KR101356935B1 - 지질, 지질 복합체 및 이들의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하기 화학식(I)에 따른 화합물에 관한 것이다:
Figure 112006080780643-pct00022
(I)
식중에서, R1 및 R2 는 서로 독립적으로 알킬을 포함하는 군으로부터 선택되며; n은 1 내지 4의 정수이고; R3 은 리실, 오르니틸, 2,4-디아미노부티릴, 히스티딜 및 하기 화학식(II)
Figure 112006080780643-pct00023
(II) (이때 m은 1 내지 3의 정수임)에 따른 아실 잔기를 포함하는 군으로부터 선택되는 아실이며; Y- 는 약제학적으로 허용되는 음이온임.
양이온서 지질, 지질 복합체, 리포플렉스, 헬퍼 지질, 혈관계, 신생혈관형성, 종양, 기능적 핵산

Description

지질, 지질 복합체 및 이들의 용도{Lipids, lipid complexes and use thereof}
본 발명은 양이온성 지질, 이들을 함유하는 조성물 및 이들의 용도뿐만 아니라 화학 화합물을 세포로 전달하는 방법에 관한 것이다.
분자생물학뿐만 아니라 분자 의학은 생물학적 활성 화합물을 세포에 도입하는 것에 크게 의존하고 있다. 이러한 생물학적 활성 화합물은 전형적으로 DNA, RNA뿐만 아니라 펩티드와 단백질을 포함한다. 극복해야할 장애는 전형적으로 음으로 하전된 외면을 갖는 지질 이중층이다. 이 세포막을 침투해서 생물학적 활성 화합물을 도입하기 위한 다수의 수법이 이 기술분야에서 개발되어 왔다. 일부 방법은 실험실 용도를 착안하였지만, 의학 분야에서는 사용될 수 없었고 특히 약물 전달에는 적합하지 않았다. 예컨대 이 분야에서 공지된 엘렉트로포레이션(electroporation) 및 탄도적(ballistic) 방법은 생물학적 활성 화합물의 국소적 전달만을 허용할 뿐이다. 상기 지질 이중층 이외에 세포막들은 또한 트랜스포터(transporter) 계를 포함한다. 따라서, 생물학적 활성 화합물을 세포막을 통과하여 전달시키기 위하여 상기 유형의 트랜스포터 계를 이용하려는 노력이 경주되어 왔다. 그러나, 이러한 트랜스포터 계의 특이성 또는 교차반응성으로 인하여 이들의 이용은 일반적으로 적 용될 수 없는 방법이었다.
생물학적 활성 화합물을 세포로 전달하기 위한 이 기술분야에 기재된 보다 일반적으로 적용가능한 방법은 바이러스 벡터를 이용하는 것이다. 그러나, 바이러스 벡터는 일부 세포 유형에만 유전자를 효과적으로 전달하기 위해서 사용될 수 있다; 그러나 이들은 화학적으로 합성된 분자를 세포로 전달하기 위해서는 사용될 수 없다.
다른 방법은 소위 리포좀을 이용하는 것이었다(Bangham, J. Mol. Biol. 13, 238-252 참조). 리포좀은 물에서 양쪽친매성 지질과 결합되면 생성되는 소포이다. 리포좀은 전형적으로 동심원적으로 배열된 인지질 이중층을 포함한다. 층의 갯수에 따라서 리포좀은 소형 단층 소포, 다층 소포 및 대형 다층 소포로 분류될 수 있다. 리포좀은 친수성 화합물이 수성 중간층으로 혼입되게 하는 반면에, 소수성 화합물은 지질층으로 혼입되므로 효과적인 전달제로 밝혀졌다. 본 기술분야에서는 지질 배합물의 조성뿐만 아니라 그의 제조방법이 생성한 지질 응집물의 구조와 크기 및 리포좀에 영향을 줄 것이라고 잘 알려져 있다. 리포좀은 또한 양이온성 지질을 혼입하는 것으로 알려져 있다.
양이온성 지질은, 리포좀의 성분인 점 이외에, 생물중합체(biopolymer)의 세포 전달에 이용될 수 있기 때문에 상당한 관심을 끌고 있다. 양이온성 지질을 사용하면 정전 작용으로 인하여 음이온성 화합물이 거의 정량적으로 캡슐화될 수 있다. 또한, 양이온성 지질은 음으로 하전된 세포막과 상호작용하여서 세포막 수송을 개시하는 것으로 믿어진다. 양이온 지질을 함유하는 리포좀 배합물의 사용 또는 생물 학적 활성 화합물과 함께 양이온성 지질을 사용하는 것은 각 배합물이 통상 혈청 부재하에서 전형적으로 플라스미드를 모든 세포 유형이 아닌 일부 세포 유형에만 전달할 수 있기 때문에 탐구적 방법을 필요로 한다.
수송될 지질 및 생물학적 활성 화합물의 전하 및/또는 중량비는 상이한 유형의 생물학적 활성 화합물을 전달하는데 있어 중요한 인자인 것으로 드러났다. 예컨대, 5,000 내지 10,000 염기 크기를 포함하는 플라스미드 전달에 적합한 지질 배합물은 전형적으로 약 10 내지 약 50 염기를 포함하는 합성 리보자임 또는 안티센스 분자와 같은 올리고뉴클레오티드의 전달에 일반적으로 효과적이지 않다는 것이 알려져 있다. 또한 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 리보자임에 대한 최적 전달 조건은 동일 세포 유형에서도 상이한 것이 밝혀졌다.
미국특허 6,395,713호는 친유성 기, 링커 및 헤드(head) 기로 구성된 양이온성 지질계 조성물 및 생물학적 활성 화합물을 세포로 전달하기 위한 이러한 조성물의 용도를 개시하고 있다.
본 발명의 기본 문제는 생물학적 활성 화합물을 세포로, 바람직하게는 동물 세포로 도입하기 위한 수단을 제공하는 것이었다. 본 발명의 다른 문제는 핵산, 특히 siRNA, siNA 및 RNAi와 같은 소형 핵산 또는 아프타머(aptamer) 및 스피겔머에 대한 전달제를 제공하는 것이다.
이들 문제는 본 명세서에 첨부한 특허청구범위의 독립항의 청구객체에 의해 해결된다. 바람직한 구체예는 첨부한 특허청구범위 종속항으로부터 취할 수 있다.
제1 요지로서 본 발명의 문제는 하기 화학식(I)에 따른 화합물에 의해 해결된다:
Figure 112006080780643-pct00001
식중에서,
R1 및 R2 는 서로 독립적으로 알킬을 포함하는 군으로부터 선택되며;
n은 1 내지 4의 정수이고;
R3 은 리실, 오르니틸, 2,4-디아미노부티릴, 히스티딜 및 하기 화학식(II)
Figure 112012032184601-pct00002
(II) (이때 m은 1 내지 3의 정수이며, Y- 는 약제학적으로 허용되는 음이온임)에 따른 아실 잔기를 포함하는 군으로부터 선택되는 아실이이다.
삭제
삭제
일 구체예로서, R1 및 R2 는 서로 독립적으로 라우릴, 미리스틸, 팔미틸 및 올레일을 포함하는 군으로부터 선택된다.
일 구체예로서, R1 은 라우릴이고 또 R2 는 미리스틸이며; 또는 R1 은 팔미틸 이고 또 R2 는 올레일이다.
일 구체예로서, m은 1 또는 2이다.
일 구체예로서, 상기 화합물은 바람직하게는 음이온 Y- 과 조합된 양이온성 지질이다.
일 구체예로서, Y- 는 할로게나이드, 아세테이트 및 트리플루오로아세테이트를 포함하는 군으로부터 선택된다.
일 구체예로서, 상기 화합물은 다음 군으로부터 선택된다:
- β-아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드
Figure 112006080780643-pct00003
- β-아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-라우릴-N-미리스틸-아미드 트리히드로클로라이드
Figure 112006080780643-pct00004
및
- ε-아르기닐-리신-N-라우릴-N-미리스틸-아미드 트리히드로클로라이드
Figure 112006080780643-pct00005
제2 요지로서 본 발명의 문제는 지질 성분으로서 제1 요지에 따른 화합물 및 담체를 포함하는 조성물에 의해 해결된다.
일 구체예로서, 상기 조성물은 추가의 성분도 포함한다.
제3 요지로서 본 발명의 문제는 제1 요지에 따른 화합물 및 약제학적 활성 화합물 및 바람직하게는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 의해 해결된다.
제2 및 제3 요지의 일 구체예로서, 약제학적 활성 화합물 및/또는 추가의 성분은 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 및 핵산을 포함하는 군으로부터 선택된다.
제2 및 제3 요지의 일 구체예로서, 상기 단백질은 항체, 바람직하게는 단일클론 항체이다.
제2 및 제3 요지의 일 구체예로서, 상기 핵산은 DNA, RNA, PNA 및 LNA를 포함하는 군으로부터 선택된다.
제2 및 제3 요지의 일 구체예로서, 상기 핵산은 기능적 핵산이며, 바람직하게는 상기 기능적 핵산은 RNAi, siRNA, siNA, 안티센스 핵산, 리보자임, 아프타머 및 스피겔머를 포함하는 군으로부터 선택된다.
제2 및 제3 요지의 일 구체예로서, 상기 조성물은 또한 1 이상의 헬퍼 지질 성분을 더 포함하며, 바람직하게는 상기 헬퍼 지질 성분은 인지질 및 스테로이드를 포함하는 군으로부터 선택된다.
제2 및 제3 요지의 일 구체예로서, 상기 헬퍼 지질 성분은 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 및 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민을 포함하는 군으로부터 선택된다.
제2 및 제3 요지의 일 구체예로서, 상기 헬퍼 지질 성분의 함량은 조성물의 전체 지질 함량의 약 20 몰% 내지 약 80몰%이다.
제2 및 제3 요지의 바람직한 구체예로서, 상기 헬퍼 지질 성분의 함량은 약 35몰% 내지 약 65몰%이다.
제2 및 제3 요지의 일 구체예로서, 상기 지질은 β-아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드이고 또 헬퍼 지질은 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민이다.
제2 및 제3 요지의 바람직한 구체예로서, 상기 지질은 50몰%이고 또 헬퍼 지질은 조성물의 전체 지질 함량의 50몰%이다.
제2 및 제3 요지의 일 구체예로서, 상기 조성물은 2 이상의 헬퍼 지질을 함유한다.
제2 및 제3 요지의 바람직한 구체예로서, 1 이상의 헬퍼 지질은 PEG 잔기, HEG 잔기, 폴리히드록시에틸 녹말(polyHES) 잔기 및 폴리프로필렌 잔기를 포함하는 군으로부터 선택되는 잔기를 포함하고, 이러한 잔기는 바람직하게는 약 500 내지 10000 Da, 보다 바람직하게는 약 2000 내지 5000 Da의 분자량을 제공한다.
제2 및 제3 요지의 바람직한 구체예로서, PEG 잔기를 포함하는 헬퍼 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디알킬-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 및 세라미드-PEG를 포함하는 군으로부터 선택된다.
제2 및 제3 요지의 보다 바람직한 구체예로서, PEG 잔기는 약 500 Da 내지 10000 Da의 분자량, 바람직하게는 약 2,000 내지 5,000 Da, 보다 바람직하게는 2,000 Da의 분자량을 갖는다.
제2 및 제3 요지의 더욱 바람직한 구체예로서, 상기 조성물은 지질 성분으로서 β-아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드, 제1 헬퍼 지질로서 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 및 제2 헬퍼 지질로서 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-PEG2000을 포함한다.
제2 및 제3 요지의 더욱 더 바람직한 구체예로서, 제2 헬퍼 지질의 함량은 약 0.05 몰% 내지 4.9 몰%, 바람직하게는 약 1 내지 3몰%이다.
제2 및 제3 요지의 더욱 더 바람직한 구체예로서, 지질의 함량은 45몰% 내지 50몰%이고, 제1 헬퍼 지질의 함량은 45 내지 50몰%이며, 단 페길화된(PEGylated) 제2 헬퍼 지질이 있는 경우, 제2 헬퍼 지질의 함량은 약 0.1몰% 내지 약 5몰%, 바람직하게는 약 1 내지 4몰%, 더욱 바람직하게는 약 2%이며, 지질의 함량, 제1 헬퍼 지질의 함량 및 제2 헬퍼 지질의 함량의 총합은 100몰%이며 제1 헬퍼 지질 및 제2 헬퍼 지질의 합은 50몰%이다.
제2 및 제3 요지의 바람직한 구체예로서, 상기 조성물은
a) β-아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드 50몰%,
1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 48몰%; 및
1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-PEG2000 2몰%를 함유하거나, 또는
b) β-L-아르기닐-2,3-L-디아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드 50몰%,
1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 49몰%; 및
N(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 바람직하게는 그의 나트륨 염 1몰%를 함유한다.
제2 및 제3 요지의 바람직한 구체예로서, 기능적 핵산은 이중쇄 리보핵산이며, 상기 조성물은 핵산, 바람직하게는 이중쇄 리보핵산인 기능적 핵산, 가장 바람직하게는 RNAi, siRNA, siNA, 안티센스 핵산 및 리보자임을 포함하는 군으로부터 선택되는 핵산을 더 포함하며, 바람직하게는 양이온성 지질에 대한 RNAi 몰비는 약 0 내지 0.075, 바람직하게는 약 0.02 내지 0.05, 더욱 바람직하게는 0.037 이다.
제2 및 제3 요지의 바람직한 구체예로서, 상기 화합물 및/또는 헬퍼 지질 성분은 수성 매질 중에 분산액으로 존재한다.
제2 및 제3 요지의 바람직한 구체예로서, 상기 화합물 및/또는 헬퍼 지질 성분은 수혼화성 용매 중의 용액으로 존재하며, 바람직하게는 상기 용매는 에탄올 및 tert-부탄올을 포함하는 군으로부터 선택된다.
제2 및 제3 요지의 바람직한 구체예로서, 상기 기능적 핵산은 이중쇄 리보핵산, 바람직하게는 RNAi, siRNA, siNA, 안티센스 핵산 및 리보자임을 포함하는 군으로부터 선택된 핵산이고, 바람직하게는 양이온성 지질에 대한 RNAi의 몰비는 약 0 내지 0.075, 바람직하게는 약 0.02 내지 0.05, 더욱 바람직하게는 0.037 이다.
제2 및 제3 요지의 바람직한 구체예로서, 상기 조성물은 핵산을 함유하며, 상기 핵산 주쇄 포스페이트 대 양이온 지질 질소원자의 전하 비는 약 1:1,5-7, 바람직하게는 1:4 이다.
제2 및 제3 요지의 바람직한 구체예로서, 분산액 중의 입자의 크기는 약 120 nm 이다.
제2 및 제3 요지의 바람직한 구체예로서, 상기 분산액은 약 1 내지 100 μM siRNA를 함유하는 스톡(stock) 분산액이고, 바람직하게는 상기 스톡 분산액은 생체내 또는 시험관에서 1:100 내지 1:10000, 보다 바람직하게는 1:1000 로 희석된다.
제4 요지로서 본 발명의 문제는 제1 요지에 따른 화합물 또는 제2 또는 제3 요지에 따른 조성물의 바람직하게는 암 및/또는 심혈관 관련 질병의 치료용 의약 제조를 위한 용도에 의해 해결된다.
제4 요지의 일 구체예로서, 의약은 암 치료용이며, 바람직하게는 상기 암은 고형암 및 비고형암을 포함하는 군으로부터 선택되며 또 보다 바람직하게는 상기 고형암은 췌장암, 유방암, 전립선암, 폐암, 대장암 및 간암을 포함하는 군으로부터 선택된다.
제4 요지의 일 구체예로서, 상기 암은 혈관형성 및 신생혈관형성을 포함하는 군으로부터 선택된다.
제4 요지의 일 구체예로서, 상기 의약은 핵산을 내피세포, 상피세포 및 종양세포를 포함하는 군으로부터 선택되는 세포에 투여하기 위한 것이고, 바람직하게는 상기 세포는 내피세포이다.
제4 요지의 일 구체예로서, 상기 내피세포는 혈관계의 내피세포이다.
제4 요지의 일 구체예로서, 혈관계는 혈관형성, 바람직하게는 종양 관련 신생혈관형성에 기인한 혈관계이다.
제4 요지의 일 구체예로서, 혈관계는 간 혈관계, 심장 혈관계, 신장 혈관계, 췌장 혈관계 및 폐 혈관계를 포함하는 군으로부터 선택된다.
제4 요지의 일 구체예로서, 의약은 전신투여용이다.
제4 요지의 일 구체예로서, 의약은 국소투여용이다.
제4 요지의 일 구체예로서, 의약은 심혈관 관련 질환의 치료용이며, 상기 심혈관 질환은 관상동맥 심장질환, 심부전, 고혈압, 혈전증, 심근경색, 허혈성 심장질환, 예컨대 협심증 및 동맥경화증을 포함하는 군으로부터 선택된다.
제4 요지의 일 구체예로서, 의약은 신생혈관형성 관련 질환의 치료용이다. 바람직하게는 이러한 혈관형성은 다음 기관 및 질환과 관련이 있으며, 혈관형성은 이러한 질병을 유발하는 것으로 기재되어 있으므로 본 발명에 따른 조성물의 사용을 허용한다(Carmeliet P., Nature medicine 9, 653 - 660 (2003)):
혈관: 혈관 이상형성, 디죠지 증후군, HHT, 해면혈관종, 동맥경화증, 이식 동맥병증, 고혈압, 당뇨병, 재협착
지방 조직: 비만
피부: 건선, 사마귀, 알레르기 피부염, 상처 켈로이드, 발열성 과립종, 수포성 질환, AIDS 환자에서 카포씨 육종, 탈모, 피부 자색반점, 모세혈관확장, 정맥호 형성
눈: 지속 증식성 유리체 증후군, 당뇨병 망막병증, 미숙아망막병증, 맥락막 혈관신생
폐: 일차 폐동맥 고혈압, 천식, 코 폴립, 신생아 호흡 장애, 폐 섬유증, 폐기종
장: 염증성 장 및 치주병, 복수, 복막유착
생식계: 자궁내막증, 자궁출혈, 난소낭, 자궁과다자극반응, 자간전증
뼈, 관절: 관절염, 윤활막염, 골수염, 골극형성, 골다공증, 손상된 뼈 골절 치유
신경계: 알츠하이머 질병, 근위축측삭경화증, 당뇨병 신경병증, 뇌졸증
위장관: 위 또는 경구 궤양, 크론씨 병
신장: 콩팥병증
제5 요지로서 본 발명의 문제는 제1 요지에 따른 화합물 및/또는 제2 요지 및/또는 제3 요지에 따른 조성물을 진단제 제조용으로 사용하는 것에 의해 해결된다.
제6 요지로서 본 발명의 문제는 제1 요지에 따른 화합물 및/또는 제2 요지 및/또는 제3 요지에 따른 조성물을 전달제로서 사용하는 것에 의해 해결된다.
제6 요지의 일 구체예로서, 전달제는 약제학적 활성 성분 및/또는 추가의 성분을 세포, 바람직하게는 포유동물 세포 및 바람직하게는 인간 세포로 전달한다.
제6 요지의 일 구체예로서, 상기 세포는 내피세포, 바람직하게는 혈관 관련 내피세포이다.
제7 요지로서 본 발명의 문제는 약제학적 활성 화합물 및/또는 추가의 성분을 세포로 또는 막, 바람직하게는 세포 막을 통과하게 전달하는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 해결된다:
- 세포 또는 막을 제공하는 단계;
- 제1 요지에 따른 화합물을 제공하는 단계;
- 약제학적 활성 화합물 및/또는 추가의 성분을 제공하는 단계;
- 상기 세포 또는 막을 약제학적 활성 화합물 및/또는 추가의 성분 및 제1 요지에 따른 화합물과 접촉시키는 단계.
제8 요지로서 본 발명의 문제는 약제학적 활성 화합물 및/또는 추가의 성분을 세포로 또는 막, 바람직하게는 세포 막을 통과하게 전달하는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 해결된다:
- 세포 또는 막을 제공하는 단계;
- 제2 요지 또는 제3 요지에 따른 조성물을 제공하는 단계;
- 상기 세포 또는 막을 제2 또는 제3 요지에 따른 조성물과 접촉시키는 단계.
제7 또는 제8 요지의 일 구체예로서, 약제학적 활성 화합물은,
- 세포 및/또는 막 근처에서 약제학적 활성 화합물 및/또는 추가의 성분을 검출하는 단계를 더 포함한다.
제9 요지로서 본 발명의 문제는
- 올레산을 제공하는 단계;
- 팔미틸아민을 제공하는 단계;
- 올레산 및 팔미틸아민을 반응시켜 N-팔미틸-올레오일아미드를 형성하는 단계;
- 상기 N-팔미틸-올레오일아미드를 N-팔미틸-올레일아민으로 환원시키는 단계를 포함하며, 상기 올레산은 적어도 90%, 보다 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 99% 순수하고 또 이 %는 올레산 대 올레산 이외의 지방산의 몰비인,
N-팔미틸-올레일아민의 합성 방법에 의해 해결된다.
제9 요지의 일 구체예로서, 올레산 및 팔미틸아민은 실온에서 반응한다.
제9 요지의 일 구체예로서, 올레산은 팔미틸아민과 반응하기 전에 전처리될 수 있고, 상기 전처리는 올레산을 무수 디클로로메탄 또는 무수 테트라히드로푸란 중의 에틸클로로포르메이트와 반응시키는 것을 포함한다.
제9 요지의 일 구체예로서, 상기 반응은 0℃, 바람직하게는 불활성 가스 하에서 실시된다.
제9 요지의 일 구체예로서, 상기 반응은 산 분해제와 반응할 수 있고, 상기 산 분해제는 바람직하게는 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민 및 피리딘을 포함 하는 군으로부터 선택된다.
제9 요지의 일 구체예로서, 클로로포름산 에틸 에스테르, 올레산, 트리에틸아민 및 팔미틸아민의 몰비는 약 1-1.05: 1: 1: 1-3: 1-1.10 이다.
제9 요지의 일 구체예로서, N-팔미틸-올레오일아미드를 N-팔미틸-올레일아민으로 환원시키는 것은 LiAlH4 를 사용하여 실시한다.
제9 요지의 일 구체예로서, 올레산이 팔미틸아민과 반응하면, 그 반응물은 세척되고, 석출되며 경우에 따라 재결정화된다.
제10 요지에서 본 발명의 문제는 제1 요지에 따른 화합물 또는 제2 요지 또는 제3 요지에 따른 조성물을 전신투여용으로, 바람직하게는 척추동물에 대한 전신 투여용으로 사용하는 것에 의해 해결된다.
제10 요지의 일 구체예로서, 척추동물은 포유동물, 보다 바람직하게는 마우스, 쥐, 기니아 피그, 고양이, 개, 원숭이 및 인간을 포함하는 군으로부터 선택된 포유동물이다.
본 발명에 따른 화합물은 도 1에 도시된 바와 같이 R1-N-R2 잔기에 의해 형성된 친유성 기, C(O)-CH(NH3 +)(CH2)n-NH 잔기에 의해 형성된 링커 기 및 R3 잔기에 의해 형성된 헤드 기를 포함하는 것으로 간주된다. 본 발명자들은 링커 기에서 양 전하를 나타내는 화합물 종류는 생물학적 활성 화합물을 세포막으로, 바람직하게는 세포로, 보다 바람직하게는 동물 세포로 전달하기에 특히 적합하다는 것을 최근에 밝혀내었다. 또한 본 발명자들은 놀랍게도 본 발명에 따른 화합물에 의해 매개된 전달은 생물학적 활성 화합물이 핵산, 보다 바람직하게는 siRNA 및 siNA일 때 특히 효과적임이 밝혀졌다.
본 명세서에서 바람직하게 사용된 바와 같이, 용어 알킬은 8 내지 20개 탄소원자, 바람직하게는 12 내지 18개 탄소원자를 함유하는 포화 지방족 라디칼, 또는 8 내지 30개 탄소원자를 함유하고, 1 이상의 이중결합 및 삼중결합을 함유하는 단일- 또는 다중불포화 지방족 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 따라서, 바람직한 구체예로서, 용어 알킬은 알케닐 및 알키닐을 포함한다. 알킬은 측쇄 및 비측쇄 모두를 지칭하며, 즉 비-선상 또는 직쇄 알킬 기를 지칭한다. 바람직한 직쇄 알킬 기는 8 내지 30개 탄소원자를 함유한다. 보다 바람직한 직쇄 알킬 기는 12 내지 18개 탄소원자를 함유한다. 바람직한 측쇄 알킬 기는 8 내지 30개 탄소원자를 함유하며, 8 내지 30개 탄소원자의 갯수는 이러한 측쇄 알킬 기의 주쇄를 형성하는 탄소원자의 갯수를 지칭한다. 측쇄 알킬 기의 주쇄는 1 이상의 알킬 기를 주쇄로부터 떨어진 분지로서 함유하며, 상기 알킬기는 본 명세서에서 정의된 바와 같고, 보다 바람직하게는 알킬 기는 단쇄 알킬 기, 보다 바람직하게는 1 내지 6개, 더욱 바람직하게는 1 내지 3개, 가장 바람직하게는 1개의 C 원자를 갖는다. 주쇄에 12 내지 18개 탄소원자를 함유하는 측쇄 알킬 기가 보다 바람직하며, 이때 분기 알킬 기는 상기 정의된 바와 같다. 특히 바람직한 알킬 기는 피타닐 기이다.
다른 구체예로서, 알킬은 상기 정의된 바와 같은 불포화 측쇄 또는 비측쇄 알킬 기이다. 보다 바람직하게는, 이러한 불포화 지방족 탄화수소 라디칼은 1, 2 또는 3 또는 4개의 이중결합을 함유하며, 1개의 이중결합을 갖는 라디칼이 특히 바 람직하다. 보다 바람직하게는 C18: 1델타9인 올레일이며, 즉 18개 탄소원자를 갖는 지방족 탄화수소 라디칼이며, 9 위치에서는 C 원자 번호 9를 C 원자 번호 10에 결합시키는 단일 결합 보다 cis 구조 이중결합으로 나타난다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, n은 1 내지 4의 정수이며, 이는 n이 1, 2, 3 또는 4일 수 있음을 의미한다. 본 명세서에 정의된 바와 같이, m은 1 내지 3의 정수이며, 이는 m이 1, 2 또는 3일 수 있음을 의미한다.
본 발명에 따른 화합물은 바람직하게는 양이온성 지질이라는 것을 알 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 화합물에 존재하는 NH 또는 NH2 기는 양성자화된 형태로 존재한다. 전형적으로, 본 발명에 따른 화합물의 양전하는 음이온의 존재에 의해 보상된다. 이러한 음이온은 일가 또는 다가 음이온일 수 있다. 바람직한 음이온은 할라이드, 아세테이트 및 트리플루오로아세테이트이다. 할라이드는 바람직하게는 플루오라이드, 클로라이드, 요오다이드 및 브로마이드이다. 가장 바람직한 것은 클로라이드이다. 양이온성 지질 및 세포에 전달될 생물학적 활성 화합물이 결합되면, 생물학적 활성 화합물의 전체 전하가 반드시 음이온일 필요는 없지만, 할라이드 음이온은 생물학적 활성 화합물에 의해 치환되어서 바람직하게는 1 또는 몇 개의 음전하를 나타낸다.
화학식(I)에 따른 화합물은 2 이상의 비대칭 C 원자를 포함한다. 본 발명에서 이러한 화합물의 가능한 에난티오머, 특히 R-R; S-S; R-S 및 S-R 에난티오머가 개시되어 있다.
본 발명에 따른 화합물은 조성물을 형성하거나 또는 조성물의 일부일 수 있고, 그러한 조성물은 담체를 포함한다. 지질 조성물로도 불리는 이러한 조성물에서, 본 발명에 따른 화합물은 지질 성분으로 지칭된다. 이러한 담체는 바람직하게는 액체 담체이다. 바람직한 액체 담체는 수성 담체 및 비수성 담체이다. 바람직한 수성 담체는 물, 수성 완충액계, 보다 바람직하게는 생리학적 완충 세기 및 생리학적 염 농도를 갖는 완충액 계이다. 바람직한 비 수성 담체는 용매, 바람직하게는 유기 용매, 예컨대 에탄올, tert-부탄올이다. 어떠한 이론에 얽매이지 않고, 수 혼화성 유기 용매가 주로 사용될 수 있다. 상기 조성물, 보다 특히 지질 조성물은 리포좀으로 존재하거나 또는 리포좀을 형성할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 1 이상의 헬퍼 지질을 포함할 수 있으며, 이후 본 명세서에서는 이들을 헬퍼 지질 성분으로 칭한다. 헬퍼 지질 성분은 바람직하게는 인지질 및 스테로이드를 포함하는 군으로부터 선택된다. 인지질은 바람직하게는 인산의 이- 및 일에스테르이다. 인지질의 바람직한 구성원은 포스포글리세리드 및 스핀고지질이다. 본 명세서에 사용된 스테로이드는 부분적으로 수소화된 시클로펜타[a]페난트렌을 기본으로 하는 천연 산출 및 합성 화합물이다. 바람직하게는, 스테로이드는 21 내지 30개 C 원자를 함유한다. 특히 바람직한 스테로이드는 콜레스테롤이다.
특히 바람직한 헬퍼 지질은 1,2-디피타놀-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPhyPE) 및 1,2-디올레오일-sn- 글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 이다.
본 발명에 따른 특히 바람직한 조성물은 β-아르기닐-2,3-디아미노 프로피온 산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드 [#6], β-아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-라우릴-N-미리스틸-아미드 트리히드로클로라이드 [#11] 또는 ε-아르기닐-리신-N-라우릴-N-미리스틸-아미드 트리히드로클로라이드 [#15]의 하나를 DPhyPE와 조합하여 포함하며, DPhyPE의 함량은 바람직하게는 80몰%, 65몰%, 50몰% 및 35몰%이고, 용어 몰%는 조성물의 전체 지질 함량%, 즉 양이온성 지질 및 비제한적인 예로서 헬퍼 지질을 비롯한 부가적인 지질을 포함한 본 발명에 따른 조성물의 지질 함량을 지칭한다.
본 발명의 범위에서 본 발명에 따른 조성물은 바람직하게는 본 발명에 따른 화합물 및/또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 1 이상의 헬퍼 지질을 포함하며, 본 발명에 따른 화합물, 즉 양이온성 지질 및/또는 헬퍼 지질 성분은 수성 매질 중의 분산액으로 존재한다. 다르게는, 본 발명에 따른 화합물, 즉 양이온성 지질, 및/또는 헬퍼 지질 성분은 수 혼화성 용매 중의 용액으로 존재한다. 수성 매질로서는, 바람직하게는 본 명세서에 기재된 바와 같은 수성 담체를 사용할 수 있다. 바람직한 수 혼화성 용매는 물과 임의 비율로 균질 상을 형성하는 용매이다. 바람직한 용매는 에탄올 및 tert-부탄올이다. 조성물, 보다 특히 지질 조성물은 리포좀으로 존재하거나 리포좀을 형성하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 따른 조성물은 다양한 구체예에서 약제학적 조성물로서 사용되는 것이 알려져 있다. 후자의 경우, 약제학적 조성물은 약제학적 활성 화합물 및 경우에 따라 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 이러한 약제학적으로 허용되는 담체는 바람직하게는 본 발명에 따른 조성물과 관련하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 담체군으로부터 선택될 수 있다. 당업자들이라면 본 명세서에 기재된 어떤 조성물도 그의 성분 및 그의 조합이 약제학적으로 허용되는 것인 한 약제학적 조성물로서 사용될 수 있음을 알 고 있을 것이다. 약제학적 조성물은 약제학적 활성 화합물을 포함한다. 이러한 약제학적 활성 화합물은 본 발명에 따른 조성물의 추가 성분과 동일할 수 있으며, 바람직하게는 생물학적 활성 화합물, 보다 바람직하게는 본 명세서에 기재된 바와 같은 생물학적 활성 화합물일 수 있다. 추가 성분, 약제학적 활성 화합물 및/또는 생물학적 활성 화합물은 바람직하게는 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 및 핵산을 포함하는 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 이러한 생물학적 활성 화합물은 음으로 하전된 분자이다. 용어 음으로 하전된 분자는, 어떠한 이론에 얽매이지 않고서, 본 발명에 따른 양이온성 지질의 양전하와 이온쌍을 형성할 수 있는 1 이상의 음으로 하전된 기를 갖는 분자를 포함하는 것으로 이해한다. 원칙적으로, 링커 분자에 있는 양전하는 지질 자체 또는 양이온 지질과 음으로 하전된 분자 사이에 형성된 복합체, 즉 생물학적 활성 화합물의 전체 구조에 어떠한 영향을 줄 것이다. 또한, 미국특허 6,395,713호에 개시된 양이온성 지질과 비교하여 본 발명에 따른 지질에 도입된 추가적인 양전하는 Xu Y, Szoka FC Jr.; Biochemistry; 1996 May 07, 35 (18): 5616-23에 시사된 바와 같이 지질의 독성 증가에 관여함에 틀림없다. 당업자들이 종래 기술인 상기 문헌으로부터 예상할 수 있는 것과 대조적으로, 본 발명에 따른 화합물은 본 명세서에 개시된 다양한 목적에 특히 적합하며 독성 증가를 나타내지 않는다.
펩티드는 바람직하게는 펩티드 결합을 통하여 서로 공유적으로 결합된 2 이 상의 아미노산으로 구성된 중합체이다. 보다 바람직하게는, 펩티드는 2 내지 10개 아미노산으로 구성된다. 펩티드의 특히 바람직한 구체예는 약 10 내지 약 100개 아미노산을 포하하는 올리고뉴클레오티드이다. 본 명세서에서 말하는 단백질은 서로 공유적으로 결합된 복수개의 아미노산으로 구성된 중합체이다. 바람직하게는 이러한 단백질은 약 100개 아미노산 또는 아미노산 잔기를 포함한다.
양이온성 지질 및 본 발명에 따른 조성물과 조합되어 사용될 수 있는 바람직한 단백질은 항체, 바람직하게는 단일클론 항체이다.
특히 바람직한 생물학적 활성 화합물, 즉 약제학적 활성 화합물 및 본 발명에 따른 조성물과 관련하여 사용되는 추가의 성분은 핵산이다. 이러한 핵산은 DNA, RNA, PNA 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 보다 바람직하게는 핵산은 기능적 핵산이다. 본 발명에서 말하는 기능적 핵산은 헵티드 및 단백질을 암호화하는 핵산이 아닌 핵산이다. 바람직한 기능적 핵산은 이 기술분야에서 모두 공지된 siRNA, siNA, RNAi, 안티센스 핵산, 리보자임, 아프타머 및 스피겔머이다.
siRNA는 국제특허출원 PCT/EP03/08666호에 기재된 바와 같은 소형 간섭 RNA이다. 이들 분자는 전형적으로 서로 염기 쌍을 이루며, 즉 서로에 대해 상보적이며, 전형적으로 왓슨-크릭 염기 쌍 형성에 의해 중재되는 것과 같은 15 내지 25개, 바람직하게는 18 내지 23개 뉴클레오티드 쌍을 포함하는 이중쇄 RNA 구조로 구성된다. 이 이중쇄 RNA 분자의 1쇄는 주로 표적 핵산, 바람직하게는 mRNA에 대하여 상보적인 반면에, 상기 이중쇄 RNA 분자의 제2쇄는 상기 표적 핵산의 스트레치와 동일하다. siRNA 분자는 각 측면 및 각 스트레치 상에서 다수의 부가적인 올리고뉴클 레오티드에 의해 측면을 접하고 있지만, 각각과 반드시 염기쌍을 이루어야 하는 것은 아니다.
RNAi는 실질적으로 siRNA와 동일한 디자인이지만, 분자는 siRNA와 비교하여 현저하게 길다. RNAi 분자는 전형적으로 50개 이상의 뉴클레오티드 및 염기 쌍을 각각 포함한다.
siRNA 및 RNAi와 동일한 작용 모드를 기초로 하는 활성인 기능적 핵산류는 siNA이다. siNA는 예컨대 국제특허출원 PCT/EP03/074654호에 기재되어 있다. 보다 특히, siNA는 siRNA에 상응하며, siNA 분자는 리보뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 안티센스 핵산은 표적 RNA, 바람직하게는 mRNA와 염기 상보성을 기초로 하여 혼성화(hybridise)되어 RNAseH를 활성화하는 올리고뉴클레오티드이다. RNaseH는 포스포디에스테르 및 포스포티오에이트-결합된 DNA에 의해 활성화된다. 그러나 포스포디에스테르-결합된 DNA는 포스포티오에이트-결합된 DNA을 제외하고는 세포 뉴클레아제에 의해 급속하게 분해된다. 안티센스 폴리뉴클레오티드는 DNA-RNA 하이브리드 복합체로서만 효과적이다. 안티센스 핵산의 바람직한 길이는 16 내지 23개 뉴클레오티드 범위이다. 상기 종류의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 예는 예컨대 미국특허 5,849,902호 및 미국특허 5,989,912호에 기재되어 있다.
기능적 핵산의 다른 군은 2개 잔기를 기본적으로 포함하는 RNA로 구성된 촉매적 활성 핵산인 리보자임이다. 제1 잔기는 촉매 활성을 나타내는 반면에, 제2 잔 기는 표적 핵산과 특정 상호작용에 관여한다. 표적 핵산과 상기 리보자임의 잔기 사이에 2개 혼성화 스트랜드를 기초한 상보적 스트레치의 혼성화 및 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 상호반응하면, 촉매 활성 잔기는 활성으로 될 수 있고, 이는 리보자임의 촉매 활성이 포스포디에스테라제 활성인 경우, 분자내 또는 분자간 사이에서 표적 핵산을 분해시킴을 의미한다. 리보자임, 그 사용 및 디자인 원리는 당업자에게 공지되어 있으며 예컨대 Doherty and Doudna (Annu. Ref. Biophys. Biomolstruct. 2000; 30: 457-75)에 기재되어 있다.
기능적 핵산의 다른 군은 아프타머이다. 아프타머는 D-핵산으로서, 단일쇄 또는 이중쇄이고 또 표적 분자와 특이적으로 상호작용한다. 아프타머의 제조 또는 선택은 예컨대 유럽 특허 EP 0 533 838호에 기재되어 있다. RNAi, siRNA, siNA, 안티센스-뉴클레오티드 및 리보자임과 대조적으로, 아프타머는 표적 mRNA를 분해하지 않지만, 단백질과 같이 표적 화합물의 2차 및 3차 구조와는 특이적으로 상호작용한다. 표적과 상호작용하면, 표적은 전형적으로 그의 생물학적 활성 변화를 나타낸다. 아프타머의 길이는 전형적으로 15 내지 80개 뉴클레오티드 길이로 작으며, 바람직하게는 약 20 내지 약 50개 뉴클레오티드이다.
기능적 핵산의 다른 군은 스피겔머이며, 이것은 예컨대 국제특허출원 WO 98/08856호에 기재되어 있다. 스피겔머는 아프타머와 유사한 분자이다. 그러나, 스피겔머는 아프타머와 대조적으로 D-뉴클레오티드 보다는 거의 또는 주로 L-뉴클레오티드로 구성된다. 다르게는, 스피겔머의 가능한 길이에 대해서는 아프타머와 관련하여 설명한 것과 거의 동일한 내용이 스피겔머에 대해서도 적용된다.
앞서 기재한 바와 같이, 본 발명자들은 놀랍게도 본 발명에 따른 화합물 및 이러한 화합물을 포함하는 조성물이 RNAi, 특히 siRNA 및 siNA를 세포로 전달하는데 특히 효과적일 수 있다는 것을 밝혀내었다. 어떠한 이론에 얽매이는 것은 아니나, 본 발명에 따른 지질 조성물에 함유된 헬퍼 지질(PEG-유리 헬퍼 지질 또는 특히 PEG-함유 헬퍼 지질일 수 있음)의 특정 몰%로 인하여, 특히 상기 종류의 헬퍼 지질의 함량이 본 명세서에 명시된 농도 범위내에서 함유되면 놀라운 효과가 달성될 수 있다는 것을 알았다. 이와 관련하여, 본 발명에 따른 조성물이 PEG 잔기를 포함하는 헬퍼 지질을 함유하면, 그러한 PEG-유도된 헬퍼 지질 함유 조성물을 사용한 전달 또는 형질감염 작용은 핵산, 특히 RNAi 분자, 가장 특히 siRNA, siNA, 안티센스 뉴클레오티드 및 리보자임의 전달에 특히 효과적이라는 것은 특히 주목할만한 일이다. 그 이유로서 본 발명자들은 놀랍게도 약 4%의 PEG-함유 헬퍼 지질을 함유하는 리포좀은 활성이지만, 4% 미만(바람직하게는 3% 미만)을 함유하는 리포좀은 기능적 전달을 매개하지 않는다는 것을 밝혀내었다. 기본적으로, 본 발명자들은 본 발명에 따른 지질 조성물에서 특정 PEG 양이 효과적인 형질감염 및 전달을 제공하는데 적합하다는 것을 발견하였다.
다른 요지로서, 본 발명자들은 리포플렉스(lipoplex) 또는 리포좀으로 존재하는 본 발명에 따른 지질 조성물은 바람직하게는 전체적인 양이온 전하, 따라서 적어도 과량의 1개 양이온 전하를 나타낸다는 것을 놀랍게도 밝혀내었다. 보다 바람직하게는, 지질 조성물은 음전하 : 양전하 전하비 약 1:1.3 내지 1:5를 나타낸다. 따라서, 본 발명은 다른 요지로서 1 이상의 양이온성 지질 및 핵산, 바람직하 게는 RNAi, siRNA 또는 siNA 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 기능적 핵산을 포함하고 음전하 : 양전하 비가 약 1:1.3 내지 1:5 인 지질 조성물에 관한 것이다. 양이온성 지질은 바람직하게는 본 명세서에 기재된 바와 같은 양이온성 지질이다. 지질 조성물은 바람직한 구체예로서 본 발명에 기재된 바와 같은 헬퍼 지질 또는 헬퍼 지질 조합물을 포함한다. 바람직한 구체예로서, 핵산을 함유하는 본 발명에 따른 조성물은 리포플렉스를 형성한다. 바람직한 구체예로서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용어 리포플렉스는 양이온성 지질, 중성 헬퍼 지질 및 핵산으로 구성된 조성물을 지칭한다.
본 발명자들은 핵산 함유 지질 배합물의 전헤 양이온 전하와 관련하여 상술한 측면에서 볼 때, siRNA와 양이온성 지질의 몰비가 본 발명에 따른 지질 조성물의 성공적인 적용에 중요할 수 있다는 것을 발견하였다. 어떠한 이론에 치우치는 것은 아니나, 본 명세서에 기재된 바와 같은 양이온성 지질의 몰은 분자당 최대 양전하를 제공할 수 있는 반면에, 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 및 보다 특히 siRNA 분자는 분자당 최대 40개 음전하를 제공하는 것으로 보여진다. 본 발명에 따른 siRNA 함유 지질 배합물의 전체 양전하에 도달하기 위하여, 상기 몰비는 0 내지 최대 0.075 범위일 수 있다. 바람직한 몰비 범위는 약 0.02 내지 0.05, 더욱 바람직하게는 약 0.037 몰비 범위이다.
본 발명자의 다른 놀라운 발견은 본 발명에 따른 조성물이 핵산, 바람직하게는 siRNA 분자 또는 siNA 분자를 함유하고 또 핵산 주쇄 포스페이트 대 양이온성 지질 질소원자의 전하비가 약 1:1.5-7, 보다 바람직하게는 1:4이면 특히 유용한 트 징을 나타낸다는 점이다. 본 명세서에서 말하는 용어 핵산 주쇄 포스페이트는 그러한 핵산을 형성하는 개별 뉴클레오티드에 의해 제공된 핵산의 포스페이트 잔기를 지칭한다. 본 명세서에서 말하는 용어 양이온성 지질 질소 원자는 바람직하게는 전체 3개의 양전하를 포함하는 양이온성 지질에 의해 제공된 질소원자를 지칭한다. 상기 3개의 양전하는 2개의 일차 아미노기 및 구아니딘 기에 의해 제공된다. 핵산 주쇄 포스페이트에 의해 제공된 전하를 측정하기 위하여, 다음 가정을 할 수 있다: 2개 뉴클레오사이드 사이의 각 포스페이트는 1개 음전하를 제공하며 또 3' 말단 포스페이트는, 존재하는 경우, 2개 음전하를 제공한다. 양이온성 지질 질소원자에 제공된 전하 및 포스페이트 원자에 의해 제공된 전하의 비를 측정하기 위하여, 시험관내 및/또는 생체 적용시 관찰되는 특정 환경하에서 효과적인 전하비는 상기 명시한 것과는 달라질 수 있음은 인정하지만, 전하는 상기 기재한 바와 같이 존재하는 것으로 추정된다.
상기 정의한 전하비는 핵산이 세포질막과 같은 인지질 이중층 막을 통과하여 효과적으로 전달되게 한다.
전달 특징을 제공하는 본 발명에 따른 조성물의 다른 사항은 그의 크기 분포이다. 바람직하게는, 분산액으로 존재하는 본 발명에 따른 조성물의 크기 분포는 약 120 nm 이다. 이 크기는 이하 실시예 부분에서 보다 자세하게 기재한 Quasi Elastic Light Scattering에 의해 측정된다.
본 발명자들은 본 발명에 따른 조성물이 핵산, 바람직하게는 기능적 핵산, 예컨대 siRNA 및 siNA 분자를 세포로 전달하기에 특히 적합하다는 것을 놀랍게도 발견하였다. 실시예 부분에 더욱 자세하게 기재한 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 상기 핵산을 내피세포, 상피세포 및 암 세포의 세포내 공간으로 전달하는데 아주 활성적이다. 상기와 같은 전달은, 다른 내피세포가 본 발명에 따른 조성물에 의해 감염될 수 있지만, 혈관계의 내피세포에서 특히 활성적인 것과 같이 더욱 증가된 특이성이 존재하는 것으로 보인다. 특히 효과적인 형질감염은 혈관계의 내피세포, 보다 특히 종양에 의해 유도된 것과 같은 신생혈관형성의 결과인 혈관계에 의해 생긴다. 고려할 수 있는 다른 혈관계는 신장, 심장, 폐, 간 및 췌장의 혈관계이다.
본 발명에 따른 조성물은 특히 온화하거나 또는 비-독성이기 때문에 지금까지 유리한 것으로 알려져 왔다. 이러한 독성 결핍은 부작용없이 상기 종류의 조성물을 사용하여 치료하는 의료적 혜택에 공헌하기 때문에 종래 기술의 조성물에 비하여 훨씬 유리하며, 따라서 볼루스(bolus) 투여과 같은 특정 투여 형태에 대한 환자 순응성을 증대시킨다. 후자는 이하 실시예에 기재된 바와 같이 동물 연구로부터 분명해졌다.
본 발명의 범위 내에서 조성물 및 보다 특히 약제학적 조성물은 본 발명에 따른 조성물에 약제학적 활성 화합물 및 추가 성분으로 함유될 수 있는 상술한 생물학적 활성 화합물 1 이상을 포함할 수 있다. 당업자라면 이들 화합물은 원칙적으로 약제학적 활성 화합물로서 사용될 수 있다는 것을 잘 알 수 있을 것이다. 이러한 약제학적 활성 화합물은 전형적으로 질병의 병리메카니즘에 관여하는 표적 분자에 대한 것이다. 본 발명의 요지와 관련하여 사용될 수 있는 다양한 생물학적 활성 화합물 및 약제학적 활성 화합물의 기초가 되는 일반적 디자인 원리 및 작용 모드로 인하여, 실질적으로 어떠한 표적이라도 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 화합물 및 이들을 함유하는 각 조성물은 상기 종류의 생물학적 활성 화합물을 사용하여 해결되고, 방지되거나 및/또는 치료되어야 하는 질병 또는 질병 상태의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 이들 생물학적 활성 화합물 이외에 기타 다른 생물학적 활성 화합물도 본 발명의 구체예에 따른 조성물의 일부일 수 있다. 바람직하게는 이러한 기타 생물학적 활성 화합물은 바람직하게는 기타 생물학적 활성 화합물이 본 발명에 따른 화합물, 보다 바람직하게는 양이온성 지질인 본 발명에 따른 화합물과 상호작용하거나 복합체화되는 조건하에서, 1 이상의 음전하를 포함한다.
본 발명에서 말하는 생물학적 활성 화합물은 바람직하게는 생물학적 활성을 나타내고, 바람직하게는 생물 계 상에서 어떠한 생물학적, 화학적 및/또는 물리적 효과를 나타내는 화합물을 의미한다. 이러한 생물 계는 바람직하게는 생화학 반응, 세포, 바람직하게는 동물 세포, 보다 바람직하게는 척추동물 세포, 가장 바람직하게는 포유동물 세포이며, 비제한적으로 사람 세포, 조직, 기관 및 생물체를 포함한다. 이러한 생물체는 마우스, 쥐, 기니아 피그, 토끼, 고양이, 개, 원숭이 및 사람을 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 범위내에서, 본 발명에 따른 조성물, 특히 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 추가의 약제학적 활성 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물, 특히 약제학적 조성물은 다양한 투여형태에 사용될 수 있으며, 국소 투여 및 전신 투여가 특히 바람직하다. 근육내 투여, 경피 투여, 피하 투여, 정맥 투여 및 폐 투여를 포함하는 군으로부터 선택되는 투여 경로가 보다 바람직하다. 본 명세서에서 바람직한 것으로 기재된 바와 같은, 국소 투여는 조성물 및 생물학적 활성 화합물이 투여되는 각 세포, 조직 및 기관과 밀접한 공간 관계로 각 조성물을 투여하는 것을 의미한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 전신 투여는 국소 투여와는 다른 투여로서, 보다 바람직하게는 혈액 및 액체와 같은 체액으로 투여되는 것이며, 상기 체액은 조성물 및 생물학적 활성 화합물이 전달될 세포, 조직 및 기관으로 조성물을 전달한다.
본 명세서에 기재한 바와 같이, 본 발명에 따른 화합물 및 조성물에 의해 생물학적 활성 화합물이 전달되어야 하는 세포막을 거치는 세포는 바람직하게는 진핵 세포, 보다 바람직하게는 척추동물 세포이며, 더욱 바람직하게는 포유동물 세포이다. 가장 바람직하게는 세포는 인간 세포이다.
본 발명에 따른 화합물 및 조성물을 사용하여 제조될 수 있는 의약은 환자를 치료 및 예방하기 위한 것이다. 바람직하게는 이러한 환자는 척추동물, 바람직하게는 포유동물 및 더욱 바람직하게는 포유동물이며, 마우스, 쥐, 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 원숭이 및 인간을 포함하는 군으로부터 선택된다. 다른 요지로서 본 발명에 따른 화합물 및 조성물은 전달제, 보다 바람직하게는 형질감염제로서 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 전달제는 화합물, 보다 바람직하게는 약제학적 활성 화합물과 같은 생물학적 활성 화합물을 막, 바람직하게는 세포 막을 통과 하게 하고 또 더욱 바람직하게는 그러한 화합물을 전술한 세포로 전달하는데 적합한 물질이다. 바람직하게는, 상기 세포는 내피 세포, 더욱 바람직하게는 척추동물의 내피세포, 가장 바람직하게는 마우스, 쥐, 기니아 피그, 개, 고양이, 원숭이 및 인간의 내피세포이다.
다른 요지로서, 본 발명은 세포에 생물학적 활성 화합물을 전달하는 방법 또는 형질감염시키는 방법에 관한 것이다. 제1 단계로서, 단계의 순서는 제한적인 것은 아니며, 세포 및 막과 세포를 각각 제공한다. 제2 단계로서, 본 발명에 따른 화합물 뿐만 아니라 약제학적 활성 화합물과 같은 생물학적 활성 화합물을 제공한다. 반응은 세포 및 막을 접촉시켜 실시되며, 본 발명에 따른 화합물 및 조성물의 생체물리학적 특징으로 인하여, 생물학적 활성 화합물은 막의 한쪽에서 다른 쪽으로 전달되거나, 또는 막이 세포를 형성하는 경우, 세포 밖에서 세포 안으로 전달된다. 세포 및 막을 접촉시키기 전에, 생물학적 활성 화합물 및 본 발명에 따른 화합물, 즉 양이온성 지질을 접촉시켜 복합체를 형성하고, 이러한 복합체를 세포 및 막과 각각 접촉시키는 것도 본 발명에 속한다.
본 발명의 다른 요지로서, 생물학적 활성 화합물 및 약제학적 활성 화합물 각각을 전달하는 방법은 세포 및 막을 제공하는 단계, 본 발명에 따른 조성물을 제공하는 단계 및 양쪽 조성물 및 세포 및 막을 접촉시키는 단계를 포함한다. 세포 및 막을 접촉시키기 전 또는 접촉시키는 동안 조성물이 형성되는 것도 본 발명에 속한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 생물학적 활성 화합물을 전달하는 방법의 구 체예로서, 상기 방법은 바람직하게는 생물학적 활성 화합물이 전달되었는지 여부를 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 검출 반응은 본 발명의 방법에 따라 전달될 생물학적 활성 화합물의 종류에 따라 달라지며 또 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 방법이 상술한 바와 같은 세포, 조직, 기관 및 생물체 상에서 실시되는 것은 본 발명에 속한다.
본 발명을 하기 도면 및 실시예를 참조하여 더욱 자세하게 설명하며, 그로부터 본 발명의 추가적인 특징, 구체예 및 이점을 취할 수 있다. 보다 자세하게는 다음과 같다.
도 1은 본 발명에 따른 양이온성 지질의 기본 구조를 도시한다.
도 2는 본 발명에 따른 화합물을 합성하기 위한 가능한 출발물질인 N-올레일-팔미틸아민의 합성을 도시하며, 이러한 합성은 미국특허 6,395,713호에 기재된 바와 같은 종래 기술에 따른 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 중요한 출발물질인 N-올레일-팔미틸아민의 합성을 도시한다.
도 4 내지 도 9는 β-아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드, β-아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-라우릴-N-미리스틸-아미드 트리히드로클로라이드 또는 ε-아르기닐-리신-N-라우릴-N-미리스틸-아미드 트리히드로클로라이드의 합성을 도시한다.
도 10은 본 발명에 따른 양이온성 지질을 합성하기 위한 다른 성분인 대체 양이온성 헤드 기의 합성을 도시한다.
도 11은 베타-아르기닐-2,3-디아미노프로피온-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드를 합성하기 위한 다른 합성 경로를 도시한다.
도 12A 및 도 12B는 본 발명에 따른 지질 배합물의 크기 분포 및 압출 및 고압 균질화의 영향을 각각 도시한다.
도 13은 동결보호제에 노출시킨 후 상이한 온도에서 저장된 RNAi 함유 지질 배합물의 웨스턴 블럿 분석 결과를 도시한다.
도 14는 헬퍼 지질이 상이한 지질 배합물에서 상이한 siRNA 적하 효과에 대한 웨스턴 블럿 분석 결과를 도시한다.
도 15는 웨스턴 블럿 분석 결과 및 PEG-치환된 지질의 상이한 농도의 효과를 도시한다.
도 16은 RasV12-의존적 종양 마우스 모델을 생성하고 다양한 배합물을 시험하는데 있어 그를 사용하기 위한 실험 순서를 도시한다.
도 17A, 도 17B 및 도 17C는 상이한 배합물을 사용하여 세포 시험후 일수의 함수로 종양 부피를 도시하는 다이아그램이다.
도 18a는 네이키드(naked) 및 리포플렉스화된 PKN3 특이적 siRNA의 효과의 웨스턴 블럿 분석 결과를 도시한다.
도 18b는 네이키드 및 배합된 siRNA의 세포내 분포를 도시하는 동촛점 현미경사진을 도시한다.
도 18c는 리포좀의 배합되고 네이키드 siNA의 간(Liver)에서의 분포를 도시 하는 표면형광 현미경(상부 패널) 및 동촛점 현미경 사진을 도시한다.
도 18d는 리포좀 배합된 siRNA에 의해 표적화된 내피세포의 표면형광 및 동촛점 현미경 사진이다.
도 18e는 상이한 종양의 내피세포의 형광 현미경 사진이다.
도 19a는 DNA 합성에 대한 PTEN 지향(directed) siRNA의 작용 모드의 개략도이고, 상이한 siRNA 종을 사용한 웨스턴 블럿 분석의 결과 및 상기 상이한 siRNA 종으로 처리된 HELA 세포의 면역형광 현미경 사진을 도시한다.
도 19b는 상이한 siRNA 분자로 처리한 내피 세포의 사진 및 간 내피세포에서 BrdU 분석 결과를 나타내는 그래프를 도시한다.
도 19c는 상이한 siRNA 분자로 처리한 내피 세포의 사진 및 종양 내피세포에서 BrdU 분석 결과를 나타내는 그래프를 도시한다.
도 20a는 효과적인 CD31 녹-다운(knock-down)을 위한 강력한 siRNA 분자를 측정하기 위한 웨스턴 블럿 분석의 결과를 도시한다.
도 20b는 마우스의 상이한 기관에서 CD 31 mRNA 양에 대한 항-CD31 siRNA 의 영향을 나타내는 다이아그램이다.
도 20c는 항 CD31 siRNA 분자를 사용하여 마우스의 상이한 기관에서 CD31 단백질 녹-다운의 효능을 측정하기 위한 웨스턴 블럿 분석 결과를 도시한다.
도 20d는 항-CD31 siRNA 분자로 처리된 마우스의 파라핀 종양 부분의 직접 면역염색에 의한 CD 31 단백질의 생체내 녹-다운의 결과를 도시한다.
도 21a는 CD31, CD34, PTEN 및 p-Akt 녹-다운에 대한 항-CD31 siRNA 및 항- PTEN siRNA 분자의 효능을 연구하기 위한 웨스턴 블럿 분석 결과를 도시한다.
도 21b는 시간 함수로서 시험 동물의 체중에 대한 상이한 패턴의 리포플렉스 투여의 효과를 나타내는 다이아그램이다.
도 21c는 2개의 상이한 종양 이종이식편의 부피에 대한 상이한 항-CD31 siRNA 처리 계획의 효과를 나타내는 다이아그램을 도시한다.
도 21d는 항-CD 31 처리 계획하에서 확립된 PC-3 이종이식편의 생장 억제를 나타내는 다이아그램이다.
실시예 1: 종래 기술에 따른 N- 올레일 - 팔미틸 아민의 합성
N-올레일-팔미틸 아민은 본 발명에 따른 화합물을 제조하기 위한 중요한 출발물질이다. N-올레일-팔미틸 아민은 원칙적으로 미국특허 6,395,713호에 기재된 바와 같이 합성할 수 있다. 각 반응 도식은 도 2에 도시되어 있다. 그러나, 이 출발물질은 예컨대 플루카(Fluka)에 의해 제공되는 것과 같은 공업용 올레일 아민이다. 가스 크로마토그래피에 의한 이 출발물질의 분석은 ≥ 70%의 순도를 나타내며, 이 물질의 30%는 상이한 사슬 길이를 갖는 아민으로 구성된다. 그 이유는 상기 물질 자체가 식물 공급원으로부터 얻는 것에 기인할 수 있다. 올레일 아민 및 1-브로모헥사데칸(팔미틸브로마이드)을 조합하고 이들을 100 내지 120℃에서 30분간 반응시킨 후 N-올레일-팔미틸 아민을 얻는다. 수율은 약 83%이다.
실시예 2: 본 발명에 따른 N- 팔미틸 - 올레일 아민의 합성
본 발명에 따른 화합물과 관련하여 본 발명자에 의해 신규 합성법이 안출되 었다(도 3). 이 신규 합성 방식은 다량의 불순물이 상기 출발물질을 기본으로하여 제조된 전달제의 품질에 영향을 준다는 본 발명자의 발견을 기초로 하고 있다. 따라서, 가스 크로마토그래피에 의해 나타낸 바와 같이 순도 ≥ 99%를 갖는 올레산을 사용하고, 이러한 올레산을 에틸클로로포르메이트, TEA 및 CH2Cl2 와 접촉시킨 다음 얻어진 혼합 카르복시산-탄산 무수물을 가스 크로마토그래피에 의해 나타낸 바와 같이 순도 ≥ 99%의 헥사데실아민(팔미틸아민)과 반응시키는 것에 의해 반응이 개시된다. 상기 반응 생성물 N-팔미틸-올레오일 아미드 [#1]를 LiAlH4a (THF 중)과 반응시켜 85% N-팔미틸-올레일 아민[#2]을 얻으며, 이것은 무색 결정성 고체로 존재한다.
보다 상세한 반응 조건은 다음에 개략적으로 나타낸다.
N- 팔미틸 - 올레오일 아미드의 합성 아민 [#1]의 합성
2.62 ml (27.5 밀리몰)의 클로로포름산 에틸 에스테르를, 아르곤 불활성 가스가 들어가 있고 0℃로 냉각된 슈렝크에 따른 250 ml 질소 플라스크 중의 30ml 무수 디클로로메탄에 용해시켰다. 40 ml 무수 디클로로메탄에 7.93 ml (25 밀리몰)의 올레산 및 4.16 ml(30 밀리몰)이 용해된 용액을 20분간 교반하에서 적가하였다. 얼음 조(bath) 상에서 30분간 교반한 후 50 ml CHCl3 에 6.64 g(27.5 밀리몰)의 팔미틸아민이 용해된 용액을 급히 적가하고 그 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이어, 상기 용액을 40 ml 물을 각각 사용하여 3회 세척하고, 유기 상은 Na2SO4 상에서 건조시키고 용매는 회전 증발기를 이용하여 제거하였다. 잔류물은 100 ml 아세톤으로부터 재결정화시켰다. 89% 수율에 상응하는 11.25 g(22.3 밀리몰)의 무색 고체를 얻었다.
N- 팔미틸 - 올레일아민 [#2]의 합성
적하 깔때기 및 환류응축기를 구비한 250 ml 삼가지 플라스크 중, 아르곤 불활성 가스 하에서, 에테르 중의 1M LiAlH4 20 ml를 제공한 다음 80 ml의 THF 중의 7.59 g (15 밀리몰) 팔미틸올레오일아미드가 용해된 용액을 20분간 적가하였다. 이 혼합물을 2.5 시간 동안 환류시킨 다음 에테르 중의 1M LiAlH4 5ml를 부가하고 다시 2.5 시간 동안 환류시켰다. 과량의 수소화물은 얼음조 냉각하에서 6M NaOH를 사용하여 분해시키고 석출물을 여과하였다. 석출물을 뜨거운 MtBE 40 ml를 각각 사용하여 2회 추출하고, 모아진 유기 상은 Na2SO4 상에서 건조시키고 용매는 회전 증발기를 이용하여 제거하였다. 잔류물은 -20℃ 에서 100 ml MtBE로부터 결정화시켰다. 수율 85%에 상응하는 6.23 g(12.7 밀리몰)을 무색 결정 고체로 얻었다.
실시예 3: Boc - Dap ( Fmoc )-N- 팔미틸 -N- 올레일 -아미드 [#3]의 합성
521 mg (1.06 밀리몰) N-올레일-팔미틸아민을 50 ml 둥근-바닥 플라스크에서 10 ml 무수 디클로로메탄에 용해시키고 289 mg (1.17 밀리몰) EEDQ를 부가하였다. 이어, 500 mg(1.17 밀리몰) Boc-Dap(FMoc)-OH를 교반하에 부가하고 그 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 이 용액을 80 ml 디클로로메탄과 함께 분리 깔때기에 전달하고 20 ml 0.1N HCl을 각각 사용하여 3회 세척하고 20 ml 포화 NaHCO3 용 액으로 1회 세척하였다. Na2SO4 상에서 건조시킨 후 용매는 회전 증발기를 이용하여 제거하였다 (도 4). 황색의 점성 오일을 얻으며, 이것은 더 이상 정제하지 않았다. 헥산/에틸아세테이트 1:1를 사용한 박층 크로마토그래피에서 Rf 0.70이 관찰되었다.
실시예 4: Boc - Dap -N- 팔미틸 -N- 올레일 -아미드 [#4]의 합성
1 g Boc-Dap(Fmoc)-N-팔미틸-올레일-아미드 원료를 50 ml 둥근-바닥 플라스크에서 8 ml 무수 디클로로메탄에 용해시켰다. 3 ml 디에틸아민을 부가하고 실온에서 교반하였다(도 4). 반응의 박층 크로마토그래피 제어는 4.5 시간 후 출발 생성물의 반응이 완료되었음을 나타내었다. 휘발성 성분은 회전 증발기에 의해 제거하고 그 잔류물은 헥산/에틸아세테이트 5:1을 사용하고 40 g 실리카겔 60 (Merck)를 이용하여 크로마토그래피 정제시켰다. 생성물은 에틸아세테이트, 에틸아세테이트/메탄올 4:1 및 디클로로메탄/메탄올 4:1로 구성된 단계 구배를 이용하여 용출시켰다. 576 mg (0.85 밀리몰) Boc-Dap-N-팔미틸-N-올레일-아미드를 황색의 점성 오일로 얻었다.
실시예 5: 테트라 - Boc -[β- 아르기닐 -2,3- 디아미노프로피온산 -N- 팔미틸 -N-
올레일 -아미드 [#5]의 합성
576 mg (0.85 밀리몰) Boc-Dap-N-팔미틸-N-올레일-아미드를 100 ml 둥근-바닥 플라스크에서 10 ml 무수 디클로로메탄에 용해시키고 교반하에서 210 mg (0.85 밀리몰) EEDQ 및 403 mg (0.85 밀리몰) Boc-Arg(Boc)2-OH를 부가하였다(도 5). 이 혼합물을 아르곤 분위기하, 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 이어, 디클로로메탄은 회전 증발기에 의해 제거하였고 또 100 ml MtBE 중의 잔류물은 분리 깔때기로 전달하였다. 유기 상은 0.1N HCl, 1N NaOH 및 포화 NaHCO3 용액으로 완전히 세척하고 Na2SO4 상에서 건조시키고 용매는 회전 증발기에 의해 제거하였다. 조 생성물을 헥산/에틸아세테이트를 용리액으로 사용하여 플래쉬 크로마토그래피(컴비플래쉬 리트리브; Isco 인코포레이티드)에 의해 정제하였다. 72%의 수율에 상응하는 694 mg (0.61 밀리몰)의 무색 점성 오일을 얻었다.
실시예 6: β- 아르기닐 -2,3- 디아미노프로피온산 -N- 팔미틸 -N- 올레일 -아미드 트리히드로클로라이드 [#6]의 합성
694 mg (0.61 밀리몰)의 잘 건조된 테트라-Boc-[β-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드]를 쉬렝크에 따른 25 ml 질소 플라스크내에, 아르곤 분위기하에서 제공하고 디옥산 중의 8 ml 4N HCl을 부가하였다.(도 5). 이 혼합물을 아르곤 불활성 가스하, 실온에서 24시간 동안 교반하며, 생성물은 비정질이며 부분적으로 약 6 내지 8시간 후 용액으로부터 왁스와 유사한 고체로서 부분적으로 석출된다. 이 반응의 완료후(CHCl3/MeOH/NH4OH 65:25:4)를 사용한 박층 대조용), 휘발성 성분은 고진공하에서 제거되었다. 489 mg (0.58 밀리몰) β-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드를 트리히드로클로라이드로서 수득하였다.
실시예 7: N- 라우릴 - 미리스틸 아민[#7]의 합성
환류 응축기 및 적하 깔때기를 구비한 500 ml 3-가지 플라스크내, 100 ml 무수 DMF에 18.54 g(100 밀리몰) 도데실아민 (라우릴아민), 6.36 g (60 밀리몰) Na2CO3 및 50 mg 테트라부틸 암모늄 요오다이드 (TBAI)를 현탁시켰다. 100 ml 무수 디옥산에 16.4 ml (60 밀리몰)의 1-브로모 테트라데칸이 용해된 용액을 100℃에서 110분간에 걸쳐 적가하고 그 혼합물을 100℃에서 3.5 시간 더 교반하였다(도 6). 이 용액을 실온에서 가능한한 높은 온도에서 여과하였다. 4℃에서 철야로 석출된 결정성 고체를 제거하고 소량의 냉각 메탄올로 세척하였다. 이어, 이 고체를 200 ml 메탄올로부터 재결정화시켰다. -18℃에서 석출된 결정은 냉각된 프릿으로부터 흡입하고 냉각 MtBE를 사용하여 세척하였다. 7.94 g (21 밀리몰)의 무색 결정성 고체를 얻으며, 이것은 35% 수율에 상응하였다.
실시예 8: Boc - Dap ( Fmoc )-N- 라우릴 -N- 미리스틸 아미드 [#8]의 합성
50 ml 둥근 바닥 플라스크내 15 ml 무수 디클로로메탄에 715 mg (1.68 밀리몰) Boc-Dap(Fmoc)-OH를 용해시키고 420 mg (1.7 밀리몰) EEDQ를 부가하였다. 이 혼합물을 실온에서 45분간 교반한 다음 641 mg (1.68 밀리몰) N-라우릴-미리스틸 아민이 25 ml 무수 디클로로메탄에 용해된 용액을 60분간에 걸쳐 서서히 적가하였다(도 6). 20시간의 반응 시간 후, 용매를 회전 증발기에 의해 제거하고 그 잔류물을 100 ml MtBE와 함께 분리 깔때기로 전달하였다. 상기 용액을 0.1 N HCl 및 포화 NaHCO3 용액으로 완전히 세척하고, 유기 상은 Na2SO4 상에서 건조시키고 용매는 회전 증발기에 의해 제거하였다. 1.02 g의 조 생성물을 얻으며, 이것은 헥산/에틸아 세테이트를 용리액으로 사용한 플래쉬 크로마토그래피(Combiflash Retrieve; Isco Inc.)에 의해 정제하였다. 607 mg의 순수한 생성물을 무색의 아주 점성인 오일로서 수득하였다. 헥산/에틸아세테이트 1:1를 사용한 박층 크로마토그래피는 0.58의 Rf 를 제공하였다.
실시예 9: Boc - Dap -N- 라우릴 -N- 미리스틸 아미드 [#9]의 합성
50 ml 둥근 바닥 플라스크내 8 ml 무수 디클로로메탄에 607 mg의 Boc-Dap(Fmoc)-N-라우릴-N-미리스틸 아미드를 용해시켰다 (도 6). 3 ml의 디에틸아민을 부가하고 그 반응을 실온에서 4.5 시간 동안 교반하였다. 휠성성 성분은 회전 증발기를 이용하여 제거하였고 잔류물은 40 g의 실리카겔 60 (Merck)과 헥산/에틸아세테이트 5:1을 사용한 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 에틸아세테이트, 디클로로메탄 및 디클로로메탄/메탄올 3:1로 구성된 단계 구배에 의해 생성물을 용출하였다. 372 mg (0.655 밀리몰)의 Boc-Dap-N-라우릴-N-미리스틸 아미드를 황색의 점성 오일로서 수득하였다.
실시예 10: 테트라 - Boc -[β- 아르기닐 -2,3- 디아미노프로피온산 -N- 라우릴 -N- 미리스틸 아미드][#10]의 합성
50 ml 둥근 바닥 플라스크내 8 ml 무수 디클로로메탄에 372 mg(0.655 밀리몰)의 Boc-Dap-N-라우릴-N-미리스틸 아미드를 용해시키고 또 교반하에서 162 mg (0.655 밀리몰) EEDQ 및 311 mg (0.655 밀리몰)의 Boc-Arg-(Boc)2-OH를 부가하였다(도 7). 이 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 이어, 회전 증발기를 이용 하여 디클로로메탄을 제거하였고 잔류물은 80 ml MtBE와 함께 분리 깔때기로 전달하였다. 유기 상은 0.1N HCl, 1N NaOH 및 포화 NaHCO3 용액을 사용하여 완전하게 세척한 다음 Na2SO4 상에서 건조시키고 용매는 회전 증발기에 의해 제거하였다. 조 생성물은 헥산/에틸아세테이트의 단계 구배를 사용한 플래쉬 크로마토그래피 (Combiflash Retrieve; Isco Inc)에 의해 정제하였다. 500 mg (0.5 밀리몰)의 무색 점성 오일을 수득하며, 이는 76% 수율에 상응하였다.
실시예 11: β- 아르기닐 -2,3- 디아미노프로피온산 -N- 라우릴 -N- 미리스틸 아미드 트리히드로클로라이드[#11]의 합성
쉬렝크에 따른 25 ml 아르곤 플라스크내, 아르곤하에서, 511 mg (0.5 밀리몰)의 잘 건조된 테트라-Boc-[β-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-라우릴-N-미리스틸 아미드]를제공하고 디옥산 중의 10 ml 4N HCl을 부가하였다(도 7). 이 혼합물을 아르곤 불활성 가스하 실온에서 24시간 동안 교반하며, 생성물은 부분적으로 비정질이고, 부분적으로 왁스 상 고체로서 6 내지 8 시간 후 용액으로부터 석출된다. 상기 반응의 완료시(CHCl3/MeOH/NH4OH 65:25:4를 사용한 박층 크로마토그래피 대조용), 모든 휘발성 성분을 고진공하에서 제거하였다. 트리-히드로클로라이드 형태의 323 mg (0.5 밀리몰)의 β-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-라우릴-N-미리스틸 아미드를 수득하였다.
실시예 12: Boc - Lys ( Fmoc )-N- 라우릴 -N- 미리스틸 아미드 트리히드로클로라이드[#12]의 합성
50 ml 둥근 바닥 플라스크내 10 ml 무수 디클로로메탄에 937 mg(2 밀리몰)의 Boc-Lys(Fmoc)-OH를 용해시키고 또 495 mg (2 밀리몰) EEDQ를 부가하였다(도 8). 이 혼합물을 실온에서 60분간 교반한 다음 30 ml 무수디클로로메탄 중의 764 mg (2 밀리몰) N-라우릴-미리스틸 아민이 용해된 용액을 120분간에 걸쳐 서서히 적가하였다. 20시간의 반응 시간 후, 용매를 회전 증발기를 사용하여 제거하고 잔류물은 100 ml MtBE와 함께 분리 깔때기로 전달하였다. 용액을 0.1N HCl 및 포화 NaHCO3 를 사용하여 완전하게 세척하고, 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고 용매를 회전 증발기를 이용하여 제거하였다. 1.757 g의 조 생성물을 얻으며, 이것은 헥산/에틸아세테이트 4:1을 용리제로 사용한 플래쉬 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 헥산/에틸아세테이트 1:1를 사용한 박층 크로마토그래피는 0.57의 Rf를 제공하였다.
실시예 13: Boc - Lys -N- 라우릴 -N- 미리스틸 아미드 [#13]의 합성
50 ml 둥근 바닥 플라스크내 16 ml 무수 디클로로메탄에 1.377 g의 Boc-Lys(Fmoc)-N-라우릴-N-미리스틸-아미드를 용해시켰다. 6 ml의 디에틸아민을 부가하고 그 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다(도 8). 휘발성 성분을 회전 증발기를 이용하여 제거하고 그 잔류물은 40 g 실리카겔 60(Merck 제조)을 이용한 크로마토그래피에 의해 헥산/에틸아세테이트 5:1을 사용하여 정제시켰다. 생성물은 에틸아세테이트, 디클로로메탄 및 디클로로메탄/메탄올 3:1로 구성된 단계 구배를 이용하여 용출시켰다. 556 mg(0.911 밀리몰) Boc-Lys-N-라우릴-N-미리스틸 아미드를 황색의 점성 오일로서 얻을 뿐만 아니라 119 mg의 혼합 분획도 얻었다.
실시예 14: 테트라 - Boc -[ε- 아르기닐 -리신-N- 라우릴 -N- 미리스틸 아미드] [#14]의 합성
556 mg (0.911밀리몰) Boc-Lys-N-라우릴-N-미리스틸-아미드를 40 ml 무수 디클로로메탄에 용해시키고 교반하에서 226 mg(0.911 밀리몰) EEDQ 및 433 mg (0.911 밀리몰) Boc-Arg(Boc)2-OH를 부가하였다. 이 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 이어, 회전 증발기를 이용하여 디클로로메탄을 제거하고 그 잔류물은 80 ml MtBE와 함께 분리 깔때기로 보내었다. 유기 상을 0.1N HCl 및 포화 NaHCO3 용액을 사용하여 완전히 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키며 또 회전 증발기를 이용하여 용매를 제거하였다. 헥산/에틸아세테이트 단계 구배를 이용한 플래쉬 크로마토그래피 (Combiflash REtrieve; Isco Inc.)에 의해 정제하였다. 무색의 점성질 오일을 730 mg (0.684 밀리몰)을 얻으며, 이는 75% 수율에 상응한다.
실시예 15: ε- 아르기닐 -리신-N- 라우릴 -N- 미리스틸 아미드 트리히드로클로라이드 [#15]의 합성
쉬렝크에 따른 25 ml 아르곤 플라스크내 아르곤하에서 730 mg (0.684 밀리몰) 잘 건조된 테트라-Boc-[ε-아르기닐-리신-N-라우릴-N-미리스틸 아미드]를 제공하고 디옥산 중의 4N HCl 10 ml를 부가하였다(도 9). 이 혼합물을 실온의 아르곤 불활성 가스하에서 24시간 동안 교반하며, 약 8시간 후 용액으로부터 비정질의 부분적 왁스-상 고체로 생성물을 얻었다. CHCl3/MeOH/NH4OH 65:25:4 를 사용한 박층 크로마토그래피에 의해 제어되는 것과 같은 반응의 완료시, 모든 휘발성 성분은 고 진공하에서 제거하였다. 491 mg(0.633 밀리몰)의 ε-아르기닐-리신-N-라우릴-N-미리스틸 아미드를 트리클로라이드로서 얻었다.
실시예 16: 트리- Boc -γ- 카르바미디노 -α,γ- 디아미노 부티르산 [#16]의 합성
100 ml 둥근 바닥 플라스크 중 15 ml 아세토니트릴에 1.31 g(6 밀리몰) Boc-Dab-OH를 제공하고 12 밀리몰 디이소프로필에틸 아민(DIPEA)을 부가하였다(도 10). 이어 Boc-DAb-OH의 일부가 용해될 때 까지 물을 적가한 다음 1.96 g(5 밀리몰)의 1,3-디-Boc-2-(트리플루오로메틸술포닐)구아니딘을 부가하였다. 이 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하며, 회전 증발기를 이용하여 아세토니트릴을 제거하였다. 수성 잔류물을 5 ml 물로 희석시키고 50 ml 디클로로메탄을 부가하였다. 교반하에서 2N HCl을 부가하는 것에 의해 반응을 pH 2로 산성화시킨 다음 유기 상을 분리하였다. 수성 상은 50 ml 디클로로메탄을 사용하여 추출하며 모아진 유기 상은 희석 HCl 및 포화 NaCl 용액 약간으로 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고 용매는 회전 증발기를 이용하여 제거하였다. 잔류물을 실리카겔 60 상에서 헥산/에틸아세테이트 2:1 를 사용한 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 수율 50%에 상응하는 1.138 g (2.47 밀리몰)의 무색 비정질 고체를 수득하였다.
실시예 17: 베타- 아르기닐 -2,3- 디아미노프로피온산 -N- 팔미틸 -N- 올레일아미드 트리히드로클로라이드 [#6]의 합성
적하 깔때기를 포함하는 250 ml 쉬렝크 플라스크내, 아르곤 분위기하에서, 1.225 g (6 밀리몰) Boc-Dap-OH를 15 ml 무수 CH2Cl2에 현탁시키고 1.72 ml 트리메틸아민을 부가하였다. 30 ml 무수 CH2Cl2에 1.52 ml (12 밀리몰) TMSCI이 용해된 용액을 급격히 교반되는 실온에서 15 내지 20분간에 걸쳐 적가하였다. 한편 941 mg(5.8 밀리몰)의 카르보닐 디이미다졸을, 아르곤 분위기하, 100 ml 쉬렝크 플라스크 내에서, 8 ml 무수 CH2Cl2에 용해시켰다. 25 ml 무수 CH2Cl2에 2.66 g (5.6 밀리몰) Boc-Arg(Boc)2-OH가 용해된 용액을 교반하 실온에서 15 내지 20분간에 걸쳐 적가하였다. 양쪽 반응은 실온에서 4시간 동안 실시하였다. 이어, 832 ㎕ (6 밀리몰)의 트리에틸 아민을 첫째 용액에 부가하고 둘째 용액을 아르곤 분위기 실온에서 적하 깔때기를 통하여 15 내지 20분간에 걸쳐 적가하였다. 15 내지 20분 후 30 ml 물을 부가하고, 45분간 급격하게 교반한 다음 용액의 pH를 2로 조정하였다. 유기 상을 분리하고 수성상은 CH2Cl2를 사용하여 수회 추출하였다. 모아진 유기 상은 NaCl의 포화 용액 및 황산 나트륨을 사용하여 건조시키고 용매는 회전 증발기를 이용하여 제거하였다. 유리상 잔류물은 실리카겔 상에서 디클로로메탄을 용리액으로 사용하는 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제시켰다. 2.74 g(4.15 밀리몰; 74%)의 무색, 비정질 고체를 얻었다[화합물 17].
상기 고체를 실시예 10의 조건과 실질적으로 유사한 조건하에서 올레일 팔미틸 아민[#2]과 반응시키고, 온도는 35 내지 40℃로 설정하였다(수율 72%). 목적하는 최종 생성물 β-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드 [#6]는 실시예 11에 기재된 바와 같은 Boc 보호기를 절단해내는 것에 의해 수득하였다. 이렇게 수득한 생성물은 MeOH/물을 용리액으로 사용하여 RP-18 실리카겔 상에서 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제시켰다.
실시예 18: 양이온성 리포좀 및 siRNA 로 구성된 복합체( 리포플렉스 )의 제조
양이온성 리포좀 및 siRNA로 구성된 리포플렉스는 지질 막/케이크 재수화, 에탄올 주입 과정, 역전 상 증발 또는 세제 투석 과정과 같은 당업자에게 공지된 표준 수법을 이용하여 제조하였다[Liposomes as Tools in Basic Research and Industry; Jean R. Philippot and Francis Schuber; CRC Press January 1995 und Liposome Technology: Preparation of Liposomes: 001 Gregory Gregoriadis CRC Press I L1c. April 1984 참조].
이렇게 하여 수득한 것으로 이후 리포플렉스로 불리고 siRNA와 같은 핵산과 조합된 리포플렉스는 지질로서 β-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드 및 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 또는 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민을 포함하며, 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민의 사용이 바람직하다. 이러한 리포좀 및 리포플렉스의 지질 분획은 50몰% β-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드 및 50몰% 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 또는 50몰% 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민이었다.
50몰% β-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드 및 50몰% 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민으 조합물을 atuFect라 칭한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 기타 지질 및 지질 조성물은 앞에서 말한 수 법 뿐만 아니라 다른 가공 단계를 이용하여 제조될 수 있는 것으로 이해된다.
리포좀 및 리포플렉스는 크기, 다분산성 및 라멜라성(lamellarity)에 따라 이들을 조절하도록 추가의 공정 단계에 처리된다. 이들 특징은 초음파처리, 다공성 막을 통한 압출 및 균질화, 바람직하게는 고압 균질화에 의해 조정될 수 있다.
이렇게 형성된 리포좀 및 리포플렉스는 베크만-쿨터 N5 서브마이크론 입자 분석기를 구비한 광자 상관관계 분광기에 의해 특징지워질 수 있으며 또 이러한 리포좀의 압출 또는 고압 균질화에 의한 크기분류는 도 12A 및 12B에 도시되어 있다.
도 12A로부터 리포좀의 크기 분포는 상이한 크기 배제를 갖는 상이한 막을 사용하여 수정될 수 있음을 알 수 있고, 본 발명의 경우 1,000 nm 내지 4000 nm 이다. 양쪽 경우, 압출 단계는 21회 반복하였다. 그러나, 본 발명의 범위내에서 크기 배제는 약 50 내지 5000 nm 이고, 압출 단계는 10 내지 50회 반복할 수 있다.
도 12B로부터 알 수 있듯이, 고압 균질화는 리포좀의 크기 분포를 수정하기 위한 적합한 수단이며, 이러한 고압 균질화를 적용하는 경우 리포좀의 크기는 리포좀에 가해진 균질화 주기의 회수에 따라 달라진다. 전형적인 압력은 100 내지 2500 바아 범위이고, 본 발명에서는 적용된 압력은 1,500 바아이다.
실시예 19: atuFect 의 저장 안정성
본 명세서에 기재된 조성물을 약제학적 조성물로서 사용한 경우, 이러한 약제학적 배합물은 반드시 저장 조건에 안정해야 한다. siRNA의 저장 안정성을 연구하기 위하여, siRNA를 종양 억제자 PTEN에 대하여 고안하여 실시예 18에 기재된 바와 같이 atuFect를 사용하여 배합하였다.
보다 특히, 이하에 기재된 최종 스톡 용액 농도를 갖는 액체 스톡 용액을 사용하여 300 mM 수크로오스 용액중에서 액체 막 수화에 의해 리포좀을 제조한 다음 압출 및 고압 균질화처리하였다. 이렇게 수득한 리포좀을 이하에 기재된 바와 같은 siRNA 분자와 1:1 몰비로 혼합하거나, 지질층은 siRNA 존재하에서 재수화될 수 있으며, 이렇게 하여 균질화된 리포플렉스 압출물을 얻었다.
siRNA 분자는 다음과 같았다:
Figure 112006080780643-pct00006
상기 식에서, 진하게 나타낸 뉴클레오티드는 각 뉴클레오티드가 2'-O-메틸인 것을 나타낸다.
리포플렉스를 혈청 함유 배지 존재하에서 상이한 농도(siRNA 분자의 nM은 도 13에 도시함)에서 48시간 HeLa 세포 상에서 배양하였다. p110a (로딩 대조용) 및 PTEN 특이 항체를 사용하여 전체 세포 추출물에 의한 면역블로트(immunoblot)는 앞서 기재한 바와 같이 실시하였다 (표준-웨스턴-프로토콜).
적합한 냉동보호제(cryoprotectant)는 비제한적이나 수크로오스, 트레할로오스, 말토오스, 셀로비오스, 라피노오스, 갈락토오스, 만니톨 및 PEG를 포함한다. 본 실시예에서, 300 mM 수크로오스 용액을 PTEN 표적 siRNA를 함유하는 atuFect 배합물에 대한 담체로 사용하였다. 이 용액을 실온에서 유지하거나 4℃에서 7일간 또는 -80℃에서 7일간 저장하였다. 상기 용액을 혈청 함유 배지를 사용하여 최종 농도로 희석시켰다(20, 10, 5 nM). 시험은 HeLa 세포 상에서 세포 밀도 40,000 웰로 실시하였다. 결과를 도 13에 도시하며, 그로부터 냉동보호제 중 siRNA를 함유하는 atuFect를 냉동시키고 -80℃에서 7일간 저장하면, 해동후, 마치 4℃에서 저장된 것과 같이 효과적이라는 것을 알 수 있다.
실시예 20: 지질 조성물 및 siRNA 로딩( load )
2개의 상이한 유형의 지질 배합물을 제조하였다. 배합물 01은 양이온성 지질로서 50몰% β-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드 및 50몰% 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민으로 구성된 반면에, 지질 배합물 02는 양이온성 지질로서 50몰% β-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드 및 50몰% 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민으로 구성되었다. 각 지질 배합물은 PTEN에 대한 siRNA를 함유하였고, (스톡 용액 농도는 15 μM siRNA 및 1,445 mg/ml 지질이었다), siRNA의 잔기는 세포 상에서 적정하였더니 최종 온도 1 μM, 500 nM, 100 nM 및 50 nM이었다.
이들 PTEN 특이적 RNAi 함유 지질 배합물을 표준 세포 배양 조건하, 1.5 g/L 중탄산 나트륨 및 4.5 g/L 글루코오스, 90%; 우태아 혈청, 10%를 함유하도록 조정된 4 mM L-글루타민을 갖는 둘베코 변형 이글 배지에서 생장한 마우스 세포주(B16V, ATCC No.: CRL6475)로 투여하였다. 세포 밀도는 40.000 세포/6개 웰이었고 48시간 후 세포를 용균시키고 웨스턴 블럿 시험처리하여 그 결과를 도 14에 도시하였다. 키나제 PRK 2(베크톤 디킨슨)에 대해 특이적인 단일 클론 항체에 의해 얻은 신호는 PTEN 신호(단일클론 항체, 산타 크루즈 제조, CA)에 대하여 대조적으 로 로딩 대조용으로 사용하였다.
도 14로부터, 지질 배합물 01, 즉 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민을 함유하는 배합물은 siRNA 함량이 50 nM일 때에도 여전히 효과적이었지만, 헬퍼 지질로서 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민을 함유하는 지질 배합물 02는 PTEN 특이 항체(산타 크루즈, CA)에 의해 검출되는 바와 같이 siRNA 함량이 약 1 μM 이상이었을 때에만 PTEN의 녹다운을 생성할 수 있다는 것을 알 수 있다. 관련되지 않은 키나제 PRK2의 신호는 로딩 대조용으로 사용하였고 또 그에 대한 항체에 의해 검출되었다.
실시예 21: 지질 조성물 및 PEG 함량
β-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드(양이온성 지질)을 지질 성분으로 또 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPhyPE) 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리에틸렌글리콜-2000 (DSPE-PEG2000)를 포함하는 지질 조성물의 형질감염 및 전달효능에 대한 PEG의 효과를 시험하기 위하여, 본 명세서에 기재한 바와 같은 방법에 따라서 하기 배합물을 생성하였다.
Figure 112006080780643-pct00007
Figure 112006080780643-pct00008
상술한 배합물에 대하여 지질 농도는 1.445 mg/ml이었고, siRNA 농도는 300 mM 수크로오스 중 15 μM 이었다. 형성된 농축 스톡 복합체를 희석하여 세포 배양 배지 중 최종 농도 20, 10, 5 nM siRNA를 얻었다.
상기 배합물에 함유된 RNAi 분자는 PTEN에 대한 것이고 그 서열은 실시예 22에 기재되어 있다. 지질 배합물을 40,000 세포/웰을 각각 함유하는 6개 웰 플레이트에 함유된 HeLa 세포에 투여하였다. 이 세포를 PTEN 발현에 대해 분석하였고 그 결과를 웨스턴 블럿으로 도 15에 도시하였다. p110a 발현은 로딩 대조용으로 사용 하였고 p110a에 대하여 특이적인 단일클론 항체에 의해 검출하였다. 도 15에 도시된 웨스턴 블럿으로부터, 약 1 내지 2몰% 헬퍼 지질 함유 PEG가 PTEN 발현의 효과적인 녹다운을 제공하기에 적합하다는 것을 알 수 있다.
양이온성 지질 성분이 PEGylated(페길화) 헬퍼 지질에 의해 치환되기 보다는 DPhyPE 성분이 PEGylated(페길화) 헬퍼 지질에 의해 치환되는 것이 바람직하다고 결론지을 수 있다. 이것은 H 배합물이 C 배합물에 비하여 더 강력할 것인지에 대한 상기 실험으로부터 알 수 있다. PEGylated(페길화) 헬퍼 지질의 함량은 바람직하게는 약 0.05% 내지 4.9%, 바람직하게는 1 내지 3%, 더욱 바람직하게는 2 내지 3% 이다.
실시예 22: siRNA 함유 지질 배합물의 생체내 용도
본 발명에 따른 siRNA 함유 지질 배합물의 적합성을 시험하기 위하여, 지질 배합물은 마우스 모델에서 사용하였다. 소위 마우스당 약 2.5 ml 액체인 약 10% 체중에 상응하는 부피가 꼬리 정맥으로 급격히 주사되는 생체내의 간으로 siRNA를 전달하기 위해 흔히 사용되는 소위 하이드로다이나믹 압력 주사와 대조적으로, 본 발명에서 생체 내 시험은 siRNA 함유 지질 배합물을 전신적으로 아주 낮은 부피(200 내지 300 ㎕)로 느리게 투여, 즉 수초간에 걸쳐서 마우스의 꼬리 정맥에 주사하는 것에 의해 실시하며, 그에 의해 임상적으로 관련된 투여 모드를 실시하였다. 이 실험 과정은 도 16에 도시하였다.
기능적으로 정상인 쥐의 배 섬유모세포(RAT2; ATCC: CRL-174)를 발암성 Ras (RasV12)를 사용하여 형질전환시켰다. 형질전환된 RasV12 의존형 섬유모세포를 마우스(그룹당 6마리 마우스; 8주령 웅성 Shoe:NMRI-nu/nu, DIMED, 독일)에 주입하며, 10일후 종양을 형성하였다. 이 단계에서, 상기 동물은 형질전환된 섬유모세포의 주사후 19일이 지날 때 까지 처리하지 않거나 또는 다양한 배합물을 사용하여 처리하였다. 다른 대조용으로서 기능적으로 정상인 쥐 배아 섬유모세포를 종양을 형성하지 않은 마우스에 주사하였다.
본 명세서에서 T-Ras로도 칭하는 siRNA 분자는 5' - 3' 방향의 다음 서열
Figure 112006080780643-pct00009
을 갖는 제1 스트랜드 T-Ras 3A 및 5' - 3' 방향의 다음 서열
Figure 112006080780643-pct00010
을 갖는 제2 스트랜드로 구성되었다. 상기에서 진하게 표시되고 또 밑줄친 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 뉴클레오티드이다. 어떤 스트랜드에서든, 3' 말단은 상기 서열에서 P로 표시된 포스페이트로 시작한다.
대조용으로서 PTEN 특이적 siRNA 분자는 다음 서열 5'
Figure 112006080780643-pct00011
3'을 갖는 제1 스트랜드 및 다음 서열 5'
Figure 112006080780643-pct00012
3'을 갖는 제2 스트랜드를 갖도록 고안되며, 상기에서 수식 패턴은 T-Ras 3A 및 T-Ras 3B와 관련하여 요약된 바와 동일하다.
다음 배합물을 마우스 모델에 투여하였다:
배합물 패널 A:
PBS;
T-Ras 3: 10 mg/kg/atuFect/3.7 mg/kg;
네이키드 T-Ras 3 10 mg/kg; 및
T-Ras 3 5 mg/kg/atuFect 38.5 mg/kg.
배합물 패널 B:
PBS;
atuFect 오직 38.5 mg/kg;
PTEN 10 mg/kg/atuFect 38.5 mg/kg; 및
T-Ras 3 5 mg/kg/atuFect 38.5 mg/kg.
배합물 패널 C:
수크로오스 (50 mM);
T-Ras 3 3.75 mg/kg/atuFect-PEG 28.9 mg/kg, 정맥투여; 및
T-Ras 3 3.75 mg/kg/atuFect-PEG 28.9 mg/kg, 복강내 투여.
본 명세서에 사용된 바와 같은 atuFect-PEG는 50 mM 수크로오스 중 50몰% β-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드, 48몰% 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 및 2% 디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-폴리에틸렌글리콜-2000 (DSPE-PEG2000)를 의미한다.
동물에서 투여는 5 mg/kg siRNA 및 38.5 mg/kg 총 지질이며; 주사액에서 이 성분의 농도는 0.5 mg/ml siRNA 및 3.85 mg/ml 총 지질이며; 몰 비는 siRNA: 0.04 μ몰/ml (분자량 약 12500 Da)에 상응하는 0.5 mg/ml 이었다. 지질은 3.85 mg/ml 총 지질이며, 양이온성 지질의 함량은 2.3 μ몰/ml에 상응하는 1.97 mg/ml (분자량 843.6)이었다. 양이온성 지질에 대한 siRNA의 몰비는 0.0174 내지 1 이다.
이들 실험의 결과를 도 17A(배합물 패널 A), 도 17B(배합물 패널 B) 및 도 17C(배합물 패널 C)에 도시하며, 이것은 시간 함수, 즉 세포 투여 후 일수에 대한 종양 부피를 나타낸다.
도 17A 및 도 17B로부터 알 수 있듯이, atuFect와 함께 배합된 T-Ras 특이적 siRNA로 구성된 리포플렉스는 가장 강한 억제를 나타내며 또 표적 특이성을 나타낸다. 음성 대조용 분자 PTENV10은 atuFect만 비교할 때 종양 생장의 향상된 억제를 나타내지 않았다(도 17B).
도 17C로부터 알 수 있듯이, atuFect-PEG는 아주 효과적이며 정맥투여 뿐만아니라 복강내 투여를 가능하게하며 유사한 효과를 나타낸다. 그와 관련하여 PEGylated(페길화) 복합체는 기능적으로 활성이며 또 PEGylation(페길화)로 인하여 지질 조성물은 페길화 (헬퍼) 지질을 갖지 않는 유사한 지질 조성물보다 훨씬 독성이 덜한 것이 분명하다.
실시예 23: 실시예 24 내지 27에 대한 재료 및 방법
siRNA - 리포플렉스의 제조
양이온성 지질 β-L-아르기닐-2,3-L-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일- 아미드 트리히드로클로라이드, 중성 인지질 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, AL) 및 페길화된 지질 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 나트륨 염(Lipoid GmbH, 루드비히샤펜, 독일)을 몰비 50/49/1로 포함하는 양이온성 리포좀은 300 mM 멸균 RNase를 갖지 않는 수크로오스 용액 중에서 지질 막을 재수화시켜 총 지질 농도 4.34 mg/ml로 만드는 것에 의해 제조하였다. 이어 뭇층판(multiamellar) 분산액은 EmulsiFlex C3 장치(Avestin, Inc., Ottawa, Canada)를 이용한 고압 균질화(750 바아에서 22 주기 및 1000 바아에서 5 주기)에 의해 처리하였다. 수득한 리포좀 분산액은 300 mM 수크로오스 중의 siRNA 0.5625 mg/ml 용액 동일 부피와 혼합하여, 양이온성 지질 질소 원자에 대한 핵산 주쇄 포스페이트 의 계산 전하비 약 1 내지 4를 나타내었다. 리포플렉스-분산액의 크기는 Quasi Elastic Light Scattering (N5 Submicron Particle Size Analyzer, Beckman Coulter, Inc., Miami, FL)에 의해 측정된 바와 같이 약 120 nm 이었다. 시험관내 실험의 경우, 상기 분산액을 10% 혈청 함유 세포 배양 배지에서 2-50nM siRNA 농도로 희석하였다.
동물 실험
가슴샘없는 웅성 누드 마우스(Hsd:NMRI-nu/nu, 8주령)를 이 연구에서 사용하였다. 확립된 종양 이종이식편 상에 대한 종양 치료 연구를 위해, 총 5.0 x 106 세포/100 ㎕ (3Y1-RasV12 에 대하여 50% 마트리겔 존재하)를 피하 이식하였다. 종양 치 료 실험을 위하여, 리포좀 siRNA 복합체 용액을 저압, 저 부피로 꼬리 정맥에 정맥 주사로 투여하였다. 30g 마우스에 대하여 0.28 mg/ml siRNA 및 2.17 mg/ml 지질을 함유하는 스톡 용액(1.88 mg/kg siRNA 및 14.5 mg/kg 지질에 상응함)의 200 ㎕ 주사부피를 사용하여 주사 계획을 달리하여(매일 대 이틀에 한번) 상이한 투약을 실시하였다. 캘리퍼스를 이용하여 종양 부피를 측정하고 다음 식
부피 = (길이 x 폭2)/2
에 따라 계산하였다. 이 연구에서 모든 동물 실험은 Landesamt fur Arbeits-, Gesundheitsschutz und technische Sicherheit Berlin, Germany (No. G0264/99)의 지도에 의해 순응하고 승인된 수순에 따라 실시하였다.
통계학적 분석
평균 ± S.E.M. 통계학적으로 유의미한 차이로 표현된 데이터는 맨-휘트니(Mann-Whitney) U시험에 의해 측정하였다. P값 < 0.05는 통계학적으로 유의미한 것으로 간주되었다.
세포 배지 및 마우스에서 siRNA - Cy3 흡수 실험
세포 배지에서, 비-배합 siRNA-Cy3 분자의 흡수 연구를 위해 HeLa 세포를 정의된 양의 siRNA 용액과 함께 무혈청 배지에서 철야로 배양하였다. 리포플렉스화된 siRNA-Cy3 세포의 흡수는 이하에 언급된 바와 같이 철야 형질감염에 의해 실시되었다. 처리된 세포를 얼음 냉각 PBS로 헹구고 현미경 관찰 전에 4% 포름알데히드/PBS 용액에서 15분간 고정하였다. 후기(late) 엔도좀 및 라이소좀을 라벨링하기 위하 여, 세포를 제조자의 추천에 따라 형광 염료 LysoTracker (Molecular Probes)와 함께 배양하고 고정후 공촛점 현미경으로 조사하였다. 생체내에서 형광적으로 라벨링된 siRNA-Cy3을 사용한 생체내 전달 실험은 배합된 및 네이키드 siRNA를 정맥투여함으로써 실시하였다. 1.88 mg/kg siRNA-Cy3 및 14.5 mg/kg 지질의 최종 투여량으로 마우스를 단일 200 ㎕ 정맥 투여로 처리하였다. 소정 시간에 마우스를 죽이고 형광 흡수를 포르말린 고정된, 파라핀 매립된 또는 OCT 축적된 냉동 조직 부분 상에서 현미경으로 조사하였다.
시험관내 형질감염
인간 HUVEC, HeLa, PC-3 세포 뿐만 아니라 쥐의 EOMA 및 NIH3T3 세포주를 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 얻고 ATCC의 추천에 따라 배양하였다. 인간의 간세포주 HuH-7은 MDC(베를린)로부터 구입하였다. 발암 RasV12 를 발현하는 쥐 3Y1 세포는 유도성 RasV12 를 기재된 바와 같이38 형질유도에 의해 생성하였다.
이들 세포주를 상기 기재한 양이온성 리포좀을 사용하여 siRNA와 형질감염시켰다. 요컨대, 세포 감염된지 약 12시간 후 혈청 함유 배지에서 희석된 상이한 양의 siRNA-리포플렉스 용액을 세포에 부가하여 1-50 nM siRNA 범위의 형질감염 농도를 달성하였다. 형질감염(48시간) 후 세포를 용균시키고 기재된 바와 같이20 면역 블로팅 처리되었다. 면역블로팅에는 다음 항체들이 사용되었다: 토끼 항-PTEN (Ab-2, 네오마커스), 단일클론 p110α/p8539, 토끼 항-PKN38, 염소 항-CD 31 (산타크루즈 바이오테크놀로지), 토끼 항-CD34 (산타크루즈 바이오테크놀로지), 토끼 항-포스포릴화된 Akt (S473)(Cell Signaling Technology).
생체내 BrdU 분석
생체내에서 세포 증식을 측정하기 위하여, 마우스를 복강내 주사에 의해 BrdU (시그마 제조; 250 mg/kg) 처리시키고 2시간 후에 도살시켰다. 간 또는 종양 조직의 포르말린 고정되고 파라핀 매립된 부분을 제조자의 수순에 따라 BrdU 염색처리시켰다(BrdU In situ detection kit, Pharmingen).
미세혈관 밀도의 측정( MVD )
미세혈관의 갯수는 단일 종양 부분24 의 3-8개 선택 영역에서 CD31-/CD34-양성 혈관을 산출함으로써 측정하였다. 혈관 단위로서 혈관 갯수는 형상, 분기 점( branch point) 및 관내강 크기("혈관의 갯수"로 칭함)에 무관하게 평가하였다. 또한 혈관 밀도는 Axiovision 3.0 소프트웨어 (Zeiss)를 이용하여 CD31-/CD34-양성 혈관 구조("혈관 길이의 합"이라 칭함)의 측정에 의해 평가하였다. Zeiss Axioplan light 현미경을 이용하여 200x 배율로 종양 부분을 주사(scanning)함으로써 산출하였다.
조직학적 분석 및 현미경
마우스를 도살시킨 후, 조직을 4.5% 완충 포르말린에 16시간 동안 고정시킨 다음 파라핀 매립 처리시켰다. 4μm 부분을 절단하고 유리 슬라이드에 두었다. 조직 부분을 염소 다클론 항-CD31/PECAM-1 (1:1000, 산타 크루즈 바이오테크놀로 지)(냉동부분 쥐 CD31의 경우, 1:100, Pharmingen) 및 쥐-단일클론 항-CD34(Cedarlane)에 의해 염색시켜 파라핀 부분에서 내피세포를 가시화시켰다. 파라핀 조직 부분 상에서 대조 염색되는 면역조직화학 및 헤마토실린/에오신 (H&E)을 표준 수법에 따라 실시하였다. 형광으로 라벨링된 siRNA의 생체내 흡수 연구를 위해, 파라핀 부분을 Zeiss Axioplan 현미경을 이용한 표면형광에 의해 직접적으로 조사하였다. 상들을 기록하고 Zeiss LSM5 이메이징 소프트웨어를 이용하여 처리하였다. siRNA의 깊이 미시적 분석에서 흡수는 Zeiss LSM510 메타 공촛점 현미경을 이용하여 실시하였다. 이를 위하여, 크실렌을 사용하여 상기 부분에서 파라핀을 제거하고, 등급 에탄올 세척을 통하여 재수화시키고, 시톡스 그린(Sytox Green) 염료(Molecular Probes 100 nM; 10분)로 염색시키고, 세척한 다음 현미경에 대해 FluorSave (Calbiochem) 에서 계수하였다. NIH3T3 세포의 면역형광 염색은 다음 항체를 사용하여 기재40된 바와 같이 실시하였다: 면역조직화학-특이적 토끼 항-인산화-Akt (S473)(Cell Signaling Technology) 및 마우스 항-α-투불린 (DMIA, Calbiochem).
표 1
Figure 112006080780643-pct00013
Figure 112006080780643-pct00014
실시예 24: 시험관내 및 생체내에서 네이키드 siRNA 및 배합 siRNA 의 전달
이 연구에서, 우리는 양쪽 스트랜드16 상에서 2'-O-메틸 당 변형을 바꾸는 것에 의해 화학적으로 안정화된 3'-오버헹(overhang)을 갖지 않는 19-mer siRNA 듀플렉스를 이용하였으며, 비변형 뉴클레오티드는 대향 스트랜드상의 변형된 뉴클레오티드와 마주 본다. 사용된 siRNA 분자는 실시예 23에 기재되어 있다.
첫 단계로서, 우리는 이들 분자가 세포 배지 중의 RNAi를 매개하는지 여부를 전달 운반체(vehicle) 부재하에서 분석하였다. 면역블로트 분석은 siRNA-리포플렉스에 대해 사용된 나노몰 농도에 비교하여 마이크로몰 농도로 네이키드 siRNA가 적용될 때 아무런 유전자 침묵이 생기지 않음을 나타내었다. 이러한 결과를 도 18a에 도시한다.
보다 자세하게 기재한 도 18a로부터 알 수 있듯이, 리포플렉스화된 siRNA에 대하여 PKN3 단백질 발현의 농도 의존적 억제가 있었지만, 면역블로트에 의해 평가된 바와 같이 HeLa 세포 중의 네이키드 siRNA는 그렇지 않았다. PTEN은 로딩 대조용으로 사용하였다.
우리는 또한 비변형 통상의 siRNA (21-mer, 2 뉴클레오티드 3'-오버헹)6 및 콜레스테롤-결합된 또는 펩티드-결합된 siRNA를 비롯한 몇 개의 결합 분자를 시험하였지만, 전달 운반체 부재하에서 내생 단백질 발현을 감소시키는 특이적 표적은 검출되지 않았다(데이터 나타내지 않음)
유전자 침묵의 결핍이 음이온성 siRNA와 음으로 하전된 세포막 사이의 반발 효과에 기인한 불충분한 세포 흡수의 결과인지 여부를 분석하기 위하여, 우리는 공 촛점 현미경에 의한 흡수를 연구하기 위해 3' 형광적으로(Cy3) 라벨링된 siRNA를 이용하였다. 우리와 다른 사람들은 전부터 안티센스 분자의 3' 말단에서 형광 라벨링이 전달 운반체16 ,17 에 의한 형질감염시 RNA 침묵 활성을 손상시키지 않음을 밝혀낸바 있다. 놀랍게도, 우리는, 고농도의 siRNA-Cy3 분자를 적용할 때, 형질감염제 부재시에도 형광적으로 라벨링된 siRNA가 상당히 흡수됨을 발견하였다. 그러나, LysoTracker 마커에 의한 공동국재(co-localization)에 의해 드러나는 바와 같이, 대다수의 형광 라벨은 후기 엔도좀/라이소좀 소포에서 끝나는 것으로 나타났으며, 이는 비-배합 siRNA는 엔도좀 경로에 관련되어 있다는 것을 나타낸다. 대조적으로, 리포좀 착물로 형질감염된 siRNA는 이들 소포로부터 분리되어 세포질로 방출되었다. 이들 결과는 siRA의 리포좀 배합물은 siRNA의 기능적 전달에 대하여 적어도 2개의 유리한 효과를 제공함을 나타낸다: 즉 향상된 세포 흡수 및 중요하게는 세포내이입 경로/엔도좀 경로로부터 RNAi-매개된 mRNA 분해가 생기는 곳인 세포질18로의 방출.
도 18b의 자세한 내용은 다음과 같다:
도 18b는 네이키드 siRNA 및 배합 siRNA의 세포내 분포를 도시한다. 형광으로 라벨링된 siRNA-Cy3은 좌측 및 중앙 패널의 HeLa 세포에서 공촛점 현미경에 의해 분석하였다. 우측 패널은 LysoTracker를 사용하여 대조염색한 후 서브세포 분포의 합쳐진 그림(녹색; 화살표, 엔도좀/라이소좀 구획에 대한 siRNA-Cy3 국소편재)을 나타낸다. 윗줄은 네이키드 siRNA-Cy3이고; 아랫줄은 리포플렉스화된 siRNA-Cy3 이다.
리포좀 배합물이 생체내에서 siRNA의 약리학적 특성을 변화시키는지 여부를 분석하기 위하여, 우리는 (저 부피 및 저압) 단일투여량의 siRNA-Cy3 분자(1.88 mg/kg siRNA)를 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 췌장, 폐, 신장 및 전립선을 포함하는 몇 개 기관의 현미경 분석은 배합된 siRNA에 의해 Cy3 특이적 형광의 현저한 증가를 나타내었다(데이터 나타내지 않음). 최고 형광량은 모두 분석된 시간(1시간, 4시간, 24시간 후 주사, 도 18c)에서 리포좀 배합된 siRNA로 처리된 마우스의 간에서 검출되었다. 이러한 결과는 네이키드 siRNA의 투여와 비교할 때 리포플렉스로 배합된 siRNA 분자의 더욱 우수한 생체분포를 나타낸다.
그러나, 전체 기관에서 향상된 생체분포는 전달된 siRNA의 기능성의 전제조건인 이들 분자의 세포내 또는 세포유형 특이적 흡수를 반드시 나타내는 것은 아니다. 배합 siRNA-Cy3의 간에서 흡수를 공촛점 현미경에 의해 더욱 자세히 분석하면 세포 레벨 형광 염색은 혈관 및 굴모양혈관의 내층에서 주로 존재함이 밝혀졌다 (도 18c, 아래 패널). 간 혈관을 근접 조사하면 내피세포층이, PBS 대조용과는 대조적으로, 형광 siRNA-Cy3에 의해 분명히 라벨링되어 있는 것을 알 수 있다(도 18d, 윗줄). 내피세포 내부에서 siRNA-Cy3은 세포질에만 존재한다(도 18d, 하부 패널). 동일 염색 패턴이 비-고정 간 냉동부분에서 발견되었으며, 이것은 어떠한 포르말린 고정된 인공물을 제외한다(데이터 표시되지 않음). 형광으로 라벨링된 리포플렉스화된 siRnA가 종양 혈관계를 표적으로하는지 여부를 시험하기 위하여, 우리는 상이한 실험 종양을 갖는 마우스에 siRNA-Cy3 리포플렉스를 단일 정맥 주사하였 다. 3개의 모든 실험 종양 이종이식편(2개는 피하(s.c), 및 1개는 간세포내(i.hep)로 투여)에서 종양 혈관계에서 현저한 형광 신호를 검출하였다(도 18e, 화살표). 종양 혈관계의 내피세포층에 의한 siRNA-Cy3 흡수는 항-CD34 항체, 내피세포 마커(도 18e, 하부 패널)과 대조 염색에 의해 확인하였다. 또한 내피세포에 의한 리포플렉스-siRNA의 흡수는 형광으로 라벨링된 지질(나타내지 않음)을 사용하여 확인하였다. 상기를 고려하면, 이들 데이터는 siRNA의 양이온성 지질계 배합물은 siRNA의 동적 및 분포 특성을 향상시키고 또 siRNA가 내피세포로 잘 흡수되게 함을 보여준다.
도 18c에 도시된 결과에 대한 실험 셋팅은 다음과 같았다. 네이키드 또는 리포플렉스화된 siRNA-Cy3을 단일 정맥 주사로 투여하고, 지시된 시간의 간 조직 부분을 표면형광 현미경(상부 패널)에 의해 분석하였다. 간 부분의 하부 패널, 근접 공촛점 현미경 상은 리포플렉스(우측 그림, siRNA-Cy3, 적색; 핵, Sytox Green과 대조 염색에 의해 녹색)와 대조하여 비-배합 siRNA-Cy3 (죄측 그림)의 분포를 나타낸다. 상기 상들은 동일 세팅으로 기록하였다. 간 혈관(화살표) 및 굴모양혈관(이중 화살표)의 염색 세기를 비교한다.
도 18d의 자세한 내용은 다음과 같다. PBS 처리된 대조용 부분(좌측 패널)과 대조적으로, 간 혈관의 내피세포 내층을 형광 siRNA-Cy3 (우측 패널)으로 장식하였다.
공촛점 현미경은 배합된 siRNA-Cy3 (적색, 합쳐짐)의 간 내피세포 (적혈구 세포, 이중 화살표)로 세포질 전달을 나타내었다. 핵에서 형광은 검출되지 않았다 (녹색, 화살표).
도 18e에 도시된 결과에 대한 실험 세팅은 다음과 같았다. 상이한 종양의 내피세포를 화살표로 표시한 바와 같은 리포좀 배합된 siRNA(siRNA-Cy3, 적색; 핵, 녹색)에 대해 표적화하였다. 윗줄은 피하 생장한 PC-3 종양(좌측 패널) 및 RasV12 형질전환된 3Y1 쥐 섬유모세포 종양(중앙 패널) 또는 간세포내에서 생장한 HuH-7 종양(우측 패널)으로부터 얻은 부분의 형광 상을 도시한다. 아랫줄은 HuH-7 종양의 내피세포에서 리포좀 전달된 siRNA-Cy3의 검출을 도시한다. 종양 내피세포는 얇은 세포질과 뚜렷한 핵(화살)을 특징으로 하는 H&E 염색(죄측 패널)에 의해 나타내었다. 연속 부분은 siRNA-Cy3 형광(적색, 중앙 패널) 및 내피세포의 항-CD34 면역염색(우측 패널)을 나타낸다.
실시예 25: PTEN 특이적 siRNA 의 간 및 종양 내피세포로의 기능적 전달
생체내 내피세포에서 내생 유전자 발현을 침묵하는 siRNA-리포플렉스의 능력을 나타내기 위하여, 우리는 포스포이노시티드 3-키나아제(PI 3-키나아제)의 길항물질인 종양 억제인자 PTEN을 표적으로 선택하였다. 우리는 내피 세포 핵에서 BrdU 혼입에 의해 증가된 DNA 합성을 측정하는 것에 의해 양성 판독계에서 PTEN 의 기능적 유전자 침묵을 모니터링하려 하였다. PTEN 발현의 손실은 만성적으로 PI3-키나아제 신호를 활성화시키는 것으로 알려져 있으며, 이것은 하류 키나아제 Akt19 (도 19a)의 인산화 증가에 의해 측정될 수 있다. PI3-키나아제의 만성적 활성화는 DNA 합성2 0 합성 증가율에 의해 부수될 수 있다.
먼저, 선택한 siRNAPTEN(실시예 23 참조), 표적 마우스 및 인간 PTEN mRNA의 RNAi 활성은 지질-매개 형질감염에 의해 시험관내에서 확인하였다(도 19a). 매 뉴클레오티드에서 2'-O-메틸 변형을 갖는 동일한 siRNA 서열을 음성 대조용(siRNA대조용)으로 사용하였으며, 이것은 균일한 변형 패턴이 RNAi 활성을 완전히16 제거하기 때문이다. PTEN 단백질 녹-다운 및 Akt의 인산화 증가는 면역 블로팅에 의해 관찰하였다. 면역형광 연구에 의해 활성 siRNAPTEN 분자의 존재하에서 향상된 Akt 인산화를 확인하였다(도 19a). 이것은 siRNAPTEN 분자가 세포 배지에서 PI 3-키나아제 신호발생을 활성화하는 능력을 보여준다.
생체내에서 PTEN 유전자 침묵에 대해 시험하기 위해, 마우스(그룹당 4마리)를 3일 연속 저압, 꼬리 정맥 주사("방법" 참조)로 PBS, 네이키드 siRNAPTEN , siRNAPTEN -리포플렉스 또는 지질 운반체와 처리하였다. 처리 4일째되는 날에, BrdU를 마우스에 주사하고 2시간 후 마우스를 죽이고 BrdU 양성 핵에 대한 간 부분의 면역조직학적 염색에 의해 BrdU 혼입을 측정하였다. 소형의 내피세포 및 인산화된 Akt 및 PTEN 특이적 항체에 의해 신뢰성있는 신호를 검출하는데 있어서 어려움은 그자리에서 단백질 녹-다운의 검출을 허용하지 않는다. 그러나, 형광 라벨링된 siRNA를 내피세포로 전달하는 관찰 세포 특이성과 일치하게, 우리는 리포좀 siRNAPTEN 에 의해서만 간 내피세포에서 BrdU 양성 핵의 현저한 증가를 관찰하였다 (도 19b). 종양을 갖는 마우스를 사용한 유사한 실험도 리포좀 배합된 활성 PTEN-siRNA 처리후 종양 내피세포의 BrdU-양성 핵의 갯수의 현저한 증가를 나타내었다(도 19c). 불활성의 충분히 메틸화된 대조용 분자 siRNA대조용는 PBS 대조군에 대한 BrdU 혼입 증가를 유발하지 않았다. 우리는 이들 데이터로부터, 양이온성 지질과 배합된 안정화된 PTEN-특이적 siRNA는 생체내에서 작용하여 전신 투여후 내피세포에서 유전자 침묵을 유발하는 것으로 결론지을 수 있다.
도 19a의 자세한 내용은 다음과 같다. 시험관내에서 안정화된 PTEN 특이적 siRNA(10 nM)의 형질감염은, 면역블로트(우측 상부 패널; PI 3-키나아제 서브유닛 p110α, p85, 영향을 받지 않은 로딩 대조용)에 의해 나타나는 바와 같이, PTEN 단백질 양을 감소시키며 하류 키나제 Akt(P*-Akt)의 인산화를 증가시켰다. siRNA대조용는 충분히 메틸화된 불활성 siRNAPTEN 분자를 나타낸다; ut, 미처리 세포이다. 인산화된 Akt의 증가는 siRNAPTEN 에 의해 형질감염된 NIH3T3 세포에서 면역형광 염색에 의해 가시화되었다(인산화된 Akt, 적색; 세포 형태학에 대한 마커로서 항-α-투불린 , 녹색).
도 19b는 대표적인 그림(상부 패널) 및 상응하는 정량화(하부 다이아그램)을 도시하며, PBS, 네이키드 siRNAPTEN , 리포플렉스화된 siRNAPTEN 및 양이온성 리포좀으로 처리된 동물로부터 얻은 간 샘플에서 BrdU 양성 내피세포 핵(화살표)의 갯수의 현저한 차이를 나타낸다(각 처리에 대해 2개 그림 도시).
통계학적 유의성: 네이키드 siRNAPTEN 대 siRNAPTEN -리포플렉스, *P = 0.0286; 리포좀 대 siRNAPTEN -리포플렉스, *P = 0.0286.
도 19c의 자세한 내용은 다음과 같다: DNA 합성에 대한 리포플렉스화된 siRNAPTEN 의 서열 특이성은 종양 혈관계에 대한 BrdU 분석에 의해 확인하였다. siRNA대조용-리포플렉스와 대조적으로 siRNAPTEN -리포플렉스로 처리된 동물로부터 얻은 종양 혈관(V)에서 증가된 BrdU 양성 핵(화살)이 검출되었다. Tu: 종양 조직. 내피세포에서 BrdU-양성 핵의 정량은 현저히 증가하였다: siRNAcontrol-리포플렉스 대 siRNAPTEN -리포플렉스 *P = 0.032
실시예 26: CD31 의 생체내 유전자 침묵
생체내 siRNA 매개 유전자 침묵을 보다 직접적으로 나타내기 위하여, 우리는 내피세포에서 선택적으로 발현된 유전자를 표적으로 집중하였다. 우리는 CD31로 공지된 혈소판-내피세포 접착 분자 1(PECAM-1)를 적합한 표적으로 선택하였는데, 그 이유는 그의 발현이 혈관계의 세포, 주로 혈소판, 단구, 중성구 및 선택된 T 세포21 -23 뿐만아니라 내피세포에 한정되기 때문이다.
마우스 및 인간 유래 내피세포 세포주(HUVEC, EOMA)에서 2'-O-메틸 변성 siRNA 분자(실시예 23 참조)의 스크리닝은 몇 개의 강력한 인간 및 마우스 특이적 CD31-siRNA 분자의 확인을 초래하였다(도 20a). 가장 강력한 siRNA 분자, siRNACD31 -8 은 실시예 23에 기재된 바와 같이 리포좀 배합되었고 또 2일 또는 7일에 걸쳐 종양을 갖는 마우스에 전신 투여되었다. 대조용 마우스는 특이성을 시험하기 위하여 등장액 수크로오스 용액 또는 리포플렉스화된 siRNAPTEN으로 처리하였다. 처리 후, 마우스를 도살시키고 실시간 RT-PCR (TaqMan) 및 면역블로팅에 의해 다양한 조직에서 유전자 침묵을 분석하였다.
siRNACD31 -8 -리플렉스에 처리된 마우스에서 CD31 mRNA의 감소가 종양, 간 및 폐에서 관찰되었지만, 비장 조직 샘플에서는 관찰되지 않았다. CD31 mRNA 양의 관찰된 감소는 mRNA 절단을 기본으로 한 작용의 RNAi-모드에 상응한다(도 20b). 또한 CD31 단백질 양의 현저한 감소는, 대조용 마우스에서 관찰된 비변경 단백질 양과 대조적으로, 2일 연속 siRNACD31 -8 -리포플렉스로 처리된 마우스로부터 얻은 종양 및 간 용균물에서 검출되었다(도 20c, 좌측 패널).
특이성 및 동일 로딩을 시험하기 위하여 우리는 CD34, 다른 내피세포 마커 단백질 뿐만 아니라 PTEN의 단백질 양을 상기 용균물에서 분석하였다. 우리는 또한 비장 및 폐에서 얻은 전체 세포 추출물을 조사하였지만, 우리는 이들 기관에서 면역블로트 분석에 의한 신뢰성있는 CD31 단백질 발현을 검출하지 못했다(데이터 나타내지 않음). CD31 단백질 녹-다운은 7일간 매일 정맥 주사에 의한 비-종양 마우스상에서 독립적 실험으로 확인하였다(도 20c, 우측 패널).
또한 CD31 발현 감소는 이종이식편 종양 마우스 모델에서 내피세포 마커 CD31 및 CD34에 대한 미세혈관 밀도(MVD)의 차이를 측정하는 것에 의해 그 자리에 서 나타내었다. MVD 측정은 종양 신행혈관형성에 대한 대리 마커이며 CD31 또는 CD34 특이적 항체24 - 26 를 사용한 혈관의 면역조직학적 염색에 의해 분석하였다. 배합된 CD31 및 PTEN특이적 siRNA를, 2일째에, 정상 부피(200㎕) 및 정상 압력에서 종양을 갖는 마우스 (종양 크기 800 mm3)에 꼬리 정맥 주사에 의해 투여하였다. 3일째되는 날 마우스를 도살시키고 CD31 및 CD34 항체를 사용한 면역염색 후 연속 부분 사이의 MVD를 비교하였다.
리포플렉스화된 siRNACD31 - 8 으로 처리된 마우스는, 혈관의 총 갯수 뿐만 아니라 혈관 길이에 의해 측정되는 바와 같이, CD31 양성 혈관의 총 양의 현저한 증가를 나타내었다(도 20d). CD34 특이적 항체에 의한 염색은 MVD 변화를 나타내지 않았으며, 이는 특이적 CD 31 침묵을 나타낸다. 대조군으로서 siRNAPTEN 및 등장 수크로오스 처리는 CD31 또는 CD 34 염색에 의한 MVD 평가에서 차이를 나타내지 않았다. 이 결과와 더불어 mRNA 및 단백질 녹-다운에 대한 분자 데이터는 리포플렉스화된 siRNACD31 - 8 의 전신 투여에 의한 CD34 양성 내피세포의 감소없이 CD31 발현의 특이적 감소를 나타낸다. 우리는 생체내 CD31 (PECAM-1) 유전자 침묵은 종양 및 간의 혈관계 중 양이온성 지질 배합 siRNA를 투여함으로써 달성될 수 있다고 결론지었다.
도 20a의 자세한 내용은 다음과 같다. 도 20a는 효과적인 CD31 녹-다운의 강력한 안정화된 siRNA의 확인을 나타낸다. HUVEC 및 쥐의 EOMA 세포를 4개의 상이한 인간, 마우스 특이적 siRNA 표적 CD31 (CD31-1, -2, -6, -8) 및 대조군 PTEN-siRNA로 형질감염시켰다. 특이적 단백질 녹-다운은 항-CD31 및 항-PTEN을 사용한 면역블로팅에 의해 평가하였으며, siRNACD31 -8 분자의 최고 효능을 나타내었다.
도 20b의 자세한 내용은 다음과 같다. 리포플렉스화된 siRNACD31 -8 정맥 주사에 의해 2일 연속 처리된 마우스는, 정량적 TaqMan RT-PCR에 의해 드러나는 바와 같이, 특정 조직에서 CD31 mRNA 양의 감소를 나타내었다. CD31 mRNA의 상대량은 PTEN mRNA 양으로 정상화되었다.
도 20c의 자세한 내용은 다음과 같다. siRNACD31 -8 -리포플렉스에 의해 전신적으로 처리된 마우스에서 CD31 단백질 녹-다운은 항-CD31 항체 및 항-PTEN 뿐만 아니라 항-CD34 (다른 내피세포 마커 단백질)를 사용하여 간 및 종양으로부터 얻은 추출물과의 면역블로트 분석에 의해 동일 단백질 로딩을 나타냄을 확인하였다. 마우스를 2일 연속(죄측 패널: 간 및 종양) 또는 7일 연속(우측 패널: 간) 정맥 주사하여 처리하였다. CD31 단백질 녹-다운은 siRNACD31 -8 -리포플렉스 처리된 동물의 간 및 종양에서 관찰(동물 2, 좌측 패널)되었지만, 등장 수크로오스 용액으로 처리된 마우스 또는 siRNAPTEN -리포플렉스 처리된 마우스에서는 관찰되지 않았다(동물 1, 3 참조). 대조 동물 4, 7 및 8(우측 패널)과 대조적으로 동물 5 및 6에서 7일간의 CD 31 녹-다운의 처리 계획을 관찰하였다. 생체내 연구을 위해 사용된 siRNACD31 -8 -리포 플렉스의 기능은 HUVEC 세포에서 평행하게 확인하였다(10 nM siRNA).
도 20d의 자세한 내용은 다음과 같다. 생체내에서 CD31 단백질의 녹-다운은 등장 수크로오스, siRNACD31 -8 -리포플렉스 및 siRNAPTEN -리포플렉스로 처리된 상응하는 마우스로부터 얻은 파라핀 종양 부분의 면역염색에 의해 직접적으로 평가하였다. 연속 부분을 항-CD31 및 항-CD34 항체로 염색시켜 종양 혈관계를 가시화하였다. siRNACD31 -8 -리포플렉스로 처리된 마우스로부터 얻은 종양 부분에서는 CD34에 대해서가 아니라 CD31에 대한 염색 세기 감소가 발견되었다. CD31 양성 혈관의 MVD 정량(혈관의 갯수로 측정, 상부 다이아그램 및 혈관의 총 길이, 하부 다이아그램)은 siRNACD31 -8 -리포플렉스 처리된 마우스로부터 얻은 샘플에서 MVD 감소를 나타내었다. 이러한 차이는 CD34 양성 혈관의 MVD 측정에 의해서는 관찰되지 않았다.
항-CD31 siRNA 분자와 관련하여, 본 발명의 기재는 항-CD31 siRNA 분자, 보다 바람직하게는 항 CD31-8 siRNA 분자에 대해 기재한 바와 같이 변형 패턴을 나타내는 항-CD31 siRNA 분자에 관한 것이다.
실시예 27: 종양 모델에서 siRNA CD31 -8 - 리포플렉스 전신 투여의 효과
이 실시예에서 우리는 CD31/PECAM-1 에 대한 배합 siRNA가 종양 생장에 대한 치료능을 나타내는지 여부에 대해 문제를 해결하였다.
CD31은 혈관/혈소판 형성에 대한 다양한 세포 메카니즘 및 기능23 , 27, 28 에 관여하는 것으로 알려져 있지만, 종양 생장하는 동안 신생혈관생성에 대한 능력은 해결되지 않고 있는 실정이다. 치료용으로 선택된 siRNA 분자는 특정 siRNACD31 -8 및 siRNAPTEN 를 대조 분자로 포함하였다. 생체내 효능에 대한 siRNACD31 -8- 및 siRNAPTEN - 리포플렉스 연구는 생체 내 시험 전에 HUVEC 에서 투여량 의존적 형질감염 실험으로 시험하였다. 이들 siRNA-리포플렉스의 기능 및 능력을 나타내는 대표적인 면역블로트는 도 21a에 도시한다.
CD31 의 녹-다운은 상기 배합물과 함께 서브나노몰 범위로 siRNACD31 -8 에 의해 달성하였다. siRNACD31 -8 매개된 유전자 침묵의 특이성은 PTEN, 인산화된 Akt 및 CD34에 대한 프로빙에 의해 예시되었다. siRNAPTEN 를 사용한 형질감염과는 달리, Akt의 인산화상태는 CD31 감소에 의해 HUVEC 세포에서 영향을 받지 않았다. CD34 단백질 양은 미처리 대조용에 비교할 때 리포플렉스에 의해 변화되지 않았다. 전신적으로 투여된 CD31-siRNA-리포플렉스의 치료 효과는 2가지 상이한 유형의 피하 종양 이종이식편을 갖는 마우스에서 조사하였다.
먼저, 우리는 상이한 리포플렉스를 사용하여 매일 전신 처리를 반복하는 투약계획을 세웠다. 매일 또는 이틀에 한번씩 꼬리 정맥에 200 ㎕ 리포플렉스 용액(단일 투여량 1.88 mg/kg/d siRNA; 14.5 mg/kg/d 지질)을 투여함으로써 상이한 전체 투여량을 얻었다. 일반적 건강한 전체 마커로서 체중의 변화를 모니터링함으로써 평가된 바와 같이, 동물 건강 상태에 대한 심각한 독성 효과는 관찰되지 않았다(도 21b).
이어, 우리는 siRNACD31 -8 -리포플렉스가 종양 생장 억제에 영향을 갖는지 연구하기 위해 매일 또는 이틀에 한번 정맥 주사 처리를 하는 2개의 투여 계획을 분석하였다. 양쪽 처리는 리포플렉스화된 siRNACD31 -8 처리된 신속하게 생장하는 3Y1-RasV12 피하 이종이식편의 종양 생장에 대한 분명한 억제 효과를 나타내었다(도 21c). 분명히, 이러한 특정 종양 이종이식편의 경우, 이틀에 한번 투약 계획이 종양 생장에 대한 억제 효과를 향상시켰다. 이러한 억제는 siRNAPTEN -리포플렉스 뿐만 아니라 수크로오스 처리된 대조군에 비교하여 통계적으로 유의미하였다(도 21c).
부가 실험으로서, 느리게 생장하는 피하 PC-3 종양 이종이식편에 리포좀 배합된 siRNACD31 - 8 를 전신투여하면 siRNAPTEN 대조군과 비교하여 현저한 종양 생장 지연이 유발되었다(도 21d). 이를 고려할 때, 생체내 이종이식편 실험은 누드 마우스에서 종양 세포의 생장이 리포좀 배합된 CD31-siRNA의 전신 투여에 의해 억제될 수 있음을 분명히 나타낸다. 이들 데이터는 CD31 (PECAM-1), 비-전통적 약물 표적이 RNAi 계 항-신생물질 치료 방해에 적합한 표적인 것으로 보인다.
도 21a의 자세한 내용은 다음과 같다. 리포플렉스화된 siRNA의 정량 대조 및 효능 시험은 HUVEC에서 전신 종양 처리에 사용하였다. 항-CD31 항체를 사용한 면역블로팅은 siRNACD31 - 8 의 경우에서 CD31의 농도 의존적 녹-다운을 나타내었지만, 대조 용 siRNAPTEN 에 대해서는 그렇지 않았다. CD31의 감소는 Akt 인산화 상태(P*-Akt)를 모니터링함으로써 밝혀진 바와 같이, siRNAPTEN 대조군과 대조적으로 PI-3-키나아제 신호생성에 아무런 영향을 나타내지 않았다. CD34 단백질 양은 영향을 받지 않았다.
도 21b의 자세한 내용은 다음과 같다. 2개의 상이한 siRNA-리포플렉스 투여량의 체중에 대한 영향을 모니터링하였다. 상이한 siRNAPTEN -리포플렉스 투여량(사각형: 매일 주사, 1.88 mg/kg/d siRNA 및 14.5 mg/kg/d 지질; 다이아몬드형: 이틀에 한번 주사 (8시간 간격), 3.75 mg/kg/d siRnA 및 28.9 mg/kg/d)를 7일 연속으로 투여하고 체중 변화를 측정하여 평균치(n = 7마우스)로서 플로팅하였다. 대조를 위하여 등장 수크로오스 용액(원형)으로 처리된 동물의 체중(평균 ± S.E.M)을 나타낸다.
도 21c 및 21d의 자세한 내용은 다음과 같다. CD31-siRNA-리포플렉스 처리에 의한 종양 생장의 억제. 2개의 상이한 종양 이종이식편(c: 3Y1-RasV12, d: PC-3)을 누드 마우스에서 피하로 확립하였다(c: 좌측 다이아그램: n = 8개 마우스/그룹, 우측, n = 7 마우스/그룹; d: n = 8 마리/그룹). 종양을 갖는 마우스를 siRNACD31 -8 -리포플렉스 (다아아몬드형), siRNAPTEN -리포플렉스(삼각형) 또는 등장 수크로오스(진한 구형)으로 처리하였다. 상이한 처리 계획을 다음과 같이 나타내다; 단일 화 살표, 매일; 이중 화살표, 이틀에 한번. (c) 확립된 3Y1-RasV12 종양의 생장은 이틀에 한번 투여하는 계획을 적용하는 것에 의해 (우측 다이아그램) siRNAPTEN -리포플렉스에 비교하여 siRNACD31 -8-리포플렉스에 의해 현저히 억제되었다. (d) 확립된 PC-3 이종이식편의 생장은 앞서 나타낸 바와 같이 siRNAPTEN -리포플렉스에 비교하여 siRNACD31-8-리포플렉스에 의해 현저히 억제되었다(1.88 mg/kg/d siRNA; 14.5 mg/kg/d 지질; 화살표). 데이터는 평균 ± S.E.M을 나타낸다; 유의성: 맨-휘트니에 의한 *P <0.05
이하의 참고문헌은 실시예 28 내지 28에 개시된 것이고 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.
Figure 112006080780643-pct00015
Figure 112006080780643-pct00016
본 명세서, 청구범위 및/또는 도면에 기재된 본 발명의 특징은 개별적으로 및 조합적으로 다양한 형태로 본 발명을 실시하기 위한 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> atugen AG <120> Lipids, lipid complexes and use thereof <130> A 19025 PCT <160> 20 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> antisense strand of PTEN specific siRNA <220> <221> misc_feature <223> antisense strand of PTEN specific siRNA molecule <400> 1 uaaguucuag cuguggugg 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> sense strand of PTEN specific siRNA molecule <400> 2 ccaccacagc uagaacuua 19 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> sense strand of a T-Ras specific si RNA molecule <220> <221> misc_feature <223> strand of a T-Ras specific si RNA molecule <400> 3 aacguguaga aggcauccu 19 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> sense strand of a T-Ras specific si RNA molecule <220> <221> misc_feature <223> strand of a T-Ras specific si RNA molecule <400> 4 aggaugccuu cuacacguu 19 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> sense strand of a PKN3 specific si RNA molecule <400> 5 gagagccugu acugcgaga 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> antisense strand of a PKN3 specific si RNA molecule <400> 6 ucucgcagua caggcucuc 19 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> sense strand of a PTENspecif ic si RNA molecule <220> <221> misc_feature <223> sense strand of a PTEN specific si RNA molecule <400> 7 ccaccacagc uagaacuua 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> anti sense strand of a PTEN specific si RNA molecule <220> <221> misc_feature <223> antisense strand of a PTEN specific si RNA molecule <400> 8 uaaguucuag cuguggugg 19 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> sense strand of a control PTEN specific si RNA molecule <400> 9 ccaccacagc uagaacuua 19 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> antisense strand of a control PTEN specific si RNA molecule <400> 10 uaaguucuag cuguggugg 19 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> sense strand of a PTEN specific si RNA molecule <400> 11 ccaccacagc uagaacuua 19 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> antisense strand of a PTEN specific si RNA molecule having Cy3 at the 3' end <400> 12 uaaguucuag cuguggugg 19 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> sense strand of a CD 31 specific si RNA molecule (CD31-1) <400> 13 ccaacuucac cauccagaa 19 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> antisense strand of a CD 31 specific si RNA molecule (CD31-1) <400> 14 uucuggaugg ugaaguugg 19 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> sense strand of a CD 31 specific si RNA molecule (CD31-2) <400> 15 ggugauagcc ccgguggau 19 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> antisense strand of a CD 31 specific si RNA molecule (CD31-2) <400> 16 auccaccggg gcuaucacc 19 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> sense strand of a CD 31 specific si RNA molecule (CD31-6) <400> 17 ccacuucuga acuccaaca 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> antisense strand of a CD 31 specific si RNA molecule (CD31-6) <400> 18 uguuggaguu cagaagugg 19 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> sense strand of a CD 31 specific si RNA molecule (CD31-8) <400> 19 cagauacucu agaacggaa 19 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <221> misc_feature <223> antisense strand of a CD 31 specific si RNA molecule (CD31-8) <400> 20 uuccguucua gaguaucug 19

Claims (61)

  1. 하기 화학식(I)에 따른 화합물:
    Figure 712013003796852-pct00017
    (I)
    식중에서,
    R1 및 R2 는 서로 독립적으로 알킬, 라우릴, 미리스틸, 팔미틸 및 올레일으로 이루어지는 군으로부터 선택되며;
    n은 1 내지 4의 정수이고;
    R3은 리실, 오르니틸, 2,4-디아미노부티릴, 히스티딜 및 하기 화학식(II)
    Figure 712013003796852-pct00018
    (II)
    (이때 m은 1 내지 3의 정수이며, Y- 는 할로게나이드, 아세테이트 및 트리플루오로아세테이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약제학적으로 허용되는 음이온임)에 따른 아실 잔기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아실이다.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, R1은 라우릴이고 R2 는 미리스틸이거나; R1 은 팔미틸이고 R2는 올레일인 화합물.
  4. 제 1항에 있어서, m은 1 또는 2인 화합물.
  5. 제 1항에 있어서, 화합물이 음이온 Y- 과 조합된 양이온성 지질인 화합물.
  6. 삭제
  7. 제 1항에 있어서, 화합물이
    - β-아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드
    Figure 712013003796852-pct00019
    - β-아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-라우릴-N-미리스틸-아미드 트리히드로클로라이드
    Figure 712013003796852-pct00020
    및
    - ε-아르기닐-리신-N-라우릴-N-미리스틸-아미드 트리히드로클로라이드
    Figure 712013003796852-pct00021
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 화합물.
  8. 지질 성분으로서 제 1항에 따른 화합물 및 담체를 포함하는, 암, 심혈관 관련 질병, 및 신생혈관형성 관련 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택된 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  9. 제 1항에 따른 화합물을 포함하는, 암, 심혈관 관련 질병, 및 신생혈관형성 관련 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택된 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서, 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 및 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 추가의 성분을 포함하는 약제학적 조성물.
  10. 제 1항에 따른 화합물, 약제학적 활성 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암, 심혈관 관련 질병, 및 신생혈관형성 관련 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택된 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서, 약제학적 활성 화합물이 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 및 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  11. 삭제
  12. 제 9항 또는 제 10항에 있어서, 단백질이 항체인 약제학적 조성물.
  13. 제 9항 또는 제 10항에 있어서, 핵산은 DNA, RNA, PNA 및 LNA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  14. 제 9항 또는 제 10항에 있어서, 핵산은 기능적 핵산이며, 이러한 기능적 핵산은 RNAi, siRNA, siNA, 안티센스 핵산, 리보자임, 아프타머 및 스피겔머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  15. 제 8항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 1 이상의 헬퍼 지질 성분을 추가로 포함하며, 이러한 헬퍼 지질 성분은 인지질 및 스테로이드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  16. 제 15항에 있어서, 헬퍼 지질 성분은 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 및 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  17. 제 15항에 있어서, 헬퍼 지질 성분의 함량은 조성물의 전체 지질 함량의 20 몰% 내지 80몰%인 약제학적 조성물.
  18. 제 17항에 있어서, 헬퍼 지질 성분의 함량은 35몰% 내지 65몰%인 약제학적 조성물.
  19. 제 16항에 있어서, 지질 성분은 β-아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드이고, 헬퍼 지질은 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민인 약제학적 조성물.
  20. 제 19항에 있어서, 지질은 50몰%이고, 헬퍼 지질은 조성물의 전체 지질 함량의 50몰%인 약제학적 조성물.
  21. 제 8항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 2 이상의 헬퍼 지질을 포함하는 약제학적 조성물.
  22. 제 21항에 있어서, 1 이상의 헬퍼 지질은 PEG 잔기, HEG 잔기, 폴리히드록시에틸 녹말(polyHES) 잔기 및 폴리프로필렌 잔기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 잔기를 포함하고, 이러한 잔기는 500 내지 10000 Da의 분자량을 갖는 약제학적 조성물.
  23. 제 22항에 있어서, PEG 잔기를 포함하는 헬퍼 지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디알킬-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 및 세라미드-PEG로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  24. 제 23항에 있어서, PEG 잔기는 500 Da 내지 10000 Da의 분자량을 갖는 약제학적 조성물.
  25. 제 24항에 있어서, 지질 성분으로서 β-아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드, 제1 헬퍼 지질로서 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 및 제2 헬퍼 지질로서 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-PEG2000을 포함하는 약제학적 조성물.
  26. 제 25항에 있어서, 제2 헬퍼 지질의 함량은 0.05 몰% 내지 4.9 몰%인 약제학적 조성물.
  27. 제 26항에 있어서, 지질의 함량은 45몰% 내지 50몰%이고, 제1 헬퍼 지질의 함량은 45 내지 50몰%이며, 단 페길화된(PEGylated) 제2 헬퍼 지질이 있는 경우, 제2 헬퍼 지질의 함량은 0.1몰% 내지 5몰%이며, 지질의 함량, 제1 헬퍼 지질의 함량 및 제2 헬퍼 지질의 함량의 총합은 100몰%이며, 제1 헬퍼 지질 및 제2 헬퍼 지질의 합은 50몰%인 약제학적 조성물.
  28. 제 21항에 있어서,
    a) β-아르기닐-2,3-디아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드 50몰%,
    1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 48몰%; 및
    1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-PEG2000 2몰%를 포함하거나,
    b) β-L-아르기닐-2,3-L-디아미노 프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리히드로클로라이드 50몰%,
    1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 49몰%; 및
    N(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 또는 이의 나트륨염 1몰%를 포함하는 약제학적 조성물.
  29. 제 14항에 있어서, 기능적 핵산은 RNAi, siRNA, siNA, 안티센스 핵산 및 리보자임으로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 양이온성 지질에 대한 RNAi의 몰비는 0 내지 0.075인 약제학적 조성물.
  30. 제 15항에 있어서, 화합물, 헬퍼 지질 성분 또는 이 둘 모두는 수성 매질 중의 분산물로서 존재하는 약제학적 조성물.
  31. 제 15항에 있어서, 화합물, 헬퍼 지질 성분 또는 이 둘 모두는 수혼화성 용매 중의 용액으로 존재하며, 용매는 에탄올 및 tert-부탄올으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조성물.
  32. 삭제
  33. 제 9항 또는 제 10항에 있어서, 핵산을 포함하며, 상기 핵산 주쇄 포스페이트 대 양이온 지질 질소원자의 전하 비는 1:1.5-7인 약제학적 조성물.
  34. 제 30항에 있어서, 분산액 중의 입자의 크기는 120 nm인 약제학적 조성물.
  35. 제 34항에 있어서, 분산액은 1 내지 100 μM siRNA를 함유하는 스톡 분산액이고, 스톡 분산액은 생체내 또는 시험관에서 1:100 내지 1:10000로 희석되는 약제학적 조성물.
  36. 삭제
  37. 제 8항 내지 제 10항중의 어느 한 항에 있어서, 조성물은 암 치료용이며, 암은 고형암 및 비고형암으로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 고형암은 췌장암, 유방암, 전립선암, 폐암, 대장암 및 간암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  38. 제 8항 내지 제 10항중의 어느 한 항에 있어서, 암은 혈관형성 및 신행혈관형성을 이루어지는 군으로부터 선택되는 프로세스와 관련되는 약제학적 조성물.
  39. 제 8항 내지 제 10항중의 어느 한 항에 있어서, 조성물은 핵산을 내피세포, 상피세포 및 종양세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포에 투여하기 위한 것인 약제학적 조성물.
  40. 제 39항에 있어서, 내피세포는 혈관계의 내피세포인 약제학적 조성물.
  41. 제 40항에 있어서, 혈관계는 신생혈관형성에 기인한 혈관계인 약제학적 조성물.
  42. 제 40항에 있어서, 혈관계는 간 혈관계, 심장 혈관계, 신장 혈관계, 췌장 혈관계 및 폐 혈관계로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  43. 제 8항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 전신투여용인 약제학적 조성물.
  44. 제 8항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 국소투여용인 약제학적 조성물.
  45. 제 8항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 진단제인 약제학적 조성물.
  46. 제 8항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 전달제로서 사용되는 약제학적 조성물.
  47. 제 46항에 있어서, 상기 전달제는 약제학적 활성 성분, 추가의 성분 또는 이 둘 모두를 세포로 전달하며, 상기 약제학적 활성 성분 및 추가의 성분은 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 및 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
  48. 제 47항에 있어서, 상기 세포는 내피세포인 약제학적 조성물.
  49. 약제학적 활성 화합물, 추가의 성분, 또는 이 둘 모두를 시험관내에서(in vitro) 세포 또는 세포 막을 통과하여 전달하는 방법으로서,
    - 세포 또는 막을 제공하는 단계;
    - 제 1항에 따른 화합물을 제공하는 단계;
    - 약제학적 활성 화합물, 추가의 성분 또는 이 둘 모두를 제공하는 단계; 및
    - 상기 세포 또는 막을 약제학적 활성 화합물, 추가의 성분 또는 이 둘 모두, 및 제 1항에 따른 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하며,
    약제학적 활성 화합물 및 추가의 성분은 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 및 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  50. 약제학적 활성 화합물, 추가의 성분, 또는 이 둘 모두를 시험관내에서(in vitro) 세포 또는 세포 막을 통과하여 전달하는 방법으로서,
    - 세포 또는 막을 제공하는 단계;
    - 제 8항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 제공하는 단계; 및
    - 상기 세포 또는 막을 제8항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하며,
    약제학적 활성 화합물 및 추가의 성분은 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 및 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
  51. 제 49항에 있어서,
    - 세포 및 막 근처에서 약제학적 활성 화합물, 추가의 성분 또는 이 둘 모두를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 삭제
  58. 삭제
  59. 삭제
  60. 제 43항에 있어서, 척추동물에 대한 전신 투여용으로 사용되는 약제학적 조성물.
  61. 제 60항에 있어서, 척추동물은 마우스, 쥐, 기니아 피그, 고양이, 개, 원숭이 및 인간으로 이루어지는 군으로부터 선택된 포유동물인 약제학적 조성물.
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