MXPA06012722A - Lipidos, complejos de lipido y su uso. - Google Patents

Lipidos, complejos de lipido y su uso.

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MXPA06012722A
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Abstract

La presente invencion se relaciona a un compuesto de acuerdo (ver formula (I)) en donde R1 y R2 son cada uno y seleccionados independientemente del grupo que consiste de alquilo; n es cualquier numero entero entre 1 y 4; R3 es un acilo seleccionado del grupo que consiste de lisilo, ornitilo, 2,4-diaminobutirilo, histidilo y un radical acilo de acuerdo a la formula (II), (ver formula (II)) en donde m es cualquier numero entero de 1 a 3 e Y es un anion farmaceuticamente aceptable.

Description

LIPIDOS, COMPLEJOS DE LIPI DO Y SU USO Descripción de la Invención La presente invención se refiere a lípidos catiónicos, composiciones que contienen los mismos y su uso, así como a un método para transferir compuestos químicos en células. La biolog ía molecular así como la medicina molecular confían fuertemente en la introducción de compuestos biológicamente activos en las células. Tales compuestos biológicamente activos comprenden normalmente, entre otros, ADN, ARN así como péptidos y proteínas, respectivamente. El obstáculo que tiene que superarse es normalmente una bicapa de lípido que tiene una superficie externa negativamente cargada. En la técnica, un número de tecnologías se han desarrollado para penetrar la membrana celular y así introducir los compuestos biológicamente activos. Algunos métodos concebidos para el uso del laboratorio, sin embargo, no se pueden utilizar en el campo médico y no son más particularmente adecuados para la liberación del fármaco. Por ejemplo, los métodos de electroporación y balísticos conocidos en la técnica, podrán, en absoluto, sólo permitir una liberación local de los compuestos biológicamente activos. Aparte de las membranas celulares de la bicapa de lípido, también comprenden sistemas de transporte. Por consiguiente, los esfuerzos fueron emprendidos utilizando esta clase de sistemas de transporte para transferir los compuestos biológicamente activos a través de la membrana celular. Sin embargo, debido a la especificidad o reactividad cruzada de tales sistemas de transporte, su uso no es un método generalmente aplicable. Un proceso generalmente más aplicable descrito en la técnica para transferir compuestos biológicamente activos en células, es el uso de vectores virales. Sin embargo, los vectores virales pueden utilizarse solamente para transferir genes eficientemente en algunos tipos de células; pero no pueden utilizarse para introducir moléculas químicamente sintetizadas en las células. Un proceso alternativo fue el uso de las así llamadas liposomas (Bangham, J . Mol. Biol. 1 3, 238-252). Las liposomas son vesículas que se generan en la asociación de lípidos anfifílicos en agua. Las liposomas normalmente comprenden bicapas concéntricamente colocadas de fosfolípidos. Dependiendo del número de capas de liposomas se pueden categorizar como vesículas unilamelares pequeñas, vesículas multilamelares y vesículas multilamelares grandes. Las liposomas han demostrado ser agentes de liberación eficientes mientras permiten incorporar compuestos hidrofílicos en las capas intermedias acuosas, mientras los compuestos hidrofóbicos se incorporan en las capas de lípidos. Es bien conocido en la técnica que la composición de la formulación de lípido así como su método de preparación tiene un efecto sobre la estructura y tamaño de los agregados de lípidos resultantes y así sobre las liposomas. Las liposomas también se conocen para incorporar los lípidos catiónicos. Los lípidos catiónicos tienen, aparte de ser componentes de liposomas, también atraer la atención considerable así como para uti lizarse para la liberación celular de los biopol ímeros. Usando los lípidos catiónicos cualquier compuesto aniónico se puede encapsular esencialmente de una manera cuantitativa debido a la interacción electrostática. Además, se cree que los lípidos catiónicos interactúan con las membranas celulares negativamente cargadas que inician el transporte de la membrana celular. Se ha encontrado que el uso de una formulación liposómica que contiene los lípidos catiónicos o el uso de lípidos catiónicos como tal junto con un compuesto biológicamente activo requiere un proceso heurístico mientras cada formulación es de uso limitado debido a que puede normalmente puede liberar plásmidos en alguno pero no todos los tipos de células, generalmente en ausencia de suero. Los índices de carga y/o masa de lípidos y los compuestos biológicamente activos a transportarse por ellos han resultado ser un factor crucial en la liberación de diversos tipos de compuestos biológicamente activos. Por ejemplo, se ha mostrado que las formulaciones de lípidos adecuadas para la liberación del plásmido que comprende 5,000 a 1 0,000 bases en tamaño, no son generalmente efectivas para la liberación de oligonucleótidos tales como ribozimas sintéticas o moléculas antisentido que normalmente comprenden de aproximadamente 1 0 aproximadamente 50 bases. Además, se ha indicado recientemente que las condiciones de liberación óptimas para oligonucleótidos y ribozimas antisentido son diferentes, incluso en el mismo tipo de célula. La Patente Norteamericana 6, 395,71 3 describe composiciones basadas en lípido catiónico que normalmente consisten de un grupo lipofílico, un enlazador y un grupo principal y el uso de tales composiciones para transferir compuestos biológicamente activos en una célula. El problema fundamental de la presente invención fue proporcionar un medio para introducir compuestos biológicamente activos en las células, preferiblemente células animales. Un problema adicional fundamental de la presente invención es proporcionar un agente de liberación para ácidos nucleicos, particularmente pequeños ácidos nucleicos tales como siARN, siAN y ARNi o aptámeros y spiegelmeros. Estos problemas son solucionados por la materia objeto de las reivindicaciones independientes anexas aquí. Las modalidades preferidas se pueden tomar de las reivindicaciones dependiente anexas aquí. En un primer aspecto el problema fundamental de la presente invención es solucionado por un compuesto de acuerdo a la fórmula (I), en donde R, y R2 son cada uno y seleccionados independientemente del grupo que consiste de alquilo; n es cualquier número entero entre 1 y 4; R3 es un acilo seleccionado del grupo que consiste de lisilo, ornitilo, 2,4-diaminobutirilo, histidilo y un radical acilo de acuerdo a la fórmula (I I), Y- (II) en donde m es cualquier número entero de 1 a 3 e Y" es un anión farmacéuticamente aceptable. En una modalidad Ri y R2 son cada uno y seleccionados independientemente del grupo que consiste de laurilo, miristilo, palmitilo y oleilo. En una modalidad i es laurilo y R2 es miristilo; o Ri es palmitilo y R2 es oleilo. En una modalidad m es 1 ó 2. En una modalidad el compuesto es un lípido catiónico, preferiblemente en asociación con un anión Y". En una modalidad Y" se selecciona del grupo que consiste de halogenidos, acetato y trifluoroacetato. En una modalidad el compuesto se selecciona del grupo que consiste de; - trihidrocloruro de N-palmitilo-N-oleil-amida del ácido ß-arginil-2,3-diamino propiónico trihidrocloruro de N-lauril-N-miristil-amida del ácido ß-arginil-2,3-diamino propiónico trihidrocloruro de e-arginil-lisina-N-lauril-N-miristil-amida En un segundo aspecto el problema fundamental de la presente invención es solucionado por una composición que comprende como un componente de lípido un compuesto de acuerdo al primer aspecto, y un portador. En una modalidad la composición comprende constituyente. En un tercer aspecto el problema fundamental de la presente invención es solucionado por una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo al primer aspecto y un compuesto farmacéuticamente aceptable y preferiblemente un portador farmacéuticamente activo. En una modalidad del segundo y tercer aspecto el compuesto farmacéuticamente activo y/o el constituyente adicional seleccionado del grupo que consiste de péptidos, proteínas, oligonucleótidos, polinucleótidos y ácidos nucleicos.
En una modalidad del segundo y tercer aspecto la proteína es un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal. En una modalidad del segundo y tercer aspecto el ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste de ADN, ARN, PNA y LNA. En una modalidad del segundo y tercer aspecto el ácido nucleico es un ácido nucleicos funcional, por lo cual preferiblemente el ácido nucleico funcional se seleccione del grupo que consiste de ARNi, siARN, siAN, ácido nucleico antisentido, ribozimas, aptámeros y spiegelmeros.
En una modalidad del segundo y tercer aspecto la composición adicionalmente comprende por lo menos un componente de lípido auxiliar, por lo cual preferiblemente el componente de lípido auxiliar se seleccione del grupo que consiste de fosfolípidos y esteroides. En una modalidad preferida del segundo y tercer aspecto el componente de lípido auxiliar se selecciona del grupo que consiste de 1 ,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina y 1 ,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina. En una modalidad del segundo y tercer aspecto el contenido del componente de lípido auxiliar es de aproximadamente 20% mol a aproximadamente 80% mol del contenido total de l ípido de la composición. En una modalidad preferida del segundo y tercer aspecto el contenido del componente de lípido auxiliar es de aproximadamente 35% mol a aproximadamente 65% mol. En una modalidad del segundo y tercer aspecto el lípido es trihidrocloruro de N-palmitil-N-oleil-amida del ácido ß-arginil-2, 3-díamino propiónico, y el lípido auxiliar es 1 ,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina. En una modalidad preferida del segundo y tercer aspecto el lípido es 50% mol y el lípido auxiliar es 50% mol del contenido total de lípido de la composición. En una modalidad del segundo y tercer aspecto la composición contiene por lo menos dos lípidos auxiliares. En una modalidad preferida del segundo y tercer aspecto por lo menos un lípido auxiliar comprende un radical que se selecciona del grupo que consiste de un radical PEG, un radical HEG, un radical del almidón de polihidroxietilo (polyHES) y un radical de polipropileno, por lo cual tal radical proporciona preferiblemente un peso molecular de aproximadamente 500 a 1 0,000 Da, más preferiblemente de aproximadamente 2,000 a 5,000 Da. En una modalidad preferida del segundo y tercer aspecto el lípido auxiliar que comprende el radical PEG se selecciona del grupo que consiste de 1 ,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1 ,2-dialquil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina; y Ceramide-PEG. En una modalidad más preferida del segundo y tercer aspecto el radical PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 500 Da a 1 0,000 Da, preferiblemente de aproximadamente 2, 000 a 5,000 Da, más preferiblemente un peso molecular de 2,000 Da. En una modalidad aún más preferida del segundo y tercer aspecto, la composición comprende como el componente lípido, trihidrocloruro de N-palmitil-N-oleil-amida del ácido ß-arginil-2, 3-diamino propiónico, como un primer l ípido auxiliar 2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, y como un segundo lípido auxiliar 1 ,2-disteroil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-PEG2000. En todavía una modalidad más preferida del segundo y tercer aspecto, el contenido del segundo lípido auxiliar es de aproximadamente 0.05% mol a 4.9% mol, de manera preferible de aproximadamente 1 a 3% mol. En todavía una modalidad más preferida adicional del segundo y tercer aspecto, el contenido de lípido es desde 45% mol a 50% mol, el contenido del primer lípido auxiliar es desde 45 a 50% mol y, bajo la condición que haya un lípido auxiliar del segundo PEGilado, el contenido del segundo lípido auxiliar es aproximadamente 0.1 % mol a aproximadamente 5% mol, de manera preferible de aproximadamente 1 a 4% mol y de manera más preferible de aproximadamente 2%, por lo cual la suma del contenido de lípido, lípido, primer lípido auxiliar y segundo lípido auxiliar es 1 00% mol y por lo cual la suma del primer lípido auxiliar y segundo lípido auxiliar es 50% mol. En una modalidad preferida del segundo y tercer aspecto la composición contiene cualquiera; a) 50% mol del trihidrocloruro de N-palmitil-N-oleil-amida del ácido ß-arginil-2,3-diamino propiónico, 48% mol de 1 ,2-dífitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina; y 2% mol de 1 ,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina- PEG2000. O b) 50% mol de trihidrocloruro de N-palmítil-N-oleil-amida del ácido ß-argin¡l-2,3-diamino propiónico, 49% mol de 1 ,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina; y 1 % mol de N(carbonil-metoxipolietilenglicol-2000)-1 ,2- diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, preferiblemente la sal de sodio del mismo. En una modalidad preferida del segundo y tercer aspecto el ácido nucleico funcional es un ácido ribonucleico doble hebra, en donde la composición adicionalmente comprende un ácido nucleico, preferiblemente un ácido nucleico funcional que sea más preferiblemente un ácido ribonucleico doble hebra y más preferiblemente un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de ARNi, siARN , siAN, ácido nucleico antisentido y ribozima, por lo cual preferiblemente la proporción molar de ARNi al lípido catiónico es de aproximadamente 0 a 0.075, de manera preferible de aproximadamente 0.02 a 0.05 y aún más preferiblemente 0.037. En una modalidad preferida del segundo y tercer aspecto el compuesto y/o componente de lípido auxiliar está presente como una dispersión en un medio acuoso. En una modalidad preferida del segundo y tercer aspecto el compuesto y/o componente de lípido auxiliar está presente como solución en un solvente miscible en agua, por lo cual preferiblemente el solvente se selecciona del grupo que consiste de etanol y terc-butanol.
En una modalidad preferida del segundo y tercer aspecto el ácido nucleico funcional es un ácido ribonucleico doble hebra, preferiblemente un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de ARNi, siARN , siAN , ácido nucleico antisentido y ribozima, y por lo cual la proporción molar de ARNi al lípido catiónico es de manera preferible de aproximadamente 0 a 0.075, de manera preferible de aproximadamente 0.02 a 0.05 y aún más preferiblemente 0.037. En una modalidad preferida del segundo y tercer aspecto la composición contiene un ácido nucleico, por lo cual la proporción de carga de los fosfatos de estructura del ácido nucleico a átomos de nitrógeno del lípido catiónico es de aproximadamente 1 : 1 .5-7, preferiblemente 1 :4. En una modalidad preferida del segundo y tercer aspecto el tamaño de las partículas en la dispersión es de aproximadamente 120 nm. En una modalidad preferida del segundo y tercer aspecto la dispersión es una dispersión común que contiene de aproximadamente 1 a 100 µM de siARN , por lo cual preferiblemente la dispersión común es diluida in vivo o in vitro por 1 : 100 a 1 : 1 0000, más preferiblemente 1 : 1000. En un cuarto aspecto el problema fundamental de la presente invención es solucionado por el uso de un compuesto de acuerdo al primer aspecto o una composición de acuerdo al segundo o tercer aspecto, para la fabricación de un medicamento, preferiblemente para el tratamiento del cáncer y/o enfermedades relacionadas cardiovasculares.
En una modalidad del cuarto aspecto el medicamento es para el tratamiento del cáncer, por lo cual preferiblemente el cáncer se selecciona del grupo que consiste de tumores sólidos y no-sólidos y por lo cual más preferiblemente el tumor sólido se selecciona del grupo que consiste de cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de colon y carcinoma hepatocelular. En una modalidad del cuarto aspecto el cáncer involucra un proceso seleccionado del grupo que consiste de angiogénesis y neoangiogénesis. En una modalidad del cuarto aspecto el medicamento es para administrar el ácido nucleico a una célula seleccionada del grupo que consiste de células endoteliales, células epiteliales y células tumorales, preferiblemente la célula es una célula endotelial. En una modalidad del cuarto aspecto las células endoteliales son células endoteliales de la vasculatura. En una modalidad del cuarto aspecto la vasculatura es la vasculatura que surge de la neoangiogénesis, preferiblemente la neoangiogénesis asociada al tumor. En una modalidad del cuarto aspecto la vasculatura se selecciona del grupo que consiste de vasculatura del hígado, vasculatura del corazón, vasculatura del riñon, vasculatura pancreática y vasculatura del pulmón. En una modalidad del cuarto aspecto el medicamento es para la administración sistémica. En una modalidad del cuarto aspecto el medicamento es para la administración local. En una modalidad del cuarto aspecto el medicamento es para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares relacionadas, por lo cual las enfermedades cardiovasculares se seleccionan del grupo que consiste de enfermedad cardíaca coronaria, paro cardíaco, hipertensión, trombosis, infarto de miocardio, enfermedades cardíacas isquémicas tales como angina pectoris y arteriosclerosis. En una modalidad del cuarto aspecto el medicamento es para el tratamiento de enfermedades de angiogénesis relacionada. Preferiblemente tal angiogénesis se refiere a los siguientes órganos y enfermedades donde la angiogénesis se describe como el factor que ocasiona tal enfermedad y, por lo tanto, permite el uso de la composición de acuerdo a la presente invención (Carmeliet P. , Nature Medicine 9, 653 - 660 (2003): vasos sanguíneos, malformaciones vasculares, síndrome de DiGeorge, HHT, hemangioma cavernoso, ateroesclerosis, arteriopatía del trasplante, hipertensión, diabetes, restenosis tejido adiposo obesidad piel psoriasis, verrugas, dermatitis alérgico, cicatrices queloides, granulomas piógenos, enfermedad que ampolla, sarcoma de Kaposi en pacientes con SIDA, pérdida de pelo, púrpura de la piel, telangiectasia, formación del laqueo venoso ojo síndrome vitreo hiperplástico persistente, retinopatía diabética, retinopatía de la prematuridad, neovascularización coroidal pulmón hipertensión pulmonar primaria, asma, pólipos nasales, sufrimiento respiratorio neonatal, fibrosis pulmonar, enfisema intestinos intestino inflamatorio y enfermedad periodontal, ascitis, adhesiones perifonéales sistema reproductor endometriosis, sangrado uterino, quistes ováricos, hiperestimulación ovárica, pre-eclampsia hueso, articulaciones artritis, sinovitis, osteomielitis, formación del osteofito, osteoporosis, curación de fractura en hueso deteriorado sistema nervioso enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, neuropatía diabética, ataque gastrointestinales ulceraciones gástricas u orales, enfermedad de Crohn riñon nefropatía En un quinto aspecto el problema fundamental de la presente invención es solucionado por el uso de un compuesto de acuerdo al primer aspecto y/o la composición de acuerdo al segundo y/o tercer aspecto para la fabricación de un agente de diagnóstico. En un sexto aspecto el problema fundamental de la presente invención es solucionado por el uso de un compuesto de acuerdo al primer aspecto o una composición de acuerdo al segundo y/o tercer aspecto, como un agente de transferencia. En una modalidad del sexto aspecto el agente de transferencia transfiere un componente farmacéuticamente activo y/o un constituyente adicional en una célula, preferiblemente una célula de mam ífero y más preferiblemente una célula de humano. En una modalidad del sexto aspecto la célula es una célula endotelial, preferiblemente una célula endotelial asociada vascular. En un séptimo aspecto el problema fundamental de la presente invención es solucionado por un método para transferir un compuesto farmacéuticamente activo y/o un constituyente adicional en una célula o a través de una membrana, preferiblemente una membrana celular, que comprende las siguientes etapas: - proporcionar las células o la membrana; proporcionar un compuesto de acuerdo a cualquiera del primer aspecto; proporcionar el compuesto farmacéuticamente activo y/o el constituyente adicional; y - poner en contacto la célula o membrana con el compuesto farmacéuticamente activo y/o el constituyente adicional, y el compuesto de acuerdo al primer aspecto. En un octavo aspecto el problema fundamental de la presente invención es solucionado por un método para transferir compuesto farmacéuticamente activo y/o un constituyente adicional en una célula o a través de una membrana, preferiblemente una membrana celular, que proporciona las siguientes etapas: proporcionar la célula o membrana; proporcionar una composición de acuerdo al segundo o tercer aspecto; y poner en contacto la célula o membrana con la composición de acuerdo al segundo o tercer aspecto. En una modalidad del séptimo u octavo aspecto el compuesto farmacéuticamente activo comprende como etapa adicional: - detectar el compuesto farmacéuticamente activo y/o constituyente adicional en la célula y/o más allá de la membrana. En un noveno aspecto el problema fundamental de la presente invención es solucionado por un método para la síntesis de N-palmitilo-oleilamina que comprende las siguientes etapas: - proporcionar el ácido oléico; proporcionar la palmitilamina; hacer reaccionar el ácido oleico y palmitilamina para formar la N-palmitil-oleoilamida; y reducir la N-palmitil-oleoilamida a N-palmitil-oleilamina, por lo cual el ácido oleíco es por lo menos 90% , más preferiblemente 95% y más preferiblemente 99% puro, por lo cual el porcentaje es la proporción molar del ácido oleico y cualquier ácido graso diferente del ácido oleico. En una modalidad del noveno aspecto el ácido oleico y la palmitilamina se hacen reaccionar a temperatura ambiente. En una modalidad del noveno aspecto el ácido oleico es sometido a un pre-tratamiento antes de hacerlo reaccionar con la palmitilamina, por lo cual el pre-tratamiento comprende hacer reaccionar el ácido oleico con etilcloroformiato, preferiblemente en diclorometano anhidro o tetrahidrofurano anhidro.
En una modalidad del noveno aspecto la reacción se realiza a 0°C, preferiblemente bajo gas inerte. En una modalidad del noveno aspecto la reacción se hace reaccionar adicionalmente con un barredor del ácido, por lo cual el barredor del ácido se selecciona preferiblemente del grupo que consiste de trietilamina, diisopropiletilamina y piridina. En una modalidad del noveno aspecto la proporción molar del etiléster del ácido clorofórmico, ácido oleico, trietilamina y palmitilamina es de aproximadamente 1 -1 .05: 1 : 1 : 1 -3: 1 -1 .1 0. En una modalidad del noveno aspecto la reducción de la N-palmitil-oleoilamida a N-palmitil-oleilamina se lleva a cabo utilizando LiAIH4. En una modalidad del noveno aspecto con respecto al hacer reaccionar el ácido oleico con la palmitilamina, la reacción se lava, precipita y el precipitado así obtenido es opcionalmente recristalizado. En un décimo aspecto el problema fundamental de la presente invención es solucionado por el uso de un compuesto de acuerdo al primer aspecto o una composición de acuerdo al segundo o tercer aspecto para la administración sistémica, preferiblemente administración sistémica a un vertebrado. En una modalidad del décimo aspecto el vertebrado es un mam ífero, preferiblemente un mam ífero seleccionado del grupo que consiste el ratón , rata, cobayo, gato, perro, mono y hombre. Los compuestos de acuerdo a la presente invención pueden, como se representa en la figura 1 , considerarse para comprender un grupo lipofílico formado por el radical R1 -N-R2, un grupo enlazador formado por el radical C(O)-CH(NH3+)(CH2)n-NH y un grupo principal formado por el radical R3. El presente inventor ha encontrado asombrosamente que esta clase de compuesto que exhibe una carga positiva en el grupo enlazador es particularmente adecuado para transferir compuestos biológicamente activos sobre una membrana celular y preferiblemente en células, más preferiblemente células animales. También, el presente inventor ha encontrado asombrosamente que la transferencia mediada por los compuestos de acuerdo a la presente invención será particularmente efectiva si el compuesto biológicamente activo es un ácido nucleico, preferiblemente siARN y siAN . Como se utiliza preferiblemente en la presente, el término alquilo se refiere a un radical partir alifático saturado que contienen de 8 a 20 átomos de carbono, preferiblemente 12 a 1 8 átomos de carbono, o un radical de hidrocarburo alifático mono o poliinsaturado que contiene de 8 a 30 átomos de carbono, que contiene por lo menos un enlace doble y triple, respectivamente. Así, en una modalidad preferida, el término alquilo también comprende alquenilo y alquinilo. Alquilo se refiere a ramificado y no ramificado, es decir grupos alquilo de cadena no lineal o lineal. Los grupos alquilo de cadena lineal preferidos contienen de 8 a 30 átomos de carbono. Más grupos alquilo de cadena lineal preferidos contienen de 12 a 1 8 átomos de carbono. Los grupos alquilo ramificados preferidos contienen de 8 a 30 átomos de carbono, por lo cual el número de 8 a 30 átomos de carbono se refiere al número de átomos de carbono que forma la estructura de tal grupo alquilo ramificado. La estructura del grupo alquilo ramificado contiene por lo menos un grupo alquilo como ramificando de la estructura, con el grupo alquilo que es definido como en la presente, más preferiblemente con el grupo alquilo que comprende grupos alquilo de cadena corta, más preferiblemente que comprenden de 1 a 6, incluso más preferido 1 a 3 y más preferido 1 átomo de carbono.
Más preferidos son los grupos alquilo ramificados que contienen 12 a 18 átomos de carbono en la estructura con los grupos alquilo de ramificación que se definen anteriormente. Un grupo alquilo particularmente preferido es el grupo fitanilo. En una modalidad alternativa, el alquilo es un grupo alquilo ramificado o no ramificado insaturado como se define antes. Más preferiblemente, tal radical de hidrocarburo alifático insaturado contiene 1 , 2, 3 ó 4 enlaces dobles, por lo cual un radical que tiene un enlace doble es particularmente preferido. Más preferido es el oleilo que es C 18: 1 delta9, es decir un radical de hidrocarburo alifático que tiene 1 8 átomos de carbono, por lo cual en la posición 9 un enlace doble configurado cis está presentado más bien como un solo enlace que une el átomo de carbono número 9 al átomo de carbono número 1 0. Como se utiliza en la presente, n es cualquier número entero entre 1 y 4, que significa que n puede ser 1 , 2, 3 y 4. Como se utiliza en la presente, m es cualquier número entero entre 1 y 3, que significa que m puede ser 1 , 2 y 3. Debe entenderse que los compuestos de acuerdo a la presente invención son preferiblemente lípidos catiónicos. Más preferiblemente, cualquiera de los grupos NH o NH2 presentes en los compuestos de acuerdo a la presente están presentes en una forma protonada. Normalmente, cualquier carga positiva del compuesto de acuerdo a la presente es compensada por la presencia de un anión. Tal anión puede ser un anión monovalente o polivalente. Los aniones preferidos son haluros, acetato y trifluoroacetato. Los haluros como se utiliza en la presente son preferiblemente fluoruros, cloruros, yoduros y bromuros. Más preferidos son los cloruros. En asociación del lípido catiónico y el compuesto biológicamente activo a transferirse en una célula, el anión haluro es remplazado por el compuesto biológicamente activo que preferiblemente exhibe una o varia cargas negativas, aunque tiene que reconocerse que la carga total del compuesto biológicamente activo no es necesariamente negativa. Debe reconocerse que cualquier compuesto de acuerdo a la fórmula (I) comprende por lo menos dos átomos de carbono asimétricos. Está dentro de la presente invención que cualquier enantiómero posible de tal compuesto se describe en la presente, es decir en particular los enantiómero R-R; S-S; R-S y S-R. Los compuestos de acuerdo a la presente invención pueden formar una composición o ser parte de una composición, por lo cual tal composición comprende un portador. En tal composición que también se refiere en la presente como la composición de lípido los compuestos de acuerdo a la presente invención también se refiere como los componentes de lípido. Tal portador es preferiblemente un portador líquido. Los portadores líquidos preferidos son portadores acuosos y portadores no acuosos. Los portadores acuosos preferidos son agua, sistemas amortiguadores acuosos, más preferiblemente sistemas amortiguadores que tienen una fuerza del amortiguador fisiológica y concentraciones de sal fisiológicas. Los portadores no acuosos preferidos son solventes, preferiblemente solventes orgánicos tales como etanol, terc-butanol. Sin desear limitarse por cualquier teoría, cualquier solvente orgánico miscible en agua puede, en principio, utilizarse. Debe reconocerse que la composición, más particularmente la composición de lípido puede estar presente como o formar las liposomas. La composición de acuerdo a la presente invención puede comprender uno o más lípidos auxiliares que también se refieren en la presente como componentes de lípido auxiliares. Los constituyentes de lípido auxiliares se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste de fosfolípidos y esteroides. Los fosfolípidos son preferiblemente di- y monoéster del ácido fosfórico. Los miembros preferidos de los fosfolípidos son fosfoglicéridos y sfingolípidos. Los esteroides, como se utiliza en la presente, ocurren naturalmente y los compuestos sintéticos basados en el ciclopenta[a]fenantreno parcialmente hidrogenado. Preferiblemente, los esteroides contienen 21 a 30 átomos de carbono. Un esteroide particularmente preferido es colesterol. Los lípidos auxiliares particularmente preferidos son 1 ,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DPhyPE) y 1 ,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE). Las composiciones particularmente preferidas de acuerdo a la presente invención comprenden cualquiera de trihidrocloruro de N- palmitilo-N-oleil-amida del ácido ß-arginil-2, 3-diaminopropiónico [#6], trihidrocloruro de N-lauril-N-miristil-amida del ácido ß-argínil-2,3-diaminopropiónico [#1 1 ] o trihidrocloruro de e-arginil-lisina-N-lauril-N-miristil-amida [#15] en combinación con DPhyPE, por lo cual el contenido de DPhyPE es preferiblemente 80% mol, 65% mol, 50% mol y 35% mol, por lo cual el término mol % se refiere al porcentaje del contenido de l ípido total de la composición, es decir el contenido de lípido de la composición que incluye el lípido catiónico de acuerdo a la presente invención y cualquier lípido adicional, incluyendo, pero sin limitarse a, cualquier lípido auxiliar. Está dentro de la presente invención que la composición de acuerdo a la presente invención preferiblemente comprende el compuesto de acuerdo a la presente invención y/o uno o varios de los lípidos auxiliares como se describen en la presente, por lo cual el compuesto de acuerdo a la presente invención, es decir el lípido catiónico, y/o el componente de lípido auxiliar está presente como una dispersión en un medio acuoso. Alternativamente, el compuesto de acuerdo a la presente invención, es decir el l ípido catiónico, y/o el componente de lípido auxiliar es/están presentes como una solución en un solvente miscible en agua. Como un medio acuoso, preferiblemente cualquiera del portador acuoso como se describe en la presente se utiliza. Los solventes miscibles en agua preferidos son cualquier solvente que forme una fase homogénea con agua en cualquier proporción. Los solventes preferidos son etanol y terc-butanol. Debe reconocerse que la composición, más particularmente la composición de lípido puede así estar presente como o formar liposomas. Debe reconocerse que la composición de acuerdo a la presente invención en sus varias modalidades también puede utilizarse como una composición farmacéutica. En último caso, la composición farmacéutica comprende un compuesto farmacéuticamente aceptable y opcionalmente un portador farmacéuticamente activo. Tal portador farmacéuticamente aceptable puede, preferiblemente seleccionarse del grupo de portadores como se define en la presente en relación con la composición de acuerdo a la presente invención. Se entenderá por los expertos en la técnica que cualquier composición como se describe en la presente puede, en principio, también se utiliza como una composición farmacéutica proporcionada donde sus ingredientes y cualquier combinación de la misma es farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica comprende un compuesto farmacéuticamente activo. Tal compuesto farmacéuticamente activo puede ser el mismo como el constituyente adicional de la composición de acuerdo a la presente invención que es preferiblemente cualquier compuesto biológicamente activo, más preferiblemente cualquier compuesto biológicamente activo como se describe en la presente. El constituyente adicional, compuesto farmacéuticamente activo y/o compuesto biológicamente activo se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste de péptidos, proteínas, oligonucleótidos, polinucleótidos y ácidos nucleicos. Preferiblemente, cualquier compuesto biológicamente activo es una molécula negativamente cargada. El término molécula negativamente cargada significa incluir moléculas que tienen por lo menos un grupo negativamente cargado que puede ser un par de iones con el grupo positivamente cargado del lípido catiónico de acuerdo a la presente invención, aunque el presente inventor no desea limitarse por ninguna teoría. En principio, la carga positiva en el radical enlazador también podrá tener cierto efecto en la estructura total del lípido como tal o cualquier complejo formado entre el lípido catiónico y la molécula negativamente cargada, es decir el compuesto biológicamente activo. Aparte de esto, la carga positiva adicional introducida en el lípido de acuerdo a la presente invención comparada con los lípidos catiónicos descrita en la Patente Norteamericana 6,395,71 3, debe contribuir a una toxicidad incrementada de este lípido como se enseña por Xu Y, Szoka FC Jr. ; Biochemistry; 07 de mayo de 1996, 35(1 8): 5616-23. En contraste para que el experto en la técnica deba esperar de este documento de la técnica anterior los compuestos de acuerdo a la presente invención sean particularmente adecuados para varios propósitos descritos en la presente y están en particular desprovistos de cualquier toxicidad creciente. Un péptido como se utiliza preferiblemente en la presente es cualquier polímero que consiste de por lo menos dos aminoácidos que son covalentemente ligados entre sí, preferiblemente a través de un enlace de péptido. Más preferiblemente, un péptido consiste de dos a diez aminoácidos. Una modalidad particularmente preferida del péptido es un oligopéptído que incluso además preferiblemente comprende de aproximadamente 1 00 a aproximadamente 100 aminoácidos. Las proteínas como se utiliza preferiblemente en la presente son polímeros que consisten de una pluralidad de aminoácidos que están covalentemente enlazadas entre sí. Preferiblemente tales proteínas comprenden aproximadamente por lo menos 100 aminoácidos o residuos aminoácidos. Una proteína preferida que puede utilizarse en relación con el lípido catiónico y la composición de acuerdo a la presente invención, es cualquier anticuerpo, preferiblemente cualquier anticuerpo monoclonal. Los compuestos biológicamente activos particularmente preferidos, es decir compuestos farmacéuticamente activos y tal constituyente adicional como se utiliza en relación con la composición de acuerdo a la presente invención son ácidos nucleicos. Tales ácidos nucleicos pueden ser ADN, ARN, APN o cualquier mezcla de los mismos. Además preferiblemente, el ácido nucleico es un ácido nucleico funcional. Un ácido nucleico funcional como se utiliza preferiblemente en la presente es un ácido nucleico que no es una codificación del ácido nucleico para un péptido y una proteína, respectivamente. Los ácidos nucleicos funcionales preferidos son síARN , siAN, ARNi, ácidos antisentido-nucleicos, ribozimas, aptámeros y spiegelmeros que son todos conocidos en la técnica. Los siARN son ARN de interferencia pequeños como, por ejemplo, descritos en la solicitud de patentes internacional PCT/EP03/08666. Estas moléculas normalmente consisten de una estructura bicatenaria de ARN que comprende entre 1 5 a 25, preferiblemente 18 a 23 pares de nucleótidos que son pares bases entre sí, es decir son esencialmente complementarias entre sí, normalmente mediadas por pares bases WatsoN-Crick. Una hebra de esta molécula de ARN doble hebra es esencialmente complementario a un ácido nucleico objetivo, preferiblemente un mARN, mientras que la segunda hebra de la molécula de ARN doble hebra es esencialmente idéntica a un estiramiento del ácido nucleico objetivo. La molécula de siARN se puede flanquear en cada lado y cada estiramiento, respectivamente, por un número de oligonucleótidos adicionales que, sin embargo, no es necesariamente el par base entre sí. El ARNi tiene esencialmente el mismo diseño que siARN , sin embargo, las moléculas son significativamente más largas comparadas a siARN . Las moléculas de ARNi normalmente comprenden 50 o más nucleótidos y pares base, respectivamente. Una clase adicional de ácidos nucleicos funcionales que son activos basados en el mismo modo de acción como los siARN y ARNi es siAN . El siAN es, por ejemplo, descrito en la solicitud de patentes internacional PCT/EP03/074654. Más particularmente, el siAN corresponde a siARN , por lo cual la molécula de siAN no comprende ninguno de los ribonucleótidos. Los ácidos nucleicos antisentido, como se utiliza preferiblemente en la presente, son oligonucleótidos que hibridizan basados en base complementaria con un ARN objetivo, preferiblemente mARN , de este modo activando el RNaseH. El RNaseH es activado por el fosfodiéster y fosfodiéster acoplado del ADN. El fosfodiéster acoplado del ADN, sin embargo, es degradado rápidamente por nucleasas celulares con excepción del fosfodiéster acoplado del ADN. Los polinucleótidos antisentido son así efectivos solamente como complejos híbridos de ADN-ARN. Las longitudes preferidas de ácidos nucleicos antisentido van desde 16 a 23 nucleótidos. Los ejemplos para esta clase de oligonucleótidos antisentido se describen, entre otros, en la Patente Norteamericana 5,849,902 y Patente Norteamericana 5,989,912. Un grupo adicional de ácidos nucleicos funcionales es los ribozimas que son ácidos nucleicos catalíticamente activos que consisten preferiblemente el ARN que comprenden básicamente dos radicales. El primer radical muestra una actividad catal ítica, mientras que el segundo radical es responsable para la interacción específica con el ácido nucleico objetivo. En la interacción entre el ácido nucleico objetivo y el radical del ribozima, normalmente por hibridación y pares base de WatsoN-Crick de estiramientos esencialmente complementarios de bases en las dos hebras de hibridación, el radical catalíticamente activo puede llegar a ser activo que significa que divide, intramolecularmente o intermolecularmente, el ácido nucleico objetivo en caso de que la actividad catalítica del ribozima es una actividad fosfodiesterasa. Las ribozimas, el uso y diseño principales se conocen por el experto en la técnica y, por ejemplo, se describen en Doherty y Doudan (Annu. Ref. Biophys. Biomolstruct. 2000; 30: 457-75). Todavía un grupo adicional de ácidos nucleicos funcionales es los aptámeros. Los aptámeros son ácidos D-nucleicos que son de una sola hebra o doble hebra y que específicamente interactúan con una molécula objetivo. La fabricación o selección de aptámeros es, por ejemplo, descrita en la patente Europea EP 0 533 838. En contraste con ARNi, siARN, siAN, los nucleótidos antisentido y ribozimas, aptámeros no degradan ningún mARN objetivo pero interactuando específicamente con la estructura secundaria y terciaria de un compuesto objetivo tal como una proteína. En la interacción con el objetivo, el objetivo muestra normalmente un cambio en su actividad biológica. La longitud de los aptámeros normalmente va de poca como 15 a mucha como 80 nucleótidos, y preferiblemente va de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 nucleótidos. Otro grupo de ácidos nucleicos funcionales es los spiegelómeros como, por ejemplo, descrito en la solicitud de patentes internacional WO 98/08856. Los spiegelómeros son moléculas similares a los aptámeros. Sin embargo, los spiegelmeros consisten totalmente o principalmente de L-nucleótidos más bien de D-nucleótidos en contraste a los aptámeros. Por otra parte, particularmente con respecto a las longitudes posibles de los spiegelómeros, las mismas se aplican a spiegelómeros como se configuran en relación con los aptámeros. Como se menciona anteriormente, el presente inventor ha encontrado asombrosamente que el compuesto de acuerdo a la presente invención y las composiciones respectivas que comprenden tal compuesto puede ser particularmente efectivos en la transferencia del ARNi, y más particularmente siARN y siAN en una célula. Debe observarse que aunque no se desea limitarse por cualquier teoría, debido al porcentaje mol particular de los lípidos auxiliares contenido en las composiciones de lípido de acuerdo a la presente invención , donde el lípido auxiliar puede ser un lípido auxiliar libre de PEG o en particular un lípido auxiliar que contiene PEG, sorprendiendo los efectos que pueden llevarse a cabo, más particularmente si el contenido de cualquiera de esta clase de lípido auxiliar se contiene dentro del intervalo de concentración especificada en la presente. En relación con la misma, es particularmente significativo que si la composición de acuerdo con la presente invención contiene un lípido auxiliar que comprende un radical de PEG, cualquier liberación o acción de transfección que utiliza tal lípido auxiliar derivado de PEG que contiene la composición es particularmente efectiva en la liberación del ácido nucleico, particularmente moléculas de ARNi, más particularmente siARN, siAN , nucleótidos antisentido y ribozimas. La razón de esto es que los presentes inventores han encontrado asombrosamente que las liposomas que contienen más de aproximadamente 4% de lípidos auxiliar que contienen PEG no son activas, mientras que las liposomas con menos de 4% (preferiblemente menos de 3%) median la liberación funcional. Básicamente, los presentes inventores han descubierto que la cantidad específica de PEG en las composiciones de lípido de acuerdo a la presente invención es adecuada para proporcionar una transfección y liberación efectivas, respectivamente. En un aspecto adicional los presentes inventores han encontrado asombrosamente que las composiciones de lípido de acuerdo a la presente invención que están preferiblemente presentes como lipoplejos o liposomas, preferiblemente muestran una carga catiónica total y así un exceso de por lo menos una carga positiva. Preferiblemente, las composiciones de lípido exhiben un índice de carga negativa: positiva de aproximadamente 1 : 1 .3 a 1 : 5. Por lo tanto, la presente invención así se refiere en un aspecto adicional a cualquier composición de lípido que comprende por lo menos un lípido catiónico y un ácido nucleico, preferiblemente un ARNi, siARN o siAN o cualquier otro de los ácidos nucleicos funcionales definidos en la presente, que tiene un índice de carga negativa:positiva de aproximadamente 1 : 1 .3 a 1 :5. El lípido catiónico es preferiblemente cualquier lípido catiónico descrito en la presente. La composición de lípido comprende en una modalidad preferida cualquier combinación del lípido auxiliar o lípido auxiliar como se describe en la presente. En una modalidad preferida la composición de acuerdo a la presente invención contiene ácidos nucleicos formando lipoplejos. En una modalidad preferida el término lipoplejos como se utiliza en la presente se refiere a una composición compuesta por el lípido catiónico, lípido neutral auxiliar y ácido nucleico. Los presentes inventores también han encontrado que en particular la proporción molar de siARN y el lípido catiónico puede ser crucial para la aplicación acertada de la composición de lípido de acuerdo a la presente invención, especialmente en vista de que se ha dicho antes con relación a la carga total catiónica del ácido nucleico que contiene las formulaciones de lípido. Sin desear ser limitado por cualquier teoría parece ser que 1 mol del lípido catiónico, particularmente como se describe en la presente, puede proporcionar un máximo de tres cargas positivas por molécula, mientras que el ácido nucleico y más particularmente las moléculas de siARN como describe en la presente, proporcionan un máximo de 40 cargas negativas por molécula. Para alcanzar una carga positiva total del siARN que contiene formulaciones de lípido de acuerdo a la presente invención, la proporción molar puede ir desde 0 a un máximo de 0.075. Un intervalo de proporción molar preferido es de aproximadamente 0.02 a 0.05 y aún más preferido es un intervalo de proporción molar de aproximadamente 0.037. Otro hallazgo sorprendente de los presentes inventores es que la composición de acuerdo a la presente invención exhibe particularmente características útiles si la composición contiene un ácido nucleico, preferiblemente una molécula de siARN o una molécula de siAN, y el índice de carga de los fosfatos de la estructura del ácido nucleico a átomos de nitrógeno del lípido catiónico es de aproximadamente 1 : 1 .5-7, más preferiblemente 1 :4. El término fosfatos de la estructura del ácido nucleico como se utiliza en la presente se refiere a radicales de fosfato del ácido nucleico proporcionados por el nucleótido individual que forma tal ácido nucleico. El término átomo de nitrógeno del lípido catiónico como se utiliza en la presente se refiere a estos átomos de nitrógeno proporcionados por el lípido catiónico que comprende preferiblemente un total de tres cargas positivas. Las tres cargas positivas son proporcionadas por dos grupos amino primarios y el grupo guanidina. Con el fin de determinar la carga proporcionada por los fosfatos de la estructura del ácido nucleico se hacen las siguientes asunciones: Cada fosfato entre dos nucleósidos se proporciona para una carga negativa y el fosfato terminal 3', si está presente, se proporciona para dos cargas negativas. Con el fin de determinar el índice de cargas proporcionadas por los átomos de nitrógeno del lípido catiónico y las cargas proporcionadas por los átomos de fosfato se asume que las cargas están presente como se describe anteriormente aunque tiene que reconocerse que bajo circunstancias particulares observadas bajo la aplicación in vitro e in vivo el índice de carga efectivo pudo ser diferente del especificado anteriormente. El índice de carga definido anteriormente proporciona una transferencia eficiente del ácido nucleico a través de una membrana de bicapa del fosfol ípido tal como una membrana de citoplasma. Una característica adicional de la composición de acuerdo a la presente invención que proporciona sus características de liberación, es su distribución de tamaño. Preferiblemente, la distribución de tamaño de la composición de acuerdo a la presente invención que está presente como dispersión es de aproximadamente 120 nm. El tamaño es preferiblemente determinado por Quasi Elastic Light Scattering , como se describe más detalladamente en parte del ejemplo. Los presentes inventores han encontrado asombrosamente que la composición de acuerdo a la presente invención es particularmente adecuada para liberar ácidos nucleicos, preferiblemente ácidos nucleicos funcionales tales como moléculas de siARN y síAN , en células. Como se señala más detalladamente en el ejemplo, las composiciones de acuerdo a la presente invención son muy activas en liberar los ácidos nucleicos en el espacio intracelular de células endoteliales, células epiteliales y células cancerosas. Parece haber incluso más especificidad creciente tal que la liberación es particularmente activa en células endoteliales de la vasculatura, aunque otras células endoteliales también se pueden infectar usando la composición de acuerdo a la presente invención. Un transfección particularmente efectiva ocurre con las células endoteliales de la vasculatura, más específicamente la vasculatura que es el resultado de la neoangiogénesis cuando se induce mediante tumores. La otra vasculatura que pude tratarse es la vasculatura del riñon, corazón, pulmón, hígado y páncreas. Debe reconocerse que la composición de acuerdo a la presente invención es también benéfica en la medida en que es particularmente moderada o no tóxica. Tal carencia de toxicidad es claramente ventajosa con respecto a las composiciones de la técnica anterior ya que contribuirá significativamente al beneficio medicinal de cualquier tratamiento usando esta clase de composición evitando los efectos colaterales, así incrementando la complacencia del paciente y formas particulares de administración tales como la administración del bolo. El último es, puesto que puede tomarse como parte del ejemplo en la presente, evidente de los estudios animales. Está dentro de la presente invención que la composición y más particularmente la composición farmacéutica puede comprender uno o más de los compuestos biológicamente activos anteriormente mencionados que pueden contenerse en una composición de acuerdo a la presente invención como el compuesto farmacéuticamente activo y como el constituyente adicional, respectivamente. Se reconocerá por un experto en la técnica que cualquiera de estos compuestos pueden, en principio, utilizarse como un compuesto farmacéuticamente activo. Tal compuesto farmacéuticamente activo se dirige normalmente contra una molécula objetivo que está involucrada en el patomecanismo de una enfermedad. Debido al principio del diseño y modo generales de la acción fundamental los varios compuestos biológicamente activos y así los compuestos farmacéuticamente activos como se utiliza en relación con cualquier aspecto de la presente invención, virtualmente cualquier objetivo puede tratarse. Por consiguiente, el compuesto de acuerdo a la presente invención y las composiciones respectivas que contienen el mismo se pueden utilizar para el tratamiento o prevención de cualquier enfermedad o condición de enfermedad que pueda tratarse, prevenir y/o tratar usando esta clase de compuestos biológicamente activos. Debe reconocerse que aparte de estos compuestos biológicamente activos también cualquier otro compuesto biológicamente activo puede partir de una composición de acuerdo a cualquier modalidad de la presente invención . Preferiblemente tal otro compuesto biológicamente activo comprende por lo menos una carga negativa, preferiblemente bajo condiciones donde el otro compuesto biológicamente activo es interactivo o complejo con el compuesto de acuerdo a la presente invención, más preferiblemente el compuesto de acuerdo a la presente invención que está presente como un lípido catiónico. Como se utiliza en la presente, un compuesto biológicamente activo es preferiblemente cualquier compuesto que es biológicamente activo, preferiblemente exhibe cualquiera de los efectos biológico, químico y/o físico en un sistema biológico. Tal sistema biológico es preferiblemente cualquier reacción bioquímica, cualquier célula, preferiblemente cualquier células animal, más preferiblemente cualquier célula vertebrada y más preferiblemente cualquier célula de mamífero, incluyendo, pero sin limitarse a, cualquier célula humana, cualquier tejido, cualquier órgano y cualquier organismo. Cualquier organismo se selecciona preferiblemente del grupo que consiste de ratones, ratas, cobayos, conejos, gatos, perros, monos y seres humanos. Está también dentro de la presente invención que cualquiera de las composiciones de acuerdo a la presente invención, más particularmente cualquier composición farmacéutica de acuerdo a la presente invención puede comprender cualquiera de los compuestos farmacéuticamente activos adicionales. La composición, particularmente la composición farmacéutica de acuerdo a la presente invención se puede utilizar para varias formas de administración , por lo cual la administración local y administración sistémica son particularmente preferidas. Se prefiere aún más una ruta de administración que se selecciona del grupo que consiste de la administración intramascular, percutánea, subcutánea, intravenosa y pulmonar. Como se utiliza preferiblemente en la presente, la administración local significa que la composición respectiva es administrada en relación espacial cercana a la célula, tejido y órgano, respectivamente, al cual la composición y el compuesto biológicamente activo, respectivamente, deben administrarse. Como se utiliza en la presente, la administración sistémica significa una administración que es diferente de una administración local y más preferiblemente es la administración en un fluido corporal tal como sangre y licor, respectivamente, por lo cual el líquido corporal transporta la composición a la célula, tejido y órgano, respectivamente, al cual la composición y el compuesto biológicamente activo, respectivamente, deben liberarse. Como se utiliza en la presente, la célula a través de la membrana celular de la cual un compuesto biológicamente activo debe transferirse por medio del compuesto y composición de acuerdo a la presente invención, respectivamente, es preferiblemente una célula eucariótica, más preferiblemente una célula de vertebrado y aún más preferiblemente una célula de mamífero. Más preferiblemente la célula es una célula humana. Cualquier medicamento que pueda ser fabricado utilizando el compuesto y composición de acuerdo a la presente invención, respectivamente, es para el tratamiento y prevención de un paciente. Preferiblemente tal paciente es un vertebrado, preferiblemente un mamífero y aún más preferiblemente tal mam ífero se selecciona del grupo que consiste de ratones, ratas, perros, gatos, cobayos, conejos, monos y humanos. En un aspecto adicional el compuesto y composición de acuerdo a la presente invención pueden utilizarse como un agente de transferencia, más preferiblemente como un agente transfeccíón. Como se utiliza preferiblemente en la presente un agente de transferencia es cualquier agente que sea adecuado para transferir un compuesto, más preferiblemente un compuesto biológicamente activo tal como un compuesto farmacéuticamente activo a través de una membrana, preferiblemente una membrana celular y más preferiblemente transferir tal compuesto en una célula como se describe anteriormente en la presente. Preferiblemente, las células son células endoteliales, más preferiblemente células endoteliales de vertebrados y más preferiblemente células endoteliales de mam íferos tales como ratones, ratas, cobayos, perros, gatos, monos y seres humanos. En aún un aspecto adicional la presente invención se refiere a un método para transferir, más particularmente para transfectar, una célula con un compuesto biológicamente activo. En una primera etapa, por medio de la cual la secuencia de etapas no está necesariamente limitada, la célula y membrana y célula, respectivamente, se proporcionan. En una segunda etapa, un compuesto de acuerdo a la presente invención se proporciona así como un compuesto biológicamente activo tal como un compuesto farmacéuticamente activo. Esta reacción se puede poner en contacto con la célula y la membrana, respectivamente, y debido a las características biofísicas del compuesto y la composición de acuerdo a la presente invención , el compuesto biológicamente activo será transferido desde un lado de la membrana al otro, o en caso que la membrana forme una célula, desde fuera de la célula hacia adentro de la célula. Está dentro de la presente invención que antes de poner en contacto la célula y la membrana, respectivamente, el compuesto biológicamente activo y el compuesto de acuerdo a la presente invención, es decir el lípido catiónico, se pondrán en contacto, con lo cual preferiblemente un complejo se forma y tal complejo se pone en contacto con la célula y membrana, respectivamente. En un aspecto adicional de la presente invención el método para transferir un compuesto biológicamente activo y un compuesto farmacéuticamente activo, respectivamente, comprende las etapas de proporcionar la célula y membrana, respectivamente, proporcionando una composición de acuerdo a la presente invención y poniendo en contacto la composición y célula y membrana, respectivamente. Está dentro de la presente invención que la composición puede formarse anterior o durante poner en contacto con la célula y membrana, respectivamente. En una modalidad de cualquier método para transferir un compuesto biológicamente activo como se describe en la presente, el método puede comprender otras etapas, preferiblemente la etapa de detectar si se ha transferido el compuesto biológicamente activo. Tal reacción de detección depende fuertemente de la clase de compuestos biológicamente activos transferidos de acuerdo al método y será fácilmente obvia para el experto en la técnica. Se encuentra dentro de la presente invención que tal método es realizado en cualquier célula, tejido, órgano y organismo como se describe en la presente. La presente invención es ilustrada adicionalmente por referencia a las siguientes figuras y ejemplos de los cuales las características, modalidades y ventajas adicionales de la presente invención pueden tomarse. Más particularmente, La figura 1 muestra el diseño básico del lípido catiónico de acuerdo a la presente invención; La figura 2 muestra la síntesis de N-oleil-palmitilamina que es un material de inicio posible para la síntesis de los compuestos de acuerdo a la presente invención, por lo cual tal síntesis es una de acuerdo con la técnica anterior como se describe en el documento US 6,395, 713; La figura 3 representa la síntesis de N-oleil-palmitilamina que es un material de inicio importante de acuerdo a la presente invención; Las figuras 4-9 representan la síntesis de trihidrocloruro de N-palmitil-N-oleil-amida del ácido ß-arginil-2,3-amino propiónico, trihidrocloruro de N-lauril-N-miristil-amida del ácido ß-arginil-2,3-diamino propiónico y trihidrocloruro de e-arginil-lisina-N-lauril-N-miristil-amida; La figura 1 0 representa la síntesis de un grupo principal catiónico alterno que es un componente alternativo para la síntesis de los lípidos catiónicos de acuerdo a la presente invención; La figura 1 1 representa una ruta sintética alternativa para la síntesis del trihidrocloruro de N-palmitil-N-oleil-amida del ácido beta-arginil-2, 3-diaminopropiónico; Las figuras 12A y 12B representan la distribución de tamaño de las formulaciones del lípido de acuerdo a la presente invención y el impacto de extrusión y homogeneización por alta presión, respectivamente; La figura 1 3 representa el resultado de un análisis Western Blot (inmunotransferencia Western) de un ARNi que contiene la formulación del lípido que es expuesta a crioprotectores y almacenada a diferentes temperaturas; La figura 14 representa el resultado de un análisis Western Blot en el impacto de diferentes cargas de siARN en las formulaciones del lípido que difieren en su lípido auxiliar; La figura 1 5 representa el resultado de un análisis Western Blot y el impacto de diferentes concentraciones de lípidos reemplazados por PEG; La figura 16 representa el grupo experimental utilizado para generar un modelo ratón del tumor dependiente de RasV1 2 y su uso en formulaciones de varias pruebas; Las figuras 17A, 17B y 17C representan los diagramas que indican el volumen del tumor en función a los días posteriores de la célula en cuestión usando diferentes formulaciones; La figura 1 8a representa el resultado de un análisis Western Blot del efecto del PKN3 desnudo y lipoplejado del siARN específico; La figura 1 8b son microscopifotografías confocales que muestran la distribución intracelular de siARNs desnudo y formulado; La figura 1 8c son fotografías de microscopio de epifluorescencia (paneles superiores) y microscopio confocal (panel inferior) que representan la distribución de siARNs liposomal formulado y desnudo en el hígado; La figura 18d son fotografías de microscopio de epifluorescencia y confocales de células endoteliales marcadas con siARNs formulado liposomal; La figura 18e son fotografías de microscopio de epifluorescencia de células endoteliales de diferentes tumores; La figura 19a es una ilustración esquemática del modo de acción de PTEN dirigido de siARN en la síntesis del ADN, y muestra el resultado de un análisis Western Blot usando diferentes especie de siARN y fotografías microscópicas de inmunofluorescencia de células HELA tratadas con diferentes especie de siARN; La figura 19b representa las imágenes de células endoteliales tratadas con diferentes moléculas de siARN y un diagrama que representa el resultado de un ensayo de BrdU en células endoteliales del h ígado; La figura 1 9c representa las imágenes de células endoteliales tratadas con diferentes moléculas de siARN y un diagrama que representa el resultado de un ensayo de BrdU en células endoteliales del tumor; La figura 20a representa el resultado de un análisis Western Blot para determinar las moléculas de siARN potentes para la prefabricación de CD31 efectiva; La figura 20b es un diagrama que ilustra el efecto de siARN anti-CD31 en niveles de mARN CD31 en diferentes órganos de ratones; La figura 20c muestra el resultado de un análisis Western Blot para determinar la eficacia de la prefabricación de la proteína CD31 en diferentes órganos de ratones usando las moléculas de siARN anti-CD31 ; La figura 20d muestra el resultado de la prefabricación in vivo de la proteína CD31 por immunocoloración directa de las secciones del tumor en parafina de ratones tratados con las moléculas de siARN anti-CD31 ; La figura 21 a representa el resultado de un análisis Western Blot que estudia la eficacia de las moléculas de siARN anti-CD31 y de siARN anti-PTEN en la prefabricación de CD31 , CD34, PTEN y p-Akt; La figura 21 b es un diagrama que ilustra el efecto de diferentes patrones de la administración del lipoplejo en el peso corporal de animales de prueba como una función de tiempo; La figura 21 c representa los diagramas que ilustran el efecto de diferentes reg ímenes de tratamiento de siARN anti-CD31 en el volumen de dos diferentes xenoinjertos de tumor; y La figura 21 d es un diagrama que ilustra la inhibición del crecimiento de los xenoinjertos PC-3 establecidos bajo un régimen de tratamiento de anti-CD31 . Ejemplo 1 : Síntesis de N-oleil-palmitil-amina de acuerdo a la técnica anterior La N-oleil-palmitil-amina es un material de inicio importante para los compuestos de acuerdo a la presente invención. La N-oleil-palmitilamina puede, en principio, sintetizarse como se describe en el documento US 6, 395,713. El esquema de reacción respectivo se representa en la figura. 2. Sin embargo, el material de inicio es amina de oleílo de grado técnico como se proporciona por, por ejemplo, Fluka. Un análisis de este material de inicio por cromatografía de gas muestra una pureza de = 70%, por lo cual 30% del material consiste de la amina que tiene diferentes longitudes de cadena. La razón de esto podría ser que el material es tal como se obtiene de las fuentes de planta. Combinar la amina de oleilo y 1 -bromohexadecano (palmitilbromida) produciendo la N-oleil-palmitil-amina después de reaccionar ambos materiales de inicio de 100 a 120°C durante 30 minutos. La producción es de aproximadamente 83%. Ejemplo 2: Síntesis de N-palmitil-oleil-amina de acuerdo a la presente invención Una nueva síntesis ha sido percibida por el presente inventor en relación con los compuestos de acuerdo a la presente invención (Figura 3). Este nuevo esquema de reacción está basado en encontrar a partir del presente inventor que la alta cantidad de impurezas afecta la calidad del agente de transferencia preparado basado en este material de inicio. Por consiguiente, la reacción inicia utilizando el ácido oleico que tiene una pureza de = 99% como se muestra por la cromatografía de gas y poner en contacto el ácido oleico con etilcloroformiato, TEA y CH2CI2 y la reacción del anhídrido carboxílico-carbónico así mezclado obtenido con hexadecilamina (palmitilamina) que tiene además una pureza de = 99% como se muestra por la cromatografía de gas. La N-palmitilo-oleoil amida del producto de reacción [#1 ] se hace reacciona posteriormente con LiAIH4 (en THF) dando por resultado 85% de la N-palmitil-oleoil amina [#2] que está presente como sólido cristalino incoloro. Las condiciones de reacción más detalladas se configuran en lo siguiente. Síntesis de N-palmitil-oleoil-amida [#1] 2.62 ml (27.5 mmol) de etiléster del ácido clorofórmíco se disuelven en 30 ml de diclorometano anhidro en un matraz de nitrógeno de 250 ml de acuerdo a Schlenk bajo gas inerte de argón y se enfrían a 0°C. Una solución de 7.93 ml (25 mmol) de ácido oleico y 4. 16 ml (30 mmol) de trietilamina en 40 ml de diclorometano anhidro se agregó gota a gota bajo dirección durante 20 minutos. Después de la dirección en el baño de hielo durante 30 minutos se agregaron rápidamente gota a gota una solución de 6.64 g (27.5 mmol) de palmitilamina en 50 ml de CHEI3 y la mezcla se dirige a temperatura ambiente durante 2 horas. Posteriormente, la solución se lava tres veces con 40 ml de agua cada vez, la fase orgánica se secó sobre Na SO4 y el solvente se eliminó usando un evaporador giratorio. El residuo fue recristalizado a partir de 1 00 ml de acetona. Se obtienen 1 1 .25 g (22.3 mmol) que corresponden a un rendimiento de 89% de un sólido incoloro. Síntesis de N-palmitil-oleil-amina [#2] Se proporcionaron 20 ml de LiAIH4 1 M en éter bajo gas inerte de argón en un matraz de tres cuellos de 250 ml que tiene un embudo de goteo y un condensador de reflujo y posteriormente una solución de 7.59 g ( 1 5 mmol) de palmitiloleoilamída en 80 ml de THF agregados gota a gota durante 20 minutos. La mezcla se sometió a reflujo durante 2.5 horas, después se agregaron otros 5 ml de LiAIH 1 M en éter y se sometieron a reflujo durante otras 2.5 horas. Se descompuso el exceso de hidruro usando NaOH 6 M bajo enfriamiento con un baño de hielo y el precipitado se filtró. El precipitado se extrajo dos veces con 40 ml de MtBE caliente cada uno, las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y el solvente se eliminó usando un evaporador giratorio. El residuo es cristalizado partir de 1 00 ml de MtBE a -20°C. Se obtuvieron 6.23 g (12.7 mmol) correspondientes a un rendimiento de 85% de un sólido cristalino incoloro. Ejemplo 3: Síntesis de Boc-Dap(Fmoc)-N-palmitM-N-oleil-amida [#3] Se disolvieron 521 mg (1 .06 mmol) de N-oleil-palmitilamina en 10 ml de diclorometano anhidro en un matraz de fondo redondo de 50 ml y se agregaron 289 mg ( 1 .17 mmol) de EEDQ. Posteriormente, se agregaron 500 mg ( 1 .17 mmol) de Boc-Dap(Fmoc)-OH bajo dirección y la mezcla se dirige a temperatura ambiente durante 20 horas. La solución se transfiere con 80 ml de diclorometano en un embudo de separación y se lava tres veces con 20 ml de HCl 0.1 N cada vez y una vez con 20 ml de solución de NaHCO3 saturada. Después de secar sobre Na2SO4 se eliminó el solvente usando un evaporador giratorio (Figura 4). Se obtiene un aceite viscoso amarillento el cual no se purificó adicionalmente. En la cromatografía en capa delgada que utiliza hexano/etilacetato de 1 : 1 se observó un Rf de 0.70. Ejemplo 4: Síntesis de Boc-Dap-N-palmitil-N-oleil-amida [#4] Se disolvió 1 g del producto de Boc-Dap(Fmoc)-N-palmitíl-N-oleil-amida en 8 ml de diclorometano anhidro en un matraz de fondo redondo de 50 ml. Se agregaron 3 ml de dietilamina y dirigieron a temperatura ambiente (Figura 4). El control de la cromatografía en capa delgada de la reacción mostró que después de 4.5 horas la reacción del producto inicial fue completada. Los componentes volátiles se eliminaron mediante un evaporador giratorio y el residuo es purificado por cromatografía usando 40 g de gel de sílice 60 (Merck) utilizando hexano/etilacetato 5: 1 . El producto fue eluido usando un gradiente de etapa que consiste de etilacetato, etilacetato/metanol 4: 1 y diclorometano/metanol 4: 1 . Se obtuvieron 576 mg (0.85 mmol) de Boc-Dap-N-palmitil-N-oleil-amida como aceite viscoso de color amarillo. Ejemplo 5: Síntesis de N-palmitil-Noleilo-amida del ácido tetra-Boc-[ß-arginil-2,3-diaminopropiónico [#5] Se disolvieron 576 mg (0.85 mmol) de Boc-Dap-N-palmitil-N-oleil-amida en 10 ml de diclorometano anhidro en un matraz de fondo redondo de 1 00 ml y 210 mg (0.85 mmol) de EEDQ y se agregaron 403 mg (0.85 mmol) de Boc-Arg(Boc)2-OH bajo dirección (Figura 5). La mezcla fue dirigida bajo atmósfera de argón a temperatura ambiente durante 20 horas. Posteriormente, se eliminó el diclorometano mediante un evaporador giratorio y se transfirió el residuo en 100 ml de MtBE en un embudo de separación. La fase orgánica fue lavada completamente con HCl 0. 1 N, NaOH 1 N y se saturó la solución de NaHCO3, se secó sobre NaSO4 y se eliminó el solvente mediante un evaporador giratorio. El producto crudo fue purificado posteriormente por cromatografía instantánea (Combiflash Retrieve; Isco Inc.) utilizando hexano/etilacetato como eluyente. Se obtuvieron 694 mg (0.61 mmol) que corresponden a un rendimiento de 72% de un aceite viscoso incoloro. Ejemplo 6: Síntesis de trihidrocloruro de N-palmitil-N-oleil-amida del ácido 3-arginil-2,3-diaminopropiónico [#6] Se proporcionaron 694 mg (0.61 mmol) de tetra-Boc-[N-palmitil-N-oleil-amida del ácido ß-arginil-2,3-diaminopropiónico] bien secos bajo atmósfera de argón en un matraz con 25 ml de nitrógeno de acuerdo a Schlenk y se agregaron 8 ml de HCl 4N en dioxano (Figura 5). La mezcla fue dirigida bajo gas inerte de argón a temperatura ambiente durante 24 horas, por lo cual se precipitó el producto como amorfo y parcialmente como el sólido similar a cera a partir de la solución después aproximadamente 6 a 8 horas. Después de completar la reacción (control de capa delgada usando CHCI3/MeOH/NH4OH 65:25:4) se eliminó cualquier componente volátil bajo alto vacío. Se obtuvieron 489 mg (0.58 mmol) de trihidrocloruro de N-pamitil-N-oleil-amida del ácido ß-arginil-2, 3-diaminopropióníco. Ejemplo 7: Síntesis de N-laurilo-N-lauril-miristil-amina [#7] Se suspendieron 18.54 g (100 mmol) de dodecilamina (laurilamina), 6.36 g (60 mmol) de Na2CO3 y 50 mg de yoduro de tetrabutilamonio (TBAI) en 100 ml de DMF anhidro en un matraz de 3 cuellos de 500 ml que tiene un condensador de reflujo y un embudo de goteo. Se agregó una solución de 16.4 ml (60 mmol) de 1 -bromo-tetradecano en 1 00 ml de dioxano gota a gota a 100°C durante un período de 1 10 minutos y la mezcla fue dirigida durante otras 3.5 horas a 100°C (Figura 6). La solución se filtró a una temperatura tan caliente como sea posible. El sólido cristalino que se precipitó a 4°C durante la noche, se eliminó y lavó con un poco de metanol frío. Posteriormente, el sólido fue recristalizado a partir de 200 ml de metanol. Se obtuvieron 9 g de cristales similares a hojas que se recristalizaron a partir de 100 ml de MtBE. Los cristales que se precipitaron a -18°C, se recolectaron a partir de una frita enfriada y lavada con MtBE frío. Se obtuvieron 7.94 g (21 mmol) de un sólido cristalino incoloro, que corresponde a un rendimiento del 35% .
Ejemplo 8: Síntesis de la Boc-Dap(Fmoc)-N-lauril-N-miristil-amida [#8] Se disolvieron 715 mg (1 .68 mmol) de Boc-Dap(Fmoc)-OH en 1 5 ml de diclorometano anhidro en un matraz de fondo redondo de 50 ml y se agregaron 420 mg (1 .7 mmol) de EEDQ. La mezcla fue dirigida a temperatura ambiente durante 45 minutos y posteriormente se agregó lentamente gota a gota una solución de 641 mg (1 .68 mmol) de N-laurilo-miristil-amina en 25 ml de diclorometano anhidro durante 60 minutos (Figura 6). Después de un tiempo de reacción de 20 horas el solvente se eliminó mediante un evaporador giratorio y el residuo se transfirió con 1 00 ml de MtBE en un embudo de separación . La solución fue lavada completamente con HCl 0.1 N y solución de NaHCO3 saturada, la fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y el solvente se eliminó mediante un evaporador giratorio. Se obtuvieron 1 .02 g de un producto crudo que fue purificado por cromatografía instantánea (Combiflash Retrieve; Isco Inc.) utilizando hexano/etilacetato como eluyente. Se obtuvieron 607 mg del producto puro como un aceite incoloro, muy viscoso. La cromatografía en capa delgada utilizó hexano/etilacetato 1 : 1 proporcionando un Rf de 0.58. Ejemplo 9: Síntesis de Boc-Dap-N-lauril-N-miristil-amida [#9] Se disolvieron 607 mg de Boc-Dap(Fmoc)-N-lauril-N-miristil-amida en 8 ml de diclorometano anhidro en un matraz de fondo redondo de 50 ml (Figura 6). Se agregaron 3 ml de dietilamina y la reacción dirigido a temperatura ambiente durante 4.5 horas. Los constituyentes volátiles se el im inaron uti l izando un evaporador giratorio y el residuo se purificó por cromatografía usando 40 g de gel de sílice 60 (Merck) con hexano/etilacetato 5: 1 . El producto se eluyó mediante una etapa de gradiente que consiste de etilacetato, diclorometano y diclorometano/metanol 3: 1 . Se obtuvieron 372 mg (0.655 mmol) de Boc-Dap-N-lauril-N-miristil-amida como un aceite amarillento, viscoso. Ejemplo 10: Síntesis de N-lauril-N-miristil-amida del ácido tetra-Boc-[ß-arginil-2,3-diaminopro pión ico [#10] Se disolvieron 372 mg (0.655 mmol) de Boc-Dap-N-lauril-N-miristil-amida en 8 ml de díclorometano anhidro en un matraz de fondo redondo de 50 ml y se agregaron 162 mg (0.655 mmol) de EEDQ y 31 1 mg (0.655 mmol) de Boc-Arg-(Boc)2-OH bajo dirección (Figura 7). La mezcla se dirigió a temperatura ambiente durante 20 horas. Posteriormente, se eliminó el diclorometano usando un evaporador giratorio y el residuo fue transferido con 80 ml de MtBE en un embudo de separación. La fase orgánica se lavó completamente con HCl 0.1 N, NaOH 1 N y solución de NaHCO3 saturada, se secó sobre Na2SO y se eliminó el solvente mediante un evaporador giratorio. El producto crudo fue purificado posteriormente por cromatografía instantánea (Combiflash Retrieve; Isco Inc. ) utilizando una etapa de gradiente de hexano/etilacetato. Se obtuvieron 500 mg (0.5 mmol) de un aceite viscoso incoloro, que corresponde a un rendimiento del 76%. Ejemplo 1 1 : Síntesis de trihidrocloruro de N-lauril-N-miristil-amida del ácido ß-arginil-2,3-diaminopropiónico [#1 1 ] Se proporcionaron 51 1 mg (0.5 mmol) de tetra-Boc[N-lauril-N-miristil-amida del ácido ß-arginil-2, 3-diaminopropiónico] bien seco debajo argón en un matraz de argón de 25 ml de acuerdo con Schlenk y se agregaron 10 ml de HCl 4 N en dioxano (Figura 7) . La mezcla fue dirigida bajo gas inerte de argón a temperatura ambiente durante 24 horas, por lo cual el producto precipitado como fue parcialmente amorfo, parcialmente sólido similar a cera a partir de la solución después de 6 a 8 horas. Durante la terminación de la reacción (control de cromatografía en capa delgada utilizando CHCI3/MeOH/NH4OH 65:25:4) todos los componentes volátiles se eliminaron bajo alto vacío. Se obtuvieron 323 mg (0.5 mmol) de N-lauril-N-miristil-amida del ácido ß-arginil-2, 3-diaminopropiónico en la forma del tri-clorhidrato. Ejemplo 12: Síntesis de Boc-Lys(Fmoc)-N-lauril-N-miristil-amida [#12] Se disolvieron 937 mg (2 mmol) de Boc-Lys(Fmoc)-OH en 10 ml de diclorometano anhidro en un matraz de fondo redondo de 50 ml y se agregaron 495 mg (2 mmol) de EEDQ (Figura 8). La mezcla fue dirigida a temperatura ambiente durante 60 minutos posteriormente se agregaron lentamente gota a gota una solución de 764 mg (2 mmol) de N-lauril-N-lauril-miristil-amina en 30 ml de diclorometano anhidro de una manera gota a gota durante 120 minutos. Después de un tiempo de reacción de 20 horas el solvente se eliminó usando un evaporador giratorio y el residuo se transfirió con 100 ml de MtBE en un embudo de separación. La solución se lavó completamente con HCl 0. 1 N y NaHCO3 saturado, la fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y el solvente se eliminó usando un evaporador giratorio. Se obtuvieron 1 .757 g de un producto crudo que se purificaron usando cromatografía instantánea con hexano/etilacetato 4: 1 como eluyente. Se obtuvieron 1 .377 g del producto puro como un aceite incoloro, muy viscoso. La cromatografía en capa delgada utilizó hexano/etilacetato 1 : 1 dando un Rf de 0.57. Ejemplo 13: Síntesis de Boc-Lys-N-lauril-N-miristil-amida [#13] Se disolvieron 1 .377 g de Boc-Lys(Fmoc)-N-lauril-N-miristil-amida en 16 ml de diclorometano anhidro en un matraz de fondo redondo de 50 ml. De agregaron 6 ml de dietilamina y la mezcla fue dirigida a temperatura ambiente durante 5 horas (Figura 8). Se eliminaron los componentes volátiles usando un evaporador giratorio y el residuo fue purificado por cromatografía usando 40 g de gel de sílice 60 (Merck) con hexano/etilacetato 5: 1 . Se eluyó el producto usando una etapa de gradiente que consiste de etilacetato, diclorometano y diclorometano/metanol 3: 1 . Se obtuvieron 556 mg (0.91 1 mmol) de Boc-Lys-N-lauril-N-miristil-amida como un aceite viscoso amarillento así como 1 1 9 mg de una fracción mezclada. Ejemplo 14: Síntesis de tetra-Boc-[e-arginil-lisina-N-lauril-N-miristil-amida [#14] De disolvieron 556 mg (0.91 1 mmol) de Boc-Lys-N-lauril-N-miristil-amida en 40 ml de diclorometano anhidro y 226 mg (0.91 1 mmol) de EEDQ y se agregaron 433 mg (0.91 1 mmol) de Boc-Arg(Boc)2-OH bajo dirección (Figura 9). La mezcla se dirigió a temperatura ambiente durante 20 horas. Posteriormente, se eliminó el diclorometano usando un evaporador giratorio y el residuo fue transferido con 80 ml de MtBE en un embudo de separación. La fase orgánica fue lavada completamente con HCl 0. 1 N y solución de NaHCO3 saturada, se secó 5 sobre Na2SO y se eliminó el solvente usando un evaporador giratorio. Se purificó el producto crudo posteriormente por cromatografía instantánea (Combiflash Retrieve; Isco I nc.) utilizando una etapa de gradiente de hexano/etilacetato. Se obtuvo un aceite incoloro, viscoso con un rendimiento de 730 mg (0.684 mmol) que corresponde al 75%.
Ejemplo 15: Síntesis de trihidrocloruro de e-arginil-lisina-N-lauryl-N-miristil-amida Se proporcionaron 730 mg (0.684 mmol) de tetra-Boc-[e-arginil-lisiN-N-laurli-N-miristil-amida bien seca bajo argón en un matraz de argón de 25 ml de acuerdo con Schlenk y se agregaron 10 ml de HCl 4 N en dioxano (Figura 9). La mezcla fue dirigida bajo gas inerte del argón a temperatura ambiente durante 24 horas, con lo cual el producto se precipitó a partir de la solución como un amorfo, parcialmente un sólido similar a cera después de aproximadamente 8 horas. Con respecto a la terminación de la reacción tal como para controlarse por cromatografía en capa delgada utilizando CHCI3/MeOH/NH OH 65:25:4, se eliminaron todos los componentes volátiles bajo alto vacío. Se obtuvieron 491 mg (0.633 mmol) de e-arginil-lisin-N-laurli-N-miristil-amida o como trihidrocloruro. Ejemplo 16: Síntesis del ácido butírico de Tri-Boc-y-carbamidin-a,?-diamino [#16] Se proporcionaron 1 .31 g (6 mmol) Boc-Dab-OH en 1 5 ml de acetonitrilo en un matraz de fondo redondo de 1 00 ml y se agregaron 12 mmol de diisopropiletilamina (DI PEA) (Figura 1 0). Posteriormente se agregó agua gota a gota hasta que una parte del Boc-Dab-OH se disolvió y posteriormente se agregaron 1 .96 g (5 mmol) de 1 ,3-di-Boc-2-(trifluorometilsulfonil)guanidina. La mezcla se dirigió a temperatura ambiente durante 12 horas, con lo cual el acetonitrilo se eliminó utilizando un evaporador giratorio. Se diluyó el residuo acuoso con 5 ml de agua y se agregaron 50 ml de diclorometano. Se acidificó la reacción a pH 2 agregando HCl 2 N bajo dirección y separación subsiguiente de la fase orgánica. Se extrajo la fase acuosa con 50 ml de diclorometano y se lavaron las fases orgánicas combinadas con algo de HCl diluido y la solución de NaCI saturada. Se secó la fase orgánica sobre Na2SO4 y se eliminó el solvente utilizando un evaporador giratorio. Se purificó el residuo utilizando cromatografía en gel de sílice 60 usando hexano/etilacetato 2: 1 . Se obtuvieron 1 .1 38 g (2.47 mmol), que corresponden a un rendimiento del 50%, de un sólido amorfo incoloro. Ejemplo 17: Síntesis de trihidrocloruro de N-palmitil-N-oleil-amida del ácido ß-arginil-2,3-diaminopropiónico [#6] Se suspendieron 1 .225 g (6 mmoles) de Boc-Dap-OH en 1 5 ml de CH2CI2 absoluto en un matraz Schlenk de 250 ml que comprende un embudo de separación bajo una atmósfera de argón y se agregaron 1 .72 ml de trimetilamina. Se agregó gota a gota una solución de 1 .52 ml ( 12 mmoles) de TMSCI en 30 ml de CH2CI2 absoluto durante 15 a 20 minutos a temperatura ambiente bajo agitación vigorosa. Mientras tanto se disolvieron 941 mg (5.8 mmoles) de carbonildiimidazol en 8 ml de CH2CI2 absoluto en un matraz Schlenk de 100 ml bajo atmósfera de argón. Se agregó gota a gota una solución de 2.66 g (5.6 mmoles) de Boc-Arg(Boc)2-OH en 25 ml de CH2CI2 absoluto durante 1 5 a 20 minutos a temperatura ambiente y bajo agitación. Ambas soluciones de reacción se agitaron a temperatura ambiente durante 4 h. Posteriormente, se agregaron 832 µl (6 mmoles) de trietilamina a la primera solución y se agregaron gota a gota a la segunda solución durante 15 a 20 minutos a través del embudo de separación a temperatura ambiente bajo atmósfera de argón. Después de 1 5 a 20 minutos se agregaron 30 ml de agua, agitando vigorosamente durante 45 minutos y la solución se ajustó a un pH de 2. Se separó la fase orgánica y se extrajo la fase acuosa varias veces con CH2CI2. Se secaron las fases orgánicas combinadas con una solución saturada de NaCI y sulfato sódico y se eliminó el solvente utilizando un evaporador giratorio. Se purificó el residuo similar a vidrio utilizando cromatografía instantánea en gel de sílice utilizando diclorometano como eluyente. Se obtuvieron 2.74 g (1 .1 5 mmoles; 74%) de un sólido incoloro, amorfo compuesto 17]. Este sólido se hace reacciona con oleil-palmitil-amina [#2] bajo condiciones que sean esencialmente análogas a una del Ejemplo 10, por lo cual la temperatura se determina de 35 a 40°C (rendimiento 72%). El trihidrocloruro de N-palmitil-N-oleil-amida del ácido ß-arginil-2, 3-diaminopropiónico del producto final [#6] se obtuvo dividiendo los grupos de protección Boc como se describe en el Ejemplo 1 1 . El producto así obtenido se puede purificar adicionalmente utilizando cromatografía instantánea en gel de sílice RP-18 utilizando MeOH/agua como eluyente. Ejemplo 18: Fabricación de complejos que consisten de liposomas catiónicas y siARN (Lipoplejos) Los lipoplejos que consisten de liposomas catiónicos y siARN son elaborados utilizando tecnolog ías estándares conocidas en la técnica tal como rehidratación de película/torta de lípido, procedimiento de inyección de etanol, evaporación de fase inversa o procedimiento de diálisis de detergente [ver Liposomes as Tools in Basic Research and Industry; Jean R. Filippot and Francis Schuber; CRC Press enero de 1995 y Liposome Technology: Preparation of Liposomes:001 Gregory Gregoriadis CRC Press I Lie. abril de 1984]. Las liposomas así obtenidas que también se refieren en la presente como lipoplejos en combinación con ácidos nucleicos tales como siARN comprenden como el trihidrocloruro de N-palmitil-N-oleil-amida del ácido ß-arginil-2,3-diaminopropiónico del lípido y adicionalmente 1 ,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina del l ípido o 1 ,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, por lo cual se prefiere el uso de 1 ,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina. La fracción de lípido de tales liposomas y lipoplejos, respectivamente, fue 50% mol de trihidrocloruro de N-palmitil-N-oleil-amida del ácido ß-arginil-2, 3-diaminopropiónico y 50% mol de 1 ,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina o 50% mol de 1 ,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina. La combinación de 50% mol de trihidrocloruro de N-palmitil-N-oleil-amida del ácido ß-arginil-2,3-diamínopropiónico y 50% mol de 1 ,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina también se refiere en la presente como atuFect. Deberá entenderse que en principio cualquier otro lípido y composición de lípido como se describe en la presente puede elaborarse utilizando las técnicas anteriormente mencionadas así como las etapas de tratamiento adicionales. Las liposomas y lipoplejos, respectivamente, se sometan a etapas de tratamiento adicionales así como para ajusfarlos con respecto al tamaño, polidispersibilidad y lamelaridad. Estas características se pueden ajustar por sonicación, extrusión tal como a través de membranas porosas, y homogeneización, preferiblemente homogeneización por alta presión. Los liposomas o lipoplejos así formados son caracterizados por espectroscopia de correlación de fotón con el analizador de partículas de submicrón BeckmaN-Coulter N 5 y los resultados de tales liposomas dimensionados por extrusión o por homogeneización por alta presión se representan en la Figuras 12A y 12B, respectivamente. A partir de la Figura 12A puede tomarse que la distribución de tamaño de las liposomas puede modificarse utilizando diferentes membranas que tienen diferentes exclusiones de tamaño, en el presente caso 1 , 000 nm y 400 nm, respectivamente. En ambos casos, la etapa de la extrusión fue repetida 21 veces. Esto, sin embargo, dentro de la presente invención donde la exclusión de tamaño puede ser de aproximadamente 50 a 5000 nm, y donde las etapas de extrusión se pueden repetir 1 0 a 50 veces. Como puede tomarse de al Figura 12B la homogeneización por alta presión es también el medio adecuado para modificar la distribución de tamaño de las liposomas, por lo cual aplicando tal homogeneización por alta presión el tamaño de las liposomas depende del número de ciclos de homogeneización a los cuales las liposomas se someten. Los intervalos de presión normales son de 100-2500 bar, por lo cual en el presente caso la presión aplicada fue de 1 ,500 bar. Ejemplo 19: Estabilidad de almacenamiento de atuFect Si las composiciones descritas en la presente son normalmente usadas como composiciones farmacéuticas, es esencial que tales formulaciones farmacéuticas sean estables para las condiciones de almacenamiento. Para estudiar la estabilidad de almacenamiento un siARN fue diseñado contra el supresor de tumores PTEN que fue formulado utilizando el atuFect como se describe en el Ejemplo 18. Más particularmente, los liposomas se elaboraron utilizando una solución madre del lípido con las concentraciones madre finales que se citan más adelante, mediante rehidratación de pel ícula del lípido en 300 M de solución de sucrosa, seguida por extrusión y homogeneización por alta presión, respectivamente. Los liposomas así obtenidos fueron mezcladas con las moléculas de siARN descritas más adelante en una relación mol de 1 : 1 ; alternativamente la capa del lípido podría rehidratarse en la presencia de siARN y los lipoplejos así obtenidos se extruyen del homogeneizado. Las moléculas de siARN fueron las siguientes: antisentido PTENAV1 0: 5' uaaguucuagcuguggugg-P 3'; sentido PTENBV10 5' ccaccacagcuagaacuua-P 3'; , por lo cual los nucleótidos en negrilla indican que el nucleótido respectivo es 2'-O-metilo. Los lipoplejos se incubaron en células HeLa en presencia de suero que contiene el medio durante 48 h en diferentes concentraciones (nM de la molécula de siARN se muestra en la figura 1 3). El inmunomanchado con extractos celulares completos utilizando un p1 10a (control de cargamento) y anticuerpos específicos de PTEN se realizaron como se describe anteriormente (Standard-Western-protocol).
Los crioprotectores adecuados incluyen, sin embargo, no se limitan a, sucrosa, trehalosa, maltosa, celobiosa, rafinosa, galactosa, manitol y PEG. En el presente ejemplo, una solución de sucrosa de 300 mM se utilizó como un portador para la formulación de atuFect que contiene el siARN que marca el PTEN . Las concentraciones madre finales fueron lípidos totales 1 ,445 mg/ml y 1 5 µM de PTEN-siARN. La solución fue mantenida a temperatura ambiente, almacenada en 40°C por siete días o almacenada a -80°C por siete días. La solución fue diluida en el medio que contiene suero a la concentración final indicada (20, 1 0, 5 nM). Las pruebas fueron realizadas en células HeLa con una densidad celular de 40,000 pozos. Los resultados se representan en la Figura 13 a partir de la cual puede tomarse que el atuFect congelado que contiene siARN en un crioprotector y que almacena al mismo a -80°C por siete días es, después de descongelarse, tan efectiva como si se mantuviera a 4°C. Ejemplo 20: Composición de lípido y carga de siARN Se prepararon dos diferentes tipos de formulaciones de l ípido. La formulación de lípido 01 consiste de 50% mol de trihidrocloruro N-palmitil-N-oleil-amida del ácido propiónico de ß-arginil-2,3-diamino como l ípido catiónico, y de 50% mol de 1 ,2-difítanoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina, mientras que la formulación de lípido 02 consiste de 50% mol de trihidrocloruro de N-palmitil-N-oleil-amida del ácido propiónico de ß-arginil-2,3-diamino, como el lípido catíónico, y de 50% mol de 1 ,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina. Cada formulación de lípido contiene un siARN dirigido contra PTEN , (la concentración madre fue 1 5 µM de siARN y 1 ,445 mg/ml de lípidos), por lo cual la molaridad del siARN fue titulada en las células que se conducen a una concentración final de 1 µM, 500 nM, 100 nM y 50 nM , respectivamente.
Estos ARNi específicos de PTEN que contienen formulaciones de lípido fueron administrados a una línea celular de ratón (B 16V, ATCCNo. : CRL6475) crecida bajo condiciones de cultivo celular estándares el medio de Eagle modificado de Dulbecco con 4 mM de L-glutamina ajustada para contener 1 .5 g/l de bicarbonato de sodio y 4.5 g/l de glucosa, 90%; suero vacuno fetal, 10%. La densidad celular fue de 40,000 células / 6 pozos y después de 48 horas las células se Usaron y se sometieron a un análisis Western Blot el resultado de el cual se representa en la Figura 14. La señal obtenida con un anticuerpo monoclonal específico para la quinasa PRK2 (Becton Dickinson) se utilizó como un control de carga en comparación a la señal de PTEN (anticuerpo monoclonal, Santa Cruze, CA). A partir de la Figura 14 puede tomarse que la formulación de lípido 01 , es decir una que contiene 1 ,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina fue aún efectiva si el contenido de siARN fuera 50 nM, mientras que la formulación de lípido 02 que contiene 1 ,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina como el lípido auxiliar podrá generar una reducción del PTEN solamente si el contenido de siARN fue de aproximadamente 1 µM o más como se detectó por un anticuerpo específico de PTEN (Santa Cruze, CA). La señal de la quinasa PRK2 sin relación se utilizó como un control de carga y detectada por un anticuerpo dirigido de la misma. Ejemplo 21 : Composición de lípido y contenido de PEG Para probar el impacto de PEG en la eficacia en la transfección y liberación de composiciones de lípido que comprende trihídrocloruro de N-palmitil-N-oleil-amida del ácido ß-arginil-2,3-diaminopropiónico (lípido catiónico) como el constituyente de lípido y 1 ,2-difitanoil-sn-glicero-3- Fosfoetanolamina (DPhyPE) y 1 , 2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanoiamina-polietilenglicol-2000 (DSPE-PEG2000) se generaron las siguientes formulaciones de acuerdo con los métodos descritos en la presente: Formulaciones Ci-Cs: Formulaciones H1-H5 Para cualquiera de las formulaciones mencionadas anteriormente la concentración del lípido fue 1 .445 mg/ml, la concentración de siARN fue 15 µM en 300 mM de sucrosa. La dilusión de los complejos madre concentrados formados produjo una concentración final de 20, 10, 5 nM de siARN en el medio de cultivo celular. Las moléculas de ARNi contenidas en las formulaciones se dirigieron contra PTEN y las secuencias se describen en el ejemplo 22. Las formulaciones de lípido se administraron en células HeLa contenidas en una placa de 6 pozos cada uno contiene 40, 000 células/pozo. Las células se analizaron por expresión de PTEN y de los resultados se representan en la Figura 15 como Western Blot. La expresión de P 1 10a fue utilizada como el control de carga y detectada por un anticuerpo monoclonal específico para p1 10a. A partir de cualquiera de Western Blot representadas en la Figura 15 pueden tomarse de aproximadamente 1 a 2% mol del lípido auxiliar que contiene PEG fue adecuado proporcionar una reducción eficiente de la expresión de PTEN. Puede concluirse que, preferiblemente, el componente de DPhyPE debe reemplazarse por el lípido auxiliar de PEGilado más bien que el componente de lípido catiónico es reemplazado por el lípido auxiliar PEGilado. Esto puede tomarse del experimento anterior donde las formulaciones H parecen ser más potentes que las formulaciones C. El contenido del lípido auxiliar PEGilado es de manera preferible de aproximadamente 0.05% a 4.9%, preferiblemente de 1 a 3% y más preferiblemente de 2 a 3%. Ejemplo 22: Uso in vivo de una formulación del lípido que contiene siARN Para probar la conformidad del siARN que contiene las formulaciones de lípido de acuerdo a la presente invención, las formulaciones de lípido se utilizan en un modelo de ratón. En contraste con la así llamada inyección de presión hidrodinámica frecuentemente utilizada para li berar siARN en el h ígado in vivo donde un volumen que corresponde a aproximadamente 10% del peso corporal que es aproximadamente 2.5 ml del líquido por ratón se inyecta rápidamente en la vena de la cola, los presentes experimentos in vivo se llevan a cabo tal que el siARN que contienen las formulaciones de lípido se administraron sistemáticamente a bajos volúmenes (200 a 300 µl) los cuales son lentos, es decir durante varios segundos, inyectados en la vena de la cola de los ratones así practicando un modo clínicamente relevante de administración. El proceso experimental se representa en la Figura 16. Los fibroblastos de embrión de rata funcionalmente normales (RAT2; ATCC:CRL-1 74) fueron transformados utilizando oncogénicos de Ras (Ras 12). Los fibroblastos dependientes de RasV12 transformados se inyectaron posteriormente en ratones (6 ratones por grupo; machos de ocho semanas de edad Shoe: NMR1 -nu/nu, DI MED, Alemania) que desarrollaron un tumor después de diez días. En esta etapa, los animales fueron cualquiera no tratados de hasta 19 días después de la inyección de los fibroblastos transformados o tratamiento que utilizan varias formulaciones se iniciaron el día 1 1 . Puesto que los fibroblastos de embrión de rata funcionalmente normales de control adicional se inyectaron en ratones de los cuales ninguno desarrolló un tumor. La molécula de siARN se refiere en la presente como T-Ras que consiste de una primera hebra T-Ras 3A que tiene la siguiente secuencia: aacguguagaaggcauccu-P en la dirección 5'-3' y una segunda hebra T-Ras 3B que tiene la siguiente secuencia: aggaugccuucuacacguu-P en la dirección 5'-3'. Favor de observar que los nucleótidos que están impresos en negritas y que están subrayados, son los nucleótidos 2'-O-metilo. En cualquiera de las hebras, el extremo 3' inicia con un fosfato representado por P en las secuencias anteriormente mencionadas. Puesto que un control de una molécula de siARN específica de PTEN fue diseñado con una primera hebra que tiene la siguiente secuencia: 5' uaaguucuagcuguggugg-P 3' y una segunda secuencia 5' ccaccacagcuagaacuua-P 3', por lo cual el patrón de modificación es el mismo como se indica en relación con T-Ras 3A y T-Ras 3B, respectivamente. Las siguientes formulaciones se administraron al modelo de ratón: Panel de formulación A: PBS; T-Ras 3: 10 mg/kg/atuFect/3.7 mg/kg; desnudo T-Ras 3 1 0 mg/kg; y T-Ras 3 5 mg/kg/atuFect 38.5 mg/kg. Panel de formulación B: PBS; atuFect solamente 38.5 mg/kg; PTEN 10 mg/kg/atuFect 38.5 mg/kg ; y T-Ras 3 5 mg/kg/atuFect 38.5 mg/kg . Panel de formulación C: sucrosa (50 mM); T-Ras 3 3.75 mg/kg/atuFect-PEG 28.9 mg/kg, administrado i. v. ; y T-Ras 3 3.75 mg/kg/atuFect-PEG 28.9 mg/kg, administrado i. p. atuFect-PEG como se utiliza en la presente significa 50% mol de trihidrocloruro de N-palmitil-N-oleil-amida del ácido propiónico de ß-arginil-2,3-diamino, 48% mol de 1 ,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina y 2% mol de 1 ,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanoiamina-polietilenglicol-2000 (DSPE-PEG2000), en 50 mM de sucrosa. La dosificación en los animales fue 5 mg/kg de siARN y 38.5 mg/kg de lípidos totales; la concentración de los componentes en la solución de inyección fue 0.5 mg/ml de siARN y 3.85 mg/ml de lípidos totales; la proporción molar fue: siARN : 0.5 mg/ml que corresponden a 0.04 µmoles/ml (peso molecular de aproximadamente 1 2, 500 Da. El lípido fue de 3.85 mg/ml del lípido total, por lo cual el contenido del lípido catiónico fue 1 .97 mg/ml (peso molecular 843.6) que corresponde a 2.3 µmoles/ml del lípido catiónico. La proporción molar de siARN al lípido catiónico fue 0.0174 a 1 . Los resultados de estos experimentos se representan en la Figura 17A (panel de formulación A), Figura 1 7B (panel de formulación B) y Figura 1 7C (panel de formulación C) que muestra el volumen del tumor como una función de tiempo, es decir los días de estimulación post-celular. Como puede tomarse de ambas figuras 1 7A y 1 7B los lipoplejos que consisten de siARN específico de T-Ras formulado con atuFect muestran la inhibición fuerte e indican la especificidad de marcado. Debe observarse que la molécula PTENV10 de control negativo no muestra una inhibición mejorada del crecimiento tumoral cuando se compara con solo atuFect (Figura 17B). Como puede tomarse de la Figura 1 7C también el atuFect-PEG es altamente efectivo y permite la administración tanto para i. p. así como para i. v. y dando por resultado eficacias similares. En relación con el mismo es notablemente evidente que los complejos PEGilado son funcionalmente activos y puede asumirse que debido a la PEGilación de las composiciones de lípido son menos tóxicas que las composiciones de lípido similares que carecen del lípido (auxiliar) PEGilado. Ejemplo 23: Material y métodos para los ejemplos 24 a 27 Preparación de los lipoplejos de siARN Los liposomas catiónicos que comprenden el trihidrocloruro de N-palmitil-N-oleil-amida del ácido ß-L-arginil-2, 3-L-diaminopropiónico del lípido catiónico, la 1 ,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina del fosfolípido neutral (Avanti Polar Lipids Inc. , Alabaster, AL) y la sal de sodio de N-(carbonil-metoxipolietilenglicol-2000)-1 ,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina del lípido PEGilado (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Alemania) en una proporción molar de 50/49/1 se prepararon por rehidratación de la película de lípido en 300 mM de solución de sucrosa libre de RNase estéril a una concentración de lípido total de 4.34 mg/ml. Posteriormente la dispersión multilamelar fue procesada adicionalmente mediante homogeneización por alta presión (22 ciclos a 750 bar y 5 ciclos a 1 ,000 bar) utilizando un dispositivo EmulsiFiex C3 (Avestin, Inc. , Ottawa, Canadá). La dispersión liposomal obtenida se mezcló con un volumen igual de 0.5625 mg/ml de solución de siARN en 300 mM de sucrosa, dando por resultado un índice de carga calculado de fosfatos de estructura del ácido nucleico a átomos de nitrógeno del l ípido catiónico de aproximadamente 1 a 4. El tamaño de la dispersión del lipoplejo fue de aproximadamente 1 20 nm como se determinó por Quasi Elastic Light Scattering (N5 Submicrón Partióle Size Analyzer, Beckman Coulter, Inc. , Miami, FL). Para los experimentos in vitro esta dispersión fue diluida adicionalmente a una concentración de 5-20 nM de siARN en 10% de suero que contiene el medio de cultivo celular. Experimentos animales Se utilizan ratones desnudos machos de Athymic (Hsd: RMN I-nu/nu, de 8 semanas de edad) a través de este estudio. Para experimentos de terapia tumoral en xenoinjertos tumorales establecidos, un total de 5.0 x 106 células/100 µl (en presencia de 50% de matrigel para 3Y1 -RasV12) se implantaron subcutáneamente (s.c.). Para experimentos de terapia tumoral, la solución compleja de siARN liposomal se administró de manera i.v. mediante inyección en la vena de la cola de bajo volumen, de baja presión. Diferentes dosificación se realizaron variando los horario de inyección (diario contra dos días) utilizadas para un ratón de 30 g a un volumen de inyección de 200 µl de una solución madre que contiene 0.28 mg/ml de siARN y 2.17 mg/ml de lípido (equivalente a una dosis de 1 .88 mg/kg de siARN y 14.5 mg/kg de lípido). El volumen de tumor fue determinado utilizando un calibrador y calculado de acuerdo a la fórmula volumen = (longitud x anchura2)/2. Todos los experimentos animales en este estudio se realizaron de acuerdo a protocolos aprobados y en conformidad con las pautas de Landesamt für Arbeits-, Gesundheitsschutz und technische Sicherheit Berlín, Alemania (No. G0264/99). Análisis estadístico Los datos se expresan como el medio ± S. E. M. El significado estad ístico de diferencias fue determinado por la prueba de Mann-Whitney U. Los valores P < 0.05 se consideran estadísticamente significativos. Experimento de absorción de siARN-Cy3 en cultivo celular y ratones Para estudios de absorción de moléculas de siARN-Cy3 no formuladas en cultivos celulares de células HeLa se incubaron con cantidades definidas de solución de siARN durante la noche en medio libre de suero. La absorción de células siARN-Cy3 lipoplejadas se llevó a cabo por transfección durante la noche como se menciona más adelante. Las células tratadas se enjuagaron con PBS enfriado con hielo y se fijaron en 4% de solución de formaldehído/PBS durante 1 5 minutos antes de la microscopía. Para el marcado final de endosomas y lisosomas, las células se incubaron con tinte fluorescente LysoTracker (Molecular Probes) de acuerdo a la recomendación de los fabricantes y examinadas por microscopía confocal después de la fijación. El experimento de liberación in vivo que utiliza el siARN-Cy3 fluorescentemente marcado, se lleva acabo por administración intravenosamente formulada y siARN desnudo. Los ratones fueron tratados con una sola inyección i.v. de 200 µl a una dosis final de 1 .88 mg/kg de siARN-Cy3 y 14.5 mg/kg de lípido. Los ratones se sacrificaron a puntos de tiempo definidos y la absorción de fluorescencia examinada mediante microscopía en formalina fijada, parafina incluida o secciones de tejido congeladas montadas en OCT. Transfección in vitro El HUVEC humano, HeLa, líneas celulares PC-3 así como líneas celulares de EOMA y NIH3T3 murinas se obtuvieron de American Type Culture Collection y cultivadas de acuerdo a recomendación de ATCC's. La línea celular del hepatoma humano HuH-7 está disponible de MDC, Berlín. Las células Rat 3Y1 que expresaban RasV12 oncogénico se generaron por la transducción de RasV12 como se describe38. Las líneas celulares se transfectaron con siARN utilizando las liposomas catiónicas descritas anteriormente. Brevemente, de manera aproximada 1 2 horas después de que diferentes cantidades de célula se sembraron de la solución de siARN-lipoplejo diluida en suero que contiene el medio se agregaron a las células para realizar las concentraciones de transfección en un intervalo de 1 -50 nM de siARN. Después de la transfección (48 h) las células se Usaron y se sometieron a inmunomanchado como se describe20. Los siguientes anticuerpos se utilizaron para inmunomanchado: conejo anti-PTEN (Ab-2, Neomarkers) , monoclonal p1 1 0a/p8539, conejo anti-PKN338, cabra anti-CD31 (Santa Cruz Biotechnology), conejo anti-CD34 (Santa Cruz Biotechnology), conejo anti-fosforilado Akt (S473) (Cell Signaling Technology). Análisis de BrdU in vivo Para medir la proliferación celular in vivo, los ratones se trataron con BrdU (Sigma; 250 mg/kg) mediante inyección intraperitoneal y se sacrificaron dos horas después. Las secciones incluidas de parafina fijadas con formalina del hígado o tejido tumoral se sometieron a manchado con BrdU de acuerdo al protocolo de los fabricantes (kit de detección in situ de BrdU , Farmingen). Determinación de densidad de microvaso (MVD) El número de microvasos fue determinado contando los vasos CD31 -/CD34-positivos en 3 - 8 áreas aleatoriamente seleccionadas de únicas secciones tumorales24. El número de vasos como unidades vasculares fue evaluado sin importar la forma, puntos ramificados y lúmenes de tamaño (que hace referencia al "número de vasos"). Adicionalmente, la densidad vascular fue determinada por la determinación de longitud total de las estructuras del vaso CD31 -/CD34-positivo (que hace referencia a la "suma de longitudes del vaso") que utiliza el software Axiovision 3.0 (Zeiss). La cuenta fue realizada escaseando secciones tumorales a 200x de ampliación con un microscopio de luz Zeiss Axioplan. Análisis y microscopía histológica Después de que se sacrificaron los ratones, los tejidos se fijaros inmediatamente en 4.5% de formalina amortiguada durante 16 horas y posteriormente procesados para la introducirlos de parafina. Se cortaron secciones de 4 µl y se colocaron en portaobjetos de vidrio. Las secciones del tejido se mancharon con policlonal anti-CD3 l/PECAM-1 de cabra (1 : 1000, Santa Cruz Biotechnology) (alternativamente para criosecciones de rata CD31 , 1 : 100, Farmingen) y rata-monoclonal anti-CD34 (Cedarlane) para visualizar las células endoteliales en secciones de parafina. El contramanchado por inmunohistoquímica y hematoxilina/eosina (H&E) en secciones de tejido de parafina se llevó a cabo de acuerdo a protocolos estándares. Para estudios de absorción in vivo de siARNs marcados fluorescentemente, las secciones de parafina se examinaron directamente por epifluorescencia con un microscopio Zeiss Axioplan. Las imágenes se registraron y procesaron utilizando el software de proyección de imagen Zeiss LSM5. Un análisis microscópico profundo de absorción de siARN se realizó con un microscopio confocal Zeiss LSM51 0 Meta. Para esto, las secciones se desparafinan con xileno, rehidratadas a través de lavadas con etanol graduadas, contramanchando con tinte Sytox Green (Molcecular Probes 100 nM; 1 0 min), enjuagadas y finalmente montadas en FluorSave (Calbiochem) para microscopía. El manchado por inmunofluorescencia de células N 1 H3T3 se llevó a cabo como se describe40, utilizando después anticuerpos: el anti-fosforilado-Akt de conejo inmunohistoquímico-específico (S473) (Cell Signaling Technology) y anti-a-tubulina de ratón (DM 1 A, Calbiochem). Tabla 1 Secuencias de siARN como se utiliza a través de los ejemplos 24 a 27 Nombre ARNsi secuencia 5' a 3' PKN3 s gagagccuguacugcgaga PKN3 as u c u c g c a g u a c a g g c u c u c PTEN s ccaccacagcuagaacuua PTEN as uaaguucuagcuguggugg PTEN s (control) ccaccacagcuaqaacuua PTEN as (control) uaaguucuagcuguggugg PTEN s ccaccacagcuagaacuua uaaguucuagcuguggugg- PTEN as-Cy3 Cy3 CD31 -1 s cea a c u u c a c ca u c c a g a a CD31 -1 as uucuggauggugaaguugg CD31 -2 s ggugauagccccgguggau CD31 -2 as auccaccggggcuaucacc CD31 -6 s ccacuucjjgaacuccaaca CD31 -6 as uguuggaguucagaagugg CD31 -8 s cagauacucuagaacggaa CD31 -8 as uuccguucuagaguaucug los nucleótidos con las modificaciones 2'-O-metilo se subrayaron Ejemplo 24: Liberación de siARNs desnudos y formulados in vitro e in vivo En este estudio, utilizando dúplex de siARN 19-mer que carece del extremo 3', que son químicamente estabilizadas por la alteración de las modificaciones del azúcar de 2'-O-metilo en ambas hebras16, por lo cual los nucleótidos sin modificar son modificados revistiendo la hebra opuesta. Las moléculas de siARN usadas actualmente se representan en el ejemplo 23. En una primera etapa, analizamos si estas moléculas median el ARNi en cultivos celulares en ausencia de vehículos de liberación. El análisis de Inmunomanchado demostró que ningún gen silencioso ocurrió cuando el siARN desnudo fue aplicado en incluso concentraciones micromolares comparadas a concentraciones nanomolares usadas para siARN-lipoplejos. Los resultados se muestran en la Figura 1 8a. Como puede tomarse de la Figura 18 más detalladamente, existe una concentración de inhibición dependiente de la expresión de la proteína PKN3 con siARNs lipoplejado, pero sin el siARN desnudo en células HeLa como se determina por inmunomanchado. PTEN sirvió como el control de carga. También probamos los siARNs convencional no modificados (21 -mer, 2 nucleótidos al extremo 3')6 y varias moléculas conjugadas incluyendo las siARNs conjugadas-colesterol o unidas al péptido, pero no detectamos ninguna reducción específica marcada de la expresión de proteína endógena en ausencia de vehículos de liberación (datos no mostrados). Para analizar si la falta del gen silenciador fue el resultado de una absorción celular inefectiva debido a efectos repulsivos entre los siARNs aniónicos y la membrana celular negativamente cargada utilizamos 3' de siARNs marcados fluorescentemente (Cy3) para estudiar su absorción mediante microscopía confocal. Nosotros, y otros hemos mostrado anteriormente que la fluorescencia que marca el extremo 3' de la molécula antisentido no deteriora el ARN que silencia la actividad cuando se transfreta con vehículos de liberación16 , 17. Sorpresivamente, observamos una absorción significativa de siARNs fluorescentemente etiquetada en ausencia de reactivos de transfección cuando se aplicaron altas concentraciones de moléculas de siARN-Cy3. Sin embargo, la mayoría del marcado por fluorescencia parece terminar en las últimas vesículas endosomales/Msosomales como se demuestra por co-localización con el marcador LysoTracker que sugiere que los siARNs no formulados permanecen atrapados en la trayectoria endosomal. En contraste, los siARNs transfectados como complejos liposomales disociados de estas vesículas y se liberaron en el citoplasma. Estos resultados indican que la formulación liposomal de siARNs proporciona por lo menos dos efectos benéficos para la liberación funcional de siARNs: una absorción celular mejorada e importantemente el escape de la trayectoria endocitótica/endosomal en el citoplasma18, donde ocurre la degradación de mARN mediada por ARNi. Los detalles de la Figura 18b son como sigue. La figura 18b muestra la distribución intracelular de siARNs desnudos y formulados. Los siARNs-Cy3 marcados fluorescentemente se analizaron por microscopía confocal en paneles izquierdos y medios de células HeLa. Los paneles derechos muestran imágenes combinadas de la distribución subcelular después de contramanchado con LysoTracker (verde; flechas, localización de siARN-Cy3 con respecto al compartimiento endosomal/lisosomal). La fila superior, siARN-Cy3 desnudo; siARN-Cy3 lipoplejada de la fila inferior. Para analizar si la formulación liposomal cambia las propiedades farmacológicas de siARNs in vivo, inyectamos (bajo volumen y baja presión) una sola dosis de moléculas de s¡ARN-Cy3 (1 .88 mg/kg de siARN) en la vena de la cola de ratones. El análisis microscópico de varios órganos incluye el páncreas, pulmón, riñon y próstata muestra un aumento significativo en la fluorescencia específica de Cy3 con siARNs formulados (datos no mostrados). La cantidad mayor de fluorescencia fue detectada en el hígado de los ratones tratados con siARNs liposomalmente formulados en todos los puntos de tiempo analizados ( 1 h, 4h, 24h, post-inyeccíón Figura 18c). Este resultado indica una mejor biodistribución de las moléculas de siARN formuladas en lipoplejos cuando se compara con la administración de siARNs desnudos. Sin embargo, la biodistribución mejorada en órganos completos no indica necesariamente una absorción específica intracelular o tipo celular de estas moléculas, que es un pre-requisito para la funcionalidad de los siARNs liberados. Un análisis más detallado de absorción de siARN-Cy3 formulado en el hígado por microscopía confocal revela que en el manchado de fluorescencia del nivel celular está predominante presente en los revestimientos de los vasos sanguíneos y los sinusoides (Figura 18c, panel inferior). Una inspección más cercana de los vasos en el hígado reveló que la capa endoteliales es claramente marcada por el siARN-Cy3 fluorescente en contraste al control de PBS (Figura 18d, fila superior). Dentro de la célula endotelial, el siARN-Cy3 está exclusivamente presente en el citoplasma (Figura 18 d, paneles inferiores). El mismo patrón de manchado fue observado en las criosecciones del hígado no fijas, que eliminan cualquier artefacto de fijación de formalina (datos no mostrados). Para probar si el siARN lipoplejado marcado fluorescentemente también marca la vasculatura 7 tumoral que tratamos en ratones que llevaban diferentes tumores experimentales con una sola inyección i .v. de lipoplejos de siARN-Cy3. En todos los tres xenoinjertos tumorales experimentales (dos subcutáneos, s.c. , y uno intrahepático, i. hep.) detectamos señales de fluorescencia significativas en la vasculatura tumoral (Figura 1 8e, flecha). La absorción de siARN-Cy3 por la capa endotelial de la vasculatura tumoral fue confirmada por contramanchado con anticuerpo anti-CD34, un marcador celular endotelial (Figura 1 8e, paneles inferiores). Además, la absorción del siARN-lipoplejo por el endotelio fue confirmado utilizando lípidos marcados fluorescentemente (no mostrados). Tomados juntos, estos datos muestran que las formulaciones basadas del lípido catiónico de siARNs mejoran las propiedades cinéticas y distribución de siARNs y permiten un absorción predominante de células endoteliales en siARNs. La configuración experimental para los resultados mostrados en la Figura 1 8c es como sigue. El siARN-Cy3 desnudo o Mpolexado fue administrado mediante una sola inyección i.v. y las secciones de tejido del hígado de puntos de tiempo indicadas se analizaron mediante un microscopio de epifluorescencia (paneles superiores). Los paneles inferiores, imágenes del microscopio confocal en primer plano de secciones del h ígado que muestran la distribución de siARN-Cy3 no formulado (imagen izquierda) comparada al lipoplejo (imagen derecha, siARN-Cy3, rojo; núcleos, verde por contramanchado con Sitos Green). Las imágenes fueron registradas con preparaciones idénticas. Se comparan la intensidad de manchado de los vasos del hígado (flecha) y sinusoides (flecha doble). Los detalles de la Figura 1 8d son como siguen. El revestimiento endotelial de un vaso del hígado es decorado con siARN-Cy3 fluorescente (panel derecho), en contraste con la sección de control tratada de PBS (panel izquierdo). El microscopio confocal reveló la liberación citoplásmica del siARN-Cy3 formulado (rojo, fusionado) en células endoteliales del h ígado (células de sangre roja, flecha doble). No hay fluorescencia perceptible en el núcleo (verde, flechas).
La preparación experimental para los resultados mostrados en la Figura 1 8e fue como sigue. Las células endoteliales de diferentes tumores fueron marcadas con siARNs formulado liposomal como se indica por las flechas (ARNsi-Cy3, rojo; núcleo, verde). La fila superior muestra las imágenes fluorescentes de secciones del tumor PC-3 subcutáneamente crecido (panel izquierdo) y tumor de fibroblasto de rata 3Y1 transformado por RasV1 2 (panel medio) o tumor HuH-7 intrahepáticamente crecido (panel derecho). La fila inferior muestra la detección del siARN-Cy3 liberado del liposoma en células endoteliales del tumor HuH-7. Las células endoteliales tumorales se muestran por manchado de H&E (panel izquierdo) caracterizado por su citoplasma delgada y el núcleo prominente (flecha). Las secciones consecutivas muestran la fluorescencia de siARN-Cy3 correspondiente (rojo, panel medio) e inmunomanchado antí-CD34 de las células endoteliales (panel derecho), respectivamente.
Ejemplo 25: Liberación Funcional de siARNs específico de PTEN a células endoteliales del hígado y tumor Para demostrar la habilidad del siARN-lipoplejos a la expresión del gen endógeno silencioso en células endoteliales in vivo, seleccionamos al PTEN supresor de tumor, un antagonista de fosfoinositida-3-quinasa (Pl 3-quinasa) , como un marcado. Nos prepusimos monitorear el gen funcional que silencia el PTEN en un sistema leído positivo midiendo la síntesis de ADN creciente por absorción de BrdU en núcleos de células endoteliales. La pérdida de la expresión de PTEN se conoce para señalizaciones de Pl 3-quinasa crónicamente activa, que puede medirse por un aumento en la fosforilación del quinasa corriente abajo Akt1 9 (Figura 1 9a). La activación crónica de Pl 3-quinasa también es acompañada por una velocidad creciente en la síntesis20 del ADN. Primero, la actividad de ARNi de un siARNPTEN seleccionado (ver ejemplo 23), ratón marcado y PTEN mARN humano, fue verificada por la transfección mediada por lípido in vitro (Figura 19a). La secuencia de siARN idéntica que llevaba la modificación 2'-O-metilo en cada nucleótido fue utilizada como un control negativo (siARNcoptro1), puesto que este patrón de modificación uniforme suprime totalmente16 la actividad de ARNi. La reducción de la proteína de PTEN y fosforilación creciente de Akt se observaron por inmunomanchado. Los estudios de inmunofluorescencia confirmaron la fosforilación de Akt mejorada en presencia de la molécula de siARNPTEN activa (Figura 19a). Esto muestra la capacidad de la molécula de siARNPTEN para la señalización de la Pl 3-quinasa activa en cultivos celulares.
Para probar el gen de PTEN que silencia los ratones in vivo (4 por grupo) se trataron con PBS, siARNPTEN desnudo, siARNPTEN-lipoplejo o vehículo de lípido durante tres días consecutivos con bajo presión, inyección en la vena de la cola (ver Métodos). El día cuatro del tratamiento, BrdU se inyectó en los ratones y dos horas más tarde los ratones fueron sacrificados y la incorporación de BrdU fue medida por manchado inmunohistológico de las secciones del hígado para los núcleos positivos de BrdU. El tamaño pequeño de las células endoteliales y las dificultades en la detección de una señal confiable con anticuerpos específicos de PTEN y Akt fosforilado y no se permitió para detectar la reducción de la proteína in situ. Sin embargo, consistente con la liberación específica de la célula observada del siARN de fluorescencia marcada a células endoteliales observamos un aumento significativo en núcleos positivos de BrdU en el endotelio del hígado solamente con el siARNPTEN liposomal (Figura 19b). Un experimento similar con ratones que producen el tumor reveló un aumento significativo así como en el número de núcleos de BrdU-positivo del endotelio tumoral después del tratamiento con PTEN-siARN activo liposomalmente formulado (Figura 19c). El siARNcontro1 de la molécula completamente desnaturalizada inactiva, no causó un aumento en la incorporación de BrdU con relación al grupo control de PBS. Concluimos de estos datos donde los siARNs específicos de PTEN estabilizados formulados con lípidos catiónicos son funcionales in vivo para inducir el gen silenciado en células endoteliales después de la administración sistémica. Los detalles de la Figura 19a son como sigue. La transfección de un siARN específico de PTEN estabilizado ( 1 0 nM) in vitro reduce el nivel de proteína de PTEN y la fosforilación incrementada de la quinasa Akt corriente abajo (P*-Akt) como se describe por inmunomanchado (panel superior derecho; Subunidades de Pl 3-quinasa p1 10a, p85, control de carga inafectado). El s¡ARNcon r0' representa una molécula de s¡ARNPTEN inactiva completamente metilada; ut, células no tratadas. El aumento de Akt fosforilada también fue visualizado por manchado de inmunofluorescencia en células NI H3T3 transfectadas con siARNPTEN (Akt fosforilada, rojo; anti-a-tubulina como marcador para la morfología celular, verde). La Figura 19b representa imágenes representativas (paneles superiores) y cuantificación correspondiente (diagrama de inferior) que muestra diferencias significativas en el número de núcleos endoteliales positivos de BrdU (flechas) en muestras del hígado de animales tratados con PBS, siARNPTEN desnudo, s¡ARNPTEN lipoplejado y liposomas catiónicas, respectivamente (dos imágenes mostrados para cada tratamiento). Significado estadístico: siARNPTE N desnudo contra siARNPTEN-lipoplejo, *P = 0.0286; liposomas contra siARNPTEN-lipoplejo, *P = 0.0286. Los detalles de la Figura 1 9c son como sigue: La especificidad de la secuencia de siARNPTEN lipoplejado en síntesis de ADN fue confirmada con el ensayo de BrdU para la vasculatura tumoral. Los núcleos positivos de BrdU crecientes (flecha) fueron detectados en vasos sanguíneos de tumor (V) de animales tratados con siARNPTEN- lipoplejo en contraste con siARNcop,rol-| jpoplejo; Tu: tejido de tumor. La cuantificación de los núcleos de BrdU-positivo en células endoteliales fue significativamente incrementado: siARNc°n,rol-|¡poplejo contra siARNPTEN-lipoplejo *P = 0.032. Ejemplo 26: gen silenciado in vivo de CD31 Para demostrar el gen silenciado mediado por siARN in vivo más directamente, enfocamos un marcado en un gen selectivamente expresado en células endoteliales. Elegimos la molécula de adhesión celular plaqueta/endotelial 1 (PECAM-1 ), también conocida como CD31 , como un blanco adecuado, puesto que su expresión se restringe a células del sistema vascular, principalmente a las células endoteliales así como plaquetas, monocitos, neutróflios y células T seleccionadas 2123. El análisis de moléculas de siARN modificadas por 2'-O-metilo (ver Ejemplo 23) en ratón y líneas celulares endotelíales derivadas de humanos (HUVEC, EOMA) conducen a la identificación de varias moléculas de CD31 -siARN específicas potentes humanas y de ratón (Figura 20a). la molécula de siARN más potente, siARNCD31 "8, fue liposomalmente formulada como se describe en el ejemplo 23 y sistémicamente administrada en ratones que producen el tumor durante dos o siete d ías en una fila. Los ratones control fueron tratados con solución de sucrosa isotónica o con siARNPTEN lipoplejado para probar la especificidad. Después del tratamiento, los ratones fueron sacrificados y el gen silenciado analizado en varios tejidos por RT-PCR en tiempo real (TaqMan) e inmunomanchado.
Una reducción en el nivel de CD31 mARN en ratones tratados con siARNCD31 8-lipoplejo se observó en el tumor, hígado y pulmón, pero no en muestras de tejido del vaso. La reducción observada en puntos de niveles de CD31 mARN a un modo de ARNi de acción basada en la división de mARN (Figura 20b). Además, una reducción significativa de los niveles de la proteína CD31 fue detectada en Usados de tumor e h ígado de ratones tratados con s¡ARNC D31 8-lipoplejos durante dos días consecutivos en contraste a los niveles de la proteína sin cambios observados en ratones control (Figura 20c, panel izquierdo) . Para probar la especificidad y carga igual analizáramos en paralelo los niveles de la proteína CD34, otra proteína matcadora de la célula endotelial, así como PTEN en estos Usados. También hemos examinado extractos celulares completos del vaso y pulmón, pero no detectamos la expresión de la proteína CD31 liberable por análisis de inmunomanchado en estos órganos (datos no mostrados). La reducción de la proteína CD31 fue confirmada en un experimento independiente en ratones que producen el no-tumor por siete inyecciones i.v. diarias (Figura 20c, panel derecho). Además, la reducción en la expresión CD31 también fue revelada in situ, midiendo las diferencias en la densidad microvasal (MVD) para marcadores endoteliales CD31 y CD34 en un modelo de ratón de tumor de xenoinjerto. La medida de MVD es un marcador sustituto para la angiogénesis del tumor, y analizado por manchando inmunohístoqulmico de los vasos sanguíneos con los anticuerpos2426 específicos CD31 o CD34. CD31 formulado y siARNs específicos de PTEN fueron administrados por inyección de la vena de la cola con volumen regular (200 µl) y la presión regular en dos días en ratones que tienen tumor (tamaño del tumor 800 mm3). El día tres, los ratones fueron sacrificados y el MVD fue comparado entre secciones consecutivas después de la inmunomanchado con CD31 y anticuerpos CD34, respectivamente. Los ratones tratados con siARNCD31 "8 lipoplejado demostraron una disminución estadística significativa de la cantidad total de vasos positivos de CD31 según lo medido por el número total de vasos así como la longitud del vaso (Figura 20d). El manchado con anticuerpos específicos de CD34 no reveló un cambio en MVD que indicara otra vez el silencio de CD31 específico. Ambos grupos de control, siARNPTEN y sucrosa isotónica tratada, no mostraron diferencias en la valoración de MVD por el manchado de CD31 o CD34. Este resultado junto con los datos moleculares sobre mARN y la reducción de la proteína, indican la reducción específica en la expresión de CD31 , sin una disminución en las células endoteliales positivas de CD34 en respuesta a la administración sistémica de siARNC D31 "8 lipoplejado. Se concluyó que el gen silencioso de CD31 in vivo (PECAM-1 ) puede obtenerse por la administración de siARNs formulado con lípido catiónico en la vasculatura de tumores e hígado. Los detalles de la Figura 20a son como sigue. La Figura 20a muestra la identificación de siARNs estabilizado potente para la reducción efectiva de CD31 . HUVEC y las células de EOMA murino fueron transfectadas con cuatro diversos CD31 apuntada a siARNs específicos de humano, ratón (CD31 -1 , -2 ,-6, -8) y un PTEN-siARN de control. La reducción de la proteína específica fue determinada por inmunotransferencia usando anti-CD31 y anti-PTEN que muestran mayor eficacia de la molécula siARNCD31 "8. Los detalles de la Figura 20b son como sigue. Los ratones tratados en dos días consecutivos por la inyección i.v. de siARNCD31 "8 lipoplejado mostraron la reducción de los niveles de mARN de CD31 en ciertos tejidos según lo revelado por TaqMan RT-PCR cuantitativo. La cantidad relativa de mARN de CD31 fue normalizada a niveles de PTEN mARN. Los detalles de la Figura 20c son como sigue. La reducción de la proteína CD31 en ratones tratados sistémicamente con siARNCD31 "8-lipoplejos fueron confirmados por análisis de inmunotransferencia con extractos del h ígado y tumor utilizando el anticuerpo anti-CD31 y anti-PTEN así como anti-CD34 (otra proteína marcadora endotelial) para mostrar una carga de proteína igual. Los ratones fueron tratados por injección i.v. en dos (panel izquierdo: hígado y tumor) o siete días consecutivos (panel derecho: hígado). La reducción de la proteína CD31 fue observada en los animales tratados con siARNCD31 lipoplejo en hígado y tumor (véase el animal 2, panel izquierdo) pero no en ratones tratados con la solución de sucrosa isotónica o en ratones tratados con siARNPTEN-lipoplejo (véase animales 1 , 3). Con un régimen de tratamiento de siete días, fue observada una reducción sustancial de CD31 en animales 5 y 6 en contraste con los animales de control 4, 7 y 8 (panel derecho). La funcionalidad del siARNCD31 "8 -lipoplejo usado para el estudio in vivo fue verificado en paralelo en las células de HUVEC ( 10 nM siARN) . Los detalles de la Figura 20d son como sigue. La reducción in vivo de la proteína CD31 fue determinada directamente mediante el inmunomanchado de secciones de tumores con parafina de ratones correspondientes tratados con sucrosa isotónica, siARNC D31 "8 -lipoplejo, y siARNPTEN -lipoplejo. Las secciones consecutivas fueron manchadas con los anticuerpos anti-CD31 y anti-CD34, respectivamente, para visualizar la vasculatura del tumor. La intensidad de manchado reducida para CD31 , pero no para CD34, fue encontrada en la sección del tumor de los ratones tratados con siARNCD31 "8 -lipoplejo. La cuantificación de MVD (determinada por el número de vasos, del diagrama superior, y las longitudes totales de vasos, diagrama inferior) de los vasos positivos de CD31 muestra un MVD reducido en las muestras de ratones tratados con siARNCD31 "8 -lipoplejo. Esta diferencia no fue observada por la medida de MVD de los vasos positivos de CD34. En relación con las moléculas de siARN anti-CD31 descritas en la presente debe observarse que la descripción de la presente solicitud se relaciona a cualquier molécula de siARN anti-CD31 y más preferiblemente cualquier molécula de siARN anti-CD31 que exhiba el patrón de modificación mostrado y descrito en la presente por ejemplo descrito en relación con la molécula de siARN anti-CD31 -8. Eiemplo 27: Eficacia de siARNCD31-lipople¡o sistemáticamente administrado en modelos de tumor En este ejemplo, tratamos la cuestión si siARNs formulados contra CD31 /PECAM-1 exhiben cualquier potencial terapéutico en el crecimiento del tumor. CD31 ha sido implicada en participar en los mecanismos celulares diferentes para la formación de vasos/plaquetas y función23 27 , 28, pero su contribución potencial a la neovascularización durante el crecimiento del tumor no ha sido tratada hasta ahora. Las moléculas de siARN electas para el método terapéutico comprenden s¡ARNCD31 "8 específico y siARNCPTEN como molécula del control. El siARNC D31 8 y siARNCPTE N-lipoplejos para los estudios in vivo de la eficacia fueron probados en una transfección dependiente de la dosis experimental en HUVEC antes del experimento in vivo. Las inmunotransferencias representativas que muestran la funcionalidad y potencia de estos siARN-lipoplejos se muestran en la Figura 21 a. La reducción de la proteína CD31 se logró con siARNCD31 ß en el intervalo sub-nanomolar bajo con estas formulaciones. La especificidad del gen silencioso mediado por siARNCD31 "8 fue demostrada probando para PTEN , Akt fosforilado y CD34. Transfecciones distintas con siARNPTEN, el estado de fosforilación de Akt no fue afectado en LAS células de H UVEC por la reducción en CD31 . El nivel de proteína CD34 no fue cambiado con ambos lipoplejos cuando se comparó a los controles no tratados. El efecto terapéutico potencial del CD31 -siARN-lipoplejo sistémicamente administrado fue investigado en los ratones que llevaban dos diferentes tipos de xenoinjertos del tumor de s.c. Primero, se estableció un régimen que permitió el tratamiento sistémico repetido utilizando diferentes dosis de lipoplejo diariamente. Diferentes dosis totales se obtuvieron por la administración de inyecciones en la vena de la cola diario o bi-diariamente de 200 µl de solución de lipoplejo (sola dosis 1 .88mg/kg/d siARN; lípido de 14.5 mg/kg/d). No se observó efectos severos tóxicos en el estado de salud animal según lo determinado supervisando los cambios en el peso corporal como marcador global de la salud general (Figura 21 b). Posteriormente, se analizó los dos regímenes de dosificación que representan los tratamientos vía iv. diarios o bi-diariamente en un estudio de eficacia de siARNCD31 8-lipoplejo en la inhibición del crecimiento del tumor. Ambos regímenes de tratamiento dieron lugar a un efecto inhibitorio claro en el crecimiento de un tumor de un xenoinjerto 3Y1 -RasV12 s.c. de crecimiento rápido, establecido con siARNC 31 8-lipoplejo (Figura 21 c). Notablemente, para este xenoinjerto de tumor particular le régimen bi-diario mejoró el efecto inhibitorio del crecimiento del tumor. Esta inhibición fue estadísticamente significativa cuando fue comparada al siARNPTEN-lipoplejo así como a los grupos de control tratados con sucrosa (Figura 21 c). En un experimento adicional, el tratamiento sistémico de un xenoinjerto de tumor PC-3 s.c. de un crecimiento más lento con siARNCD31 "8 formulado de forma liposómica causó de manera similar un retraso significativo en el crecimiento del tumor en contraste al control de siARNPTE N (Figura 21 d). Tomados juntos, los experimentos del xenoinjerto in vivo muestran claramente que el crecimiento de las células tumorales en ratones desnudos puede ser suprimido por la administración sistémica de CD31 -siARNs formulado de forma liposómica. Estos datos también implican que CD31 (PECAM-1 ), un objetivo de fármaco no-clásico, parezca ser un blanco adecuado para la intervención terapéutica anti-angiogénica basada en ARNi. Los detalles de la Figura 21 a son como sigue. El control de calidad y prueba de eficacia del siARN lipoplejado usado para el tratamiento sistémico del tumor en HUVEC. La inmunotransferencia que usa el anticuerpo anti-CD31 reveló una reducción dependiente de la concentración de CD31 en el caso de s¡ARNCD31 "8, pero no con el control siARNPTEN. La reducción de CD31 no tuvo ningún efecto en la Pl 3-quinasa que se señala según lo revelado supervisando el estado de fosforilación de Akt (P*-Akt), en contraste al control de siARNPTEN. El nivel de la proteína CD34 no fue afectado. Los detalles de la Figura 21 b son como sigue. La influencia de dos diferentes dosis de siARN-lipoplejo en peso corporal fue supervisada. Diversas dosis de s¡ARNPTEN - lipoplejo (cuadros: inyección diaria dando por resultado 1 .88 mg/kg/d de siARN y 14.5 mg/kg/d de lípidos; diamantes: inyección bi-diaria (8h de intervalo), 3.75 mg/kg/d de siARN y 28.9 mg/kg/d, fueron administrados por siete días consecutivos, y los cambios en peso corporal fueron medidos y graficados como valor medio (n = 7 ratones). Por comparación, los pesos corporales (media ± S. E. M. ) de animales tratados con la solución isotónica de sucrosa (circuios) se muestran . Los detalles de las figuras 21 c y 21 d son como sigue. La inhibición del crecimiento del tumor por medio del tratamiento con CD31 -siARN-lipoplejo. Dos diferentes xenoinjertos de tumor (c: 3Y1 -Rasv 12, d: PC-3) fueron estabilizados s.c. en ratones desnudos (c: diagrama izquierdo: n = 8 ratones por grupo, derecho, n = 7 ratones por grupo; d: n = 8 por grupo). Los ratones portadores de tumores fueron tratados con siARNCD31 8-lipoplejo (diamantes), siARNPTEN-lipoplejos (triángulos) o sucrosa isotónica (esferas sólidas). Diferentes regímenes de tratamiento fueron aplicados según lo indicado; flecha única, diario; flechas dobles, bi-díariamente. (c) El crecimiento de los tumores 3Y1 -Rasv12 establecidos fue inhibido significativamente por siARNCD31 "8" lipoplejo cuando se compararó a siARNPTEN-lipoplejos aplicando el régimen de dosificación bi-diariamente (diagrama derecho), (d) El crecimiento de xenoinjertos PC-3 establecidos significativamente fue inhibido con siARNCD31 8lipoplejo en comparación con s¡ARNPTE N-lipoplejo tratado administrado como se indicó (1 .88 mg/kg/d de siARN; 14.5 mg/kg/d de lípídos; flecha). Los datos representan la media ± S. E. M. ; significación : *P < 0.05 de acuerdo a Mann-Whitney. Las referencias siguientes estaban inherentes a los ejemplos 23 a 28 y son incorporadas en la presente en su totalidad por referencia: 6. Elbashir, S. M. et al. Duplexes of 21 -nucleotide RNAs medíate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 41 1 , 494-8 (2001 ). 16. Czauderna, F. et al. Structural variations and stabilising modifications of synthetic siRNAs in mammalian cells. Nucleic Acids Res 31 , 2705-16 (2003). 17. Chiu, Y. L. & Rana, T. M. RNAi in human cells: basic structural and functional features of small interfering RNA. Mol Cell 10, 549-61 (2002). 18. Zelphati, O. & Szoka, F.C. , Jr. Mechanism of oligonucleotide reléase from cationic liposomes. Proc Nati Acad Sci USA 93, 1 1493-8 ( 1996). 19. Stambolic, y. et al. Negative regulation of PKB/Akt-dependent cell survival by the tumor suppressor PTEN . Cell 95, 29-39 (1 998). 20. Klippel, A. et al. Activation of phosphatidylinositol 3-kinase is sufficient for cell cycle entry and promotes cellular changes characteristic of oncogenic transformation. Mol Cell Biol 1 8, 5699- 71 1 (1 998) . 21 . Watt, S.M. , Gschmeissner, S. E. & Bates, P.A. PECAM-1 : its expression and function as a cell adhesión molecule on hemopoietic and endothelial cells. Leuk Lymphoma 17, 229-44 ( 1995). 22. Newman , P.J. et al. PECAM-1 (CD31 ) cloning and relation to adhesión molecules of the immunoglobulin gene superfamily. Science 247, 1219-22 (1990). 23. Han, N. & Madri, J.A. PECAM- 1 : oíd fríend, new partners. Curr Op/77 Cell Biol 15, 515-24 (2003). 24. Fox, S. B. & Harris, A. L. Histological quantitation of tumour angiogenesis. Apmis 112, 4 1 3-30 (2004). 25. Uzzan, B. , Nicolás, P. , Cucherat, M. & Perret, G.Y. Microvessel density as a prognostic factor in women with breast cáncer: a systematic review of the literature and meta-analysis. Cáncer Res 64, 2941 -55 (2004). 26. Weidner, N. , Semple, J . P. , Welch, W. R. & Folkman, J . Tumor angiogenesis and metastasis—correlation in invasive breast carcinoma. N Engl J Med 324, 1 -8 (1 991 ). 27. Man, N. , Mahooti, S. & Madri, J.A. Distinct signal transduction pathways are utilized during the tube formation and survival phases of in vitro angiogenesis. J Cell Sci 111 (Pt 24), 3621-31 (1998). 28. Solowiej , A. , Biswas, P. , Graesser, D. & Madri, J .A. Lack of platelet endothelial cell adhesión molecule-1 attenuates foreign body inflammation because of decreased angiogenesis. Am J Pathol 162, 953-62 (2003). 38. Leenders, F. et al. PKN3 is required for malignant prostate cell growth downstream of activated Pl 3-kinase. Embo J 23, 3303-1 3 (2004). 39. Klippel, A. , Escobedo, J.A. , Hirano, M. & Williams, L.T. The interaction of small domains between the subunits of phosphatidylinositol 3-kinase determines enzyme activity. Mol Cell Biol 14, 2675-85 (1994). 40. Santel, A. & Fuller, M.T. Control of mitochondrial morphology by a human mitofusin. J Cell Sci 1 14, 867-74 (2001 ).
Las características de la presente invención descritas en la especificación , las reivindicaciones y/o dibujos pueden separadamente y en combinación con cualquier de los mismos ser materiales para realizar la invención en varias formas de de los mismos.

Claims (1)

  1. REIVI NDICACIONES 1 . Un compuesto de acuerdo con la fórmula (I), en donde Ri y R2 son cada uno y seleccionados independientemente del grupo que consiste de alquilo; n es cualquier número entero entre 1 y 4; R3 es un acilo seleccionado del grupo que consiste de lisilo, ornitilo, 2,4-diaminobutirilo, histidilo y un radical acilo de acuerdo a la fórmula (I I), (ID en donde m es cualquier número entero de 1 a 3 e Y" es un anión farmacéuticamente aceptable. 2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde RT y R2 son cada uno y seleccionados independientemente del grupo que consiste de laurilo, miristilo, palmitilo y oleilo. 3. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde R^ es laurilo y R2 es miristilo; o Ri es palmitilo y R2 es oleilo. 4. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde m es 1 ó 2. 5. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el compuesto es un lípido catiónico, preferiblemente en asociación con un anión Y". 6. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde Y" se selecciona del grupo que consiste de halogenidos, acetato y trifluoroacetato. 7. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste de trihidrocloruro de N-palmitilo-N-oleil-amida del ácido ß-arginil-2,3-diamino propiónico trihidrocloruro de N-lauril-N-miristil-amida del ácido ß-arginil-2,3-diamino propiónico trihidrocloruro de e-arginil-lisina-N-lauril-N-miristil-amida 8. Una composición que comprende como componente lípido un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y un portador. 9. La composición de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la composición comprende un constituyente adicional, 10. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un compuesto farmacéuticamente activo y preferiblemente un portador farmacéuticamente aceptable. 1 1 . La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde el compuesto farmacéuticamente activo y/o el constituyente adicional se seleccionan del grupo que consiste de péptidos, proteínas, oligonucleótidos, polinucleótidos y ácidos nucleicos. 12. La composición de acuerdo con la reivindicación 1 1 , en donde la proteína es un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo monoclonal. 1 3. La composición de acuerdo con la reivindicación 1 1 , en donde es el ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste de ADN , ARN, PNA y LNA. 14. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 1 ó 1 3, en donde el ácido nucleico es un ácido nucleico funcional, por lo cual preferiblemente el ácido nucleico funcional es seleccionado del grupo que comprende ARNi, siARN, siAN, ácido nucleico antisentido, ribozimas, aptámeros y spiegelmeros. 1 5. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, además comprende al menos un componente lípido auxiliar, por lo cual preferiblemente el componente lípido auxiliar se selecciona del grupo que consiste de fosfolípidos y esteroides. 16. La composición de acuerdo con la reivindicación 1 5, en donde el componente lípido auxiliar se selecciona del grupo que consiste de 1 ,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina y 1 , 2-dioleil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina. 17. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 16, en donde el contenido del componente de l ípido auxiliar es de aproximadamente 20% mol a aproximadamente 80% mol del contenido total de lípido de la composición. 1 8. La composición de acuerdo con la reivindicación 17, en donde el contenido del componente de lípido auxiliar es de aproximadamente 35% mol a aproximadamente 65% mol. 19. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en donde el lípido es trihidrocloruro de N-palmitil-N-oleil-amida del ácido ß-arginil-2,3-diamino propiónico, y el l ípido auxiliar es 1 ,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina. 20. La composición de acuerdo con la reivindicación 19, en donde el l ípido es 50% mol y el lípido auxiliar es 50% mol del contenido total de lípido de la composición. 21 . La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 20, en donde la composición contiene al menos dos lípidos auxiliares. 22. La composición de acuerdo con la reivindicación 21 , en donde al menos un lípido auxiliar comprende un radical que se selecciona del grupo que consiste de un radical PEG, un radical HEG , un radical del almidón de polihidroxietilo (polyHES) y un radical de polipropileno, por lo cual tal radical proporciona preferiblemente un peso molecular de aproximadamente 500 a 10,000 Da, más preferiblemente de aproximadamente 2,000 a 5,000 Da. 23. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 22, en donde el lípido auxiliar que comprende el radical PEG se selecciona del grupo que consiste de 1 ,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, 1 ,2-dialquil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina; y Ceramide-PEG. 24. La composición de acuerdo con la reivindicación 23, en donde el radical PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 500 Da a 1 0,000 Da, preferiblemente de aproximadamente 2,000 a 5,000 Da, más preferiblemente un peso molecular de 2,000 Da. 25. La composición de acuerdo con la reivindicación 24, en donde la composición comprende como el componente lípido, trihidrocloruro de N-palmitil-N-oleil-amida del ácido ß-arginil-2,3-diamino propiónico, como un primer lípido auxiliar 2-difítanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, y como un segundo lípido auxiliar 1 ,2-disteroil-sn- glicero-3-fosfoetanolamina-PEG2000. 26. La composición de acuerdo con la reivindicación 25, en donde el contenido del segundo lípido auxiliar es de aproximadamente 0.05% mol a 4.9% mol, de manera preferible de aproximadamente 1 a 3% mol. 27. La composición de acuerdo con la reivindicación 26, en donde el contenido de lípido es desde 45% mol a 50% mol, el contenido del primer lípido auxiliar es desde 45 a 50% mol y, bajo la condición que haya un lípido auxiliar del segundo PEGilado, el contenido del segundo lípido auxiliar es aproximadamente 0.1 % mol a aproximadamente 5% mol, de manera preferible de aproximadamente 1 a 4% mol y de manera más preferible de aproximadamente 2%, por lo cual la suma del contenido de lípido, lípido, primer lípido auxiliar y segundo lípido auxiliar es 100% mol y por lo cual la suma del primer lípido auxiliar y segundo lípido auxiliar es 50% mol. 28. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 27, contiene: a) 50% mol de trihidrocloruro de N-palmitil-N-oleil-amida del ácido ß-arginil-2,3-diamino propiónico, 48% mol de 1 ,2-difitano¡l-sn-gUcero-3-fosfoetanolamina; y 2% mol de 1 ,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina- PEG2000. o b) 50% mol de trihidrocloruro de N-palmitil-N-oleil-amida del ácido ß-arginil-2,3-diamino propiónico, 49% mol de 1 ,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina; y 1 % mol de N(carbonil-metoxipolietilenglicol-2000)-1 ,2- diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, preferiblemente la sal de sodio del mismo. 29. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 28, en donde el ácido nucleico funcional es un ácido ribonucleico doble hebra, en donde la composición adicionalmente comprende un ácido nucleico, preferiblemente un ácido nucleico funcional que sea más preferiblemente un ácido ribonucleico doble hebra y más preferiblemente un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de ARNi, siARN, siAN, ácido nucleico antisentido y ribozima, por lo cual preferiblemente la proporción molar de ARNi al lípido catiónico es de aproximadamente 0 a 0.075, de manera preferible de aproximadamente 0.02 a 0.05 y aún más preferiblemente 0.037. 30. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 29, en donde el compuesto y/o el componente de lípido auxiliar está presente como una dispersión en un medio acuoso. 31 . La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 29, en donde el compuesto y/o el componente de lípido auxiliar está presente como solución en un solvente miscible en agua, por lo cual preferiblemente el solvente se selecciona del grupo que consiste de etanol y terc-butanol. 32. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 31 , en donde el ácido nucleico funcional es un ácido ribonucleico doble hebra, preferiblemente un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de ARNi , siARN, siAN , ácido nucleico antísentido y ribozima, y por lo cual la proporción molar de ARNi al lípido catiónico es de manera preferible de aproximadamente 0 a 0.075, de manera preferible de aproximadamente 0.02 a 0.05 y aún más preferiblemente 0.037. 33. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 32, preferiblemente 29 a 32, en donde la composición contiene un ácido nucleico, por lo cual la proporción de carga de los fosfatos de estructura del ácido nucleico a átomos de nitrógeno del lípido catiónico es de aproximadamente 1 : 1 .5-7, preferiblemente 1 :4. 34. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 33, preferiblemente 29 a 33, en donde el tamaño de las partículas en la dispersión es de aproximadamente 1 20 nm . 35. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 34, preferiblemente 29 a 34, en donde la dispersión es una dispersión común que contiene de aproximadamente 1 a 100 µM de ARNsi, por lo cual preferiblemente la dispersión común es diluida in vivo o in vitro por 1 : 1 00 a 1 : 1 0000, más preferiblemente 1 : 1 000. 36. Uso de compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 35, para la fabricación de un medicamento, preferiblemente para el tratamiento del cáncer y/o enfermedades relacionadas cardiovasculares. 37. Uso de acuerdo a la reivindicación 36, en donde el medicamento es para el tratamiento del cáncer, por lo cual preferiblemente el cáncer se selecciona del grupo que consiste de tumores sólidos y no-sólidos y por lo cual más preferiblemente el tumor sólido se selecciona del grupo que consiste de cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón , cáncer de colon y carcinoma hepatocelular. 38. Uso de acuerdo a la reivindicación 35 ó 36, en donde el cáncer involucra un proceso seleccionado del grupo que consiste de angiogénesis y neoangiogénesis. 39. Uso de acuerdo a la reivindicación 36, en donde el medicamento es para administrar el ácido nucleico a una célula seleccionada del grupo que consiste de células endoteliales, células epiteliales y células tumorales, preferiblemente la célula es una célula endotelial. 40. Uso de acuerdo a la reivindicación 39, en donde las células endoteliales son células endoteliales de la vasculatura. 41 . Uso de acuerdo a la reivindicación 40, en donde la vasculatura es la vasculatura que surge de la neoangiogénesis, preferiblemente la neoangiogénesis asociada al tumor. 42. Uso de acuerdo a la reivindicación 40, en donde la vasculatura se selecciona del grupo que consiste de vasculatura del h ígado, vasculatura del corazón, vasculatura del riñon, vasculatura pancreática y vasculatura del pulmón. 43. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 36 a 42, en donde el medicamento es para la administración sistémica. 44. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 36 a 42, en donde el medicamento es para la administración local. 45. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 36 a 44, en donde el medicamento es un agente de diagnóstico. 46. Uso de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 8 a 35, como un agente de transferencia. 47. Uso de acuerdo a la reivindicación 46, en donde el agente de transferencia transfiere un componente farmacéuticamente activo y/o un constituyente adicional en una célula, preferiblemente una célula de mam ífero y más preferiblemente una célula de humano. 48. Uso de acuerdo a la reivindicación 47, por el cual la célula es una célula endotelial, preferiblemente una célula endotelial asociada vascular. 49. Un método para transferir un compuesto farmacéuticamente activo y/o un constituyente adicional en una célula o a través de una membrana, preferiblemente una membrana celular, que comprende las siguientes etapas: proporcionar las células o la membrana; - proporcionar un compuesto de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; proporcionar el compuesto farmacéuticamente activo y/o el constituyente adicional; y poner en contacto la célula o membrana con el compuesto farmacéuticamente activo y/o el constituyente adicional, y el compuesto de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7. 50. Método para transferir un compuesto farmacéuticamente activo y/o un constituyente adicional en una célula o a través de una membrana, preferiblemente una membrana celular, que proporciona las siguientes etapas: proporcionar la célula o membrana; proporcionar una composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 8 a 35; y poner en contacto la célula o membrana con la composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 8 a 35. 51 . El método de acuerdo a reivindicaciones 49 y 50, en donde el compuesto farmacéuticamente activo comprende como etapa adicional: detectar el compuesto farmacéuticamente activo y/o constituyente adicional en la célula y/o más allá de la membrana. 52. Un método para la síntesis de N-palmitilo-oleilamina que comprende las siguientes etapas: proporcionar el ácido oléico; proporcionar palmitilamina; - hacer reaccionar el ácido oleico y palmitilamina para formar la N-palmitil-oleoilamida; y reducir la N-palmitil-oleoilamida a N-palmitil-oleilamina, por lo cual el ácido oleico es por lo menos 90%, más preferiblemente 95% y más preferiblemente 99% puro, por lo cual el porcentaje es la proporción molar del ácido oleico y cualquier ácido graso diferente del ácido oleico. 53. El método de acuerdo con la reivindicación 52, en donde el ácido oleico y palmitilamina son reaccionados a temperatura ambiente. 54. El método de acuerdo con la reivindicación 52 ó 53, en donde el ácido oleico es sometido a un pre-tratamiento antes de hacerlo reaccionar con la palmitilamina, por lo cual el pre-tratamiento comprende hacer reaccionar el ácido oleico con etilcloroformiato, preferiblemente en diclorometano anhidro o tetrahidrofurano anhidro. 55. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 52 a 54, en donde la reacción es realizada a 0°C, preferiblemente bajo gas inerte. 56. El método de acuerdo con las reivindicaciones 54 y 55, en donde la reacción se hace reaccionar adicionalmente con un barredor del ácido, por lo cual el barredor del ácido se selecciona preferiblemente del grupo que consiste de trietilamina, diisopropiletilamina y piridina. 57. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 52 a 56, en donde la proporción molar del etiléster del ácido clorofórmico, ácido oleico, trietilamina y palmitilamina es de aproximadamente 1 -1 .05: 1 : 1 : 1 -3: 1 -1 .10. 58. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 52 a 57, en donde la reducción de la N-palmitil-oleoilamida a N-palmitil-oleilamina se lleva a cabo utilizando LiAIH4. 59. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 52 a 57, en donde durante la reacción del ácido oleico con la palmitilamina, la reacción se lava, precipita y el precipitado así obtenido opcionalmente es recristalizado. 60. Uso de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 35 para la administración sistémica, preferiblemente la administración sistémica a un vertebrado. 61 . Uso de acuerdo con la reivindicación 60, en donde el vertebrado es un mamífero, más preferiblemente un mam ífero seleccionado del grupo que consiste de ratón, rata, cobayo, gato, perro, mono y hombre.
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