512 GIDDs permitió descubrir dendrímeros que pueden superar las barreras intracelulares y establecer relaciones estructuraactividad(FIG. 7A). (FIG. 7B) Un mapa de calor del silenciamiento de la luciferasa en células HeLa-Luc tras el tratamiento con nanopartículas de dendrímero (33 nM siLuc, n=3) ilustra las relaciones de actividad zonal. Se midió la actividad de la luciferasa y la viabilidad celular para identificar los dendrímeros que equilibran una alta potencia de administración con una baja toxicidad (véanse datos adicionales en la FIG. 8). (FIG. 7C) El análisis de los grupos de nanopartículas que permitieron un silenciamiento superior al 50 % identificó dendrímeros con estructuras topológicas optimizadas para superar las barreras de administración intracelular. La zona hija se analizó además si su índice de aciertos era mayor que el de su zona parental según una serie de criterios. La tasa de aciertos de la zona parental se marca en naranja, y la tasa de aciertos mayor o menor de su grupo filial se marca en verde o azul, respectivamente. ~El 6 % de la biblioteca completa permitió un silenciamiento de genes superior al 50 %. La zona de estabilización núcleo-periferia tuve un 10 % de aciertos. Dentro de la zona I, la subzona con ramas SC rindió un 15 %, mientras que la subzona con ramas SO sólo tuvo un 1 % de aciertos. En la subzona con ramas SC, los dendrímeros con tres a seis ramas, con ramas SC5-8 o con ramas SC9-12 tenían una probabilidad mucho mayor de mediar eficientemente en la administración de ARNip.
La FIG. 8 muestra la viabilidad celular tras la adición de 1.512 NPs de dendrímeros degradables de primera generación (G1DD) que contienen siLuc (33 nM de ARNip, el valor es la media de n=3). Los GIDD se formularon en nanopartículas que contenían el ARNsi dirigido a la luciferasa de luciérnaga (siLuc) con una relación en peso de 12,5:1 (G1DD:ARNsi) y los lípidos auxiliares colesterol, 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (Ds PC) y el lípido PEG2000 con una relación molar de 50:38:10:2 (G1DD:colesterol:DSPC:lípido PEG). La viabilidad celular se midió con el reportero de luciferasa ONE-Glo Tox y el ensayo de viabilidad celular (Promega) siguiendo su protocolo. La viabilidad de las células se obtuvo normalizando con respecto a las células no tratadas. Control no tratado (n=6). Muestras experimentales (n=3).
La FIG. 9A y 9B muestran la actividad de administración intracelular de ARNip de 1.512 dendrímeros degradables de primera generación (GIDDs). Los GIDD se formularon en nanopartículas que contenían ARNsi dirigido a la luciferasa de luciérnaga (siLuc) con una relación en peso de 12,5:1 (G1DD:ARNsi) y los lípidos auxiliares colesterol, 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) y el lípido PEG2000 con una relación molar de 50:38:10:2 (G1DD : colesterol : DSPC: lípido PEG). (FiG. 9A) El mapa de calor de la reducción de la actividad de la luciferasa en la célula HeLa que expresa de forma estable la luciferasa de luciérnaga tras el tratamiento de las nanopartículas G1DD con 33 nM de ARNsi se divide en zonas y regiones para describir la ruptura del proceso de análisis dendrítico (ver parte FIG. 9B). La viabilidad de las células y la actividad de la luciferasa se midieron con el reportero ONE-Glo Tox Luciferase y el ensayo de viabilidad celular (Promega) siguiendo su protocolo. La reducción de la luciferasa se obtuvo normalizando la actividad de la luciferasa con la actividad de la luciferasa y la viabilidad de las células no tratadas. Control no tratado (n=6). Muestras experimentales (n=3). (FIG. 9B) Utilización de un proceso de análisis de árbol inspirado en dendrímeros para identificar dendrímeros degradables con estructuras optimizadas para mediar el ARNsi y superar las barreras de administración intracelular, analizando su tasa de aciertos con reducción de la actividad de la luciferasa en más del 50 %. La zona hija se analiza además si su índice de aciertos es mayor que el de su zona parental según una serie de normas. La tasa de aciertos de la zona parental se muestra con el gráfico de barras negras, y la tasa de aciertos mayor o menor de su grupo filial se muestra con la fuente azul o roja. ~El 6 % de la biblioteca completa indujo un silenciamiento de genes superior al 50 %. La zona de estabilización núcleo-periferia (zona I) tiene un 10 % de aciertos. En la zona I, la subzona con ramas SC tiene un 15 %, mientras que la subzona con ramas SO tiene un 1 %. En la subzona con ramas SC, los dendrímeros con tres, cuatro, cinco o seis ramas SC5-8 ramas o SC9-12 ramas tienen muchas más posibilidades de mediar eficientemente el ARNip para superar las barreras de administración intracelular.
Las FIGS. 10A-10C muestran el cribado sistemático del suministro de ARNsi in vivo , identificando además dendrímeros que también pueden superar las barreras extracelulares. El análisis proporcionó el SAR para diseñar dendrímeros adicionales con la actividad prevista. (FIG. 10A) Se evaluaron 26 dendrímeros degradables de primera generación con estructuras diversificadas para la anulación del Factor VII en ratones a una dosis de ARNip de 1 mg/kg (n=3). Control PBS (n=3). Los datos se muestran como media ± d.s. (FIG.
10B) El diseño racional de dendrímeros degradables con múltiples ramificaciones se logró mediante (I) la elección de poliaminas con múltiples IBC y (II) el aumento de la ramificación mediante la expansión de la generación. Se utilizaron las poliaminas naturales espermidina 5A5 y espermina 6A4. 1A2 (un RIG), 2A2 & 2A11 (dos RIG), 3A3 & 3A5 (tres RIG), y 4A1 & 4A3 (cuatro RIG) fueron elegidos para sintetizar dendrímeros degradables con múltiples ramificaciones a través de la expansión generacional (véase también la FIG. 11).
(FIG. 10C) Se evaluaron 24 dendrímeros degradables diseñados racionalmente a través de las estrategias I y II para la anulación del Factor VII en ratones a una dosis de ARNip de 1 mg/kg (n=3). Control PBS (n=3). Los datos se muestran como media ± d.s. Los dendrímeros diseñados de forma racional fueron activos con una alta tasa de éxito.
La FIG. 11 muestra la ruta sintética de 2A2 y 2A11 (dos IBC), 3A3 y 3A5 (tres IBC), y 4A1 y 4A3 (cuatro IBC) para preparar dendrímeros degradables con múltiples ramas mediante la estrategia de expansión de la generación.
Las FIGS. 12A-12E muestran la evaluación de la toxicidad in vivo de algunos de los dendrímeros degradables (>95 % de eliminación del FVII in vivo ) identificando además los dendrímeros que podrían equilibrar una alta eficacia de administración con una baja toxicidad. Algunas de las NPs de dendrímeros degradables poseían (FIG. 12A) de tamaño similar y (FIG. 12B) carga superficial neta tras la unión del ARNsi de control (siCTR) (las nanopartículas se representan en el gráfico de izquierda a derecha según la leyenda de la FIG. 12B). Las LNP lipidoides C12-200 constituyeron un reto de comparación, ya que representan el mejor ejemplo de un sistema no hidrolizable con una eficacia in vivo comparable. (FIG. 12C) Los ratones de tipo salvaje (p26) fueron inyectados i.v. con algunas NPs a 4 mg de siCTR/kg (100 mg de dendrímero/kg o 28 mg de control C12-200/kg) (n=3). El cambio de peso corporal varió entre las formulaciones según la identidad del dendrímero, pero todas las NPs fueron en gran medida no tóxicas en ratones normales, WT. (FIG. 12D) Cambio en el peso corporal de los ratones transgénicos portadores de tumores agresivos impulsados por MYC (p32) tras la inyección de 3 mg de siCTR/kg (75 mg/kg de 5A2-SC8 y 6A3-SC12 o 21 mg/kg de C12-200) (n=5). (FIG. 12E) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier de ratones transgénicos inyectados a los días 32, 36, 40 y 44 con nanopartículas 5A2-SC8 y 6A3-SC12 a una dosis de 3 mg de siCTR/kg (75 mg de dendrímero/kg) (n=5). En ratones portadores de tumores (un huésped vulnerable), la toxicidad del portador fue exagerada, y sólo el 5A2-SC8 fue capaz de ser bien tolerado y no afectar a la supervivencia. Los datos se muestran como media ± d.s. Análisis estadístico realizado con (e) la prueba de Mantel-Cox; n.s. P > 0,05; *P < 0,05.
Las FIGS. 13A y 13B muestran el agresivo modelo de tumor hepático transgénico impulsado por MYC que se eligió para evaluar la toxicidad y la potencia de los dendrímeros modulares degradables para administrar miARN para la supresión del crecimiento del tumor (Nguyen et al., 2014). (FIG. 13A) Esquema que muestra el modelo de ratón transgénico LAP-tTa; TRE-MYC. TRE-MYC es activado o desactivado por el promotor LAP específico del hígado cuando está presente con el transgén LAP-tTA en ausencia o presencia de doxiciclina (Dox). (FIG. 13B) Sin ningún tratamiento, los tumores hepáticos son visibles alrededor de p20-26, luego el hígado está lleno de pequeños tumores hacia p32, y finalmente los tumores crecen y el tamaño del hígado aumenta dramáticamente en p42 a p60.
Las FIGS. 14A-14C muestran imágenes de fluorescencia que confirman la administración de ARNip en las células tumorales dentro del hígado. (FIG. 14A) Anatomía macroscópica e imágenes de fluorescencia de ratones transgénicos portadores de tumores hepáticos agresivos a la edad de 41 días. Las imágenes de fluorescencia muestran que las nanopartículas 5A2-SC8 formuladas con ARNsi marcado con Cy5.5 median la acumulación masiva de ARNsi en todo el hígado canceroso, con una acumulación menor en el bazo y los riñones 24 horas después de la inyección i.v. de 1 mg de Cy5.5-ARNsi/kg. Para confirmar aún más si las NPs 5A2-SC8 pueden suministrar ARNip in vivo en las células tumorales, se recogieron tejidos tumorales del hígado, se incrustaron en OTC y se seccionaron para tinción H&E e imágenes confocales 24 horas después de la inyección i.v. (FIG. 14B) La tinción de H&E confirma que los hígados contienen tumores. Los mismos cortes de tejidos tumorales se escanearon utilizando imágenes confocales y se capturaron bajo tres canales: DAPI para los núcleos (azul), FITC para la actina teñida de faloidina (verde) y Cy5.5 para el ARNip (rojo).
(FIG. 14C) La imagen confocal de la misma región muestra que el 5A2-SC8 puede administrar eficazmente el ARNip en las células tumorales dentro del hígado.
Las FIGS. 15A y 15B muestran en(FIG. 15A) la biodistribución en ratones normales de tipo salvaje y ratones portadores de tumores hepáticos de las NPs 5A2-SC8 formuladas con ARNsi marcado con Cy5.5 y(FIG. 15B) Imágenes de tinción H&E de hígados de ratones portadores de tumores. Las NPs5A2-SC8 median la acumulación de ARNip marcado con Cy5.5 en todo el hígado de ratones normales y ratones con tumores hepáticos 24 horas después de la inyección i.v. de 1 mg de ARNip/kg. Las imágenes de tinción H&E muestran que los hígados de los ratones portadores de tumores están llenos de ellos y que el mismos cortes utilizado para las imágenes confocales contiene células tumorales. Obsérvese que el tamaño del hígado aumenta a medida que los tumores crecen (véanse los recuadros proporcionalmente iguales en la FIG. 15A).
Las FIGS. 16A-16H muestran que los dendrímeros modulares degradables pueden suministrar un imitador terapéuticod de miARN de Let-7g a un modelo de tumor genético agresivo y clínicamente relevante, impulsado por MYC, lo que da como resultado un beneficio de supervivencia significativo. (FIG. 16A) Las NPs 5A2-SC8 permiten el silenciamiento de la proteína FVII en ratones transgénicos portadores de tumores de hígado impulsados por MYC, según las mediciones en sangre y (FIG. 16B) en tejidos hepáticos recogidos (inyección única, 1 mg/kg, ratones p26, 48 horas después de la inyección) (siCTR a la izquierda y siFVII a la derecha). (FIG. 16C) Las NPs 5A2-SC8 permiten la administración de Let-7g en los tejidos hepáticos de ratones transgénicos portadores de tumores hepáticos impulsados por MYC(inyección única, 1 mg/kg, ratones p26, 48 horas después de la inyección). La expresión deLet-7g aumentó significativamente, mientras que otros miembros de la familia Let-7 no se vieron afectados (siCTR a la izquierda y siFVII a la derecha).
(FIG. 16D) Los ratones transgénicos portadores de tumores hepáticos impulsados por MYC recibieron inyecciones i.v. semanales de 1 mg/kg de Let-7g, comenzando el día 26 (que es después del inicio del desarrollo del tumor) hasta el día 61. Los ratones que recibieron Let-7g tenían el abdomen visiblemente más pequeño. (FIG. 16E) La circunferencia abdominal era menor en los ratones tratados en comparación con los controles. (FIG. 16F) Las imágenes representativas de los hígados de los ratones inyectados con imitador Let-7g e imitador de control muestran una carga tumoral reducida. (FIG. 16G) La administración semanal de mimicos de miARN dentro de NPs 5A2-SC8 no afectó al aumento de peso normal, mientras que la administración de mimicos de miARN dentro de LNPs C12-200 causó pérdida de peso y muerte. n=5. (FIG.
16H) La administración de Let-7g semanalmente de 26 a 61 días prolongó la supervivencia. Todos los ratones de control que no recibieron ningún tratamiento (n=9) y los ratones que recibieron NPs 5A2-SC8 (n=5) que contenían un imitador de control no dirigido murieron alrededor de 60 días después del nacimiento. Los ratones inyectados con LNP C12-200 murieron prematuramente (n=7). Los experimentos de imitación de C12-200 CTR se interrumpieron porque todos los ratones que recibieron las inyecciones de imitación de C12-200 Let-7g habían muerto (n=7). La administración de Let-7g dentro de las NPs 5A2-SC8 proporcionó un pronunciado beneficio de supervivencia. Los datos se muestran como media ± d.s. Análisis estadístico realizado con (a,b,c,e) prueba tde Student de dos colas, o (h) prueba de Mantel-Cox; n.s. P > 0,05; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ****P < 0,0001.
Las FIGS. 17A-17C muestran la administración de siLuc utilizando nanopartículas de dendrímero formuladas con diferentes combinaciones de colesterol, fosfolípidos y lípidos PEG en HeLa-Luc(FIG. 17A), A549-Luc(FIG. 17B), y MDA-MB231-Luc(FIG. 17C).
Las FIGS. 18A y 18B muestran (FIG. 18A) la comparación de la formulación de diferente composición con lípidos DSPC frente a lípidos DOPE con PEG-DMG en la administración de siLuc a HeLa-Luc. La FIG. 18B muestra la comparación de la formulación de diferente composición con lípidos DSPC frente a lípidos DOPE con PEG-DHD en la administración de siLuc a HeLa-Luc.
La FIG. 19 muestra la administración de un ARNsg utilizando una composición de nanopartículas que contiene un dendrímero o Z120 y con y sin el fosfolípido DSPC en la formulación de las nanopartículas.
FIGS. 20A y 20B muestran el porcentaje de encapsulación del ARNsg(FIG. 20A) y la administración en células HeLa-Luc-Cas9(FIG. 20B).
Las FIGS.21A y 21B muestran la viabilidad de las células IGROV a las que se les ha administrado el ARNm Luc tras 24 horas de incubación (FIG. 21A) y 48 horas de incubación(FIG. 21B).
FIG. 22 muestra la microscopía de fluorescencia de las células después del tratamiento con ARNm de mCherry que muestra la administración del ARNm a esas células.
DESCRIPCIÓN DE LAS REALIZACIONES ILUSTRATIVAS
En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona dendrímeros lipocatiónicos que pueden utilizarse como portadores de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, los dendrímeros contienen uno o más grupos que sufren degradación en condiciones fisiológicas. En algunas realizaciones, los dendrímeros se formulan en composiciones que comprenden los dendrímeros y uno o más ácidos nucleicos. Estas composiciones pueden comprender además uno o más lípidos auxiliares como el colesterol y/o un fosfolípido. Finalmente, en algunos aspectos, la presente divulgación también describe procedimientos para tratar una o más enfermedades que pueden ser tratadas con un ácido nucleico terapéutico utilizando las composiciones de dendrímeros.
A. DEFINICIONES QUÍMICAS
Cuando se utiliza en el contexto de un grupo químico: "hidrógeno" significa -H; "hidroxi" significa -OH; "oxo" significa =O; "carbonilo" significa -C(=O)-; "carboxi" significa -C(=O)OH (también escrito como -COOH o -CO2H); "halo" significa independientemente -F, -Cl, -Br o -I; "amino" significa -NH2; "hidroxiamino" significa -NHOH; "nitro" significa -NO2 ; imino significa =NH; "ciano" significa -CN; "isocianato" significa -N=C=O; "azido" significa -N3 ; en un contexto monovalente "fosfato" significa -OP(O)(OH)2 o una forma desprotonada del mismo; en un contexto divalente "fosfato" significa -OP(O)(OH)O- o una forma desprotonada del mismo; "mercapto" significa -SH; y "tio" significa =S; "sulfonilo" significa -S(O)2-; "hidroxisulfonilo" significa -S(O)2OH; "sulfonamida" significa -S(O)2NH2 ; y "sulfinilo" significa -S(O)-.
En el contexto de las fórmulas químicas, el símbolo "-" significa un enlace simple, "=" significa un enlace doble y "=" significa un enlace triple. El símbolo "— " representa un enlace opcional, que si está presente es simple o doble. El símbolo M====" representa un enlace simple o un enlace doble. Así, por ejemplo, la fórmula
Figure imgf000022_0001
incluye
y
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Y se entiende que ningún átomo de anillo de este tipo forma parte de más de un doble enlace. Además, se observa que el símbolo de enlace covalente al conectar uno o dos átomos estereogénicos, no indica ninguna estereoquímica preferida. En cambio, abarca todos los estereoisómeros, así como sus mezclas. El símbolo cuando se dibuja perpendicularmente a través de un enlace (por ejemplo,
Figure imgf000022_0003
para el metilo) indica un punto de unión del grupo. Cabe señalar que el punto de unión sólo se suele identificar de esta manera para los grupos más grandes con el fin de ayudar al lector a identificar inequívocamente un punto de unión. El s í m b o l o s i g n i f i c a un enlace simple donde el grupo unido al extremo grueso de la cuña está "fuera de la página" El símbolo......" significa un enlace simple en la que el grupo unido al extremo grueso de la cuña está "dentro de la página". El símbolo " 'A A A " s¡gn¡f¡ca un enlace simple en la que la geometría alrededor de un doble enlace (por ejemplo, E o Z) no está definida. Por lo tanto, están previstas ambas opciones, así como sus combinaciones. Cualquier valencia indefinida en un átomo de una estructura mostrada en esta aplicación representa implícitamente un átomo de hidrógeno unido a ese átomo. Un punto en negrita sobre un átomo de carbono indica que el hidrógeno unido a ese carbono está orientado fuera del plano del papel.
Cuando un grupo "R" se representa como un "grupo flotante" en un sistema de anillos, por ejemplo, en la fórmula
Figure imgf000022_0004
entonces R puede sustituir a cualquier átomo de hidrógeno unido a cualquiera de los átomos del anillo, incluyendo un hidrógeno representado, implícito o expresamente definido, siempre que se forme una estructura estable. Cuando un grupo "R" se representa como un "grupo flotante" en un sistema de anillos fusionados, como por ejemplo en la fórmula:
Figure imgf000022_0005
entonces R puede sustituir a cualquier hidrógeno unido a cualquiera de los átomos del anillo de cualquiera de los anillos fusionados, a menos que se especifique lo contrario. Los hidrógenos reemplazables incluyen los hidrógenos representados (por ejemplo, el hidrógeno unido al nitrógeno en la fórmula anterior), los hidrógenos implícitos (por ejemplo, un hidrógeno de la fórmula anterior que no se muestra pero que se entiende que está presente), los hidrógenos definidos expresamente y los hidrógenos opcionales cuya presencia depende de la identidad de un átomo del anillo (por ejemplo, un hidrógeno unido al grupo X, cuando X es igual a -CH-), siempre que se forme una estructura estable. En el ejemplo representado, R puede residir en el anillo de 5 o 6 miembros del sistema de anillos fusionados. En la fórmula anterior, la letra de subíndice "y" que sigue inmediatamente al grupo "R" encerrado entre paréntesis, representa una variable numérica. A menos que se especifique lo contrario, esta variable puede ser 0, 1,2 o cualquier número entero mayor que 2, sólo limitado por el número máximo de átomos de hidrógeno reemplazables del anillo o sistema de anillos.
Para los grupos químicos y las clases de compuestos, el número de átomos de carbono en el grupo o la clase es el indicado a continuación: "Cn" define el número exacto (n) de átomos de carbono en el grupo/clase. "C<n" define el número máximo (n) de átomos de carbono que puede haber en el grupo/clase, siendo el número mínimo el más pequeño posible para el grupo/clase en cuestión, por ejemplo, se entiende que el número mínimo de átomos de carbono en el grupo "alquenilo(c<8)" o la clase "alqueno(c<8)" es dos. Compárese con "alcoxi(c<io)", que designa a los grupos alcoxi que tienen de 1 a 10 átomos de carbono. "Cn-n'" define tanto el número mínimo (n) como el máximo (n') de átomos de carbono en el grupo. Así, "alquilo(C2-10)" designa aquellos grupos alquilo que tienen de 2 a 10 átomos de carbono. Estos indicadores del número de carbono pueden preceder o seguir a los grupos químicos o a la clase que modifica y pueden ir o no entre paréntesis, sin que ello signifique un cambio de significado. Así, los términos "olefina C5", "olefina C5", "olefina(C5)" y "olefinaC5" son todos sinónimos.
El término "saturado" cuando se utiliza para modificar un compuesto o grupo químico significa que el compuesto o grupo químico no tiene dobles enlaces carbono-carbono ni triples enlaces carbono-carbono, excepto como se indica a continuación. Cuando el término se utiliza para modificar un átomo, significa que éste no forma parte de ningún enlace doble o triple. En el caso de las versiones sustituidas de los grupos saturados, pueden estar presentes uno o más dobles enlaces carbono-oxígeno o un doble enlace carbono-nitrógeno. Y cuando dicho enlace está presente, no se excluyen los dobles enlaces carbono-carbono que pueden ocurrir como parte del tautomerismo del cetoenol o del tautomerismo de la imina/enamina. Cuando el término "saturado" se utiliza para modificar una solución de una sustancia, significa que no se puede disolver más de esa sustancia en esa solución.
El término "alifático" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" significa que el compuesto o grupo químico así modificado es un compuesto o grupo de hidrocarburo acíclico o cíclico, pero no aromático. En los compuestos/grupos alifáticos, los átomos de carbono pueden unirse en cadenas rectas, cadenas ramificadas o anillos no aromáticos (alicíclicos). Los compuestos/grupos alifáticos pueden ser saturados, es decir, unidos por enlaces simples carbonocarbono (alcanos/alquilo), o insaturados, con uno o más enlaces dobles carbono-carbono (alquenos/alquenilo) o con uno o más enlaces triples carbono-carbono (alquinos/alquinilo).
El término "aromático", cuando se utiliza para modificar un compuesto o un átomo de un grupo químico, significa que el compuesto o el grupo químico contiene un anillo insaturado planar de átomos que está estabilizado por una interacción de los enlaces que forman el anillo.
El término "alquilo", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere a un grupo alifático saturado monovalente con un átomo de carbono como punto de unión, una estructura acíclica lineal o ramificada, y ningún átomo distinto del carbono y el hidrógeno. Los grupos -CH3 (Me), -CH2CH3 (Et), -CH2CH2CH3 (n-Pr o propilo), -Ch (CH3) 2 (i-Pr, 'Pr o isopropilo), -CH2CH2CH2CH3(n-Bu), -CH(CH3)CH2CH3 (sec-butilo), -CH2CH(CH3) 2 (isobutilo), -C(CH3) 3 (terc-butilo, t-butilo, t-Buo Bu), y -CH2C(CH3)3 (neo-pentilo) son ejemplos no limitativos de grupos alquilo. El término "alcanodiilo", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere a un grupo alifático saturado divalente, con uno o dos átomos de carbono saturados como punto(s) de unión, una estructura acíclica lineal o ramificada, sin dobles o triples enlaces carbono-carbono y sin átomos distintos del carbono y el hidrógeno. Los grupos -CH2-(metileno), -CH2CH2-, -CH2C(CH3)2CH2-, y -CH2CH2CH2- son ejemplos no limitantes de grupos alcanodiilo. Un "alcano" se refiere a la clase de compuestos que tienen la fórmula H-R, en la que R es alquilo, tal como se define este término anteriormente. Cuando cualquiera de estos términos se utiliza con el modificador "sustituido" uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2 , -NO2 -CO2H, -CO2CH3 , -CN, -SH, -OCH3 , -OCH2CH3 , -C(O)CH3, -NHCH3 , -NHCH2CH3 , -N(CH3)2, -C(O)NH2 , -C(O)NHCH3, -C(O)N(CH3)2, -OC(O)CH3, -NHC(O)CH3, -S(O)2OH, o -S(O)2NH2. Los siguientes grupos son ejemplos no limitantes de grupos alquilos sustituidos: -CH2OH, -CH2Cl, -CF3, -CH2CN, -CH2C(O)OH, -CH2C(O)OCH3, -CH2C(O)NH2, -CH2C(O)CH3, -CH2OCH3, -CH2OC(O)CH3, -CH2NH2 , -CH2N(CH3)2, y -CH2CH2CL El término "haloalquilo" es un subconjunto del alquilo sustituido, en la que la sustitución del átomo de hidrógeno se limita al halo(es decir, -F, -Cl, -Br o -I), de manera que no hay otros átomos aparte del carbono, el hidrógeno y el halógeno. El grupo -CH2Cl es un ejemplo no limitante de haloalquilo. El término "fluoroalquilo" es un subconjunto del alquilo sustituido, en la que la sustitución del átomo de hidrógeno se limita al flúor, de manera que no hay otros átomos aparte del carbono, el hidrógeno y el flúor. Los grupos -CH2F, -CF3 y -CH2CF3 son ejemplos no limitantes de grupos fluoroalquilos.
El término "cicloalquilo", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere a un grupo alifático saturado monovalente con un átomo de carbono como punto de unión, dicho átomo de carbono formando parte de una o más estructuras de anillo no aromáticas, sin dobles o triples enlaces carbono-carbono, y sin átomos distintos del carbono y el hidrógeno. Algunos ejemplos no limitantes son: -CH(CH2)2 (ciclopropilo), ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo (Cy). El término "cicloalcanediilo", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere a un grupo alifático saturado divalente con dos átomos de carbono como puntos de unión, sin dobles o triples enlaces carbono-carbono y sin átomos distintos del carbono y el hidrógeno. El grupo
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es un ejemplo no limitante de grupo cicloalcanodiilo. Un "cicloalcano" se refiere a la clase de compuestos que tienen la fórmula H-R, en la que R es un cicloalquilo tal y como se define este término anteriormente. Cuando cualquiera de estos términos se utiliza con el modificador "sustituido" uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2 , -NO2 -CO2H, -CO2CH3 , -CN, -SH, -OCH3 , -OCH2CH3 , -C(O)CH3, -NHCH3 , -NHCH2CH3 , -N(CH3 )2 , -C(O)NH2 , -C(O)NHCH3 , -C(O)N(CH3 )2 , -OC(O)CH3 , -NHC(O)CH3 , -S(O)2OH, o -S(O)2NH2.
El término "alquenilo", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere a un grupo alifático monovalente insaturado con un átomo de carbono como punto de unión, una estructura acíclica lineal o ramificada, al menos un doble enlace carbono-carbono no aromático, sin triples enlaces carbono-carbono, y sin átomos distintos del carbono y el hidrógeno. Algunos ejemplos no limitantes son: -CH=CH2 (vinilo), -CH=CHCH3, -CH=CH2CH3, -CH2CH=CH2 (alilo), -CH2CH=CH3, y -CH=CHCH=CH2. El término "alquenodiilo", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere a un grupo alifático insaturado divalente, con dos átomos de carbono como puntos de unión, una estructura lineal o ramificada, una estructura acíclica lineal o ramificada, al menos un doble enlace carbono-carbono no aromático, sin triples enlaces carbono-carbono y sin otros átomos que no sean carbono e hidrógeno. Los grupos -CH=CH-, -CH=C(CH3)CH2-, -CH=CH2-, y -CH2CH=CHCH2- son ejemplos no limitativos de grupos alquenodiilo. Cabe señalar que, si bien el grupo alquenodiilo es alifático, una vez conectado en ambos extremos, no se impide que este grupo forme parte de una estructura aromática. Los términos "alqueno" y "olefina" son sinónimos y se refieren a la clase de compuestos que tienen la fórmula H-R, en la que R es alquenilo tal y como se define este término anteriormente. Del mismo modo, los términos "alqueno terminal" y "a-olefina" son sinónimos y se refieren a un alqueno con un solo doble enlace carbono-carbono, en la que dicho enlace forma parte de un grupo vinilo en un extremo de la molécula. Cuando cualquiera de estos términos se utiliza con el modificador "sustituido" uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2 , -NO2 -CO2 H, -CO2CH3 , -CN, -SH, -OCH3 , -OCH2CH3 , -C(O)CH3, -NHCH3 , -NHCH2CH3 , -N(CH3)2, -C(O)NH2 , -C(O)NHCH3, -C(O)N(CH3)2, -OC(O)CH3, -NHC(O)CH3, -S(O)2OH, o -S(O)2 NH2. Los grupos -CH=CHF, -CH=CHCl y -CH=CHBr son ejemplos no limitativos de grupos alquenilo sustituidos.
El término "alquinilo", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere a un grupo alifático monovalente insaturado con un átomo de carbono como punto de unión, una estructura acíclica lineal o ramificada, al menos un triple enlace carbono-carbono y ningún átomo distinto del carbono y el hidrógeno. Tal y como se utiliza aquí, el término alquinilo no excluye la presencia de uno o más dobles enlaces carbono-carbono no aromáticos. Los grupos -C=CH, -C=CCH3 , y -CH2CECCH3 son ejemplos no limitantes de grupos alquilos. Un "alquino" se refiere a la clase de compuestos que tienen la fórmula H-R, en la que R es un alquino. Cuando cualquiera de estos términos se utiliza con el modificador "sustituido" uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2 , -NO2 -CO2H, -CO2CH3 , -CN, -SH, -OCH3 , -OCH2CH3 , -C(O)CH3, -NHCH3 , -NHCH2CH3 , -N(CH3)2, -C(O)NH2 , -C(O)NHCH3, -C(O)N(CH3)2, -OC(O)CH3, -NHC(O)CH3, -S(O)2OH, o -S(O)2NH2.
El término "arilo", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere a un grupo aromático monovalente insaturado con un átomo de carbono aromático como punto de unión, formando dicho átomo de carbono parte de una o más estructuras de anillo aromático de seis miembros, en la que los átomos del anillo son todos de carbono, y en la que el grupo no consta de más átomos que el carbono y el hidrógeno. Si hay más de un anillo, los anillos pueden estar fusionados o no. Tal como se utiliza aquí, el término no excluye la presencia de uno o más grupos alquilo o aralquilo (si la limitación del número de carbonos lo permite) unidos al primer anillo aromático o a cualquier otro anillo aromático presente. Ejemplos no limitantes de grupos arilo incluyen el fenilo (Ph), el metilfenilo, el (dimetil)fenilo, el - C6H4CH2CH3 (etilfenilo), el naftilo y un grupo monovalente derivado del bifenilo. El término "arenodiilo", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere a un grupo aromático divalente con dos átomos de carbono aromáticos como puntos de unión, formando dichos átomos de carbono parte de una o más estructuras de anillos aromáticos de seis miembros en los que los átomos del anillo son todos de carbono, y en los que el grupo monovalente no consta de más átomos que el carbono y el hidrógeno. Tal y como se utiliza aquí, el término no excluye la presencia de uno o más grupos alquilo, arilo o aralquilo (si la limitación del número de carbonos lo permite) unidos al primer anillo aromático o a cualquier otro anillo aromático presente. Si hay más de un anillo, los anillos pueden estar fusionados o no. Los anillos no fusionados pueden estar conectados a través de uno o más de los siguientes: un enlace covalente, grupos alcanodiilo o alquenodiilo (si la limitación del número de carbonos lo permite). Ejemplos no limitantes de grupos arenodiilo incluyen:
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Un "areno" se refiere a la clase de compuestos que tienen la fórmula H-R, en la que R es arilo tal y como se ha definido anteriormente. El benceno y el tolueno son ejemplos no limitativos de arenos. Cuando cualquiera de estos términos se utiliza con el modificador "sustituido" uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2 , -NO2 -CO2H, -CO2CH3 , -CN, -SH, -OCH3 , -OCH2CH3 , -C(O)CH3, -NHCH3 , -NHCH2CH3 , -N(CH3)2, -C(O)NH2 , -C(O)NHCH3, -C(O)N(CH3)2, -OC(O)CH3, -NHC(O)CH3, -S(O)2OH, o -S(O)2NH2.
El término "aralquilo", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere al grupo monovalente -alcanediiloarilo, en la que los términos alcanediilo y arilo se utilizan cada uno de manera coherente con las definiciones proporcionadas anteriormente. Ejemplos no limitantes son: el fenilmetilo (bencilo, Bn) y el 2-fenil-etilo. Cuando el término aralquilo se utiliza con el modificador "sustituido", uno o más átomos de hidrógeno del alquenodiilo y/o del grupo arilo han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2 , -NO2 , -CO2H, -CO2CH3 , -CN, -SH, -OCH3 , -OCH2CH3 , -C(O)CH3, -NHCH3 , -NHCH2CH3 , -N(CH3)2, -C(O)NH2 , -C(O)NHCH3, -C(O)N(CH3)2, -OC(O)CH3, -NHC(O)CH3, -S(O)2OH, o -S(O)2NH2. Ejemplos no limitantes de aralquilos sustituidos son: (3-clorofenil)-metilo, y 2-cloro-2-fenil-et-1-il.
El término "heteroarilo", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere a un grupo aromático monovalente con un átomo de carbono aromático o un átomo de nitrógeno como punto de unión, formando dicho átomo de carbono o átomo de nitrógeno parte de una o más estructuras de anillo aromático en las que al menos uno de los átomos del anillo es nitrógeno, oxígeno o azufre, y en las que el grupo heteroarilo no consta de más átomos que el carbono, el hidrógeno, el nitrógeno aromático, el oxígeno aromático y el azufre aromático. Los anillos heteroarilo pueden contener 1,2, 3 o 4 átomos de anillo seleccionados entre el nitrógeno, el oxígeno y el azufre. Si hay más de un anillo, los anillos pueden estar fusionados o no. Tal como se utiliza aquí, el término no excluye la presencia de uno o más grupos alquilo, arilo y/o aralquilo (si la limitación del número de carbonos lo permite) unidos al anillo aromático o al sistema de anillos aromáticos. Ejemplos no limitantes de grupos heteroarilo incluyen furanilo, imidazolilo, indolilo, indazolilo (Im), isoxazolilo, metilpiridinilo, oxazolilo, fenilpiridinilo, piridinilo (piridilo), pirrolilo, pirimidinilo, pirazinilo, quinolilo, quinazolilo, quinoxalinilo, triazinilo, tetrazolilo, tiazolilo, tienilo y triazolilo. El término "N-heteroarilo" se refiere a un grupo heteroarilo con un átomo de nitrógeno como punto de unión. El término "heteroarenodiilo", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere a un grupo aromático divalente, con dos átomos de carbono aromático, dos átomos de nitrógeno aromático, o un átomo de carbono aromático y un átomo de nitrógeno aromático como los dos puntos de unión, dichos átomos formando parte de una o más estructura(s) anular(es) aromática(s) en la que al menos uno de los átomos del anillo es nitrógeno, oxígeno o azufre, y en la que el grupo divalente no consta de más átomos que el carbono, hidrógeno, nitrógeno aromático, oxígeno aromático y azufre aromático. Si hay más de un anillo, los anillos pueden estar fusionados o no. Los anillos no fusionados pueden estar conectados a través de uno o más de los siguientes: un enlace covalente, grupos alcanodiilo o alquenodiilo (si la limitación del número de carbonos lo permite). Tal como se utiliza aquí, el término no excluye la presencia de uno o más grupos alquilo, arilo y/o aralquilo (si la limitación del número de carbonos lo permite) unidos al anillo aromático o al sistema de anillos aromáticos. Entre los ejemplos no limitantes de grupos heteroarendílicos se incluyen:
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Un "heteroareno" se refiere a la clase de compuestos que tienen la fórmula H-R, donde R es un heteroarilo. La piridina y la quinoleína son ejemplos no limitativos de heteroarenos. Cuando estos términos se utilizan con el modificador "sustituido" uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2 , -NO2, -CO2H -CO2CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(O)CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -C(O)NH2, -C(O)NHCH3 , -C(O)N(CH3 )2 , -OC(O)CH3 , -NHC(O)CH3 , -S(O)2OH, o -S(O)2NH2.
El término "heterocicloalquilo", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere a un grupo monovalente no aromático con un átomo de carbono o un átomo de nitrógeno como punto de unión, formando dicho átomo de carbono o átomo de nitrógeno parte de una o más estructuras de anillo no aromáticas en las que al menos uno de los átomos del anillo es nitrógeno, oxígeno o azufre, y en las que el grupo heterocicloalquilo no consta de más átomos que los de carbono, hidrógeno, nitrógeno, oxígeno y azufre. Los anillos de heterocicloalquilo pueden contener 1, 2, 3 o 4 átomos de anillo seleccionados entre nitrógeno, oxígeno o azufre. Si hay más de un anillo, los anillos pueden estar fusionados o no. Tal y como se utiliza aquí, el término no excluye la presencia de uno o más grupos alquilo (si la limitación del número de carbonos lo permite) unidos al anillo o sistema de anillos. Además, el término no excluye la presencia de uno o más dobles enlaces en el anillo o sistema de anillos, siempre que el grupo resultante siga siendo no aromático. Ejemplos no limitantes de grupos heterocicloalquilo incluyen aziridinilo, azetidinilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidrotiofuranilo, tetrahidropiranilo, piranilo, oxiranilo y oxetanilo. El término "N-heterocicloalquilo" se refiere a un grupo heterocicloalquilo con un átomo de nitrógeno como punto de unión. El N-pirrolidiniloes un ejemplo de dicho grupo. El término "heterocicloalcanodiilo", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere a un grupo cíclico divalente, con dos átomos de carbono, dos átomos de nitrógeno, o un átomo de carbono y un átomo de nitrógeno como los dos puntos de unión, dichos átomos formando parte de una o más estructura(s) de anillo en la que al menos uno de los átomos del anillo es nitrógeno, oxígeno o azufre, y en la que el grupo divalente no consta de más átomos que el carbono, hidrógeno, nitrógeno, oxígeno y azufre. Si hay más de un anillo, los anillos pueden estar fusionados o no. Los anillos no fusionados pueden estar conectados a través de uno o más de los siguientes: un enlace covalente, grupos alcanodiilo o alquenodiilo (si la limitación del número de carbonos lo permite). Tal y como se utiliza aquí, el término no excluye la presencia de uno o más grupos alquilo (si la limitación del número de carbonos lo permite) unidos al anillo o sistema de anillos. Además, el término no excluye la presencia de uno o más dobles enlaces en el anillo o sistema de anillos, siempre que el grupo resultante siga siendo no aromático. Ejemplos no limitantes de grupos heterocicloalcanodiilo incluyen:
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Cuando estos términos se utilizan con el modificador "sustituido" uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2 -NO2 , -CO2H, -CO2CH3 , -CN, -SH, -OCH3 , -OCH2CH3 , -C(O)CH3, -NHCH3 , -NHCH2CH3 , -N(CH3 )2 , -C(O)NH2 , -C(O)NHCH3 , -C(O)N(CH3 )2 , -OC(O)CH3 , -NHC(O)CH3 , -S(O)2OH, o -S(O)2NH2.
El término "acilo", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere al grupo -C(O)R, en la que R es un hidrógeno, un alquilo, un cicloalquilo, un alquenilo, un arilo, un aralquilo o un heteroarilo, tal como se definen estos términos anteriormente. Los grupos -CHO, -C(O)CH3 (acetilo, Ac), -C(O)CH2CH3, -C(O)CH2CH3, -C(O)CH(CH3)2, -C(O)CH(CH2)2 , -C(O)C6H5, -C(O)C6H4CH3, -C(O)CH2C6H5, -C(O)(imidazolilo) son ejemplos no limitativos de grupos acilo. Un "tioacil" se define de manera análoga, salvo que el átomo de oxígeno del grupo -C(O)R se ha sustituido por un átomo de azufre, -C(S)R. El término "aldehído" corresponde a un alcano, como se ha definido anteriormente, en la que al menos uno de los átomos de hidrógeno ha sido sustituido por un grupo -CHO. Cuando cualquiera de estos términos se utiliza con el modificador "sustituido", uno o más átomos de hidrógeno (incluyendo un átomo de hidrógeno directamente unido al átomo de carbono del grupo carbonilo o tiocarbonilo, si lo hay) han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2 , -NO2 , -CO2H, -CO2CH3 , -CN, -SH, -OCH3 , -OCH2CH3 , -C(O)CH3, -NHCH3 , -NHCH2CH3 , -N(CH3 )2 , -C(O)NH2 , -C(O)NHCH3 , -C(O)N(CH3 )2 , -OC(O)CH3 , -NHC(O)CH3 , -S(O)2OH, o -S(O)2NH2. Los grupos -C(O)CH2CF3 , -CO2H (carboxilo), -CO2CH3 (metilcarboxilo), -CO2CH2CH3 , -C(O)NH2 (carbamoil), y -CON(CH3 )2 , son ejemplos no limitantes de grupos acílicos sustituidos.
El término "alcoxi", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere al grupo -OR, en la que R es un alquilo, tal como se ha definido anteriormente. Algunos ejemplos no limitantes son: -OCH3 (metoxi), -OCH2CH3 (etoxi), -OCH2CH2CH3 , -OCH(CH3)2 (isopropoxi), -OC(CH3)3 (terc-butoxi), -OCH(CH2)2 , -O-ciclopentilo y -O-ciclohexilo. Los términos "cicloalcoxi", "alqueniloxi", "alquiniloxi", "ariloxi", "aralcoxi", "heteroariloxi", "heterocicloalcoxi" y "aciloxi", cuando se utilizan sin el modificador "sustituido", se refieren a grupos, definidos como -OR, en los que R es cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heterocicloalquilo y acilo, respectivamente. El término "alcoxidilio" se refiere al grupo divalente -O-alcanediilo-, -O-alcanediilo-O-, o -alcanediilo-O-alcanediilo-. El término "alquiltio" y "aciltio" cuando se utiliza sin el modificador "sustituido" se refiere al grupo -SR, en la que R es un alquilo y un acilo, respectivamente. El término "alcohol" corresponde a un alcano, tal como se ha definido anteriormente, en la que al menos uno de los átomos de hidrógeno ha sido sustituido por un grupo hidroxi. El término "éter" corresponde a un alcano, tal como se ha definido anteriormente, en la que al menos uno de los átomos de hidrógeno ha sido sustituido por un grupo alcoxi. Cuando cualquiera de estos términos se utiliza con el modificador "sustituido" uno o más átomos de hidrógeno han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2 , -NO2 -CO2H, -CO2CH3 , -CN, -SH, -OCH3 , -OCH2CH3 , -C(O)CH3, -NHCH3 , -NHCH2CH3 , -N(CH3)2, -C(O)NH2 , -C(O)NHCH3, -C(O)N(CH3)2, -OC(O)CH3 , -NHC(O)CH3 , -S(O)2OH, o -S(O)2NH2.
El término "alquilamino", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere al grupo -NHR, en la que R es un alquilo, tal como se ha definido anteriormente. Algunos ejemplos no limitantes son: -NHCH3 y -NHCH2CH3. El término "dialquilamino", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere al grupo -NRR', en la que R y R' pueden ser el mismo o diferentes grupos alquilo, o R y R' pueden tomarse juntos para representar un alcanodiilo. Ejemplos no limitantes de grupos dialquilamino incluyen: -N(CH3)2 y -N(CH3)(CH2CH3). Los términos "cicloalquilamino", "alquenilamino", "alquilamino", "arilamino", "aralquilamino", "heteroarilamino", "heterocicloalquilamino", "alcoxiamino" y "alquilsulfonilamino", cuando se utilizan sin el modificador "sustituido", se refiere a los grupos definidos como -NHR, en los que R es cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, heterocicloalquilo, alcoxi y alquilsulfonilo, respectivamente. Un ejemplo no limitante de un grupo arilamino es -NHC6H5. El término "alquilaminodiilo" se refiere al grupo divalente -NH-alcanediilo-, -NH-alcanediilo-NH-, o -alcanediilo-NH-alcanediilo-. El término "amido" (acilamino), cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere al grupo -NHR, en la que R es un acilo, tal como se ha definido anteriormente. Un ejemplo no limitante de un grupo amido es -NHC(O)CH3. El término "alquilimino", cuando se utiliza sin el modificador "sustituido", se refiere al grupo divalente =NR, en la que R es un alquilo, tal como se ha definido anteriormente. Cuando cualquiera de estos términos se utiliza con el modificador "sustituido" uno o más átomos de hidrógeno unidos a un átomo de carbono han sido sustituidos independientemente por -OH, -F, -Cl, -Br, -I -NH2 , -NO2 , -CO2H, -CO2CH3 , -CN, -SH, -OCH3 , -OCH2CH3 , -C(O)CH3, -NHCH3 , -NHCH2CH3 , -N(CH3)2, -C(O)NH2 , -C(O)NHCH3 , -C(O)N(CH3 )2 , -OC(O)CH3 , -NHC(O)CH3 , -S(O)2OH, o -S(O)2NH2. Los grupos -NHC(O)OCH3 y -NHC(O)NHCH3 son ejemplos no limitantes de grupos amido sustituidos.
El uso de la palabra "un" o "uno, una", cuando se utiliza junto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o la especificación puede significar "uno", pero también es coherente con el significado de "uno o más", "al menos uno" y "uno o más de uno"
A lo largo de esta solicitud, el término "aproximadamente" se utiliza para indicar que un valor incluye la variación inherente de error para el dispositivo, el procedimiento que se emplea para determinar el valor, o la variación que existe entre los sujetos del estudio.
Tal como se utiliza en esta solicitud, el término "peso molecular promedio" se refiere a la relación entre el número de moles de cada especie de polímero y la masa molar de dicha especie. En particular, cada molécula de polímero puede tener diferentes niveles de polimerización y, por tanto, una masa molar diferente. El peso molecular promedio puede utilizarse para representar el peso molecular de una pluralidad de moléculas de polímero. El peso molecular promedio suele ser sinónimo de masa molar promedio. En particular, hay tres tipos principales de peso molecular promedio: masa molar promedio en número, masa media en peso (masa) y masa molar promedio en Z. En el contexto de esta solicitud, a menos que se especifique lo contrario, el peso molecular promedio representa la masa molar promedio en número o la masa molar promedio en peso de la fórmula. En algunas realizaciones, el peso molecular promedio es la masa molar promedio. En algunas realizaciones, el peso molecular promedio puede utilizarse para describir un componente de PEG presente en un lípido.
Los términos "comprender", "tener" e "incluir" son verbos de enlace abiertos. Cualquier forma o tiempo de uno o más de estos verbos, como "comprende", "abarca", "tiene", "tiene", "incluye" e "incluye", también son abiertos. Por ejemplo, cualquier procedimiento que "comprenda", "tenga" o "incluya" uno o más pasos no se limita a poseer sólo esos pasos y también abarca otros pasos no enumerados.
El término "eficaz", tal como se utiliza en la especificación y/o las reivindicaciones, significa adecuado para lograr un resultado deseado, esperado o previsto. "Cantidad efectiva", "cantidad terapéuticamente efectiva" o "cantidad farmacéuticamente efectiva", cuando se utilizan en el contexto del tratamiento de un paciente o sujeto con un compuesto, significa aquella cantidad del compuesto que, cuando se administra a un sujeto o paciente para tratar una enfermedad, es suficiente para efectuar dicho tratamiento para la enfermedad.
Tal como se utiliza aquí, el término "IC50" se refiere a una dosis inhibitoria que es el 50 % de la respuesta máxima obtenida. Esta medida cuantitativa indica qué cantidad de un fármaco u otra sustancia (inhibidor) es necesaria para inhibir un proceso biológico, bioquímico o químico determinado (o un componente de un proceso, es decir, una enzima, una célula, un receptor celular o un microorganismo) a la mitad.
Un "isómero" de un primer compuesto es un compuesto separado en la que cada molécula contiene los mismos átomos constituyentes que el primer compuesto, pero en la que la configuración de esos átomos en tres dimensiones difiere.
Tal como se utiliza aquí, el término "paciente" o "sujeto" se refiere a un organismo mamífero vivo, como un ser humano, un mono, una vaca, una oveja, una cabra, un perro, un gato, un ratón, una rata, un conejillo de indias o una especie transgénica del mismo. En ciertas realizaciones, el paciente o sujeto es un primate. Ejemplos no limitativos de sujetos humanos son los adultos, los jóvenes, los bebés y los fetos.
Tal y como se utiliza generalmente en el presente documento, "farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que son, dentro del ámbito del buen juicio médico, adecuados para su uso en contacto con los tejidos, órganos y/o fluidos corporales de los seres humanos y los animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otros problemas o complicaciones acordes con una relación beneficio/riesgo razonable.
Por "sales farmacéuticamente aceptables" se entienden las sales de los compuestos de la presente invención que son farmacéuticamente aceptables, como se ha definido anteriormente, y que poseen la actividad farmacológica deseada. Dichas sales incluyen sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos como el ácido clorhídrico, el ácido bromhídrico, el ácido sulfúrico, el ácido nítrico y el ácido fosfórico; o con ácidos orgánicos como el ácido 1,2-etanodisulfónico, el ácido 2-hidroxietanosulfónico, el ácido 2-naftalenosulfónico, el ácido 3-fenilpropiónico, el ácido 4,4'-metilenbis(3-hidroxi-2-eno-1-carboxílico), el ácido 4-metilbiciclo[2.2.2]oct-2-eno-1-carboxílico, ácido acético, ácidos mono y dicarboxílicos alifáticos, ácidos sulfúricos alifáticos, ácidos sulfúricos aromáticos, ácido bencenosulfónico, ácido benzoico, ácido alcanfor sulfónico, ácido carbónico, ácido cinámico, ácido cítrico, ácido ciclopentanopropiónico, ácido etanosulfónico, ácido fumárico, ácido glucoheptónico, ácido glucónico, ácido glutámico, ácido glicólico, ácido heptanoico, ácido hexanoico, ácido hidroxinaftoico, ácido láctico, ácido laurilsulfúrico, ácido maleico, ácido málico, ácido malónico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido mucónico, ácido o-(4-hidroxibenzoil)benzoico, ácido oxálico, ácido p-clorobencenosulfónico, ácido alcanoico sustituido por fenilo, ácido propiónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido pirúvico, ácido salicílico, ácido esteárico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido terciariobutilacético y ácido trimetilacético. Las sales farmacéuticamente aceptables también incluyen sales de adición de bases que pueden formarse cuando los protones ácidos presentes son capaces de reaccionar con bases inorgánicas u orgánicas. Las bases inorgánicas aceptables son el hidróxido de sodio, el carbonato de sodio, el hidróxido de potasio, el hidróxido de aluminio y el hidróxido de calcio. Las bases orgánicas aceptables incluyen la etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina y N-metilglucamina. Debe reconocerse que el anión o catión particular que forma parte de cualquier sal de esta invención no es crítico, siempre y cuando la sal, en su conjunto, sea farmacológicamente aceptable. Otros ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables y sus procedimientos de preparación y uso se presentan en Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use (P. H. Stahl & C. G. Wermuth eds., Verlag Helvetica Chimica Acta, 2002).
El término "portador farmacéuticamente aceptable", tal como se utiliza aquí, significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, como un relleno líquido o sólido, diluyente, excipiente, disolvente o material de encapsulación, que participa en el transporte de un agente químico.
La "prevención" o "prevenir" incluye: (1) inhibir la aparición de una enfermedad en un sujeto o paciente que puede estar en riesgo y/o predispuesto a la enfermedad pero que todavía no experimenta o muestra alguna o toda la patología o sintomatología de la enfermedad, y/o (2) retrasar la aparición de la patología o sintomatología de una enfermedad en un sujeto o paciente que puede estar en riesgo y/o predispuesto a la enfermedad pero que todavía no experimenta o muestra alguna o toda la patología o sintomatología de la enfermedad.
Una "unidad de repetición" es la entidad estructural más simple de ciertos materiales, por ejemplo, las estructuras y/o los polímeros, ya sean orgánicos, inorgánicos o metal-orgánicos. En el caso de una cadena de polímeros, las unidades de repetición se enlazan sucesivamente a lo largo de la cadena, como las cuentas de un collar. Por ejemplo, en el polietileno, -[-CH2CH2-]n-, la unidad de repetición es -CH2CH2-. El subíndice "n" denota el grado de polimerización, es decir, el número de unidades de repetición enlazadas. Cuando el valor de "n" se deja sin definir o cuando "n" está ausente, simplemente designa la repetición de la fórmula entre los paréntesis, así como la naturaleza polimérica del material. El concepto de unidad de repetición se aplica igualmente a los casos en que la conectividad entre las unidades de repetición se extiende tridimensionalmente, como en las estructuras metal-orgánicas, los polímeros modificados, los polímeros termoestables, etc. En el contexto del dendrímero, la unidad de repetición también puede describirse como unidad de ramificación, capas interiores o generaciones. Del mismo modo, el grupo de terminación también puede describirse como grupo de superficie.
Un "estereoisómero" o "isómero óptico" es un isómero de un compuesto dado en la que los mismos átomos están unidos a los mismos otros átomos, pero en la que la configuración de esos átomos en tres dimensiones difiere. Los "enantiómeros" son estereoisómeros de un determinado compuesto que son imágenes especulares entre sí, como las manos izquierda y derecha. Los "diastereómeros" son estereoisómeros de un determinado compuesto que no son enantiómeros. Las moléculas quirales contienen un centro quiral, también llamado estereocentro o centro estereogénico, que es cualquier punto, aunque no necesariamente un átomo, en una molécula que lleva grupos tales que un intercambio de dos grupos cualesquiera conduce a un estereoisómero. En los compuestos orgánicos, el centro quiral suele ser un átomo de carbono, fósforo o azufre, aunque también es posible que otros átomos sean estereocentros en compuestos orgánicos e inorgánicos. Una molécula puede tener múltiples estereocentros, lo que le confiere muchos estereoisómeros. En los compuestos cuyo estereoisomerismo se debe a centros estereogénicos tetraédricos (por ejemplo, el carbono tetraédrico), el número total de estereoisómeros hipotéticamente posibles no superará 2n, donde n es el número de estereocentros tetraédricos. Las moléculas con simetría suelen tener menos del máximo número posible de estereoisómeros. Una mezcla 50:50 de enantiómeros se denomina mezcla racémica. Alternativamente, una mezcla de enantiómeros puede estar enriquecida enantioméricamente de manera que un enantiómero esté presente en una cantidad superior al 50 %. Normalmente, los enantiómeros y/o diastereómeros pueden resolverse o separarse mediante técnicas conocidas en la técnica. Se contempla que para cualquier estereocentro o eje de quiralidad para el que no se haya definido la estereoquímica, ese estereocentro o eje de quiralidad puede estar presente en su forma R, en su forma S, o como una mezcla de las formas R y S, incluyendo mezclas racémicas y no racémicas. Tal como se utiliza en el presente documento, la frase "sustancialmente libre de otros estereoisómeros" significa que la composición contiene < 15 %, más preferentemente < 10 %, aún más preferentemente < 5 %, o más preferentemente < 1 % de otro(s) estereoisómero(s).
"Tratamiento" o "tratar" incluye (1) inhibir una enfermedad en un sujeto o paciente que experimenta o muestra la patología o sintomatología de la enfermedad (por ejemplo, detener el desarrollo posterior de la patología y/o sintomatología), (2) mejorar una enfermedad en un sujeto o paciente que experimenta o muestra la patología o sintomatología de la enfermedad (por ejemplo, revertir la patología y/o sintomatología), y/o (3) efectuar cualquier disminución medible de una enfermedad en un sujeto o paciente que está experimentando o mostrando la patología o sintomatología de la enfermedad.
B. DENDRÍMEROS Y ESTRUCTURAS DENDRÍTICAS
En algunos aspectos de la presente divulgación, se proporcionan dendrímeros que contienen componentes lipofílicos y catiónicos. Los dendrímeros son un polímero que presenta una ramificación dendrítica regular, formada por la adición secuencial o generacional de capas ramificadas hacia o desde un núcleo y se caracterizan por un núcleo, al menos una capa interior ramificada y una capa superficial ramificada. (Véase Petar R. Dvornic y Donald A. Tomalia en Chem. in Britain, 641-645, agosto de 1994.) En otras realizaciones, el término "dendrímero", tal y como se utiliza aquí, pretende incluir una arquitectura molecular con un núcleo interior, capas interiores (o "generaciones") de unidades repetitivas unidas regularmente a este núcleo iniciador, y una superficie exterior de grupos terminales unidos a la generación más externa. Un "dendrón" es una especie de dendrímero que tiene ramas que emanan de un punto focal que está o puede unirse a un núcleo, ya sea directamente o a través de una fracción de enlace para formar un dendrímero más grande. En algunas realizaciones, las estructuras de dendrímeros tienen grupos de repetición radiados desde un núcleo central que se duplica con cada unidad de repetición para cada rama. En algunas realizaciones, los dendrímeros descritos en el presente documento pueden describirse como una molécula pequeña, moléculas de tamaño medio, lípidos o material similar a los lípidos. Estos términos pueden utilizarse para describir los compuestos aquí descritos que tienen una apariencia de dendrón (por ejemplo, moléculas que irradian desde un único punto focal).
Aunque los dendrímeros son polímeros, los dendrímeros son preferibles a los polímeros tradicionales porque tienen una estructura controlable, un peso molecular único, funcionalidades de superficie numerosas y controlables, y tradicionalmente adoptan una conformación globular después de alcanzar una generación específica. Los dendrímeros pueden prepararse mediante reacciones secuenciales de cada unidad de repetición para producir estructuras poliméricas monodispersas, en forma de árbol y/o de estructura generacional. Los dendrímeros individuales consisten en una molécula de núcleo central, con una cuña dendrítica unida a uno o más sitios funcionales en ese núcleo central. La capa superficial dendrimérica puede tener una variedad de grupos funcionales dispuestos en ella, incluyendo grupos aniónicos, catiónicos, hidrofílicos o lipofílicos, según los monómeros de ensamblaje utilizados durante la preparación.
Modificando los grupos funcionales y/o las propiedades químicas del núcleo, de las unidades repetitivas y de los grupos superficiales o de terminación, se pueden modular sus propiedades físicas. Algunas de las propiedades que pueden variar son la solubilidad, la toxicidad, la inmunogenicidad y la capacidad de bioadhesión. Los dendrímeros suelen describirse por su generación o por el número de unidades de repetición en las ramas. Un dendrímero formado únicamente por la molécula del núcleo se denomina Generación 0, mientras que cada unidad de repetición consecutiva a lo largo de todas las ramas es la Generación 1, la Generación 2, y así sucesivamente hasta el grupo de terminación o de superficie. En algunas realizaciones, son posibles medias generaciones que resultan sólo de la primera reacción de condensación con la amina y no de la segunda reacción de condensación con el tiol
La preparación de dendrímeros requiere un nivel de control sintético que se consigue mediante series de reacciones escalonadas que comprenden la construcción del dendrímero por cada grupo consecutivo. La síntesis de dendrímeros puede ser de tipo convergente o divergente. Durante la síntesis de dendrímeros divergentes, la molécula se ensambla desde el núcleo hasta la periferia en un proceso escalonado que implica la unión de una generación a la anterior y el cambio de grupos funcionales para la siguiente etapa de reacción. La transformación del grupo funcional es necesaria para evitar la polimerización incontrolada. Esta polimerización daría lugar a una molécula muy ramificada que no es monodispersa y que se conoce como polímero hiperramificado. Debido a los efectos estéricos, al seguir reaccionando las unidades de repetición del dendrímero se obtiene una molécula con forma de esfera o globular, hasta que el hacinamiento estérico impide la reacción completa en una generación específica y destruye la monodispersidad de la molécula. Así, en algunas realizaciones, se contemplan específicamente los dendrímeros de la generación G1-G10. En algunas realizaciones, los dendrímeros comprenden 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 unidades de repetición, o cualquier intervalo derivable de las mismas. En algunas realizaciones, los dendrímeros utilizados aquí son G0, G1, G2 o G3. Sin embargo, el número de generaciones posibles (como 11, 12, 13, 14, 15, 20 o 25) puede aumentarse reduciendo las unidades de separación en el polímero ramificado.
Además, los dendrímeros tienen dos entornos químicos principales: el entorno creado por los grupos superficiales específicos en la generación de la terminación y el interior de la estructura dendrítica que, debido a la estructura de orden superior, puede estar protegido del medio a granel y de los grupos superficiales. Debido a estos diferentes entornos químicos, los dendrímeros han encontrado numerosos usos potenciales diferentes, incluso en aplicaciones terapéuticas.
En algunos aspectos, los dendrímeros de la presente divulgación se ensamblan utilizando la reactividad diferencial de los grupos acrilato y metacrilato con aminas y tioles. Los dendrímeros que pueden utilizarse aquí incluyen aminas secundarias o terciarias y tioéteres formados por la reacción de un grupo acrilato con una amina primaria o secundaria y un metacrilato con un grupo mercapto. Además, las unidades de repetición de los dendrímeros aquí descritos pueden contener grupos degradables en condiciones fisiológicas. En algunas realizaciones, estas unidades de repetición pueden contener uno o más grupos germinales diéteres, ésteres, amidas o disulfuros. En algunas realizaciones, la molécula central es una monoamina que permite la polimerización dendrítica en una sola dirección. En otras realizaciones, la molécula del núcleo es una poliamina con múltiples ramas dendríticas diferentes, cada una de las cuales puede comprender una o más unidades de repetición. El dendrímero puede formarse eliminando uno o más átomos de hidrógeno de este núcleo. En algunas realizaciones, estos átomos de hidrógeno están en un heteroátomo, como un átomo de nitrógeno. En algunas realizaciones, el grupo de terminación es un grupo lipofílico como un grupo alquilo o alquenilo de cadena larga. En otras realizaciones, el grupo de terminación es un grupo haloalquilo o haloalquenilo de cadena larga. En otras realizaciones, el grupo de terminación es un grupo alifático o aromático que contiene un grupo ionizable como una amina (-NH2) o un ácido carboxílico (-CO2H). En otras realizaciones, el grupo de terminación es un grupo alifático o aromático que contiene uno o más donantes de enlaces de hidrógeno, como un grupo hidróxido, un grupo amida o un éster.
Los dendrímeros proporcionados por la presente divulgación se muestran, por ejemplo, arriba en la sección de resumen de la invención y en las reivindicaciones que siguen. Pueden realizarse utilizando los procedimientos indicados en la sección de Ejemplos. Estos procedimientos pueden modificarse y optimizarse aún más utilizando los principios y técnicas de la química orgánica aplicados por un experto en la materia. Estos principios y técnicas se enseñan, por ejemplo, en March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure (2007).
Los dendrímeros de la presente divulgación pueden contener uno o más átomos de carbono o nitrógeno asimétricamente sustituidos, y pueden aislarse en forma ópticamente activa o racémica. Por lo tanto, se entienden todas las formas quirales, diastereoméricas, racémicas, epiméricas y todas las formas geométricas isoméricas de una fórmula química, a menos que se indique específicamente la estereoquímica o la forma isomérica. Los dendrímeros pueden presentarse como racematos y mezclas racémicas, enantiómeros simples, mezclas diastereoméricas y diastereómeros individuales. En algunas realizaciones, se obtiene un único diastereómero. Los centros quirales de los dendrímeros de la presente divulgación pueden tener la configuración S o R. Además, se contempla que uno o más de los dendrímeros pueden estar presentes como isómeros constitucionales. En algunas realizaciones, los compuestos tienen la misma fórmula pero diferente conectividad con los átomos de nitrógeno del núcleo. Sin querer ceñirse a ninguna teoría, se cree que tales dendrímeros existen porque los monómeros de partida reaccionan primero con las aminas primarias y luego, estadísticamente, con cualquier amina secundaria presente. Así, los isómeros constitucionales pueden presentar las aminas primarias totalmente reaccionadas y luego una mezcla de aminas secundarias reaccionadas.
Las fórmulas químicas utilizadas para representar los dendrímeros de la presente divulgación típicamente sólo mostrarán uno de posiblemente varios tautómeros diferentes. Por ejemplo, se sabe que muchos tipos de grupos cetónicos existen en equilibrio con los correspondientes grupos enol. Del mismo modo, muchos tipos de grupos imina existen en equilibrio con los grupos enamina. Independientemente de qué tautómero se represente para una fórmula determinada, y de cuál sea el más frecuente, todos los tautómeros de una fórmula química determinada están previstos.
Los dendrímeros de la presente divulgación también pueden tener la ventaja de que pueden ser más eficaces que, ser menos tóxicos que, tener una acción más prolongada que, ser más potentes que, producir menos efectos secundarios que, ser absorbidos más fácilmente que, y/o tener un mejor perfil farmacocinéticopor ejemplo, una mayor biodisponibilidad oral y/o un menor aclaramiento) que, y/o tener otras propiedades farmacológicas, físicas o químicas útiles con respecto a los compuestos conocidos en la técnica anterior, ya sea para su uso en las indicaciones indicadas en el presente documento o de otro modo.
Debe reconocerse que el anión o catión particular que forma parte de cualquier forma de sal de un dendrímero proporcionada en el presente documento no es crítico, siempre que la sal, en su conjunto, sea farmacológicamente aceptable. Otros ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables y sus procedimientos de preparación y uso se presentan en Handbook of Pharmaceutical Salts: Propiedades y uso (2002).
C. LÍPIDOS AUXILIARES
En algunos aspectos de la presente divulgación, uno o más lípidos auxiliares se mezclan con los polímeros de la presente divulgación para crear una composición. En algunas realizaciones, los polímeros se mezclan con 1,2, 3, 4 o 5 tipos diferentes de lípidos auxiliares. Se contempla que los polímeros pueden mezclarse con múltiples lípidos diferentes de un mismo tipo. En algunas realizaciones, el lípido podría ser un esteroide o un derivado esteroide. En otras realizaciones, el lípido es un lípido PEG. En otras realizaciones, el lípido es un fosfolípido. En otras realizaciones, la composición de dendrímeros comprende un esteroide o un derivado esteroide, un lípido PEG y un fosfolípido.
1. Esteroides y derivados de los esferoides
En algunos aspectos de la presente divulgación, los polímeros se mezclan con uno o más esteroides o un derivado de esteroides para crear una composición de dendrímeros. En algunas realizaciones, el esteroide o derivado esteroide comprende cualquier esteroide o derivado esteroide. Tal como se utiliza en este documento, en algunas realizaciones, el término "esteroide" es una clase de compuestos con una estructura cíclica de cuatro anillos de 17 carbonos que puede comprender además una o más sustituciones que incluyen grupos alquilo, grupos alcoxi, grupos hidroxi, grupos oxo, grupos acilo o un doble enlace entre dos o más átomos de carbono. En un aspecto, la estructura de anillo de un esteroide comprende tres anillos de ciclohexilo fusionados y un anillo de ciclopentilo fusionado como se muestra en la fórmula siguiente:
Figure imgf000030_0001
En algunas realizaciones, un derivado esteroide comprende la estructura de anillo anterior con una o más sustituciones no alquílicas. En algunas realizaciones, el esteroide o derivado esteroide es un esterol cuya fórmula se define además como:
Figure imgf000030_0002
En algunas realizaciones de la presente divulgación, el esteroide o el derivado del esteroide es un colestano o un derivado del colestano. En un colestano, la estructura del anillo se define además por la fórmula:
Figure imgf000031_0001
Como se ha descrito anteriormente, un derivado del colestano incluye una o más sustituciones no alquílicas del sistema de anillos anterior. En algunas realizaciones, el colestano o el derivado del colestano es un colesteno o un derivado del colesteno o un esterol o un derivado del esterol. En otras realizaciones, el colestano o el derivado del colestano es tanto un colesterol como un esterol o un derivado del mismo.
En algunas realizaciones, las composiciones pueden comprender además una relación molar entre el esteroide y el dendrímero de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1:20. En algunas realizaciones, la relación molar es de aproximadamente 1:20, 1:18, 1:16, 1:14, 1:12, 1:10, 1:8, 1:6, 1:4, 1:2, 1:1,2:1, 4:1, 6:1,8:1, hasta aproximadamente 10:1 o cualquier intervalo derivable de ello. En algunas realizaciones, la relación molar es de aproximadamente 38:50 o de aproximadamente 1:5.
2. PEG o lípido PEGilado
En algunos aspectos de la presente divulgación, los polímeros se mezclan con uno o más lípidos PEGilados (o lípidos PEG) para crear una composición de dendrímeros. En algunas realizaciones, la presente divulgación comprende el uso de cualquier lípido al que se haya unido un grupo PEG. En algunas realizaciones, el lípido PEG es un diglicérido que también comprende una cadena PEG unida al grupo glicerol. En otras realizaciones, el lípido PEG es un compuesto que contiene uno o más grupos alquilo o alquenilo de cadena larga C6-C24 o un grupo ácido graso C6-C24 unido a un grupo enlazador con una cadena PEG. Algunos ejemplos no limitantes de un lípido PEG incluyen una fosfatidiletanolamina y un ácido fosfatídico modificados con PEG, una ceramida conjugada con PEG, dialquilaminas modificadas con PEG y 1,2-diaciloxipropano-3-aminas modificadas con PEG, diacilgliceroles y dialquilgliceroles modificados con PEG. En algunas realizaciones, la diastearoilfosfatidiletanolamina modificada con PEG o el dimiristoilsn-glicerol modificado con PEG. En algunas realizaciones, la modificación del PEG se mide por el peso molecular del componente PEG del lípido. En algunas realizaciones, la modificación de PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 100 a aproximadamente 15.000. En algunas realizaciones, el peso molecular es de aproximadamente 200 a aproximadamente 500, de aproximadamente 400 a aproximadamente 5.000, de aproximadamente 500 a aproximadamente 3.000, o de aproximadamente 1.200 a aproximadamente 3.000. El peso molecular de la modificación de PEG es de aproximadamente 100, 200, 400, 500, 600, 800, 1.000, 1.250, 1.500, 1.750, 2.000, 2.250, 2.500, 2.750, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 12.500, hasta aproximadamente 15.000. Algunos ejemplos no limitantes de lípidos que pueden utilizarse en la presente invención se enseñan en la Patente estadounidense 5.820.873, WO 2010/141069 o la la patente estadounidense 8.450.298.
En otro aspecto, el lípido PEG tiene la fórmula:
Figure imgf000031_0002
en la que: R12 y R13 son cada uno independientemente alquilo(c<24), alquenilo(c<24), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; Re es hidrógeno, alquilo(c<8), o alquilo(c<8) sustituido; y x es 1-250. En algunas realizaciones, Re es alquilo(c<8) como el metilo. R12 y R13 son cada uno independientemente alquilo(C<4-20). En algunas realizaciones, x es 5-250. En una realización, x es 5-125 o x es 100-250. En algunas realizaciones, el lípido PEG es 1,2-dimiristoil-sn-glicerol, metoxipolietilenglicol.
En otro aspecto, el lípido PEG tiene la fórmula:
donde: ni es un número entero entre 1 y 100 y n2 y n3 se seleccionan cada uno de forma independiente entre un número entero entre 1 y 29. En algunas realizaciones, m es 5, 10, 15, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o 100, o cualquier intervalo derivable del mismo. En algunas realizaciones, m es de aproximadamente 30 a aproximadamente 50. En algunas realizaciones, n2 es de 5 a 23. En algunas realizaciones, n2 es de 11 a aproximadamente 17. En algunas realizaciones, n3 es de 5 a 23. En algunas realizaciones, n3 es de 11 a aproximadamente 17.
En algunas realizaciones, las composiciones pueden comprender además una relación molar del lípido PEG con el dendrímero de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1:250. En algunas realizaciones, la relación molar es de aproximadamente 1:1, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:110, 1:120, 1:125, 1:150, 1:175, 1:200, 1:225, hasta aproximadamente 1:250 o cualquier intervalo derivable de ello. En algunas realizaciones, la relación molar es de aproximadamente 1:25 o de aproximadamente 3:100.
3. Fosfolípidos
En algunos aspectos de la presente divulgación, los polímeros se mezclan con uno o más fosfolípidos para crear una composición de dendrímeros. En algunas realizaciones, cualquier lípido que también comprenda un grupo fosfato. En algunas realizaciones, el fosfolípido es una estructura que contiene uno o dos grupos alquilo o alquenilo de cadena larga C6-C24, un glicerol o una esfingosina, uno o dos grupos fosfato y, opcionalmente, una pequeña molécula orgánica. En algunas realizaciones, la pequeña molécula orgánica es un aminoácido, un azúcar o un grupo alcoxi sustituido por amino, como la colina o la etanolamina. En algunas realizaciones, el fosfolípido es una fosfatidilcolina. En algunas realizaciones, el fosfolípido es distearoilfosfatidilcolina o dioleoilfosfatidiletanolamina.
En algunas realizaciones, las composiciones pueden comprender además una relación molar entre el fosfolípido y el dendrímero de aproximadamente 1:10 a aproximadamente 1:20. En algunas realizaciones, la relación molar es de aproximadamente 1:20, 1:18, 1:16, 1:14, 1:12, 1:10, 1:8, 1:6, 1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 4:1, 6:1, 8:1, hasta aproximadamente 10:1 o cualquier intervalo derivable de ello. En algunas realizaciones, la relación molar es de aproximadamente 38:50 o de aproximadamente 1:5.
D. ÁCIDOS NUCLEICOS Y AGENTES TERAPÉUTICOS BASADOS EN ÁCIDOS NUCLEICOS
1. Ácidos nucleicos
En algunos aspectos de la presente divulgación, las composiciones de dendrímeros comprenden uno o más ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, la composición de dendrímero comprende uno o más ácidos nucleicos presentes en una relación en peso respecto al dendrímero de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 1:100. En algunas realizaciones, la relación en peso entre el ácido nucleico y el dendrímero es de aproximadamente 5:1, 2,5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, o 1:100, o cualquier intervalo derivable. En algunas realizaciones, la relación en peso es de aproximadamente 1:25 o de aproximadamente 1:7. Además, debe quedar claro que la presente divulgación no se limita a los ácidos nucleicos específicos aquí divulgados. Sin embargo, la presente invención no está limitada en su alcance a ninguna fuente, secuencia o tipo de ácido nucleico en particular, ya que una persona con conocimientos ordinarios de la técnica podría identificar fácilmente homólogos relacionados en otras fuentes de ácido nucleico, incluidos los ácidos nucleicos de especies no humanas (por ejemplo, ratón, rata, conejo, perro, mono, gibón, chimpancé, mono, babuino, vaca, cerdo, caballo, oveja, gato y otras especies). Se contempla que el ácido nucleico utilizado en la presente divulgación puede comprender una secuencia basada en una secuencia de origen natural. Teniendo en cuenta la degeneración del código genético, las secuencias que tienen al menos un 50 %, normalmente al menos un 60 %, más normalmente un 70 %, más normalmente un 80 %, preferentemente al menos un 90 % y más preferentemente un 95 % de nucleótidos que son idénticos a la secuencia de nucleótidos de la secuencia natural. En otra realización, el ácido nucleico es una secuencia complementaria a una secuencia natural, o complementaria al 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % y 100 %.
En algunos aspectos, el ácido nucleico es una secuencia que silencia, es complementaria o sustituye a otra secuencia presente in vivo. Las secuencias de 17 bases de longitud sólo deberían aparecer una vez en el genoma humano y, por tanto, son suficientes para especificar una secuencia objetivo única. Aunque los oligómeros más cortos son más fáciles de fabricar y aumentan la accesibilidad in vivo, hay otros muchos factores que intervienen en la determinación de la especificidad de la hibridación. Tanto la afinidad de unión como la especificidad de la secuencia de un oligonucleótido a su objetivo complementario aumentan con el aumento de la longitud. Se contempla que se utilizarán oligonucleótidos ejemplares de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más pares de bases, aunque se contemplan otros. También se contemplan polinucleótidos más largos que codifican 250, 500, 1000, 1212, 1500, 2000, 2500, 3000 o más.
El ácido nucleico utilizado aquí puede derivarse del ADN genómico, es decir, clonado directamente del genoma de un organismo particular. Sin embargo, en las realizaciones preferidas, el ácido nucleico comprendería ADN complementario (ADNc). También se contempla un ADNc más un intrón natural o un intrón derivado de otro gen; estas moléculas diseñadas se denominan a veces "minigenes" Como mínimo, estos y otros ácidos nucleicos de la presente invención pueden utilizarse como estándares de peso molecular en, por ejemplo, la electroforesis en gel.
El término "ADNc" se refiere al ADN preparado utilizando ARN mensajero (ARNm) como plantilla. La ventaja de utilizar un ADNc, frente al ADN genómico o al ADN polimerizado a partir de una plantilla de ARN genómico, no procesado o parcialmente procesado, es que el ADNc contiene principalmente secuencias codificantes de la proteína correspondiente. Puede haber ocasiones en las que se prefiera la secuencia genómica completa o parcial, por ejemplo, cuando las regiones no codificantes son necesarias para una expresión óptima o cuando las regiones no codificantes, como los intrones, deben ser el objetivo de una estrategia antisentido.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico comprende uno o más segmentos antisentido que inhiben la expresión de un gen o producto génico. La metodología antisentido aprovecha el hecho de que los ácidos nucleicos tienden a emparejarse con secuencias "complementarias". Por complementario, se entiende que los polinucleótidos son aquellos que son capaces de emparejarse entre sí según las reglas estándar de complementariedad Watson-Crick. Es decir, las purinas más grandes se emparejarán con las pirimidinas más pequeñas para formar combinaciones de guanina emparejada con citosina (G:C) y adenina emparejada con timina (A:T) en el caso del ADN, o adenina emparejada con uracilo (A:U) en el caso del ARN. La inclusión de bases menos comunes como la inosina, la 5-metilcitosina, la 6-metiladenina, la hipoxantina y otras en las secuencias de hibridación no interfiere con el emparejamiento.
El direccionamiento al ADN de doble cadena (ds) con polinucleótidos conduce a la formación de triple hélice; dirigirse al ARN conducirá a la formación de doble hélice. Los polinucleótidos antisentido, cuando se introducen en una célula diana, se unen específicamente a su polinucleótido diana e interfieren en la transcripción, el procesamiento del ARN, el transporte, la traducción y/o la estabilidad. Los constructos de ARN antisentido, o el ADN que codifica dicho ARN antisentido, pueden emplearse para inhibir la transcripción o la traducción de genes, o ambas, dentro de una célula huésped, ya sea in vitro o in vivo, como en un animal huésped, incluido un sujeto humano.
Los constructos antisentido pueden diseñarse para unirse al promotor y a otras regiones de control, exones, intrones o incluso a los límites exón-intrón de un gen. Se contempla que los constructos antisentido más eficaces incluirán regiones complementarias a las uniones de empalme intrón/exón. Por lo tanto, se propone que una realización preferida incluya un constructo antisentido con complementariedad a regiones dentro de 50-200 bases de una unión de empalme intrón-exón. Se ha observado que algunas secuencias de exones pueden incluirse en el constructo sin afectar seriamente a la selectividad de la diana. La cantidad de material exónico incluido variará en función de las secuencias particulares de exones e intrones utilizadas. Se puede comprobar fácilmente si se incluye demasiado ADN de exón simplemente probando los constructos in vitro para determinar si la función celular normal se ve afectada o si la expresión de los genes relacionados que tienen secuencias complementarias se ve afectada.
Como se ha dicho anteriormente, "complementario" o "antisentido" significa secuencias de polinucleótidos que son sustancialmente complementarias en toda su longitud y que tienen muy pocos desajustes de bases. Por ejemplo, las secuencias de quince bases pueden denominarse complementarias cuando tienen nucleótidos complementarios en trece o catorce posiciones. Naturalmente, las secuencias que son completamente complementarias serán secuencias que son totalmente complementarias en toda su longitud y no tienen desajustes de bases. También se contemplan otras secuencias con menor grado de homología. Por ejemplo, podría diseñarse un constructo antisentido que tenga regiones limitadas de alta homología, pero que también contenga una región no homóloga (por ejemplo, ribozima; véase más adelante). Estas moléculas, a pesar de tener una homología inferior al 50 %, se unirían a las secuencias objetivo en las condiciones adecuadas.
Puede ser ventajoso combinar porciones de ADN genómico con ADNc o secuencias sintéticas para formar un ARNsi o para generar constructos específicos. Por ejemplo, si se desea un intrón en el constructo final, será necesario utilizar un clon genómico. El ADNc, el ARNsi o un polinucleótido sintetizado pueden proporcionar sitios de restricción más convenientes para la parte restante del constructo y, por lo tanto, se utilizarían para el resto de la secuencia. Otras realizaciones incluyen el dsARN o el ssARN, que pueden utilizarse para dirigirse a secuencias genómicas o a transcripciones codificantes/no codificantes.
En otras realizaciones, las composiciones de dendrímeros pueden comprender un ácido nucleico que comprende uno o más vectores de expresión se utilizan en una terapia génica. La expresión requiere que se proporcionen señales apropiadas en los vectores, y que incluyan varios elementos reguladores, como potenciadores/promotores tanto de origen viral como de mamíferos que impulsen la expresión de los genes de interés en las células huésped. También se definen los elementos diseñados para optimizar la estabilidad y la traducibilidad del ARN mensajero en las células huésped. También se proporcionan las condiciones para el uso de una serie de marcadores de selección de fármacos dominantes para establecer clones celulares permanentes y estables que expresen los productos, así como un elemento que vincula la expresión de los marcadores de selección de fármacos con la expresión del polipéptido.
A lo largo de esta solicitud, el término "constructo de expresión" se entiende que incluye cualquier tipo de constructo genético que contenga un ácido nucleico que codifique un producto génico en la que parte o toda la secuencia de codificación del ácido nucleico sea capaz de ser transcrita. El transcrito puede traducirse en una proteína, pero no necesariamente. En ciertas realizaciones, la expresión incluye tanto la transcripción de un gen como la traducción del ARNm en un producto génico. En otras realizaciones, la expresión sólo incluye la transcripción del ácido nucleico que codifica un gen de interés.
El término "vector" se utiliza para referirse a una molécula de ácido nucleico portadora en la que se puede insertar una secuencia de ácido nucleico para introducirla en una célula en la que se puede replicar. Una secuencia de ácido nucleico puede ser "exógena", lo que significa que es ajena a la célula en la que se introduce el vector o que la secuencia es homóloga a una secuencia de la célula pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula huésped en la que la secuencia no se encuentra normalmente. Los vectores incluyen plásmidos, cósmidos, virus (bacteriófagos, virus animales y virus vegetales) y cromosomas artificiales (porejemplo, YAC). Un experto en la materia estaría bien equipado para construir un vector mediante técnicas recombinantes estándar, que se describen en Sambrook et al. (1989) y Ausubel et al. (1994).
El término "vector de expresión" se refiere a un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos parte de un producto génico capaz de ser transcrito. En algunos casos, las moléculas de ARN se traducen en una proteína, un polipéptido o un péptido. En otros casos, estas secuencias no se traducen, por ejemplo, en la producción de moléculas antisentido o ribozimas. Los vectores de expresión pueden contener una variedad de "secuencias de control", que se refieren a las secuencias de ácido nucleico necesarias para la transcripción y posiblemente la traducción de una secuencia codificadora vinculada operativamente en un organismo huésped particular. Además de las secuencias de control que gobiernan la transcripción y la traducción, los vectores y los vectores de expresión pueden contener secuencias de ácido nucleico que cumplen también otras funciones y que se describen infra.
2. ARNip
Como se ha mencionado anteriormente, la presente invención contempla el uso de uno o más ácidos nucleicos inhibidores para reducir la expresión y/o activación de un gen o producto génico. Los ejemplos de un ácido nucleico inhibidor incluyen moléculas dirigidas a una secuencia de ácido nucleico, como un ARNsi (ARN de interferencia pequeño), un ARN de horquilla corta (ARNhc), un ARN de doble cadena, un oligonucleótido antisentido, una ribozima y moléculas dirigidas a un gen o producto génico, como un aptámero.
Un ácido nucleico inhibidor puede inhibir la transcripción de un gen o impedir la traducción del transcrito del gen en una célula. Un ácido nucleico inhibidor puede tener una longitud de 16 a 1000 nucleótidos, y en ciertas realizaciones de 18 a 100 nucleótidos.
Los ácidos nucleicos inhibidores son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el ARNsi, el ARNhc y el ARN de doble cadena se han descrito en Patentes estadounidenses 6.506.559 y 6,573,099 así como en Publicaciones de patentes de EE.UU. 2003/0051263, 2003/0055020, 2004/0265839, 2002/0168707, 2003/0159161y 2004/0064842.
Desde el descubrimiento del ARNi por Fire y sus colegas en 1998, los mecanismos bioquímicos se han caracterizado rápidamente. El ARN de doble cadena (ARNbc) es escindido por Dicer, que es una ribonucleasa de la familia de las ARNasas III. Este proceso produce ARNips de ~21 nucleótidos de longitud. Estos ARNsi se incorporan a un complejo multiproteico de silenciamiento inducido por ARN (RISC) que es guiado hasta el ARNm objetivo. El RISC escinde el ARNm objetivo en la mitad de la región complementaria. En las células de los mamíferos, se encuentran los microARNs (miARNs) relacionados que son fragmentos cortos de ARN (~22 nucleótidos). Los miARNs se generan tras la escisión mediada por Dicer de fragmentos más largos (~70 nucleótidos) con estructuras imperfectas de ARN en horquilla. El miARN se incorpora a un complejo miARN-proteína (miRNP), lo que provoca la represión traslacional del ARNm objetivo.
Al diseñar un ácido nucleico capaz de generar un efecto de ARNi, hay varios factores que deben considerarse, como la naturaleza del ARNsi, la durabilidad del efecto de silenciamiento y la elección del sistema de administración. Para producir un efecto de ARNi, el ARNsi que se introduce en el organismo suele contener secuencias exónicas. Además, el proceso de ARNi depende de la homología, por lo que las secuencias deben seleccionarse cuidadosamente para maximizar la especificidad del gen, al tiempo que se minimiza la posibilidad de interferencias cruzadas entre secuencias homólogas, pero no específicas del gen. En particular, el ARNsi presenta una identidad superior al 80, 85, 90, 95, 98 % o incluso 100 % entre la secuencia del ARNsi y una porción de la secuencia de nucleótidos de EphA. Las secuencias inferiores a un 80 % de identidad con el gen objetivo son sustancialmente menos eficaces. Por lo tanto, cuanto mayor sea la identidad entre el ARNsi y el gen que se va a inhibir, menos probable será que la expresión de los genes no relacionados se vea afectada.
Además, el tamaño del ARNip es una consideración importante. En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a moléculas de ARNsi que incluyen al menos unos 19-25 nucleótidos, y que son capaces de modular la expresión génica. En el contexto de la presente divulgación, el ARNsi es particularmente inferior a 500, 200, 100, 50, 25 o 20 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el ARNsi tiene una longitud de unos 25 nucleótidos a unos 35 nucleótidos o de unos 19 nucleótidos a unos 25 nucleótidos.
Para mejorar la eficacia del silenciamiento génico mediado por ARNsi, se han desarrollado directrices para la selección de los sitios objetivo en el ARNm para el diseño óptimo del ARNsi (Soutschek et al., 2004; Wadhwa et al., 2004). Estas estrategias pueden permitir enfoques racionales para la selección de secuencias de ARNsi con el fin de lograr el máximo derribo de genes. Para facilitar la entrada del ARNsi en las células y los tejidos, se ha utilizado una variedad de vectores que incluyen plásmidos y vectores virales como adenovirus, lentivirus y retrovirus (Wadhwa et al., 2004).
Dentro de un ácido nucleico inhibidor, los componentes de un ácido nucleico no tienen por qué ser del mismo tipo ni homogéneos en su totalidad (por ejemplo, un ácido nucleico inhibidor puede comprender un nucleótido y un ácido nucleico o análogo de nucleótido). Típicamente, un ácido nucleico inhibidor forma una estructura de doble cadena; la estructura de doble cadena puede resultar de dos ácidos nucleicos separados que son parcial o completamente complementarios. En ciertas realizaciones de la presente invención, el ácido nucleico inhibidor puede comprender un solo ácido nucleico (polinucleótido) o un análogo de ácido nucleico y formar una estructura de doble cadena complementándose consigo mismoj'por ejemplo, formando un bucle de horquilla). La estructura de doble cadena del ácido nucleico inhibidor puede comprender 16-500 o más nucleobases contiguas, incluyendo todos los intervalos derivables de las mismas. El ácido nucleico inhibidor puede comprender de 17 a 35 nucleobases contiguas, más particularmente de 18 a 30 nucleobases contiguas, más particularmente de 19 a 25 nucleobases, más particularmente de 20 a 23 nucleobases contiguas, o de 20 a 22 nucleobases contiguas, o 21 nucleobases contiguas que hibridan con un ácido nucleico complementario (que puede ser otra parte del mismo ácido nucleico o un ácido nucleico complementario separado) para formar una estructura de doble cadena.
El ARNsi puede obtenerse de fuentes comerciales o naturales, o puede sintetizarse utilizando cualquiera de las técnicas conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, las fuentes comerciales de ARNip prediseñados incluyen la tecnología Stealth™ Select de Invitrogen (Carlsbad, CA), Ambion® (Austin, TX) y Qiagen® (Valencia, CA). Un ácido nucleico inhibidor que puede aplicarse en las composiciones y procedimientos de la presente invención puede ser cualquier secuencia de ácido nucleico que haya sido encontrada por cualquier fuente como un regulador descendente validado del gen o producto génico.
En algunas realizaciones, la invención presenta una molécula aislada de ARNsi de al menos 19 nucleótidos, que tiene al menos una hebra que es sustancialmente complementaria a al menos diez pero no más de treinta nucleótidos consecutivos de un ácido nucleico que codifica un gen, y que reduce la expresión de un gen o producto génico. En una de las realizaciones de la presente divulgación, la molécula de ARNsi tiene al menos una hebra que es sustancialmente complementaria a al menos diez pero no más de treinta nucleótidos consecutivos del ARNm que codifica un gen o un producto génico.
En una de las realizaciones, la molécula de ARNsi es al menos 75, 80, 85 o 90 % homóloga, particularmente al menos 95 %, 99 % o 100 % similar o idéntica, o cualquier porcentaje entre los anteriores (por ejemplo, la invención contempla 75 % y mayor, 80 % y mayor, 85 % y mayor, y así sucesivamente, y dichos intervalos pretenden incluir todos los números enteros entre ellos), a al menos 10 nucleótidos contiguos de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína terapéutica objetivo.
El ARNsi también puede comprender una alteración de uno o más nucleótidos. Dichas alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, como por ejemplo en los extremos del ARN de 19 a 25 nucleótidos o internamente (en uno o más nucleótidos del ARN). En ciertos aspectos, la molécula de ARN contiene un grupo 3'-hidroxilo. Los nucleótidos en las moléculas de ARN de la presente invención también pueden comprender nucleótidos no estándar, incluyendo nucleótidos no naturales o desoxirribonucleótidos. El oligonucleótido bicatenario puede contener un esqueleto modificado, por ejemplo, fosforotioato, fosforoditioato u otros esqueletos modificados conocidos en la técnica, o puede contener enlaces internucleósidos no naturales. Las modificaciones adicionales de los ARNsi (por ejemplo, ribonucleótidos 2'-O-metilos, ribonucleótidos 2'-desoxi-2'-fluoro, nucleótidos de "base universal", nucleótidos 5-C-metilos, uno o más enlaces internucleotídicos de fosforotioato, y la incorporación de residuos desoxiabásicos invertidos) pueden encontrarse en Publicación estadounidense 2004/0019001 y en Patente estadounidense 6.673.611. En conjunto, todos estos ácidos nucleicos o ARN alterados descritos anteriormente se denominan ARNsi modificados.
En una realización, el ARNsi es capaz de disminuir la expresión de un producto genético particular en al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, o al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, o al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o más o cualquier intervalo entre los anteriores.
3. CRISPR/CAS
Los CRISPRs (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas) son loci de ADN que contienen repeticiones cortas de secuencias de bases. Cada repetición va seguida de segmentos cortos de "ADN espaciador" procedentes de exposiciones anteriores a un virus. Las CRISPR se encuentran en aproximadamente el 40 % de los genomas secuenciados de eubacterias y en el 90 % de los de arqueas secuenciados. Las CRISPR se asocian a menudo con genes cas que codifican proteínas relacionadas con las CRISPR. El sistema CRISPR/Cas es un sistema inmunitario procariota que confiere resistencia a elementos genéticos extraños, como plásmidos y fagos, y proporciona una forma de inmunidad adquirida. Los espaciadores CRISPR reconocen y silencian estos elementos genéticos exógenos como el ARNi en los organismos eucariotas.
Las repeticiones fueron descritas por primera vez en 1987 para la bacteria Escherichia coli. En el año 2000, se identificaron repeticiones agrupadas similares en otras bacterias y arqueas y se denominaron repeticiones cortas interespaciadas con regularidad (SRSR). Los SRSR pasaron a llamarse CRISPR en 2002. Se descubrió que un conjunto de genes, algunos de los cuales codifican proteínas putativas de tipo nucleasa o helicasa, estaban asociados a las repeticiones CRISPR (los cas, o genes asociados a CRISPR ).
En 2005, tres investigadores independientes demostraron que los espaciadores CRISPR mostraban homología con varios ADN de fagos y ADN extracromosómico como los plásmidos. Esto fue un indicio de que el sistema CRISPR/cas podría tener un papel en la inmunidad adaptativa de las bacterias. Koonin y sus colegas propusieron que los espaciadores sirven de plantilla para las moléculas de ARN, de forma análoga a las células eucariotas que utilizan un sistema llamado ARN de interferencia.
En 2007 Barintervalou, Horvath (científicos de la industria alimentaria de Danisco) y otros demostraron que podían alterar la resistencia del Streptococcus thermophilus al ataque de los fagos con ADN espaciador. Doudna y Charpentier habían estado explorando de forma independiente las proteínas asociadas a CRISPR para aprender cómo las bacterias despliegan los espaciadores en sus defensas inmunológicas. Estudiaron conjuntamente un sistema CRISPR más sencillo que se basa en una proteína llamada Cas9. Descubrieron que las bacterias responden a un fago invasor transcribiendo espaciadores y ADN palindrómico en una larga molécula de ARN que luego la célula utiliza el traARNcr y el Cas9 para cortarlo en trozos llamados ARNcrs.
CRISPR demostró por primera vez que funcionaba como herramienta de ingeniería/edición del genoma en cultivos de células humanas en 2012. Desde entonces, se ha utilizado en una amplia gama de organismos, como la levadura de panadería (S. cerevisiae), el pez cebra, los nematodos/C. elegans), las plantas, los ratones y varios otros organismos. Además, CRISPR se ha modificado para crear factores de transcripción programables que permiten a los científicos dirigir y activar o silenciar genes específicos. Actualmente se dispone de bibliotecas de decenas de miles de ARN guía.
La primera prueba de que CRISPR puede revertir los síntomas de una enfermedad en animales vivos se demostró en marzo de 2014, cuando investigadores del MIT curaron a ratones de un raro trastorno hepático. Desde 2012, el sistema CRISPR/Cas se utiliza para la edición de genes (silenciar, potenciar o cambiar genes específicos) que funciona incluso en eucariotas como ratones y primates. Mediante la inserción de un plásmido que contiene genes cas y CRISPRs específicamente diseñados, se puede cortar el genoma de un organismo en cualquier lugar deseado.
Las repeticiones CRISPR tienen un tamaño de 24 a 48 pares de bases. Suelen mostrar cierta simetría diádica, lo que implica la formación de una estructura secundaria como una horquilla, pero no son verdaderamente palindrómicos. Las repeticiones están separadas por espaciadores de longitud similar. Algunas secuencias de espaciadores CRISPR coinciden exactamente con secuencias de plásmidos y fagos, aunque algunos espaciadores coinciden con el genoma del procariota (espaciadores autodirigidos). Se pueden añadir rápidamente nuevos espaciadores en respuesta a la infección por fagos.
Los genes asociados a CRISPR/cas) se asocian a menudo con conjuntos de repeticiones-espaciadores CRISPR. En 2013, se habían descrito más de cuarenta familias diferentes de proteínas Cas. De estas familias de proteínas, Cas1 parece ser ubicua entre los diferentes sistemas CRISPR/Cas. Se han utilizado combinaciones particulares de genes cas y estructuras de repetición para definir 8 subtipos de CRISPR (Ecoli, Ypest, Nmeni, Dvulg, Tneap, Hmari, Apern y Mtube), algunos de los cuales están asociados a un módulo de genes adicional que codifica proteínas misteriosas asociadas a la repetición (RAMPs). En un mismo genoma puede haber más de un subtipo de CRISPR. La distribución esporádica de los subtipos de CRISPR/Cas sugiere que el sistema está sujeto a la transferencia horizontal de genes durante la evolución microbiana.
El ADN exógeno es aparentemente procesado por proteínas codificadas por los genes Cas en pequeños elementos (~30 pares de bases de longitud), que luego se insertan de alguna manera en el locus CRISPR cerca de la secuencia líder. Los ARN de los loci CRISPR se expresan de forma constitutiva y son procesados por las proteínas Cas hasta convertirse en pequeños ARN compuestos por elementos secuenciales individuales de origen exógeno con una secuencia de repetición flanqueante. Los ARN guían a otras proteínas Cas para silenciar elementos genéticos exógenos a nivel de ARN o a Dn . Las pruebas sugieren una diversidad funcional entre los subtipos de CRISPR. Las proteínas Cse (Cas subtipo Ecoli) (llamadas CasA-E en E. coli) forman un complejo funcional, Cascade, que procesa los transcritos de ARN CRISPR en unidades de repetición de espaciadores que Cascade retiene. En otros procariotas, Cas6 procesa los transcritos CRISPR. Curiosamente, la inactivación de fagos basada en CRISPR en E. coli requiere Cascade y Cas3, pero no Cas1 y Cas2. Las proteínas Cmr (módulo Cas RAMP) que se encuentran en Pyrococcus furiosus y otros procariotas forman un complejo funcional con pequeños ARN CRISPR que reconoce y escinde los ARN diana complementarios. Las enzimas CRISPR guiadas por ARN se clasifican como enzimas de restricción de tipo V.
Véase también Publicación de la patente estadounidense 2014/0068797.
i. Cas9
Cas9 es una nucleasa, una enzima especializada en cortar el ADN, con dos sitios de corte activos, uno para cada hebra de la doble hélice. Se ha demostrado que se puede inhabilitar uno o ambos sitios preservando la capacidad de Cas9 para localizar su ADN objetivo. Jinek combinó el traARNcr y el ARN espaciador en una molécula de "ARN de guía única" que, mezclada con Cas9, podía encontrar y cortar las dianas de ADN correctas. Jinek et al . propusieron que estos a Rn guía sintéticos podrían utilizarse para la edición de genes.
Las proteínas Cas9 están altamente enriquecidas en bacterias patógenas y comensales. La regulación génica mediada por CRISPR/Cas puede contribuir a la regulación de los genes bacterianos endógenos, especialmente durante la interacción bacteriana con huéspedes eucariotas. Por ejemplo, la proteína Cas Cas9 de Francisella novicida utiliza un pequeño y único ARN asociado a CRISPR/Cas (scaARN) para reprimir un transcrito endógeno que codifica una lipoproteína bacteriana que es fundamental para que F. novicida amortigüe la respuesta del huésped y promueva la virulencia.
ii. ARNg o ARNsg
Como proteína guiada por ARN, Cas9 requiere un ARN corto para dirigir el reconocimiento de las dianas de ADN (Mali et al., 2013a). Aunque Cas9 interroga preferentemente a las secuencias de ADN que contienen una secuencia PAM NGG puede unirse aquí sin un objetivo protospacer. Sin embargo, el complejo Cas9-ARNg requiere una estrecha coincidencia con el ARNg para crear una rotura de doble cadena (Cho et al., 2013; Hsu et al., 2013). Las secuencias CRISPR en las bacterias se expresan en múltiples ARN y luego se procesan para crear cadenas guía de ARN (Bikard et al., 2013). Dado que los sistemas eucariotas carecen de algunas de las proteínas necesarias para procesar los ARN CRISPR, se creó el constructo sintético ARNg para combinar las piezas esenciales de ARN para la orientación de Cas9 en un único ARN expresado con el promotor de la ARN polimerasa tipo III U6 (Mali et al., 2013a, b). Los ARNg sintéticos tienen una longitud mínima de algo más de 100 pb y contienen una porción que se dirige a los 20 nucleótidos protospacer inmediatamente anteriores a la secuencia pA m NGG; los ARNg no contienen una secuencia PAM.
4. Nucleobases modificadas
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos de la presente divulgación comprenden uno o más nucleósidos modificados que comprenden una fracción de azúcar modificada. Dichos compuestos que comprenden uno o más nucleósidos modificados con azúcares pueden tener propiedades deseables, como una mayor estabilidad de las nucleasas o una mayor afinidad de unión con un ácido nucleico diana en relación con un oligonucleótido que comprenda sólo nucleósidos con fracciones de azúcares naturales. En algunas realizaciones, las fracciones de azúcar modificadas son fracciones de azúcar sustituidas. En algunas realizaciones, las fracciones de azúcar modificadas son sustitutos de azúcar. Dichos sustitutos del azúcar pueden comprender una o más sustituciones correspondientes a las de las fracciones de azúcar sustituidas.
En algunas realizaciones, las fracciones de azúcar modificadas son fracciones de azúcar sustituidas que comprenden uno o más sustituyentes de azúcar no puenteados, incluyendo sustituyentes en las posiciones 2' y/o 5'. Entre los ejemplos de sustituyentes del azúcar adecuados para la posición 2'- se incluyen: 2'-F, 2'-OCH3 ("OMe" u "O-metilo"), y 2'-O(CH2)2OCH3("MOE"). En ciertas realizaciones, los sustituyentes del azúcar en la posición 2' se seleccionan entre alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O--C1-C10 alquilo, O-C1-C10 alquilo sustituido; OCF3 , O(CH2)2SCH3, O(CH2)2--O--N(Rm)(Rn), y O--CH2-C(=O)--N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido. Entre los ejemplos de sustituyentes de azúcar en la posición 5'se incluyen: 5'-metilo (R o S); 5'-vinilo, y 5'-metoxi. En algunas realizaciones, los azúcares sustituidos comprenden más de un sustituyente de azúcar no puente, por ejemplo, las fracciones de azúcar T-F-5'-metilo (véase, por ejemplo, la solicitud internacional p Ct WO 2008/101157 para otras fracciones de azúcar 5',2'-bis sustituidas y nucleósidos).
Los nucleósidos que comprenden fracciones de azúcares 2'-sustituidos se denominan nucleósidos 2'-sustituidos. En algunas realizaciones, un nucleósido 2'-sustituido comprende un grupo 2'-sustituyente seleccionado entre halo, alilo, amino, azido, SH, CN, OCN, CF3, OCF3, O, S o N(Rm)-alquilo; O, S o N(Rm)-alquenilo; O, S o N(Rm)-alquinilo; O-alquilenilo-O-alquilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo, O-alquilo, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2--O--N(Rm)(Rn) u O--CH2--C(=O)—N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H, un grupo protector amino o un alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido. Estos grupos 2'-sustituyentes pueden estar además sustituidos con uno o más grupos sustituyentes seleccionados independientemente entre hidroxilo, amino, alcoxi, carboxi, bencilo, fenilo, nitro (NO2), tiol, tioalcoxi (S-alquilo), halógeno, alquilo, arilo, alquenilo y alquinilo.
En algunas realizaciones, un nucleósido 2'-sustituido comprende un grupo 2'-sustituyente seleccionado entre F, NH2 , N3, OCF3, O--CH3, O(CH2)3NH2, CH2-CH=CH2, O--CH2-CH=CH2, OCH2CH2OCH3, O(CH2)2SCH3, O--(CH2)2--O--N(Rm)(Rn), O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2, y acetamida N-sustituida (O--CH2--C(=O)--N(Rm)(Rn) donde cada Rm y Rn es, independientemente, H, un grupo protector amino o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido.
En algunas realizaciones, un nucleósido 2'-sustituido comprende una fracción de azúcar que comprende un grupo 2'-sustituyente seleccionado entre F, OCF3, O--CH3, OCH2CH2OCH3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2--O--N(CH3)2, --O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2, y O-CH2-C(=O)-N(H)CH3.
En algunas realizaciones, un nucleósido 2'-sustituido comprende una fracción de azúcar que comprende un grupo 2'-sustituyente seleccionado entre F, O--CH3 , y OCH2CH2OCH3.
Ciertas fracciones de azúcar modificadas comprenden un sustituyente de azúcar puente que forma un segundo anillo que da lugar a una fracción de azúcar bicíclica. En algunas de estas realizaciones, la fracción de azúcar bicíclica comprende un puente entre los átomos del anillo de furanosa 4' y 2'. Ejemplos de estos sustituyentes de azúcar de 4' a 2', incluyen: --[C(Ra)(Rb)]n--, --[C(Ra)(Rb)]n--O--, --C(RaRb)--N(R)--O-- o, --C(RaRb)--O--N(R)--; 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)--O-2' (LNA); 4'-(CH2)--S-2'; 4'-(CH2)2--O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)--O-2' (cEt) y 4'-CH(CH2OCH3)--O-2', y análogos de los mismos (véase, porejemplo g., La patente estadounidense 7.399.845); 4'-C(CH3)(CH3)--O-2' y análogos de los mismos, (véase, por ejemplo WO 2009/006478); 4'-CH2--N(OCH3)-2' y análogos de los mismos (véase, por ejemplo WO2008/150729); 4'-CH2- -O--N(CH3)-2' (véase, por ejemplo US2004/0171570, publicado el 2 de septiembre de 2004); 4'-CH2--O--N(R)-2', y 4'-CH2--N(R)--O-2'-, donde cada R es, independientemente, H, un grupo protector, o C1-C12 alquilo; 4'-CH2--N(R)--O-2', donde R es H, C1-C12 alquilo, o un grupo protector (véase, Patente de EE.UU. 7,427,672); 4'-CH2--C(H)(CH3)-2' (véase, por ejemplo Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118­ 134); y 4'-CH2--C(=CH2)-2' y sus análogos (véase Solicitud internacional p Ct WO 2008/154401).
En algunas realizaciones, dichos puentes de 4' a 2' comprenden independientemente de 1 a 4 grupos enlazados seleccionados independientemente de --[C(Ra)(Rb)]n--, --C(Ra)=C(Rb)--, --C(Ra)=N--, -C(=NRa)--, --C(=O)--, --C(=S)--, --O--, --Si(Ra)2--, --S(=O)x--, y --N(Ra)--; donde:
x es 0, 1 o 2;
n es 1, 2, 3 o 4;
cada Ra y Rb es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, radical heterociclo radical heterocíclico sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C5-C7 , radical alicíclico C5-C7 sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2, SJi, N3 , COOJ1, acilo (C(=O)--H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J1) o sulfoxilo (S(=O)-J1); y
cada Ji y J2 es, independientemente, H, C1-C12 alquilo, C1-C12 alquilo sustituido, C2-C12 alquenilo, C2-C12 alquenilo sustituido, C2-C12 alquinilo, C2-C12 alquinilo sustituido, C5-C20 arilo, C5-C20 arilo sustituido, acilo (C(=O)--H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, C1-C12 aminoalquilo, C1-C12 aminoalquilo sustituido, o un grupo protector.
Los nucleósidos que comprenden fracciones de azúcares bicíclicos se denominan nucleósidos bicíclicos o BNAs. Los nucleósidos bicíclicos incluyen, (A) a-L-metilenooxi (4'-CH2--O-2') BNA, (B) p-D-metilenooxi (4'-CH2--O-2') BNA (también denominado ácido nucleico bloqueado o LNA), (C) Etilenooxi (4'-(CH2)2--O-2') BNA, (D) Aminooxi (4 -CH2--O--N(R)-2') BNA, (E) Oxiamino (4'-CH2--N(R)--O-2') BNA, (F) metil(metilenooxi) (4'-CH(CH3)--O-2') BNA (también denominado etilo restringido o cEt), (G) metileno-tio (4'-CH2--S-2') BNA, (H) metileno-amino (4'-CH2-N(R)-2') BNA, (I) BNA metilénico (4'-CH2--CH(CH3)-2'), (J) BNA propilénico (4'-(CH2)3-2') y (K) BNA metoxi(etilenooxi) (4'-CH(CH2OMe)-O-2') (también denominado MOE restringido o cMOE).
Se conocen en la técnica otras fracciones de azúcares bicíclicos, por ejemplo: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456 Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630 Wahlestedt y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638 Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222 Singh et al., J. Org. Chem, 1998, 63, 10035­ 10039 Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 129(26) 8362-8379 (4 de julio de 2007) Elayadi et al., Curr. Opinión Invens. Drogas, 2001, 2, 5561 Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; Orum et al., Curr. Opinión Mol. Ther., 2001, 3, 239­ 243 Patentes estadounidenses 7.053.207, 6,268,490, 6,770,748, 6,794,499, 7,034,133, 6,525,191, 6,670,461y 7,399,845 WO 2004/106356, WO 1994/14226, WO 2005/021570y WO 2007/134181y la publicación de patentes de EE.UU. núm US 2004/0171570, US 2007/0287831y US 2008/0039618 Números de serie de los EE.UU. 12/129.154, 60/989,574, 61/026,995, 61/026,998, 61/056,564, 61/086,231, 61/097,787y 61/099,844y las solicitudes internacionales PCT Nos PCT/US2008/064591, PCT/US2008/066154y PCT/US2008/068922.
En algunas realizaciones, las fracciones de azúcar bicíclicas y los nucleósidos que incorporan dichas fracciones de azúcar bicíclicas se definen además por la configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un puente metileno-oxi de 4'-2', puede estar en la configuración .alpha.-L o en la configuración .beta.-D. Anteriormente, se incorporaron nucleósidos bicíclicos a-L-metilenooxi (4'-CH2--O-2') en oligonucleótidos antisentido que mostraron actividad antisentido (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21,6365-6372).
En algunas realizaciones, las fracciones de azúcar sustituidas comprenden uno o más sustituyentes de azúcar no puente y uno o más sustituyentes de azúcar puente (por ejemplo, azúcares 5'-sustituidos y 4'-2' puenteados Solicitud internacional PCT WO 2007/134181donde el LNA está sustituido, por ejemplo, con un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo).
En algunas realizaciones, las fracciones de azúcar modificadas son sustitutos de azúcar. En algunas de estas realizaciones, el átomo de oxígeno del azúcar natural está sustituido, por ejemplo, por un átomo de azufre, carbono o nitrógeno. En algunas de estas realizaciones, dicha fracción de azúcar modificada también comprende sustituyentes puente y/o no puente como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, algunos sustitutos del azúcar comprenden un átomo de azufre de 4' y una sustitución en la posición 2' (véase, por ejemplo, la solicitud de patente estadounidense publicada US 2005/0130923) y/o en la posición 5'. A modo de ejemplo adicional, se han descrito nucleósidos bicíclicos carbocíclicos que tienen un puente 4'-2' (véase, por ejemplo, Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429­ 4443 y Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740).
En algunas realizaciones, los sustitutos del azúcar comprenden anillos que tienen menos de 5 átomos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un sustituto del azúcar comprende un tetrahidropirano de seis miembros. Estos tetrahidropiranos pueden ser modificados o sustituidos. Los nucleósidos que comprenden dichos tetrahidropiranos modificados incluyen, el ácido nucleico de hexitol (HNA), el ácido nucleico de anitol (ANA), el ácido nucleico de manitol (MNA) (véase Leumann, C J. Bioorg. & Med. Chem. (2002) 10:841-854), y fluoro HNA (F-HNA).
En algunas realizaciones, los nucleósidos THP modificados de Fórmula VII se proporcionan en los que q1, q2 , q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno H. En algunas realizaciones, al menos uno de q1, q2 , q3, q4, q5, q6 y q7 es distinto de H. En algunas realizaciones, al menos uno de q1, q2 , q3, q4, q5, q6 y q7 es metilo. En algunas realizaciones, se proporcionan nucleósidos THP de Fórmula VII en los que uno de R1 y R2 es F. En ciertas realizaciones, R1 es fluoro y R2 es H, R1 es metoxi y R2 es H, y R1 es metoxietoxi y R2 es H.
También se conocen en la técnica muchos otros sistemas de anillos sustitutos de azúcares bicíclicos y tricíclicos que pueden utilizarse para modificar nucleósidos para su incorporación en compuestos antisentido (véase, por ejemplo, el artículo de revisión Leumann, J. C, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854).
También se proporcionan combinaciones de modificaciones sin limitación, como los nucleósidos sustituidos con 2'-F-5'-metilo (véase Solicitud Internacional PCT WO 2008/101157 para otros nucleósidos 5',2'-bis sustituidos divulgados) y la sustitución del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo por S y la sustitución adicional en la posición 2'- (véase la publicación de patente estadounidense US 2005/0130923) o, alternativamente, la sustitución en 5' de un ácido nucleico bicíclico (véase la Solicitud Internacional PCT WO 2007/134181 en la que un nucleósido bicíclico 4-CH2--O-2' se sustituye además en la posición 5' con un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo). También se ha descrito la síntesis y preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con su oligomerización y estudios bioquímicos (véase, por ejemplo, Srivastava et al., 2007).
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona oligonucleótidos que comprenden nucleósidos modificados. Estos nucleótidos modificados pueden incluir azúcares modificados, nucleobases modificadas y/o enlaces modificados. Las modificaciones específicas se seleccionan de forma que los oligonucleótidos resultantes posean características deseables. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden uno o más nucleósidos similares al ARN. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden uno o más nucleótidos similares al ADN.
En algunas realizaciones, los nucleósidos de la presente invención comprenden una o más nucleobases no modificadas. En ciertas realizaciones, los nucleósidos de la presente invención comprenden una o más nucleobases modificadas.
En algunas realizaciones, las nucleobases modificadas se seleccionan entre: bases universales, bases hidrófobas, bases promiscuas, bases de tamaño expandido y bases fluoradas como se define en el presente documento. Pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo; 5-propinilcitosina; 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros derivados alquílicos de la adenina y la guanina, 2-propil y otros derivados alquílicos de la adenina y la guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinilo CH3) uracilo y citosina y otros derivados alquílicos de bases pirimidínicas, 6-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-amino-adenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina, 3-deazaguanina y 3-deazaadenina, bases universales, bases hidrófobas, bases promiscuas, bases de tamaño expandido y bases fluoradas como se definen en el presente documento. Otras nucleobases modificadas incluyen pirimidinas tricíclicas como la fenoxazina citidina([5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), fenotiazina citidina (1H-pirimido[5,4-b][1,4]benzotiazin-2(3H)-ona), pinzas G como una fenoxazina citidina sustituida (p. ej, 9-(2-aminoetoxi)-H-pirimido[5,4-13][1,4]benzoxazin-2(3H)-ona), citidina de carbazol (2H-pirimido[4,5-b]indol-2-ona), citidina de piridoindol (H-pirido[3',2':4,5]pirrolo[2,3-d]pirimidin-2-ona). Las nucleobases modificadas también pueden incluir aquellas en las que la base de purina o pirimidina se sustituye por otros heterociclos, por ejemplo 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Otras nucleobases incluyen las divulgadas en la Patente de EE.UU. 3.687.808 y las divulgadas en The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Kroschwitz, J. I., Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858-859los divulgados por Englisch et al. , 1991; y los divulgados por Sanghvi, Y. S., 1993.
Las patentes representativas de los Estados Unidos que enseñan la preparación de algunas de las nucleobases modificadas mencionadas anteriormente, así como de otras nucleobases modificadas, incluyen sin limitación las Patentes de Estados Unidos 3,687,808 4,845,205 5,130,302 5,134,066 5,175,273 5,367,066 5,432,272 5,457,187 5,459,255 5,484,908 5,502,177 5,525,711 5,552,540 5,587,469 5,594,121 5,596,091 5,614,617 5,645,985 5,681,941 5,750,6925,763,588 5,830,653 y 6,005,096.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona oligonucleótidos que comprenden nucleósidos enlazados. En tales realizaciones, los nucleósidos pueden unirse utilizando cualquier enlace internucleósido. Las dos clases principales de grupos de enlace internucleósido se definen por la presencia o ausencia de un átomo de fósforo. Los enlaces internucleósidos representativos que contienen fósforo incluyen fosfodiésteres (P=O), fosfotriesteres, metilfosfonatos, fosforamidatos y fosforotioatos (P=S). Los grupos de enlace internucleósido representativos que no contienen fósforo incluyen el metilenmetilimino (--CH2--N(CH3 )--O--CH2--), el tiodiéster (--O--C(O)--S--), el tionocarbamato (--O--C(O)(NH)--S--); el siloxano (--O--Si(H)2--O--); y la N,N'-dimetilhidracina (--CH2--N(CH3)--N(CHa)--). Los enlaces modificados, en comparación con los enlaces fosfodiésteres naturales, pueden utilizarse para alterar, y normalmente aumentar, la resistencia a las nucleasas del oligonucleótido. En algunas realizaciones, los enlaces internucleósidos que tienen un átomo quiral pueden prepararse como una mezcla racémica, o como enantiómeros separados. Los enlaces quirales representativos incluyen los alquilfosfonatos y los fosforotioatos. Los procedimientos de preparación de enlaces internucleósidos que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos por los expertos en la materia.
Los oligonucleótidos descritos en el presente documento contienen uno o más centros asimétricos y, por tanto, dan lugar a enantiómeros, diastereómeros y otras configuraciones estereoisoméricas que pueden definirse, en términos de estereoquímica absoluta, como (R) o (S), a o p, como en el caso de los anómeros de azúcar, o como (D) o (L), como en el caso de los aminoácidos, etc. Los compuestos antisentido que se proporcionan en el presente documento incluyen todos los isómeros posibles, así como sus formas racémicas y ópticamente puras.
Los enlaces neutros de internucleósidos incluyen, sin limitación, fosfotriésteres, metilfosfonatos, MMI (3'-CH2--N(CH3)--O-5') amida-3 (3'-CH2--C(=O)--N(H)-5'), amida-4 (3'-CH2--N(H)--C(=O)-5'), formacetal (3'-O-CH2-O-5'), y tioformacetal (3-S-CH2—O-5'). Otros enlaces neutros de internucleósidos incluyen enlaces no iónicos que comprenden siloxano (dialquilsiloxano), éster de carboxilato, carboxamida, sulfuro, éster de sulfonato y amidas (Ver por ejemplo: Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y. S. Sanghvi and P. D. Cook, Eds., ACS Symposium Series 580; Chapters 3 and 4, 40-65). Otros enlaces neutros internucleósidos incluyen enlaces no iónicos que comprenden componentes mixtos N, O, S y CH2.
También se pueden realizar modificaciones adicionales en otras posiciones del oligonucleótido, particularmente en la posición 3' del azúcar del nucleótido terminal 3' y en la posición 5' del nucleótido terminal 5'. Por ejemplo, una modificación adicional de los oligonucleótidos conjugados con ligando de la presente invención implica vincular químicamente al oligonucleótido una o más fracciones o conjugados no ligandos adicionales que mejoran la actividad, la distribución celular o la captación celular del oligonucleótido. Dichas fracciones incluyen fracciones lipídicas como una fracción de colesterol (Letsinger et al., 1989), ácido cólico (Manoharan et al., 1994), un tioéter, por ejemplo , hexil-5-tritiol (Manoharan et al., 1992; Manoharan et al., 1993), un tiocolesterol (Oberhauser et al., 1992), una cadena alifática, por ejemplo, dodecandiol o residuos de undecilo (Saison-Behmoaras et al., 1991; Kabanov et al., 1990; Svinarchuk et al., 1993), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o trietilamonio 1,2-di-O-hexadecil-racglicero-3-H-fosfonato (Manoharan et al., 1995; Shea et al., 1990), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al., 1995), o ácido adamantano acético (Manoharan et al., 1995), una fracción de palmito (Mishra et al., 1995), o una fracción de octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al., 1996).
Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de tales conjugados de oligonucleótidos incluyen, Patentes de Estados Unidos 4,828,979 4,948,882 5,218,105 5,525,465 5,541,313 5,545,730 5,552,538 5,578,717, 5,580,731 5,580,731 5,591,5845,109,1245,118,8025,138,0455,414,0775,486,6035,512,439 5,578,718 5,608,046
4,587,0444,605,735 4,667,025 4,762,7794,789,7374,824,941 4,835,2634,876,3354,904,5824,958,013 5,082,830 5,112,9635,214,1365,082,830 5,112,9635,214,1365,245,0225,254,4695,258,5065,262,536; 5,272,2505,292,873 5,317,0985,371,241, 5,391,7235,416,203, 5,451,4635,510,4755,512,6675,514,7855,565,5525,567,8105,574,142 5,585,481 5,587,371 5,595,7265,597,6965,599,9235,599,928 y 5,688,941.
E. KITS
La presente divulgación también proporciona kits. Cualquiera de los componentes aquí divulgados puede combinarse en forma de kit. En algunas realizaciones, los kits comprenden un dendrímero o una composición como la descrita anteriormente o en las reivindicaciones.
Los kits incluirán generalmente al menos un vial, tubo de ensayo, frasco, botella, jeringa u otro recipiente, en la que se puede colocar un componente, y preferentemente, alicuotado adecuadamente. Cuando hay más de un componente en el kit, el kit también contendrá generalmente un segundo, tercer u otros recipientes adicionales en los que los componentes adicionales pueden colocarse por separado. Sin embargo, en un recipiente se pueden incluir diversas combinaciones de componentes. En algunas realizaciones, todos los componentes de administración de ácido nucleico se combinan en un único recipiente. En otras realizaciones, algunos o todos los componentes de administración de dendrímeros con los polímeros instantáneos se proporcionan en recipientes separados.
Los kits de la presente invención también incluirán típicamente un envase para contener los diversos contenedores en estrecho confinamiento para la venta comercial. Estos envases pueden ser de cartón o de plástico moldeado por inyección o por soplado, en los que se guardan los envases deseados. Un kit también puede incluir instrucciones para emplear los componentes del kit. Las instrucciones pueden incluir variaciones que se pueden aplicar.
F. EJEMPLOS
Ejemplo 1: Materiales e instrumentación
1. Materiales para la síntesis química
Todas las aminas, tioles y otros productos químicos no especificados se adquirieron en Sigma-Aldrich. La 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) se compró a Avanti Lipids. El lípido PEG2000 se sintetizó químicamente, como se describe a continuación. El Ci2-200 se sintetizó siguiendo el procedimiento descrito (Love et al., 2010). Todos los disolventes orgánicos se adquirieron en Fisher Scientific y se purificaron con un sistema de purificación de disolventes (Innovative Technology).
2. Ácidos nucleicos y otros materiales para experimentos in vitro e in vivo
Todos los ARNips fueron comprados a Sigma-Aldrich. El imitador de miARN Let-7g y su imitador de control fueron adquiridos a Ambion por Life Technologies. El medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) y el suero bovino fetal (FBS) se compraron a Sigma-Aldrich. El OptiMEM, el DAPI y la faloidina Alexa Fluor 488 se compraron a Life Technologies. ONE-Glo Tox se compró a Promega. El Biophen FVII se compró a Aniara Corporation.
La secuencia de las hebras en sentido y antisentido de los ARNips fue la siguiente:
siLuc (ARNip contra la luciferasa). dT son bases de ADN. Todos los demás son bases de ARN.
en sentido: 5'-GAUUAUGUCCGGUUAUGUA[dT][dT]-3' (SEQ ID NO: 3)
antisentido: 3'-UACAUAACCGGACAUAAUC[dT][dT]-5' (SEQ ID NO: 4)
siFVII (ARNip contra el FVII). Los nucleótidos 2'-Fluoro modificados van en minúsculas.
en sentido: 5'-GGAucAucAAGucuuAc[dT][dT]-3' (SEQ ID NO: 1)
antisentido: 3'-GuAAGAcuuGAGAuGAucc[dT] [dT]-5' (SEQ ID NO: 2) siCTR (ARNip como control) sentido: 5'-GCGCGAUAGCGCGAAUAUA[dT][dT]-3' (SEQ ID NO: 5)
antisentido: 3'- UAUAUUCGCGCUAUCGC[dT][dT]-5' (SEQ ID NO: 6)
Sigma-Aldrich MISSION siRNA Universal Negative Control #1 (número de catálogo: SIC001) se utilizó como ARNip no dirigido en los experimentos de control. En los estudios in vivo se utilizaron ARNips de control modificados con 2' OMe (Sigma-Aldrich, modificaciones propias) para reducir la estimulación inmunológica.
ARNsi marcado con Cy5.5 (ARNsi para la obtención de imágenes)
en sentido: 5'-Cy5.5-GAUUAUGUCCGGUUAUGUA[dT][dT]-3' (SEQ ID NO: 3)
antisentido: 3'-UACAUAACCGGACAUAAUC[dT][dT]-5' (SEQ ID NO: 4)
imitador de miARN Let-7g
Ambion (Life Technologies) imitador de miARN mirVana (número de catálogo: 4464070, ID del producto: MC11758, nombre: has-let-7g). La secuencia exacta y las modificaciones no han sido divulgadas por Ambion. Imita la Let-7g humana madura.
imitador de miARN de Control negativo (CTR)
Ambion (Life Technologies) mirVana miARN Mimic, Negative Control #1 (número de catálogo: 4464061). La secuencia exacta y las modificaciones no han sido divulgadas por Ambion.
3. Automatización robótica
Las formulaciones de nanopartículas (NP) y el cribado in vitro se realizaron en un robot de manipulación de fluidos Tecan Freedom EVO 200 equipado con un brazo de manipulación de líquidos de 8 canales (LiHa), un brazo multicanal con cabezal de 96 canales (MCA), un brazo manipulador robótico (RoMa) y un lector de microplacas InfiniTe F/M200 Pro integrado (Tecan). Dos estaciones integradas de calentamiento y agitación de reacciones químicas a medida (agitadores de tambor de la serie 710E-3HM de V&P Scientific) proporcionaron soporte de reacción y mezcla. Todas las operaciones se programaron en el software EVOware Standard (Tecan).
4. Caracterización sintética
La RMN de1H y 13C se realizó en un espectrómetro Varian de 500 MHz. La EM se realizó en un Voyager DE-Pro MALDI TOF. La cromatografía instantánea se realizó en un sistema de cromatografía CombiFlash Rf-200i de Teledyne Isco, equipado con detectores de UV-vis y de dispersión de luz evaporativa (ELSD). Los tamaños de las partículas y los potenciales zeta se midieron mediante dispersión dinámica de la luz (DLS) utilizando un Malvern Zetasizer Nano ZS (láser He-Ne, A = 632 nm).
5. Formulación de nanopartículas para estudios in vivo
Las nanopartículas de dendrímero formuladas para estudios in vivo se prepararon utilizando un instrumento de mezcla microfluídica con características de mezcla rápida en espiga (Precision Nanosystems NanoAssemblr). Las soluciones de etanol de dendrímeros, DSPC, colesterol y lípidos PEG2000 se combinaron rápidamente con soluciones ácidas de ARNsi como se describe a continuación. La relación típica de acuosa:EtOH fue de 3:1 (volumen) y el flujo típico fue de 12 mL/minuto.
6. Cribado automatizado de administración in vitro de dendrímeros modulares degradables
Las formulaciones de nanopartículas (NP) y el cribado in vitro se realizaron en un robot de manipulación de fluidos Tecan Freedom EVO 200 equipado con un brazo de manipulación de líquidos de 8 canales (LiHa), un brazo multicanal con cabezal de 96 canales (MCA), un brazo manipulador robótico (RoMa) y un lector de microplacas InfiniTe F/M200 Pro integrado (Tecan).
Las células HeLa que expresan de forma estable la luciferasa de luciérnaga (HeLa-Luc) se obtuvieron a partir de células HeLa (ATCC) mediante la transfección estable del gen de la luciferasa utilizando una infección lentiviral seguida de una selección clonal. Se sembraron células HeLa-Luc (10.000 células/pocillo) en cada pocillo de una placa blanca opaca de 96 pocillos (Coming) y se dejaron fijar durante toda la noche en DMEM sin rojo de fenol suplementado con 5 % de FBS. El segundo día, antes de iniciar la transfección, se sustituyó el medio por otro que contenía FBS.
Las nanopartículas GIDD-siLuc se formularon con la ayuda de un robot automatizado de manipulación de fluidos para acelerar el proceso de descubrimiento. Todas las operaciones se programaron con el software EVOware Standard. En primer lugar, las soluciones de reacción de los dendrímeros se diluyeron desde la concentración original de la reacción hasta 12,5 mM en etanol. A continuación, las soluciones de dendrímeros se diluyeron por segunda vez de 12,5 mM a 1 mM en etanol utilizando el brazo de LiHa. A continuación, se añadieron 89,2 pl de una mezcla de lípidos en etanol en una placa transparente de 96 pocillos. La mezcla de lípidos estaba compuesta por DSPC (0,0690 mM), colesterol (0,2622 mM) y lípidos PEG2000 (0,0138 mM) en etanol. Posteriormente, se añadieron 30,8 pl de cada dendrímero (1 mM) a la mezcla de lípidos en la placa de 96 pocillos a través del LiHa, seguido de una mezcla rápida (15 veces; 75 pl de volumen de mezcla; 250 pl/segundo de velocidad). El LiHa añadió y mezcló 8 puntas a la vez. A una segunda placa transparente de 96 pocillos, se añadieron 50 pl de siLuc (20 ng/pl) en tampón citrato (pH = 4,3) a través del LiHa. A continuación, se añadieron 30 pl de la mezcla de etanol (dendrímero, DSPC, colesterol, lípido PEG2000) a la solución de siLuc de 50 pl, seguida de una mezcla rápida (15 veces; volumen de mezcla de 75 pl; velocidad de 250 pl/segundo) para formar las nanopartículas de dendrímero. A continuación, se añadieron 120 pL de PBS estéril (1*) y se mezclaron con el LiHa para diluir las NPs y aumentar el pH. Posteriormente, las placas se reformularon para permitir una transferencia fácil a las células en crecimiento. Por último, se añadieron 20 pl de las soluciones de NP a las células en cultivo utilizando puntas estériles desechables a través del cabezal MCA96 para evitar la contaminación. Las células recibieron finalmente 100 ng de siLuc (33 nM). La relación molar entre el dendrímero y el siLuc fue de 100:1 durante esta fase de cribado. La composición final de la formulación fue G1DD:colesterol:DSPC:lípido PEG2000: = 50:38:10:2 (por mol). Las células se incubaron durante 24 horas a 37 °C, 5 % de CO2 y luego se analizó la actividad de la luciferasa de luciérnaga y la viabilidad utilizando los kits de ensayo One Glo Tox (Promega).
7. Formulaciones de dendrímeros-ARN pequeños para estudios in vivo
Las nanopartículas de dendrímero formuladas para estudios in vivo se prepararon utilizando un instrumento de mezcla microfluídica con características de mezcla rápida en espiga (Precision Nanosystems NanoAssemblr). Las soluciones de etanol del dendrímero, el DSPC, el colesterol y el lípido PEG2000 (relación molar de 50:38:10:2) se combinaron rápidamente con soluciones ácidas de ARN pequeño para obtener la relación final en peso de 25:1 (dendrímero:ARN pequeño). La relación típica de acuosa:EtOH fue de 3:1 (volumen) y el flujo típico fue de 12 mL/minuto. Las LNP C12-200 se prepararon según el procedimiento descrito (Love et al., 2010). Las soluciones de etanol de C12-2 0 0 , DSPC, colesterol y lípidos PEG2000 (relación molar de 50:38,5:10:1,5) se combinaron rápidamente con soluciones ácidas de ARN pequeño para obtener la relación final en peso de 7:1 (C12-200:ARN pequeño). Todas las NPs formuladas se purificaron mediante diálisis en PBS estéril con un corte de 3,5kD y el tamaño se midió mediante dispersión dinámica de luz (DLS) antes de los estudios in vivo . Cuando procedía, la encapsulación de los ARN pequeños se medía con el ensayo de unión Ribogreen (Invitrogen) tomando la pequeña cantidad de solución y siguiendo su protocolo.
8. Estudios en animales
Todos los experimentos fueron aprobados por los nstitutional Animal Care and Use Committees of The University of Texas Southwestern Medical Center y fueron consistentes con las regulaciones locales, estatales y federales, según corresponda. Los ratones hembra C57BL/6 se compraron a Harlan Laboratories (Indianápolis, IN). Los ratones transgénicos portadores de tumores hepáticos impulsados por MYC se generaron cruzando la cepa TRE-MYC con la cepa LAP-tTA. Los ratones con el genotipo LAP-tTA y TRE-MYC se mantuvieron con 1 mg/mL de dox, y MYC se indujo mediante la retirada de dox. Se realizó un análisis de potencia para anticipar el número de animales necesario para alcanzar la significación estadística.
9. Silenciamiento in vivo del factor VII en ratones
Para el cribado de la administración in vivo , ratones C57BL/6 hembra recibieron inyecciones i.v. en la vena de la cola de PBS (control negativo, n=3) o NPs de dendrímero que contenían ARNsi no dirigido (siCTR, control negativo, n=3) o NPs de dendrímero que contenían ARNsi anti-Factor VII (siFVII, n=3) diluido en PBS (200 pl o menos en volumen total). Al cabo de 48 horas, se midió el aumento/pérdida de peso corporal y se anestesió a los ratones mediante la inhalación de isofluorano para la recogida de muestras de sangre por sangrado ocular retro-orbital. El suero se aisló con tubos de separación de suero (Becton Dickinson) y los niveles de proteína del Factor VII se analizaron mediante un ensayo cromogénico (Biophen FVII, Aniara Corporation). Se construyó una curva estándar utilizando muestras de ratones inyectados con PBS y se determinó la expresión relativa del Factor VII comparando los grupos tratados con un control de PBS no tratado.
Para el estudio terapéutico, se verificó la eliminación del FVII en los ratones transgénicos con el ensayo sanguíneo antes mencionado y por qPCR utilizando tejidos hepáticos recolectados. Para evaluar la significación estadística, se realizaron pruebas t de Student de dos colas con un nivel de confianza del 95 %.
10. Biodistribución
Los ratones hembra C57BL/6 o los ratones transgénicos portadores de tumores hepáticos recibieron inyecciones i.v. en la vena de la cola con NPs de dendrímero que contenían Cy5.5-ARNsi a 1 mg/kg de ARNsi en 200 pL. A las 24 horas después de la inyección, se practicó la eutanasia a los ratones y se extrajeron los órganos. La biodistribución se evaluó mediante la obtención de imágenes de órganos enteros con un sistema IVIS Lumina (Caliper Life Sciences) con el ajuste de filtro Cy5.5.
Para la obtención de imágenes confocales, el tejido se crioseccionó (7 pm) y se fijó con paraformaldehído al 4 % a temperatura ambiente durante 10 minutos. Los cortes se lavaron tres veces con PBS y se bloquearon durante 30 minutos en PBS con albúmina al 1 %. A continuación, las secciones se incubaron durante 30 minutos con Alexa Fluor 488 Phalloidin (dilución 1:200, Life Technologies) en PBS con albúmina al 1 %. Los cortes se lavaron tres veces con Tween 20 al 0,1 % y se montaron con ProLong Gold Antifade (Life Technologies). Las secciones se visualizaron con un microscopio confocal de barrido puntual LSM 700 (Zeiss) equipado con un objetivo de 25*.
11. Evaluación de la toxicidad in vivo y estudios terapéuticos de Let-7g
Los ratones de tipo salvaje o los ratones transgénicos portadores de tumores hepáticos se dividieron aleatoriamente en diferentes grupos. Los ratones recibieron inyecciones i.v. en la vena de la cola de NPs de dendrímeros que contenían siCTR. Su peso corporal se controló diariamente. En el caso de los ratones transgénicos portadores de tumores de hígado, se realizaron múltiples inyecciones en la cola para simular una dosificación repetida.
Para los estudios terapéuticos de Let-7g, los ratones transgénicos portadores de tumores hepáticos recibieron inyecciones i.v. semanales en la vena de la cola de NPs con imitador Let-7g o imitador CTR a una dosificación de 1 mg/kg en 200 pL de PBS desde la edad de 26 a 61 días. Se utilizó la aleatorización por orden de procesamiento. No se hizo ningún cegamiento. Se controló cuidadosamente su peso corporal, el tamaño del abdomen y la supervivencia. Para evaluar la significación estadística, se realizaron pruebas T de dos colas con un nivel de confianza del 95 % o pruebas de Mantel-Cox.
Ejemplo 2: Síntesis y caracterización de lípidos y dendrímeros de PEG
1. Síntesis de una biblioteca con 1.512 dendrímeros degradables de primera generación (G1DD)
Los GIDDs se sintetizaron mediante dos reacciones secuenciales ortogonales. En un primer momento, se hicieron reaccionar por separado aminas con diferentes centros de ramificación iniciales (IBC) con el grupo acrilato del metacrilato de 2-(acriloiloxi)etilo (AEMA), con una relación molar entre la amina y el AEMA igual al número de IBC (por ejemplo, aminas 2A: se añadieron dos equivalentes de AEMA; aminas 6A: se añadieron seis equivalentes de AEMA). Las reacciones se llevaron a cabo con la adición de 5 % en moles de hidroxitolueno butilado (BHT) durante 24 horas a 50 °C. A continuación, cada aducto de primer paso se hizo reaccionar por separado con cada tiol en una relación molar de tiol a aducto igual a los números de IBC de la amina (por ejemplo, aducto de primer paso de la amina 2A: se añadieron dos equivalentes de cada tiol; aducto de primer paso de la amina 6A: se añadieron seis equivalentes de cada tiol). Las reacciones se llevaron a cabo con la adición de un 5 % en moles de catalizador de dimetilfenilfosfina (DMPP) durante 48 horas a 60 °C. La síntesis de la biblioteca de 1.512 miembros se aceleró llevando a cabo las reacciones en viales de vidrio y bloques de reacción de aluminio. Se emplearon estaciones de calentamiento y agitación de reacciones químicas hechas a medida (agitadores de tambor de la serie 710E-3HM de V&P Scientific).
Los experimentos iniciales de cribado de administración in vitro se realizaron con GIDDs crudos. Se realizaron estudios de seguimiento para verificar la actividad utilizando dendrímeros purificados.
Todos los experimentos in vivo con animales se realizaron con GIDDs purificados. Los GIDDs purificados se obtuvieron por cromatografía instantánea en columna en una columna de alúmina neutra utilizando un sistema de cromatografía Teledyne Isco con el eluyente de gradiente de hexano y acetato de etilo.
2. Síntesis de dendrímeros degradables de alta generación (HGDDs) (1A2-G2-SC8 como ejemplo)
Figure imgf000044_0001
Se prepararon dendrímeros degradables de generación superior según el procedimiento anterior (Ma et al., 2009). El 1A2-G1 se preparó directamente después de que la amina 1A2 reaccionara con un equivalente de AEMA en presencia de 5 % en moles de BHT a 50 °C durante 24 horas. 1A2-G1 (4,00 g, 11,7 mmol) se disolvió en 10 mL de DMSO. Después de añadir 2-aminoetantiol (1,37 g, 17,5 mmol) a la solución anterior, la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 min. A continuación, se añadieron inmediatamente 300 mL de diclorometano a la disolución de la reacción y se lavó con agua salada fría (50 mL * 3) para eliminar el 2-aminoetanol sobrante. La fase orgánica se secó con sulfato de magnesio y se condensó por evaporación rotatoria para utilizarla directamente en el siguiente paso. En la solución anterior se añadieron AEMA (4,75 g, 25,8 mmol) y BHT (227 mg, 1,08 mmol). La reacción se agitó a 50 °C y se monitorizó mediante 1H RMN. Una vez completada la reacción, la solución se lavó repetidamente con porciones de 20 mL de hexano hasta que no se encontró EAMA a través del análisis de la placa de TLC. La solución lavada se secó al vacío para obtener un líquido viscoso 1A3-G2 directamente para el siguiente paso. El 1A3-G2 se hizo reaccionar siguiendo el procedimiento sintético de dos pasos anterior para dar el líquido viscoso 1A3-G3 directamente para el siguiente paso. Después de disolver 1A2-G3 (0,5 g, 0,3 mmol) en 0,5 mL de DMSO, se añadió 1-octanotiol (216 pL, 1,22 mmol) y dimetilfenilfosfina (DMPP) (8,6 pL, 0,061mmol). La reacción se agitó a 60 °C durante 48 horas y luego se purificó pasando una columna de alúmina neutra con el eluyente gradiente de hexano y acetato de etilo. Se obtuvo un líquido viscoso de color amarillo claro 1A2-G3-SC8 .
3. Síntesis del lípido PEG2000
Figure imgf000045_0001
Se disolvieron PEG44-OH (80 g, 40 mmol) y piridina (6,5 mL, 80 mmol) en 250 mL de DCM anhidro y se enfriaron a 0 °C. Se añadió cloruro de metanosulfonilo (15,5 mL, 200 mmol) en 50 mL de DCM durante 30 min y la mezcla se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente. Se añadieron otros 100 mL de DCM y la fase orgánica se lavó con solución saturada de NaHCO3 (50 mL * 3), y luego con salmuera (50 mL * 3). La solución resultante se concentró y el residuo se recristalizó en isopropanol y se secó para obtener un polvo blanco PEG2000-Ms (74 g, 93 %).
Se disolvió PEG2000-Ms (35,41 g, 17,7 mmol) en 250 mL de DMF. A continuación, se añadió a la solución NaN3 (12,4 g, 19,0 mmol). La reacción se agitó bajo nitrógeno durante 2 días a 50 °C. Tras eliminar la DMF, el residuo se disolvió en 300 mL de DCM y se lavó con salmuera (50 mL * 3). Tras eliminar los disolventes, el aceite residual se disolvió en 50 mL de metanol y el producto se precipitó tres veces con 300 mL de éter dietílico para dar el compuesto deseado (25,55 g, 72 %) como polvo blanco Peg2000-N3.
Se añadieron propargilamina (0,50 g, 9,1 mmol), BHT (191 mg, 0,91 mmol) y EAMA (2,73 g, 18,2 mmol) en un vial de reacción de 25 mL. La mezcla se agitó durante 48 horas a 50 °C. La reacción se enfrió para dar un producto de aceite incoloro T3-G1 sin purificar para su uso en la siguiente reacción.
4. Caracterización de dendrímeros seleccionados
Figure imgf000046_0001
1H RMN (400 MHz, CDCI3, 5): 4.38-4,19 (br, 28H, -OCH2CH2O-), 2,90-2,80 (br, 7H, -C(O)CH(CH 3 )CH 2 S-), 2,75-2,71 (br, 14H, -NCH 2 CH 2 C(O)-), 2,70-2,49 (br, 28H, -C(O)CH(CHs)CH 2 S-, -SCH2-), 2,49-2.39 (br, 36H, -N(CH) 2 , -NCH 2 CH 2 N(CH2CH2)2NCH2-, -CH2N(CH2-)2), 1,57-1,48 (m, 8H, -SCH 2 CH 2 CH 2 -), 1,37-1.28 (br, 8H, SCH 2 CH 2 CH 2 -), 1,28-1,16 (br, 53H, -SCH2CH2(CH)4CH3, -HCC(CH3)CH2S-), 0,85 (t, J = 7,1 Hz, 12H, -(CH2)4CH3). 13C RMN (400 MHz, CDCl3, 5): 174.92, 172.03, 62.22, 62.17, 62.13, 62.07, 49.06, 40.23, 40.14, 35.36, 32.68, 32.56, 31.76, 29.60, 29.14, 28.82, 22.58, 16.85, 16.81, 14.04. MS (MALDI-TOF, m/z) Calc. para C 109 H 196 N 6 O 28 S 7 : 2261.21, encontrado: 2262.43
Figure imgf000046_0002
1H RMN (400 MHz, CDCl3, 5): 4.34-4,21 (br, 16H, -OCH2CH2O-), 2,82-2,76 (m, 4H, -SCH 2 CH(CH s )-), 2,73 (t, J = 7,1 Hz, 8H, -C(O)CH 2 CH 2 N-), 2,70-2,64 (m, 4H, -SCH 2 CH(CH s )-), 258-2,51 (m, 4H, -SCH 2 CH(CH s )-), 2,51-2,46 (m, 8H, -CH 2 CH 2 S-), 2,45-2,40 (m, 18H, (-C(O)CH 2 CH 2 ) 2 NCH 2 CH 2 CH 2 N(CH 2 -) 2 ), 2.35-2,26 (br, 4H, -CH 2 CH 2 N(CH 2 -) 2 ), 1,65­ 1,58 (br, 4H, -NCH 2 CH 2 CH 2 N-), 1,57-1,49 (m, 8H, -SCH 2 CH 2 CH 2 -), 1,37-1.28 (br, 8H, -SCH 2 CH 2 CH 2 -), 1,28-1,16 (br, 44H, -SCH2CH2 (CH2)4CH3, -CHC(CH3)CH2S-), 0,85 (t, J = 7,0 Hz, 12H, -(CH2)4CHs). 13C RMN (400 MHz, CDCl3, 5): 174.90, 172.18, 62.18, 62.05, 49.05, 40.14, 35.37, 32.68, 32.40, 31.76, 29.60, 29.15, 28.83, 22.60, 16.81, 14.08. MS (MALDI-TOF, m/z) Calc. para C 78 H 144 N 4 O 16 S 4 : 1520.95, encontrado: 1521.32
Figure imgf000046_0003
1H RMN (400 MHz, CDCl3, 5): 4.32-4,21 (br, 16H, -OCH2CH2O-), 2,82-2,76 (m, 4H, -SCH 2 CH(CH s )-), 2,73 (t, J = 7,0 Hz, 8H, -C(O)CH 2 CH 2 N-), 2,69-2.62 (m, 4H, -SCH 2 CH(CH s )-), 2,58-2,50 (m, 4H, -SCH 2 CH(CH s )-), 2,50-2,45 (m, 8H, -CH 2 CH 2 S-), 2,45-2,38 (m, 12H, (-C(O)CH 2 CH 2 ) 2 NCH 2 -), 2,34-2.24 (br, 4H, -CH2N(CH3)CH2-), 2,24-2,00 (br, 3H, -CH2N(CH3)CH2) 1,66-1,57 (br, 4H, -NCH 2 CH 2 CH 2 N-), 1,57-1,48 (m, 8H, -SCH 2 CH 2 CH 2 -), 1.37-1.28 (br, 8H, -SCH 2 CH 2 CH 2 -), 1.28-1.16 (br, 45H, -SCHCH2(CH2)4CH3, -CHC(CH3)CH2S-), 0.85 (t, J = 7.0 Hz, 12H, -(CH2)4CHs).
13C RMN (400 MHz, CDCl3, 5): 174.90, 172.18, 62.18, 62.05, 49.00, 40.13, 35.36, 32.68, 32.35, 31.76, 29.60, 29.15, 28.83, 22.60, 16.81, 14.04. MS (MALDI-TOF, m/z) Calc. para C 75 H 139 N 3 O 16 S 4 : 1465.90, encontrado: 1465.65
Figure imgf000046_0004
1H RMN (400 MHz, CDCI3, 5): 4.34-4,20 (br, 20H, -OCH2CH2O-), 2,82-2,76 (m, 5H, -SCH2CH(CH3)-), 2,75-2,70 (br, 10H, -C(O)CH2CH2N-), 269-2,62 (m, 5H, -SCH2CH(CH3)-), 2,60-2,52 (m, 5H, -SCH2CH(CH3)-), 2,52-2,49 (m, 10H, -CH2CH2S-), 2,49-2.45 (br, 16H, -NCH2CH2 N-), 2,45-2,40 (br, 10H, -CH2N-), 1,57-1,48 (br, 10H, -SCH2CH2CH-), 1,37­ 1.28 (br, 10H, -SCH2CH2CH2-), 1,28-1,16 (br, 55H, -SCH2CH2(CH2)4CHs, -CHC(CHs)CH2S-), 0,87-0,79 (br, 15H, -(CH2)4CH3). 13C RMN (400 MHz, CDCl3, 5): 174.93, 172.13, 62.28, 62.01, 49.04, 40.13, 35.36, 32.68, 32.35, 31.76, 29.60, 29.15, 28.83, 22.59, 16.82, 14.05. MS (MALDI-TOF, m/z) Calc. para C93H173N5O20S5 : 1840.13, encontrado: 1841.37. También se ha preparado el 5A2-SC8 con 6 brazos (estructura mostrada a continuación)
Figure imgf000047_0001
1H RMN (400 MHz, CDCl3, 5): 4.32-4,21 (br, 20H, -OCH2CH2O-), 2,82-2,76 (m, 5H, -SCH2CH(CH3)-), 2,76-2,70 (br, 10H, -C(O)CH2CH2N-), 269-2,62 (m, 5H, -SCH2CH(CH3)-), 2,58-2,50 (m, 5H, -SCH2CH(CH3)-), 2,50-2,45 (m, 10H, -CH2CH2S-), 2,45-2.20 (br, 20H, (-(CH2)2NCH2-, -CH2NHCH2-), 1,66-1,57 (br, 6H, -NCH2CH2CH2N-), 1,57-1,48 (br, 10H, -SCH2CH2CH2-), 1,37-1.28 (br, 10H, -SCH2CH2CH2-), 1,28-1,16 (br, 55H, -SCH2CH2(CH2)4CHs, -CHC(CHs)CHS-), 0,82-0,75 (br, 15H, -(CH2)4CH3). 13C RMN (400 MHz, CDCl3, 5): 174.98, 172.13, 62.28, 62.01, 49.04, 40.13, 35.36, 32.68, 32.35, 31.76, 29.60, 29.15, 28.83, 22.61, 16.85, 14.14. MS (MALDI-TOF, m/z) Calc. para C94H174N4O20S5 : 1839.13, encontrado: 1838.97
Figure imgf000047_0002
1H RMN (400 MHz, CDCl3, 5): 4.33-4,20 (br, 24H, -OCH2CH2O-), 2,82-2,77 (m, 6H, -SCH2CH(CH3)-), 2,77-2,71 (br, 12H, -C(O)CH2 CH2N-), 268-2,62 (m, 6H, -SCH2CH(CH3)-), 2,60-2,52 (m, 6H, -SCH2CH(CH3)-), 2,52-2,48 (br, 12H, -CH2CH2S-), 2,48-2.46 (br, 12H, -NCH2CH2 N-), 2,45-2,40 (br, 12H, (-CH2)2N-), 1,57-1,47 (br, 12H, -SCH2CH2CH2-), 1,37-1.28 (br, 12H, -SCH2CH2CH2-), 1,28-1,16 (br, 108H, -SCH2CH2(CH2)sCHs, -CHC(CHs)CHS-), 0,87-0,80 (br, 18H, -(CH2)sCH3). 13C RMN (400 MHz, CDCl3, 5): 174.87, 172.07, 62.16, 62.04, 49.48, 40.47, 40.11, 35.34, 32.69, 32.42, 31.86, 29.61, 29.58, 29.57, 29.50, 29.29, 29.21, 28.85, 22.62, 16.81, 14.06. MS (MALDI-TOF, m/z) Calc. para C132H246N4O24S6 : 2463.65, encontrado: 2464.52.
Ejemplo 3: Diseño de bibliotecas y síntesis de dendrímeros degradables de primera generación (GIDDs)
El cáncer de hígado es un huésped desafiante para la intervención terapéutica porque la hepatotoxicidad inducida por los medicamentos puede exacerbar la enfermedad hepática subyacente (Boyerinas et al., 2010). Por lo tanto, para lograr una terapia eficaz mediada por ARNi, hay que mantener un equilibrio de alta potencia y baja toxicidad del portador. Esto requiere una estrategia versátil para ajustar fácilmente el portador de administración en términos de tamaño, estructura química y propiedades físicas finales(FIG. 1A). En algunas realizaciones, se diseñaron dendrímeros que presentan una o más de las siguientes características: materiales óptimos y monodispersos para la manipulación química y de tamaño (Wu et al., 2004; Carlmark et al., 2009; Killops et al., 2008; Ma et al., 2009; Franc y Kakkar, 2010). Se utilizaron reacciones ortogonales para reaccionar secuencialmente con metacrilato de 2-(acriloxi)etilo (AEMA) para diversificar los dendrímeros degradables de primera generación (GIDDs) a través de varios parámetros: núcleo (C), enlace o unidad de repetición(L), y periferia o grupo de terminación(P)(FIG. 1B). En algunas realizaciones, se eligieron los ésteres como enlace degradable de partida porque los poliésteres se utilizan en productos aprobados por la FDA con una toxicidad mínima. En cada paso de crecimiento, el número de ésteres aumenta, lo que ofrece la oportunidad de identificar dendrímeros degradables con una potencia y toxicidad equilibradas.
Resultados anteriores muestran que estas reacciones ortogonales pueden construir dendrímeros de poliéster con una serie de generaciones (Ma et al., 2009). Sin embargo, antes de utilizar esta estrategia, se verificó que los procedimientos son capaces de producir dendrímeros diversificados utilizando una variedad de compuestos de amina y tiol químicamente distintos sin purificación. Para examinar la robustez de esta química, se utilizaron los materiales de partida más difíciles, la tris(2-aminoetil)amina con seis enlaces N-H como centros de ramificación inicial (IBC) y la tetradecilamina con una cadena alquílica de 14 carbonos de longitud, para probar los límites estructurales de las reacciones de adición ortogonal de Michael. Tanto la tris(2-aminoetil)amina como la tetradecilamina reaccionaron cuantitativa y selectivamente con la funcionalidad de acrilato en el AEMA después de 24 horas en presencia de 5 % en moles de hidroxitolueno butilado (BHT) (para inhibir la formación de radicales) a 50 °C, mientras que el AEMA por sí solo no reacciona en estas condiciones (FIGS. 2 & 3). En la segunda reacción ortogonal (adición de sulfa-Michael), se requirió dimetilfenilfosfina como catalizador para conseguir el producto final en baja concentración (la más baja es de 125 mM) o a pequeña escala (~20 mg de media), así como para lograr una alta conversión (100 % por 1H RMN), de modo que el material pueda utilizarse sin purificación para posteriores ensayos o ampliación de la generación(FIGS.
4 & 5). Algunos de los dendrímeros se resintetizaron a mayor escala y se purificaron mediante cromatografía instantánea antes de realizar estudios in vivo .
Debido a las múltiples barreras de administración, la potencia de los portadores de ARN pequeños a través de la nanoencapsulación está influenciada por varios factores, incluyendo el pKa, la topología/estructura y la hidrofobicidad (Siegwart et al ., 2011; Jayaraman et al., 2012; Schaffert et al., 2011; Whitehead et al., 2014). Para identificar fácilmente dendrímeros degradables con alta potencia de administración, se diseñó una biblioteca de GIDDs con cuatro zonas: unión del núcleo - estabilización de la periferia (zona I), unión del núcleo - unión de la periferia (zona II), estabilización del núcleo - estabilización de la periferia (zona III), y estabilización del núcleo - unión de la periferia (zona IV) diversificando químicamente las aminas formadoras del núcleo C y los tioles formadores de la periferia P (FIGS. 1C Y 1D). En las zonas I y II, la unión del ARN fue modulada por aminas con uno(1An) a seis(6An) centros de ramificación inicial (IBC). Por lo tanto, los dendrímeros correspondientes contenían de una a seis ramas. En las zonas III y IV, la estabilización de las NPs de ARN-dendrímero se modificó principalmente con diferentes longitudes de cadenas alquílicas(1Hn y 2Hn). En las zonas II y IV, la capacidad de unión de los aminotioles(SNn) se moduló principalmente con diferentes aminas, mientras que en las zonas I y III, la estabilización se modificó con la longitud de los alquiltioles(SCn) y los carboxilos e hidroxilos(SOn). Se probó la eficacia de toda la biblioteca de compuestos con los dendrímeros(FIG.6).
Ejemplo 4: Cribado in vitro de G1DD para la administración intracelular de ARNip
Los portadores de administración deben superar una serie de barreras extracelulares e intracelulares para permitir que los ARN pequeños sean activos dentro de las células tumorales. Se identificaron los GIDDs que pueden mediar el ARNip para superar las barreras intracelulares mediante el cribado de la biblioteca de 1.512 miembros G1DD para la capacidad de administrar el ARNip in vitro a las células HeLa que expresan de forma estable la luciferasa. Los GIDD se formularon en nanopartículas (NPs) que contenían ARNsi dirigido a la luciferasa (siLuc) y los lípidos auxiliares colesterol, 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC) y el lípido PEG2000 (Akinc et al., 2008; Semple et al., 2010). El potencial de administración intracelular se evaluó cuantificando la reducción de la luciferasa y la viabilidad celular(FIGS.7-9).
Para extraer el SAR de los datos in vitro , se utilizó un proceso de análisis de árbol inspirado en los dendrímeros(FIGS.
7B Y 9B). Entre los 1.512 dendrímeros, 88 mediaron en el silenciamiento de la luciferasa de >50 % y la tasa de aciertos de toda la biblioteca fue del 6 %. Cuando se analizó el índice de aciertos de las cuatro zonas (I-IV), el índice de aciertos de la zona I fue del 10 %, mientras que los de la zona II, III y IV fueron del 0 %, 2 % y 3 %, respectivamente. Este resultado indicó que estos dendrímeros con núcleo de unión a ARNsi y periferia estabilizadora (zona I) tienen un potencial de administración intracelular de ARNsi mucho mayor. Dentro de los tipos de ramificación de la zona 1, los índices de acierto de los dendrímeros con periferia SO son tan bajos como el 1 %, mientras que el de los dendrímeros con periferia SC era tan alto como el 15 %. Sin querer ceñirse a ninguna teoría, se cree que la estabilización hidrófoba de la periferia del dendrímero es crucial para administrar eficientemente el ARNip en las células a través de la nanoencapsulación. Esto probablemente da lugar a un mayor empaquetamiento hidrofóbico que proporciona estabilidad adicional a la NP (Leung et al., 2012). Después de examinar adicinalmente el número de ramas y la longitud de ramas de estos dendrímeros con núcleo de unión y periferia SC , los dendrímeros con núcleo de unión y tres, cuatro, cinco o seis ramas SC5-8 o ramas SC9-12 tienen >25 % de posibilidades de administrar siLuc en células HeLa con >50 % de eliminación de luciferasa. Mediante el cribado in vitro de la biblioteca completa de G1DD y el proceso de análisis de dendrímeros, se identificó el grupo de dendrímeros que mostró una mayor administración intracelular de ARNip: los grupos con núcleo de unión / periferia de SC y núcleo de unión con tres a seis ramas de SC5-8 o SC9-12.
Ejemplo 5. identificación de dendrímeros degradables para la administración eficaz de ARNip in vivo y diseño de dendrímeros G2-G4
Habiendo identificado los dendrímeros que pueden superar las barreras intracelulares, a continuación se identificaron los dendrímeros que pueden superar las barreras extracelulares para administrar eficientemente el ARNsi in vivo . Al separar estos dos procesos, se podría identificar la funcionalidad química que supera las barreras que incluyen la estabilidad de la sangre, la localización en el hígado (tumor), la captación celular y la liberación activa del ARNip. Se evaluó la capacidad de los dendrímeros para silenciar el Factor VII en los hepatocitos porque este factor de coagulación de la sangre puede cuantificarse fácilmente a partir de una pequeña muestra de suero (Akinc et al., 2008; Semple et al., 2010). Se seleccionaron 26 de los dendrímeros degradables que dieron resultado para maximizar la diversidad química: 22 poseían una estructura química optimizada basada en el proceso de análisis dendrítico y otros 4(2A2-SC14, 2A6-SC14, 2A9-SC14, y 6A1-SO9) fueron elegidos en base a su alta capacidad de administración intracelular de ARNip. Los dendrímeros se formularon con ARNsi anti-Factor VII (siFVII) y se inyectaron i.v. en ratones a una dosis de 1 mg de siFVII/kg. La actividad del FVII se cuantificó 3 días después de la inyección. A pesar de la elevada potencia in vitro , los dendrímeros 2A2-SC14, 2A6-SC14, 2A9-SC14, 6A1-SO9 y la mayoría de los dendrímeros de tres ramas sólo mostraron una mínima reducción del FVII in vivo (FIG. 3A). Los dendrímeros que contenían un núcleo de unión y cuatro, cinco o seis ramas SC8 o SC12 mostraron un mayor derribo. Según estos estudios, los dendrímeros de rama SC8 fueron en general más eficaces que los compuestos de rama SC12.
Con los resultados del cribado de alto rendimiento in vitro e in vivo en la mano, nos preguntamos si ahora podíamos utilizar esa información SAR para diseñar racionalmente dendrímeros con la actividad prevista para validar nuestro enfoque. Se preparó una serie de dendrímeros degradables utilizando dos estrategias: (I) eligiendo poliaminas con cinco o seis IBC; y (II) aumentando las ramas mediante la expansión de la generación de dendrímeros(FIG. 10). Se eligieron dos aminas naturales, la espermidina (5 RIGs) y la espermina (6 RIGs), para aplicar la estrategia I. En cuanto a la estrategia II, se eligieron 1A2 (un RIG), 2A2 y 2A11 (dos RIGs), 3a3 y 3A5 (tres RIGs), y 4A1 y 4A3 (cuatro RIGs) para obtener dendrímeros degradables con múltiples ramificaciones mediante la expansión generacional (FIGS. 10C & 11). Se evaluaron otros 24 dendrímeros degradables(FIG. 10C) para seguir examinando el SAR in vivo . Después de la expansión de la generación, los dendrímeros de mayor generación de 1A2 (un IBC), 2A2 (dos IBC) y 3A3 y 3A5 (tres IBC) con cuatro o seis ramas SC tuvieron una buena administración de ARNip in vivo a los hepatocitos, mientras que los dendrímeros con ocho ramas fueron menos activos. Este proceso transformó los núcleos de amina que resultaron inactivos en el cribado in vitro , para luego diseñar racionalmente dendrímeros de mayor generación que mostraron actividad in vivo .
Ejemplo 6: Evaluación de la toxicidad in vivo de dendrímeros degradables en ratones portadores de tumores de hígado impulsados por MYC
Para identificar dendrímeros degradables con el equilibrio requerido de baja toxicidad y alta potencia requerida para el tratamiento del cáncer de hígado, se eligieron los dendrímeros degradables para evaluar su toxicidad in vivo . Paralelamente, analizamos las LNP lipidoides C12-200 que elegimos como el mejor ejemplo de un sistema no hidrolizable que ya había demostrado ser potente en ratones y primates no humanos (Love et al., 2010). Los lipidoides, como clase, son materiales de referencia en la vanguardia de la investigación clínica (Kanasty et al., 2013; Love et al., 2010; Sahay et al., 2013). Se utilizó un ARNip de control no inmunogénico para evaluar mejor la toxicidad de los propios dendrímeros individuales. Las NPs de dendrímero se formularon en una relación en peso de 25:1 (dendrímero: siCTR), más alta de lo necesario para sondear mejor la toxicidad. Las LNP C12-200 se prepararon utilizando parámetros de formulación idénticos a los comunicados anteriormente (Love et al., 2010). Se caracterizó el tamaño y el potencial zeta de cada NP en tampón PBS. Todos ellos poseían un tamaño similar, de 64-80 nm de diámetro, y sus superficies tenían una carga casi neutra(FIGS. 12A Y 12B). Cada NP formulada se inyectó i.v. en ratones de tipo salvaje a una dosis de 4 mg de siCTR/kg (100 mg de dendrímero/kg o 28 mg de C12-200/kg). Entre las diferentes formas de evaluar la toxicidad in vivo , la pérdida de peso corporal puede utilizarse como un parámetro sencillo e informativo. En los ratones normales, se produjeron cambios mínimos en el peso corporal de las NPs seleccionadas, incluidas las LNPs de control C 12-200. Sin embargo, entre los candidatos, los ratones inyectados con 5A2-SC8 y 6A3-SC12 experimentaron una recuperación más rápida y ganaron peso normalmente después del primer día.
Sobre la base de estos resultados, se eligieron 5A2-SC8 y 6A3-SC12 para una evaluación adicional de su toxicidad in vivo en ratones transgénicos crónicamente enfermos portadores de tumores hepáticos agresivos con inyecciones únicas y múltiples. Se eligió un modelo de cáncer de hígado transgénico inducible por Tet-On MYC bien establecido(FIG. 13A) (Nguyen et al., 2014). Dado que los tumores son más agresivos cuando MYC se sobreexpresa en los primeros momentos del desarrollo, se indujo MYC inmediatamente después del nacimiento (p0), lo que dio lugar a tumores hepáticos de rápido crecimiento. A la edad de 32 días (p32), estos ratones transgénicos enfermos portadores de tumores hepáticos agresivos fueron inyectados con NPs 5A2-SC8 o 6A3-SC12 en dosis de 3 mg de siCTR/kg (75 mg de dendrímero/kg o 21 mg de C12-200/kg). Los ratones que recibieron la inyección 5A2-SC8 perdieron aproximadamente un 5 % de su peso corporal el primer día y volvieron rápidamente a su peso inicial el segundo día, mientras que los ratones que recibieron la inyección 6A3-SC12 seguían perdiendo un 10 % de su peso corporal al tercer día y no pudieron recuperarse(FIG. 12D). Después de múltiples inyecciones, estos ratones murieron siete días antes en comparación con los ratones que no recibieron ningún tratamiento debido a la toxicidad del portador 6A3-SC12 (FIG. 12E). En contraste con el resultado en ratones WT, la inyección de LNP C12-200 a ratones portadores de tumores agresivos perdió >20 % de peso después de un día, a pesar de recibir ~3 veces menos lípidos que los ratones inyectados con 5A2-SC8 (FIG. 12D). Estos datos mostraron que pequeños cambios en la estructura química pueden producir grandes cambios en la toxicidad. También demostró que los ratones portadores de tumores son más sensibles a la intervención que los ratones sanos. A partir de estos resultados, el 5A2-SC8 se reveló como un dendrímero degradable que poseía un equilibrio de baja toxicidad (tolerancia en ratones portadores de tumores hasta 75 mg/kg) y una eficaz eliminación del FVII in vivo (>95 % con 1 mg de siFVII/kg). Además de ser menos tóxicas que los compuestos de referencia, las NPs 5A2-SC8 son más eficaces porque estos dendrímeros reducen la preocupación clínica por la toxicidad que limita la dosis y permiten una ventana terapéutica más amplia.
Ejemplo 7: Potente supresión del crecimiento de Turner del hígado mediante la administración sistémica de un imitador de miARN de Let-7g
Con el fin de evaluar la capacidad de las NPs de dendrímeros degradables para administrar un miARN terapéutico sin causar toxicidad adicional, se utilizó de nuevo el modelo de cáncer de hígado agresivo y transgénico MYC inducido en p0 (Nguyen et al., 2014). Estos ratones desarrollaron cánceres de rápido crecimiento parecidos al hepatoblastoma (HB) pediátrico, un tipo de tumor que comparte muchas de las características moleculares del CHC. La distensión abdominal por efecto de la masa era visible a grandes rasgos después de 20 días, y los tumores crecieron rápidamente. Sin intervención, los ratones morían a los 60 días de nacer. Dada la rapidez y la letalidad de este modelo, las posibilidades de éxito de la terapia son limitadas.
Dado que la 5A2-SC8 presenta un equilibrio entre la baja toxicidad in vivo y la eficacia para silenciar la diana hepatocelular FVII, en primer lugar se examinó si las NPs 5A2-SC8 podían administrar ARNsi en las células tumorales. A la edad de 41 días (p41), los hígados de estos ratones transgénicos están llenos de tumores(FIGS. 14A). En p40, los ratones fueron inyectados por vía intravenosa con NPs 5A2-SC8 con ARNip marcado con Cy5.5 a una dosis de 1 mg de ARNip/kg. 24 horas después de la inyección, las imágenes de fluorescencia mostraron la acumulación de ARNsi mediada por 5A2-SC8 en el hígado canceroso, con sólo una acumulación menor en el bazo y los riñones(FIGS. 14A-14B). Las NPs5A2-SC8 suministraron ARNips en hígados normales y transgénicos incluso si los hígados cancerosos son más grandes que los normales(FIG. 15A).
Para confirmar aún más si las NPs 5A2-SC8 pueden suministrar ARNsi in vivo en las células tumorales, se recogieron tejidos tumorales del hígado y se obtuvieron imágenes 24 horas después de la inyección intravenosa. La tinción con H&E mostró que los tejidos tumorales están densamente llenos de núcleos celulares y muestran un fenotipo canceroso(FIG. 15B). Las imágenes confocales confirmaron que las NPs 5A2-SC8 fueron capaces de suministrar eficazmente el ARNip marcado en las células tumorales(FIG. 14C).
A continuación se evaluó el beneficio terapéutico de la administración de ARN pequeño mediada por 5A2-SC8 en estos ratones transgénicos crónicamente enfermos. Uno de los miARNs más importantes es Let-7, una familia supresora de tumores regulada a la baja en muchos tipos de tumores (Boyerinas et al., 2010; Roush y Slack, 2008). Dado que se sabe que la Let-7g endógena está regulada a la baja en el HB de hígado (Nguyen et al., 2014), se realizaron pruebas para determinar si la administración de un imitador de la Let-7g en este modelo de ratón agresivo, modificado genéticamente, podría inhibir el desarrollo del cáncer de hígado.
Se verificó que las NPs 5A2-SC8 podían permitir la administración de ARNip en este modelo. La administración de una dosis única de siFVII i.v. mostró un potente silenciamiento de la proteína FVII mediante un ensayo en sangre(FIG.
16A) y por qPCR en tejidos hepáticos recolectados(FIG. 16B). Este silenciamiento se logró en p26, que es posterior al inicio del desarrollo del tumor. A continuación, se administró 1 mg/kg de Let-7g en NPs 5A2-SC8 i.v. a ratones portadores de tumores (p26). La expresión deLet-7g se multiplicó por 7 en los tejidos hepáticos 48 horas después de la inyección(FIG. 16C).
A continuación, se inició un régimen terapéutico a partir de p26 mediante la administración semanal de NPs 5A2-SC8 que contenían imitador Let-7g o imitador de Control a 1 mg/kg. En p50, los ratones que recibieron el imitador Let-7g tenían el abdomen más pequeño y una carga tumoral reducida(FIGS. 16D-16F). Let-7g causó la reducción de la circunferencia abdominal, cuantitativa del crecimiento del tumor(FIG. 16E). El efecto sobre el crecimiento del tumor se confirmó mediante imágenes hepáticas ex vivo (FIG. 16F). Lo más importante es que la administración de Let-7g semanalmente de 26 a 61 días no afectó al aumento de peso(FIG. 16G) y una supervivencia significativamente mayor(FIG. 16H). Todos los ratones de control que no recibieron ningún tratamiento y los ratones que recibieron NPs 5A2-SC8 con imitador CTR-murieron alrededor de los 60 días de edad. Las LNP C12-200(imitador Let-7g o de control) indujeron la muerte prematura y requirieron la interrupción del experimento. La administración de Let-7g dentro de las NPs 5A2-SC8 proporcionó un beneficio de supervivencia espectacular, con un ratón que vivió hasta 100 días. Estos resultados mostraron que 5A2-SC8 puede equilibrar una alta eficacia de administración con una baja toxicidad para proporcionar un beneficio terapéutico significativo a los ratones transgénicos crónicamente enfermos mediante la inhibición efectiva del crecimiento del tumor hepático.
Ejemplo 8: Evaluación de diferentes composiciones de lípidos para la administración de ARNip,
Para evaluar qué composición lipídica dentro de las nanopartículas de dendrímero conduce a una mejor administración de ARNsi, se varió la identidad y la concentración de diferentes fosfolípidos y PEG-lípidos. Se utilizaron tres líneas celulares diferentes (HeLa-Luc, A549-Luc y MDA-MB231-Luc). Las células estaban presentes en 10K células por pocillo y una incubación de 24 horas. La lectura se determinó 24 horas después de la transfección. En las nanopartículas se utilizaron DSPC y DOPE como fosfolípidos y PEG-DSPE, Pe G-DMG y PEG-DHD como PEG-lípidos. Las composiciones contienen una relación molar lípido o dendrímero:colesterol:fosfolípido:PEG-lípido de 50:38:10:2. La relación molar entre el lípido/dendrímero y el ARNip fue de 100:1 y se utilizó una dosis de 100 ng. Se utilizaron los ensayos RiboGreen, Cell-titer Fluor y OneGlo para determinar la eficacia de estas composiciones. Los resultados muestran la actividad relativa de la luciferasa en las células HeLa-Luc(FIG. 17A), A549-Luc(FIG. 17B), y MDA-MB231-Luc (FIG. 17C). Las seis formulaciones utilizadas en los estudios incluyen: dendrímero (lípido) colesterol DSPC PEG-DSPE (formulación 1), dendrímero (lípido) colesterol DOPE PEG-DSPE (formulación 2), dendrímero (lípido) colesterol DSPC PEG-DMG (formulación 3), dendrímero (lípido) colesterol DOPE PEG-DMG (formulación 4), dendrímero (lípido) colesterol DSPC PEG-DSPE (formulación 5), y dendrímero (lípido) colesterol DOPE PEG-DHD (formulación 6).
Se realizaron más experimentos para determinar qué fosfolípidos mostraban una mayor administración de moléculas de ARNsi. Se utilizó una línea celular HeLa-Luc con 10K células por pocillo, incubación de 24 horas y lectura 24 horas después de las transfecciones. Las composiciones contenían DOPE o DOPC como fosfolípido con PEG-DHD como PEG-lípido. La relación de lípido (o dendrímero):colesterol:fosfolípido:PEG-lípido fue de 50:38:10:2 en una relación molar con la relación molar de dendrímero (o lípido) a ARNsi de 200:1. Estas composiciones se probaron a una dosis de 50 ng utilizando los ensayos Cell-titer Fluor y OneGlo. Estos resultados se muestran en las FIGS. 18A & 18B.
Ejemplo 9: Evaluación de nanopartículas de dendrímeros para la administración de ARNsg y otros ácidos nucleicos CRISPR
Para evaluar las composiciones para la administración de ácidos nucleicos para la edición de genes CRISPR/Cas, se probó la administración de ARNsg y ARNm. Se crearon líneas celulares que permitieran un rápido cribado de las NPs de dendrímero y Z120 para la administración de ARNsg. Por ejemplo, se establecieron células HeLa (cáncer de cuello de útero) y A549 (cáncer de pulmón) para coexpresar luciferasa y Cas9. Se verificó la selección y el control de calidad. Los ARN guía se diseñaron de acuerdo con los procedimientos anteriormente descritos y se dirigieron al primer exón del gen objetivo deseado. Las dianas que poseían la puntuación más alta, indicando la actividad de corte y la especificidad de la secuencia, se llevaron a cabo para la preparación del ARNsg utilizando los protocolos establecidos. Los oligonucleótidos de ADN se sintetizaron comercialmente, se anillaron, se clonaron mediante digestión Bsbl y se ligaron en un esqueleto de plásmido que contenía Cas9. La transcripción in vitro permitió aislar el ARNsg, que luego pudo ser empaquetado en NPs de dendrímero para su administración. Se diseñó una serie de 5 guías diferentes para la luciferasa. Estas guías se validaron mediante la transfección de sgLuc-Cas9 pADN utilizando reactivos comerciales para seleccionar la mejor secuencia de ARNsg. A continuación, se empaquetaron sgLuc en NPs de dendrímero y se evaluó la administración en células HeLa-Luc-Cas9 para la administración de ARNsg. Tras un número determinado de horas de exposición, se midió la luciferasa y la viabilidad en comparación con las células no tratadas utilizando One Glo Tox (Promega). En un experimento típico, se sembraron 10K células por pozo, seguido de una incubación de 24 horas, la adición de nanopartículas de dendrímero que contenían sgLuc, y la lectura a las 24-48 horas después de la transfección. Estas composiciones contenían combinaciones de dendrímeros, DSPC o DOPE, colesterol y PEG-lípido. Además, las composiciones contenían varias concentraciones de MgCl2. Las proporciones molares de lípido (o dendrímero):colesterol:PEG-lípido fueron 50:38,5:0,5 con una relación molar de lípido y ácido nucleico (ARNsg) de 200:1 y una dosis de 50 ng. De nuevo, se utilizaron los ensayos Cell-titer Fluor y OneGlo para obtener los resultados. Los resultados sin fosfolípido se muestran en la FIG. 19. Se realizaron estudios similares con la presencia de fosfolípidos. En estas composiciones se utilizó el fosfolípido DSPC en las formulaciones. Utilizando la misma relación que la anterior para las composiciones que no contenían un fosfolípido, las composiciones que contenían fosfolípidos tenían una relación molar de 50:38,5:10:0,5 (lípido/dendrímero:colesterol:fosfolípido:PEG-lípido) utilizando la misma cantidad de dosificación. Estas composiciones se probaron con RiboGreen, Cell-titer Fluor y OneGlo en dos periodos de tiempo, 24 horas y 72 horas. Los datos obtenidos a las 24 horas se muestran en la FIG.20A y 72 horas se muestra en la FIG. 20B.
Ejemplo 10: Evaluación de nanopartículas de dendrímeros para la administración de ARNm
De manera similar, a los estudios realizados con ARNsi, se probó la administración de moléculas de ARNm con los dendrímeros descritos en el presente documento y Z120. Se utilizó una línea celular IGROV1 a una concentración de 4K células por pocillo, incubación de 24 horas y lectura a las 24 y 48 horas post transfección. Estas composiciones contenían DSPC, DOPE o ningún fosfolípido y PEG-DHD como PEG-lípido. Las relaciones molares de lípido (o dendrímero):colesterol:fosfolípido:PEG-lípido fueron 50:38,5:0(10):2 con una relación en peso de dendrímero y ácido nucleico (ARNm) de 5, 10, 20, 30 o 40 a 1 y dos dosis diferentes: una dosis de 50 ng y otra de 100 ng. Para obtener los resultados se utilizaron los ensayos Cell-titer Fluor y OneGlo. Estos resultados se muestran en la FIG. 21A (24 horas) y FIG. 21B (48 horas). Además, la administración de ARNm mCherry en se visualizó en la FIG. 22 utilizando una composición de nanopartículas con una relación 20:1 de N/P y DSPC como fosfolípido y PEG-DHD como PEG-lípido.
Referencias
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Patente estadounidense n° 5.596.091
Patente estadounidense n° 5.597.696
Patente estadounidense n° 5.599.923
Patente estadounidense n° 5.599.928
Patente estadounidense n° 5.608.046
Patente estadounidense n° 5.614.617
Patente estadounidense n° 5.645.985
Patente estadounidense n° 5.681.941
Patente de EE.UU. n° 5.688.941,
Patente estadounidense n° 5.750.692
Patente estadounidense n° 5.763.588
Patente estadounidense n° 5.820.873
Patente estadounidense n° 5.830.653
Patente estadounidense n° 6.005.096
Patente estadounidense n° 6.268.490
Patente estadounidense n° 6.506.559
Patente estadounidense n° 6.525.191
Patente estadounidense n° 6.573.099
Patente estadounidense n° 6.670.461
Patente estadounidense n° 6.673.611
Patente estadounidense n° 6.770.748
Patente estadounidense n° 6.794.499
Patente estadounidense n° 7.034.133
Patente estadounidense n° 7.053.207
Patente estadounidense n° 7.399.845
Patente estadounidense n° 8.450.298
Solicitud de patente de EE.UU. n° 12/129.154
Solicitud de patente de EE.UU. n° 60/989.574
Solicitud de patente de EE.UU. n° 61/026.995
Solicitud de patente de EE.UU. n° 61/026.998
Solicitud de patente de EE.UU. n° 61/056.564
Solicitud de patente de EE.UU. n° 61/086.231
Solicitud de patente de EE.UU. n° 61/097.787
Solicitud de patente de EE.UU. n° 61/099.844 Publicación de la patente estadounidense n° 2004/0171570 Publicación de la patente estadounidense n° 2002/0168707 Publicación de la patente estadounidense n° 2003/0051263 Publicación de la patente estadounidense n° 2003/0055020 Publicación de la patente estadounidense n° 2003/0159161 Publicación de la patente estadounidense n° 2004/0019001 Publicación de la patente estadounidense n° 2004/0064842 Publicación de la patente estadounidense n° 2004/0171570 Publicación de la patente estadounidense n° 2004/0265839 Publicación de la patente estadounidense n° 2005/0130923 Publicación de la patente estadounidense n° 2007/0287831 Publicación de la patente estadounidense n° 2008/0039618 Solicitud PCT No PCT/US2008/064591
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Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un dendrímero de la fórmula:
Grupo de núcleo-(unidad de repetición)n-terminación (I)
en la que el núcleo está unido a la unidad de repetición mediante la eliminación de uno o más átomos de hidrógeno del núcleo y la sustitución del átomo de hidrógeno por la unidad de repetición y en la que:
el núcleo tiene la fórmula:
Xw, vFt|
( i i )
en la que:
X1 es amino o alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), heterocicloalquilo(c<i2), heteroarilo(c<i2), o una versión sustituida de los mismos;
R1 es amino, hidroxi, o mercapto, o alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y
a es 1,2, 3, 4, 5 o 6; o
el núcleo tiene la fórmula:
Figure imgf000058_0001
en la que:
X2 es N(R5)y;
R5 es hidrógeno, alquilo(c<i8), o alquilo sustituido(c<i8); y
y es 0, 1 o 2, siempre que la suma de y y z sea 3;
R2 es amino, hidroxi, o mercapto, o alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
b es 1,2, 3, 4, 5 o 6; y
z es 1,2, 3; siempre que la suma de z e y sea 3; o
el núcleo tiene la fórmula:
R 3 NaX 3 H ; R4 (IV )
en la que:
X3 es -NR6-, donde R6 es hidrógeno, alquilo(c<8), o alquilo sustituido(c<i8), -O-, o alquilaminodiilo(c<8), alcoxidio(c<8), arenodiilo(c<8), heteroarenodiilo(c<8), heterocicloalcanodiilo(c<8), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
R3 y R4 son cada uno independientemente amino, hidroxi, o mercapto, o alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; o un grupo de la fórmula: -(CH2CH2 N)e(Rc)Rd;
en la que:
e es 1, 2 o 3;
Rc y Rd son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo(c<6), o alquilo (c<6) sustituido;
c y d son cada uno independientemente 1,2, 3, 4, 5 o 6; o
el núcleo es alquilamina(c<i8)), dialquilamina(c<36), heterocicloalcano(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
en la que la unidad de repetición comprende un diacilo degradable y un enlazador;
el grupo diacílico degradable tiene la fórmula:
Figure imgf000059_0001
en la que:
Ai y A2 son cada uno independientemente -O- o -NRa-, donde:
Ra es hidrógeno, alquilo(c<6), o alquilo (c<6) sustituido;
Y3 es alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; o un grupo de la fórmula:
Figure imgf000059_0002
en la que:
X3 y X4 son alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
Y5 es un enlace covalente, alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y
R9 es alquilo(c<8) o alquilo (c<8) sustituido;
el grupo enlazador tiene la fórmula
Figure imgf000059_0003
en la que:
Y 1 es alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y
en la que cuando la unidad de repetición comprende un grupo enlazador, entonces el grupo enlazador está unido a un grupo diacílico degradable tanto en el átomo de nitrógeno como en el átomo de azufre del grupo enlazador, donde el primer grupo de la unidad de repetición es un grupo diacílico degradable, donde para cada grupo enlazador, el siguiente grupo comprende dos grupos diacílicos degradables unidos al átomo de nitrógeno del grupo enlazador; y donde n es el número de grupos enlazadores presentes en la unidad de repetición; y
el grupo de terminación tiene la fórmula
Figure imgf000059_0004
en la que:
Y4 es un alcanodiilo(c<i8) o un alcanodiilo(c<i8) en la que uno o más de los átomos de hidrógeno del alcanodiilo(c<i8) han sido sustituidos por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -SH, -OCH3 , -OCH2CH3 , -SCH3 , o -OC(O)CH3;
R10 es hidrógeno, carboxi, hidroxi, o
arilo(c<i2), alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), N-heterocicloalquilO(c<i2), -C(O)N(R11)-alcanodiilo(c<6)-heterocicloalquilo(c<i2), -C(O)-alquilamino(c<i2), -C(O)-dialquilamino(c<i2), -C(O)-N-heterocicloalquilo(c<i2), em la que:
R11 es hidrógeno, alquilo(c<6), o alquilo (c<6) sustituido;
en la que el último diacilo degradable de una cadena de unidades repetitivas está unido al grupo de terminación; y n es 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
2. El dendrímero de la reivindicación 1, en la que el dendrímero tiene la fórmula:
Grupo de núcleo-(unidad de repetición)n-terminación (I)
en la que el núcleo está unido a la unidad de repetición mediante la eliminación de uno o más átomos de hidrógeno del núcleo y la sustitución del átomo de hidrógeno por la unidad de repetición y en la que:
el núcleo tiene la fórmula:
Figure imgf000060_0001
en la que:
X2 es N(R5)y;
R5 es hidrógeno o alquilo(c<i8), o alquilo sustituido(c<i8); y
y es 0, 1 o 2, siempre que la suma de y y z sea 3;
R2 es amino, hidroxi, o mercapto, o alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
b es 1,2, 3, 4, 5 o 6; y
z es 1,2, 3; siempre que la suma de z e y sea 3;
en la que la unidad de repetición comprende un diacilo degradable y un enlazador;
el grupo diacílico degradable tiene la fórmula:
Figure imgf000060_0002
en la que:
A 1 y A2 son cada uno independientemente -O- o -NRa-, donde:
Ra es hidrógeno, alquilo(c<6), o alquilo (c<6) sustituido;
Y3 es alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; o un grupo de la fórmula:
Figure imgf000060_0003
en la que:
X3 y X4 son alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
Y5 es un enlace covalente, alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y
R9 es alquilo(c<8) o alquilo (c<8) sustituido;
el grupo enlazador tiene la fórmula
Figure imgf000060_0004
en la que:
Y1 es alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y
en la que cuando la unidad de repetición comprende un grupo enlazador, entonces el grupo enlazador está unido a un grupo diacílico degradable tanto en el átomo de nitrógeno como en el átomo de azufre del grupo enlazador, donde el primer grupo de la unidad de repetición es un grupo diacílico degradable, donde para cada grupo enlazador, el siguiente grupo comprende dos grupos diacílicos degradables unidos al átomo de nitrógeno del grupo enlazador; y donde n es el número de grupos enlazadores presentes en la unidad de repetición; y
el grupo de terminación, en la que el grupo de terminación tiene la fórmula:
Figure imgf000061_0001
en la que:
Y4 es un alcanodiilo(c<i8) o un alcanodiilo(c<i8) en la que uno o más de los átomos de hidrógeno del alcanodiilo(c<i8) han sido sustituidos por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -SH, -OCH3 , -OCH2CH3 , -SCH3 , o -OC(O)CH3 ; R10 es hidrógeno, carboxi, hidroxi, o
arilo(c<i2), alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), N-heterocicloalquilO(c<i2), -C(O)N(Rn)-alcanodiilo(c<6)-heterocicloalquilo(c<i2), -C(O)-alquilamino(c<i2), -C(O)-dialquilamino(c<i2), -C(O)-N-heterocicloalquilo(c<i2), em la que:
en la que el último diacilo degradable de una cadena de unidades repetitivas está unido al grupo de terminación; y
n es 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
3. El dendrímero de la reivindicación 1, en la que el dendrímero tiene la fórmula:
Grupo de núcleo-(unidad de repetición)n-terminación (I)
en la que el núcleo está unido a la unidad de repetición mediante la eliminación de uno o más átomos de hidrógeno del núcleo y la sustitución del átomo de hidrógeno por la unidad de repetición y en la que:
el núcleo tiene la fórmula:
Figure imgf000061_0002
en la que:
X3 es -NR6-, donde R6 es hidrógeno, alquilo(c<i8), o alquilo(c<i8) sustituido, -O-, o alquilaminodiilo(c<8), alcoxidio(c<8), arenodiilo(c<8), heteroarenodiilo(c<8), heterocicloalcanodiilo(c<8), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
R3 y R4 son cada uno independientemente amino, hidroxi, o mercapto, o alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; o un grupo de la fórmula: -(CH2CH2N)e(Rc)Rd; en la que:
e es 1, 2 o 3;
Rc y Rd son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo(c<6), o alquilo (c<6) sustituido;
c y d son cada uno independientemente 1,2, 3, 4, 5 o 6; y
en la que la unidad de repetición comprende un diacilo degradable y un enlazador;
el grupo diacílico degradable tiene la fórmula:
Figure imgf000061_0003
en la que:
A 1 y A2 son cada uno independientemente -O- o -NRa-, donde:
Ra es hidrógeno, alquilo(c<6), o alquilo (c<6) sustituido;
Y3 es alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; o un grupo de la fórmula:
Figure imgf000061_0004
en la que:
X3 y X4 son alcanodiilO(c<i2), alquenodiilO(c<i2), arenodiilO(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
Y5 es un enlace covalente, alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y
R9 es alquilo(c<8) o alquilo (c<8) sustituido;
el grupo enlazador tiene la fórmula
Figure imgf000062_0001
en la que:
Y1 es alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; y
en la que cuando la unidad de repetición comprende un grupo enlazador, entonces el grupo enlazador está unido a un grupo diacílico degradable tanto en el átomo de nitrógeno como en el átomo de azufre del grupo enlazador, donde el primer grupo de la unidad de repetición es un grupo diacílico degradable, donde para cada grupo enlazador, el siguiente grupo comprende dos grupos diacílicos degradables unidos al átomo de nitrógeno del grupo enlazador; y donde n es el número de grupos enlazadores presentes en la unidad de repetición; y
el grupo de terminación, en la que el grupo de terminación tiene la fórmula:
Figure imgf000062_0002
en la que:
Y4 es un alcanodiilo(c<i8) o un alcanodiilo(c<i8) en la que uno o más de los átomos de hidrógeno del alcanodiilo(c<i8) han sido sustituidos por -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -SH, -OCH3 , -OCH2CH3 , -SCH3 , o -OC(O)CH3; R10 es hidrógeno, carboxi, hidroxi, o
arilo(c<i2), alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), N-heterocicloalquilO(c<i2), -C(O)N(Rn)-alcanodiilo(c<6)-heterocicloalquilo(c<i2), -C(O)-alquilamino(c<i2), -C(O)-dialquilamino(c<i2), -C(O)-N-heterocicloalquilo(c<i2), en la que:
R11 es hidrógeno, alquilo(c<6), o alquilo (c<6) sustituido;
en la que el último diacilo degradable de una cadena de unidades repetitivas está unido al grupo de terminación; y
n es 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
4. El dendrímero según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el grupo de terminación se define además por la fórmula:
Figure imgf000062_0003
en la que:
Y4 es alcanodiilo(c<i8); y
R10 es hidrógeno.
5. El dendrímero según cualquiera de las reivindicaciones 1,2 y 4, en la que el núcleo se define además por la fórmula:
Figure imgf000062_0004
en la que:
X2 es N(R5)y;
R5 es hidrógeno o alquilO(c<i8), o alquilo sustituidO(c<i8); y
y es 0, 1 o 2, siempre que la suma de y y z sea 3;
R2 es amino, hidroxi, o mercapto, o alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
b es 1,2, 3, 4, 5 o 6; y
z es 1,2, 3; siempre que la suma de z e y sea 3.
6. El dendrímero de la reivindicación 5, en la que X2 es N o NR5 , en la que R5 es hidrógeno o alquilo(c<8) como R5 es hidrógeno o metilo, z es 3 o 2,R2 es amino, alquilamino(c<i2) o alquilamino(C<12 ) sustituido como metilamino, o dialquilamino(c<i2) o dialquilamino(C<12 ) sustituido como dimetilamino, y/o b es 1,2, 3, o 4.
7. El dendrímero según cualquiera de las reivindicaciones 5 y 6, en la que el núcleo se define además como:
Figure imgf000063_0001
o en la que el núcleo se define además como:
Figure imgf000063_0002
8. El dendrímero según cualquiera de las reivindicaciones 1,3 y 4, en la que el núcleo se define además como:
Figure imgf000063_0003
en la que:
X3 es -NR6-, donde R6 es hidrógeno, alquilo(c<i8), o alquilo(c<i8) sustituido, -O-, o alquilaminodiilo(c<8), alcoxidio(c<8), arenodiilo(c<8), heteroarenodiilo(c<8), heterocicloalcanodiilo(c<8), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
R3 y R4 son cada uno independientemente amino, hidroxi, o mercapto, o alquilamino(c<i2), dialquilamino(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; o un grupo de la fórmula: -(CH2CH2N)e(Rc)Rd; en la que:
e es 1, 2 o 3;
Rc y Rd son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo(c<6), o alquilo (c<6) sustituido;
c y d son cada uno independientemente 1,2, 3, 4, 5 o 6.
9. El dendrímero de la reivindicación 8, en la que X3 es alquilaminodiilo(c<8) o alquilaminodiilo(c<8 ) sustituido, como -NHCH2CH2NH- o -NHCH2CH2NHCH2CH2NH-, X3 es heterocidoalcanodiNo(c<8 ) o heteroddoalcanodiilo(c<8 ) sustituido, como NN-piperazindiilo, R3 es amino, alquilamino(c<12 ) o alquilamino(c<12 ) sustituido como metilamino, y/o R4 es amino, alquilamino(c<i2) o alquilamino(c<12 ) sustituido como metilamino, -(CH2CH2N)e(Rc)Rd: donde:
e es 1, 2 o 3;
Rc y Rd son cada uno independientemente hidrógeno, alquilo(c<6), o alquilo (c<6) sustituido.
10. El dendrímero según cualquiera de las reivindicaciones 8 y 9, en la que el núcleo se define además como:
Figure imgf000064_0004
o en la que el núcleo se define además como:
Figure imgf000064_0001
11. El dendrímero según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -10, en la que Y3 es:
Figure imgf000064_0002
en la que:
X3 y X4 son alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
Y5 es un enlace covalente, alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos; o
Y3 es:
Figure imgf000064_0003
en la que:
X3 y X4 son alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
Y5 es un enlace covalente, alcanodiilo(c<i2), alquenodiilo(c<i2), arenodiilo(c<i2), o una versión sustituida de cualquiera de estos grupos;
Ai es -O- o -NH-,A 2 es -O- o -NH-, Rg es alquilo^) como el metilo; y/o n es 1,2 o 3.
12. Una composición que comprende:
(A) un dendrímero según cualquiera de las reivindicaciones 1-11; y
(B) un ácido nucleico.
13. La composición de la reivindicación 12, en la que el ácido nucleico es un ARNip, un miARN, un pri-miARN, un ARN mensajero (ARNm), un ácido nucleico relacionado con las repeticiones palindrómicas cortas regularmente espaciadas (CRISPR), un Ar N guía único (ARNsg), un CRISPR-ARN (ARNcr), un ARNcr trans-activador (traARNcr) un ADN plasmídico (ADNp), un ARN de transferencia (ARNt), un oligonucleótido antisentido (ASO), un ARN guía, un ADN de doble cadena (ADNbc), un ADN de cadena simple (ADNmc), un ARN de cadena simple (ARNs) o un ARN de doble cadena (ARNd), como un ARNsi, un ARNt o un ácido nucleico que puede utilizarse en un proceso CRISPR; el dendrímero y el ácido nucleico están presentes en una relación en peso de aproximadamente 1001 a aproximadamente 1:5; y/o la composición comprende además uno o más lípidos auxiliares, como un esteroide, un derivado de esteroide, un lípido p Eg o un fosfolípido.
14. Una composición farmacéutica que comprende:
(A) una composición según cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13; y
(B) un portador farmacéuticamente aceptable.
15. Un compuesto o composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-14 para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno, como el cáncer, en un paciente que comprende administrar al paciente que lo necesita una cantidad farmacéuticamente eficaz de una composición o una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1-14.
16. El dendrímero según la reivindicación 1, en la que el núcleo se define además como:
Figure imgf000065_0001
o en la que el núcleo se define además como:
o
Figure imgf000066_0001
Ai y A 2 son -O-, Y 3 es -CH 2 CH 2 -, R 9 es metilo;
el grupo de terminación es
Figure imgf000066_0002
y n = 0; 1
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
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