KR102641298B1 - 지질양이온성 덴드리머 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

양이온성 그룹 및 지용성 그룹을 갖는 모듈 덴드리머가 여기에 제공된다. 일부 양태에서, 여기에 제공된 덴드리머는 핵산 및 하나 이상의 헬퍼 지질 부형제를 함유하는 조성물로 제형화될 수 있다. 일부 양태에서, 이들 조성물은 질환 또는 장애를 치료적 핵산으로 치료하는 데 사용될 수도 있다.

Description

지질양이온성 덴드리머 및 이의 용도
본원은 2015년 9월 14일자로 출원된 미국 가출원 제 62/218,412호의 우선권의 이익을 주장하며, 그 전체 내용은 여기에 참고로 포함된다.
본 발명은 일반적으로 덴드리머 분야에 관한 것이다. 특히, 핵산을 포함하는 덴드리머 나노입자 조성물에 관한 것이다. 보다 특별하게, 본 발명은 핵산 전달용 덴드리머 나노입자 조성물에 관한 것이다. 보다 특별하게, 약물 또는 다른 부형제의 전달용 나노입자 조성물에 관한 것이다.
RNAi 또는 다른 핵산 약제의 발견 및 치료적 잠재력에 대한 인식 이후, 효과적인 전달 담체에 대한 지속적인 연구가 있었다(Whitehead et al., 2009; Kanasty et al., 2013; Akinc et al., 2008; Davis et al., 2010; Love et al., 2010; Siegwart et al., 2011; Jayaraman et al., 2012). 건강한 간에 소형 RNA(small RNA)의 전달 효능에 관해서는 진전이 있었지만, 종양에 대한 높은 효능 및 낮은 정상 세포 간독성의 임상적으로 요구되는 조합은 현재 기존의 전달 비히클(vehicle)에 의해 충족되지 못하고 있다. 불행하게도, 간세포 암종(hepatocellular carcinoma: HCC) 치료용 저분자 의약품의 모두 5개의 제3단계 인간 임상 실험(Phase III human clinical trial)은 지난 4년간, 부분적으로는, 쇠약해지는 후기 간 기능 장애가 약물 독성을 증폭시키기 때문에 모두 실패했다(Roberts, L.R., 2008; Scudellari, M., 2014). 마이크로 RNA(miRNA)는, 세포 분화, 증식 및 생존에 관여하는 여러 경로를 동시에 표적하여 종양 억제자로 기능할 수 있기 때문에 유망한 대안 전략을 나타내지만, 이러한 치료적 약제는 담체가 효과적일 것을 요구한다(Ventura and Jacks, 2009; Kasinski and Slack, 2011; Ling et al., 2013; Cheng et al., 2015). 약물 담체의 효능 대 독성의 균형은, 특히 담체 자신의 독성이 상기 소형 RNA 치료의 치료적 효과를 약화시킬 수 있는 간암 전후 사정에서 유용한 기준이다.
낮은 독성 및 높은 효능의 균형을 달성하기 위해, 전달 담체의 구조적 다양성 및 분자 크기를 확장시킴에 의한 화학적 구조의 영향은 치료적으로 효과적인 균형을 달성하는 데 유용하다. 덴드리머는 중심 코어로부터 반경 방향으로 방사되는 다수의 완전히 분지된 단위체로 구성된 단분산(monodisperse) 거대 분자이다. 따라서, 덴드리머는 저분자와 같은 높은 수준의 분자 균일성과, 다분산(polydisperse) 중합체와 같은 화학적 조정을 위한 넓은 이론적 공간을 가진다. 이러한 고유한 특성은 덴드리머가, 다양한 생의학적 적용에서(Stiriba et al., 2002; Lee et al., 2005; Wu et al., 2015), 특유의 성질을 가질 수 있게 한다(Murat and Grest, 1996; Percec et al., 2010; Duncan and Izzo, 2005). 유전자 전달에서, 대부분의 연구는 추가적인 화학적 변형을 위해 제한된 수의 상업적 덴드리머를 사용했다(Kang et al., 2005; Taratula et al., 2009; Khan et al., 2014). 따라서, 덴드리머 적용의 확장은 크기, 화학적 성질, 토폴로지(topology), 및 궁극적으로는 화학적 합성을 통한 덴드리머의 물리적 성질을 쉽게 조정하는 능력에 의존한다. 이와 같이, 핵산 또는 다른 약물의 담체로서 작용할 수 있는 새로운 덴드리머의 개발은 임상적으로 유용하다.
하기의 참고 문헌은 여기에 제시된 것에 보충적인 예시적인 절차 또는 다른 세부 사항을 제공하는 한, 여기에 참고 문헌으로 구체적으로 포함된다.
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일부 양태에서, 본 개시는,
덴드리머는 화학식(I)을 갖고:
코어-(반복 단위)n-말단 그룹 (I)
여기서,
상기 코어는, 하나 이상의 수소 원자를 상기 코어로부터 제거하고 상기 원자를 상기 반복 단위로 대체함으로써 상기 반복 단위에 연결되고, 여기서,
상기 코어는 하기 화학식(II)를 갖고:
(II)
여기서,
X1은 아미노, 또는 알킬아미노(C≤12), 디알킬아미노(C≤12), 헤테로사이클로알킬(C≤12), 헤테로아릴(C≤12), 또는 이들의 치환된 버전이고;
R1은 아미노, 하이드록시, 또는 머캅토, 또는 알킬아미노(C≤12), 디알킬아미노(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이며;
a는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이거나; 또는
상기 코어는 하기 화학식(III)을 갖고:
(III)
여기서,
X2는 N(R5)y이고;
R5는 수소, 알킬(C≤18), 또는 치환된 알킬(C≤18)이며;
y는 0, 1, 또는 2이고, 단, y와 z의 합은 3이고;
R2는 아미노, 하이드록시, 또는 머캅토, 또는 알킬아미노(C≤12), 디알킬아미노(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이고;
b는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이며;
z는 1, 2, 3이며; 단, z와 y의 합은 3이거나; 또는
상기 코어는 하기 화학식(IV)를 갖고:
(IV)
여기서,
X3는 -NR6-이고, 여기서 R6는 수소, 알킬(C≤8), 또는 치환된 알킬(C≤8), -O-, 또는 알킬아미노디일(C≤8), 알콕시디일(C≤8), 아렌디일(C≤8), 헤테로아렌디일(C≤8), 헤테로사이클로알칸디일(C≤8), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 아미노, 하이드록시, 또는 머캅토, 또는 알킬아미노(C≤12), 디알킬아미노(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전; 또는 -(CH2CH2N)e(Rc)Rd의 화학식을 갖는 그룹이고;
여기서,
e는 1, 2, 또는 3이고;
Rc 및 Rd는 각각 독립적으로 수소, 알킬(C≤6), 또는 치환된 알킬(C≤6)이고;
c 및 d는 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이거나; 또는
상기 코어는 알킬아민(C≤18), 디알킬아민(C≤36), 헤테로사이클로알칸(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이고;
여기서 상기 반복 단위는 분해성 디아실 및 링커를 포함하고;
상기 분해성 디아실 그룹은 하기 화학식(VII)을 갖고:
(VII)
여기서,
A1 및 A2는 각각 독립적으로 -O- 또는 -NRa-이고,
여기서,
Ra는 수소, 알킬(C≤6), 또는 치환된 알킬(C≤6)이고;
Y3는 알칸디일(C≤12), 알켄디일(C≤12), 아렌디일(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전; 또는 하기 화학식을 갖는 그룹이고:
또는
여기서,
X3 및 X4는 알칸디일(C≤12), 알켄디일(C≤12), 아렌디일(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이고;
Y5는 공유 결합, 알칸디일(C≤12), 알켄디일(C≤12), 아렌디일(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이며;
R9는 알킬(C≤8) 또는 치환된 알킬(C≤8)이고;
상기 링커 그룹은 하기 화학식(VI)을 갖고:
(VI)
여기서,
Y1은 알칸디일(C≤12), 알켄디일(C≤12), 아렌디일(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이며;
여기서 상기 반복 단위가 링커 그룹을 포함할 때, 그 다음에 상기 링커 그룹은 상기 링커 그룹의 질소 및 황 원자 모두에 분해성 디아실 그룹이 부착되고, 여기서 상기 반복 단위의 제1 그룹은 분해성 디아실 그룹이고, 여기서 각 링커 그룹에 대하여, 다음 그룹은 상기 링커 그룹의 질소 원자에 부착된 2개의 분해성 디아실 그룹을 포함하고; 여기서, n은 상기 반복 단위에 존재하는 링커 그룹의 수이며;
상기 말단 그룹은 하기 화학식(VIII)을 갖고:
(VIII)
여기서,
Y4는 알칸디일(C≤18), 또는 알칸디일(C≤18) 상의 하나 이상의 수소 원자가 -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -SCH3, 또는 -OC(O)CH3로 대체된 알칸디일(C≤18)이고;
R10은 수소, 카르복시, 하이드록시, 또는
아릴(C≤12), 알킬아미노(C≤12), 디알킬아미노(C≤12), N-헤테로사이클로알킬(C≤12), -C(O)N(R11)-알칸디일(C≤6)-헤테로사이클로알킬(C≤12), -C(O)-알킬아미노(C≤12), -C(O)-디알킬아미노(C≤12), -C(O)-N-헤테로사이클로알킬(C≤12)이고, 여기서,
R11은 수소, 알킬(C≤6), 또는 치환된 알킬(C≤6)이고;
여기서 상기 사슬의 마지막 분해성 디아실은 말단 그룹에 부착되고;
n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6인,
덴드리머 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다. 일부 양태에서, 덴드리머의 구조가 하기와 같이 추가로 정의되는:
상기 코어는 하기 화학식(II)를 갖고:
(II)
여기서,
X1은 아미노 또는 알킬아미노(C≤12), 디알킬아미노(C≤12), 헤테로사이클로알킬(C≤12), 헤테로아릴(C≤12), 또는 이의 치환된 버전이고;
R1은 아미노, 하이드록시, 또는 머캅토, 또는 알킬아미노(C≤12), 디알킬아미노(C≤12), 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이며;
a는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이고;
여기서 상기 반복 단위는 분해성 디아실 및 링커를 포함하고;
상기 분해성 디아실 그룹은 하기 화학식(VII)을 갖고:
(VII)
여기서,
A1 및 A2는 각각 독립적으로 -O- 또는 -NRa-이고,
여기서,
Ra은 수소, 알킬(C≤6), 또는 치환된 알킬(C≤6)이고;
Y3는 알칸디일(C≤12), 알켄디일(C≤12), 아렌디일(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전; 또는 하기 화학식의 그룹이고:
또는
여기서,
X3 및 X4는 알칸디일(C≤12), 알켄디일(C≤12), 아렌디일(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이고;
Y5는 공유 결합, 알칸디일(C≤12), 알켄디일(C≤12), 아렌디일(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이며;
R9은 알킬(C≤8) 또는 치환된 알킬(C≤8)이고;
상기 링커 그룹은 하기 화학식(VI)을 갖고:
(VI)
여기서,
Y1은 알칸디일(C≤12), 알켄디일(C≤12), 아렌디일(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이며;
여기서 상기 반복 단위가 링커 그룹을 포함할 때, 그 다음에 상기 링커 그룹은 상기 링커 그룹의 질소 및 황 원자 모두에 분해성 디아실 그룹이 부착되고, 여기서 상기 반복 단위의 제1 그룹은 분해성 디아실 그룹이고, 여기서 각 링커 그룹에 대하여, 다음 그룹은 상기 링커 그룹의 질소 원자에 부착된 2개의 분해성 디아실 그룹을 포함하고; 여기서 n은 상기 반복 단위에 존재하는 링커 그룹의 수이며;
상기 말단 그룹, 여기서 상기 말단 그룹은 하기 화학식(VIII)을 갖고:
(VIII)
여기서,
Y4는 알칸디일(C≤18), 또는 알칸디일(C≤18) 상의 하나 이상의 수소 원자가 -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -SCH3, 또는 -OC(O)CH3로 대체된 알칸디일(C≤18)이고;
R10은 수소, 카르복시, 하이드록시, 또는
아릴(C≤12), 알킬아미노(C≤12), 디알킬아미노(C≤12), N-헤테로사이클로알킬(C≤12), -C(O)N(R11)-알칸디일(C≤6)-헤테로사이클로알킬(C≤12), -C(O)-알킬아미노(C≤12), -C(O)-디알킬아미노(C≤12), -C(O)-N-헤테로사이클로알킬(C≤12)이고, 여기서,
R11은 수소, 알킬(C≤6), 또는 치환된 알킬(C≤6)이고;
여기서 상기 사슬의 마지막 분해성 디아실은 말단 그룹에 부착되고;
n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6인,
덴드리머 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 일부 양태에서, 덴드리머는 하기 화학식(I)을 갖고:
코어-(반복 단위)n-말단 그룹 (I)
여기서,
상기 코어는, 하나 이상의 수소 원자를 상기 코어로부터 제거하고 상기 원자를 상기 반복 단위로 대체함으로써 상기 반복 단위에 연결되고, 여기서,
상기 코어는 하기 화학식(III)을 갖고:
(III)
여기서,
X2는 N(R5)y이고;
R5는 수소, 알킬(C≤18), 또는 치환된 알킬(C≤18)이며;
y는 0, 1, 또는 2이고, 단, y와 z의 합은 3이고;
R2는 아미노, 하이드록시, 또는 머캅토, 또는 알킬아미노(C≤12), 디알킬아미노(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이고;
b는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이며;
z는 1, 2, 3이며; 단, z와 y의 합은 3이고;
여기서 상기 반복 단위는 분해성 디아실 및 링커를 포함하고;
상기 분해성 디아실 그룹은 하기 화학식(VII)을 갖고:
(VII)
여기서,
A1 및 A2는 각각 독립적으로 -O- 또는 -NRa-이고,
여기서,
Ra는 수소, 알킬(C≤6), 또는 치환된 알킬(C≤6)이고;
Y3는 알칸디일(C≤12), 알켄디일(C≤12), 아렌디일(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전; 또는 하기 화학식을 갖는 그룹이고:
또는
여기서,
X3 및 X4는 알칸디일(C≤12), 알켄디일(C≤12), 아렌디일(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이고;
Y5는 공유 결합, 알칸디일(C≤12), 알켄디일(C≤12), 아렌디일(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이며;
R9는 알킬(C≤8) 또는 치환된 알킬(C≤8)이고;
상기 링커 그룹은 하기 화학식(VI)을 갖고:
(VI)
여기서,
Y1은 알칸디일(C≤12), 알켄디일(C≤12), 아렌디일(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이며;
여기서 상기 반복 단위가 링커 그룹을 포함할 때, 그 다음에 상기 링커 그룹은 상기 링커 그룹의 질소 및 황 원자 모두에 분해성 디아실 그룹이 부착되고, 여기서 상기 반복 단위의 제1 그룹은 분해성 디아실 그룹이고, 여기서 각 링커 그룹에 대하여, 다음 그룹은 상기 링커 그룹의 질소 원자에 부착된 2개의 분해성 디아실 그룹을 포함하고; 여기서, n은 상기 반복 단위에 존재하는 링커 그룹의 수이며;
상기 말단 그룹, 여기서 상기 말단 그룹은 하기 화학식(VIII)을 갖고:
(VIII)
여기서,
Y4는 알칸디일(C≤18), 또는 알칸디일(C≤18) 상의 하나 이상의 수소 원자가 -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -SCH3, 또는 -OC(O)CH3로 대체된 알칸디일(C≤18)이고;
R10은 수소, 카르복시, 하이드록시, 또는
아릴(C≤12), 알킬아미노(C≤12), 디알킬아미노(C≤12), N-헤테로사이클로알킬(C≤12), -C(O)N(R11)-알칸디일(C≤6)-헤테로사이클로알킬(C≤12), -C(O)-알킬아미노(C≤12), -C(O)-디알킬아미노(C≤12), -C(O)-N-헤테로사이클로알킬(C≤12)이고,
여기서 상기 사슬의 마지막 분해성 디아실은 말단 그룹에 부착되고;
n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6인,
덴드리머 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 다른 양태에서, 덴드리머는 하기 화학식(I)을 갖고:
코어-(반복 단위)n-말단 그룹 (I)
여기서,
상기 코어는, 하나 이상의 수소 원자를 상기 코어로부터 제거하고 상기 원자를 상기 반복 단위로 대체함으로써 상기 반복 단위에 연결되고, 여기서,
상기 코어는 하기 화학식(IV)를 갖고:
(IV)
여기서,
X3는 -NR6-이고, 여기서 R6는 수소, 알킬(C≤8), 또는 치환된 알킬(C≤8), -O-, 또는 알킬아미노디일(C≤8), 알콕시디일(C≤8), 아렌디일(C≤8), 헤테로아렌디일(C≤8), 헤테로사이클로알칸디일(C≤8), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 아미노, 하이드록시, 또는 머캅토, 또는 알킬아미노(C≤12), 디알킬아미노(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전; 또는 -(CH2CH2N)e(Rc)Rd의 화학식을 갖는 그룹이고;
여기서,
e는 1, 2, 또는 3이고;
Rc 및 Rd는 각각 독립적으로 수소, 알킬(C≤6), 또는 치환된 알킬(C≤6)이고;
c 및 d는 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이고;
여기서 상기 반복 단위는 분해성 디아실 및 링커를 포함하고;
상기 분해성 디아실 그룹은 하기 화학식(VII)을 갖고:
(VII)
여기서,
A1 및 A2는 각각 독립적으로 -O- 또는 -NRa-이고,
여기서,
Ra는 수소, 알킬(C≤6), 또는 치환된 알킬(C≤6)이고;
Y3는 알칸디일(C≤12), 알켄디일(C≤12), 아렌디일(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전; 또는 하기 화학식을 갖는 그룹이고:
또는
여기서,
X3 및 X4는 알칸디일(C≤12), 알켄디일(C≤12), 아렌디일(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이고;
Y5는 공유 결합, 알칸디일(C≤12), 알켄디일(C≤12), 아렌디일(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이며;
R9는 알킬(C≤8) 또는 치환된 알킬(C≤8)이고;
상기 링커 그룹은 하기 화학식(VI)을 갖고:
(VI)
여기서,
Y1은 알칸디일(C≤12), 알켄디일(C≤12), 아렌디일(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이며;
여기서 상기 반복 단위가 링커 그룹을 포함할 때, 그 다음에 상기 링커 그룹은 상기 링커 그룹의 질소 및 황 원자 모두에 분해성 디아실 그룹이 부착되고, 여기서 상기 반복 단위의 제1 그룹은 분해성 디아실 그룹이고, 여기서 각 링커 그룹에 대하여, 다음 그룹은 상기 링커 그룹의 질소 원자에 부착된 2개의 분해성 디아실 그룹을 포함하고; 여기서, n은 상기 반복 단위에 존재하는 링커 그룹의 수이며;
상기 말단 그룹, 여기서 상기 말단 그룹은 하기 화학식(VIII)을 갖고:
(VIII)
여기서,
Y4는 알칸디일(C≤18), 또는 알칸디일(C≤18) 상의 하나 이상의 수소 원자가 -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -SCH3, 또는 -OC(O)CH3로 대체된 알칸디일(C≤18)이고;
R10은 수소, 카르복시, 하이드록시, 또는
아릴(C≤12), 알킬아미노(C≤12), 디알킬아미노(C≤12), N-헤테로사이클로알킬(C≤12), -C(O)N(R11)-알칸디일(C≤6)-헤테로사이클로알킬(C≤12), -C(O)-알킬아미노(C≤12), -C(O)-디알킬아미노(C≤12), -C(O)-N-헤테로사이클로알킬(C≤12)이고, 여기서,
R11은 수소, 알킬(C≤6), 또는 치환된 알킬(C≤6)이고;
여기서 상기 사슬의 마지막 분해성 디아실은 말단 그룹에 부착되고;
n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6인,
덴드리머 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 다른 양태에서, 덴드리머는 하기 화학식(I)을 갖고:
코어-(반복 단위)n-말단 그룹 (I)
여기서,
상기 코어는, 하나 이상의 수소 원자를 상기 코어로부터 제거하고 상기 원자를 상기 반복 단위로 대체함으로써 상기 반복 단위에 연결되고, 여기서,
상기 코어는 알킬아민(C≤18), 디알킬아민(C≤36), 헤테로사이클로알칸(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이고;
여기서 상기 반복 단위는 분해성 디아실 및 링커를 포함하고;
상기 분해성 디아실 그룹은 하기 화학식(VII)을 갖고:
(VII)
여기서,
A1 및 A2는 각각 독립적으로 -O- 또는 -NRa-이고,
여기서,
Ra는 수소, 알킬(C≤6), 또는 치환된 알킬(C≤6)이고;
Y3는 알칸디일(C≤12), 알켄디일(C≤12), 아렌디일(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전; 또는 하기 화학식을 갖는 그룹이고:
또는
여기서,
X3 및 X4는 알칸디일(C≤12), 알켄디일(C≤12), 아렌디일(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이고;
Y5는 공유 결합, 알칸디일(C≤12), 알켄디일(C≤12), 아렌디일(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이며;
R9는 알킬(C≤8) 또는 치환된 알킬(C≤8)이고;
상기 링커 그룹은 하기 화학식(VI)을 갖고:
(VI)
여기서,
Y1은 알칸디일(C≤12), 알켄디일(C≤12), 아렌디일(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이며;
여기서 상기 반복 단위가 링커 그룹을 포함할 때, 그 다음에 상기 링커 그룹은 상기 링커 그룹의 질소 및 황 원자 모두에 분해성 디아실 그룹이 부착되고, 여기서 상기 반복 단위의 제1 그룹은 분해성 디아실 그룹이고, 여기서 각 링커 그룹에 대하여, 다음 그룹은 상기 링커 그룹의 질소 원자에 부착된 2개의 분해성 디아실 그룹을 포함하고; 여기서, n은 상기 반복 단위에 존재하는 링커 그룹의 수이며;
상기 말단 그룹, 여기서 상기 말단 그룹은 하기 화학식(VIII)을 갖고:
(VIII)
여기서,
Y4는 알칸디일(C≤18), 또는 알칸디일(C≤18) 상의 하나 이상의 수소 원자가 -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -SCH3, 또는 -OC(O)CH3로 대체된 알칸디일(C≤18)이고;
R10은 수소, 카르복시, 하이드록시, 또는
아릴(C≤12), 알킬아미노(C≤12), 디알킬아미노(C≤12), N-헤테로사이클로알킬(C≤12), -C(O)N(R11)-알칸디일(C≤6)-헤테로사이클로알킬(C≤12), -C(O)-알킬아미노(C≤12), -C(O)-디알킬아미노(C≤12), -C(O)-N-헤테로사이클로알킬(C≤12)이고, 여기서,
R11은 수소, 알킬(C≤6), 또는 치환된 알킬(C≤6)이고;
여기서 상기 사슬의 마지막 분해성 디아실은 말단 그룹에 부착되고;
n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6인,
덴드리머 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 일부 양태에서, 말단 그룹은 하기 화학식(VIII)에 의해 추가로 정의되고:
(VIII)
여기서,
Y4는 알칸디일(C≤18), 또는 하나 이상의 수소 원자가 -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -SCH3, 또는 -OC(O)CH3로 대체된 알칸디일(C≤18)이며;
R10은 수소이다.
다른 양태에서, 말단 그룹은 하기 화학식(VIII)에 의해 추가로 정의되고:
(VIII)
여기서,
Y4는 알칸디일(C≤18)이며;
R10은 수소이다.
일부 양태에서, Y4는 알칸디일(C4-18)이다. 다른 양태에서, 말단 그룹은 하기 화학식(VIII)에 의해 추가로 정의되고:
(VIII)
여기서,
Y4는 알칸디일(C≤18), 또는 하나 이상의 수소 원자가 -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -SCH3, 또는 -OC(O)CH3로 대체된 알칸디일(C≤18)이며;
R10은 알킬아미노(C≤12), 디알킬아미노(C≤12), N-헤테로사이클로알킬(C≤12)이다. 일부 양태에서, 말단 그룹은 하기 화학식(VIII)에 의해 추가로 정의되고:
(VIII)
여기서,
Y4는 알칸디일(C≤18), 또는 하나 이상의 수소 원자가 -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -SCH3, 또는 -OC(O)CH3로 대체된 알칸디일(C≤18)이며;
R10은 하이드록시이다.
일부 양태에서, 상기 코어는 하기 화학식(II)에 의해 추가로 정의되고:
(II)
여기서,
X1은 알킬아미노(C≤12), 디알킬아미노(C≤12), 헤테로사이클로알킬(C≤12), 헤테로아릴(C≤12), 또는 이들의 치환된 버전이고;
R1은 아미노, 하이드록시, 또는 머캅토, 또는 알킬아미노(C≤12), 디알킬아미노(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이며;
a는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 일부 양태에서, X1은 알킬아미노(C≤12) 또는 치환된 알킬아미노(C≤12)이다. 일부 양태에서, X1은 에틸아미노이다. 다른 양태에서, X1은 디알킬아미노(C≤12) 또는 치환된 디알킬아미노(C≤12)이다. 일부 양태에서, X1은 디메틸아미노이다. 다른 양태에서, X1은 헤테로사이클로알킬(C≤12) 또는 치환된 헤테로사이클로알킬(C≤12)이다. 일부 양태에서, X1은 4-피페리디닐, N-피페리디닐, N-모르폴리닐, N-피롤리디닐, 2-피롤리디닐, N-피페라지닐, 또는 N-4-메틸피페라디지닐이다. 다른 양태에서, X1은 헤테로아릴(C≤12) 또는 치환된 헤테로아릴(C≤12)이다. 일부 양태에서, X1은 2-피리디닐 또는 N-이미다졸릴이다. 일부 양태에서, R1은 하이드록시이다. 다른 양태에서, R1은 아미노이다. 다른 양태에서, R1은 알킬아미노(C≤12) 또는 치환된 알킬아미노이다. 일부 양태에서, R1은 알킬아미노(C≤12)이다. 일부 양태에서, R1은 메틸아미노 또는 에틸아미노이다. 다른 양태에서, a는 1, 2, 3, 또는 4이다. 다른 양태에서, a는 2 또는 3이다. 일부 양태에서, a는 2이다. 다른 양태에서, a는 3이다. 일부 양태에서, 상기 코어는 하기 화학식의 화합물로 추가로 정의된다:
, , , , , , , , , , , , , , , 또는 .
일부 양태에서, 상기 코어는 하기와 같이 추가로 정의된다:
, , , , 또는 .
다른 양태에서, 상기 코어가 하기 화학식(III)에 의해 추가로 정의된다:
(III)
여기서,
X2는 N(R5)y이고;
R5는 수소, 알킬(C≤8), 또는 치환된 알킬(C≤18)이며;
y는 0, 1, 또는 2이고, 단, y와 z의 합은 3이고;
R2는 아미노, 하이드록시, 또는 머캅토, 또는 알킬아미노(C≤12), 디알킬아미노(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이고;
b는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이며;
z는 1, 2, 3이며; 단, z와 y의 합은 3이다.
일부 양태에서, X2는 N이다. 다른 양태에서, X2는 NR5이고, 여기서 R5는 수소 또는 알킬(C≤8)이다. 일부 양태에서, R5는 수소이다. 다른 양태에서, R5는 메틸이다. 일부 양태에서, z는 3이다. 다른 양태에서, z는 2이다. 일부 양태에서, R2는 하이드록시이다. 다른 양태에서, R2는 아미노이다. 다른 양태에서, R2는 알킬아미노(C≤12) 또는 치환된 알킬아미노(C≤12)이다. 일부 양태에서, R2는 알킬아미노(C≤12)이다. 일부 양태에서, R2는 메틸아미노이다. 다른 양태에서, R2는 디알킬아미노(C≤12) 또는 치환된 디알킬아미노(C≤12)이다. 일부 양태에서, R2는 디알킬아미노(C≤12)이다. 일부 양태에서, R2는 디메틸아미노이다. 일부 양태에서, b는 1, 2, 3, 또는 4이다. 일부 양태에서, b는 2 또는 3이다. 일부 양태에서, b는 2이다. 다른 양태에서, b는 3이다. 일부 양태에서, 상기 코어는 하기 화학식과 같이 추가로 정의된다:
, , , , , , 또는 .
일부 양태에서, 상기 코어는 하기와 같이 추가로 정의된다:
, , 또는.
다른 양태에서, 상기 코어는 하기 화학식(IV)와 같이 추가로 정의되고:
(IV)
여기서,
X3는 -NR6-이고, 여기서 R6는 수소, 알킬(C≤8), 또는 치환된 알킬(C≤8), -O-, 또는 알킬아미노디일(C≤8), 알콕시디일(C≤8), 아렌디일(C≤8), 헤테로아렌디일(C≤8), 헤테로사이클로알칸디일(C≤8), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 아미노, 하이드록시, 또는 머캅토, 또는 알킬아미노(C≤12), 디알킬아미노(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전; 또는 -(CH2CH2N)e(Rc)Rd의 화학식을 갖는 그룹이고;
여기서,
e는 1, 2, 또는 3이고;
Rc 및 Rd는 각각 독립적으로 수소, 알킬(C≤6), 또는 치환된 알킬(C≤6)이고;
c 및 d는 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다.
일부 양태에서, X3는 -O-이다. 다른 양태에서, X3는 -NR6-이고, 여기서 R6는 수소, 알킬(C≤8), 또는 치환된 알킬(C≤8)이다. 일부 양태에서, X3는 -NH- 또는 -NCH3-이다. 다른 양태에서, X3는 알킬아미노디일(C≤8) 또는 치환된 알킬아미노디일(C≤8)이다. 일부 양태에서, X3는 -NHCH2CH2NH- 또는 -NHCH2CH2NHCH2CH2NH-이다. 다른 양태에서, X3는 알콕시디일(C≤8) 또는 치환된 알콕시디일(C≤8)이다. 일부 양태에서, X3는 -OCH2CH2O-이다. 다른 양태에서, X3는 아렌디일(C≤8) 또는 치환된 아렌디일(C≤8)이다. 일부 양태에서, X3는 벤젠디일이다. 다른 양태에서, X3는 헤테로사이클로알칸디일(C≤8) 또는 치환된 헤테로사이클로알칸디일(C≤8)이다. 일부 양태에서, X3는 N,N'-피페라지디일이다.
일부 양태에서, R3는 아미노이다. 다른 양태에서, R3는 하이드록시이다. 다른 양태에서, R3는 알킬아미노(C≤12) 또는 치환된 알킬아미노(C≤12)이다. 일부 양태에서, R3는 알킬아미노(C≤12)이다. 일부 양태에서, R3는 메틸아미노이다. 다른 양태에서, R3는 디알킬아미노(C≤12) 또는 치환된 디알킬아미노(C≤12)이다. 일부 양태에서, R3는 디알킬아미노(C≤12)이다. 일부 양태에서, R3는 디메틸아미노이다.
일부 양태에서, R4은 아미노이다. 다른 양태에서, R4는 하이드록시이다. 다른 양태에서, R4는 알킬아미노(C≤12) 또는 치환된 알킬아미노(C≤12)이다. 일부 양태에서, R4는 알킬아미노(C≤12)이다. 일부 양태에서, R4는 메틸아미노이다. 다른 양태에서, R4는 디알킬아미노(C≤12) 또는 치환된 디알킬아미노(C≤12)이다. 일부 양태에서, R4는 디알킬아미노(C≤12)이다. 일부 양태에서, R4는 디메틸아미노이다. 다른 양태에서, R4는 -(CH2CH2N)e(Rc)Rd이고: 여기서, e는 1, 2, 또는 3이고; Rc 및 Rd는 각각 독립적으로 수소, 알킬(C≤6), 또는 치환된 알킬(C≤6)이다. 일부 양태에서, e는 1 또는 2이다. 일부 양태에서, e는 1이다. 일부 양태에서, Rc는 수소이다. 일부 양태에서, Rd는 수소이다.
일부 양태에서, c는 1, 2, 3, 또는 4이다. 일부 양태에서, c는 2 또는 3이다. 일부 양태에서, c는 2이다. 다른 양태에서, c는 3이다. 일부 양태에서, d는 1, 2, 3, 또는 4이다. 일부 양태에서, d는 2 또는 3이다. 일부 양태에서, d는 2이다. 다른 양태에서, d는 3이다. 일부 양태에서, 상기 코어는 하기와 같이 추가로 정의된다:
, , , , , , , , , , , 또는 .
일부 양태에서, 상기 코어는 하기와 같이 추가로 정의된다:
.
다른 양태에서, 상기 코어는 알킬아민(C≤18), 디알킬아민(C≤36), 헤테로사이클로알칸(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이다. 일부 양태에서, 상기 코어는 알킬아민(C≤18) 및 치환된 알킬아민(C≤18)이다. 일부 양태에서, 상기 코어는 옥틸아민, 데실아민, 도데실아민, 테트라데실아민, 헥사데실아민, 옥타데실아민이다. 다른 양태에서, 상기 코어는 디알킬아민(C≤36) 또는 치환된 디알킬아민(C≤36)이다. 일부 양태에서, 상기 코어는 N-메틸, N-도데실아민, 디옥틸아민 또는 디데실아민이다. 다른 양태에서, 상기 코어는 헤테로사이클로알칸(C≤12) 또는 치환된 헤테로사이클로알칸(C≤12)이다. 일부 양태에서, 상기 코어는 4-N-메틸피페라지닐이다. 일부 양태에서, Y1은 알칸디일(C≤8) 또는 치환된 알칸디일(C≤8)이다. 일부 양태에서, Y1은 알칸디일(C≤8)이다. 일부 양태에서, Y1은 -CH2CH2-이다. 일부 양태에서, Y3는 알칸디일(C≤8) 또는 치환된 알칸디일(C≤8)이다. 일부 양태에서, Y3는 알칸디일(C≤8)이다. 일부 양태에서, Y3는 -CH2CH2-이다. 일부 양태에서, Y3는 하기 화학식과 같고:
여기서,
X3 및 X4는 알칸디일(C≤12), 알켄디일(C≤12), 아렌디일(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이고;
Y5는 공유 결합, 알칸디일(C≤12), 알켄디일(C≤12), 아렌디일(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이다.
일부 양태에서, X3는 알칸디일(C≤12) 또는 치환된 알칸디일(C≤12)이다. 일부 양태에서, X3는 -CH2CH2-이다. 일부 양태에서, X4는 알칸디일(C≤12) 또는 치환된 알칸디일(C≤12)이다. 일부 양태에서, X4는 -CH2CH2-이다. 일부 양태에서, Y5는 공유 결합이다. 일부 양태에서, Y3는 하기 화학식과 같고:
여기서,
X3 및 X4는 알칸디일(C≤12), 알켄디일(C≤12), 아렌디일(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이다.
Y5는 공유 결합, 알칸디일(C≤12), 알켄디일(C≤12), 아렌디일(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이다.
일부 양태에서, X3는 알칸디일(C≤12) 또는 치환된 알칸디일(C≤12)이다. 일부 양태에서, X3는 -CH2CH2-이다. 일부 양태에서, X4는 알칸디일(C≤12) 또는 치환된 알칸디일(C≤12)이다. 일부 양태에서, X4는 -CH2CH2-이다. 일부 양태에서, Y5는 공유 결합이다. 일부 양태에서, Y5는 -CH2- 또는 -C(CH3)2-이다. 일부 양태에서, A1은 -O-이다. 다른 양태에서, A1은 -NRa-이다. 일부 양태에서, Ra는 수소이다. 일부 양태에서, R9은 알킬(C≤8)이다. 일부 양태에서 R9은 메틸이다. 일부 양태에서, n은 0, 1, 2, 3, 또는 4이다. 일부 양태에서, n은 0, 1, 2, 또는 3이다. 일부 양태에서, n은 0이다. 다른 양태에서, n은 1이다. 다른 양태에서, n은 2이다. 다른 양태에서, n은 3이다.
다른 양태에서, 본 개시는 하기를 포함하는 조성물을 제공한다:
(a) 본원에 기술된 덴드리머; 및
(b) 핵산.
일부 양태에서, 핵산은 siRNA(short interfering RNA: small interfering RNA), 마이크로RNA(microRNA), pri-miRNA, 전령 RNA(mRNA), CRISPR(cluster regularly interspaced short palindromic repeat) 관련 핵산, 단일 가이드 RNA(single guide RNA: sgRNA), CRISPR-RNA(crRNA), 트랜스-활성화 crRNA(trans-activating crRNA: tracrRNA), 플라스미드 DNA(pDNA), 전달 RNA(tRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 가이드 RNA, 이중 가닥 DNA(dsDNA), 단일 가닥 DNA(ssDNA), 단일 가닥 RNA(ssRNA) 및 이중 가닥 RNA(dsRNA)이다. 일부 양태에서, 핵산은 siRNA, tRNA, 또는 CRISPR 과정에서 사용될 수 있는 핵산이다. 상기 핵산은 siRNA일 수 있다. 다른 양태에서, 핵산은 예를 들면 CRISPR(cluster regularly interspaced short palindromic repeat) 관련 핵산, 단일 가이드 RNA(single guide RNA: sgRNA), CRISPR-RNA(crRNA), 또는 트랜스-활성화 crRNA(trans-activating crRNA: tracrRNA)와 같은 CRISPR 과정에서 사용될 수 있는 핵산이다. 일부 양태에서, 핵산은 Factor VII에 대한 siRNA로 하기 서열을 포함한다:
5'-GGAucAucucAAGucuuAc[dT][dT]-3' (SEQ ID NO: 1); 또는
3'-GuAAGAcuuGAGAuGAucc[dT][dT]-5' (SEQ ID NO: 2).
다른 양태에서, 핵산은 miRNA이다. 다른 양태에서, 상기 핵산은 mRNA이다. 다른 양태에서, 핵산은 tRNA이다. 다른 양태에서, 핵산은 가이드 RNA이다. 일부 양태에서, 가이드 RNA는 CRISPR 과정에 사용된다. 다른 양태에서, 핵산은 pDNA이다.
일부 양태에서, 상기 덴드리머 및 핵산은 약 100:1 내지 약 1:5 중량비로 존재한다. 일부 양태에서, 덴드리머 대 핵산의 중량비는 약 50:1 내지 약 2:1이다. 일부 양태에서, 덴드리머 대 핵산의 중량비는 25:1이다. 다른 양태에서, 덴드리머 대 핵산의 중량비는 7:1이다. 일부 양태에서, 조성물은 하나 이상의 헬퍼 지질을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 상기 헬퍼 지질은 스테로이드, 스테로이드 유도체, PEG 지질, 또는 인지질로부터 선택된다. 일부 양태에서, 상기 헬퍼 지질은 스테로이드 또는 스테로이드 유도체이다. 일부 양태에서, 상기 스테로이드는 콜레스테롤이다. 일부 양태에서, 스테로이드 또는 스테로이드 유도체 및 상기 덴드리머는 약 10:1 내지 약 1:20 몰비로 존재한다. 일부 양태에서, 상기 스테로이드 또는 스테로이드 유도체 및 덴드리머의 몰비는 약 1:1 내지 약 1:10이다. 일부 양태에서, 상기 스테로이드 또는 스테로이드 유도체 및 덴드리머의 몰비는 38:50이다. 일부 양태에서, 상기 스테로이드 또는 스테로이드 유도체 및 덴드리머의 몰비는 약 1:5이다.
다른 양태에서, 상기 헬퍼 지질은 PEG 지질이다. 일부 양태에서, 상기 PEG 지질은 하기 화학식의 화합물과 같은 PEG화된 디아실글리세롤이고:
여기서,
R12 및 R13은 각각 독립적으로 알킬(C≤24), 알케닐(C≤24), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이고;
Re는 수소, 알킬(C≤8), 또는 치환된 알킬(C≤8)이며;
x는 1-250이다.
일부 양태에서, 상기 PEG 지질은 디미리스토일-sn-글리세롤 또는 하기 화학식을 갖는 화합물이고:
여기서,
n1은 5-250이며;
n2 및 n3는 각각 독립적으로 2-25이다.
일부 양태에서, 상기 PEG 지질 및 덴드리머는 약 1:1 내지 약 1:250 몰비로 존재한다. 일부 양태에서, 상기 PEG 지질 및 덴드리머의 몰비는 약 1:10 내지 약 1:125이다. 일부 양태에서, 상기 PEG 지질 및 덴드리머의 몰비는 약 1:20 내지 약 1:50이다. 다른 양태에서, 상기 헬퍼 지질은 인지질이다. 일부 양태에서, 상기 인지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine: DSPC)이다. 다른 양태에서, 상기 인지질은 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine: DOPE)이다. 일부 양태에서, 상기 인지질 및 덴드리머는 약 10:1 내지 약 1:20의 몰비로 존재한다. 일부 양태에서, 상기 인지질 및 덴드리머의 몰비는 약 1:1 내지 약 1:10이다. 일부 양태에서, 상기 인지질 및 덴드리머의 몰비는 약 4:5이다. 일부 양태에서, 상기 인지질 및 덴드리머의 몰비는 약 1:5이다. 일부 양태에서, 조성물은 상기 덴드리머, 핵산, 및 하나 이상의 헬퍼 지질로 필수적으로 이루어진다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 하기를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다:
(a) 본원에 기술된 조성물 또는 덴드리머; 및
(b) 약학적으로 허용 가능한 담체.
일부 양태에서, 약학적으로 허용 가능한 담체는 용매 또는 용액이다. 일부 양태에서, 약학적 조성물은 경구로, 지방세포내로, 동맥내로, 관절내로, 두개내로, 피부내로, 병변내로, 근육내로, 비강내로, 안구내로, 심막내로, 복강내로, 흉강내로, 전립선내로, 직장내로, 경막내로, 기관내로, 종양내로, 배꼽내로, 질내로, 정맥내로, 포낭내로, 유리체내로, 리포좀으로, 국소로, 점막으로, 비경구로, 직장으로, 결막하로, 피하로, 설하로, 국부로, 협측으로(transbuccally), 경피로, 질로, 크림으로, 지질 조성물로, 카테터를 통해, 세척을 통해, 연속 주입을 통해, 주입을 통해, 흡입을 통해, 주사를 통해, 국소 전달을 통해 또는 국소화된 관류를 통해 투여하기 위하여 제형화된다. 일부 양태에서, 약학적 조성물은 정맥내 또는 동맥내 주사를 위해 제형화된다. 일부 양태에서, 약학적 조성물은 단위 투여량으로서 제형화된다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 핵산을 세포로 전달하는 단계를 포함하는 유전자의 발현을 조절하는 방법으로서, 상기 세포로의 상기 핵산의 흡수를 야기하기에 충분한 조건 하에서 상기 세포를 여기에 기술된 조성물 또는 약학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 세포는 시험관내 접촉된다. 다른 양태에서, 세포는 생체내 접촉된다. 다른 양태에서, 세포는 생체외 접촉된다. 일부 양태에서, 유전자 발현의 조절은 질환 또는 장애를 치료하기에 충분하다. 일부 양태에서, 상기 질환 또는 장애는 암이다. 일부 양태에서, 상기 질환 또는 장애는 간암이다. 일부 양태에서, 상기 질환 또는 질병은 간세포 암종(hepatocellular carcinoma)이다.
또 다른 양태에서, 본 개시는 환자의 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 여기에 기술된 조성물 또는 약학적 조성물의 약학적 유효량을 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 상기 질환 또는 장애는 암이다. 일부 양태에서, 상기 질환 또는 장애는 간암이다. 일부 양태에서, 상기 질환 또는 질병은 간세포 암종이다. 일부 양태에서, 방법은 상기 환자에게 하나 이상의 부가적인 암 치료를 부여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 암 치료는 화학치료적 화합물, 수술, 방사선 치료, 또는 면역 치료이다. 일부 양태에서, 조성물 또는 약학적 조성물은 상기 환자에게 1회 투여된다. 다른 양태에서, 조성물 또는 약학적 조성물은 상기 환자에게 2회 이상 투여된다. 일부 양태에서, 환자는 인간과 같은 포유류이다.
또 다른 양태에서, 본 개시는,
덴드리머는 화학식(I)를 갖고:
코어-(반복 단위)n-말단 그룹 (I)
여기서,
상기 코어는, 하나 이상의 수소 원자를 상기 코어로부터 제거하고 상기 원자를 상기 반복 단위로 대체함으로써 상기 반복 단위에 연결되고, 여기서,
상기 코어는 하기 화학식(IV)를 갖고:
(IV)
여기서,
X3는 -NR6-이고, 여기서 R6는 수소, 알킬(C≤8), 또는 치환된 알킬(C≤8), -O-, 또는 알킬아미노디일(C≤8), 알콕시디일(C≤8), 아렌디일(C≤8), 헤테로아렌디일(C≤8), 헤테로사이클로알켄디일(C≤8), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이고;
R3 및 R4는 각각 독립적으로 아미노, 하이드록시, 또는 머캅토, 또는 알킬아미노(C≤12), 디알킬아미노(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이고;
c 및 d는 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이거나; 또는
여기서 상기 반복 단위는 분해성 디아실 및 링커를 포함하고;
상기 분해성 디아실 그룹은 하기 화학식(VII)을 갖고:
(VII)
여기서,
A1 및 A2는 각각 독립적으로 -O- 또는 -NRa-이고,
여기서,
Ra는 수소, 알킬(C≤6), 또는 치환된 알킬(C≤6)이고;
Y3는 알칸디일(C≤12), 알켄디일(C≤12), 아렌디일(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이고;
상기 링커 그룹은 하기 화학식(VI)을 갖고:
(VI)
여기서,
Y1은 알칸디일(C≤12), 알켄디일(C≤12), 아렌디일(C≤12), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이며;
여기서 상기 반복 단위가 링커 그룹을 포함할 때, 그 다음에 상기 링커 그룹은 상기 링커 그룹의 질소 및 황 원자 모두에 분해성 디아실 그룹이 부착되고, 여기서 상기 반복 단위의 제1 그룹은 분해성 디아실 그룹이고, 여기서 각 링커 그룹에 대하여, 다음 그룹은 상기 링커 그룹의 질소 원자에 부착된 2개의 분해성 디아실 그룹을 포함하고; 여기서, n은 상기 반복 단위에 존재하는 링커 그룹의 수이며;
상기 말단 그룹은 하기 화학식(VIII)을 갖고:
(VIII)
여기서,
Y4는 알칸디일(C≤18)이고;
R10은 수소이고;
여기서 상기 사슬의 마지막 분해성 디아실은 말단 그룹에 부착되고;
n은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6인,
덴드리머 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
용어 "포함한다(comprise)"("포함한다" 및 "포함하는"과 같은 "포함한다"의 임의의 형태), "가진다"("가진다" 및 "갖는"과 같은 "가진다"의 임의의 형태), "함유한다"("함유한다" 및 "함유하는"과 같은 "함유한다"의 임의의 형태) 및 용어 "포함하다(include)"("포함하다" 및 "포함하는"과 같은 "포함한다"의 임의의 형태)는 한정 없는 연결 동사이다. 따라서, 하나 이상의 열거된 단계 또는 요소 과정을 "포함하다(comprise)", "가지다", "함유하다", 또는 "포함하다(include)"는 방법, 조성물, 키트, 또는 시스템은 그 열거된 단계 또는 요소를 보유하지만, 오직 그 단계 또는 요소만을 보유하는 것으로 한정되지 않는다; 이는 열거되지 않는 요소 또는 단계를 보유(포함)할 수 있다. 이와 같이, 하나 이상의 열거된 특징을 "포함한다", "가진다", "함유한다" 또는 "포함하다"는 방법, 조성물, 키트, 또는 시스템의 요소는 그 특징을 보유하지만, 오직 그 특징만을 보유하는 것으로 한정되지 않는다; 이는 열거되지 않은 특징을 보유할 수 있다.
임의의 본 방법, 조성물, 키트, 및 시스템의 임의의 양태는 기술된 단계 및/또는 특징을 포함/함유/가지는 대신에, 기술된 단계 및/또는 특징으로 구성하거나 필수적으로 구성될 수 있다. 따라서, 임의의 청구항에서, 용어 "구성하는" "필수적으로 구성하는"은 그렇지 않으면 한정없는 연결 동사를 사용하는 주어진 청구항의 범위를 변경하기 위하여 상기에 열거된 임의의 한정 없는 연결 동사를 대체할 수 있다.
청구항에서 용어 "또는"의 사용은, 명시적으로 대안만을 지칭하거나 대안이 상호 배타적이지 않는 한, "및/또는"을 의미하기 위해 사용되지만, 개시는 대안만과 "및/또는"을 지칭하는 정의를 지지한다.
본 개시의 다른 목적, 특징, 및 이점은 하기의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 예는 발명의 특정 양태를 나타내지만 단지 예시로서 주어진 것으로 이해되어야 하는데, 이는 발명의 정신 및 범위 내에서의 다양한 변화 및 변경은 해당 기술 분야의 통상의 기술자에게 본 상세한 설명으로부터 명백해질 것이기 때문이다. 특정 화합물이 특정 일반적 화학식에 속하기 때문에 단순히 다른 일반적 화학식에도 속할 수 없다는 것을 의미하지 않는다는 것에 유의한다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 양태을 추가로 설명하기 위해 포함된다. 본 발명은 여기에 제시된 특정 양태의 상세한 설명과 조합하여 하나 이상의 도면을 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있다.
도1A 내지 도1D는 종양 세포에 대한 높은 효능 및 정상 세포에 대한 낮은 독성의 조합이 취약한 간암에서의 소형 RNA 치료에 요구된다는 것을 보여준다. 생체적합성 에스테르-기반 덴드리머의 화학적 작용기 및 크기를 다양화하기 위한 모듈 전략은 낮은 독성 및 높은 생체내 소형 RNA 전달 효능의 균형을 이루는 덴드리머의 발견을 가능하게 했다. 직교 반응(orthogonal reaction)은 1,512개의 G1 모듈 분해성 덴드리머의 합성을 가속화시켜, 분자 구조의 수, 크기 및 화학적 다양성을 증가시켰다. 각 단계에서의 분해성 에스테르 결합의 포함은 낮은 독성을 촉진시켰다. (도1A) 소형 RNA는 자체적으로 세포에 들어가기에는 너무 크고 음이온성이다. 상기 RNAi 머시너리를 효율적으로 활용하기 위해서, 전달 담체는 수많은 세포외 및 세포내 장벽을 통해 소형 RNA를 샤페론(chaperone)해야 한다. 덴드리머 구조에서 작용기 그룹 정체성(identity) 및 배치의 미세한 조정을 가능할 수 있게 하는 모듈 디자인이 계획되었다. (도1B) 상기 라이브러리는 순차적인 직교 반응을 통해 설립되었다. 먼저, 일련의 초기 분지 중심(initial branching centers, IBCs)를 갖는 아민은 2개의 분해성 에스테르 그룹을 함유하는 AEMA의 입체 장애가 더 적은 아크릴레이트 그룹과 정량적이고 선택적으로 반응했다. 상기 생성물은 다양한 티올과 DMPP-촉매된 반응을 겪었다. (도1C) 상기 다중 세포외 및 세포내 전달 장벽을 극복하기 위해 소형 RNA를 매개하는 최적화된 토폴로지 구조를 갖는 분해성 덴드리머를 확인하기 위해, 상기 라이브러리는 4개의 지역으로 나누어졌다: 코어 결합 - 주변부 안정화 (지역 I), 코어 결합 - 주변부 결합 (지역 II), 코어 안정화 - 주변부 안정화 (지역 III), 및 코어 안정화 - 주변부 결합 (지역 IV). (도1D) 덴드리머는 코어 및 주변부를 위한 화학적으로 다양한 아민 및 티올로 독립적으로 조절된다. 선택된 아민은 2개의 범주로 나뉜다: 1개 내지 6개로 분지된 종을 생성할 RNA 결합을 위한 이온화 가능한 아민은 1A-6A로 표지되고, NP 안정화를 위한 소수성 아민은 1H-2H로 표지된다. 이들 아민은 더 높은 덴드리머 세대로 효능을 증가시킬 것으로 예상된다. NP 안정화를 위한 소수성 알킬 아민은 탄화수소 길이를 기반으로 로 표지된다. 알코올 및 카르복실산 말단화된 티올(SO1-SO9) 및 아민-작용기화된 티올(SN1-SN11)은 화학적 다양성을 증가시키기 위해 상기 라이브러리 디자인에 포함된다. 다중 분지를 갖는 더 높은 세대 덴드리머 G2-G4도 세대 확대 반응(도10B 및 도11 참조)을 이용해 합성되었다.
도2는 부틸레이티드 하이드록시톨루엔(butylated hydroxyltoluene: BHT) 5 몰% 존재 하에 50℃에서 트리스(2-아미노에틸)아민(tris(2-aminoethyl)amine, 6A3)의 2-(아크릴로일옥시)에틸 메타크릴레이트(2-(acryloyloxy)ethyl methacrylate: AEMA)와의 높은 아자-마이클 첨가 선택성을 보여준다. 트리스(2-아미노에틸)아민을 첨가하지 않으면, AEMA 단독으로는 24시간 후에 반응하지 않고, 전환(conversion)은 0%이다. 트리스(2-아미노에틸)아민을 첨가한 후에는, AEMA 전환은 2시간 후에 약 82% 및 24시간 후에 약 98%이며, 6개의 분지를 갖는 제1 세대 덴드리머(6A3-G1)를 생성한다. AEMA의 1H NMR 추적에 의해 반응을 쉽게 모니터링하기 위해 과량의 AEMA(6×0.05 당량)이 첨가된다는 점에 유의한다. EAMA 전환이 완료되면, 남은 Ha 및 Hb의 5% 신호가 여전히 존재해야 한다.
도3은 부틸레이티드 하이드록시톨루엔(BHT) 5 몰% 존재 하에 50℃에서 긴 알킬 사슬 테트라데실아민(2H4)의 2-(아크릴로일옥시)에틸 메타크릴레이트(AEMA)와의 높은 아자-마이클 첨가 선택성을 보여준다. AEMA 단독으로는 24시간 후에 반응하지 않고, 전환은 0%이다. 테트라데실아민을 첨가한 후에는, AEMA 전환은 24시간 후에 약 97%이며, 긴 알킬 사슬 코어를 갖는 제1 세대 덴드리머(2H4-G1)를 생성시킨다. AEMA의 1H NMR 추적에 의해 반응을 쉽게 모니터링하기 위해 과량의 AEMA가 첨가된다는 점에 유의한다. AEMA 전환이 완료되면, 남은 Ha 및 Hb의 5% 신호가 여전히 존재해야 한다.
도4는 60℃, 400 μL DMSO-D6에서 48시간 동안의 6A3-G1(125 mM)의 2-(부틸아미노)에탄티올(6×1.2 당량) 또는 1-테트라데칸티올(6×1.2 당량)과의 설파-마이클 첨가를 보여준다. 티올 화합물을 첨가하지 않으면, 6A3-G1은 60℃, DMSO-D6에서 48시간 동안 동일하게 유지된다. 5 몰% 디메틸페닐포스핀(dimethylphenylphosphine: DMPP)을 촉매로서 첨가하면, 6A3-G1은 60℃, DMSO-D6에서 48시간 이내에 100% 전환율으로 1-테트라데칸티올과 반응하는 반면, DMPP가 없으면 6A3-G1의 전환율은 57%에 불과하다. 2-(부틸아미노)에탄티올과의 6A3-G1의 전환율은 DMPP의 첨가 여부에 관계없이 거의 정량적인데, 이는 2-(부틸아미노)에탄티올의 아민 그룹이 촉매로 작용할 수 있기 때문일 것이다. 6A3-G1이 티올 반응물(6×0.1 당량)을 자신의 2개의 이중 결합으로 소비하는 EAMA(6×0.05 당량)를 함유하기 때문에 과량의 티올(6×0.2 당량)이 첨가된다는 점에 유의한다.
도5는 60℃, DMSO-D6에서 48시간 동안의 2-(부틸아미노)에탄티올(2×1.2 당량) 또는 1-테트라데칸티올(2×1.2 당량)과의 2H4-G1(125 mM)의 설파-마이클 첨가를 보여준다. 티올 화합물을 첨가하지 않으면, 2H-G1은 60℃, DMSO-D6에서 48시간 동안 동일하게 유지된다. (5 몰%) 디메틸페닐포스핀(DMPP)을 촉매로서 첨가하면, 2H4-G1은 60℃, DMSO-D6에서 48시간 이내에 100% 전환율으로 1-테트라데칸티올과 반응하는 반면, DMPP가 없으면 2H4-G1의 전환율은 51%에 불과하다. 2-(부틸아미노)에탄티올과의 2H4-G1의 전환율은 DMPP의 첨가 여부에 관계없이 정량적인데, 이는 2-(부틸아미노)에탄티올의 아민 그룹이 촉매로 작용할 수 있기 때문일 것이다. 2H4-G1이 티올 반응물(2×0.1 당량)을 자신의 2개의 이중 결합으로 소비하는 EAMA(2×0.05 당량)를 함유하기 때문에 과량의 티올(2×0.2 당량)이 첨가된다는 점에 유의한다.
도6A 및 도6B는 1,512개의 제1 세대 분해성 덴드리머의 라이브러리가 고효율로 설립되었다. (도6A) 다양한 초기 분지 중심(IBC)을 갖는 다른 아민(C)은 2-(아크릴로일옥시)에틸 메타크릴레이트(AEMA)와 정확히 1:1 공급 당량에서 5 몰% 부틸레이티드 하이드록시톨루엔(BHT)의 존재 하에 50℃에서 24시간 동안 반응했다. 42개 반응 모두의 전환율은 1H NMR에 의해 거의 정량적이다. (도6B) 42개의 C-L-G1 각각은 36개의 티올(P) 각각과 66μL DMSO에서 5% DMPP와 작은 스케일에서(평균 ~20 mg) 반응했다. 티올 농도는 750 mM이고, 1An&1Hn, 2An&2Hn, 3An, 4An, 5An, 및 6An의 농도는 각각 750 mM, 275 mM, 250 mM, 187.5 mM, 150 mM 및 125 mM이다. 어떤 티올 화합물의 첨가도 없을 때, 모든 42개의 C-L-G1은 60℃에서 48시간 동안 안정하게 유지되었다. SC4, SN8, 및 SO9와 42개 모두와의 반응 각각은 거의 정량적인 전환을 가진다(1H NMR로 측정).
도7A 내지 도7C는 1,512개의 G1DD의 시험관내 siRNA 전달 스크리닝이 세포내 장벽을 극복할 수 있는 덴드리머의 발견을 가능하게 했고, 구조-활성 관계를 확립했다는 것을 보여준다(도7A). (도7B) 덴드리머 나노입자(33 nM siLuc, n=3)의 처리 후의 HeLa-Luc 세포에서 루시페라아제(luciferase) 침묵의 히트 맵(heat map)은 지역 활성 관계를 나타낸다. 루시페라아제 활성 및 세포 생존력(cell viability)은 높은 전달 효율 및 낮은 독성의 균형을 이루는 덴드리머를 확인하기 위해 측정되었다(도8의 추가 데이터 참조). (도7C) 50% 초과의 침묵을 가능하게 한 나노입자 그룹의 분석은 세포내 전달 장벽을 극복하기 위한 최적화된 토폴로지 구조를 갖는 덴드리머를 확인했다. 딸 지역은 일련의 기준에 따라 히트율(hit rate)이 부모 지역보다 더 높았을 경우 추가로 분석되었다. 부모 지역의 히트율은 주황색으로 표시되고, 그의 딸 지역의 높거나 낮은 히트율은 각각 초록색 또는 파란색으로 표시된다. 전체 라이브러리의 약 6%가 50% 이상의 유전자 침묵을 가능하게 했다. 코어 결합 - 주변부 안정화 지역 I은 10%의 히트율을 가졌다. 지역 I 내에서, SC 분지를 갖는 하위 지역은 15%를 수득한 반면, SO 분지를 갖는 하위 지역은 1%에 불과한 히트율을 가졌다. SC 분지를 갖는 하위 지역에서, 3개 내지 6개의 분지, SC5-8 분지, 또는 SC9-12 분지를 갖는 덴드리머는 siRNA 전달을 효율적으로 매개할 훨씬 더 높은 기회를 가졌다.
도8은 siLuc(33 nM siRNA, n=3의 평균 값)를 함유하는 1,512개의 제1 세대 분해성 덴드리머(G1DD) NP를 첨가한 후의 세포 생존력을 보여준다. G1DD는, 반딧불이 루시페라아제-표적 siRNA(siLuc)를 12.5:1 중량비(G1DD:siRNA)로, 헬퍼 지질 콜레스테롤, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포콜린(DSPC) 및 지질 PEG2000을 50:38:10:2 몰비(G1DD:콜레스테롤:DSPC:지질 PEG)로 함유하는 나노입자로 제형화되었다. 세포 생존력은 ONE-Glo + Tox 루시페라아제 리포터 및 세포 생존력 에세이(Promega)를 통해 그의 프로토콜을 따라 측정되었다. 세포 생존력은 처리되지 않은 세포로 표준화함으로써 얻어졌다. 처리되지 않은 대조군(n=6). 실험 샘플(n=3).
도9A 및 도9B는 1,512개의 제1 세대 분해성 덴드리머(G1DD)의 세포내 siRNA 전달 활성을 보여준다. G1DD는, 반딧불이 루시페라아제-표적 siRNA(siLuc)를 12.5:1 중량비(G1DD:siRNA)로, 헬퍼 지질 콜레스테롤, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포콜린(DSPC) 및 지질 PEG2000을 50:38:10:2 몰비(G1DD:콜레스테롤:DSPC:지질 PEG)로 함유하는 나노입자로 제형화되었다. (도9A) G1DD 나노입자를 33 nM siRNA로 처리한 후 반딧불이 루시페라아제를 안정하게 발현하는 HeLa 세포의 루시페라아제 활성 감소의 히트 맵은, 덴드리틱 분석 과정의 브레이크다운(breakdown)을 기술하기 위해, 지역과 영역으로 나뉜다(도9B 참조). 세포 생존력 및 루시페라아제 활성은 ONE-Glo + Tox 루시페라아제 리포터 및 세포 생존력 에세이(Promega)를 통해 그의 프로토콜을 따라 측정되었다. 루시페라아제 감소는 처리되지 않은 세포의 루시페라아제 활성 및 생존력으로 표준화함으로써 얻어졌다. 처리되지 않은 대조군(n=6). 실험 샘플(n=3). (도9B) 50% 초과의 루시페라아제 활성 감소를 갖는 히트율을 분석함으로써 세포내 전달 장벽을 극복하기 위한 siRNA를 매개하는 최적의 구조를 갖는 분해성 덴드리머를 확인하는, 덴드리머-인스파이어드 트리 분석 과정(dendrimer-inspired tree analysis process)의 활용. 딸 지역은 일련의 기준에 따라 부모 지역보다 더 높은 히트율을 가질 경우 추가로 분석된다. 부모 지역의 히트율은 검정 막대 그래프로 표시되며, 딸 지역의 높거나 낮은 히트율은 파란색 또는 빨간색 폰트로 표시된다. 전체 라이브러리의 약 6%는 50% 초과의 유전자 침묵을 유발했다. 코어 결합 - 주변부 안정화 지역(지역 I)은 10%의 히트율을 가진다. 지역 I에서ㅡ SC 분지를 갖는 하위 지역은 15%을 가지는 반면, SO 분지를 갖는 하위 지역은 1%를 가진다. SC 분지를 갖는 하위 지역에서, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 분지, SC5-8 분지, 또는 SC9-12 분지를 갖는 덴드리머는 세포내 전달 장벽을 극복하기 위해 siRNA를 효율적으로 매개할 훨씬 더 높은 기회를 가진다.
도10A 내지 도10C는 체계적인 생체내 siRNA 전달 스크리닝이 세포외 장벽도 극복할 수 있는 덴드리머를 추가로 확인했다는 것을 보여준다. 분석은 예측된 활성을 갖는 추가적인 덴드리머를 디자인하기 위해 SAR을 제공했다. (도10A) 다양한 구조를 갖는 26개의 제1 세대 분해성 덴드리머는 1 mg/kg의 siRNA 투여량(n=3)에서 마이스(mice)의 인자 VII 녹다운(knockdown)에 대해 평가되었다. PBS 대조군(n=3). 데이터는 평균±s.d.로 보여진다. (도10B) 다중 분지를 갖는 분해성 덴드리머의 합리적인 디자인은 (I) 다중 IBC를 갖는 폴리아민의 선택 및 (II) 세대 확장을 통한 분지의 증가를 통해 달성되었다. 천연 폴리아민 스페르미딘(5A5) 및 스페르민(6A4)이 활용되었다. 1A2(1개의 IBC), 2A2 & 2A11(2개의 IBC), 3A3 & 3A5(3개의 IBC), 및 4A1 & 4A3(4개의 IBC)는 다중 분지를 갖는 분해성 덴드리머를 세대 확장을 통해 합성하기 위해 선택되었다(도11 참조). (도10C) 전략 I 및 전략 II를 통해 합리적으로 디자인된 24개의 분해성 덴드리머는 1 mg/kg의 siRNA 투여량(n=3)에서 마이스의 인자 VII 녹다운에 대해 평가되었다. PBS 대조군(n=3). 데이터는 평균±s.d.로 보여진다. 합리적으로 디자인된 덴드리머는 높은 히트율에서 활성이었다.
도11은 다중 분지를 갖는 분해성 덴드리머를 세대 확장 전략을 통해 준비하기 위한 2A2 & 2A11(2개의 IBC), 3A3 & 3A5(3개의 IBC), 및 4A1 & 4A3(4개의 IBC)의 합성 경로를 보여준다.
도12A 내지 도12E는 높은 전달 효율과 낮은 독성의 균형을 이루는 덴드리머를 추가로 확인하는, 일부 분해성 덴드리머(95% 초과의 생체내 FVII 녹다운)의 생체내 독성 평가를 보여준다. 일부 분해성 덴드리머 NP는 (도12A) 비슷한 크기 및 (도12B) 대조군 siRNA(siCTR) 결합 후 비슷한 총 표면 전하를 보유했다(나노입자는 도12B의 범례에 기반하여 좌측에서 우측으로 그래프에 도시되었다). C12-200 리피도이드(lipidoid) LNP는 비교할 만한 생체내 효율을 가진 비가수분해성 시스템의 가장 좋은 예를 나타내기 때문에 까다로운 비교를 제공했다. (도12C) 야생형 마이스(p26)는 일부 NP가 4 mg siCTR/kg(100 mg 덴드리머/kg 또는 28 mg 대조군 C12-200/kg)으로 i.v. 주사되었다(n=3). 체중의 변화는 덴드리머 정체성에 따른 제형 간에 다양했지만, 모든 NP는 정상적인 WT 마이스에서 대체로 독성이 없었다. (도12D) 3 mg siCTR/kg(75 mg/kg 5A2-SC8 및 6A3-SC12 또는 21 mg/kg C12-200) 주사 후 공격적인 MYC-유발 종양(p32)을 앓는 형질 전환 마이스의 체중 변화(n=5). (도12E) 32일, 36일, 40일, 및 44일에 5A2-SC8 및 6A3-SC12 나노입자가 3 mg siCTR/kg(75 mg 덴드리머/kg)의 투여랑으로 주사된 형질 전환 마이스의 카플란-마이어 생존 곡선(n=5). 종양을 앓는 마이스(취약한 숙주)에서는 담체의 독성이 과장되었고, 오직 5A2-SC8만이 잘 견디고 생존에 영향을 미치지 않을 수 있었다. 데이터는 평균 ± s.d.로 보여진다. (e) 맨텔-콕스 검정으로 통계 분석이 수행되었다; n.s. P>0.05; *P < 0.05.
도13A 및 도13B는 공격적인 형질 전환 MYC-유발 간종양 모델이, 종양 성장 억제를 위한 miRNA 전달용 모듈 분해성 덴드리머의 독성 및 효능을 평가하기 위해 선택되었다(Nguyen et al., 2014). (도13A) LAP-tTa를 보여주는 개략도; TRE-MYC 형질 전환 마이스 모델. TRE-MYC는 독시사이클린(Dox)의 부재 또는 존재 하에 LAP-tTA 도입 유전자가 존재할 때 간-특이적 LAP 프로모터에 의해 온 또는 오프된다. (도13B) 어떤 치료도 없으면, 간 종양은 약 p20-26으로 보이고, 그 다음 간은 p32로 작은 종양들로 가득차고, 마지막으로 종양이 크게 성장하며 간의 크기는 p42에서 p60으로 극적으로 증가한다.
도14A 내지 도14C는 형광 이미징이 간 내의 종양 세포로의 siRNA의 전달을 확인한다는 것을 보여준다. (도14A) 41일째 나이에 공격적인 간종양을 앓는 형질 전환 마이스의 육안 해부학 및 형광 이미징. 형광 이미징은 Cy5.5로 표지된 siRNA로 제형화된 5A2-SC8 나노입자가 1 mg Cy5.5-siRNA/kg을 i.v. 주사한 후 24시간 후 암성(cancerous) 간 전체 내의 막대한 siRNA 축적과 비장 및 신장 내의 작은 축적을 매개한다는 것을 보여준다. 5A2-SC8 NP가 생체 내에서 종양 세포내로 siRNA를 전달할 수 있는지를 추가로 확인하기 위해, i.v. 주사 24시간 후, 간의 종양 조직이 수집되고, OTC에 내장되고, H&E 염색 및 공초점 이미징을 위해 절편되었다. (도14B) H&E 염색은 간이 종양을 함유한다는 것을 확인한다. 종양 조직의 동일한 슬라이드는 공초점 이미징을 이용해 스캔되었고, 3개의 채널에서 캡처되었다: 핵을 위한 DAPI(파란색), 팔로이딘으로 염색된 액틴을 위한 FITC(초록색), 및 siRNA를 위한 Cy5.5(빨간색). (도14C) 동일한 영역의 공초점 이미징은 5A2-SC8이 간 내의 종양 세포에 siRNA를 효과적으로 전달할 수 있다는 것을 보여준다.
또한, 도15A 및 도15B는 Cy5.5-표지 siRNA로 제형화된 5A2-SC8 NP의 정상 야생형 마이스 및 간 종양을 앓는 마이스의 생체분포(biodistribution)을 보여주고(도15A), 종양을 앓는 마이스의 간의 H&E 염색 이미지를 보여준다(도15B). 5A2-SC8 NP는 1 mg siRNA/kg의 i.v. 주사 24시간 후 정상 마이스 및 간 종양을 앓는 마이스 양쪽 모두의 간 전체 내의 Cy5.5-표지 siRNA 축적을 매개한다. H&E 염색 이미지는 종양을 앓는 마이스의 간이 종양으로 가득찬다는 것과 공초점 이미징에 사용된 슬라이드가 종양 세포를 함유한다는 것을 보여준다. 간의 크기가 종양이 성장함에 따라 증가한다는 점에 유의한다(도15A의 비례적으로 동등한 상자 참조).
도16A 내지 도16H는 치료적 Let-7g miRNA 모방체를 임상적으로 적절하고 공격적인 MYC-유발 유전적 종양 모델에 전달하여 상당한 생존 이점을 초래할 수 있는 모듈 분해성 덴드리머를 보여준다. (도16A) 5A2-SC8 NP는, 혈액 내 및 (도16B) 수확된 간 조직 내에서 측정(1회 주사, 1 mg/kg, p26 마이스, 48시간 후 주사)된 바와 같이(좌측의 siCTR 및 우측의 siFVII), MYC-유발 간종양을 앓는 형질 전환 마이스의 FVII 단백질 침묵을 가능하게 한다. (도16C) 5A2-SC8 NP는 MYC-유발 간종양을 앓는 형질 전환 마이스의 간 조직에의 Let-7g의 전달을 가능하게 했다(1회 주사, 1 mg/kg, p26 마이스, 48시간 후 주사). Let-7g 발현은 상당히 증가한 반면, 다른 Let-7 패밀리 멤버는 영향을 받지 않았다(좌측은 siCTR 및 우측의 siFVII). (도16D) MYC-유발 간종양을 앓는 형질 전환 마이스는 26일째(종양 발달이 시작된 후인)부터 61일째까지 매주 1 mg/kg의 Let-7g i.v. 주사를 매주 받았다. Let-7g를 받은 마이스는 눈에 띄게 작은 복부를 가졌다. (도16E) 복부 둘레는 처리된 마이스가 대조군에 비해 더 작았다. (도16F) Let-7g 모방체 및 대조군 모방체가 주사된 마이스의 간의 대표적인 이미지는 종양 부하(tumor burden) 감소를 보여준다. (도16G) 5A2-SC8 NP 내의 miRNA 모방체의 매주 전달은 정상 체중 증가에는 영향을 미치지 않은 반면, C12-200 LNP 내의 miRNA 전달은 체중 감소 및 사망을 초래했다(n=5). (도16H) 26일째부터 61일째까지의 매주 Let-7g의 전달은 생존을 연장했다. 처리하지 않은 대조군 마이스(n=9) 및 표적하지 않은 모방체 대조군을 함유하는 5A-SC8 NP를 받은 마이스(n=5)는 생후 약 60일 뒤에 사망했다. C12-200 LNP가 주사된 마이스는 조기에 사망했다(n=7). #C12-200 + CTR 모방체 실험은 C12-200 + Let-7g 모방체 주사를 받은 모든 마이스가 사망했기 때문에 중단되었다. 5A-SC8 NP 내의 Let-7g의 전달은 명백한 생존 이점을 부여했다. 데이터는 평균 ± s.d.로 보여진다. 통계 분석은 (a,b,c,e) 투-테일드 스튜던트 t 검정(two-tailed Student's t-test), 또는 (h) 맨텔-콕스 검정; n.s. P > 0.05; *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001으로 수행되었다.
도17A 내지 도17C는 HeLa-Luc(도17A), A549-Luc(도17B), 및 MDA-MB231-Luc(도17C)의 콜레스테롤, 인지질, 및 PEG 지질의 다른 조합으로 제형화된 덴드리머 나노입자를 이용한 siLuc 전달의 전달을 보여준다.
도18A 및 도18B는 (도18A) DSPC 지질 vs PEG-DMG 및 DOPE 지질을 갖는 다른 조성물 제형의 HeLa-Luc으로의 siLuc의 전달에 대한 비교를 보여준다. 도18B는 DSPC 지질 vs DOPE 및 PEG-DHD 지질을 갖는 다른 조성물 제형의 HeLa-Luc로의 siLuc의 전달에 대한 비교를 보여준다.
도19는 나노입자 제형 내에 인지질 DSPC를 갖거나 갖지 않고, 덴드리머 또는 Z120을 함유하는 나노입자 조성물을 사용한 sgRNA 전달의 전달을 보여준다.
또한, 도20A 및 도20B는 sgRNA의 캡슐화 백분율(도20A) 및 HeLa-Luc-Cas9 세포 내로의 전달(도20B)을 보여준다.
또한, 도21A 및 도21B는 Luc mRNA가 전달된 IGROV 세포의 24시간 배양 후(도21A) 및 48시간 배양 후(도21B) 생존력을 보여준다.
도22는 mCherry mRNA 처리 후 세포의 형광 현미경을 보여주며, 이들 세포로의 mRNA의 전달을 보여준다.
일부 양태에서, 본 개시는 핵산의 담체로서 사용될 수 있는 지질양이온성 덴드리머를 제공한다. 일부 양태에서, 상기 덴드리머는 생리학적 조건 하에서 분해를 겪는 하나 이상의 그룹을 함유한다. 일부 양태에서, 상기 덴드리머는 덴드리머 및 하나 이상의 핵산을 포함하는 조성물로 제형화된다. 상기 조성물은 콜레스테롤 및/또는 인지질과 같은 하나 이상의 헬퍼 지질을 추가로 포함할 수 있다. 마지막으로, 일부 양태에서, 본 개시는 상기 덴드리머 조성물을 이용한 핵산 치료물로 치료될 수 있는 하나 이상의 질환을 치료하는 방법도 제공한다.
A. 화학적 정의
화학적 그룹의 맥락에서 사용되는 경우, "수소"는 -H를 의미하고; "하이드록시"는 -OH를 의미하고; "옥소"는 =O를 의미하고; "카보닐"은 -C(=O)-를 의미하고; "카르복시"는 -C(=O)OH(-COOH 또는 -CO2H로도 적힌다)를 의미하고; "할로"는 독립적으로 -F, -Cl, -Br, 또는 -I를 의미하고; "아미노"는 -NH2를 의미하고; "하이드록시아미노"는 -NHOH를 의미하고; "니트로"는 -NO2를 의미하고; "이미노"는 =NH를 의미하고; "시아노"는 -CN을 의미하고; "이소시아네이트"는 -N=C=O를 의미하고; "아지도"는 -N3를 의미하고; 1가 맥락에서 "포스페이트"는 -OP(O)(OH)2 또는 이의 탈양성자 형태를 의미하고; 2가 맥락에서 "포스페이트"는 -OP(O)(OH)O- 또는 이의 탈양성자 형태를 의미하고; "머캅토"는 -SH를 의미하고; "티오"는 =S를 의미하고; "설포닐"은 -S(O)2-를 의미하고; "하이드록시설포닐"은 -S(O)2OH를 의미하고; "설포아미드"는 -S(O)2NH2를 의미하며; "설피닐"은 -S(O)-를 의미한다.
화학식의 맥락에서 사용되는 경우, 기호 "-"는 단일 결합을 의미하고, "="는 이중 결합을 의미하고, "≡"는 삼중 결합을 의미한다. 기호 ""는, 단일 결합 또는 이중 결합이 존재하는 경우인, 선택적 결합을 표시한다. 기호 ""는 단일 결합 또는 이중 결합을 의미한다. 따라서, 예를 들어, 화학식 은 , , , 및 을 포함한다. 그리고 이러한 고리 원자가 하나보다 많은 이중 결합의 일부를 형성하지 않는다는 것이 이해된다. 더욱이, 공유 결합 기호 "-"는, 1개 또는 2개의 입체성 원자를 연결하는 경우, 어떤 선호되는 입체화학을 나타내지 않는다는 점에 유의해야 한다. 대신에, 모든 입체 이성질체뿐만 아니라 이들의 혼합물도 포함한다. 기호 ""는 결합을 가로질러 수직으로 그려지는 경우(예를 들어, 메틸에 있어서, ), 그룹의 부착 지점을 나타낸다. 부착 지점은, 독자가 부착 지점을 명확하게 식별하는 것을 돕기 위해, 전형적으로, 큰 그룹에 대해서만 이러한 방식으로 식별된다는 점에 유의한다. 기호 ""는, 쐐기의 두꺼운 끝에 부착된 그룹이 "페이지 바깥"으로 나오는, 단일 결합을 의미한다. 기호 ""는 쐐기의 두꺼운 끝에 부착된 그룹이 "페이지 안"으로 들어가는, 단일 결합을 의미한다. 기호 ""은 이중 결합 주위의 기하학이 정의되지 않은(예를 들어, E 또는 Z) 단일 결합을 의미한다. 그러므로, 두 선택 모두뿐만 아니라 이들의 조합도 의도된다. 본 출원에서 보여진 구조의 원자 상에 있는 임의의 정의되지 않은 원자가는 암시적으로 해당 원자에 결합된 수소 원자를 나타낸다. 탄소 원자 상의 굵은 점은 해당 탄소 원자에 부착된 수소가 페이지 평면의 바깥을 향하고 있다는 것을 나타낸다.
"R" 그룹이 고리 시스템 상에 "떠있는 그룹"으로 도시되는 경우, 예를 들어, 하기 화학식:
,
그러면 R은 임의의 상기 고리 원자에 부착된 임의의 수소 원자를 대체할 수 있고, 임의의 수소 원자는, 안정한 구조가 형성되는 한, 도시, 암시, 또는 명시적으로 정의된 수소를 포함한다. "R" 그룹은 축합고리(fused ring) 시스템 상에 "떠있는 그룹"으로 도시되는 경우, 예를 들어, 하기 화학식:
,
그러면, 달리 명시되지 않는 한, "R"은 축합고리의 임의의 고리 원자에 부착된 임의의 수소를 대체할 수 있다. 대체 가능한 수소는, 안정한 구조가 형성되는 한, 도시된 수소(예를 들어, 상기 화학식에서 질소에 부착된 수소), 암시된 수소(예를 들어, 상기 화학식에서 보이진 않지만 존재하는 것으로 이해되는 수소), 명시적으로 정의된 수소, 및 고리 원자의 정체성에 따라 존재하는 선택적 수소(예를 들어, X가 -CH-일 때 그룹 X에 부착된 수소)를 포함한다. 도시된 예에서, R은 축합고리 시스템의 5각고리 또는 6각고리 상에 존재할 수 있다. 상기 화학식에서, 괄호로 묶인 그룹 "R" 뒤에 즉시 따라오는 하위 첨자 "y"는 숫자 변수를 나타낸다. 달리 명시되지 않는 한, 이 변수는 0, 1, 2, 또는 2보다 큰 임의의 정수가 될 수 있고, 고리 또는 고리 시스템의 대체 가능한 수소의 최대 수에 의해서만 제한된다.
화학적 그룹 및 화합물 클래스의 경우, 그룹 또는 클래스의 탄소 원자의 수는 하기와 같이 나타낸다: "Cn"은 그룹/클래스의 탄소 원자의 정확한 수(n)을 정의한다. "C≤n"은 문제의 그룹/클래스에서 가능한 작은 최솟값을 갖고 그룹/클래스에 존재할 수 있는 탄소 원자의 최댓값를 정의하고, 예를 들어, 그룹 "알케닐(C≤8)" 및 클래스 "알켄(C≤8)"의 탄소 원자의 최솟값은 2로 이해된다. 1개 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알콕시 그룹을 지정하는 "알콕시(C≤10)"와 비교한다. "Cn-n'"은 그룹의 탄소 원자의 최솟값(n) 및 최댓값(n')을 모두 정의한다. 따라서, "알킬(C2-10)"은 2개 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알킬 그룹을 지정한다. 탄소수 지표는 그가 수식하는 화학적 그룹 또는 클래스를 선행하거나 따라갈 수 있고, 의미에 어떠한 변화도 나타내지 않고 괄호로 묶을 수도 묶지 않을 수도 있다. 따라서, 용어 "C5 올레핀", "C5-올레핀", "올레핀(C5)", 및 "올레핀C5"는 모두 동의어이다.
용어 "포화된"은 화합물 또는 화학적 그룹을 수식하기 위해 사용되는 경우, 탄소-탄소 이중 결합 또는 탄소-탄소 삼중 결합을 갖지 않는 화합물 또는 화학적 그룹을 의미하며, 하기에 명시된 경우를 제외한다. 상기 용어가 원자를 수식하기 위해 사용되는 경우에는, 상기 원자가 임의의 이중 결합 또는 삼중 결합의 일부가 아니라는 의미이다. 포화된 그룹의 치환된 버전의 경우, 하나 이상의 탄소 산소 이중 결합 또는 탄소 질소 이중결합이 존재할 수 있다. 이러한 결합이 존재하는 경우, 케토-엔올 상호변이(tautomerism) 또는 이민/엔아민 상호변이의 일부로서 발생할 수 있는 탄소-탄소 이중 결합은 배제되지 않는다. 용어 "포화된"이 물질의 용액을 수식하기 위해 사용되는 경우, 이는 그 용액에 그 물질이 더 이상 녹을 수 없다는 것을 의미한다.
용어 "지방족"은 수식어 "치환된"이 없이 사용되는 경우, 수식된 화합물 또는 화학적 그룹이 비환상(acyclic) 또는 환상(cyclic)이지만 비방향족 탄화수소 화합물 또는 그룹인 것을 의미한다. 지방족 화합물/그룹에서는, 탄소 원자가 선형 사슬, 분지된 사슬, 또는 비방향족 고리(알리사이클릭: alicyclic)로 함께 연결될 수 있다. 지방족 화합물/그룹은 탄소-탄소 단일 결합(알칸/알킬)으로 연결되어 포화될 수 있고, 또는 하나 이상의 탄소-탄소 이중 결합(알켄/알케닐) 또는 하나 이상의 탄소-탄소 삼중 결합(알킨/알키닐)을 가져 불포화될 수 있다.
용어 "방향족"은 화합물 또는 화학적 그룹을 수식하기 위해 사용되는 경우, 화합물 또는 화학적 그룹이 고리를 형성하는 결합의 상호작용에 의해 안정화되는 원자의 평면 불포화 고리를 함유한다는 것을 의미한다.
용어 "알킬"은 수식어 "치환된"이 없이 사용되는 경우, 부착점으로서의 탄소 원자, 선형 또는 분지된 비환상 구조를 갖고, 탄소 및 수소 외의 다른 원자를 갖지 않는 1가 포화 지방족 그룹을 지칭한다. 상기 그룹 -CH3(Me), -CH2CH3(Et), -CH2CH2CH3(nPr 또는 프로필), -CH(CH3)2(iPr, iPr, 또는 이소프로필), -CH2CH2CH2CH3(nBu), -CH(CH3)CH2CH3(sec-부틸), -CH2CH(CH3)2(이소부틸), -C(CH3)3(tert-부틸, t-부틸, t-Bu 또는 tBu), 및 -CH2C(CH3)3(네오펜틸)는 알킬 그룹의 한정되지 않는 예이다. 용어 "알칸디일"은 "치환된" 수식어가 없이 사용되는 경우, 부착점으로서의 1개 또는 2개의 포화된 탄소 원자, 선형 또는 분지된 비환상 구조를 갖고, 탄소-탄소 이중 결합 또는 삼중 결합을 갖지 않고, 탄소 및 수소 외의 다른 원자를 갖지 않는 2가 포화된 지방족 그룹을 의미한다. 상기 그룹 -CH2-(메틸렌), -CH2CH2-, -CH2C(CH3)2CH2-, 및-CH2CH2CH2-는 알칼디일 그룹의 한정되지 않는 예이다. "알칸"은 화학식 H-R을 갖는 화합물의 클래스를 지칭하고, 여기서 R은 상기에 정의된 바와 같은 알킬이다. 임의의 이들 용어가 "치환된" 수식어와 함께 사용되는 경우, 하나 이상의 수소가 독립적으로 -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -NO2, -CO2H, -CO2CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(O)CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -C(O)NH2, -C(O)NHCH3, -C(O)N(CH3)2, -OC(O)CH3, -NHC(O)CH3, -S(O)2OH, 또는 -S(O)2NH2로 대체된다. 하기의 그룹은 치환된 알킬 그룹의 한정되지 않는 예이다: -CH2OH, -CH2Cl, -CF3, -CH2CN, -CH2C(O)OH, -CH2C(O)OCH3, -CH2C(O)NH2, -CH2C(O)CH3, CH2OCH3, CH2OC(O)CH3, CH2NH2, CH2N(CH3)2, 및 CH2CH2Cl. 용어 "할로알킬"은 치환된 알킬의 부분집합이고, 여기에는 수소 원자 대체물이 할로(F, Cl, Br, 또는 I와 동일)로 한정되어, 탄소, 수소, 및 할로젠 외에 다른 원자는 존재하지 않는다. 그룹 -CH2Cl은 할로알킬의 한정되지 않는 예이다. 용어 "플루오로알킬"은 치환된 알킬의 부분집합이고, 여기에는 수소 원자 대체물이 플루오로로 한정되어 탄소, 수소, 및 불소 외에 다른 원자가 존재하지 않는 것이다. 그룹 -CH2F, -CF3, 및 -CH2CF3는 플루오로알킬 그룹의 한정되지 않는 예이다.
용어 "사이클로알킬"은 "치환된" 수식어가 없이 사용되는 경우, 부착점으로서의 탄소 원자를 갖고, 이 탄소 원자는 하나 이상의 비방향족 고리 구조의 일부를 형성하며, 탄소-탄소 이중 결합 또는 삼중 결합을 갖지 않고, 탄소 및 수소 외에 다른 원자를 갖지 않는, 1가 포화된 지방족 그룹을 지칭한다. 한정되지 않는 예는 하기를 포함한다: -CH(CH2)2(사이클로프로필), 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 또는 사이클로헥실(Cy). 용어 "사이클로알칸디일"은 "치환된" 수식어가 없는 경우 부착점으로서 2개의 탄소 원자를 갖고, 탄소-탄소 이중 결합 또는 삼중 결합, 및 탄소 및 수소 외 다른 원자를 갖지 않는 2가 지방족 그룹을 의미한다. 그룹 은 사이클로알칸디일 그룹의 한정되지 않는 예이다. "사이클로알칸"은 화학식 H-R을 갖는 화합물의 클래스를 지칭하고, 여기서 R은 상기에 정의된 바와 같은 사이클로알킬이다. 임의의 이들 용어가 "치환된" 수식어와 함께 사용되는 경우, 하나 이상의 수소가 독립적으로 -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -NO2, -CO2H, -CO2CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(O)CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -C(O)NH2, -C(O)NHCH3, -C(O)N(CH3)2, -OC(O)CH3, -NHC(O)CH3, -S(O)2OH, 또는 -S(O)2NH2로 대체된다.
용어 "알케닐"은 "치환된" 수식어가 없이 사용되는 경우, 부착점으로서의 탄소, 선형 또는 분지된 비환형 구조, 및 적어도 하나의 비방향족 탄소-탄소 이중 결합을 갖고, 탄소-탄소 삼중 결합, 및 탄소 및 산소 외에 다른 원자를 갖지 않는 1가 불포화 지방족 그룹을 의미한다. 한정되지 않는 예는 하기를 포함한다: CH=CH2(비닐), CH=CHCH3, CH=CHCH2CH3, CH2CH=CH2(알릴), CH2CH=CHCH3, 및 CH=CHCH=CH2. 용어 "알켄다일"은 "치환된" 수식어가 없이 사용되는 경우, 부착점으로서의 2개의 탄소 원자, 선형 또는 분지된 비환형 구조, 및 적어도 하나의 비방향족 탄소-탄소 이중 결합을 갖고, 탄소-탄소 삼중 결합, 및 탄소 및 수소 외의 다른 원자를 갖지 않는 2가 불포화 지방족 그룹을 지칭한다. 상기 그룹 -CH=CH-, -CH=C(CH3)CH2-, -CH=CHCH2-, 및 -CH2CH=CHCH2-은 알켄디일 그룹의 한정되지 않는 예시이다. 알켄디일 그룹은 지방족인 반면, 양 끝에 연결되면, 이 그룹은 방향족 구조의 일부를 형성하는 것에서 배제되지 않는다는 것을 유의한다. 용어 "알켄" 및 "올레핀"은 동의어이고, 화학식 H-R을 갖고 여기서 R은 상기에서 정의된 바와 같은 알케닐인 화합물의 클래스를 지칭한다. 유사하게, 용어 "말단 알켄" 및 "α-올레핀"은 동의어이며, 탄소-탄소 이중 결합 1개만을 갖는 알켄으로서, 상기 결합은 분자의 끝에 있는 비닐 그룹의 일부인 것을 의미한다. 임의의 이들 용어가 "치환된" 수식어와 함께 사용되는 경우, 하나 이상의 수소 원자가 독립적으로 -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -NO2, -CO2H, -CO2CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(O)CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -C(O)NH2, -C(O)NHCH3, -C(O)N(CH3)2, -OC(O)CH3, -NHC(O)CH3, -S(O)2OH, 또는 -S(O)2NH2로 대체된다. 그룹 -CH=CHF, -CH=CHCl 및 -CH=CHBr은 치환된 알케닐 그룹의 한정되지 않는 예이다.
용어 "알키닐"은 "치환된" 수식어가 없이 사용되는 경우, 부착점으로서의 탄소 원자, 선형 또는 분지된 비환형 구조, 및 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖고, 탄소 및 수소 외에 다른 원자를 갖지 않는 1가 불포화된 지방족 그룹을 의미한다. 여기에 사용된 바와 같이, 용어 알키닐은 하나 이상의 비방향족 탄소-탄소 이중 결합의 존재를 배제하지 않는다. 그룹 -C≡CH, -C≡CCH3, 및 -CH2C≡CCH3은 알키닐 그룹의 한정되지 않는 예이다. "알킨"은 화학식 H-R을 갖고 여기서 R은 알키닐인 화합물의 클래스를 지칭한다. 임의의 이들 용어가 "치환된" 수식어와 함께 사용되는 경우, 하나 이상의 수소 원자가 독립적으로 -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -NO2, -CO2H, -CO2CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(O)CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -C(O)NH2, -C(O)NHCH3, -C(O)N(CH3)2, -OC(O)CH3, -NHC(O)CH3, -S(O)2OH, 또는 -S(O)2NH2로 대체된다.
용어 "아릴"은 "치환된" 수식어가 없이 사용되는 경우, 부착점으로서의 방향족 탄소 원자를 갖고, 이 탄소 원자는 하나 이상의 6각 방향족 고리 구조의 일부를 형성하는 것인 1가 불포화된 그룹으로서, 여기서 고리 원자가 모두 탄소이고, 여기서 그룹은 탄소 및 수소 외에 다른 원자로 구성되지 않는 것을 의미한다. 하나보다 많은 고리가 존재하는 경우, 고리는 축합되거나 축합되지 않을 수 있다. 여기서 사용된 바와 같이, 상기 용어는 제1 방향족 고리 또는 임의의 추가적으로 존재하는 방향족 고리에 부착된 하나 이상의 알킬 또는 아랄킬 그룹(탄소 수 한정 허용)의 존재를 배제하지 않는다. 아릴 그룹의 한정되지 않는 예는 페닐(Ph), 메틸페닐, (디메틸)페닐, C6H4CH2CH3(에틸페닐), 나프틸, 및 비페닐(biphenyl)으로부터 유래된 1가 그룹을 포함한다. 용어 "아렌디일"은 "치환된" 수식어가 없이 사용되는 경우, 부착점으로서의 2개의 방향족 탄소 원자를 갖고, 이 탄소 원자는 하나 이상의 6각 방향족 고리 구조의 일부를 형성하는 것인 2가 방향족 그룹으로서, 여기서 고리 원자는 모두 탄소이며, 여기서 상기 1가 그룹은 탄소 및 수소 외에 다른 원자로 구성되지 않는 것을 지칭한다. 여기서 사용된 바와 같이, 상기 용어는 제1 방향족 고리 또는 임의의 추가적으로 존재하는 방향족 고리에 부착된 하나 이상의 알킬, 아릴, 또는 아랄킬 그룹(탄소 수 제한 허용)의 존재를 배제하지 않는다. 하나보다 많은 고리가 존재하는 경우, 상기 고리는 축합되거나 축합되지 않을 수 있다. 축합되지 않은 고리는 하기 중 하나 이상과 연결될 수 있다: 공유 결합, 알칸디일, 또는 알켄디일 그룹(탄소 수 제한 허용). 아렌디일 그룹의 한정되지 않는 예는 하기를 포함한다:
, , , , , 및 .
"아렌"은 화학식 H-R을 갖고, 여기서 R은 상기에 정의된 바와 같은 아릴인 화합물의 클래스를 지칭한다. 벤젠 및 톨루엔은 아렌의 한정되지 않는 예이다. 임의의 이들 용어가 "치환된" 수식어와 함께 사용되는 경우, 하나 이상의 수소가 독립적으로 -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -NO2, -CO2H, -CO2CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(O)CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -C(O)NH2, -C(O)NHCH3, -C(O)N(CH3)2, -OC(O)CH3, -NHC(O)CH3, -S(O)2OH, 또는 -S(O)2NH2로 대체된다.
용어 "아랄킬"은 "치환" 수식어가 없이 사용되는 경우, 1가 그룹 -알칸디일-아릴을 의미하고, 용어 알칸디일 및 아릴은 각각 상기에 제공된 정의와 일치하는 방식으로 사용된다. 한정되지 않는 예는 하기와 같다: 페닐메틸(벤질, Bn) 및 2-페닐-에틸. 용어 아랄킬은 "치환된" 수식어와 함께 사용되는 경우, 알칸디일 및/또는 아릴 그룹의 하나 이상의 수소가 독립적으로 -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -NO2, -CO2H, -CO2CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(O)CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -C(O)NH2, -C(O)NHCH3, -C(O)N(CH3)2, -OC(O)CH3, -NHC(O)CH3, -S(O)2OH, 또는 -S(O)2NH2로 대체된다. 치환된 아랄킬의 한정되지 않는 예는 하기와 같다: (3-클로로페닐)-메틸, 및 2-클로로-2-페닐-에트-1-일.
용어 "헤테로아릴"은 "치환된" 수식어가 없이 사용되는 경우, 부착점으로서의 방향족 탄소 원자 또는 질소 원자를 갖고, 이 탄소 원자 또는 질소 원자는 하나 이상의 방향족 고리 구조의 일부를 형성하는 것인 1가 방향족 그룹으로서, 여기서 적어도 하나의 고리 원자는 질소, 산소, 또는 황이고, 여기서 헤테로아릴 그룹은 탄소, 수소, 방향족 질소, 방향족 산소, 및 방향족 황 외에 다른 원자로 구성되지 않는 것을 지칭한다. 헤테로 아릴 고리는 질소, 산소, 및 황으로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 고리 원자를 함유할 수 있다. 하나보다 많은 고리가 존재하는 경우, 상기 고리는 축합되거나 축합되지 않을 수 있다. 여기에 사용된 바와 같이, 상기 용어는 방향족 고리 또는 방향족 고리 시스템에 부착된 하나 이상의 알킬, 아릴, 및/또는 아랄킬 그룹(탄소 수 제한 허용)의 존재를 배제하지 않는다. 헤테로아릴 그룹의 한정되지 않는 예는 퓨라닐, 이미다졸릴, 인돌릴, 인다졸릴(Im), 이소옥사졸릴, 메틸피리디닐, 옥사졸릴, 페닐피리디닐, 피리디닐(피리딜), 피롤릴, 피리미디닐, 피라지닐, 퀴놀릴, 퀴나졸릴, 퀴노옥살리닐, 트리아지닐, 테트라졸릴, 티아졸릴, 티에닐, 및 트리아졸릴을 포함한다. 용어 "N-헤테로아릴"은 부착점으로서 질소 원자를 갖는 헤테로아릴 그룹을 지칭한다. 용어 "헤테로아렌디일"은 "치환된" 수식어가 없이 사용되는 경우, 2개의 부착점으로서 2개의 방향족 탄소 원자, 2개의 방향족 질소 원자, 또는 1개의 방향족 탄소 원자 및 1개의 방향족 질소 원자를 갖고, 이 원자는 하나 이상의 방향족 고리 구조의 일부를 형성하는 것인 2가 방향족 그룹으로서, 여기서 상기 적어도 하나의 고리 원자는 질소, 산소 또는 황이고, 여기서 상기 2가 그룹은 탄소, 수소, 방향족 질소, 방향족 산소 및 방향족 황으로 구성된 것을 의미한다. 하나보다 많은 고리가 존재하는 경우, 상기 고리는 축합되거나 축합되지 않을 수 있다. 축합되지 않은 고리는 하기 중 하나 이상을 통해 연결될 수 있다: 공유 결합, 알칸디일, 또는 알켄디일 그룹(탄소 수 제한 허용). 여기에 사용된 바와 같이, 상기 용어는 상기 방향족 고리 또는 방향족 고리 시스템에 부착된 하나 이상의 알킬, 아릴, 및/또는 아랄킬 그룹(탄소 수 제한 허용)의 존재를 배제하지 않는다. 헤테로아렌디일 그룹의 한정되지 않는 예는 하기를 포함한다:
, 및 .
"헤테로아렌"은 화학식 H-R으로서, R은 헤테로아릴인 화합물의 클래스를 의미한다. 피리딘 및 퀴놀린은 헤테로아렌의 한정되지 않는 예이다. 이들 용어가 "치환된" 수식어와 함께 사용되는 경우, 하나 이상의 수소 원자가 독립적으로 -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -NO2, -CO2H, -CO2CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(O)CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -C(O)NH2, -C(O)NHCH3, -C(O)N(CH3)2, -OC(O)CH3, -NHC(O)CH3, -S(O)2OH, 또는 -S(O)2NH2로 대체된다.
용어 "헤테로사이클로알킬"은 "치환된" 수식어가 없이 사용되는 경우, 부착점으로서의 탄소 원자 또는 질소 원자를 갖고, 이 탄소 원자 또는 질소 원자는 하나 이상의 비방향족 고리 구조의 일부를 형성하는 것인 1가 비방향족 그룹으로서, 여기서 적어도 하나의 고리 원자는 질소, 산소, 또는 황이고, 여기서 헤테로사이클로알킬 그룹은 탄소, 수소, 질소, 산소, 및 황 외에 다른 원자로 구성되지 않은 것을 지칭한다. 헤테로사이클로알킬 고리는 질소, 산소, 또는 황으로부터 선택된 1개, 2개, 3개, 또는 4개 고리 원자를 가질 수 있다. 하나보다 많은 고리가 존재하는 경우, 상기 고리는 축합되거나 축합되지 않을 수 있다. 여기에 사용된 바와 같이, 상기 용어는 고리 또는 고리 시스템에 부착된 하나 이상의 알킬(탄소 수 제한 허용)의 존재를 배제하지 않는다. 또한, 상기 용어는 고리 또는 고리 시스템에 하나 이상의 이중 결합의 존재를 배제하지 않지만, 단, 초래되는 그룹은 비방향족으로 유지된다. 헤테로사이클로알킬의 한정되지 않는 예는 아지리디닐, 아제티디닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 테트라하이드로퓨라닐, 테트라하이드로티오퓨라닐, 테트라하이드로피라닐, 피라닐, 옥시라닐, 및 옥세타닐을 포함한다. 용어 "N-헤테로사이클로알킬"은 부착점으로서의 질소 원자를 갖는 헤테로사이클로알킬 그룹을 지칭한다. N-피롤리디닐은 이러한 그룹의 예이다. 용어 "헤테로사이클로알칸디일"은 "치환된" 수식어가 없이 사용되는 경우, 2개의 부착점으로서의 2개의 탄소 원자, 2개의 질소 원자, 또는 1개의 탄소 원자 및 1개의 질소 원자를 갖고, 이 원자는 하나 이상의 고리 구조의 일부를 형성하는 것인 2가 환형 그룹으로서, 여기서 적어도 하나의 고리 원자는 질소, 산소, 또는 황이고, 여기서 상기 2가 그룹은 탄소, 수소, 질소, 산소, 및 황 외에 다른 원자로 구성되지 않는 것을 지칭한다. 하나보다 많은 고리가 존재하는 경우, 상기 고리는 축합되거나 축합되지 않을 수 있다. 축합되지 않은 고리는 하기 중 하나 이상을 통해 연결될 수 있다: 공유 결합, 알칸디일, 또는 알켄디일 그룹(탄소 수 제한 허용). 여기에 사용된 바와 같이, 상기 용어는 고리 또는 고리 시스템에 부착된 하나 이상의 알킬 그룹(탄소 수 제한 허용)의 존재를 배제하지 않는다. 또한, 상기 용어는 고리 또는 고리 시스템의 하나 이상의 이중 결합의 존재를 배제하지 않지만, 단, 초래되는 그룹은 비방향족으로 유지된다. 헤테로사이클로알칸디일 그룹의 한정되지 않는 예는 하기를 포함한다:
, , 및 .
이들 용어가 "치환된" 수식어와 함께 사용되는 경우, 하나 이상의 수소 원자가 독립적으로 -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -NO2, -CO2H, -CO2CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(O)CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -C(O)NH2, -C(O)NHCH3, -C(O)N(CH3)2, -OC(O)CH3, -NHC(O)CH3, -S(O)2OH, 또는 -S(O)2NH2로 대체된다.
용어 "아실"은 "치환된" 수식어가 없이 사용되는 경우, -C(O)R 그룹으로서, 여기서 R은 상기에서 정의된 바와 같은, 수소, 알킬, 사이클로알킬, 알케닐, 아릴, 아랄킬, 또는 헤테로아릴인 것을 지칭한다. 그룹, -CHO, -C(O)CH3(아세틸, Ac), -C(O)CH2CH3, -C(O)CH2CH2CH3, -C(O)CH(CH3)2, -C(O)CH(CH2)2, -C(O)C6H5, -C(O)C6H4CH3, -C(O)CH2C6H5, -C(O)(이미다졸릴)은 아실 그룹의 한정되지 않는 예이다. "티오아실", -C(S)R은 그룹 -C(O)R의 산소 원자가 황 원자로 대체된 것을 제외하고는 유사한 방식으로 정의된다. 용어 "알데하이드"는 상기에 정의된 바와 같은 알칸에 상응하고, 여기서 적어도 하나의 수소 원자는 -CHO 그룹으로 대체된다. 임의의 이들 용어가 "치환된" 수식어와 함께 사용되는 경우, 하나 이상의 수소 원자(있다면, 카보닐 또는 티오카보닐 그룹의 탄소 원자에 직접 부착된 수소 원자를 포함)가 독립적으로 -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -NO2, -CO2H, -CO2CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(O)CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -C(O)NH2, -C(O)NHCH3, -C(O)N(CH3)2, -OC(O)CH3, -NHC(O)CH3, -S(O)2OH, 또는 -S(O)2NH2로 대체된다. 그룹, -C(O)CH2CF3, -CO2H (카르복실), -CO2CH3 (메틸카르복실), -CO2CH2CH3, -C(O)NH2(칼바모일), 및 -CON(CH3)2는 치환된 아실 그룹의 한정되지 않는 예이다.
용어 "알콕시"는 "치환된" 수식어가 없이 사용되는 경우, 그룹 -OR으로서, R은 상기에 정의된 바와 같은 알킬인 것을 의미한다. 한정되지 않는 예는 하기를 포함한다: -OCH3(메톡시), -OCH2CH3(에톡시), -OCH2CH2CH3, -OCH(CH3)2(이소프로폭시), -OC(CH3)3(tert-부톡시), -OCH(CH2)2, -O-사이클로펜틸, 및 -O-사이클로헥실을 포함한다. 용어 "사이클로알콕시", "알케닐옥시," "알키닐옥시," "아릴옥시," "아랄콕시," "헤테로아릴옥시," "헤테로사이클로알콕시," 및 "아실옥시"는 "치환된" 수식어가 없이 사용되는 경우, -OR로 정의된 그룹으로서, R은 각각 사이클로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴, 헤테로사이클로알킬, 및 아실인 것을 지칭한다. 용어 "알콕시디일"은 2가 그룹 -O-알칸디일-, -O-알칸디일-O-, 또는 -알칸디일-O-알칸디일-을 지칭한다. 용어 "알킬티오" 및 "아실티오"는 "치환된" 수식어가 없이 사용되는 경우, 그룹 -SR로서, R은 각각 알킬 및 아실인 것을 의미한다. 용어 "알코올"은 상기에 정의된 바와 같은 알칸에 상응하며, 여기서 적어도 하나의 수소 원자가 알콕시 그룹으로 대체되는 것이다. 용어 "에테르"는 상기에 정의된 바과 같은 알칸에 상응하며, 여기서 적어도 하나의 수소 원자는 알콕시 그룹으로 대체되는 것이다. 임의의 이들 용어가 "치환된" 수식어와 함께 사용되는 경우, 적어도 하나의 수소 원자는 독립적으로 -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -NO2, -CO2H, -CO2CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(O)CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -C(O)NH2, -C(O)NHCH3, -C(O)N(CH3)2, -OC(O)CH3, -NHC(O)CH3, -S(O)2OH, 또는 -S(O)2NH2로 대체된다.
용어 "알킬아미노"는 "치환된" 수식어가 없이 사용되는 경우, -NHR 그룹으로서, R은 상기에 정의된 바와 같은 알킬인 것을 의미한다. 한정되지 않는 예는 하기를 포함한다: -NHCH3 및 -NHCH2CH3. 용어 "디알킬아미노"는 "치환된" 수식어가 없이 사용되는 경우, -NRR' 그룹으로서, R 및 R'는 동일하거나 상이한 알킬 그룹일 수 있고, 또는 R 및 R'가 함께 알칸디일을 나타낼 수 있는 것을 지칭한다. 디알킬아미노 그룹의 한정되지 않는 예는 하기를 포함한다: -N(CH3)2 및 -N(CH3)(CH2CH3). 용어 "사이클로알킬아미노", "알케닐아미노", "알키닐아미노", "아릴아미노", "아랄킬아미노", "헤테로아릴아미노", "헤테로사이클로알킬아미노", "알콕시아미노", 및 "알킬설포닐아미노"는 "치환된" 수식어가 없이 사용되는 경우, -NHR로 정의되는 그룹으로서, R은 각각 사이클로알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴, 헤테로사이클로알킬, 알콕시, 및 알킬설포닐인 것을 의미한다. 아릴아미노 그룹의 한정되지 않는 예는 -NHC6H5이다. 용어 "알킬아미노디일"은 2가 그룹 -NH-알칸디일-, -NH-알칸디일-NH-, 또는 -알칸디일-NH-알칸디일-을 지칭한다. 용어 "아미도"(아실아미노)는 "치환된" 수식어가 없이 사용되는 경우, -NHR 그룹으로서, R은 상기에 정의된 바와 같은 아실인 것을 지칭한다. 아미도 그룹의 한정되지 않는 예는 -NHC(O)CH3이다. 용어 "알킬이미노"는 "치환된" 수식어가 없이 사용되는 경우, 2가 그룹 =NR으로서, R은 상기에 정의된 바와 같은 알킬인 것을 의미한다. 임의의 이들 용어가 "치환된" 수식어와 함께 사용되는 경우, 탄소 원자에 부착된 하나 이상의 수소가 독립적으로 -OH, -F, -Cl, -Br, -I, -NH2, -NO2, -CO2H, -CO2CH3, -CN, -SH, -OCH3, -OCH2CH3, -C(O)CH3, -NHCH3, -NHCH2CH3, -N(CH3)2, -C(O)NH2, -C(O)NHCH3, -C(O)N(CH3)2, -OC(O)CH3, -NHC(O)CH3, -S(O)2OH, 또는 -S(O)2NH2로 대체된다. 그룹 -NHC(O)OCH3 및 -NHC(O)NHCH3은 치환된 아미도 그룹의 한정되지 않는 예이다.
단어 "하나(a)" 또는 "한(an)"은 용어 "포함하는"과 함께 청구항 및/또는 명세서에서 사용되는 경우, "1개"를 의미할 수 있으나, "1개 이상" 및 "적어도 1개"와도 일치한다.
본 출원 전반에서, 용어 "약"은, 값이 그 값을 결정하기 위해 사용되는 장치 또는 방법, 또는 연구 대상들 간에 존재하는 변화에 대한 내재된 오류의 변화를 포함한다는 것을 나타내기 위해 사용된다.
본 출원에 사용된 바와 같이, 용어 "평균 분자량"은 각 중합체 종의 몰수 및 해당 종의 몰질량 사이의 관계를 지칭한다. 특히, 각 중합체 분자는 상이한 중합 수준을 가지므로 상이한 몰질량을 가질 수 있다. 평균 분자량은 복수의 중합체 분자의 분자량을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 평균 분자량은 평균 몰질량과 전형적으로 동의어이다. 특히, 평균 분자량의 3개의 주요 유형이 존재한다: 수평균몰질량, 무게평균몰질량, 및 Z-평균몰질량. 본 출원의 문맥에서, 달리 명시되지 않는 한, 평균몰질량은 화학식의 수평균몰질량 또는 무게평균몰질량을 나타낸다. 일부 양태에서, 평균분자량은 수평균몰질량이다. 일부 양태에서, 평균몰질량은 지질에 존재하는 PEG 성분을 서술하는 데 사용될 수 있다.
용어 "포함한다(comprise)" "가진다(has)" 및 "포함하다(include)"는 한정 없는 연결 동사이다. "포함한다(comprise)", "포함하는", "가지다", "갖는", "포함하다(include)" 및 "포함하는"과 같은 하나 이상의 이들 동사의 어떤 형태 또는 시제도 한정이 없다. 예를 들어, 하나 이상의 단계를 "포함하다", "가지다" 또는 "포함하다"는 임의의 방법은 상기 하나 이상의 단계만을 갖는 것으로 한정되지 않고, 다른 나열되지 않은 단계도 포함한다.
용어 "효과적인"은, 이 용어가 명세서 및/또는 청구범위에 사용되는 바와 같이, 원하는, 예상되는, 또는 의도된 결과를 달성하기에 적절하다는 의미이다. "효과적인 양," "치료적으로 효과적인 양" 또는 "약학적으로 효과적인 양"은 화합물으로 환자 또는 피실험자를 치료하는 맥락에서 사용되는 경우, 질환을 치료하기 위해 피실험자 또는 환자에게 투여될 때 질병의 이러한 치료에 영향을 미치기에 충분한 화합물의 양을 의미한다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "IC50"는 최대 반응이 얻어진 것의 50%인 억제 투여량을 지칭한다. 이 정량적 측정은 주어진 생물학적, 생화학적, 또는 화학적 과정(또는 과정의 구성 요소, 즉, 효소, 세포, 세포 수용체 또는 미생물)을 반으로 억제하기 위해 특정 약 또는 다른 물질(억제제)이 얼마나 필요한지를 나타낸다.
제1 화합물의 "이성질체"는 각 분자가 제1 화합물과 동일한 구성 원자를 함유하지만, 이들 원자의 배열이 3차원에서 상이한 별개의 화합물이다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "환자" 또는 "피실험자"는 인간, 원숭이, 소, 양, 염소, 개, 고양이, 마이스, 래트, 기니피그, 또는 이들의 형질 전환 종과 같은 살아있는 포유류 유기체를 지칭한다. 특정 양태에서, 환자 또는 피실험자는 영장류이다. 인간 피실험자의 한정되지 않는 예는 성인, 청소년, 유아 및 태아이다.
여기에 일반적으로 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한"은 적절한 의학적 판단의 범위 내에서, 인간 및 동물의 조직, 장기, 및/또는 체액과의 접촉 용도에 적합하고, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 기타 문제 또는 합리적인 유익/위험 비율에 상응하는 합병증이 없는, 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투약 형태를 지칭한다.
"약학적으로 허용 가능한 염"은 상기에 정의한 바와 같이 약학적으로 허용 가능하고, 원하는 약학적 활성을 보유하는 본 발명의 화합물의 염을 의미한다. 이러한 염은, 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 및 유사물과 같은 무기산으로 형성된 산 부가 염, 또는 1,2-에탄디설포닉 산, 2-하이드록시에탄설포닉 산, 2-나프탈렌설포닉 산, 3-페닐프로피오닉 산, 4,4'-메틸렌비스(3-하이드록시-2-엔-1-카르복실산), 4-메틸비사이클로[2.2.2]옥타-2-엔-1-카르복실산, 아세트산, 지방족 모노- 및 디카르복실산, 지방족 황산, 방향족 황산, 벤젠술폰산, 벤조산, 캄폴술폰산, 탄산, 신남산, 구연산, 사이클로펜탄프로피오닉 산, 에탄 술폰산, 푸마르산, 글루코헵토닉 산, 글루콘산, 글루타민산, 글리콜산, 헵타노익 산, 헥사노익 산, 하이드록시나프토익 산, 락틱 산, 라우릴술폰산, 말레익 산, 말릭 산, 말론산, 만데릭 산, 메탄술폰산, 뮤코닉 산, o-(4-하이드록시벤조일)벤조산, 옥살산, p-클로로벤젠술폰산, 페닐-치환된 알카노익 산, 프로피노익 산, p-톨루엔술폰산, 피루브산, 살리실산, 스테아르산, 숙신산, 타르타르산, 3차부틸아세트산, 트리메틸아세트산, 및 유사물과 같은 유기산으로 형성된 산 부가 염을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 염은 또한 존재하는 산성 양성자가 무기 또는 유기 염기와 반응할 수 있는 경우 형성될 수 있는 염기 부가 염도 포함한다. 허용 가능한 무기 염기는 수산화나트륨, 탄산나트륨, 수산화칼륨, 수산화알루미늄, 및 수산화칼슘을 포함한다. 허용 가능한 유기 염기는 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 트로메타민, N-메틸글루카민, 및 유사물을 포함한다. 본 발명의 임의의 염의 일부를 형성하는 특정 음이온 또는 양이온은, 염이 약학적으로 허용 가능한 한 비판적이지 않다. 약학적으로 허용 가능한 염 및 그들의 준비 및 사용 방법의 추가적인 예는 Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use(P.H. Stahl & C.G. Wermuth eds., Verlag Helvetica Chimica Acta, 2002)에 제시되어 있다.
여기에 사용되는 바와 같은 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는, 화학적 약제를 운송 또는 운반하는 데 관련된, 액체 또는 고체 충진제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질과 같은 약학적으로 허용 가능한 물질, 조성물, 또는 비히클을 의미한다.
"예방" 또는 "예방하는"은 하기를 포함한다: (1) 질환에 걸릴 위험이 있고/있거나 질환에 걸리기 쉽지만, 아직 병리나 증상의 일부나 전부를 경험하거나 나타내지 않는 피실험자 또는 환자의 질환의 발병을 억제하는 것, 및/또는 (2) 질환에 걸릴 위험이 있고/있거나 질환에 걸리기 쉽지만, 아직 병리나 증상의 일부나 전부를 경험하거나 나타내지 않는 피실험자 또는 환자의 질환의 발병을 늦추는 것.
"반복 단위"는 유기물, 무기물, 또는 금속-유기물인, 특정 물질의 가장 단순한 구조적 실체로, 예를 들어, 프레임워크 및/또는 중합체가 있다. 중합체 사슬의 경우, 반복 단위는 목걸이의 구슬처럼, 사슬을 따라 연속적으로 함께 연결된다. 예를 들어, 폴리에틸렌에서, -[-CH2CH2-]n-, 반복 단위는 -CH2CH2-이다. 첨자 "n"은 중합의 정도, 즉, 함께 연결된 반복 단위의 수를 나타낸다. "n"의 값이 정의되지 않거나 "n"이 없는 경우, 이는 물질의 중합체성 성질뿐만 아니라 괄호 내의 화학식의 반복을 간단히 지정한다. 반복 단위의 개념은, 금속 유기 프레임워크, 변형된 중합체, 열경화성 중합체 등과 같은 반복 단위 간의 연결이 3차원적으로 확장되는 곳에 동일하게 적용된다. 덴드리머의 맥락에서, 반복 단위는 분지 단위, 내부 층, 또는 세대로도 기술될 수 있다. 비슷하게, 말단 그룹은 표면 그룹으로도 기술될 수 있다.
"입체 이성질체" 또는 "광학 이성질체"는, 주어진 화합물과 동일한 원자가 동일한 다른 원자와 결합되지만 이들 원자의 3차원 배열이 다른, 주어진 화합물의 이성질체이다. "거울상 이성질체"는 주어진 화합물과 왼손과 오른손과 같이, 서로 거울상인 주어진 화합물의 입체 이성질체이다. "부분 입체 이성질체"는 거울상 이성질체가 아닌 주어진 화합물의 입체 이성질체이다. 카이랄 분자는 카이랄 중심을 함유하는데, 카이랄 중심은 입체중심 또는 입체발생중심(stereogenic center)으로도 지칭되고, 임의의 두 그룹의 상호교환이 입체 이성질체를 유도하는 그룹을 갖는 분자 내의 임의의 지점으로, 반드시 하나의 원자이진 않다. 유기 화합물에서, 카이랄 중심은 전형적으로 탄소, 인, 또는 황 원자이지만, 유기 및 무기 화합물에서 다른 원자가 입체중심이 되는 것도 가능하다. 분자는 복수의 입체 중심을 가져, 많은 입체 이성질체를 제공할 수 있다. 입체 이성질성(stereoisomerism)이 사면체 입체발생중심(예를 들어, 사면체 탄소)에 의한 것인 화합물에서, 이론적으로 가능한 입체 이성질체의 수는 2n을 초과하지 않을 것이고, 여기서 n은 사면체 입체중심의 수이다. 대칭을 가지는 분자는 흔히 입체 이성질체의 최대로 가능한 수보다 적게 갖는다. 거울상 이성질체의 50:50 혼합물은 라세믹 혼합물이라고 지칭된다. 그 대신에, 거울상 이성질체의 혼합물은 거울상 이성질적으로 풍부하여, 하나의 거울상 이성질체가 50%보다 많은 양으로 존재할 수 있다. 전형적으로, 거울상 이성질체 및/또는 부분 입체 이성질체는 해당 분야에 공지된 기법을 사용해 분해되거나 분리될 수 있다. 입체 화학이 정의되지 않은 임의의 입체중심 또는 카이랄 축에 대하여, 이 입체중심 또는 카이랄 축은 R 형태, S 형태, 또는 라세믹 혼합물 또는 비라세믹 혼합물을 포함한 R 및 S 형태의 혼합물으로 존재할 수 있다는 것이 고려된다. 여기에 사용된 바와 같이, "다른 입체 이성질체가 실질적으로 없다"는 문구는 조성물이 15% 이하, 더 바람직하게는 10% 이하, 훨씬 더 바람직하게는 5% 이하, 가장 바람직하게는 1% 이하로 다른 입체 이성질체를 함유하는 것을 의미한다.
"치료" 또는 "치료하는"은 하기를 포함한다: (1) 질환의 병리 또는 증상을 경험하거나 나타내는 피실험자 또는 환자의 질환을 억제하는 것(예를 들어, 병리 및/또는 증상의 추가 발달을 억제하는 것), (2) 질환의 병리 또는 증상을 경험하거나 나타내는 피실험자 또는 환자의 질환을 개선하는 것(예를 들어, 병리 또는/및 증상을 역전시키는 것), 및/또는 (3) 질환의 병리 또는 증상을 경험하거나 나타내는 피실험자 또는 환자의 질환의 측정 가능한 감소에 영향을 미치는 것.
상기 정의는 여기에 참고 문헌으로 포함된 임의의 참고 문헌에서의 상반되는 정의를 대체한다. 그러나, 특정 용어가 정의된다는 사실이, 정의되지 않은 용어가 불명확함을 나타내는 지표로 간주되어서는 안된다. 오히려, 사용된 모든 용어는 통상의 기술자가 범위를 이해하고 본 발명을 실시할 수 있도록 본 발명을 기술하는 것으로 믿어진다.
B. 덴드리머 및 덴드리머릭 구조
본 개시의 일부 양태에서, 지용성 및 양이온성 성분을 함유하는 덴드리머가 제공된다. 덴드리머는 규칙적인 덴드리틱 분지를 보이는 중합체로, 코어로부터 또는 코어로 순차적 또는 분지층의 세대별 부가에 의해 형성되며, 코어, 적어도 하나의 내부 분지층, 및 표면 분지층으로 특징지어진다(Petar R. Dvornic and Donald A. Tomalia in Chem. in Britain, 641-645, August 1994. 참조). 다른 양태에서, 여기에 사용된 바와 같은 용어 "덴드리머"는, 내부 코어, 이 개시제 코어에 규칙적으로 부착된 반복 단위의 내부층(또는 "세대"), 및 최외각 세대에 부착된 말단 그룹의 외부 표면을 갖는 분자 구조를 포함하지만 이에 한정되지는 않는 것이 의도된다. "덴드론(dendron)"은, 직접적으로 또는 더 큰 덴드리머를 형성하기 위한 연결 모이어티를 통해, 코어에 연결되거나 연결될 수 있는 초점으로부터 발산하는 분지를 갖는 덴드리머의 종이다. 일부 양태에서, 상기 덴드리머 구조는 각 분지에 대해 각 반복 단위를 2배로 하는 중심 코어로부터 방산하는 반복 그룹을 갖는다. 일부 양태에서, 여기에 기술된 덴드리머는 작은 분자, 중간 크기 분자, 지질, 또는 지질 유사 물질로 기술될 수 있다. 이들 용어는 덴드론 유사 외관을 갖는 여기에 기술된 화합물(예를 들어, 단일 초점으로부터 방사하는 분자)을 기술하기 위해 사용될 수 있다.
덴드리머는 중합체이지만, 덴드리머는 제어 가능한 구조, 단일 분자량, 다양하고 제어 가능한 표면 작용기, 및 특정 세대에 도달한 후 구형 형태를 전통적으로 채택하기 때문에 종래의 중합체보다 선호된다. 덴드리머는 각 반복 단위의 순차적인 반응으로 준비되어, 단분산, 트리(tree)형 및/또는 세대 구조 중합체 구조를 생산할 수 있다. 개별 덴드리머는 중심 코어 분자와 해당 중심 코어 상에 하나 이상의 작용기 자리에 부착된 덴드리틱 쐐기로 구성된다. 덴드리머릭 표면층은, 준비 동안 사용된 조립 단량체에 따라, 음이온성, 양이온성, 수용성, 또는 지용성 그룹을 포함하는, 표면 위에 배치된 다양한 작용기를 가질 수 있다.
코어, 반복 단위, 및 표면 또는 말단 그룹의 작용기 및/또는 화학적 특성을 변형함으로써, 그들의 물리적 성질이 조절될 수 있다. 변할 수 있는 일부 성질은 용해도, 독성, 면역원성, 및 생체 부착 능력을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 덴드리머는 종종 분지 내의 그들의 세대 또는 반복 단위의 수로 기술된다. 코어 분자만으로 구성된 덴드리머는 0세대로 지칭되고, 모든 분지를 따라 각각의 연속적인 반복 단위는 말단 또는 표면 그룹까지 1세대, 2세대 등이다. 일부 양태에서, 반 세대(half generation)가 가능하며, 이는 티올과의 제2 축합 반응 없이 아민과의 제1 축합 반응만 일어남에 의해 초래된다.
덴드리머의 준비는 각 연속적인 그룹마다 덴드리머를 만드는 단계를 포함한 일련의 단계적 반응을 통해 달성되는 합성 제어의 수준이 요구된다. 덴드리머 합성은 수렴형 또는 발산형일 수 있다. 발산형 덴드리머 합성 동안, 한 세대를 이전 세대에 부착하는 단계, 그 다음 반응의 다음 단계를 위해 작용기를 변경하는 단계를 포함하는 단계적 과정에서 분자는 코어로부터 주변부로 조립된다. 작용기 변환은 제어되지 않은 중합을 방지하기 위해 필수적이다. 이러한 중합은 단분산이 아니고, 달리 고차분지 중합체(hyperbranched polymer)라고 알려진 고도로 분지된 분자를 유도할 것이다. 입체 효과에 의해, 덴드리머 반복 단위와의 반응을 계속하는 것은 입체적인 과밀이 특정 세대에서 완전한 반응을 방지하고 분자의 단분산을 파괴할 때까지, 구 모양의 또는 구형의 분자를 유도한다. 따라서, 일부 양태에서, G1-G10 세대의 덴드리머가 특별히 고려된다. 일부 양태에서, 덴드리머는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 반복 단위, 또는 이로부터 유도할 수 있는 임의의 범위를 포함한다. 일부 양태에서, 여기에 사용된 덴드리머는, G0, G1, G2, 또는 G3이다. 그러나, 가능한 세대의 수(예를 들어, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 또는 25)는 분지 중합체 내의 간격 단위를 감소시켜 증가시킬 수 있다.
또한, 덴드리머는 2개의 주요한 화학적 환경을 가진다: 말단 세대 상의 특정 표면 그룹과, 더 높은 차원 구조로 인해 구조가 벌크 매체 및 표면 그룹으로부터 보호될 수 있는 덴드리틱 구조의 내부에 의해 창조되는 환경. 이 상이한 화학적 환경 때문에, 덴드리머는 치료적 응용을 포함해 다양한 상이한 잠재적인 용도를 가진다.
일부 양태에서, 본 개시의 덴드리머는 아크릴레이트 및 메타크릴레이트 그룹의 아민 및 티올과의 상이한 반응성을 사용하여 조립된다. 여기에 사용될 수 있는 덴드리머는 1차 또는 2차 아민과 아크릴레이트 그룹의 반응 및 머캅토 그룹과 메타크릴레이트의 반응에 의해 형성된 2차 또는 3차 아민 및 티오에테르를 포함한다. 또한, 여기에 기술된 덴드리머의 반복 단위는 생리학적 조건 하에서 분해성인 그룹을 함유할 수 있다. 일부 양태에서, 이들 반복 단위는 하나 이상의 제미날(geminal) 디에테르, 에스테르, 아미드, 또는 디설피드 그룹을 함유할 수 있다. 일부 양태에서, 코어 분자는 한 방향으로만 덴드리틱 중합이 허용되는 모노아민이다. 다른 양태에서, 코어 분자는, 각각이 하나 이상의 반복 단위를 포함할 수 있는 복수의 상이한 덴드리틱 분지를 갖는 폴리아민이다. 덴드리머는 하나 이상의 수소 원자를 이 코어로부터 제거하여 형성될 수 있다. 일부 양태에서, 이들 수소 원자는 질소 원자와 같은 헤테로 원자에 존재한다. 일부 양태에서, 말단 그룹은 긴 사슬 알킬 또는 알케닐 그룹과 같은 지용성 그룹이다. 다른 양태에서, 말단 그룹은 긴 사슬 할로알킬 또는 할로알케닐 그룹이다. 다른 양태에서, 말단 그룹은 아민(-NH2) 또는 카르복실산(-CO2H)과 같은 이온화 가능한 그룹을 함유하는 지방족 또는 방향족 그룹이다. 다른 양태에서, 말단 그룹은 하이드록사이드 그룹, 아미드 그룹, 또는 에스테르와 같은 하나 이상의 수소 결합 주개(donor)를 함유하는 지방족 또는 방향족 그룹이다.
본 개시에 의해 제공되는 덴드리머는, 예를 들어, 상기의 발명의 요약 부분과 하기의 청구범위에 보여진다. 이는 실시예 부분에 개요가 서술된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 이 방법은 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 적용되는 유기 화학의 원리 및 기법을 사용하여 추가로 변형되거나 최적화될 수 있다. 이러한 원리 및 기법은 예를 들어, 여기에 참고 문헌으로서 포함된, March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure (2007)에서 교시된다.
본 개시의 덴드리머는 하나 이상의 비대칭적으로-치환된 탄소 또는 질소 원자를 함유할 수 있고, 광학적으로 활성이거나 라세믹 형태로 분리될 수 있다. 따라서, 특정 입체화학 또는 이성질적 형태가 달리 명시되지 않는 한, 화학식의 모든 카이랄, 부분 입체 이성질적, 라세믹 형태, 에피머 형태, 및 모든 기하 이성질체가 의도된다. 덴드리머는 라세미체 및 라세믹 혼합물, 단일한 거울상 이성질체, 부분 입체 이성질체 혼합물, 및 개별 부분 입체 이성질체로서 발생할 수 있다. 일부 양태에서, 단일한 부분 입체 이성질체가 얻어진다. 본 개시의 덴드리머의 카이랄 중심은 S 또는 R 배열을 가질 수 있다. 더욱이, 하나 이상의 덴드리머는 구조 이성질체로 존재할 수 있다는 것이 고려된다. 일부 양태에서, 화합물은 동일한 화학식을 갖지만 코어의 질소 원자의 상이한 연결성을 갖는다. 어떤 이론에 구속되기를 바라지 않고, 개시 단량체가 먼저 1차 아민과 반응하고 그 다음 존재하는 2차 아민과 통계적으로 반응하기 때문에, 이러한 덴드리머가 존재한다고 믿어진다. 따라서, 구조 이성질체는 완전히 반응된 1차 아민 및 그 다음 반응된 2차 아민의 혼합물을 나타낼 수 있다.
본 개시의 덴드리머를 나타내기 위해 사용된 화학식은 가능한 여러 상이한 토토머 중 전형적으로 하나만을 보여준다. 예를 들어, 케톤 그룹의 많은 유형은 상응하는 엔올 그룹과 평형 상태로 존재하는 것으로 알려져 있다. 비슷하게, 이민 그룹의 많은 유형은 상응하는 에나민 그룹과 평형 상태로 존재하는 것으로 알려져 있다. 주어진 화학식에서 어떤 토토머가 그려지는지와 관계 없이, 또한, 어떤 것이 가장 만연한지와 관계 없이, 주어진 화학식의 모든 토토머가 의도된다.
본 개시의 덴드리머는, 여기에 언급된 지시의 용도이든 그 외이든, 선행 기술에 알려진 화합물보다, 더 효과적일 수 있고, 독성이 더 적을 수 있고, 더 길게 작용할 수 있고, 더 강력할 수 있고, 더 적은 부작용을 생성할 수 있고, 더 쉽게 흡수될 수 있고, 더 나은 약학동태적 프로파일(예를 들어, 더 높은 경구 생체 이용률 및/또는 더 낮은 제거(clearance))를 가질 수 있고, 및/또는 다른 유용한 약학적, 물리적, 또는 화학적 성질을 가질 수 있다는 이점도 가질 수 있다.
또한, 본 개시의 덴드리머를 구성하는 원자는 이러한 원자의 모든 동위 원소 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 여기에 사용된 바와 같은 동위 원소는 동일한 원자 번호를 갖지만 다른 질량수를 가지는 원자를 포함한다. 일반적인 예로, 한정 없이, 수소의 동위 원소는 삼중 수소 및 이중 수소를 포함하고, 탄소의 동위 원소는 13C 및 14C를 포함한다.
여기에 제공된 덴드리머의 임의의 염 형태의 일부를 형성하는 특정 음이온 또는 양이온은 염으로서 전체적으로 약학적으로 수용 가능한 이상 비판적이지 않다는 것이 인식되어야 한다. 약학적으로 허용 가능한 염 및 이의 준비 및 사용하는 방법의 추가적인 예는 여기에 참고 문헌으로 포함된 Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, and Use(2002)에 나타나 있다.
C. 헬퍼 지질
본 개시의 일부 양태에서, 하나 이상의 헬퍼 지질은 조성물을 창출하기 위해 본 개시의 중합체와 혼합된다. 일부 양태에서, 중합체는 헬퍼 지질의 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개의 상이한 유형과 혼합된다. 중합체는 단일 유형의 여러 다른 지질과 혼합될 수 있다는 것이 고려된다. 일부 양태에서, 지질은 스테로이드 또는 스테로이드 유도체일 수 있다. 다른 양태에서, 지질은 PEG 지질이다. 다른 양태에서, 지질은 인지질이다. 다른 양태에서, 덴드리머 조성물은 스테로이드 또는 스테로이드 유도체, PEG 지질, 및 인지질을 포함한다.
1. 스테로이드 및 스테로이드 유도체
본 개시의 일부 양태에서, 중합체는 덴드리머 조성물을 창출하기 위해 하나 이상의 스테로이드 또는 스테로이드 유도체와 혼합된다. 일부 양태에서, 스테로이드 또는 스테로이드 유도체는 임의의 스테로이드 또는 스테로이드 유도체를 포함한다. 여기에 사용된 바와 같이, 일부 양태에서, 용어 "스테로이드"는 4개의 고리 17개의 탄소 환형 구조를 갖는 화합물 클래스로서, 알킬 그룹, 알콕시 그룹, 하이드록시 그룹, 옥소 그룹, 아실 그룹, 또는 둘 이상의 탄소 원자 간의 이중 결합을 포함하는 하나 이상의 치환을 추가로 포함할 수 있다. 한 양태에서, 스테로이드의 환형 구조는 하기의 화학식에 보이는 바와 같이 3개의 축합된 사이클로헥실 고리 및 축합된 사이클로펜틸 고리를 포함한다:
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일부 양태에서, 스테로이드 유도체는 하나 이상의 비알킬 치환을 갖는 상기 고리 구조를 포함한다. 일부 양태에서, 스테로이드 또는 스테로이드 유도체는 스테롤으로서, 여기서 화학식은 하기와 같이 추가로 정의된다:
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본 개시의 일부 양태에서, 스테로이드 또는 스테로이드 유도체는 콜레스탄 또는 콜레스탄 유도체이다. 콜레스탄에서, 고리 구조는 하기 화학식에 의해 추가로 정의된다:
상기에 기술한 바와 같이, 콜레스탄 유도체는 상기 고리 시스템의 하나 이상의 비알킬 치환을 포함한다. 일부 양태에서, 콜레스탄 또는 콜레스탄 유도체는 콜레스탄 또는 콜레스탄 유도체 또는 스테롤 또는 스테롤 유도체이다. 다른 양태에서, 콜레스탄 또는 콜레스탄 유도체는 콜레스테르 및 스테롤 모두 또는 이들의 유도체이다.
일부 양태에서, 조성물은 스테로이드 대 덴드리머의 약 1:10 내지 약 1:20의 몰비를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 몰비는 약 1:20, 1:18, 1:16, 1:14, 1:12, 1:10, 1:8, 1:6, 1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 4:1, 6:1, 8:1 내지 약 1:10 또는 이로부터 유도할 수 있는 임의의 범위이다. 일부 양태에서, 몰비는 약 38:50 또는 약 1:5이다.
2. PEG 또는 PEG화된 지질
본 개시의 일부 양태에서, 중합체는 덴드리머 조성물을 창출하기 위해 하나 이상의 PEG화된 지질(또는 PEG 지질)과 혼합된다. 일부 양태에서, 본 개시는 PEG 그룹이 부착되는 임의의 지질을 사용하는 것이 포함된다. 일부 양태에서, PEG 지질은 글리세롤 그룹에 부착된 PEG 사슬도 포함하는 디글리세리드이다. 다른 양태에서, PEG 지질은 하나 이상의 C6-C24 긴 사슬 알킬 또는 알케닐 그룹 또는 PEG 사슬과의 링커 그룹에 부착된 C6-C24 지방산 그룹을 함유하는 화합물이다. PEG 지질의 한정되지 않는 일부 예는 PEG 변형된 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딕 산, PEG 세라미드 컨쥬게이트, PEG 변형된 디알킬아민 및 PEG 변형된 1,2-디아실옥시프로판-3-아민, PEG 변형된 디아실글리세롤 및 디알킬글리세롤을 포함한다. 일부 양태에서, PEG 변형된 디아스테아로일포스파티딜에탄올아민 또는 PEG 변형된 디미스토일-sn-글리세롤. 일부 양태에서, PEG 변형은 지질의 PEG 성분의 몰질량에 의해 측정된다. 일부 양태에서, PEG 변형은 약 100 내지 약 15,000의 몰질량을 갖는다. 일부 양태에서, 몰질량은 약 200 내지 약 500, 약 400 내지 약 5,000, 약 500 내지 약 3,000, 또는 약 1,200 내지 약 3,000이다. PEG 변형의 몰질량은 약 100, 200, 400, 500, 600, 800, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,250, 2,500, 2,750, 3,000, 3,500, 4,000, 4,500, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 12,500 내지 약 15,000이다. 본 발명에서 사용될 수도 있는, 지질의 한정되지 않는 일부 예는 여기에 참고 문헌으로 포함된 미국 특허 제 5,820,873호, 제 WO 2010/141069호, 또는 미국 특허 제 8,450,298호에 교시된다.
다른 양태에서, PEG 지질은 하기의 화학식을 갖는다:
여기서, R12 및 R13은 각각 독립적으로 알킬(C≤24), 알케닐(C≤24), 또는 이들 그룹 중 하나의 치환된 버전이고; Re는 수소, 알킬(C≤8), 또는 치환된 알킬(C≤8)이며; x는 1-250이다. 일부 양태에서, Re은 메틸과 같은 알킬(C≤8)이다. R12 및 R13은 각각 독립적으로 알킬(C≤4-20)이다. 일부 양태에서 x는 5-250이다. 한 양태에서, x는 5-125이거나, 또는 x는 100-250이다. 일부 양태에서, PEG 지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜이다.
다른 양태에서, PEG 지질은 하기의 화학식을 갖는다:
여기서, n1은 1 및 100 사이의 정수이고, n2 및 n3 는 각각 독립적으로 1 및 29 사이의 정수에서 선택된다. 일부 양태에서, n1은 5, 10, 15, 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100, 또는 이로부터 유도할 수 있는 임의의 범위이다. 일부 양태에서, n1은 약 30 내지 약 50이다. 일부 양태에서 n2는 5 내지 23이다. 일부 양태에서, n2는 11 내지 약 17이다. 일부 양태에서, n3는 5 내지 23이다. 일부 양태에서 n3은 11 내지 약 17이다.
일부 양태에서, 조성물은 PEG 지질 대 덴드리머의 약 1:1 내지 약 1:250의 몰비를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 몰비는 약 1:1, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100, 1:110, 1:120, 1:125, 1:150, 1:175, 1:200, 1:225, 내지 약 1:250 또는 이로부터 유도할 수 있는 임의의 범위이다. 일부 양태에서, 몰비는 약 1:25 또는 약 3:100이다.
3. 인지질
본 개시의 다른 양태에서, 중합체는 덴드리머 조성물을 창출하기 위해 하나 이상의 인지질과 혼합된다. 일부 양태에서, 포스페이트 그룹도 포함하는 임의의 지질. 일부 양태에서, 상기 인지질은 1개 또는 2개의 긴 사슬 C6-C24 알킬 또는 알케닐 그룹, 글리세롤 또는 스핑고신, 1개 또는 2개의 포스페이트 그룹, 및 선택적으로, 작은 유기 분자를 함유하는 구조이다. 일부 양태에서, 작은 유기 분자는 아미노산, 당, 또는 콜린 또는 에탄올아민과 같은 아미노 치환된 알콕시 그룹이다. 일부 양태에서, 인지질은 포스파티딜콜린이다. 일부 양태에서, 인지질은 디스테아로일포스파티딜콜린 또는 디올레오일포스파티딜에탄올아민이다.
일부 양태에서, 조성물은 인지질 대 덴드리머의 약 1:10 내지 약 1:20의 몰비를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 몰비는 약 1:20, 1:18, 1:16, 1:14, 1:12, 1:10, 1:8, 1:6, 1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 4:1, 6:1, 8:1, 내지 약 10:1 또는 이로부터 유도할 수 있는 임의의 범위이다. 일부 양태에서, 몰비는 약 38:50 또는 약 1:5이다.
D. 핵산 및 핵산 기반의 치료적 약제
1. 핵산
본 개시의 일부 양태에서, 덴드리머 조성물은 하나 이상의 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, 덴드리머 조성물은 덴드리머에 대한 중량비가 약 5:1 내지 약 1:100으로 존재하는 하나 이상의 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, 핵산의 덴드리머에 대한 중량비는 약 5:1, 2.5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 또는 1:100, 또는 이로부터 유도할 수 있는 임의의 범위이다. 일부 양태에서, 중량비는 약 1:25 또는 약 1:7이다. 또한, 본 개시는 여기에 개시된 특정 핵산에 한정되지 않는다는 것이 명백해야 한다. 그러나, 본 발명은 핵산의 임의의 특정 소스, 서열 또는 유형에 한정되지 않으며, 이는 해당 기술 분야의 통상의 기술자가 쉽게 다양한 비인간 종(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 개, 원숭이, 침팬지, 유인원, 비비, 암소, 돼지, 말, 양, 고양이, 및 다른 종)의 핵산을 포함한 다양한 다른 핵산의 소스에서 관련된 상동(homolog)을 확인할 수 있기 때문이다. 본 개시에서 사용된 핵산은 자연 발생 서열에 기반한 서열을 포함할 수 있다는 것이 고려된다. 유전 암호의 축퇴(degeneracy)를 고려하는, 자연 발생 서열의 뉴클레오티드 서열과 동일한 적어도 약 50%, 통상적으로 적어도 약 60%, 더 통상적으로 약 70%, 가장 통상적으로 약 80%, 바람직하게는 적어도 약 90%, 가장 바람직하게는 약 95%의 뉴클레오티드를 갖는 서열. 다른 양태에서, 핵산은 자연 발생 서열의 상보적 서열이거나, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 및 100% 상보적이다.
일부 양태에서, 핵산은 생체내 존재하는 다른 서열을 침묵시키거나, 그 서열과 상보적이거나 그 서열을 대체하는 서열이다. 길이가 17개 염기인 서열은 인간 게놈에서 오직 한 번만 나타나야 하므로, 고유한 표적 서열을 지정하기에 충분하다. 비록 더 짧은 올리고머가 제조하고 생체내 접근성을 증가시키기에 더 쉽지만, 많은 다른 요소들이 혼성화의 특이성을 결정하는 데 관여된다. 올리고뉴클레오티드의 상보적 표적에 대한 결합력(binding affinity) 및 서열 특이성 모두는 길이가 증가함에 따라 증가한다. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개 또는 더 많은 염기쌍의 예시적인 올리고뉴클레오티드가 사용될 수 있다는 것이 고려되나, 다른 것들도 고려된다. 250, 500, 1000, 1212, 1500, 2000, 2500, 3000개 또는 그 이상을 암호화하는 더 긴 폴리뉴클레오티드도 고려된다.
여기에 사용된 핵산은 게놈 DNA로부터 유도될 수 있다. 즉, 특정 유기체의 게놈으로부터 직접 클로닝된다. 그러나, 바람직한 양태에서, 핵산은 상보적 DNA(cDNA)를 포함할 것이다. 또한 고려되는 것은, 천연 인트론 또는 다른 유전자로부터 유도된 인트론이 부가된 cDNA이다; 이러한 조작된 분자는 때로는 "미니 유전자"라고 지칭된다. 최소한, 이들 및 본 발명의 다른 핵산은 예를 들어 겔 전기 영동에서 분자량 표준으로 사용될 수 있다.
용어 "cDNA"는 전령 DNA(mRNA)를 주형(template)으로서 사용하여 준비된 DNA를 지칭하는 것이 의도된다. cDNA를 사용하는 것의 이점은, 게놈 DNA, 또는 게놈 RNA 주형, 프로세싱되지 않은 RNA 주형, 또는 부분적으로 프로세싱된 RNA 주형으로부터 중합된 DNA와 대조적으로, cDNA가 주로 상응하는 단백질의 암호화 서열을 함유한다는 것이다. 최적의 발현을 위해 비암호화 영역이 요구되는 경우 또는 안티센스 전략에서 인트론과 같은 비암호화 영역이 표적되는 경우와 같이, 전체적 또는 부분적 게놈 서열이 바람직한 경우가 존재할 것이다.
일부 양태에서, 핵산은 유전자 또는 유전자 생성물의 발현을 억제하는, 하나 이상의 안티센스 절편을 포함한다. 안티센스 방법론은 핵산이 "상보적" 서열과 쌍을 이루는 경향이 있다는 사실을 이용한다. 보완적으로, 이는 폴리뉴클레오티드가 표준 왓슨-크릭 상보성 규칙에 따라 염기쌍을 형성할 수 있는 것임을 의미한다. 즉, 더 큰 퓨린은 더 작은 피리미딘과 염기 쌍을 형성해, 시토신과 쌍을 이룬 구아닌(G:C), 및 DNA일 때 티민과(A:T), 또는 RNA일 때 우라실(A:U)과 쌍을 이룬 아데닌의 조합을 형성한다. 혼성 서열에서 이노신, 5-메틸시토신, 6-메틸아데닌, 하이포잔틴 등과 같은 덜 흔한 염기의 포함은 쌍 형성을 방해하지 않는다.
폴리뉴클레오티드로 이중 가닥(ds) DNA를 표적하는 것은 삼중 나선 형성을; RNA를 표적하는 것은 이중 나선 형성을 유도할 것이다. 안티센스 폴리뉴클레오티드는, 표적 세포 내에 도입될 때, 표적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 결합하고, 전사, RNA 프로세싱, 수송, 번역 및/또는 안정성을 방해한다. 안티센스 RNA 구조물 또는 이러한 안티센스 RNA를 암호화하는 DNA는 인간 피실험자를 포함한 숙주 동물과 같은 숙주 세포 내에서, 생체내 또는 시험관내에서, 유전자 전사 또는 번역 또는 이 모두를 억제하기 위해 사용될 수 있다.
안티센스 구조물은 유전자의 프로모터 및 다른 조절 영역, 엑손, 인트론, 또는 심지어 엑손-인트론 경계에 결합하도록 디자인될 수 있다. 가장 효과적인 안티센스 구조물은 인트론/엑손 스플라이스 접합부에 상보적인 영역을 포함할 것이라는 것이 고려된다. 따라서, 바람직한 양태는 인트론-엑손 스플라이스 접합부의 50-200개의 염기의 영역에 상보성을 갖는 안티센스 구조물을 포함한다는 것이 제안된다. 일부 엑손 서열은 이들의 표적 선택성에 심각하게 영향을 미치지 않으면서 구조물에 포함될 수 있다는 것이 관찰되었다. 포함된 엑손 물질의 양은 사용된 특정 엑손 및 인트론 서열에 따라 달라질 것이다. 정상 세포 기능이 영향을 받는지 또는 상보적 서열을 갖는 관련된 유전자의 발현이 영향을 받는지를 결정하기 위해 실험관내에서 구조물을 테스트함으로써 지나치게 많은 엑손 DNA가 포함되었는지를 용이하게테스트할 수 있다.
상기에 언급한 바와 같이, "상보적" 또는 "안티센스"는 전체 길이에 걸쳐 실질적으로 상보적이고, 매우 적은 염기 미스매치를 갖는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 예를 들어, 15개의 염기 길이의 서열은, 그들이 13개 또는 14개 위치에서 상보적인 뉴클레오티드를 가질 때 상보적이라고 칭할 수 있다. 자연적으로, 완전히 상보적인 서열은 전체 길이에 걸쳐 전체적으로 상보적이고 염기 미스매치가 없는 서열일 것이다. 낮은 수준의 상동성을 갖는 다른 서열도 고려된다. 예를 들어, 높은 상동성의 제한된 영역을 갖지만 비상동 영역도 함유하는 안티센스 구조물(예를 들어, 리보자임; 하기 참조)이 디자인될 수 있다. 이들 분자는, 50%보다 적은 상동성을 갖지만, 적절한 조건 하에서 표적 서열에 결합할 것이다.
게놈 DNA 일부를 cDNA 또는 합성 서열과 결합하여 siRNA를 형성하거나 특정 구조물을 생성하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 인트론이 궁극적인 구조물에 필요한 곳에서, 게놈 클론이 사용되어야 할 것이다. cDNA, siRNA 또는 합성된 폴리뉴클레오티드는 구조물의 남은 부분에 더 편리한 제한 부위를 제공할 수 있으며, 따라서, 서열의 남은 부분에 사용될 것이다. 다른 양태는 표적 게놈 서열 또는 암호화/비암호화 전사에 사용될 수 있는 RNA 또는 ssRNA를 포함한다.
다른 양태에서, 덴드로머 조성물은 유전자 치료에 사용되는 하나 이상의 발현 벡터를 포함하는 핵산을 포함할 수 있다. 발현은 벡터에 적절한 신호가 제공될 것 및 숙주 세포 내의 관심 유전자의 발현을 유도하는 바이러스 및 포유동물 소스 모두의 인핸서(enhancer)/프로모터와 같은 다양한 조절인자를 포함하는 것이 요구된다. 숙주 세포 내의 전령 RNA 안정성 및 번역 가능성을 최적화하기 위해 디자인된 인자도 정의되었다. 생성물을 발현하는 영구적이고 안정한 세포 클론을 확립하기 위한 다수의 우세한 약물 선택 마커의 사용을 위한 조건도 제공되는데, 이는 약물 선택 마커의 발현을 폴리펩티드 발현으로 연결시키는 인자이기 때문이다.
본 출원 전반에 걸쳐, 용어 "발현 구조물"은, 유전자 생성물을 암호화하는 핵산으로서, 핵산 암호화 서열의 일부 또는 전부가 전사될 수 있는 것을 함유하는 임의의 유형의 유전자 구조물을 포함하는 것을 의미한다. 전사체는 단백질로 번역될 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 특정 양태에서, 발현은 유전자의 전사 및 mRNA의 유전자 생성물로의 번역 모두를 포함한다. 다른 양태에서, 발현은 오직 관심 유전자를 암호화하는 핵산의 전사만을 포함한다.
용어 "벡터"는 핵산 서열이 복제될 수 있는 세포 내로 도입하기 위해 삽입될 수 있는 담체 핵산 분자를 지칭하기 위해 사용된다. 핵산 서열은 "외인성(exogenous)"일 수 있고, 이는 벡터가 도입되는 세포에 외래적이거나 서열이 세포 내의 서열과 상동이지만 그 서열이 일반적으로 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내의 위치에 존재하는 것을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스(박테리오파지, 동물 바이러스, 및 식물 바이러스), 및 인공 염색체(예를 들어, YAC)를 포함한다. 해당 기술 분야의 통상의 기술자는, 여기에 참고 문헌으로 포함된 Sambrook et al.(1989) 및 Ausubel et al.(1994)에 기술된 표준 재조합 기법을 통해 벡터를 조립하는 데 잘 갖추어져 있을 것이다.
용어 "발현 벡터"는 전사될 수 있는 유전자 생성물의 적어도 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 지칭한다. 일부 경우, RNA 분자는 그 다음 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드로 번역된다. 다른 경우, 이들 서열은, 예를 들어, 안티센스 분자 또는 리보자임의 생산에서, 번역되지 않는다. 발현 벡터는, 특정 숙주 유기체의 작동 가능하게 연결된 암호화 서열의 전사 및 가능한 경우 번역에 필수적인 핵산 서열을 지칭하는 다양한 "조절 서열"을 포함할 수 있다. 전사 및 번역을 제어하는 조절 서열 이외에, 벡터 및 발현 벡터는 다른 기능을 제공하고 하기에 기술되는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
2. siRNA
상기에 언급된 바와 같이, 본 발명은 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 및/또는 활성을 감소시키기 위한 하나 이상의 억제 핵산의 사용을 고려한다. 억제 핵산의 예는, siRNA(small interfering RNA), 짧은-헤어핀 RNA(shRNA), 이중 가닥 RNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 및 압타머와 같은 유전자 또는 유전자 생성물을 표적하는 분자를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
억제 핵산은 세포 내의 유전자의 전사를 억제하거나 유전자 전사체의 번역을 막을 수 있다. 억제 핵산은 16개 내지 1000개의 뉴클레오티드 길이일 수 있고, 특정 양태에서는 18개 내지 100개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
억제 핵산은 해당 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, siRNA, shRNA, 및 이중 가닥 RNA는, 모두 전체로 여기에 참고 문헌으로 포함된, 미국 특허 공보 제 2003/0051263호, 제 2003/0055020호, 제 2004/0265839호, 제 2002/0168707호, 제 2003/0159161호, 및 제 2004/0064842호와 마찬가지로, 미국 특허 제 6,506,559호 및 제 6,573,099호에 기술되어 있다.
1998년 Fire 및 동료에 의한 RNAi 발현 이후, 생화학적 메커니즘은 빠르게 특징지어졌다. 이중가닥 RNA(dsRNA)는 RNAase III 계열의 리보뉴클레아제인 다이서(Dicer)에 의해 절단된다. 이 과정은 약 21개 뉴클레오티드 길이의 siRNA를 야기한다. 이 siRNA는 표적 mRNA로 유도되는 다중단백질 RISC(RNA-induced silencing complex)에 포함된다. RISC는 상보적 영역의 중간에서 표적 mRNA를 절단한다. 포유동물 세포에서, 관련된 마이크로RNA(miRNA)는 짧은 RNA 절편(약 22개 뉴클레오티드)로 밝혀진다. miRNA는 불완전한 헤어핀 RNA 구조를 갖는 더 긴 전구체(약 70개 뉴클레오티드)의 다이서-매개된 절단 후에 생성된다. miRNA는 표적 mRNA의 번역 억제를 유도하는 miRNA-단백질 복합체(miRNP)로 포함된다.
RNAi 효과를 생성할 수 있는 핵산을 디자인할 때, siRNA의 성질, 침묵 효과의 내구성, 및 전달 시스템의 선택과 같은 고려해야 하는 여러 요인이 존재한다. RNAi 효과를 생성시키기 위해, 유기체에 도입되는 siRNA는 전형적으로 엑손 서열을 함유할 것이다. 더욱이, RNAi 과정은 상동성 의존적이므로, 상기 서열은 유전자 특이성을 최대화하는 반면, 상동이지만 유전자 특이적이지 않은 서열 간의 교차 간섭의 가능성을 최소화할 수 있도록 신중하게 선택되어야 한다. 특히 siRNA는 siRNA 서열과 EphA 뉴클레오티드 서열의 부분 간의 80, 85, 90, 95, 98% 이상 또는 심지어 100%의 동일성을 보인다. 표적 유전자와 약 80%보다 적게 동일한 서열은 상당히 적게 효과적이다. 따라서, siRNA 및 억제될 유전자 간의 동일성이 더 높을수록, 관련되지 않은 유전자의 발현이 더 적게 영향을 받을 것이다.
또한, siRNA의 크기도 중요한 고려 사항이다. 일부 양태에서, 본 개시는 적어도 약 19-25개 뉴클레오티드를 포함하고 유전자 발현을 조절할 수 있는 siRNA 분자에 관한 것이다. 본 개시의 맥락에서, siRNA는 특히 500, 200, 100, 50, 25, 또는 20개보다 적은 뉴클레오티드 길이이다. 일부 양태에서, siRNA는 약 25개 뉴클레오티드 내지 약 35개 뉴클레오티드 또는 약 19개 뉴클레오티드 내지 약 25개 뉴클레오티드 길이이다.
siRNA-매개 유전자 침묵의 효과를 향상시키기 위해, mRNA 상의 표적 부위의 선택 지침이 siRNA의 최적 디자인을 위해 개발되었다(Soutschek et al., 2004; Wadhwa et al., 2004). 이 전략은 최대 유전자 녹다운을 달성하기 위해 siRNA 서열을 선택하는 합리적인 접근법을 고려할 수 있다. siRNA의 세포 또는 조직으로의 출입을 용이하게 하기 위해, 플라스미드, 및 아데노바이러스, 렌티바이러스, 및 레트로바이러스와 같은 바이러스 벡터를 포함한 다양한 벡터가 사용된다(Wadhwa et al., 2004).
억제 핵산 내에서, 핵산의 성분은 동일한 유형이거나 전체가 상동일 필요는 없다(예를 들어, 억제 핵산은 뉴클레오티드 및 핵산 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다). 전형적으로, 억제 핵산은 이중 가닥 구조를 형성한다; 이중나선 구조는 부분적으로 또는 완전히 상보적인 2개의 별개 핵산으로부터 초래될 수 있다. 본 발명의 특정 양태에서, 억제 핵산은 오직 단일한 핵산(폴리뉴클레오티드) 또는 핵산 유사체만을 포함할 수 있고, 자체로 상보함(complementing)으로써 이중나선 구조를 형성(예를 들어, 헤어핀 고리 형성)할 수 있다. 억제 핵산의 이중 가닥 구조는 16-500개 또는 그보다 많은 인접한 핵염기를 포함할 수 있고, 이로부터 유도되는 모든 범위를 포함한다. 억제 핵산은, 이중 가닥 구조를 형성하기 위해 상보적 핵산(같은 핵산의 다른 부분이거나 별개의 상보적 핵산일 수 있다)과 혼성되는, 17개 내지 35개 인접한 핵염기, 더 특히 18개 내지 30개 인접한 핵염기, 더 특히, 19개 내지 25개 인접한 핵염기, 더 특히 20개 내지 23개 인접한 핵염기, 또는 20개 내지 22개 인접한 핵염기, 또는 21개 인접한 핵염기를 포함할 수 있다.
siRNA는 상업적 소스, 천연 소스로부터 얻어질 수 있거나, 해당 기술 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 다수의 기술 중 임의의 것을 사용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 사전 디자인된 siRNA의 상업적 소스는, Invitrogen's StealthTM Select technology(Carlsbad, CA), Ambion®(Austin, TX), 및 Qiagen®(Valencia, CA)을 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법에 적용될 수 있는 억제 핵산은, 임의의 소스에 의해 유전자 또는 유전자 생성물의 검증된 하향조절제(downregulator)로 밝혀진 임의의 핵산 서열일 수 있다.
일부 양태에서, 발명은, 유전자를 암호화하는 핵산의 적어도 10개이지만 30개를 초과하지 않는 연속된 뉴클레오티드와 실질적으로 상보적이고 유전자 또는 유전자 생성물의 발현을 감소시키는 적어도 하나의 가닥을 갖는, 적어도 19개의 뉴클레오티드의 고립된 siRNA 분자를 특징으로 한다. 본 개시의 한 양태에서, siRNA 분자는, 유전자 또는 유전자 생성물을 암호화하는 mRNA의 적어도 10개이지만 30개를 초과하지 않는 연속된 뉴클레오티드와 실질적으로 상보적인 적어도 하나의 가닥을 가진다.
한 양태에서, siRNA 분자는 표적 치료적 단백질을 암호화하는 임의의 핵산 서열의 적어도 10개의 연속된 뉴클레오티드와 적어도 75, 80, 85, 또는 90% 상동이거나, 특히 적어도 95%, 99%, 또는 100% 유사 또는 동일하거나, 또는 상기 사이에 있는 임의의 백분율(예를 들어, 발명은 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상 등을 고려하고, 상기 범위는 그 사이의 모든 전체 수를 포함하는 것이 의도된다)이다.
siRNA는 또한 하나 이상의 뉴클레오티드의 변경을 포함할 수 있다. 이러한 변경은, 예를 들어, 19 내지 25개 뉴클레오티드 RNA의 말단에 또는 내부에(RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에) 비뉴클레오티드 물질의 첨가를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, RNA 분자는 3'-하이드록실 그룹을 함유한다. 본 발명의 RNA 분자의 뉴클레오티드는, 비-자연 발생 뉴클레오티드 또는 디옥시리보뉴클레오티드를 포함한 비표준 뉴클레오티드도 포함할 수 있다. 이중 가닥 올리고뉴클레오티드는, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 해당 기술 분야에 알려진 다른 변형된 골격과 같은 변형된 골격을 함유할 수 있고, 비-자연 인터뉴클레오시드 연결을 함유할 수 있다. siRNA(예를 들어, 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드, 2'-디옥시-2'-플루오로 리보뉴클레오티드, "범용 염기(universal base)" 뉴클레오티드, 5-C-메틸 뉴클레오티드, 하나 이상의 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연결, 및 역 디옥시어베이직 잔기 편입)의 추가적 변형은 미국 특허 공보 제 2004/0019001호 및 미국 특허제 6,673,611호(각각이 그 전체가 참고 문헌으로 포함된다)에서 찾아질 수 있다. 총체적으로, 상기에 기술된 이와 같이 변경된 핵산 또는 RNA 모두는 변형된 siRNA라고 지칭된다.
한 양태에서, siRNA는 특정 유전자 생성물의 발현을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 그 이상 또는 이들 사이의 임의의 범위로 감소시킬 수 있다.
3. CRISPR/CAS
CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)은 염기 서열의 짧은 반복을 포함하는 DNA 위치이다. 각 반복 뒤에는 바이러스에 대한 이전 노출으로부터의 "스페이서 DNA"의 짧은 절편이 이어진다. CRISPR은 약 40%의 서열화된 진정세균 게놈 및 약 90%의 서열화된 고세균에서 찾아질 수 있다. CRISPR은 CRISPR과 관련된 단백질을 암호화하는 cas 유전자와 종종 연관된다. CRISPR/Cas 시스템은 플라스미드 및 파지와 같은 외래 유전 인자에 내성을 부여하고 후천적 면역의 형태를 제공하는 원핵 면역 시스템이다. CRISPR 스페이서는 진핵 유기체의 RNAi와 같은 외인성 유전자 요소를 인식하고 침묵시킨다.
반복은 박테리아 Escherichia coli에서 1987년에 처음 기술되었다. 2000년에 비슷한 클러스터 반복이 추가적인 박테리아 및 고세균에서 확인되었고, SRSR(Short Regularly Spaced Repeat)으로 칭해졌다. SRSR은 2002년에 다시 CRIPSR로 개명되었다. 일부가 추정적인(putative) 뉴클레아제 또는 헬리케이즈 단백질을 암호화하는 유전자의 집합(cas, 또는 CRISPR-관련된 유전자)이 CRISPR 반복과 연관된 것으로 밝혀졌다.
2005년에 3명의 독립적인 연구자들이 CRISPR 스페이서가 여러 파지 DNA, 및 플라스미드와 같은 염색체외 DNA와 상동성을 보였다는 것을 보였다. 이는 CRISPR/cas 시스템이 박테리아의 적응 면역에 역할을 할 수 있다는 조짐이었다. Koonin 및 동료는 스페이서가 RNA 간섭이라고 불리는 시스템을 사용하는 진핵 세포와 비슷하게 RNA 분자를 위한 주형의 역할을 한다는 것을 제안했다.
2007년에 Barrangou 및 Horvath(Danisco의 식품공학 과학자들)과 다른 이들은 파지 공격에 대한 Streptococcus thermophilus의 내성을 스페이서 DNA로 변경할 수 있음을 보였다. Doudna 및 Charpentier은 박테리아가 그들의 면역 방어에서 스페이서를 어떻게 배치하는지 알아보기 위해, 독립적으로 CRISPR-연관된 단백질을 독립적으로 탐구해왔다. 그들은 공동으로 Cas9이라고 불리는 단백질에 의존하는 더 간단한 CRISPR 시스템을 연구했다. 그들은 박테리아가 스페이서 및 회문 DNA를 긴 RNA 분자로 전사함으로써 침입하는 파지에 반응하고, 그 다음 세포가 tracrRNA 및 Cas9을 사용해 긴 RNA 분자를 crRNA라고 불리는 조각으로 절단한다는 것을 발견했다.
CRISPR은 2012년까지 인간 세포 배양에서 게놈 공학/편집 도구로 처음 보여졌다. 그 후로, 빵 효모(S. cerevisiae), 지브라 피쉬, 선충류(C. elegans), 식물, 마이스, 및 여러 다른 유기체를 포함한 넓은 범위의 유기체에 사용되었다. 또한, CRISPR은 과학자가 특정 유전자를 표적하고, 활성시키고, 또는 침묵시키는 것을 가능하게 하는 프로그래밍할 수 있는 전사 인자를 제조하기 위해 변형되었다. 수만개의 가이드 RNA의 라이브러리가 현재 이용 가능하다.
CRISPR이 살아있는 동물의 질환 증상을 역전시킬 수 있다는 첫번째 증거가 2014년 3월에 MIT 연구자가 희귀한 간 장애를 갖는 마이스를 치료했을 때 보여졌다. 2012년부터, CRISPR/Cas 시스템은 마이스 및 영장류와 같은 진핵 생물에서도 작동하는 유전자 편집(특정 유전자를 침묵시키거나, 인핸싱하거나, 바꾸는 것)에 사용되었다. cas 유전자 및 특이적으로 디자인된 CRISPR을 함유하는 플라스미드를 삽입함으로써, 유기체의 게놈은 원하는 위치에서 절단될 수 있다.
CRISPR 반복은 24개 내지 48개의 염기 쌍 크기 범위 내이다. 그들은 대개 몇몇 한쌍의 대칭(dyad symmetry)을 보이고, 진정한 회문 구조(palindromic)는 아닌 헤어핀과 같은 2차 구조의 형성을 암시한다. 반복은 비슷한 길이의 스페이서에 의해 분리된다. 일부 CRISPR 스페이서 서열은 플라스미드 및 파지의 서열과 완전히 일치하지만, 일부 스페이서는 원핵 생물의 게놈(자가 표적 스페이서)과 일치한다. 새로운 스페이서는 파지 감염에 반응하여 빠르게 첨가될 수 있다.
CRISPR-연관된(cas) 유전자는 종종 CRISPR 반복 스페이서 배열과 관련된다. 2013년 현재, 40개가 넘는 상이한 Cas 단백질 군이 기술되었다. 이들 단백질 군에서, Cas1은 상이한 CRISPR/CAS 시스템 사이에 편재하는 것으로 보인다. cas 유전자 및 반복 구조의 특정 조합은 8개의 CRISPR 아형(Ecoli, Ypest, Nmeni, Dvulg, Tneap, Hmari, Apern, and Mtub)을 정의하기 위해 사용되었고, 이 중 일부는 RAMP(repeat-associated mysterious protein)을 암호화하는 추가적인 유전자 모듈과 연관된다. 하나 이상의 CRISPR 아형은 단일한 염색체 내에서 발생할 수 있다. CRISPR/Cas 아형의 산발적 분포는 시스템이 미생물 진화 동안 수평 유전자 전달의 대상이 됨을 암시한다.
외인성 DNA는 Cas 유전자에 의해 암호화된 단백질에 의해 작은 인자(약 30개의 염기 쌍 길이)로 분명히 프로세싱되었고, 인자들은 그 다음 어떻게든 리더 서열 근처의 CRISPR 위치로 삽입된다. CRISPR 위치의 RNA는 본질적으로 발현되고 Cas 단백질에 의해, 플랭킹 반복 서열을 갖는 개별, 외인성으로 유도된 서열 인자로 구성된 작은 RNA로 프로세싱된다. RNA는 다른 Cas 단백질을 유도하여 RNA 또는 DNA 수준의 외인성 유전 인자를 침묵시킨다. 증거는 CRISPR 아형의 기능적 다양성을 제시한다. Cse(Cas 아형 Ecoli) 단백질(E. coli의 CasA-E라고 불림)은 기능적 복합체인 케스케이드를 형성하고, 케스케이드는 CRISPR RNA 전사체를 케스케이드가 보유한 스페이서-반복 단위로 프로세싱한다. 다른 원핵 생물에서, Cas6은 CRISPR 전사체를 프로세싱한다. 흥미롭게도, E.coli에서의 CRISPR-기반 파지 불활성화는 케스케이드 및 Cas3를 필요로 하지만, Cas1 및 Cas2는 그렇지 않다. Pyrococcus furiosus와 다른 원핵 생물에서 발견되는 Cmr(Cas RAMP 모듈) 단백질은 상보적인 표적 RNA를 인식하고 절단하는 작은 CRISPR RNA를 갖는 기능적 복합체를 형성한다. RNA-유도된 CRISPR 효소는 V형 제한 효소로 분류된다.
참고 문헌으로 전체로 포함된 미국 특허 공보 제 2014/0068797호도 참조한다.
i. Cas9
Ca9는 DNA 절단에 특화된 효소로서, 이중 나선의 각각 가닥에 1개씩, 총 2개의 활성 절단 부위를 갖는 뉴클레아제이다. Cas9의 표적 DNA를 홈에 위치시키는 능력을 보존하면서 하나 또는 둘 모두의 부위를 무능하게 할 수 있다는 것이 입증되었다. Jinek은 tracrRNA 및 스페이서 RNA를, 정확한 DNA 표적을 찾고 절단할 수 있는 Cas9과 혼합된 "단일-가이드 RNA" 분자로 결합했다. Jinek et al.은 이러한 합성 가이드 RNA가 유전자 편집에 사용될 수 있을 것이라고 제안했다.
Cas9 단백질은 병원성 및 공생성 박테리아에 매우 풍부하다. CRISP/Cas-매개 유전자 조절은 특히 진핵 생물 숙주와의 박테리아 상호작용 동안, 내인성 박테리아 유전자의 조절에 기여할 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질인 Francisella novicida의 Cas9은 특유의 작은 CRISPR/Cas-연관 RNA(scaRNA)를 사용해, 숙주 반응을 둔화하고 독성을 증가시키는 데 F. novicida에게 중요한 박테리아 지질단백질을 암호화하는 내인성 전사체를 억제한다.
ii. gRNA 또는 sgRNA
RNA 유도된 단백질로서, Cas9은 DNA 표적의 인식을 지도하기 위한 짧은 RNA를 필요로 한다(Mali et al., 2013a). Cas9은 우선적으로 PAM 서열 NGG를 함유하는 DNA 서열을 조사하지만, 프로토스페이서 표적 없이 결합할 수 있다. 그러나, Cas9-gRNA 복합체는 이중 가닥 절단(double strand break)을 창조하기 위해 gRNA와의 가까운 매치를 필요로 한다(Cho et al., 2013; Hsu et al., 2013). 박테리아의 CRISPR 서열은 복수의 RNA에서 발현되고, 그 다음 RNA를 위한 가이드 가닥을 창조하기 위해 프로세싱된다(Bikard et al., 2013). 진핵 시스템은 CRISPR RNA를 프로세싱하기 위해 필요한 단백질의 일부가 부족하기 때문에, Ca9 표적화를 위한 RNA의 필수적인 조각을, RNA 폴리머라제 III형 프로모터 U6와 함께 발현되는 단일 RNA로 결합하기 위해 합성 구조물 gRNA가 창조된다(Mali et al., 2013a, b). 합성 gRNA는 최소 길이가 100bp를 약간 넘고, PAM 서열 NGG 바로 앞에 있는 20개 프로토스페이서 뉴클레오티드를 표적하는 부분을 함유한다; gRNA는 PAM 서열을 함유하지 않는다.
4. 변형된 핵염기
일부 양태에서, 본 개시의 핵산은 변형된 당 모이어티를 포함하는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 하나 이상의 당-변형된 뉴클레오시드를 포함하는 이러한 화합물은, 자연 발생 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드만을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 비해, 향상된 뉴클레아제 안정성 또는 표적 핵산과의 증가된 결합력과 같은 바람직한 성질을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 변형된 당 모이어티는 치환된 당 모이어티이다. 일부 양태에서, 변형된 당 모이어티는 당 대용물이다. 이러한 당 대용물은 치환된 당 모이어티와 대응되는 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 변형된 당 모이어티는 하나 이상의 비가교 당 치환기를 포함하는 치환된 당 모이어티이고, 상기 치환기는 2' 및/또는 5' 위치에서의 치환기를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 2'-위치에 적합한 당 치환기의 예는 하기를 포함하지만 이에 한정되지 않는다: 2'-F, 2'-OCH3("OMe" 또는 "O-메틸"), 및 2'-O(CH2)2OCH3("MOE"). 특정 양태에서, 2' 위치에서의 당 치환기는 하기에서 선택된다: 알릴, 아미노, 아지도, 티오, O-알릴, O--C1-C10 알킬, O--C1-C10 치환된 알킬; OCF3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2--O--N(Rm)(Rn), 및 O--CH2--C(=O)--N(Rm)(Rn), 여기서 Rm 및 Rn은 각각은 독립적으로 H 또는 치환된 또는 비치환된 C1-C10 알킬이다. 5'-위치에서의 당 치환기의 예는 하기를 포함하지만 이에 한정되지 않는다: 5'-메틸(R 또는 S); 5'-비닐, 및 5'-메톡시. 특정 양태에서, 치환된 당은 예를 들어, T-F-5'-메틸 당 모이어티(예를 들어, 추가적인 5',2'-비스 치환된 당 모이어티 및 뉴클레오시드를 위해 PCT 국제 출원 WO 제 2008/101157 참조)와 같은 1개보다 많은 비가교된 당 치환기를 포함한다.
2'-치환된 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드는 2'-치환된 뉴클레오시드로 지칭된다. 일부 양태에서, 2'-치환된 뉴클레오시드는 하기에서 선택된 2'-치환된 그룹을 포함한다: 할로, 알릴, 아미노, 아지도, SH, CN, OCN, CF3, OCF3, O, S, 또는 N(Rm)-알킬; O, S, 또는 N(Rm)-알케닐; O, S 또는 N(Rm)-알키닐; 0-알킬레닐-O-알킬, 알키닐, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴, O-아랄킬, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2--O--N(Rm)(Rn) 또는 O--CH2--C(=O)--N(Rm)(Rn), 여기서 Rm 및 Rn 각각은 독립적으로 H, 아미노 보호 그룹 또는 치환된 또는 비치환된 C1-C10 알킬이다. 이들 2'-치환 그룹은 하기에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환 그룹으로 추가로 치환될 수 있다: 하이드록실, 아미노, 알콕시, 카르복시, 벤질, 페닐, 니트로(NO2), 티올, 티오알콕시(S-알킬), 할로젠, 알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐.
일부 양태에서, 2'-치환된 뉴클레오시드는 하기에서 선택된 2'-치환 그룹을 포함하는 2'-치환된 뉴클레오시드이다: F, NH2, N3, OCF3, O--CH3, O(CH2)3NH2, CH2―CH=CH2, O--CH2―CH=CH2, OCH2CH2OCH3, O(CH2)2SCH3, O--(CH2)2--O--N(Rm)(Rn), O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2, 및 N-치환된 아세트아미드 (O--CH2--C(=O)--N(Rm)(Rn) 여기서 Rm 및 Rn 각각은 독립적으로 H, 아미노 보호 그룹 또는 치환된 또는 비치환된 C1-C10 알킬이다.
일부 양태에서, 2'-치환된 뉴클레오시드는 하기에서 선택된 2'-치환 그룹을 포함하는 당 모이어티를 포함한다: F, OCF3, O--CH3, OCH2CH2OCH3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2--O--N(CH3)2, --O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2, 및 O--CH2--C(=O)--N(H)CH3.
일부 양태에서, 2'-치환된 뉴클레오시드는 하기에서 선택된 2'-치환 그룹을 포함하는 당 모이어티를 포함한다: F, O--CH3, 및 OCH2CH2OCH3.
특정 변형된 당 모이어티는 이환 당 모이어티를 초래하는 제2 고리를 형성하는, 가교 당 치환기를 포함한다. 일부 이러한 양태에서, 이환 당 모이어티는 4' 및 2' 퓨라노스 고리 원자 사이의 가교를 포함한다. 이러한 4'에서 2'로의 당 치환기의 예는 하기를 포함하지만 이에 한정되지 않는다: --[C(Ra)(Rb)]n--, --[C(Ra)(Rb)]n--O--, --C(RaRb)--N(R)--O-- 또는, --C(RaRb)--O--N(R)--; 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)--O-2'(LNA); 4'-(CH2)--S-2'; 4'-(CH2)2--O-2'(ENA); 4'-CH(CH3)--O-2'(cEt) 및 4'-CH(CH2OCH3)--O-2', 및 이들의 유사체(예를 들어, 미국 특허 제 7,399,845호 참조); 4'-C(CH3)(CH3)--O-2' 및 이들의 유사체(예를 들어, WO 제 2009/006478호 참조); 4'-CH2--N(OCH3)-2' 및 이들의 유사체(예를 들어, WO 제 2008/150729호 참조); 4'-CH2--O--N(CH3)-2'(예를 들어, 2004년 9월 2일에 게재된 미국 2004/0171570호 참조); 4'-CH2--O--N(R)-2', 및 4'-CH2--N(R)--O-2'-, 여기서 R 각각은 독립적으로 H, 보호 그룹, 또는 C1-C12 알킬이다; 4'-CH2--N(R)--O-2', 여기서 R은 H, C1-C12 알킬, 또는 보호 그룹이다(미국 특허 제 7,427,672호 참조); 4'-CH2--C(H)(CH3)-2'(예를 들어, Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134 참조); 및 4'-CH2--C(=CH2)-2' 및 이들의 유사체(PCT 국제 출원 WO 제 2008/154401호 참조).
일부 양태에서, 이러한 4'에서 2'로의 가교는 독립적으로 하기에서 독립적으로 선택된 1에서 4로의 연결된 그룹을 포함한다: --[C(Ra)(Rb)]n--, --C(Ra)=C(Rb)--, --C(Ra)=N--, --C(=NRa)--, --C(=O)--, --C(=S)--, --O--, --Si(Ra)2--, --S(=O)x--, 및 --N(Ra)--; 여기서,
x는 0, 1, 또는 2이고;
n은 1, 2, 3, 또는 4이고;
Ra 및 Rb 각각은 독립적으로 H, 보호 그룹, 하이드록실, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 헤테로사이클 라디칼, 치환된 헤테로사이클 라디칼, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C5-C7 지환식(alicyclic) 라디칼, 치환된 C5-C7 지환식 라디칼, 할로젠, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, 아실(C(=O)--H), 치환된 아실, CN, 설포닐(S(=O)2-J1), 또는 설폭실(S(=O)-J1)이며;
J1 및 J2 각각은 독립적으로 H, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 아실(C(=O)--H), 치환된 아실, 헤테로사이클 라디칼, 치환된 헤테로사이클 라디칼, C1-C12 아미노알킬, 치환된 C1-C12 아미노알킬, 또는 보호 그룹이다.
이환 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오시드는 이환 뉴클레오시드 또는 BNA로 지칭된다. 이환 뉴클레오시드는 하기를 포함하지만 이에 한정되지 않는다: (A) α-L-메틸렌옥시(4'-CH2--O-2') BNA, (B) β-D-메틸렌옥시(4'-CH2--O-2') BNA (락된(locked) 핵산 또는 LNA로도 지칭된다), (C) 에틸렌옥시(4'-(CH2)2--O-2') BNA, (D) 아미노옥시(4'-CH2--O--N(R)-2') BNA, (E) 옥시아미노(4'-CH2--N(R)--O-2') BNA, (F) 메틸(메틸렌옥시)(4'-CH(CH3)--O-2') BNA(구속된(constrained) 에틸 또는 cEt로도 지칭된다), (G) 메틸렌-티오(4'-CH2--S-2') BNA, (H) 메틸렌-아미노(4'-CH2-N(R)-2') BNA, (I) 메틸 카르보사이클(4'-CH2--CH(CH3)-2') BNA, (J) 프로필렌 카르보사이클(4'-(CH2)3-2') BNA, 및 (K) 메톡시(에틸렌옥시)(4'-CH(CH2OMe)-O-2') BNA(구속된 MOE 또는 cMOE으로도 지칭된다).
추가적인 이환 당 모이어티는 해당 기술 분야에 알려져 있다. 예를 들어: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 129(26) 8362-8379(2007년 7월 4일); Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 5561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; 미국 특허 제 7,053,207호, 제 6,268,490호, 제 6,770,748호, 제 6,794,499호, 제 7,034,133호, 제 6,525,191호, 제 6,670,461호, 및 제 7,399,845호; WO 공개공보 제 2004/106356호, WO 공개공보 제 1994/14226호, WO 공개공보 제 2005/021570호, 및 WO 공개공보 제 2007/134181호; 미국 특허 공보 US 제 2004/0171570호, US 제 2007/0287831호, 및 US 제 2008/0039618호; 미국 특허출원 제 12/129,154호, 제 60/989,574호, 제 61/026,995호, 제 61/026,998호, 제 61/056,564호, 제 61/086,231호, 제 61/097,787호, 및 제 61/099,844호; 및 PCT 국제 출원 제 PCT/US2008/064591호, 제 PCT/US2008/066154호, 및 제 PCT/US2008/068922호.
일부 양태에서, 이러한 이환 당 모이어티를 포함하는 이환 당 모이어티 및 뉴클레오시드가 이성질적 배열에 의해 추가로 정의된다. 예를 들어, 4'-2' 메틸렌-옥시 가교를 포함하는 뉴클레오시드는 .알파.-L 배열 또는 .베타.-D 배열일 수 있다. 이전에, α-L-메틸렌옥시(4'-CH2--O-2') 이환 뉴클레오시드는 안티센스 활성을 보였던 안티센스 올리고뉴클레오티드로 포함된다(Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
일부 양태에서, 치환된 당 모이어티는 하나 이상의 비가교 당 치환기 및 하나 이상의 가교 당 치환기를 포함한다(예를 들어, 5'-치환된 및 4'-2' 가교된 당; PCT 국제 출원 WO 제 2007/134181호, 여기서 LNA는 예를 들어 5'-메틸 또는 5'-비닐 그룹으로 치환된다).
일부 양태에서, 변형된 당 모이어티는 당 대용물이다. 일부 이러한 양태에서, 자연 발생 당의 산소 원자는 예를 들어 황, 탄소, 또는 질소 원자로 치환된다. 일부 이러한 양태에서, 이러한 변형된 당 모이어티는 상기에 기술한 바와 같은 가교 및/또는 비가교 치환기도 포함한다. 예를 들어, 특정 당 대용물은 4'-황 원자 및 2'-위치(예를 들어, 게재된 미국 특허 출원 US 제 2005/0130923호 참조) 및/또는 5' 위치에서의 치환 포함한다. 추가적인 예로서, 4'-2' 가교를 갖는 카르보사이클 이환 뉴클레오시드가 기술된다(예를 들어, Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 and Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740 참조).
일부 양태에서, 당 대용물은 5개 원자를 갖는 것이 아닌 고리를 포함한다. 예를 들어, 일부 양태에서, 당 대용물은 6각 테트라하이드로피란을 포함한다. 이러한 테트라하이드로피란은 추가로 변형되거나 치환될 수 있다. 이러한 변형된 테트라하이드로피란을 포함하는 뉴클레오시드는 헥시톨 핵산(HNA), 아니톨 핵산(ANA), 마니톨 핵산(MNA)(Leumann, C J. Bioorg. & Med. Chem. (2002) 10:841-854 참조), 및 플루오로 HNA(F-HNA)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
일부 양태에서, 화학식 VII의 변형된 THP 뉴클레오시드가 제공되고, 여기서 q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7는 각각 H이다. 특정 양태에서 q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7 중 적어도 하나는 H가 아니다. 일부 양태에서, q1, q2, q3, q4, q5, q6 및 q7 중 적어도 하나는 메틸이다. 일부 양태에서, 화학식 VII의 THP 뉴클레오시드가 제공되고, 여기서 R1 및 R2 중 하나는 F이다. 특정 양태에서, R1는 플루오로이며 R2는 H이고, R1은 메톡시이며 R2는 H이고, R1은 메톡시에톡시이며 R2은 H이다.
많은 다른 이환 및 삼환 당 대용물 고리 시스템은, 안티센스 화합물에 포함하기 위해 뉴클레오시드를 변형하는 데 사용될 수 있다고도 해당 기술 분야에 알려져 있다(예를 들어, review article: Leumann, J. C, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854 참조).
2'-F-5'-메틸 치환된 뉴클레오시드(다른 개시된 5',2'-비스 치환된 뉴클레오시드를 위해 PCT 공개공보 WO 제 2008/101157호 참조) 및 리보실 고리 산소 원자의 S로의 대체 및 이환 핵산의 2'-위치에서의 추가적인 치환(미국 특허 공보 제 2005/0130923호 참조) 또는 대안적으로 5'-치환(PCT 공개공보 WO 제 2007/134181호 참조, 여기서 4'-CH2--O-2' 이환 뉴클레오시드는 5' 위치에서 5'-메틸 또는 5'-비닐 그룹으로 추가로 치환된다)과 같은 변형의 조합도 한정 없이 제공된다. 카르보사이클 이환 뉴클레오시드의 합성 및 준비도 그들의 올리고머화 및 생화학적 연구와 함께 기술되었다(예를 들어, Srivastava et al., 2007 참조).
일부 양태에서, 본 발명은 변형된 뉴클레오시드를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 이 변형된 뉴클레오티드는 변형된 당, 변형된 핵염기, 및/또는 변형된 연결을 포함할 수 있다. 특정 변형은 초래되는 올리고뉴클레오티드가 바람직한 특성을 보유하도록 선택된다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 RNA-유사 뉴클레오시드를 포함한다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 DNA-유사 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명의 뉴클레오시드는 하나 이상의 비변형된 핵염기를 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명의 뉴클레오시드는 하나 이상의 변형된 핵염기를 포함한다.
일부 양태에서, 변형된 핵염기는 하기에서 선택된다: 여기에 정의된 바와 같은 범용 염기, 소수성 염기, 무차별 염기, 크기 확대된 염기(size-expanded base), 및 불소화된 염기. 여기에 정의된 바와 같은 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 2-아미노프로필아데닌을 포함하는 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린, 5-프로피닐우라실; 5-프로피닐시토신; 5-하이드록시메틸 시토신, 잔틴, 히포잔틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸, 및 아데닌 및 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-프로필, 및 아데닌 및 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 CH3) 우라실 및 시토신 및 피리미딘 염기의 다른 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(수도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티오, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-디아자구아닌 및 7-디아자아데닌, 3-디아자구아닌 및 3-디아자아데닌, 범용 염기, 소수성 염기, 무차별 염기, 크기 확대된 염기, 및 불소화된 염기. 추가로 변형된 핵염기는 페녹사진 시티딘([5,4-b][1,4]벤족사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘(1H-피리미도[5,4-b][1,4]벤조티아진-2(3H)-온), 치환된 페녹사진 시티딘(예를 들어, 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-13][1,4]벤족사진-2(3H)-온)과 같은 G-클램프, 카르바졸 시티딘(2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘(H-피리도[3',2':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온)과 같은 3환 피리미딘을 포함한다. 변형된 핵염기도 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로사이클, 예를 들어, 7-디아자-아데닌, 7-디아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈으로 대체된 것을 포함할 수 있다. 추가로 핵염기는 미국 특허 제 3,687,808호에 개시된 것, The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, Kroschwitz, J. I., Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858-859에 개시된 것; Englisch et al., 1991에 의해 개시된 것; 및 Sanghvi, Y. S., 1993에 의해 개시된 것을 포함한다.
특정의 상기 언급된 변형된 핵염기에 더하여 다른 변형된 핵염기의 준비를 교시하는 대표적인 미국 특허는 하기를 한정 없이 포함한다: 미국 특허 제 3,687,808호; 제 4,845,205호; 제 5,130,302호; 제 5,134,066호; 제 5,175,273호; 제 5,367,066호; 제 5,432,272호; 제 5,457,187호; 제 5,459,255호; 제 5,484,908호; 제 5,502,177호; 제 5,525,711호; 제 5,552,540호; 제 5,587,469호; 제 5,594,121호; 제 5,596,091호; 제 5,614,617호; 제 5,645,985호; 제 5,681,941호; 제 5,750,692호; 제 5,763,588호; 제 5,830,653호 및 제 6,005,096호, 각각은 전체로 참고 문헌으로 여기에 포함된다.
일부 양태에서, 본 발명은 연결된 뉴클레오시드를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 이러한 양태에서, 뉴클레오시드는 임의의 인터뉴클레오시드 연결을 사용해 함께 연결될 수 있다. 2개의 주된 부류의 인터뉴클레오시드 연결 그룹은 인 원자의 존재 또는 부재로 정의된다. 대표적인 인 함유 인터뉴클레오시드 연결은 포스포디에스테르(P=O), 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, 포스포라미데이트, 및 포스포티오에이트(P=S)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 대표적인 인 비함유 인터뉴클레오시드 연결 그룹은 메틸렌메틸이미노(--CH2--N(CH3)--O--CH2--), 티오디에스테르(--O--C(O)--S--), 티오노카르바메이트(--O--C(O)(NH)--S--); 실록산(--O--Si(H)2--O--); 및 N,N'-디메틸하이드라진(--CH2--N(CH3)--N(CH3)--)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 천연 포스포디에스테르 연결과 비교하여 변형된 연결은, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레아제 내성을 변경하는 데, 전형적으로는 증가시키는 데 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 카이랄 원자를 갖는 인터뉴클레오시드 연결은 라세믹 혼합물 또는 분리된 거울쌍 이성질체로 준비될 수 있다. 대표적인 카이랄 연결은 알킬포스포네이트 및 포스포로티오에이트를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 인-함유 및 인-비함유 인터뉴클레오시드 연결의 준비 방법은 해당 기술 분야의 기술자에게 잘 알려져 있다.
여기에 기술된 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 비대칭 중심을 함유하고, 따라서 절대 입체화학적으로 (R) 또는 (S), 당 아노머와 같은 경우 α 또는 β, 또는 아미노산과 같은 경우 (D) 또는 (L) 등으로 정의될 수 있는, 거울쌍 이성질체, 부분 입체 이성질체, 및 다른 입체 이성질체적 배열을 야기한다. 모든 이러한 가능한 이성질체는 그들의 라세믹 및 광학적으로 순수한 형태와 마찬가지로 여기에 제공된 안티센스 화합물에 포함된다.
중성 인터뉴클레오시드 연결은 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, MMI(3'-CH2--N(CH3)--O-5'), 아미드-3(3'-CH2--C(=O)--N(H)-5'), 아미드-4(3'-CH2--N(H)--C(=O)-5'), 포름아세탈(3'-O--CH2--O-5'), 및 티오포름아세탈(3'-S--CH2--O-5')을 한정 없이 포함한다. 추가로 중성 인터뉴클레오시드 연결은 실록산(디알킬실록산), 카르복실레이트 에스테르, 카르복사미드, 설피드, 설포네이트 에스테르 및 아미드(예를 들어, Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y. S. Sanghvi 및 P. D. Cook, Eds., ACS Symposium Series 580; Chapters 3 and 4, 40-65 참조)를 포함하는 비이온성 연결을 포함한다. 추가적인 중성 인터뉴클레오시드 연결은 N, O, S 및 CH2 성분 부분이 혼합된 것을 포함하는 비이온성 연결을 포함한다.
추가적인 변형도, 올리고뉴클레오티드 상의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 상의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 만들어질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 리간드 컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드의 추가적인 변형은 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 향상시키는 하나 이상의 추가적인 비-리간드 모이어티 또는 컨쥬게이트를 올리고뉴클레오티드로 화학적으로 연결시키는 것을 수반한다. 이러한 모이어티는 콜레스테롤 모이어티(Letsinger et al., 1989), 콜릭 산(Manoharan et al., 1994), 예를 들어 헥실-5트리틸티올(Manoharan et al., 1992; Manoharan et al., 1993)과 같은 티오에스테르, 티오콜레스테롤(Oberhauser et al., 1992), 예를 들어 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison-Behmoaras et al., 1991; Kabanov et al., 1990; Svinarchuk et al., 1993)와 같은 지방족 사슬, 예를 들어 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글레세로-3-H-포스페이트(Manoharan et al., 1995; Shea et al., 1990)와 같은 인지질, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(Manoharan et al., 1995), 아다만탄 아세트산(Manoharan et al., 1995), 팔미틸 모이어티(Mishra et al., 1995), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티(Crooke et al., 1996)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
이러한 올리고뉴클레오티드 컨쥬게이트의 준비를 교시하는 대표적인 미국 특허는 하기를 포함하지만 이에 한정되지 않는다: 미국 특허 제 4,828,979호; 제 4,948,882호; 제 5,218,105호; 제 5,525,465호; 제 5,541,313호; 제 5,545,730호; 제 5,552,538호; 제 5,578,717호, 제 5,580,731호; 제 5,580,731호; 제 5,591,584호; 제 5,109,124호; 제 5,118,802호; 제 5,138,045호; 제 5,414,077호; 제 5,486,603호; 제 5,512,439호; 제 5,578,718호; 제 5,608,046호; 제 4,587,044호; 제 4,605,735호; 제 4,667,025호; 제 4,762,779호; 제 4,789,737호; 제 4,824,941호; 제 4,835,263호; 제 4,876,335호; 제 4,904,582호; 제 4,958,013호; 제 5,082,830호; 제 5,112,963호; 제 5,214,136호; 제 5,082,830호; 제 5,112,963호; 제 5,214,136호; 제 5,245,022호; 제 5,254,469호; 제 5,258,506호; 제 5,262,536호; 제 5,272,250호; 제 5,292,873호; 제 5,317,098호; 제 5,371,241호, 제 5,391,723호; 제 5,416,203호, 제 5,451,463호; 제 5,510,475호; 제 5,512,667호; 제 5,514,785호; 제 5,565,552호; 제 5,567,810호; 제 5,574,142호; 제 5,585,481호; 제 5,587,371호; 제 5,595,726호; 제 5,597,696호; 제 5,599,923호; 제 5,599,928호 및 제 5,688,941호, 각각은 여기에 참고 문헌으로 포함된다.
E. 키트
본 개시는 키트도 제공한다. 여기에 개시된 임의의 성분은 키트의 형태로 결합될 수 있다. 일부 양태에서, 키트는 상기에 또는 청구범위에 기술된 덴드리머 또는 조성물을 포함한다.
키트는 일반적으로 성분이 위치될 수 있으며 바람직하게는 적절하게 분액될 수 있는 적어도 하나의, 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 다른 용기를 포함할 것이다. 키트에 1개보다 많은 성분이 존재하는 경우, 키트는 일반적으로 추가적인 성분이 별도로 위치할 수 있는, 제2, 제3 또는 다른 추가적인 용기를 함유할 것이다. 그러나, 성분의 다양한 조합이 용기에 포함될 수 있다. 일부 양태에서, 모든 핵산 전달 성분은 단일한 용기에 결합된다. 다른 양태에서, 현(instant) 중합체를 갖는 일부 또는 전부의 덴드리머 전달 성분은 별개의 용기에 제공된다.
본 발명의 키트는 전형적으로 상업적 판매를 위해 밀폐된 상태의 다양한 용기를 함유하는 포장도 포함할 것이다. 이러한 포장은 원하는 용기가 유지되는 판지 또는 사출성형 또는 중공성형 플라스틱 포장을 포함할 수 있다. 키트는 키트 성분을 활용하는 지침도 포함할 수 있다. 지침은 구현될 수 있는 변형이 포함될 수 있다.
F. 실시예
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 설명하기 위해 포함된다. 하기의 예에 개시된 기법은 본 발명의 실시에서 잘 기능하기 위해 발명자에 의해 발견된 기법을 나타내며, 따라서 실시를 위한 바람직한 모드를 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것이 해당 기술 분야의 통상의 기술자에게 이해되어야 한다. 그러나, 해당 기술 분야의 통상의 기술자는 본 개시에 비추어, 개시된 특정 양태에서 많은 변화가 만들어질 수 있고, 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 유사하거나 비슷한 결과를 여전히 얻을 수 있다는 것을 이해해야 한다.
예 1: 물질 및 기기
1. 화학적 합성을 위한 물질
모든 아민, 티올, 및 그렇지 않으면 특정되지 않은 화학 물질은 Sigma-Aldrich에서 구입되었다. 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)는 Avanti Lipids에서 구입되었다. 지질 PEG2000은 하기에 기술한 바와 같이 화학적으로 합성되었다. C12-200은 보고된 절차(Love et al., 2010)를 따라 합성되었다. 모든 유기 용매는 Fisher Scientific에서 구입되었고, 용매 정제 시스템으로 정제되었다(Innovative Technology).
2. 실험관내 및 생체내 실험을 위한 핵산 및 다른 물질
모든 SiRNA는 Sigma-Aldrich에서 구입되었다. Let-7g miRNA 모방체 및 대조군 모방체는 Ambion by Life Trechnology에서 구입되었다. Dulbecco's Modified Eagle Media(DMEM) 및 fetal bovine serum(FBS)은 Sigma-Aldrich에서 구입되었다. OptiMEM, DAPI, 및 Alexa Fluor 499 phalloidin은 Life Technologies에서 구입되었다. One-Glo + Tox은 Promega에서 구입했다. Biophen FVII는 Aniara Corporation에서 구입되었다.
siRNA의 센스 및 안티센스 서열은 하기와 같다:
siLuc(루시페라아제에 대한 siRNA). dT는 DNA 염기이다. 모든 다른 것들은 RNA 염기이다.
센스: 5'-GAUUAUGUCCGGUUAUGUA[dT][dT]-3' (SEQ ID NO: 3)
안티센스: 3'-UACAUAACCGGACAUAAUC[dT][dT]-5' (SEQ ID NO: 4)
siFVII(FVII에 대한 siRNA). 2'-플루오로 변형 뉴클레오티드는 아래 경우이다.
센스: 5'-GGAucAucucAAGucuuAc[dT][dT]-3' (SEQ ID NO: 1)
안티센스: 3'-GuAAGAcuuGAGAuGAucc[dT][dT]-5' (SEQ ID NO: 2)
siCTR(대조군으로서의 siRNA)
센스: 5'-GCGCGAUAGCGCGAAUAUA[dT][dT]-3' (SEQ ID NO: 5)
안티센스: 3'- UAUAUUCGCGCUAUCGCGC[dT][dT]-5' (SEQ ID NO: 6)
Sigma-Aldrich MISSION siRNA Universal Negative Control #1(카탈로그 번호: SIC001)는 대조군 실험에서 표적되지 않은 siRNA로서 사용되었다. 2' OMe 변형된 대조군 siRNA(Sigma-Aldrich, proprietary modifications)가 생체내 연구에서 면역 자극을 감소시키기 위해 사용되었다.
Cy5.5-표지된 siRNA(이미징을 위한 siRNA)
센스: 5'-Cy5.5-GAUUAUGUCCGGUUAUGUA[dT][dT]-3' (SEQ ID NO: 3)
안티센스: 3'-UACAUAACCGGACAUAAUC[dT][dT]-5' (SEQ ID NO: 4)
Let-7g miRNA 모방체
Ambion(Life Technologies) mirVana miRNA mimic(카탈로그 번호: 4464070, 제품 ID: MC11758, 명칭: has-let-7g). 정확한 서열 및 변형은 Ambion에 의해 개시되지 않았다. 성숙한 인간 Let-7g를 모방한다.
음성 대조군(CTR) miRNA 모방체
Ambion(Life Technologies) mirVana miRNA Mimic, Negative Control #1(카탈로그 번호: 4464061). 정확한 서열 및 변형은 Ambion에 의해 개시되지 않았다.
3. 로봇식 자동화
나노입자(NP) 제형화 및 실험관내 스크리닝은 8-채널 액체 취급 팔(liquid handling arm: LiHa), 96-채널 헤드를 갖는 다중-채널 팔(mult-channel arm: MCA), 로봇식 조작기 팔(robotic manipulator arm:Roma), 및 통합된 InfiniTe F/M200 프로 마이크로 플레이트 리더(Tecan)을 갖춘 Tecan Freedom EVO 200 liquid handling robot으로 수행되었다. 2개의 통합된 맞춤형 가열 및 교반 화학 반응 스테이션(V&P Scientific 710E-3HM Series Tumble Stirrers)이 반응 및 혼합 지원을 제공했다. 모든 작업은 EVOware Standard software(Tecan)에 프로그래밍되었다.
4. 합성 특성평가
1H 및 13C NMR은 Varian 500 MHz spectrometer로 수행되었다. MS는 Voyager DE-Pro MALDI TOF로 수행되었다. 플래시 크로마토그래피는 UV-vis 및 증발형 광 산란 검출기(evaporative light scattering detectors: ELSD)를 갖춘 Teledyne Isco CombiFlash Rf-200i chromatography system으로 수행되었다. 입자 크기 및 제타 포텐셜은 Malvern Zetasizer Nano ZS(He-Ne 레이저, λ = 632 nm)을 사용하여 동적 광 산란(Dynamic Light Scattering: DLS)에 의해 측정되었다.
5. 생체내 연구를 위한 나노입자 제형화
생체내 연구를 위해 제형화된 덴드리머 나노입자는 해링본(herringbone) 신속 혼합 특징을 갖는 미세유체 혼합 장치(Precision Nanosystems NanoAssemblr)를 사용해 준비되었다. 덴드리머, DSPC, 콜레스테롤, 지질 PEG2000의 에탄올 용액은 하기에 기술된 바와 같이 siRNA 산성 용액과 신속하게 결합되었다. 수용액:EtOH의 전형적인 부피비는 3:1이고, 전형적인 유속은 12 mL/분이다.
6. 모듈 분해성 덴드리머의 자동화된 시험관내 전달 스크리닝
나노입자(NP) 제형화 및 실험관내 스크리닝은 8-채널 액체 취급 팔(liquid handling arm: LiHa), 96-채널 헤드를 갖는 다중-채널 팔(mult-channel arm: MCA), 로봇식 조작기 팔(robotic manipulator arm:Roma), 및 통합된 InfiniTe F/M200 프로 마이크로 플레이트 리더(Tecan)을 갖춘 Tecan Freedom EVO 200 liquid handling robot으로 수행되었다.
반딧불이 루시페라이제(HeLa-Luc)를 안정하게 발현하는 HeLa 세포는 렌티 바이러스 감염과 그 뒤에 이어지는 클론 선택을 이용한 루시페라아제의 안정한 형질주입에 의해 HeLa 세포(ATCC)로부터 유래되었다. HeLa-Luc 세포를 불투명한 흰색 96-웰 플레이트(Corning)에 살포하고(10,000 세포/웰), 페놀 레드 없는 5% FBS로 보충된 DMEM에서 밤새 부착하도록 허용되었다. 미디아는 둘째날에 형질주입을 시작하기 전에 신선한, FBS-함유 미디아로 교체되었다.
G1DD-siLuc 나노입자는 자동화된 유체 취급 로봇의 도움에 의해 발견 과정을 가속화하기 위해 제형화되었다. 모든 작업은 EVOware Standard software에 프로그래밍되었다. 먼저, 덴드리머 반응 용액은 원래의 반응 농도에서 에탄올에서 12.5 mM로 희석되었다. 다음으로, 덴드리머 용액은 에탄올에서 12.5 mM에서 1 mM로 LiHa 팔을 이용해 두번째로 희석되었다. 그 다음, 89.2 μL의 에탄올 내의 지질 혼합물이 96-웰 클리어 플레이트에 첨가되었다. 지질 혼합물은 에탄올 내에 DSPC(0.0690 mM), 콜레스테롤(0.2622 mM), 및 지질 PEG2000(0.0138 mM)로 구성되었다. 이어서, 30.8 μL의 각각의 덴드리머(1 mM)는 96-웰 플레이트 내의 지질 혼합물에 LiHa를 통해 첨가되었고, 그후 신속 혼합이 이어졌다(15번; 75 μL 혼합 부피; 250 μL/초 속도). LiHa는 한번에 8개 팁을 첨가하고 혼합했다. 제2 클리어 96-웰 플레이트에 시트레이트 버퍼(pH = 4.3) 내의 50 μL의 siLuc(20 ng/μL)가 LiHa에 의해 첨가되었다. 그 다음 30 μL의 에탄올 혼합물(덴드리머, DSPC, 콜레스테롤, 지질 PEG2000)이 50 μL siLuc 용액에 첨가되었고, 그후 덴드리머 나노입자를 형성하기 위해 신속 혼합이 이어졌다(15회; 75 μL 혼합 부피; 250 μL/초 속도). 다음으로, NP를 희석하고 pH를 높이기 위해, LiHa를 이용해 120 μL의 멸균 PBS(1×)가 첨가되었고 혼합되었다. 이어서, 성장하는 세포에 용이한 전달을 고려하기 위해 플레이트가 재구성되었다. 마지막으로, 20 μL의 NP 용액은 오염을 피하기 위하여 MCA96 헤드을 통해 멸균 일회용 팁을 사용해 배양 세포에 첨가되었다. 세포는 궁극적으로 100 ng siLuc(33 nM)을 받았다. 이 스크리닝 단계에서 덴드리머 대 siLuc의 몰비는 100:1이었다. 제형의 최종 조성은 G1DD:콜레스테롤:DSPC:지질 PEG2000 = 50:38:10:2(몰 기준)이었다. 세포는 24시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 배양되었고, 그 다음 반딧불이 루시페라아제 활성 및 생존력이 One Glo + Tox assay kits(Promega)를 사용하여 분석되었다.
7. 생체내 연구를 위한 덴드리머-소형 RNA 제형화
생체내 연구를 위한 제형화된 덴드리머 나노입자는 헤링본 혼합 특징을 갖는 미세유체 혼합 장치(Precision Nanosystems NanoAssemblr)를 사용하여 준비되었다. 덴드리머, DSPC, 콜레스테롤, 및 지질 PEG2000(50:38:10:2 몰비)의 에탄올 용액은 소형 RNA의 산성 용액과 신속하게 혼합되어 25:1(덴드리머:소형 RNA)의 최종 중량비를 제공했다. 수용액:EtOH의 전형적인 부피비는 3:1이었고, 전형적인 유속은 12 mL/분이었다. C12-200 LNP는 보고된 절차(Love et al., 2010)에 따라 준비되었다. C12-200, DSPC, 콜레스테롤, 및 지질 PEG2000(50:38.5:10:1.5 몰비)의 에탄올 용액은 소형 RNA의 산성 용액과 신속하게 혼합되어, 7:1(C12-200:소형 RNA)의 최종 중량비를 제공했다. 모든 제형화된 NP는 3.5kD 컷오프에서 멸균 PBS 내에서의 투석에 의해 정제되었고, 크기는 동적 광 산란(DLS)에 의해 생체내 연구 전에 측정되었다. 적용 가능한 경우, 용액의 소량을 취해 프로토콜을 따라 Ribogreen binding assay(Invitrogen)로 소형 RNA의 캡슐화를 측정했다.
8. 동물 연구
모든 실험은 텍사스 대학 남서부 의료 센터의 제도적 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committees)의 승인을 받았고, 지역, 주, 및 연방 규정에 부합했다. 암컷 C57BL/6 마이스는 Harlan Laboratories(Indianapolis, IN)에서 구입되었다. MYC-유발 간 종양을 앓는 형질 전환 마이스는 TRE-MYC 스트레인과 LAP-tTA 스트레인을 교차하여 생성되었다. LAP-tTA 및 TRE-MYC 유전자형을 앓는 마이스는 dox 1 mg/mL에서 유지되었고, MYC는 dox를 제거하여 유도되었다. 파워 분석은 통계적 유의성을 얻기 위하여 필요한 동물 수를 예상하기 위해 수행되었다.
9. 마이스의 생체내 인자 VII 침묵
생체내 전달 스크리닝을 위해, 암컷 C57BL/6 마이스는, PBS(음성 대조군, n=3) 또는 표적하지 않는 siRNA를 함유하는 덴드리머 NP(siCTR, 음성 대조군, n=3) 또는 PBS에서 희석된(전체 부피 200 mL 이하) 안티-인자 VII siRNA를 함유하는 덴드리머 NP(siFVII, n=3)의 꼬리 혈관 i.v. 주사를 맞았다. 48시간 후, 체중 증가/감소가 측정되었고, 마이스는 레트로-오비탈 눈 채혈에 의한 혈액 샘플 수집을 위해 이소플루오란 흡입으로 마취시켰다. 세럼은 세럼 분리 튜브(Becton Dickinson)에 의해 고립되었고, 인자 VII 단백질 수준은 발색 에세이(Biophen FVII, Aniara Corporation)에 의해 분석되었다. 표준 곡선은 PBS-주사된 마이스의 샘플을 사용하여 그려졌고, 상대적인 인자 VII 발현은 처리된 그룹을 처리되지 않은 PBS 대조군과 비교하여 결정되었다.
치료적 연구를 위해, 형질 전환 마이스의 FVII 녹다운은 상기 혈액 에세이 및 qPCR에 의해 수확된 간 조직을 이용해 확인되었다. 통계적 유의성을 평가하기 위해, 95% 신뢰 수준에서 투-테일드 스튜던트 t 검정이 실시되었다.
10. 생체 분포
암컷 C57BL/6 마이스 또는 간 종양을 앓는 형질 전환 마이스는 Cy5.5-siRNA를 함유하는 덴드리머 NP를 siRNA 200 mL의 1 mg/kg에서 꼬리 혈관 i.v. 주사로 받았다. 주사 24시간 후에, 마이스가 안락사되고 장기는 제거되었다. 생체 분포는 Cy5.5 필터 설정을 갖는 IVIS Lumina System(Caliper Life Sciences)으로 전체 장기를 이미징하여 평가되었다.
공초점 이미징을 위해, 조직은 동결 절편(7 mm)되고 실온에서 4% 파라포름알데하이드를 사용해 10분간 고정되었다. 슬라이드는 PBS로 3회 세척되고, 1% 알부민을 갖는 PBS에서 30분간 블로킹(blocking)되었다. 그 다음, 절편은 Alexa Fluor 488 Phalloidin(1:200 희석, Life Technologies)과 1% 알부민을 갖는 PBS에서 30분간 배양되었다. 슬라이드는 0.1% Tween 20으로 3회 세척되었고, ProLong Gold Antifade(Life Technologies)을 이용하여 장착되었다. 절편은 25× 대물 렌즈를 갖춘 LSM 700 포인트 스캐닝 공초점 현미경(Zeiss)을 이용해 이미징되었다.
11. 생체내 독성 평가 및 Let-7g 치료적 연구
야생형 마이스 또는 간 종양을 앓는 형질 전환 마이스는 무작위로 다른 그룹으로 나뉘었다. 마이스는 siCTR를 함유하는 덴드리머 NP의 꼬리 혈관 i.v. 주사를 맞았다. 그들의 체중은 매일 모니터링되었다. 간 종양을 앓는 형질 전환 마이스에게 복수의 꼬리 혈관 주사가 반복적인 투약을 시뮬레이션하기 위해 수행되었다.
Let-7g 치료적 연구에서, 간 종양을 앓는 형질 전환 마이스는 Let-7g 모방체 또는 CTR 모방체를 갖는 덴드리머 NP의 매주의 꼬리 혈관 i.v. 주사를, 26일째부터 내지 61일째 나이까지 PBS 200 mL 내 1 mg/kg 투여량으로 맞았다. 처리 순서 무작위화가 사용되었다. 블라인딩은 하지 않았다. 그들의 체중, 복부 크기, 및 생존률은 신중하게 모니터링되었다. 통계적 유의성을 평가하기 위해 95% 신뢰 수준에서의 투-테일드 T 검정 또는 맨텔-콕스 검정이 수행되었다.
실시예2: PEG 지질 및 덴드리머의 합성 및 특성 평가
1. 1,512개의 제1 세대 분해성 덴드리머(G1DD)를 함유하는 라이브러리의 합성
G1DD는 2개의 순차적인 직교 반응을 통해 합성되었다. 처음에, 상이한 초기 분지 중심(IBC)를 갖는 아민은 2-(아크릴로일옥시)에틸 메타크릴레이트(AEMA)의 아크릴레이트 그룹과 IBC 수와 동일한 아민 대 AEMA의 몰비로 개별적으로 반응했다(예를 들어, 2A 아민: 2당량의 AEMA가 첨가되었다; 6A 아민: 6당량의 AEMA가 첨가되었다). 반응은 5 몰% 부틸레이티드 하이드록시톨루엔(BHT)의 첨가로 24시간 동안 50℃에서 수행되었다. 다음으로, 각 제1 단계 부가물은 각 티올과 아민 IBC 수와 동일한 티올 대 부가물의 몰비로 개별적으로 반응했다(예를 들어, 2A 아민 제1 부가물: 2당량의 각 티올이 첨가되었다; 6A 아민 제1 부가물: 6당량 각 티올이 첨가되었다). 반응은 5 몰% 디메틸페닐포스핀(DMPP) 촉매의 첨가로 48시간 동안 60℃에서 수행되었다. 1,512개의 멤버 라이브러리 합성은 유리 바이알 및 알루미늄 반응 블록에서 반응을 수행함에 의해 가속화되었다. 맞춤형 가열 및 교반 화학 반응 스테이션(V&P Scientific 710E-3HM Series Tumble Stirrers)이 활용되었다.
초기 생체내 전달 스크리닝 실험은 미가공의 G1DD로 수행되었다. 활성을 증명하기 위한 후속 연구는 정제된 덴드리머를 사용하여 수행되었다.
모든 생체내 실험은 정제된 G1DD로 수행되었다. 정제된 G1DD는, 헥산 및 에틸 아세테이트의 구배 용리액(gradient eluent)으로 Teledyne Isco chromatography sysytem을 사용하여 중성 알루미나 컬럼 상에서 컬럼 플래시 크로마토그래피에 의해 얻어졌다.
2. 더 높은 세대 분해성 덴드리머(HGDD)의 합성(예로서, 1A2-G2-SC8)
더 높은 세대 분해성 덴드리머는 이전 방법에 따라 준비되었다(Ma et al., 2009). 1A2-G1은 1A2 아민이 5 몰% BHT의 존재 하에 50℃에서 24시간 동안 1당량의 AEMA와 반응한 직후에 준비되었다. 1A2-G1(4.00 g, 11.7 mmol)은 10 mL DMSO에 용해되었다. 2-아미노에탄티올(1.37 g, 17.5 mmol)을 상기 용액에 첨가한 후, 반응은 실온에서 30분 동안 교반되었다. 그 다음, 300 mL 디클로로메탄은 즉시 반응 용액에 첨가되었고 과량의 2-아미노에탄티올을 제거하기 위해 차가운 염수(50 mL × 3)로 세척되었다. 유기상을 마그네슘 설페이트로 건조시켰고, 다음 단계에 즉시 사용하기 위해 회전 증발을 통해 농축시켰다. AEMA(4.75 g, 25.8 mmol) 및 BHT(227 mg, 1.08 mmol)는 상기 용액에 첨가되었다. 반응은 50℃에서 교반되었고 1H NMR을 통해 모니터링되었다. 반응이 완결된 후에, 용액은 TLC 플레이트 분석에 의해 EAMA가 발견되지 않을 때까지 20 mL 헥산 부분으로 반복해서 세척되었다. 세척된 용액은 진공에서 건조되었고, 점성 액체 1A3-G2는 다음 단계를 위해 직접 수득되었다. 1A3-G2는 상기 2단계 합성 절차에 따라 반응되었고, 점성 액체 1A3-G3은 다음 단계를 위해 직접 수득되었다. 1A2-G3(0.5 g, 0.3 mmol)가 0.5 mL DMSO에 용해된 후, 1-옥탄티올(216 mL, 1.22 mmol) 및 디메틸페닐포스핀(DMPP)(8.6 mL, 0.061 mmol)가 첨가되었다. 반응은 60℃에서 48시간 동안 교반되고, 그 다음 헥산 및 에틸 아세테이트의 구배 용리액으로 중성 알루미나 컬럼을 작동시켜 정제했다. 엷은 노란색의 점성 액체 1A2-G3-SC8이 얻어졌다.
3. 지질 PEG2000의 합성
PEG44-OH(80 g, 40 mmol) 및 피리딘(6.5 mL, 80 mmol)은 250 mL 무수 DCM에 용해되었고, 0℃까지 냉각되었다. 50 mL DCM 내의 메탄설포닐 클로라이드(15.5 mL, 200 mmol)는 30분에 걸쳐 첨가되었고, 혼합물은 실온에서 밤새 교반되었다. 다른 100 mL DCM이 첨가되었고, 유기상은 포화된 NaHCO3 용액(50 mL × 3) 및 그 다음 염수(50 mL × 3)로 세척되었다. 초래된 용액을 농축시키고, 잔류물이 이소프로판올에서 재결정되고 건조되었고, 흰색 파우더 PEG2000-Ms(74 g, 93%)가 얻어졌다.
PEG2000-Ms(35.41 g, 17.7 mmol)는 DMF 250 mL에 용해되었다. 그 다음, NaN3(12.4 g, 19.0 mmol)가 용액에 첨가되었다. 반응은 질소 하에 2일 동안 50℃에서 교반되었다. DMF의 제거 후에, 잔류물은 300 mL DCM에 용해되고, 염수(50 mL × 3)로 세척되었다. 용매의 제거 후에, 잔류 오일은 50 mL 메탄올에 용해되고, 생성물이 300 mL 디에틸 에테르로 3회 침전되었고, 흰색 파우더 PEG2000-N 3 로서 원하는 화합물(25.55 g, 72%)이 수득되었다.
프로파르길아민(0.50 g, 9.1 mmol), BHT(191 mg, 0.91 mmol), 및 EAMA(2.73 g, 18.2 mmol)가 25 mL 반응 바이알에 첨가되었다. 혼합물이 48시간 동안 50℃에서 교반되었다. 반응은 냉각되었고, 다음 반응을 위해 무색의 오일 생성물 T3-G1이 정제 없이 수득되었다.
4. 선택 덴드리머의 특성평가
1H NMR(400 MHz, CDCl3, δ): 4.384.19(br, 28H, -OCH 2 CH 2 O-), 2.90-2.80(br, 7H, C(O)CH(CH3)CH 2 S), 2.75-2.71(br, 14H, -NCH2 CH 2 C(O)-), 2.70-2.49(br, 28H, C(O)CH(CH3)CH 2 S, SCH 2 ), 2.49-2.39(br, 36H, N(CH 3 ) 2 , NCH 2 CH 2 N(CH 2 CH 2 ) 2 NCH 2 , CH 2 N(CH 2 ) 2 ), 1.57-1.48(m, 8H, SCH2 CH 2 CH2), 1.37-1.28(br, 8H, SCH2CH2 CH 2 ), 1.28-1.16(br, 53H, SCH2CH2 (CH 2 ) 4 CH3, CHC(CH 3 )CH2S), 0.85(t, J = 7.1 Hz, 12H, (CH2)4 CH 3 ). 13C NMR(400 MHz, CDCl3, δ): 174.92, 172.03, 62.22, 62.17, 62.13, 62.07, 49.06, 40.23, 40.14, 35.36, 32.68, 32.56, 31.76, 29.60, 29.14, 28.82, 22.58, 16.85, 16.81, 14.04. MS(MALDI-TOF, m/z) C109H196N6O28S7의 계산값: 2261.21, 측정값: 2262.43.
1H NMR (400 MHz, CDCl3, δ): 4.344.21 (br, 16H, OCH 2 CH 2 O), 2.82-2.76 (m, 4H, SCH 2 CH(CH3)), 2.73 (t, J = 7.1 Hz, 8H, C(O)CH 2 CH2N), 2.70-2.64 (m, 4H, SCH 2 CH(CH3)), 2.58-2.51 (m, 4H, SCH2CH(CH3)), 2.51-2.46 (m, 8H, CH2 CH 2 S), 2.45-2.40 (m, 18H, (C(O)CH2 CH 2 )2NCH 2 CH2CH2N(CH 2 )2), 2.35-2.26 (br, 4H, CH2 CH 2 N(CH 2 )2), 1.65-1.58 (br, 4H, NCH2 CH 2 CH2N), 1.57-1.49 (m, 8H, SCH2 CH 2 CH2), 1.37-1.28 (br, 8H, SCH2CH2 CH 2 ), 1.28-1.16 (br, 44H, SCH2CH2 (CH 2 ) 4 CH3, CHC(CH 3 )CH2S), 0.85 (t, J = 7.0 Hz, 12H, (CH2)4 CH 3 ). 13C NMR (400 MHz, CDCl3, δ): 174.90, 172.18, 62.18, 62.05, 49.05, 40.14, 35.37, 32.68, 32.40, 31.76, 29.60, 29.15, 28.83, 22.60, 16.81, 14.08. MS (MALDI-TOF, m/z) C78H144N4O16S4의 계산값: 1520.95, 측정값: 1521.32.
1H NMR (400 MHz, CDCl3, δ): 4.324.21 (br, 16H, OCH 2 CH 2 O), 2.82-2.76 (m, 4H, SCH 2 CH(CH3)), 2.73 (t, J = 7.0 Hz, 8H, C(O)CH 2 CH2N), 2.69-2.62 (m, 4H, SCH 2 CH(CH3)), 2.58-2.50 (m, 4H, SCH2CH(CH3)), 2.50-2.45 (m, 8H, CH2 CH 2 S), 2.45-2.38 (m, 12H, (C(O)CH2 CH 2 )2NCH 2 ), 2.34-2.24 (br, 4H, CH 2 N(CH3)CH 2 ), 2.24-2.00 (br, 3H, CH2N(CH 3 )CH2) 1.66-1.57 (br, 4H, NCH2 CH 2 CH2N), 1.57-1.48 (m, 8H, SCH2 CH 2 CH2), 1.37-1.28 (br, 8H, SCH2CH2 CH 2 ), 1.28-1.16 (br, 45H, SCH2CH2 (CH 2 ) 4 CH3, CHC(CH 3 )CH2S), 0.85 (t, J = 7.0 Hz, 12H, (CH2)4 CH 3 ). 13C NMR (400 MHz, CDCl3, δ): 174.90, 172.18, 62.18, 62.05, 49.00, 40.13, 35.36, 32.68, 32.35, 31.76, 29.60, 29.15, 28.83, 22.60, 16.81, 14.04. MS (MALDI-TOF, m/z) C75H139N3O16S4의 계산값:: 1465.90, 측정값: 1465.65.
1H NMR (400 MHz, CDCl3, δ): 4.344.20 (br, 20H, OCH 2 CH 2 O), 2.82-2.76 (m, 5H, SCH 2 CH(CH3)), 2.75-2.70 (br, 10H, C(O)CH 2 CH2N), 2.69-2.62 (m, 5H, SCH 2 CH(CH3)), 2.60-2.52 (m, 5H, SCH2CH(CH3)), 2.52-2.49 (m, 10H, CH2 CH 2 S), 2.49-2.45 (br, 16H, NCH 2 CH 2 N), 2.45-2.40 (br, 10H, CH 2 N), 1.57-1.48 (br, 10H, SCH2 CH 2 CH2), 1.37-1.28 (br, 10H, SCH2CH2 CH 2 ), 1.28-1.16 (br, 55H, SCH2CH2 (CH 2 ) 4 CH3, CHC(CH 3 )CH2S), 0.87-0.79 (br, 15H, (CH2)4 CH 3 ). 13C NMR (400 MHz, CDCl3, δ): 174.93, 172.13, 62.28, 62.01, 49.04, 40.13, 35.36, 32.68, 32.35, 31.76, 29.60, 29.15, 28.83, 22.59, 16.82, 14.05. MS (MALDI-TOF, m/z) C93H173N5O20S5의 계산값: 1840.13, 측정값: 1841.37. 5A2-SC8도 6개의 팔로 준비되었다(하기에 보여지는 구조).
1H NMR (400 MHz, CDCl3, δ): 4.324.21 (br, 20H, OCH 2 CH 2 O), 2.82-2.76 (m, 5H, SCH 2 CH(CH3)), 2.76-2.70 (br, 10H, C(O)CH 2 CH2N), 2.69-2.62 (m, 5H, SCH 2 CH(CH3)), 2.58-2.50 (m, 5H, SCH2CH(CH3)), 2.50-2.45 (m, 10H, CH2 CH 2 S), 2.45-2.20 (br, 20H, ((CH 2 )2NCH 2 , CH 2 NHCH 2 ), 1.66-1.57 (br, 6H, NCH2 CH 2 CH2N), 1.57-1.48 (br, 10H, SCH2 CH 2 CH2), 1.37-1.28 (br, 10H, SCH2CH2 CH 2 ), 1.28-1.16 (br, 55H, SCH2CH2 (CH 2 ) 4 CH3, CHC(CH 3 )CH2S), 0.82-0.75 (br, 15H, (CH2)4 CH 3 ). 13C NMR (400 MHz, CDCl3, δ): 174.98, 172.13, 62.28, 62.01, 49.04, 40.13, 35.36, 32.68, 32.35, 31.76, 29.60, 29.15, 28.83, 22.61, 16.85, 14.14. MS (MALDI-TOF, m/z) C94H174N4O20S5의 계산값: 1839.13, 측정값: 1838.97.
1H NMR (400 MHz, CDCl3, δ): 4.334.20 (br, 24H, OCH 2 CH 2 O), 2.82-2.77 (m, 6H, SCH 2 CH(CH3)), 2.77-2.71 (br, 12H, C(O)CH 2 CH2N), 2.68-2.62 (m, 6H, SCH 2 CH(CH3)), 2.60-2.52 (m, 6H, SCH2CH(CH3)), 2.52-2.48 (br, 12H, CH2 CH 2 S), 2.48-2.46 (br, 12H, NCH 2 CH 2 N), 2.45-2.40 (br, 12H, (CH 2 ) 2 N), 1.57-1.47 (br, 12H, SCH2 CH 2 CH2), 1.37-1.28 (br, 12H, SCH2CH2 CH 2 ), 1.28-1.16 (br, 108H, SCH2CH2 (CH 2 ) 8 CH3, CHC(CH 3 )CH2S), 0.87-0.80 (br, 18H, (CH2)8 CH 3 ). 13C NMR (400 MHz, CDCl3, δ): 174.87, 172.07, 62.16, 62.04, 49.48, 40.47, 40.11, 35.34, 32.69, 32.42, 31.86, 29.61, 29.58, 29.57, 29.50, 29.29, 29.21, 28.85, 22.62, 16.81, 14.06. MS (MALDI-TOF, m/z) C132H246N4O24S6의 계산값: 2463.65, 측정값: 2464.52.
실시예3: 라이브러리 디자인 및 제1 세대 분해성 덴드리머(G1DD)의 합성
간암은, 약물-유도 간독성이 근원적인 간 질환을 악화시킬 수 있기 때문에, 치료적 개입에 도전적인 숙주이다(Boyerinas et al., 2010). 따라서, 효과적인 RNAi-매개 치료를 달성하기 위해, 담체의 높은 효능과 낮은 독성의 균형이 유지되어야 한다. 이는 크기, 화학적 구조, 및 궁극적인 물리적 성질의 관점에서 전달 담체를 쉽게 조정하기 위한 다목적 전략을 필요로 한다(도1A), 일부 양태에서, 덴드리머는 하나 이상의 하기의 특징을 나타내는 덴드리머가 디자인되었다: 화학적 및 크기 조절을 위한 최적의 단분산 물질(Wu et al., 2004; Carlmark et al., 2009; Killops et al., 2008; Ma et al., 2009; Franc and Kakkar, 2010). 직교 반응은 하기와 같은 다양한 파라미터를 통해 제1 세대 분해성 덴드리머(G1DD)를 다양화하기 위하여 2-(아크릴로일옥시)에틸 메타크릴레이트(AEMA)와 순차적으로 반응하기 위해 활용되었다: 코어(C), 연결부 또는 반복 단위(L), 및 주변부 또는 말단 그룹(P)(도1B). 일부 양태에서, 에스테르는 출발 분해성 연결부로서 선택되었는데, 이는 폴리에스테르가 최소의 독성을 갖는 FDA 승인 제품에서 사용되기 때문이다. 각 성장 단계에서, 에스테르 수는 증가하여, 효능 및 독성이 균형을 이룬 분해성 덴드리머를 확인할 기회를 제공한다.
이전 결과는 이러한 직교 반응이 일련의 세대를 갖는 폴리에스테르 덴드리머를 만들 수 있다는 것을 보여준다(Ma et al., 2009). 그러나, 이 전략이 활용되기 전에, 이 방법은 다양한 화학적으로 구별되는 아민 및 티올 화합물을 정제 없이 사용하여 다양화된 덴드리머를 수득할 수 있다는 것이 증명되었다. 이러한 화학 반응의 견고성을 시험하기 위해, 가장 어려운 출발 물질인, 개시 분지 중심(IBC)으로서 6개의 N-H 결합을 갖는 트리스(2-아미노에틸)아민 및 탄소 14개 길이의 알킬 사슬을 갖는 테트라데실아민이 직교 마이클 첨가 반응의 구조적인 한계를 시험하기 위해 사용되었다. 트리스(2-아미노에틸)아민 및 테트라데실아민 모두는 5 몰% 부틸레이티드 하이드록시톨루엔(BHT)의 존재 하에 50℃에서 24시간 후에 AEMA의 아크릴레이트 작용기와 정량적 및 선택적으로 반응한 반면, AEMA는 자체적으로 이러한 조건 하에 반응하지 않고 유지된다(도2 & 도3). 제2 직교 반응(설파-마이클 첨가), 디메틸포스핀은 낮은 농도 또는 작은 스케일 조건에서 최종 생성물을 달성하기 위해서뿐만 아니라 높은 전환(1H NMR에 의하면, 100%)을 달성하여 물질이 후속적인 시험을 위한 정제 또는 세대 확장(도4 & 도5) 없이 사용될 수 있도록 하기 위해 촉매로서 요구된다. 일부 덴드리머는 생체내 연구를 수행하기 전에 더 큰 스케일로 합성되고 플래시 크로마토그래피에 의해 정제되었다.
다중 전달 장벽 때문에, 나노캡슐화를 통한 소형 RNA 담체의 효능은 pKa, 토폴로지/구조, 및 소수성(Siegwart et al., 2011; Jayaraman et al., 2012; Schaffert et al., 2011; Whitehead et al., 2014)을 포함한 다양한 인자에 의해 영향을 받는다. 높은 전달 효능을 갖는 분해성 덴드리머를 쉽게 확인하기 위해, G1DD의 라이브러리가 4개의 지역과 함께 디자인되었다: 코어-형성 아민 C 및 주변부-형성 티올 P를 화학적으로 다양화하는 것에 의한, 코어 결합 - 주변부 안정화(지역 I), 코어 결합 - 주변부 결합(지역 II), 코어 안정화 - 주변부 안정화(지역 III), 및 코어 안정화 - 주변부 결합(지역 IV)(도1C 및 도1D). 지역 I 및 지역 II에서, RNA 결합은 1개(1An) 내지 6개(6An)의 초기 분지 중심(IBC)를 갖는 아민에 의해 조절되었다. 대응하는 덴드리머는 따라서 1개 내지 6개의 분지를 함유한다. 지역 III 및 지역 IV에서, RNA-덴드리머 NP의 안정화는 다른 길이의 알킬 사슬에 의해 주로 변화되었다(1Hn 및 2Hn). 지역 II 및 지역 IV에서, 아미노티올(SNn)의 결합 능력은 주로 다른 아민로 조절되었지만, 지역 I 및 지역 III에서, 안정화는 알킬티올(SCn) 길이 및 카르복실- 및 하이드록실- 알킬티올(SOn)에 의해 변화되었다. 화합물의 전체 라이브러리는 덴드리머의 효능에 대해 시험되었다(도6).
실시예4: siRNA 세포내 전달을 위한 실험관내 G1DD 스크리닝
전달 담체는 소형 RNA가 종양 세포 내에서 활성화될 수 있도록 하기 위해 일련의 세포외 및 세포내 장벽을 극복해야 한다. 루시페라이제를 안정하게 발현하는 HeLa 세포에 siRNA를 실험관내 전달하는 능력에 대해 1,512개 멤버 G1DD 라이브러리를 스크리닝함으로써, siRNA가 세포내 장벽을 극복할 수 있도록 매개할 수 있는 G1DD가 확인되었다. G1DD는 루시페라아제-표적 siRNA(siLuc) 및 헬퍼 지질 콜레스테롤, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC) 및 지질 PEG2000을 함유하는 나노입자(NP)로 제형화되었다(Akinc et al., 2008; Semple et al., 2010). 세포내 전달 가능성은 루시페라아제 감소 및 세포 생존력을 정량화하여 평가되었다(도7 내지 도9).
실험관내 데이터로부터 SAR을 추출하기 위해, 덴드리머-인스파이어드 트리 분석 과정(도7B 및 도9B)을 사용했다. 1,512개의 덴드리머 중에서, 88개가 50% 이상의 루시페라아제 침묵을 매개했고, 전체 라이브러리의 히트율은 6%였다. 모든 4개 지역(I-IV)의 히트율을 분석했을 때, 지역 I의 히트율은 10%인 반면, 지역 II, 지역 III, 및 지역 IV는 각각 0%, 2%, 및 3%였다. 이 결과는 siRNA-결합 코어 및 안정화 주변부(지역 I)를 갖는 덴드리머가 매우 높은 세포내 siRNA 전달 가능성을 가진다는 것을 나타낸다. 지역 I의 분지 유형내에서, SO 주변부를 갖는 덴드리머의 히트율은 1%만큼 낮은 반면, SC 주변부를 갖는 덴드리머는 15%만큼 높았다. 어떤 이론에 구속되지 않고, 덴드리머 주변부로부터의 소수성 안정화는 나노캡슐화를 통해 siRNA를 세포내로 효과적으로 전달하는 데 중요하다. 이는 추가적인 NP 안정성을 제공하기 위해 증가된 소수성 패킹을 초래할 수 있다(Leung et al., 2012). 결합 코어 및 SC 주변부를 갖는 덴드리머의 분지 수 및 분지 길이가 추가적으로 조사된 후, 결합 코어 및 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 SC5-8 분지 또는 SC9-12 분지를 갖는 덴드리머가 siLuc를 HeLa 세포에 전달하는 25%의 확률과 50% 이상의 루시페라아제 녹다운을 가진다. 이는 추가적인 NP 안정성을 제공하는 증가된 소수성 패킹을 초래할 가능성이 있다(Leung et al., 2012). 결합 코어 및 SC 주변부를 갖는 덴드리머의 분지 수 및 분지 길이가 추가로 조사된 후, 결합 코어 및 3개, 4개, 5개 또는 6개의 SC5-8 분지 또는 SC9-12 분지를 갖는 덴드리머는 25% 초과의 siLuc를 HeLa 세포로 전달할 가능성 및 50% 초과의 루시페라아제 녹다운을 가진다. 전체 G1DD 라이브러리의 실험관내 스크리닝 및 덴드리틱 분석 과정을 통해, 증가된 세포내 siRNA 전달을 보이는 덴드리머의 그룹이 확인되었다: 결합 코어/SC 주변부 및 결합 코어 및 3개 내지 6개의 SC5-8 또는 SC9-12 분지를 갖는 그룹.
실시예5: 효과적인 세포내 siRNA 전달을 위한 분해성 덴드리머의 확인 및 G2-G4 덴드리머의 디자인
세포내 장벽을 극복할 수 있는 덴드리머를 확인한 다음, 세포외 장벽을 극복하여 siRNA를 생체내에서 효과적으로 전달할 수 있도록 하는 덴드리머가 확인되었다. 이들 두 과정을 분리하여, 혈액의 안정성, 간(종양) 위치 파악, 세포의 섭취, 활성화된 siRNA 방출을 포함하는 장벽을 극복하는 화학적 작용기를 확인할 수 있었다. 혈액 응고 인자는 작은 혈청 샘플에서 쉽게 정량화될 수 있기 때문에, 덴드리머는 간세포에서 인자 VII를 침묵시키는 능력에 대해 평가되었다(Akinc et al., 2008; Semple et al., 2010). 히트 분해성 덴드리머 중 26개가 화학적 다양성을 극대화하기 위해 선택되었다: 22개는 덴드리틱 분석 과정을 기반으로 최적화된 화학적 구조를 보유했고, 추가적인 4개(2A2-SC14, 2A6-SC14, 2A9-SC14, 및 6A1-SO9)는 높은 세포내 siRNA 전달 능력을 기반으로 선택되었다. 덴드리머는 항-인자 VII siRNA(siFVII)와 함께 제형화되었고, 마이스에 1 mg siFVII/kg의 투여량으로 i.v. 주사되었다. FVII 활성은 주사 3일 후에 정량화되었다. 높은 실험관내 효능에도 불구하고, 2A2-SC14, 2A6-SC14, 2A9-SC14, 6A1-SO9 및 대부분의 3-분지 덴드리머는 최소의 생체내 FVII 녹다운만을 보였다(도3A). 결합 코어 및 4개, 5개, 또는 6개의 SC8 또는 SC12 분지를 함유하는 덴드리머는 더 높은 녹다운을 보였다. 이들 연구를 기반으로, SC8 분지 덴드리머는 일반적으로 SC12 분지 화합물보다 더 효과적이었다.
현재 다루고 있는 실험관내 및 생체내 높은-처리 스크리닝 결과를 통해, 우리는 우리의 접근법을 검증하기 위하여 예측된 활성을 갖는 덴드리머를 합리적으로 디자인하는 데 SAR 정보를 이제 이용할 수 있을지 질문했다. 일련의 분해성 덴드리머는 2개의 전략을 사용해 준비되었다: (I) 5개 또는 6개의 IBC를 갖는 폴리아민의 선택을 통해; 및 (II) 덴드리머 세대 확장을 통한 분지의 증가를 통해(도10). 2개의 천연 아민인 스퍼르미딘(5개 IBC) 및 스퍼르민(6개 IBC)이 전략 I을 수행하기 위해 선택되었다. 전략 II에 관해서는, 1A2(1개 IBC), 2A2 & 2A11(2개 IBC), 3A3 & 3A5(3개 IBC), 및 4A1 & 4A3(4개 IBC)가 세대 확장을 통해 복수의 분지를 갖는 분해성 덴드리머를 수득하기 위해 선택되었다(도10C 및 도11). 24개의 추가적인 분해성 덴드리머는 생체내 SAR을 추가로 조사하기 위해 평가되었다(도10C). 세대 확장 후, 4개 또는 6개의 SC 분지를 갖는 1A2(1개 IBC), 2A2(2개 IBC), 및 3A3 & 3A5(3개 IBC)의 더 높은 세대 덴드리머는 우수한 간세포로의 생체내 siRNA 전달을 가지는 반면, 8개의 분지를 갖는 덴드리머는 덜 활성이었다. 이 과정은 실험관내 스크린에서 불활성이었던 아민 코어를 변환시키고, 그 다음 생체내 활성을 보이는 더 높은 세대 덴드리머를 합리적으로 디자인한다.
실시예6: MYC-유발 간종양을 앓는 마이스에서 분해성 덴드리머의 세포내 독성 평가
간암 치료에 필요한 낮은 독성 및 높은 효능의 필요한 균형을 갖는 분해성 덴드리머를 확인하기 위해, 생체내 독성을 평가하기 위해 분해성 덴드리머가 선택되었다. 이와 동시에, 우리는, 마이스 및 비인간 영장류에서 강력한 것으로 전에 입증된 비가수분해성 시스템의 가장 우수한 예로서 우리가 선택한 C12-200 리피도이드 LNP를 분석했다(Love et al., 2010). 클래스로서 리피도이드는 임상 연구의 최전선에 있는 벤치마크 물질이다(Kanasty et al., 2013; Love et al., 2010; Sahay et al., 2013), 비-면역 대조군 siRNA는 개별 덴드리머 자체의 독성을 가장 잘 평가하기 위해 사용되었다. 덴드리머 NP는 독성을 더 잘 조사하기 위해 필요한 것보다 더 높은, 중량비 25:1(덴드리머:siCTR)로 제형화되었다. C12-200 LNP는 이전에 보고된 것(Love et al., 2010)과 동일한 제형화 파라미터를 사용하여 준비되었다. PBS 버퍼에서 각 NP의 크기 및 제타 포텐셜이 특성평가되었다. 그들은 비슷한 크기인 64-80 nm 직경을 보유하고, 그들의 표면은 중성 전하에 가깝다(도12A 및 도12B). 각 제형화된 NP는 야생형 마이스에 4 mg siCTR/kg 투여량(100 mg 덴드리머/kg 또는 28 mg C12-200/kg)으로 i.v. 주사되었다. 생체내 독성을 평가하기 위한 많은 다른 방법 중에서, 체중 감소는 간단하고 유익한 파라미터로서 활용되었다. 정상 마이스에서, C12-200 대조군 LNP를 포함한 선택된 NP에 대해 최소의 체중 변화가 존재했다. 그러나, 후보군 중에서, 5A2-SC8 및 6A3-SC12를 주사 받은 마이스는 더 빠른 회복 및 첫째날 후에 정상적으로 증가된 체중을 경험했다.
이들 결과를 기반으로, 5A2-SC8 및 6A3-SC12는 1회 및 복수의 주사를 받은 공격적인 간종양을 앓는 만성적인 형질 전환 마이스의 생체내 독성의 추가적인 평가를 위해 선택되었다. 잘 확립된 Tet-On MYC-유발된 형질 전환 간암 모델이 선택되었다(도13A)(Nguyen et al., 2014). MYC가 더 이른 발달 시점에 과다 발현되면 종양이 더 공격적이기 때문에, MYC는 출생 직후(p0) 유도되어 빠르게 성장하는 간종양을 초래했다. 32일째 나이(p32)에, 공격적인 간종양을 앓는 아픈 형질 전환 마이스는 5A2-SC8 또는 6A3-SC12 NP가 3 mg siCTR/kg 투여량(75 mg 덴드리머/kg 또는 21 mg C12-200/kg)으로 주사되었다. 5A2-SC8 주사를 받은 마이스는 첫째날에 약 5% 체중을 잃었고, 둘째날에 빠르게 출발 중량으로 돌아온 반면, 6A3-SC12 주사를 받은 마이스는 셋째날에 여전히 10% 체중을 잃고 회복될 수 없었다(도12D). 다중 주사 후에, 이들 마이스는 6A3-SC12 담체의 독성 때문에 치료를 받지 않은 마이스에 비해 7일 이르게 사망했다(도12E). WT 마이스에서의 결과와 비교하여, 공격적인 종상을 앓는 마이스에의 C12-200 LNP의 주사는, 5A2-SC8 주사된 마이스보다 약 3배 적은 지질을 받았음에도 불구하고, 1일 후 20% 초과의 체중을 잃었다(도12D). 이들 데이터는 화학적 구조의 작은 변화도가 독성의 큰 변화를 생성할 수 있다는 것을 보여줬다. 이는 또한 종양을 앓는 마이스는 건강한 마이스보다 간섭에 더 민감하다는 것도 보여줬다. 이들 결과를 기반으로, 5A2-SC8는 낮은 독성(종양을 앓는 마이스에서 75 mg/kg까지의 내성) 및 효과적인 생체내 FVII 녹다운(1 mg siFVII/kg에서 95% 초과)의 균형을 보유하는 분해성 덴드리머로 나타났다. 벤치마크 화합물보다 독성이 낮을 뿐만 아니라, 이들 덴드리머가 복용량 독성에 대한 임상적 우려를 감소시키고 넓은 치료적 윈도우를 가능하게 하므로, 5A2-SC8 NP는 더 효과적이다.
실시예7: Let-7g miRNA 모방체의 체계적인 투여를 통한 간종양 성장의 강력한 억제
분해성 덴드리머 NP의 치료적 miRNA 모방체를 추가적인 독성을 야기함 없이 전달하는 능력을 평가하기 위해, p0에 유도된 공격적인 MYC 형질 전환 간암 모델이 다시 사용되었다(Nguyen et al., 2014). 이들 마이스는 HCC와 분자적 특징을 많이 공유하는 종양 종류인 소아 간아세포종(hepatoblastoma, HB)를 닮은 빠르게 성장하는 암을 발달시켰다. 종괴 효과(mass effect)에 의한 복부 팽창이 20일 후 극도로 보였고, 종양은 빠르게 성장했다. 간섭 없이, 마이스는 생후 60일 이내에 사망했다. 이 모델의 속도 및 치사율을 고려할 때, 성공적인 치료의 제한된 기회가 존재한다.
5A2-SC8은 낮은 생체내 독성 및 간세포 표적 FVII를 침묵시키는 효과의 균형을 이루기 때문에, 처음에, 5A2-SC8 NP가 siRNA를 종양 세포에 전달할 수 있는지 조사되었다. 41일째 나이(p41)에, 이들 형질 전환 마이스의 간은 종양으로 가득찼다(도14A). p40에, 마이스는 Cy5.5-표지된 siRNA를 갖는 5A2-SC8 NP를 1 mg siRNA/kg의 투여량으로 정맥내 주사되었다. 주사 후 24시간에, 형광 이미징은 암성(cancerous) 간 내에 5A2-SC8 매개된 siRNA 축적을 보였고, 비장 및 신장 내에 적은 축적만을 보였다(도14A 및 도14B). 5A2-SC8 NP는 암성 간이 정상인 것보다 더 크더라도 siRNA를 정상 및 형질 전환 간에 전달했다(도15A).
5A2-SC8 NP가 siRNA를 생체내에서 종양 세포에 전달할 수 있는지를 추가로 확인하기 위해, 간의 종양 조직은 정맥 주사 24시간 후에 수집되고 이미징되었다. H&E 염색은 종양 조직이 세포 핵으로 밀집하여 가득차고 암 표현형을 보인다는 것을 보였다(도15B). 공초점 이미징은 5A2-SC8 NP가 표지된 siRNA를 종양 세포로 효과적으로 전달할 수 있었다는 것을 확인했다(도14C).
만성적인 형질 전환 마이스에서 5A2-SC8-매개된 소형 RNA 전달의 치료적 효과는 그 다음 평가되었다. 가장 중요한 miRNA 중 하나는, 많은 종양 유형에서 하향 조절되는 종양 억제자 패밀리인 Let-7이다(Boyerinas et al., 2010; Roush and Slack, 2008). 내인성 Let-7g는 간 HB에서 하향 조절된다고 알려져 있기 때문에(Nguyen et al., 2014), 이 공격적인 유전자 조작된 마우스 모델에서 Let-7g 모방체의 전달이 간암의 발달을 억제할 수 있을지 결정하기 위해 테스트가 수행되었다.
5A2-SC8 NP는 이 모델에서 siRNA 전달을 가능하게 할 수 있다고 증명되었다. siRVII i.v. 1회 투여량의 전달은 FVII 단백질의 강력한 침묵을 수확된 간 조직에서 혈액 에세이를 이용해(도16A) 및 qPCR에 의해(도16B) 보였다. 이 침묵은 종양 발달이 개시된 후인 p26에 달성되었다. 다음, 1 mg/kg Let-7g는 5A2-SC8 NP 내에서 종양을 앓는 마이스에 i.v. 전달되었다(p26). Let-7g 발현은 주사 후 48시간에 간 조직에서 7배로 높아졌다(도16C).
그 다음, Let-7g 모방체 또는 대조군 모방체를 함유하는 5A2-SC8 NP를 1mg/ kg로 매주 투여하는 것에 의한 치료 요법은 p26부터 시작되었다. p50에, Let-7g 모방체를 받은 마이스는 극도로 더 작은 복부 및 감소된 종양 부하를 가졌다(도16D 및 도16F). Let-7g는 복부 둘레의 감소를 야기했다(도16E). 종양 성장의 효과는 생체외 간 이미징에 의해 확인되었다(도16F). 가장 중요하게는, Let-7g의 26일째 나이부터 61일째 나이까지의 매주 전달은 중량 증가에 영향을 미치지 않았고(도16G), 생존을 상당히 연장시켰다(도16H). 치료를 받지 않은 대조군 마이스 및 CTR-모방체를 갖는 5A2-SC8 NP를 받은 마이스 모두는 약 60일째 나이에 사망했다. C12-200 LNP(Let-7g 또는 대조군 모방체)는 조기 사망을 유도했고 실험의 중단을 필요로 했다. 6A2-SC8 NP 내의 Let-7g의 전달은 극적인 생존 이점을 제공했고, 한 마리의 마이스는 100일까지 생존했다. 이들 결과는 5A2-SC8은, 간 종양 성장을 효과적으로 억제함에 의해 만성적인 형질 전환 마이스에 상당한 치료적 이점을 제공하기 위하여, 높은 전달 효능 및 낮은 독성의 균형을 이룰 수 있다는 것을 보여줬다.
실시예8: siRNA 전달을 위한 다른 지질 조성물의 평가
덴드리머 나노입자 내의 어떤 지질 조성물이 향성된 siRNA 전달을 유도하는지 평가하기 위해, 다른 인지질 및 PEG 지질의 정체성 및 농도가 다양화되었다. 3개의 다른 세포 라인(HeLa-Luc, A549-Luc, 및 MDA-MB231-Luc)이 사용되었다. 세포는 웰당 10K 세포 및 24시간 배양으로 존재했다. 형질전환 24시간 후에 판독값이 결정되었다. 나노입자에서, DSPC 및 DOPE는 인지질로서 사용되었고, PEG-DSPE, PEG-DMG, 및 PEG-DHD는 PEG 지질로서 사용되었다. 조성물은 지질 또는 50:38:10:2의 몰비의 덴드리머:콜레스테롤:인지질:PEG 지질을 함유한다. 지질/덴드리머 대 siRNA의 몰비는 100 ng 투여량이 사용되었을 때 100:1이었다. RiboGreen, Cell-titer Fluor, 및 OneGlo 에세이가 이들 조성물의 효과를 결정하기 위해 사용되었다. 결과는 HeLa-Luc 세포(도17A), A549-Luc(도17B), 및 MDA-MB231-Luc(도17C)에서 상대적인 루시페라아제 활성을 보여준다. 연구에 사용된 6개의 제형은 하기를 포함한다: 덴드리머(지질) + 콜레스테롤 + DSPC + PEG-DSPE (제형 1), 덴드리머(지질) + 콜레스테롤 + DOPE + PEG-DSPE (제형 2), 덴드리머(지질) + 콜레스테롤 + DSPC + PEG-DMG (제형 3), 덴드리머(지질) + 콜레스테롤 + DOPE + PEG-DMG (제형 4), 덴드리머(지질) + 콜레스테롤 + DSPC + PEG-DSPE (제형 5), and 덴드리머(지질) + 콜레스테롤 + DOPE + PEG-DHD (제형 6).
추가적인 실험은 어떤 인지질이 siRNA 분자의 증가된 전달을 보였는지를 결정하기 위해 작동되었다. HeLa-Luc 세포 라인은 웰당 10K 세포, 24시간 배양, 및 형질전환 24시간 후의 판독값으로 사용되었다. 조성물은 DOPE 또는 DOPC를 인지질로서, PEG-DHD를 PEG 지질로서 함유했다. 지질(또는 덴드리머):콜레스테롤:인지질:PEG 지질의 비율은 50:38:10:2 몰비였고, 덴드리머(또는 지질) 대 siRNA의 몰비는 200:1이었다. 조성물은 Cell-titer Fluor 및 OneGlo 에세리를 사용해 50 ng 투여량에서 테스트되었다. 이들 결과는 도18A 및 도18B에 보여진다.
실시예9: sgRNA 및 다른 CRISPR 핵산의 전달에 대한 덴드리머 나노입자의 평가
CRISPR/Cas 유전자 편집을 위한 핵산을 전달하는 조성물을 평가하기 위해, sgRNA 및 mRNa의 전달이 테스트되었다. 덴드리머 NP 및 Z120의 sgRNA 전달에 대한 신속한 스크리닝을 가능하게 할 수 있는 세포 라인이 창조되었다. 예를 들어, HeLa(자궁 경부암) 및 A549(폐암) 세포는 루시페라아제 및 Cas9을 동시에 발현하도록 확립되었다. 선택 및 품질 조절은 검증되었다. 가이드 RNA는 원하는 표적 유전자의 첫번째 엑손을 표적하는 이전의 보고된 방법을 따라 디자인되었다. 분열 활성 및 서열 특이성을 나타내는 가장 높은 점수를 보유한 표적은 확립된 프로토콜을 사용해 sgRNA 준비를 위해 이월되었다. DNA 올리고뉴클레오티드는 상업적으로 합성되고, 어닐되고, Bsbi 소화에 의해 클론되며, Cas9을 함유하는 플라스미드 주형에 연결되었다. 실험관내 전사는, 이후 전달을 위한 덴드리머 NP내로 포장될 수 있는 sgRNA의 고립을 가능하게 했다. 일련의 5개 다른 가이드는 루시페라아제를 위해 디자인되었다. 이들 가이드는 상업적인 반응물을 사용해 가장 좋은 sgRNA 서열을 선택하기 위해 sgLuc-Cas9 pDNA 형질전환에 의해 검증되었다. 다음, 우리는 sgLuc를 덴드리머 NP내로 포장하고, sgRNA의 전달을 위한 HeLa-Luc-Cas9 세포에서의 전달을 평가했다. 결정된 수의 시간의 노출 후에, 루시페라아제 및 생존력은 처리되지 않은 세포와 비교하여 One Glo + Tox(Promega)를 사용해 측정되었다. 전형적인 실험에서, 10K 세포가 웰당 배양되었고, 이후 24시간 배양, sgLuc를 함유하는 덴드리머 나노입자의 첨가, 및 형질전환 후 24-48시간에의 판독이 이어졌다. 이들 조성물은 덴드리머, DSPC 또는 DOPE, 콜레스테롤, 및 PEG 지질의 조합이 함유했다. 추가로, 조성물은 다양한 농도의 MgCl2을 함유한다. 지질(또는 덴드리머):콜레스테롤:PEG 지질의 몰비는 50:38.5:0.5였고, 지질 대 핵산(sgRNA)의 몰비는 200:1였으며, 투여량은 50 ng이었다. 다시, Cell-titer Fluor 및 OneGlo 에세이가 결과를 얻기 위해 사용되었다. 인지질이 없는 결과는 도19에 보여진다. 비슷한 연구는 인지질이 존재할 때 수행되었다. 이들 조성물에서, 인지질 DSPC는 제형에서 사용되었다. 상기 인지질을 함유하지 않는 조성물과 같은 비율을 이용해, 인지질 함유 조성물은 50:38.5:10:0.5(지질/덴드리머:콜레스테롤:인지질:PEG 지질)의 몰비를 같은 투여량을 이용해 가졌다. 이들 조성물은 RiboGreen, Cell-titer Fluor, 및 OneGlo를 사용해 24시간 및 72시간의 2개의 시간 간격에서 테스트되었다. 24시간에 얻어진 데이터는 도20A에 나타났고, 72시간에 얻어진 데이터는 도20B에 나타났다.
실시예10: mRNA 전달에 대한 덴드리머 나노입자의 평가
siRNA로 수행된 연구와 비슷하게, mRNA 분자의 전달은 여기에 기술된 덴드리머 및 Z120으로 테스트되었다. IGROV1 세포 라인은 웰당 4K 세포의 농도, 24시간 배양, 및 형질전환 24시간 및 48시간 후에의 판독으로 사용되었다. 이들 조성물은 DSPC, DOPE, 또는 인지질이 아닌 것, 및 PEG 지질로서 PEG-DHD를 함유한다. 지질(또는 덴드리머):콜레스테롤:인지질:PEG 지질의 몰비는 40:38.5:0(10):2였고, 덴드리머 대 핵산(mRNA)의 중량비가 5, 10, 20, 30, 또는 40 대 1이었으며, 2개의 다른 투여량은 50 ng 투여량 및 100 ng 투여량이었다. Cell-titer Fluor 및 OneGlo 에세이는 결과를 얻기 위해 사용되었다. 이들 결과는 도21A(24시간) 및 도21B(48시간)에 보여졌다. 추가로, mCherry mRNA의 전달은 20:1 비율 N/P 및 인지질로서 DSPC 및 PEG 지질로서 PEG-DHD를 갖는 나노입자 조성물을 사용하여 도22에 시각화되었다.
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
여기에 개시되고 청구된 모든 조성물 및 방법은 본 개시에 비추어 과도한 실험 없이 제조되고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 특정 양태로 기술되었지만, 해당 기술의 통상의 기술자에게는 발명의 개념, 사상, 및 범위에서 벗어나지 않고 여기에 기술된 조성물 및 방법, 단계 또는 방법의 단계의 순서에 변화가 가해질 수 있다는 것이 명백하다. 보다 구체적으로, 화학적으로 및 생리학적으로 모두 관련된 특정 약제는, 같거나 비슷한 결과를 달성하면서도, 여기에 기술된 약제로 대체될 수 있다는 것이 명백하다. 모든 이러한 비슷한 대체물 및 변형은 해당 기술 분야의 통상의 기술자에게 명백하고, 첨부된 청구범위에 의해 정해진 바와 같이 발명의 정신, 범위, 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
<110> THE BOARD OF REGENTS OF THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM <120> LIPOCATIONIC DENDRIMERS AND USES THEREOF <130> IPA180276-US-D1-1 <150> US 62/218412 <151> 2015-09-14 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 1 ggaucaucuc aagucuuac 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 2 ccuaguagag uucagaaug 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 3 gauuaugucc gguuaugua 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 4 cuaauacagg ccaauacau 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 5 gcgcgauagc gcgaauaua 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic nucleic acid <400> 6 cgcgcuaucg cgcuuauau 19

Claims (96)

  1. 하기 화학식(I)을 갖는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    코어-반복 단위-말단 그룹 (I),
    여기서:
    상기 코어는, 2 내지 6개의 수소 원자를 상기 코어로부터 제거하고 상기 수소 원자들을 상기 반복 단위들로 대체함으로써 2 내지 6개의 반복 단위에 연결되고; 여기서:
    상기 코어는 하기 화학식(II)를 갖고:
    (II),
    여기서, 화학식(II)에서:
    X1은 선택적으로 치환되는 디알킬아미노(C≤12), 선택적으로 치환되는 헤테로사이클로알킬(C≤12), 또는 선택적으로 치환되는 헤테로아릴(C≤12)이고;
    R1은 아미노, 하이드록시, 선택적으로 치환되는 알킬아미노(C≤12), 또는 선택적으로 치환되는 디알킬아미노(C≤12)이며;
    a는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이거나; 또는
    상기 코어는 하기 화학식(III)을 갖고:
    (III),
    여기서, 화학식(III)에서:
    X2는 N(R5)y이고; 여기서
    R5는 수소, 또는 선택적으로 치환되는 알킬(C≤18)이며;
    y는 0, 1, 또는 2이고, 단, y와 z의 합은 3이고;
    R2는 아미노 또는 선택적으로 치환되는 알킬아미노(C≤12)이고;
    b는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이며;
    z는 1, 2, 3이며; 단, z와 y의 합은 3이거나; 또는
    상기 코어는 하기 화학식(IV)를 갖고:
    (IV),
    여기서, 화학식(IV)에서:
    X3는 -NR6-, -O-, 또는 선택적으로 치환되는 알킬아미노디일(C≤8), 선택적으로 치환되는 알콕시디일(C≤8), 선택적으로 치환되는 아렌디일(C≤8), 또는 선택적으로 치환되는 헤테로사이클로알칸디일(C≤8)이고; 여기서 R6은 수소, 알킬(C≤8), 또는 치환된 알킬(C≤8)이고,
    R3 및 R4는 각각 독립적으로 아미노, 선택적으로 치환되는 알킬아미노(C≤12), 또는 선택적으로 치환되는 디알킬아미노(C≤12)이고;
    여기서,
    c 및 d는 각각 독립적으로 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이고;
    상기 반복 단위는 하기 화학식(VII)의 분해성 디아실 그룹을 포함하고:
    (VII),
    여기서, 화학식(VII)에서:
    A1 및 A2는 각각 독립적으로 -O-이고, 여기서:
    Y3는 선택적으로 치환되는 알칸디일(C≤12)이고;
    R9는 선택적으로 치환되는 알킬(C≤8)이며;
    상기 말단 그룹은 하기 화학식(VIII)을 갖고:
    (VIII),
    여기서, 화학식(VIII)에서:
    Y4는 알칸디일(C≤18)이며;
    R10은 수소이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 코어는 하기 화학식(II)을 갖고:
    (II),
    여기서, 화학식(II)에서:
    X1은 헤테로사이클로알킬(C≤12)이고;
    R1은 아미노이고;
    a는 1, 2, 3, 또는 4인,
    화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 코어는 , , , , , , , , , , , , , , 및 로부터 선택되는,
    화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 코어는 , , , , 및 로부터 선택되는,
    화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 코어는 하기 화학식(III)을 갖고:
    (III),
    여기서, 화학식(III)에서:
    X2는 N 또는 NR5이고, 여기서 R5는 수소 또는 메틸이고;
    R2는 아미노 또는 메틸아미노인,
    화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 코어는 , , , , , 및 로부터 선택되는,
    화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 코어는 , , 및 로부터 선택되는,
    화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 코어는 하기 화학식(IV)를 갖고:
    (IV)
    여기서, 화학식(IV)에서:
    X3는 -NR6-, -NHCH2CH2NH-, 또는 또는 -NHCH2CH2NHCH2CH2NH-이고;
    R6는 수소 또는 메틸이고;
    R3는 아미노 또는 선택적으로 치환되는 알킬아미노(C≤12)이고;
    R4은 아미노 또는 선택적으로 치환되는 알킬아미노(C≤12)이고;
    c 및 d는 각각 독립적으로 2 또는 3인,
    화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 코어는 , , , , , , , , , , 및 로부터 선택되는,
    화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    화학식(VIII)을 갖는 말단 그룹이 각각 독립적으로 , , , , , , , , , , , , 및 로 구성된 군으로부터 선택되는,
    화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  11. 제10항에 있어서,
    화학식(VII)을 갖는 분해성 디아실 그룹에서, Y3는 -CH2CH2-이고 R9는 메틸인,
    화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  12. 하기 화학식(I-1)을 갖는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    코어-반복 단위-말단 그룹 (I-1),
    여기서:
    상기 코어는, 4개의 수소 원자를 상기 코어로부터 제거하고 상기 수소 원자들을 상기 반복 단위들로 대체함으로써 4개의 반복 단위에 연결되고; 여기서:
    상기 코어는 하기 구조를 갖고:
    ,
    상기 반복 단위는 하기 화학식(VII)을 갖는 분해성 디아실이고:
    (VII),
    여기서, 화학식(VII)에서:
    A1 및 A2는 각각 -O-이고;
    Y3는 -CH2CH2-이고;
    R9는 -CH3이며;
    상기 말단 그룹은 , , , , , , 및 로 구성된 군으로부터 선택된다.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 말단 그룹은 인,
    화합물.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 말단 그룹은 인,
    화합물.
  15. 하기 화학식(I-2)를 갖는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    코어-반복 단위-말단 그룹 (I-2),
    여기서:
    상기 코어는, 4개 또는 5개의 수소 원자를 상기 코어로부터 제거하고 상기 수소 원자들을 상기 반복 단위들로 대체함으로써 4개 또는 5개의 반복 단위에 연결되고; 여기서:
    상기 코어는 하기 구조를 갖고:
    ,
    상기 반복 단위는 하기 화학식(VII)을 갖는 분해성 디아실이고:
    (VII),
    여기서, 화학식(VII)에서:
    A1 및 A2는 각각 -O-이고;
    Y3는 -CH2CH2-이고;
    R9는 -CH3이며;
    상기 말단 그룹은 , , , , , , 및 로 구성된 군으로부터 선택된다.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 말단 그룹은 인,
    화합물.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 말단 그룹은 인,
    화합물.
  18. 하기 화학식(I-3)을 갖는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    코어-반복 단위-말단 그룹 (I-3),
    여기서:
    상기 코어는, 4개 내지 6개의 수소 원자를 상기 코어로부터 제거하고 상기 수소 원자들을 상기 반복 단위들로 대체함으로써 4개 내지 6개의 반복 단위에 연결되고; 여기서:
    상기 코어는 하기 구조를 갖고:
    ,
    상기 반복 단위는 하기 화학식(VII)을 갖는 분해성 디아실이고:
    (VII),
    여기서, 화학식(VII)에서:
    A1 및 A2는 각각 -O-이고;
    Y3는 -CH2CH2-이고;
    R9는 -CH3이며;
    상기 말단 그룹은 , , , , , , 및 로 구성된 군으로부터 선택된다.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 코어는 6개의 반복 단위에 연결되는,
    화합물.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 말단 그룹은 인,
    화합물.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 말단 그룹은 인,
    화합물.
  22. 하기 화학식(I-4)를 갖는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    코어-반복 단위-말단 그룹 (I-4),
    여기서:
    상기 코어는, 4개 또는 5개의 수소 원자를 상기 코어로부터 제거하고 상기 수소 원자들을 상기 반복 단위들로 대체함으로써 4개 또는 5개의 반복 단위에 연결되고; 여기서:
    상기 코어는 하기 구조를 갖고:
    ,
    상기 반복 단위는 하기 화학식(VII)을 갖는 분해성 디아실이고:
    (VII),
    여기서, 화학식(VII)에서:
    A1 및 A2는 각각 -O-이고;
    Y3는 -CH2CH2-이고;
    R9는 -CH3이며;
    상기 말단 그룹은 , , , , , , 및 로 구성된 군으로부터 선택된다.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 코어는 5개의 반복 단위에 연결되는,
    화합물.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 말단 그룹은 인,
    화합물.
  25. 제23항에 있어서,
    상기 말단 그룹은 인,
    화합물.
  26. 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이들 중 임의의 것의 약학적으로 허용 가능한 염:




    .
  27. (A) 제1항 내지 제9항 및 제12항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 및
    (B) 치료적 약제를 포함하는 조성물.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 치료적 약제가 핵산인,
    조성물.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 핵산이 짧은 간섭 리보핵산(small interfering ribonucleic acid: siRNA), miRNA, pri-miRNA, 전령 RNA(mRNA), 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복(cluster regularly interspaced short palindromic repeat: CRISPR) 관련 핵산, 단일 가이드 RNA(single guide RNA: sgRNA), CRISPR-RNA(crRNA), 트랜스-활성화 crRNA(trans-activating crRNA: tracrRNA), 플라스미드 DNA(pDNA), 전달 RNA(tRNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 가이드 RNA, 이중 가닥 DNA(dsDNA), 단일 가닥 DNA(ssDNA), 단일 가닥 RNA(ssRNA), 이중 가닥 RNA(dsRNA), 또는 이의 임의의 조합을 포함하는,
    조성물.
  30. 제28항에 있어서,
    상기 핵산이 mRNA인,
    조성물.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 조성물이 가이드 RNA를 더 포함하는,
    조성물.
  32. 제28항에 있어서,
    상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 상기 핵산에 대한 중량비는 100:1 내지 1:5인,
    조성물.
  33. 제28항에 있어서,
    상기 조성물은 스테로이드, 스테로이드 유도체, 중합체 컨쥬게이트된 지질, 인지질, 및 이의 임의의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 헬퍼 지질을 추가로 포함하는,
    조성물.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 스테로이드 또는 스테로이드 유도체는 콜레스테롤이고, 상기 인지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC) 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)이고, 상기 중합체 컨쥬게이트된 지질은 PEG 변형된 미리스토일-sn-글리세롤인,
    조성물.
  35. 제33항에 있어서,
    상기 스테로이드 또는 스테로이드 유도체의 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 대한 몰비는 10:1 내지 1:20이고; 및/또는
    상기 중합체 컨쥬게이트된 지질의 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 대한 몰비는 1:1 내지 1:250이고; 및/또는
    상기 인지질의 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 대한 몰비는 10:1 내지 1:20인,
    조성물.
  36. (A) 제27항에 따른 조성물; 및
    (B) 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고,
    근육내로, 정맥내로, 또는 흡입을 통해 투여하기 위하여 제형화된,
    대상체로의 투여를 위한 약학적 조성물.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 조성물이 핵산을 대상체의 세포에 전달하기 위한 것인, 조성물.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 조성물의 대상체로의 투여 후에 상기 핵산에 의해 발현되는 단백질이 상기 대상체의 세포에서 검출되는, 조성물.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 단백질이 형광 이미징을 포함하는 방법에 의해 검출되는, 조성물.
  40. 제38항에 있어서,
    상기 단백질이 발광 에세이를 포함하는 방법에 의해 검출되는, 조성물.
  41. 제38항에 있어서,
    상기 단백질이 공초점 이미징을 포함하는 방법에 의해 검출되는, 조성물.
  42. 제37항에 있어서,
    상기 조성물의 대상체로의 투여 후에 상기 핵산에 의해 발현되는 단백질이 상기 대상체의 세포에 존재하는, 조성물.
  43. 제36항에 있어서,
    상기 조성물은 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 것인, 조성물.
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