KR20220110749A

KR20220110749A - 간외 전달

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Publication number: KR20220110749A
Application number: KR1020227019035A
Authority: KR
Inventors: 야야프라카시 케이. 나이르; 마틴 에이. 마이어; 유안 씨. 살리나스; 쉬게오 마쓰다; 알렉산더 브이. 켈린; 스콧 피. 렌티니; 구오 헤; 미쉘 에이치. 정; 저스틴 엠. 피어슨; 무티아 마노하란; 데일 씨. 귄터; 이반 즐라테브; 크리스토퍼 에스. 테일; 바산트 알. 자드하브; 스튜어트 밀슈타인; 마야 야나스; 드루바이요티 다타
Original assignee: 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority date: 2019-11-06
Filing date: 2020-11-06
Publication date: 2022-08-09
Also published as: CN114945669A; AU2020378414A1; US20230016929A1; WO2021092371A2; EP4055166A2; JP2023500681A; MX2022005220A; CA3160329A1; BR112022007795A2; WO2021092371A3

Abstract

본 발명의 일 양태는 타겟 유전자와 상보적인 안티센스 가닥; 상기 안티센스 가닥과 상보적인 센스 가닥; 및 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 위치에, 선택적으로 링커 또는 담체를 통해, 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 함유하는, 하나 이상의 친유성 단량체를 포함하는 화합물에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 양태는 유전자 사일런싱의 방법으로서, 치료적 유효량의 친유성 단량체-접합 화합물을 이를 필요로 하는 세포 또는 피험자에 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.

Description

간외 전달

생체내에서 세포로 iRNA 제제의 효율적인 전달에는 세포외 환경, 특히, 혈청 단백질로부터의 실질적인 보호 및 특이적 타겟화가 필요하다. RNAi-기반 치료법은 간-관련 장애의 치료를 위한 유망한 임상 데이터를 보여준다. 그러나, 간외 조직으로의 siRNA 전달은 여전히 난관으로 남아 siRNA-기반 요법의 이용에 한계가 있다.

생체내에서 iRNA 제제의 실험 및 치료적 적용을 제한하는 요인 중 하나는 온전한 siRNA를 효율적으로 전달하는 능력이다. 특정 어려움은 생체내에서 망막으로의 비-바이러스성 유전자 전달과 관련이 있다. 난제들 중 하나는 망막의 형질감염을 방해하는 내부 경계막을 극복하는 것이다. 또한, 유리체의 음으로 하전된 당은 양성 DNA-형질감염 시약 복합체와 상호 작용하여 이들의 응집을 촉진하는데, 이는 확산 및 세포 흡수를 방해하는 것으로 밝혀졌다.

중추 신경계(central nervous system: CNS)로의 올리고뉴클레오타이드 전달은 자유 올리고뉴클레오타이드가 지나갈 수 없는 혈액 뇌 장벽(blood brain barrier: BBB)으로 인해 특정 문제를 제기한다. CNS로 올리고뉴클레오타이드를 전달하기 위한 한 가지 수단은 척수강내 전달에 의한 것이다. 그러나, 올리고뉴클레오타이드는 또한 요망되는 치료 효과를 달성하기 위해 CNS의 타겟 세포로 효율적으로 내재화될 필요가 있다. 종래 연구는 전형적으로 뉴런 기원의 세포로 올리고뉴클레오타이드의 세포내 내재화를 돕기 위해 전달 시약, 예컨대, 리포좀, 양이온성 지질 및 나노입자를 사용하여 복합체를 형성시키는 것이었다.

따라서, iRNA 제제의 치료적 잠재력을 달성하고 향상시키기 위해 조직 전달 시약의 사용 없이 생체내에서 siRNA 분자를 전달하기 위한 신규하고 개선된 방법이 계속해서 요구되고 있다.

본 발명의 일 양태는 올리고뉴클레오타이드의 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 위치에, 선택적으로 링커 또는 담체를 통해, 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 함유하는, 하나 이상의 친유성 단량체를 포함하는 화합물(예를 들어, 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있는 올리고뉴클레오타이드)을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 일부 구현예는 타겟 유전자와 상보적인 안티센스 가닥; 상기 안티센스 가닥과 상보적인 센스 가닥; 및 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 위치에, 선택적으로 링커 또는 담체를 통해, 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 함유하는, 하나 이상의 친유성 단량체를 포함하는 화합물(예를 들어, 이중-가닥 iRNA 제제)을 제공한다.

일부 구현예에서, 옥탄올-물 분배 계수 logK_ow에 의해 측정되는 친유성 모이어티의 친유성은 0 초과이다. 친유성 모이어티는 1 초과, 1.5 초과, 2 초과, 3 초과, 4 초과, 5 초과, 또는 10 초과의 logK_ow를 지닐 수 있다.

일부 구현예에서, 화합물의 혈장 단백질 결합 검정에서 비결합 분율에 의해 측정되는 화합물의 소수성은 0.2 초과이다. 일 구현예에서, 결정되는 혈장 단백질 결합 검정은 인간 혈청 알부민 단백질을 이용하여 전기영동 이동성 변화 검정(electrophoretic mobility shift assay: EMSA)이다. 결합 검정에서 비결합 siRNA의 분율에 의해 측정되는 화합물의 소수성은 siRNA의 생체내 전달 향상을 위해 0.15 초과, 0.2 초과, 0.25 초과, 0.3 초과, 0.35 초과, 0.4 초과, 0.45 초과, 또는 0.5 초과이다.

일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 지방족, 사이클릭, 예컨대, 비사이클릭, 또는 폴리사이클릭, 예컨대, 폴리비사이클릭 화합물, 예컨대, 스테로이드(예를 들어, 스테롤) 또는 선형 또는 분지형 지방족 탄화수소이다. 예시적인 친유성 모이어티는 지질, 콜레스테롤, 레티노산, 콜릭산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 제라닐옥시헥시아놀, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜릭산, O3-(올레오일)콜렌산, 이부프로펜, 나프록센, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진이다.

적합한 친유성 모이어티는 또한 포화되거나 불포화된 C₄-C₃₀ 탄화수소 사슬(예를 들어, C₄-C₃₀ 알킬 또는 알케닐), 및 하이드록실, 아민, 카르복실산, 설포네이트, 포스페이트, 티올, 아자이드, 및 알카인으로 이루어진 군으로부터 선택된 선택적 작용기를 함유하는 것들을 포함한다. 작용기는 iRNA 제제에 친유성 모이어티를 부착시키는 데 유용하다. 일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 포화되거나 불포화된 C₆-C₁₈ 탄화수소 사슬(예를 들어, 선형 C₆-C₁₈ 알킬 또는 알케닐)을 함유한다. 일 구현예에서, 친유성 모이어티는 포화되거나 불포화된 C₁₆ 탄화수소 사슬(예를 들어, 선형 C₁₆ 알킬 또는 알케닐)을 함유한다. 일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 둘 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 함유한다.

일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 자유 말단 카르복실산 작용기(예를 들어, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산, 트리데칸산, 테트라데칸산, 펜타데칸산, 헥사데칸산, 헵타데칸산, 옥타데칸산, 올레산, 리놀레산, 아라키돈산, 시스-4,7,10,13,16,19-도코사헥사엔산)를 갖는 C₆-C₃₀ 모이어티이다.

일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 C₆-C₃₀ 산(예를 들어, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산, 트리데칸산, 테트라데칸산, 펜타데칸산, 헥사데칸산, 헵타데칸산, 옥타데칸산, 올레산, 리놀레산, 아라키돈산, 시스-4,7,10,13,16,19-도코사헥사엔산, 비타민 A, 비타민 E, 콜레스테롤 등) 또는 C₆-C₃₀ 알코올(예를 들어, 헥산올, 헵탄올, 옥탄올, 노난올, 데칸올, 운데칸올, 도데칸올, 트리데칸올, 테트라데칸올, 펜타데칸올, 헥사데칸올, 헵타데칸올, 옥타데칸올, 올레일 알코올, 리놀레일 알코올, 아라키돈 알코올, 시스-4,7,10,13,16,19-도코사헥산올, 레티놀, 비타민 E, 콜레스테롤 등)이다.

친유성 단량체는 iRNA 제제의 임의의 부분, 예를 들어, 뉴클레오베이스, 당 모이어티, 또는 뉴클레오사이드간 결합에 접합된 친유성 모이어티를 포함할 수 있다. 친유성 모이어티가 iRNA 제제의 뉴클레오베이스, 리보당, 또는 뉴클레오사이드간 결합에 대한 직접 부착을 통해 iRNA 제제에 접합되는 경우, 친유성 단량체는 뉴클레오베이스, 리보당, 또는 뉴클레오사이드간 결합, 및 친유성 모이어티를 포함한다. 대안적으로, 친유성 단량체는 그러한 링커 또는 담체를 통해 비-리보스 치환 단위에 접합된 친유성 모이어티를 포함할 수 있다. 친유성 모이어티가 비-리보스 치환 단위, 예컨대, 링커 또는 담체를 통해 iRNA 제제에 접합되는 경우, 친유성 단량체는 비-리보스 치환 단위, 예컨대, 링커 또는 담체, 및 친유성 모이어티를 포함한다.

소정의 구현예에서, 친유성 단량체는 뉴클레오베이스를 함유하지 않는다.

소정의 구현예에서, 친유성 단량체는 하나 이상의 링커(테터)를 통해 화합물에 접합된 친유성 모이어티를 포함한다.

일부 구현예에서, 친유성 단량체는 에테르, 티오에테르, 우레아, 카르보네이트, 아민, 아미드, 말레이미드-티오에테르, 디설파이드, 포스포디에스테르, 설폰아미드 결합, 클릭 반응의 산물(예를 들어, 아자이드-알카인의 첨가환화로부터의 트리아졸), 또는 카르바메이트를 함유하는 링커를 통해 화합물에 접합된 친유성 모이어티를 포함한다.

일부 구현예에서, 링커(테터) 중 적어도 하나는 산화환원 분해형 링커(예컨대, 환원 분해형 링커; 예를 들어, 디설파이드 기), 산 분해형 링커(예를 들어, 하이드라존 기, 에스테르 기, 아세탈 기, 또는 케탈 기), 에스테라제 분해형 링커(예를 들어, 에스테르 기), 포스파타제 분해형 링커(예를 들어, 포스페이트 기), 또는 펩티다제 분해형 링커(예를 들어, 펩타이드 결합)이다.

다른 구현예에서, 링커(테터) 중 하나는 갈락토사민, 글루코사민, 글루코스, 갈락토스, 만노스, 및 이들의 조합의 DNA, RNA, 디설파이드, 아미드, 작용화 단당류 또는 올리고당류로 이루어진 군으로부터 선택된 생분해형 링커이다.

소정의 구현예에서, 친유성 단량체는 비-리보스 치환 단위, 즉, 하나 이상의 뉴클레오타이드(들)를 치환하는 담체를 통해 화합물에 접합된 친유성 모이어티를 포함한다. 담체는 사이클릭 기 또는 비사이클릭 기일 수 있다. 일 구현예에서, 사이클릭 기는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔란, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸릴, 및 데칼린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 비사이클릭 기는 세리놀 백본, 글리세롤 백본, 또는 디에탄올아민 백본을 기반으로 한 모이어티이다.

일부 구현예에서, 담체는 이중-가닥 iRNA 제제에서 하나 이상의 뉴클레오타이드(들)를 치환한다. 일부 구현예에서, 담체는 이중-가닥 iRNA 제제의 내부 위치(들)에서 하나 이상의 뉴클레오타이드(들)를 치환한다. 다른 구현예에서, 담체는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 말단에서 뉴클레오타이드를 치환한다. 일 구현예에서, 담체는 센스 가닥의 3' 말단의 말단 뉴클레오타이드를 치환하고, 이에 의해 센스 가닥의 3' 말단을 보호하는 말단 캡으로서 작용한다. 일 구현예에서, 담체는 아민을 갖는 사이클릭 기이고, 예를 들어, 담체는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸라닐, 또는 데칼리닐일 수 있다.

일부 구현예에서, 친유성 단량체는 하기 화학식 중 하나로 표현될 수 있다:

(식에서,

J₁ 및 J₂는 각각 독립적으로 O, S, NR^N, 선택적으로 치환된 알킬, OC(O)NH, NHC(O)O, C(O)NH, NHC(O), OC(O), C(O)O, OC(O)O, NHC(O)NH, NHC(S)NH, OC(S)NH, OP(N(R^P)₂)O, 또는 OP(N(R^P)₂)이고;

는 사이클릭 기 또는 비사이클릭 기이고;

R^N은 H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 아르알킬, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 또는 아미노 보호기이고;

R^P는 각 경우에 독립적으로 H, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 또는 선택적으로 치환된 헤테로아릴이고;

L₁₀은 치환되거나 비치환된, 포화되거나 불포화된 C3-C8 탄화수소, (예를 들어, C3-C8 알킬, 알케닐, 또는 알키닐, 또는 둘 이상의 이중 결합을 함유하는 C3-C8 탄화수소)이고; 치환된 기는 "치환된" 탄화수소, 알킬, 알케닐, 또는 알키닐에 대하여 본원에 이미 기재된 것들을 포함하고;

L₁₁은 치환되거나 비치환된, 포화되거나 불포화된 C6-C26 탄화수소, (예를 들어, C6-C26 알킬, 알케닐, 또는 알키닐, 또는 둘 이상의 이중 결합을 함유하는 C3-C8 탄화수소)이고; 치환된 기는 "치환된" 탄화수소, 알킬, 알케닐, 또는 알키닐에 대하여 본원에 이미 기재된 것들을 포함하고;

Q는 담체 상에 뉴클레오베이스가 없는 경우 부재이거나, 생체내에서 L₁₁로부터 L₁₀을 적어도 10% 분해할 분해형 기이다. 예를 들어, Q는 생체내에서 분해되어 친유성 단량체로부터 L₁₁을 약 10 내지 70%, 약 15 내지 50%, 약 20 내지 40%, 또는 약 20 내지 30%까지 분해할 수 있는 분해형 기일 수 있다. 예시적인 분해형 기는 -OC(O)-, -C(O)O-, -SC(O)-, -C(O)S-, -OC(S)-, -C(S)O-, -S-S-, -C(R⁵)=N-, -N=C(R⁵)-, -C(R⁵)=N-O-, -O-N=C(R⁵)-, -C(O)N(R⁵)-, -N(R⁵)C(O)-, -C(S)N(R⁵)-, -N(R⁵)C(S)-, -N(R⁵)C(O)N(R⁵)-, -N(R⁵)C(O)C(R³)(R⁴)OC(O)-, -C(O)OC(R³)(R⁴)C(O)N(R⁵)-, -OC(O)O-, -OSi(R⁵)₂O-, -C(O)(CR³R⁴)C(O)O-, -OC(O)(CR³R⁴)C(O)-,

, 또는 이들의 조합물을 포함하고, R¹¹은 C₂-C₈ 알킬 또는 알케닐이다. 각 경우에, R³, R⁴, 및 R⁵는 각각 독립적으로 H 또는 C₁-C₄ 알킬임).

일 구현예에서, Q의 분해는 뇌 척수액(CSF)에서 리간드의 안정성, 혈장에서의 리간드의 안정성, 뇌 균질물 또는 조직 균질물(간, 눈 등)에서 리간드의 안정성, 또는 유리체액에서 리간드의 안정성에 의해 결정된다.

사이클릭 및 비사이클릭 기는 본원에 이미 기재된 것들을 포함한다.

일 구현예에서, 비사이클릭 기는 세리놀, 글리세롤, 또는 디에탄올아민 백본이다.

일 구현예에서, 사이클릭 기는 피롤리디닐, 하이드록시프롤리닐, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸라닐, 및 데칼리닐로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일 구현예에서, 사이클릭 기는 리보스 또는 리보스 유사체이다. 리보스 유사체의 예는 아라비노스, 4'-티오 리보스, 2'-O-메틸 리보스, GNA, UNA, 및 LNA 유사체를 포함한다.

일부 구현예에서, 화합물의 가닥의 하나 이상의 위치에 접합된 친유성 단량체는 하기 구조를 갖는다:

친유성 단량체에 대한 상기 구조에서, 단량체는 또한 하나 이상의 비대칭 중심을 함유할 수 있고, 따라서 라세미체 및 라세미 혼합물, 단일 거울상이성질체, 개별 부분입체이성질체 및 부분입체이성질체 혼합물로서 발생한다. 단량체의 이러한 이성질체 형태 모두는 명시적으로 포함된다.

친유성 단량체에 대한 상기 구조에서, 알킬렌 사슬은 하나 이상의 불포화 결합을 함유할 수 있다.

정수 m은 0 내지 8이다. 정수 n은 1 내지 21이다. R₂'는 리보스 당에 대한 허용 가능한 2'-변형, 예컨대, 2'-O-메톡시알킬 (예를 들어, 2'-O-메톡시메틸, 2'-O-메톡시에틸, 또는 2'-O-2-메톡시프로파닐) 변형, 2'-O-알릴 변형, 2'-C-알릴 변형, 2'-플루오로 변형, 2'-O-N-메틸아세트아미도 (2'-O-NMA) 변형, 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 (2'-O-DMAEOE) 변형, 2'-O-아미노프로필 (2'-O-AP) 변형, 또는 2'-아라-F 변형인 임의의 작용기일 수 있다. 예를 들어, R₂'는 H, OH, F, OMe, O-메톡시알킬, O-알릴, O-N-메틸아세트아미도, O-디메틸아미노에톡시에틸, 또는 O-아미노프로필일 수 있다. B는 변형 또는 비변형 뉴클레오베이스이다. W는 알킬 기, 예컨대, C₁-C₄ 알킬 (예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, t-부틸)이다. R, R', 및 R''는 각각 독립적으로 H 또는 알킬 기, 예컨대, C₁-C₄ 알킬(예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, t-부틸)이다.

(R₂'는 2'-F, 2'-OMe, 2'-NMA, 2'-데옥시, 또는 2'-OH임);

;

이들 구조에서, B는 변형 또는 비변형 뉴클레오베이스이다.

친유성 단량체의 구체적인 구현예는 하기를 포함한다:

이들 구조에서, B는 변형 또는 비변형 뉴클레오베이스이고; R 및 R'는 각각 독립적으로 H, 메틸, 에틸, 이소프로필, 또는 t-부틸이다.

일부 구현예에서, 친유성 단량체는 다음의 담체를 통해 화합물의 가닥(단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥; 또는 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥)에 접합된 친유성 모이어티를 함유한다:

이들 구현예에서, R은 본원에 정의된 바와 같은 친유성 모이어티이다. R₂'는 H, OH, F, OMe, O-메톡시알킬, O-알릴, O-N-메틸아세트아미도, O-디메틸아미노에톡시에틸, 또는 O-아미노프로필이다. B는 변형 또는 비변형 뉴클레오베이스이다.

일부 구현예에서, 친유성 단량체는 다음의 담체를 통해 화합물의 가닥(단일-가닥 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥; 또는 이중-가닥 올리고뉴클레오타이드의 센스 및/또는 안티센스 가닥)의 내부 위치에 접합된 친유성 모이어티를 함유한다:

이들 구현예에서, R은 본원에 정의된 바와 같은 친유성 모이어티이다. n은 1 내지 21의 정수이다. R₂'는 H, OH, F, OMe, O-메톡시알킬, O-알릴, O-N-메틸아세트아미도, O-디메틸아미노에톡시에틸, 또는 O-아미노프로필이다. B는 변형 또는 비변형 뉴클레오베이스이다.

친유성 단량체의 추가 예는 실시예에서 확인될 수 있다.

일부 구현예에서, 화합물의 센스 및 안티센스 가닥은 각각 15개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이이다.

일 구현예에서, 화합물의 센스 및 안티센스 가닥은 각각 19개 내지 25개 뉴클레오타이드 길이이다.

일 구현예에서, 화합물의 센스 및 안티센스 가닥은 각각 21개 내지 23개 뉴클레오타이드 길이이다.

일부 구현예에서, 화합물은 말단의 적어도 하나에 단일-가닥 오버행, 예를 들어, 1개 내지 10개 뉴클레오타이드 길이의 3' 및/또는 5' 오버행(들), 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개 뉴클레오타이드의 오버행을 포함한다. 일부 구현예에서, 둘 모두의 가닥은 이중 가닥 영역에서 1개 내지 5개(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개)의 단일-가닥 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 스트레치를 갖는다. 일 구현예에서, 단일-가닥 오버행은 1개, 2개, 또는 3개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 구현예에서, 화합물은 또한 안티센스 가닥의 5'-말단(또는 센스 가닥의 3'-말단)에 위치하거나 또는 그 반대로 위치하는 블런트 말단을 가질 수 있다. 일 구현예에서, 화합물은 안티센스 가닥의 3'-말단에 3' 오버행, 및 선택적으로 안티센스 가닥의 5'-말단에 블런트 말단을 포함한다. 일 구현예에서, 화합물은 센스 가닥의 5'-말단에 5' 오버행, 및 선택적으로 안티센스 가닥의 5'-말단에 블런트 말단을 갖는다. 일 구현예에서, 화합물은 iRNA 듀플렉스의 양 말단에 두 개의 블런트 말단을 갖는다.

일 구현예에서, 화합물의 센스 가닥은 21개-뉴클레오타이드 길이이고, 안티센스 가닥은 23개-뉴클레오타이드 길이이고, 여기서 가닥은 3'-말단에 2개-뉴클레오타이드 길이의 단일 가닥 오버행을 갖는 21개 연속 염기쌍의 이중-가닥 영역을 형성한다.

일부 구현예에서, 센스 가닥은 3'-말단에서 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 3'-말단에서 적어도 2개의 포스포로티오에이트 결합을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 친유성 단량체는 센스 가닥의 3'-말단에 위치한다. 일 구현예에서, 포스포로티오에이트 결합 중 하나는 친유성 단량체와 센스 가닥의 3'-말단으로부터의 제1 뉴클레오타이드 사이에 위치한다.

일부 구현예에서, 센스 가닥은 5'-말단에서 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 센스 가닥은 5'-말단에서 적어도 2개의 포스포로티오에이트 결합을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 친유성 단량체는 센스 가닥의 5'-말단에 위치한다. 일 구현예에서, 포스포로티오에이트 결합 중 하나는 친유성 단량체와 센스 가닥의 5'-말단으로부터의 제1 뉴클레오타이드 사이에 위치한다.

일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 3'-말단에서 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 3'-말단에서 적어도 2개의 포스포로티오에이트 결합을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 친유성 단량체는 안티센스 가닥의 3'-말단에 위치한다. 일 구현예에서, 포스포로티오에이트 결합 중 하나는 친유성 단량체와 안티센스 가닥의 3'-말단으로부터의 제1 뉴클레오타이드 사이에 위치한다.

일부 구현예에서, 화합물은 안티센스 가닥의 5'-말단에 포스페이트 또는 포스페이트 모방체를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 포스페이트 모방체는 5'-비닐 포스포네이트(VP)이다.

일부 구현예에서, 화합물의 안티센스 가닥의 5'-말단은 5'-비닐 포스포네이트(VP)를 함유하지 않는다.

일부 구현예에서, 화합물은 적어도 하나의 말단 키랄 인 원자를 추가로 포함한다.

뉴클레오타이드간 결합에 대한 위치 특이적 키랄 변형은 가닥의 5' 말단, 3' 말단, 또는 5' 말단과 3' 말단 둘 모두에서 발생할 수 있다. 이는 본원에서 "말단" 키랄 변형으로 지칭된다. 말단 변형은 말단 영역의 3' 또는 5' 말단 위치에서, 예를 들어, 말단 뉴클레오타이드의 위치에서, 또는 가닥의 마지막 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 뉴클레오타이드 내에서 발생할 수 있다. 키랄 변형은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 센스 가닥과 안티센스 가닥 둘 모두에서 발생할 수 있다. 각각의 키랄 순수 인 원자는 Rp 배치 또는 Sp 배치, 및 이들의 조합일 수 있다. 키랄 변형 및 키랄-변형된 dsRNA 제제에 관한 더 많은 세부사항은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 "Chirally-Modified Double-Stranded RNA Agents,"라는 명칭으로 2018년 12월 21일에 출원된 PCT/US18/67103에서 찾아볼 수 있다.

일부 구현예에서, 화합물은 Sp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 말단에 제1 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형; Rp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 말단에 제1 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형; 및 Rp 배치 또는 Sp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 말단에 제1 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형을 추가로 포함한다.

일 구현예에서, 화합물은 Sp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 말단에 제1 및 제2 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형; Rp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 말단에 제1 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형; 및 Rp 배치 또는 Sp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 말단에 제1 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형을 추가로 포함한다.

일 구현예에서, 화합물은 Sp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 말단에 제1, 제2, 및 제3 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형; Rp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 말단에 제1 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형; 및 Rp 배치 또는 Sp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 말단에 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형을 추가로 포함한다.

일 구현예에서, 화합물은 Sp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 말단에 제1 및 제2 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형; Rp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 말단에 제3 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형; Rp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 말단에 제1 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형; 및 Rp 배치 또는 Sp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 말단에 제1 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형을 추가로 포함한다.

일 구현예에서, 화합물은 Sp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 말단에 제1 및 제2 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형; Rp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 말단에 제1, 및 제2 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형; 및 Rp 배치 또는 Sp 배치에서 결합 인 원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 말단에 제1 뉴클레오타이드간 결합에서 발생하는 말단 키랄 변형을 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 화합물은 안티센스 가닥의 제1의 다섯 개 뉴클레오타이드에서 적어도 두 개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 갖는다(5' 말단으로부터 계수하여).

일부 구현예에서, 안티센스 가닥은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 또는 18개 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합으로 분리되는 1개, 2개, 또는 3개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합의 두 개의 블록을 포함한다.

일부 구현예에서, 화합물은 특이적 CNS 조직에 대한 전달을 매개하는 수용체를 타겟화하는 타겟화 리간드를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 타겟화 리간드는 Angiopep-2, 지질단백질 수용체 관련 단백질(lipoprotein receptor related protein: LRP) 리간드, bEnd.3 세포 결합 리간드, 트랜스페린 수용체(transferrin receptor: TfR) 리간드, 만노스 수용체 리간드, 글루코스 운반체 단백질, 및 LDL 수용체 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 화합물은 안구 조직에 대한 전달을 매개하는 수용체를 타겟화하는 타겟화 리간드를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 타겟화 리간드는 트랜스-레티놀, RGD 펩타이드, LDL 수용체 리간드, 및 탄수화물-기재 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 타겟화 리간드는 RGD 펩타이드, 예컨대, H-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys-Cys-OH 또는 사이클로(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys)이다.

일부 구현예에서, 화합물은 간 조직을 타겟화하는 타겟화 리간드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 타겟화 리간드는 탄수화물-기재 리간드이다. 일 구현예에서, 타겟화 리간드는 GalNAc 접합체이다.

일부 구현예에서, 화합물의 안티센스 및 센스 가닥의 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35% 또는 30%는 변형된다. 예를 들어, 화합물의 50%가 변형될 때, 화합물에 존재하는 모든 뉴클레오타이드의 50%는 본원에 기재된 바와 같은 변형을 함유한다.

일부 구현예에서, 화합물의 안티센스 및 센스 가닥은 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 거의 100%의 2'-O-메틸 변형 뉴클레오타이드를 포함한다.

일 구현예에서, 화합물은 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 이중-가닥 dsRNA 제제이고, 이중-가닥 dsRNA 제제의 적어도 50%의 뉴클레오타이드는 독립적으로 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-데옥시, 또는 2'-플루오로로 변형된다.

일 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 안티센스이고, 안티센스의 적어도 50%의 뉴클레오타이드는 독립적으로 LNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 또는 2'-데옥시로 변형된다.

일부 구현예에서, 화합물의 센스 및 안티센스 가닥은 12개 미만, 10 개 미만, 8 개 미만, 6개 미만, 4개 미만, 2개 미만의 2'-F 변형 뉴클레오타이드를 포함하거나 2'-F 변형 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 화합물은 센스 가닥에 12개 미만, 10 개 미만, 8 개 미만, 6개 미만, 4개 미만, 2개 미만의 2'-F 변형 뉴클레오타이드를 포함하거나 2'-F 변형 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 화합물은 안티센스 가닥에 2'-F 변형을 12개 미만, 10개 미만, 8개 미만, 6개 미만, 4개 미만, 2개 미만 갖거나, 2'-F 변형을 갖지 않는다.

일부 구현예에서, 화합물은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 임의의 위치에 하나 이상의 2'-F 변형을 갖는다.

일부 구현예에서, 화합물은 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만의 비-천연 뉴클레오타이드를 갖거나, 비-천연 뉴클레오타이드를 실질적으로 갖지 않는다. 비-천연 뉴클레오타이드의 예는 비사이클릭 뉴클레오타이드, LNA, HNA, CeNA, 2'-O-메톡시알킬(예를 들어, 2'-O-메톡시메틸, 2'-O-메톡시에틸, 또는 2'-O-2-메톡시프로파닐), 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-플루오로, 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA), 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸(2'-O-DMAEOE), 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-아라-F, L-뉴클레오사이드 변형(예컨대, 2'-변형된 L-뉴클레오사이드, 예를 들어, 2'-데옥시-L-뉴클레오사이드), BNA 무염기 당, 무염기 사이클릭 및 열린-사슬 알킬을 포함한다.

일부 구현예에서, 화합물은 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 또는 거의 100%의 천연 뉴클레오타이드를 갖는다. 이러한 구현예의 목적 상, 천연 뉴클레오타이드는 2'-OH, 2'-데옥시, 및 2'-OMe를 갖는 것들을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 안티센스 가닥은, 예를 들어, 안티센스 가닥의 시드 영역에 적어도 하나의 비잠김 핵산(UNA) 또는 글리세롤 핵산(GNA) 변형을 함유한다. 일 구현예에서, 시드 영역은 안티센스 가닥의 5'-말단의 2번 내지 8번 위치(또는 5번 내지 7번 위치)에 있다.

일 구현예에서, 화합물은 15개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이를 각각 갖는 센스 가닥 및 안티센스 가닥; 안티센스 가닥의 제1의 5개 뉴클레오타이드에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 포함하고(5' 말단으로부터 계수하여); 여기서 듀플렉스 영역은 19개 내지 25개 염기쌍(바람직하게는 19개, 20개, 21개 또는 22개)이고; 화합물은 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만의 비-천연 뉴클레오타이드를 갖거나, 비-천연 뉴클레오타이드를 실질적으로 갖지 않는다.

일 구현예에서, 화합물은 15개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이를 각각 갖는 센스 가닥 및 안티센스 가닥; 안티센스 가닥의 제1의 5개 뉴클레오타이드에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 포함하고(5' 말단으로부터 계수하여); 여기서 듀플렉스 영역은 19개 내지 25개 염기쌍(바람직하게는 19개, 20개, 21개 또는 22개)이고; 화합물은 2'-OH, 2'-데옥시, 또는 2'-OMe를 갖는 것과 같이, 80% 초과, 85% 초과, 95% 초과, 또는 거의 100%의 천연 뉴클레오타이드를 갖는다.

본 발명의 일 양태는 센스 가닥 및 안티센스 가닥(각 가닥은 독립적으로 15개 내지 35개 뉴클레오타이드 길이를 가짐); 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여 제1의 5개 뉴클레오타이드 사이에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합; 센스 및/또는 안티센스 가닥 상의 적어도 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 2'-데옥시 변형을 포함하는 화합물을 제공하고; 화합물은 19개 내지 25개 염기쌍의 이중 가닥(듀플렉스) 영역을 갖고; 화합물은 리간드를 포함하고; 센스 가닥은 글리콜 핵산(GNA)을 포함하지 않는다.

안티센스 가닥은 RNA 간섭을 매개하도록 타겟 서열에 충분한 상보성을 갖는 것으로 이해된다. 다시 말해서, 화합물은 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있다.

일 구현예에서, 화합물은 적어도 3개의 2'-데옥시 변형을 포함한다. 2'-데옥시 변형은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 안티센스 가닥의 2번 및 14번 위치, 및 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 센스 가닥의 11번 위치에 있다.

일 구현예에서, 화합물은 적어도 5개의 2'-데옥시 변형을 포함한다. 2'-데옥시 변형은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 안티센스 가닥의 2번, 12번 및 14번 위치, 및 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 센스 가닥의 9번 및 11번 위치에 있다.

일 구현예에서, 화합물은 적어도 7개의 2'-데옥시 변형을 포함한다. 2'-데옥시 변형은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 안티센스 가닥의 2번, 5번, 7번, 12번 및 14번 위치, 및 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 센스 가닥의 9번 및 11번 위치에 있다.

일 구현예에서, 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 2번, 5번, 7번, 12번 및 14번 위치에 적어도 5개의 2'-데옥시 변형을 포함한다. 안티센스 가닥은 18개 내지 25개 뉴클레오타이드 길이, 또는 18개 내지 23개 뉴클레오타이드 길이를 갖는다.

일 구현예에서, 화합물은 하나 이상의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 화합물은 20% 미만, 예를 들어, 15% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있거나, 화합물은 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 예를 들어, 화합물은 모든 천연 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 예시적인 비-천연 뉴클레오타이드는 비사이클릭 뉴클레오타이드, 잠김 핵산 (LNA), HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-플루오로, 2'-O-N-메틸아세트아미도 (2'-O-NMA), 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 (2'-O-DMAEOE), 2'-O-아미노프로필 (2'-O-AP), 및 2'-아라-F를 포함하나, 이로 한정되지 않는다.

일 구현예에서, 화합물은 센스 가닥 및 안티센스 가닥(각 가닥은 독립적으로 15개 내지 35개 뉴클레오타이드 길이를 가짐); 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여 제1의 5개 뉴클레오타이드 사이에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합; 센스 및/또는 안티센스 가닥 상의 적어도 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 2'-데옥시 뉴클레오타이드를 포함하고; 화합물은 19개 내지 25개 염기쌍의 듀플렉스 영역을 갖고; 화합물은 리간드를 포함하고; 센스 가닥은 글리콜 핵산(GNA)을 포함하지 않고; 화합물은 20% 미만, 예를 들어, 15% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하거나 화합물은 모든 천연 뉴클레오타이드를 포함한다.

일 구현예에서, 적어도 하나의 센스 및 안티센스 가닥은 센스 또는 안티센스 가닥의 중심 영역에 적어도 1개, 예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개 이상의 2'-데옥시 변형을 포함한다. 따라서, 일 구현예에서, 화합물은 센스 가닥 및 안티센스 가닥(각 가닥은 독립적으로 15개 내지 35개 뉴클레오타이드 길이를 가짐); 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여 제1의 5개 뉴클레오타이드 사이에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합; 센스 및/또는 안티센스 가닥 상의 적어도 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 2'-데옥시 뉴클레오타이드를 포함하고; 화합물은 19개 내지 25개 염기쌍의 듀플렉스 영역을 갖고; 화합물은 리간드를 포함하고; 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 중심 영역에 적어도 1개, 예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개 이상의 2'-데옥시 변형을 포함한다.

일부 구현예에서, 센스 가닥은 18개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이를 갖고, 센스 가닥의 중심 영역에 적어도 2개의 2'-데옥시 변형을 포함한다. 예를 들어, 센스 가닥은 18개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이를 갖고, 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 7번, 8번, 9번, 10번, 11번, 12번, 및 13번 위치 내에 적어도 2개의 2'-데옥시 변형을 포함한다.

일 구현예에서, 안티센스 가닥은 18개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이를 갖고, 안티센스 가닥의 중심 영역에 적어도 2개의 2'-데옥시 변형을 포함한다. 예를 들어, 안티센스 가닥은 18개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이를 갖고, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 10번, 11번, 12번, 13번, 14번, 15번, 및 16번 위치 내에 적어도 2개의 2'-데옥시 변형을 포함한다.

일 구현예에서, 화합물은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고; 센스 가닥은 17개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이를 갖고, 센스 가닥의 중심 영역에 적어도 1개의 2'-데옥시 변형을 포함하고; 안티센스 가닥은 독립적으로 17개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이를 갖고, 안티센스 가닥의 중심 영역에 적어도 2개의 2'-데옥시 변형을 포함한다.

일 구현예에서, 화합물은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고; 센스 가닥은 17개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이를 갖고, 센스 가닥의 중심 영역에 적어도 2개의 2'-데옥시 변형을 포함하고; 센스 가닥은 독립적으로 17개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이를 갖고, 안티센스 가닥의 중심 영역에 적어도 하나의 2'-데옥시 변형을 포함한다.

일 구현예에서, 화합물은 센스 가닥 및 안티센스 가닥(각 가닥은 독립적으로 15개 내지 35개 뉴클레오타이드 길이를 가짐); 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여 제1의 5개 뉴클레오타이드 사이에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합; 센스 및/또는 안티센스 가닥 상의 적어도 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 2'-데옥시 뉴클레오타이드를 포함하고; 화합물은 19개 내지 25개 염기쌍의 듀플렉스 영역을 갖고; 화합물은 리간드를 포함하고; 센스 가닥은 센스 가닥의 중심 영역에 적어도 1개, 예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개 이상의 2'-데옥시 변형을 포함한다.

일 구현예에서, 화합물은 센스 가닥 및 안티센스 가닥(각 가닥은 독립적으로 15개 내지 35개 뉴클레오타이드 길이를 가짐); 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여 제1의 5개 뉴클레오타이드 사이에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합; 센스 및/또는 안티센스 가닥 상의 적어도 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 2'-데옥시 뉴클레오타이드를 포함하고; 화합물은 19개 내지 25개 염기쌍의 듀플렉스 영역을 갖고; 화합물은 리간드를 포함하고; 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 중심 영역에 적어도 1개, 예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개 이상의 2'-데옥시 변형을 포함한다.

일 구현예에서, 화합물은 센스 가닥 및 안티센스 가닥(각 가닥은 독립적으로 15개 내지 35개 뉴클레오타이드 길이를 가짐); 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여 제1의 5개 뉴클레오타이드 사이에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합; 센스 및/또는 안티센스 가닥 상의 적어도 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 2'-데옥시 뉴클레오타이드를 포함하고; 화합물은 19개 내지 25개 염기쌍의 듀플렉스 영역을 갖고; 화합물은 리간드를 포함하고; 화합물은 20% 미만, 예를 들어, 15% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하거나 화합물은 모든 천연 뉴클레오타이드를 포함하고; 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 중심 영역에 적어도 1개, 예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개 이상의 2'-데옥시 변형을 포함한다.

일 구현예에서, 화합물은 센스 가닥 및 안티센스 가닥(각 가닥은 독립적으로 15개 내지 35개 뉴클레오타이드 길이를 가짐); 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여 제1의 5개 뉴클레오타이드 사이에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합; 센스 및/또는 안티센스 가닥 상의 적어도 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 2'-데옥시 뉴클레오타이드를 포함하고; 화합물은 19개 내지 25개 염기쌍의 듀플렉스 영역을 갖고; 화합물은 리간드를 포함하고; 화합물은 20% 미만, 예를 들어, 15% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하거나 화합물은 모든 천연 뉴클레오타이드를 포함하고; 센스 가닥은 센스 가닥의 중심 영역에 적어도 1개, 예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개 이상의 2'-데옥시 변형을 포함한다.

일 구현예에서, 화합물은 센스 가닥 및 안티센스 가닥(각 가닥은 독립적으로 15개 내지 35개 뉴클레오타이드 길이를 가짐); 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여 제1의 5개 뉴클레오타이드 사이에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합; 센스 및/또는 안티센스 가닥 상의 적어도 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 2'-데옥시 뉴클레오타이드를 포함하고; 화합물은 19개 내지 25개 염기쌍의 듀플렉스 영역을 갖고; 화합물은 리간드를 포함하고; 화합물은 20% 미만, 예를 들어, 15% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만의 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하거나 화합물은 모든 천연 뉴클레오타이드를 포함하고; 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 중심 영역에 적어도 1개, 예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개 이상의 2'-데옥시 변형을 포함한다.

일 구현예에서, 화합물이 8개 미만의 비-2'OMe 뉴클레오타이드를 포함하는 경우, 안티센스 가닥은 적어도 하나의 DNA를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 구현예 중 어느 하나에서, 화합물이 8개 미만의 비-2'OMe 뉴클레오타이드를 포함하는 경우, 안티센스 가닥은 적어도 하나의 DNA를 포함한다.

일 구현예에서, 안티센스가 2개의 데옥시 뉴클레오타이드를 포함하고 상기 뉴클레오타이드가 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 2번 및 14번 위치에 있는 경우, 화합물은 8개 이하(예를 들어, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개, 1개 또는 0개)의 비-2'OMe 뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 구현예들 중 어느 하나에서, 안티센스가 2개의 데옥시 뉴클레오타이드를 포함하고 상기 뉴클레오타이드가 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 2번 및 14번 위치에 있는 경우, 화합물은 0개, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 8개의 비 2'-OMe 뉴클레오타이드를 포함한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 피하 또는 정맥내 투여에 의해 피험자의 특정 타겟에 본 발명의 화합물을 전달하기 위한 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 피하 또는 정맥내 투여에 의해 피험자의 특정 타겟에 상기 제제를 전달하기 위한 방법에서의 용도를 위한 본 발명의 화합물을 추가로 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태는 세포에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 타겟 유전자와 상보적인 안티센스 가닥; 상기 안티센스 가닥과 상보적인 센스 가닥; 및 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 위치에, 선택적으로 링커 또는 담체를 통해, 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 함유하는, 하나 이상의 친유성 단량체를 포함하는 화합물과 상기 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.

화합물과 관련된 본 발명의 첫 번째 양태에서 친유성 단량체, 친유성 모이어티, 및 화합물에 대한 이들의 접합에 대한 상기 구현예 모두는 세포에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키는 방법에 관한 본 발명의 이러한 양태에 적합하다.

일 구현예에서, 세포는 간외세포이다.

일 구현예에서, 세포는 간세포가 아니다.

본 발명의 또 다른 양태는 피험자에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 타겟 유전자와 상보적인 안티센스 가닥; 상기 안티센스 가닥과 상보적인 센스 가닥; 및 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에, 선택적으로 링커 또는 담체를 통해, 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 함유하는, 하나 이상의 친유성 단량체를 포함하는 화합물과 상기 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 피험자에게 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.

화합물과 관련된 본 발명의 첫 번째 양태에서 친유성 단량체, 친유성 모이어티, 및 화합물에 대한 이들의 접합에 대한 상기 구현예 모두는 피험자에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키는 방법에 관한 본 발명의 이러한 양태에 적합하다.

일 구현예에서, 세포는 간외로 투여된다.

일 구현예에서, 화합물은 척수강내로 또는 뇌실내로 투여된다. 화합물의 척수강내 또는 뇌실내 투여에 의해, 방법은 뇌 또는 척추 조직, 예를 들어, 피질, 소뇌, 경추, 요추, 및 흉추에서 타겟 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.

일부 구현예에서, 예시적인 타겟 유전자는 APP, ATXN2, C9orf72, TARDBP, MAPT(Tau), HTT, SNCA, FUS, ATXN3, ATXN1, SCA1, SCA7, SCA8, MeCP2, PRNP, SOD1, DMPK, 및 TTR이다. 피험자에서 이러한 타겟 유전자의 발현을 감소시키기 위해, 화합물은 눈(들)에 직접적으로, 예를 들어, 유리체내로 투여될 수 있다. 화합물의 유리체내 투여에 의해, 방법은 안구 조직에서 타겟 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 CNS 장애를 갖는 피험자를 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 이중-가닥 RNAi 제제를 피험자에게 투여하고, 이에 의해 피험자를 치료하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 이중-가닥 RNAi 제제는 타겟 유전자와 상보적인 안티센스 가닥; 상기 안티센스 가닥과 상보적인 센스 가닥; 및 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에, 선택적으로 링커 또는 담체를 통해, 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 함유하는, 하나 이상의 친유성 단량체를 포함한다.

화합물과 관련된 본 발명의 첫 번째 양태에서 친유성 단량체, 친유성 모이어티 및 화합물에 대한 이들의 접합에 대한 상기 구현예 모두는 CNS 장애를 갖는 피험자를 치료하는 방법에 관한 본 발명의 이러한 양태에 적합하다. 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 예시적인 CNS 장애는 알츠하이머(Alzheimer), 근위축성 축삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis: ALS), 전측두엽 치매(frontotemporal dementia), 헌팅턴(Huntington), 파킨슨(Parkinson), 척수소뇌(spinocerebellar), 프리온(prion) 및 라포라(lafora)를 포함한다.

도 1은 세라미드의 일반 구조를 나타내는 반응식이다.
도 2는 siRNA 듀플렉스들을 24시간 동안 래트 CSF와 함께 인큐베이션한 후 래트 CSF에서 siRNA 접합체의 안정성을 도시하는 그래프이다.
도 3은 24시간 동안 토끼 및 시노(NHP)의 유리체액에서 siRNA 접합체의 안정성을 도시하는 그래프이다. 잔여량의 리간드-접합 듀플렉스가 플롯팅되었다.
도 4는 24시간 동안 토끼 및 시노(NHP)의 유리체액에서 siRNA 접합체의 안정성을 도시하는 그래프이다. 잔여량의 리간드-접합 듀플렉스가 플롯팅되었다.
도 5a 및 도 5b는 4시간 동안의 래트 뇌 균질물에서 siRNA 접합체의 안정성을 도시하는 그래프이다. 잔여량의 리간드-접합 듀플렉스는 도 5a에 플롯팅되었고, PS 결합의 안정성은 도 5b에 플롯팅되었다.
도 6은 24시간 동안 토끼 및 시노(NHP)의 유리체액에서 에스테라제 분해형 접합체를 갖는 siRNA 접합체의 안정성을 도시하는 그래프이다. 가수분해된 리간드-접합 듀플렉스의 백분율이 플롯팅되었다.
도 7는 24시간 동안 래트 혈장, CSF 및 뇌 균질물에서 에스테라제 분해형 접합체를 갖는 siRNA 접합체의 안정성을 도시하는 그래프이다. 가수분해된 리간드-접합 듀플렉스의 백분율이 플롯팅되었다.
도 8은 상이한 농도들의 HSA에서 siRNA 접합체의 인간 혈청 알부민 결합을 도시하는 그래프이다. 결합된 siRNA의 분획은 인간 혈청 알부민 농도에 대해 플롯팅되었다.
도 9는 상이한 농도들의 HSA에서 노출된 카르복실산을 갖는 siRNA 접합체의 인간 혈청 알부민 결합을 도시하는 그래프이다. 결합된 siRNA의 분획은 인간 혈청 알부민 농도에 대해 플롯팅되었다.
도 10은 PBS 대조와 비교하여 단일 7.5 μg 용량의 siRNA 듀플렉스의 유리체내 투여 후 마우스 눈에서 qPCR에 의한 안구 TTR 발현의 억제를 도시하는 그래프이다.
도 11은 PBS 대조와 비교하여 단일 1 μg 용량의 siRNA 듀플렉스의 유리체내 투여 후 래트 눈에서 qPCR에 의한 안구 TTR 발현의 억제를 도시하는 그래프이다.
도 12는 PBS 대조와 비교하여 단일 7.5 μg 용량의 siRNA 듀플렉스의 유리체내 투여 후 마우스 눈에서 qPCR에 의한 안구 TTR 발현의 억제를 도시하는 그래프이다.
도 13은 PBS 대조와 비교하여 단일 1 μg 용량의 siRNA 듀플렉스의 유리체내 투여 후 래트 눈에서 qPCR에 의한 안구 TTR 발현의 억제를 도시하는 그래프이다.
도 14는 PBS 대조와 비교하여 단일 7.5 μg 용량의 siRNA 듀플렉스의 유리체내 투여 후 마우스 눈에서 qPCR에 의한 안구 TTR 발현의 억제를 도시하는 그래프이다.
도 15는 PBS 대조와 비교하여 단일 1 μg 용량의 siRNA 듀플렉스의 유리체내 투여 후 래트 눈에서 qPCR에 의한 안구 TTR 발현의 억제를 도시하는 그래프이다.
도 16은 3개의 상이한 농도에서 대조 듀플렉스 AD-900954와 비교하여, Q367에 의해 변형된 siRNA 듀플렉스로의 세포의 형질감염 24시간 후 일차 마우스 간세포에서의 TTR 유전자 발현의 억제를 도시하는 그래프이다. 뉴클레오타이드 각각은 Q367에 의해 센스 가닥에 걸쳐 변형되었다.
도 17은 3개의 상이한 농도에서 대조 듀플렉스 AD-900954와 비교하여, Q367에 의해 변형된 siRNA 듀플렉스로의 세포의 형질감염 24시간 후 일차 마우스 간세포에서의 SOD1 유전자 발현의 억제를 도시하는 그래프이다. 뉴클레오타이드 각각은 Q367에 의해 센스 가닥에 걸쳐 변형되었다.
도 18a 내지 도 18d는 14일 후 인공 CSF 투여 대조군과 비교한, 단일 0.9 mg의 siRNA 듀플렉스/래트의 IT 투여 후 래트 척수(도 18a), 소뇌(도 18b), 전두엽 피질(도 18c), 및 심장(도 18d)에서 qPCR에 의한 SOD1 발현의 억제를 도시하는 그래프이다.
도 19a 내지 도 19e는 14일 후 인공 CSF 투여 대조군과 비교한, 단일 0.9 mg의 siRNA 듀플렉스/래트의 IT 투여 후 래트 척수(도 19a), 뇌간(도 19b), 소뇌(도 19c), 전두엽 피질(도 19d), 및 심장(도 19e)에서 qPCR에 의한 SOD1 발현의 억제를 도시하는 그래프이다.
도 20은 14일 후 인공 CSF 투여 대조군과 비교한, 단일 0.9 mg의 siRNA 듀플렉스/래트의 IT 투여 후 래트 뇌(소뇌 및 전두엽 피질) 및 척수(흉부 척수)에서 qPCR에 의한 SOD1 발현의 억제를 도시하는 그래프이다.
도 21a 및 도 21b는 14일(도 21a) 및 7일(도 21b) 후 인공 CSF 투여 대조군과 비교한, 단일 50 μg(도 21a) 및 110 μg(도 21b)의 siRNA 듀플렉스/마우스의 ICV 투여에 따른 마우스 뇌(우반구) 및 심장에서 qPCR에 의한 SOD1 발현의 억제를 도시하는 그래프이다.

본 발명자들은, 특히, 친유성 모이어티를 함유하는 친유성 단량체를 화합물의 적어도 하나의 가닥에서 하나 이상의 위치에 접합시키는 것이 놀랍게도, CNS 시스템 및 안구 시스템의 세포로의 효율적인 진입을 야기하고, CNS 시스템 및 안구 시스템의 세포로 효율적으로 내재화되어, 이중-가닥 iRNA의 생체내 안구 전달(예를 들어, 유리체내 전달) 및 척수강내 또는 뇌실내 전달에 대하여 우수한 결과를 제공한다는 것을 발견하였다.

본 발명의 하나의 양태는 타겟 유전자와 상보적인 안티센스 가닥; 상기 안티센스 가닥과 상보적인 센스 가닥; 및 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 위치에, 선택적으로 링커 또는 담체를 통해, 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 함유하는, 하나 이상의 친유성 단량체를 포함하는, 화합물을 제공한다.

용어 "친유성제" 또는 "친유성 모이어티"는 광범위하게 지질에 대한 친화성을 갖는 임의의 화합물 또는 화학적 모이어티를 지칭한다. 친유성 모이어티의 친유성을 특성규명하는 한 가지 방법은 옥탄올-물 분배 계수, logK_ow에 의한 것이며, 여기서 K_ow는 평형 상태인 2-상 시스템의 수성 상 중 이의 농도에 대한 옥탄올-상 중 화학물질 농도의 비율이다. 옥탄올-물 분배 계수는 물질의 실험실-측정 성질이다. 그러나, 이는 또한 1차-원리 또는 경험적 방법을 이용하여 계산되는 화학물질의 구조적 성분에 기여하는 계수를 이용함으로써 예측될 수 있다(예를 들어, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 문헌[Tetko et al., J. Chem. Inf. Comput. Sci. 41:1407-21 (2001)] 참조). 이는 비-수성 또는 물보다 유성인 환경을 선호하는 물질의 경향에 대한 열역학적 척도를 제공한다(즉, 이의 친수성/친유성 균형). 원칙적으로, 화학 물질의 성질은 이의 logK_ow가 0을 초과할 때 친유성이다. 전형적으로, 친유성 모이어티는 1 초과, 1.5 초과, 2 초과, 3 초과, 4 초과, 5 초과, 또는 10초과의 logK_ow를 지닌다. 예를 들어, 6-아미노 헥산올의 logK_ow는, 예를 들어, 대략 0.7인 것으로 예측된다. 동일한 방법을 이용하여, 콜레스테릴 N-(헥산-6-올) 카르바메이트의 logK_ow는 10.7인 것으로 예측된다.

분자의 친유성은 분자가 지니고 있는 작용기에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 친유성 모이어티의 말단에 하이드록실 기 또는 아민 기를 첨가하는 것은 친유성 모이어티의 분배 계수(예를 들어, logK_ow)를 증가시키거나 감소시킬 수 있다.

대안적으로, 하나 이상의 친유성 모이어티를 함유하는, 하나 이상의 친유성 단량체에 접합된 화합물(예를 들어, 이중-가닥 iRNA 제제)의 소수성은 이의 단백질 결합 특징에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 화합물의 혈장 단백질 결합 검정에서 비결합 분율은 이중-가닥 iRNA 제제의 상대 소수성과 양의 상관관계가 있는 것(이는 이중-가닥 iRNA 제제의 사일런싱 활성과 양의 상관관계가 있을 수 있음)으로 결정될 수 있다.

일 구현예에서, 결정되는 혈장 단백질 결합 검정은 인간 혈청 알부민 단백질을 이용하여 전기영동 이동성 변화 검정(EMSA)이다. 결합 검정에서 비결합 siRNA의 분율에 의해 측정되는 이중-가닥 iRNA 제제의 소수성은 siRNA의 생체내 전달 향상을 위해 0.15 초과, 0.2 초과, 0.25 초과, 0.3 초과, 0.35 초과, 0.4 초과, 0.45 초과, 또는 0.5 초과이다.

이에 따라, 화합물에 친유성 모이어티를 함유하는 친유성 단량체를 접합시키는 것은 siRNA의 생체내 전달 향상을 위해 최적의 소수성을 제공한다.

소정의 구현예에서, 친유성 모이어티는 지방족, 사이클릭, 예컨대, 비사이클릭, 또는 폴리사이클릭, 예컨대, 폴리비사이클릭 화합물, 예컨대, 스테로이드(예를 들어, 스테롤) 또는 선형 또는 분지형 지방족 탄화수소이다. 친유성 모이어티는 일반적으로 사이클릭 또는 비사이클릭일 수 있는 탄화수소 사슬을 포함할 수 있다. 탄화수소 사슬은 다양한 치환기 및/또는 하나 이상의 헤테로원자, 예컨대, 산소 또는 질소 원자를 포함할 수 있다. 그러한 친유성 지방족 모이어티는, 제한 없이, 포화되거나 불포화된 C₄-C₃₀ 탄화수소(예를 들어, C₆-C₁₈ 탄화수소), 포화되거나 불포화된 지방산, 왁스(예를 들어, 지방산 및 지방 디아미드의 일가 알코올 에스테르), 테르펜(예를 들어, C₁₀ 테르펜, C₁₅ 세스퀴테르펜, C₂₀ 디테르펜, C₃₀ 트리테르펜, 및 C₄₀ 테트라테르펜), 및 그 밖의 폴리비사이클릭 탄화수소를 포함한다. 예를 들어, 친유성 모이어티는 C₄-C₃₀ 탄화수소 사슬(예를 들어, C₄-C₃₀ 알킬 또는 알케닐)을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 포화되거나 불포화된 C₆-C₁₈ 탄화수소 사슬(예를 들어, 선형 C₆-C₁₈ 알킬 또는 알케닐)을 함유한다. 일 구현예에서, 친유성 모이어티는 포화되거나 불포화된 C₁₆ 탄화수소 사슬(예를 들어, 선형 C₁₆ 알킬 또는 알케닐)을 함유한다.

친유성 모이어티를 함유하는 친유성 단량체는, 이미 친유성 단량체에 존재하거나 iRNA 제제에 도입된 작용기, 예컨대, 하이드록시 기(예를 들어, -CO-CH₂-OH)에 의한 것을 포함하여, 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 iRNA 제제에 부착될 수 있다. 이미 친유성 단량체에 존재하거나 iRNA 제제에 도입된 작용기는 하이드록실, 아민, 카르복실산, 설포네이트, 포스페이트, 티올, 아자이드, 및 알카인을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.

iRNA 제제와 친유성 단량체의 접합은, 예를 들어, 하이드록시와 알킬 기 R-, 알칸오일 기 RCO- 또는 치환된 카르바모일 기 RNHCO- 간의 에테르 또는 카르복실 또는 카르바모일 에스테르 결합의 형성을 통해 이루어질 수 있다. 알킬 기 R은 사이클릭(예를 들어, 사이클로헥실) 또는 비사이클릭(예를 들어, 직쇄 또는 분지형; 및 포화 또는 불포화)일 수 있다. 알킬 기 R은 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실, 트리데실, 테트라데실, 펜타데실, 헥사데실, 헵타데실 또는 옥타데실 기 등일 수 있다.

일부 구현예에서, 친유성 모이어티를 함유하는 친유성 단량체는 에테르, 티오에테르, 우레아, 카르보네이트, 아민, 아미드, 말레이미드-티오에테르, 디설파이드, 포스포디에스테르, 설폰아미드 결합, 클릭 반응의 산물(예를 들어, 아자이드-알카인의 첨가환화로부터의 트리아졸), 또는 카르바메이트를 함유하는 링커를 통해 화합물에 접합된다.

또 다른 구현예에서, 친유성 모이어티는 스테로이드, 예컨대, 스테롤이다. 스테로이드는 퍼하이드로-1,2-사이클로펜타노페난트렌 고리 시스템을 함유하는 폴리사이클릭 화합물이다. 스테로이드는, 제한 없이, 담즙산(예를 들어, 콜릭산, 데옥시콜릭산 및 데하이드로콜릭산), 코르티손, 디곡시게닌, 테스토스테론, 콜레스테롤, 및 양이온성 스테로이드, 예컨대, 코르티손을 포함한다. "콜레스테롤 유도체"는, 예를 들어, 치환기의 치환, 첨가 또는 제거에 의해 콜레스테롤로부터 얻어진 화합물을 지칭한다.

또 다른 구현예에서, 친유성 모이어티는 방향족 모이어티이다. 이러한 맥락에서, 용어 "방향족"은 대체적으로 단일- 및 다중방향족 탄화수소를 지칭한다. 방향족 기는, 제한 없이, 선택적으로 치환될 수 있는 1개 내지 3개의 방향족 고리를 포함하는 C₆-C₁₄ 아릴 모이어티; 어느 하나가 독립적으로 선택적으로 치환되거나 비치환될 수 있는 알킬 기에 공유 결합된 아릴 기를 포함하는 "아르알킬" 또는 "아릴알킬" 기; 및 "헤테로아릴" 기를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "헤테로아릴"은 5개 내지 14개의 고리 원자, 바람직하게는 5개, 6개, 9개, 또는 10개의 고리 원자를 갖고; 사이클릭 배열에 공유된 6, 10, 또는 14ð 전자를 갖고, 탄소 원자 이외에, 질소(N), 산소(O), 및 황(S)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 내지 약 3개의 헤테로원자를 갖는 기를 지칭한다.

본원에서 사용되는 "치환된" 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 또는 헤테로사이클릭 기는 1개 내지 약 4개, 바람직하게는 1개 내지 약 3개, 더욱 바람직하게는 1개 또는 2개의 비-수소 치환기를 갖는 것이다. 적합한 치환기는, 제한 없이, 할로, 하이드록시, 니트로, 할로알킬, 알킬, 알크아릴, 아릴, 아르알킬, 알콕시, 아릴옥시, 아미노, 아실아미노, 알킬카르바모일, 아릴카르바모일, 아미노알킬, 알콕시카르보닐, 카르복시, 하이드록시알킬, 알칸설포닐, 아렌설포닐, 알칸설폰아미도, 아렌설폰아미도, 아르알킬설폰아미도, 알킬카르보닐, 아실옥시, 시아노, 및 우레이도 기를 포함한다.

일부 구현예에서, 친유성 모이어티는 아르알킬 기, 예를 들어, 2-아릴프로판오일 모이어티이다. 아르알킬 기의 구조적 특징은 친유성 모이어티가 생체내에서 적어도 하나의 단백질을 결합하도록 선택된다. 소정의 구현예에서, 아르알킬 기의 구조적 특징은 친유성 모이어티가 혈청, 혈관, 또는 세포 단백질에 결합하도록 선택된다. 소정의 구현예에서, 아르알킬 기의 구조적 특징은 알부민, 면역글로불린, 지질단백질, α-2-마크로글로불린, 또는 α-1-당단백질에 대한 결합을 촉진한다.

소정의 구현예에서, 리간드는 나프록센 또는 나프록센의 구조적 유도체이다. 나프록센의 합성을 위한 절차는 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 No. 3,904,682 및 미국 특허 No. 4,009,197에서 찾아볼 수 있다. 나프록센은 화학명 (S)-6-메톡시-α-메틸-2-나프탈렌아세트산을 갖고, 구조는

이다.

소정의 구현예에서, 리간드는 이부프로펜 또는 이부프로펜의 구조적 유도체이다. 이부프로펜의 합성을 위한 절차는 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 No. 3,228,831에서 찾아볼 수 있다. 이부프로펜의 구조는

이다.

추가의 예시적인 아르알킬 기는 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 No. 7,626,014에 예시되어 있다.

또 다른 구현예에서, 적합한 친유성 모이어티는 지질, 콜레스테롤, 레티노산, 콜릭산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 제라닐옥시헥시아놀, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜릭산, O3-(올레오일)콜렌산, 이부프로펜, 나프록센, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진을 포함한다.

소정의 구현예에서, 특히 친유성 모이어티가 낮은 친유성 및 소수성을 갖는 경우, 하나보다 많은 친유성 모이어티를 함유하는 친유성 단량체가 이중-가닥 iRNA 제제에 혼입될 수 있다. 일 구현예에서, 둘 이상의 친유성 모이어티를 함유하는 친유성 단량체는 이중-가닥 iRNA 제제의 동일한 가닥에 혼입된다. 일 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제의 각 가닥은 혼입된 하나 이상의 친유성 모이어티를 함유하는 친유성 단량체를 갖는다. 일 구현예에서, 둘 이상의 친유성 모이어티를 함유하는 친유성 단량체는 이중-가닥 iRNA 제제의 동일한 위치(즉, 동일한 뉴클레오베이스, 동일한 당 모이어티, 또는 동일한 뉴클레오사이드간 결합)에 혼입된다. 이는, 예를 들어, 담체, 및/또는 분지형 링커, 및/또는 둘 이상의 친유성 모이어티를 연결할 수 있는 하나 이상의 링커를 함유하는 친유성 단량체를 사용하여 달성될 수 있다.

친유성 모이어티가 iRNA 제제의 뉴클레오베이스, 리보당, 또는 뉴클레오사이드간 결합에 대한 직접 부착을 통해 iRNA 제제에 접합되는 경우, 친유성 단량체는 뉴클레오베이스, 리보당, 또는 뉴클레오사이드간 결합, 및 친유성 모이어티를 포함한다. 대안적으로, 친유성 단량체는 비-리보스 치환 단위, 예컨대, 링커 또는 담체에 접합된 친유성 모이어티를 포함할 수 있다. 친유성 모이어티가 비-리보스 치환 단위, 예컨대, 링커 또는 담체를 통해 이중-가닥 iRNA 제제에 접합되는 경우, 친유성 단량체는 비-리보스 치환 단위, 예컨대, 링커 또는 담체, 및 친유성 모이어티를 포함한다.

소정의 구현예에서, 친유성 단량체는 하나 이상의 링커(테터)를 통해 iRNA 제제에 접합된 친유성 모이어티를 포함한다.

일 구현예에서, 친유성 단량체는 에테르, 티오에테르, 우레아, 카르보네이트, 아민, 아미드, 말레이미드-티오에테르, 디설파이드, 포스포디에스테르, 설폰아미드 결합, 클릭 반응의 산물(예를 들어, 아자이드-알카인의 첨가환화로부터의 트리아졸), 또는 카르바메이트를 함유하는 링커를 통해 화합물에 접합된 친유성 모이어티를 포함한다.

링커/테터

링커/테터는 "테터링 부착점(TAP)"에서 친유성 모이어티에 연결된다. 링커/테터는 임의의 C₁-C₁₀₀ 탄소-함유 모이어티(예를 들어, C₁-C₇₅, C₁-C₅₀, C₁-C₂₀, C₁-C₁₀; C₁, C₂, C₃, C₄, C₅, C₆, C₇, C₈, C₉, 또는 C₁₀)를 포함할 수 있고, 적어도 하나의 질소 원자를 가질 수 있다. 소정의 구현예에서, 질소 원자는, 친유성 모이어티에 대한 연결점으로서 작용할 수 있는 링커/테터의 말단 아미노 또는 아미도(NHC(O)-) 기의 일부를 형성한다. 링커/테터(밑줄 그어짐)의 비-제한적 예는 TAP-(CH ₂ ) _n NH-; TAP-C(O)(CH ₂ ) _n NH-; TAP-NR''''(CH ₂ ) _n NH-, TAP-C(O)-(CH ₂ ) _n -C(O)-; TAP-C(O)-(CH ₂ ) _n -C(O)O-; TAP-C(O)-O-; TAP-C(O)-(CH ₂ ) _n -NH-C(O)-; TAP-C(O)-(CH ₂ ) _n -; TAP-C(O)-NH-; TAP-C(O)-; TAP-(CH ₂ ) _n -C(O)-; TAP-(CH ₂ ) _n -C(O)O-; TAP-(CH ₂ ) _n -; 또는 TAP-(CH ₂ ) _n -NH-C(O)-를 포함하고, 여기서 n은 1 내지 20(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20)이고, R''''는 C₁-C₆ 알킬이다. 바람직하게는, n은 5, 6, 또는 11이다. 다른 구현예에서, 질소는 말단 옥시아미노 기, 예를 들어, -ONH₂, 또는 하이드라지노 기, -NHNH₂의 일부를 형성할 수 있다. 링커/테터는, 예를 들어, 하이드록시, 알콕시, 퍼할로알킬로 선택적으로 치환되고/치환되거나, 하나 이상의 추가 헤테로원자, 예를 들어, N, O, 또는 S가 선택적으로 삽입될 수 있다. 바람직한 테터링된 리간드는, 예를 들어, TAP-(CH ₂ ) _n NH(리간드); TAP-C(O)(CH ₂ ) _n NH(리간드); TAP-NR''''(CH ₂ ) _n NH(리간드); TAP-(CH ₂ ) _n ONH(리간드); TAP-C(O)(CH ₂ ) _n ONH(리간드); TAP-NR''''(CH ₂ ) _n ONH(리간드); TAP-(CH ₂ ) _n NHNH ₂ (리간드), TAP-C(O)(CH ₂ ) _n NHNH ₂ (리간드); TAP-NR''''(CH ₂ ) _n NHNH ₂ (리간드); TAP-C(O)-(CH ₂ ) _n -C(O)(리간드); TAP-C(O)-(CH ₂ ) _n -C(O)O(리간드); TAP-C(O)-O(리간드); TAP-C(O)-(CH ₂ ) _n -NH-C(O)(리간드); TAP-C(O)-(CH ₂ ) _n (리간드); TAP-C(O)-NH(리간드); TAP-C(O)(리간드); TAP-(CH ₂ ) _n -C(O)(리간드); TAP-(CH ₂ ) _n -C(O)O(리간드); TAP-(CH ₂ ) _n (리간드); 또는 TAP-(CH ₂ ) _n -NH-C(O)(리간드)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노 말단 링커/테터(예를 들어, NH₂, ONH₂, NH₂NH₂)는 리간드와 이미노 결합(즉, C=N)을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 아미노 말단 링커/테터(예를 들어, NH₂, ONH₂, NH₂NH₂)는, 예를 들어, C(O)CF₃로 아실화될 수 있다.

일부 구현예에서, 링커/테터는 머캅토 기(즉, SH) 또는 올레핀(예를 들어, CH=CH₂)으로 종결될 수 있다. 예를 들어, 테터는 TAP-(CH ₂ ) _n -SH, TAP-C(O)(CH ₂ ) _n SH, TAP-(CH ₂ ) _n -(CH=CH ₂ ), 또는 TAP-C(O)(CH ₂ ) _n (CH=CH ₂ )일 수 있고, 여기서 n은 다른 곳에 기재된 바와 같을 수 있다. 테터는, 예를 들어, 하이드록시, 알콕시, 퍼할로알킬로 선택적으로 치환되고/거나, 하나 이상의 추가 헤테로원자, 예를 들어, N, O, 또는 S가 선택적으로 삽입될 수 있다. 이중 결합은 시스 또는 트랜스 또는 E 또는 Z일 수 있다.

다른 구현예에서, 링커/테터는 바람직하게는 링커/테터의 말단 위치에 친전자성 모이어티를 포함할 수 있다. 예시적인 친전자성 모이어티는, 예를 들어, 알데하이드, 알킬 할라이드, 메실레이트, 토실레이트, 노실레이트, 또는 브로실레이트, 또는 활성화된 카르복실산 에스테르, 예를 들어, NHS 에스테르, 또는 펜타플루오로페닐 에스테르를 포함한다. 바람직한 링커/테터(밑줄 그어짐)는 TAP-(CH ₂ ) _n CHO; TAP-C(O)(CH ₂ ) _n CHO; 또는 TAP-NR''''(CH ₂ ) _n CHO(여기서, n은 1 내지 6이고, R''''는 C₁-C₆ 알킬임); 또는 TAP-(CH ₂ ) _n C(O)ONHS; TAP-C(O)(CH ₂ ) _n C(O)ONHS; 또는 TAP-NR''''(CH ₂ ) _n C(O)ONHS(여기서, n은 1 내지 6이고, R''''는 C₁-C₆ 알킬임); TAP-(CH ₂ ) _n C(O)OC ₆ F ₅ ; TAP-C(O)(CH ₂ ) _n C(O) OC ₆ F ₅ ; 또는 TAP-NR''''(CH ₂ ) _n C(O) OC ₆ F ₅ (여기서, n은 1 내지 11이고, R''''는 C₁-C₆ 알킬임); 또는 -(CH ₂ ) _n CH ₂ LG; TAP-C(O)(CH ₂ ) _n CH ₂ LG; 또는 TAP-NR''''(CH ₂ ) _n CH ₂ LG(여기서, n은 다른 곳에 기재된 바와 같을 수 있고, R''''는 C₁-C₆ 알킬임)(LG는 이탈 기, 예를 들어, 할라이드, 메실레이트, 토실레이트, 노실레이트, 브로실레이트일 수 있음)를 포함한다. 테터링은 리간드의 친핵성 기, 예를 들어, 티올 또는 아미노 기를 테터의 친전자성 기와 커플링시킴으로써 수행될 수 있다.

다른 구현예에서, 단량체는 링커/테터의 말단 위치에 프탈이미도 기(K)를 포함하는 것이 바람직할 수 있다

.

다른 구현예에서, 다른 보호된 아미노 기는 링커/테터의 말단 위치, 예를 들어, alloc, 모노메톡시 트리틸(MMT), 트리플루오로아세틸, Fmoc, 또는 아릴 설포닐에 있을 수 있다(예를 들어, 아릴 부분은 오르토-니트로페닐 또는 오르토, 파라-디니트로페닐일 수 있음).

본원에 기재된 임의의 링커/테터는 하나 이상의 추가 연결 기, 예를 들어, -O-(CH₂)_n-, -(CH₂)_n-SS-, -(CH₂)_n-, 또는 -(CH=CH)-를 추가로 포함할 수 있다.

분해형 링커/테터

일부 구현예에서, 링커/테터 중 적어도 하나는 산화환원 분해형 링커, 산 분해형 링커, 에스테라제 분해형 링커, 포스파타제 분해형 링커, 또는 펩티다제 분해형 링커일 수 있다.

일 구현예에서, 링커/테터 중 적어도 하나는 환원 분해형 링커(예를 들어, 디설파이드 기)일 수 있다.

일 구현예에서, 링커/테터 중 적어도 하나는 산 분해형 링커(예를 들어, 하이드라존 기, 에스테르 기, 아세탈 기, 또는 케탈 기)일 수 있다.

일 구현예에서, 링커/테터 중 적어도 하나는 에스테라제 분해형 링커(예를 들어, 에스테르 기)일 수 있다.

일 구현예에서, 링커/테터 중 적어도 하나는 포스파타제 분해형 링커(예를 들어, 포스페이트 기)일 수 있다.

일 구현예에서, 링커/테터 중 적어도 하나는 펩티다제 분해형 링커(예를 들어, 펩타이드 결합)일 수 있다.

분해형 연결 기는 분해 제제, 예를 들어, pH, 산화환원 퍼텐셜 또는 분해성 분자의 존재에 취약하다. 일반적으로, 분해 제제는 혈청 또는 혈액에서보다 세포 내에서 더욱 만연하거나 보다 높은 수준 또는 활성으로 발견된다. 이런 분해성 제제의 예로는, 환원에 의해 산화환원 분해형 연결 기를 분해할 수 있으며, 세포에 존재하는 예를 들어, 산화 또는 환원 효소 또는 머캅탄과 같은 환원제를 비롯하여 특정 기질에 선택되거나 또는 기질 특이성을 가지지 않는 산화환원 제제; 에스테라제; 엔도좀 또는 산성 환경을 만들 수 있는 제제, 예를 들어, pH가 5 이하로 되게 하는 제제; 일반 산으로서 작용함으로써 산 분해형 연결 기를 가수분해하거나 또는 분해할 수 있는 효소, (기질 특이성일 수 있는) 펩티다제, 및 포스파타제를 포함한다.

이황화 결합과 같은 분해형 연결 기는 pH에 취약할 수 있다. 인간 혈청의 pH는 7.4이며, 평균 세포내 pH는 약간 더 낮아 약 7.1 내지 7.3의 범위이다. 엔도좀은 5.5 내지 6.0 범위의 보다 산성의 pH를 가지며, 리소좀은 약 5.0의 보다 더 산성인 pH를 가진다. 일부 테터들은 바람직한 pH에서 분해되는 분해형 연결 기를 가질 것이며, 이로써 세포 내에서 리간드(예를 들어, 타겟화 또는 세포-침투성 리간드, 예컨대, 콜레스테롤)로부터 또는 세포의 목적하는 구획으로 iRNA 제제를 방출할 것이다.

리간드를 iRNA 제제에 연결하는 화학적 접합(예를 들어, 연결 기)은 이황화 결합을 포함할 수 있다. iRNA 제제/리간드 복합체가 엔도시토시스에 의해 세포에 삼켜질 때, 엔도좀의 산성 환경은 이황화 결합이 분해되게 하고, 이에 의해 리간드로부터 iRNA 제제를 방출할 것이다(Quintana et al., Pharm Res. 19:1310-1316, 2002; Patri et al., Curr. Opin. Curr. Biol. 6:466-471, 2002). 리간드는 iRNA 제제의 치료 효과를 보완할 수 있는 제2 치료제 또는 타겟화 리간드일 수 있다.

테터는 특정 효소에 의해 분해될 수 있는 분해형 연결 기를 포함할 수 있다. 테터에 혼입되는 연결 기의 유형은 iRNA 제제에 의해 타겟화되는 세포에 좌우될 수 있다. 예를 들어, 간 세포에서 mRNA를 타겟화하는 iRNA 제제는 에스테르기를 포함하는 테터에 접합될 수 있다. 간세포는 에스테라제가 풍부하므로, 테터는 에스테라제가 풍부하지 않은 세포 유형에서보다 간세포에서 보다 효율적으로 분해될 것이다. 테터의 분해는 테터의 원위 말단에 부착되는 리간드로부터 iRNA 제제를 방출하고, 이에 의해 iRNA 제제의 사일런싱 활성을 잠재적으로 향상시킨다. 에스테라제가 풍부한 다른 세포 유형으로는, 폐세포, 신피질 세포, 및 고환 세포를 포함한다.

펩타이드 결합을 함유하는 테터는, 간세포 및 활막세포와 같이 펩티다제가 풍부한 세포 유형을 타겟화하기 위해 iRNA 제제에 접합될수 있다. 예를 들어, 염증성 질환(예를 들어, 류마티스 관절염)의 치료를 위한 것과 같이 활막세포에 타겟화되는 iRNA 제제는 펩타이드 결합을 함유하는 테터에 접합될 수 있다.

일반적으로, 후보물질 분해형 연결 기의 적합성은 분해성 제제(또는 조건)가 후보물질 연결 기를 분해하는 능력을 시험함으로써 평가될 수 있다. 혈액, 또는 기타 비-타겟 조직과 접촉한 경우의 분해에 대해 저항성을 나타내는 능력에 대해 후보물질 분해형 연결 기를 또한 시험하는 것도 바람직할 것이고, 예를 들어, iRNA 제제의 조직은 피험자에 투여될 때 노출될 것이다. 따라서, 당업자는 제1 조건과 제2 조건 사이에서 분해에 대한 상대적인 취약성을 측정할 수 있으며, 제1 조건은 타겟 세포에서의 분해의 지표인 것으로 선택되며 제2 조건은 기타 조직 또는 혈액이나 혈청과 같은 생물학적 유체에서의 분해의 지표인 것으로 선택된다. 평가는 세포 무함유 시스템, 세포, 세포 배양물, 기관 또는 조직 배양물, 또는 전체 동물에서 수행될 수 있다. 세포-무함유 또는 배양 조건에서 초기 평가를 하고 전체 동물에서 추가로 평가하여 확인하는 것이 유용할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 유용한 후보물질 화합물은 혈액 또는 혈청(또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관 내 조건 하)과 비교해 세포(또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관 내 조건 하)에서 적어도 2, 4, 10 또는 100배 더 빠르게 분해된다.

산화환원 분해형 연결 기

분해형 연결 기의 일 클래스는 환원 또는 산화 시 분해되는 산화환원 분해형 연결 기이다. 환원 분해형 연결 기의 일 예는 디설파이드 연결기(-S-S-)이다. 후보물질인 분해형 연결기가 적절한 "환원 분해형 연결기"이거나 또는 예를 들어 특정 iRNA 모이어티 및 특정 타겟화 제제와 사용하기에 적절한지 결정하기 위해, 당업자는 본원에서 기술된 방법을 고찰할 수 있다. 예를 들어, 후보물질은, 타겟 세포와 같은 세포에서 관찰되는 분해의 속도를 모방하는, 디티오트레이톨(DTT) 또는 당해 기술분야에 공지된 시약을 사용하는 기타 환원제와 함께 인큐베이션함으로써 평가될 수 있다. 후보물질은 또한, 혈액 또는 혈청 조건을 모방하도록 선택된 조건 하에 평가될 수도 있다. 바람직한 구현예에서, 후보물질 화합물은 혈액에서 10% 이하 분해된다. 바람직한 구현예에서, 유용한 후보물질 화합물은, 혈액(또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관 내 조건 하)과 비교해 세포(또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관 내 조건 하)에서 적어도 2배, 4배, 10배 또는 100배 더 빠르게 분해된다. 후보물질 화합물의 분해 속도는 세포내 배지를 모방하도록 선택된 조건 하에서 표준 효소 카이네틱스 분석법을 이용해 측정되며, 세포외 배지를 모방하도록 선택된 조건과 비교될 수 있다.

포스페이트-기재의 분해형 연결기

포스페이트-기재의 분해형 연결기는 포스페이트기를 분해하거나 또는 가수분해하는 제제에 의해 분해된다. 세포에서 포스페이트기를 분해하는 제제의 일 예는, 세포에서 포스파타제와 같은 효소이다. 포스페이트-기재의 연결 기의 예는, -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)(Rk)-S이다. 바람직한 구현예는 -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-이다. 바람직한 구현예는 -O-P(O)(OH)-O-이다. 이들 후보물질은 전술한 것들과 유사한 방법을 이용해 평가될 수 있다.

산 분해형 연결 기

산 분해형 연결 기는 산성 조건 하에 분해되는 연결 기이다. 바람직한 구현예에서, 산 분해형 연결 기는, pH가 약 6.5 이하(예를 들어, 약 6.0, 5.5, 5.0 이하)인 산성 환경에서, 또는 일반 산(general acid)으로서 작용할 수 있는 효소와 같은 제제에 의해 분해된다. 세포에서, 엔도좀 및 리소좀과 같이 pH가 낮은 특정 세포소기관은 산 분해형 연결 기에 대해 분해 환경을 제공할 수 있다. 산 분해형 연결 기의 예로는, 하이드라존, 케탈, 아세탈, 에스테르, 및 아미노산의 에스테르를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 산 분해 기는 일반식 -C=NN-, C(O)O, 또는 -OC(O)을 가질 수 있다. 바람직한 구현예는, 에스테르의 산소에 부착된 탄소(알콕시기)가 아릴기, 치환된 알킬기, 또는 디메틸 펜틸 또는 t-부틸과 같은 3차 알킬기인 경우이다. 이들 후보물질은 전술한 것들과 유사한 방법을 이용해 평가될 수 있다.

에스테르-기재의 연결기

에스테르-기재의 연결기는 세포 내 에스테라제 및 아미다제와 같은 효소에 의해 분해된다. 에스테르-기재의 분해형 연결기의 예로는, 알킬렌, 알케닐렌 및 알키닐렌 기의 에스테르를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 에스테르 분해형 연결 기는 일반식 -C(O)O-, 또는 -OC(O)-를 가진다. 이들 후보물질은 전술한 것들과 유사한 방법을 이용해 평가될 수 있다.

펩타이드-기재의 분해기

펩타이드-기재 연결기는 세포 내 펩티다제 및 프로테아제와 같은 효소에 의해 분해된다. 펩타이드-기재의 분해형 연결기는 아미노산들 사이에 형성되어 올리고펩타이드(예를 들어, 디펩타이드, 트리펩타이드 등) 및 폴리펩타이드를 제공하는 펩타이드 결합이다. 펩타이드-기재의 분해 기는 아미드기(-C(O)NH-)를 포함하지 않는다. 아미드기는 임의의 알킬렌, 알케닐렌 또는 알킨렌 간에 형성될 수 있다. 펩타이드 결합은 아미노산들 간에 형성되어 펩타이드 및 단백질을 제공하는 아미드 결합의 특수한 유형이다. 펩타이드-기재의 분해 기는 일반적으로, 아미노산들 간에 형성되어 펩타이드 및 단백질을 제공하는 펩타이드 결합(즉, 아미드 결합)으로 한정되며, 전체의 아미드 작용기를 포함하지 않는다. 펩타이드 분해형 연결기는 화학식 -NHCHR¹C(O)NHCHR²C(O)-를 가지며, 여기서, R¹ 및 R²는 2개의 인접한 아미노산의 R 기이다. 이들 후보물질은 전술한 것들과 유사한 방법을 이용해 평가될 수 있다.

생분해형 링커/테터

링커는 또한 분자의 두 부분, 예를 들어, 비스(siRNA)를 생성시키는 두 개의 개별 siRNA 분자 중 하나 또는 둘 모두의 가닥을 연결하는 뉴클레오타이드 및 비-뉴클레오타이드 링커 또는 이들의 조합인 생분해형 링커를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 두 개의 개별 siRNA 간의 단순한 정전 또는 적층 상호작용은 링커를 나타낼 수 있다. 비-뉴클레오타이드 링커는 지방족, 비사이클릭, 헤테로사이클릭, 및 이들의 조합인, 단당류, 이당류, 올리고당류, 및 이들의 유도체로부터 얻어진 테터 또는 링커를 포함한다.

일부 구현예에서, 링커(테터) 중 적어도 하나는 갈락토사민, 글루코사민, 글루코스, 갈락토스, 및 만노스, 및 이들의 조합의 DNA, RNA, 디설파이드, 아미드, 작용화 단당류 또는 올리고당류로 이루어진 군으로부터 선택된 생분해형 링커이다.

일 구현예에서, 생분해형 탄수화물 링커는, 두 개의 siRNA 단위를 연결할 수 있는 적어도 하나의 아노머 결합을 갖는, 1개 내지 10개 당류 단위를 가질 수 있다. 둘 이상의 당류가 존재하는 경우, 이들 단위는 1개 내지 3개, 1개 내지 4개, 또는 1개 내지 6개의 당 결합을 통해, 또는 알킬 사슬을 통해 연결될 수 있다.

예시적인 생분해형 링커는 하기를 포함한다:

생분해형 링커에 대한 더 많은 논의는 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 2018년 1월 18일에 출원된 "Endosomal Cleavable Linkers,"라는 명칭의 PCT 출원 No. PCT/US18/14213에서 찾아볼 수 있다.

담체

소정의 구현예에서, 친유성 단량체는 비-리보스 치환 단위, 즉, 하나 이상의 뉴클레오타이드(들)를 치환하는 담체를 통해 iRNA 제제에 접합된 친유성 모이어티를 포함한다.

담체는 사이클릭 기 또는 비사이클릭 기일 수 있다. 일 구현예에서, 사이클릭 기는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔란, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸릴, 및 데칼린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 비사이클릭 기는 세리놀 백본 또는 디에탄올아민 백본을 기반으로 한 모이어티이다.

담체는 이중-가닥 iRNA 제제의 하나 이상의 뉴클레오타이드(들)를 대체할 수 있다.

일부 구현예에서, 담체는 이중-가닥 iRNA 제제의 내부 위치(들)에서 하나 이상의 뉴클레오타이드(들)를 치환한다.

다른 구현예에서, 담체는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 말단에서 뉴클레오타이드를 치환한다. 일 구현예에서, 담체는 센스 가닥의 3' 말단 상의 말단 뉴클레오타이드를 치환하고, 이에 의해 센스 가닥의 3' 말단을 보호하는 말단 캡으로서 작용한다. 일 구현예에서, 담체는 아민을 갖는 사이클릭 기이고, 예를 들어, 담체는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸라닐, 또는 데칼리닐일 수 있다.

하위단위의 리보스 당이 이와 같이 치환되는 리보뉴클레오타이드 하위단위는 본원에서 리보스 치환 변형 하위단위(RRMS)로 지칭된다. 담체는 사이클릭 또는 비사이클릭 모이어티일 수 있고, 두 개의 "백본 부착점"(예를 들어, 하이드록실 기) 및 리간드(예를 들어, 친유성 모이어티)를 포함한다. 친유성 모이어티는 담체에 직접 부착되거나, 상술된 바와 같이 개입하는 링커/테터에 의해 담체에 간접적으로 부착될 수 있다.

리간드-접합 단량체 하위단위는 iRNA 분자의 5' 또는 3' 말단 하위단위일 수 있다. 즉, 두 개의 "W" 기 중 하나는 하이드록실 기일 수 있고, 다른 "W" 기는 둘 이상의 비변형 또는 변형 리보뉴클레오타이드의 사슬일 수 있다. 대안적으로, 리간드-접합 단량체 하위단위는 임의의 내부 위치를 점유할 수 있고, 둘 모두의 "W" 기는 하나 이상의 비변형 또는 변형 리보뉴클레오타이드일 수 있다. 하나보다 많은 리간드-접합 단량체 하위단위는 iRNA 제제에 존재할 수 있다.

당 치환-기재 단량체, 예를 들어, 리간드-접합 단량체(사이클릭)

사이클릭 당 치환-기재 단량체, 예를 들어, 당 치환-기재 리간드-접합 단량체는 또한 본원에서 RRMS 단량체 화합물로 지칭된다. 담체는 하기에서 제공되는 일반식(LCM-2)를 가질 수 있다(상기 구조에서, 바람직한 백본 부착점은 R¹ 또는 R²; R³ 또는 R⁴; 또는 Y가 CR⁹R¹⁰에 존재하는 경우 R⁹ 및 R¹⁰으로부터 선택될 수 있음(두 개의 위치는 두 개의 백본 부착점, 예를 들어, R¹과 R⁴, 또는 R⁴와 R⁹를 제공하도록 선택됨)). 바람직한 테터링 부착점은 R⁷; X가 CH₂인 경우 R⁵ 또는 R⁶을 포함한다. 담체는 가닥으로 도입될 수 있는 엔터티(entity)로서 후술된다. 따라서, 구조는 또한 부착점의 하나(말단 위치의 경우) 또는 두 개(내부 위치의 경우), 예를 들어, R¹ 또는 R²; R³ 또는 R⁴; 또는 R⁹ 또는 R¹⁰(Y가 CR⁹R¹⁰일 때)은 포스페이트, 또는 변형 포스페이트, 예를 들어, 황 함유 백본에 연결되는 상황을 포괄하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 상기 명명된 R 기들 중 하나는 -CH₂-일 수 있고, 여기서 하나의 결합이 담체에 연결되고, 하나가 백본 원자, 예를 들어, 연결 산소 또는 중앙 인 원자에 연결된다.

식에서,

X는 N(CO)R⁷, NR⁷ 또는 CH₂이고;

Y는 NR⁸, O, S, CR⁹R¹⁰이고;

Z는 CR¹¹R¹²이거나 부재이고;

각각의 R¹, R², R³, R⁴, R⁹, 및 R¹⁰은 독립적으로 H, OR^a, 또는 (CH₂)_nOR^b이고, 단, R¹, R², R³, R⁴, R⁹, 및 R¹⁰ 중 적어도 두 개는 OR^a 및/또는 (CH₂)_nOR^b이고;

각각의 R⁵, R⁶, R¹¹, 및 R¹²는 독립적으로 리간드, H, 1개 내지 3개의 R¹³로 선택적으로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 또는 C(O)NHR⁷이거나; R⁵와 R¹¹은 함께 R¹⁴로 선택적으로 치환된 C₃-C₈ 사이클로알킬이고;

R⁷은 리간드일 수 있고, 예를 들어, R⁷은 R^d일 수 있거나, R⁷은, 예를 들어, 테터링 모이어티를 통해 담체에 간접적으로 테터링된 리간드, 예를 들어, NR^cR^d로 치환된 C₁-C₂₀ 알킬; 또는 NHC(O)R^d로 치환된 C₁-C₂₀ 알킬일 수 있고;

R⁸은 H 또는 C₁-C₆ 알킬이고;

R¹³은 하이드록시, C₁-C₄ 알콕시, 또는 할로이고;

R¹⁴은 NR^cR⁷이고;

R¹⁵은 시아노로 선택적으로 치환된 C₁-C₆ 알킬, 또는 C₂-C₆ 알케닐이고;

R¹⁶은 C₁-C₁₀ 알킬이고;

R¹⁷은 액체 또는 고체 상 지지 시약이고;

L은 -C(O)(CH₂)_qC(O)-, 또는 -C(O)(CH₂)_qS-이고;

R^a는 보호 기, 예를 들어, CAr₃;(예를 들어, 디메톡시트리틸 기) 또는 Si(X^5')(X^5'')(X^5''')(여기서, (X^5'), (X^5''), 및 (X^5''')는 다른 곳에서 기재된 바와 같음)이고;

R^b는 P(O)(O^-)H, P(OR¹⁵)N(R¹⁶)₂ 또는 L-R¹⁷이고;

R^c는 H 또는 C₁-C₆ 알킬이고;

R^d는 H 또는 리간드이고;

각 Ar은, 독립적으로, C₁-C₄ 알콕시로 선택적으로 치환된 C₆-C₁₀ 아릴이고;

n은 1 내지 4이고; q는 0 내지 4이다.

예시적인 담체는, 예를 들어, X가 N(CO)R⁷ 또는 NR⁷이고, Y가 CR⁹R¹⁰이고, Z가 부재인 것; 또는 X가 N(CO)R⁷ 또는 NR⁷이고, Y가 CR⁹R¹⁰이고, Z가 CR¹¹R¹²인 것; 또는 X가 N(CO)R⁷ 또는 NR⁷이고, Y가 NR⁸이고, Z가 CR¹¹R¹²인 것; 또는 X가 N(CO)R⁷ 또는 NR⁷이고, Y가 O이고, Z가 CR¹¹R¹²인 것; 또는 X가 CH₂이고; Y가 CR⁹R¹⁰이고; Z가 CR¹¹R¹²이고, R⁵와 R¹¹이 함께 C₆ 사이클로알킬을 형성하는 것(H, z = 2), 예를 들어, X가 CH₂; Y가 CR⁹R¹⁰이고; Z가 CR¹¹R¹²이고, R⁵와 R¹¹이 함께 C₅ 사이클로알킬을 형성하는 인단 고리 시스템(H, z = 1)을 포함한다.

소정의 구현예에서, 담체는 피롤린 고리 시스템, 또는, 예를 들어, X가 N(CO)R⁷ 또는 NR⁷이고, Y가 CR⁹R¹⁰이고, Z가 부재인 4-하이드록시프롤린 고리 시스템(D)을 기반으로 할 수 있다

. OFG¹은 바람직하게는, 5-원 고리에서 탄소 중 하나에 연결되는, 일차 탄소, 예를 들어, 엑소사이클릭 알킬렌 기, 예를 들어, 메틸렌 기에 부착된다(D에서 -CH₂OFG¹). OFG²는 바람직하게는 5-원 고리에서 탄소 중 하나에 직접 부착된다(D에서 -OFG²). 피롤린-기재 담체의 경우, -CH₂OFG¹은 C-2에 부착될 수 있고, OFG²는 C-3에 부착될 수 있거나; -CH₂OFG¹은 C-3에 부착될 수 있고, OFG²는 C-4에 부착될 수 있다. 소정의 구현예에서, CH₂OFG¹ 및 OFG²는 상기 언급된 탄소 중 하나에 같은 자리로 치환될 수 있다. 3-하이드록시프롤린-기재 담체의 경우, -CH₂OFG¹은 C-2에 부착될 수 있고, OFG²는 C-4에 부착될 수 있다. 피롤린- 및 4-하이드록시프롤린-기재 단량체는 따라서 결합(예를 들어, 탄소-탄소 결합)을 함유할 수 있고, 여기서 결합 회전은 특정 결합에 대해서 제한되고, 예를 들어, 고리의 존재로부터 제한이 일어난다. 따라서, CH₂OFG¹ 및 OFG²는 상기 기재된 임의의 페어링에서 서로에 대해 시스 또는 트랜스일 수 있다. 이에 따라서, 모든 시스/트랜스 이성질체가 명백히 포함된다. 또한, 단량체는 하나 이상의 비대칭 중심을 함유할 수 있고, 따라서 라세미체 및 라세미 혼합물, 단일 거울상이성질체, 개별 부분입체이성질체 및 부분입체 이성질체 혼합물로서 발생한다. 단량체의 이러한 이성질체 형태 모두는 명시적으로 포함된다(예를 들어, CH₂OFG¹ 및 OFG²를 갖는 중심은 둘 모두 R 배치를 가질 수 있거나; 둘 모두 S 배치를 가질 수 있거나; 하나의 중심이 R 배치를 가질 수 있고, 다른 중심이 S 배치를 가질 수 있으며, 그 반대일 수 있음). 테터링 부착점은 바람직하게는 질소이다. 담체 D의 바람직한 예는 하기를 포함한다:

.

소정의 구현예에서, 담체는, 예를 들어, X가 N(CO)R⁷ 또는 NR⁷이고, Y가 CR⁹R¹⁰이고, Z가 CR¹¹R¹²인 피페리딘 고리 시스템(E)을 기반으로 할 수 있다

. OFG¹은 바람직하게는, 6-원 고리에서 탄소 중 하나에 연결되는, 일차 탄소, 예를 들어, 엑소사이클릭 알킬렌 기, 예를 들어, 메틸렌 기(n=1) 또는 에틸렌 기(n=2)에 부착된다[E에서 -(CH₂)_nOFG¹]. OFG²는 바람직하게는 6-원 고리에서 탄소 중 하나에 직접 부착된다(E에서 -OFG²). -(CH₂)_nOFG¹ 및 OFG²는 고리에 같은 자리로 배치될 수 있다. 즉, 둘 모두의 기가, 예를 들어, C-2, C-3, 또는 C-4에서 동일한 탄소에 부착될 수 있다. 대안적으로, -(CH₂)_nOFG¹ 및 OFG²는 고리에서 이웃 자리로 배치될 수 있다. 즉, 둘 모두의 기가 인접한 고리 탄소 원자에 부착될 수 있는데, 예를 들어, -(CH₂)_nOFG¹은 C-2에 부착될 수 있고, OFG²는 C-3에 부착될 수 있거나; -(CH₂)_nOFG¹은 C-3에 부착될 수 있고, OFG²는 C-2에 부착될 수 있거나; -(CH₂)_nOFG¹은 C-3에 부착될 수 있고, OFG²는 C-4에 부착될 수 있거나; -(CH₂)_nOFG¹은 C-4에 부착될 수 있고, OFG²는 C-3에 부착될 수 있다. 피페리딘-기재 단량체는 따라서 결합(예를 들어, 탄소-탄소 결합)을 함유할 수 있고, 여기서 결합 회전은 특정 결합에 대해서 제한되고, 예를 들어, 고리의 존재로부터 제한이 일어난다. 따라서, -(CH₂)_nOFG¹ 및 OFG²는 상기 기재된 임의의 페어링에서 서로에 대해 시스 또는 트랜스일 수 있다. 이에 따라, 모든 시스/트랜스 이성질체가 명시적으로 포함된다. 또한, 단량체는 하나 이상의 비대칭 중심을 함유할 수 있고, 따라서 라세미체 및 라세미 혼합물, 단일 거울상이성질체, 개별 부분입체이성질체 및 부분입체 이성질체 혼합물로서 발생한다. 단량체의 이러한 이성질체 형태 모두는 명시적으로 포함된다(예를 들어, CH₂OFG¹ 및 OFG²를 갖는 중심은 둘 모두 R 배치를 가질 수 있거나; 둘 모두 S 배치를 가질 수 있거나; 하나의 중심이 R 배치를 가질 수 있고, 다른 중심이 S 배치를 가질 수 있으며, 그 반대일 수 있음). 테터링 부착점은 바람직하게는 질소이다.

소정의 구현예에서, 담체는, 예를 들어, X가 N(CO)R⁷ 또는 NR⁷이고, Y가 NR⁸이고, Z가 CR¹¹R¹²인 피레라진 고리 시스템(F), 또는 X가 N(CO)R⁷ 또는NR⁷이고, Y가 O이고, Z가 CR¹¹R¹²인 모르폴린 고리 시스템(G)을 기반으로 할 수 있다

. OFG¹은 바람직하게는, 6-원 고리에서 탄소 중 하나에 연결되는, 일차 탄소, 예를 들어, 엑소사이클릭 알킬렌 기, 예를 들어, 메틸렌 기에 부착된다(F 또는 G에서 -CH₂OFG¹). OFG²는 바람직하게는 6-원 고리에서 탄소 중 하나에 직접 부착된다(F 또는 G에서 -OFG²). F와 G 둘 모두의 경우, -CH₂OFG¹은 C-2에 부착될 수 있고, OFG²는 C-3에 부착될 수 있거나; 이의 반대일 수 있다. 소정의 구현예에서, CH₂OFG¹ 및 OFG²는 상기 언급된 탄소 중 하나에 같은 자리로 치환될 수 있다. 피페라진- 및 모르폴린-기재 단량체는 따라서 결합(예를 들어, 탄소-탄소 결합)을 함유할 수 있고, 여기서 결합 회전은 특정 결합에 대해서 제한되고, 예를 들어, 고리의 존재로부터 제한이 일어난다. 따라서, CH₂OFG¹ 및 OFG²는 상기 기재된 임의의 페어링에서 서로에 대해 시스 또는 트랜스일 수 있다. 이에 따라, 모든 시스/트랜스 이성질체가 명시적으로 포함된다. 또한, 단량체는 하나 이상의 비대칭 중심을 함유할 수 있고, 따라서 라세미체 및 라세미 혼합물, 단일 거울상이성질체, 개별 부분입체이성질체 및 부분입체 이성질체 혼합물로서 발생한다. 단량체의 이러한 이성질체 형태 모두는 명시적으로 포함된다(예를 들어, CH₂OFG¹ 및 OFG²를 갖는 중심은 둘 모두 R 배치를 가질 수 있거나; 둘 모두 S 배치를 가질 수 있거나; 하나의 중심이 R 배치를 가질 수 있고, 다른 중심이 S 배치를 가질 수 있으며, 그 반대일 수 있음). R'''은, 예를 들어, C₁-C₆ 알킬, 바람직하게는 CH₃일 수 있다. 테터링 부착점은 바람직하게는 F와 G 둘 모두에서 질소이다.

소정의 구현예에서, 담체는, 예를 들어, X가 CH₂이고; Y가 CR⁹R¹⁰이고; Z가 CR¹¹R¹²이고, R⁵와 R¹¹이 함께 C₆ 사이클로알킬을 형성하는 데칼린 고리 시스템(H, z = 2), 또는, 예를 들어, X가 CH₂이고; Y가 CR⁹R¹⁰이고; Z가 CR¹¹R¹²이고, R⁵와 R¹¹이 함께 C₅ 사이클로알킬을 형성하는 인단 고리 시스템(H, z = 1)을 기반으로 할 수 있다.

. OFG¹는 바람직하게는, C-2, C-3, C-4, 또는 C-5 중 하나에 연결되는, 일차 탄소, 예를 들어, 엑소사이클릭 메틸렌 기(n=1) 또는 에틸렌 기(n=2)에 부착된다[H에서 -(CH₂)_nOFG¹]. OFG²는 바람직하게는 C-2, C-3, C-4, 또는 C-5 중 하나에 직접 부착된다(H에서 -OFG²). -(CH₂)_nOFG¹ 및 OFG²는 고리에 같은 자리로 배치될 수 있다. 즉, 둘 모두의 기가, 예를 들어, C-2, C-3, C-4, 또는 C-5에서 동일한 탄소에 부착될 수 있다. 대안적으로, -(CH₂)_nOFG¹ 및 OFG²는 고리에서 이웃 자리로 배치될 수 있다. 즉, 둘 모두의 기가 인접한 고리 탄소 원자에 부착될 수 있는데, 예를 들어, -(CH₂)_nOFG¹은 C-2에 부착될 수 있고, OFG²는 C-3에 부착될 수 있거나; -(CH₂)_nOFG¹은 C-3에 부착될 수 있고, OFG²는 C-2에 부착될 수 있거나; -(CH₂)_nOFG¹은 C-3에 부착될 수 있고, OFG²는 C-4에 부착될 수 있거나; -(CH₂)_nOFG¹은 C-4에 부착될 수 있고, OFG²는 C-3에 부착될 수 있거나; -(CH₂)_nOFG¹는 C-5에 부착될 수 있고, OFG²는 C-4에 부착될 수 있다. 데칼린 또는 인단-기재 단량체는 따라서 결합(예를 들어, 탄소-탄소 결합)을 함유할 수 있고, 여기서 결합 회전은 특정 결합에 대해서 제한되고, 예를 들어, 고리의 존재로부터 제한이 일어난다. 따라서, -(CH₂)_nOFG¹ 및 OFG²는 상기 기재된 임의의 페어링에서 서로에 대해 시스 또는 트랜스일 수 있다. 이에 따라, 모든 시스/트랜스 이성질체가 명시적으로 포함된다. 또한, 단량체는 하나 이상의 비대칭 중심을 함유할 수 있고, 따라서 라세미체 및 라세미 혼합물, 단일 거울상이성질체, 개별 부분입체이성질체 및 부분입체 이성질체 혼합물로서 발생한다. 단량체의 이러한 이성질체 형태 모두는 명시적으로 포함된다(예를 들어, CH₂OFG¹ 및 OFG²를 갖는 중심은 둘 모두 R 배치를 가질 수 있거나; 둘 모두 S 배치를 가질 수 있거나; 하나의 중심이 R 배치를 가질 수 있고, 다른 중심이 S 배치를 가질 수 있으며, 그 반대일 수 있음). 바람직한 구현예에서, C-1 및 C-6에서 치환기는 서로에 대해 트랜스이다. 테터링 부착점은 바람직하게는 C-6 또는 C-7이다.

다른 담체는 3-하이드록시프롤린(J)을 기반으로 한 것들을 포함할 수 있다

. 따라서, -(CH₂)_nOFG¹ 및 OFG²는 서로에 대해 시스 또는 트랜스일 수 있다. 이에 따라, 모든 시스/트랜스 이성질체가 명시적으로 포함된다. 또한, 단량체는 하나 이상의 비대칭 중심을 함유할 수 있고, 따라서 라세미체 및 라세미 혼합물, 단일 거울상이성질체, 개별 부분입체이성질체 및 부분입체 이성질체 혼합물로서 발생한다. 단량체의 이러한 이성질체 형태 모두는 명시적으로 포함된다(예를 들어, CH₂OFG¹ 및 OFG²를 갖는 중심은 둘 모두 R 배치를 가질 수 있거나; 둘 모두 S 배치를 가질 수 있거나; 하나의 중심이 R 배치를 가질 수 있고, 다른 중심이 S 배치를 가질 수 있으며, 그 반대일 수 있음). 테터링 부착점은 바람직하게는 질소이다.

더 많은 대표적인 사이클릭, 당 치환-기재 담체에 대한 세부 사항은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 No. 7,745,608 및 8,017,762에서 찾아볼 수 있다.

당 치환-기재 단량체(비사이클릭)

비사이클릭 당 치환-기재 단량체, 예를 들어, 당 치환-기재 리간드-접합 단량체는 또한 본원에서 리보스 치환 단량체 하위단위(RRMS) 단량체 화합물로 지칭된다. 바람직한 비사이클릭 담체는 화학식 LCM-3 또는 LCM-4를 가질 수 있다:

.

일부 구현예에서, 각각의 x, y, 및 z는 서로 독립적으로 0, 1, 2, 또는 3일 수 있다. 화학식 LCM-3에서, y와 z가 상이할 때, 삼차 탄소는 R 배치 또는 S 배치를 가질 수 있다. 바람직한 구현예에서, x는 0(제로)이고, y 및 z는 각각 화학식 LCM-3(예를 들어, 세리놀 기반)에서 1이고, y 및 z는 각각 화학식 LCM-3에서 1이다. 각각의 하기 화학식 LCM-3 또는 LCM-4는, 예를 들어, 하이드록시, 알콕시, 퍼할로알킬로 선택적으로 치환될 수 있다.

더 많은 대표적인 비사이클릭, 당 치환-기재 담체에 대한 세부 사항은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 No. 7,745,608 및 8,017,762에서 찾아볼 수 있다.

일부 구현예에서, 화합물은 센스 가닥의 5' 말단 또는 안티센스 가닥의 5' 말단에 접합된 친유성 모이어티를 함유하는 하나 이상의 친유성 단량체를 포함한다.

소정의 구현예에서, 친유성 단량체는 담체 및/또는 링커를 통해 가닥의 5'-말단에 접합된 친유성 모이어티를 함유한다. 일 구현예에서, 친유성 단량체는 하기 화학식의 담체를 통해 가닥의 5'-말단에 접합된 친유성 모이어티를 함유한다:

(여기서, R은 리간드, 예컨대, 친유성 모이어티임).

일부 구현예에서, 화합물은 센스 가닥의 3' 말단 또는 안티센스 가닥의 3' 말단에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 함유하는 하나 이상의 친유성 단량체를 포함한다.

소정의 구현예에서, 친유성 단량체는 담체 및/또는 링커를 통해 가닥의 3'-말단에 접합된 친유성 모이어티를 함유한다. 일 구현예에서, 친유성 단량체는 하기 화학식의 담체를 통해 가닥의 3'-말단에 접합된 친유성 모이어티를 함유한다:

(여기서, R은 리간드, 예컨대, 친유성 모이어티임).

소정의 구현예에서, 친유성 단량체는 담체 및/또는 링커를 통해 가닥의 내부 위치에 접합된 친유성 모이어티를 함유한다. 일 구현예에서, 친유성 단량체는 하기 화학식의 담체를 통해 가닥의 내부 위치에 접합된 친유성 모이어티를 함유한다:

(여기서, R은 리간드, 예컨대, 친유성 모이어티임).

일부 구현예에서, 화합물은 센스 가닥의 양 말단에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 함유하는 하나 이상의 친유성 단량체를 포함한다.

일부 구현예에서, 화합물은 안티센스 가닥의 양 말단에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 함유하는 하나 이상의 친유성 단량체를 포함한다.

일부 구현예에서, 화합물은 센스 또는 안티센스 가닥의 내부 위치에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 함유하는 하나 이상의 친유성 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 친유성 모이어티는 리보스, 뉴클레오베이스, 및/또는 뉴클레오타이드간 결합에 접합된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 친유성 모이어티는 리보스의 2' 위치, 3' 위치, 4' 위치, 및/또는 5' 위치에서 리보스에 접합된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 친유성 모이어티는 본원에 정의된 바와 같은 천연(예컨대, A, T, G, C, 또는 U) 또는 변형 뉴클레오베이스에 접합된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 친유성 모이어티는 본원에 정의된 바와 같은 포스페이트 또는 변형 포스페이트 기에 접합된다.

일부 구현예에서, 화합물은 센스 가닥의 5' 말단 또는 3' 말단에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 함유하는 하나 이상의 친유성 단량체, 및 안티센스 가닥의 5' 말단 또는 3' 말단에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 함유하는 하나 이상의 친유성 단량체를 포함한다.

일부 구현예에서, 친유성 단량체는 하나 이상의 링커(테터) 및/또는 담체를 통해 가닥의 종결 말단에 접합된 친유성 모이어티를 함유한다.

일 구현예에서, 친유성 단량체는 하나 이상의 링커(테터)를 통해 가닥의 종결 말단에 접합된 친유성 모이어티를 함유한다.

일 구현예에서, 친유성 단량체는, 선택적으로 하나 이상의 개재 링커(테터)를 통해, 사이클릭 담체를 통해 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 5' 말단에 접합된 친유성 모이어티를 함유한다.

일부 구현예에서, 적어도 하나의 친유성 단량체는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 하나 이상의 말단 위치에 위치한다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 친유성 단량체는 센스 가닥의 3' 말단 또는 5' 말단에 위치한다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 친유성 단량체는 안티센스 가닥의 3' 말단 또는 5' 말단에 위치한다.

일부 구현예에서, 친유성 모이어티를 함유하는 친유성 모노머는 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에 접합된다. 가닥의 내부 위치는, 가닥의 3' 말단 및 5' 말단으로부터의 말단 위치를 제외한(예를 들어, 두 개의 위치: 3' 말단으로부터 계수하여 1번 위치 및 5' 말단으로부터 계수하여 1번 위치 배제) 가닥의 임의의 위치의 뉴클레오타이드를 지칭한다.

일 구현예에서, 적어도 하나의 친유성 단량체는 가닥의 각 단부로부터 말단 두 개의 위치를 제외한(예를 들어, 네 개의 위치: 3' 말단으로부터 계수하여 1번 위치 및 2번 위치 및 5' 말단으로부터 계수하여 1번 위치 및 2번 위치 배제) 모든 위치를 포함하는 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에 위치한다. 일 구현예에서, 친유성 단량체는 가닥의 각 단부로부터 말단 세 개의 위치를 제외한(예를 들어, 여섯 개의 위치: 3' 말단으로부터 계수하여 1번 위치, 2번 위치 및 3번 위치 및 5' 말단으로부터 계수하여 1번 위치, 2번 위치 및 3번 위치 배제) 모든 위치를 포함하는 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에 위치한다.

일 구현예에서, 적어도 하나의 친유성 단량체는 듀플렉스 영역 내 모든 위치를 포함하지만 센스 가닥의 3' 말단에서 말단 뉴클레오타이드를 대체하는 오버행 영역 또는 담체 영역을 포함하지 않는, 듀플렉스 영역의 적어도 하나의 말단의 하나 이상의 위치에 위치한다.

일 구현예에서, 적어도 하나의 친유성 단량체는 듀플렉스 영역의 안티센스 가닥의 5'-말단에서 제1의 5개, 4개, 3개, 2개, 또는 처음 염기쌍 내 센스 가닥에 위치한다.

일 구현예에서, 적어도 하나의 친유성 단량체는 센스 가닥의 분해 부위 영역을 제외한 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에 위치하고, 예를 들어, 친유성 단량체는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 9번 내지 12번 위치에 위치하지 않고, 예를 들어, 친유성 단량체는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 9번 내지 11번 위치에 위치하지 않는다. 대안적으로, 내부 위치는 센스 가닥의 3'-말단으로부터 계수하여 11번 내지 13번 위치를 배제한다.

일 구현예에서, 적어도 하나의 단량체는 안티센스 가닥의 분해 부위 영역을 배제하는 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에 위치한다. 예를 들어, 내부 위치는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계수하여 12번 내지 14번 위치를 배제한다.

일 구현예에서, 적어도 하나의 친유성 단량체는, 3'-말단으로부터 계수하여 센스 가닥의 11번 내지 13번 위치, 및 5'-말단으로부터 계수하여 안티센스 가닥의 12번 내지 14번 위치를 배제하는, 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에 위치한다.

일 구현예에서, 하나 이상의 친유성 단량체는 다음 내부 위치 중 하나 이상에 위치한다: 각 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여, 센스 가닥의 4번 내지 8번 및 13번 내지 18번 위치, 및 안티센스 가닥의 6번 내지 10번 및 15번 내지 18번 위치.

일 구현예에서, 하나 이상의 친유성 단량체는 다음 내부 위치 중 하나 이상에 위치한다: 각 가닥의 5' 말단으로부터 계수하여, 센스 가닥의 5번, 6번, 7번, 15번, 및 17번 위치, 및 안티센스 가닥의 15번 및 17번 위치.

정의

구체적인 정의가 제공되지 않는 한, 본원에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학 및 약제 및 제약 화학과 연관하여 사용되는 명명법 및 이들의 절차 및 기술은 당업계에 잘 알려져 있고 당업계에서 일반적으로 사용되는 것들이다. 표준 기법이 화학적 합성, 및 화학적 분석에 사용될 수 있다. 특정의 그러한 기법 및 절차는, 예를 들어, 임의의 목적 상 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 문헌["Carbohydrate Modifications in Antisense Research" Edited by Sangvi and Cook, American Chemical Society, Washington D.C., 1994; "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa., 18th edition, 1990; 및 "Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications" Edited by Stanley T. Crooke, CRC Press, Boca Raton, Fla.; 및 Sambrook et al., "Molecular Cloning, A laboratory Manual," 2^ndEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989]에서 찾아볼 수 있다. 허용되는 경우, 본원의 개시 전반에 걸쳐 언급된 모든 특허, 출원, 공개 출원 및 기타 간행물 및 기타 데이터는 그 전체가 원용에 의해 포함된다.

본원에서 사용되는 용어 "타겟 핵산"은 발현 또는 활성이 siRNA 화합물에 의해 조절될 수 있는 임의의 핵산 분자를 지칭한다. 타겟 핵산은 타겟 단백질을 코딩하는 DNA로부터 번역되는 RNA(pre-mRNA 및 mRNA 또는 이들의 일부를 포함하나, 이로 한정되지 않음), 및 또한 그러한 RNA, 및 miRNA로부터 유래된 cDNA를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 예를 들어, 타겟 핵산은 발현이 특정 장애 또는 질환 상태와 관련이 있는 세포 유전자(또는 유전자로부터 번역된 mRNA)일 수 있다. 일부 구현예에서, 타겟 핵산은 감염원으로부터의 핵산 분자일 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "iRNA"는 RNA 전사물의 타겟화된 분해를 매개하는 제제를 지칭한다. 이러한 제제는 RNAi-유도 사일런싱 복합체(RNAi-induced silencing complex: RISC)로도 알려진 세포질 다중-단백질 복합체와 관련된다. RNA 간섭을 유도하는 데 효과적인 제제가 또한 본원에서 siRNA, RNAi 작용제 또는 iRNA 제제로 지칭된다. 따라서, 이러한 용어들은 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 iRNA는 마이크로RNA 및 전-마이크로RNA를 포함한다. 또한, 본원에서 사용되는 본 발명의 "화합물" 또는 "화합물들"은 또한 iRNA 제제를 지칭하며, iRNA 제제와 상호교환적으로 사용될 수 있다.

iRNA 제제는 타겟 유전자에 충분한 상동성의 영역을 포함하고, iRNA 제제, 또는 이의 단편이 타겟 유전자의 하향조절을 매개할 수 있도록 뉴클레오타이드의 측면에서 충분한 길이어야 한다. (설명의 용이성을 위해, 예를 들어, 용어 뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드는 때때로 본원에서 iRNA 제제의 하나 이상의 단량체 하위단위에 대한 언급에서 사용된다. 본원에서 용어 "리보뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드"의 사용은 변형 RNA 또는 뉴클레오타이드 서로게이트의 경우에 또한 하나 이상의 위치에서 변형 뉴클레오타이드, 또는 서로게이트 치환 모이어티를 지칭할 수 있다는 것이 이해될 것이다.) 따라서, iRNA 제제는 타겟 RNA에 적어도 부분적으로, 및 일부 구현예에서 완전히 상보적인 영역이거나 이를 포함한다. iRNA 제제와 타겟 사이가 완전 상보적일 필요는 없지만, 대응물이 iRNA 제제, 또는 이들의 분해 산물로 하여금, 예를 들어, 타겟 RNA, 예를 들어, mRNA의 RNAi 분해에 의해 서열 특이적 사일런싱을 유도할 수 있게 하기에 충분해야 한다. 안티센스에서는 타겟 가닥과의 상보성, 또는 상동성 정도가 가장 중요하다. 특히 안티센스 가닥에서 완전 상보성이 흔히 바람직하지만, 일부 구현예는 특히 안티센스 가닥에서, 하나 이상, 또는 예를 들어, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개, 또는 그 미만의 미스매치(타겟 RNA에 대해)를 포함할 수 있다. 센스 가닥은 안티센스 가닥과 충분히 상보적이어야만 분자의 모든 이중 가닥 특징을 유지한다.

iRNA 제제는 인터페론 반응을 촉발시키기에 충분히 긴 분자(이는 다이서에 의해 분해되고(Bernstein et al. 2001. Nature, 409:363-366) RISC(RNAi-유도 사일런싱 복합체)에 진입할 수 있음); 및 인터페론 반응을 촉발시키지 않게 충분히 짧은 분자(분자는 또한 다이서에 의해 분해되고/분해되거나 RISC에 진입할 수 있음), 예를 들어, RISC에 대한 진입이 가능한 크기의 분자, 예를 들어, 다이서-분해 산물과 유사한 분자를 포함한다. 인터페론 반응을 촉발시키지 않게 충분히 짧은 분자는 본원에서 siRNA 제제 또는 더 짧은 iRNA 제제로 칭해진다. 본원에서 사용되는 "siRNA 제제 또는 더 짧은 iRNA 제제"는 인간 세포에서 유해한 인터페론 반응을 유도하지 않기에 충분히 짧은, 60개, 50개, 40개, 또는 30개 미만의 뉴클레오타이드 쌍의 듀플렉스 영역을 갖는, iRNA 제제, 예를 들어, 이중 가닥 RNA 제제 또는 단일 가닥 제제를 지칭한다. siRNA 제제, 또는 이의 분해 산물은, 예를 들어, 타겟 RNA에 대해 RNAi를 유도함으로써 타겟 유전자를 하향 조절할 수 있고, 여기서 타겟은 내생성 또는 병원성 타겟 RNA를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 "단일 가닥 iRNA 제제"는 단일 분자로 구성되는 iRNA 제제이다. 이는 가닥내 페어링에 의해 형성된 듀플렉스 영역을 포함할 수 있는데, 예를 들어, 이는 헤어핀 또는 팬-핸들 구조일 수 있거나, 이를 포함할 수 있다. 단일 가닥 iRNA 제제는 타겟 분자에 대해 안티센스일 수 있다. 단일 가닥 iRNA 제제는 RISC에 진입하거나 타겟 mRNA의 RISC 매개 분해에 관여할 수 있도록 충분히 길 수 있다. 단일 가닥 iRNA 제제는 적어도 14개, 및 다른 구현예에서, 적어도 15개, 20개, 25개, 29개, 35개, 40개, 또는 50개 뉴클레오타이드 길이이다. 소정의 구현예에서, 이는 200개, 100개, 또는 60개 미만 뉴클레오타이드 길이이다.

루프는 iRNA 가닥의 한 섹션이 또 다른 가닥 또는 동일한 가닥의 또 다른 섹션과 염기쌍을 형성할 때 듀플렉스에서 대항하는 뉴클레오타이드와 짝을 이루지 않는 iRNA 가닥의 영역을 지칭한다.

헤어핀 iRNA 제제는 17개, 18개, 19개, 29개, 21개, 22개, 23개, 24개, 또는 25개 이상의 뉴클레오타이드 쌍의 듀플렉스 영역을 가질 것이다. 듀플렉스 영역은 200개, 100개, 또는 50개 이하의 길이일 수 있을 것이다. 소정의 구현예에서, 듀플렉스 영역에 대한 범위는 15개 내지 30개, 17개 내지 23개, 19개 내지 23개, 및 19개 내지 21개 뉴클레오타이드 쌍 길이이다. 헤어핀은 일부 구현예에서 3'에서, 및 소정의 구현예에서 헤어핀의 안티센스 측에서 단일 가닥 오버행 또는 말단의 쌍을 이루지 않은 영역을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 오버행은 2개 내지 3개 뉴클레오타이드 길이이다.

본원에서 사용되는 "이중 가닥(ds) iRNA 제제"는 사슬간 혼성화가 듀플렉스 구조의 영역을 형성할 수 있는 하나보다 많은, 및 일부 경우에 두 개의 가닥을 포함하는 iRNA 제제이다.

본원에서 사용되는 용어 "siRNA 활성" 및 "RNAi 활성"은 siRNA에 의한 유전자 사일런싱을 지칭한다.

본원에서 사용되는 RNA 간섭 분자에 의한 "유전자 사일런싱"은 타겟 유전자에 대한 세포에서 mRNA 수준의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 100% 이하, 및 miRNA 또는 RNA 간섭 분자의 존재 없이 세포에서 확인되는 mRNA 수준의 그 사이의 임의의 정수로의 감소를 지칭한다. 하나의 바람직한 구현예에서, mRNA 수준은 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99%, 100% 이하, 및 5% 내지 100% 사이의 임의의 정수로 감소된다.

본원에서 사용되는 용어 "유전자 발현을 조절하다"는 유전자의 발현, 또는 RNA 분자 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 하위단위를 코딩하는 등가의 RNA 분자의 수준이 조절제의 부재에서 관찰되는 발현, 수준, 또는 활성보다 크도록 또는 낮도록 상향 조절되거나 하향 조절된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 용어 "조절하다"는 "억제하다"를 의미할 수 있지만, 단어 "조절하다"의 사용은 이러한 정의로 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 유전자 발현 조절은 유전자의 발현, 또는 RNA 분자 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 하위단위를 코딩하는 등가의 RNA 분자의 수준이 siRNA, 예를 들어, RNAi 제제의 부재에서 관찰되는 것과 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배 이상 상이할 때 발생한다. % 및/또는 배수 차이는 대조 또는 비-대조에 비해서 계산될 수 있고, 예를 들어, 하기와 같다:

유전자 발현과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "억제하다", "하향 조절하다", 또는 "감소하다"는 유전자의 발현, 또는 RNA 분자 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 하위단위를 코딩하는 등가의 RNA 분자의 수준, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 하위단위의 활성이 조절제의 부재에서 관찰되는 것보다 적게 감소된다는 것을 의미한다. 유전자 발현은 유전자의 발현, 또는 RNA 분자 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 하위단위를 코딩하는 등가의 RNA 분자의 수준, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 하위단위의 활성이 상응하는 비조절된 대조에 비해 적어도 10% 더 낮게, 및 바람직하게는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 가장 바람직하게는 100%(즉, 유전자 발현 없음) 감소될 때 하향조절된 것이다.

유전자 발현과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "증가시키다" 또는 "상향 조절하다"는 유전자의 발현, 또는 RNA 분자 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 하위단위를 코딩하는 등가의 RNA 분자의 수준, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 하위단위의 활성이 조절제의 부재에서 관찰되는 것보다 높게 증가된다는 것을 의미한다. 유전자 발현은 유전자의 발현, 또는 RNA 분자 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 하위단위를 코딩하는 등가의 RNA 분자의 수준, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 하위단위의 활성이 상응하는 비조절된 대조에 비해 적어도 10%, 및 바람직하게는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 100%, 1.1-배, 1.25-배, 1.5-배, 1.75-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배, 50-배, 100-배 이상 증가될 때 상향 조절된 것이다.

본원에서 사용되는 용어 "증가된" 또는 "증가하다"는 일반적으로 통계적으로 유의한 양으로의 증가를 의미하고; 어떠한 의심도 피하기 위해, "증가된"은 참조 수준에 비해 적어도 10% 증가, 예를 들어, 참조 수준에 비해 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 또는 100% 이하 증가 또는 10% 내지 100% 사이의 임의의 증가, 또는 참조 수준에 비해 적어도 약 2-배, 또는 적어도 약 3-배, 또는 적어도 약 4-배, 또는 적어도 약 5-배 또는 적어도 약 10-배, 또는 2-배 내지 10-배 이상 사이의 임의의 증가를 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "감소된" 또는 "감소하다"는 일반적으로 통계적으로 유의한 양으로의 감소를 의미한다. 그러나, 의심을 피하기 위해, "감소된"은 참조 수준에 비해 적어도 10% 감소, 예를 들어, 참조 수준에 비해 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%의 감소 또는 100% 이하 감소(즉, 참조 샘플에 비해 부재 수준), 또는 10% 내지 100% 사이의 임의의 감소를 의미한다.

이중-가닥 iRNA는 듀플렉스 구조를 형성하도록 혼성화되기에 충분히 상보적인 두 개의 올리고뉴클레오타이드 가닥을 포함한다. 일반적으로, 듀플렉스 구조는 15개 내지 30개, 더욱 일반적으로 18개 내지 25개, 더욱 더 일반적으로 19개 내지 24개, 및 가장 일반적으로 19개 내지 21개 염기쌍 길이이다. 일부 구현예에서, 25개 내지 30개 염기쌍 길이의 더 긴 이중-가닥 iRNA가 바람직하다. 일부 구현예에서, 10개 내지 15개 염기쌍 길이의 더 짧은 이중-가닥 iRNA가 바람직하다. 또 다른 구현예에서, 이중-가닥 iRNA는 적어도 21개 뉴클레오타이드 길이이다.

일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 안티센스 RNA 가닥은 타겟 서열의 적어도 일부와 상보적인 상보성 영역을 갖고, 듀플렉스 영역은 14개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이이다. 유사하게, 타겟 서열과 상보적인 영역은 14개 내지 30개, 더욱 일반적으로 18개 내지 25개, 더욱 더 일반적으로 19개 내지 24개, 및 가장 일반적으로 19개 내지 21개 뉴클레오타이드 길이이다.

본원에서 사용되는 용어 "화합물"은 올리고뉴클레오타이드, 안티센스, 또는 iRNA 제제, 예컨대, siRNA일 수 있는 올리고머 화합물을 지칭한다.

본원에서 사용되는 문구 "안티센스 가닥"은 관심 대상의 타겟 서열에 실질적으로 또는 100% 상보적인 올리고머 화합물을 지칭한다. 문구 "안티센스 가닥"은 헤어핀 또는 덤벨 타입 구조를 형성할 수 있는 단분자성 올리고머 화합물뿐만 아니라, 두 개의 별개의 가닥으로부터 형성된 올리고머 화합물 둘 모두의 안티센스 영역을 포함한다. 용어 "안티센스 가닥" 및 "가이드 가닥"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

문구 "센스 가닥"은 타겟 서열, 예컨대, 메신저 RNA 또는 DNA의 서열과 전부 또는 일부 동일한 뉴클레오사이드 서열을 갖는 올리고머 화합물을 지칭한다. 용어 "센스 가닥"과 "패신저 가닥"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

본원에서, "특이적으로 혼성화할 수 있는" 및 "상보적인"은 핵산이 전형적인 왓슨-크릭 또는 다른 비-전형적인 타입에 의해 또 다른 핵산 서열로 수소 결합(들)을 형성할 수 있다는 것을 의미한다. 본 발명의 핵 분자에 관하여, 이의 상보적 서열을 갖는 핵산 분자에 대한 결합 자유 에너지는 핵산의 관련 기능, 예를 들어, RNAi 활성을 진행시킬 수 있기에 충분하다. 핵산 분자에 대한 결합 자유 에너지의 측정은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Turner et al, 1987, CSH Symp. Quant. Biol. LII pp.123-133; Frier et al., 1986, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373-9377; Turner et al., 1987, /. Am. Chem. Soc. 109:3783-3785] 참조). 상보성 퍼센트는 제2 핵산 서열과 수소 결합(예를 들어, 왓슨-크릭 염기 페이링)을 형성할 수 있는 핵산 분자에서 인접 잔기의 백분율을 지시한다(예를 들어, 10개 중 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개가 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 및 100% 상보성임). "완전 상보성" 또는 100% 상보성은 핵산 서열의 인접 잔기 모두가 제2 핵산 서열에서 동일한 수의 인접 잔기와 수소 결합할 것임을 의미한다. 완전 상보성보다 적은은 두 가닥의 뉴클레오사이드 단위 전부는 아니지만 일부가 서로 수소 결합할 수 있는 상황을 지칭한다. "실질적으로 상보적인"은 비상보적이 되도록 선택되는 오버행과 같은 폴리뉴클레오타이드 가닥의 영역을 배제하고 90% 이상 상보성을 나타내는 폴리뉴클레오타이드 가닥을 지칭한다. 특이적 결합은 특이적 결합이 요망되는 조건 하에, 즉, 생체내 검정 또는 치료적 처지의 경우에 생리학적 조건 하에, 또는 시험관내 검정의 경우에 검정이 수행되는 조건 하에 비-타겟 서열에 대한 올리고머 화합물의 비-특이적 결합을 방지하도록 충분한 정도의 상보성을 필요로 한다. 비-타겟 서열은 전형적으로 뉴클레오타이드와 적어도 5개 상이하다.

일부 구현예에서, 화합물의 이중-가닥 영역은 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개 이상 뉴클레오타이드 쌍 길이이거나 그 초과이다.

일부 구현예에서, 화합물의 안티센스 가닥은 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개 뉴클레오타이드 길이이거나 그 초과이다.

일부 구현예에서, 화합물의 센스 가닥은 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개 뉴클레오타이드 길이이거나 그 초과이다.

일 구현예에서, 화합물의 센스 및 안티센스 가닥은 각각 15개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이이다.

일부 구현예에서, 하나의 가닥은 이중 가닥 영역에서 1개 내지 5개의 단일-가닥 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 스트레치를 갖는다. "이중-가닥 영역에서 단일-가닥 뉴클레오타이드의 스트레치"는 단일-가닥 스트레치의 양 말단에 적어도 하나의 뉴클레오타이드 염기쌍이 존재한다는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 둘 모두의 가닥은 이중 가닥 영역에서 1개 내지 5개(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개)의 단일-가닥 뉴클레오타이드의 적어도 하나의 스트레치를 갖는다. 두 가닥 모두가 이중 가닥 영역에서 1개 내지 5개(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개)의 단일-가닥 뉴클레오타이드의 스트레치를 갖는 경우, 그러한 단일-가닥 뉴클레오타이드는 서로 대립될 수 있거나(예를 들어, 미스매치 스트레치), 이들은 제2 가닥이 제1 가닥의 단일-가닥 iRNA에 대립되는 단일-가닥 뉴클레오타이드를 갖지 않도록 위치될 수 있고, 이의 반대일 수 있다(예를 들어, 단일-가닥 루프). 일부 구현예에서, 단일-가닥 뉴클레오타이드는 양 말단으로부터 8개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 두 가닥 사이의 상보적 영역의 5' 또는 3' 말단으로부터 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 또는 2개의 뉴클레오타이드 내에 존재한다.

일 구현예에서, 화합물은 말단 중 적어도 하나에 단일-가닥 오버행을 포함한다. 일 구현예에서, 단일-가닥 오버행은 1개, 2개, 또는 3개 뉴클레오타이드 길이이다.

일 구현예에서, iRNA 제제의 센스 가닥은 21개-뉴클레오타이드 길이이고, 안티센스 가닥은 23개-뉴클레오타이드 길이이고, 여기서 가닥은 3'-말단에 2개-뉴클레오타이드 길이의 단일 가닥 오버행을 갖는 21개의 연속 염기쌍의 이중-가닥 영역을 형성한다.

일부 구현예에서, 이중-가닥 iRNA의 각 가닥은, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 PCT 공보 No. 2004080406에 기재된 바와 같이, ZXY 구조를 갖는다.

소정의 구현예에서, 이중-가닥 올리고머 화합물의 두 가닥은 서로 연결될 수 있다. 두 가닥은 양 말단에, 또는 단지 하나의 말단에 서로 연결될 수 있다. 하나의 말단에 연결하는 것은 제1 가닥의 5'-말단이 제2 가닥의 3'-말단에 연결되거나 제1 가닥의 3'-말단이 제2 가닥의 5'-말단에 연결된다는 것을 의미한다. 두 가닥이 양 말단에서 서로 연결되는 경우, 제1 가닥의 5'-말단은 제2 가닥의 3'-말단에 연결되고, 제1 가닥의 3'-말단은 제2 가닥의 5'-말단에 연결된다. 두 가닥은 (N)_n을 포함하나, 이로 한정되지 않는 올리고뉴클레오타이드 링커에 의해 함께 연결될 수 있으며, 여기서 N은 독립적으로 변형 또는 비변형 뉴클레오타이드이고, n은 3 내지 23이다. 일부 구현예에서, n은 3 내지 10, 예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10이다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드 링커는 GNRA, (G)₄, (U)₄, 및 (dT)₄로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 N은 변형 또는 비변형 뉴클레오타이드이고, R은 변형 또는 비변형 퓨린 뉴클레오타이드이다. 링커의 뉴클레오타이드 중 일부는 링커의 다른 뉴클레오타이드와 염기-쌍 상호작용에 관여할 수 있다. 두 가닥은 또한 비-뉴클레오사이드 링커, 예를 들어, 본원에 기재된 링커에 의해 함께 연결될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 올리고뉴클레오타이드 화학적 변형 또는 변화가 올리고뉴클레오타이드 링커에서 사용될 수 있다는 것이 당업자에게 인지될 것이다.

헤어핀 및 덤벨 타입 올리고머 화합물은 14개, 15개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 29개, 21개, 22개, 23개, 24개, 또는 25개 이상의 뉴클레오타이드 쌍의 듀플렉스 영역을 가질 것이다. 듀플렉스 영역은 200개, 100개, 또는 50개 이하 길이일 수 있다. 일부 구현예에서, 듀플렉스 영역에 대한 범위는 15개 내지 30개, 17개 내지 23개, 19개 내지 23개, 및 19개 내지 21개 뉴클레오타이드 쌍 길이이다.

헤어핀 올리고머 화합물은 일부 구현예에서 3'에서, 및 일부 구현예에서 헤어핀의 안티센스에서 단일 가닥 오버행 또는 말단의 쌍을 이루지 않은 영역을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 오버행은 1개 내지 4개, 더욱 일반적으로 2개 내지 3개 뉴클레오타이드 길이이다. RNA 간섭을 포함할 수 있는 헤어핀 올리고머 화합물은 또한 본원에서 "shRNA"로 지칭된다.

소정의 구현예에서, 두 개의 올리고머 가닥은 특이적 결합이 요망되는 조건 하에, 즉, 생체내 검정 또는 치료적 처지의 경우에 생리학적 조건 하에, 및 시험관내 검정의 경우에 검정이 수행되는 조건 하에 비-타겟 핵산 서열에 대한 안티센스 화합물의 비-특이적 결합을 방지하도록 충분한 정도의 상보성이 존재할 때 특이적으로 혼성화된다.

본원에서 사용되는 "엄격한 혼성화 조건" 또는 "엄격한 조건"은 안티센스 화합물이 이의 타겟 서열에 혼성화되지만 다른 서열에는 최소수로만 혼성화될 조건을 지칭한다. 염격한 조건은 서열-의존적이고, 상이한 환경에서 상이할 것이며, 안티센스 화합물이 타겟 서열에 혼성화되는 "엄격한 조건"은 안티센트 화합물의 성질 및 조성 및 이들을 연구할 검정에 의해 결정된다.

뉴클레오타이드 친화성 변형의 도입은 비변형 화합물에 비해 더 많은 수의 미스매치를 허용할 수 있는 것으로 당업계에서 이해된다. 유사하게, 특정 올리고뉴클레오타이드 서열은 다른 올리고뉴클레오타이드 서열보다 미스매치를 더 허용할 수 있다. 당업자는, 예컨대, 용융 온도(Tm)를 결정함으로써 올리고뉴클레오타이들 간, 또는 올리고뉴클레오타이드와 타겟 핵산 간의 적절한 수의 미스매치를 결정할 수 있다. Tm 또는 △Tm은 당업자에게 익숙한 기술에 의해 계산될 수 있다. 예를 들어, Freier 등의 문헌[Nucleic Acids Research, 1997, 25, 22: 4429-4443]에 기재된 기술에 의해 당업자가 뉴클레오타이드 변형을, RNA:DNA 듀플렉스의 용융 온도를 증가시키는 이들의 능력에 대하여 평가하는 것이 가능하다.

siRNA 설계

일 구현예에서, iRNA 제제는 길이가 19 nt인 이중 말단 블런트머(double ended bluntmer)로서, 센스 가닥은 5' 말단으로부터 7번, 8번, 9번 위치에서 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 3 개의 2'-F 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유한다. 안티센스 가닥은 5'말단으로부터 11번, 12번, 13번 위치에서 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 세 개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유한다.

일 구현예에서, iRNA 제제는 길이가 20 nt인 이중 말단 블런트머로서, 센스 가닥은 5' 말단으로부터 8번, 9번, 10번 위치에서 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 3 개의 2'-F 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유한다. 안티센스 가닥은 5'말단으로부터 11번, 12번, 13번 위치에서 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 세 개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유한다.

일 구현예에서, iRNA 제제는 길이가 21 nt인 이중 말단 블런트머로서, 센스 가닥은 5' 말단으로부터 9번, 10번, 11번 위치에서 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 3 개의 2'-F 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유한다. 안티센스 가닥은 5'말단으로부터 11번, 12번, 13번 위치에서 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 세 개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유한다.

일 구현예에서, iRNA 제제는 21개 뉴클레오타이드(nt) 센스 가닥 및 23개 뉴클레오타이드(nt) 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서, 센스 가닥은 5' 말단으로부터 9번, 10번, 11번 위치에서 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 3 개의 2'-F 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유하고; 안티센스 가닥은 5'말단으로부터 11번, 12번, 13번 위치에서 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 세 개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유하고, iRNA의 한 말단은 블런트인 반면, 다른 말단은 2 nt 오버행을 포함한다. 바람직하게는, 2 nt 오버행은 안티센스의 3'-말단에 있다. 선택적으로, iRNA 제제는 리간드(예를 들어, GalNAc₃)를 추가로 포함한다.

일 구현예에서, iRNA 제제는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하며, 여기서, 센스 가닥은 25개 내지 30개 뉴클레오타이드 잔기 길이이고, 5' 말단 뉴클레오타이드(1번 위치)로부터 시작해서, 상기 제1 가닥의 1번 내지 23번 위치는 8개 이상의 리보뉴클레오타이드를 포함하고; 안티센스 가닥은 36개 내지 66개 뉴클레오타이드 잔기 길이이며, 3' 말단 뉴클레오타이드로부터 시작해서, 센스 가닥의 1번 내지 23번 위치와 쌍을 이룬 위치에서 8개 이상의 리보뉴클레오타이드를 포함하여 듀플렉스를 형성하고; 안티센스 가닥의 적어도 3' 말단 뉴클레오타이드는 센스 가닥과 쌍을 이루지 않고, 최대 6개의 연속 3' 말단 뉴클레오타이드는 센스 가닥과 쌍을 이루지 않음으로써 1개 내지 6개 뉴클레오타이드의 3' 단일-가닥 오버행을 형성하고; 안티센스 가닥의 5' 말단은 센스 가닥과 쌍을 이루지 않는 10개 내지 30개의 연속 뉴클레오타이드를 포함함으로써 10개 내지 30개 뉴클레오타이드의 단일-가닥 5' 오버행을 형성하고; 센스 및 안티센스 가닥이 최적 상보성을 위해 정렬된 경우 적어도 센스 가닥의 5' 말단 및 3' 말단 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드와 염기쌍을 이룸으로써 센스 및 안티센스 가닥 간에 실질적으로 듀플렉스화된 영역을 형성하고; 안티센스 가닥은 안티센스 가닥 길이의 19개 이상의 리보뉴클레오타이드를 따라 타겟 RNA와 충분히 상보적이어서 상기 이중-가닥 핵산이 포유류 세포 내로 도입되는 경우 타겟 유전자 발현을 감소시키고; 센스 가닥은 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 세 개의 2'-F 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유하고, 모티프 중 적어도 하나는 분해 부위에서 또는 그 근처에서 발생한다. 안티센스 가닥은 분해 부위에서 또는 그 근처에서 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 세 개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유한다.

일 구현예에서, iRNA 제제는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하며, 상기 dsRNA 제제는 25개 이상 29개 이하의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 제1 가닥 및 5' 말단으로부터 11번, 12번, 13번 위치에 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 세 개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 갖는 30개 이하의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 제2 가닥을 포함하고; 상기 제1 가닥의 상기 3' 말단 및 상기 제2 가닥의 상기 5' 말단은 블런트 말단을 형성하고, 상기 제2 가닥은 제1 가닥보다 그 3' 말단이 1개 내지 4개 뉴클레오타이드가 더 길고, 25개 이상의 뉴클레오타이드 길이인 듀플렉스 영역에서, 상기 제2 가닥은 상기 제2 가닥 길이의 19개 이상의 nt를 따라 타겟 mRNA와 충분히 상보적이어서 상기 iRNA 제제가 포유류 세포 내로 도입되는 경우 타겟 유전자 발현을 감소시키며, 상기 iRNA의 다이서 분해는 우선적으로 상기 제2 가닥의 상기 3' 말단을 포함하는 siRNA를 생성함으로써 포유류에서 타겟 유전자의 발현을 감소시킨다. 선택적으로, iRNA 제제는 리간드(예를 들어, GalNAc₃)를 추가로 포함한다.

일 구현예에서, iRNA 제제의 센스 가닥은 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 세 개의 동일한 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유하고, 여기서 모티프 중 하나는 센스 가닥에서 분해 부위에서 발생한다. 예를 들어, 센스 가닥은 5'말단으로부터 7개 내지 15개 위치 내에서 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 세 개의 2'-F 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유할 수 있다.

일 구현예에서, iRNA 제제의 안티센스 가닥은 또한 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 세 개의 동일한 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유할 수 있고, 여기서 모티프 중 하나는 안티센스 가닥에서 분해 부위에서 또는 그 근처에서 발생한다. 예를 들어, 안티센스 가닥은 5'말단으로부터 9개 내지 15개 위치 내에서 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 세 개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유할 수 있다.

길이가 17 nt 내지 23 nt인 듀플렉스 영역을 갖는 iRNA 제제의 경우, 안티센스 가닥의 분해 부위는 전형적으로 5'-말단에서 10개, 11개 및 12개 위치 주위에 있다. 따라서, 세 개의 동일한 변형의 모티프는 안티센스 가닥의 9개, 10개, 11개 위치; 10개, 11개, 12개의 위치; 11개, 12개, 13개 위치; 12개, 13개, 14개 위치; 또는 13개, 14개, 15개 위치에서 발생할 수 있고, 계수는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 제1 뉴클레오타이드로부터 시작하거나, 계수는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내에 제1 쌍을 이룬 뉴클레오타이드로부터 시작한다. 안티센스 가닥에서 분해 부위는 또한 5'-말단으로부터 iRNA의 듀플렉스 영역의 길이에 따라 변할 수 있다.

일부 구현예에서, iRNA 제제는 14개 내지 30개의 뉴클레오타이드를 각각 갖는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오타이드에 3개의 동일한 변형의 적어도 2개의 모티프를 함유하고, 모티프 중 적어도 하나는 가닥 내에서 분해 부위에서 또는 그 근처에서 발생하고, 모티프 중 적어도 하나는 적어도 하나의 뉴클레오타이드에 의해 분해 부위에서 모티프와 분리되는 가닥의 또 다른 부분에서 발생한다. 일 구현예에서, 안티센스 가닥은 또한 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 세 개의 동일한 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유하고, 여기서 모티프 중 하나는 가닥 내 분해 부위에서 또는 그 근처에서 발생한다. 센스 가닥 내 분해 부위에서 또는 그 근처에서 발생하는 모티프의 변형은 안티센스 가닥 내 분해 부위에서 또는 그 근처에서 발생하는 모티프의 변형과 상이하다.

일부 구현예에서, iRNA 제제는 14개 내지 30개의 뉴클레오타이드를 각각 갖는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오타이드에 3개의 2'-F 변형의 적어도 1개의 모티프를 함유하고, 모티프 중 적어도 하나는 가닥 내에서 분해 부위에서 또는 그 근처에서 발생한다. 일 구현예에서, 안티센스 가닥은 또한 분해 부위에서 또는 그 근처에서 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 세 개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유한다.

일부 구현예에서, iRNA 제제는 14개 내지 30개의 뉴클레오타이드를 각각 갖는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 5'말단으로부터 9번, 10번, 11번 위치에서 3개의 연속 뉴클레오타이드에 3개의 2'-F 변형의 적어도 1개의 모티프를 함유하고, 안티센스 가닥은 5'말단으로부터 11번, 12번, 13번 위치에서 세 개의 연속 뉴클레오타이드에 3개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 함유한다.

일 구현예에서, iRNA 제제는 듀플렉스 내에서 타겟과 미스매치(들), 또는 이들의 조합을 포함한다. 미스매치는 오버행 영역 또는 듀플렉스 영역에서 발생할 수 있다. 염기쌍은 해리 또는 용융을 촉진하는 이들의 특성을 토대로 순위가 매겨질 수 있다(예를 들어, 특정 페어링의 결합 또는 해리의 자유 에너지에서, 가장 간단한 방법은 개별 쌍 기준으로 쌍을 시험하지만, 옆의 인접한 또는 유사한 분석이 또한 사용될 수 있음). 해리의 촉진 면에서, A:U는 G:C보다 바람직하며; G:U는 G:C보다 바람직하고; I:C는 G:C보다 바람직하다(I=이노신). 미스매치, 예를 들어, 비-원형(canonical) 또는 원형 페어링 이외의 페어링(본원의 다른 곳에 기재된 바와 같음)은 원형(A:T, A:U, G:C) 페어링보다 바람직하며; 보편적인 염기를 포함하는 페어링이 원형 페어링보다 바람직하다.

일 구현예에서, iRNA 제제는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내에 제1의 염기쌍 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 중 하나 이상을 포함하며, 듀플렉스의 5' 말단에서 안티센스 가닥의 해리를 촉진하기 위해, 독립적으로 A:U, G:U, I:C, 및 미스매칭된 쌍, 예를 들어, 비-원형 또는 원형 페어링 이외의 페어링 또는 보편적인 염기를 포함하는 페어링의 군으로부터 선택될 수 있다.

일 구현예에서, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 1번 위치의 뉴클레오타이드는 A, dA, dU, U, 및 dT로 이루어진 군으로부터 선택된다. 대안적으로, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 제1의 염기쌍 1개, 2개 또는 3개 중 적어도 하나는 AU 염기쌍이다. 예를 들어, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 제1 염기쌍은 AU 염기쌍이다.

일 구현예에서, dsRNA 제제의 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35% 또는 30%는 변형된다. 예를 들어, dsRNA 제제의 50%가 변형될 때, dsRNA 제제에 존재하는 모든 뉴클레오타이드의 50%는 본원에 기재된 바와 같은 변형을 함유한다.

일 구현예에서, 센스 및 안티센스 가닥은 각각 독립적으로 비사이클릭 뉴클레오타이드, LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-데옥시, 2'-플루오로, 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA), 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸(2'-O-DMAEOE), 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 또는 2'-아라-F로 변형된다.

일 구현예에서, dsRNA 제제의 센스 및 안티센스 가닥은 각각 2개 이상의 상이한 변형을 함유한다.

일 구현예에서, dsRNA 제제는 임의의 2'-F 변형을 함유하지 않는다.

일 구현예에서, dsRNA 제제의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합의 하나 이상의 블록을 포함한다. 일 예에서, 센스 가닥은 2개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합의 1개의 블록을 포함한다. 일 예에서, 안티센스 가닥은 2개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합의 2개의 블록을 포함한다. 예를 들어, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 2개의 블록은 16개 내지 18개 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합에 의해 분리된다.

일 구현예에서, dsRNA 제제의 센스 및 안티센스 가닥은 각각 15개 내지 30개 뉴클레오타이드를 갖는다. 일 예에서, 센스 가닥은 19개 내지 22개 뉴클레오타이드를 가지며, 안티센스 가닥은 19개 내지 25개 뉴클레오타이드를 갖는다. 또 다른 예에서, 센스 가닥은 21개 뉴클레오타이드를 가지며, 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오타이드를 갖는다.

일 구현예에서, 듀플렉스에서 안티센스 가닥의 5' 말단의 1번 위치의 뉴클레오타이드는 A, dA, dU, U, 및 dT로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 제1, 제2, 및 제3 염기쌍 중 하나 이상은 AU 염기쌍이다.

일 구현예에서, dsRNA 제제의 안티센스 가닥은 이에 혼성화하는 타겟 RNA와 100% 상보적이며 RNA 간섭을 통해 그 발현을 억제한다. 또 다른 구현예에서, dsRNA 제제의 안티센스 가닥은 타겟 RNA와 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 65% 이상, 60% 이상, 55% 이상, 또는 50% 이상 상보적이다.

일 양태에서, 본 발명은 타겟 유전자의 발현을 억제할 수 있는 본원에 정의된 dsRNA 제제에 관한 것이다. dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하며, 각각의 가닥은 14개 내지 40개 뉴클레오타이드를 갖는다. 센스 가닥은 하나 이상의 열적 탈안정화 뉴클레오타이드를 함유하며, 하나 이상의 상기 열적 탈안정화 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 씨드 영역(즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 2번 내지 8번 위치에)과 반대 부위에 또는 그 근처에서 발생한다.

열적 탈안정화 뉴클레오타이드는, 예를 들어 센스 가닥이 21개 뉴클레오타이드 길이인 경우, 센스 가닥의 5'-말단의 14번 내지 17번 위치에서 발생할 수 있다. 안티센스 가닥은 입체적으로 까다로운 2'-OMe 변형보다 작은 2개 이상의 변형 핵산을 함유한다. 바람직하게는 입체적으로 까다로운 2'-OMe보다 작은 2개의 변형 핵산은 11개 뉴클레오타이드 길이에 의해 분리된다. 예를 들어, 2개의 변형 핵산은 안티센스 가닥의 5' 말단의 2번 및 14번 위치에 있다.

일 구현예에서, dsRNA 제제는

(a) 센스 가닥으로서,

(i) 18개 내지 23개 뉴클레오타이드 길이;

(ii) 7번 내지 15번 위치에서 3개의 연속적인 2'-F 변형

을 갖는 센스 가닥, 및

(b) 안티센스 가닥으로서,

(i) 18개 내지 23개 뉴클레오타이드 길이;

(ii) 가닥의 임의의 위치에서 적어도 2'-F 변형; 및

(iii) (5' 말단으로부터 계수하여) 제1의 5개의 뉴클레오타이드에서 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합

을 갖는 안티센스 가닥을 포함하며, dsRNA 제제는 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 위치에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 함유하는 하나 이상의 친유성 단량체를 갖고; 안티센스 가닥의 3'-말단에 두 개의 뉴클레오타이드 오버행, 및 안티센스 가닥의 5'-말단에서 블런트 말단; 또는 듀플렉스의 블런트 말단의 양 말단을 갖는다.

일 구현예에서, dsRNA 제제는

(a) 센스 가닥으로서,

(i) 18개 내지 23개 뉴클레오타이드 길이;

(ii) 4개 미만의 2'-F 변형

을 갖는 센스 가닥,

(b) 안티센스 가닥으로서,

(i) 18개 내지 23개 뉴클레오타이드 길이;

(ii) 12개 미만의 2'-F 변형; 및

일 구현예에서, dsRNA 제제는

(a) 센스 가닥으로서,

(i) 19개 내지 35개 뉴클레오타이드 길이;

(ii) 4개 미만의 2'-F 변형

을 갖는 센스 가닥,

(b) 안티센스 가닥으로서,

(i) 19개 내지 35개 뉴클레오타이드 길이;

(ii) 12개 미만의 2'-F 변형; 및

을 갖는 안티센스 가닥을 포함하며, 듀플렉스 영역은 19개 내지 25개 염기쌍(바람직하게는 19개, 20개, 21개 또는 22개)이고; dsRNA 제제는 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 위치에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 함유하는 하나 이상의 친유성 단량체를 갖고; 안티센스 가닥의 3'-말단에 두 개의 뉴클레오타이드 오버행, 및 안티센스 가닥의 5'-말단에서 블런트 말단; 또는 듀플렉스의 블런트 말단의 양 말단을 갖는다.

일 구현예에서, dsRNA 제제는 15개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이를 갖는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고; 안티센스 가닥의 제1의 5개 뉴클레오타이드에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합이 있고(5' 말단으로부터 계수하여); 여기서 듀플렉스 영역은 19개 내지 25개 염기쌍(바람직하게는, 19개, 20개, 21개 또는 22개)이고; dsRNA 제제는 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 위치에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 함유하는 하나 이상의 친유성 단량체를 갖고; dsRNA 제제는 20% 미만, 15% 미만 및 10% 미만의 비-천연 뉴클레오타이드를 갖는다.

비-천연 뉴클레오타이드의 예는 비사이클릭 뉴클레오타이드, LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-데옥시, 2'-플루오로, 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA), 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸(2'-O-DMAEOE), 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 또는 2'-아라-F 등을 포함한다.

일 구현예에서, dsRNA 제제는 15개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이를 갖는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고; 안티센스 가닥의 제1의 5개 뉴클레오타이드에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합이 있고(5' 말단으로부터 계수하여); 여기서 듀플렉스 영역은 19개 내지 25개 염기쌍(바람직하게는, 19개, 20개, 21개 또는 22개)이고; dsRNA 제제는 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 위치에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 함유하는 하나 이상의 친유성 단량체를 갖고; dsRNA 제제는 80% 초과, 85% 초과 및 90% 초과의 천연 뉴클레오타이드를 갖고, 예컨대, 2'-OH, 2'-데옥시, 2'-OMe는 천연 뉴클레오타이드이다.

일 구현예에서, dsRNA 제제는 15개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이를 갖는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고; 안티센스 가닥의 제1의 5개 뉴클레오타이드에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합이 있고(5' 말단으로부터 계수하여); 여기서 듀플렉스 영역은 19개 내지 25개 염기쌍(바람직하게는, 19개, 20개, 21개 또는 22개)이고; dsRNA 제제는 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 위치에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 함유하는 하나 이상의 친유성 단량체를 갖고; dsRNA 제제는 100%의 천연 뉴클레오타이드를 갖고, 예컨대, 2'-OH, 2'-데옥시 및 2'-OMe는 천연 뉴클레오타이드이다.

일 구현예에서, dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 각 가닥은 14개 내지 30개 뉴클레오타이드를 갖고, 센스 가닥 서열은 하기 화학식 I으로 표현된다:

[화학식 I]

식에서,

i 및 j는 각각 독립적으로 0 또는 1이고;

p 및 q는 각각 독립적으로 0 내지 6이고;

각각의 N_a는 독립적으로 0개 내지 25개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 두 개의 상이하게 변형된 뉴클레오타이드를 포함하고;

각각의 N_b는 독립적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개의 변형 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고;

각각의 n_p 및 n_q는 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;

여기서, N_b 및 Y는 동일한 변형을 갖지 않고;

XXX, YYY 및 ZZZ는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드에 3개의 동일한 변형의 1개의 모티프를 나타내고;

dsRNA 제제는 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 위치에 접합된 하나 이상의 친유성 모이어티를 함유하는 하나 이상의 친유성 단량체를 갖고;

dsRNA의 안티센스 가닥은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 또는 18개 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합으로 분리되는 1개, 2개, 또는 3개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합의 2개의 블록을 포함한다.

다양한 공개문헌들은 다량체성 siRNA를 기술하였으며, 모두 본 발명의 siRNA와 함께 사용될 수 있다. 이런 공개 문헌들로는, WO2007/091269, 미국 특허 No. 7858769, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887 및 WO2011/031520를 포함하며, 이들은 원용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함되어 있다.

일부 구현예에서, 본 발명의 iRNA 제제의 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35% 또는 30%는 2'-OMe로 변형된다.

일부 구현예에서, iRNA 제제의 각각의 센스 및 안티센스 가닥은 독립적으로 비사이클릭 뉴클레오타이드, LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-데옥시, 2'-플루오로, 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA), 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸(2'-O-DMAEOE), 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 또는 2'-아라-F로 변형된다.

일부 구현예에서, iRNA 제제의 각각의 센스 및 안티센스 가닥은 적어도 두 개의 상이한 변형을 함유한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 임의의 2'-F 변형을 함유하지 않는다.

일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개 또는 12개의 2'-F 변형(들)을 함유한다. 일 예에서, 본 발명의 화합물은 9개 또는 10개의 2'-F 변형을 함유한다.

본 발명의 iRNA 제제는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합을 추가로 포함할 수 있다. 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 임의의 뉴클레오타이드 또는 가닥의 임의의 위치 둘 모두에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드간 결합 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드에서 발생할 수 있거나; 각각의 뉴클레오타이드간 결합 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 교대 패턴으로 발생할 수 있거나; 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 교대 패턴에서 둘 모두의 뉴클레오타이드간 결합 변형을 함유할 수 있다. 센스 가닥에서의 뉴클레오타이드간 결합 변형의 교대 패턴은 안티센스 가닥과 동일하거나 또는 상이할 수 있으며, 센스 가닥에서의 뉴클레오타이드간 결합 변형의 교대 패턴은 안티센스 가닥에서의 뉴클레오타이드간 결합 변형의 교대 패턴에 대해 이동을 가질 수 있다.

일 구현예에서, iRNA 제제는 오버행 영역에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 변형을 포함한다. 예를 들어, 오버행 영역은 2개의 뉴클레오타이드 간에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합을 가지는 뉴클레오타이드를 2개 함유할 수 있다. 뉴클레오타이드간 결합 변형은 또한, 듀플렉스 영역 내의 말단 쌍의 뉴클레오타이드와 오버행 뉴클레오타이드를 연결하도록 만들어질 수 있다. 예를 들어, 2개, 3개, 4개 이상, 또는 모든 오버행 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합을 통해 연결될 수 있으며, 선택적으로, 오버행 뉴클레오타이드의 옆에 존재하는 쌍으로 된 뉴클레오타이드와 오버행 뉴클레오타이드를 연결하는 부가적인 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합이 존재할 수 있다. 예를 들어, 말단의 3개의 뉴클레오타이드 간에는 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합이 2개 이상 존재할 수 있으며, 3개의 뉴클레오타이드 중 2개는 오버행 뉴클레오타이드이며, 세번째 뉴클레오타이드는 오버행 뉴클레오타이드 옆의 쌍으로 된 뉴클레오타이드이다. 바람직하게는, 이들 말단의 뉴클레오타이드 3개는 안티센스 가닥의 3' 말단에 존재할 수 있다.

일부 구현예에서, iRNA 제제의 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합의 하나 이상의 블록을 포함한다. 일 예에서, 센스 가닥은 2개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합의 1개의 블록을 포함한다. 일 예에서, 안티센스 가닥은 2개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합의 2개의 블록을 포함한다. 예를 들어, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 결합 2개의 블록은 16개 내지 18개 포스페이트 뉴클레오타이드간 결합에 의해 분리된다.

일부 구현예에서, iRNA 제제의 안티센스 가닥은 이에 혼성화하는 타겟 RNA와 100% 상보적이며 RNA 간섭을 통해 그 발현을 억제한다. 또 다른 구현예에서, iRNA 제제의 안티센스 가닥은 타겟 RNA와 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 60%, 적어도 55%, 또는 적어도 50% 상보적이다.

핵산 변형

일부 구현예에서, 화합물은 본원에 기재된 적어도 하나의 핵산 변형을 포함한다. 예를 들어, 적어도 하나의 변형은 변형 뉴클레오사이드간 결합, 변형 뉴클레오베이스, 변형 당, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 제한 없이, 그러한 변형은 화합물에서 임의의 위치에 존재할 수 있다. 예를 들어, 변형은 RNA 분자들 중 하나에 존재할 수 있다.

핵산 변형(뉴클레오베이스)

뉴클레오사이드의 천연 생성 염기 부분은 전형적으로 헤테로사이클릭 염기이다. 두 개의 가장 흔한 부류의 그러한 헤테로사이클릭 염기는 퓨린 및 피리미딘이다. 펜토푸라노실 당을 포함하는 그러한 뉴클레오사이드의 경우, 포스페이트 기는 당의 2', 3' 또는 5' 하이드록실 모이어티에 연결될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 데 있어서, 그러한 포스페이트 기는 인접한 뉴클레오사이드를 서로에 대해 공유 연결하여 선형 폴리머 화합물을 형성한다. 올리고뉴클레오타이드 내에서, 포스페이트 기는 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오사이드간 백본을 형성하는 것으로 흔히 언급된다. RNA 및 DNA의 천연 생성 결합 또는 백본은 3'에서 5'로의 포스포디에스테르 결합이다.

"비변형" 또는 "천연" 뉴클레오베이스, 예컨대, 퓨린 뉴클레오베이스 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 뉴클레오베이스 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U) 외에, 당업자에게 알려진 다수의 변형 뉴클레오베이스 또는 뉴클레오베이스 모방체가 본원에 기재된 화합물에 적합하다. 비변형 또는 천연 뉴클레오베이스는 개선된 특성을 갖는 iRNA를 제공하도록 변형되거나 치환될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제 저항성 올리고뉴클레오타이드는 이러한 염기들과 또는 합성 및 천연 뉴클레오베이스(예를 들어, 이노신, 잔틴, 하이포잔틴, 뉴불라린, 이소구아니신, 또는 투베르시딘) 및 본원에 기재된 올리고머 변형 중 어느 하나와 제조될 수 있다. 대안적으로, 임의의 상기 염기들 및 "보편적인 염기"의 치환되거나 변형된 유사체가 사용될 수 있다. 천연 염기가 비-천연 및/또는 보편적인 염기로 치환되는 경우, 뉴클레오타이드는 본원에서 변형된 뉴클레오베이스 및/또는 뉴클레오베이스 변형을 포함한다고 한다. 변형된 뉴클레오베이스 및/또는 뉴클레오베이스 변형은 또한 접합된 모이어티, 예를 들어, 본원에 기재된 리간드를 포함하는 천연, 비-천연 및 보편적 염기를 포함한다. 뉴클레오베이스와의 접합에 바람직한 접합 모이어티는 적절한 알킬, 알케닐 또는 아미드 결합이 있는 링커를 통해 뉴클레오베이스에 접합될 수 있는 양이온성 아미노 기를 포함한다.

본원에 기재된 올리고머 화합물은 또한 뉴클레오베이스(당업계에서 흔히 간단히 "염기로" 지칭됨) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "비변형" 또는 "천연" 뉴클레오베이스는 퓨린 염기 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 염기 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. 예시적인 변형 뉴클레오베이스는 기타 합성 및 천연 뉴클레오베이스, 예컨대, 이노신, 잔틴, 하이포잔틴, 뉴불라린, 이소구아니신, 튜베르시딘, 2-(할로)아데닌, 2-(알킬)아데닌, 2-(프로필)아데닌, 2-(아미노)아데닌, 2-(아미노알킬)아데닌, 2-(아미노프로필)아데닌, 2-(메틸티오)-N⁶-(이소펜테닐)아데닌, 6-(알킬)아데닌, 6-(메틸)아데닌, 7-(데아자)아데닌, 8-(알케닐)아데닌, 8-(알킬)아데닌, 8-(알키닐)아데닌, 8-(아미노)아데닌, 8-(할로)아데닌, 8-(하이드록실)아데닌, 8-(티오알킬)아데닌, 8-(티올)아데닌, N⁶-(이소펜틸)아데닌, N⁶-(메틸)아데닌, N⁶,N⁶-(디메틸)아데닌, 2-(알킬)구아닌, 2-(프로필)구아닌, 6-(알킬)구아닌, 6-(메틸)구아닌, 7-(알킬)구아닌, 7-(메틸)구아닌, 7-(데아자)구아닌, 8-(알킬)구아닌, 8-(알케닐)구아닌, 8-(알키닐)구아닌, 8-(아미노)구아닌, 8-(할로)구아닌, 8-(하이드록실)구아닌, 8-(티오알킬)구아닌, 8-(티올)구아닌, N-(메틸)구아닌, 2-(티오)시토신, 3-(데아자) 5-(아자)시토신, 3-(알킬)시토신, 3-(메틸)시토신, 5-(알킬)시토신, 5-(알키닐)시토신, 5-(할로)시토신, 5-(메틸)시토신, 5-(프로피닐)시토신, 5-(프로피닐)시토신, 5-(트리플루오로메틸)시토신, 6-(아조)시토신, N⁴-(아세틸)시토신, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우라실, 2-(티오)우라실, 5-(메틸) 2-(티오)우라실, 5-(메틸아미노메틸)-2-(티오)우라실, 4-(티오)우라실, 5-(메틸) 4-(티오)우라실, 5-(메틸아미노메틸)-4-(티오)우라실, 5-(메틸) 2,4-(디티오)우라실, 5-(메틸아미노메틸)-2,4-(디티오)우라실, 5-(2-아미노프로필)우라실, 5-(알킬)우라실, 5-(알키닐)우라실, 5-(알릴아미노)우라실, 5-(아미노알릴)우라실, 5-(아미노알킬)우라실, 5-(구아니디늄알킬)우라실, 5-(1,3-디아졸-1-알킬)우라실, 5-(시아노알킬)우라실, 5-(디알킬아미노알킬)우라실, 5-(디메틸아미노알킬)우라실, 5-(할로)우라실, 5-(메톡시)우라실, 우라실-5 옥시아세트산, 5-(메톡시카르보닐메틸)-2-(티오)우라실, 5-(메톡시카르보닐-메틸)우라실, 5-(프로피닐)우라실, 5-(프로피닐)우라실, 5-(트리플루오로메틸)우라실, 6-(아조)우라실, 디하이드로우라실, N³-(메틸)우라실, 5-우라실(즉, 유사우라실), 2-(티오)유사우라실, 4-(티오)유사우라실, 2,4-(디티오)유사우라실, 5-(알킬)유사우라실, 5-(메틸)유사우라실, 5-(알킬)-2-(티오)유사우라실, 5-(메틸)-2-(티오)유사우라실, 5-(알킬)-4-(티오)유사우라실, 5-(메틸)-4-(티오)유사우라실, 5-(알킬)-2,4-(디티오)유사우라실, 5-(메틸)-2,4-(디티오)유사우라실, 1-치환된 유사우라실, 1-치환된 2(티오)-유사우라실, 1-치환된 4-(티오)유사우라실, 1-치환된 2,4-(디티오)유사우라실, 1-(아미노카르보닐에틸레닐)-유사우라실, 1-(아미노카르보닐에틸레닐)-2(티오)-유사우라실, 1-(아미노카르보닐에틸레닐)-4-(티오)유사우라실, 1-(아미노카르보닐에틸레닐)-2,4-(디티오)유사우라실, 1-(아미노알킬아미노카르보닐에틸레닐)-유사우라실, 1-(아미노알킬아미노-카르보닐에틸레닐)-2(티오)-유사우라실, 1-(아미노알킬아미노카르보닐에틸레닐)-4-(티오)유사우라실, 1-(아미노알킬아미노카르보닐에틸레닐)-2,4-(디티오)유사우라실, 1,3-(디아자)-2-(옥소)-페녹사진-1-일, 1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-페녹사진-1-일, 1,3-(디아자)-2-(옥소)-펜티아진-1-일, 1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-펜티아진-1-일, 7-치환된 1,3-(디아자)-2-(옥소)-페녹사진-1-일, 7-치환된 1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-페녹사진-1-일, 7-치환된 1,3-(디아자)-2-(옥소)-펜티아진-1-일, 7-치환된 1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-펜티아진-1-일, 7-(아미노알킬하이드록시)-1,3-(디아자)-2-(옥소)-페녹사진-1-일, 7-(아미노알킬하이드록시)-1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-페녹사진-1-일, 7-(아미노알킬하이드록시)-1,3-(디아자)-2-(옥소)-펜티아진-1-일, 7-(아미노알킬하이드록시)-1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-펜티아진-1-일, 7-(구아니디늄알킬하이드록시)-1,3-(디아자)-2-(옥소)-페녹사진-1-일, 7-(구아니디늄알킬하이드록시)-1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-페녹사진-1-일, 7-(구아니디늄알킬-하이드록시)-1,3-(디아자)-2-(옥소)-펜티아진-1-일, 7-(구아니디늄알킬하이드록시)-1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-펜티아진-1-일, 1,3,5-(트리아자)-2,6-(디옥사)-나프탈렌, 이노신, 잔틴, 하이포잔틴, 뉴불라린, 튜베르시딘, 이소구아니신, 이노시닐, 2-아자-이노시닐, 7-데아자-이노시닐, 니트로이미다졸릴, 니트로피라졸릴, 니트로벤즈이미다졸릴, 니트로인다졸릴, 아미노인돌릴, 피롤로피리미디닐, 3-(메틸)이소카르보스티릴일, 5-(메틸)이소카르보스티릴일, 3-(메틸)-7-(프로피닐)이소카르보스티릴일, 7-(아자)인돌릴, 6-(메틸)-7-(아자)인돌릴, 이미디조피리디닐, 9-(메틸)-이미디조피리디닐, 피롤로피리지닐, 이소카르보스티릴일, 7-(프로피닐)이소카르보스티릴일, 프로피닐-7-(아자)인돌릴, 2,4,5-(트리메틸)페닐, 4-(메틸)인돌릴, 4,6-(디메틸)인돌릴, 페닐, 나프탈레닐, 안트라세닐, 페난트라세닐, 피레닐, 스틸베닐, 테트라세닐, 펜타세닐, 디플루오로톨릴, 4-(플루오로)-6-(메틸)벤즈이미다졸, 4-(메틸)벤즈이미다졸, 6-(아조)티민, 2-피리딘온, 5-니트로인돌, 3-니트로피롤, 6-(아자)피리미딘, 2-(아미노)퓨린, 2,6-(디아미노)퓨린, 5-치환된 피리미딘, N²-치환된 퓨린, N⁶-치환된 퓨린, O⁶-치환된 퓨린, 치환된 1,2,4-트리아졸, 피롤로-피리미딘-2-온-3-일, 6-페닐-피롤로-피리미딘-2-온-3-일, 파라-치환된-6-페닐-피롤로-피리미딘-2-온-3-일, 오르토-치환된-6-페닐-피롤로-피리미딘-2-온-3-일, 비스-오르토-치환된-6-페닐-피롤로-피리미딘-2-온-3-일, 파라-(아미노알킬하이드록시)-6-페닐-피롤로-피리미딘-2-온-3-일, 오르토-(아미노알킬하이드록시)-6-페닐-피롤로-피리미딘-2-온-3-일, 비스-오르토--(아미노알킬하이드록시)-6-페닐-피롤로-피리미딘-2-온-3-일, 피리도피리미딘-3-일, 2-옥소-7-아미노-피리도피리미딘-3-일, 2-옥소-피리도피리미딘-3-일, 또는 이들의 임의의 O-알킬화된 또는 N-알킬화된 유도체를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 대안적으로, 임의의 상기 염기들 및 "보편적인 염기"의 치환되거나 변형된 유사체가 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 보편적인 뉴클레오베이스는 용융 거동, 세포내 효소의 인식 또는 iRNA 듀플렉스의 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않으면서 4개의 천연 생성 뉴클레오베이스 모두와 염기쌍이 될 수 있는 임의의 뉴클레오베이스이다. 일부 예시적인 보편적인 뉴클레오베이스는 2,4-디플루오로톨루엔, 니트로피롤릴, 니트로인돌릴, 8-아자-7-데아자아데닌, 4-플루오로-6-메틸벤즈이미다졸, 4-메틸벤즈이미다졸, 3-메틸 이소카르보스티릴일, 5-메틸 이소카르보스티릴일, 3-메틸-7-프로피닐 이소카르보스티릴일, 7-아자인돌릴, 6-메틸-7-아자인돌릴, 이미디조피리디닐, 9-메틸-이미디조피리디닐, 피롤로피리지닐, 이소카르보스티릴일, 7-프로피닐 이소카르보스티릴일, 프로피닐-7-아자인돌릴, 2,4,5-트리메틸페닐, 4-메틸이노릴, 4,6-디메틸인돌릴, 페닐, 나프탈레닐, 안트라세닐, 페난트라세닐, 피레닐, 스틸베닐, 테트라세닐, 펜타세닐, 및 이들의 구조적 유도체를 포함하나, 이로 한정되지 않는다(예를 들어, 문헌[Loakes, 2001, Nucleic Acids Research, 29, 2437-2447] 참조).

추가 뉴클레오베이스는 미국 특허 No. 3,687,808에 개시된 것들; 2009년 3월 26일에 출원된 국제 출원 No. PCT/US09/038425에 개시된 것들; 문헌[Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 858-859 쪽, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990]에 개시된 것들; 문헌[English et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613]에 개시된 것들; 문헌[Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijin, P.Ed. Wiley-VCH, 2008]에 개시된 것들; 및 문헌[Sanghvi, Y.S., 챕터 15, dsRNA Research and Applications, 289-302 쪽, Crooke, S.T. and Lebleu, B., Eds., CRC Press, 1993]에 개시된 것들을 포함한다. 상기 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

소정의 구현예에서, 변형된 뉴클레오베이스는, 예를 들어, 7-데아자 퓨린, 5-메틸 시토신, 또는 G-클램프와 같은 모 뉴클레오베이스와 구조가 매우 유사한 뉴클레오베이스이다. 소정의 구현예에서, 뉴클레오베이스 모방체는, 예를 들어, 트리사이클릭 페녹사진 뉴클레오베이스 모방체와 같이 더 복잡한 구조를 포함한다. 상기 언급된 변형 뉴클레오베이스의 제조를 위한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

핵산 변형(당)

본원에 제공된 본 발명의 화합물은 변형 당 모이어티를 갖는, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함하여, 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 이상)의 단량체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오사이드의 푸라노실 당 고리는 잠김 핵산 또는 바이사이클릭 핵산을 형셩하기 위해 치환기의 첨가, 두 개의 비-같은 자리 고리 원자의 가교를 포함하나, 이로 한정되지 않는 다수의 방식으로 변형될 수 있다. 소정의 구현예에서, 올리고머 화합물은 LNA인 하나 이상(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 이상)의 단량체를 포함한다.

잠김 핵산의 일부 구현예에서, 푸르나오실의 2' 위치는 다음으로부터 독립적으로 선택된 링커에 의해 4' 위치에 연결된다:

-[C(R1)(R2)]_n-, -[C(R1)(R2)]_n-O-, -[C(R1)(R2)]_n-N(R1)-, -[C(R1)(R2)]_n-N(R1)-O-, -[C(R1R2)]_n-O-N(R1)-, -C(R1)=C(R2)-O-, -C(R1)=N-, -C(R1)=N-O-, -C(-NR1)-, -C(=NR1)-O-, -C(=O)-, -C(=O)O-, -C(=S)-, ―C(=S)O―, ―C(=S)S―, -O-, ―Si(R1)2-, -S(=O)_x- 및 -N(R1)-

식에서,

x는 0, 1, 또는 2이고;

n은 1, 2, 3, 또는 4이고;

각각의 R1 및 R2는 독립적으로 H, 보호기, 하이드록실, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 헤테로사이클 라디칼, 치환된 헤테로사이클 라디칼, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C5-C7 비사이클릭 라디칼, 치환된 C5-C7 비사이클릭 라디칼, 할로겐, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, 아실(C(=O)-H), 치환된 아실, CN, 설포닐(S(=O)2-J1), 또는 설폭실(S(=O)-J1)이고;

각각의 J1 및 J2는 독립적으로 H, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 아실(C(=O)-H), 치환된 아실, 헤테로사이클 라디칼, 치환된 헤테로사이클 라디칼, C1-C12 아미노알킬, 치환된 C1-C12 아미노알킬 또는 보호기이다.

일부 구현예에서, LNA 화합물의 각각의 링커는 독립적으로 -[C(R1)(R2)]n-, -[C(R1)(R2)]n-O-, -C(R1R2)-N(R1)-O- 또는 -C(R1R2)-O-N(R1)-이다. 또 다른 구현예에서, 각각의 상기 링커는 독립적으로 4'-CH₂-2', 4'-(CH₂)₂-2', 4'-(CH₂)₃-2', 4'-CH₂-O-2', 4'-(CH₂)₂-O-2', 4'-CH₂-O-N(R1)-2' 및 4'-CH₂-N(R1)-O-2'이고, 각각의 R1은 독립적으로 H, 보호기 또는 C1-C12 알킬이다.

특정 LNA는 특허 문헌뿐만 아니라 과학 문헌(문헌[Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456]; 문헌[Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630]; 문헌[Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638]; 문헌[Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222]; WO 94/14226; WO 2005/021570; 문헌[Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039])에 제조되고 개시되어 있으며; LNA가 개시되어 있는 발행된 미국 특허 및 공개 출원의 예는, 예를 들어, 미국 특허 No. 7,053,207; 6,268,490; 6,770,748; 6,794,499; 7,034,133; 및 6,525,191; 및 미국 등록전 공개 No. 2004-0171570; 2004-0219565; 2004-0014959; 2003-0207841; 2004-0143114; 및 20030082807을 포함한다.

또한, 리보실 당 고리의 2'-하이드록실 기가 당 고리의 4' 탄소 원자에 연결되고, 이에 의해 메틸렌옥시(4'-CH₂-O-2') 결합을 형성하여 바이사이클릭 당 모이어티를 형성하는 LNA가 본원에 제공된다(문헌[Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561]; 문헌[Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8 1-7]; 및 문헌[Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243]에 보고되어 있으며; 또한 미국 특허 No. 6,268,490 및 6,670,461 참조). 결합은 2' 산소 원자 및 4' 탄소 원자를 가교하는 메틸렌(-CH₂-)일 수 있고, 여기서 용어 메틸렌옥시(4'-CH₂-O-2') LNA는 바이사이클릭 모이어티에 대하여 사용되고; 이러한 위치에서 에틸렌 기의 경우에, 용어 에틸렌옥시(4'-CH₂CH₂-O-2') LNA가 사용된다(Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456: Morita et al., Bioorganic Medicinal Chemistry, 2003, 11, 2211-2226). 메틸렌옥시(4'-CH₂-O-2') LNA 및 다른 바이사이클릭 당 유사체는 상보적 DNA 및 RNA와 매우 높은 듀플렉스 열 안정성(Tm=+3 내지 +10℃), 3'-엑소뉴클레오리틱 분해를 향하는 안정성 및 우수한 가용성 특성을 나타낸다. BNA를 포함하는 강력하고 비독성인 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 기재되어 있다(Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638).

또한 논의된 메틸렌옥시(4'-CH₂-O-2') LNA의 이성질체는 3'-엑소뉴클레아제에 대항하는 우수한 안정성을 갖는 것으로 밝혀진 알파-L-메틸렌옥시(4'-CH₂-O-2') LNA이다. 알파-L-메틸렌옥시(4'-CH₂-O-2') LNA는 강력한 안티센스 활성을 나타낸 안티센스 갭머 및 키메라로 도입되었다(Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).

메틸렌옥시(4'-CH₂-O-2') LNA 단량체 아데닌, 시토신, 구아닌, 5-메틸-시토신, 티민 및 우라실의 합성 및 제조, 이와 함께 이들의 올리고머화, 및 핵산 인식 특성이 기재되어 있다(Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). BNA 및 이의 제조가 또한 WO 98/39352 및 WO 99/14226에 기재되어 있다.

메틸렌옥시(4'-CH₂-O-2') LNA, 포스포로티오에이트-메틸렌옥시(4'-CH₂-O-2') LNA 및 2'-티오-LNA의 유사체가 또한 제조되었다(Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). 핵산 폴리머라제를 위한 기질로서 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 듀플렉스를 포함하는 잠김 뉴클레오사이드 유사체의 제조가 또한 기재되어 있다(Wengel et al., WO 99/14226). 게다가, 신규한 입체형태 제한 고친화성 올리고뉴클레오타이드 유사체인 2'-아미노-LNA의 합성이 또한 당업계에 개시되어 있다(Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). 또한, 2'-아미노- 및 2'-메틸아미노-LNA가 제조되었고, 상보적 RNA 및 DNA 가닥과 이들의 듀플렉스의 열적 안정성이 종래에 보고되었다.

변형 당 모이어티는 잘 알려져 있으며, 이의 타겟에 대한 안티센스 화합물의 친화성을 변경하고, 전형적으로 증가시키고/증가시키거나 뉴클레아제 저항성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 변형 당의 대표적인 목록은 메틸렌옥시(4'-CH₂-O-2') LNA 및 에틸렌옥시(4'-(CH₂)₂-O-2' 브릿지) ENA를 포함한 바이사이클릭 변형 당; 치환 당, 특히, 2'-F, 2'-OCH₃ 또는 2'-O(CH₂)₂-OCH₃ 치환기를 갖는 2'-치환기; 및 4'-티오 변형 당을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 당은 또한 특히 당 모방 기로 치환될 수 있다. 변형 당의 제조를 위한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그러한 변형 당의 제조를 교시하는 일부 대표적인 특허 및 공보는 미국 특허 No. 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 5,792,747; 5,700,920; 6,531,584; 및 6,600,032; 및 WO 2005/121371를 포함하나, 이로 한정되지 않는다.

"옥시"-2' 하이드록실 기 변형의 예는 알콕시 또는 아릴옥시(OR, 예를 들어, R = H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당); 폴리에틸렌글리콜(PEG), O(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂OR, n=1 내지 50; "잠김" 핵산(LNA)(여기서, 뉴클레오사이드의 푸라노스 부분은 푸라노스 고리의 두 개의 탄소 원자를 연결하는 브릿지를 포함하고, 이에 의해 바이사이클릭 고리 시스템을 형성함); O-아민 또는 O-(CH₂)_n아민(n=1 내지 10, 아민 = NH₂; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 디헤테로아릴 아미노, 에틸렌디아민 또는 폴리아미노); 및 O-CH₂CH₂(NCH₂CH₂NMe₂)₂를 포함한다.

"데옥시" 변형은 수소(즉, 데옥시리보스 당, 특히 단일-가닥 오버행과 관련); 할로(예를 들어, 플루오로); 아미노(예를 들어, NH₂; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 디헤테로아릴 아미노, 또는 아미노 산); NH(CH₂CH₂NH)_nCH₂CH₂-아민(아민 = NH₂; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노); -NHC(O)R(R = 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당); 시아노; 머캅토; 알킬-티오-알킬; 티오알콕시; 티오알킬; 알킬; 사이클로알킬; 아릴; 알케닐 및 알키닐(예를 들어, 아미노 작용기로 선택적으로 치환될 수 있음)을 포함한다.

다른 적합한 2'-변형, 예를 들어, 변형 MOE는 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 출원 공개 No. 20130130378에 기재되어 있다.

2' 위치에서의 변형은 아라비노스 배치에 존재할 수 있다. 용어 "아라비노스 배치"는 아라비노스에서의 2'-OH와 동일한 배치에 리보스의 C2'에서의 치환기의 배치를 지칭한다.

당은 당에서 동일한 탄소의 두 개의 상이한 변형, 예를 들어, 젬 변형(gem modification)을 포함할 수 있다. 당 기는 또한 리보스에서 상응하는 탄소와 반대의 입체화학적 배치를 지니는 하나 이상의 탄소를 함유할 수 있다. 따라서, 올리고머 화합물은 당으로서, 예를 들어, 아라비노스를 함유하는 하나 이상의 단량체를 포함할 수 있다. 단량체는 당의 1' 위치에서 알파 결합, 예를 들어, 알파-뉴클레오사이드를 가질 수 있다. 단량체는 또한 4'-위치에서 반대 배치를 가질 수 있고, 예를 들어, C5' 및 H4' 또는 이를 치환하는 치환기는 서로 상호교환된다. C5' 및 H4' 또는 이를 치환하는 치환기가 서로 상호교환되는 경우, 당은 4' 위치에서 변형된다고 한다.

본원에 개시된 본 발명의 화합물은 또한 무염기 당, 즉, C-1'에서 뉴클레오베이스가 없는 당을 포함할 수 있거나, C1'에서 뉴클레오베이스 대신 다른 화학기를 갖는다. 예를 들어, 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 No. 5,998,203를 참조하라. 이러한 무염기 당은 또한 구성 당 원자 중 하나 이상에서 변형을 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 L 이성질체, 예를 들어, L-뉴클레오사이드인 하나 이상의 당을 함유할 수 있다. 당 기에 대한 변형은 또한 황, 선택적으로 치환된 질소 또는 CH₂ 기로의 4'-O 치환을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, C1'과 뉴클레오베이스 간의 결합은 α 배치이다.

당 변형은 또한 비사이클릭 리보스 당을 갖는 임의의 뉴클레오타이드를 지칭하는, "비사이클릭 뉴클레오타이드"를 포함할 수 있고, 여기서 리보스 탄소 간의 C-C 결합(예를 들어, C1'-C2', C2'-C3', C3'-C4', C4'-O4', C1'-O4')은 부재이고/부재이거나 리보스 탄소 또는 산소(예를 들어, C1', C2', C3', C4' 또는 O4') 중 적어도 하나는 독립적으로 또는 조합하여 뉴클레오타이드에서 부재이다. 일부 구현예에서, 비사이클릭 뉴클레오타이드는

,

또는

이고, 여기서 B는 변형 또는 비변형 뉴클레오베이스이고, R₁ 및 R₂는 독립적으로 H, 할로겐, OR₃, 또는 알킬이고; R₃는 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당이다.

일부 구현예에서, 당 변형은 아라비노스 배치에서 2'-O-Me를 갖는 2'-H, 2'-O-Me(2'-O-메틸), 2'-O-MOE(2'-O-메톡시에틸), 2'-F, 2'-O-[2-(메틸아미노)-2-옥소에틸](2'-O-NMA), 2'-S-메틸, 2'-O-CH₂-(4'-C)(LNA), 2'-O-CH₂CH₂-(4'-C)(ENA), 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), 2'-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE) 및 젬 2'-OMe/2'F로 이루어진 군으로부터 선택된다.

특정 뉴클레오사이드가 이의 2'-위치를 통해 다음 뉴클레오타이드에 연결되는 경우, 본원에 기재된 당 변형은 특정 뉴클레오타이드, 예를 들어, 이의 2'-위치를 통해 연결된 뉴클레오타이드에 대한 당의 3'-위치에 위치될 수 있는 것이 이해되어야 한다. 3' 위치에서의 변형은 자일로스 배치에 존재할 수 있다. 용어 "자일로스 배치"는 자일로스 당에서의 3'-OH와 동일한 배치에 리보스의 C3'에서의 치환기의 배치를 지칭한다.

C4' 및/또는 C1'에 부착된 수소는 선형- 또는 분지형- 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알키닐로 치환될 수 있고, 여기서 알킬, 알케닐 및 알키닐의 백본은 O, S, S(O), SO₂, N(R'), C(O), N(R')C(O)O, OC(O)N(R'), CH(Z'), 인 함유 결합, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릭 또는 선택적으로 치환된 사이클로알킬 중 하나 이상을 함유할 수 있고, R'은 수소, 아실 또는 선택적으로 치환된 지방족이고, Z'는 OR₁₁, COR₁₁, CO₂R₁₁,

, NR₂₁R₃₁, CONR₂₁R₃₁, CON(H)NR₂₁R₃₁, ONR₂₁R₃₁, CON(H)N=CR₄₁R₅₁, N(R₂₁)C(=NR₃₁)NR₂₁R₃₁, N(R₂₁)C(O)NR₂₁R₃₁, N(R₂₁)C(S)NR₂₁R₃₁, OC(O)NR₂₁R₃₁, SC(O)NR₂₁R₃₁, N(R₂₁)C(S)OR₁₁, N(R₂₁)C(O)OR₁₁, N(R₂₁)C(O)SR₁₁,N(R₂₁)N=CR₄₁R₅₁, ON=CR₄₁R₅₁, SO₂R₁₁, SOR₁₁, SR₁₁, 및 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릭으로 이루어진 군으로부터 선택되고; R₂₁ 및 R₃₁는 각 경우에 독립적으로 수소, 아실, 비치환되거나 치환된 지방족, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릭, OR₁₁, COR₁₁, CO₂R₁₁, 또는 NR₁₁R₁₁ ^'이거나; R₂₁ 및 R₃₁은 이들이 부착된 원자와 함께 헤테로사이클릭 고리를 형성하고; R₄₁ 및 R₅₁은 각 경우에 독립적으로 수소, 아실, 비치환되거나 치환된 지방족, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릭, OR₁₁, COR₁₁, 또는 CO₂R₁₁, 또는 NR₁₁R₁₁'이고; R₁₁ 및 R₁₁'은 독립적으로 수소, 지방족, 치환된 지방족, 아릴, 헤테로아릴, 또는 헤테로사이클릭이다. 일부 구현예에서, 5' 말단 뉴클레오타이드의 C4'에 부착된 수소는 치환된다.

일부 구현예에서, C4' 및 C5'는 함께 바람직하게는 적어도 하나의 -PX(Y)-를 포함하는 선택적으로 치환된 헤테로사이클릭을 형성하고, 여기서 X는 H, OH, OM, SH, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알콕시, 선택적으로 치환된 알킬티오, 선택적으로 치환된 알킬아미노 또는 선택적으로 치환된 디알킬아미노이고, M은 독립적으로 각 경우에 +1의 전체 전하를 갖는 알칼리 금속 또는 전이 금속이고; Y는 O, S, 또는 NR'이고, 여기서 R'는 수소, 선택적으로 치환된 지방족이다. 바람직하게는, 이러한 변형은 iRNA의 5' 말단에 있다.

소정의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 상기 화학식의 적어도 두 개의 인접 단량체의 적어도 두 개의 영역을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 갭핑 모티프를 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 약 8개 내지 약 14개의 인접 β-D-2'-데옥시리보푸라노실 뉴클레오사이드의 적어도 하나의 영역을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 약 9개 내지 약 12개의 인접 β-D-2'-데옥시리보푸라노실 뉴클레오사이드의 적어도 하나의 영역을 포함한다.

소정의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 하기 화학식의 적어도 하나(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 이상)의 (S)-cEt 단량체를 포함한다:

식에서, Bx는 헤테로사이클릭 염기 모이어티이다.

소정의 구현예에서, 단량체는 당 모방체를 포함한다. 소정의 그러한 구현예에서, 모방체는 당 또는 당-뉴클레오사이드간 결합 조합 대신에 사용되고, 뉴클레오베이스는 선택된 타겟에 혼성화를 위해 유지된다. 당 모방체의 대표적인 예는 사이클로헥세닐 또는 모르폴리노를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 당-뉴클레오사이드간 결합 조합을 위한 모방체의 대표적인 예는 펩타이드 핵산(PNA) 및 비하전된 비키랄 결합에 의해 연결된 모르폴리노 기를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 일부 예에서, 모방체는 뉴클레오베이스 대신에 사용된다. 대표적인 뉴클레오베이스 모방체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 트리사이클릭 페녹사진 유사체 및 보편적인 염기를 포함하나, 이로 한정되지 않는다(Berger et al., Nuc Acid Res. 2000, 28:2911-14, 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 당, 뉴클레오사이드 및 뉴클레오베이스 모방체의 합성 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

핵산 변형(당간 결합)

단량체(변형 및 비변형 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드를 포함하나, 이로 한정되지 않음)를 함께 연결하고, 이에 의해 올리고머 화합물, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 연결기가 본원에 기재된다. 그러한 연결기는 또한 당간 결합으로 지칭된다. 두 가지 주요 부류의 연결기는 인 원자의 존재 또는 부재에 의해 정의된다. 대표적인 인 함유 결합은 포스포디에스테르(P=O), 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, 포스포라미데이트, 및 포스포로티오에이트(P=S)를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 대표적인 비-인 함유 연결기는 메틸렌메틸이미노(-CH₂-N(CH₃)-O-CH₂-), 티오디에스테르(-O-C(O)-S-), 티오노카르바메이트(-O-C(O)(NH)-S-); 실록산(-O-Si(H)₂-O-); 및 N,N'-디메틸하이드라진(-CH₂-N(CH₃)-N(CH₃)-)을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 천연 포스포디에스테르 결합에 비해 변형된 결합은 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레아제 저항성을 변경하기 위해, 전형적으로 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 소정의 구현예에서, 키랄 원자를 갖는 결합은 별개의 거울상이성질체로서 라세미 혼합물로서 제조될 수 있다. 대표적인 키랄 결합은 알킬포스포네이트 및 포스포로티오에이트를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 인-함유 및 비-인-함유 결합의 제조 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

연결기에서 포스페이트 기는 산소 중 하나를 상이한 치환기로 치환함으로써 변형될 수 있다. 이러한 변형의 한 가지 결과는 핵산 분해에 대한 올리고뉴클레오타이드의 저항 증가일 수 있다. 변형된 포스페이트 기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스테르, 수소 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합에서 비-가교 포스페이트 산소 원자 중 하나는 임의의 다음으로 치환될 수 있다: S, Se, BR₃(R은 수소, 알킬, 아릴임), C(즉, 알킬 기, 아릴 기 등), H, NR₂(R은 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 아릴임), 또는 (R은 선택적으로 치환된 알킬 또는 아릴임). 비변형 포스페이트 기에서 인 원자는 비키랄성이다. 그러나, 상기 원자들 또는 원자들의 군들 중 하나로 비-가교 산소 중 하나를 치환하는 것은 인 원자를 키랄성으로 만드는데; 다시 말해서, 이러한 방식으로 변형된 포스페이트 기에서 인 원자는 입체발생 중심이다. 입체발생 인 원자는 "R" 배치(본원에서 Rp) 또는 "S" 배치(본원에서 Sp)를 지닐 수 있다.

포스포로디티오에이트는 황으로 치환된 둘 모두의 비-가교 산소를 갖는다. 포스포로디티오에이트에서 인 중심은 올리고뉴클레오타이드 부분입체이성질체의 형성을 배제하는 비키랄성이다. 따라서, 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 키랄 중심을 제거하는, 둘 모두의 비-가교 산소에 대한 변형, 예를 들어, 포스포로디티오에이트 형성은 이들이 부분입체이성질체 혼합을 생성시킬 수 없다는 점에서 바람직할 수 있다. 따라서, 비-가교 산소는 독립적으로 O, S, Se, B, C, H, N, 또는 OR(R은 알킬 또는 아릴임) 중 어느 하나일 수 있다.

포스페이트 링커는 또한 질소(가교된 포스포로아미데이트), 황(가교된 포스포로티오에이트) 및 탄소(가교된 메틸렌포스포네이트)로의 가교 산소(즉, 단량체의 당에 포스페이트를 연결하는 산소) 치환에 의해 변형될 수 있다. 치환은 연결 산소 중 하나 또는 둘 모두의 연결 산소에서 발생할 수 있다. 가교 산소가 뉴클레오사이드의 3'-산소인 경우, 탄소로의 치환이 바람직하다. 가교 산소가 뉴클레오사이드의 5'-산소인 경우, 질소로의 치환이 바람직하다.

포스페이트에 연결된 산소 중 적어도 하나가 치환되거나 포스페이트 기가 비-인 기로 치환된 변형된 포스페이트 결합은 또한 "비-포스포디에스테르 당간 결합" 또는 "비-포스포디에스테르 링커"로 지칭된다.

소정의 구현예에서, 포스페이트 기는 비-인 함유 커넥터, 예를 들어, 탈포스포 링커로 치환될 수 있다. 탈포스포 링커는 또한 본원에서 비-포스포디에스테르 링커로 지칭된다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 하전된 포스포디에스테르 기는 핵산 분해에서 반응 중심이기 때문에, 중성 구조적 모방체로의 이의 치환은 뉴클레아제 안정성 향상을 제공할 것으로 사료된다. 다시, 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 일부 구현예에서, 하전된 포스페이트 기가 중성 모이어티로 치환되는 변경을 도입하는 것이 바람직할 수 있다.

포스페이트 기를 치환할 수 있는 모이어티의 예는 아미드(예를 들어, 아미드-3(3'-CH₂-C(=O)-N(H)-5') 및 아미드-4-(3'-CH₂-N(H)-C(=O)-5')), 하이드록실아미노, 실록산(디알킬실록산), 카르복사미드, 카르보네이트, 카르복시메틸, 카르바메이트, 카르복실레이트 에스테르, 티오에테르, 에틸렌 옥사이드 링커, 설파이드, 설포네이트, 설폰아미드, 설포네이트 에스테르, 티오포르마세탈(3'-S-CH₂-O-5'), 포르마세탈(3'-O-CH₂-O-5'), 옥심, 메틸렌이미노, 메티켄카르보닐아미노, 메틸렌메틸이미노(MMI, 3'-CH₂-N(CH₃)-O-5'), 메틸렌하이드라조, 메틸렌디메틸하이드라조, 메틸렌옥시메틸이미노, 에테르(C3'-O-C5'), 티오에테르(C3'-S-C5'), 티오아세트아미도(C3'-N(H)-C(=O)-CH₂-S-C5', C3'-O-P(O)-O-SS-C5', C3'-CH₂-NH-NH-C5', 3'-NHP(O)(OCH₃)-O-5' 및 3'-NHP(O)(OCH₃)-O-5' 및 혼합 N, O, S 및 CH₂ 성분 부분을 함유하는 비이온성 결합을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 예를 들어, 문헌[Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y.S. Sanghvi and P.D. Cook Eds. ACS Symposium Series 580; 챕터 3 및 4, (pp. 40-65)]을 참조하라. 바람직한 구현예는 메틸렌메틸이미노(MMI), 메틸렌카르보닐아미노, 아미드, 카르바메이트 및 에틸렌 옥사이드 링커를 포함한다.

당업자는 특정 예에서 비-가교 산소의 치환이 이웃하는 2'-OH에 의한 당간 결합의 분해 향상을 야기할 수 있고, 따라서, 다수 예에서 비-가교 산소의 변형은 2'-OH의 변형, 예를 들어, 이웃하는 당간 결합, 예를 들어, 아라비노스 당, 2'-O-알킬, 2'-F, LNA 및 ENA의 분해에 관여하지 않는 변형을 필요로 할 수 있다는 것을 잘 알고 있다.

바람직한 비-포스포디에스테르 당간 결합은 포스포로티오에이트, 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상의 거울상이성질체 과량의 Sp 이성질체를 갖는 포스포로티오에이트, 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상의 거울상이성질체 과량의 Rp 이성질체를 갖는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리오에스테르, 알킬-포스포네이트(예를 들어, 메틸-포스포네이트), 셀레노포스페이트, 포스포라미데이트(예를 들어, N-알킬포스포라미데이트), 및 보라노포스페이트를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 적어도 하나(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 이상 및 최대 모두 포함)의 변형 또는 비포스포디에스테르 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 적어도 하나(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 이상 및 최대 모두 포함)의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다.

포스페이트 링커 및 당이 뉴클레아제 저항성 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 서로게이트로 치환된 본 발명의 화합물이 또한 구성될 수 있다. 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 반복적으로 하전된 백본의 부재는 폴리음이온을 인식하는 단백질(예를 들어, 뉴클레아제)에 대한 결합을 감소시키는 것으로 사료된다. 다시, 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 일부 구현예에서, 염기가 중성 서로게이트 백본에 의해 테터링되는 변경을 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 예로는 모르폴리노, 사이클로부틸, 피롤리딘, 펩타이드 핵산(PNA), 아미노에틸글리실 PNA(aegPNA) 및 백본-연장 피롤리딘 PNA(bepPNA) 뉴클레오사이드 서로게이트가 포함된다. 바람직한 서로게이트는 PNA 서로게이트이다.

본원에 기재된 본 발명의 화합물은 하나 이상의 비대칭 중심을 함유하고, 이에 따라 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 및 절대 입체화학 측면에서 (R) 또는 (S)로서, 예컨대, 아미노산의 등의 경우와 같이 당 아노머의 경우, (D) 또는 (L)로서 규정될 수 있는 다른 입체이성질체 구성을 야기할 수 있다. 본원에 제공된 본 발명의 화합물에는 모든 그런한 가능한 이성질체, 뿐만 아니라 이들의 라세미 및 광학적으로 순수한 형태가 포함된다.

핵산 변형(말단 변형)

일부 구현예에서, 화합물의 안티센스 가닥의 5'-말단은 5'-비닐 포스포네이트 (VP)를 함유하지 않는다.

본 발명의 iRNA 제제의 말단은 변형될 수 있다. 그러한 변형은 하나의 말단 또는 양 말단에서일 수 있다. 예를 들어, iRNA의 3' 및/또는 5' 말단은 다른 작용성 분자 엔터티, 예컨대, 표지 모이어티, 예를 들어, 형광단(예를 들어, 피렌, TAMRA, 플루오레세인, Cy3 또는 Cy5 염료) 또는 보호기(예를 들어, 황, 규소, 붕소 또는 에스테르 기반)에 접합될 수 있다. 작용성 분자 엔터티는 포스페이트 기 및/또는 링커를 통해 당에 부착될 수 있다. 링커의 말단 원자는 포스페이트 기 또는 당의 C-3' 또는 C-5' O, N, S 또는 C 기의 연결 원자에 연결하거나 이를 치환할 수 있다. 대안적으로, 링커는 뉴클레오타이드 서로게이트(예를 들어, PNA)의 말단 원자에 연결하거나 이를 치환할 수 있다.

링커/포스페이트-작용성 분자 엔터티-링커/포스페이트 배열이 이중 가닥 올리고머 화합물의 두 가닥 사이에 삽입되는 경우, 이러한 배열은 헤어핀-타입 올리고머 화합물에서 헤어핀 루프에 대한 대체일 수 있다.

활성을 조절하는 데 유용한 말단 변형은 포스페이트 또는 포스페이트 유사체로의 iRNA의 5' 말단 변형을 포함한다. 소정의 구현예에서, iRNA의 5' 말단은 포스포릴화되거나 포스포릴 유사체를 포함한다. 예시적인 5'-포스페이트 변형은 RISC 매개 유전자 사일런싱과 상용성인 것들을 포함한다. 5'-종결 말단에서의 변형은 또한 피험자의 면역계를 자극하거나 억제하는 데 유용할 수 있다. 일부 구현예에서, 올리고머 화합물의 5'-말단은 변형

를 포함하고, 여기서 W, X 및 Y는 각각 독립적으로 O, OR(R은 수소, 알킬, 아릴임), S, Se, BR₃(R은 수소, 알킬, 아릴임), BH₃ ^-, C(즉, 알킬 기, 아릴 기 등), H, NR₂(R은 수소, 알킬, 아릴임), 또는 OR(R은 수소, 알킬 또는 아릴임)로 이루어진 군으로부터 선택되고; A 및 Z는 각각 독립적으로 각 경우에 부재, O, S, CH₂, NR(R은 수소, 알킬, 아릴임), 또는 선택적으로 치환된 알킬렌이고, 여기서 알킬렌의 백본은 내부적으로 및/또는 말단에서 O, S, SS 및 NR(R은 수소, 알킬, 아릴임) 중 하나 이상을 포함할 수 있고; n은 0 내지 2이다. 일부 구현예에서, n은 1 또는 2이다. A는 당의 5' 탄소에 연결된 산소를 치환하는 것으로 이해된다. n이 0일 때, W 및 Y는 이들이 부착되는 P와 함께 선택적으로 치환된 5원 내지 8원 헤테로사이클릭을 형성할 수 있고, 여기서 W 및 Y는 각각 독립적으로 O, S, NR' 또는 알킬렌이다. 바람직하게는, 헤테로사이클릭은 아릴 또는 헤테로아릴로 치환된다. 일부 구현예에서, 5'-말단 뉴클레오타이드의 C5'에서 수소 중 하나 또는 둘 모두는 할로겐, 예를 들어, F로 치환된다.

예시적인 5'-변형은 5'-모노포스페이트((HO)₂(O)P-O-5'); 5'-디포스페이트 ((HO)₂(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-트리포스페이트((HO)₂(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-모노티오포스페이트(포스포로티오에이트; (HO)₂(S)P-O-5'); 5'-모노디티오포스페이트(포스포로디티오에이트; (HO)(HS)(S)P-O-5'), 5'-포스포로티올레이트((HO)₂(O)P-S-5'); 5'-알파-티오트리포스페이트; 5'-베타-티오트리포스페이트; 5'-감마-티오트리포스페이트; 5'-포스포라미데이트((HO)₂(O)P-NH-5', (HO)(NH₂)(O)P-O-5')를 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 다른 5'-변형은 5'-알킬포스포네이트(R(OH)(O)P-O-5', R=알킬, 예를 들어, 메틸, 에틸, 이소프로필, 프로필 등임), 5'-알킬에테르포스포네이트(R(OH)(O)P-O-5'(R=알킬에테르, 예를 들어, 메톡시메틸(CH₂OMe), 에톡시메틸 등임)을 포함한다. 다른 예시적인 5'-변형은 Z가 적어도 1회 선택적으로 치환된 알킬인 경우, 예를 들어, ((HO)₂(X)P-O[-(CH₂)_a-O-P(X)(OH)-O]_b-5', ((HO)₂(X)P-O[-(CH₂)_a-P(X)(OH)-O]_b-5', ((HO)2(X)P-[-(CH₂)_a-O-P(X)(OH)-O]_b-5'; 디알킬 말단 포스페이트 및 포스페이트 모방체: HO[-(CH₂)_a-O-P(X)(OH)-O]_b-5', H₂N[-(CH₂)_a-O-P(X)(OH)-O]_b-5', H[-(CH₂)_a-O-P(X)(OH)-O]_b-5', Me₂N[-(CH₂)_a-O-P(X)(OH)-O]_b-5', HO[-(CH₂)_a-P(X)(OH)-O]_b-5', H₂N[-(CH₂)_a-P(X)(OH)-O]_b-5', H[-(CH₂)_a-P(X)(OH)-O]_b-5', Me₂N[-(CH₂)_a-P(X)(OH)-O]_b-5'를 포함하고, 여기서 a 및 b는 각각 독립적으로 1 내지 10이다. 다른 구현예는 BH₃, BH₃ ^- 및/또는 Se로의 산소 및/또는 황의 치환을 포함한다.

말단 변형은 또한 분포를 모니터링하는 데 유용할 수 있고, 그러한 경우에 첨가될 바람직한 기는 형광단, 예를 들어, 플루오레세인 또는 Alexa 염료, 예를 들어, Alexa 488을 포함한다. 말단 변형은 또한 흡수를 향상시키는 데 유용할 수 있으며, 이에 유용한 변형은 타겟화 리간드를 포함한다. 말단 변형은 또한 또 다른 모이어티에 올리고뉴클레오타이드를 가교시키는 데 유용할 수 있으며; 이에 유용한 변형은 미토마이신 C, 프소라렌, 및 이의 유도체를 포함한다.

열적 탈안정화 변형

본 발명의 화합물, 예컨대, iRNA 또는 dsRNA 제제는 안티센스 가닥의 씨드 영역(즉, 안티센스 가닥의 5'-말단의 2번 내지 8번 위치)에 반대되는 부위에서 센스 가닥에 열적 탈안정화 변형을 도입함으로써 iRNA 듀플렉스의 해리 또는 용융 경향성을 증가시켜(듀플렉스 회합의 자유 에너지를 감소시켜) RNA 간섭에 대해 최적화될 수 있다. 상기 변형은 듀플렉스가 안티센스 가닥의 씨드 영역에서 해리하거나 용융하는 경향성을 증가시킬 수 있다.

열적 탈안정화 변형에는 무염기 변형; 대항하는 가닥에서 대항하는 뉴클레오타이드와의 미스매치; 및 당 변형, 예컨대 2'-데옥시 변형 또는 비사이클릭 뉴클레오타이드, 예를 들어 비잠김 핵산(UNA) 또는 글리세롤 핵산(GNA)이 포함될 수 있다.

예시되는 무염기 변형은 다음과 같다:

예시되는 당 변형은 다음과 같다:

용어 "UNA"는 비잠김 비사이클릭 핵산을 나타내며, 임의의 당 결합이 제거되어 비잠김 "당" 잔기를 형성한다. 일 예에서, UNA는 또한 C1'-C4' 간 결합(즉, C1' 및 C4' 탄소 간 공유 탄소-산소-탄소 결합)이 제거된 단량체를 포괄한다. 또 다른 예에서, 당의 C2'-C3' 결합(즉, C2' 및 C3' 탄소 간 공유 탄소-탄소 결합)이 제거된다(문헌[Mikhailov et. al., Tetrahedron Letters, 26 (17): 2059 (1985); 및 Fluiter et al., Mol. Biosyst., 10: 1039 (2009)] 참고, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 비사이클릭 유도체는 왓슨-크릭 쌍 형성에 영향을 미치지 않고 더 큰 백본 유연성을 제공한다. 비사이클릭 뉴클레오타이드는 2'-5' 또는 3'-5' 결합을 통해 연결될 수 있다.

용어 'GNA'는 DNA 또는 RNA와 유사하지만 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 반복 글리세롤 단위로 이루어진다는 점에서 그 "백본"의 조성이 상이한 중합체인 글리콜 핵산을 나타낸다:

열적 탈안정화 변형은 dsRNA 듀플렉스 내 대항하는 가닥에서 열적 탈안정화 뉴클레오타이드 및 대항하는 뉴클레오타이드 간 미스매치(즉, 비상보적 염기쌍)일 수 있다. 예시적인 미스매치 염기쌍에는 G:G, G:A, G:U, G:T, A:A, A:C, C:C, C:U, C:T, U:U, T:T, U:T, 또는 이들의 조합이 포함된다. 당분야에 공지된 다른 미스매치 염기쌍도 본 발명에 적합하다. 미스매치는 천연 생성 뉴클레오타이드 또는 변형 뉴클레오타이드인 뉴클레오타이드 간에 발생할 수 있다, 즉 미스매치 염기쌍 형성은 뉴클레오타이드의 리보스 당의 변형과 무관하게 각각의 뉴클레오타이드로부터의 뉴클레오베이스 간에 발생할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 화합물, 예컨대, siRNA 또는 iRNA 제제는 2'-데옥시 뉴클레오베이스인 미스매치 쌍 형성에 1개 이상의 뉴클레오베이스를 함유한다; 예를 들어, 2'-데옥시 뉴클레오베이스가 센스 가닥에 있다.

무염기 뉴클레오타이드, 비사이클릭 뉴클레오타이드 변형(UNA 및 GNA 포함), 및 미스매치 변형의 더 많은 예는 WO 2011/133876에 상세히 기재되어 있으며, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

열적 탈안정화 변형에는 또한 대항하는 염기와 수소 결합을 형성하는 능력이 감소되거나 폐지된 범(universal) 염기, 및 포스페이트 변형이 포함될 수 있다.

반대 가닥에서의 염기와 수소 결합을 형성하는 능력이 손상되거나 완전 폐지된 뉴클레오베이스 변형이 WO 2010/0011895에 기재된 dsRNA 듀플렉스의 중심 영역의 탈안정화에 대해 평가되었으며, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 예시적인 뉴클레오베이스 변형은 다음과 같다:

천연 포스포디에스테르 결합 대비 dsRNA 듀플렉스의 열적 안정성을 감소시키는 것으로 공지된 예시적인 포스페이트 변형은 다음과 같다:

일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 2'-5' 결합(2'-H, 2'-OH 및 2'-OMe 포함 및 P=O 또는 P=S 포함)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2'-5' 결합 변형은 뉴클레아제 저항성을 촉진하기 위해 또는 안티센스 가닥에 대한 센스의 결합을 억제하기 위해 이용될 수도 있고, 또는 RISC에 의한 센스 가닥 활성화를 회피하기 위해 센스 가닥의 5' 말단에서 이용될 수 있다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 화합물은 L 당(예를 들어, 2'-H, 2'-OH 및 2'-OMe 포함 L 리보스, L-아라비노스)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 L 당 변형은 뉴클레아제 저항성을 촉진하기 위해 또는 안티센스 가닥에 대한 센스의 결합을 억제하기 위해 이용될 수도 있고, 또는 RISC에 의한 센스 가닥 활성화를 회피하기 위해 센스 가닥의 5' 말단에서 이용될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 iRNA 제제는 담체를 통해 리간드에 접합되며, 담체는 사이클릭기 또는 비-사이클릭기일 수 있으며; 바람직하게는, 사이클릭기는 피로릴디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔란, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸릴 및 데칼린으로부터 선택되며; 바람직하게는, 비-사이클릭기는 세리놀 백본 또는 디에탄올아민 백본으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 iRNA 제제의 적어도 하나의 가닥은 5' 인산화되거나 5' 프라임 말단에 포스포릴 유사체가 포함된다. 5'-포스페이트 변형에는 RISC 매개 유전자 사일런싱과 상용성인 것들이 포함된다. 적합한 변형에는 5'-모노포스페이트((HO)₂(O)P-O-5'); 5'-디포스페이트((HO)₂(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-트리포스페이트((HO)₂(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-구아노신 캡(7-메틸화 또는 비-메틸화)(7m-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-아데노신 캡(Appp), 및 임의의 변형 또는 비변형 뉴클레오타이드 캡 구조(N-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-모노티오포스페이트(포스포로티오에이트; (HO)₂(S)P-O-5'); 5'-모노디티오포스페이트(포스포로디티오에이트; (HO)(HS)(S)P-O-5'), 5'-포스포로티올레이트((HO)2(O)P-S-5'); 산소/황이 대체된 모노포스페이트, 디포스페이트 및 트리포스페이트의 임의의 추가 조합(예를 들어, 5'-알파-티오트리포스페이트, 5'-감마-티오트리포스페이트 등), 5'-포스포로아미데이트((HO)₂(O)P-NH-5', (HO)(NH₂)(O)P-O-5'), 5'-알킬포스포네이트(R=알킬=메틸, 에틸, 이소프로필, 프로필 등, 예를 들어 RP(OH)(O)-O-5'-, 5'-알케닐포스포네이트(즉, 비닐, 치환 비닐), (OH)₂(O)P-5'-CH2-), 5'-알킬에테르포스포네이트(R=알킬에테르=메톡시메틸(MeOCH2-), 에톡시메틸 등, 예를 들어 RP(OH)(O)-O-5'-)가 포함된다.

타겟 유전자

제한 없이, siRNA를 위한 타겟 유전자는 원치 않는 세포 증식을 촉진하는 유전자, 성장 인자 유전자, 성장 인자 수용체 유전자, 키나제를 발현하는 유전자, 어댑터 단백질 유전자, G 단백질 수퍼 패밀리 분자를 코딩하는 유전자, 전사 인자를 코딩하는 유전자, 혈관신생을 매개하는 유전자, 바이러스 유전자, 바이러스 복제에 필요한 유전자, 바이러스 기능을 매개하는 세포 유전자, 세균성 병원체의 유전자, 아메바성 병원체의 유전자, 기생성 병원체의 유전자, 진균 병원체의 유전자, 원치 않는 면역 반응을 매개하는 유전자, 통증의 프로세싱을 매개하는 유전자, 신경 질환을 매개하는 유전자, 이형접합의 손실로 특성규명되는 세포에서 발견되는 대립 유전자, 또는 다형성 유전자의 하나의 대립 유전자를 포함하나, 이로 한정되지 않는다.

siRNA를 위한 특정의 예시적인 타겟 유전자는 PCSK-9, ApoC3, AT3, AGT, ALAS1, TMPR, HAO1, AGT, C5, CCR-5, PDGF 베타 유전자; Erb-B 유전자, Src 유전자; CRK 유전자; GRB2 유전자; RAS 유전자; MEKK 유전자; JNK 유전자; RAF 유전자; Erk1/2 유전자; PCNA(p21) 유전자; MYB 유전자; c-MYC 유전자; JUN 유전자; FOS 유전자; BCL-2 유전자; 사이클린 D 유전자; VEGF 유전자; EGFR 유전자; 사이클린 A 유전자; 사이클린 E 유전자; WNT-1 유전자; 베타-카테닌 유전자; c-MET 유전자; PKC 유전자; NFKB 유전자; STAT3 유전자; 서바이빈 유전자; Her2/Neu 유전자; 토포이소머라제 I 유전자; 토포이소머라제 II 알파 유전자; p73 유전자; p21(WAF1/CIP1) 유전자, p27(KIP1) 유전자; PPM1D 유전자; 카베올린 I 유전자; MIB I 유전자; MTAI 유전자; M68 유전자; 종양 억제 유전자; p53 유전자; DN-p63 유전자; pRb 종양 억제 유전자; APC1 종양 억제 유전자; BRCA1 종양 억제 유전자; PTEN 종양 억제 유전자; MLL 융합 유전자, 예를 들어, MLL-AF9, BCR/ABL 융합 유전자; TEL/AML1 융합 유전자; EWS/FLI1 융합 유전자; TLS/FUS1 융합 유전자; PAX3/FKHR 융합 유전자; AML1/ETO 융합 유전자; 알파 v-인테그린 유전자; Flt-1 수용체 유전자; 튜불린 유전자; 인간 유두종 바이러스 유전자, 인간 유두종 바이러스 복제에 필요한 유전자, 인간 면역결핍 바이러스 유전자, 인간 면역결핍 바이러스 복제에 필요한 유전자, A형 간염 바이러스 유전자, A형 간염 바이러스 복제에 필요한 유전자, B형 간염 바이러스 유전자, B형 간염 바이러스 복제에 필요한 유전자, C형 간염 바이러스 유전자, C형 간염 바이러스 복제에 필요한 유전자, D형 간염 바이러스 유전자, D형 간염 바이러스 복제에 필요한 유전자, E형 간염 바이러스 유전자, E형 간염 바이러스 복제에 필요한 유전자, F형 간염 바이러스 유전자, F형 간염 바이러스 복제에 필요한 유전자, G형 간염 바이러스 유전자, G형 간염 바이러스 복제에 필요한 유전자, H형 간염 바이러스 유전자, H형 간염 바이러스 복제에 필요한 유전자, 호흡기 세포융합 바이러스 유전자, 호흡기 세포융합 바이러스 복제에 필요한 유전자, 단순 헤르페스 바이러스 유전자, 단순 헤르페스 바이러스 복제에 필요한 유전자, 헤르페스 거대세포바이러스 유전자, 헤르페스 거대세포바이러스 복제에 필요한 유전자, 헤르페스 엡스타인 바 바이러스 유전자, 헤르페스 엡스타인 바 바이러스 복제에 필요한 유전자, 카포시 육종-관련 헤르페스 바이러스 유전자, 카포시 육종-관련 헤르페스 바이러스 복제에 필요한 유전자, JC 바이러스 유전자, JC 바이러스 복제에 필요한 유전자, 믹소 바이러스 유전자, 믹소 바이러스 유전자 복제에 필요한 유전자, 리노바이러스 유전자, 리노바이러스 복제에 필요한 유전자, 코로나바이러스 유전자, 코로나바이러스 복제에 필요한 유전자, 웨스트 나일 바이러스 유전자, 웨스트 나일 바이러스 복제에 필요한 유전자, 세인트 루이스 뇌염 유전자, 세인트 루이스 뇌염 복제에 필요한 유전자, 진드기-매개 뇌염 바이러스 유전자, 진드기-매개 뇌염 바이러스 복제에 필요한 유전자, 무레이 밸리 뇌염 바이러스 유전자, 무레이 밸리 뇌염 바이러스 복제에 필요한 유전자, 뎅기 바이러스 유전자, 뎅기 바이러스 유전자 복제에 필요한 유전자, 시미안 바이러스 40 유전자, 시미안 바이러스 40 복제에 필요한 유전자, 인간 T 세포 림프영양성 바이러스 유전자, 인간 T 세포 림프영양성 바이러스 복제에 필요한 유전자, 몰로니-뮤린 백혈병 바이러스 유전자, 몰로니-뮤린 백혈병 바이러스 복제에 필요한 유전자, 뇌척수심근염 바이러스 유전자, 뇌척수심근염 바이러스 복제에 필요한 유전자, 홍역 바이러스 유전자, 홍역 바이러스 복제에 필요한 유전자, 수두 대상포진 바이러스 유전자, 수두 대상포진 바이러스 복제에 필요한 유전자, 아데노바이러스 유전자, 아데노바이러스 복제에 필요한 유전자, 황열 바이러스 유전자, 황열 바이러스 복제에 필요한 유전자, 폴리오바이러스 유전자, 폴리오바이러스 복제에 필요한 유전자, 폭스바이러스 유전자, 폭스바이러스 복제에 필요한 유전자, 말라리아원충 유전자, 말라리아원충 유전자 복제에 필요한 유전자, 마이코박테륨 울세란스 유전자, 마이코박테륨 울세란스 복제에 필요한 유전자, 마이코박테륨 튜버큐로시스 유전자, 마이코박테륨 튜버큐로시스 복제에 필요한 유전자, 마이코박테륨 레프라에 유전자, 마이코박테륨 레프라에 복제에 필요한 유전자, 스타필로코쿠스 아우레우스 유전자, 스타필로코쿠스 아우레우스 복제에 필요한 유전자, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 유전자, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 복제에 필요한 유전자, 스트렙토코쿠스 피오게네스 유전자, 스트렙토코쿠스 피오게네스 복제에 필요한 유전자, 클라미디아 뉴모니아에 유전자, 클라미디아 뉴모니아에 복제에 필요한 유전자, 마이코플라스마 뉴모니아에 유전자, 마이코플라스마 뉴모니아에 복제에 필요한 유전자, 인테그린 유전자, 셀렉틴 유전자, 보체계 유전자, 케모카인 유전자, 케모카인 수용체 유전자, GCSF 유전자, Gro1 유전자, Gro2 유전자, Gro3 유전자, PF4 유전자, MIG 유전자, 프로-혈소판 염기성 단백질 유전자, MIP-1I 유전자, MIP-1J 유전자, RANTES 유전자, MCP-1 유전자, MCP-2 유전자, MCP-3 유전자, CMBKR1 유전자, CMBKR2 유전자, CMBKR3 유전자, CMBKR5v, AIF-1 유전자, I-309 유전자, 이온 통로의 성분으로의 유전자, 신경전달물질 수용체로의 유전자, 신경전달물질 리간드로의 유전자, 아밀로이드-패밀리 유전자, 프레세닐린 유전자, HD 유전자, DRPLA 유전자, SCA1 유전자, SCA2 유전자, MJD1 유전자, CACNL1A4 유전자, SCA7 유전자, SCA8 유전자, 이형접합(LOH) 세포의 손실에서 발견되는 대립 유전자, 다형성 유전자의 하나의 대립 유전자 및 이들의 조합을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.

이형접합(LOH)의 손실은 LOH의 부위에서 서열, 예를 들어, 유전자에 대한 반접합성을 야기할 수 있다. 이는 정상 세포와 질병-상태 세포, 예를 들어, 암 세포 간에 상당한 유전적 차이를 초래할 수 있으며, 정상 세포와 질병-상태 세포, 예를 들어, 암 세포 간에 유용한 차이를 제공한다. 이러한 차이는 유전자 또는 다른 서열이 이배체 세포에서는 이형접합성이지만 LOH를 갖는 세포에서는 반접합성이기 때문에 발생할 수 있다. LOH의 영역은 흔히 손실로 원치 않는 증식을 촉진하는 유전자, 예를 들어, 종양 억제 유전자, 및 예를 들어 다른 유전자, 일부 경우에 정상 기능, 예를 들어, 성장에 필수적인 유전자를 포함하는 다른 서열을 포함할 것이다. 본 발명의 방법은, 부분적으로, 본 발명의 조성물로 필수 유전자의 하나의 대립 유전자의 특이적 조절에 의존한다.

소정의 구현예에서, 본 발명은 마이크로-RNA를 조절하는 본 발명의 화합물을 제공한다.

타겟화 CNS

일부 구현예에서, 본 발명은 조발성 가족성 알츠하이머병을 위한 APP, 척수소뇌성 실조증 2 및 ALS를 위한 ATXN2, 및 근위축성 축삭 경화증 및 전측두엽 치매를 위한 C9orf72를 타겟화하는 화합물을 제공한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 ALS를 위한 TARDBP, 전측두엽 치매를 위한 MAPT(Tau), 및 헌팅턴병을 위한 HTT를 타겟화하는 화합물을 제공한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 파킨슨병을 위한 SNCA, ALS를 위한 FUS, 척수소뇌성 실조증 3를 위한 ATXN3, SCA1을 위한 ATXN1, SCA7 및 SCA8를 위한 유전자, DRPLA를 위한 ATN1, XLMR을 위한 MeCP2, 프라이온병, 퇴행성 CNS 장애: 라포라병을 위한 PRNP, DM1(CNS 및 골격근)을 위한 DMPK, 및 hATTR(CNS, 안구 및 전신)을 위한 TTR을 타겟화하는 화합물을 제공한다.

척수소뇌성 실조증은 유전성 뇌-기능 장애이다. SCA1-8과 같이 주로 유전되는 형태의 척수소뇌성 실조증은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 장애이다. 예시적인 타겟은 SCA2, SCA3, 및 SCA1을 포함한다.

SCA2를 위한 ATXN2 타겟화

척수소뇌성 실조증 2(SCA2)는 진행성 실조증으로서 두 번째로 가장 흔한 SCA이다. 이러한 타겟과 관련된 또 다른 질환은 근위축성 축삭 경화증(ALS)이다. 이러한 질환은 쇠약해지고 결국에는 치명적이 되는 질환-조절 요법이 없는 질환이다. SCA의 유병률은 100,000명 당 2명 내지 6명이고; ATXN2는 전 세계 SCA 인구의 15%를 유발하고, 일부 국가, 특히 쿠바(100,000명 당 40명)에서 훨씬 더 많은 SCA 인구를 유발하고 있다. ATXN2를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어 ATXN2에서 코딩 CAG 반복 확장은 척수, 뇌간 또는 소뇌와 같은 조직에서 가족성 및 산발성 SCA 및 ALS에서 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 ATXN2의 상염색체 우성 코딩 CAG 확장이 독성의 미스폴딩된 단백질의 발현 및 푸르키네 세포 및 뉴런 사멸을 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 ATXN2 mRNA의 70% 녹다운(KD)으로 나타났으며; mATXN2 마우스 KD POC가 입증되었다. 안전성과 관련하여, mATXN2 녹아웃(KO) 마우스는 건강한 것으로 보고되었다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF CAG mRNA 및 펩타이드 반복 단백질을 포함한다.

SCA3를 위한 ATXN3 타겟화

척수소뇌성 실조증 3(SCA3)는 진행성 실조증으로서 전 세계에서 가장 흔한 SCA이다. 이러한 질환은 쇠약해지고 결국에는 치명적이 되는 질환-조절 요법이 없는 질환이다. 이는 SCA의 가장 흔한 원인이며, SCA의 유병률은 100,000명 당 2명 내지 6명이고; ATXN3은 미국에서 SCA 인구의 21%를 유발하고, 유럽, 특히, 포르투갈에서 훨씬 더 많이 발생한다. ATXN3 타겟화는 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, ATXN3에서 코딩 CAG 반복 확장은 척수, 뇌간 또는 소뇌와 같은 조직에 가족성 및 산발성 SCA에서 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 ATXN3의 상염색체 우성 코딩 CAG 확장이 독성의 미스폴딩된 단백질의 발현 및 푸르키네 세포 및 뉴런 사멸을 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 ATXN3 mRNA의 70% KD로 나타났으며; mATXN3 마우스 KD POC가 입증되었다. 안전성과 관련하여, mATXN3 KO 마우스는 건강한 것으로 보고되었다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF CAG mRNA 및 펩타이드 반복 단백질을 포함한다.

SCA1를 위한 ATXN1 타겟화

척수소뇌성 실조증 1(SCA1)은 진행성 실조증으로서 1993년에 발견된 첫 번째 SCA 유전자이다. 이러한 질환은 쇠약해지고 결국에는 치명적이 되는 질환-조절 요법이 없는 질환이다. SCA의 유병률은 100,000명 당 2명 내지 6명이고; ATXN1은 미국과 전 세계에서 SCA 인구의 6%를 유발하며, 일부 국가(일본에서 25%), 특히 폴란드(64%) 및 시베리아(100%)에서는 훨씬 더 많다. ATXN1을 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어 ATXN1에서 코딩 CAG 반복 확장은 척수, 뇌간 또는 소뇌와 같은 조직에 가족성 및 산발성 SCA에서 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 ATXN1의 상염색체 우성 코딩 CAG 확장이 독성의 미스폴딩된 단백질의 발현 및 푸르키네 세포 및 뉴런 사멸을 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 ATXN1 mRNA의 70% KD로 나타났으며; mATXN1 마우스 POC가 입증되었다. 안전성과 관련하여, mATXN1 KO 마우스는 건강한 것으로 보고되었다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF CAG mRNA 및 펩타이드 반복 단백질을 포함한다.

SCA7를 위한 ATXN7 타겟화

척수소뇌성 실조증 7(SCA7)은 진행성 운동 실조와 망막 변성을 유발한다. 이러한 질환은 쇠약해지고 결국에는 치명적인 망막 및 소뇌 장애가 되는 질환-조절 요법이 없는 질환이다. SCA의 유병률은 100,000명 당 2명 내지 6명이고; ATXN7는 전 세계 SCA 인구의 5%를 유발하고, 일부 국가, 특히 남아프리카에서는 훨씬 더 많다. ATXN7을 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, ATXN7에서 코딩 CAG 반복 확장은 척수, 뇌간, 소뇌 또는 망막과 같은 조직에 가족성 및 산발성 SCA에서 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 ATXN1의 상염색체 우성 코딩 CAG 확장이 독성의 미스폴딩된 단백질의 발현, 추체-간체 이영양증 유발, 및 푸르키네 세포 및 뉴런 치사를 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 척수강내(IT) 및 유리체내(IVT) 투여를 통해 ATXN1 mRNA의 70% KD로 나타났다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF CAG mRNA 및 펩타이드 반복 단백질을 포함한다.

SCA8를 위한 ATXN8 타겟화

척수소뇌성 실조증 8(SCA8)은 진행성 신경퇴행성 실조증으로서 ATXN8에서 CTG 반복 확장에 의해 초래된다. 이러한 질환은 쇠약해지고 결국에는 치명적이 되는 질환-조절 요법이 없는 질환이다. SCA의 유병률은 100,000명 당 2명 내지 6명이고; ATXN8은 전 세계 SCA 인구의 3%를 유발하고, 일부 국가, 특히 필란드에서는 훨씬 더 많다. ATXN8을 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, ATXN8에서 코딩 CTG 반복 확장은 척수, 뇌간 또는 소뇌와 같은 조직에 가족성 및 산발성 SCA에서 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 ATXN8의 상염색체 우성 코딩 CTG 확장이 독성의 미스폴딩된 단백질의 발현, 푸르키네 세포 유발 및 뉴런 치사를 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 ATXN8 mRNA의 70% KD로 나타났다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF CTG mRNA 및 펩타이드 반복 단백질을 포함한다.

SCA6을 위한 CACNA1A 타겟화

척수소뇌성 실조증 6(SCA6)은 진행성 실조증이다. 이러한 질환은 쇠약해지고 결국에는 치명적이 되는 질환-조절 요법이 없는 질환이다. SCA의 유병률은 100,000명 당 2명 내지 6명이고; CACNA1A는 전 세계 SCA 인구의 15%를 유발한다. CACNA1A을 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, CACNA1A에서 코딩 CAG 반복 확장은 척수, 뇌간 또는 소뇌와 같은 조직에 가족성 및 산발성 SCA에서 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 CACNA1A의 상염색체 우성 코딩 CAG 확장이 독성의 미스폴딩된 단백질의 발현 및 푸르키네 세포 및 뉴런 사멸을 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 CACNA1A CAG 발현의 70% KD로 나타났다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF CAG mRNA 및 펩타이드 반복 단백질을 포함한다.

유전성 폴리글루타민 장애에 대한 예시적인 타겟은 헌팅턴병(HD)을 포함한다.

헌팅턴병을 위한 HTT 타겟화

헌팅턴 돌연변이는 진행성 CNS 퇴행성 질환인 HD를 유발한다. 이러한 질환은 쇠약해지고 결국에는 치명적이 되는 질환-조절 요법이 없는 질환이다. HD의 유병률은 전 세계에서 100,000명 당 5명 내지 10명이며, 특정 국가, 특히 베네수엘라에서는 훨씬 더 흔하다. HTT를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, HTT에서 코딩 CAG 반복 확장은 선조체, 또는 피질과 같은 조직에 가족성 및 산발성 HD에서 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 HTT의 상염색체 우성 코딩 CAG 확장이 독성의 미스폴딩 단백질의 발현 및 뉴런 사멸을 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 HTT CAG 확장에서만 70% 녹다운(KD)으로 나타났으며; 뮤린 POC가 입증되었다. 안전성과 관련하여, 마우스에서 HTT의 KO는 치명적일 수 있고; 인간에서 KD가 입증되었다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF mRNA 및 펩타이드 반복 단백질을 포함한다.

DRPLA를 위한 ATN1 타겟화

아트로핀 1 돌연변이는 HD와 유사한 진행성 척수소뇌 장애인 치상핵적핵-담창구시상하부위축증(dentatorubral-pallidoluysian atrophy: DRPLA)을 유발한다. 이러한 질환은 쇠약해지고 결국에는 치명적이 되는 질환-조절 요법이 없는 질환이다. DRPLA의 유병률은 일본에서 1,000,000명 당 2명 내지 7명이다. ATN1을 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, ATN1에서 코딩 CAG 반복 확장은 척수, 뇌간, 소뇌, 또는 피질과 같은 조직에 가족성 및 산발성 SCA에서 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 ATN1의 상염색체 우성 코딩 CAG 확장이 독성의 미스폴딩 단백질의 발현 및 뉴런 사멸을 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 독성 ATN1의 70% KD로 나타났다. 안전성과 관련하여, ATN1 KO 마우스는 건강한 것으로 보고되었다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF CAG mRNA 및 펩타이드 반복 단백질을 포함한다.

척수 및 숨뇌근육 위축증을 위한 AR 타겟화

안드로겐 수용체 돌연변이는 척수 및 숨뇌근육 위축증(SBMA, 케네디병), 진행성 근육 소모성 질환 및 기타 질환을 유발한다. 이러한 질환은 쇠약해지고 결국에는 치명적이 되는 질환-조절 요법이 없는 질환이다. SBMA의 유병률은 남성 100,000명 당 2명이고; 여성은 경증의 표현형을 갖는다. AR을 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, AR에서 코딩 CAG 반복 확장은 척수, 또는 뇌간과 같은 조직에 가족성 SBMA에서 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 AR의 X-연관 코딩 CAG 확장이 독성 증가-또는-기능 및 운동 뉴런 치사를 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 AR의 70% KD로 나타났다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF CAG mRNA 및 펩타이드 반복 단백질을 포함한다.

프리드리히 실조증을 위한 FXN 타겟화

FXN의 열성 기능 상실 GAA 확장은 진행성 퇴행성 실조증인 프리드리히 실조증(FA)을 유발한다. 이러한 질환은 쇠약해지고 결국에는 치명적이 되는 질환-조절 요법이 없는 질환이다. FA의 유병률은 전세계에서 100,000명 당 2명이다. FXN을 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, FXN에서 인트론 GAA 반복 확장은 척수, 소뇌, 또는 아마도 망막 및 심장과 같은 조직에 가족성 FA에서 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 FXN의 상염색체 열성 비-코딩 FAA 확장이 중요한 미토콘드리아 단백질인 FXN의 발현 감소를 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 FXN 인트론 GAS 확장의 70% KD로 나타났다. 안전성과 관련하여, 인트론 GAA의 KD는 마우스에서 안전하고 효과적이다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF mRNA 및 펩타이드 반복 단백질을 포함한다.

FXTAS를 위한 FMR1 타겟화

성인의 운동실조 및 인지 상실의 진행성 장애인 취약 X-관련 떨림/실조 증후군(FXTAS)은 FMR1 과발현에 의해 유발된다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 쇄약해지는 질환이다. FMR1 순열의 유병률은 남성 500명 중 1명이다. FMR1을 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, FMR1에서 코딩 CCG 반복 확장 선돌연변이는 척수, 소뇌, 또는 피질과 같은 조직에서 FXTAS로 발견되었다 이러한 타겟화의 기전은 FMR1의 X-연관 코딩 CCG 확장이 독성 mRNA를 유발했기 때문일 수 있다. 효능은 독성 mRNA의 70% KD로 나타났다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF mRNA 및 펩타이드 반복 단백질을 포함한다.

취약 X 증후군을 위한 FMR1의 상류 타겟화

진행성 정신지체 장애인 취약 X 증후군(FRAXA)은 FMR1의 상류 mRNA를 타겟화함으로써 치료될 수 있다. 이러한 질환은 쇠약해지는 질환-조절 요법이 없는 질환이다. FRAXA의 유병률은 남성 4,000명 당 1명, 여성 8,000명 당 1명이다. FMR1을 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, FMR1에서 코딩 CCG 반복 확장은 CNS와 같은 조직에서 FRAXA에 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 FMR1의 X-연관 코딩 CCG 확장이 LOF를 유발하고; 정상 FMR1이 핵으로부터 특이적 mRNA를 운반하는 기능을 하기 때문일 수 있다. 효능은 독성 mRNA의 70% KD로 나타났다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF mRNA 및 펩타이드 반복 단백질을 포함한다.

우성 유전 근위축성 축삭 경화증은 질환-조절 요법이 없는 파괴적 장애이다. 예시적인 타겟은 C9orf72, ATXN2(또한 SCA2 유발), 및 MAPT를 포함한다.

ALS를 위한 C9orf72 타겟화

C9orf72는 근위축성 축삭 경화증(ALS) 및 전측두엽 치매(FTD)의 가장 흔한 원인이다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 운동 뉴런의 치명적인 장애이다. ALS의 유병률은 100,000명 당 2명 5명이고(10%는 가족성); C9orf72는 미국과 유럽에서 가족성 ALS의 39% 및 산발성 ALS의 7%를 유발한다. C9orf72를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, 헥사-뉴클레오타이드 확장은 상위 및 하위 운동 뉴런(ALS의 경우); 또는 피질(FTD의 경우)과 같은 조직에 가족성 및 산발성 ALS에서 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 상염색체 우성 헥사-뉴클레오타이드 확장이 독성 디펩타이드 반복 단백질의 반복-관련 비-AUG-의존 번역 및 뉴런 치사를 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 C9orf72의 70% KD로 나타났다. 안전성과 관련하여, C9orf72의 이형접합 LOF 돌연변이는 인간과 마우스에서 안전한 것으로 보인다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF 헥사-뉴클레오타이드 반복 mRNA 및 디펩타이드 반복 단백질을 포함한다.

ALS를 위한 TARDBP 타겟화

TARDBP 돌연변이는 ALS 및 전측두엽 치매(FTD)를 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 운동 뉴런의 치명적인 장애이다. ALS의 유병률은 100,000명 당 2명 내지 5명이고(10%는 가족성); TARDBP는 가족성 ALS의 5% 및 산발성 ALS의 1.5%를 유발한다. TARDBP를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, 돌연변이는 상위 및 하위 운동 뉴런(ALS의 경우); 또는 피질(FTD의 경우)과 같은 조직에 가족성 및 산발성 ALS에서 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 상염색체 우성 TRDBP 돌연변이가 독성 TRDBP 단백질 및 뉴런 치사를 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 TARDBP 돌연변이체 대립유전자의 70% KD로 나타났다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF 단백질을 포함한다.

ALS를 위한 FUS 타겟화

FUS 돌연변이는 ALS 및 FTD를 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 운동 뉴런의 치명적인 장애이다. ALS의 유병률은 100,000명 당 2명 내지 5명이고(10%는 가족성); FUS는 가족성 ALS의 5%를 유발하고; FUS 포함은 산발성 ALS에서 흔히 발견된다. FUS를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, 돌연변이는 ALS의 경우 상위 및 하위 운동 뉴런과 같은 조직에 가족성 ALS에서 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 상염색체 우성 FUS 돌연변이가 비정상적인 단백질 폴딩 및 뉴런 치사를 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 FUS 돌연변이체 대립유전자의 70% KD로 나타났다. 안전성과 관련하여, KO 마우스는 분투적이었지만 생존했고, ADHD 표현형을 가졌다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF 단백질을 포함한다.

ALS를 위한 SOD1 타겟화

SOD1의 우성 및 열성 돌연변이는 ALS를 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 운동 뉴런의 치명적인 장애이다. ALS의 유병률은 100,000명 당 2명 5명이고(10%는 가족성); SOD1은 가족성 ALS의 5% 내지 20%를 유발한다. SOD1을 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, 다수의 SOD1 돌연변이는 ALS의 경우 상위 및 하위 운동 뉴런과 같은 조직에 가족성으로 AD 및 AR ALS와 관련이 있다. 이러한 타겟화의 효능은 돌연변이-특이적 KD를 필요로 할 수 있다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 마이오마커는 돌연변이-특이적일 수 있다.

우성 유전 전측두엽 치매 및 진행성 책상 마비. 타겟은 MAPT이 AD, 또는 C9orf72에 중요할 수 있기 때문에 MAPT를 포함한다.

FTD-17 및 PSP를 위한 미세소관-관련 단백질 Tau 타겟화

17 번 염색체와 연관된 가족성 형태의 FTD인 가족성 전측두엽 치매 17(FTD-17), 및 가족성 진행성 책상 마비는 MAPT 돌연변이에 의해 유발될 수 있는데, 이는 또한 희귀성 형태의 진행성 책상 마비, 피질기저 변성, 호흡 부전이 있는 타우병증, 발작이 있는 치매를 유발할 수 있다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 신경퇴행성 장애이다. FTD의 유병률은 100,000명 당 15명 내지 22명이고; 네덜란드에서 FTD-17의 유병률은 인구 1,000,000명 중 1명이다. MAPT를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, GOF 점 및 MAPT의 스플라이스 자리 돌연변이는 전두 또는 측두 피질과 같은 조직에 가족성 및 산발성 FTD에서 발견되었다. 이러한 타겟화의 기전은 MAPT의 상염색체 우성 GOF 돌연변이가 독성 타우 펩타이드 및 뉴런 사멸을 초래하기 때문일 수 있다. 효능은 MAPT의 70% KD로 나타났다. 안전성과 관련하여, MAPT KO 마우스는 건강한 것으로 보고되었다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF Tau mRNA 및 단백질을 포함한다.

FTD 및 ALS를 위한 세퀘스토좀 1 타겟화

산발성 FTD/ALS는 우성 SQSTM1 돌연변이와 연관된다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 신경퇴행성 장애이다. 이는 매우 희귀성 질환이다. 세퀘스토좀 1을 타겟화하는 것은 전두 및 측두 피질, 또는 소뇌 및 척수와 같은 조직에 산발성 경우에 인간 분자 유전적 연관성을 통해 타당해진다. 가능한 진단은 유전자 검사; 초기 증상을 포함한다.

우성 유전 파킨슨병은 질환-조절 요법이 없는 파괴적 장애이다. 타겟은 SNCA를 포함한다.

파킨슨병을 위한 SNCA 타겟화

알파 시누클레인 돌연변이는 가족성 파킨슨병(PD) 및 루이 소체 치매를 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 신경퇴행성 장애이다. PD의 유병률은 전 세계에서 400만명이고; PD의 1/3은 가족성이고; fPD의 1%는 SNCA에 의해 유발된다. SNCA를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, SNCA 점 돌연변이 및 중복은 숨뇌; 또는 중뇌의 흑질과 같은 조직에 가족성 PD를 유발한다. 이러한 타겟화의 기전은 비정상적인 SNCA 단백질의 과발현 또는 발현이 독성 펩타이드 및 뉴런 사멸을 초래하기 때문일 수 있다. 효능은 SNCA의 70% KD로 나타났다. 안전성과 관련하여, SNCA KO 마우스는 건강했다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF SNCA mRNA 및 단백질을 포함한다.

파킨슨병을 위한 LRRK2 타겟화

류신-풍부 반복 키나제 2 돌연변이는 가족성 파킨슨병을 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 신경퇴행성 장애이다. PD의 유병률은 전 세계에서 400만명이고; PD의 1/3은 가족성이고; fPD의 3% 내지 7%는 LRRK2에 의해 유발된다. LRRK2를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, LRRK2 점 돌연변이 및 중복은 숨뇌; 또는 중뇌의 흑질과 같은 조직에 가족성 PD를 유발한다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF mRNA 및 단백질을 포함한다.

척수성 근위축증 V를 위한 GARS 타겟화

상염색체 우성 글리실-tRNA 신테타제 돌연변이는 척추성 근위축증 V(SMAV) 또는 원위 유전성 운동 신경병증 Va를 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 신경퇴행성 장애이다. 이는 매우 희귀성 질환이다. GAR를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, GARS 점 돌연변이는 척수와 같은 조직에서 가족성 SMA를 유발한다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 초기 증상을 포함한다.

척수성 근위축증을 위한 세이핀 타겟화

상염색체 우성 세이핀 돌연변이는 척수성 근위축증(SMA) 또는 원위 유전성 운동 신경병증을 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 신경퇴행성 장애이다. 이는 매우 희귀성 질환이다. 세이핀을 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, 세이핀 점 돌연변이는 척수와 같은 조직에서 가족성 SMA를 유발한다. 이러한 타겟화의 기전은 아마도 GOF 및 독성 펩타이드이다. 효능은 50% KD로 나타났다. 안전성과 관련하여, 열성 LOF 돌연변이는 지방 이영양증과 함께 또는 없이 진행성 뇌병증을 유발한다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다.

우성 유전 알츠하이머병은 질환-조절 요법이 없는 파괴적 장애이다. 타겟은 가족성 질환에서 중추적인 기계적인 역할 및 일반적인 AD에서 가능한 역할 때문에 APP를 포함한다.

알츠하이머병을 위한 APP 타겟화

아밀로이드 전구체 단백질 돌연변이는 조발성 가족성 알츠하이머병(EOFAD); 다운 증후군에서의 AD; 또는 AD를 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 신경퇴행성 장애이다. EOFAD-APP의 유병률은 1% AD이고; 21번 삼중염색체의 유병률은 1% AD이고; AD의 유병률은 미국에서 약 250만명 내지 5백만명이다. APP를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, APP 중복 및 점 돌연변이는 뇌 피질 또는 해마와 같은 조직에 EOFAD를 유발한다. 이러한 타겟화의 기전은 APP 과발현 또는 독성 대사의 발현이 진행성 뉴런 사멸을 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 APP의 70% KD로 나타났다. 안전성과 관련하여, KD 마우스는 일부 행동 이상증과 함께 건강한 것으로 보고되었고; KD 마우스는 일부 공간 기억 장애와 함께 건강한 것으로 보고되었다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 초기 증상; 또는 MRI를 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF APP mRNA 및 펩타이드를 포함한다.

알츠하이머병을 위한 PSEN1 타겟화

프레세닐린 1 돌연변이는 조발성 가족성 알츠하이머병(EOFAD); 또는 AD를 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 신경퇴행성 장애이다. PSEN1을 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, PSEN1 점 돌연변이는 뇌 피질 또는 해마와 같은 조직에 EOFAD를 유발한다. 이러한 타겟화의 기전은 PSEN1의 상염색체 우성 돌연변이가 비정상적인 APP 대사를 유발하고 독성 펩타이드가 진행성 뉴런 사멸을 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 APP KD로 나타났는데, 이는 PSEN1-특이적 요법에 대한 필요성을 없앨 수 있다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 초기 증상; 또는 MRI를 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF PSEN1 및 APP 펩타이드를 포함한다.

알츠하이머병을 위한 PSEN2 타겟화

프레세닐린 2 돌연변이는 조발성 가족성 알츠하이머병(EOFAD); 또는 AD를 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 신경퇴행성 장애이다. PSEN2를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, PSEN2 점 돌연변이는 뇌 피질 또는 해마와 같은 조직에 EOFAD를 유발한다. 이러한 타겟화의 기전은 PSEN2의 상염색체 우성 돌연변이가 비정상적인 APP 대사를 유발하고 독성 펩타이드가 진행성 뉴런 사멸을 유발하기 때문일 수 있다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 초기 증상; 또는 MRI를 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF PSEN2 및 APP 펩타이드를 포함한다.

알츠하이머병을 위한 Apo E 타겟화

아포지질단백질 E4는 노인에서 산발성 AD와 관련이 있다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 신경퇴행성 장애이다. AD의 유병률은 미국에서 250만명 내지 500만명이다. Apo E를 타겟화하는 것은 ApoE4와 AD 간의 연관성을 지지하는 게놈 증거가 다수 집단에 우수하기 때문에 효과적일 수 있다. 타겟 조직은 뇌 피질일 수 있다. Apo E4가 다수 집단에서 강력한 연관성에도 불구하고 AD의 발병에 기여하는지의 여부는 아직 명확하지 않다. 지금까지, 데이터는 Apo E4 동형접합성이 노인에서 AD 위험의 증가를 지시하지만 노인에서도 AD를 유발하기에는 충분하지 않다는 것을 지시한다. 안전성과 관련하여, CNS에서 Apo E의 KD는 Apo E의 인간 LOF 돌연변이가 명백한 신경학적 결함과 관련이 없기 때문에 안전할 수 있지만, 전신 노출은 고리포단백혈증 III형을 유발할 수 있다. 가능한 진단은 AD의 임상 진단; EOFAD 돌연변이의 배제; Apo E4 유전자형에 대한 유전자 검사를 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF APP, Tau mRNA 및 펩타이드를 포함한다.

CNS 유전자 중복 장애. 절반까지의 일관된 KD는 이러한 장애들을 개선할 수 있다. 타겟은 MeCP2를 포함한다.

X-연관 정신 지체를 위한 MeCP2 타겟화

메틸 CpG 결합 단백질 2 유전자 중복은 X-연관 정신 지체(XLMR)를 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 인지 장애이다. X-연관 MR의 1% 내지 15%는 MeCP2 중복에 의해 유발되고; 인구의 2% 내지 3%가 MR을 갖는다. MeCP2를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, MeCP2 중복은 뇌 피질과 같은 조직에 XLMR을 유발한다. 이러한 타겟화의 기전은 MeCP2 과발현이 다른 유전자의 조절장애 및 신경퇴행을 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 MeCP2의 50% KD로 나타났고; 마우스 모델에서 ASO KD는 표현형을 역전시켰다. 안전성과 관련하여, MeCP2 LOF 돌연변이는 레트 증후군을 유발할 수 있다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF MeCP2 mRNA 및 펩타이드를 포함한다.

우성 유전 아밀로이드 뇌혈관병증은 질환-조절 요법이 없는 파괴적 장애이다. 타겟은 TTR을 포함한다.

hATTR CAA를 위한 TTR 타겟화

이러한 타겟화는 CNS siRNA에 대한 도입 위험성이 낮을 수 있다. 아밀로이드 뇌혈관병증(CAA) 및 뇌척수막 아밀로이드증은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 장애이다. TTR을 타겟화하는 것은 인간 유전학 및 약리학을 통해 우수해질 수 있다. 타겟 조직은 CNS 혈관계, 또는 CNS일 수 있다. 이러한 타겟화의 기전은 돌연변이 단백질이 혈관 외막에 축적되어 CNS 출혈을 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 TTR의 70% KD로 나타났다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF mRNA 및 단백질을 포함한다.

CAA를 위한 ITM2B 타겟화

내재성 막 단백질 2B 돌연변이는 아밀로이드 뇌혈관병증(CAA), 영국 유형 또는 가족성 영국 치매(FBD)를 유발한다. 특이적 돌연변이가 또한 우성 망막 변성을 유발할 수 있다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 장애이다. 이는 희귀성 질환이다. ITM2B를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있다. 타겟 조직은 CNS 혈관계, 또는 CNS일 수 있다. 이러한 타겟화의 기전은 아마도 GOF 돌연변이를 수반한다. 효능은 ITM2B 돌연변이체 대립유전자의 70% KD에 의해 밝혀졌다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF mRNA 및 가능한 단백질을 포함한다.

CAA를 위한 CST3 타겟화

시스타틴 C 돌연변이는 아이슬란드 타입인 가족성 아밀로이드 뇌혈관병증을 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 장애이다. 이는 아이슬란드 및 덴마크를 제외하고 희귀성 질환이다. CST3를 타겟화하는 것은 인간 유전학을 통해 우수해질 수 있다. 타겟 조직은 CNS 혈관계일 수 있다. 이러한 타겟화의 기전은 돌연변이 단백질이 혈관 외막에 축적되어 CNS 출혈을 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 돌연변이체 대립유전자의 가능하게는 70% KD로 나타났다. 안전성과 관련하여, CST3 KO 마우스는 관절염 위험이 있을 수 있다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, 가능한 CSF mRNA 및 단백질을 포함한다.

강직성 하반신마비를 위한 SPAST 타겟화

SPASTIN 돌연변이는 인지 상실과 함께 강직성 하반신마비(SP) 4를 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 하위 운동 신경퇴행성 장애이다. SP의 유병률은 인구 100,000명 당 5명이고; SP4는 우성 SP의 45%이다. SPAST를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, SPAST 트리뉴클레오타이드 돌연변이는 척수; 또는 CNS와 같은 조직에 가족성 SP를 유발한다. 이러한 타겟화의 기전은 개연성 없는 및 개연성 있는 우성-음성 돌연변이가 비정상적인 미세소관 대사 및 신경퇴행을 유발하기 때문일 수 있다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, 가능한 CSF SPAST mRNA 및 단백질을 포함한다.

강직성 하반신마비를 위한 KIF5A 타겟화

키네신 패밀리 구성원 5A 돌연변이는 말초 신경병증 및 기타 장애와 함께 강직성 하반신마비(SP) 10을 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 하위 운동 신경퇴행성 장애이다. SP의 유병률은 100,000명 당 5명이고; SP10은 1,000,000명 당 1명이다. KIF5A를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, KIF5A 아미노 말단 미스센스 돌연변이는 SP10을 유발하고; KIF5A는 CNS에서 발현되며, 미세소관 운동 단백질을 코딩한다. 타겟 조직은 척수일 수 있다. 이러한 타겟화의 기전은 상염색체 우성 미스센스 돌연변이가 SP10를 유발하고, 아마도 운동요소에 결합하는 미세소관에 영향을 미치기 때문일 수 있다. 효능은 돌연변이체 대립유전자의 가능한 한 kD에 의해 제공될 수 있다. 안전성과 관련하여, KIF5A 틀이동 돌연변이는 신생아 난치성 근육간대경련을 유발하고, 스플라이스 부위 돌연변이는 아마도 LOF 메커니즘을 통해 가족성 ALS와 관련이 있었다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, 가능한 CSF mRNA 및 단백질을 포함한다.

강직성 하반신마비를 위한 ATL1 타겟화

아틀라스틴 돌연변이는 강직성 하반신 마비 3A 및 감각 신경병증 1D, 유전성 감각 신경병증(HSN)을 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 하위 운동 신경퇴행성 장애이다. SP의 유병률은 100,000명 당 5명이고; SP3A는 희귀성 우성 형태이다. ATL1을 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, ATL1 점 돌연변이는 가족성 SP를 유발한다. 타겟 조직은 척수일 수 있다. 이러한 타겟화의 기전은 우성-음성 ATL1 단백질의 상염색체 우성 발현이 SP3A를 유발하지만, LOF 돌연변이가 감각 신경병증 1D를 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 특이적 ATL1 대립유전자의 70% KD로 나타났다. 안전성과 관련하여, ATL1 이형접합 LOF 돌연변이는 HSN1D를 유발한다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF ATL1 mRNA 및 단백질을 포함한다.

강직성 하반신마비를 위한 NIPA1 타겟화

LOF NIPA1 돌연변이는 간질 및 발작과 함께 강직성 하반신마비 6을 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 하위 운동 신경퇴행성 장애이다. SP의 유병률은 100,000명 당 5명이고; SP6은 희귀성 우성 형태이다. NIPA1을 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, NIPA1 점 돌연변이는 가족성 SP를 유발한다. 타겟 조직은 척수; 또는 CNS일 수 있다. 이러한 타겟화의 기전은 결함 막 단백질의 상염색체 우성 발현이 SP3A; 및 아마도 LOF를 유발하기 때문일 수 있다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, 가능한 CSF mRNA 및 단백질을 포함한다.

우성 유전 근긴장성 이영양증은 CNS 및 전신 요법이 필요한 CNS, 골격근 및 심장근의 장애이다. 타겟은 DM1을 위해 MPK를 포함한다.

근긴장성 이영양증 1을 위한 DMPK 타겟화

근긴장성 이영양증 단백질 키나제를 타겟화하는 효과적인 요법에는 CNS 및 전신 요법이 필요하다. 근긴장성 이영양증 1(DM1)은 근육 및 CNS의 퇴행성 장애이다. 이는 질환-조절 요법이 없는 치명적인 장애이다. DM1의 유병률은 전세계 8,000명 당 1명이다. DMPK를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, DMPK CTG 반복 확장은 가족성 DM1을 유발한다. 타겟 조직은 골격근, 심장근, 또는 CNS일 수 있다. 이러한 타겟화의 기전은 상염색체 우성 비-코딩 CTG 반복이 비정상적인 RNA 프로세싱 및 우성 부작용을 유발하고; 극심한 확장으로부터의 예상이 질환의 조기 발병을 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 DMPK의 70%로 나타났고; ASO 효능은 마우스에서 입증되었다. 안전성은 KO 및 ASO KD로 마우스에서 입증되었다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, 혈액 및 CSF mRNA 및 단백질을 포함한다.

근긴장성 이영양증 2를 위한 ZNF9 타겟화

아연 핑거 단백질 9 돌연변이는 골격근의 퇴행성 장애인 근긴장성 이영양증 2(DM2)를 유발한다. 이는 질환-조절 요법이 없는 중증 장애이다. DM2의 유병률은 전 세계 8,000명 당 1명이고; 이는 성인에서 가장 흔한 근이영양증이다. ZNF9를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, 인트론 1에서 ZNF9 CTTG 반복 확장은 가족성 DM2를 유발한다. 타겟 조직은 골격근, 또는 심장근일 수 있다. 이러한 타겟화의 기전은 인트론 1에서 상염색체 우성 CTTG 반복 확장이 비정상적인 RNA 대사 및 우성 부작용을 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 독성 ZNF9의 70% KD로 나타났다. 마우스에서 안전한 KD가 입증되었다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, 혈액 mRNA 및 단백질을 포함한다.

우성 유전 프라이온병은 유전성, 산발성 및 전염성 PRNP 장애이다. 타겟은 PRNP를 포함한다.

근긴장성 프라이온병을 위한 PRNP 타겟화

근긴장성 프라이온병은 PRNP-관련 아밀로이드 뇌혈관병증, 거스트만-슈트라우슬러-센커병(GSD), 크로이츠 펠트-야콥병(CJD), 치명적 가족성 불면증(FFI), 헌팅턴병-유사 1(HDL1), 및 쿠루 감수성을 포함하는 우성 유전 프라이온병이다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 신경퇴행성 장애이다. 이러한 유형의 질환의 유병률은 1,000,000명 당 1명이다. PRNP를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, PRNP 돌연변이는 가족성 및 산발성 프라이온병을 유발한다. 타겟 조직은 CNS일 수 있다. 이러한 타겟화의 기전은 상염색체 우성 단백질 미드-폴딩이 신경독증을 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 PRNP KD의 70%로 나타났고; PRNP 다형성이 쿠루병을 막는 것으로 보였다. 안전성과 관련하여, PRNP KO 마우스는 건강한 것으로 보고되었다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF mRNA 및 단백질을 포함한다.

라포라의 근간대성 뇌전증을 위한 글리코겐 신타제 타겟화

라포린(EPM2A) 유전자 돌연변이는 유전성 진행성 발작 장애인 AR 근간대성 뇌전증을 유발한다. 이러한 질환은 질환-조절 요법이 없는 치명적인 발작 및 인지 기능 저하 장애이다. 이러한 질환의 유병률은 1,000,000명 당 4명이다. 글리코겐 신타제를 타겟화하는 것은 인간 분자 유전학을 통해 우수해질 수 있는데, 예를 들어, 돌연변이는 라포라의 AR 가족성 근간대성 뇌전증을 유발한다. 타겟 조직은 CNS일 수 있다. 이러한 타겟화의 기전은 라포린의 상염색체 열성 기능장애가 글리코겐의 미스폴딩 및 발작의 병소를 유발하기 때문일 수 있다. 효능은 글리코겐 신타제 GYS1의 70% KD로 나타났다. 안전성과 관련하여, GYS1 결핍은 골격 및 심장 근육 글리코겐 결핍을 유발하고; 생존하는 GYS1 마우스는 근육 결함을 가졌다. 가능한 진단은 가족력; 유전자 검사; 또는 초기 증상을 포함한다. 사용될 수 있는 바이오마커는, 예를 들어, CSF mRNA 및 단백질을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 노화-관련 황반 변성(AMD)(건성 및 습성), 새발성 맥락망막병증, 우성 색소성 망막염 4, 후치 이영양증(Fuch's dystrophy), hATTR 아밀로이드증, 유전성 및 산발성 녹내장, 및 스타가르트병(stargardt's disease)을 포함하나 이로 한정되지 않는 질환을 위해 유전자를 타겟화하는 화합물을 제공한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 습성(또는 삼출성) AMD를 위해 VEGF를 타겟화하는 화합물을 제공한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 건성(또는 비삼출성) AMD를 위해 C3를 타겟화하는 화합물을 제공한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 건성(또는 비삼출성) AMD를 위해 CFB를 타겟화하는 화합물을 제공한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 녹내장을 위해 MYOC를 타겟화하는 화합물을 제공한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 녹내장을 위해 ROCK2를 타겟화하는 화합물을 제공한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 녹내장을 위해 ADRB2를 타겟화하는 화합물을 제공한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 녹내장을 위해 CA2를 타겟화하는 화합물을 제공한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 백내장을 위해 CRYGC를 타겟화하는 화합물을 제공한다.

일부 구현예에서, 본 발명은 건성안 증후군을 위해 PPP3CB를 타겟화하는 화합물을 제공한다.

리간드

소정의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 하나 이상의 접합기의 공유 부착에 의해 추가로 변형된다. 일반적으로, 접합기는 약력학, 약동학, 결합, 흡수, 세포 분포, 세포 흡수, 전하 및 청소율을 포함하나 이로 한정되지 않는 본 발명의 부착된 화합물의 하나 이상의 성질을 변형한다. 접합기는 화학 분야에서 일상적으로 사용되며, 직접적으로 또는 선택적 연결 모이어티 또는 연결기를 통해 올리고머 화합물과 같은 모 화합물에 연결된다. 접합기의 바람직한 목록은 제한 없이 삽입제, 리포터 분자, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 티오에테르, 폴리에테르, 콜레스테롤, 티오콜레스테롤, 콜릭산 모이어티, 엽산, 지질, 인지질, 비오틴, 페나진, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아다만탄, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 쿠마린 및 염료를 포함한다.

일부 구현예에서, 화합물은 특이적 CNS 조직에 대한 전달을 매개하는 수용체를 타겟화하는 타겟화 리간드를 추가로 포함한다. 이러한 타겟화 리간드는 특이적인 척수강내 및 전신 전달이 가능하도록 친유성 모이어티와 조합하여 접합될 수 있다.

CNS 조직에 대한 수용체 매개 전달을 타겟화하는 예시적인 타겟화 리간드는 펩타이드 리간드, 예컨대, Angiopep-2, 지질단백질 수용체 연관 단백질(LRP) 리간드, bEnd.3 세포 결합 리간드; 트랜스페린 수용체(TfR) 리간드(뇌에서 철분 수송계를 이용하고, 뇌실질로 물질을 운반할 수 있음); 만노스 수용체 리간드(후각 초성 세포, 신경교세포를 타겟화함), 글루코스 운반체 단백질, 및 LDL 수용체 리간드이다.

일부 구현예에서, 화합물은 특이적 안구 조직에 대한 전달을 매개하는 수용체를 타겟화하는 타겟화 리간드를 추가로 포함한다. 이러한 타겟화 리간드는 특이적인 안구 전달(예를 들어, 유리체내 전달) 및 전신 전달이 가능하도록 친유성 모이어티와 조합하여 접합될 수 있다. 안구 조직에 대한 수용체 매개 전달을 타겟화하는 예시적인 타겟화 리간드는 친유성 리간드, 예컨대, 모든 트랜스 레티놀(레티노산 수용체를 타겟화함); RGD 펩타이드(망막 색소 상피 세포를 타겟화함), 예컨대, H-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys-Cys-OH 또는 사이클로(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys; LDL 수용체 리간드; 및 탄수화물 기반 리간드(후안방에서 내피 세포를 타겟화함)이다.

본 발명에 적합한 바람직한 접합기는 지질 모이어티, 예컨대, 콜레스테롤 모이어티(Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553); 콜릭산(Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4, 1053); 티오에테르, 예를 들어, 헥실-S-트리틸티올(Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765); 티오콜레스테롤(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533); 지방족 사슬, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49); 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄-1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777); 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969); 아다만탄 아세트산(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651); 팔미틸 모이어티(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229); 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923)를 포함한다.

일반적으로, 광범위하게 다양한 엔터티, 예를 들어, 리간드는 본원에 기재된 올리고머 화합물에 커플링될 수 있다. 리간드는 천연 생성 분자, 또는 재조합 또는 합성 분자를 포함할 수 있다. 예시적인 리간드는 폴리리신(PLL), 폴리 L-아스파르트산, 폴리 L-글루탐산, 스티렌-말렌산 무수물 공중합체, 폴리(L-락타이드-코-글리콜라이드) 공중합체, 디비닐 에테르-말레산 무수물 공중합체, N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드 공중합체(HMPA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG, 예를 들어, PEG-2K, PEG-5K, PEG-10K, PEG-12K, PEG-15K, PEG-20K, PEG-40K), MPEG, [MPEG]₂, 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 중합체, 폴리포스파진, 폴리에틸렌이민, 양이온성 기, 스페르민, 스페르미딘, 폴리아민, 유사펩타이드-폴리아민, 펩티도미메틱 폴리아민, 덴드리머 폴리아민, 아르기닌, 아미딘, 프로타민, 양이온성 지질, 양이온성 포피린, 폴리아민의 4차 염, 티로트로핀, 멜라노트로핀, 렉틴, 당단백질, 계면활성제 단백질 A, 뮤신, 글리코실화된 폴리아미노산, 트랜스페린, 비스포스포네이트, 폴리글루타메이트, 폴리아스파테이트, 앱타머, 아시알로페투인, 하이알루로난, 프로콜라겐, 면역글로불린(예를 들어, 항체), 인슐린, 트랜스페린, 알부민, 당-알부민 접합체, 삽입제(예를 들어, 아크리딘), 가교제(예를 들어, 프소랄렌(psoralen), 미토마이신 C), 포피린(TPPC4, 텍사피린(texaphyrin), 사피린(Sapphyrin)), 폴리사이클릭 방향족 탄화수소(예를 들어, 페나진, 디하이드로페나진), 인공 엔도뉴클레아제(예를 들어, EDTA), 친유성 분자(예를 들어, 스테로이드, 담즙산, 콜레스테롤, 콜릭산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 제라닐옥시헥실 기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜릭산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진), 펩타이드(예를 들어, 알파 나선 펩타이드, 양친매성 펩타이드, RGD 펩타이드, 세포 투과 펩타이드, 엔도좀분해성/융합유도성 펩타이드), 알킬화제, 포스페이트, 아미노, 머캅토, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사성표지 마커, 효소, 헵텐(예를 들어, 비오틴), 수송/흡수 촉진제(예를 들어, 나프록센, 아스피린, 비타민 E, 엽산), 합성 리보뉴클레아제(예를 들어, 이미다졸, 비스이미다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터, 아크리딘-이미다졸 접합체, 테트라아자마크로사이클의 Eu3+ 복합체), 디니트로페닐, HRP, AP, 항체, 호르몬 및 호르몬 수용체, 렉틴, 탄수화물, 다가 탄수화물, 비타민(예를 들어, 비타민 A, 비타민 E, 비타민 K, 비타민 B, 예를 들어, 엽산, B12, 리보플라빈, 비오틴 및 피리독살), 비타민 보조인자, 리포폴리사카라이드, p38 MAP 키나제의 활성화제, NF-

의 활성화제, 탁손(taxon), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 사이토칼라신(cytochalasin), 노코다졸(nocodazole), 야플라키놀리드(japlakinolide), 라트룬쿨린 A(latrunculin A), 팔로이딘(phalloidin), 스윈홀라이드 A(swinholide A), 인다노신(indanocine), 마이오세르빈(myoservin), 종양 괴사 인자 알파(TNF-알파), 인터루킨-1 베타, 감마 인터페론, 천연 또는 재조합 저밀도 지질단백질(LDL), 천연 또는 재조합 고밀도 지질단백질(HDL), 및 세포-투과 제제(예를 들어, 나선형 세포-투과 제제)를 포함하나, 이로 한정되지 않는다.

펩타이드 및 펩티도미메틱 리간드는, 천연 생성 펩타이드 또는 변형 펩타이드, 예를 들어, D 또는 L 펩타이드; α, β, 또는 γ 펩타이드; N-메틸 펩타이드; 아자펩타이드; 하나 이상의 아미드를 갖는 펩타이드, 즉, 하나 이상의 우레아, 티오우레아, 카르바메이트, 또는 설포닐 우레아 결합으로 치환된 결합을 갖는 펩타이드; 또는 사이클릭 펩타이드를 갖는 것들을 포함한다. 펩티도미메틱(본원에서 올리고펩티도미메틱으로도 지칭됨)은 천연 펩타이드와 유사한 한정된 3차원 구조로 폴딩될 수 있는 분자이다. 펩타이드 또는 펩티도미메틱 리간드는 약 5개 내지 50개 아미노산 길이, 예를 들어, 약 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 또는 50개 아미노산 길이일 수 있다.

예시적인 양친매성 펩타이드로는, 세크로핀(cecropin), 라이코톡신(lycotoxin), 파라닥신(paradaxin), 부포린(buforin), CPF, 봄비닌-유사(bombinin-like) 펩타이드(BLP), 카텔리시딘(cathelicidin), 세라토톡신(ceratotoxin), S. 클라바(S. clava) 펩타이드, 하그피쉬 장 항균 펩타이드(hagfish intestinal antimicrobial peptide)(HFIAP), 마가이닌(magainine), 브레비닌-2(brevinin-2), 데르마셉틴(dermaseptin), 멜리틴(melittin), 플레우로시딘(pleurocidin), H₂A 펩타이드, 제노푸스(Xenopus) 펩타이드, 에스쿨렌티니스-1(esculentinis-1), 및 캐린(caerin)이 포함되나, 이로 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 용어 "엔도좀분해성 리간드"는 엔도좀분해 특성을 갖는 분자를 지칭한다. 엔도좀분해성 리간드는 세포 구획, 예컨대, 엔도좀, 리포좀, 소포체(ER), 골지(Golgi) 장치, 미세소관, 과산화체, 또는 세포 내 다른 소낭성 조직으로부터 세포의 세포질로 본 발명의 조성물, 또는 이의 성분을의 용해 및/또는 수송을 촉진한다. 일부 예시적인 엔도좀분해성 리간드는 이미다졸, 폴리 또는 올리고이미다졸, 선형 또는 분지형 폴리에틸렌이민(PEI), 선형 및 분지형 폴리아민, 예를 들어, 스페르민, 양이온성 선형 및 분지형 폴리아민, 폴리카르복실레이트, 폴리양이온, 마스킹된(masked) 올리고 또는 폴리 양이온 또는 음이온, 아세탈, 폴리아세탈, 케탈/폴리케탈, 오르토에스테르, 마스킹 또는 비-마스킹된 양이온성 또는 음이온성 전하를 갖는 선형 또는 분지형 중합체, 마스킹 또는 비-마스킹된 양이온성 또는 음이온성 전하를 가진 덴드리머, 폴리음이온성 펩타이드, 폴리음이온성 펩타이드모방체, pH-감수성 펩타이드, 천연 및 합성 융합생성 지질, 천연 및 합성 양이온성 지질을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.

예시적인 엔도좀분해성/융합생성 펩타이드는 하기를 포함하나, 이로 한정되지 않는다:

AALEALAEALEALAEALEALAEAAAAGGC(GALA); AALAEALAEALAEALAEALAEALAAAAGGC(EALA); ALEALAEALEALAEA; GLFEAIEGFIENGWEGMIWDYG(INF-7); GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG(Inf HA-2); GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGCGLFEAIEGFIENGWEGMID GWYGC(diINF-7); GLFEAIEGFIENGWEGMIDGGCGLFEAIEGFIENGWEGMIDGGC(diINF-3); GLFGALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAAGGSC(GLF); GLFEAIEGFIENGWEGLAEALAEALEALAAGGSC(GALA-INF3); GLF EAI EGFI ENGW EGnI DG K GLF EAI EGFI ENGW EGnI DG(INF-5, n은 노르류신임); LFEALLELLESLWELLLEA(JTS-1); GLFKALLKLLKSLWKLLLKA(ppTG1); GLFRALLRLLRSLWRLLLRA(ppTG20); WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA(KALA); GLFFEAIAEFIEGGWEGLIEGC(HA); GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(멜리틴); H₅WYG; 및 CHK6HC.

이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 융합생성 지질은 막과 융합하고, 결과적으로 막을 탈안정화시킨다. 융합생성 지질은 일반적으로 작은 헤드 기, 및 불포화 아실 기를 갖는다. 예시적인 융합생성 지질은 1,2-디레오일-sn-3-포스포에탄올아민(DOPE), 포스파티딜에탄올아민(POPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-올(Di-Lin), N-메틸(2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔일)-1,3-디옥솔란-4-일)메탄아민(DLin-k-DMA) 및 N-메틸-2-(2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에닐)-1,3-디옥솔란-4-일)에탄아민(본원에서 XTC로도 지칭됨)을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.

본 발명에 적합한 엔도좀분해 활성을 갖는 합성 폴리머는 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 출원 공개 No. 2009/0048410; 2009/0023890; 2008/0287630; 2008/0287628; 2008/0281044; 2008/0281041; 2008/0269450; 2007/0105804; 20070036865; 및 2004/0198687에 기재되어 있다.

예시적인 세포 투과 펩타이드는 RQIKIWFQNRRMKWKK(페네트라틴); GRKKRRQRRRPPQC(Tat 단편 48 내지 60); GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV(신호 서열 기반 펩타이드); LLIILRRRIRKQAHAHSK(PVEC); GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL(트랜스포르탄); KLALKLALKALKAALKLA(양친매성 모델 펩타이드); RRRRRRRRR(Arg9); KFFKFFKFFK(세균성 세포 벽 투과 펩타이드); LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES(LL-37); SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAIQGGPR(세크로핀 P1); ACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC(α-데펜신); DHYNCVSSGGQCLYSACPIFTKIQGTCYRGKAKCCK(β-데펜신); RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGFPPRFPPRFPGKR-NH2-(PR-39); ILPWKWPWWPWRR-NH2 (인돌리시딘); AAVALLPAVLLALLAP(RFGF); AALLPVLLAAP(RFGF 유사체); 및 RKCRIVVIRVCR(박테네신)을 포함하나, 이로 한정되지 않는다.

예시적인 양이온성 기는, 예를 들어, O-아민(아민 = NH₂; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노, 에틸렌 디아민, 폴리아미노); 아미노알콕시, 예를 들어, O(CH₂)_n아민, (예를 들어, 아민 = NH₂; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노, 에틸렌 디아민, 폴리아미노); 아미노(예를 들어, NH₂; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 디헤테로아릴 아미노, 또는 아미노산); 및 NH(CH₂CH₂NH)_nCH₂CH₂-아민(아민 = NH₂; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노)으로부터 유래된 양성화된 아미노 기를 포함하나, 이로 한정되지 않는다.

본원에 사용되는 용어 "타겟화 리간드"는 선택된 타겟, 예를 들어, 세포, 세포 유형, 조직, 기관, 신체 부위, 또는 구획, 예를 들어, 세포, 조직 또는 기관 구획에 대해 향상된 친화성을 제공하는 임의의 분자를 지칭한다. 일부 예시적인 타겟화 리간드는 항체, 항원, 엽산, 수용체 리간드, 탄수화물, 앱타머, 인테그린 수용체 리간드, 케모카인 수용체 리간드, 트랜스페린, 비오틴, 세로토닌 수용체 리간드, PSMA, 엔도텔린, GCPII, 소마토스타틴, LDL 및 HDL 리간드를 포함하나, 이로 한정되지 않는다.

탄수화물 기재 타겟화 리간드는 D-갈락토스, 다가 갈락토스, N-아세틸-D-갈락토사민(GalNAc), 다가 GalNAc, 예를 들어, GalNAc₂ 및 GalNAc₃(GalNAc 및 다가 GalNAc는 본원에서 총괄하여 GalNAc 접합체로 지칭됨); D-만노스, 다가 만노스, 다가 락토스, N-아세틸-글루코사민, 글루코스, 다가 글루코스, 다가 푸코스, 글리코실화된 폴리아미노산 및 렉틴을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 용어 다가는 하나보다 많은 단당류 단위가 존재한다는 것을 지시한다. 그러한 단당류 하위단위는 글리코사이드 결합을 통해 서로 연결되거나 스캐폴드 분자에 연결될 수 있다.

리간드로서 본 발명에 용이한 다수의 엽산 및 엽산 유사체는 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 미국 특허 No. 2,816,110; 5,552,545; 6,335,434 및 7,128,893에 기재되어 있다.

본원에서 사용되는 용어 "PK 조절 리간드" 및 "PK 조절제"는 본 발명의 조성물의 약동학을 조절할 수 있는 분자를 지칭한다. 일부 예시적인 PK 조절제는 친유성 분자, 담즙산, 스테롤, 인지질 유사체, 펩타이드, 단백질 결합제, 비타민, 지방산, 페녹사진, 아스피린, 나프록센, 이부프로펜, 수프로펜, 케토프로펜, (S)-(+)-프라노프로펜, 카프로펜, PEG, 비오틴, 및 트랜스티레티아-결합 리간드(예를 들어, 테트라아이오도티로아세트산, 2, 4, 6-트리아이오도페놀 및 플루페남산)을 포함하나, 이로 한정되지 않는다. 다수의 포스포로티오에이트 당간 결합을 포함하는 올리고머성 화합물은 또한 혈청 단백질에 결합하는 것으로 알려져 있고, 그에 따라 짧은 올리고머 화합물, 예를 들어, 약 5개 내지 30개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 5개 내지 25개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 5개 내지 20개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 20개의 뉴클레오타이드)를 포함하는 올리고뉴클레오타이드, 및 백본에 복수의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는 것은 리간드(예를 들어, PK 조절 리간드)로서 또한 본 발명에 용이하다. PK 조절 올리고뉴클레오타이드는 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개 이상의 포스포로티오에이트 및/또는 포스포로디티오에이트 결합을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, PK 조절 올리고뉴클레오타이드에서 모든 뉴클레오타이드간 결합은 포스포로티오에이트 및/또는 포스포로디티오에이트 결합이다. 또한, 혈청 구성분(예를 들어, 혈청 단백질)을 결합하는 앱타머는 또한, 본 발명에서 PK 조절 리간드로서 용이하다. 혈청 구성분(예를 들어, 혈청 단백질)에 대한 결합은 알부민 결합 검정, 예컨대, 문헌[Oravcova, et al., Journal of Chromatography B (1996), 677: 1-27]에 기재된 것들로부터 예측될 수 있다.

2개 이상의 리간드가 존재하는 경우, 리간드는 모두 동일한 특성을 가질 수 있으며, 모두 서로 다른 특성들을 가질 수 있거나, 또는 일부 리간드들은 동일한 특성들을 가지는 한편 다른 것들은 서로 다른 특성들을 가진다. 예를 들어, 리간드는 타겟화 특성을 가지거나, 엔도좀분해성 활성을 가지거나, 또는 PK 조절 특성을 가질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 리간드들은 모두 서로 다른 특성들을 가진다.

리간드 또는 테터링된 리간드는, 상기 단량체가 본 발명의 화합물의 구성분(예를 들어, 본 발명의 화합물 또는 링커)에 혼입되는 경우, 상기 단량체 상에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 리간드는, "전구체" 단량체가 본 발명의 화합물의 구성분(예를 들어, 본 발명의 화합물 또는 링커)에 혼입된 후에, 상기 "전구체" 단량체에 커플링을 통해 혼입될 수 있다. 예를 들어, 아미노-말단화된 테터를 갖는(즉, 관련된 리간드를 갖지 않는) 단량체, 예를 들어, 링커-NH₂는 본 발명의 화합물의 구성분(예를 들어, 본 발명의 화합물 또는 링커)에 혼입될 수 있다. 후속적인 작업에서, 즉, 전구체 단량체를 본 발명의 화합물의 구성분(예를 들어, 본 발명의 화합물 또는 링커)에 혼입한 후, 친전자성 기를 가지는 리간드, 예를 들어, 펜타플루오로페닐 에스테르 또는 알데하이드 기는 후속해서, 전구체 단량체의 테터의 말단 친핵성 기와 함께 리간드의 친전자성 기를 커플링함으로써 전구체 단량체에 부착될 수 있다.

또 다른 예에서, 클릭 화학 반응에 참여하는데 적절한 화학 기를 가지는 단량체, 예를 들어, 아자이드 또는 알카인 말단화된 테터/링커가 혼입될 수 있다. 후속적인 작업에서, 즉, 전구체 단량체를 가닥에 삽입한 후, 알카인 또는 아자이드와 같은 상보적인 화학 기를 가지는 리간드는 알카인 및 아자이드를 함께 커플링함으로써 전구체 단량체에 부착될 수 있다.

일부 구현예에서, 리간드는 본 발명의 화합물의 뉴클레오베이스, 당 모이어티, 또는 뉴클레오사이드간 결합에 접합될 수 있다. 퓨린 뉴클레오베이스 또는 이의 유도체에의 접합은 엔도사이클릭 원자 및 엑소사이클릭 원자를 비롯한 임의의 위치에서 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 퓨린 뉴클레오베이스의 2-위치, 6-위치, 7-위치, 또는 8-위치는 접합체 모이어티에 부착된다. 피리미딘 뉴클레오베이스 또는 이의 유도체에의 접합은 임의의 위치에서 발생할 수도 있다. 일부 구현예에서, 피리미딘 뉴클레오베이스의 2-위치, 5-위치, 및 6-위치는 접합체 모이어티로 치환될 수 있다. 리간드가 뉴클레오베이스에 접합되는 경우, 바람직한 위치는 혼성화를 방해하지 않는, 즉, 염기 페어링에 필요한 수소 결합 상호작용을 방해하지 않는 위치이다.

뉴클레오사이드의 당 모이어티에의 접합은 임의의 탄소 원자에서 발생할 수 있다. 접합 모이어티에 부착될 수 있는 당 모이어티의 예시적인 탄소 원자는 2', 3', 및 5' 탄소 원자를 포함한다. 1' 위치는 또한, 무염기(abasic) 잔기와 같은 접합 모이어티에 부착될 수도 있다. 뉴클레오사이드간 결합은 또한, 접합 모이어티를 가질 수 있다. 인-함유 결합의 경우(예를 들어, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로아미데이트 등), 접합 모이어티는 인 원자, 또는 인 원자에 결합된 O, N, 또는 S 원자에 직접 부착될 수 있다. 아민-함유 또는 아미드-함유 뉴클레오사이드간 결합(예를 들어, PNA)의 경우, 접합 모이어티는 아민 또는 아미드의 질소 원자 또는 인접한 탄소 원자에 부착될 수 있다.

올리고뉴클레오타이드의 접합체를 제조하기 위한 수많은 방법이 존재한다. 일반적으로, 올리고뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 상의 반응성 기(예를 들어, OH, SH, 아민, 카르복실, 및 알데하이드 등)를 접합체 모이어티 상의 반응성 기와 접촉시킴으로써 접합체 모이어티에 부착된다. 일부 구현예에서, 하나의 반응성 기는 친전자성이고, 다른 기는 친핵성이다.

예를 들어, 친전자성 기는 카르보닐-함유 작용기일 수 있고, 친핵성 기는 아민 또는 티올일 수 있다. 연결기로 및 연결기 없이 핵산 및 관련 올리고머 화합물의 접합 방법은, 예를 들어, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 문헌[Manoharan in Antisense Research and Applications, Crooke and LeBleu, eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1993, 챕터 17]와 같은 문헌에 잘 기술되어 있다.

리간드는 링커 또는 담체 단랑체, 예를 들어, 리간드 담체를 통해 본 발명의 화합물에 부착될 수 있다. 담체로는, (i) 하나 이상의 "백본 부착점", 바람직하게는 2개의 "백본 부착점", 및 (ii) 하나 이상의 "테터링 부착점"을 포함한다. 본원에서 사용되는 "백본 부착점"은 하이드록실기와 같은 작용기, 또는 일반적으로 백본, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 포스페이트, 또는 변형 포스페이트, 예를 들어, 황 함유 백본으로의 담체 단량체의 혼입에 적절하며 이에 이용가능한 결합을 지칭한다. "테터링 부착점"(TAP)은 선택된 모이어티를 연결하는(백본 부착점을 제공하는 원자와 구별되는) 탄소 원자 또는 헤테로원자와 같은 사이클릭 담체의 구성원 고리 원자를 지칭한다. 선택된 모이어티는, 예를 들어, 탄수화물, 예를 들어, 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 올리고당류 및 다당류일 수 있다. 선택적으로, 선택된 모이어티는 담체 단량체에의 개입 테터에 의해 연결된다. 따라서, 담체는 종종 아미노기와 같은 작용기를 포함하거나, 또는 일반적으로 구성분 원자에의 리간드와 같은 또 다른 화학적 엔터티의 혼입 또는 테터링에 적절한 결합을 포함할 것이다.

전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함되는, 핵산의 접합체의 제조가 교시되어 있는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 No. 4,828,979; 4,948,882; 5,218, 105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,149,782; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599, 923; 5,599,928; 5,672,662; 5,688,941; 5,714,166; 6,153,737; 6,172,208; 6,300,319; 6,335,434; 6,335,437; 6,395,437; 6,444,806; 6,486,308; 6,525,031; 6,528,631; 6,559,279를 포함하나, 이로 한정되지 않는다.

리간드는 링커 또는 담체를 통해 iRNA 제제에 접합될 수 있기 때문에, 그리고 링커 또는 담체는 분지형 링커를 함유할 수 있기 때문에, iRNA 제제는 이후 담체에 대한 동일하거나 상이한 백본 부착점을 통해, 또는 분지형 링커(들)를 통해 다중 리간드를 함유할 수 있다. 예를 들어, 분지형 링커의 분지점은 이가, 삼가, 사가, 오가, 또는 육가 원자, 또는 그러한 다중 원자가를 나타내는 기일 수 있다. 소정의 구현예에서, 분지점은 -N, -N(Q)-C, -O-C, -S-C, -SS-C, -C(O)N(Q)-C, -OC(O)N(Q)-C, -N(Q)C(O)-C, 또는 -N(Q)C(O)O-C이고; 여기서 Q는 독립적으로 각 경우에 H 또는 선택적으로 치환된 알킬이다. 다른 구현예에서, 분지점은 글리세롤 또는 글리세롤 유도체이다.

후보물질 iRNA의 평가

제제 또는 변형된 분자 및 대조 분자를 적절한 조건에 노출시키고, 선택된 특성의 존재에 대하여 평가함으로써 선택된 특성에 대한 후보물질 iRNA 제제, 예를 들어, 변형된 RNA가 평가될 수 있다. 예를 들어, 분해제에 대한 저항성은 다음과 같이 평가될 수 있다. 후보물질 변형된 RNA(및 대조 분자, 일반적으로 비변형 형태)는 분해 조건에 노출, 예를 들어, 분해제, 예를 들어, 뉴클레아제를 포함하는 환경에 노출될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플, 예를 들어, 치료 용도, 예를 들어, 혈액 또는 세포 분획, 예를 들어, 무세포 균질물 또는 파괴된 세포에 주어질 수 있는 환경과 유사한 것이 사용될 수 있다. 후보물질 및 대조는 이후 임의의 다수 접근법들에 의해 분해에 대한 저항성에 대하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 후보물질 및 대조는 노출 전에, 예를 들어, 방사성 또는 효소 표지, 또는 Cy3 또는 Cy5와 같은 형광 표지로 표지될 수 있다. 대조 및 변형된 RNA는 분해제, 및 선택적으로 대조, 예를 들어, 불활성화된, 예를 들어, 열 불활성화된 분해제와 함께 인큐베이션될 수 있다. 물리적 파라미터, 예를 들어, 변형 및 대조 분자의 크기가 이후 결정된다. 이들은 분자가 이의 원래의 길이를 유지했는지를 평가하기 위해 물리적 방법, 예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 사이징 컬럼에 의해 결정되거나, 기능적으로 평가될 수 있다. 대안적으로, 노던 블럿 분석은 비표지된 변형 분자의 길이를 검정하기 위해 사용될 수 있다.

기능 검정이 또한 후보물질 제제를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 기능 검정은, 변형이 유전자 발현을 사일런싱시키는 분자의 능력을 변경하는 지를 알아내기 위해 초기에 또는 조기 비-기능 검정(예를 들어, 분해 저항성에 대한 검정) 후에 적용될 수 있다. 예를 들어, 세포, 예를 들어, 마우스 또는 인간 세포와 같은 포유류 세포는 형광 단백질, 예를 들어, GFP를 발현하는 플라스미드, 및 형광 단백질을 코딩하는 전사체에 상동성인 후보물질 RNA 제제로 공동-형질감염될 수 있다(예를 들어, WO 00/44914 참조). 예를 들어, GFP mRNA에 상동성인 변형 dsiRNA는 형질감염이 후보 물질 dsiRNA를 포함하지 않은 대조 세포, 예를 들어, 제제가 첨가되지 않는 대조 및/또는 비-변형 RNA가 첨가되지 않은 대조에 비해, 세포 형광의 감소를 모니터링함으로써 GFP 발현을 억제하는 능력에 대하여 검정될 수 있다. 유전자 발현에 대한 후보물질 제제의 효능은 변형 및 비변형 dssiRNA 화합물의 존재에서 세포 형광을 비교함으로써 평가될 수 있다.

대안적인 기능 검정에서, 내인성 마우스 유전자, 예를 들어, c-mos와 같은 모체에서 발현된 유전자에 상동성인 후보물질 dssiRNA 화합물은 미성숙 마우스 난모세포에 주사되어 제제가 생체내에서 유전자 발현을 억제하는 능력을 평가할 수 있다(예를 들어, WO 01/36646 참조). 난모세포의 표현형, 예를 들어, 중기 II에서 정지를 유지하는 능력은 제제가 발현을 억제하고 있다는 지표로서 모니터링될 수 있다. 예를 들어, dssiRNA 화합물에 의한 c-mos mRNA의 분해는 난모세포가 중기 정지를 종료하고 단위생식 발달을 개시하게 할 것이다(Colledge et al. Nature 370: 65-68, 1994; Hashimoto et al. Nature, 370:68-71, 1994). 타겟 RNA 수준에 대한 변형된 제제의 효과는 음성 대조군과 비교하여, 타겟 mRNA 수준의 감소에 대해 검정하는 노던 블롯에 의해, 또는 타겟 단백질의 수준 감소에 대해 검정하는 웨스턴 블롯에 의해 검증될 수 있다. 대조군은 제제가 첨가되지 않은 세포 및/또는 비-변형 RNA가 첨가된 세포를 포함할 수 있다.

생리적 효과

본원에 기재된 siRNA 화합물은 인간 및 비-인간 동물 서열 둘 모두와 siRNA의 상보성에 의해 치료 독성의 결정이 더 용이하도록 설계될 수 있다. 이러한 방법에 의해, siRNA는 인간으로부터의 핵산 서열 및 적어도 하나의 비-인간 동물, 예를 들어, 비-인간 포유류, 예컨대, 설치류, 반추류 또는 영장류로부터의 핵산 서열과 완전 상보적인 서열로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 비-인간 포유류는 마우스, 래트, 개, 돼지, 염소, 양, 소, 원숭이, 판 파니스쿠스(Pan paniscus), 판 트로글로디테스(Pan troglodytes), 마카카 물라토(Macaca mulatto), 또는 시노몰구스(Cynomolgus) 원숭이일 수 있다. siRNA 화합물의 서열은 비-인간 포유류 및 인간의 상동성 유전자, 예를 들어, 종양유전자 또는 종양 억제 유전자 내에서 서열과 상보적일 수 있다. 비-인간 포유류에서 siRNA 화합물의 독성을 결정함으로써, 인간에서 siRNA 화합물의 독성이 추정될 수 있다. 보다 강도 높은 독성 시험의 경우, siRNA는 인간 및 하나보다 많은, 예를 들어, 2개 또는 3개 이상의 비-인간 동물과 상보적일 수 있다.

본원에 기재된 방법은 인간에 대한 siRNA 화합물의 임의의 생리적 효과, 예를 들어, 임의의 원치 않는 효과, 예컨대, 독성 효과, 또는 임의의 긍정적인 또는 요망되는 효과를 상관관계하는 데 사용될 수 있다.

siRNA의 세포 흡수 증가

siRNA의 세포 흡수 및/또는 세포내 타겟화를 증가시키는 공유 부착된 접합체를 함유하는 다양한 siRNA 조성물이 본원에 기재된다.

추가로, siRNA 화합물 및 세포 내 siRNA의 흡수에 영향을 미치는 약물을 투여하는 단계를 포함하는 본 발명의 방법이 제공된다. 약물은 siRNA 화합물이 투여되기 전에, 그 후에, 또는 동시에 투여될 수 있다. 약물은 siRNA 화합물에 공유 또는 비-공유 연결될 수 있다. 약물은, 예를 들어, 지질다당류, p38 MAP 키나제의 활성화제, 또는 NF-

의 활성화제일 수 있다. 약물은 세포에 대한 일시적 효과를 가질 수 있다. 약물은, 예를 들어, 세포의 세포골격을 파열시킴으로써, 예를 들어, 세포의 미세소관, 미세섬유 및/또는 중간 필라멘트를 파열시킴으로써 세포의 siRNA 화합물의 흡수를 증가시킬 수 있다. 약물은 예를 들어, 탁손, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 사이토칼라신, 노코다졸, 야플라키놀리드, 라트룬쿨린 A, 팔로이딘, 스윈홀라이드 A, 인다노신, 또는 마이오세르빈일 수 있다. 약물은 또한, 예를 들어, 염증 반응을 활성화시킴으로써 siRNA 화합물의 주어진 세포 또는 조직으로의 흡수를 증가시킬 수 있다. 이러한 효과를 갖는 예시적인 약물로는, 종양 괴사 인자 알파(TNF 알파), 인터루킨-1 베타, CpG 모티프, 감마 인터페론 또는 더욱 일반적으로는 톨-유사 수용체를 활성화시키는 제제를 포함한다.

siRNA 생산

siRNA는, 예를 들어, 벌크로, 다양한 방법에 의해 생산될 수 있다. 예시적인 방법은 유기 합성 및 RNA 분해, 예를 들어, 시험관내 분해를 포함한다.

유기 합성. siRNA는 개별적으로 단일 가닥 RNA 분자, 또는 이중-가닥 RNA 분자의 각각의 개개 가닥을 합성함으로써 제조될 수 있고, 그 후에 구성 가닥이 이후 어닐링될 수 있다.

대형 생물반응기, 예를 들어, Pharmacia Biotec AB(스웨덴 웁살라)로부터의 OligoPilot II는 주어진 siRNA에 대해 다량의 특정 RNA 가닥을 생성시키기 위해 사용될 수 있다. OligoPilotII 반응기는 단지 1.5 몰 과량의 포스포라미다이트 뉴클레오타이드를 사용하여 뉴클레오타이드를 효율적으로 커플링할 수 있다. RNA 가닥을 제조하기 위해, 리보뉴클레오타이드 아미다이트가 사용된다. 단량체 첨가의 표준 사이클이 siRNA에 대해 21개 내지 23개의 뉴클레오타이드 가닥을 합성하기 위해 사용될 수 있다. 전형적으로, 두 개의 상보적 가닥은 별개로 생성된 후, 예를 들어, 고형 지지체로부터의 방출 및 탈보호 후에 어닐링된다.

유기 합성은 별개의 siRNA 종을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 특정 타겟 유전자에 대한 종의 상보성은 정확하게 명시될 수 있다. 예를 들어, 종은 다형체, 예를 들어, 단일 뉴클레오타이드 다형체를 포함하는 영역과 상보적일 수 있다. 추가로, 다형체의 위치는 정확하게 규정될 수 있다. 일부 구현예에서, 다형체는 내부 영역, 예를 들어, 하나의 말단 또는 양 말단으로부터 적어도 4개, 5개, 7개, 또는 9개 뉴클레오타이드에 위치한다.

dsiRNA 분해. siRNA는 또한 보다 큰 siRNA를 분해함으로써 제조될 수 있다. 분해는 시험관내 또는 생체내에서 매개될 수 있다. 예를 들어, 시험관내에서 분해에 의해 iRNA를 생성시키기 위해, 하기 방법이 이용될 수 있다:

시험관내 전사. dsiRNA는 양 방향으로 핵산(DNA) 세그먼트를 번역함으로써 생성된다. 예를 들어, HiScribe™ RNAi 전사 키트(New England Biolabs)은 벡터를 T7 프로모터에 의해 양측에 측접된 위치에서 벡터에 클로닝된 핵산 세그먼트에 대해 dsiRNA를 생성시키기 위한 벡터 및 방법을 제공한다. 별개의 주형이 dsiRNA에 대한 두 개의 상보적 가닥의 T7 전사에 대하여 생성되었다. 주형은 T7 RNA 폴리머라제의 첨가에 의해 시험관내에서 번역되고, dsiRNA가 생성된다. PCR 및/또는 다른 RNA 폴리머라제(예를 들어, T3 또는 SP6 폴리머라제)를 사용하는 유사한 방법이 또한 재조합 효소의 제제를 오염시킬 수 있는 도톡신일 수 있다.

시험관내 분해. 일 구현예에서, 이러한 방법에 의해 생성된 RNA는, 예를 들어, 다이서 또는 필적 가능한 RNAse III-기반 활성을 이용하여 시험관내에서 siRNA로 분해되는 말단siRNA를 제거하기 위해 주의하여 정제된다. 예를 들어, dsiRNA는 초파리로부터 또는 정제된 구성분, 예를 들어, 정제된 RNAse 또는 RISC 복합체(RNA-유도 사일런싱 복합체)를 사용하여 시험관내 추출물에서 인큐베이션될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ketting et al. Genes Dev 2001 Oct 15;15(20):2654-9]; 및 문헌[Hammond Science 2001 Aug 10;293(5532):1146-50]을 참조하라.

dsiRNA 분해는 일반적으로, 각각 소스 dsiRNA 분자의 특정 21 nt 내지 23 nt 단편인, 복수의 siRNA 종을 생성시킨다. 예를 들어, 소스 dsiRNA 분자의 오버랩핑 영역 및 인접 영역과 상보적인 서열을 포함하는 siRNA가 존재할 수 있다.

합성 방법에 상관없이, siRNA 제제는 제형화에 적절한 용액(예를 들어, 수용액 및/또는 유기 용액)에서 제조될 수 있다. 예를 들어, siRNA 제제는 순수한 이중-증류수에서 침전되고 재용해되고, 동결건조될 수 있다. 건조된 siRNA는 이후 의도된 제형화 공정에 적절한 용액에서 재현탁될 수 있다.

친유성 모이어티에 접합된 이중-가닥 iRNA 제제의 제조

일부 구현예에서, 친유성 모이어티를 함유하는 친유성 단량체는 뉴클레오베이스, 당 모이어티, 또는 뉴클레오사이드간 결합을 통해 화합물에 접합된다.

퓨린 뉴클레오베이스 또는 이의 유도체에 대한 접합은 내향고리 및 외향 고리 원자를 포함하여 임의의 위치에서 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 퓨린 뉴클레오베이스의 2-, 6-, 7-, 또는 8-위치는 접합체 모이어티에 부착된다. 피리미딘 뉴클레오베이스 또는 이의 유도체에 대한 접합은 또한 임의의 위치에서 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 피리미딘 뉴클레오베이스의 2-, 5-, 및 6-위치는 접합체 모이어티로 치환될 수 있다. 친유성 모이어티가 뉴클레오베이스에 접합되는 경우, 바람직한 위치는 혼성화를 방해하지 않는, 즉, 염기 페이링에 필요한 수소 결합 상호작용을 방해하지 않는 위치이다. 일 구현예에서, 친유성 모이어티를 함유하는 친유성 단량체는 알킬, 알케닐 또는 아미드 결합을 함유하는 링커를 통해 뉴클레오베이스에 접합될 수 있다.

뉴클레오사이드의 당 모이어티에 대한 접합은 임의의 탄소 원자에서 발생할 수 있다. 친유성 모이어티가 부착될 수 있는 당 모이어티의 예시적인 탄소 원자는 2', 3', 및 5' 탄소 원자를 포함한다. 친유성 모이어티는 또한 무염기 잔기에서와 같이 1' 위치에 부착될 수 있다. 일 구현예에서, 친유성 모이어티는 링커로 또는 링커 없이 2'-O 변형을 통해 당 모이어티에 접합될 수 있다.

뉴클레오사이드간 결합은 또한 친유성 모이어티를 가질 수 있다. 인-함유 결합(예를 들어, 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오테이트, 및 포스포로아미데이트 등)을 위해, 친유성 모이어티는 직접적으로 인 원자에 또는 인 원자에 결합된 O, N, 또는 S 원자에 부착될 수 있다. 아민- 또는 아미드-함유 뉴클레오사이드간 결합(예를 들어, PNA)을 위해, 친유성 모이어티는 아민 또는 아미드의 질소 원자에 또는 인접한 탄소 원자에 부착될 수 있다.

일 구현예에서, 제1(상보적) RNA 가닥 및 제2(센스) RNA 가닥은 개별적으로 합성될 수 있고, 여기서 RNA 가닥 중 하나는 펜던트 친유성 모이어티를 포함하고, 제1 및 제2 RNA 가닥은 혼합되어 dsRNA를 형성시킨다. RNA 가닥을 합성하는 단계는 바람직하게는 고체-상 합성을 포함하며, 여기서 개별 뉴클레오타이드는 연속적인 합성 사이클에서 뉴클레오타이드간 3'-5' 포스포디에스테르 결합의 형성을 통해 말단에서 말단으로 접합된다.

일 구현예에서, 포스포라미다이트 기를 갖는 친유성 분자는 마지막 합성 사이클에서 제1(상보적) 또는 제2(센스) RNA 가닥의 3'-말단 또는 5'-말단에 커플링된다. RNA의 고체-상 합성에서, 뉴클레오타이드는 처음에 뉴클레오사이드 포스포라미다이트의 형태이다. 각 합성 사이클에서, 추가 뉴클레오사이드 포스포라미다이트는 이전에 혼입된 뉴클레오타이드의 -OH 기에 연결된다. 친유성 분자가 포스포라미다이트 기를 갖는 경우, 이는 고체-상 합성에서 이전에 합성된 RNA의 자유 OH 말단에 대한 뉴클레오사이드 포스포라미다이트와 유사한 방식으로 커플링될 수 있다. 합성은 통상적인 RNA 합성기를 이용하여 자동화된 및 표준화된 방식으로 일어날 수 있다. 포스포라미다이트 기를 갖는 친유성 분자의 합성은 포스포라미다이트 기를 생성시키기 위해 자유 하이드록실의 포스피틸화를 포함할 수 있다.

일반적으로, 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어, 각각 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되는, 문헌[Caruthers et al., Methods in Enzymology (1992) 211:3-19]; WO 99/54459; 문헌[Wincott et al., Nucl. Acids Res. (1995) 23:2677-2684]; 문헌[Wincott et al., Methods Mol. Bio., (1997) 74:59]; 문헌[Brennan et al., Biotechnol. Bioeng. (1998) 61:33-45]; 및 미국 특허 No. 6,001,311에 기재된 바와 같이 당업계에 알려진 프로토콜을 이용하여 합성될 수 있다. 일반적으로, 올리고뉴클레오타이드의 합성은 5'-말단에 디메톡시트리릴, 및 3'-말단에 포스포라미다이트와 같이 통상적인 핵산 보호 및 커플링기를 포함한다. 비-제한적 예에서, 소규모 합성이 ChemGenes Corporation(애슐랜드, 매사추세츠)에 의해 시판되는 리보뉴클레오사이드 포스포라미다이트를 사용하여 Applied Biosystems, Inc.(바이터슈타트, 독일)에 의해 시판되는 Expedite 8909 RNA 합성기에서 실시된다. 대안적으로, 합성은 96-웰 플레이트 합성기, 예컨대, Protogene(팰로앨토, 캘리포니아)에 의해 생산된 기기에서, 또는 각각 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 문헌[Usman et al., J. Am. Chem. Soc. (1987) 109:7845]; 문헌[Scaringe, et al., Nucl. Acids Res. (1990) 18:5433]; 문헌[Wincott, et al., Nucl. Acids Res. (1990) 23:2677-2684]; 및 문헌[Wincott, et al., Methods Mol. Bio. (1997) 74:59]에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 핵산 분자는 개별적으로 합성되고, 합성 후에, 예를 들어, 결찰(문헌[Moore et al., Science (1992) 256:9923]; WO 93/23569; 문헌[Shabarova et al., Nucl. Acids Res. (1991) 19:4247]; 문헌[Bellon et al., Nucleosides & Nucleotides (1997) 16:951]; 문헌[Bellon et al., Bioconjugate Chem. (1997) 8:204]에 의해; 또는 합성 및/또는 탈보호 후 혼성화에 의해 함께 접합될 수 있다. 핵산 분자는 통상적인 방법을 이용하여 겔 전기영동에 의해 정제될 수 있거나, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC; 그 전체가 여기서 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 상기 Wincott 등의 문헌 참조)에 의해 정제되고 물에서 재현탁될 수 있다.

약제학적 조성물

하나의 양태에서, 본 발명은 타겟 RNA와 상보적인, 예를 들어, 실질적으로 및/또는 정확히 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 공정될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체를 코딩하는 DNA)을 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 타겟 RNA는 내인성 인간 유전자의 전사물일 수 있다. 일 구현예에서, siRNA 화합물은 (a)가 19개 내지 25개 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 21개 내지 23개 뉴클레오타이드이고, (b)는 내인성 타겟 RNA와 상보적이고, 선택적으로, (c)는 적어도 하나의 3' 오버행 1 nt 내지 5 nt 길이를 포함한다. 일 구현예에서, 약학적 조성물은 에멀젼, 마이크로에멀젼, 크림, 젤리, 또는 리포좀일 수 있다.

일 예에서, 약학적 조성물은 국소 전달제와 혼합된 siRNA 화합물을 포함한다. 국소 전달제는 복수의 미세 소수포일 수 있다. 미세 소수포는 리포좀일 수 있다. 일부 구현예에서, 리포좀은 양이온성 리포좀이다.

또 다른 양태에서, 약학적 조성물은 국소적 침투 증진제와 혼합된 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 공정될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체를 코딩하는 DNA)를 포함한다. 일 구현예에서, 국소 침투 증진제는 지방산이다. 지방산은 아라키돈산, 올레산, 라우르산, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자사이클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 또는 C_1-10 알킬 에스테르, 모노글리세라이드, 디글리세라이드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다.

또 다른 구현예에서, 국소 침투 증진제는 담즙염이다. 담즙염은 콜릭산, 데하이드로콜릭산, 데옥시콜릭산, 글루콜릭산, 글리콜릭산, 글리코데옥시콜릭산, 타우로콜릭산, 타우로데옥시콜릭산, 케노데옥시콜릭산, 우르소데옥시콜릭산, 소듐 타우로-24,25-디하이드로-푸시데이트, 소듐 글리코디하이드로푸시데이트, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다.

또 다른 구현예에서, 침투 증진제는 킬레이팅제이다. 킬레이팅제는 EDTA, 시트르산, 살리실레이트, 콜라겐의 N-아실 유도체, 라우레쓰-9, 베타-디케톤의 N-아미노 아실 유도체 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

또 다른 구현예에서, 침투 증진제는 계면활성제, 예를 들어, 이온성 또는 비이온성 계면활성제이다. 계면활성제는 소듐 라우릴 설페이트, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르, 퍼플루오르화합물 에멀젼 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

또 다른 구현예에서, 침투 증진제는 불포화 사이클릭 우레아, 1-알킬-알콘, 1-알케닐아자사이클로-알카논, 스테로이드성 항-염증제 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 추가의 또 다른 구현예에서, 침투 증진제는 글리콜, 피롤, 아존, 또는 테르펜일 수 있다.

하나의 양태에서, 본 발명은 경구 전달에 적합한 형태의 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 공정될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체를 코딩하는 DNA)을 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 일 구현예에서, 경구 전달은 siRNA 화합물 조성물을 위장관, 예를 들어 소장, 결장(예를 들어, 결장암 치료를 위해) 등의 세포 또는 영역에 전달하는 데 사용될 수 있다. 경구 전달 형태는 정제, 캡슐 또는 겔 캡슐일 수 있다. 일 구현예에서, 약학적 조성물의 siRNA 화합물은 세포 접착 단백질의 발현을 조절하거나, 세포 증식 속도를 조절하거나, 진핵 병원체 또는 레트로바이러스에 대항하는 생물학적 활성을 갖는다. 또 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 포유류 위에서 정제, 캡슐 또는 겔 캡슐의 용해를 실질적으로 방지하는 장용 물질을 포함한다. 일부 구현예에서, 장용 물질은 코팅이다. 코팅은 아세테이트 프탈레이트, 프로필렌 글리콜, 소르비탄 모노놀레에이트, 셀룰로스 아세테이트 트리멜리테이트, 하이드록시 프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트 또는 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트일 수 있다.

또 다른 구현예에서, 약학적 조성물의 경구 투여형은 침투 증진제를 포함한다. 침투 증진제는 담즙염 또는 지방산일 수 있다. 담즙염은 우르소데옥시콜릭산, 케노데옥시콜릭산, 및 이의 염일 수 있다. 지방산은 카프르산, 라우르산, 및 이의 염일 수 있다.

또 다른 구현예에서, 약학적 조성물의 경구 투여형은 부형제를 포함한다. 일 예에서, 부형제는 폴리에틸렌글리콜이다. 또 다른 예에서, 부형제는 프레시롤이다.

또 다른 구현예에서, 약학적 조성물의 경구 투여형은 가소제를 포함한다. 가소제는 디에틸 프탈레이트, 트리아세틴 디부틸 세바케이트, 디부틸 프탈레이트 또는 트리에틸 시트레이트일 수 있다.

하나의 양태에서, 본 발명은 siRNA 화합물 및 전달 비히클을 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 일 구현예에서, siRNA 화합물은 (a)가 19개 내지 25개 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 21개 내지 23개 뉴클레오타이드이고, (b)는 내인성 타겟 RNA와 상보적이고, 선택적으로, (c)는 적어도 하나의 3' 오버행 1개 내지 5개 뉴클레오타이드 길이를 포함한다.

일 구현예에서, 전달 비히클은 국소적 투여 경로에 의해 세포에 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 공정될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체를 코딩하는 DNA)을 전달할 수 있다. 전달 비히클은 미세 소수포일 수 있다. 일 예에서, 미세 소수포는 리포좀이다. 일부 구현예에서, 리포좀은 양이온성 리포좀이다. 또 다른 예에서, 미세 소수포는 미셀이다. 하나의 양태에서, 본 발명은 주사용 투여형의 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 공정될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체를 코딩하는 DNA)을 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 일 구현예에서, 약학적 조성물의 주사용 투여형은 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 일부 구현예에서, 멸균 용액은 희석제, 예컨대, 물; 염류 용액; 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 또는 프로필렌 글리콜을 포함할 수 있다.

하나의 양태에서, 본 발명은 경구 투여형의 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 공정될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체를 코딩하는 DNA)을 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 일 구현예에서, 경구 투여형은 정제, 캡슐 및 겔 캡슐로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 약학적 조성물은 포유류 위에서 정제, 캡슐 또는 겔 캡슐의 용해를 실질적으로 방지하는 장용 물질을 포함한다. 일부 구현예에서, 장용 물질은 코팅이다. 코팅은 아세테이트 프탈레이트, 프로필렌 글리콜, 소르비탄 모놀레에이트, 셀룰로스 아세테이트 트리멜리테이트, 하이드록시 프로필 메틸 셀룰로스 프탈레이트 또는 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트일 수 있다. 일 구현예에서, 약학적 조성물의 경구 투여형은 침투 증진제, 예를 들어, 본원에 기재된 침투 증진제를 포함한다.

하나의 양태에서, 본 발명은 직장 투여형의 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 공정될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체를 코딩하는 DNA)을 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 일 구현예에서, 직장 투여형은 관장제이다. 또 다른 구현예에서, 직장 투여형은 좌제이다.

하나의 양태에서, 본 발명은 질 투여형의 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 공정될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체를 코딩하는 DNA)을 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 일 구현예에서, 질 투여형은 좌제이다. 또 다른 구현예에서, 질 투여형은 발포체, 크림, 또는 겔이다.

하나의 양태에서, 본 발명은 폐 또는 비내 투여형의 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 공정될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체를 코딩하는 DNA)을 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다. 일 구현예에서, siRNA 화합물은 입자, 예를 들어, 거대입자, 예를 들어, 미소구체로 혼입된다. 입자는 분무 건조, 동결건조, 증발, 유동층 건조, 진공 건조, 또는 이들의 조합에 의해 생성될 수 있다. 미소구체는 현탁액, 분말, 또는 이식가능한 고형물로서 제형화될 수 있다.

치료 방법 및 전달 경로

본 발명의 또 다른 양태는 세포에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 상기 세포를 본 발명의 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 세포는 간외 세포이다.

본 발명의 또 다른 양태는 피험자에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 본 발명의 화합물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는 CNS 장애를 갖는 피험자를 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 본 발명의 이중-가닥 RNAi 제제를 피험자에게 투여하고, 이에 의해 피험자를 치료하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 예시적인 CNS 장애는 알츠하이머, 근위축성 축삭 경화증(ALS), 전측두엽 치매, 헌팅턴, 파킨슨, 척수소뇌, 프리온 및 라포라를 포함한다.

본 발명의 화합물은 타겟화되는 유전자의 유형 및 치료하고자 하는 장애의 유형에 좌우하여 다양한 경로에 의해 피험자에게 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 화합물은 간외로, 예컨대, 안구 투여(예를 들어, 유리체내 투여) 또는 척수강내 또는 뇌실내 투여로 투여된다.

일 구현예에서, 화합물은 척수강내로 또는 뇌실내로 투여된다. 이중-가닥 iRNA 제제의 척수강내 또는 뇌실내 투여에 의해, 방법은 뇌 또는 척추 조직, 예를 들어, 피질, 소뇌, 경추, 요추 및 흉추에서 타겟 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.

일부 구현예에서, 예시적인 타겟 유전자는 APP, ATXN2, C9orf72, TARDBP, MAPT(Tau), HTT, SNCA, FUS, ATXN3, ATXN1, SCA1, SCA7, SCA8, MeCP2, PRNP, SOD1, DMPK, 및 TTR이다. 피험자에서 이러한 타겟 유전자의 발현을 감소시키기 위해, 화합물은 눈(들)에 직접적으로(예를 들어, 유리체내로) 투여될 수 있다. 이중-가닥 iRNA 제제의 유리체내 투여에 의해, 방법은 안구 조직에서 타겟 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.

제형화에 대한 설명의 용이함을 위해, 본 섹션에서 조성물 및 방법은 대체로 변형 siRNA 화합물과 관련하여 논의된다. 그러나, 이러한 제형화, 조성물 및 방법은 다른 siRNA 화합물, 예를 들어, 비변형 siRNA 화합물로 실시될 수 있으며, 그러한 실시는 본 발명의 내에 있다는 것이 이해될 수 있다. iRNA를 포함하는 조성물은 다양한 경로에 의해 피험자에게 전달될 수 있다. 예시적인 경로는 정맥내, 국소, 직장, 항문, 질, 비내, 폐, 안구를 포함한다.

본 발명의 iRNA 분자는 투여에 적절한 약학적 조성물에 혼입될 수 있다. 이런 조성물은 전형적으로, siRNA 화학종 하나 이상 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 본원에서, 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는, 약학적 투여와 융화성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장성제 및 흡수지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 약학적 활성 성분에 대한 이런 매질 및 제제의 사용은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 임의의 종래 매질 또는 제제가 활성 화합물과 비융화성인 점을 제외하고는, 조성물에서 이의 사용이 고려된다. 보충적 활성 화합물이 또한 이 조성물에 혼입될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은, 국소 또는 전신 치료가 바람직한지의 여부, 및 치료 영역에 따라, 다수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는(안내, 질, 직장, 비내, 경피를 비롯하여) 국소 투여, 경구 투여 또는 비경구 투여일 수 있다. 비경구 투여로는, 정맥내 드립(drip), 피하, 복강내 또는 근육내 주사, 또는 척추강내 또는 뇌실내 투여를 포함한다.

투여 경로 및 부위는 타겟화를 증대시키도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 근육 세포를 타겟으로 하기 위해서는, 목적하는 근육으로 근육내 주사하는 것이 타당한 선택일 것이다. 폐세포는 iRNA를 에어로졸 형태로 투여함으로써 타겟화될 것이다. 혈관 내피 세포는 벌룬 카테터(balloon catheter)를 iRNA로 코팅하고 DNA를 기계적으로 도입함으로써 타겟화될 수 있다.

국소 투여용 제형은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적약, 좌제, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 통상적인 약학적 담체, 수성, 분말 또는 유성 베이스, 및 증점제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다. 코팅된 콘돔, 및 장갑 등도 유용할 수 있다.

경구 투여용 조성물은 분말 또는 과립, 물, 시럽, 엘릭서 또는 비-수성 매질 중의 현탁액 또는 용액, 정제, 캡슐, 로젠지 또는 트로키를 포함한다. 정제의 경우에, 사용될 수 있는 담체는 락토스, 소듐 시트레이트 및 인산의 염을 포함한다. 다양한 붕해제, 예컨대, 전분, 및 윤활제, 예컨대, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 라우릴 설페이트 및 탈크가 정제에 흔히 사용된다. 캡슐 형태의 경구 투여를 위해, 유용한 희석제는 락토스 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜이다. 수성 현탁액이 경구 사용에 필요한 경우, 핵산 조성물은 유화제 및 현탁화제와 조합될 수 있다. 요망되는 경우, 특정 감미제 및/또는 향미제가 첨가될 수 있다.

척수강내 또는 심실내 또는 뇌실내 투여용 조성물은, 또한 완충제, 희석제 및 기타 적합한 첨가제를 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제형은, 또한 완충제, 희석제 및 기타 적합한 첨가제를 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다. 뇌실내 주사는, 예를 들어, 저장소에 부착된 뇌실내 카테터에 의해 용이해질 수 있다. 정맥내 사용을 위해, 용질의 최종 농도는 제제를 등장성으로 만들도록 제어될 수 있다.

안구 투여를 위해, 연고 또는 점적 가능한 액체는 어플리케이터 또는 점안제와 같은 당업계에 알려진 안구 전달 시스템에 의해 전달될 수 있다. 이러한 조성물은 무코모방체, 예컨대, 하이알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 또는 폴리(비닐 알코올), 보존제, 예컨대, 소르브산, EDTA 또는 벤질크로늄 클로라이드, 및 보통량의 희석제 및/또는 담체를 포함할 수 있다.

일 구현예에서, siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물 조성물의 투여는 비경구, 예를 들어, 정맥내(예를 들어, 볼루스 또는 분산형 투입), 피내, 복강내, 근육내, 척추강내, 심실내, 뇌실내, 두개내, 피하, 경점막, 협측, 설하, 내시경적, 직장, 경구, 질, 국소, 폐, 비내, 요도 또는 안구이다. 투여는 피험자에 의해 또는 의료인과 같은 다른 사람에 의해 제공될 수 있다. 약제는 측정된 투약량, 또는 계량된 투약량을 전달하는 디스펜서(dispenser)로 제공될 수 있다. 선택된 전달 방식은 하기에서 보다 상세히 논의된다.

척수강내 투여. 일 구현예에서, 화합물은 척수강내 주사(즉, 뇌와 척수 조직을 담그는 척수액에 주사)에 의해 전달된다. 척수액으로의 iRNA 제제의 척수강내 주사는 볼루스 주사로서 또는 피부 아래에 이식될 수 있는 미니펌프를 통해 수행되어 척수액으로 siRNA의 정기적이고 지속적인 전달을 제공할 수 있다. 척수액이 생성되는 맥락막 신경총으로부터의 척수액 순환은 척수와 등쪽 뿌리 신경절 주위로 내려가 이어서 소뇌를 지나 피질 위에서 거미막 과립으로 올라가고, 여기서 유체가 CNS를 빠져나갈 수 있고, 주사된 화합물의 크기, 안정성 및 용해도에 좌우하여, 척수강내로 전달된 분자는 전체 CNS 전반에 걸쳐 타겟을 공격할 수 있다.

일부 구현예에서, 척수강내 투여는 펌프를 통해 이루어진다. 펌프는 외과적으로 이식된 삼투 펌프일 수 있다. 일 구현예에서, 삼투 펌프는 척수강내 투여를 용이하게 하기 위해 척추관의 지주막하 공간에 이식된다.

일부 구현예에서, 척수강내 투여는 소정 부피의 약학적 제제를 함유하는 저장소, 및 저장소에 함유된 약학적 제제의 일부를 전달하도록 구성된 펌프를 포함하는 약제용 척수강내 전달 시스템을 통해 이루어진다. 이러한 척수강내 전달 시스템에 관한 보다 상세한 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 2015년 1월 28일에 출원된 PCT/US2015/013253에서 찾아볼 수 있다.

척수강내로 또는 뇌실내로 주사된 iRNA 제제의 양은 하나의 타겟 유전자에서부터 또 다른 타겟 유전자까지 다를 수 있고, 적용되어야 하는 적절한 양은 각 타겟 유전자에 대하여 개별적으로 결정되어야 할 수 있다. 전형적으로, 이러한 양은 10 μg 내지 2 mg, 바람직하게는 50 μg 내지 1500 μg, 더욱 바람직하게는 100 μg 내지 1000 μg의 범위이다.

직장 투여. 본 발명은 또한 본원에 기재된 siRNA 화합물의 직장 투여 또는 전달을 위한 방법, 조성물, 및 키트를 제공한다.

이에 따라서, 본원에 기재된 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 공정될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체를 코딩하는 DNA), 예를 들어, 치료적 유효량의 본원에 기재된 siRNA 화합물, 예를 들어, 40개 미만, 예를 들어, 30개 미만의 뉴클레오타이드의 이중 가닥 영역을 갖고 하나 또는 두 개의 1 내지 3 뉴클레오타이드 단일 가닥 3' 오버행을 갖는 siRNA 화합물은 직장으로 투여되는, 예를 들어, 하부 또는 상부 결장으로 직장을 통해 도입될 수 있다. 이러한 접근법은 염증 장애, 원치 않는 세포 증식으로 특성규명되는 장애, 예를 들어, 폴립, 또는 결장암의 치료에 특히 유용하다.

약제는 약제의 전달을 위한 수단을 포함하는 분배 장치, 예를 들어, 결장 검사 또는 폴립 제거에 사용되는 것과 유사한 가요성 카메라-유도 장치를 도입함으로써 결장 부위에 전달될 수 있다.

siRNA 화합물의 직장 투여는 관장제에 의해 이루어진다. 관장제의 siRNA 화합물은 염류 또는 완충 용액에 용해될 수 있다. 직장 투여는 또한, 다른 성분, 예를 들어, 부형제, 예를 들어, 코코아 버터 또는 하이드로프로필메틸셀룰로스를 포함할 수 있는 좌제에 의해 이루어질 수 있다.

안구 전달. 본원에 기재된 iRNA 제제는 안구 조직에 투여될 수 있다. 예를 들어, 약제는 눈 또는 근처 조직의 표면에, 예를 들어, 눈꺼풀의 안쪽에 적용될 수 있다. 이들은 국소적으로, 예를 들어, 스프레이에 의해, 점적약에서, 세안제, 또는 연고로서 적용될 수 있다. 투여는 피험자에 의해 또는 의료인과 같은 다른 사람에 의해 제공될 수 있다. 약제는 측정된 투약량, 또는 계량된 투약량을 전달하는 디스펜서로 제공될 수 있다. 약제는 또한 눈의 안쪽에 투여될 수 있으며, 선택된 부위 또는 구조에 이를 도입할 수 있는 바늘 또는 다른 전달 장치에 의해 도입될 수 있다. 안구 치료는 눈 또는 근처 조직의 염증을 치료하는 데 특히 바람직하다.

소정의 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 눈에 직접적으로 눈주위, 결막, 테논하, 전안방내, 유리체내, 안구내, 전방 또는 후방 근접결막, 망막하, 결막하, 안구후, 또는 소관내 주사와 같이 안구 조직 주사에 의해; 카테터 또는 망막 펠릿, 안구내 삽입물, 좌제 또는 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴성 물질을 포함하는 임플란트와 같은 다른 배치 장치를 사용하여 눈에 직접 적용함으로써; 국소적 안구 점적약 또는 연고에 의해; 또는 맹낭에서 서방형 장치에 의해 전달되거나, 공막(경공막)에 인접하게 또는 공막에(공막내) 또는 눈 안에 이식될 수 있다. 전안방내 주사는 각막을 거쳐 전방 챔버로 제제가 섬유주대에 도달하게 할 수 있다. 소관내 주사는 쉴렘관을 드레이닝하는 정맥 수집 통로로 또는 쉴렘관으로 이루어질 수 있다.

일 구현예에서, 이중-가닥 iRNA 제제는 의료인이 사용하기 위해 즉시 주사 가능한 형태의 예비-충전된 주사기와 같은 유리체내 주사에 의해 눈, 예를 들어, 눈의 유리체방에 투여될 수 있다.

안과 전달을 위해, 이중-가닥 iRNA 제제는 안과적으로 허용 가능한 보존제, 보조용매, 계면활성제, 점도 증진제, 침투 증진제, 완충제, 염화나트륨 또는 물과 조합되어 수성 멸균 안과 현탁액 또는 용액을 형성할 수 있다. 용액 제형은 생리적으로 허용 가능한 등장성 수성 완충액에 접합체를 용해시킴으로써 제조될 수 있다. 추가로, 용액은 이중-가닥 iRNA 제제를 용해시키는 데 도움을 주는 허용 가능한 계면활성제를 포함할 수 있다. 점도 결합제, 예컨대, 하이드록시메틸 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 또는 폴리비닐피롤리돈 등은 이중-가닥 iRNA 제제의 보유를 향상시키기 위해 약학적 조성물에 첨가될 수 있다.

멸균 안내 연고 제형을 제조하기 위해, 이중-가닥 iRNA 제제는 적절한 비히클, 예컨대, 미네랄 오일, 액체 라놀린, 또는 백색 페트롤라툼에서 보존제와 조합된다. 멸균 안내 겔 제형은 당업계에 공지된 방법에 따라, 예를 들어, CARBOPOL®-940(BF Goodrich, 샬럿, N.C.) 등의 조합으로부터 제조된 친수성 베이스에 이중-가닥 iRNA 제제를 현탁시킴으로써 제조될 수 있다.

국소 전달. 임의의 본원에 기재된 siRNA 화합물은 피부에 직접적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 약제는 국소적으로 적용되거나, 예를 들어, 피부에 침투하지만, 예를 들어, 아래의 근육 조직에는 침투하지 않는 미세바늘 또는 미세바늘의 배터리를 사용하여 피부 층에 전달될 수 있다. siRNA 화합물 조성물의 투여는 국소적일 수 있다. 예를 들어, 국소 적용은 조성물을 피험자의 진피 또는 표피에 전달할 수 있다. 국소 투여는 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적약, 좌제, 스프레이, 액체 또는 분말의 형태일 수 있다. 국소 투여용 조성물은 리포좀, 미셀, 에멀젼, 또는 기타 친유성 분자 조립체로서 제형화될 수 있다. 경피 투여는 적어도 하나의 침투 증진제로, 예컨대, 이온삼투, 음파영동, 및 초음파영동으로 적용될 수 있다.

제형화에 대한 설명의 용이함을 위해, 본 섹션에서 조성물 및 방법은 대체로 변형 siRNA 화합물과 관련하여 논의된다. 그러나, 이러한 제형화, 조성물 및 방법은 다른 siRNA 화합물, 예를 들어, 비변형 siRNA 화합물로 실시될 수 있으며, 그러한 실시는 본 발명의 내에 있다는 것이 이해될 수 있다. 일부 구현예에서, siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 공정될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체를 코딩하는 DNA)은 국소 투여를 통해 피험자에게 전달된다. "국소 투여"는 피험자의 표면에 직접적으로 제형을 접촉시킴에 의한 피험자에 대한 전달을 지칭한다. 가장 일반적인 형태의 국소 전달은 피부에 대한 것이지만, 본원에 개시된 조성물은 또한 신체의 다른 표면, 예를 들어, 눈, 점막, 체강 표면 또는 내부 표면에 직접적으로 적용될 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 가장 흔한 국소 전달은 피부에 대한 것이다. 이 용어는 국소 및 경피를 포함하나 이로 한정되지 않는 여러 투여 경로를 포함한다. 이러한 투여 방식은 전형적으로 피부 투과 장벽의 침투 및 타겟 조직 또는 층으로의 효율적인 전달을 포함한다. 국소 투여는 표피 및 진피를 침투하고, 궁극적으로 조성물의 전신 전달을 달성하기 위한 수단으로 사용될 수 있다. 국소 투여는 또한 올리고뉴클레오타이드를 피험자의 표피 또는 진피, 또는 이의 특정 층, 또는 기저 조직에 선택적으로 전달하기 위한 수단으로 사용될 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "피부"는 동물의 표피 및/또는 진피를 지칭한다. 포유류 피부는 두 개의 주요한 별개의 층으로 이루어진다. 피부의 외층은 표피라 불린다. 표피는 각질층, 과립층, 척수층 및 기저층으로 구성되며, 각질층은 피부 표면에 있고 기저층은 표피의 가장 깊은 부분이다. 표피는 이의 신체 상 위치에 좌우하여 50 μm 내지 0.2 mm의 두께이다.

표피 아래에는 표피보다 상당히 더 두꺼운 진피가 있다. 진피는 주로 섬유 다발 형태의 콜라겐으로 구성된다. 콜라겐 다발은 특히 혈관, 림프 모세혈관, 땀샘, 신경 종말 및 면역학적 활성 세포에 대한 지지를 제공한다.

기관으로서의 피부의 주요 기능 중 하나는 물질의 체내 유입을 조절하는 것이다. 피부의 주요 투과 장벽은 다양한 분화 상태에 있는 여러 세포층으로부터 형성된 각질층에 의해 제공된다. 각질층에서 세포 사이의 공간은 피부 투과 장벽을 더 강화하기 위해 시일(seal)을 제공하는 격자-유사 형태로 배열된 상이한 지질로 채워진다.

피부에 의해 제공되는 투과 장벽은 약 750 Da 초과의 분자량을 갖는 분자에 대해 대체로 불투과성이도록 되어 있다. 더 큰 분자가 피부의 투과 장벽을 지나가기 위해서는 정상적인 삼투 이외의 기전이 이용되어야 한다.

여러 요인으로 투여되는 제제에 대한 피부의 투과성이 결정된다. 이러한 요소들은 치료되는 피부의 특징, 전달제의 특징, 약물과 전달제 그리고 약물과 피부 둘 모두 간의 상호작용, 적용되는 약물의 투약량, 치료 형태, 및 치료 후 요법을 포함한다. 표피 및 진피를 선택적으로 타겟화하기 위해, 미리선택된 층으로의 약물 침투를 가능하게 할 하나 이상의 침투 증진제를 포함하는 조성물을 제형화하는 것이 때때로 가능하다.

경피 전달은 지용성 치료제의 투여를 위한 중요한 경로이다. 진피는 표피보다 투과성이 더 높고, 그에 따라 마모되거나, 화상을 입거나, 벗겨진 피부를 통해 흡수가 훨씬 더 빠르다. 피부로의 혈류를 증가시키는 염증 및 기타 생리적 상태가 또한 경피 흡착을 향상시킨다. 이러한 경로를 통한 흡수는 유성 비히클(도찰제)의 사용에 의해 또는 하나 이상의 침투 증진제의 사용을 통해 증진될 수 있다. 경피 경로를 통해 본원에 개시된 조성물을 전달하는 다른 효과적인 방법은 피부의 수화 및 제어형 방출 국소 패치의 사용을 포함한다. 경피 경로는 전신 및/또는 국소 요법을 위해 본원에 개시된 조성물을 전달하는 잠재적으로 효과적인 수단을 제공한다.

또한, 이온삼투(전기장의 영향 하에 생물학적 막을 통해 이온 용질 전달)(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 163), 음파영동 또는 초음파영동(생물학적 막, 특히, 피부 및 각막에 걸쳐 다양한 치료제의 흡수 증진을 위해 초음파 사용)(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 166), 및 투여 위치 및 투여 부위에서의 머무름에 대한 비히클 특징 최적화(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 168)는 피부와 점막 부위에 걸쳐 국소적으로 적용된 조성물의 수송을 향상시키기 위한 유용한 방법일 수 있다.

제공된 조성물 및 방법은 또한 배양되거나 보존된 진피 조직에서 및 동물에서 시험관내 다양한 단백질 및 유전자의 기능을 검사하는 데 사용될 수 있다. 본 발명은 따라서 임의의 유전자의 기능을 검사하는 데 적용될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 치료적으로 또는 예방적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 건선, 편평 태선, 독성 표피 괴사, 다형 홍반, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 악성 흑색종, 파제트병, 카포시 육종, 폐 섬유증, 라임병 및 피부의 바이러스, 진균 및 세균 감염과 같은 질환을 앓는 것으로 인지되거나 의심되는 동물의 치료를 위해 사용될 수 있다.

폐 전달. 임의의 본원에 기재된 siRNA 화합물은 폐기관계에 투여될 수 있다. 폐 투여는 흡입에 의해 또는 폐기관계로의 전달 장치 도입에 의해, 예를 들어, 약제를 분배할 수 있는 전달 장치를 도입함으로써 달성될 수 있다. 특정 구현예는 흡입에 의한 폐 전달 방법을 이용할 수 있다. 약제는 흡입될 수 있도록 충분히 작은 형태로, 예를 들어, 습성 또는 건성으로 약제를 전달하는 디스펜서에서 제공될 수 있다. 장치는 계량된 투약량의 약제를 전달할 수 있다. 피험자, 또는 또 다른 사람이 약제를 투여할 수 있다. 폐 전달은 폐 조직에 직접적으로 영향을 미치는 장애뿐만 아니라 다른 조직에 영향을 미치는 장애에 효과적이다. siRNA 화합물은 폐 전달을 위해 액체 또는 비액체, 예를 들어, 분말, 결정, 또는 에어로졸로서 제형화될 수 있다.

제형화에 대한 설명의 용이함을 위해, 본 섹션에서 조성물 및 방법은 대체로 변형 siRNA 화합물과 관련하여 논의된다. 그러나, 이러한 제형화, 조성물 및 방법은 다른 siRNA 화합물, 예를 들어, 비변형 siRNA 화합물로 실시될 수 있으며, 그러한 실시는 본 발명의 내에 있다는 것이 이해될 수 있다. siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물(예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 공정될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중-가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 또는 이의 전구체를 코딩하는 DNA)을 포함하는 조성물은 폐 전달에 의해 피험자에게 투여될 수 있다. 폐 전달 조성물은 분산액을 환자가 흡입함으로써 전달될 수 있고, 그에 따라, 분산액 내의 조성물, 예를 들어, iRNA가 폐에 도달할 수 있고, 폐에서 폐포 부위를 통해 직접 혈액 순환으로 용이하게 흡수될 수 있다. 폐 전달은 폐의 질환을 치료하기 위해 전신 전달과 국소 전달 둘 모두에 효과적일 수 있다.

폐 전달은 네뷸라이저, 에어로졸, 미세포 및 건조 분말-기반 제형의 사용을 포함하여 여러 접근법에 의해 달성될 수 있다. 전달은 액체 네뷸라이저, 에어로졸-기반 흡입기, 및 건조 분말 분산 장치로 달성될 수 있다. 투약량 계량 장치가 사용될 수 있다. 애토마이저 또는 흡입기 사용의 이점 중 하나는 장치가 자체적으로 함유되어 있기 때문에 오염 가능성이 최소화된다는 것이다. 예를 들어, 건조 분말 분산 장치는 건조 분말로서 용이하게 제형화될 수 있는 약물을 전달한다. iRNA 조성물은 동결건조되거나 분무-건조된 분말로서 단독으로 또는 적합한 분말 담체와 조합하여 안정하게 저장될 수 있다. 흡입용 조성물의 전달은, 장치에 도입될 때 에어로졸 약제의 투여 중 환자에게 용량 추적, 순응도 모니터링, 및/또는 투여 촉구를 가능하게 하는, 타이머, 용량 카운터, 시간 측정 장치, 또는 시간 표시기를 포함할 수 있는 투여 타이밍 부재에 의해 매개될 수 있다.

용어 "분말"은 자유 유동하고 흡입 장치에 용이하게 분산될 수 있고 후속적으로 피험자에 의해 흡입되어 입자가 폐에 도달하여 폐포로 침투할 수 있게 하는, 미분된 고체 입자로 이루어진 조성물을 의미한다. 따라서, 분말은 "호흡성"이라고 한다. 예를 들어, 평균 입도는 비교적 균일한 구형 모양 분포로 약 10 μm 미만의 직경이다. 일부 구현예에서, 직경은 약 7.5 μm 미만, 및 일부 구현예에서 약 5.0 μm 미만이다. 일반적으로, 입도 분포는 약 0.1 μm 내지 약 5 μm의 직경, 때때로, 약 0.3 μm 내지 약 5 μm이다.

용어 "건조"는 조성물이 약 10 중량%(% w) 미만, 일반적으로 약 5% w 미만, 및 일부 경우에 약 3% w.보다 적은 물의 수분 함량을 갖는다는 것을 의미한다. 건조 조성물은 입자가 에어로졸을 형성하도록 흡입 장치에 용이하게 분산가능하게 할 수 있다.

용어 "치료적 유효량"은 예상되는 생리적 반응을 제공하기 위해 치료하고자 하는 피험자에서 요망되는 수준의 약물을 제공하는 데 필요한 조성물에 존재하는 양이다.

용어 "생리적 유효량"은 요망되는 완화 또는 치유 효과를 제공하기 위해 피험자에게 전달되는 양이다.

용어 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 담체가 폐에 대한 유의한 해로운 독성 효과 없이 폐에 취해질 수 있다는 것을 의미한다.

담체로서 유용한 유형의 약학적 부형제는 안정화제, 예컨대, 인간 혈청 알부민(HSA), 벌킹 제제, 예컨대, 탄수화물, 아미노산 및 폴리펩타이드; pH 조절제 또는 완충제; 염, 예컨대, 염화나트륨 등을 포함한다. 이러한 담체는 결정질 또는 비정질 형태일 수 있거나, 이 둘의 혼합일 수 있다.

특히 가치 있는 벌킹 제제는 상용성 탄수화물, 폴리펩타이드, 아미노산 또는 이들의 조합물을 포함한다. 적합한 탄수화물은 단당류, 예컨대, 갈락토스, D-만노스, 및 소르보스 등; 이당류, 예컨대, 락토스, 및 트레할로스 등; 사이클로덱스트린, 예컨대, 2-하이드록시프로필-.베타.-사이클로덱스트린; 및 다당류, 예컨대, 라피노스, 말토덱스트린, 및 덱스트란 등; 알디톨, 예컨대, 만니톨, 및 자일리톨 등을 포함한다. 탄수화물의 그룹은 락토스, 트레할로스, 라피노스 말토덱스트린, 및 만니톨을 포함할 수 있다. 적합한 폴리펩타이드는 아스파르탐을 포함한다. 아미노산은 아닐린 및 글리신을 포함하고, 일부 구현예에서는 글리신이 사용된다.

본 발명의 조성물의 소수 성분인 첨가제는 분무 건조 동안 형태 안정성을 위해 그리고 분말의 분산성을 향상하기 위해 포함될 수 있다. 이러한 첨가제들은 소수성 아미노산, 예컨대, 트립토판, 티로신, 류신, 및 페닐알라닌 등을 포함한다.

적합한 pH 조절제 또는 완충제는 유기산 및 염기로부터 제조된 유기염, 예컨대, 소듐 시트레이트, 및 소듐 아스코르베이트 등을 포함하고; 일부 구현예에서는 소듐 시트레이트가 사용될 수 있다.

미셀 iRNA 제형의 폐 투여는 테트라플루오로에탄, 헵타플루오로에탄, 디메틸플루오로프로판, 테트라플루오로프로판, 부탄, 이소부탄, 디메틸 에테르 및 기타 비-CFC 및 CFC 추진제와 같은 추진제가 있는 투약량 계량 스프레이 장치를 통해 달성될 수 있다.

경구 또는 비내 전달. 본원에 기재된 임의의 siRNA 화합물은 경구로, 예를 들어, 정제, 캡슐, 겔 캡슐, 로젠지, 트로키 또는 액체 시럽의 형태로 투여될 수 있다. 추가로, 조성물은 국소적으로 구강의 표면에 적용될 수 있다.

임의의 본원에 기재된 siRNA 화합물은 비내로 투여될 수 있다. 비내 투여는 비내로 전달 장치의 도입에 의해, 예를 들어, 약제를 분배할 수 있는 전달 장치를 도입함으로써 달성될 수 있다. 비내 전달 방법은, 예를 들어, 점적약에 의한, 또는 비강의 표면에 대한 국소 투여에 의한 스프레이, 에어로졸, 액체를 포함한다. 약제는 흡입될 수 있도록 충분히 작은 형태로, 예를 들어, 습성 또는 건성으로 약제를 전달하는 디스펜서에서 제공될 수 있다. 장치는 계량된 투약량의 약제를 전달할 수 있다. 피험자, 또는 또 다른 사람이 약제를 투여할 수 있다.

비내 전달은 비내 조직에 직접적으로 영향을 미치는 장애뿐만 아니라 다른 조직에 영향을 미치는 장애에 효과적이다. siRNA 화합물은 액체 또는 비액체, 예를 들어, 분말, 결정으로서 또는 비내 전달을 위해 제형화될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "결정질"은 결정의 구조 또는 특징을 갖는 고형물, 즉, 평면이 일정한 각도로 교차하고 규칙적인 내부 구조가있는 3-차원 구조의 입자를 말한다. 본 발명의 조성물은 상이한 결정질 형태를 가질 수 있다. 결정질 형태는, 예를 들어, 분무 건조를 포함하여 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다.

제형화에 대한 설명의 용이함을 위해, 본 섹션에서 조성물 및 방법은 대체로 변형 siRNA 화합물과 관련하여 논의된다. 그러나, 이러한 제형화, 조성물 및 방법은 다른 siRNA 화합물, 예를 들어, 비변형 siRNA 화합물로 실시될 수 있으며, 그러한 실시는 본 발명의 내에 있다는 것이 이해될 수 있다. 경구와 비점막 둘 모두 다른 투여 경로보다 이점을 제공한다. 예를 들어, 이러한 막들을 통해 투여되는 약물은 빠른 작용 개시를 가지며, 치료 혈장 수준을 제공하고, 간 대사의 첫 번째 통과 효과를 막고, 약물이 부적당한 위장관(GI) 환경에 노출되는 것을 막는다. 추가 이점들은 약물이 용이하게 적용되고, 국소화되고, 제거될 수 있는 막 부위로의 용이한 접근을 포함한다.

경구 전달에서, 조성물은 구강의 표면으로, 예를 들어, 혀의 앞면 및 입의 바닥의 점막을 포함하는 설하 점막 또는 볼의 내벽을 구성하는 볼 점막으로 타겟화될 수 있다. 설하 점막은 비교적 투과성이고, 그에 따라 다수 약물의 신속한 흡수 및 허용 가능한 생체이용률을 제공한다. 또한, 설하 점막은 편리하고, 허용 가능하며, 용이하게 접근가능하다.

구강 점막을 통해 침투하는 분자의 능력은 분자 크기, 지용성 및 펩타이드 단백질 이온화와 관련이 있는 것으로 보인다. 1000 달톤 미만의 소분자는 점막을 신속하게 지나가는 것으로 보인다. 분자 크기가 증가함에 따라, 투과성은 빠르게 감소한다. 지용성 화합물은 비-지용성 분자보다 더 투과성이다. 최대 흡수는 분자의 전하가 비이온화되거나 중성일 때 발생한다. 그러므로, 하전된 분자는 경구 점막을 통한 흡수에 가장 큰 난제를 제기한다.

iRNA의 약학적 조성물은 또한 투약량 계량 스프레이 디스펜서로부터 상술된 바와 같은 혼합된 미셀 약학적 제형 및 추진제를 흡입 없이 구강에 분무함으로써 인간의 구강으로 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 디스펜서는 먼저 약학적 제형 및 추진제를 구강 내로 분무하기 전에 흔들어진다. 예를 들어, 약제는 구강으로 분무되거나, 예를 들어, 액체, 고체 또는 겔 형태로 구강 내 표면에 직접 적용될 수 있다. 이러한 투여는 구강, 예를 들어, 잇몸 또는 혀의 염증 치료에 특히 바람직하며, 예를 들어, 일 구현예에서, 구강 투여는, 예를 들어, 흡입 없이, 디스펜서, 예를 들어, 약학적 조성물 및 추진제를 분배하는 투약량 계량 스프레이 디스펜서로부터 구강으로 분무함으로써 이루어진다.

본 발명의 일 양태는 또한 척수강내 또는 뇌실내 전달에 의해 CNS로 또는 안구 전달, 예를 들어, 유리체내 전달에 의해 안구 조직으로 올리고뉴클레오타이드를 전달하는 방법에 관한 것이다.

일부 구현예는 세포에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 선택적으로 링커 또는 담체를 통해, 올리고뉴클레오타이드에 접합된 친유성 모이어티를 함유하는 하나 이상의 친유성 단량체를 갖는 올리고뉴클레오타이드와 상기 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 세포는 CNA계에서의 세포이다. 일 구현에에서, 세포는 안구 세포이다.

일부 구현예는 피험자에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 선택적으로 링커 또는 담체를 통해, 올리고뉴클레오타이드에 접합된 친유성 모이어티를 함유하는 하나 이상의 친유성 단량체를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다. 일 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드 접합체는 척수강내로 또는 뇌실내로 투여된다(뇌 또는 척추 조직에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키기 위해). 일 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드 접합체는 안구로, 예를 들어, 유리체내로 투여된다(안구 조직에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키기 위해).

일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 이중-가닥이다. 일 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 타겟 유전자와 상보적인 안티센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥과 상보적인 센스 가닥을 포함하는 화합물이다.

일부 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 단일-가닥이다. 일 구현예에서, 올리고뉴클레오타이드는 안티센스이다.

일부 구현예에서, 친유성 모이어티를 함유하는 친유성 단량체는 올리고뉴클레오타이드의 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 내부 위치에 위치한다. 일부 구현예에서, 친유성 모이어티를 함유하는 친유성 단량체는 올리고뉴클레오타이드의 적어도 하나의 가닥의 하나 이상의 말단 위치에 위치한다.

본 발명은 다음의 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 추가로 한정하는 것으로 여겨져서는 안된다. 본 출원 전체에 걸쳐 인용되는 모든 참조문헌, 계류중인 특허 출원 및 공개 특허의 내용들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 명시적으로 포함된다.

실시예

이제 일반적으로 기술되는 본 발명은 하기 실시예를 참조로 보다 용이하게 이해될 것이며, 실시예는 단지 본 발명의 소정의 양태 및 구현예에 대한 예시의 목적으로만 포함되고, 본 발명을 제한하려고 의도된 것이 아니다.

실시예 1. 친유성 단량체의 합성

고형 지지체 또는 포스포라미다이트로서 siRNA의 다양한 위치(말단 및/또는 내부 위치)에 친유성 리간드를 도입하도록 친유성 단량체를 합성하였다. 하기 반응식(예를 들어, 일반 절차에 대해 반응식 1 내지 반응식 3)에 나타낸 바와 같은 방법들을 이용하여 다양한 지질들이 하이드록시프롤리놀 유도체를 통해 접합될 수 있고, 생성된 빌딩 블록 포스포라미다이트는 siRNA에 혼입될 수 있다.

반응식 1

반응식 2

반응식 3

5' 말단에서 프롤리놀 상에 친유성 접합체의 합성

반응식 4

화합물 2: 가열-오븐 건조된 100 mL 둥근 병 플라스크에, 무수 DCM(50 mL) 중 화합물 1(3 g, 24.28 mmol, 1.0 당량)의 용액을 첨가하였다. 테트라데칸산 2a(6.10 g, 26.70 mmol, 1.1 eq.), 이어서 HBTU(10.13 g, 26.70 mmol, 1.1 eq.) 및 DIPEA(12.68 mL, 72.53 mmol, 3 eq.)를 용액에 첨가하였다. 생성된 용액을 아르곤 하에 밤새 실온에서 교반하였다. 80% EtOAc/헥산을 이용한 TLC는 생성물의 형성을 나타냈다. 반응 혼합물을 염수 용액으로 켄칭시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 용액을 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 오일 형태 잔여물로 농축시켰다. 0 내지 70% EtOAc/헥산으로 화합물 2를 용리시켜 80 g 실리카 겔 컬럼으로 ISCO 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 백색 유성 화합물을 수득하였다(7.2 g).

화합물 3: 화합물 2의 합성에 대하여 상기 절차와 유사한 절차로 화합물 1 및 팔미트산을 사용하여 화합물 3을 수득하였다.

화합물 4: 화합물 2의 합성에 대하여 상기 절차와 유사한 절차로 화합물 1 및 스테아르산을 사용하여 화합물 4를 수득하였다.

화합물 5: 화합물 2의 합성에 대하여 상기 절차와 유사한 절차로 화합물 1 및 올레산을 사용하여 화합물 5를 수득하였다.

화합물 6: 화합물 2의 합성에 대하여 상기 절차와 유사한 절차로 화합물 1 및 도데칸산을 사용하여 화합물 6을 수득하였다. M+1=270.3.

화합물 7: 화합물 2의 합성에 대하여 상기 절차와 유사한 절차로 화합물 1 및 도코산산을 사용하여 화합물 7을 수득하였다.

화합물 8: 화합물 2(7.2 g, 24.2 mmol, 1 eq.)를 무수 EtOAc(120 mL)에 용해시켰다. 아이스 배쓰 내에서 그리고 아르곤 하에, DIPEA(12.65 mL, 72.61 mmol, 3 eq.), 이어서 N,N-디이소프로필아미노시아노에틸 포스폰아미드-Cl(6.30 g, 26.61 mmol, 1.1 eq.)를 용액에 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 50% EtOAc/헥산에서의 TLC는 반응의 완료를 나타냈다. 반응 혼합물을 염수로 켄칭시키고, EtOAc로 추출하였다. 유기층을 분리하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 백색 오일로 농축시켰다. 화합물 8을 0 내지 50% EtOAc/헥산으로 용리시켜 ISCO 정제에 의해 65%(7.71 g)의 수율로 제공하였다.

화합물 9: 화합물 8의 합성에 대하여 상기 절차와 유사한 절차로 화합물 3 및 N,N-디이소프로필아미노-시아노에틸 포스폰아미드-Cl을 사용하여 화합물 9를 수득하였다.

화합물 10: 화합물 8의 합성에 대하여 상기 절차와 유사한 절차로 화합물 4 및 N,N-디이소프로필아미노-시아노에틸 포스폰아미드-Cl을 사용하여 화합물 10을 수득하였다.

화합물 11: 화합물 8의 합성에 대하여 상기 절차와 유사한 절차로 화합물 5 및 N,N-디이소프로필아미노-시아노에틸 포스폰아미드-Cl을 사용하여 화합물 11을 수득하였다.

화합물 12: 화합물 8의 합성에 대하여 상기 절차와 유사한 절차로 화합물 6 및 N,N-디이소프로필아미노-시아노에틸 포스폰아미드-Cl을 사용하여 화합물 12를 수득하였다.

화합물 13: 화합물 8의 합성에 대하여 상기 절차와 유사한 절차로 화합물 7 및 N,N-디이소프로필아미노-시아노에틸 포스폰아미드-Cl을 사용하여 화합물 13을 수득하였다.

5' 말단에서 프롤리놀 상에 말단 산-함유 친유성 접합체의 합성

반응식 5

화합물 15: 기계적 교반기가 장착된 3-L 3-구 둥근 바닥 플라스크에 화합물 14(15 g, 49.9 mmol, 1 eq.), HBTU(20.8 g, 54.9 mmol) 및 무수 DMF(350 mL)를 충전시켰다. 혼합물을 30분 동안 교반하여 출발 물질을 용해시킨 후, DIPEA(17.3 mL, 99.8 mmol)를 실온에서 격렬히 교반하면서 적가하였다. 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반한 후, 0℃까지 냉각시켰다. DMF(110 mL) 중 (S)-3-피롤리디놀 1(6.78 g, 54.9 mmol) 및 DIPEA(17.3 mL, 99.8 mmol)의 혼합물을 반응 혼합물에 0℃에서 30분에 걸쳐 적가한 후, 실온까지 가온시켰다. 반응 혼합물을 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 진행을 TLC(5% MeOH/에틸아세테이트 또는 50% 에틸아세테이트/헥산)에 의해 모니터링하였다. 반응 혼합물을 0 내지 5℃까지 냉각시키고, 물(1.5 L)로 희석하고, 30분 동안 교반한 다음, 여과하여 갈색 고형물의 화합물 15를 수집하였고, 이를 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 연갈색 고형물로서 화합물 15(17 g, 92% 수율)를 수득하였다.

화합물 16: 오븐 건조된 500 mL 1-목 둥근 병 플라스크에 아르곤 하에 화합물 15(8 g, 21.6 mmol, 1 eq.) 및 클로로포름(100 mL)을 충전시켰다. 반응 혼합물을 0℃까지 냉각시킨 후, DIPEA를 첨가하고, 이어서 0℃에서 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필-클로로포스포라미다이트(5.31 mL, 23.8 mmol)를 적가하였다. 반응 혼합물을 서서히 실온까지 가온시키고, 3시간 동안 교반하였다. 반응 진행을 TLC에 의해 모니터링하였다. 반응 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, MeOH(3 ml)로 켄칭시키고, 30분 동안 교반한 다음, 농축시켜 미정제 생성물 16을 얻었고, 이를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 분획들을 합하고, 농축시켜 화합물 16을 걸쭉한 시럽(4.38 g, 36% 수율)으로서 수득하였다.

화합물 18: 기계적 교반기가 장착된 3-L 3-구 둥근 바닥 플라스크에 화합물 17(14 g, 42.6 mmol, 1 eq.), HBTU(17.8 g, 46.9 mmol), 및 무수 DMF(330 mL)를 충전시켰다. 혼합물을 30분 동안 교반하여 고형물을 용해시킨 후, DIPEA(14.8 mL, 85.2 mmol)를 실온에서 격렬히 교반하면서 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반한 후, 0℃까지 냉각시켰다. 무수 DMF(125 mL) 중 (S)-3-피롤리디놀 1(5.79 g, 46.9 mmol) 및 DIPEA(14.8 mL, 85.2 mmol)의 혼합물을 반응 혼합물에 0℃에서 30분에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 실온까지 가온시키고, 18시간 동안 교반하였다. 반응 진행을 TLC(5% MeOH/에틸 아세테이트)에 의해 모니터링하였다. 혼합물을 0 내지 5℃까지 냉각시키고, 물(1.5 L)로 서서히 켄칭시키고, 30분 동안 교반한 다음, 여과하여 갈색 고형물의 화합물 18을 수집하였다. 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 18을 연갈색 고형물로서 수득하였다(16.1 g, 95% 수율).

화합물 19: 오븐 건조된 500 mL 1-목 둥근 병 플라스크에 아르곤 하에 화합물 18(13 g, 32.6 mmol, 1 eq.) 및 클로로포름(130 mL)을 충전시켰다. 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, 촉매량의 DMAP 및 DIPEA(17.1 mL, 98.0 mmol, 3 eq.)를 첨가하고, 이어서 15분의 기간에 걸쳐 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(8.02 mL, 35.9 mmol)를 적가하였다. 반응 혼합물을 실온까지 가온시키고, 5시간 동안 교반하였다. 반응 진행을 TLC(5% MeOH/에틸 아세테이트)에 의해 모니터링하였다. 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, MeOH(7 ml)로 켄칭시키고, 1시간 동안 교반한 다음, 농축시켜 미정제 생성물 19를 얻었다. 미정제 생성물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 합하고, 농축시키고, 고진공 하에 건조시켜, 걸쭉한 시럽으로서 화합물 19(10.17 g, 52% 수율)를 수득하였다.

화합물 21: 기계적 교반기가 장착된 3-L 3-구 둥근 바닥 플라스크에 화합물 20(15 g, 35.2 mmol, 1 eq.), HBTU(14.7 g, 38.7 mmol) 및 DMF(600 mL)를 충전시켰다. 혼합물을 30분 동안 교반하여 고형물을 용해시킨 후, DIPEA(12.3 mL, 70.5 mmol)를 실온에서 격렬히 교반하면서 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반한 후, 0℃까지 냉각시켰다. 무수 DMF(110 mL) 중 (S)-3-피롤리디놀 1(4.79 g, 38.7 mmol) 및 DIPEA(12.3 mL, 70.5 mmol)의 혼합물을 반응 혼합물에 0℃에서 30분에 걸쳐 적가한 후, 실온까지 가온시켰다. 반응 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 반응 진행을 TLC(5% MeOH/에틸 아세테이트)에 의해 모니터링하였다. 혼합물을 0 내지 5℃까지 냉각시키고, 물(1.5 L)로 서서히 켄칭시키고, 1.5시간 동안 교반한 후, 여과하여 갈색 고형물의 화합물 21을 수집하였고, 이를 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 연갈색 고형물로서 화합물 21(16.1 g, 90% 수율)을 수득하였다.

화합물 22: 오븐 건조된 500 mL 1-목 둥근 병 플라스크에 아르곤 하에 화합물 21(16 g, 37.6 mmol, 1 eq.) 및 클로로포름(200 mL)을 충전시켰다. 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, 촉매량의 DMAP 및 DIPEA(14.4 mL, 83.0 mmol, 3 eq.)를 첨가하고, 이어서 15분의 기간에 걸쳐 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(6.78 mL, 30.4 mmol)를 적가하였다. 반응 혼합물을 실온까지 가온시키고, 4시간 동안 교반하였다. 반응 진행을 TLC(5% MeOH/에틸 아세테이트)에 의해 모니터링하였다. 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, MeOH(7 ml)로 켄칭시키고, 30분 동안 교반한 다음, 농축시켜 미정제 생성물 6을 얻었고, 이를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 합하고, 농축시키고, 고진공 하에 건조시켜, 걸쭉한 시럽으로서 화합물 22(9.7 g, 41% 수율)를 수득하였다.

3' 말단에서 프롤리놀 상에 친유성 접합체의 합성

반응식 6

화합물 22: CH₂Cl₂에서 표준 펩타이드 커플링 조건 하에 화합물 21 및 미리스트산을 사용하여 화합물 22를 합성하였다.

화합물 23: CH₂Cl₂에서 표준 펩타이드 커플링 조건 하에 화합물 21 및 팔미트산을 사용하여 화합물 23을 합성하였다.

화합물 24: CH₂Cl₂에서 표준 펩타이드 커플링 조건 하에 화합물 21 및 스테아르산을 사용하여 화합물 24를 합성하였다.

화합물 25: CH₂Cl₂에서 표준 펩타이드 커플링 조건 하에 화합물 21 및 올레산을 사용하여 화합물 25를 합성하였다.

화합물 26: 무수 디클로로메탄(86.26 mL) 중 화합물 22(5.67 g, 9.00 mmol)의 용액에 DMAP(1.10 g, 9.00 mmol) 및 석신산 무수물(1.80 g, 18.00 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 0℃까지 냉각시킨 후, 트리에틸아민(3.76 mL, 27.01 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였고, 이때 출발 물질의 존재가 나타나지 않았다(DCM 중에서 5% MeOH 중 5% Et₃N). 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 DCM 중 0 내지 5% MeOH의 구배로 실리카 겔(Et₃N으로 전처리됨)에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 4.91 g(75% 수율)의 석시네이트를 수득하였다. 무수 DMF(331.64 mL) 중 석시네이트(4.91 g, 6.73 mmol)의 용액에 DIPEA(4.69 mL, 26.91 mmol)를 첨가한 후, 완전히 용해될 때까지 교반하였다. HBTU(2.68 g, 7.06 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 5분 동안 교반하였다. 제어된 다공성 유리(CPG)(152 μmol/g, 48.68 g, 7.40 mmol)를 혼합물에 첨가하였다. 둥근 병 플라스크를 고무 마개로 캡핑하고, 확실히 파라필름처리하고, 그런 다음, 기계식 진탕기에서 밤새 진탕시켰다. 혼합물을 진공 하에 유리 프리트 깔때기를 통해 여과하고, 아세토니트릴, 메탄올, 아세토니트릴, 및 디에틸 에테르(각각 300 mL)와 병행하여 세정하였다. 여과액을 폐기하고, 여과된 물질을 프리트 상에서 20분 동안 진공 건조시켰다. 여과된 물질을 원래의 플라스크로 회수하고, 고진공에서 밤새 건조시켰다. 고형 지지체 상의 물질의 로딩을 Beckman Coulter 분광광도계에서 비어의 법칙 및 UV-Vis에 의해 확인하였다. 고형 지지체 물질을 칭량하고(53.5 mg), 250 mL 부피 플라스크에서 아세토니트릴 중 0.1 M p-톨루엔술폰산에 용해시켰다. 혼합물을 초음파처리하고, 1시간 동안 그대로 정치시켰다. 기계를 동일한 용매로 블랭킹하고, 용액의 411 nm에서의 UV 흡광도를 3회 측정하였다. 나머지 고형 지지체 물질을 1% Et₃N(325 mL)으로 피리딘 중 30% 아세트산 무수물을 사용하여 캡핑하였다. 플라스크를 캡핑하고, 파라필름처리한 다음, 기계적 진탕기에서 3시간 동안 진탕시켰다. 혼합물을 진공 하에서 유리 프리트 깔때기 상에서 여과하고, THF 중 10% H₂O, MeOH, THF 중 10% H₂O, MeOH, ACN, 및 디에틸 에테르(각각 300 mL)의 순서로 세척하였다. 여과액을 폐기하고, 고형 지지체 물질을 진공 하에 프리트 상에서 건조시켰다. 고형 지지체 물질을 둥근 병 플라스크로 옮긴 후, 고진공 상에서 밤새 건조시켜 화합물 26(48.96 g, 106.92 μmol/g 로딩)을 수득하였다.

화합물 27: 무수 디클로로메탄(74.28 mL) 중 화합물 23(5.10 g, 7.75 mmol)의 용액에 DMAP(947 mg, 7.75 mmol) 및 석신산 무수물(1.55 g, 15.50 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 0℃까지 냉각시킨 후, 트리에틸아민(3.24 mL, 23.26 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였고, 이때 출발 물질의 존재가 나타나지 않았다(DCM 중에서 5% MeOH 중 5% Et₃N). 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 DCM 중 0 내지 5% MeOH의 구배로 실리카 겔(Et₃N으로 전처리됨)에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 3.85 g(65% 수율)의 석시네이트를 수득하였다.

무수 DMF(250.42 mL) 중 석시네이트(3.85 g, 5.08 mmol)의 용액에 DIPEA(3.54 mL, 20.32 mmol)를 첨가한 후, 완전히 용해될 때까지 교반하였다. HBTU(2.02 g, 5.33 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 5분 동안 교반하였다. 제어된 다공성 유리(CPG)(152 μmol/g, 36.77 g, 5.59 mmol)를 혼합물에 첨가하였다. 둥근 병 플라스크를 고무 마개로 캡핑하고, 확실히 파라필름처리하고, 그런 다음, 기계식 진탕기에서 밤새 진탕시켰다. 혼합물을 진공 하에 유리 프리트 깔때기를 통해 여과하고, 아세토니트릴, 메탄올, 아세토니트릴, 및 디에틸 에테르(각각 300 mL)와 병행하여 세정하였다. 여과액을 폐기하고, 여과된 물질을 프리트 상에서 20분 동안 진공 건조시켰다. 여과된 물질을 원래의 플라스크로 회수하고, 고진공에서 밤새 건조시켰다. 고형 지지체 상의 물질의 로딩을 Beckman Coulter 분광광도계에서 비어의 법칙 및 UV-Vis에 의해 확인하였다. 고형 지지체 물질을 칭량하고(59.7 mg), 250 mL 부피 플라스크에서 아세토니트릴 중 0.1 M p-톨루엔술폰산에 용해시켰다. 혼합물을 초음파처리하고, 1시간 동안 그대로 정치시켰다. 기계를 동일한 용매로 블랭킹하고, 용액의 411 nm에서의 UV 흡광도를 3회 측정하였다. 나머지 고형 지지체 물질을 1% Et₃N(325 mL)으로 피리딘 중 30% 아세트산 무수물을 사용하여 캡핑하였다. 플라스크를 캡핑하고, 파라필름처리한 다음, 기계적 진탕기에서 3시간 동안 진탕시켰다. 혼합물을 진공 하에서 유리 프리트 깔때기 상에서 여과하고, THF 중 10% H₂O, MeOH, THF 중 10% H₂O, MeOH, ACN, 및 디에틸 에테르(각각 300 mL)의 순서로 세척하였다. 여과액을 폐기하고, 고형 지지체 물질을 진공 하에 프리트 상에서 건조시켰다. 고형 지지체 물질을 둥근 병 플라스크로 옮기고, 고진공 상에서 밤새 건조시켜 화합물 27(38.53 g, 112.87 μmol/g 로딩)을 수득하였다.

화합물 28: 무수 디클로로메탄(77.24 mL) 중 화합물 24(5.53 g, 8.06 mmol)의 용액에 DMAP(984 mg, 8.06 mmol) 및 석신산 무수물(1.61 g, 16.12 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 0℃까지 냉각시킨 후, 트리에틸아민(3.37 mL, 24.18 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였고, 이때 출발 물질의 존재가 나타나지 않았다(DCM 중에서 5% MeOH 중 5% Et₃N). 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 DCM 중 0 내지 5% MeOH의 구배로 실리카 겔(Et₃N으로 전처리됨)에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 5.18 g(81%)의 석시네이트를 수득하였다.

무수 DMF(324.91 mL) 중 석시네이트(5.18 g, 6.59 mmol)의 용액에 DIPEA(4.59 mL, 26.36 mmol)를 첨가하고, 완전히 용해될 때까지 교반하였다. HBTU(2.62 g, 6.92 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 5분 동안 교반하였다. 제어된 다공성 유리(CPG)(152 μmol/g, 47.69 g, 7.25 mmol)를 혼합물에 첨가하였다. 둥근 병 플라스크를 고무 마개로 캡핑하고, 확실히 파라필름처리하고, 그런 다음, 기계식 진탕기에서 밤새 진탕시켰다. 혼합물을 진공 하에 유리 프리트 깔때기를 통해 여과하고, 아세토니트릴, 메탄올, 아세토니트릴, 및 디에틸 에테르(각각 300 mL)와 병행하여 세정하였다. 여과액을 폐기하고, 여과된 물질을 프리트 상에서 20분 동안 진공 건조시켰다. 여과된 물질을 원래의 플라스크로 회수하고, 고진공에서 밤새 건조시켰다. 고형 지지체 상의 물질의 로딩을 Beckman Coulter 분광광도계에서 비어의 법칙 및 UV-Vis에 의해 확인하였다. 고형 지지체 물질을 칭량하고(54.0 mg), 250 mL 부피 플라스크에서 아세토니트릴 중 0.1 M p-톨루엔술폰산에 용해시켰다. 혼합물을 초음파처리하고, 1시간 동안 그대로 정치시켰다. 기계를 동일한 용매로 블랭킹하고, 용액의 411 nm에서의 UV 흡광도를 3회 측정하였다. 나머지 고형 지지체 물질을 1% Et₃N(325 mL)으로 피리딘 중 30% 아세트산 무수물을 사용하여 캡핑하였다. 플라스크를 캡핑하고, 파라필름처리한 다음, 기계적 진탕기에서 3시간 동안 진탕시켰다. 혼합물을 진공 하에서 유리 프리트 깔때기 상에서 여과하고, THF 중 10% H₂O, MeOH, THF 중 10% H₂O, MeOH, ACN, 및 디에틸 에테르(각각 300 mL)의 순서로 세척하였다. 여과액을 폐기하고, 고형 지지체 물질을 진공 하에 프리트 상에서 건조시켰다. 고형 지지체 물질을 둥근 병 플라스크로 옮기고, 고진공 상에서 밤새 건조시켜 화합물 28(50.60 g, 108.88 μmol/g 로딩)을 수득하였다.

화합물 29: 무수 디클로로메탄(72.71 mL) 중 화합물 25(5.19 g, 7.59 mmol)의 용액에 DMAP(927 mg, 7.59 mmol) 및 석신산 무수물(1.52 g, 15.18 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 0℃까지 냉각시킨 후, 트리에틸아민(3.37 mL, 24.18 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였고, 이때 출발 물질의 존재가 나타나지 않았다(DCM 중에서 5% MeOH 중 5% Et₃N). 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 DCM 중 0 내지 5% MeOH의 구배로 실리카 겔(Et₃N으로 전처리됨)에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 5.47 g(92%)의 화합물 3d(R = C₁₈H₃₃)를 수득하였다.

무수 DMF(343.98 mL) 중 석시네이트(5.47 g, 6.98 mmol)의 용액에 DIPEA(4.86 mL, 27.91 mmol)를 첨가한 후, 완전히 용해될 때까지 교반하였다. HBTU(2.78 g, 7.33 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 5분 동안 교반하였다. 제어된 다공성 유리(CPG)(152 μmol/g, 50.46 g, 7.67 mmol)를 혼합물에 첨가하였다. 둥근 병 플라스크를 고무 마개로 캡핑하고, 확실히 파라필름처리하고, 그런 다음, 기계식 진탕기에서 밤새 진탕시켰다. 혼합물을 진공 하에 유리 프리트 깔때기를 통해 여과하고, 아세토니트릴, 메탄올, 아세토니트릴, 및 디에틸 에테르(각각 300 mL)와 병행하여 세정하였다. 여과액을 폐기하고, 여과된 물질을 프리트 상에서 20분 동안 진공 건조시켰다. 여과된 물질을 원래의 플라스크로 회수하고, 고진공에서 밤새 건조시켰다. 고형 지지체 상의 물질의 로딩을 Beckman Coulter 분광광도계에서 비어의 법칙 및 UV-Vis에 의해 확인하였다. 고형 지지체 물질을 칭량하고(52.7 mg), 250 mL 부피 플라스크에서 아세토니트릴 중 0.1 M p-톨루엔술폰산에 용해시켰다. 혼합물을 초음파처리하고, 1시간 동안 그대로 정치시켰다. 기계를 동일한 용매로 블랭킹하고, 용액의 411 nm에서의 UV 흡광도를 3회 측정하였다. 나머지 고형 지지체 물질을 1% Et₃N(325 mL)으로 피리딘 중 30% 아세트산 무수물을 사용하여 캡핑하였다. 플라스크를 캡핑하고, 파라필름처리한 다음, 기계적 진탕기에서 3시간 동안 진탕시켰다. 혼합물을 진공 하에서 유리 프리트 깔때기 상에서 여과하고, THF 중 10% H₂O, MeOH, THF 중 10% H₂O, MeOH, ACN, 및 디에틸 에테르(각각 300 mL)의 순서로 세척하였다. 여과액을 폐기하고, 고형 지지체 물질을 진공 하에 프리트 상에서 건조시켰다. 고형 지지체 물질을 둥근 병 플라스크로 옮기고, 고진공 상에서 밤새 건조시켜 화합물 29(51.63 g, 106.29 μmol/g 로딩)를 수득하였다.

화합물 31: CH₂Cl₂에서 표준 펩타이드 커플링 조건 하에 화합물 30 및 팔미트산을 사용하여 화합물 31을 합성하였다.

화합물 32: 무수 디클로로메탄(60.89 mL) 중 화합물 31(4.90 g, 6.35 mmol)의 용액에 DMAP(776 mg, 6.35 mmol) 및 석신산 무수물(1.27 g, 12.71 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 0℃까지 냉각시킨 후, 트리에틸아민(2.66 mL, 19.06 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였고, 이때 출발 물질의 존재가 나타나지 않았다(DCM 중에서 5% MeOH 중 5% Et₃N). 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 DCM 중 0 내지 10% MeOH의 구배로 실리카 겔(Et₃N으로 전처리됨)에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 4.34 g(78%)의 석시네이트를 수득하였다.

무수 DMF(245.63 mL) 중 석시네이트(4.34 g, 4.98 mmol)의 용액에 DIPEA(3.74 mL, 19.93 mmol)를 첨가한 후, 완전히 용해될 때까지 교반하였다. HBTU(1.98 g, 5.23 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 5분 동안 교반하였다. 제어된 다공성 유리(CPG)(152 μmol/g, 36.05 g, 5.48 mmol)를 혼합물에 첨가하였다. 둥근 병 플라스크를 고무 마개로 캡핑하고, 확실히 파라필름처리하고, 그런 다음, 기계식 진탕기에서 밤새 진탕시켰다. 혼합물을 진공 하에 유리 프리트 깔때기를 통해 여과하고, 아세토니트릴, 메탄올, 아세토니트릴, 및 디에틸 에테르(각각 300 mL)와 병행하여 세정하였다. 여과액을 폐기하고, 여과된 물질을 프리트 상에서 20분 동안 진공 건조시켰다. 여과된 물질을 원래의 플라스크로 회수하고, 고진공에서 밤새 건조시켰다. 고형 지지체 상의 물질의 로딩을 Beckman Coulter 분광광도계에서 비어의 법칙 및 UV-Vis에 의해 확인하였다. 고형 지지체 물질을 칭량하고(52.6 mg), 250 mL 부피 플라스크에서 아세토니트릴 중 0.1 M p-톨루엔술폰산에 용해시켰다. 혼합물을 초음파처리하고, 1시간 동안 그대로 정치시켰다. 기계를 동일한 용매로 블랭킹하고, 용액의 411 nm에서의 UV 흡광도를 3회 측정하였다. 나머지 고형 지지체 물질을 1% Et₃N(325 mL)으로 피리딘 중 30% 아세트산 무수물을 사용하여 캡핑하였다. 플라스크를 캡핑하고, 파라필름처리한 다음, 기계적 진탕기에서 3시간 동안 진탕시켰다. 혼합물을 진공 하에서 유리 프리트 깔때기 상에서 여과하고, THF 중 10% H₂O, MeOH, THF 중 10% H₂O, MeOH, CAN, 및 디에틸 에테르(각각 300 mL)의 순서로 세척하였다. 여과액을 폐기하고, 고형 지지체 물질을 진공 하에 프리트 상에서 건조시켰다. 고형 지지체 물질을 둥근 병 플라스크로 옮기고, 고진공 상에서 밤새 건조시켜 화합물 32(37.59 g, 80.09 μmol/g 로딩)을 수득하였다.

3' 말단에서 프롤리놀 상에 말단 산-함유 친유성 접합체의 합성

반응식 7

화합물 23: 무수 디클로로메탄 중 팔미트산(12.22 g, 47.67 mmol) 및 HBTU(19.89 g, 52.44 mmol)의 용액을 0℃까지 냉각시켰다. DIPEA(24.91 mL, 143.02 mmol)를 용액에 적가하였다. 5분 동안 교반한 후, 화합물 21(20 g, 47.67 mmol)을 반응에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였고, 이때 출발 물질의 존재가 나타나지 않았다(헥산 중 60% EtOAc). 반응 혼합물을 DCM으로 희석하고, 포화 수성 NaHCO₃로 표준 수성 후처리를 수행하였다. 유기층을 합하고, 포화 수성 NaCl로 세척하고, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 헥산 중 0 내지 50% EtOAc의 구배로 실리카 겔(Et₃N으로 전처리됨)에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 28.01 g(89% 수율)의 화합물 23을 수득하였다.

화합물 33: 반응 전, 화합물 23(9.57 g, 14.55 mmol)을 아세토니트릴로 2 회 공증발시킨 후, 고진공에서 밤새 건조시켰다. 화합물 23을 무수 디클로로메탄(169.75 mL)에 용해시키고, DIPEA(7.60 mL, 43.64 mmol) 및 1-메틸이미다졸(579.7 uL, 7.27 mmol)을 적가하였다. 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, 클로로-2-시아노에톡시-N,N-디이소프로필아미노포스핀(3.90 mL, 17.46 mmol)을 적가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 TLC(EtOAc 중 60% 헥산)에 의해 확인하고, 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔여물을 EtOAc에 재현탁시키고, 포화 수성 NaHCO₃로 신속하게 수성 후처리를 수행하였다. 유기층을 합하고, 포화 수성 NaCl로 세척하고, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 헥산 중 0 내지 30% EtOAc의 구배로 실리카 겔(Et₃N으로 전처리됨)에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 10.11 g(81% 수율)의 화합물 33(C₁₆H₃₁)을 수득하였다.

화합물 35: 무수 디클로로메탄 중 메틸 에스테르 지질 카르복실산 34(2.15 g, 7.15 mmol) 및 HBTU(2.98 g, 7.87 mmol)의 용액을 0℃까지 냉각시켰다. DIPEA(3.74 mL, 21.45 mmol)를 용액에 적가하였다. 5분 동안 교반한 후, 화합물 21(3 g, 7.15 mmol)을 반응에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였고, 이때 출발 물질의 존재가 나타나지 않았다(헥산 중 60% EtOAc). 반응 혼합물을 DCM으로 희석하고, 포화 수성 NaHCO₃로 표준 수성 후처리를 수행하였다. 유기층을 합하고, 포화 수성 NaCl로 세척하고, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 헥산 중 0 내지 62% EtOAc의 구배로 실리카 겔(Et₃N으로 전처리됨)에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 4.04 g(80% 수율)의 화합물 35를 수득하였다.

화합물 36: 반응 전, 화합물 35(4.04 g, 5.76 mmol)를 아세토니트릴로 2 회 공증발시킨 후, 고진공에서 밤새 건조시켰다. 화합물 35를 무수 디클로로메탄(66.94 mL)에 용해시키고, DIPEA(3.01 mL, 17.27 mmol) 및 1-메틸이미다졸(458.7 uL, 5.76 mmol)을 적가하였다. 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, 클로로-2-시아노에톡시-N,N-디이소프로필아미노포스핀(1.54 mL, 6.91 mmol)을 적가하였다. 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 TLC(EtOAc 중 60% 헥산)에 의해 확인하고, 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔여물을 EtOAc에 재현탁시키고, 포화 수성 NaHCO₃로 신속하게 수성 후처리를 수행하였다. 유기층을 합하고, 포화 수성 NaCl로 세척하고, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 헥산 중 0 내지 30% EtOAc의 구배로 실리카 겔(Et₃N으로 전처리됨)에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 4.09 g(79%)의 화합물 36을 수득하였다.

화합물 38: 무수 디클로로메탄 중 메틸 에스테르 지질 카르복실산 37(2.35 g, 7.15 mmol) 및 HBTU(2.98 g, 7.87 mmol)의 용액을 0℃까지 냉각시켰다. DIPEA(3.74 mL, 21.45 mmol)를 용액에 적가하였다. 5분 동안 교반한 후, 화합물 21(3 g, 7.15 mmol)을 반응에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였고, 이때 출발 물질의 존재가 나타나지 않았다(헥산 중 60% EtOAc). 반응 혼합물을 DCM으로 희석하고, 포화 수성 NaHCO₃로 표준 수성 후처리를 수행하였다. 유기층을 합하고, 포화 수성 NaCl로 세척하고, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 헥산 중 0 내지 68% EtOAc의 구배로 실리카 겔(Et₃N으로 전처리됨)에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 4.44 g(85% 수율)의 화합물 38을 수득하였다.

화합물 39: 반응 전, 화합물 38(4.44 g, 6.08 mmol)을 아세토니트릴로 2회 공증발시킨 후, 고진공에서 밤새 건조시켰다. 화합물 38을 무수 디클로로메탄(70.74 mL)에 용해시키고, DIPEA(3.18 mL, 18.25 mmol) 및 1-메틸이미다졸(484.8 uL, 6.08 mmol)을 적가하였다. 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, 클로로-2-시아노에톡시-N,N-디이소프로필아미노포스핀(1.63 mL, 7.30 mmol)을 적가하였다. 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 TLC(EtOAc 중 30% 헥산)에 의해 확인하고, 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔여물을 EtOAc에 재현탁시키고, 포화 수성 NaHCO₃로 신속하게 수성 후처리를 수행하였다. 유기층을 합하고, 포화 수성 NaCl로 세척하고, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 헥산 중 0 내지 30% EtOAc의 구배로 실리카 겔(Et₃N으로 전처리됨)에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 4.43 g(78% 수율)의 화합물 39를 수득하였다.

헥사데실 하이드록시프롤리놀 트리포스페이트의 합성

반응식 8

화합물 40: 합성 전, 출발 물질인 화합물 23을 피리딘으로 2회 공증발시키고, 고진공에서 밤새 건조시켰다. 출발 물질(1.01 g, 1.54 mmol)을 무수 피리딘(7.46 mL)에 용해시키고, 0℃까지 냉각시키고, 벤조일 클로라이드(214 μL, 1.84 mmol)를 적가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, TLC를 확인하였다(에틸 아세테이트 중 80% 헥산). 용매를 감압 하에 스트립핑하고, 잔여물을 에틸 아세테이트에 재현탁시켰다. 표준 수성 후처리를 포화 수성 NaHCO₃로 수행하였다. 유기층을 합하고, 포화 수성 NaCl로 세척하고, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 헥산 중 0 내지 20% EtOAc의 구배로 실리카 겔(Et₃N으로 전처리됨)에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 890 mg(76% 수율)의 화합물 40을 수득하였다.

화합물 41: 교반 막대가 충전된 둥근 바닥 플라스크에서, 화합물 40(890 mg, 1.17 mmol)을 물 중 80% AcOH(13 mL)에 용해시켰다. 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하고, 용매를 감압 하에 제거하였다. 잔여물을 톨루엔으로 2회 공증발시키고, 고진공에서 건조시켰다. 잔여물을 헥산 중 0 내지 60% EtOAc의 구배로 실리카 겔(Et₃N으로 전처리됨)에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 301 mg(56% 수율)의 화합물 41을 수득하였다.

화합물 42: 합성 전, 출발 물질인 화합물 41(200 mg, 0.435 mmol)을 고진공에서 밤새 건조시켰다. 교반 막대가 장착된 둥근 병 플라스크에서, 출발 물질에 실온에서 양성자 스폰지(93 mg, 0.435 mmol) 및 트리메틸 포스페이트(1.81 mL, 15.64 mmol)를 충전시켰다. 반응 플라스크를 진공 라인을 사용하여 탈기한 다음, 아르곤으로 플러싱하고, 3회 반복한 다음, 아르곤하에 유지시켰다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 교반한 후, 30분 동안 NaCl 배쓰 및 얼음 위에서 -5 내지 -10℃까지 냉각시켰다. 냉각 후, 밀봉된 유리 시린지를 통해 포스포릴 클로라이드(28.30 μL, 0.305 mmol)를 첨가하고, 4분 동안 교반하고, 포스포릴 클로라이드(20.22 μL, 0.217 mmol)의 다른 분획을 밀봉된 유리 시린지를 통해 첨가하였다. 혼합물을 -5℃ 내지 -10℃에서 10분 동안 교반하였다. 피로포스페이트 칵테일을 무수 아세토니트릴(1.75 mL)에 용해된 트리부틸암모늄 피로포스페이트(255.50 mg, 0.348 mmol) 및 트리부틸아민(621.95 μL, 2.61 mmol)으로 제조하고, -20℃에서 드라이 아이스/아세톤 배쓰에서 유지시켰다. 10분 동안 교반한 후, 피로포스페이트 칵테일을 차가운 반응 혼합물에 신속하게 그러나 주의하여 적가한 다음, 추가 10분 동안 교반하였다. 플라스크로부터 아르곤 라인을 제거한 후에, 첨가 깔때기를 통해 물(12 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 분리 깔때기로 옮기고, 수성 층을 디클로로메탄(각각 5 mL)으로 3회 세척하였다. 수성 층들을 합하고, 암모늄 하이드록사이드(시린지를 사용하여 3 방울)를 사용하여 pH를 6.5까지 조절하였다. 혼합물을 4℃에서 밤새 저장하였다. 용매를 감압 하에 스트립핑하고, 나머지 잔여물을 아세톤/드라이 아이스 배쓰 중에 -80℃에서 동결시켰다. 잔여물을 밤새 동결건조시키고, D₂O에서 ³¹P NMR 분석을 위해 제출하였다. ³¹P NMR (202 MHz, D₂O) δ 3.72, -10.12, -20.99.

2'-O-C6 -아미노-TFA 우리딘 아미다이트의 합성

반응식 9

화합물 102: 화합물 101(5 g, 7.75 mmol)을 반응 플라스크에 첨가하였다. 출발 물질을 디클로로메탄(50 ml)에 용해시키고, 트리에틸아민(4.23 ml, 31 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 에틸 트리플루로아세테이트(2.75 g, 19.38 mmol)를 반응물에 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, TLC(5% MeOH/DCM)에 의해 확인하고, 포스포몰리브덴산을 사용하여 현상하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 디클로로메탄에 용해시키고, 분리 깔때기에 첨가하고, 유기층을 포화 소듐 바이카르보네이트로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시키고, 고진공에 두어 화합물 102(4.32 g, 75%)를 수득하였다.

C₃₈H₄₂F₃N₃O₉에 대한 질량 계산치: 741.76, 실측치: 740.2 (M-H).

화합물 103: 화합물 102(4.3 g, 5.8 mmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, 탈기시키고, 아르곤으로 퍼징하였다. 출발 물질을 디클로로메탄(40 ml)에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(2.02 ml, 11.6 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(1.93 ml, 8.7 mmol)를 첨가하고, 반응을 실온에서 1시간 내지 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 TLC(75% EtOAc/헥산)에 의해 확인하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 에틸 아세테이트에 용해시키고, 분리 깔때기에 첨가하고, 유기층을 포화 소듐 바이카르보네이트로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(10% 내지 100% EtOAc/헥산) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압에서 농축시켜 화합물 103(4.62 g, 85%)을 수득하였다.

2'-O-C3 -아미노-TFA 우리딘 아미다이트의 합성

반응식 10

화합물 105: 화합물 104(2.5 g, 4.14 mmol)를 반응 플라스크에 첨가하였다. 출발 물질을 디클로로메탄(20 ml)에 용해시키고, 트리에틸아민(2.26 ml, 16.56 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 에틸 트리플루로아세테이트(1.47 g, 10.35 mmol)를 반응물에 적가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, TLC(3% MeOH/DCM)에 의해 확인하고, 포스포몰리브덴산을 사용하여 현상하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 디클로로메탄에 용해시키고, 분리 깔때기에 첨가하고, 유기층을 포화 소듐 바이카르보네이트로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(0% 내지 10% MeOH/DCM) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압에서 농축시켜 화합물 105(1.83 g, 63%)을 수득하였다.

C₃₅H₃₆F₃N₃O₉에 대한 질량 계산치: 699.68, 실측치: 698.2 (M-H).

화합물 106: 화합물 105(1.70 g, 2.43 mmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, 탈기시키고, 아르곤으로 퍼징하였다. 출발 물질을 디클로로메탄(2 ml)에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(0.846 ml, 4.86 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(0.649 ml, 2.92 mmol)를 첨가하고, 반응을 실온에서 1시간 내지 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 TLC(50% EtOAc/헥산)에 의해 확인하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 에틸 아세테이트에 용해시키고, 분리 깔때기에 첨가하고, 유기층을 포화 소듐 바이카르보네이트로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(10% 내지 100% EtOAc/헥산) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압에서 농축시켜 화합물 106(0.787 g, 36%)을 수득하였다.

2'-O-C6-아미드-C16 접합 우리딘 아미다이트의 합성

반응식 11

화합물 107: 화합물 101(5.7 g, 8.83 mmol)을 팔미트산(2.51 g, 9.8 mmol) 및 HBTU(4.08 g, 10.77 mmol)와 함께 반응 플라스크에 첨가하였다. 고형물을 DMF(25 ml)에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(4.61 ml, 26.5 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 MS에 의해 확인하였다. 반응 혼합물을 디에틸 에테르 및 묽은 소듐 바이카르보네이트 용액으로 희석하고, 분리 깔때기에 첨가하였다. 유기층을 묽은 소듐 바이카르보네이트 용액, 포화 소듐 바이카르보네이트, 및 이후 포화 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(0% 내지 100% EtOAc/헥산) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압에서 농축시켜 화합물 107(6.33 g, 81%)을 수득하였다.

C₅₂H₇₃N₃O₉에 대한 질량 계산치: 884.17, 실측치: 882.5 (M-H).

화합물 108: 화합물 107(5.83 g, 6.59 mmol)을 반응 플라스크에 첨가하고, 탈기시키고, 아르곤으로 퍼징하였다. 출발 물질을 디클로로메탄(60 ml)에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(3.45 ml, 19.78 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 반응 혼합물을 아이스 배쓰를 통해 0℃까지 냉각시켰다. 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(1.91 ml, 8.57 mmol) 및 1-메틸이미다졸(0.525 ml, 6.6 mmol)을 반응 혼합물에 첨가하고, 반응 혼합물이 실온까지 가온되게 하고, 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 TLC(80% EtOAc/헥산)에 의해 확인하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 디클로로메탄에 용해시키고, 분리 깔때기에 첨가하고, 유기층을 포화 소듐 바이카르보네이트로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(10% 내지 80% EtOAc/헥산) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압에서 농축시켜 화합물 108(4.6 g, 64%)을 수득하였다.

2'-O-C3-아미드-C16 접합 우리딘 아미다이트의 합성

반응식 12

화합물 109: 화합물 104(5.3 g, 8.78 mmol)를 팔미트산(2.50 g, 9.75 mmol) 및 HBTU(4.06 g, 10.71 mmol)와 함께 반응 플라스크에 첨가하였다. 고형물을 DMF(25 ml)에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(4.59 ml, 26.34 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 MS에 의해 확인하였다. 반응 혼합물을 디에틸 에테르 및 묽은 소듐 바이카르보네이트 용액으로 희석하고, 분리 깔때기에 첨가하였다. 유기층을 묽은 소듐 바이카르보네이트 용액, 포화 소듐 바이카르보네이트, 및 이후 포화 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(0% 내지 100% EtOAc/헥산) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압에서 농축시켜 화합물 109(4.66 g, 63%)를 수득하였다.

C₄₉H₆₇N₃O₉에 대한 질량 계산치: 842.09, 실측치: 840.5 (M-H).

화합물 110: 화합물 109(4.66 g, 5.53 mmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, 탈기시키고, 아르곤으로 퍼징하였다. 출발 물질을 디클로로메탄(40 ml)에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(2.89 ml, 16.6 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 반응 혼합물을 아이스 배쓰를 통해 0℃까지 냉각시켰다. 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(1.61 ml, 7.19 mmol) 및 1-메틸이미다졸(0.441 ml, 5.53 mmol)을 반응 혼합물에 첨가하고, 반응 혼합물이 실온까지 가온되게 하고, 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 TLC(80% EtOAc/헥산)에 의해 확인하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 디클로로메탄에 용해시키고, 분리 깔때기에 첨가하고, 유기층을 포화 소듐 바이카르보네이트로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(10% 내지 80% EtOAc/헥산) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압에서 농축시켜 화합물 110(3.86 g, 67%)을 수득하였다.

2'-O-C6-아미드-C14 접합 우리딘 아미다이트의 합성

반응식 13

화합물 111: 화합물 101(5.0 g, 7.74 mmol)을 미리스트산(1.96 g, 8.6 mmol) 및 HBTU(3.58 g, 9.45 mmol)와 함께 반응 플라스크에 첨가하였다. 고형물을 DMF(25 ml)에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(4.05 ml, 23.23 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 TLC(80% EtOAc/헥산)에 의해 확인하였다. 반응 혼합물을 디에틸 에테르 및 묽은 소듐 바이카르보네이트 용액으로 희석하고, 분리 깔때기에 첨가하였다. 유기층을 묽은 소듐 바이카르보네이트 용액, 포화 소듐 바이카르보네이트, 및 이후 포화 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(0% 내지 100% EtOAc/헥산) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압에서 농축시켜 화합물 111(3.78 g, 57%)을 수득하였다.

화합물 112: 화합물 111(3.78 g, 4.42 mmol)을 반응 플라스크에 첨가하고, 탈기시키고, 아르곤으로 퍼징하였다. 출발 물질을 디클로로메탄(40 ml)에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(2.31 ml, 13.25 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 반응 혼합물을 아이스 배쓰를 통해 0℃까지 냉각시켰다. 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(1.28 ml, 5.74 mmol) 및 1-메틸이미다졸(0.352 ml, 4.42 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물이 실온까지 가온되게 하고, 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 TLC(80% EtOAc/헥산)에 의해 확인하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 디클로로메탄에 용해시키고, 분리 깔때기에 첨가하고, 유기층을 포화 소듐 바이카르보네이트로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(10% 내지 80% EtOAc/헥산) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압에서 농축시켜 화합물 112(4.04 g, 87%)를 수득하였다.

2'-O-C6-아미드-C18 접합 우리딘 아미다이트의 합성

반응식 14

화합물 113: 화합물 101(5.0 g, 7.74 mmol)을 스테아르산(2.45 g, 8.6 mmol) 및 HBTU(3.58 g, 9.45 mmol)와 함께 반응 플라스크에 첨가하였다. 고형물을 DMF(25 ml)에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(4.05 ml, 23.23 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 TLC(80% EtOAc/헥산)에 의해 확인하였다. 반응 혼합물을 디에틸 에테르 및 묽은 소듐 바이카르보네이트 용액으로 희석하고, 분리 깔때기에 첨가하였다. 유기층을 묽은 소듐 바이카르보네이트 용액, 포화 소듐 바이카르보네이트, 및 이후 포화 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(0% 내지 100% EtOAc/헥산) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압에서 농축시켜 화합물 113(3.56 g, 50%)을 수득하였다.

화합물 114: 화합물 113(5.86 g, 6.44 mmol)을 반응 플라스크에 첨가하고, 탈기시키고, 아르곤으로 퍼징하였다. 출발 물질을 디클로로메탄(60 ml)에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(3.36 ml, 19.31 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 반응 혼합물을 아이스 배쓰를 통해 0℃까지 냉각시켰다. 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(1.87 ml, 1.98 mmol) 및 1-메틸이미다졸(0.513 ml, 6.44 mmol)을 반응 혼합물에 첨가하고, 반응 혼합물이 실온까지 가온되게 하고, 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 TLC(80% EtOAc/헥산)에 의해 확인하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 디클로로메탄에 용해시키고, 분리 깔때기에 첨가하고, 유기층을 포화 소듐 바이카르보네이트로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(0% 내지 50% EtOAc/헥산) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압에서 농축시켜 화합물 114(4.67 g, 65%)를 수득하였다.

2'-O-C6-아미드-올레일 접합 우리딘 아미다이트의 합성

반응식 15

화합물 115: 화합물 101(5.0 g, 7.74 mmol)을 올레일산(2.43 g, 8.6 mmol) 및 HBTU(3.58 g, 9.45 mmol)와 함께 반응 플라스크에 첨가하였다. 고형물을 DMF(75 ml)에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(4.05 ml, 23.23 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 TLC(80% EtOAc/헥산)에 의해 확인하였다. 반응 혼합물을 디에틸 에테르 및 묽은 소듐 바이카르보네이트 용액으로 희석하고, 분리 깔때기에 첨가하였다. 유기층을 묽은 소듐 바이카르보네이트 용액, 포화 소듐 바이카르보네이트, 및 이후 포화 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(0% 내지 100% EtOAc/헥산) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압에서 농축시켜 화합물 115(5.86 g, 84%)를 수득하였다.

C₅₄H₇₅N₃O₉에 대한 질량 계산치: 910.21, 실측치: 908.5 (M-H).

화합물 116: 화합물 115(3.56 g, 3.90 mmol)을 반응 플라스크에 첨가하고, 탈기시키고, 아르곤으로 퍼징하였다. 출발 물질을 디클로로메탄(35 ml)에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(2.04 ml, 11.71 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 반응 혼합물을 아이스 배쓰를 통해 0℃까지 냉각시켰다. 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(1.13 ml, 5.07 mmol) 및 1-메틸이미다졸(0.311 ml, 3.9 mmol)을 반응 혼합물에 첨가하고, 반응 혼합물이 실온까지 가온되게 하고, 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 TLC(80% EtOAc/헥산)에 의해 확인하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 디클로로메탄에 용해시키고, 분리 깔때기에 첨가하고, 유기층을 포화 소듐 바이카르보네이트로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(0% 내지 100% EtOAc/헥산) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압에서 농축시켜 화합물 116(3.5 g, 80%)을 수득하였다.

2'-O-C3-아미드-올레일 접합 우리딘 아미다이트의 합성

반응식 16

화합물 117: 화합물 104(5.0 g, 8.28 mmol)를 올레일산(2.6 g, 9.19 mmol) 및 HBTU(3.83 g, 10.11 mmol)와 함께 반응 플라스크에 첨가하였다. 고형물을 DMF(70 ml)에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(4.33 ml, 24.85 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 TLC(80% EtOAc/헥산)에 의해 확인하였다. 반응 혼합물을 디에틸 에테르 및 묽은 소듐 바이카르보네이트 용액으로 희석하고, 분리 깔때기에 첨가하였다. 유기층을 묽은 소듐 바이카르보네이트 용액, 포화 소듐 바이카르보네이트, 및 이후 포화 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(0% 내지 100% EtOAc/헥산) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압에서 농축시켜 화합물 117(4.6 g, 64%)을 수득하였다.

C₅₁H₆₉N₃O₉에 대한 질량 계산치: 868.13, 실측치: 867.5 (M-H).

화합물 118: 화합물 117(4.6 g, 5.3 mmol)을 반응 플라스크에 첨가하고, 탈기시키고, 아르곤으로 퍼징하였다. 출발 물질을 디클로로메탄(45 ml)에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(2.77 ml, 15.9 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 반응 혼합물을 아이스 배쓰를 통해 0℃까지 냉각시켰다. 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(1.54 ml, 6.89 mmol) 및 1-메틸이미다졸(0.422 ml, 5.3 mmol)을 반응 혼합물에 첨가하고, 반응 혼합물이 실온까지 가온되게 하고, 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 TLC(80% EtOAc/헥산)에 의해 확인하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 디클로로메탄에 용해시키고, 분리 깔때기에 첨가하고, 유기층을 포화 소듐 바이카르보네이트로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(0% 내지 60% EtOAc/헥산) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압에서 농축시켜 화합물 118(4.64 g, 82%)을 수득하였다.

A, G, C 및 U의 2'-O-C3 및 2'-O-C6 포스포라미다이트의 합성

반응식 17

2'-O-C3 우리딘 포스포라미다이트 804a 의 합성: 합성 전, 출발 물질인 화합물 803a(4.00 g, 6.80 mmol)를 아세토니트릴로 2회 공증발시키고, 고진공에서 밤새 건조시켰다. 무수 디클로로메탄(79.03 mL) 중 화합물 803a의 용액에 DIPEA(4.14 mL, 23.78 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 아이스 배쓰에서 0℃까지 냉각시키고, 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(2.73 mL, 12.23 mmol)를 적가하였다. 혼합물을 실온까지 가온시키고, 4시간 동안 교반하고, TLC를 확인하였다(헥산 중 60% EtOAc). 용매를 감압 하에 스트립핑시키고, 잔여물을 고진공에서 1시간 동안 건조시켰다. 잔여물을 EtOAc에 재현탁시키고, 포화 수성 NaHCO₃로 신속하게 표준 수성 후처리를 수행하였다. 유기층을 합하고, 포화 수성 NaCl로 세척하고, 무수 소듐 설페이트 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 헥산 중 0 내지 60% EtOAc의 구배로 실리카 겔(Et₃N으로 전처리됨)에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 4.53 g(84% 수율)의 화합물 804a를 수득하였다.

2'-O-C6 우리딘 포스포라미다이트 804b의 합성: 화합물 803b(4.0 g, 6.35 mmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, 탈기시키고, 아르곤으로 퍼징하였다. 출발 물질을 디클로로메탄에 용해시키고, 디이소프로필아민(2.21 ml, 12.7 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(2.12 ml, 9.53 mmol)를 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응을 TLC(헥산 중 70% EtOAc)에 의해 확인하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 디클로로메탄에 용해시키고, 분리 깔때기에 첨가하고, 유기층을 포화 소듐 바이카르보네이트 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 염수 용액으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 소듐 설페이트로 건조하였다. 고형물을 여과해 내고, 모액을 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(헥산 중 30% 내지 100% EtOAc) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하고, 산물 분획을 합하고, 감압에서 농축시켜 804b(3.42 g, 65%)를 수득하였다.

2'-O-C6 및 2'-O-C3 아데노신 포스포라미다이트의 합성

반응식 18

화합물 813a 및 813b의 합성: 상기 합성 반응식 18에 나타낸 절차 및 화합물 804b의 합성에 대하여 기재된 포스피틸화 공정과 유사한 절차를 이용함으로써, 화합물 813a 및 813b를 합성하고 특징규명하였다.

2'-O-C6 및 2'-O-C3 구아노신 포스포라미다이트의 합성

반응식 19

화합물 822a 및 822b의 합성: 상기 합성 반응식 19에 나타낸 절차 및 화합물 804b의 합성에 대하여 기재된 포스피틸화 공정과 유사한 절차를 이용함으로써, 화합물 804b, 화합물 822a 및 822b를 합성하고 특징규명하였다.

2'-O-C6-아미드-C16 에스테르 접합 우리딘 아미다이트의 합성

반응식 20

화합물 122: 가열-오븐 건조된 100 mL 둥근 병 플라스크에 무수 DCM(120 mL) 중 화합물 101(4 g, 6.19 mmol, 1.0 eq.)의 용액을 첨가하였다. 16-메톡시-16-옥소헥사데칸산, 화합물 121(2.05 g, 6.81 mmol, 1.1 eq.), 이어서 HBTU(2.58 g, 6.81 mmol, 1.1 eq.) 및 DIPEA(3.24 mL, 18.58 mmol, 3 eq.)를 용액에 첨가하였다. 생성된 용액을 아르곤 하에 밤새 실온에서 교반하였다. 100% EtOAc/헥산을 이용한 TLC는 생성물의 형성을 나타냈다. 반응 혼합물을 염수 용액으로 켄칭시키고, DCM으로 추출하였다. 합한 유기 용액을 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 오일로 농축시켰다. 0 내지 100% EtOAc/헥산으로 용리시켜 80 g 실리카 겔 컬럼으로 ISCO 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여 화합물 122를 제공하였다. 걸쭉한 오일 생성물을 수득하였다(4.81 g, 84%).

화합물 123: 화합물 122(4.81 g, 5.18 mmol, 1 eq.)를 무수 EtOAc(120 mL)에 용해시켰다. 아르곤 하에 아이스 배쓰에 냉각시키고, DIPEA(2.71 ml, 15.55 mmol, 3 eq.) 이어서 N,N-디이소프로필아미노시아노에틸 포스폰아미드-Cl(1.35 g, 5.70 mmol, 1.1 eq.)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 100% EtOAc/헥산에서의 TLC는 반응의 완료를 나타냈다. 반응 혼합물을 염수로 켄칭시키고, EtOAc로 추출하였다. 유기층을 분리하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 백색 오일로 농축시켰다. 0 내지 100% EtOAc/헥산으로 용리시켜 ISCO 정제로 화합물 123을 78.3%(4.58 g)의 수율로 제공하였다.

2'-O-C6-아미드-C18 에스테르 접합 우리딘 아미다이트의 합성

반응식 21

화합물 125: 화합물 122의 합성에 대한 상기 절차와 유사한 절차로 화합물 101 및 18-메톡시-18-옥소옥타데칸산 124을 사용함으로써 화합물 125를 수득하였다.

화합물 126: 화합물 123의 합성에 대한 상기 절차와 유사한 절차로 N,N-디이소프로필아미노시아노에틸 포스폰아미드-Cl과 화합물 125를 사용함으로써 화합물 126을 수득하였다.

2'-O-C6-아미드-C20 에스테르 접합 우리딘 아미다이트의 합성

반응식 22

화합물 128: 화합물 128의 합성에 대한 상기 절차와 유사한 절차로 화합물 101 및 20-메톡시-20-옥소이코산산 127을 사용함으로써 화합물 128을 수득하였다.

화합물 129: 화합물 123의 합성에 대한 상기 절차와 유사한 절차로 N,N-디이소프로필아미노시아노에틸 포스폰아미드-Cl과 화합물 128을 사용함으로써 화합물 129를 수득하였다.

2',3'-O-펜타데실 ω 카르복시메틸 에스테르 우리딘 포스포라미다이트의 합성

반응식 23

화합물 131 및 132: 디메틸포름아미드(DMF)(60 mL) 중 화합물 130(3.3 g, 6.95 mmol)의 용액에 메틸-16-브로모헥사데카노에이트(5.00 g, 13.89 mmol) 및 테트라부틸암모늄 아이오다이드(5.24 g, 13.89 mmol)를 한 번에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 130℃에서 12시간 동안 환류로 가열하였다. 생성된 적색 용액의 DMF를 고진공 하에 제거하여 검형 갈색 물질을 수득하였고, 이를 콤비플래시 크로마토그래피(구배: DCM 중 0 내지 10% MeOH)에 의해 정제하여 화합물 131 및 132(1.45 g, 41% 수율)의 혼합물을 누르스름한 갈색 고형물로서 수득하였다.

화합물 133 및 134: 건조 피리딘(30 mL) 중 화합물 131 및 132(1.5 g, 2.92 mmol)의 투명한 용액에 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드(1.25 g, 3.51 mmol)를 세 분획으로 나누어 첨가하였다. 반응 혼합물을 22℃에서 12시간 동안 교반한 후, NaHCO₃ 포화 용액(30 mL)으로 켄칭시켰다. 생성된 혼합물을 DCM(2 × 40 mL)으로 추출하였다. 합한 유기층을 분리하고, 염수(40 mL)로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 건조 상태로 증발시켰다. 미정제 화합물을 콤비플래시 크로마토그래피(구배: 헥산 중 10 내지 50% 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 화합물 133을 백색 포움(0.32 g, 13%)으로서 및 화합물 134를 누르스름한 백색 포움(0.81 g, 34%)으로서 수득하였다.

화합물 133에 대한 스펙트럼 데이터:

화합물 134에 대한 스펙트럼 데이터:

화합물 135: 22℃에서 건조 디클로로메탄(30 mL) 중 화합물 133(1.0 g, 1.23 mmol)의 투명한 용액에 디이소프로필에틸아민(800.89 mg, 6.13 mmol, 1.08 mL) 및 N-메틸이미다졸(152.63 mg, 1.84 mmol, 148.19 μL)을 서서히 첨가하였다. 생성된 용액을 5분 동안 교반하고, 그 후에 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(611.38 mg, 2.45 mmol, 576.77 μL)를 한 번에 첨가하였다. 반응 혼합물을 22℃에서 1 hr동안 계속 교반하고, TLC를 확인하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄(50 mL)으로 희석하고, 10% 소듐 바이카르보네이트 용액(2 × 50 mL)으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 건조 상태로 증발시켰다. 수득된 미정제 물질을 콤비플래시 크로마토그래피(구배: 헥산 중 20 내지 50% 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 화합물 135(1.01 g, 81% 수율)를 수득하였다.

화합물 136: 22℃에서 건조 디클로로메탄(40 mL) 중 135(0.95 g, 1.17 mmol)의 투명한 용액에 디이소프로필에틸아민(760.85 mg, 5.83 mmol, 1.03 mL) 및 N-메틸이미다졸(193.33 mg, 2.33 mmol, 187.70 μL)을 서서히 첨가하였다. 생성된 용액을 5분 동안 교반하고, 그 후에 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(580.81 mg, 2.33 mmol, 547.93 μL)를 한 번에 첨가하였다. 반응 혼합물을 22℃에서 1시간 동안 계속 교반하고, TLC를 확인하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄(50 mL)으로 희석하고, 10% 소듐 바이카르보네이트 용액(2 × 50 mL)으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 무수 Na₂SO₄상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 건조 상태로 증발시켰다. 수득된 미정제 물질을 콤비플래시 크로마토그래피(구배: 헥산 중 20 내지 50% 에틸 아세테이트)에 의해 136(0.97 g, 82% 수율)으로 정제하였다.

2',3'-O-펜타데실 ω 카르복시메틸 에스테르 아디노신 포스포라미다이트의 합성

반응식 24

화합물 202 및 203: 건조 디메틸포름아미드(50 mL) 중 화합물 201(5.0 g, 18.71 mmol)의 현탁액에 0℃에서 소듐 하이드라이드(미네랄 오일 중 60% 분산액)(748.32 mg, 18.71 mmol)를 첨가하고, 30분 동안 교반하였다. 아이스 배쓰를 제거하고, 반응 혼합물을 45℃까지 가온시키고, 5시간 동안 교반하였고, 그 후에 용매를 고진공 펌프에서 증발시키고, 고형 물질을 콤비플래시 크로마토그래피(구배: DCM 중 0 내지 10% MeOH)에 의해 정제하여 화합물 202 및 203(4.2 g, 42% 수율)의 혼합물을 백색 고형물로서 수득하였다.

화합물 204 및 205: 건조 피리딘(25 mL) 중 화합물 2 및 3의 혼합물(3.6 g, 6.72 mmol)의 투명한 용액에 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드(2.88 g, 8.06 mmol)를 세 분획으로 나누어 첨가하였다. 반응 혼합물을 22℃에서 24시간 동안 교반한 후, NaHCO₃ 포화 용액(30 mL)으로 켄칭시켰다. 생성된 혼합물을 DCM(2 × 40 mL)으로 추출하였다. 합한 유기층을 분리하고, 염수(40 mL)로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 건조 상태로 증발시켰다. 미정제 화합물을 콤비플래시 크로마토그래피(구배: 헥산 중 10 내지 90% 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 화합물 204(0.36 g, 6%) 및 205(3.8 g, 67%)를 백색 포움으로서 수득하였다.

화합물 204에 대한 스펙트럼 데이터:

화합물 205에 대한 스펙트럼 데이터:

화합물 206: 디메틸포름아미드(30 mL) 중 화합물 204(1.27 g, 1.52 mmol)의 투명한 용액에 N,N-디메틸포름아미드 디메틸 아세탈(288.16 mg, 2.27 mmol, 323.77 μL)을 한 번에 첨가하고, 반응 혼합물을 60℃에서 4시간 동안 교반하였다. TLC를 확인하고, 고진공 펌프 하에서 휘발성 물질을 제거하였다. 잔여물을 DCM(100 mL)에 용해시키고, 유기층을 염수(3 × 50 mL)로 세척하였다. 그 후에, DCM 층을 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 건조 상태로 증발시켰다. 이에 따라 수득된 미정제 물질을 콤비플래시 크로마토그래피(구배: DCM 중 0 내지 5% MeOH)에 의해 정제하여 206(0.87 g, 64% 수율)을 백색 흡습성 고형물로서 수득하였다.

화합물 207: 디메틸포름아미드(30 mL) 중 205(2.0 g, 2.39 mmol)의 투명한 용액에 N,N-디메틸포름아미드 디메틸 아세탈(453.79 mg, 3.58 mmol, 505.90 μL)을 한 번에 첨가하고, 반응 혼합물을 60℃에서 4 hr 동안 교반하였다. TLC를 확인하고, 고진공 펌프 하에서 휘발성 물질을 제거하였다. 잔여물을 DCM(100 mL)에 용해시키고, 유기층을 염수(3 × 50 mL)로 세척하였다. 그 후에, DCM 층을 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 건조 상태로 증발시켰다. 이에 따라 수득된 미정제 물질을 콤비플래시 크로마토그래피(구배: DCM 중 0 내지 5% MeOH)에 의해 정제하여 화합물 207(1.85 g, 87% 수율)을 백색 흡습성 고형물로서 수득하였다.

화합물 208: 22℃에서 건조 디클로로메탄(20 mL) 중 화합물 206(0.68 g, 761.38 μmol)의 투명한 용액에 디이소프로필에틸아민(496.97 mg, 3.81 mmol, 669.77 μL) 및 N-메틸이미다졸(94.71 mg, 1.14 mmol, 91.95 μL)을 서서히 첨가하였다. 생성된 용액을 5분 동안 교반하고, 그 후에 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(379.37 mg, 1.52 mmol, 357.90 μL)를 한 번에 첨가하였다. 반응 혼합물을 22℃에서 1시간 동안 계속 교반하고, TLC를 확인하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄(50 mL)으로 희석하고, 10% 소듐 바이카르보네이트 용액(2 × 50 mL)으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 건조 상태로 증발시켰다. 수득된 미정제 물질을 콤비플래시 크로마토그래피(구배: 헥산 중 40 내지 70% 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 화합물 208(0.61 g, 73% 수율)을 백색 흡습성 고형물로서 수득하였다.

화합물 209: 22℃에서 건조 디클로로메탄(35 mL) 중 화합물 207(0.2 g, 223.93 μmol)의 투명한 용액에 디이소프로필에틸아민(146.17 mg, 1.12 mmol, 196.99 μL) 및 N-메틸이미다졸(27.86 mg, 335.90 μmol, 27.04 μL)을 서서히 첨가하였다. 생성된 용액을 5분 동안 교반하고, 그 후에 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(111.58 mg, 447.87 μmol, 105.26 μL)를 한 번에 첨가하였다. 반응 혼합물을 22℃에서 1시간 동안 계속 교반하고, TLC를 확인하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄(50 mL)으로 희석하고, 10% 소듐 바이카르보네이트 용액(2 × 50 mL)으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 건조 상태로 증발시켰다. 수득된 미정제 물질을 콤비플래시 크로마토그래피(구배: 헥산 중 20 내지 50% 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 화합물 209(0.173 g, 71% 수율)를 흡습성 고형물로서 수득하였다.

2',3'-O-펜타데실 ω 카르복시메틸 에스테르 구아노신 포스포라미다이트의 합성

반응식 25

화합물 219 및 220: 건조 디메틸포름아미드 중 화합물 218의 현탁액에 0℃에서 소듐 하이드라이드(미네랄 오일 중 60% 분산액)를 첨가하고, 30분 동안 교반하였다. 아이스 배쓰를 제거하고, 반응 혼합물을 45℃까지 가온시키고, 5시간 동안 교반하였고, 그 후에 용매를 고진공 펌프에서 증발시키고, 고형 물질을 콤비플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 219 및 220의 혼합물을 수득하였다.

화합물 221 및 222: 문헌[Robins et. al. (Can. J. Chem. 1997, 75, 762-767)]에 기재된 바와 같이 화합물 219 및 220을 아데노신 데아미나제(ADA)를 사용하여 각각 화합물 221 및 222로 변환시켰다.

화합물 223 및 224: 건조 피리딘 중 화합물 221 및 222의 혼합물의 투명한 용액에 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드를 세 번에 나누어 첨가하였다. 반응 혼합물을 22℃에서 24시간 동안 교반한 후, NaHCO₃ 포화 용액으로 켄칭시켰다. 생성된 혼합물을 DCM으로 추출하였다. 합한 유기층을 분리하고, 염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 건조 상태로 증발시켰다. 미정제 화합물을 콤비플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 223 및 224를 수득하였다.

화합물 225: 디메틸포름아미드 중 화합물 223의 투명한 용액에 N,N-디메틸포름아미드 디메틸 아세탈을 한 번에 첨가하고, 반응 혼합물을 60℃에서 4 hr 동안 교반하였다. TLC를 확인하고, 고진공 펌프 하에서 휘발성 물질을 제거하였다. 잔여물을 DCM(100 mL)에 용해시키고, 유기층을 염수로 세척하였다. DCM 층을 이후 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 건조 상태로 증발시켰다. 이에 따라 수득된 미정제 물질을 콤비플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 225를 수득하였다.

화합물 226: 디메틸포름아미드 중 화합물 224의 투명한 용액에 N,N-디메틸포름아미드 디메틸 아세탈을 한 번에 첨가하고, 반응 혼합물을 60℃에서 4시간 동안 교반하였다. TLC를 확인하고, 고진공 펌프 하에서 휘발성 물질을 제거하였다. 잔여물을 DCM에 용해시키고, 유기층을 염수로 세척하였다. DCM 층을 이후 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 건조 상태로 증발시켰다. 이에 따라 수득된 미정제 물질을 콤비플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 226을 수득하였다.

화합물 227: 22℃에서 건조 디클로로메탄 중 화합물 225의 투명한 용액에 디이소프로필에틸아민 및 N-메틸이미다졸을 서서히 첨가하였다. 생성된 용액을 5분 동안 교반하고, 그 후에 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트를 한 번에 첨가하였다. 반응 혼합물을 22℃에서 1시간 동안 계속 교반하고, TLC를 확인하였다. 반응 혼합물을 10% 소듐 바이카르보네이트 용액을 첨가하여 디클로로메탄으로 희석하였다. 유기층을 분리하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 건조 상태로 증발시켰다. 이에 따라 수득된 미정제 물질을 콤비플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 227을 수득하였다.

화합물 228: 22℃에서 건조 디클로로메탄 중 화합물 226의 투명한 용액에 디이소프로필에틸아민 및 N-메틸이미다졸을 서서히 첨가하였다. 생성된 용액을 5분 동안 교반하고, 그 후에 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트를 한 번에 첨가하였다. 반응 혼합물을 22℃에서 1시간 동안 계속 교반하고, TLC를 확인하였다. 반응 혼합물을 10% 소듐 바이카르보네이트 용액을 첨가하여 디클로로메탄으로 희석하였다. 유기층을 분리하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 건조 상태로 증발시켰다. 이에 따라 수득된 미정제 물질을 콤비플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 228을 수득하였다.

2',3'-O-펜타데실 ω 카르복시메틸 에스테르 시티딘 포스포라미다이트의 합 성

반응식 26

화합물 210: 디메틸포름아미드(15 mL) 중 화합물 134(1.2 g, 1.47 mmol)의 투명한 용액에 이미다졸(202.51 mg, 2.94 mmol)을 첨가하고, 5분 동안 교반하였다. 생성된 용액에 3차-부틸디메틸실릴 클로라이드(343.17 mg, 2.21 mmol)를 한 번에 첨가하고, 22℃에서 12시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 에틸아세테이트(50 mL) 및 염수(50 mL)로 희석하였다. 유기층을 분리하고, 염수(2 × 50 mL) 및 물(50 mL)로 추가로 세척하였다. 그 후에, 유기층을 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 건조 상태로 증발시켰다. 이에 따라 수득된 미정제 화합물을 콤비플래시 크로마토그래피(구배: 헥산 중 0 내지 50% 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 화합물 210(1.12 g, 82% 수율)을 백색 포움으로서 수득하였다.

화합물 211: 아세토니트릴(30 mL) 중 화합물 210(1.2 g, 1.29 mmol)의 투명한 용액에 1,2,4-트리아졸(2.00 g, 28.41 mmol) 및 트리에틸아민(2.89 g, 28.41 mmol, 3.98 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃까지 냉각시킨 후, 인(V)옥시클로라이드(594.02 mg, 3.87 mmol, 362.21 μL)를 서서히 첨가하였다. 15분 후에 아이스 배쓰를 제거하고, 22℃에서 8 hr 동안 교반을 계속하였다. 휘발성 물질을 고진공 하에 제거하고, 잔여물을 DCM(50 mL)에 희석하고, 유기층을 물(30 mL) 및 염수(50 mL)로 세척하였다. DCM 층을 분리하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 건조 상태로 증발시켰다. 미정제 화합물을 콤비플래시 크로마토그래피(구배: 헥산 중 20 내지 60% 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 화합물 211(0.99 g, 78% 수율)을 백색 고형물로서 수득하였다.

화합물 212: THF(20 mL) 중 화합물 211(0.99 g, 1.01 mmol)의 용액에 22℃에서 THF 중 테트라부틸암모늄 플루오라이드 1 M(346.72 mg, 1.31 mmol, 383.97 μL)을 한 번에 서서히 첨가한 후, 3시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 고진공 펌프에서 제거하고, 이에 따라 수득된 미정제 잔여물을 콤비플래시 크로마토그래피(구배: DCM 중 0 내지 5% 메탄올)에 의해 정제하여 화합물 212(0.69 g, 79% 수율)를 백색 고형물로서 수득하였다.

화합물 213: 22℃에서 건조 DCM(10 mL) 중 화합물 212(0.23 g, 265.57 μmol)의 투명한 용액에 디이소프로필에틸아민(173.35 mg, 1.33 mmol, 233.62 μL) 및 N-메틸이미다졸(33.04 mg, 398.36 μmol, 32.07 μL)을 서서히 첨가하였다. 생성된 용액을 5분 동안 교반하고, 그 후에 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(132.33 mg, 531.15 μmol, 124.84 μL)를 한 번에 첨가하였다. 반응 혼합물을 22℃에서 1시간 동안 계속 교반하고, TLC를 확인하였다. 반응 혼합물을 DCM(50 mL)으로 희석하고, 10% 소듐 바이카르보네이트 용액(2 × 50 mL)으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 건조 상태로 증발시켰다. 수득된 미정제 물질을 콤비플래시 크로마토그래피(구배: 헥산 중 30 내지 60% 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 화합물 213(0.23 g, 81% 수율)을 백색 고형물로서 수득하였다.

화합물 214: 디메틸포름아미드(15 mL) 중 화합물 133(1.3 g, 1.60 mmol)의 투명한 용액에 이미다졸(219.38 mg, 3.19 mmol)을 첨가하고, 5분 동안 교반하였다. 생성된 용액에 3차-부틸디메틸실릴 클로라이드(371.77 mg, 2.39 mmol)를 한 번에 첨가하고, 22℃에서 16시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(50 mL) 및 염수(50 mL)로 희석하였다. 유기층을 분리하고, 염수(2 × 50 mL) 및 물(50 mL)로 추가로 세척하였다. 그 후에, 유기층을 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 건조 상태로 증발시켰다. 이에 따라 수득된 미정제 화합물을 콤비플래시 크로마토그래피(구배: 헥산 중 0 내지 50% 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 화합물 214(1.29 g, 1.39 mmol, 87.03% 수율)를 백색 포움으로서 수득하였다.

화합물 215: 아세토니트릴(30 mL) 중 화합물 214(1.29 mmol)의 투명한 용액에 1,2,4-트리아졸(28.41 mmol) 및 트리에틸아민(28.41 mmol, 3.98 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃까지 냉각시킨 후, 인(V)옥시클로라이드(3.87 mmol, 362.21 μL)를 서서히 첨가하였다. 15분 후에 아이스 배쓰를 제거하고, 22℃에서 9시간 동안 교반을 계속하였다. 휘발성 물질을 고진공 하에 제거하고, 잔여물을 DCM(60 mL)에 희석하고, 유기층을 물(30 mL) 및 염수(2 × 50 mL)로 세척하였다. DCM 층을 분리하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 건조 상태로 증발시켰다. 미정제 화합물을 콤비플래시 크로마토그래피(구배: 헥산 중 20 내지 70% 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 215(0.92 g, 72% 수율)를 백색 고형물로서 수득하였다.

화합물 216: THF(20 mL) 중 화합물 215(0.92 g)의 용액에 22℃에서 THF 중 테트라부틸암모늄 플루오라이드 1 M(1.31 mmol, 383.97 μL)을 한 번에 서서히 첨가한 후, 3시간 동안 교반하였다. 휘발성 물질을 고진공 펌프에서 제거하고, 이에 따라 수득된 미정제 잔여물을 콤비플래시 크로마토그래피(구배: DCM 중 0 내지 5% 메탄올)에 의해 정제하여 화합물 216(0.70 g, 79% 수율)을 백색 고형물로서 수득하였다.

화합물 217: 22℃에서 건조 DCM(10 mL) 중 화합물 216(0.25 g)의 투명한 용액에 디이소프로필에틸아민(1.33 mmol, 233.62 μL) 및 N-메틸이미다졸(398.36 μmol, 32.07 μL)을 서서히 첨가하였다. 생성된 용액을 5분 동안 교반하고, 그 후에 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(531.15 μmol, 124.84 μL)를 한 번에 첨가하였다. 반응 혼합물을 22℃에서 1시간 동안 계속 교반하고, TLC를 확인하였다. 반응 혼합물을 DCM(50 mL)으로 희석하고, 10% 소듐 바이카르보네이트 용액(2 × 50 mL)으로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 건조 상태로 증발시켰다. 수득된 미정제 물질을 콤비플래시 크로마토그래피(구배: 헥산 중 30 내지 80% 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여 화합물 217(0.24 g, 82% 수율)을 백색 포움으로서 수득하였다.

2'-O-트리, 헵타 및 노나-데실 ω 카르복시메틸 에스테르 우리딘 포스포라미다이트의 합성

반응식 27

화합물 701: 헵탄 중 트리메틸알루미늄(35.2 mL, 70.3 mmol)의 2 M 용액을 데크-9-엔-1-올(41.05 mL, 230.14 mmol) 및 무수 디글라임(24 mL)의 혼합물에 적가하였다. 생성된 혼합물을 100℃까지 1시간 동안 가열하고, 실온까지 냉각시키고, 이어서 5'-OTBDPS 무수 우리딘 700(14.85 g, 31.96 mmol)을 한 번에 첨가하였다. 반응 혼합물을 125℃에서 밤새 가열하였다. 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 10% H₃PO₄(400 mL)와 에틸 아세테이트(500 mL) 사이에 분배하였다. 유기층을 분리하고, 염수로 세척하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하였다. 휘발물을 진공 하에 제거하고, 잔여물을 용리액으로서 헥산 중 0 내지 40% EtOAc를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 701(10.5 g, 52%)을 제공하였다.

C₃₅H₄₉N₂O₆Si [M+H]⁺ m/z에 대한 LRMS (ESI) 계산치 = 621.33, 실측치 621.4.

반응식 28

화합물 703: MeOH(105 mL) 중 9-브로모논-1-엔 702(13.3 g, 62.24 mmol)의 용액을 H₂O(25 mL) 중 포타슘 시아나이드(5.27 g, 80.9 mmol)의 용액과 합하였다. 생성된 혼합물을 24시간 동안 환류로 가열하였다. 유기 용매를 감압 하에 제거하고, 수성 잔여물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 미정제 니트릴을 제공하였다. 100 mL의 에탄올 및 100 mL의 물 중 포타슘 하이드록사이드(31.43 g, 560.18 mmol)의 용액에 이전에 합성된 니트릴을 첨가하고, 생성된 혼합물을 24시간 동안 환류로 가열하였다. 혼합물의 총 부피를 감압 하에 절반으로 감소시킨 후, Et₂O(100 mL)로 추출하였다. 농축된 HCl을 산성 pH (1 내지 2)에 도달할 때까지 생성된 수성 층에 적가하고, 이어서 Et₂O(2 × 100 mL)로 추출하였다. 유기 추출물을 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 건조 상태로 증발시켜, 미정제 카르복실산(9.81 g)을 수득하였다. 미정제 카르복실산을 무수 MeOH(130 mL)에 용해시키고, 티오닐 클로라이드(6.77 mL, 93.36 mmol)를 0℃에서 적가하였다. 아이스 배쓰를 제거하고, 생성된 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 휘발물을 감압 하에 제거하고, 잔여물을 용리액으로서 EtOAc/헥산 2:8을 사용하여 실리카 패드(5 cm)를 통해 여과하여 화합물 703(10.5 g, 3 단계에 걸쳐 91%)을 제공하였다.

C₁₁H₂₁O₂ [M+H]⁺ m/z에 대한 LRMS (ESI) 계산치 = 185.15, 실측치 185.1.

반응식 29

화합물 704: 화합물 701(5.42 g, 8.73 mmol)을 무수 DCM(175 mL)에 용해시키고, 이어서 메틸 데크-9-에노에이트 703(10.46 g, 56.74 mmol), 벤조퀴논(141.56 mg, 1.31 mmol) 및 2세대 Hoveyda-Grubbs 촉매(547.04 mg, 873.0 μmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 3.5시간 동안 환류에서 교반하고, 실온까지 냉각시키고, 반응 혼합물의 총 부피를 감압 하에 절반으로 감소시켰다. 생성된 용액을 120 g 실리카 컬럼 카트리지에 로딩하고, 용리액으로서 헥산 중 0 내지 60% EtOAc를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 704(5.37 g, 79%)를 초록빛 오일로서 제공하였다.

C₄₄H₆₅N₂O₈Si[M+H]⁺ m/z에 대한 LRMS (ESI) 계산치 = 777.44, 실측치 777.5.

반응식 30

화합물 705: 탄소 상 10% Pd(735.42 mg, 0.69 mmol)를 EtOH(170 mL) 중 뉴클레오사이드 704(5.37 g, 6.91 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 수소를 충전한 벌룬에 연결된 3 방향 어댑터를 플라스크에 장착하였다. 용액을 포화시키도록 일련의 진공-H₂ 재충전(x3)으로 플라스크를 처리하였다. 0.5시간 후에, 혼합물을 MeOH로 희석하고, 셀라이트 패드를 통해 추가 메탄올로 세정하면서 여과하였다. 여과액을 감압 하에 증발시켜 미정제 화합물 705(5.01 g, 93%)를 제공하였다.

C₄₄H₆₇N₂O₈Si[M+H]⁺ m/z에 대한 LRMS (ESI) 계산치 = 779.46, 실측치 779.4.

반응식 31

화합물 706: 트리에틸아민(3.59 mL, 25.72 mmol) 및 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드(3.14 mL, 19.3 mmol)를 THF(50 mL) 중 화합물 705(5.01 g, 6.43 mmol)의 교반된 용액에 순차적으로 첨가하였다. 생성된 혼합물을 45℃에서 4시간 동안 가열한 다음, 감압 하에 휘발성 물질을 제거하였다. 미정제 잔여물을 용리액으로서 헥산 중 0 내지 100% EtOAc를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 706(1.46 g, 42%)를 제공하였다.

반응식 32

화합물 707: 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드(1.10 g, 3.24 mmol) 및 트리에틸아민(0.45 mL, 3.24 mmol)을 피리딘(20 mL) 중 뉴클레오사이드 706(1.46 g, 2.70 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 3시간 후, 용매를 감압 하에 제거하고, 잔여물을 EtOAc에 용해시키고, 물, 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 건조 상태로 증발시켰다. 잔여물을 용리액으로서 헥산 중 0 내지 50% EtOAc를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 707(1.325 g, 58%)을 제공하였다.

반응식 33

화합물 708: DIPEA, 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트, 및 N-메틸이미다졸을 0℃에서 무수 EtOAc 중 화합물 707의 교반된 용액에 순차적으로 첨가하였다. 저온 배쓰를 제거하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 반응을 MeCN/톨루엔 중 트리에탄올아민(2.7 M, 50 mL)의 용액으로 켄칭시키고, 5분 동안 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 분리 깔때기로 옮기고, 층을 분리하고, 유기층을 5% NaCl 용액, 및 염수로 순차적으로 세척하였다. 유기층을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 건조 상태로 증발시켰다. 잔여물을 트리에틸아민 전처리된 실리카 겔 상에 사전-흡착시켰다. 컬럼을 1% NEt₃를 함유하는 헥산으로 평형시켰다. 잔여물을 용리액으로서 헥산 중 0 내지 40% EtOAc를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 708을 제공하였다.

반응식 34

화합물 710: MeOH(180 mL) 중 11-브로모운데크-1-엔(25.08 g, 103.25 mmol)의 용액을 H₂O(45 mL) 중 포타슘 시아나이드(8.74 g, 134.2 mmol)의 용액과 합하였다. 생성된 혼합물을 24시간 동안 환류로 가열하였다. 유기 용매를 감압 하에 제거하고, 수성 잔여물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 미정제 니트릴을 제공하였다. 150 mL의 에탄올 및 150 mL의 물 중 포타슘 하이드록사이드(52.14 g, 929.3 mmol)의 용액에 이전에 합성된 니트릴을 첨가하고, 생성된 혼합물을 24시간 동안 환류로 가열하였다. 혼합물의 총 부피를 감압 하에 절반으로 감소시킨 후, Et₂O(200 mL)로 추출하였다. 농축된 HCl을 산성 pH (1 내지 2)로 감소될 때까지 생성된 수성 층에 적가하고, 이어서 Et₂O(2x200 mL)로 추출하였다. 유기 추출물을 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 건조 상태로 증발시켜, 미정제 카르복실산(16.6 g)을 수득하였다. 미정제 카르복실산을 무수 MeOH(150 mL)에 용해시키고, 티오닐 클로라이드(8.24 mL, 113.6 mmol)를 0℃에서 적가하였다. 아이스 배쓰를 제거하고, 생성된 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 휘발물을 감압 하에 제거하고, 잔여물을 용리액으로서 EtOAc/헥산 2:8을 사용하여 실리카 패드(5 cm)를 통해 여과하여 화합물 710(17.5 g, 3 단계에 걸쳐 79%)을 제공하였다.

반응식 35

화합물 711: 화합물 701(4.44 g, 7.15 mmol)을 무수 DCM(145 mL)에 용해시키고, 이어서 메틸 데크-9-에노에이트 710(15.18 g, 71.5 mmol), 벤조퀴논(116 mg, 1.07 mmol) 및 2세대 Hoveyda-Grubbs 촉매(448 mg, 0.715 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 3.5시간 동안 환류에서 교반하고, 실온까지 냉각시키고, 반응 혼합물의 총 부피를 감압 하에 절반으로 감소시켰다. 생성된 용액을 120 g 실리카 컬럼 카트리지에 로딩하고, 용리액으로서 헥산 중 0 내지 60% EtOAc를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 711(4.63 g, 80%)을 초록빛 오일로서 제공하였다.

반응식 36

화합물 712: 탄소 상 10% Pd(612 mg, 0.575 mmol)를 EtOH(150 mL) 중 뉴클레오사이드 711(4.63 g, 5.75 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 수소를 충전한 벌룬에 연결된 3 방향 어댑터를 플라스크에 장착하였다. 용액을 포화시키도록 일련의 진공-H₂ 재충전(x3)으로 플라스크를 처리하였다. 0.5시간 후에, 혼합물을 MeOH로 희석하고, 셀라이트 패드를 통해 추가 메탄올로 세정하면서 여과하였다. 여과액을 감압 하에 증발시켜 미정제 712(4.52 g, 97%)를 제공하였다.

C₄₆H₇₁N₂O₈Si[M+H]⁺ m/z에 대한 LRMS (ESI) 계산치 = 807.49, 실측치 807.5.

반응식 37

화합물 713: 테트라부틸암모늄 플루오라이드(THF 중 1 M)를 THF 중 화합물 712의 교반된 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반한 후, 휘발물을 감압 하에 제거하였다. 잔여물을 CH₂Cl₂에 재구성하고, 물로 분배하였다. 층을 분리하고, 수성 분획을 CH₂Cl₂(3 × 20 mL)로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(2:8 EtOAc/헥산) 상에서 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 713을 제공하였다.

반응식 38

화합물 714: 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드(x g, x mmol) 및 트리에틸아민(x mL, x mmol)을 피리딘(x mL) 중 뉴클레오사이드 713(x g, x mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 3시간 후, 용매를 감압 하에 제거하고, 잔여물을 EtOAc에 용해시키고, 물, 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 건조 상태로 증발시켰다. 잔여물을 용리액으로서 헥산 중 0 내지 50% EtOAc를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 714를 제공하였다.

반응식 39

화합물 715: DIPEA, 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트, 및 N-메틸이미다졸을 0℃에서 무수 EtOAc 중 화합물 714의 교반된 용액에 순차적으로 첨가하였다. 저온 배쓰를 제거하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 반응을 MeCN/톨루엔 중 트리에탄올아민(2.7 M, 50 mL)의 용액으로 켄칭시키고, 5분 동안 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 분리 깔때기로 옮기고, 층을 분리하고, 유기층을 5% NaCl 용액, 및 염수로 순차적으로 세척하였다. 유기층을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 건조 상태로 증발시켰다. 잔여물을 트리에틸아민 전처리된 실리카 겔 상에 사전-흡착시켰다. 컬럼을 1% NEt₃를 함유하는 헥산으로 평형시켰다. 잔여물을 용리액으로서 헥산 중 0 내지 40% EtOAc를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 715를 제공하였다.

반응식 40

화합물 717: 화합물 701을 무수 DCM에 용해시키고, 이어서 메틸 헥스-5-에노에이트, 벤조퀴논 및 2세대 Hoveyda-Grubbs 촉매를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 3.5시간 동안 환류에서 교반하고, 실온까지 냉각시키고, 반응 혼합물의 총 부피를 감압 하에 절반으로 감소시켰다. 생성된 용액을 120 g 실리카 컬럼 카트리지에 로딩하고, 용리액으로서 헥산 중 0 내지 60% EtOAc를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 716을 초록빛 오일로서 제공하였다.

반응식 41

화합물 717: 탄소 상 10% Pd를 EtOH 중 뉴클레오사이드 716의 교반된 용액에 첨가하였다. 수소를 충전한 벌룬에 연결된 3 방향 어댑터를 플라스크에 장착하였다. 용액을 포화시키도록 일련의 진공-H₂ 재충전(x3)으로 플라스크를 처리하였다. 0.5시간 후에, 혼합물을 MeOH로 희석하고, 셀라이트 패드를 통해 추가 메탄올로 세정하면서 여과하였다. 여과액을 감압 하에 증발시켜 미정제 717을 제공하였다.

반응식 42

화합물 718: 테트라부틸암모늄 플루오라이드(THF 중 1 M)를 THF 중 화합물 717의 교반된 용액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반한 후, 휘발물을 감압 하에 제거하였다. 잔여물을 CH₂Cl₂에 재구성하고, 물로 분배하였다. 층을 분리하고, 수성 분획을 CH₂Cl₂(3 × 20 mL)로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔여물을 실리카 겔(2:8 EtOAc/헥산) 상에서 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 718을 제공하였다.

반응식 43

화합물 719: 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드 및 트리에틸아민을 피리딘 중 뉴클레오사이드 718의 교반된 용액에 첨가하였다. 3시간 후, 용매를 감압 하에 제거하고, 잔여물을 EtOAc에 용해시키고, 물, 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 건조 상태로 증발시켰다. 잔여물을 용리액으로서 헥산 중 0 내지 50% EtOAc를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 719를 제공하였다.

반응식 44

화합물 720: DIPEA, 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트, 및 N-메틸이미다졸을 0℃에서 무수 EtOAc 중 화합물 719의 교반된 용액에 순차적으로 첨가하였다. 저온 배쓰를 제거하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 반응을 MeCN/톨루엔 중 트리에탄올아민(2.7 M, 50 mL)의 용액으로 켄칭시키고, 5분 동안 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 분리 깔때기로 옮기고, 층을 분리하고, 유기층을 5% NaCl 용액, 및 염수로 순차적으로 세척하였다. 유기층을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 건조 상태로 증발시켰다. 잔여물을 트리에틸아민 전처리된 실리카 겔 상에 사전-흡착시켰다. 컬럼을 1% NEt₃를 함유하는 헥산으로 평형시켰다. 잔여물을 용리액으로서 헥산 중 0 내지 40% EtOAc를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 720을 제공하였다.

2',3'-O-헥사데실 우리딘 포스포라미다이트의 합성

반응식 45

화합물 145 및 146: DMF(150 mL) 중 2,3'-O-디부틸스탄닐렌 우리딘 130(6.6 g, 13.89 mmol)의 용액에 1-브로모헥사데칸(8.48 g, 27.78 mmol) 및 테트라부틸암모늄 아이오다이드(10.26 g, 27.78 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 130℃에서 환류 설정에서 밤새 교반하여 암갈색 용액을 형성시켰다. 용액을 실리카 상에서 용리시키고(30% MeOH/DCM), 모든 UV 활성 분획을 수집하였다. 분획들을 진공에서 농축시키고, 산물 잔여물을 실리카(5% MeOH/DCM) 상에서 용리시켜 화합물 145 및 화합물 146(3.38 g)의 미정제 혼합물을 수득하였다.

화합물 147 및 148: 피리딘(10 mL)을 화합물 145 및 화합물 146(2.34 g, 4.99 mmol)의 미정제 혼합물에 첨가하고, 진공에서 농축시켜 미량의 물을 제거하였다. 혼합물 잔여물을 고진공 하에 배치하고, 아르곤으로 3회 재충전하였다. 피리딘(42 mL) 중 화합물 145 및 화합물 146의 용액을 4,4'-디메톡시트리틸 클로라이드(1.86 g, 5.49 mmol)로 처리하고, 아르곤 하에서 실온에서 밤새 교반하였다. 반응을 MeOH(5 mL)로 켄칭시키고, 진공에서 농축시켰다. 산물 잔여물을 3% TEA/DCM에 용해시키고, 포화 NaHCO₃(수성) 및 염수로 세척하였다. 유기층을 Na₂SO₄로 건조시키고, 진공에서 농축시켰다. 3% TEA/DCM을 3회 용리시킴으로써 실리카 컬럼을 중화시킨 후 산물 잔여물을 로딩하였다. 생성물을 실리카(3% TEA/헥산 중 40 내지 60% 에틸아세테이트) 상에서 정제하였다. 화합물 147(1.32 g, 34%) 및 화합물 148(660 mg, 17%)을 분리하고, 백색 고형물로서 수득하였다.

화합물 149: 피리딘(8 mL)을 화합물 147(660 mg, 0.856 mmol)에 첨가하고, 진공에서 농축시켜 미량의 물을 3회 제거하였다. 잔여물을 고진공 하에 배치하고, 아르곤으로 3회 재충전하였다. DCM(12 mL)을 첨가하여 용액을 형성하고, 교반하면서 아이스 배쓰에 넣었다. N,N-디이소프로필에틸아민(447 μL, 2.57 mmol) 및 1-메틸이미다졸(13.7 μL, 0.171 mmol)을 첨가하고, 0℃에서 20분 동안 교반하였다. 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로-포스포라미다이트(382 μL, 1.71 mmol)를 첨가하고, 용액을 아이스 배쓰에서 꺼내고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 생성물 혼합물을 포화 NaHCO₃(수성)로 세척하고, 3% TEA/DCM으로 추출하였다. 유기층을 Na₂SO₄로 건조시키고, 진공에서 농축시켰다. 3% TEA/DCM을 3회 용리시킴으로써 실리카 컬럼을 중화시킨 후 산물 잔여물을 로딩하였다. 생성물을 실리카(3% TEA/헥산 중 50% 에틸아세테이트) 상에서 정제하였다. 화합물 149(790 mg, 95%)를 백색 고형물로서 수득하였다.

화합물 150: 피리딘(6 mL)을 화합물 148(1.32 g, 1.71 mmol)에 첨가하고, 진공에서 농축시켜 미량의 물을 3회 제거하였다. 잔여물을 고진공 하에 배치하고, 아르곤으로 3회 재충전하였다. DCM(12 mL)을 첨가하여 용액을 형성하고, 교반하면서 아이스 배쓰에 넣었다. N,N-디이소프로필에틸아민(894 μL, 5.14 mmol) 및 1-메틸이미다졸(28 μL, 0.342 mmol)을 첨가하고, 0℃에서 20분 동안 교반하였다. 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로-포스포라미다이트(765 μL, 3.42 mmol)를 첨가하고, 용액을 아이스 배쓰에서 꺼내고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 생성물 혼합물을 포화 NaHCO₃(수성)로 세척하고, 3% TEA/DCM으로 추출하였다. 유기층을 Na₂SO₄로 건조시키고, 진공에서 농축시켰다. 3% TEA/DCM을 3회 용리시킴으로써 실리카 컬럼을 중화시킨 후 산물 잔여물을 로딩하였다. 생성물을 실리카(3% TEA/헥산 중 50% 에틸아세테이트) 상에서 정제하였다. 화합물 150(1.43 g, 86%)을 백색 고형물로서 수득하였다.

2'-O-C3-아미드-C18 접합 우리딘 아미다이트의 합성

반응식 46

화합물 151: 화합물 104(6.0 g, 9.94 mmol), 스테아르산(3.39 g, 11.9 mmol), 및 HBTU(4.6 g, 12.13 mmol)를 자석 교반 막대가 장착된 빈 플라스크에서 합하였다. 플라스크의 내용물을 5분 동안 아르곤으로 플러싱한 후에, DMF(25 mL) 및 DIPEA(5.2 mL, 29.8 mmol)를 첨가하였다. 20시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 NaHCO₃ 포화 용액 및 디에틸 에테르로 희석하였다. 층을 분리하고, 유기층을 NaHCO₃ 포화 용액 및 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 휘발물을 감압 하에 제거하고, 잔여물을 용리액으로서 CH₂Cl₂ 중 0 내지 6% MeOH를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 151(5.5 g, 64%)을 제공하였다.

화합물 152: 화합물 151(5.5 g, 6.32 mmol)을 아세토니트릴(2회)로 공증발시키고, 2시간 동안 고진공 라인에 연결하였다. 잔여물을 에틸 아세테이트(125 mL)에 용해시키고, 0℃까지 냉각시켰다. 이전 용액에, DIPEA(2.75 mL, 15.80 mmol), 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(3.53 mL, 15.80 mmol), 및 1-메틸이미다졸(0.50 mL, 6.3 mmol)을 순차적으로 첨가하였다. 저온 배쓰를 제거하고, 반응 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 반응을 MeCN/톨루엔 중 트리에탄올아민(2.7 M, 17.5 mL)의 용액으로 켄칭시키고, 5분 동안 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 분리 깔때기로 옮기고, 층을 분리하고, 유기층을 5% NaCl 용액(50 mL), 및 염수로 순차적으로 세척하였다. 유기층을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 건조 상태로 증발시켰다. 잔여물을 트리에틸아민 전처리된 실리카 겔 상에 사전-흡착시켰다. 컬럼을 1% NEt₃를 함유하는 헥산으로 평형시켰다. 잔여물을 용리액으로서 헥산 중 0 내지 60% EtOAc를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 152(4.5 g, 67%)를 제공하였다.

2'-O-C3-아미드-C14 접합 우리딘 아미다이트의 합성

반응식 47

화합물 153: 화합물 104(5.0 g, 8.3 mmol), 테트라데칸산(2.10 g, 9.19 mmol), 및 HBTU(3.83 g, 10.1 mmol)를 자석 교반 막대가 장착된 빈 플라스크에서 합하였다. 플라스크의 내용물을 5분 동안 아르곤으로 플러싱한 후에, DMF(25 mL) 및 DIPEA(4.3 mL, 24.8 mmol)를 첨가하였다. 20시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 NaHCO₃ 포화 용액 및 디에틸 에테르로 희석하였다. 층을 분리하고, 유기층을 NaHCO₃ 포화 용액 및 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 휘발물을 감압 하에 제거하고, 잔여물을 용리액으로서 CH₂Cl₂ 중 0 내지 6% MeOH를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 153(3.93 g, 58%)을 제공하였다.

화합물 154: 화합물 153(3.93 g, 4.83 mmol)을 아세토니트릴(2회)로 공증발시키고, 2시간 동안 고진공 라인에 연결하였다. 잔여물을 에틸 아세테이트(100 mL)에 용해시키고, 0℃까지 냉각시켰다. 이전 용액에, DIPEA(2.1 mL, 12.1 mmol), 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(2.69 mL, 12.1 mmol), 및 1-메틸이미다졸(0.38 mL, 4.83 mmol)을 순차적으로 첨가하였다. 저온 배쓰를 제거하고, 반응 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 반응을 MeCN/톨루엔 중 트리에탄올아민(2.7 M, 14 mL)의 용액으로 켄칭시키고, 5분 동안 교반하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 분리 깔때기로 옮기고, 층을 분리하고, 유기층을 5% NaCl 용액(50 mL), 및 염수로 순차적으로 세척하였다. 유기층을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 건조 상태로 증발시켰다. 잔여물을 트리에틸아민 전처리된 실리카 겔 상에 사전-흡착시켰다. 컬럼을 1% NEt₃를 함유하는 헥산으로 평형시켰다. 잔여물을 용리액으로서 헥산 중 0 내지 60% EtOAc를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 154(4.38 g, 89%)를 제공하였다.

5'-아미드-친유성 접합 2'-OMe-시티딘 아미다이트의 합성

반응식 48

화합물 156: p-톨루엔설포닐 클로라이드(20.7 g, 0.108 mol)를 무수 CH₂Cl₂(220 mL) 중 화합물 155(30.0 g, 72.5 mmol) 및 피리딘(29.3 mL, 0.363 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 48시간 동안 환류로 가열하였다. 냉각 후, CH₂Cl₂(200 mL) 및 NaHCO₃ 포화 수용액(500 mL)을 서서히 첨가하고, 1시간 동안 격렬하게 교반하였다. 혼합물을 분리 깔때기로 옮기고, 층을 분리하고, 유기층을 1 M HCl 및 염수로 세척하였다. 유기층을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 건조 상태로 증발시켜 미정제 토실레이트 화합물 156(41.2 g)을 제공하였다. 미정제 토실레이트를 추가 정제 없이 다음 반응에 사용하였다.

화합물 157: 소듐 아자이드(14.15 g, 0.217 mol)를 DMF(360 mL) 중 화합물 156(41.2 g, 72.6 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 90℃에서 8시간 동안 가열하고, 실온까지 냉각시키고, 물(300 mL) 및 디에틸 에테르(200 mL)와 합하였다. 혼합물을 분리 깔때기로 옮기고, 층을 분리하고, 수성 층을 디에틸 에테르로 2회 추출하였다. 유기층을 합하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 건조 상태로 증발시켰다. 잔여물을 용리액으로서 헥산 중 0 내지 60% EtOAc를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 157(27.5 g, 2 단계에 걸쳐 86%)를 제공하였다.

화합물 158: 메탄올(300 mL) 중 화합물 157(17.0 g, 38.8 mmol)의 교반된 용액에, 10% Pd/C Degussa 타입(4.13 g, 3.88 mmol)을 첨가하였다. 수소를 충전한 벌룬에, 그리고 진공 라인에 연결된 3 방향 어댑터를 플라스크에 장착하였다. 플라스크의 내용물을 일련의 진공/수소 재충전(3회)으로 처리하였다. 40분 후에, TFA(3 ml)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 휘발물을 건조 상태로 증발시켰다. 잔여물을 용리액으로서 CH₂Cl₂ 중 0 내지 10% MeOH를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 158(12.5 g, 77%)을 제공하였다.

화합물 159: 화합물 158(5.1 g, 9.7 mmol), 팔미트산(2.74 g, 10.7 mmol), 및 HBTU(4.41 g, 11.6 mmol)를 자석 교반 막대가 장착된 빈 플라스크에서 합하였다. 플라스크의 내용물을 5분 동안 아르곤으로 플러싱한 후에, DMF(32 mL) 및 DIPEA(6.76 mL, 38.8 mmol)를 첨가하였다. 4시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 NaHCO₃ 포화 용액 및 디에틸 에테르로 희석하였다. 층을 분리하고, 유기층을 NaHCO₃ 포화 용액 및 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 휘발물을 감압 하에 제거하고, 잔여물을 용리액으로서 CH₂Cl₂ 중 0 내지 6% MeOH를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 159(4.97 g, 78%)를 제공하였다.

화합물 160: 화합물 158(5.85 g, 11.1 mmol), 스테아르산(3.47 g, 12.2 mmol), 및 HBTU(5.05 g, 13.3 mmol)를 자석 교반 막대가 장착된 빈 플라스크에서 합하였다. 플라스크의 내용물을 5분 동안 아르곤으로 플러싱한 후에, DMF(37 mL) 및 DIPEA(7.74 mL, 44.4 mmol)를 첨가하였다. 4시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 NaHCO₃ 포화 용액 및 디에틸 에테르로 희석하였다. 층을 분리하고, 유기층을 NaHCO₃ 포화 용액 및 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시켰다. 휘발물을 감압 하에 제거하고, 잔여물을 용리액으로서 CH₂Cl₂ 중 0 내지 6% MeOH를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 160(3.87 g, 51%)를 제공하였다.

화합물 161: 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드(3.5 mL, 21.7 mmol)를 0℃에서 THF(50 mL) 중 화합물 159(4.7 g, 7.2 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 실온에서 24시간 동안 교반한 후, 휘발물을 감압 하에 제거하고, 잔여물을 용리액으로서 CH₂Cl₂ 중 0 내지 6% MeOH를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 161(3.49 g, 90%)을 제공하였다.

화합물 162: 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드(2.66 mL, 16.5 mmol)를 0℃에서 THF(50 mL) 중 화합물 160(3.74 g, 5.51 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 실온에서 24시간 동안 교반한 후, 휘발물을 감압 하에 제거하고, 잔여물을 용리액으로서 CH₂Cl₂ 중 0 내지 6% MeOH를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 162를 제공하였다.

화합물 163/164: 화합물 161 및 162의 표준 포스피틸화로 각각 화합물 163 및 164를 제공하였다.

5'-아미드-친유성 접합 2'-OMe-아데노신 아미다이트의 합성

반응식 49

화합물 166: p-톨루엔설포닐 클로라이드(34.3 g, 0.180 mmol)를 무수 CH₂Cl₂(180 mL) 중 화합물 165(30.0 g, 60.0 mmol) 및 피리딘(24.3 mL, 300 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 48시간 동안 환류로 가열하였다. 냉각 후, CH₂Cl₂(200 mL) 및 NaHCO₃ 포화 수용액(500 mL)을 서서히 첨가하고, 1시간 동안 격렬하게 교반하였다. 혼합물을 분리 깔때기로 옮기고, 층을 분리하고, 유기층을 1 M HCl 및 염수로 세척하였다. 유기층을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 건조 상태로 증발시켜 미정제 토실레이트 화합물 166을 제공하였다. 미정제 토실레이트를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.

화합물 167: 소듐 아자이드(11.93 g, 183.5 mmol)를 DMF(300 mL) 중 미정제 화합물 166(40.0 g, 61.2 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 90℃에서 8시간 동안 가열하고, 실온까지 냉각시키고, 물(300 mL) 및 디에틸 에테르(200 mL)와 합하였다. 혼합물을 분리 깔때기로 옮기고, 층을 분리하고, 층을 분리하고, 수성 층을 디에틸 에테르로 2회 추출하였다. 유기층을 합하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 건조 상태로 증발시켰다. 잔여물을 용리액으로서 CH₂Cl₂ 중 0 내지 8% MeOH를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 167(29.8 g, 92%)을 제공하였다.

화합물 168: 메탄올(130 mL) 중 화합물 167(13.58 g, 25.88 mmol)의 교반된 용액에, 10% Pd/C Degussa 타입(2.75 g, 2.59 mmol)을 첨가하였다. 수소를 충전한 벌룬에, 그리고 진공 라인에 연결된 3 방향 어댑터를 플라스크에 장착하였다. 플라스크의 내용물을 일련의 진공/수소 재충전(3회)으로 처리하였다. 40분 후에, 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 휘발물을 건조 상태로 증발시켰다. 잔여물을 용리액으로서 CH₂Cl₂ 중 0 내지 10% MeOH를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 168(9.4 g, 72%)을 제공하였다.

화합물 168과 RCOOH로서 도시된 지질 산의 표준 아미드 커플링으로 2'-OMe-아데노신의 다양한 5'- 친유성 접합체들을 제공하였다. 이들 화합물은 상기 반응식 49에 나타낸 바와 같이 포스포라미다이트 빌딩 블록들로 변환될 수 있다.

5'-아미노 아데노신 지질 아미다이트의 합성

반응식 50

화합물 511: 화합물 501(1.26 g, 5.5 mmol) 및 HOBT 수화물(1.27 g, 8.3 mmol)을 아르곤 분위기 하에 무수 DMF(30 mL) 및 THF(10 ml)에 용해시키고, 물/아이스 배쓰에서 0 내지 5℃까지 냉각시켰다. HBTU(2.45 g, 6.5 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(3.0 mL, 17.1 mmol)을 첨가하고, 용액을 10분 동안 교반하였다. 화합물 500(2.3 g, 4.6 mmol)을 첨가하고, 반응을 0 내지 5℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(50 mL) 및 5% NaCl(200 mL)로 희석하고, 5분 동안 교반하였다. 유기층을 단리하고, 10% H₃PO₄(1 × 200 mL), 5% NaCl(1 × 200 mL), 4% NaHCO₃(1 × 200 mL), 및 포화 NaCl(1 × 200 mL)로 세척하였다. 유기층을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 25℃에서 감압 하에 포움으로 농축시켰다. 실리카 겔 플래시 크로마토그래피, 80 g 실리카 컬럼, 및 에틸 아세테이트:헥산(1:1 내지 10:1 구배)을 통해 정제를 수행하였다. 분획을 감압 하에 농축시키고, 아세토니트릴(2회)로 체이싱하였다. 분획을 고진공 하에 밤새 건조시켰다. 화합물 511을 87% 수율(2.86 g)로 백색 포움으로서 단리하였다.

화합물 512: 화합물 511과 유사한 방식으로 화합물 500 및 화합물 502로부터 화합물 512를 합성하였다. 화합물 512를 90% 수율(3.05 g)로 유리질 고형물로서 단리하였다.

화합물 513: 화합물 511과 유사한 방식으로 화합물 500 및 화합물 503으로부터 화합물 513을 합성하였다. 화합물 513을 87% 수율(3.05 g)로 단리하였다.

화합물 514: 화합물 511과 유사한 방식으로 화합물 500 및 화합물 504로부터 화합물 514를 합성하였다. 화합물 514를 77% 수율(2.08 g)로 백색 포움으로서 단리하였다.

화합물 521: 화합물 511(2.99 g, 3.9 mmol)을 아르곤 분위기 하에 무수 THF(12 mL)에 용해시켰다. 트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드(2.6 mL, 15.7 mmol)를 첨가하고, 반응을 실온에서 19시간 동안 교반한 후, 45℃까지 3시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 감압 하에 오일로 농축시켰다. 오일을 에틸 아세테이트(50 mL)로 희석하고, 5% NaCl(2 × 150 mL) 및 포화 NaCl(1 × 150 mL)로 세척하였다. 유기층을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 25℃에서 감압 하에 농축시키고, 고진공 하에 밤새 건조시켰다. 화합물 521을 97% 수율(2.28 g)로 백색 포움으로서 단리하였다.

화합물 522: 화합물 521과 유사한 방식으로 화합물 512로부터 화합물 522를 합성하였다. 화합물 522를 96% 수율(2.42 g)로 단리하였다.

화합물 523: 화합물 521과 유사한 방식으로 화합물 513으로부터 화합물 523을 합성하였다. 화합물 523을 100% 수율(2.57 g)로 단리하였다.

화합물 524: 화합물 521과 유사한 방식으로 화합물 514로부터 화합물 524를 합성하였다. 화합물 524를 98% 수율(1.67 g)로 백색 고형물로서 단리하였다.

화합물 531: 화합물 521(2.24 g, 3.7 mmol)을 아르곤 분위기 하에 무수 THF(20 mL)에 용해시켰다. N,N-디이소프로필에틸아민(0.86 mL, 4.9 mmol) 및 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포라미다이트(1.1 mL, 4.9 mmol)를 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 트리에탄올아민(3.7 mL, 10 mmol, 아세토니트릴:톨루엔(4:9) 중 2.7 M 용액)을 반응 혼합물에 첨가하고, 5분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(80 mL)로 희석하고, 감압 하에 30 mL까지 농축시키고, 에틸 아세테이트(50 mL)로 희석한 후, 5% NaCl(3 × 100 mL) 및 포화 NaCl(1 × 100 mL)로 세척하였다. 유기층을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 포움으로 농축시켰다. 실리카 겔 플래시 크로마토그래피, 80 g 실리카 컬럼, 및 에틸 아세테이트(+ 0.5% 트리에틸아민):헥산(1:1 내지 100% 에틸 아세테이트 구배)을 통해 정제를 수행하였다. 분획을 감압 하에 농축시키고, 아세토니트릴(2x)로 체이싱하였다. 분획을 고진공 하에 밤새 건조시켰다. 화합물 531을 67% 수율(2.00 g)로 백색 포움으로서 단리하였다.

화합물 532: 화합물 531과 유사한 방식으로 화합물 522로부터 화합물 532를 합성하였다. 화합물 532를 81% 수율(2.56 g)로 백색 포움으로서 단리하였다.

화합물 533: 화합물 531과 유사한 방식으로 화합물 523으로부터 화합물 533을 합성하였다. 화합물 533을 89% 수율(2.95 g)로 단리하였다.

화합물 534: 화합물 531과 유사한 방식으로 화합물 524로부터 화합물 534를 합성하였다. 화합물 534를 77% 수율(1.65 g)로 백색 포움으로서 단리하였다.

입체 장애된 에스테르-함유 지질의 합성

반응식 51

화합물 603: 팔미트산 601(3.53 g, 13.1 mmol) 및 포타슘 카르보네이트(3.71 g, 26.85 mmol)를 아세톤(250 mL) 중 벤질 2-브로모아세테이트(3.0 g, 13.1 mmol, 2.05 mL)의 교반된 용액에 첨가하였다. 환류에서 24시간 동안 가열한 후, 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 여과하여 과량의 K₂CO₃를 제거하였다. 여과액을 감압 하에 증발시키고, 잔여물을 디에틸 에테르(50 mL)와 물(50 mL) 사이에 분배하였다. 유기 분획을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 증발시켜 미정제 벤질 에스테르 602(5.2 g)를 제공하였다. 잔여물을 에틸 아세테이트/메탄올의 4:1 혼합물(100 mL)에 용해시키고, 이어서 10% Pd/C(0.75 g, 0.71 mmol)를 첨가하였다. 수소를 충전한 고무 벌룬에, 그리고 진공 라인에 연결된 3 방향 어댑터를 플라스크에 장착하였다. 플라스크를 진공 하에 20초 동안 두고, 이어서 수소를 재충전시켰다. 순서를 2회 넘게 반복하였다. 4시간 후에, 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여과액을 에틸 아세테이트(x3) 및 메탄올(x2)로 세정하였다. 합한 여과액을 감압 하에 증발시켰다. 잔여물을 용리액으로서 헥산 중 0 내지 20% EtOAc(헥산은 1%의 아세트산을 함유함)를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 603(2.22 g, 51%)을 제공하였다.

반응식 52

화합물 606: 스테아르산 604(2.0 g, 7.03 mmol) 및 포타슘 카르보네이트(1.99 g, 14.41 mmol)를 아세톤(250 mL) 중 벤질 2-브로모아세테이트(1.61 g, 7.03 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 환류에서 24시간 동안 가열한 후, 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 여과하여 과량의 K₂CO₃를 제거하였다. 여과액을 감압 하에 증발시키고, 잔여물을 디에틸 에테르와 물(50 mL) 사이에 분배하였다. 유기 분획을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 증발시켜 미정제 벤질 에스테르 605(3.0 g)를 제공하였다. 잔여물을 에틸 아세테이트/메탄올의 1:1 혼합물(100 mL)에 용해시키고, 이어서 10% Pd/C(738 mg, 0.693 mmol)를 첨가하였다. 수소를 충전한 고무 벌룬에, 그리고 진공 라인에 연결된 3 방향 어댑터를 플라스크에 장착하였다. 플라스크를 진공 하에 20초 동안 두고, 이어서 수소를 재충전시켰다. 순서를 2회 넘게 반복하였다. 4시간 후에, 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여과액을 에틸 아세테이트(x3) 및 메탄올(x2)로 세정하였다. 합한 여과액을 감압 하에 증발시켰다. 잔여물을 용리액으로서 헥산 중 0 내지 20% EtOAc(헥산은 1%의 아세트산을 함유함)를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 606(1.5 g, 2 단계에 걸쳐 62%)을 제공하였다.

반응식 53

화합물 608: 팔미트산 601(2.66 g, 10.37 mmol)을 아르곤 하에서 건조 DCM(100 mL)에 용해시키고, 0℃까지 냉각시켰다. 옥살릴 클로라이드(2 M, 10.37 mL, 20.73 mmol), 이어서 DMF(1 방울)를 첨가하였다. 아이스 배쓰를 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 가스의 방출이 중단되었을 때(약 2시간), 혼합물을 진공에서 농축시켜 미정제 팔미토일 클로라이드를 제공하였다. 또 다른 플라스크에서, 메틸 2-하이드록시프로파노에이트(0.9 mL, 9.42 mmol)를 건조 DCM(60 mL)에 용해시키고, 이어서 피리딘(3.81 mL, 47.1 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, 이어서 DCM(10 mL) 중 팔미토일 클로라이드의 용액을 카눌라를 통해 적가하였다. 아이스 배쓰를 제거하고, 반응을 밤새 교반하였다. 반응을 탈이온수(50 mL)로 켄칭시키고, 30분 동안 격렬하게 교반하였다. 이염기성 혼합물을 분리 깔때기로 옮겼다. 층을 나누고, 분리하였다. 유기층을 남기면서 수성 층을 디클로로메탄(150 mL × 2)으로 추출하였다. 유기물을 합하고, 1 M 수성 염산, 포화 수성 소듐 바이카르보네이트, 염수로 세척하고, 건조시키고(소듐 설페이트), 여과하고, 농축시켰다. 미정제 잔여물을 용리액으로서 헥산 중 0 내지 10% EtOAc를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 607(2.28 g, 70%)을 제공하였다.

리튬 아이오다이드(3.89 g, 29.05 mmol)를 무수 피리딘(30 mL) 중 화합물 607(2 g, 5.84 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 환류에서 24시간 동안 교반한 후, 혼합물을 증발시켰다. 잔여 오일을 1 M HCl과 EtOAc의 혼합물로 현탁시켰다. 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(x3)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 소듐 티오설페이트 포화 수용액, 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 실리카 겔에 사전흡착시켰다. 잔여물을 용리액으로서 CH₂Cl₂ 중 0 내지 20% MeOH를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 608(1.01 g, 52%)을 제공하였다.

반응식 54

화합물 610: 스테아르산 604(2.95 g, 10.37 mmol)를 아르곤 하에서 건조 DCM(100 mL)에 용해시키고, 0℃까지 냉각시켰다. 옥살릴 클로라이드(2 M, 10.37 mL, 20.73 mmol), 이어서 DMF(1 방울)를 첨가하였다. 아이스 배쓰를 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 가스의 방출이 중단되었을 때(약 2시간), 혼합물을 진공에서 농축시켜 미정제 스테아릴 클로라이드를 제공하였다. 또 다른 플라스크에서, 메틸 2-하이드록시프로파노에이트(0.981 g, 9.42 mmol, 0.9 mL)를 건조 DCM(60 mL)에 용해시키고, 이어서 피리딘(3.81 mL, 47.12 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, 이어서 DCM(10 mL) 중 스테아릴 클로라이드의 용액을 카눌라를 통해 적가하였다. 아이스 배쓰를 제거하고, 반응을 밤새 교반하였다. 반응을 탈이온수(50 mL)로 켄칭시키고, 30분 동안 격렬하게 교반하였다. 이염기성 혼합물을 분리 깔때기로 옮겼다. 층을 나누고, 분리하였다. 유기층을 남기면서 수성 층을 디클로로메탄(150 mL × 2)으로 추출하였다. 유기물을 합하고, 1 M 수성 염산, 포화 수성 소듐 바이카르보네이트, 염수로 세척하고, 건조시키고(소듐 설페이트), 여과하고, 농축시켰다. 미정제 잔여물을 용리액으로서 헥산 중 0 내지 10% EtOAc를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 609(3.09 g, 88%)를 제공하였다.

리튬 아이오다이드(5.58 g, 41.7 mmol)를 무수 피리딘(40 mL) 중 화합물 609(3.09 g, 8.34 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 환류에서 24시간 동안 교반한 후, 혼합물을 증발시켰다. 잔여 오일을 1 M HCl과 EtOAc의 혼합물로 현탁시켰다. 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(x3)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 소듐 티오설페이트 포화 수용액, 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 실리카 겔에 사전흡착시켰다. 잔여물을 용리액으로서 CH₂Cl₂ 중 0 내지 20% MeOH를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 610(1.29 g, 43%)을 제공하였다.

반응식 55

화합물 612: 팔미트산 601(2.66 g, 10.37 mmol)을 아르곤 하에서 건조 DCM(100 mL)에 용해시키고, 0℃까지 냉각시켰다. 옥살릴 클로라이드(1.79 mL, 20.73 mmol), 이어서 DMF(1 방울)를 첨가하였다. 아이스 배쓰를 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 가스의 방출이 중단되었을 때(약 2시간), 혼합물을 진공에서 농축시켜 미정제 팔미토일 클로라이드를 제공하였다. 또 다른 플라스크에서, 메틸-(R)-락테이트(0.9 mL, 9.42 mmol)를 건조 DCM(60 mL)에 용해시키고, 이어서 피리딘(3.81 mL, 47.1 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, 이어서 DCM(10 mL) 중 팔미토일 클로라이드의 용액을 카눌라를 통해 적가하였다. 아이스 배쓰를 제거하고, 반응을 밤새 교반하였다. 반응을 탈이온수(50 mL)로 켄칭시키고, 30분 동안 격렬하게 교반하였다. 이염기성 혼합물을 분리 깔때기로 옮겼다. 층을 나누고, 분리하였다. 유기층을 남기면서 수성 층을 디클로로메탄(150 mL × 2)으로 추출하였다. 유기물을 합하고, 1 M 수성 염산, 포화 수성 소듐 바이카르보네이트, 염수로 세척하고, 건조시키고(소듐 설페이트), 여과하고, 농축시켰다. 미정제 잔여물을 용리액으로서 헥산 중 0 내지 10% EtOAc를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 611(3.02 g, 93%)을 제공하였다.

리튬 아이오다이드(5.90 g, 44.1 mmol)를 무수 피리딘(47 mL) 중 화합물 611(3.02 g, 8.82 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 환류에서 24시간 동안 교반한 후, 혼합물을 증발시켰다. 잔여 오일을 1 M HCl과 EtOAc의 혼합물로 현탁시켰다. 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(x3)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 소듐 티오설페이트 포화 수용액, 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 실리카 겔에 사전흡착시켰다. 잔여물을 용리액으로서 CH₂Cl₂ 중 0 내지 20% MeOH를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 612(1.2 g, 41%)를 제공하였다.

C₁₉H₃₅O₄ [M-H]^- m/z에 대한 LRMS (ESI) 계산치 = 327.26, 실측치 327.2. 거울상이성질체 과량: 100%.

반응식 56

화합물 614: 팔미트산 601(2.66 g, 10.37 mmol)을 아르곤 하에서 건조 DCM(100 mL)에 용해시키고, 0℃까지 냉각시켰다. 옥살릴 클로라이드(1.79 mL, 20.73 mmol), 이어서 DMF(1 방울)를 첨가하였다. 아이스 배쓰를 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 가스의 방출이 중단되었을 때(약 2시간), 혼합물을 진공에서 농축시켜 미정제 팔미토일 클로라이드를 제공하였다. 또 다른 플라스크에서, 메틸-(S)-락테이트(0.9 mL, 9.42 mmol)를 건조 DCM(60 mL)에 용해시키고, 이어서 피리딘(3.81 mL, 47.1 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, 이어서 DCM(10 mL) 중 팔미토일 클로라이드의 용액을 카눌라를 통해 적가하였다. 아이스 배쓰를 제거하고, 반응을 밤새 교반하였다. 반응을 탈이온수(50 mL)로 켄칭시키고, 30분 동안 격렬하게 교반하였다. 이염기성 혼합물을 분리 깔때기로 옮겼다. 층을 나누고, 분리하였다. 유기층을 남기면서 수성 층을 디클로로메탄(150 mL × 2)으로 추출하였다. 유기물을 합하고, 1 M 수성 염산, 포화 수성 소듐 바이카르보네이트, 염수로 세척하고, 건조시키고(소듐 설페이트), 여과하고, 농축시켰다. 미정제 잔여물을 용리액으로서 헥산 중 0 내지 70% EtOAc를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 613(3.2 g, 99%)을 제공하였다.

리튬 아이오다이드(6.25 g, 46.7 mmol)를 무수 피리딘(30 mL) 중 화합물 613(3.2 g, 9.34 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 환류에서 24시간 동안 교반한 후, 혼합물을 증발시켰다. 잔여 오일을 1 M HCl과 EtOAc의 혼합물로 현탁시켰다. 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(x3)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 소듐 티오설페이트 포화 수용액, 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 실리카 겔에 사전흡착시켰다. 잔여물을 용리액으로서 CH₂Cl₂ 중 0 내지 20% MeOH를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 614(1.81 g, 59%)를 제공하였다.

C₁₉H₃₅O₄ [M-H]^- m/z에 대한 LRMS (ESI) 계산치 = 327.26, 실측치 327.3. 거울상이성질체 과량: 100%.

반응식 57

화합물 616: 팔미트산 601(2.46 g, 9.59 mmol)을 건조 DCM(100 mL)에 용해시키고, 0℃까지 냉각시켰다. 옥살릴 클로라이드(1.66 mL, 20.3 mmol), 이어서 DMF(1 방울)를 첨가하였다. 아이스 배쓰를 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 가스의 방출이 중단되었을 때(약 2시간), 혼합물을 진공에서 농축시켜 미정제 팔미토일 클로라이드를 제공하였다. 또 다른 플라스크에서, 메틸 2-하이드록시-2-메틸-프로파노에이트(1.03 g, 8.72 mmol)를 건조 DCM(60 mL)에 용해시키고, 이어서 피리딘(3.5 mL, 43.6 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, 이어서 DCM(20 mL) 중 팔미토일 클로라이드의 용액을 카눌라를 통해 적가하였다. 아이스 배쓰를 제거하고, 반응을 밤새 교반하였다. 반응을 NH₄Cl 포화 수용액으로 켄칭시켰다. 이염기성 혼합물을 분리 깔때기로 옮기고, 층을 분리하였다. 수성 층을 디클로로메탄(150 mL × 2)으로 추출하였다. 합한 유기층을 합하고, 1 M 수성 염산, 포화 수성 소듐 바이카르보네이트, 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 미정제 잔여물을 용리액으로서 헥산 중 0 내지 10% EtOAc를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 615(1.78 g, 57%)를 제공하였다.

C₂₁H₄₁O₄ [M+H]⁺ m/z에 대한 LRMS (ESI) 계산치 = 357.29, 실측치 357.3.

리튬 아이오다이드(3.34 g, 24.9 mmol)를 무수 피리딘(25 mL) 중 화합물 615(1.78 g, 4.99 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 환류에서 24시간 동안 교반한 후, 휘발물을 감압 하에 제거하였다. 잔여 오일을 1 M HCl과 EtOAc의 혼합물로 현탁시켰다. 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(x3)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 소듐 티오설페이트 포화 수용액, 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 실리카 겔에 사전흡착시켰다. 잔여물을 용리액으로서 CH₂Cl₂ 중 0 내지 20% MeOH를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 616(1.23 g, 72%)을 제공하였다.

C₂₀H₃₇O₄ [M-H]^- m/z에 대한 LRMS (ESI) 계산치 = 341.28, 실측치 341.3.

반응식 58

화합물 618: 팔미트산 601(2.19 g, 8.54 mmol)을 건조 DCM(100 mL)에 용해시키고, 0℃까지 냉각시켰다. 옥살릴 클로라이드(1.47 mL, 17.1 mmol), 이어서 DMF(1 방울)를 첨가하였다. 아이스 배쓰를 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 교반하였다. 가스의 방출이 중단되었을 때(약 2시간), 혼합물을 진공에서 농축시켜 미정제 팔미토일 클로라이드를 제공하였다. 또 다른 플라스크에서, 메틸 2-하이드록시-3-메틸-부타노에이트(1.08 g, 7.76 mmol)를 건조 DCM(60 mL)에 용해시키고, 이어서 피리딘(3.14 mL, 38.8 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃까지 냉각시키고, 이어서 DCM(10 mL) 중 팔미토일 클로라이드의 용액을 카눌라를 통해 적가하였다. 아이스 배쓰를 제거하고, 반응을 밤새 교반하였다. 반응을 NH₄Cl 포화 수용액으로 켄칭시켰다. 이염기성 혼합물을 분리 깔때기로 옮기고, 층을 분리하였다. 수성 층을 디클로로메탄(150 mL × 2)으로 추출하였다. 합한 유기층을 합하고, 1 M 수성 염산, 포화 수성 소듐 바이카르보네이트, 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 미정제 잔여물을 용리액으로서 헥산 중 0 내지 10% EtOAc를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 617(2.18g, 75%)을 제공하였다.

C₂₂H₄₃O₄ [M+H]⁺ m/z에 대한 LRMS (ESI) 계산치 = 371.31, 실측치 371.3.

리튬 아이오다이드(3.94 g, 29.4 mmol)를 무수 피리딘(25 mL) 중 화합물 617(2.18 g, 5.88 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 환류에서 24시간 동안 교반한 후, 휘발물을 감압 하에 제거하였다. 잔여 오일을 1 M HCl과 EtOAc의 혼합물로 현탁시켰다. 층을 분리하고, 수성 층을 EtOAc(x3)로 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 소듐 티오설페이트 포화 수용액, 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 실리카 겔에 사전흡착시켰다. 잔여물을 용리액으로서 CH₂Cl₂ 중 0 내지 20% MeOH를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 618(1.59 g, 75%)을 제공하였다.

C₂₁H₃₉O₄ [M-H]^- m/z에 대한 LRMS (ESI) 계산치 = 355.29, 실측치 355.3.

반응식 59

화합물 620: 2-메틸헥사데칸산 618(2.42 g, 8.95 mmol), 및 포타슘 카르보네이트(2.54 g, 18.34 mmol)를 아세톤(250 mL) 중 벤질 브로모아세테이트(1.48 mL, 9.40 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 24시간 동안 환류 후, 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고, 여과하여 과량의 K₂CO₃를 제거하였다. 여과액을 감압 하에 증발시켰다. 잔여물은 백색 고형물이었고, 이를 디에틸 에테르(50 mL)와 물(50 mL) 사이에 분배하였다. 유기 분획을 마그네슘 설페이트 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 증발시켜 미정제 벤질 에스테르를 제공하였다. 잔여물을 실리카 겔에 사전흡착시키고, 0% 내지 8% 구배 EtOAc/헥산을 사용함으로써 정제하여 화합물 619(2.03 g, 54%)를 제공하였다.

C₂₆H₄₂O₄Na [M+Na]⁺ m/z에 대한 LRMS (ESI) 계산치 = 441.31, 실측치 441.3.

화합물 618(2.03 g, 4.85 mmol)을 에틸 아세테이트/메탄올의 4:1 혼합물(80 mL)에 용해시키고, 이어서 10% Pd/C(516 mg, 0.484 mmol)를 첨가하였다. 수소를 충전한 고무 벌룬에, 그리고 진공 라인에 연결된 3 방향 어댑터를 플라스크에 장착하였다. 플라스크를 진공 하에 20초 동안 두고, 이어서 수소를 재충전시켰다. 순서를 2회 넘게 반복하였다. 4시간 후에, 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 여과액을 에틸 아세테이트(x3) 및 메탄올(x2)로 세정하였다. 합한 여과액을 감압 하에 증발시켰다. 잔여물을 용리액으로서 헥산 중 0 내지 60% EtOAc(헥산은 1%의 아세트산을 함유함)를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 620(1.13 g, 70%)을 제공하였다.

C₁₉H₃₅O₄[M-H]^- m/z에 대한 LRMS (ESI) 계산치 = 327.26, 실측치 327.2.

분해형 세라미드-형 링커

세라미다제(CDase)를 세라미드의 형성 및 분해를 조절하는 스핑고지질 대사의 주요 효소이다. 세라미드는 도 1에 도시된 바와 같이, 스핑고신 골격 및 지방산 잔기로 구성된다. 아미드 결합의 분해에 의한 세라미드의 효소 분해는, 이들의 pH 옵티마, 세포하 위치, 일차 구조, 메커니즘, 및 기능에 의해 구별되는 CDase의 3개의 패밀리들(산성, 중성, 및 알칼리성)에 의해 제어된다.

2'-O-세라미드-형 뉴클레오사이드 포스포라미데이트는 인간 중립 CDase들의 메커니즘 및 구조적 요건들에 기초한 전략을 이용하여 합성될 수 있다. 합성된 단량체 뉴클레오사이드는 siRNA 내로 전략적으로 도입되고, 일단 체내에서, CDase에 의해 선택적으로 분해될 것이고, 지방산 및 올리고뉴클레오타이드 사슬이 방출될 것이다.

2'-O-세라미드-형 뉴클레오사이드 포스포라미데이트에 대한 합성 절차는 반응식 60으로 도시될 수 있다. 화합물 901은 상업적으로 입수 가능하거나 우리딘으로부터 2 단계로 제조될 수 있다. (S)-알릴글리신의 유도체로 뉴클레오사이드의 2'-위치에서의 말단 알켄의 교차 복분해에 의해 화합물 902를 제공하였다. 내부 알켄의 수소화, 이어서 포스포라미데이트의 형성에 의해 화합물 903을 수득하였다.

반응식 60

실시예 2. siRNA에 대한 친유성 모이어티의 합성후 접합

반응식 61

반응식 62

반응식 61 및 반응식 62에 도시된 바와 같이, 다양한 친유성 모이어티를 포함하는 다양한 리간드를 합성-후 접합 방법을 통해 siRNA 제제에 접합시켰다. siRNA의 센스 또는 안티센스 가닥의 아미노 유도체를 펩타이드 커플링 조건 하에 친유성 리간드의 NHS 에스테르 또는 카르복실산과 반응시켰다. 이어서, 이들 단일 가닥을 정제하고, 다른 가닥과 조합하여 siRNA 듀플렉스를 제조하였다.

실시예 3. 말단 산 작용기를 갖는 siRNA 접합체의 합성

반응식 62

반응식 62에 도시된 바와 같이, 컬럼 상에서 또는 합성-후 접합을 통해 말단 및 내부 위치에서 siRNA 제제에 카르복실산 모이어티를 갖는 다양한 친유성을 포함하는 다양한 리간드를 접합시켰다.

먼저, 말단 에스테르를 갖는 친유성 모이어티를 함유하는 고형 지지된 단일 가닥을 수중 20% 피페리딘으로 밤새 처리한 다음, 실온에서 15시간 동안 에탄올 중 2:1 NH₄OH로 처리하여, 말단 카르복실산을 갖는 단일 가닥을 생성하였다. 이들 단일 가닥을 대응하는 안티센스 가닥과 조합하여 다양한 검정을 위해 siRNA 듀플렉스를 생성하였다(예를 들어, 표 11, 표 12, 표 18, 및 표 19 참조).

실시예 4. 포스페이트 백본에 부착된 친유성 기를 갖는 siRNA 결합체의 합성.

반응식 63

화합물 861: 소듐 아자이드(2.57 g, 39.53 mmol)를 MeCN(100 mL) 중 헥사데칸-1-설포닐 클로라이드(10.08 g, 30.4 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 실온에서 10시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 EtOAc(200 mL)로 희석하고, 물(50 mL)로 세척하였다. 유기상을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 건조 상태로 증발시켰다. 잔여물을 용리액으로서 헥산 중 0 내지 5% EtOAc를 사용함으로써 ISCO 자동 컬럼에 의해 정제하여 화합물 861(7.71 g, 76%)을 제공하였다.

화합물 861과 올리고뉴클레오타이드(센스 또는 안티센스 가닥) 간의 반응. 올리고뉴클레오타이드의 고체-상 합성 동안(반응식 64), 화합물 861의 용액(아세토니트릴 중 0.5 M)을 사용하여 P(III) 포스파이트 에스테르 중간체 862를 산화시켜 설포닐 포스포라미다이트 화합물 863을 생성하였다. 이러한 산화 단계는 일반적인 산화 시약(I₂ 또는 황화 시약) 대신 사용되고, P(III) 포스파이트의 산화를 수반하는 임의의 뉴클레오타이드 합성 단계에서 수행될 수 있다. 합성의 종료 시, 표준 조건들을 사용하여 올리고를 완전히 탈보호하고, 고형 지지체로부터 분해하여 설포닐포스포라미데이트를 함유하는 올리고뉴클레오타이드 864를 제공하였다.

반응식 64

[표 1]

친유성 모이어티로 변형된 포스페이트 백본을 갖는 siRNA

이탤릭체의 대문자 및 소문자는 각각 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘으로의 2'-데옥시-2'-플루오로(2'-F), 및 2'-O-메틸(2'-OMe) 당 변형을 나타내고; s는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 나타내고; VP는 비닐 포스포네이트를 나타낸다.

실시예 5: 뉴클레오베이스 변형 친유성 접합체를 위한 단량체의 합성

하기에 도시된 바와 같이, 피리미딘의 C5 위치에서 아미노 링커와 다양한 지질들이 접합될 수 있고, 빌딩 블록 포스포라미다이트가 siRNA에 혼입될 수 있다.

C5-지질 접합 우리딘 포스포라미다이트의 합성

반응식 65

화합물 831: 1,3-디아미노프로판(81.0 g, 1.09 mol)을 실온에서 MeOH(120 mL) 중 화합물 830(15.0 g, 21.9 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM으로 희석하고, 이 용액을 H₂O 및 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 진공에서 농축시켜 미정제 물질(14.5 g)을 수득하였다. 이러한 미정제 물질을 다음 커플링 반응에 바로 사용하였다. ESI-MS; 661.3 (M+H).

화합물 832: 화합물 831(5.0 g, 7.57 mmol)을 미리스트산(3.46 g, 15.1 mmol) 및 HBTU(3.44 g, 9.08 mmol)와 함께 반응 플라스크에 첨가하였다. 고형물을 CH₂Cl₂(150 mL)에 용해시키고, 디이소프로필에틸아민(2.93 g, 22.7 mmol)을 시린지를 통해 첨가하였다. 반응을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응을 TLC(EtOAc)에 의해 체크하여 출발 물질의 소비를 확인하였다. 반응을 CH₂Cl₂로 희석한 다음, NaHCO₃ 포화 용액에 의해 세척하였다. 유기층을 분리하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 미정제 잔여물을 실리카 겔(0% 내지 100% EtOAc/헥산) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 정제하여 화합물 832(4.98 g, 5.72 mmol, 76%)를 제공하였다.

화합물 833: 화합물 832의 합성에 대하여 상술된 방식과 유사한 방식으로 팔미트산을 사용함으로써 화합물 833(3.62 g, 53.2%)을 수득하였다.

화합물 834: 화합물 832의 합성에 대하여 상술된 방식과 유사한 방식으로 올레산을 사용함으로써 화합물 834(5.29 g, 79.5%)을 수득하였다.

화합물 835: 200 mL 둥근 바닥 플라스크에 무수 EtOAc(80 mL) 중 화합물 832(4.98 g, 5.72 mmol)를 아르곤 하에 첨가하고, 아이스 배쓰에서 냉각시켰다. 그 후에, N,N-디이소프로필아미노시아노에틸 포스폰아미드 클로라이드(1.49 g, 6.2 9 mmol), 이어서 DIPEA(2.22 g, 17.2 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 그 후에, 반응 혼합물을 염수로 켄칭시키고, EtOAc로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 무수 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 미정제 오일로 농축시켰다. 실리카 겔(헥산 중 0% 내지 60% EtOAc) 상에서 플래시 크로마토그래피에 의해 화합물 835(2.22 g, 2.07 mmol, 36.25%)를 제공하였다.

화합물 836: 화합물 836의 합성에 대하여 상술된 방식과 유사한 방식으로 화합물 833(2.16 g, 48.8%)을 수득하였다.

화합물 837: 화합물 837의 합성에 대하여 상술된 방식과 유사한 방식으로 화합물 834(1.42 g, 22.1%)을 수득하였다.

반응식 66

반응식 66에 도시된 바와 같이, 보호된 무수 뉴클레오사이드(800)는 임의의 분지형 알킬 알코올에 의해 개환되어 화합물 820을 제공할 수 있다. 5'-위치에서 보호기의 제거는 화합물 822를 제공한다. 유리 뉴클레오사이드 822의 5'-위치는 DMTr 기에 의해 보호되어 화합물 823을 제공하고, 3'-위치에서 이차 하이드록실 기는 포스피틸화되어 화합물 824를 제공한다. 화합물 825는 표준 트리아졸 조건을 사용하여 시토신 유도체로 변환되어 화합물 826을 제공할 수 있다. 엑소사이클릭 아미노 기는 벤조일 기에 의해 보호되어 화합물 826을 제공하고, 후속 포스틸화는 화합물 827을 제공한다. 2' 위치에서 분지형 알킬 뉴클레오사이드의 일부 예는 하기 도시된 것들을 포함하나, 이로 한정되지 않는다:

실시예 6. 다양한 매트릭스들에서 siRNA 접합체의 대사 안정성 결정

뇌 척수액(CSF)에서의 리간드의 안정성: 37℃에서 24시간 동안 96-웰 플레이트에서 약하게 진탕시키면서 12.5 μL의 siRNA(0.1 mg/mL)와 함께 50 μL의 래트 유래 CSF(BioIVT, Cat. RAT00CSFXZN)를 인큐베이션함으로써 리간드의 안정성을 평가하였다. 그 후에, 4.1% Tween 20, 0.3% Triton X-100, 24.7 mM Tris-HCl, pH 8.0에서 0.0875 mg 프로테이나제 K를 함유하는 프로테이나제 K 용액 25 μL를 첨가하고, 약하게 진탕시키면서 50℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 단백질을 분해하였다. 이어서, 샘플들을 450 μL의 세포용해 완충액(Phenomenex, Cat. AL0-8579)으로 희석하고, 이를 고체 상 추출을 위한 제조 시 암모늄 하이드록사이드를 사용하여 pH 5.5로 조절하였다.

뇌 균질물에서 리간드의 안정성: 37℃에서 24시간 동안 96-웰 플레이트에서 약하게 진탕시키면서 12.5 μL의 siRNA(0.1 mg/mL)와 50 μL의 래트 뇌 균질물(BioIVT, Cat. S05966)을 인큐베이션함으로써 리간드의 안정성을 평가하였다. 그 후에, 4.1% Tween 20, 0.3% Triton X-100, 24.7 mM Tris-HCl, pH 8.0에서 0.0875 mg 프로테이나제 K를 함유하는 프로테이나제 K 용액 25 μL를 첨가하고, 약하게 진탕시키면서 50℃에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 단백질을 분해하였다. 이어서, 샘플들을 450 μL의 세포용해 완충액(Phenomenex, Cat. AL0-8579)으로 희석하고, 이를 고체 상 추출을 위한 제조 시 암모늄 하이드록사이드를 사용하여 pH 5.5로 조절하였다.

유리체액에서 리간드의 안정성: 플레이트를 약하게 진탕시키면서 37℃에서 24시간 동안 96-웰 플레이트에서 12.5 μL의 siRNA(0.1 mg/mL)와 함께 50 μL의 토끼 유래(BioIVT, Cat. RAB00VITHUMPZN) 또는 시노몰구스 원숭이 유래(BioIVT, Cat. NHP01HUMPZN) 유리체액을 인큐베이션함으로써 리간드의 안정성을 평가하였다. 그 후에, 4.1% Tween 20, 0.3% Triton X-100, 24.7 mM Tris-HCl, pH 8.0에서 0.0875 mg 프로테이나제 K를 함유하는 프로테이나제 K 용액 25 μL를 첨가하고, 약하게 진탕시키면서 50℃에서 1 h 동안 인큐베이션함으로써 단백질을 분해하였다. 이어서, 샘플들을 450 μL의 세포용해 완충액(Phenomenex, Cat. AL0-8579)로 희석하고, 이를 고체 상 추출을 위한 제조 시 암모늄 하이드록사이드를 사용하여 pH 5.5로 조절하였다.

고체 상 추출: 이어서, Clarity OTX 고체 상 추출 플레이트들(Phenomenex, Cat. 8E-S103-EGA)을 사용하여 고체 상 추출을 수행하였다. 플레이트를 먼저 양압 매니폴드(positive pressure manifold), 이어서 1.9 mL의 평형 완충액(2 mM 소듐 아자이드를 갖는 50 mM 암모늄 아세테이트, pH 5.5)를 사용하여 1 mL 메탄올을 통과시킴으로써 컨디셔닝한 다음, 샘플을 컬럼 상에 로딩하였다. 이어서, 컬럼을 1.5 mL의 세척 완충액(50% 아세토니트릴 중 50 mM 암모늄 아세테이트, pH 5.5)로 5 회 세척하였다. 샘플을 0.6 mL의 용리 완충액(40% 아세토니트릴 및 10% THF 중 10 mM EDTA, 100 mM 암모늄 바이카르보네이트, 10 mM DTT, pH 8.8)으로 용리시키고, 질소 유동(TurboVap, 40℃에서 65 psi N₂)을 사용하여 건조시켰다.

분석 방법: SPE 후, 샘플들을 120 μL의 물에서 재구성하고, 전기 분무 이온화(ESI)에 의해 Thermo QExactive에서 질량 분석법 검출과 결합한 액체 크로마토그래피를 사용하여 분석하였다. 샘플들을 주입하고(30 μL), 80℃에서 유지되는 XBridge BEH C8 XP 컬럼 130 Å, 2.5 μm, 2.1 × 30 mm(Waters, Cat. 176002554)를 사용하여 분리하였다. 이동상 A는 16 mM 트리에틸아민 및 200 mM 헥사플루오로이소프로판올이었고, 이동상 B는 메탄올이었고, 6.2분에 걸쳐 0 내지 65% 이동상 B의 구배를 1 mL/min에서 사용하였다. ESI 소스를 스프레이 전압 = 2800 V, 시스 가스 유동 = 65 유닛, 보조 가스 유동 = 20 유닛, 스위프 가스 유동 = 4 유닛, 모세관 온도 = 300℃, 300℃까지 가열되는 보조 가스를 사용하여 풀 스캔으로 음이온 모드로 작동시켰다. 신호를 디콘볼루션하기 위해 Promass 소프트웨어를 사용하였다.

CSF 중 siRNA 접합체의 안정성 연구

[표 2]

안정성 연구를 위한 siRNA 접합체

도 2는 siRNA 듀플렉스를 24시간 동안 래트 CSF와 함께 인큐베이션한 후 래트 CSF 중 다양한 친유성 단량체(상기 표 2에 열거됨)와 접합된 siRNA의 안정성을 나타낸 것이다.

유리체액 중 siRNA 접합체의 안정성 연구

[표 3]

안정성 연구를 위한 siRNA 접합체

도 3은 24시간 동안 각각 토끼 및 시노(NHP)의 유리체액 중 다양한 친유성 단량체(상기 표 3에 열거됨)와 접합된 siRNA의 안정성을 나타낸 것이다. 잔여량의 리간드-접합 siRNA 듀플렉스가 도면에 플롯팅되었다.

[표 4]

토끼 및 NHP의 유리체액에서 안정성 연구를 위한 siRNA 접합체

도 4는 24시간 동안 토끼 및 시노(NHP)의 유리체액 중 다양한 친유성 단량체(상기 표 4에 열거됨)와 접합된 siRNA의 안정성을 나타낸 것이다. 잔여량의 리간드-접합 siRNA 듀플렉스가 도면에 플롯팅되었다.

[표 5]

래트 뇌 균질물에서 대사 안정성 연구를 위한 siRNA 접합체

도 5a 및 도 5b는 각각 4시간 및 24시간 동안 래트 뇌 균질물에서 다양한 친유성 단량체(상기 표 5에 열거됨)와 접합된 siRNA의 안정성을 나타낸 것이다. 잔여량의 리간드-접합 siRNA 듀플렉스가 도 5a에 플롯팅되었다. 도 5b는 PS 결합의 안정성을 나타낸 것이다.

[표 6]

유리체액에서 안정성 연구를 위한 에스테라제 분해형 접합체와 접합된 siRNA

도 6은 24시간 동안 토끼 및 시노(NHP)의 유리체액에서 에스테라제 분해형 접합체(상기 표 6에 열거됨)를 갖는 siRNA 접합체의 안정성을 나타낸 것이다. 가수분해된 리간드-접합 siRNA 듀플렉스의 백분율이 도면에 플롯팅되었다.

[표 7]

혈장, CSF 및 뇌 균질물에서 안정성 연구를 위한 에스테라제 분해형 접합체와 접합된 siRNA

도 7은 24시간 동안 래트 혈장, CSF 및 뇌 균질물에서 에스테라제 분해형 접합체(상기 표 7에 열거됨)를 갖는 siRNA 접합체의 안정성을 나타낸 것이다. 가수분해된 리간드-접합 siRNA 듀플렉스의 백분율이 플롯팅되었다.

실시예 7. CNS 조직에서의 소수성 및 활성의 상관관계

CNS 조직에서의 지질 접합체의 흡수 및 활성에서의 소수성의 역할을 평가하기 위해, 단일의 더 긴 지질 사슬 대신에, 다수의 더 짧은 지질들을 센스 또는 안티센스 가닥(표 8)에 도입하였다. EMSA 검정에 의한 소수성 측정에 기초하여, 도입된 다수의 더 짧은 지질 사슬을 갖는 siRNA 접합체에 대해, 단일의 더 긴 사슬을 갖는 siRNA 접합체의 소수성과 유사한 소수성이 달성될 수 있는 것으로 결정되었다. siRNA 접합체들의 단백질 결합 특징들을 하기에 주어진 바와 같은 EMSA 검정에 의해 측정하였다.

Kd 결정을 위한 EMSA 검정 프로토콜: Bio Rad 10% 기준 TBE 폴리아크릴아미드 겔을 기준 겔 전기영동 탱크에서 20분 동안 100 V로 1X TBE에서 프리-런으로 평형화하였다. 각각의 샘플 웰을 프리-런 전 및 후에, 20 μL의 1X TBE 전기영동 완충액(Bio Rad)으로 플러싱하였다. siRNA 듀플렉스 당 2개의 겔들에 대해 샘플들이 이중으로 준비되었다(총 사중). 1X PBS 중 10 μM의 스톡 농도의 듀플렉스를 1X PBS를 함유하는 0.5 μM의 최종 농도(총 부피 20 μL) 및 증가 농도의 비-변성 인간 혈청 알부민(HSA) 용액(Calbiochem)으로 희석하였다. 인간 혈청 알부민 농도는 최대 1 mM의 경우 100의 증분으로 0 μM에서부터 1000 μM까지의 범위였고, 최대 2 mM의 경우 다양한 증분으로 0 μM에서부터 2000 μM까지의 범위였다. 샘플들을 혼합하고, 3000 RPM으로 30 초 동안 원심분리한 다음, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다.

인큐베이션이 완료되면, 4 μL의 6x EMSA 겔-로딩 용액(LifeTechnologies)을 각 샘플에 첨가하고, 3000 RPM에서 30초 동안 원심분리하고, 12 μL의 각 샘플을 겔 상에 로딩하였다. 겔 전기영동을 먼저 20분 동안 50V에서 러닝하여 전체 샘플이 겔 상에서 완전히 로딩되게 하였다. 그 후에, 겔 전기영동을 1시간 동안 100 V에서 러닝하였다. 전기영동의 완료 시, 케이싱에서 겔을 제거하고, 50 mL의 1X TBE에 배치하였다. 염색을 위해, 5 μL의 SYBR Gold(LifeTechnologies)를 용기에 첨가하고, 겔을 플랫폼 로커에서 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 겔을 50 mL의 1X TBE로 세정하고, 추가 50 mL의 완충액에 넣었다.

다음의 파라미터들을 사용하여 겔을 이미징하기 위해 Bio Rad ChemiDoc MP 이미징 시스템을 사용하였다: 이미징 어플리케이션을 SYBR Gold로 설정하고, 크기를 Bio-Rad 기준 겔로 설정하고, 노출을 강한 밴드에 대해 수동으로 설정하고, 강조된 포화 픽셀을 하나로 바꾸고, 색을 회색으로 설정하였다. 검출, 분자량 분석, 및 산출량을 모두 비활성화시켰다. 선명한 겔 사진이 얻어지면, Image Lab 5.2(Bio Rad)를 사용하여 이미지를 프로세싱하였다. 밴드 강도가 측정되도록 레인 및 밴드를 자동으로 설정하였다. 각 샘플의 밴드 강도를 인간 혈청 알부민이 없는 듀플렉스(0 μM에서 대조)에 대해 정규화하여 HSA의 농도에 대해 결합된 siRNA의 분율을 얻었다. 힐 슬로프 방정식(Hill slope equation)을 이용한 하나의 부위 특이적 결합에 맞는 비선형 회귀 곡선 피트를 사용하여, GraphPad Prism 7에서 결합 친화도 해리 상수를 계산하였다.

siRNA 접합체에 단일 지질 사슬을 도입하는 대신에, 듀플렉스 구조에 다수의 더 짧은 지질을 도입함으로써 유사한 생체내 활성을 얻었다. siRNA 접합체 활성은 순서 상 상이한 더 짧은 지질들의 위치에 의존한다. 이들 설계들을 활용함으로써, 간, 신장 및 심장에 대한 시스템 노출 siRNA 접합체가 제한될 수 있다(도 21b).

[표 8]

단백질 결합 검정에 사용되는 siRNA 접합체에 대한 Kd 및 듀플렉스 정보

siRNA 접합체들의 소수성은 상이한 CNS 조직들에 대한 siRNA의 활성 및 분포에 중요하며, 또한 척수강내 투여 후 siRNA 접합체들의 전신 노출에서 중요한 역할을 한다. 접합체들의 수의 단백질 결합 특징들을 조사함으로써, 노출된 카르복실산과 알킬 사슬을 갖는 접합체는 CNS 조직들에서 활성이었지만, 심장에서는 덜 활성인 것으로 밝혀졌다(표 8 내지 표 9 및 도 8 내지 도 9 참조).

[표 9]

단백질 결합 검정에 사용되는 접합체에 대한 Kd 및 듀플렉스 정보

실시예 8. 친유성 접합 siRNA를 사용한 마우스 눈에서 mRNA 녹다운

단일 7.5 μg 또는 1 μg 용량의 siRNA 듀플렉스를 유리체내 투여한 후 마우스 눈에서 qPCR에 의해 표 10에 열거된 siRNA 접합체로 TTR 유전자 사일런싱을 연구하고, 14 일째에 마우스들을 희생시켰으며, 결과를 PBS 대조와 비교하였다. 결과는 도 10 내지 도 11에 나타나 있다.

[표 10]

생체내 안구 연구에 대한 5'-3' 친유성 siRNA 접합체

*이탤릭체의 대문자 및 소문자는 각각 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘으로의 2'-데옥시-2'-플루오로(2'-F), 및 2'-O-메틸(2'-OMe) 당 변형을 나타내고; s는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 나타내고; VP는 비닐 포스포네이트를 나타내고; Nhd는 2'-O-헥사데실을 나타낸다.

단일 7.5 μg 용량의 siRNA 듀플렉스를 또한 유리체내 투여한 후 마우스 눈에서 qPCR에 의해 표 11에 열거된 siRNA 접합체로 TTR 유전자 사일런싱을 연구하고, 14 일째에 마우스들을 희생시켰으며, 결과를 PBS 대조와 비교하였다. 결과는 도 12에 나타나 있다. 하기 열거된 siRNA 듀플렉스를 에스테라제 분해형 접합체와 접합하였다.

[표 11]

TTR 서열의 에스테라제 분해형 친유성 siRNA 접합체

단일 1 μg 용량의 siRNA 듀플렉스를 또한 유리체내 투여한 후 래트 눈에서 qPCR에 의해 표 12에 열거된 siRNA 접합체로 TTR 유전자 사일런싱을 연구하고, 14 일째에 래트를 희생시켰으며, 결과를 PBS 대조와 비교하였다. 결과는 도 13에 나타나 있다.

[표 12]

래트에서 생체내 연구를 위한 친유성 siRNA 접합체(5', 3', 내부, 및 말단 카르복실산)

단일 7.5 μg 용량의 siRNA 듀플렉스를 또한 유리체내 투여한 후 마우스 눈에서 qPCR에 의해 표 13에 열거된 siRNA 접합체로 TTR 유전자 사일런싱을 연구하고, 14 일째에 마우스들을 희생시켰으며, 결과를 PBS 대조와 비교하였다. 결과는 도 14에 나타나 있다. 하기 열거된 siRNA 듀플렉스를 다중 더 짧은 지질 분자와 접합하였다.

[표 13]

TTR 서열의 센스 및 안티센스 가닥에 따라 분포된 다중의 더 짧은 지질을 갖는 친유성 siRNA 접합체

단일 1 μg 용량의 siRNA 듀플렉스를 또한 유리체내 투여한 후 래트 눈에서 qPCR에 의해 표 14에 열거된 siRNA 접합체로 TTR 유전자 사일런싱을 연구하고, 14 일째에 래트를 희생시켰으며, 결과를 PBS 대조와 비교하였다. 결과는 도 15에 나타나 있다. 하기 열거된 siRNA 듀플렉스를 에스테라제 분해형 접합체와 접합하였다.

[표 14]

래트에서 생체내 평가를 위한 친유성 siRNA 접합체(무염기 워크)

실시예 9. siRNA 서열에 걸친 무염기 친유성 변형(Q367)의 위치 영향

센스 가닥에서 전체 siRNA 서열에 걸친 친유성 변형의 위치의 영향을 대조 듀플렉스 AD-900954(표 15에 도시됨)와 비교하여, Q367 리간드에 의해 변형된 siRNA 접합체를 사용하여 일차 마우스 간세포에서 평가하였다. 세포를 자유 흡수를 위해 0.1 nM, 1 nM, 및 10 nM 농도로 각각의 siRNA 접합체와 인큐베이션하고(형질감염제 없이), 24시간 후에 TTR mRNA를 측정하였다. 값을 비처리 대조 세포의 분율로 플롯팅하였다. 결과는 도 16에 나타나 있다.

[표 15]

TTR 서열의 센스 가닥에 걸친 무염기 친유성 리간드 워크

센스 가닥에서 전체 SOD1 siRNA 서열에 걸친 친유성 변형의 위치의 영향을 또한 대조 듀플렉스 AD-463791(표 16에 도시됨)와 비교하여, Q367 리간드에 의해 변형된 siRNA 접합체를 사용하여 일차 마우스 간세포에서 평가하였다. 세포를 자유 흡수를 위해 0.1 nM, 1 nM, 및 10 nM 농도로 각각의 siRNA 접합체와 인큐베이션하고(형질감염제 없이), 24시간 후에 SOD1 mRNA를 측정하였다. 값을 비처리 대조 세포의 분율로 플롯팅하였다. 결과는 도 17에 나타나 있다.

[표 16]

SOD1 서열의 센스 가닥에 걸친 무염기 친유성 리간드 워크

*이탤릭체의 대문자 및 소문자는 각각 아데노신, 시티딘, 구아노신 및 우리딘으로의 2'-데옥시-2'-플루오로(2'-F), 및 2'-O-메틸(2'-OMe) 당 변형을 나타내고; s는 포스포로티오에이트(PS) 결합을 나타내고; VP는 비닐 포스포네이트를 나타낸다.

실시예 10. 친유성 접합 siRNA를 사용한 CNS에서 mRNA 녹다운

단일 0.9 mg 용량의 siRNA 듀플렉스의 척수강내 투여 후 래트 뇌(소뇌 및 전두엽 피질), 척수(흉부 척수), 및 심장에서 qPCR에 의해 표 17에 열거된 siRNA 접합체로 SOD1 유전자 사일런싱을 연구하고, 14 일째에 래트를 희생시켰으며, 결과를 인공 CSF 투여 대조와 비교하였다. 결과는 도 18에 나타나 있다.

[표 17]

SOD1 서열의 친유성 siRNA 접합체(5', 3' 및 내부)

단일 0.9 mg 용량의 siRNA 듀플렉스의 척수강내 투여 후 래트 뇌(뇌줄기, 소뇌 및 전두엽 피질), 척수(흉부 척수), 및 심장에서 qPCR에 의해 표 18에 열거된 siRNA 접합체로 SOD1 유전자 사일런싱을 또한 연구하고, 14 일째에 래트를 희생시켰으며, 결과를 인공 CSF 투여 대조와 비교하였다. 결과는 도 19에 나타나 있다.

[표 18]

래트 연구를 위한 SOD1 서열의 친유성 siRNA 접합체.

단일 0.9 mg 용량의 siRNA 듀플렉스의 척수강내 투여 후 래트 뇌(소뇌 및 전두염 피질), 척수(흉부 척수), 및 심장에서 qPCR에 의해 표 19에 열거된 siRNA 접합체로 SOD1 유전자 사일런싱을 또한 연구하고, 7 일째에 래트를 희생시켰으며, 결과를 인공 CSF 투여 대조와 비교하였다. 결과는 도 20에 나타나 있다.

[표 19]

SOD1 서열의 에스테라제 분해형 친유성 siRNA 접합체

단일 50 ug 또는 150 ug 용량의 siRNA 듀플렉스를 또한 ICV 투여한 후 마우스 뇌 및 심장에서 qPCR에 의해 표 20에 열거된 siRNA 접합체로 SOD1 유전자 사일런싱을 연구하고, 14 일째 또는 7 일째에 마우스들을 희생시켰으며, 결과를 인공 CSF 투여 대조와 비교하였다. 결과는 도 21에 나타나 있다.

[표 20]

마우스 ICV 실험을 위한 SOD1 서열의 친유성 siRNA 접합체

Claims

타겟 유전자와 상보적인 안티센스 가닥;
상기 안티센스 가닥과 상보적인 센스 가닥; 및
하나 이상의 친유성 단량체
를 포함하는, 화합물로서, 친유성 단량체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물:

(식에서,
m은 0 내지 8의 정수이고;
n은 1 내지 21의 정수이고;
R₂'는 H, OH, F, OMe, O-메톡시알킬, O-알릴, O-N-메틸아세트아미도, O-디메틸아미노에톡시에틸, 또는 O-아미노프로필이고;
B는 변형 또는 비변형 뉴클레오베이스이고;
W는 알킬 기이고;
R, R', 및 R''는 각각 독립적으로 H 또는 알킬 기임).
제1항에 있어서, 상기 센스 및 안티센스 가닥은 각각 15개 내지 30개 뉴클레오타이드 길이인, 화합물.
제1항에 있어서, 상기 센스 및 안티센스 가닥은 각각 19개 내지 25개 뉴클레오타이드 길이인, 화합물.
제1항에 있어서, 상기 센스 및 안티센스 가닥은 각각 21개 내지 23개 뉴클레오타이드 길이인, 화합물.
제4항에 있어서, 센스 가닥은 21개 뉴클레오타이드 길이이고, 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오타이드 길이이고, 가닥은 3'-말단에 2개 뉴클레오타이드 길이의 단일-가닥 오버행을 갖는 21개의 연속 염기쌍의 이중-가닥 영역을 형성하는, 화합물.
제1항에 있어서, 상기 화합물은 말단 중 적어도 하나에서 단일-가닥 오버행을 포함하는, 화합물.
제6항에 있어서, 상기 단일-가닥 오버행은 1개, 2개 또는 3개 뉴클레오타이드 길이인, 화합물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 및 안티센스 가닥은 10개 미만의 2'-플루오로 변형 뉴클레오타이드를 포함하는, 화합물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 및 안티센스 가닥은 적어도 50%, 적어도 60%, 또는 적어도 70%의 2'-OMe 변형 뉴클레오타이드를 포함하는, 화합물.
제1항에 있어서, 친유성 단량체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물:

(식에서, R 및 R'는 각각 독립적으로 H, 메틸, 에틸, 이소프로필, 또는 t-부틸임).
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 3'-말단에서 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는, 화합물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥은 3'-말단에서 적어도 2개의 포스포로티오에이트 결합을 포함하는, 화합물.
제11항 또는 제12항에 있어서, 포스포로티오에이트 결합 중 하나는 친유성 단량체와 센스 가닥의 3'-말단으로부터의 제1 뉴클레오타이드 사이에 위치하는, 화합물.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥의 5'-말단에 포스페이트 또는 포스페이트 모방체를 추가로 포함하는, 화합물.
제14항에 있어서, 포스페이트 모방체는 5'-비닐 포스포네이트(VP)인, 화합물.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥은 시드 영역에 적어도 하나의 GNA를 포함하는, 화합물.
제16항에 있어서, 시드 영역은 안티센스 가닥의 5'말단으로부터 5번 내지 7번 위치에 있는, 화합물.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, CNS 조직에 대한 전달을 매개하는 수용체를 타겟화하는 타겟화 리간드를 추가로 포함하는, 화합물.
제18항에 있어서, 타겟화 리간드는 Angiopep-2, 지질단백질 수용체 관련 단백질(lipoprotein receptor related protein: LRP) 리간드, bEnd.3 세포 결합 리간드, 트랜스페린 수용체(transferrin receptor: TfR) 리간드, 만노스 수용체 리간드, 글루코스 운반체 단백질, 및 LDL 수용체 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 안구 조직에 대한 전달을 매개하는 수용체를 타겟화하는 타겟화 리간드를 추가로 포함하는, 화합물.
제20항에 있어서, 타겟화 리간드는 트랜스-레티놀, RGD 펩타이드, LDL 수용체 리간드, 및 탄수화물 기재 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 화합물.
제21항에 있어서, 표적화 리간드는 RGD 펩타이드이고, RGD 펩타이드는 H-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Lys-Cys-OH 또는 사이클로(-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys)인, 화합물.
세포에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 상기 세포를
타겟 유전자와 상보적인 안티센스 가닥;
상기 안티센스 가닥과 상보적인 센스 가닥; 및
하나 이상의 친유성 단량체
를 포함하는 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하고,
친유성 단량체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법:

(식에서,
m은 0 내지 8의 정수이고;
n은 1 내지 21의 정수이고;
R₂'는 H, OH, F, OMe, O-메톡시알킬, O-알릴, O-N-메틸아세트아미도, O-디메틸아미노에톡시에틸, 또는 O-아미노프로필이고;
W는 알킬 기이고;
R, R', 및 R''는 각각 독립적으로 H 또는 알킬 기임).
제23항에 있어서, 세포는 간세포가 아닌, 방법.
제23항에 있어서, logK_ow에 의해 측정되는 친유성 단량체의 친유성은 0을 초과하는, 방법.
제25항에 있어서, 이중-가닥 iRNA 제제의 혈장 단백질 결합 검정에서 비결합 분율에 의해 측정되는, 화합물의 소수성은 0.2 초과인, 방법.
제26항에 있어서, 혈장 단백질 결합 검정은 인간 혈청 알부민 단백질을 이용하는 전기영동 이동성 변화 검정인, 방법.
피험자에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서,
타겟 유전자와 상보적인 안티센스 가닥;
상기 안티센스 가닥과 상보적인 센스 가닥; 및
하나 이상의 친유성 단량체
를 포함하는 화합물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하고, 친유성 단량체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법:

(식에서,
m은 0 내지 8의 정수이고;
n은 1 내지 21의 정수이고;
R₂'는 H, OH, F, OMe, O-메톡시알킬, O-알릴, O-N-메틸아세트아미도, O-디메틸아미노에톡시에틸, 또는 O-아미노프로필이고;
W는 알킬 기이고;
R, R', 및 R''는 각각 독립적으로 H 또는 알킬 기임).
제28항에 있어서, 화합물은 간외로 투여되는, 방법.
제29항에 있어서, 화합물은 척수강내 또는 뇌실내로 투여되는, 방법.
제28항에 있어서, 뇌 또는 척추 조직에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키는, 방법.
제31항에 있어서, 뇌 또는 척추 조직은 피질, 소뇌, 경추, 요추, 및 흉추로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제31항에 있어서, 타겟 유전자는 APP, ATXN2, C9orf72, TARDBP, MAPT(Tau), HTT, SNCA, FUS, ATXN3, ATXN1, SCA1, SCA7, SCA8, MeCP2, PRNP, SOD1, DMPK, 및 TTR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제28항에 있어서, 화합물은 피험자의 눈(들)에 직접 투여되는, 방법.
제28항에 있어서, 안구 조직에서 타겟 유전자의 발현을 감소시키는, 방법.
CNS 장애를 갖는 피험자를 치료하는 방법으로서, 치료적 유효량의 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항의 화합물을 피험자에게 투여하고, 이에 의해 피험자를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
제36항에 있어서, CNS 장애는 알츠하이머(Alzheimer), 근위축성 축삭 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis: ALS), 전측두엽 치매(frontotemporal dementia), 헌팅턴(Huntington), 파킨슨(Parkinson), 척수소뇌(spinocerebellar), 프리온(prion) 및 라포라(lafora)의 군으로부터 선택되는, 방법.
타겟 유전자와 상보적인 안티센스 가닥;
상기 안티센스 가닥과 상보적인 센스 가닥; 및
하기로 이루어진 군으로부터 선택된 담체를 통해 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥에 접합된 친유성 모이어티를 함유하는 하나 이상의 친유성 단량체를 포함하는, 화합물:

(식에서,
R은 친유성 모이어티이고;
R₂'는 H, OH, F, OMe, O-메톡시알킬, O-알릴, O-N-메틸아세트아미도, O-디메틸아미노에톡시에틸, 또는 O-아미노프로필이고;
B는 변형 또는 비변형 뉴클레오베이스임).
타겟 유전자와 상보적인 안티센스 가닥;
상기 안티센스 가닥과 상보적인 센스 가닥; 및
하기로 이루어진 군으로부터 선택된 담체를 통해 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 내부 위치에 접합된 친유성 모이어티를 함유하는 하나 이상의 친유성 단량체를 포함하는, 화합물:

(식에서,
R은 친유성 모이어티이고;
n은 1 내지 21의 정수이고;
R₂'는 H, OH, F, OMe, O-메톡시알킬, O-알릴, O-N-메틸아세트아미도, O-디메틸아미노에톡시에틸, 또는 O-아미노프로필이고;
B는 변형 또는 비변형 뉴클레오베이스임).