JP2023540429A - てんかんを治療するための方法及び組成物 - Google Patents

てんかんを治療するための方法及び組成物 Download PDF

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Abstract

本開示は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化することによって、てんかん、例えば、側頭葉てんかんを治療することを必要とする対象においてそれを行うための遺伝子療法に関する方法及び組成物を提供する。特に、本開示は、過剰興奮性神経回路においてＧｌｕＫ２タンパク質の発現を阻害し、てんかん型放電を阻害することができる阻害性ＲＮＡ構築物を提供する。

Description

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、配列表を含む。上述のＡＳＣＩＩコピーは、２０２１年７月８日に作成され、「５１４６０－００３ＷＯ４＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿７＿８＿２１＿ＳＴ２５」という名称であり、４２５，５５３バイトのサイズである。
開示の分野
本開示は、てんかんの分野に含まれる。特に、本開示は、てんかん、例えば、側頭葉てんかんを治療するための方法及び組成物に関する。
側頭葉てんかん（ＴＬＥ）は、成人における部分てんかんの最も一般的な形態である（てんかんの全ての形態の３０～４０％）。海馬が、ＴＬＥの病態生理学において重要な役割を果たすことは十分に確立されている。ＴＬＥのヒト患者及び動物モデルにおいて、神経回路の異常な再構成が起こる。ネットワーク再編成（「反応性可塑性（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）」）の最良の例のうちの１つは、海馬において歯状回顆粒細胞（ＤＧＣ）上で新規な病態生理学的なグルタミン酸作動性シナプスを確立する再発性苔状線維（ｒＭＦ）の発芽であり（Ｔａｕｃｋ ａｎｄ Ｎａｄｌｅｒ，１９８５、Ｒｅｐｒｅｓａ ｅｔ ａｌ．，１９８９ａ，１９８９ｂ、Ｓｕｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．，１９８９、Ｇａｂｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００４）、再発性興奮性ループを引き起こす。ｒＭＦシナプスは、異所性カイニン酸型受容体（ＫＡＲ）を介して作動する（Ｅｐｓｚｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ａｒｔｉｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１，２０１５）。ＫＡＲは、ＧｌｕＫ１～ＧｌｕＫ５サブユニットから組み立てられたテトラマーグルタミン酸受容体である。異種発現系において、ＧｌｕＫ１、ＧｌｕＫ２、及びＧｌｕＫ３は、ホモマー受容体を形成し得るが、ＧｌｕＫ４及びＧｌｕＫ５は、ＧｌｕＫ１～３サブユニットと組み合わせてヘテロマー受容体を形成し得る。ネイティブＫＡＲは、脳において広く分布し、海馬において高密度の受容体が見出され（Ｃａｒｔａ ｅｔ ａｌ，２０１６，ＥＪＮ）、ＴＬＥに関与する主要な構造である。本願発明者らによる以前の研究は、発作間欠期スパイク及び発作時放電を含むてんかん発作が、ＧｌｕＫ２ ＫＡＲサブユニットを欠くマウスにおいて顕著に減少することを確立した。更に、てんかん性活性は、異所性シナプスＫＡＲをブロックするＧｌｕＫ２／ＧｌｕＫ５含有ＫＡＲの薬理学的低分子アンタゴニストの使用後に大幅に減少した（Ｐｅｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。これらのデータは、ＤＧＣのｒＭＦで異所性発現したＫＡＲが、ＴＬＥの慢性てんかん発作において大きな役割を果たすことを示している。したがって、ＤＧＣで発現し、ＧｌｕＫ２／ＧｌｕＫ５で構成される異常なＫＡＲは、薬剤抵抗性ＴＬＥの治療のための有望な標的を代表するものであると考えられる。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）戦略が、多くの疾患標的について提案されている。ＲＮＡｉベースの療法の成功した用途は、限定的である。ＲＮＡｉ療法薬は、中枢神経系（ＣＮＳ）の場合と同様に、特に、複雑な遺伝子パターンが存在する場合には、ＲＮＡ設計に情報を与えるための疑わしいオフターゲットドメインの予測、インビボでの遺伝子サイレンシング有効性の変動、及びオフターゲット効果の減少等の複数の課題に直面する。しかしながら、難治性ＴＬＥの治療に利用可能なＲＮＡｉベースの遺伝子療法は限定的である。したがって、発作障害、例えば、ＴＬＥ（例えば、治療に難治性のＴＬＥ）の治療のための新しい治療モダリティの緊急な必要性が存在する。
Ｔａｕｃｋ ＤＬ，Ｎａｄｌｅｒ Ｊ Ｖ（１９８５）Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｏｓｓｙ ｆｉｂｅｒ ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ ｉｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｋａｉｎｉｃ ａｃｉｄ－ｔｒｅａｔｅｄ ｒａｔｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ５：１０１６－１０２２ Ｒｅｐｒｅｓａ Ａ，Ｌｅ Ｇａｌｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅ Ｇ，Ｂｅｎ－Ａｒｉ Ｙ（１９８９ａ）Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｋｉｎｄｌｉｎｇ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｐｉｌｅｐｓｙ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ ９９：３４５－３５０． Ｒｅｐｒｅｓａ Ａ，Ｒｏｂａｉｎ Ｏ，Ｔｒｅｍｂｌａｙ Ｅ，Ｂｅｎ－Ａｒｉ Ｙ（１９８９ｂ）Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｉｎ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ｅｐｉｌｅｐｓｙ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ ９９：３５１－３５５． Ｓｕｔｕｌａ Ｔ，Ｃａｓｃｉｎｏ Ｇ，Ｃａｖａｚｏｓ Ｊ，Ｐａｒａｄａ Ｉ，Ｒａｍｉｒｅｚ Ｌ（１９８９）Ｍｏｓｓｙ ｆｉｂｅｒ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅｐｉｌｅｐｔｉｃ ｈｕｍａｎ ｔｅｍｐｏｒａｌ ｌｏｂｅ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ ２６：３２１－３３０． Ｇａｂｒｉｅｌ Ｓ，Ｎｊｕｎｔｉｎｇ Ｍ，Ｐｏｍｐｅｒ ＪＫ，Ｍｅｒｓｃｈｈｅｍｋｅ Ｍ，Ｓａｎａｂｒｉａ ＥＲＧ，Ｅｉｌｅｒｓ Ａ，Ｋｉｖｉ Ａ，Ｚｅｌｌｅｒ Ｍ，Ｍｅｅｎｃｋｅ Ｈ－Ｊ，Ｃａｖａｌｈｅｉｒｏ Ｅ ａ，Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ Ｕ，Ｌｅｈｍａｎｎ Ｔ－Ｎ（２００４）Ｓｔｉｍｕｌｕｓ ａｎｄ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｐｉｌｅｐｔｉｆｏｒｍ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｄｅｎｔａｔｅ ｇｙｒｕｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２４：１０４１６－１０４３０．
本開示は、てんかん、例えば、側頭葉てんかん（ＴＬＥ）の治療又は予防を必要とする対象（例えば、ヒト）においてそれを行うための組成物及び方法を提供する。開示される方法は、てんかんを有するか、又はてんかんを発症するリスクがあると診断された対象に対して、グルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（Ｇｒｉｋ２）遺伝子によってコードされるｍＲＮＡを標的化する阻害性ＲＮＡ（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）、又はこれらをコードする核酸ベクター（例えば、レンチウイルスベクター、若しくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、例えば、ＡＡＶ９ベクター）の治療有効量の投与を含む。本開示はまた、開示されるＡＳＯ薬剤又はそれをコードする核酸ベクターのうちの１つ以上を含有する薬学的組成物を特徴とする。
第１の態様において、本開示は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの一本鎖領域内で特異的にハイブリダイズする８００以下（例えば、８００、７５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、又は１９以下）のヌクレオチドの長さを有する単離されたポリヌクレオチドであって、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドが、１８ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満（例えば、１７ｋｃａｌ／ｍｏｌ、１６ｋｃａｌ／ｍｏｌ、１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、１４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、１３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、１２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、１１ｋｃａｌ／ｍｏｌ、１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、９ｋｃａｌ／ｍｏｌ、８ｋｃａｌ／ｍｏｌ、７ｋｃａｌ／ｍｏｌ、６ｋｃａｌ／ｍｏｌ、５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、又は１ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、又はそれより小さい）標的開放エネルギー（Ｔａｒｇｅｔ Ｏｐｅｎｉｎｇ Ｅｎｅｒｇｙ）を有し、（ａ）ポリヌクレオチドが、配列番号７７２～７７４（すなわち、欧州特許出願第ＥＰ１９１８５５３３．７の配列番号１～３）のうちのいずれか１つの核酸配列を含まないか、（ｂ）ポリヌクレオチドが、配列番号６８、若しくは配列番号６８及び配列番号６４９の核酸配列を含むか、又は（ｃ）ポリヌクレオチドが、５．５３ｋｃａｌ／ｍｏｌ～５．５５ｋｃａｌ／ｍｏｌ（例えば、５．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ）である総開放エネルギー（Ｔｏｔａｌ Ｏｐｅｎｉｎｇ ｅｎｅｒｇｙ）を有していない、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
上述の態様のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を含まない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号１～７７１の配列のうちのいずれか１つと組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの核酸配列は、５．５３ｋｃａｌ／ｍｏｌ～５．５５ｋｃａｌ／ｍｏｌ（例えば、５．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ）である総開放エネルギーを有する。
別の態様において、本開示は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの一本鎖領域内で特異的にハイブリダイズする２３ヌクレオチド以下の長さを有する単離されたＲＮＡポリヌクレオチドであって、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドが、１８ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満（例えば、１７ｋｃａｌ／ｍｏｌ、１６ｋｃａｌ／ｍｏｌ、１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、１４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、１３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、１２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、１１ｋｃａｌ／ｍｏｌ、１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、９ｋｃａｌ／ｍｏｌ、８ｋｃａｌ／ｍｏｌ、７ｋｃａｌ／ｍｏｌ、６ｋｃａｌ／ｍｏｌ、５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、又は１ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、又はそれより小さい）総開放エネルギー（Ｔｏｔａｌ Ｏｐｅｎｉｎｇ Ｅｎｅｒｇｙ）を有し、ポリヌクレオチドが、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの核酸配列を含まない、単離されたＲＮＡポリヌクレオチドを提供する。
上述の態様のいくつかの実施形態において、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドは、５．５３ｋｃａｌ／ｍｏｌ～５．５５ｋｃａｌ／ｍｏｌである総開放エネルギーを有していない。いくつかの実施形態において、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドは、５．５４ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満である総開放エネルギーを有する。いくつかの実施形態において、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドは、５．５４ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい総開放エネルギーを有する。いくつかの実施形態において、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドは、５．５４ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満であるか、又は５．５４ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい総開放エネルギーを有する。
上述の態様のいくつかの実施形態において、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドは、－３５ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい（例えば、－３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい、又はそれより大きい）二本鎖形成の／からのエネルギー（Ｅｎｅｒｇｙ ｏｆ／ｆｒｏｍ Ｄｕｐｌｅｘ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を有する。いくつかの実施形態において、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドは、－３６．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ～－３６．５ｋｃａｌ／ｍｏｌである二本鎖形成のエネルギーを有しない。いくつかの実施形態において、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドは、－３６．６１ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい二本鎖形成のエネルギーを有する。いくつかの実施形態において、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドは、－３６．６１ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満である二本鎖形成のエネルギーを有する。
いくつかの実施形態において、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドは、－２４ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きな（例えば、－２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きな、又はそれより大きな）総結合エネルギー（Ｔｏｔａｌ Ｅｎｅｒｇｙ ｏｆ Ｂｉｎｄｉｎｇ）を有する。いくつかの実施形態において、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドは、－２９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ～－２９．３ｋｃａｌ／ｍｏｌである総結合エネルギーを有しない。いくつかの実施形態において、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドは、－２９．４ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい総結合エネルギーを有する。いくつかの実施形態において、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドは、－２９．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満である総結合エネルギーを有する。
いくつかの実施形態において、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドは、５０％未満（例えば、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満、又はそれより小さい）ＧＣ含有量を有する。いくつかの実施形態において、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドは、４２．７％～４７．６％であるＧＣ含有量を有しない。いくつかの実施形態において、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドは、４２．９％未満であるＧＣ含有量を有する。いくつかの実施形態において、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドは、４２．９％より大きいＧＣ含有量を有する。いくつかの実施形態において、ＧＣ含有量は、ポリヌクレオチドについて決定される。いくつかの実施形態において、ＧＣ含有量は、ポリヌクレオチドに対して実質的に相補的である（例えば、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個以下のミスマッチを有する）配列について決定される。いくつかの実施形態において、ＧＣ含有量は、ポリヌクレオチドと、そのポリヌクレオチドに対して実質的に相補的である配列との間のハイブリダイゼーションによって形成される二本鎖について決定される。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号１～７７１の配列のうちのいずれか１つと組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号６８の配列と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号６８及び６４９の配列と組み合わせた状態で、含まない。
別の態様において、本開示は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの一本鎖領域内で特異的にハイブリダイズする８００ヌクレオチド以下の長さを有する単離されたポリヌクレオチドであって、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドが、５．５３～５．５５ｋｃａｌ／ｍｏｌである総開放エネルギーを有さず、ポリヌクレオチドが、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの核酸配列を含まない、単離されたポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号１～７７１の配列のうちのいずれか１つ以上と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号６８の配列と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号６８及び６４９の配列と組み合わせた状態で、含まない。
別の態様において、本開示は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの一本鎖領域内で特異的にハイブリダイズする８００ヌクレオチド以下の長さを有する単離されたポリヌクレオチドであって、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドが、－３６．７～－３６．５ｋｃａｌ／ｍｏｌである二本鎖形成のエネルギーを有さず、ポリヌクレオチドが、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの核酸配列を含まない、単離されたポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号１～７７１の配列のうちのいずれか１つ以上と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号６８の配列と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号６８及び６４９の配列と組み合わせた状態で、含まない。
別の態様において、本開示は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの一本鎖領域内で特異的にハイブリダイズする８００ヌクレオチド以下の長さを有する単離されたポリヌクレオチドであって、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドが、－２９．５～－２９．３ｋｃａｌ／ｍｏｌである総結合エネルギーを有さず、ポリヌクレオチドが、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの核酸配列を含まない、単離されたポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号１～７７１の配列のうちのいずれか１つ以上と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号６８の配列と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号６８及び６４９の配列と組み合わせた状態で、含まない。
別の態様において、本開示は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの一本鎖領域内で特異的にハイブリダイズする２３ヌクレオチド以下の長さを有する単離されたＲＮＡポリヌクレオチドであって、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドが、５．５３～５．５５ｋｃａｌ／ｍｏｌである総開放エネルギーを有さず、ポリヌクレオチドが、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの核酸配列を含まない、単離されたＲＮＡポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号１～７７１の配列のうちのいずれか１つ以上と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号６８の配列と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号６８及び６４９の配列と組み合わせた状態で、含まない。
別の態様において、本開示は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの一本鎖領域内で特異的にハイブリダイズする２３ヌクレオチド以下の長さを有する単離されたＲＮＡポリヌクレオチドであって、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドが、－３６．７～－３６．５ｋｃａｌ／ｍｏｌである二本鎖形成のエネルギーを有さず、ポリヌクレオチドが、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの核酸配列を含まない、単離されたＲＮＡポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号１～７７１の配列のうちのいずれか１つ以上と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号６８の配列と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号６８及び６４９の配列と組み合わせた状態で、含まない。
別の態様において、本開示は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの一本鎖領域内で特異的にハイブリダイズする２３ヌクレオチド以下の長さを有する単離されたＲＮＡポリヌクレオチドであって、ハイブリダイズされたポリヌクレオチドが、－２９．５～－２９．３ｋｃａｌ／ｍｏｌである総結合エネルギーを有さず、ポリヌクレオチドが、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの核酸配列を含まない、単離されたＲＮＡポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号１～７７１の配列のうちのいずれか１つ以上と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号６８の配列と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号６８及び６４９の配列と組み合わせた状態で、含まない。
上述の態様のいくつかの実施形態において、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの一本鎖領域は、ループ領域１～１４からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、（ａ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ１領域、（ｂ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ２領域、（ｃ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ３領域、（ｄ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ４領域、（ｅ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ５領域、（ｆ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ６領域、（ｇ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ７領域、（ｈ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ８領域、（ｉ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ９領域、（ｊ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ１０領域、（ｋ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ１１領域、（ｌ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ１２領域、（ｍ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ１３領域、又は（ｎ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ１４領域内で特異的にハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、ループ１のその領域は、配列番号１４５の少なくとも１０個の（例えば、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ループ２領域は、配列番号１４６の少なくとも１０個の（例えば、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ループ３領域は、配列番号１４７の少なくとも１０個の（例えば、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ループ４領域は、配列番号１４８の少なくとも１０個の（例えば、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ループ５領域は、配列番号１４９の少なくとも１０個の（例えば、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ループ６領域は、配列番号１５０の少なくとも１０個の（例えば、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ループ７領域は、配列番号１５１の少なくとも１０個の（例えば、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ループ８領域は、配列番号１５２の少なくとも１０個の（例えば、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ループ９領域は、配列番号１５３の少なくとも１０個の（例えば、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ループ１０領域は、配列番号１５４の少なくとも１０個の（例えば、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ループ１１領域は、配列番号１５５の少なくとも１０個の（例えば、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ループ１２領域は、配列番号１５６の少なくとも１０個の（例えば、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ループ１３領域は、配列番号１５７の少なくとも１０個の（例えば、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ループ１４領域は、配列番号１５８の少なくとも１０個の（例えば、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、配列同一性は、配列番号１４５～１５８のうちのいずれか１つの少なくとも１５個の（例えば、少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０個の）連続ヌクレオチドにわたって決定される。いくつかの実施形態において、配列同一性は、配列番号１４５～１５８のうちのいずれか１つの少なくとも３０個の（例えば、少なくとも３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０個の）連続ヌクレオチドにわたって決定される。いくつかの実施形態において、配列同一性は、配列番号１４５～１５８のうちのいずれか１つの少なくとも６０個の（例えば、少なくとも６５、７０、７５、又は８０個の）連続ヌクレオチドにわたって決定される。いくつかの実施形態において、配列同一性は、配列番号１４５～１５８のうちのいずれか１つの全長にわたって決定される。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号１の少なくとも５個の（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｂ）配列番号４の少なくとも５個の（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｃ）（ｉ）配列番号５の少なくとも５個の（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、又は
（ｉｉ）配列番号６の少なくとも５個の（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｄ）配列番号７の少なくとも５個の（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｅ）配列番号９６の少なくとも５個の（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｆ）（ｉ）配列番号８の少なくとも５個の（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｉ）配列番号９８の少なくとも５個の（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、又は
（ｉｉｉ）配列番号９９の少なくとも５個の（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｇ）配列番号９の少なくとも５個の（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｈ）配列番号６３の少なくとも５個の（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉ）配列番号１０の少なくとも５個の（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、又は
（ｊ）配列番号１１の少なくとも５個の（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、配列同一性は、配列番号１、４～１１、６３、９６、９８、又は９９のうちのいずれか１つの少なくとも１０個の（例えば、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって決定される。いくつかの実施形態において、配列同一性は、配列番号１、４～１１、６３、９６、９８、又は９９のうちのいずれか１つの少なくとも１５個の（例えば、少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって決定される。いくつかの実施形態において、配列同一性は、配列番号１、４～１１、６３、９６、９８、又は９９のうちのいずれか１つの少なくとも２０個の（例えば、少なくとも２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって決定される。いくつかの実施形態において、配列同一性は、配列番号１、４～１１、６３、９６、９８、又は９９のうちのいずれか１つの全長にわたって決定される。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドとＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡの一本鎖領域とによって形成される二本鎖構造を含み、二本鎖構造は、ポリヌクレオチドのヌクレオチドと、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの一本鎖領域のヌクレオチドとの間に少なくとも１つ（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又はそれより多い）ミスマッチを含む。
いくつかの実施形態において、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの一本鎖領域は、ループ領域１～１４からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、平均位置エントロピーは、２３～７９個のヌクレオチドにわたって計算される。
いくつかの実施形態において、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの一本鎖領域は、非対形成領域１～５からなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、（ａ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの非対形成領域１、（ｂ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの非対形成領域２、（ｃ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの非対形成領域３、（ｄ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの非対形成領域４、又は（ｅ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの非対形成領域５内で特異的にハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、（ａ）非対形成領域１は、配列番号１５９の少なくとも１０個の（例えば、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、（ｂ）非対形成領域２は、配列番号１６０の少なくとも１０個の（例えば、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、（ｃ）非対形成領域３は、配列番号１６１の少なくとも１０個の（例えば、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、（ｄ）非対形成領域４は、配列番号１６２の少なくとも１０個の（例えば、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、かつ／又は（ｅ）非対形成領域５は、配列番号１６３の少なくとも１０個の（例えば、少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、配列同一性は、配列番号１５９～１６３のうちのいずれか１つの少なくとも１５個の（例えば、少なくとも１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０個の）連続ヌクレオチドにわたって決定される。いくつかの実施形態において、配列同一性は、配列番号１５９～１６３のうちのいずれか１つの少なくとも３０個の（例えば、少なくとも３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０個の）連続ヌクレオチドにわたって決定される。いくつかの実施形態において、配列同一性は、配列番号１５９～１６３のうちのいずれか１つの少なくとも６０個の（例えば、少なくとも６５、７０、７５、又は８０個の）連続ヌクレオチドにわたって決定される。いくつかの実施形態において、配列同一性は、配列番号１５９～１６３のうちのいずれか１つの全長にわたって決定される。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、
（ａ）（ｉ）配列番号１３の少なくとも５個の（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｉ）配列番号１４の少なくとも５個の（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号７２の少なくとも５個の（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、又は
（ｉｖ）配列番号７３の少なくとも５個の（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｂ）配列番号１５の少なくとも５個の（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、又は
（ｃ）配列番号１６の少なくとも５個の（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、配列同一性は、配列番号１３～１６、７２、又は７３のうちのいずれか１つの少なくとも１０個の（例えば、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって決定される。いくつかの実施形態において、配列同一性は、配列番号１３～１６、７２、又は７３のうちのいずれか１つの少なくとも１５個の（例えば、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって決定される。いくつかの実施形態において、配列同一性は、配列番号１３～１６、７２、又は７３のうちのいずれか１つの少なくとも２０個の（例えば、少なくとも２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって決定される。いくつかの実施形態において、配列同一性は、配列番号１３～１６、７２、又は７３のうちのいずれか１つの全長にわたって決定される。いくつかの実施形態において、配列同一性は、配列番号１３～１６、７２、又は７３のうちのいずれか１つの３０個以下の（例えば、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２個以下の）連続ヌクレオチドにわたって決定される。いくつかの実施形態において、配列同一性は、配列番号１３～１６、７２、又は７３のうちのいずれか１つの２５個以下の（例えば、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２個以下の）連続ヌクレオチドにわたって決定される。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドとＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡの一本鎖領域とによって形成される二本鎖構造を含み、二本鎖構造は、ポリヌクレオチドのヌクレオチドと、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの一本鎖領域のヌクレオチドとの間に少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上）ミスマッチを含む。
いくつかの実施形態において、平均位置エントロピーは、２３～７９個のヌクレオチドにわたって計算される。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのコード配列にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、（ａ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１内の領域、（ｂ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン２内の領域、（ｃ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン３内の領域、（ｄ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン４内の領域、（ｅ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン５内の領域、（ｆ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン６内の領域、（ｇ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン７内の領域、（ｈ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン８内の領域、（ｉ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン９内の領域、（ｊ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１０内の領域、（ｋ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１１内の領域、（ｌ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１２内の領域、（ｍ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１３内の領域、（ｎ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１４内の領域、（ｏ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１５内の領域、かつ／又は（ｐ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１６内の領域にハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、（ａ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１が、配列番号１２９の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、（ｂ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン２が、配列番号１３０の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、（ｃ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン３が、配列番号１３１の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、（ｄ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン４が、配列番号１３２の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、（ｅ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン５が、配列番号１３３の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、（ｆ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン６が、配列番号１３４の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、（ｇ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン７が、配列番号１３５の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、（ｈ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン８が、配列番号１３６の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、（ｉ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン９が、配列番号１３７の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、（ｊ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１０が、配列番号１３８の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、（ｋ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１１が、配列番号１３９の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、（ｌ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１２が、配列番号１４０の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、（ｍ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１３が、配列番号１４１の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、（ｎ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１４が、配列番号１４２の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、（ｏ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１５が、配列番号１４３の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、かつ／又は（ｐ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１６が、配列番号１４４の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、
（ａ）配列番号１の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｂ）（ｉ）配列番号２の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｉ）配列番号３の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号３０の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｖ）配列番号３１の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｖ）配列番号３６の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｖｉ）配列番号４０の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｖｉｉ）配列番号５９の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号７６の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｘ）配列番号８０の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｘ）配列番号８１の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｘｉ）配列番号９２の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、及び／又は
（ｘｉｉ）配列番号９３の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｃ）（ｉ）配列番号４０の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｉ）配列番号６０の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号６８の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｖ）配列番号７０の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、及び／又は
（ｖ）配列番号８６の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｄ）（ｉ）配列番号６８の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｉ）配列番号６９の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、及び／又は
（ｉｉｉ）配列番号７０の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｅ）（ｉ）配列番号４の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｉ）配列番号５の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号６の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｖ）配列番号５６の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｖ）配列番号５７の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｖｉ）配列番号５８の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｖｉｉ）配列番号９１の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号９４の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、及び／又は
（ｉｘ）配列番号９５の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｆ）（ｉ）配列番号２０の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｉ）配列番号３７の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号３８の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｖ）配列番号４４の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｖ）配列番号４６の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｇ）配列番号１２の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｈ）（ｉ）配列番号７の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｉ）配列番号８の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号９６の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｖ）配列番号９８の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、及び／又は
（ｖ）配列番号９９の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉ）（ｉ）配列番号２２の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｉ）配列番号３９の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号６２の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｖ）配列番号７４の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｖ）配列番号７５の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｖｉ）配列番号８７の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｖｉｉ）配列番号８８の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号８９の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、及び／又は
（ｉｘ）配列番号９０の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｊ）（ｉ）配列番号８２の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｉ）配列番号８３の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号８４の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、及び／又は
（ｉｖ）配列番号８５の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｋ）（ｉ）配列番号１３の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｉ）配列番号１４の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号７２の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、及び／又は
（ｉｖ）配列番号７３の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｌ）（ｉ）配列番号３４の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｉ）配列番号３５の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号７７の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｖ）配列番号７８の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、及び／又は
（ｖ）配列番号７９の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｍ）配列番号５１の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
並びに／又は
（ｎ）（ｉ）配列番号９の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｉ）配列番号１０の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号１１の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｖ）配列番号１５の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｖ）配列番号１６の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｖｉ）配列番号１７の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｖｉｉ）配列番号１８の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２７の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｉｘ）配列番号３２の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｘ）配列番号３３の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｘｉ）配列番号４１の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｘｉｉ）配列番号４９の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｘｉｉｉ）配列番号５０の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｘｉｖ）配列番号５２の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｘｖ）配列番号５３の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｘｖｉ）配列番号６１の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列、及び／又は
（ｘｖｉｉ）配列番号６３の少なくとも５個の（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、配列同一性は、配列番号１～１２、１３～１８、２０、２２、２７、３０～４１、４４、４６、４９～５３、５６～６３、６８～７０、７２～９２、又は９４～９９のうちのいずれか１つの少なくとも１０個の（例えば、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって決定される。いくつかの実施形態において、配列同一性は、配列番号１～１２、１３～１８、２０、２２、２７、３０～４１、４４、４６、４９～５３、５６～６３、６８～７０、７２～９２、又は９４～９９のうちのいずれか１つの少なくとも１５個の（例えば、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって決定される。いくつかの実施形態において、配列同一性は、配列番号１～１２、１３～１８、２０、２２、２７、３０～４１、４４、４６、４９～５３、５６～６３、６８～７０、７２～９２、又は９４～９９のうちのいずれか１つの少なくとも２０個の（例えば、少なくとも２０、２１、又は２２個の）連続ヌクレオチドにわたって決定される。いくつかの実施形態において、配列同一性は、配列番号１～１２、１３～１８、２０、２２、２７、３０～４１、４４、４６、４９～５３、５６～６３、６８～７０、７２～９２、又は９４～９９のうちのいずれか１つの全長にわたって決定される。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号６８の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号６８及び６４９の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、５から３’へ、配列番号６８、７５８、及び６４９の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、５から３’へ、配列番号６４９、７５８、及び６８の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、５から３’へ、配列番号６４９、７５８、及び６８の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、５から３’へ、配列番号７５２、６８、７５８、６４９、及び７５３の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、５から３’へ、配列番号７５２、６４９、７５８、６８、及び７５３の核酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの非コード配列にハイブリダイズする。いくつかの実施形態において、非コード配列は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。いくつかの実施形態において、５’ＵＴＲは、配列番号１２６の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより大きな）配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、非コード配列は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態において、３’ＵＴＲは、配列番号１２７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより大きな）配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１１５～６８１の核酸配列のうちのいずれか１つにハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより大きな）配列同一性を有する
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。いくつかの実施形態において、ＡＳＯは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、又はｓｈＲＮＡ適合マイクロＲＮＡ（ｓｈｍｉＲＮＡ）である。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、１９～２１個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、１９個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、２０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、２１個のヌクレオチドである。
いくつかの実施形態において、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、又は配列番号１２４の核酸配列によってコードされる。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、細胞におけるＧｌｕｋ２タンパク質のレベルを減少させることができる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、細胞におけるＧｌｕＫ２タンパク質のレベルを、少なくとも１０％、少なくとも少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％減少させる。いくつかの実施形態において、細胞は、ニューロンである。いくつかの実施形態において、ニューロンは、海馬ニューロンである。いくつかの実施形態において、海馬ニューロンは、歯状回顆粒細胞（ＤＧＣ）である。
上述の態様のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を含まない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号１～７７１のうちのいずれか１つの配列のうちのいずれか１つと組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号６８の配列と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号６８及び６４９の配列と組み合わせた状態で、含まない。
別の態様において、本開示は、上述の態様及び実施形態のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、ベクターは、複製欠損性である。いくつかの実施形態において、複製欠損性ベクターは、ビリオンの合成、複製、及びパッケージングに必要な遺伝子のうちの１つ以上のコード領域を欠くベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、哺乳動物ベクター、細菌ベクター、又はウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、発現ベクターである。
いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、オルトミクソウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、プラス鎖ＲＮＡウイルス、ピコルナウイルス、アルファウイルス、二本鎖ＤＮＡウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス、鶏痘ウイルス、及びカナリアポックスウイルスからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ベクターは、ＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ１０ベクターである。
いくつかの実施形態において、ベクターは、米国仮特許出願第６３／０５０，７４２号（参照により本明細書に組み込まれる）の表９又は表１０に定義される配列のうちのいずれか１つを含有する発現カセットを含む。
いくつかの実施形態において、上述の態様のベクターは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を含まない。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号１～７７１の配列のうちのいずれか１つ以上と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号６８の配列と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号６８及び６４９の配列と組み合わせた状態で、含まない。
別の態様において、本開示は、表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される標的配列、又は表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される対応する標的配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ標的配列に対して完全又は実質的に相補的である抗Ｇｒｉｋ２ガイド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ、又はそれらに対して最大８５％以上の配列同一性を有するそれらのバリアント）と、ガイド配列に完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列と、を含む、発現カセットを提供する。
別の態様において、本開示は、表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される標的配列、又は表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される対応する標的配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ標的配列に対して完全又は実質的に相補的である抗Ｇｒｉｋ２ガイド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ、又はそれらに対して最大８５％以上の配列同一性を有するそれらのバリアント）と、ガイド配列に完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列と、を含む、発現カセットを提供する。
別の態様において、本開示は、表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される標的配列、又は表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される対応する標的配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ標的配列に対して完全又は実質的に相補的である抗Ｇｒｉｋ２ガイド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＣＡＧプロモーター（例えば、配列番号７３７、又はそれに対して最大８５％以上の配列同一性を有するそのバリアント）と、ガイド配列に完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列と、を含む、発現カセットを提供する。
別の態様において、本開示は、表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される標的配列、又は表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される対応する標的配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ標的配列に対して完全又は実質的に相補的である抗Ｇｒｉｋ２ガイド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＣＢＡプロモーター（例えば、配列番号７３８、又はそれに対して最大８５％以上の配列同一性を有するそのバリアント）と、ガイド配列に完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列と、を含む、発現カセットを提供する。
別の態様において、本開示は、表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される標的配列、又は表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される対応する標的配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ標的配列に対して完全又は実質的に相補的である抗Ｇｒｉｋ２ガイド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＵ６プロモーター（例えば、配列番号７２８～７３３のうちのいずれか１つ、又はそれらに対して最大８５％以上の配列同一性を有するそれらのバリアント）と、ガイド配列に完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列と、を含む、発現カセットを提供する。
別の態様において、本開示は、表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される標的配列、又は表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される対応する標的配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ標的配列に対して完全又は実質的に相補的である抗Ｇｒｉｋ２ガイド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＨ１プロモーター（例えば、配列番号７３４、又はそれに対して最大８５％以上の配列同一性を有するそのバリアント）と、ガイド配列に完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列と、を含む、発現カセットを提供する。
別の態様において、本開示は、表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される標的配列、又は表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される対応する標的配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ標的配列に対して完全又は実質的に相補的である抗Ｇｒｉｋ２ガイド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結された７ＳＫプロモーター（例えば、配列番号７４６、又はそれに対して最大８５％以上の配列同一性を有するそのバリアント）と、ガイド配列に完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列と、を含む、発現カセットを提供する。
別の態様において、本開示は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つ、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択される抗Ｇｒｉｋ２ガイド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ、又はそれらに対して最大８５％以上の配列同一性を有するそれらのバリアント）と、ガイド配列に完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列と、を含む、発現カセットを提供する。
別の態様において、本開示は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つ、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択される抗Ｇｒｉｋ２ガイド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ、又はそれらに対して最大８５％以上の配列同一性を有するそれらのバリアント）と、ガイド配列に完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列と、を含む、発現カセットを提供する。
別の態様において、本開示は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つ、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択される抗Ｇｒｉｋ２ガイド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＣＡＧプロモーター（例えば、配列番号７３７、又はそれに対して最大８５％以上の配列同一性を有するそのバリアント）と、ガイド配列に完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列と、を含む、発現カセットを提供する。
別の態様において、本開示は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つ、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択される抗Ｇｒｉｋ２ガイド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＣＢＡプロモーター（例えば、配列番号７３８、又はそれに対して最大８５％以上の配列同一性を有するそのバリアント）と、ガイド配列に完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列と、を含む、発現カセットを提供する。
別の態様において、本開示は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つ、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択される抗Ｇｒｉｋ２ ガイド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＵ６プロモーター（例えば、配列番号７２８～７３３のうちのいずれか１つ、又はそれらに対して最大８５％以上の配列同一性を有するそれらのバリアント）と、ガイド配列に完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列と、を含む、発現カセットを提供する。
別の態様において、本開示は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つ、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択される抗Ｇｒｉｋ２ガイド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＨ１プロモーター（例えば、配列番号７３４、又はそれに対して最大８５％以上の配列同一性を有するそのバリアント）と、ガイド配列に完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列と、を含む、発現カセットを提供する。
別の態様において、本開示は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つ、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択される抗Ｇｒｉｋ２ガイド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結された７ＳＫプロモーター（例えば、配列番号７４６、又はそれに対して最大８５％以上の配列同一性を有するそのバリアント）と、ガイド配列に完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列と、を含む、発現カセットを提供する。別の態様において、本開示は、表９に記載される発現カセットのうちのいずれか１つから選択される発現カセットを提供する（「発明を実施するための形態」を参照されたい）。
別の態様において、本開示は、ステム－ループ配列を含有するヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、ステム－ループ配列が、５’から３’へ、（ｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０）、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するガイドヌクレオチド配列を含む５’ステム－ループアーム、（ｉｉ）ループ領域であって、マイクロＲＮＡループ配列を含む、ループ領域、（ｉｉｉ）ガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的であるパッセンジャーヌクレオチド配列を含む３’ステム－ループアームを含む、発現カセットを提供する。
別の態様において、本開示は、発現カセットであって、（ａ）ステム－ループ配列であって、５’から３’へ、（ｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０）、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するガイドヌクレオチド配列を含む５’ステム－ループアーム、（ｉｉ）ループ領域であって、マイクロＲＮＡループ配列を含む、ループ領域、（ｉｉｉ）ガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的であるパッセンジャーヌクレオチド配列を含む３’ステム－ループアームを含む、ステム－ループ配列と、（ｂ）上述のガイド配列に対して５’に位置する第１の隣接領域と、（ｃ）上述のパッセンジャー配列に対して３’に位置する第２の隣接領域と、を含有するヌクレオチド配列を含む、発現カセットを提供する。
いくつかの実施形態において、上述の態様の発現カセットは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を含まない。いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号１～７７１の配列のうちのいずれか１つ以上と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号６８の配列と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号６８及び６４９の配列と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号６８及び６４９の配列と組み合わせた状態で、含まない。
別の態様において、本開示は、ステム－ループ配列を含むヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、ステム－ループ配列が、５’から３’へ、（ｉ）ガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的であるパッセンジャーヌクレオチド配列を含む５’ステム－ループアーム、（ｉｉ）ループ領域であって、マイクロＲＮＡループ配列を含む、ループ領域、（ｉｉｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０）、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するガイドヌクレオチド配列を含む３’ステム－ループアームを含む、発現カセットを提供する。いくつかの実施形態において、発現カセットは、第２のステム－ループ配列を更に含み、第２のステム－ループ配列が、５’から３’へ、（ｉ）第２のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第２のパッセンジャーヌクレオチド配列を含む第２の５’ステム－ループアーム、（ｉｉ）第２のループ領域であって、第２のマイクロＲＮＡループ配列を含む、第２のループ領域、（ｉｉｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０）、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する第２のガイドヌクレオチド配列を含む第２の３’ステム－ループアームを含む。いくつかの実施形態において、第１のステム－ループ配列及び第２のステム－ループ配列は、同一である。いくつかの実施形態において、第１のステム－ループ配列及び第２のステム－ループ配列は、異なっている。
別の態様において、本開示は、発現カセットであって、（ａ）ステム－ループ配列であって、５’から３’へ、（ｉ）ガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的であるパッセンジャーヌクレオチド配列を含む５’ステム－ループアーム、（ｉｉ）ループ領域であって、マイクロＲＮＡループ配列を含む、ループ領域、（ｉｉｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０）、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するガイドヌクレオチド配列を含む３’ステム－ループアームを含む、ステム－ループ配列、（ｂ）上述のガイド配列に対して５’に位置する第１の隣接領域、及び（ｃ）上述のパッセンジャー配列に対して３’に位置する第２の隣接領域を含む、ヌクレオチド配列を含む、発現カセットを提供する。いくつかの実施形態において、発現カセットは、更に、（ａ）第２のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、（ｉ）第２のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第２のパッセンジャーヌクレオチド配列を含む第２の５’ステム－ループアーム、（ｉｉ）第２のループ領域であって、第２のマイクロＲＮＡループ配列を含む、第２のループ領域、（ｉｉｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０）、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する第２のガイドヌクレオチド配列を含む第２の３’ステム－ループアームを含む、第２のステム－ループ配列と、（ｂ）上述の第２のガイド配列に対して５’に位置する第３の隣接領域と、（ｃ）上述の第２のパッセンジャー配列に対して３’に位置する第４の隣接領域と、を含む。いくつかの実施形態において、第１のステム－ループ配列及び第２のステム－ループ配列は、同一である。いくつかの実施形態において、第１のステム－ループ配列及び第２のステム－ループ配列は、異なっている。
上述の態様及び実施形態のいくつかの実施形態において、第１の隣接領域は、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、又は７６８のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第２の隣接領域は、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、又は７６９のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、第１の隣接領域は、５’スペーサー配列と、５’隣接配列と、を含む。いくつかの実施形態において、第２の隣接領域は、３’スペーサー配列と、３’隣接配列と、を含む。
いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡループ配列は、ｍｉＲ－３０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－２１８－１、又はｍｉＲ－１２４－３配列である。いくつかの実施形態において、マイクロＲＮＡループ配列は、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、又は７７０のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、発現カセットは、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、７ＳＫプロモーター、アポリポタンパク質Ｅ－ヒトアルファ１－アンチトリプシン（ＡｐｏＥ－ｈＡＡＴ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＣＫ８プロモーター、ｍＵ１ａプロモーター、伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーター、ヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、シナプシン（ＳＹＮ）プロモーター、ＲＮＡ結合Ｆｏｘ－１ホモログ３（ＲＢＦＯＸ３）プロモーター、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、血小板由来成長因子サブユニットβ（ＰＤＧＦβ）プロモーター、小胞グルタミン酸トランスポーター（ＶＧＡＴ）プロモーター、ソマトスタチン（ＳＳＴ）プロモーター、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）プロモーター、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）プロモーター、パルブアルブミン（ＰＶ）プロモーター、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）プロモーター、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６７（ＧＡＤ６７）プロモーター、ドーパミン受容体Ｄ１（ＤＲＤ１）プロモーター、ドーパミン受容体Ｄ２（ＤＲＤ２）プロモーター、補体Ｃ１ｑ様２（Ｃ１ＱＬ２）プロモーター、プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）プロモーター、プロスペロホメオボックス１（ＰＲＯＸ１）プロモーター、微小管関連タンパク質１Ｂ（ＭＡＰ１Ｂ）プロモーター、及びチューブリンアルファ１（Ｔ－α１／ＴＵＢＡ３）プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、発現カセットは、ＳＹＮプロモーター（例えば、ヒトＳＹＮプロモーター、例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ、又は配列番号６８２～６８２及び７９０のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）を含む。いくつかの実施形態において、発現カセットは、ＣＡＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ、又は配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）を含む。いくつかの実施形態において、発現カセットは、Ｃ１ＱＬ２プロモーター（例えば、配列番号７１９若しくは配列番号７９１、又は配列番号７１９若しくは配列番号７９１の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）を含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、２つ以上のステム－ループ配列に作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、プロモーターは、２つのステム－ループ配列（例えば、ベクター中にタンデムで存在する２つのステム－ループ配列）に作動可能に連結される。
いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号７７５、７７７、７７９、７８１、７８３～７８８、７９６、７９８～８０１、８０３、８０５、８０７、８０９、８１１、８１３、８１７、８１９、及び８２１のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号８０４、８０６、８０８、８１０、８１２、８１４、８１８、８２０、及び８２２のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するベクターに組み込まれる。
別の態様において、本開示は、発現カセットであって、５’から３’へ、（ａ）第１のプロモーター配列（例えば、本明細書に開示されるプロモーター配列のうちのいずれか１つ、例えば、表５に開示されるもの、例えば、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ）、ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）、又はＣ１ｑｌ２プロモーター（例えば、配列番号７１９、若しくは配列番号７９１）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）、（ｂ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し、第１のプロモーターに対して作動可能に連結される、第１のガイドヌクレオチド配列、（ｃ）任意選択的に、第２のプロモーター配列（例えば、本明細書に開示されるプロモーター配列のうちのいずれか１つ、例えば、表５に開示されるもの、例えば、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ）、ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）、又はＣ１ｑｌ２プロモーター（例えば、配列番号７１９、若しくは配列番号７９１）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）、（ｂ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する第２のガイドヌクレオチド配列を含み、任意選択的に、第２のガイドヌクレオチド配列が、第２のプロモーターに作動可能に連結される、発現カセットを提供する。いくつかの実施形態において、第１のガイド配列及び／又は第２のガイド配列は、Ｇ９配列（配列番号６８）、又はそれに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアントである。いくつかの実施形態において、第１のガイド配列及び／又は第２のガイド配列は、ＧＩ配列（配列番号７７）、又はそれに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアントである。いくつかの実施形態において、第１のガイド配列及び／又は第２のガイド配列は、ＭＷ配列（配列番号８０）、又はそれに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアントである。いくつかの実施形態において、第１のガイド配列及び／又は第２のガイド配列は、ＭＵ配列（配列番号９６）、又はそれに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアントである。いくつかの実施形態において、第１のガイド配列は、Ｇ９配列（配列番号６８）、又はそれに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアントであり、第２のガイド配列は、ＧＩ配列（配列番号７７）、又はそれに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアントである。いくつかの実施形態において、第１のガイド配列は、Ｇ９配列（配列番号６８）、又はそれに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアントであり、第２のガイド配列は、ＭＷ配列（配列番号８０）、又はそれに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアントである。いくつかの実施形態において、第１のガイド配列は、ＧＩ配列（配列番号７７）、又はそれに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアントであり、第２のガイド配列は、Ｇ９配列（配列番号６８）、又はそれに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアントである。いくつかの実施形態において、第１のガイド配列は、ＧＩ配列（配列番号７７）、又はそれに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアントであり、第２のガイド配列は、ＭＷ配列（配列番号８０）、又はそれに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアントである。
いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号７８５～７８８のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、第１のプロモーターは、ＳＹＮプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ、又はそれに対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアントであり、任意選択的に、第２のプロモーターは、ＣＡＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ、又はそれに対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアントである。
上述の態様のいくつかの実施形態において、発現カセットは、第１のガイドヌクレオチド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第１のパッセンジャーヌクレオチド配列を更に含み、第１のパッセンジャーヌクレオチド配列は、第１のガイドヌクレオチド配列に対して５’又は３’に位置する。
上述の態様のいくつかの実施形態において、発現カセットは、第２のガイドヌクレオチド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第２のパッセンジャーヌクレオチド配列を更に含み、第２のパッセンジャーヌクレオチド配列は、第２のガイドヌクレオチド配列に対して５’又は３’に位置する。
上述の態様のいくつかの実施形態において、発現カセットは、更に、第１のガイド配列に対して５’に位置する、第１の５’隣接領域（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、及び７６８のうちのいずれか１つ、又はそれに対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアントを含む。
上述の態様のいくつかの実施形態において、発現カセットは、第１のガイド配列に対して３’に位置する第１の３’隣接領域を更に含む。
上述の態様のいくつかの実施形態において、発現カセットは、第２のガイド配列に対して５’に位置する第２の５’隣接領域を更に含む。
上述の態様のいくつかの実施形態において、発現カセットは、第２のガイド配列に対して３’に位置する第２の３’隣接領域を更に含む。
上述の態様のいくつかの実施形態において、発現カセットは、第１のガイド配列と第１のパッセンジャー配列との間に位置する第１のループ領域を更に含み、第１のループ領域は、第１のマイクロＲＮＡループ配列（例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、及び７７０のうちのいずれか１つ、又はそれらに対して１、２、又は３個のヌクレオチド変化を有するそれらのバリアント）を含む。
上述の態様のいくつかの実施形態において、発現カセットは、第２のガイド配列と第２のパッセンジャー配列との間に位置する第２のループ領域を更に含み、第２のループ領域は、第２のマイクロＲＮＡループ配列（例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、及び７７０のうちのいずれか１つ、又はそれらに対して１、２、又は３個のヌクレオチド変化を有するそれらのバリアント）を含む。
別の態様において、本開示は、発現カセットであって、５’から３’へ、
（ａ）第１のプロモーター配列（例えば、本明細書に開示されるプロモーター配列のうちのいずれか１つ、例えば、表５に開示されるもの、例えば、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ）、ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）、又はＣ１ｑｌ２プロモーター（例えば、配列番号７１９、若しくは配列番号７９１）、又はそれに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアント）、
（ｂ）第１のパッセンジャーヌクレオチド配列に対して５’に位置する第１の５’隣接領域（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、及び７６８のうちのいずれか１つ、又はそれに対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアント）、
（ｃ）第１のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、
（ｉ）第１のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第１のパッセンジャーヌクレオチド配列を含む、第１の５’ステム－ループアーム、
（ｉｉ）第１のループ領域であって、第１のマイクロＲＮＡループ配列を含む、第１のループ領域（例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、及び７７０のうちのいずれか１つ、又はそれらに対して１、２、又は３個のヌクレオチド変化を有するそれらのバリアント）、
（ｉｉｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する第１のガイドヌクレオチド配列を含む第１の３’ステム－ループアームを含む、第１のステム－ループ配列、
（ｄ）上述の第１のガイドヌクレオチド配列に対して３’に位置する第１の３’隣接領域（例えば、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、及び７６９のうちのいずれか１つ、又はそれらに対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）、
（ｅ）任意選択的に、第２のプロモーター配列（例えば、本明細書に開示されるプロモーター配列のうちのいずれか１つ、例えば、表５に開示されるもの、例えば、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ）、ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）、又はＣ１ｑｌ２プロモーター（例えば、配列番号７１９、若しくは配列番号７９１）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）、
（ｆ）第２のパッセンジャーヌクレオチド配列に対して５’に位置する第２の５’隣接領域（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、及び７６８のうちのいずれか１つ、又はそれらに対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）、
（ｇ）第２のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、
（ｉ）第２のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第２のパッセンジャーヌクレオチド配列を含む、第２の５’ステム－ループアーム、（ｉｉ）第２のループ領域であって、第２のマイクロＲＮＡループ配列（例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、及び７７０のうちのいずれか１つ、又はそれらに対して１、２、又は３個のヌクレオチド変化を有するそれらのバリアント）を含む、第２のループ領域、
（ｉｉｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する第２のガイドヌクレオチド配列を含む、第２の３’ステム－ループアームを含む、第２のステム－ループ配列、
並びに
（ｈ）上述の第２のガイドヌクレオチド配列に対して３’に位置する第２の３’隣接領域（例えば、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、及び７６９のうちのいずれか１つ）を含む、ヌクレオチド配列を含む、発現カセットを提供する。
いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号７８５、７８７、及び７８８のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。
別の態様において、本開示は、発現カセットであって、５’から３’へ、
（ａ）第１のプロモーター配列（例えば、本明細書に開示されるプロモーター配列のうちのいずれか１つ、例えば、表５に開示されるもの、例えば、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ）、ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）、又はＣ１ｑｌ２プロモーター（例えば、配列番号７１９、若しくは配列番号７９１）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）、
（ｂ）第１のパッセンジャーヌクレオチド配列に対して５’に位置する第１の５’隣接領域（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、及び７６８のうちのいずれか１つ）、
（ｃ）第１のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、
（ｉ）第１のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第１のパッセンジャーヌクレオチド配列を含む、第１の５’ステム－ループアーム、
（ｉｉ）第１のループ領域であって、第１のマイクロＲＮＡループ配列を含む、第１のループ領域（例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、及び７７０のうちのいずれか１つ）、
（ｉｉｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する第１のガイドヌクレオチド配列を含む、第１の３’ステム－ループアームを含む、第１のステム－ループ配列、
（ｄ）上述の第１のガイドヌクレオチド配列に対して３’に位置する第１の３’隣接領域（例えば、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、及び７６９のうちのいずれか１つ）、
（ｅ）任意選択的に、第２のプロモーター配列（例えば、本明細書に開示されるプロモーター配列のうちのいずれか１つ、例えば、表５に開示されるもの、例えば、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ）、ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）、又はＣ１ｑｌ２プロモーター（例えば、配列番号７１９、若しくは配列番号７９１）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）、
（ｆ）第２のガイドヌクレオチド配列に対して５’に位置する第２の５’隣接領域（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、及び７６８のうちのいずれか１つ）、
（ｇ）第２のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、
（ｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するガイドヌクレオチド配列を含む、第２の５’ステム－ループアーム、
（ｉｉ）第２のループ領域であって、第２のマイクロＲＮＡループ配列（例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、及び７７０のうちのいずれか１つ）を含む、第２のループ領域、
（ｉｉｉ）第２のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第２のパッセンジャーヌクレオチド配列を含む、第２の３’ステム－ループアームを含む、第２のステム－ループ配列、
並びに
（ｈ）上述の第２のパッセンジャーヌクレオチド配列に対して３’に位置する第２の３’隣接領域（例えば、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、及び７６９のうちのいずれか１つ）を含む、ヌクレオチド配列を含む、発現カセットを提供する。
別の態様において、本開示は、発現カセットであって、５’から３’へ、
（ａ）第１のプロモーター配列（例えば、本明細書に開示されるプロモーター配列のうちのいずれか１つ、例えば、表５に開示されるもの、例えば、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ）、ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）、又はＣ１ｑｌ２プロモーター（例えば、配列番号７１９、若しくは配列番号７９１）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）、
（ｂ）第１のガイドヌクレオチド配列に対して５’に位置する第１の５’隣接領域（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、及び７６８のうちのいずれか１つ）、
（ｃ）第１のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、
（ｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する第１のガイドヌクレオチド配列を含む、第１の５’ステム－ループアーム、
（ｉｉ）第１のループ領域であって、第１のマイクロＲＮＡループ配列を含む、第１のループ領域（例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、及び７７０のうちのいずれか１つ）、
（ｉｉｉ）第１のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第１のパッセンジャーヌクレオチド配列を含む、第１の３’ステム－ループアームを含む、第１のステム－ループ配列、
（ｄ）上述の第１のパッセンジャーヌクレオチド配列に対して３’に位置する第１の３’隣接領域（例えば、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、及び７６９のうちのいずれか１つ）、
（ｅ）任意選択的に、第２のプロモーター配列（例えば、本明細書に開示されるプロモーター配列のうちのいずれか１つ、例えば、表５、例えば、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ）、ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）、又はＣ１ｑｌ２プロモーター（例えば、配列番号７１９、若しくは配列番号７９１）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）、
（ｆ）第２のパッセンジャーヌクレオチド配列に対して５’に位置する第２の５’隣接領域（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、及び７６８のうちのいずれか１つ）、
（ｇ）第２のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、
（ｉ）第２のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第２のパッセンジャーヌクレオチド配列を含む、第２の５’ステム－ループアーム、
（ｉｉ）第２のループ領域であって、第２のマイクロＲＮＡループ配列（例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、及び７７０のうちのいずれか１つ）を含む、第２のループ領域、
（ｉｉｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する第２のガイドヌクレオチド配列を含む、第２の３’ステム－ループアームを含む、第２のステム－ループ配列、
並びに
（ｈ）上述の第２のガイドヌクレオチド配列に対して３’に位置する第２の３’隣接領域（例えば、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、及び７６９のうちのいずれか１つ）を含む、ヌクレオチド配列を含む、発現カセットを提供する。
いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号７８６の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。
別の態様において、本開示は、発現カセットであって、５’から３’へ、
（ａ）第１のプロモーター配列（例えば、本明細書に開示されるプロモーター配列のうちのいずれか１つ、例えば、表５に開示されるもの、例えば、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ）、ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）、又はＣ１ｑｌ２プロモーター（例えば、配列番号７１９、若しくは配列番号７９１）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）、
（ｂ）第１のガイドヌクレオチド配列に対して５’に位置する第１の５’隣接領域（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、及び７６８のうちのいずれか１つ）、
（ｃ）第１のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、
（ｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する第１のガイドヌクレオチド配列を含む、第１の５’ステム－ループアーム、
（ｉｉ）第１のループ領域であって、第１のマイクロＲＮＡループ配列を含む、第１のループ領域（例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、及び７７０のうちのいずれか１つ）、
（ｉｉｉ）第１のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第１のパッセンジャーヌクレオチド配列を含む、第１の３’ステム－ループアームを含む、第１のステム－ループ配列、
（ｄ）上述の第１のパッセンジャーヌクレオチド配列に対して３’に位置する第１の３’隣接領域（例えば、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、及び７６９のうちのいずれか１つ）、
（ｅ）任意選択的に、第２のプロモーター配列（例えば、本明細書に開示されるプロモーター配列のうちのいずれか１つ、例えば、表５に開示されるもの、例えば、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ）、ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）、又はＣ１ｑｌ２プロモーター（例えば、配列番号７１９、若しくは配列番号７９１）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）、
（ｆ）第２のガイドヌクレオチド配列に対して５’に位置する第２の５’隣接領域（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、及び７６８のうちのいずれか１つ）、
（ｇ）第２のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、
（ｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するガイドヌクレオチド配列を含む、第２の５’ステム－ループアーム、
（ｉｉ）第２のループ領域であって、第２のマイクロＲＮＡループ配列（例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、及び７７０のうちのいずれか１つ）を含む、第２のループ領域、
（ｉｉｉ）第２のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第２のパッセンジャーヌクレオチド配列を含む、第２の３’ステム－ループアームを含む、第２のステム－ループ配列、
並びに
（ｈ）上述の第２のパッセンジャーヌクレオチド配列に対して３’に位置する第２の３’隣接領域（例えば、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、及び７６９のうちのいずれか１つ）を含む、ヌクレオチド配列を含む、発現カセットを提供する。
いくつかの実施形態において、第１のプロモーター及び／又は、任意選択的に、第２のプロモーターは、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、７ＳＫプロモーター、アポリポタンパク質Ｅ－ヒトアルファ１－アンチトリプシンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＣＫ８プロモーター、ｍＵ１ａプロモーター、伸長因子１αプロモーター、ＨＳＶプロモーター、チロキシン結合グロブリンプロモーター、シナプシンプロモーター、ＲＮＡ結合Ｆｏｘ－１ホモログ３プロモーター、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩプロモーター、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、血小板由来成長因子サブユニットβ、小胞グルタミン酸トランスポータープロモーター、ソマトスタチンプロモーター、神経ペプチドＹプロモーター、血管作動性腸管ペプチドプロモーター、パルブアルブミンプロモーター、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５プロモーター、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６７プロモーター、ドーパミン受容体Ｄ１プロモーター、ドーパミン受容体Ｄ２プロモーター、補体Ｃ１ｑ様２プロモーター、プロオピオメラノコルチンプロモーター、プロスペロホメオボックス１プロモーター、微小管関連タンパク質１Ｂプロモーター、及びチューブリンアルファ１プロモーターからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、第１のプロモーターは、ＳＹＮプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ、又はそれに対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアントであり、任意選択的に、第２のプロモーターは、ＣＡＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ、又はそれに対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアントである。
いくつかの実施形態において、第１の５’隣接領域及び／又は第２の５’隣接領域は、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、及び７６８のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第１の５’隣接領域及び／又は第２の５’隣接領域は、７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、及び７６８の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、第１の３’隣接領域及び／又は第２の３’隣接領域は、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、及び７６９のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第１の３’隣接領域及び／又は第２の３’隣接領域は、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、及び７６９のうちのいずれか１つの核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、第１のマイクロＲＮＡループ配列及び／又は第２のマイクロＲＮＡループ配列は、ｍｉＲ－３０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－２１８－１、又はｍｉＲ－１２４－３配列である。いくつかの実施形態において、第１のマイクロＲＮＡループ配列及び／又は第２のマイクロＲＮＡループ配列は、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、及び７７０のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第１のマイクロＲＮＡループ配列及び／又は第２のマイクロＲＮＡループ配列は、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、及び７７０のうちのいずれか１つの核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、発現カセットは、上述の発現カセットの５’末端上の５’末端逆位反復（ＩＴＲ）配列と、上述の発現カセットの３’末端上の３’－ＩＴＲ配列と、を含む。いくつかの実施形態において、５’－ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２の５’－ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列である。いくつかの実施形態において、５’－ＩＴＲ配列は、配列番号７４６、又は配列番号７４７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、５’－ＩＴＲ配列は、配列番号７４６、又は配列番号７４７の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、３’－ＩＴＲ配列は、核酸配列配列番号７４８、配列番号７４９、又は配列番号７８９に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、３’－ＩＴＲ配列は、核酸配列配列番号７４８、配列番号７４９、又は配列番号７８９を有するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、発現カセットは、エンハンサー配列を更に含む。いくつかの実施形態において、エンハンサー配列は、配列番号７４５の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、エンハンサー配列は、配列番号７４５の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、発現カセットは、イントロン配列を更に含む。いくつかの実施形態において、イントロン配列は、配列番号７４３、又は配列番号７４４の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、イントロン配列は、配列番号７４３、又は配列番号７４４の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、発現カセットは、１つ以上のポリアデニル化シグナルを更に含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のポリアデニル化シグナルは、ウサギベータ－グロビン（ＲＢＧ）ポリアデニル化シグナルである。いくつかの実施形態において、ＲＢＧポリアデニル化シグナルは、配列番号７５０、配列番号７５１、又は配列番号７９２の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＲＢＧポリアデニル化シグナルは、配列番号７５０、配列番号７５１、又は配列番号７９２の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルである。いくつかの実施形態において、ＢＧＨポリアデニル化シグナルは、配列番号７９３の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ＢＧＨポリアデニル化シグナルは、配列番号７９３の核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、上述の態様及び実施形態の発現カセットは、上述の態様及び実施形態のベクターに組み込まれる。
いくつかの実施形態において、上述の態様の発現カセットは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を含まない。いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号１～７７１の配列のうちのいずれか１つ以上と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号６８の配列と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、発現カセットは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を、配列番号６８及び６４９の配列と組み合わせた状態で、含まない。
いくつかの実施形態において、発現カセットは、１つ以上の（例えば、１、２、又はそれより多くの）スタッファー配列を更に含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のスタッファー配列は、発現カセットの３’末端に配置されている。いくつかの実施形態において、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号８１５の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号８１５の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９１％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号８１５の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号８１５の核酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号８１５の核酸配列を有する。いくつかの実施形態において、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号８１６の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号８１６の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９１％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号８１６の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号８１６の核酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号８１６の核酸配列を有する。
別の態様において、本開示は、細胞においてＧｒｉｋ２発現を阻害する方法であって、本方法が、細胞を、上述の態様及び実施形態の少なくとも１つのポリヌクレオチド、上述の態様及び実施形態のベクター、又は上述の態様及び実施形態の発現カセットと接触させることを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズし、細胞においてＧｒｉｋ２の発現を阻害するか、又は減少させる。いくつかの実施形態において、本方法は、細胞におけるＧｒｉｋ２のレベルを減少させる。いくつかの実施形態において、本方法は、細胞におけるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのレベルを、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡにハイブリダイズすることができない対照ポリヌクレオチドで処理された細胞におけるＧｌｕＫ２タンパク質のレベルと比較して、又はポリヌクレオチドで処理されていない細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％減少させる。いくつかの実施形態において、本方法は、細胞におけるＧｌｕｋ２タンパク質のレベルを減少させる。いくつかの実施形態において、本方法は、細胞におけるＧｌｕＫ２タンパク質のレベルを、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡにハイブリダイズすることができない対照ポリヌクレオチドで処理された細胞におけるＧｌｕＫ２タンパク質のレベルと比較して、又はポリヌクレオチドで処理されていない細胞と比較して、少なくとも１０％、少なくとも少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％減少させる。
いくつかの実施形態において、細胞は、ニューロンである。いくつかの実施形態において、ニューロンは、海馬ニューロンである。いくつかの実施形態において、海馬ニューロンは、ＤＧＣである。いくつかの実施形態において、ＤＧＣは、異常な再発性苔状線維軸索を含む。細胞はまた、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、例えば、Ｇｒｉｋ２を発現するｉＰＳＣ由来のグルタミン酸作動性ニューロンに由来する神経細胞であり得る。
いくつかの実施形態において、上述の態様の方法は、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列の使用を含まない。いくつかの実施形態において、本方法は、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列の使用を、配列番号１～７７１の配列のうちのいずれか１つ以上と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、本方法は、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列の使用を、配列番号６８の配列と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、本方法は、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列の使用を、配列番号６８及び配列番号６４９の配列と組み合わせた状態で、含まない。
別の態様において、本開示は、障害を治療又は緩和することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、本方法が、対象に、上述の態様及び実施形態の少なくとも１つのポリヌクレオチド、上述の態様及び実施形態のベクター、又は上述の態様及び実施形態の発現カセット（例えば、配列番号７７５、７７７、７７９、７８１、７８３～７８８、７９６、７９８～８０１、８０３、８０５、８０７、８０９、８１１、８１３、８１７、８１９、及び８２１のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む発現カセット）を投与することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、障害は、てんかんである。いくつかの実施形態において、てんかんは、側頭葉てんかん（ＴＬＥ）、慢性てんかん、及び／又は難治性てんかんである。いくつかの実施形態において、てんかんは、ＴＬＥである。いくつかの実施形態において、ＴＬＥは、外側ＴＬＥ（ｌＴＬＥ）である。いくつかの実施形態において、ＴＬＥは、内側ＴＬＥ（ｍＴＬＥ）である。
上述の実施形態のうちの１つ以上、又は各々において、対象は、ヒトである。
いくつかの実施形態において、上述の態様の方法は、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列の投与を含まない。いくつかの実施形態において、本方法は、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列の投与を、配列番号１～７７１の配列のうちのいずれか１つ以上と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列の投与を、配列番号６８の配列と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列の投与を、配列番号６８及び配列番号６４９の配列と組み合わせた状態で、含まない。
別の態様において、本開示は、上述の態様及び実施形態のポリヌクレオチド、上述の態様及び実施形態のベクター、又は上述の態様及び実施形態の発現カセットと、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤と、を含む、薬学的組成物を提供する。
いくつかの実施形態において、上述の態様の薬学的組成物は、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を有するポリヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を有するポリヌクレオチドを、配列番号１～７７１の配列のうちのいずれか１つ以上と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を有するポリヌクレオチドを、配列番号６８の配列と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を有するポリヌクレオチドを、配列番号６８及び配列番号６４９の配列と組み合わせた状態で、含まない。
別の態様において、本開示は、上述の態様の薬学的組成物と、添付文書と、を含む、キットを提供する。いくつかの実施形態において、添付文書は、上述の態様及び実施形態の方法において薬学的組成物を使用するための説明書を含む。
いくつかの実施形態において、上述の態様のキットは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を有するポリヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態において、キットは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を有するポリヌクレオチドを、配列番号１～７７１の配列のうちのいずれか１つ以上と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、キットは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を有するポリヌクレオチドを、配列番号６８の配列と組み合わせた状態で、含まない。いくつかの実施形態において、キットは、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの配列を有するポリヌクレオチドを、配列番号６８及び配列番号６４９の配列と組み合わせた状態で、含まない。
定義
簡便のために、本明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲で使用されるいくつかの用語及び語句の意味を以下に提供する。別段の定めがない限り、又は内容から暗に示されない限り、以下の用語及び語句は、以下に提供される意味を含む。定義は、特定の実施形態を記載する際の補助となるように提供されるものであり、請求される技術を限定することを意図したものではない。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本技術が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。当該技術分野でのある用語の使用と、本明細書で提供されるその定義との間に明らかな矛盾がある場合、本明細書内で提供される定義が優先する。
本明細書において、文脈から別様に明確でない限り、（ｉ）「１つの（ａ）」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されてもよく、（ｉｉ）「又は」という用語は、「及び／又は」を意味すると理解されてもよく、（ｉｉｉ）「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、それら自体によって表されるか、又は１つ以上の追加の構成要素若しくはステップと合わせて、箇条書きされた構成要素若しくはステップを包含すると理解されてもよい。
「約」という用語は、引用されている値の±１０％である量を指し、引用されている値の±５％、又は引用されている値の±２％であってもよい。
「３’非翻訳領域」及び「３’ＵＴＲ」という用語は、ｍＲＮＡ分子（例えば、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ）の終止コドンに対して３’の領域を指す。３’ＵＴＲは、タンパク質へと翻訳されないが、ｍＲＮＡ転写産物のポリアデニル化、局在化、安定化、及び／又は翻訳効率にとって重要な調節配列を含む。３’ＵＴＲ中の調節配列は、エンハンサー、サイレンサー、ＡＵリッチ要素、ポリＡテール、ターミネーター、及びマイクロＲＮＡ認識配列を含み得る。「３’非翻訳領域」及び「３’ＵＴＲ」という用語はまた、ｍＲＮＡ分子をコードする遺伝子の対応する領域を指し得る。
「５’非翻訳領域」及び「５’ＵＴＲ」という用語は、開始コドンに対して５’であるｍＲＮＡ分子（例えば、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ）の領域を指す。この領域は、翻訳開始の調節にとって重要である。５’ＵＴＲは、完全に非翻訳性である場合があり、又はいくつかの生物において、その領域のいくつかが翻訳され得る。転写開始部位は、５’ＵＴＲの開始をマーキングし、開始コドンの前の１個のヌクレオチドで終了する。真核生物において、５’ＵＴＲは、開始コドンを保有するコザックコンセンサス配列を含む。５’ＵＴＲは、翻訳の調節にとって重要である上流のオープンリーディングフレームとしても知られているシス作用性調節要素を含み得る。この領域はまた、上流のＡＵＧコドン及び終止コドンを保有し得る。その高いＧＣ含有量を考慮すると、５’ＵＴＲは、翻訳の調節において役割を果たすヘアピンループ等の二次構造を形成し得る。「投与」という用語は、任意の効果的な経路によって、療法剤（例えば、本明細書に開示されるように、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、又はそれをコードするベクター）を対象に提供するか、又は与えることを指す。例示的な投与経路は、本明細書及び以下に記載される（例えば、脳室内注射、髄腔内注射、実質内注射、静脈内注射、及び定位注射）。
「アデノ随伴ウイルスベクター」又は「ＡＡＶベクター」という用語は、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ＥＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ－ＴＴ、ＡＡＶ－ＤＪ８、又はＡＡＶ．ＨＳＣ１６を含む、アデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターを指す。ＡＡＶベクターは、全体的に、又は一部分（例えば、ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子）が欠失しているが、機能的隣接ＩＴＲ配列を保持する、ＡＡＶ野生型遺伝子のうちの１つ以上を有し得る。機能的ＩＴＲ配列は、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製、及びパッケージングを促進する。したがって、ＡＡＶベクターは、ウイルスの複製及びパッケージングのためにシスで必要とされるその配列（例えば、機能的ＩＴＲ）を少なくとも含むと本明細書で定義される。ＩＴＲは、野生型ポリヌクレオチド配列である必要はなく、その配列が、機能的レスキュー、複製、及びパッケージングを提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換によって改変され得る。ＡＡＶ発現ベクターは、既知の技術を使用して構築され、少なくとも、転写、転写開始領域を含む制御要素、目的のＤＮＡ（例えば、本開示のＡＳＯ剤をコードするポリヌクレオチド）、及び転写終止領域の方向に作動可能に連結された構成要素として提供する。
「アデノ随伴ウイルス末端逆位反復」及び「ＡＡＶ ＩＴＲ」という用語は、ＤＮＡ複製の起源として、また、ウイルスのためのパッケージングシグナルとして合わせてシスで機能するＡＡＶゲノムの各末端に隣接する、当該技術分野で認識されている領域を指す。ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ ｒｅｐコード領域と合わせて、効率的な切除、及び哺乳動物ゲノム内の２つの隣接ＩＴＲの間を中断するポリヌクレオチド配列のインテグレーションを提供する。ＡＡＶ ＩＴＲ領域のポリヌクレオチド配列は、知られている。本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、必ずしも野生型ポリヌクレオチド配列を含まず、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換によって改変され得る。それに加えて、ＡＡＶ ＩＴＲは、限定されないが、特にＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ＥＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ－ＴＴ、ＡＡＶ－ＤＪ８、又はＡＡＶ．ＨＳＣ１６を含む様々なＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。更に、ＡＡＶベクター中の選択されたポリヌクレオチド配列に隣接する５’及び３’ＩＴＲは、これらが、例えば、宿主細胞ゲノム又はベクターからの目的の配列の切除及びレスキューを可能にし、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞中に存在する場合にレシピエント細胞ゲノムへの異種配列のインテグレーションを可能にすることを意図するように機能する限り、同一、又は同じＡＡＶ血清型又は単離物に由来する必要はない。それに加えて、ＡＡＶ ＩＴＲは、限定されないが、特に、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ＥＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ－ＴＴ、ＡＡＶ－ＤＪ８、又はＡＡＶ．ＨＳＣ１６を含む様々なＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」及び「ＡＳＯ」という用語は、標的ｍＲＮＡ分子（例えば、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ）との相補的な塩基対形成によってハイブリダイズすることができ、ｍＲＮＡの不安定化及び分解、又は翻訳の阻害によって、その発現を阻害することができる、オリゴヌクレオチドを指す。ＡＳＯの非限定的な例としては、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。
「ｃＤＮＡ」という用語は、ｍＲＮＡ配列のＤＮＡ等価物である核酸配列（すなわち、チミジンで置換されたウリジンを有する）を指す。一般に、ｃＤＮＡ及びｍＲＮＡという用語は、当業者が、ｃＤＮＡ配列が、ウリジンがチミジンとして読み取られることを除き、ｍＲＮＡ配列と同じであることを理解しているため、特定の遺伝子（例えば、Ｇｒｉｋ２遺伝子）を参照する際に相互に置き換え可能に使用され得る。
「コード配列」という用語は、タンパク質又はその一部をコードするｍＲＮＡ分子の核酸配列に対応する。これに関連して、「非コード配列」は、タンパク質又はその一部をコードしないｍＲＮＡ分子の核酸配列に対応する。非コード配列の非限定的な例としては、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、イントロン、ポリＡテール、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、及び他のシス調節配列が挙げられる。
「相補的」という用語は、第２のヌクレオチド又はヌクレオシド配列に関連して第１のヌクレオチド又はヌクレオシドを記載するために使用される場合、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと含む特定の条件下でハイブリダイズし、二本鎖構造を形成する能力を指す。かかる条件は、例えば、ストリンジェントな条件であってもよく、ストリンジェントな条件は、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．４）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃、又は７０℃で１２～１６時間、その後、洗浄を含み得る（例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。他の条件、例えば、生物の内側で直面し得るような生理学的に関連する条件を適用し得る。ハイブリダイズされたヌクレオチド又はヌクレオシドの究極の適用に従う２つの配列の相補性の試験に最も適した条件のセットを決定するための方法は、当該技術分野でよく知られている。
「相補的な」配列は、本明細書で使用される場合、そのハイブリダイズする能力に関する上述の要求が満たされる限り、非ワトソンクリック塩基対、及び／又は非天然の代替的なヌクレオチドから形成される塩基対も含んでもよく、又は全体的にそれらから形成されてもよい。かかる非ワトソンクリック塩基対としては、限定されないが、Ｇ：Ｕゆらぎ、又はフーグスティーン型塩基対形成が挙げられる。本明細書に記載のオリゴヌクレオチドと標的配列との間の相補的な配列は、一方又は両方のヌクレオチド配列の全長にわたる、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドに対する、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの塩基対形成を含む。かかる配列は、本明細書において、お互いに対して「完全に相補的で」あると呼ばれる場合がある。第１の配列が、本明細書の第２の配列に関して「実質的相補的である」と称される場合、その２つの配列は、完全に相補的であってもよく、又はほとんどがその究極の用途に関連する条件下でハイブリダイズする（例えば、ｍＲＮＡ、例えばＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ）に結合し、その発現を阻害する）能力を保持しつつ、最大３０個の塩基対の二本鎖の場合、ハイブリダイズすると１個以上であるが、一般的には１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個以下のミスマッチ塩基対を形成し得る。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列が、目的のｍＲＮＡの非中断部分に対して実質的に相補的である場合、その目的のｍＲＮＡの少なくとも一部に対して相補的である。
「相補性を有する領域」という用語は、内因性遺伝子（例えば、Ｇｒｉｋ２）の発現と干渉するように、遺伝子、一次転写産物、配列（例えば、標的配列）、又はプロセシングされたｍＲＮＡの全て又は一部に対して実質的に相補的であるオリゴヌクレオチド上の領域を指す。相補性を有する領域が、標的配列に対して完全に相補的ではない場合、ミスマッチは、分子の内部領域又は末端領域にあり得る。一般に、最も許容されるミスマッチは、末端領域（例えば、オリゴヌクレオチドの５’末端及び／又は３’末端の５、４、３、又は２個のヌクレオチド内）にある。
「保存的アミノ酸置換」、「保存的置換」、及び「保存的変異」という用語は、１つ以上のアミノ酸を、同様の物理化学的特性（例えば、極性、静電量、及び立体障害体積）を示す１つ以上の異なるアミノ酸に置換することを指す。これらの特性は、以下の表１に２０種類の天然に存在するアミノ酸の各々についてまとめられている。
この表から、保存的アミノ酸置換ファミリーには、（ｉ）Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ及びＩ、（ｉｉ）Ｄ及びＥ、（ｉｉｉ）Ｃ、Ｓ及びＴ、（ｉｖ）Ｈ、Ｋ及びＲ、（ｖ）Ｎ及びＱ、並びに（ｖｉ）Ｆ、Ｙ及びＷが含まれることが理解される。したがって、保存的変異又は置換は、１つのアミノ酸を、同じアミノ酸ファミリーのメンバーに置換したもの（例えば、ＳｅｒをＴｈｒに、又はＬｙｓをＡｒｇに置換したものである。
「細胞をオリゴヌクレオチドと接触させる」（例えば、本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド）という語句は、任意の可能な手段によって細胞と接触させることを含む。細胞をオリゴヌクレオチドと接触させることは、細胞をインビトロでオリゴヌクレオチドと接触させること、又は細胞をインビボでオリゴヌクレオチドと接触させることを含む。細胞をオリゴヌクレオチドと接触させることはまた、細胞を、ポリヌクレオチドをコードする核酸ベクター、又はそれを含有する薬学的組成物と接触させることを指し得る。接触させることは、直接的又は間接的に行われ得る。したがって、例えば、オリゴヌクレオチドは、本方法を個々に行うことによって細胞と物理的に接触させてもよく、又は代替的に、オリゴヌクレオチド剤は、その後で細胞との接触を可能にするか、又は引き起こす状況に置かれてもよい。細胞をインビトロで接触させることは、例えば、細胞をオリゴヌクレオチドとともにインキュベートすることによって行われ得る。細胞をインビボで接触させることは、例えば、オリゴヌクレオチドを、細胞が位置する組織の内部若しくは付近に注射することによって、又はオリゴヌクレオチド剤を、別の領域（例えば、血流若しくは皮下の空間）に注射することによって行われてもよく、その結果、上述の薬剤が、その後に、接触される細胞が位置する組織に到達する。接触するインビトロ法及びインビボ法の組み合わせも可能である。例えば、また、細胞をインビトロでオリゴヌクレオチドと接触させ、その後に、対象へと移植してもよい。
細胞をオリゴヌクレオチドと接触させることは、細胞への取り込み又は吸収を容易にすることによって、又はそれを行うことによって、「導入する」か、又は「細胞にオリゴヌクレオチドを送達すること」を含む。オリゴヌクレオチドの吸収又は取り込みは、独力での拡散、又は活性細胞プロセスによって、又は補助剤若しくはデバイスによって行うことができる。細胞へオリゴヌクレオチドを導入することは、インビトロ及び／又はインビボであり得る。例えば、インビボ導入のために、オリゴヌクレオチドは、組織部位に注射されてもよく、又は全身投与されてもよい。細胞へのインビトロ導入は、エレクトロポレーション及びリポフェクション等の当該技術分野で知られる方法を含む。別の例において、オリゴヌクレオチドは、形質導入によって、例えば、ポリヌクレオチドをコードするウイルスベクターによって、細胞へと導入することができる。ウイルスベクターは、コードされたポリヌクレオチドを発現させるために、細胞プロセシング（例えば、細胞内在化、カプシドシェディング、ポリヌクレオチドの転写、並びにＤｒｏｓｈａ及びＤｉｃｅｒによるプロセシング）を受け得る。更なるアプローチは、本明細書で以下に記載されるか、及び／又は当該技術分野で知られている。
ある遺伝子（例えば、Ｇｒｉｋ２）に関して、「～の発現を破壊する」、「～の発現を阻害する」、又は「～の発現を減少させる」という用語は、機能的遺伝子産物（例えば、ＧｌｕＫ２タンパク質）の形成を防止すること、又は減少させることを指す。遺伝子産物は、その通常の（野生型の）機能を充足する場合に、機能的である。ある遺伝子の発現の破壊は、その遺伝子によってコードされる機能的タンパク質の発現を防止するか、又は減少させる。遺伝子発現は、例えば、干渉ＲＮＡ分子（例えば、ＡＳＯ）、例えば、本明細書に記載されるものを使用することによって破壊され得る。
本明細書に記載の組成物、ベクター構築物、又はウイルスベクターの「有効量」、「治療有効量」、及び「十分な量」という用語は、対象（哺乳動物を含む、例えばヒト）に投与される場合、臨床結果を含め、有益又は所望の結果を生じさせるのに十分な量を指す。そのように、「有効量」、又はその類義語は、適用される文脈に依存して変わる。例えば、側頭葉てんかん（ＴＬＥ）を治療するという文脈において、有効量は、ある組成物、ベクター構築物、又はウイルスベクターを投与せずに得られた応答と比較して、治療応答を達成するのに十分な、その組成物、ベクター構築物、又はウイルスベクターの量である。このような量に対応する本明細書に記載の所与の組成物の量は、例えば、所与の薬剤、薬学的製剤、投与経路、疾患若しくは障害の種類及びその重症度、対象の属性（例えば、年齢、性別、体重）、治療される宿主、及び／又はてんかんの場合において、てんかん性病巣のサイズ（例えば、脳体積）等の様々な因子に応じて変化する場合があるが、そうではなく当該技術分野でよく知られている方法に従って決定することもできる。また、本明細書で使用される場合、本開示の組成物、ベクター構築物、又はウイルスベクターの「治療有効量」は、対照と比較して、対象における有益又は所望の結果を生じさせる量である。本明細書で定義される場合、本開示の組成物、ベクター構築物、ウイルスベクター、又は細胞の治療有効量は、本明細書に記載される方法等の当該技術分野で知られている方法によって容易に決定され得る。投薬計画は、適切なエンドポイント療法応答（例えば、治療される対象におけるてんかん性発作の発生の統計的に有意な減少）を提供するために調節され得る。
「てんかん」という用語は、再発性てんかん性発作を伴い臨床的に存在する１つ以上の神経学的障害を指す。てんかんは、Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｅａｇｕｅ Ａｇａｉｎｓｔ Ｅｐｉｌｅｐｓｙ（ＩＬＡＥ、Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０）に従って、電気臨床的な症候群に従って分類することができる。これらの症候群は、発症時の年齢、明確な特定症候群（術後症候群）、及び構造的代謝的原因、例えば、以下によってカテゴリー分けすることができる。（Ａ）発症時の年齢：（ｉ）新生児期は、良性家族性新生児てんかん（ＢＦＮＥ）、早期ミオクロニー脳症（ＥＭＥ）、大田原症候群を含み、（ｉｉ）幼少期は、移行する焦点起始てんかん発作を伴う幼児のてんかん、ウエスト症候群、幼児におけるミオクロニーてんかん（ＭＥＩ）、良性点頭てんかん、良性家族性点頭てんかん、ドラベ症候群、非進行性障害におけるミオクロニー脳症を含み、（ｉｉｉ）小児期は、熱性てんかん発作プラス（ＦＳ＋）、パナイトポーラス症候群、ミオクロニー脱力（以前は脱力）発作を伴うてんかん、中心側頭棘波を伴う良性てんかん（ＢＥＣＴＳ）、常染色体優性夜間前頭葉てんかん（ＡＤＮＦＬＥ）、遅発性小児後頭葉てんかん（ガストー型）、ミオクロニー欠神てんかん、レノックス・ガストー症候群、睡眠時の連続性棘徐波を伴うてんかん性脳症（ＣＳＷＳ）、ランドウ・クレフナー症候群（ＬＫＳ）、小児欠神てんかん（ＣＡＥ）を含み、（ｉｖ）青年／成人期は、若年性欠神てんかん（ＪＡＥ）若年性ミオクロニーてんかん（ＪＭＥ）、全般強直間代発作のみを伴うてんかん、進行性ミオクローヌスてんかん（ＰＭＥ）、聴覚的特徴を伴う常染色体優性てんかん（ＡＤＥＡＦ）、他の家族性側頭葉てんかんを含み、（ｖ）様々な年齢での発症は、様々な病巣を伴う家族性焦点てんかん（小児から成人まで）、反射てんかんを含み、（Ｂ）明確な特定症候群（術後症候群）は、内側側頭葉てんかん（ＭＴＬＥ）、ラスムッセン症候群、視床下部過誤腫を伴う笑い発作、片側けいれん片麻痺てんかんを含み、（Ｃ）構造的代謝的原因に起因し、それによって組織化されるてんかんは、皮質形成異常（片側巨脳症、異所形成等）、神経皮膚症候群（結節性硬化症及びスタージ・ウェーバー）、腫瘍、感染、外傷、血管腫、周産期障害、及び脳卒中を含む。「難治性てんかん」という用語は、薬学的治療に対して難治性であるてんかん、すなわち、現行の薬学的治療が、患者の疾患の有効な治療を可能にしないものを指す（例えば、Ｅｎｇｌｏｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ Ｐｅｄｉａｔｒ １２：１３４－４１（２０１３）を参照されたい）。
「エクソン」という用語は、遺伝子（例えば、Ｇｒｉｋ２遺伝子）のコード領域内の領域を指し、そのヌクレオチド配列は、対応するタンパク質のアミノ酸配列を決定する。「エクソン」という用語はまた、遺伝子から転写されたＲＮＡの対応する領域を指す。エクソンは、プレｍＲＮＡへと転写され、遺伝子の選択的スプライシングに依存して、成熟ｍＲＮＡに含まれ得る。プロセシング後に成熟ｍＲＮＡに含まれるエクソンは、タンパク質へと翻訳される。エクソンの配列は、タンパク質のアミノ酸組成を決定付ける。代替的に、成熟ｍＲＮＡに含まれるエクソンは、非コード性（例えば、タンパク質へと翻訳されないエクソン）であり得る。
「発現」という用語は、遺伝子又は核酸の発現という文脈で使用される場合、情報（遺伝子に含まれる）の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的な転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡ、又は任意の他の種類のＲＮＡ）、又はｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物としてはまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、及び編集等のプロセスによって修飾されるｍＲＮＡ、並びに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ＡＤＰ－リボシル化、ミリストイル化、及びグリコシル化によって修飾されたタンパク質（例えば、ＧｌｕＫ２）も挙げられる。
「発現する」という用語は、以下の事象のうちの１つ以上を指す。（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡテンプレートの産生（例えば、転写による）、（２）ＲＮＡ転写産物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’ｃａｐ形成、及び／又は３’末端プロセシングによる）、（３）ＲＮＡからポリペプチド又はタンパク質への翻訳、並びに（４）ポリペプチド又はタンパク質の翻訳後修飾。対象における目的の遺伝子の発現は、例えば、対象から得られる試料における、対応するタンパク質をコードするｍＲＮＡの量若しくは濃度の低下若しくは増加（例えば、本明細書に記載されるか、若しくは当該技術分野で知られているＲＮＡ検出手順、例えば、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）及びＲＮＡ ｓｅｑ技術を使用して評価されるような）、対応するタンパク質の量若しくは濃度の低下若しくは増加（例えば、本明細書に記載されるか、若しくは当該技術分野で知られているタンパク質検出方法、例えば、特に、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して評価されるような）、及び／又は対応するタンパク質の活性の低下若しくは増加（例えば、イオンチャンネルの場合において、本明細書に記載されるか、若しくは当該技術分野で知られている電気生理学的方法を使用して評価されるような）を検出することによって明らかにすることができる。
「ＧｌｕＫ２」という用語は、「ＧｌｕＲ６」、「ＧＲＩＫ２」、「ＭＲＴ６」、「ＥＡＡ４」、又は「ＧｌｕＫ６」としても知られており、現時点で使用されるＩＵＰＨＡＲ命名法で命名されるような、グルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２タンパク質を指す（Ｃｏｌｌｉｎｇｒｉｄｇｅ，Ｇ．Ｌ．，Ｏｌｓｅｎ，Ｒ．Ｗ．，Ｐｅｔｅｒｓ，Ｊ．，Ｓｐｅｄｄｉｎｇ，Ｍ．，２００９．Ａ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｌｉｇａｎｄ－ｇａｔｅｄ ｉｏｎ ｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ５６，２－５）。「ＧｌｕＫ２含有ＫＡＲ」、「ＧｌｕＫ２受容体」、「ＧｌｕＫ２タンパク質」、及び「ＧｌｕＫ２サブユニット」という用語は、全体で相互に置き換え可能に使用されてもよく、一般に、Ｇｒｉｋ２遺伝子によってコードされるか、又は発現されるタンパク質を指す。
「ガイド鎖」、又は「ガイド配列」という用語は、ステム－ループ構造の５’又は３’ステム－ループアームのいずれかに配置されるステム－ループＲＮＡ構造（例えば、ｓｈＲＮＡ又はマイクロＲＮＡ）の構成要素を指し、ガイド鎖／配列は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害することができる、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡアンチセンス配列（例えば、配列番号１～１００のうちのいずれか１つ、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）を含む。ガイド鎖／配列はまた、追加の配列、例えば、スペーサー又はリンカー配列を含み得る。ガイド配列は、ステム－ループＲＮＡ構造のパッセンジャー鎖／配列に対して相補的又は実質的に相補的であり得る（例えば、５、４、３、２、又は１個以下のミスマッチを有する）。
「イオンチャネル型グルタミン酸受容体」という用語は、ＮＭＤＡ（Ｎ－メチル－Ｄ－アスパルテート）、ＡＭＰＡ（α－アミノ－３－ヒドロキシ－５－メチル－４－イソオキサゾールプロピオン酸）及びカイニン酸型受容体（ＫＡＲ）のクラスのメンバーを含む。機能的ＫＡＲは、ＧｌｕＫ１、ＧｌｕＫ２、ＧｌｕＫ３、ＧｌｕＫ４、及びＧｌｕＫ５サブユニットと呼ばれる５種類のサブユニットのホモマー又はヘテロマーの組み合わせからのテトラマー集合体へと組み立てられ得る（Ｒｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。本開示の標的は、いくつかの場合において、ＧｌｕＫ２及びＧｌｕＫ５で構成されるＫＡＲ複合体である。Ｇｒｉｋ２遺伝子の発現の阻害は、ＧｌｕＫ５サブユニット自体が機能的なホモマーチャンネルを形成しないという観察結果を考慮すると、ＧｌｕＫ２／ＧｌｕＫ５カイニン酸型受容体機能を無効化するのに十分なものである。
「発現の阻害剤」は、遺伝子（例えば、Ｇｒｉｋ２遺伝子）の発現を阻害するか、又は低下させる生物学的効果を有する薬剤（例えば、本開示のＡＳＯ剤）を指す。遺伝子（例えば、Ｇｒｉｋ２遺伝子）の発現を阻害すると、典型的には、標的細胞又は組織において遺伝子産物（タンパク質、例えば、ＧｌｕＫ２タンパク質）の低下、又は更には全廃を引き起こすが、様々なレベルの阻害が達成され得る。発現を阻害するか、又は低下させることは、典型的には、ノックダウンと呼ばれる。
「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、２つ以上の共有結合したヌクレオチドを含む、単離された分子を指す。このように共有結合したヌクレオチドはまた、核酸分子と呼ばれてもよい。一般に、「単離された」ポリヌクレオチドは、そこから得られる核酸配列に関して、人工であり、化学合成されており、精製されており、かつ／又は異種であるポリヌクレオチドを指す。
「マイクロＲＮＡ」という用語は、ｍＲＮＡ翻訳を調節し、したがって、標的タンパク質の存在量に影響を及ぼす、非コードＲＮＡの短い（典型的には、約２２個のヌクレオチド）配列を指す。いくつかのマイクロＲＮＡは、単一の単シストロン性遺伝子から転写され、一方で、他のものは、多重遺伝子の遺伝子クラスターの一部として転写される。マイクロＲＮＡの構造は、５’及び３’隣接配列と、ステムを含むヘアピン配列と、ステムループ配列と、を含み得る。細胞内のプロセシングの間、未成熟マイクロＲＮＡは、Ｄｒｏｓｈａによって先端切断され、５’及び３’隣接配列が切り離される。その後、マイクロＲＮＡ分子は、核から細胞質へと移行され、Ｄｉｃｅｒによるループ領域の切断を受ける。マイクロＲＮＡの生物学的作用は、ｍＲＮＡ分子の領域（典型的には、３’非翻訳領域）に対する結合によって、翻訳調節のレベルで発揮され、ｍＲＮＡの切断、分解、不安定化、及び／又はあまり効率的ではない翻訳を引き起こす。マイクロＲＮＡのその標的に対する結合は、一般に、マイクロＲＮＡのヘアピン配列内の短い（例えば、６～８個のヌクレオチドの）「シード領域」によって媒介される。本開示全体で、ｓｉＲＮＡという用語は、その等価なｍｉＲＮＡを含んでいてもよく、その結果、ｍｉＲＮＡは、その等価なｓｉＲＮＡと同じ標的に対する相同性を有する塩基を（例えば、シード領域中に）包含する。上述のように、マイクロＲＮＡは、天然に存在しないマイクロＲＮＡ、例えば、１つ以上の異種核酸配列を有するマイクロＲＮＡであり得る。
「ヌクレオチド」という用語は、修飾されているか、又は天然に存在するデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであると定義される。ヌクレオチドは、典型的には、プリン及びピリミジンを含み、チミジン、シチジン、グアノシン、アデノシン、及びウリジンを含む。本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、上に定義されるヌクレオチド又は本明細書に開示される修飾ヌクレオチドのオリゴマーであると定義される。「オリゴヌクレオチド」という用語は、一本鎖又は二本鎖であり得る、３’－５’又は５’－３’に配向した核酸配列を指す。本開示の文脈で使用されるオリゴヌクレオチドは、特に、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。この用語は、「オリゴヌクレオチド類似体」も含み、オリゴヌクレオチド類似体は、（ｉ）修飾骨格構造、例えば、天然のオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドにみられる標準的なホスホジエステル連結以外の骨格、及び（ｉｉ）任意選択的に、修飾糖部分、例えば、リボース又はデオキシリボース部分ではなく、モルホリノ部分を有するオリゴヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチド類似体は、ワトソンクリック塩基対形成におよって標準的なポリヌクレオチド塩基に水素結合することができる塩基を保持し、類似体の骨格は、標準的なポリヌクレオチド（例えば、一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡ）においてオリゴヌクレオチド類似体と塩基との間の配列特異的な様式でのかかる水素結合を可能にする様式で塩基を提示する。特に、類似体は、実質的に帯電していないリン含有骨格を有するものである。オリゴヌクレオチド類似体中の実質的に帯電していないリン含有骨格は、サブユニット連結の大部分、例えば、その連結の５０～１００％、典型的には、少なくとも６０％～１００％、又は７５％、又は８０％が、帯電しておらず、１個のリン原子を含有するものである。更に、「オリゴヌクレオチド」という用語は、転写のためのその通常の配向に対して逆であり、そのため、宿主細胞内で発現する標的遺伝子ｍＲＮＡ分子に対して相補的であるＲＮＡ又はＤＮＡ配列に対応する、オリゴヌクレオチド配列を指す。アンチセンスガイド鎖は、標的遺伝子の発現と干渉することができるという条件で、いくつかの異なる方法で構築され得る。例えば、アンチセンスガイド鎖は、標的遺伝子のコード領域（又はその一部）が、その補体（例えば、アンチセンス及びセンス遺伝子によってコードされるＲＮＡが相補的であり得る）の転写を可能にするような転写についてのその正常な配向に対して逆相補的であることによって、構築され得る。オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子と同じイントロン又はエクソンパターンを有している必要はなく、標的遺伝子の非コードセグメントは、ＡＳＯ等のコードセグメントとして標的遺伝子発現のアンチセンス抑制を達成する際に等しく有効であり得る。いくつかの場合において、ＡＳＯは、標的遺伝子と同じエクソンパターンを有する。
オリゴヌクレオチドは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに対する標的化及びハイブリダイゼーションを可能にする任意の長さを有するものであってもよく（例えば、オリゴヌクレオチドは、少なくともＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡの領域に対して完全に、又は実質的に相補的であり）、約１０～５０個の塩基対の長さ、例えば、約１５～５０個の塩基対の長さ、又は約１８～５０個の塩基対の長さ、例えば、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０個の塩基対の長さ、例えば、約１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、又は２１～２２個の塩基対の長さの範囲であり得る。上述の引用される範囲及び長さの中間の範囲及び長さも、本開示の一部であると企図される。
「パッセンジャー鎖」、及び「パッセンジャー配列」という用語は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡアンチセンス配列（例えば、配列番号１～１００のうちのいずれか１つ、又は配列番号１～１０８のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントに対して相補的又は実質的に相補的な（例えば、５、４、３、２、又は１個以下のミスマッチを有する）配列を含む、ステム－ループ構造の５’又は３’ステム－ループアームのいずれかに配置されるステム－ループＲＮＡ構造（例えば、ｓｈＲＮＡ又はマイクロＲＮＡ）の構成要素を指す。パッセンジャー鎖／配列はまた、追加の配列、例えば、スペーサー又はリンカー配列を含み得る。パッセンジャー配列は、ステム－ループＲＮＡ構造のガイド鎖／配列に対して相補的又は実質的に相補的であり得る。
「プラスミド」という用語は、その中に追加のＤＮＡセグメントをライゲーションし得る、染色体外の環状の二本鎖ＤＮＡ分子を指す。プラスミドは、ベクターの一種であり、それに連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子である。特定のプラスミドは、中に導入される宿主細胞において自律複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌プラスミド、及びエピソーム哺乳動物プラスミド）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると、宿主細胞のゲノムにインテグレーションされることが可能であり、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。特定のプラスミドは、それに対して作動可能に連結される遺伝子の発現を指令することができる。
「位置エントロピー」という用語は、ポリヌクレオチド（例えば、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ）内の個々のヌクレオチドに適用する場合、ヌクレオチドが、ｍＲＮＡ二次構造によって与えられる拘束及び局所的トポロジーが与えられると仮定することができる分子位置、構成、又は配置の数を表す熱力学的量を指す。特定のヌクレオチド位置での低い位置エントロピーは、ヌクレオチドが、少ない数の位置構成を占めることができることを示す。特定のヌクレオチド位置での高い位置エントロピーは、ヌクレオチドが、多い数の位置構成を占めることができることを示す。ポリヌクレオチド鎖内のヌクレオチドは、別のヌクレオチドとの塩基対形成に関与する結果として、低い位置エントロピーを示す場合があり、それによって、塩基対形成したヌクレオチドを仮定することができる位置構成の合計数を拘束し得る。逆に、ポリヌクレオチド内のヌクレオチドは、ハイブリダイズされない結果として、高い位置エントロピーを示す場合があり、それによって、塩基対形成したヌクレオチドと比較して、その位置構成に関して、より大きな自由度を有し得る。「平均位置エントロピー」という用語は、所与の配列の全てのヌクレオチド位置にわたる位置エントロピー値の平均値を指す。例えば、平均位置エントロピーは、少なくとも２個の（例えば、少なくとも（例えば、少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個、又はそれより多くの）ヌクレオチドにわたって計算することができる。特定の例において、平均位置エントロピーは、２個以上のヌクレオチドにわたって計算される。別の例において、平均位置エントロピーは、５個以上のヌクレオチドにわたって計算される。別の例において、平均位置エントロピーは、１０個以上のヌクレオチドにわたって計算される。別の例において、平均位置エントロピーは、１５個以上のヌクレオチドにわたって計算される。別の例において、平均位置エントロピーは、２０個以上のヌクレオチドにわたって計算される。別の例において、平均位置エントロピーは、２５個以上のヌクレオチドにわたって計算される。別の例において、平均位置エントロピーは、３０個以上のヌクレオチドにわたって計算される。別の例において、平均位置エントロピーは、３５個以上のヌクレオチドにわたって計算される。別の例において、平均位置エントロピーは、４０個以上のヌクレオチドにわたって計算される。別の例において、平均位置エントロピーは、４５個以上のヌクレオチドにわたって計算される。別の例において、平均位置エントロピーは、５０個以上のヌクレオチドにわたって計算される。別の例において、平均位置エントロピーは、５５個以上のヌクレオチドにわたって計算される。別の例において、平均位置エントロピーは、６０個以上のヌクレオチドにわたって計算される。別の例において、平均位置エントロピーは、６５個以上のヌクレオチドにわたって計算される。別の例において、平均位置エントロピーは、７０個以上のヌクレオチドにわたって計算される。別の例において、平均位置エントロピーは、７５個以上のヌクレオチドにわたって計算される。別の例において、平均位置エントロピーは、８０個以上のヌクレオチドにわたって計算される。別の例において、平均位置エントロピーは、８５個以上のヌクレオチドにわたって計算される。別の例において、平均位置エントロピーは、９０個以上のヌクレオチドにわたって計算される。別の例において、平均位置エントロピーは、９５個以上のヌクレオチドにわたって計算される。別の例において、平均位置エントロピーは、１００個以上のヌクレオチドにわたって計算される。
ポリヌクレオチド配列内のヌクレオチドの位置エントロピーを定量化するための方法は、当該技術分野でよく知られている。一本鎖ポリヌクレオチド、例えば、高い位置エントロピー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ単位でゼロに近い）を有するｍＲＮＡ又はＲＮＡ阻害剤の二次構造は、折り畳みアルゴリズム（例えばＲＮＡｆｏｌｄ）で予測される場合、その自身の構造内にステム－ループ等の強く安定な二本鎖を形成する尤度が低い。この予測される高い位置エントロピーの一本鎖ＲＮＡは、典型的には、その結合標的に対して高い親和性を示す（例えば、２０１５年５月２１日に公開されたＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１５／０７３３６０号を参照されたい）。Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの非対形成領域（非対形成ループ及び非対形成ステム）は、高い位置エントロピー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ単位でゼロに近い）を有すると予測され、ガイド配列との相互作用にとって好ましい。
「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼによって結合されるＤＮＡ上の認識配列を指す。ポリメラーゼは、ポリヌクレオチドの転写を駆動する。本明細書に記載の組成物及び方法とともに使用するのに適した例示的なプロモーターは、例えば、Ｓａｎｄｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：４２４（２００７）に記載され、その開示は、核酸調節要素に関する場合に参照により本明細書に組み込まれる。これに加えて、「プロモーター」という用語は、生体系において天然に存在しない調節ＤＮＡ配列である合成プロモーターを指し得る。合成プロモーターは、天然に存在しないポリヌクレオチド配列と組み合わせた、天然に存在するプロモーターの一部を含有し、種々のポリヌクレオチド、ベクター、及び標的細胞型を使用して組換えＤＮＡを発現するように最適化することができる。
参照ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に関して「配列同一性率（％）」は、必要に応じて、最大の配列同一性率を達成するために、配列をアラインメントし、ギャップを導入した後に、参照ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列中の核酸又はアミノ酸と同一である、候補配列中の核酸又はアミノ酸の割合として定義される。核酸又はアミノ酸の配列同一性率を決定する目的のためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、又はＭｅｇａｌｉｇｎソフトウエア等の公的に利用可能なコンピュータソフトウエアを使用して、当該技術分野でよく知られている種々の方法で達成することができる。十分に認識されている従来の方法を使用して、比較される配列の全長にわたる最大アラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含め、配列をアラインメントするために適切なパラメータを決定することができる。例えば、配列同一性率の値は、配列比較コンピュータプログラムＢＬＡＳＴを使用して生成され得る。実例として、所与の核酸又はアミノ酸（Ｂ）と比較した、それとの、又はそれに対する、所与の核酸又はアミノ酸配列（Ａ）の配列同一性率（代替的に、所与の核酸又はアミノ酸（Ｂ）と比較した、それとの、又はそれに対する、特定の配列同一性率を有する、所与の核酸又はアミノ酸配列（Ａ）として示され得る）は、以下のように計算される。
１００×（分数Ｘ／Ｙ）
ここで、Ｘは、Ａ及びＢの配列アラインメントプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ）のアラインメントにおける、そのプログラムによって同一のマッチとしてスコアリングされたヌクレオチド又はアミノ酸の数であり、Ｙは、Ｂにおける核酸の総数である。核酸又はアミノ酸配列Ａの長さが、核酸又はアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの配列同一性率は、Ａに対するＢの配列同一性率と等しくない。
「薬学的に許容される」という用語は、合理的なベネフィット／リスク比に相応する過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、及び他の問題となる合併症がなく、対象、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）の組織と接触させるのに適した化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指す。
「薬学的組成物」という用語は、本明細書で使用される場合、薬学的に許容される賦形剤とともに製剤化される、本明細書に記載の化合物（例えば、ＡＳＯ、又はそれを含有するベクター）を含有する組成物を表し、いくつかの場合において、哺乳動物における疾患の治療のための療法計画の一部として政府規制機関の承認を受けつつ製造又は販売され得る。薬学的組成物は、例えば、単位剤形（例えば、錠剤、カプセル、カプレット、ジェルキャップ、若しくはシロップ）での経口投与、局所投与（例えば、クリーム、ジェル、ローション、若しくは軟膏）、静脈内投与（例えば、粒状の塞栓物を含まない滅菌溶液として、及び静脈内用途に適した溶媒系における）、髄腔内注射、脳室内注射、実質内注射、又は任意の他の薬学的に許容される製剤で、製剤化され得る。
「薬学的に許容される賦形剤」は、患者において実質的に非毒性かつ非炎症性であるという特性を有する、本明細書に記載の化合物以外の任意の成分（例えば、活性化合物を懸濁又は溶解させることができるビヒクル）を指す。賦形剤としては、例えば、接着防止剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング、圧縮助剤、崩壊剤、染料（色素）、エモリエント、乳化剤、充填剤（希釈剤）、膜形成剤又はコーティング、香味剤、香料、滑剤（流動促進剤）、滑沢剤、防腐剤、印刷インク、吸着媒、懸濁剤又は分散剤、甘味剤、及び水和水が挙げられる。例示的な賦形剤としては、限定されないが、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、ショ糖、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、及びキシリトールが挙げられる。
本明細書に記載の化合物（例えば、ＡＳＯ、及びそれを含有するベクター）は、薬学的に許容される塩として調製することができるようなイオン性基を有し得る。これらの塩は、無機酸若しくは有機酸を伴う酸付加塩であってもよく、又は塩は、本明細書に記載の化合物の酸性形態である場合には、無機塩基若しくは有機塩基から調製され得る。多くの場合、化合物は、薬学的に許容される酸又は塩基の付加生成物として調製された薬学的に許容される塩として調製されるか、又は使用される。適切な薬学的に許容される酸及び塩基、並びに適切な塩の調製のための方法は、当該技術分野でよく知られている。塩は、無機及び有機の酸及び塩基を含む、薬学的に許容される非毒性の酸及び塩基から調製され得る。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、カンホレート（ｃａｍｐｈｏｒａｔｅ）、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、及び吉草酸塩が挙げられる。代表的なアルカリ金属塩若しくはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、及びマグネシウム、並びに非毒性アンモニウム、四級アンモニウム、及びアミンカチオン（限定されないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、及びエチルアミンを含む）が挙げられる。
「調節配列」という用語は、遺伝子の転写又は翻訳を制御する、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。かかる調節配列は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰｅｒｄｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，（２０１４））に記載される。
「標的」又は「標的化する」という用語は、ＡＳＯ剤（例えば、本明細書に記載されるＡＳＯ剤）が、Ｇｒｉｋ２遺伝子又はＧｌｕＫ２タンパク質をコードするｍＲＮＡに対する相補的な塩基対形成によって特異的に結合する能力を指す。
「一本鎖領域」という用語は、一本鎖である（例えば、ｍＲＮＡ内の他のヌクレオチドに対してハイブリダイズされない）か、又は実質的に一本鎖である（例えば、領域内のヌクレオチドの５％以下が、同じＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ分子の他のヌクレオチドに対してハイブリダイズされる）、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（例えば、配列番号１１５の核酸配列を有するＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ、又は配列番号１１５の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）の予測二次構造の領域に対応する。Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの一本鎖領域の非限定的な例は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）の予測ループ領域１～１４（配列番号１４５～１５８）と、予測非対形成領域１～５（配列番号１５９～１６３）を含んでいた。
「低分子干渉ＲＮＡ」及び「ｓｉＲＮＡ」という用語は、各々の鎖が、ＲＮＡ、ＲＮＡ類似体、又はＲＮＡ及びＤＮＡを含む、二本鎖核酸を指す。ｓｉＲＮＡ分子は、１９～２３個のヌクレオチド（例えば、２１個のヌクレオチド）を含み得る。ｓｉＲＮＡは、典型的には、ｓｉＲＮＡ中の二本鎖領域が１７～２１個のヌクレオチド（例えば、１９個のヌクレオチド）を含むように、各鎖の３’末端上に２ｂｐのオーバーハングを有する。典型的には、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、標的遺伝子／ＲＮＡの標的配列と十分に相補的である。ｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡ干渉経路内で作動し、標的ｍＲＮＡ（例えば、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ）に結合し、Ｄｉｃｅｒ媒介性ｍＲＮＡ切断を介してｍＲＮＡを分解することによって、ｍＲＮＡ発現の阻害を引き起こす。本開示全体で、ｓｉＲＮＡという用語は、その等価なｍｉＲＮＡを含むことを意味しており、その結果、ｍｉＲＮＡは、その等価なｓｉＲＮＡと同じ標的に対する相同性を有する塩基を包含する。
「短ヘアピンＲＮＡ」及び「ｓｈＲＮＡ」という用語は、細胞中でステム－ループ構造を形成し、５～３０個のヌクレオチドのループ領域と、ループ領域の両側に１５～５０個のヌクレオチドの長い相補的なＲＮＡと、を含有し、相補的なＲＮＡ配列との間の塩基対形成によって二本鎖ステムを形成し、いくつかの場合において、各々のステムを形成する相補的な鎖の前及び後に追加の１～５００個のヌクレオチドを含有する、５０～１００個のヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡを指す。例えば、ｓｈＲＮＡは、一般に、ＲＮＡポリメラーゼによる転写を停止させるためにヘアピンの３’に特定の配列を必要とする。かかるｓｈＲＮＡは、一般に、短い５’及び３’隣接配列を含むことに起因して、Ｄｒｏｓｈａによるプロセシングを回避する。他のｓｈＲＮＡ、例えば、「ｓｈＲＮＡ様マイクロＲＮＡ」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩから転写され、より長い５’及び３’隣接配列を含み、Ｄｒｏｓｈａによる核におけるプロセシングを必要とし、その後に、切断したｓｈＲＮＡは、核から細胞質ゾルへと移行され、細胞質ゾルにおいてＤｉｃｅｒによって更に切断される。ｓｉＲＮＡと同様に、ｓｈＲＮＡは、配列特異的な方法で標的ｍＲＮＡに結合し、それによって、標的ｍＲＮＡを切断し、破壊し、したがって、標的ｍＲＮＡの発現を抑制する。
「対象」及び「患者」という用語は、動物（例えば、哺乳動物、例えば、ヒト）を指す。本明細書に記載の方法によって治療される対象は、てんかん（例えば、ＴＬＥ）を有すると診断された対象、又はこの状態を発症するリスクのある対象であってもよい。診断は、当該技術分野で知られている任意の方法又は技術によって行われ得る。本開示に従って治療される対象は、標準的な試験を受けていてもよく、又は検査を行わずに、疾患又は状態に関連する１つ以上のリスク因子の存在に起因して、リスクのある対象として特定されていてもよい。
「側頭葉てんかん」、又は「ＴＬＥ」という用語は、脳の側頭葉に由来する慢性及び再発性のてんかん発作（てんかん）を特徴とする慢性の神経学的状態を指す。ＴＬＥは、神経ネットワークのモルホ機能的再編成、及び海馬の歯状回の顆粒細胞からの再発性苔状線維の発芽を特徴とするため、この疾患は、無傷の脳組織における急性てんかん発作とは異なり、一方で、無傷の組織における急性てんかん発作は、このような回路特異的な再編成は関与しない。ＴＬＥは、脳の片方又は両方の半球におけるてんかん原性病巣の出現から生じ得る。
「形質導入」及び「形質導入する」という用語は、細胞内に核酸材料（例えば、ベクター、例えば、ウイルスベクター構築物、又はその一部）を導入し、その後で、その細胞において、核酸材料（例えば、ベクター構築物又はその一部）によってコードされるポリヌクレオチドを発現させる方法を指す。
「治療」又は「治療する」という用語は、疾患に冒されるリスクがあるか、又は疾患に冒されていた疑いがある患者、及び疾病状態であるか、疾患若しくは医学的状態に罹患していると診断された患者の治療を含む、予備的及び予防的治療、並びに根治又は疾患を改変する治療の両方を指す。治療はまた、臨床的再発の抑制を含む。障害若しくは再発する障害を予防し、治癒し、その発症を遅らせ、その重症度を減少させ、若しくはその１つ以上の症状を緩和するために、又はこのような治療を行わない状態で予想されるものを超えて対象の生存期間を延長させるために、治療は、医学的障害を有するか、又は最終的に障害を獲得し得る対象に行われ得る。「療法計画」とは、疾病の治療パターン、例えば、療法中に使用される投薬のパターンを意味する。療法計画は、誘導計画及び維持計画を含み得る。「誘導計画」又は「誘導期間」という語句は、疾患の初期治療に使用される療法計画（又は療法計画の一部）を指す。誘導計画の一般的な目標は、治療計画の初期期間中に、患者に対して高レベルの薬物を提供することである。誘導計画は、（一部分が、又は全体に）「負荷計画」を使用してもよく、負荷計画は、維持期間中に医師が使用するよりも多い用量の薬物を投与すること、維持期間中に医師が薬物を投与するよりも頻繁に薬物を投与すること、又はその両方を含み得る。「維持計画」又は「維持期間」という語句は、例えば、長期間（数ヶ月間又は数年間）にわたって患者を寛解状態に保つために、疾病の治療中に患者の維持のために使用される療法計画（又は療法計画の一部）を指す。維持計画は、連続療法（例えば、規則的な間隔、例えば、週、月、年の間隔で薬物を投与すること等）、又は間欠療法（例えば、中断される治療、間欠治療、再発時の治療、又は特定の所定の基準（例えば、疾患の顕現）を達成したときの治療）を使用し得る。
「ベクター」という用語は、核酸ベクター、例えば、ＤＮＡベクター、例えば、プラスミド、ＲＮＡベクター、又は別の適切なレプリコン（例えば、ウイルスベクター）を含む。原核細胞又は真核細胞への外因性ポリヌクレオチド又はタンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達のために、種々のベクターが開発されてきた。かかる発現ベクターの例は、例えば、目的の核酸材料の発現に適したベクターに関する場合に参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ１９９４／０１１０２６に開示される。本明細書に記載の組成物及び方法とともに使用するのに適した発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列と、例えば、哺乳動物細胞において異種核酸材料（例えば、ＡＳＯ）の発現に使用される追加の配列要素と、を含有する。本明細書に記載のＡＳＯ剤の発現に使用することができる特定のベクターとしては、遺伝子転写を指令する調節配列（例えば、プロモーター及びエンハンサー領域）を含有するプラスミドが挙げられる。本明細書に開示されるＡＳＯ剤の発現のための他の有用なベクターは、これらのポリヌクレオチドの翻訳速度を増強するか、又は遺伝子転写から得られるＲＮＡの安定性又は核外排出を改善するポリヌクレオチド配列を含有する。これらの配列要素としては、例えば、５’及び３’非翻訳領域、ＩＲＥＳ、及び発現ベクター上に保有される遺伝子の効率的な転写を指令するためのポリアデニル化シグナル部位が挙げられる。本明細書に記載の組成物及び方法とともに使用するのに適した発現ベクターはまた、かかるベクターを含有する細胞の選択のためのマーカーをコードするポリヌクレオチドを含有し得る。適切なマーカーの例は、抗生物質、例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ノーセオトリシン、又はゼオシンに対する抵抗性をコードする遺伝子である。
「総結合自由エネルギー」という用語は、ｍＲＮＡ上の標的領域の開放、一本鎖ガイドの生成、及び一本鎖ｓｉＲＮＡガイドのその一本鎖ｍＲＮＡ標的配列に対するハイブリダイゼーションを含め、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（例えば、配列番号１１５）上のその対応する標的配列にハイブリダイズするヌクレオチド又はポリヌクレオチド（例えば、本開示のＡＳＯ剤）のプロセスの自由エネルギーに対応する、ヌクレオチド又はポリヌクレオチドの熱力学的特性（ｋｃａｌ／ｍｏｌで測定される）を指す。本開示の文脈において、特定のＡＳＯ配列についての総結合自由エネルギーの負の値が大きいほど、一般に、上述のＡＳＯによるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ発現のノックダウンの有効性の減少と関連があり、一方で、値がゼロに近いほど、一般に、ノックダウン有効性の増加を反映している。
「二本鎖形成からのエネルギー」という用語は、一本鎖ｍＲＮＡ配列（例えば、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ）に対する一本鎖ｓｉＲＮＡガイドのハイブリダイゼーションの自由エネルギーに対応する、ヌクレオチド又はポリヌクレオチドの熱力学的特性（ｋｃａｌ／ｍｏｌで測定される）を指す。本開示の文脈において、所与のヌクレオチド又はポリヌクレオチドについてのより負の二本鎖形成のエネルギー値は、二本鎖の形成が、二本鎖形成のエネルギーがよりゼロに近い二本鎖の形成よりも好ましいことを反映しており、また、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ発現のノックダウン有効性の減少を反映している。したがって、この値は、二本鎖形成の好ましさとノックダウン効率との逆関係を示し、二本鎖形成のエネルギーが、二本鎖形成ではなく、（その逆の）二本鎖分離の好ましさを決定するための強い尺度を提供することを示唆している。したがって、二本鎖形成からのエネルギーの値の負が大きいほど、二本鎖はより安定になる。安定性の低いＧｒｉｋ２標的：ＡＳＯ二本鎖は、おそらくそのプロセシビティの増加に起因して、ＡＳＯがＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ発現をノックダウンする際により有効である可能性があることを示し得るということになる。言い換えると、標的細胞との複合体中のＡＳＯは、異なるｍＲＮＡ分子上の同じ領域を標的化するために、あまり安定ではない二本鎖から解かれる可能性が高く、これはその効率に直接的に関連するだろう。
「開放エネルギー」及び「総開放エネルギー」という用語は、標的位置でＲＮＡ二次構造を分解する（すなわち、開放する／アクセス可能にする）のに必要なエネルギーに対応する、ヌクレオチド又はポリヌクレオチドの熱力学的特性（ｋｃａｌ／ｍｏｌで測定される）を指し、潜在的に、付近の二次構造の分解、又は標的配列と二次構造を形成する遠位配列の関与を含む。本開示の文脈において、開放エネルギーの負の値が大きいほど、ＲＮＡ二次構造を分解し、対応するＡＳＯ配列のノックダウン有効性の減少を反映するのにより高いエネルギーを必要とすることを示す。この値は、折り畳みを解除するために必要なエネルギーが少ない標的配列が、折り畳みを解除する方に従いやすく、したがって、ＡＳＯ結合へのアクセス可能性が高いと考えることができることを示す。
「ＧＣ含有量」及び「ＧＣ率（％）」という用語は、ポリヌクレオチド（例えば、本開示のＡＳＯ、又はその完全又は実質的に相補的な配列）中の、グアニン（Ｇ）又はシトシン（Ｃ）のいずれかである塩基の割合を指す。２個の水素結合によって媒介されるＡ－Ｔ／Ｕ結合とは異なり、Ｇ－Ｃ結合は、３個の水素結合によって媒介される。より大きなＧＣ含有量を有するポリヌクレオチド二本鎖は、より安定であり、二本鎖を分解するためにより多くのエネルギーを必要とする。この安定性は、必ずしも水素結合の数の増加によって与えられるものではなく、むしろより安定な塩基スタッキングによって与えられる。所与のポリヌクレオチドについて、ＧＣ含有量は、以下のように計算され得る。
図１Ａ～１Ｑは、細胞におけるＧｌｕＫ２タンパク質の発現をノックダウン（ＫＤ）するためのグルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（Ｇｒｉｋ２） ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）構築物の特定及び評価を示す。（図１Ａ）セントロイドエントロピーモデルであるＲＮＡｆｏｌｄによって予測されるような、ヒトＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡバリアント１（配列番号１１５）の予測二次構造。（図１Ｂ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに対する複数の抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯの予測結合領域。例示的な結合領域には、特定されたループ領域（１＝ループ１（配列番号１４５）、２＝ループ２（配列番号１４６）、３＝ループ３（配列番号１４７）、４＝ループ４（配列番号１４８）、５＝ループ５（配列番号１４９）、６＝ループ６（配列番号１５０）、７＝非対形成１（配列番号１５９）、８＝非対形成２（配列番号１６０）、９＝ループ７（配列番号１５１）、１０＝ループ８（配列番号１５２）、１１＝ループ９（配列番号１５３）、１２＝ループ１０（配列番号１５４）、１３＝非対形成３（配列番号１６１）、１４＝ループ１１（配列番号１５５）、１５＝非対形成４（配列番号１６２）、１６＝非対形成５（配列番号１６３）、１７＝ループ１２（配列番号１５６）、１８＝ループ１３（配列番号１５７）、及び１９＝ループ１４（配列番号１５８））、並びにステム様非対形成領域（それぞれ、配列番号１５９～１６３に対応するアラビア数字１５～１９によって示される）が含まれる。（図１Ｃ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）の５’ＵＴＲ（配列番号１２６、ｓｉＲＮＡ Ｄ３（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＸＺ（配列番号５４）、ｓｉＲＮＡ ＣＹ（配列番号４３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ１（配列番号４６）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ Ｙ０（配列番号５５）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ０（配列番号４５）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ（配列番号２６）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＥ（配列番号２５）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＦ（配列番号２４）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ／ｓｉＳＰＯＴＲ１５（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＺＺ／ｓｉＳＰＯＴＲ１６（配列番号１００）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ／ｓｉＳＰＯＴＲ１７（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ Ｄ３／ｓｉＳＰＯＴＲ１８（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ／ｓｉＳＰＯＴＲ１９（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２０（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ／ｓｉＳＰＯＴＲ２１（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ／ｓｉＳＰＯＴＲ２２（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ／ｓｉＳＰＯＴＲ２３（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ／ｓｉＳＰＯＴＲ２４（配列番号２６）、及びｓｉＲＮＡ ＴＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２５（配列番号２４））、並びにエクソン１（配列番号１２９、ｓｉＲＮＡ ＣＫ（配列番号２９）、ｓｉＲＮＡ ＴＣ（配列番号２８）、及びｓｉＲＮＡ ＴＣ／ｓｉＳＰＯＴＲ１（配列番号２８））のコード配列（ＣＤＳ）内の予測結合領域に対してアラインメントされた抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤の模式図。（図１Ｄ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン２（配列番号１３０）内の特定されたループ１領域（配列番号１４５）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（Ｇ０、配列番号１）の模式図。（図１Ｅ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１０（配列番号１３８）内の特定されたループ５（配列番号１４９）及びループ６（配列番号１５０）領域に対してアラインメントされた、５つの例示的なＡＳＯ配列（ＧＤ（配列番号７、ＭＵ（配列番号９６）、ＭＴ（配列番号９９）、ＭＳ（配列番号９９）、及びＧ３（配列番号８））の模式図。（図１Ｆ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１１（配列番号１３９）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（ＭＪ（配列番号８９）、ＴＨ（配列番号２２、ＭＩ（配列番号９０）、Ｙ９（配列番号８８）、ＴＫ（配列番号７４）、Ｙ８（配列番号８７、ＴＩ（配列番号７６、ＣＵ（配列番号３９）、及びＹ７（配列番号６２））を示す模式図。（図１Ｇ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補ＡＳＯ剤によるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのレポーターノックダウン率（表２も参照されたい）。（図１Ｈ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤について非特異的なホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）の減少。（図１Ｉ）空の対照ベクターからの残留ｆｆｌｕｃ発現の関数としてのＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡノックダウン率を示す散布図（標的化されたｆｆｌｕｃノックダウン及び非特異的なｆｆｌｕｃノックダウンの関係）。（図１Ｊ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｋ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｌ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｍ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｎ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｏ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｐ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験される１９ｂｐのｓｉＲＮＡの各々におけるＧ又はＣとして特定される塩基の率（ＧＣ含有量）の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｑ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのＧＣ含有量の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。 図１Ａ～１Ｑは、細胞におけるＧｌｕＫ２タンパク質の発現をノックダウン（ＫＤ）するためのグルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（Ｇｒｉｋ２） ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）構築物の特定及び評価を示す。（図１Ａ）セントロイドエントロピーモデルであるＲＮＡｆｏｌｄによって予測されるような、ヒトＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡバリアント１（配列番号１１５）の予測二次構造。（図１Ｂ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに対する複数の抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯの予測結合領域。例示的な結合領域には、特定されたループ領域（１＝ループ１（配列番号１４５）、２＝ループ２（配列番号１４６）、３＝ループ３（配列番号１４７）、４＝ループ４（配列番号１４８）、５＝ループ５（配列番号１４９）、６＝ループ６（配列番号１５０）、７＝非対形成１（配列番号１５９）、８＝非対形成２（配列番号１６０）、９＝ループ７（配列番号１５１）、１０＝ループ８（配列番号１５２）、１１＝ループ９（配列番号１５３）、１２＝ループ１０（配列番号１５４）、１３＝非対形成３（配列番号１６１）、１４＝ループ１１（配列番号１５５）、１５＝非対形成４（配列番号１６２）、１６＝非対形成５（配列番号１６３）、１７＝ループ１２（配列番号１５６）、１８＝ループ１３（配列番号１５７）、及び１９＝ループ１４（配列番号１５８））、並びにステム様非対形成領域（それぞれ、配列番号１５９～１６３に対応するアラビア数字１５～１９によって示される）が含まれる。（図１Ｃ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）の５’ＵＴＲ（配列番号１２６、ｓｉＲＮＡ Ｄ３（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＸＺ（配列番号５４）、ｓｉＲＮＡ ＣＹ（配列番号４３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ１（配列番号４６）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ Ｙ０（配列番号５５）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ０（配列番号４５）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ（配列番号２６）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＥ（配列番号２５）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＦ（配列番号２４）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ／ｓｉＳＰＯＴＲ１５（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＺＺ／ｓｉＳＰＯＴＲ１６（配列番号１００）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ／ｓｉＳＰＯＴＲ１７（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ Ｄ３／ｓｉＳＰＯＴＲ１８（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ／ｓｉＳＰＯＴＲ１９（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２０（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ／ｓｉＳＰＯＴＲ２１（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ／ｓｉＳＰＯＴＲ２２（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ／ｓｉＳＰＯＴＲ２３（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ／ｓｉＳＰＯＴＲ２４（配列番号２６）、及びｓｉＲＮＡ ＴＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２５（配列番号２４））、並びにエクソン１（配列番号１２９、ｓｉＲＮＡ ＣＫ（配列番号２９）、ｓｉＲＮＡ ＴＣ（配列番号２８）、及びｓｉＲＮＡ ＴＣ／ｓｉＳＰＯＴＲ１（配列番号２８））のコード配列（ＣＤＳ）内の予測結合領域に対してアラインメントされた抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤の模式図。（図１Ｄ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン２（配列番号１３０）内の特定されたループ１領域（配列番号１４５）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（Ｇ０、配列番号１）の模式図。（図１Ｅ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１０（配列番号１３８）内の特定されたループ５（配列番号１４９）及びループ６（配列番号１５０）領域に対してアラインメントされた、５つの例示的なＡＳＯ配列（ＧＤ（配列番号７、ＭＵ（配列番号９６）、ＭＴ（配列番号９９）、ＭＳ（配列番号９９）、及びＧ３（配列番号８））の模式図。（図１Ｆ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１１（配列番号１３９）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（ＭＪ（配列番号８９）、ＴＨ（配列番号２２、ＭＩ（配列番号９０）、Ｙ９（配列番号８８）、ＴＫ（配列番号７４）、Ｙ８（配列番号８７、ＴＩ（配列番号７６、ＣＵ（配列番号３９）、及びＹ７（配列番号６２））を示す模式図。（図１Ｇ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補ＡＳＯ剤によるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのレポーターノックダウン率（表２も参照されたい）。（図１Ｈ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤について非特異的なホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）の減少。（図１Ｉ）空の対照ベクターからの残留ｆｆｌｕｃ発現の関数としてのＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡノックダウン率を示す散布図（標的化されたｆｆｌｕｃノックダウン及び非特異的なｆｆｌｕｃノックダウンの関係）。（図１Ｊ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｋ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｌ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｍ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｎ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｏ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｐ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験される１９ｂｐのｓｉＲＮＡの各々におけるＧ又はＣとして特定される塩基の率（ＧＣ含有量）の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｑ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのＧＣ含有量の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。 図１Ａ～１Ｑは、細胞におけるＧｌｕＫ２タンパク質の発現をノックダウン（ＫＤ）するためのグルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（Ｇｒｉｋ２） ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）構築物の特定及び評価を示す。（図１Ａ）セントロイドエントロピーモデルであるＲＮＡｆｏｌｄによって予測されるような、ヒトＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡバリアント１（配列番号１１５）の予測二次構造。（図１Ｂ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに対する複数の抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯの予測結合領域。例示的な結合領域には、特定されたループ領域（１＝ループ１（配列番号１４５）、２＝ループ２（配列番号１４６）、３＝ループ３（配列番号１４７）、４＝ループ４（配列番号１４８）、５＝ループ５（配列番号１４９）、６＝ループ６（配列番号１５０）、７＝非対形成１（配列番号１５９）、８＝非対形成２（配列番号１６０）、９＝ループ７（配列番号１５１）、１０＝ループ８（配列番号１５２）、１１＝ループ９（配列番号１５３）、１２＝ループ１０（配列番号１５４）、１３＝非対形成３（配列番号１６１）、１４＝ループ１１（配列番号１５５）、１５＝非対形成４（配列番号１６２）、１６＝非対形成５（配列番号１６３）、１７＝ループ１２（配列番号１５６）、１８＝ループ１３（配列番号１５７）、及び１９＝ループ１４（配列番号１５８））、並びにステム様非対形成領域（それぞれ、配列番号１５９～１６３に対応するアラビア数字１５～１９によって示される）が含まれる。（図１Ｃ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）の５’ＵＴＲ（配列番号１２６、ｓｉＲＮＡ Ｄ３（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＸＺ（配列番号５４）、ｓｉＲＮＡ ＣＹ（配列番号４３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ１（配列番号４６）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ Ｙ０（配列番号５５）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ０（配列番号４５）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ（配列番号２６）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＥ（配列番号２５）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＦ（配列番号２４）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ／ｓｉＳＰＯＴＲ１５（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＺＺ／ｓｉＳＰＯＴＲ１６（配列番号１００）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ／ｓｉＳＰＯＴＲ１７（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ Ｄ３／ｓｉＳＰＯＴＲ１８（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ／ｓｉＳＰＯＴＲ１９（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２０（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ／ｓｉＳＰＯＴＲ２１（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ／ｓｉＳＰＯＴＲ２２（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ／ｓｉＳＰＯＴＲ２３（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ／ｓｉＳＰＯＴＲ２４（配列番号２６）、及びｓｉＲＮＡ ＴＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２５（配列番号２４））、並びにエクソン１（配列番号１２９、ｓｉＲＮＡ ＣＫ（配列番号２９）、ｓｉＲＮＡ ＴＣ（配列番号２８）、及びｓｉＲＮＡ ＴＣ／ｓｉＳＰＯＴＲ１（配列番号２８））のコード配列（ＣＤＳ）内の予測結合領域に対してアラインメントされた抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤の模式図。（図１Ｄ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン２（配列番号１３０）内の特定されたループ１領域（配列番号１４５）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（Ｇ０、配列番号１）の模式図。（図１Ｅ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１０（配列番号１３８）内の特定されたループ５（配列番号１４９）及びループ６（配列番号１５０）領域に対してアラインメントされた、５つの例示的なＡＳＯ配列（ＧＤ（配列番号７、ＭＵ（配列番号９６）、ＭＴ（配列番号９９）、ＭＳ（配列番号９９）、及びＧ３（配列番号８））の模式図。（図１Ｆ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１１（配列番号１３９）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（ＭＪ（配列番号８９）、ＴＨ（配列番号２２、ＭＩ（配列番号９０）、Ｙ９（配列番号８８）、ＴＫ（配列番号７４）、Ｙ８（配列番号８７、ＴＩ（配列番号７６、ＣＵ（配列番号３９）、及びＹ７（配列番号６２））を示す模式図。（図１Ｇ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補ＡＳＯ剤によるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのレポーターノックダウン率（表２も参照されたい）。（図１Ｈ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤について非特異的なホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）の減少。（図１Ｉ）空の対照ベクターからの残留ｆｆｌｕｃ発現の関数としてのＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡノックダウン率を示す散布図（標的化されたｆｆｌｕｃノックダウン及び非特異的なｆｆｌｕｃノックダウンの関係）。（図１Ｊ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｋ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｌ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｍ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｎ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｏ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｐ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験される１９ｂｐのｓｉＲＮＡの各々におけるＧ又はＣとして特定される塩基の率（ＧＣ含有量）の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｑ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのＧＣ含有量の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。 図１Ａ～１Ｑは、細胞におけるＧｌｕＫ２タンパク質の発現をノックダウン（ＫＤ）するためのグルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（Ｇｒｉｋ２） ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）構築物の特定及び評価を示す。（図１Ａ）セントロイドエントロピーモデルであるＲＮＡｆｏｌｄによって予測されるような、ヒトＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡバリアント１（配列番号１１５）の予測二次構造。（図１Ｂ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに対する複数の抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯの予測結合領域。例示的な結合領域には、特定されたループ領域（１＝ループ１（配列番号１４５）、２＝ループ２（配列番号１４６）、３＝ループ３（配列番号１４７）、４＝ループ４（配列番号１４８）、５＝ループ５（配列番号１４９）、６＝ループ６（配列番号１５０）、７＝非対形成１（配列番号１５９）、８＝非対形成２（配列番号１６０）、９＝ループ７（配列番号１５１）、１０＝ループ８（配列番号１５２）、１１＝ループ９（配列番号１５３）、１２＝ループ１０（配列番号１５４）、１３＝非対形成３（配列番号１６１）、１４＝ループ１１（配列番号１５５）、１５＝非対形成４（配列番号１６２）、１６＝非対形成５（配列番号１６３）、１７＝ループ１２（配列番号１５６）、１８＝ループ１３（配列番号１５７）、及び１９＝ループ１４（配列番号１５８））、並びにステム様非対形成領域（それぞれ、配列番号１５９～１６３に対応するアラビア数字１５～１９によって示される）が含まれる。（図１Ｃ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）の５’ＵＴＲ（配列番号１２６、ｓｉＲＮＡ Ｄ３（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＸＺ（配列番号５４）、ｓｉＲＮＡ ＣＹ（配列番号４３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ１（配列番号４６）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ Ｙ０（配列番号５５）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ０（配列番号４５）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ（配列番号２６）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＥ（配列番号２５）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＦ（配列番号２４）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ／ｓｉＳＰＯＴＲ１５（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＺＺ／ｓｉＳＰＯＴＲ１６（配列番号１００）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ／ｓｉＳＰＯＴＲ１７（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ Ｄ３／ｓｉＳＰＯＴＲ１８（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ／ｓｉＳＰＯＴＲ１９（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２０（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ／ｓｉＳＰＯＴＲ２１（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ／ｓｉＳＰＯＴＲ２２（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ／ｓｉＳＰＯＴＲ２３（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ／ｓｉＳＰＯＴＲ２４（配列番号２６）、及びｓｉＲＮＡ ＴＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２５（配列番号２４））、並びにエクソン１（配列番号１２９、ｓｉＲＮＡ ＣＫ（配列番号２９）、ｓｉＲＮＡ ＴＣ（配列番号２８）、及びｓｉＲＮＡ ＴＣ／ｓｉＳＰＯＴＲ１（配列番号２８））のコード配列（ＣＤＳ）内の予測結合領域に対してアラインメントされた抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤の模式図。（図１Ｄ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン２（配列番号１３０）内の特定されたループ１領域（配列番号１４５）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（Ｇ０、配列番号１）の模式図。（図１Ｅ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１０（配列番号１３８）内の特定されたループ５（配列番号１４９）及びループ６（配列番号１５０）領域に対してアラインメントされた、５つの例示的なＡＳＯ配列（ＧＤ（配列番号７、ＭＵ（配列番号９６）、ＭＴ（配列番号９９）、ＭＳ（配列番号９９）、及びＧ３（配列番号８））の模式図。（図１Ｆ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１１（配列番号１３９）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（ＭＪ（配列番号８９）、ＴＨ（配列番号２２、ＭＩ（配列番号９０）、Ｙ９（配列番号８８）、ＴＫ（配列番号７４）、Ｙ８（配列番号８７、ＴＩ（配列番号７６、ＣＵ（配列番号３９）、及びＹ７（配列番号６２））を示す模式図。（図１Ｇ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補ＡＳＯ剤によるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのレポーターノックダウン率（表２も参照されたい）。（図１Ｈ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤について非特異的なホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）の減少。（図１Ｉ）空の対照ベクターからの残留ｆｆｌｕｃ発現の関数としてのＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡノックダウン率を示す散布図（標的化されたｆｆｌｕｃノックダウン及び非特異的なｆｆｌｕｃノックダウンの関係）。（図１Ｊ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｋ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｌ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｍ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｎ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｏ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｐ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験される１９ｂｐのｓｉＲＮＡの各々におけるＧ又はＣとして特定される塩基の率（ＧＣ含有量）の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｑ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのＧＣ含有量の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。 図１Ａ～１Ｑは、細胞におけるＧｌｕＫ２タンパク質の発現をノックダウン（ＫＤ）するためのグルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（Ｇｒｉｋ２） ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）構築物の特定及び評価を示す。（図１Ａ）セントロイドエントロピーモデルであるＲＮＡｆｏｌｄによって予測されるような、ヒトＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡバリアント１（配列番号１１５）の予測二次構造。（図１Ｂ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに対する複数の抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯの予測結合領域。例示的な結合領域には、特定されたループ領域（１＝ループ１（配列番号１４５）、２＝ループ２（配列番号１４６）、３＝ループ３（配列番号１４７）、４＝ループ４（配列番号１４８）、５＝ループ５（配列番号１４９）、６＝ループ６（配列番号１５０）、７＝非対形成１（配列番号１５９）、８＝非対形成２（配列番号１６０）、９＝ループ７（配列番号１５１）、１０＝ループ８（配列番号１５２）、１１＝ループ９（配列番号１５３）、１２＝ループ１０（配列番号１５４）、１３＝非対形成３（配列番号１６１）、１４＝ループ１１（配列番号１５５）、１５＝非対形成４（配列番号１６２）、１６＝非対形成５（配列番号１６３）、１７＝ループ１２（配列番号１５６）、１８＝ループ１３（配列番号１５７）、及び１９＝ループ１４（配列番号１５８））、並びにステム様非対形成領域（それぞれ、配列番号１５９～１６３に対応するアラビア数字１５～１９によって示される）が含まれる。（図１Ｃ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）の５’ＵＴＲ（配列番号１２６、ｓｉＲＮＡ Ｄ３（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＸＺ（配列番号５４）、ｓｉＲＮＡ ＣＹ（配列番号４３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ１（配列番号４６）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ Ｙ０（配列番号５５）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ０（配列番号４５）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ（配列番号２６）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＥ（配列番号２５）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＦ（配列番号２４）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ／ｓｉＳＰＯＴＲ１５（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＺＺ／ｓｉＳＰＯＴＲ１６（配列番号１００）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ／ｓｉＳＰＯＴＲ１７（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ Ｄ３／ｓｉＳＰＯＴＲ１８（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ／ｓｉＳＰＯＴＲ１９（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２０（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ／ｓｉＳＰＯＴＲ２１（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ／ｓｉＳＰＯＴＲ２２（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ／ｓｉＳＰＯＴＲ２３（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ／ｓｉＳＰＯＴＲ２４（配列番号２６）、及びｓｉＲＮＡ ＴＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２５（配列番号２４））、並びにエクソン１（配列番号１２９、ｓｉＲＮＡ ＣＫ（配列番号２９）、ｓｉＲＮＡ ＴＣ（配列番号２８）、及びｓｉＲＮＡ ＴＣ／ｓｉＳＰＯＴＲ１（配列番号２８））のコード配列（ＣＤＳ）内の予測結合領域に対してアラインメントされた抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤の模式図。（図１Ｄ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン２（配列番号１３０）内の特定されたループ１領域（配列番号１４５）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（Ｇ０、配列番号１）の模式図。（図１Ｅ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１０（配列番号１３８）内の特定されたループ５（配列番号１４９）及びループ６（配列番号１５０）領域に対してアラインメントされた、５つの例示的なＡＳＯ配列（ＧＤ（配列番号７、ＭＵ（配列番号９６）、ＭＴ（配列番号９９）、ＭＳ（配列番号９９）、及びＧ３（配列番号８））の模式図。（図１Ｆ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１１（配列番号１３９）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（ＭＪ（配列番号８９）、ＴＨ（配列番号２２、ＭＩ（配列番号９０）、Ｙ９（配列番号８８）、ＴＫ（配列番号７４）、Ｙ８（配列番号８７、ＴＩ（配列番号７６、ＣＵ（配列番号３９）、及びＹ７（配列番号６２））を示す模式図。（図１Ｇ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補ＡＳＯ剤によるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのレポーターノックダウン率（表２も参照されたい）。（図１Ｈ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤について非特異的なホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）の減少。（図１Ｉ）空の対照ベクターからの残留ｆｆｌｕｃ発現の関数としてのＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡノックダウン率を示す散布図（標的化されたｆｆｌｕｃノックダウン及び非特異的なｆｆｌｕｃノックダウンの関係）。（図１Ｊ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｋ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｌ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｍ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｎ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｏ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｐ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験される１９ｂｐのｓｉＲＮＡの各々におけるＧ又はＣとして特定される塩基の率（ＧＣ含有量）の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｑ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのＧＣ含有量の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。 図１Ａ～１Ｑは、細胞におけるＧｌｕＫ２タンパク質の発現をノックダウン（ＫＤ）するためのグルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（Ｇｒｉｋ２） ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）構築物の特定及び評価を示す。（図１Ａ）セントロイドエントロピーモデルであるＲＮＡｆｏｌｄによって予測されるような、ヒトＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡバリアント１（配列番号１１５）の予測二次構造。（図１Ｂ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに対する複数の抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯの予測結合領域。例示的な結合領域には、特定されたループ領域（１＝ループ１（配列番号１４５）、２＝ループ２（配列番号１４６）、３＝ループ３（配列番号１４７）、４＝ループ４（配列番号１４８）、５＝ループ５（配列番号１４９）、６＝ループ６（配列番号１５０）、７＝非対形成１（配列番号１５９）、８＝非対形成２（配列番号１６０）、９＝ループ７（配列番号１５１）、１０＝ループ８（配列番号１５２）、１１＝ループ９（配列番号１５３）、１２＝ループ１０（配列番号１５４）、１３＝非対形成３（配列番号１６１）、１４＝ループ１１（配列番号１５５）、１５＝非対形成４（配列番号１６２）、１６＝非対形成５（配列番号１６３）、１７＝ループ１２（配列番号１５６）、１８＝ループ１３（配列番号１５７）、及び１９＝ループ１４（配列番号１５８））、並びにステム様非対形成領域（それぞれ、配列番号１５９～１６３に対応するアラビア数字１５～１９によって示される）が含まれる。（図１Ｃ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）の５’ＵＴＲ（配列番号１２６、ｓｉＲＮＡ Ｄ３（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＸＺ（配列番号５４）、ｓｉＲＮＡ ＣＹ（配列番号４３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ１（配列番号４６）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ Ｙ０（配列番号５５）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ０（配列番号４５）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ（配列番号２６）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＥ（配列番号２５）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＦ（配列番号２４）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ／ｓｉＳＰＯＴＲ１５（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＺＺ／ｓｉＳＰＯＴＲ１６（配列番号１００）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ／ｓｉＳＰＯＴＲ１７（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ Ｄ３／ｓｉＳＰＯＴＲ１８（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ／ｓｉＳＰＯＴＲ１９（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２０（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ／ｓｉＳＰＯＴＲ２１（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ／ｓｉＳＰＯＴＲ２２（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ／ｓｉＳＰＯＴＲ２３（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ／ｓｉＳＰＯＴＲ２４（配列番号２６）、及びｓｉＲＮＡ ＴＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２５（配列番号２４））、並びにエクソン１（配列番号１２９、ｓｉＲＮＡ ＣＫ（配列番号２９）、ｓｉＲＮＡ ＴＣ（配列番号２８）、及びｓｉＲＮＡ ＴＣ／ｓｉＳＰＯＴＲ１（配列番号２８））のコード配列（ＣＤＳ）内の予測結合領域に対してアラインメントされた抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤の模式図。（図１Ｄ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン２（配列番号１３０）内の特定されたループ１領域（配列番号１４５）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（Ｇ０、配列番号１）の模式図。（図１Ｅ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１０（配列番号１３８）内の特定されたループ５（配列番号１４９）及びループ６（配列番号１５０）領域に対してアラインメントされた、５つの例示的なＡＳＯ配列（ＧＤ（配列番号７、ＭＵ（配列番号９６）、ＭＴ（配列番号９９）、ＭＳ（配列番号９９）、及びＧ３（配列番号８））の模式図。（図１Ｆ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１１（配列番号１３９）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（ＭＪ（配列番号８９）、ＴＨ（配列番号２２、ＭＩ（配列番号９０）、Ｙ９（配列番号８８）、ＴＫ（配列番号７４）、Ｙ８（配列番号８７、ＴＩ（配列番号７６、ＣＵ（配列番号３９）、及びＹ７（配列番号６２））を示す模式図。（図１Ｇ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補ＡＳＯ剤によるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのレポーターノックダウン率（表２も参照されたい）。（図１Ｈ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤について非特異的なホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）の減少。（図１Ｉ）空の対照ベクターからの残留ｆｆｌｕｃ発現の関数としてのＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡノックダウン率を示す散布図（標的化されたｆｆｌｕｃノックダウン及び非特異的なｆｆｌｕｃノックダウンの関係）。（図１Ｊ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｋ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｌ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｍ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｎ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｏ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｐ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験される１９ｂｐのｓｉＲＮＡの各々におけるＧ又はＣとして特定される塩基の率（ＧＣ含有量）の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｑ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのＧＣ含有量の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。 図１Ａ～１Ｑは、細胞におけるＧｌｕＫ２タンパク質の発現をノックダウン（ＫＤ）するためのグルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（Ｇｒｉｋ２） ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）構築物の特定及び評価を示す。（図１Ａ）セントロイドエントロピーモデルであるＲＮＡｆｏｌｄによって予測されるような、ヒトＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡバリアント１（配列番号１１５）の予測二次構造。（図１Ｂ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに対する複数の抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯの予測結合領域。例示的な結合領域には、特定されたループ領域（１＝ループ１（配列番号１４５）、２＝ループ２（配列番号１４６）、３＝ループ３（配列番号１４７）、４＝ループ４（配列番号１４８）、５＝ループ５（配列番号１４９）、６＝ループ６（配列番号１５０）、７＝非対形成１（配列番号１５９）、８＝非対形成２（配列番号１６０）、９＝ループ７（配列番号１５１）、１０＝ループ８（配列番号１５２）、１１＝ループ９（配列番号１５３）、１２＝ループ１０（配列番号１５４）、１３＝非対形成３（配列番号１６１）、１４＝ループ１１（配列番号１５５）、１５＝非対形成４（配列番号１６２）、１６＝非対形成５（配列番号１６３）、１７＝ループ１２（配列番号１５６）、１８＝ループ１３（配列番号１５７）、及び１９＝ループ１４（配列番号１５８））、並びにステム様非対形成領域（それぞれ、配列番号１５９～１６３に対応するアラビア数字１５～１９によって示される）が含まれる。（図１Ｃ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）の５’ＵＴＲ（配列番号１２６、ｓｉＲＮＡ Ｄ３（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＸＺ（配列番号５４）、ｓｉＲＮＡ ＣＹ（配列番号４３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ１（配列番号４６）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ Ｙ０（配列番号５５）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ０（配列番号４５）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ（配列番号２６）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＥ（配列番号２５）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＦ（配列番号２４）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ／ｓｉＳＰＯＴＲ１５（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＺＺ／ｓｉＳＰＯＴＲ１６（配列番号１００）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ／ｓｉＳＰＯＴＲ１７（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ Ｄ３／ｓｉＳＰＯＴＲ１８（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ／ｓｉＳＰＯＴＲ１９（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２０（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ／ｓｉＳＰＯＴＲ２１（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ／ｓｉＳＰＯＴＲ２２（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ／ｓｉＳＰＯＴＲ２３（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ／ｓｉＳＰＯＴＲ２４（配列番号２６）、及びｓｉＲＮＡ ＴＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２５（配列番号２４））、並びにエクソン１（配列番号１２９、ｓｉＲＮＡ ＣＫ（配列番号２９）、ｓｉＲＮＡ ＴＣ（配列番号２８）、及びｓｉＲＮＡ ＴＣ／ｓｉＳＰＯＴＲ１（配列番号２８））のコード配列（ＣＤＳ）内の予測結合領域に対してアラインメントされた抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤の模式図。（図１Ｄ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン２（配列番号１３０）内の特定されたループ１領域（配列番号１４５）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（Ｇ０、配列番号１）の模式図。（図１Ｅ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１０（配列番号１３８）内の特定されたループ５（配列番号１４９）及びループ６（配列番号１５０）領域に対してアラインメントされた、５つの例示的なＡＳＯ配列（ＧＤ（配列番号７、ＭＵ（配列番号９６）、ＭＴ（配列番号９９）、ＭＳ（配列番号９９）、及びＧ３（配列番号８））の模式図。（図１Ｆ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１１（配列番号１３９）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（ＭＪ（配列番号８９）、ＴＨ（配列番号２２、ＭＩ（配列番号９０）、Ｙ９（配列番号８８）、ＴＫ（配列番号７４）、Ｙ８（配列番号８７、ＴＩ（配列番号７６、ＣＵ（配列番号３９）、及びＹ７（配列番号６２））を示す模式図。（図１Ｇ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補ＡＳＯ剤によるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのレポーターノックダウン率（表２も参照されたい）。（図１Ｈ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤について非特異的なホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）の減少。（図１Ｉ）空の対照ベクターからの残留ｆｆｌｕｃ発現の関数としてのＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡノックダウン率を示す散布図（標的化されたｆｆｌｕｃノックダウン及び非特異的なｆｆｌｕｃノックダウンの関係）。（図１Ｊ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｋ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｌ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｍ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｎ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｏ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｐ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験される１９ｂｐのｓｉＲＮＡの各々におけるＧ又はＣとして特定される塩基の率（ＧＣ含有量）の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｑ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのＧＣ含有量の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。 図１Ａ～１Ｑは、細胞におけるＧｌｕＫ２タンパク質の発現をノックダウン（ＫＤ）するためのグルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（Ｇｒｉｋ２） ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）構築物の特定及び評価を示す。（図１Ａ）セントロイドエントロピーモデルであるＲＮＡｆｏｌｄによって予測されるような、ヒトＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡバリアント１（配列番号１１５）の予測二次構造。（図１Ｂ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに対する複数の抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯの予測結合領域。例示的な結合領域には、特定されたループ領域（１＝ループ１（配列番号１４５）、２＝ループ２（配列番号１４６）、３＝ループ３（配列番号１４７）、４＝ループ４（配列番号１４８）、５＝ループ５（配列番号１４９）、６＝ループ６（配列番号１５０）、７＝非対形成１（配列番号１５９）、８＝非対形成２（配列番号１６０）、９＝ループ７（配列番号１５１）、１０＝ループ８（配列番号１５２）、１１＝ループ９（配列番号１５３）、１２＝ループ１０（配列番号１５４）、１３＝非対形成３（配列番号１６１）、１４＝ループ１１（配列番号１５５）、１５＝非対形成４（配列番号１６２）、１６＝非対形成５（配列番号１６３）、１７＝ループ１２（配列番号１５６）、１８＝ループ１３（配列番号１５７）、及び１９＝ループ１４（配列番号１５８））、並びにステム様非対形成領域（それぞれ、配列番号１５９～１６３に対応するアラビア数字１５～１９によって示される）が含まれる。（図１Ｃ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）の５’ＵＴＲ（配列番号１２６、ｓｉＲＮＡ Ｄ３（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＸＺ（配列番号５４）、ｓｉＲＮＡ ＣＹ（配列番号４３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ１（配列番号４６）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ Ｙ０（配列番号５５）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ０（配列番号４５）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ（配列番号２６）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＥ（配列番号２５）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＦ（配列番号２４）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ／ｓｉＳＰＯＴＲ１５（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＺＺ／ｓｉＳＰＯＴＲ１６（配列番号１００）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ／ｓｉＳＰＯＴＲ１７（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ Ｄ３／ｓｉＳＰＯＴＲ１８（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ／ｓｉＳＰＯＴＲ１９（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２０（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ／ｓｉＳＰＯＴＲ２１（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ／ｓｉＳＰＯＴＲ２２（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ／ｓｉＳＰＯＴＲ２３（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ／ｓｉＳＰＯＴＲ２４（配列番号２６）、及びｓｉＲＮＡ ＴＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２５（配列番号２４））、並びにエクソン１（配列番号１２９、ｓｉＲＮＡ ＣＫ（配列番号２９）、ｓｉＲＮＡ ＴＣ（配列番号２８）、及びｓｉＲＮＡ ＴＣ／ｓｉＳＰＯＴＲ１（配列番号２８））のコード配列（ＣＤＳ）内の予測結合領域に対してアラインメントされた抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤の模式図。（図１Ｄ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン２（配列番号１３０）内の特定されたループ１領域（配列番号１４５）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（Ｇ０、配列番号１）の模式図。（図１Ｅ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１０（配列番号１３８）内の特定されたループ５（配列番号１４９）及びループ６（配列番号１５０）領域に対してアラインメントされた、５つの例示的なＡＳＯ配列（ＧＤ（配列番号７、ＭＵ（配列番号９６）、ＭＴ（配列番号９９）、ＭＳ（配列番号９９）、及びＧ３（配列番号８））の模式図。（図１Ｆ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１１（配列番号１３９）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（ＭＪ（配列番号８９）、ＴＨ（配列番号２２、ＭＩ（配列番号９０）、Ｙ９（配列番号８８）、ＴＫ（配列番号７４）、Ｙ８（配列番号８７、ＴＩ（配列番号７６、ＣＵ（配列番号３９）、及びＹ７（配列番号６２））を示す模式図。（図１Ｇ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補ＡＳＯ剤によるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのレポーターノックダウン率（表２も参照されたい）。（図１Ｈ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤について非特異的なホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）の減少。（図１Ｉ）空の対照ベクターからの残留ｆｆｌｕｃ発現の関数としてのＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡノックダウン率を示す散布図（標的化されたｆｆｌｕｃノックダウン及び非特異的なｆｆｌｕｃノックダウンの関係）。（図１Ｊ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｋ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｌ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｍ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｎ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｏ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｐ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験される１９ｂｐのｓｉＲＮＡの各々におけるＧ又はＣとして特定される塩基の率（ＧＣ含有量）の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｑ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのＧＣ含有量の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。 図１Ａ～１Ｑは、細胞におけるＧｌｕＫ２タンパク質の発現をノックダウン（ＫＤ）するためのグルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（Ｇｒｉｋ２） ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）構築物の特定及び評価を示す。（図１Ａ）セントロイドエントロピーモデルであるＲＮＡｆｏｌｄによって予測されるような、ヒトＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡバリアント１（配列番号１１５）の予測二次構造。（図１Ｂ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに対する複数の抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯの予測結合領域。例示的な結合領域には、特定されたループ領域（１＝ループ１（配列番号１４５）、２＝ループ２（配列番号１４６）、３＝ループ３（配列番号１４７）、４＝ループ４（配列番号１４８）、５＝ループ５（配列番号１４９）、６＝ループ６（配列番号１５０）、７＝非対形成１（配列番号１５９）、８＝非対形成２（配列番号１６０）、９＝ループ７（配列番号１５１）、１０＝ループ８（配列番号１５２）、１１＝ループ９（配列番号１５３）、１２＝ループ１０（配列番号１５４）、１３＝非対形成３（配列番号１６１）、１４＝ループ１１（配列番号１５５）、１５＝非対形成４（配列番号１６２）、１６＝非対形成５（配列番号１６３）、１７＝ループ１２（配列番号１５６）、１８＝ループ１３（配列番号１５７）、及び１９＝ループ１４（配列番号１５８））、並びにステム様非対形成領域（それぞれ、配列番号１５９～１６３に対応するアラビア数字１５～１９によって示される）が含まれる。（図１Ｃ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）の５’ＵＴＲ（配列番号１２６、ｓｉＲＮＡ Ｄ３（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＸＺ（配列番号５４）、ｓｉＲＮＡ ＣＹ（配列番号４３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ１（配列番号４６）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ Ｙ０（配列番号５５）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ０（配列番号４５）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ（配列番号２６）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＥ（配列番号２５）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＦ（配列番号２４）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ／ｓｉＳＰＯＴＲ１５（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＺＺ／ｓｉＳＰＯＴＲ１６（配列番号１００）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ／ｓｉＳＰＯＴＲ１７（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ Ｄ３／ｓｉＳＰＯＴＲ１８（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ／ｓｉＳＰＯＴＲ１９（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２０（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ／ｓｉＳＰＯＴＲ２１（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ／ｓｉＳＰＯＴＲ２２（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ／ｓｉＳＰＯＴＲ２３（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ／ｓｉＳＰＯＴＲ２４（配列番号２６）、及びｓｉＲＮＡ ＴＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２５（配列番号２４））、並びにエクソン１（配列番号１２９、ｓｉＲＮＡ ＣＫ（配列番号２９）、ｓｉＲＮＡ ＴＣ（配列番号２８）、及びｓｉＲＮＡ ＴＣ／ｓｉＳＰＯＴＲ１（配列番号２８））のコード配列（ＣＤＳ）内の予測結合領域に対してアラインメントされた抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤の模式図。（図１Ｄ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン２（配列番号１３０）内の特定されたループ１領域（配列番号１４５）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（Ｇ０、配列番号１）の模式図。（図１Ｅ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１０（配列番号１３８）内の特定されたループ５（配列番号１４９）及びループ６（配列番号１５０）領域に対してアラインメントされた、５つの例示的なＡＳＯ配列（ＧＤ（配列番号７、ＭＵ（配列番号９６）、ＭＴ（配列番号９９）、ＭＳ（配列番号９９）、及びＧ３（配列番号８））の模式図。（図１Ｆ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１１（配列番号１３９）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（ＭＪ（配列番号８９）、ＴＨ（配列番号２２、ＭＩ（配列番号９０）、Ｙ９（配列番号８８）、ＴＫ（配列番号７４）、Ｙ８（配列番号８７、ＴＩ（配列番号７６、ＣＵ（配列番号３９）、及びＹ７（配列番号６２））を示す模式図。（図１Ｇ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補ＡＳＯ剤によるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのレポーターノックダウン率（表２も参照されたい）。（図１Ｈ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤について非特異的なホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）の減少。（図１Ｉ）空の対照ベクターからの残留ｆｆｌｕｃ発現の関数としてのＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡノックダウン率を示す散布図（標的化されたｆｆｌｕｃノックダウン及び非特異的なｆｆｌｕｃノックダウンの関係）。（図１Ｊ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｋ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｌ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｍ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｎ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｏ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｐ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験される１９ｂｐのｓｉＲＮＡの各々におけるＧ又はＣとして特定される塩基の率（ＧＣ含有量）の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｑ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのＧＣ含有量の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。 図１Ａ～１Ｑは、細胞におけるＧｌｕＫ２タンパク質の発現をノックダウン（ＫＤ）するためのグルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（Ｇｒｉｋ２） ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）構築物の特定及び評価を示す。（図１Ａ）セントロイドエントロピーモデルであるＲＮＡｆｏｌｄによって予測されるような、ヒトＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡバリアント１（配列番号１１５）の予測二次構造。（図１Ｂ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに対する複数の抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯの予測結合領域。例示的な結合領域には、特定されたループ領域（１＝ループ１（配列番号１４５）、２＝ループ２（配列番号１４６）、３＝ループ３（配列番号１４７）、４＝ループ４（配列番号１４８）、５＝ループ５（配列番号１４９）、６＝ループ６（配列番号１５０）、７＝非対形成１（配列番号１５９）、８＝非対形成２（配列番号１６０）、９＝ループ７（配列番号１５１）、１０＝ループ８（配列番号１５２）、１１＝ループ９（配列番号１５３）、１２＝ループ１０（配列番号１５４）、１３＝非対形成３（配列番号１６１）、１４＝ループ１１（配列番号１５５）、１５＝非対形成４（配列番号１６２）、１６＝非対形成５（配列番号１６３）、１７＝ループ１２（配列番号１５６）、１８＝ループ１３（配列番号１５７）、及び１９＝ループ１４（配列番号１５８））、並びにステム様非対形成領域（それぞれ、配列番号１５９～１６３に対応するアラビア数字１５～１９によって示される）が含まれる。（図１Ｃ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）の５’ＵＴＲ（配列番号１２６、ｓｉＲＮＡ Ｄ３（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＸＺ（配列番号５４）、ｓｉＲＮＡ ＣＹ（配列番号４３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ１（配列番号４６）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ Ｙ０（配列番号５５）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ０（配列番号４５）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ（配列番号２６）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＥ（配列番号２５）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＦ（配列番号２４）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ／ｓｉＳＰＯＴＲ１５（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＺＺ／ｓｉＳＰＯＴＲ１６（配列番号１００）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ／ｓｉＳＰＯＴＲ１７（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ Ｄ３／ｓｉＳＰＯＴＲ１８（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ／ｓｉＳＰＯＴＲ１９（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２０（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ／ｓｉＳＰＯＴＲ２１（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ／ｓｉＳＰＯＴＲ２２（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ／ｓｉＳＰＯＴＲ２３（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ／ｓｉＳＰＯＴＲ２４（配列番号２６）、及びｓｉＲＮＡ ＴＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２５（配列番号２４））、並びにエクソン１（配列番号１２９、ｓｉＲＮＡ ＣＫ（配列番号２９）、ｓｉＲＮＡ ＴＣ（配列番号２８）、及びｓｉＲＮＡ ＴＣ／ｓｉＳＰＯＴＲ１（配列番号２８））のコード配列（ＣＤＳ）内の予測結合領域に対してアラインメントされた抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤の模式図。（図１Ｄ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン２（配列番号１３０）内の特定されたループ１領域（配列番号１４５）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（Ｇ０、配列番号１）の模式図。（図１Ｅ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１０（配列番号１３８）内の特定されたループ５（配列番号１４９）及びループ６（配列番号１５０）領域に対してアラインメントされた、５つの例示的なＡＳＯ配列（ＧＤ（配列番号７、ＭＵ（配列番号９６）、ＭＴ（配列番号９９）、ＭＳ（配列番号９９）、及びＧ３（配列番号８））の模式図。（図１Ｆ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１１（配列番号１３９）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（ＭＪ（配列番号８９）、ＴＨ（配列番号２２、ＭＩ（配列番号９０）、Ｙ９（配列番号８８）、ＴＫ（配列番号７４）、Ｙ８（配列番号８７、ＴＩ（配列番号７６、ＣＵ（配列番号３９）、及びＹ７（配列番号６２））を示す模式図。（図１Ｇ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補ＡＳＯ剤によるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのレポーターノックダウン率（表２も参照されたい）。（図１Ｈ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤について非特異的なホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）の減少。（図１Ｉ）空の対照ベクターからの残留ｆｆｌｕｃ発現の関数としてのＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡノックダウン率を示す散布図（標的化されたｆｆｌｕｃノックダウン及び非特異的なｆｆｌｕｃノックダウンの関係）。（図１Ｊ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｋ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｌ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｍ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｎ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｏ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｐ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験される１９ｂｐのｓｉＲＮＡの各々におけるＧ又はＣとして特定される塩基の率（ＧＣ含有量）の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｑ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのＧＣ含有量の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。 図１Ａ～１Ｑは、細胞におけるＧｌｕＫ２タンパク質の発現をノックダウン（ＫＤ）するためのグルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（Ｇｒｉｋ２） ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）構築物の特定及び評価を示す。（図１Ａ）セントロイドエントロピーモデルであるＲＮＡｆｏｌｄによって予測されるような、ヒトＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡバリアント１（配列番号１１５）の予測二次構造。（図１Ｂ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに対する複数の抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯの予測結合領域。例示的な結合領域には、特定されたループ領域（１＝ループ１（配列番号１４５）、２＝ループ２（配列番号１４６）、３＝ループ３（配列番号１４７）、４＝ループ４（配列番号１４８）、５＝ループ５（配列番号１４９）、６＝ループ６（配列番号１５０）、７＝非対形成１（配列番号１５９）、８＝非対形成２（配列番号１６０）、９＝ループ７（配列番号１５１）、１０＝ループ８（配列番号１５２）、１１＝ループ９（配列番号１５３）、１２＝ループ１０（配列番号１５４）、１３＝非対形成３（配列番号１６１）、１４＝ループ１１（配列番号１５５）、１５＝非対形成４（配列番号１６２）、１６＝非対形成５（配列番号１６３）、１７＝ループ１２（配列番号１５６）、１８＝ループ１３（配列番号１５７）、及び１９＝ループ１４（配列番号１５８））、並びにステム様非対形成領域（それぞれ、配列番号１５９～１６３に対応するアラビア数字１５～１９によって示される）が含まれる。（図１Ｃ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）の５’ＵＴＲ（配列番号１２６、ｓｉＲＮＡ Ｄ３（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＸＺ（配列番号５４）、ｓｉＲＮＡ ＣＹ（配列番号４３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ１（配列番号４６）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ Ｙ０（配列番号５５）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ０（配列番号４５）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ（配列番号２６）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＥ（配列番号２５）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＦ（配列番号２４）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ／ｓｉＳＰＯＴＲ１５（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＺＺ／ｓｉＳＰＯＴＲ１６（配列番号１００）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ／ｓｉＳＰＯＴＲ１７（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ Ｄ３／ｓｉＳＰＯＴＲ１８（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ／ｓｉＳＰＯＴＲ１９（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２０（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ／ｓｉＳＰＯＴＲ２１（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ／ｓｉＳＰＯＴＲ２２（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ／ｓｉＳＰＯＴＲ２３（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ／ｓｉＳＰＯＴＲ２４（配列番号２６）、及びｓｉＲＮＡ ＴＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２５（配列番号２４））、並びにエクソン１（配列番号１２９、ｓｉＲＮＡ ＣＫ（配列番号２９）、ｓｉＲＮＡ ＴＣ（配列番号２８）、及びｓｉＲＮＡ ＴＣ／ｓｉＳＰＯＴＲ１（配列番号２８））のコード配列（ＣＤＳ）内の予測結合領域に対してアラインメントされた抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤の模式図。（図１Ｄ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン２（配列番号１３０）内の特定されたループ１領域（配列番号１４５）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（Ｇ０、配列番号１）の模式図。（図１Ｅ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１０（配列番号１３８）内の特定されたループ５（配列番号１４９）及びループ６（配列番号１５０）領域に対してアラインメントされた、５つの例示的なＡＳＯ配列（ＧＤ（配列番号７、ＭＵ（配列番号９６）、ＭＴ（配列番号９９）、ＭＳ（配列番号９９）、及びＧ３（配列番号８））の模式図。（図１Ｆ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１１（配列番号１３９）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（ＭＪ（配列番号８９）、ＴＨ（配列番号２２、ＭＩ（配列番号９０）、Ｙ９（配列番号８８）、ＴＫ（配列番号７４）、Ｙ８（配列番号８７、ＴＩ（配列番号７６、ＣＵ（配列番号３９）、及びＹ７（配列番号６２））を示す模式図。（図１Ｇ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補ＡＳＯ剤によるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのレポーターノックダウン率（表２も参照されたい）。（図１Ｈ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤について非特異的なホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）の減少。（図１Ｉ）空の対照ベクターからの残留ｆｆｌｕｃ発現の関数としてのＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡノックダウン率を示す散布図（標的化されたｆｆｌｕｃノックダウン及び非特異的なｆｆｌｕｃノックダウンの関係）。（図１Ｊ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｋ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｌ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｍ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｎ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｏ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｐ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験される１９ｂｐのｓｉＲＮＡの各々におけるＧ又はＣとして特定される塩基の率（ＧＣ含有量）の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｑ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのＧＣ含有量の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。 図１Ａ～１Ｑは、細胞におけるＧｌｕＫ２タンパク質の発現をノックダウン（ＫＤ）するためのグルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（Ｇｒｉｋ２） ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）構築物の特定及び評価を示す。（図１Ａ）セントロイドエントロピーモデルであるＲＮＡｆｏｌｄによって予測されるような、ヒトＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡバリアント１（配列番号１１５）の予測二次構造。（図１Ｂ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに対する複数の抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯの予測結合領域。例示的な結合領域には、特定されたループ領域（１＝ループ１（配列番号１４５）、２＝ループ２（配列番号１４６）、３＝ループ３（配列番号１４７）、４＝ループ４（配列番号１４８）、５＝ループ５（配列番号１４９）、６＝ループ６（配列番号１５０）、７＝非対形成１（配列番号１５９）、８＝非対形成２（配列番号１６０）、９＝ループ７（配列番号１５１）、１０＝ループ８（配列番号１５２）、１１＝ループ９（配列番号１５３）、１２＝ループ１０（配列番号１５４）、１３＝非対形成３（配列番号１６１）、１４＝ループ１１（配列番号１５５）、１５＝非対形成４（配列番号１６２）、１６＝非対形成５（配列番号１６３）、１７＝ループ１２（配列番号１５６）、１８＝ループ１３（配列番号１５７）、及び１９＝ループ１４（配列番号１５８））、並びにステム様非対形成領域（それぞれ、配列番号１５９～１６３に対応するアラビア数字１５～１９によって示される）が含まれる。（図１Ｃ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）の５’ＵＴＲ（配列番号１２６、ｓｉＲＮＡ Ｄ３（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＸＺ（配列番号５４）、ｓｉＲＮＡ ＣＹ（配列番号４３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ１（配列番号４６）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ Ｙ０（配列番号５５）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ０（配列番号４５）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ（配列番号２６）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＥ（配列番号２５）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＦ（配列番号２４）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ／ｓｉＳＰＯＴＲ１５（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＺＺ／ｓｉＳＰＯＴＲ１６（配列番号１００）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ／ｓｉＳＰＯＴＲ１７（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ Ｄ３／ｓｉＳＰＯＴＲ１８（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ／ｓｉＳＰＯＴＲ１９（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２０（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ／ｓｉＳＰＯＴＲ２１（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ／ｓｉＳＰＯＴＲ２２（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ／ｓｉＳＰＯＴＲ２３（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ／ｓｉＳＰＯＴＲ２４（配列番号２６）、及びｓｉＲＮＡ ＴＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２５（配列番号２４））、並びにエクソン１（配列番号１２９、ｓｉＲＮＡ ＣＫ（配列番号２９）、ｓｉＲＮＡ ＴＣ（配列番号２８）、及びｓｉＲＮＡ ＴＣ／ｓｉＳＰＯＴＲ１（配列番号２８））のコード配列（ＣＤＳ）内の予測結合領域に対してアラインメントされた抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤の模式図。（図１Ｄ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン２（配列番号１３０）内の特定されたループ１領域（配列番号１４５）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（Ｇ０、配列番号１）の模式図。（図１Ｅ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１０（配列番号１３８）内の特定されたループ５（配列番号１４９）及びループ６（配列番号１５０）領域に対してアラインメントされた、５つの例示的なＡＳＯ配列（ＧＤ（配列番号７、ＭＵ（配列番号９６）、ＭＴ（配列番号９９）、ＭＳ（配列番号９９）、及びＧ３（配列番号８））の模式図。（図１Ｆ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１１（配列番号１３９）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（ＭＪ（配列番号８９）、ＴＨ（配列番号２２、ＭＩ（配列番号９０）、Ｙ９（配列番号８８）、ＴＫ（配列番号７４）、Ｙ８（配列番号８７、ＴＩ（配列番号７６、ＣＵ（配列番号３９）、及びＹ７（配列番号６２））を示す模式図。（図１Ｇ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補ＡＳＯ剤によるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのレポーターノックダウン率（表２も参照されたい）。（図１Ｈ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤について非特異的なホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）の減少。（図１Ｉ）空の対照ベクターからの残留ｆｆｌｕｃ発現の関数としてのＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡノックダウン率を示す散布図（標的化されたｆｆｌｕｃノックダウン及び非特異的なｆｆｌｕｃノックダウンの関係）。（図１Ｊ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｋ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｌ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｍ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｎ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｏ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｐ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験される１９ｂｐのｓｉＲＮＡの各々におけるＧ又はＣとして特定される塩基の率（ＧＣ含有量）の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｑ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのＧＣ含有量の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。 図１Ａ～１Ｑは、細胞におけるＧｌｕＫ２タンパク質の発現をノックダウン（ＫＤ）するためのグルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（Ｇｒｉｋ２） ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）構築物の特定及び評価を示す。（図１Ａ）セントロイドエントロピーモデルであるＲＮＡｆｏｌｄによって予測されるような、ヒトＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡバリアント１（配列番号１１５）の予測二次構造。（図１Ｂ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに対する複数の抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯの予測結合領域。例示的な結合領域には、特定されたループ領域（１＝ループ１（配列番号１４５）、２＝ループ２（配列番号１４６）、３＝ループ３（配列番号１４７）、４＝ループ４（配列番号１４８）、５＝ループ５（配列番号１４９）、６＝ループ６（配列番号１５０）、７＝非対形成１（配列番号１５９）、８＝非対形成２（配列番号１６０）、９＝ループ７（配列番号１５１）、１０＝ループ８（配列番号１５２）、１１＝ループ９（配列番号１５３）、１２＝ループ１０（配列番号１５４）、１３＝非対形成３（配列番号１６１）、１４＝ループ１１（配列番号１５５）、１５＝非対形成４（配列番号１６２）、１６＝非対形成５（配列番号１６３）、１７＝ループ１２（配列番号１５６）、１８＝ループ１３（配列番号１５７）、及び１９＝ループ１４（配列番号１５８））、並びにステム様非対形成領域（それぞれ、配列番号１５９～１６３に対応するアラビア数字１５～１９によって示される）が含まれる。（図１Ｃ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）の５’ＵＴＲ（配列番号１２６、ｓｉＲＮＡ Ｄ３（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＸＺ（配列番号５４）、ｓｉＲＮＡ ＣＹ（配列番号４３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ１（配列番号４６）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ Ｙ０（配列番号５５）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ０（配列番号４５）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ（配列番号２６）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＥ（配列番号２５）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＦ（配列番号２４）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ／ｓｉＳＰＯＴＲ１５（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＺＺ／ｓｉＳＰＯＴＲ１６（配列番号１００）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ／ｓｉＳＰＯＴＲ１７（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ Ｄ３／ｓｉＳＰＯＴＲ１８（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ／ｓｉＳＰＯＴＲ１９（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２０（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ／ｓｉＳＰＯＴＲ２１（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ／ｓｉＳＰＯＴＲ２２（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ／ｓｉＳＰＯＴＲ２３（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ／ｓｉＳＰＯＴＲ２４（配列番号２６）、及びｓｉＲＮＡ ＴＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２５（配列番号２４））、並びにエクソン１（配列番号１２９、ｓｉＲＮＡ ＣＫ（配列番号２９）、ｓｉＲＮＡ ＴＣ（配列番号２８）、及びｓｉＲＮＡ ＴＣ／ｓｉＳＰＯＴＲ１（配列番号２８））のコード配列（ＣＤＳ）内の予測結合領域に対してアラインメントされた抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤の模式図。（図１Ｄ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン２（配列番号１３０）内の特定されたループ１領域（配列番号１４５）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（Ｇ０、配列番号１）の模式図。（図１Ｅ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１０（配列番号１３８）内の特定されたループ５（配列番号１４９）及びループ６（配列番号１５０）領域に対してアラインメントされた、５つの例示的なＡＳＯ配列（ＧＤ（配列番号７、ＭＵ（配列番号９６）、ＭＴ（配列番号９９）、ＭＳ（配列番号９９）、及びＧ３（配列番号８））の模式図。（図１Ｆ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１１（配列番号１３９）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（ＭＪ（配列番号８９）、ＴＨ（配列番号２２、ＭＩ（配列番号９０）、Ｙ９（配列番号８８）、ＴＫ（配列番号７４）、Ｙ８（配列番号８７、ＴＩ（配列番号７６、ＣＵ（配列番号３９）、及びＹ７（配列番号６２））を示す模式図。（図１Ｇ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補ＡＳＯ剤によるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのレポーターノックダウン率（表２も参照されたい）。（図１Ｈ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤について非特異的なホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）の減少。（図１Ｉ）空の対照ベクターからの残留ｆｆｌｕｃ発現の関数としてのＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡノックダウン率を示す散布図（標的化されたｆｆｌｕｃノックダウン及び非特異的なｆｆｌｕｃノックダウンの関係）。（図１Ｊ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｋ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｌ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｍ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｎ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｏ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｐ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験される１９ｂｐのｓｉＲＮＡの各々におけるＧ又はＣとして特定される塩基の率（ＧＣ含有量）の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｑ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのＧＣ含有量の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。 図１Ａ～１Ｑは、細胞におけるＧｌｕＫ２タンパク質の発現をノックダウン（ＫＤ）するためのグルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（Ｇｒｉｋ２） ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）構築物の特定及び評価を示す。（図１Ａ）セントロイドエントロピーモデルであるＲＮＡｆｏｌｄによって予測されるような、ヒトＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡバリアント１（配列番号１１５）の予測二次構造。（図１Ｂ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに対する複数の抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯの予測結合領域。例示的な結合領域には、特定されたループ領域（１＝ループ１（配列番号１４５）、２＝ループ２（配列番号１４６）、３＝ループ３（配列番号１４７）、４＝ループ４（配列番号１４８）、５＝ループ５（配列番号１４９）、６＝ループ６（配列番号１５０）、７＝非対形成１（配列番号１５９）、８＝非対形成２（配列番号１６０）、９＝ループ７（配列番号１５１）、１０＝ループ８（配列番号１５２）、１１＝ループ９（配列番号１５３）、１２＝ループ１０（配列番号１５４）、１３＝非対形成３（配列番号１６１）、１４＝ループ１１（配列番号１５５）、１５＝非対形成４（配列番号１６２）、１６＝非対形成５（配列番号１６３）、１７＝ループ１２（配列番号１５６）、１８＝ループ１３（配列番号１５７）、及び１９＝ループ１４（配列番号１５８））、並びにステム様非対形成領域（それぞれ、配列番号１５９～１６３に対応するアラビア数字１５～１９によって示される）が含まれる。（図１Ｃ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）の５’ＵＴＲ（配列番号１２６、ｓｉＲＮＡ Ｄ３（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＸＺ（配列番号５４）、ｓｉＲＮＡ ＣＹ（配列番号４３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ１（配列番号４６）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ Ｙ０（配列番号５５）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ０（配列番号４５）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ（配列番号２６）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＥ（配列番号２５）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＦ（配列番号２４）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ／ｓｉＳＰＯＴＲ１５（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＺＺ／ｓｉＳＰＯＴＲ１６（配列番号１００）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ／ｓｉＳＰＯＴＲ１７（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ Ｄ３／ｓｉＳＰＯＴＲ１８（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ／ｓｉＳＰＯＴＲ１９（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２０（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ／ｓｉＳＰＯＴＲ２１（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ／ｓｉＳＰＯＴＲ２２（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ／ｓｉＳＰＯＴＲ２３（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ／ｓｉＳＰＯＴＲ２４（配列番号２６）、及びｓｉＲＮＡ ＴＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２５（配列番号２４））、並びにエクソン１（配列番号１２９、ｓｉＲＮＡ ＣＫ（配列番号２９）、ｓｉＲＮＡ ＴＣ（配列番号２８）、及びｓｉＲＮＡ ＴＣ／ｓｉＳＰＯＴＲ１（配列番号２８））のコード配列（ＣＤＳ）内の予測結合領域に対してアラインメントされた抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤の模式図。（図１Ｄ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン２（配列番号１３０）内の特定されたループ１領域（配列番号１４５）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（Ｇ０、配列番号１）の模式図。（図１Ｅ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１０（配列番号１３８）内の特定されたループ５（配列番号１４９）及びループ６（配列番号１５０）領域に対してアラインメントされた、５つの例示的なＡＳＯ配列（ＧＤ（配列番号７、ＭＵ（配列番号９６）、ＭＴ（配列番号９９）、ＭＳ（配列番号９９）、及びＧ３（配列番号８））の模式図。（図１Ｆ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１１（配列番号１３９）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（ＭＪ（配列番号８９）、ＴＨ（配列番号２２、ＭＩ（配列番号９０）、Ｙ９（配列番号８８）、ＴＫ（配列番号７４）、Ｙ８（配列番号８７、ＴＩ（配列番号７６、ＣＵ（配列番号３９）、及びＹ７（配列番号６２））を示す模式図。（図１Ｇ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補ＡＳＯ剤によるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのレポーターノックダウン率（表２も参照されたい）。（図１Ｈ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤について非特異的なホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）の減少。（図１Ｉ）空の対照ベクターからの残留ｆｆｌｕｃ発現の関数としてのＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡノックダウン率を示す散布図（標的化されたｆｆｌｕｃノックダウン及び非特異的なｆｆｌｕｃノックダウンの関係）。（図１Ｊ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｋ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｌ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｍ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｎ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｏ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｐ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験される１９ｂｐのｓｉＲＮＡの各々におけるＧ又はＣとして特定される塩基の率（ＧＣ含有量）の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｑ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのＧＣ含有量の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。 図１Ａ～１Ｑは、細胞におけるＧｌｕＫ２タンパク質の発現をノックダウン（ＫＤ）するためのグルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（Ｇｒｉｋ２） ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）構築物の特定及び評価を示す。（図１Ａ）セントロイドエントロピーモデルであるＲＮＡｆｏｌｄによって予測されるような、ヒトＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡバリアント１（配列番号１１５）の予測二次構造。（図１Ｂ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに対する複数の抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯの予測結合領域。例示的な結合領域には、特定されたループ領域（１＝ループ１（配列番号１４５）、２＝ループ２（配列番号１４６）、３＝ループ３（配列番号１４７）、４＝ループ４（配列番号１４８）、５＝ループ５（配列番号１４９）、６＝ループ６（配列番号１５０）、７＝非対形成１（配列番号１５９）、８＝非対形成２（配列番号１６０）、９＝ループ７（配列番号１５１）、１０＝ループ８（配列番号１５２）、１１＝ループ９（配列番号１５３）、１２＝ループ１０（配列番号１５４）、１３＝非対形成３（配列番号１６１）、１４＝ループ１１（配列番号１５５）、１５＝非対形成４（配列番号１６２）、１６＝非対形成５（配列番号１６３）、１７＝ループ１２（配列番号１５６）、１８＝ループ１３（配列番号１５７）、及び１９＝ループ１４（配列番号１５８））、並びにステム様非対形成領域（それぞれ、配列番号１５９～１６３に対応するアラビア数字１５～１９によって示される）が含まれる。（図１Ｃ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）の５’ＵＴＲ（配列番号１２６、ｓｉＲＮＡ Ｄ３（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＸＺ（配列番号５４）、ｓｉＲＮＡ ＣＹ（配列番号４３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ１（配列番号４６）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ Ｙ０（配列番号５５）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ０（配列番号４５）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ（配列番号２６）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＥ（配列番号２５）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＦ（配列番号２４）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ／ｓｉＳＰＯＴＲ１５（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＺＺ／ｓｉＳＰＯＴＲ１６（配列番号１００）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ／ｓｉＳＰＯＴＲ１７（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ Ｄ３／ｓｉＳＰＯＴＲ１８（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ／ｓｉＳＰＯＴＲ１９（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２０（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ／ｓｉＳＰＯＴＲ２１（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ／ｓｉＳＰＯＴＲ２２（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ／ｓｉＳＰＯＴＲ２３（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ／ｓｉＳＰＯＴＲ２４（配列番号２６）、及びｓｉＲＮＡ ＴＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２５（配列番号２４））、並びにエクソン１（配列番号１２９、ｓｉＲＮＡ ＣＫ（配列番号２９）、ｓｉＲＮＡ ＴＣ（配列番号２８）、及びｓｉＲＮＡ ＴＣ／ｓｉＳＰＯＴＲ１（配列番号２８））のコード配列（ＣＤＳ）内の予測結合領域に対してアラインメントされた抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤の模式図。（図１Ｄ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン２（配列番号１３０）内の特定されたループ１領域（配列番号１４５）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（Ｇ０、配列番号１）の模式図。（図１Ｅ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１０（配列番号１３８）内の特定されたループ５（配列番号１４９）及びループ６（配列番号１５０）領域に対してアラインメントされた、５つの例示的なＡＳＯ配列（ＧＤ（配列番号７、ＭＵ（配列番号９６）、ＭＴ（配列番号９９）、ＭＳ（配列番号９９）、及びＧ３（配列番号８））の模式図。（図１Ｆ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１１（配列番号１３９）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（ＭＪ（配列番号８９）、ＴＨ（配列番号２２、ＭＩ（配列番号９０）、Ｙ９（配列番号８８）、ＴＫ（配列番号７４）、Ｙ８（配列番号８７、ＴＩ（配列番号７６、ＣＵ（配列番号３９）、及びＹ７（配列番号６２））を示す模式図。（図１Ｇ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補ＡＳＯ剤によるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのレポーターノックダウン率（表２も参照されたい）。（図１Ｈ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤について非特異的なホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）の減少。（図１Ｉ）空の対照ベクターからの残留ｆｆｌｕｃ発現の関数としてのＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡノックダウン率を示す散布図（標的化されたｆｆｌｕｃノックダウン及び非特異的なｆｆｌｕｃノックダウンの関係）。（図１Ｊ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｋ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｌ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｍ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｎ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｏ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｐ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験される１９ｂｐのｓｉＲＮＡの各々におけるＧ又はＣとして特定される塩基の率（ＧＣ含有量）の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｑ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのＧＣ含有量の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。 図１Ａ～１Ｑは、細胞におけるＧｌｕＫ２タンパク質の発現をノックダウン（ＫＤ）するためのグルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（Ｇｒｉｋ２） ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）構築物の特定及び評価を示す。（図１Ａ）セントロイドエントロピーモデルであるＲＮＡｆｏｌｄによって予測されるような、ヒトＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡバリアント１（配列番号１１５）の予測二次構造。（図１Ｂ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに対する複数の抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯの予測結合領域。例示的な結合領域には、特定されたループ領域（１＝ループ１（配列番号１４５）、２＝ループ２（配列番号１４６）、３＝ループ３（配列番号１４７）、４＝ループ４（配列番号１４８）、５＝ループ５（配列番号１４９）、６＝ループ６（配列番号１５０）、７＝非対形成１（配列番号１５９）、８＝非対形成２（配列番号１６０）、９＝ループ７（配列番号１５１）、１０＝ループ８（配列番号１５２）、１１＝ループ９（配列番号１５３）、１２＝ループ１０（配列番号１５４）、１３＝非対形成３（配列番号１６１）、１４＝ループ１１（配列番号１５５）、１５＝非対形成４（配列番号１６２）、１６＝非対形成５（配列番号１６３）、１７＝ループ１２（配列番号１５６）、１８＝ループ１３（配列番号１５７）、及び１９＝ループ１４（配列番号１５８））、並びにステム様非対形成領域（それぞれ、配列番号１５９～１６３に対応するアラビア数字１５～１９によって示される）が含まれる。（図１Ｃ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）の５’ＵＴＲ（配列番号１２６、ｓｉＲＮＡ Ｄ３（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＸＺ（配列番号５４）、ｓｉＲＮＡ ＣＹ（配列番号４３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ１（配列番号４６）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ Ｙ０（配列番号５５）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ０（配列番号４５）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ（配列番号２６）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＥ（配列番号２５）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＦ（配列番号２４）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ／ｓｉＳＰＯＴＲ１５（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＺＺ／ｓｉＳＰＯＴＲ１６（配列番号１００）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ／ｓｉＳＰＯＴＲ１７（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ Ｄ３／ｓｉＳＰＯＴＲ１８（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ／ｓｉＳＰＯＴＲ１９（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２０（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ／ｓｉＳＰＯＴＲ２１（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ／ｓｉＳＰＯＴＲ２２（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ／ｓｉＳＰＯＴＲ２３（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ／ｓｉＳＰＯＴＲ２４（配列番号２６）、及びｓｉＲＮＡ ＴＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２５（配列番号２４））、並びにエクソン１（配列番号１２９、ｓｉＲＮＡ ＣＫ（配列番号２９）、ｓｉＲＮＡ ＴＣ（配列番号２８）、及びｓｉＲＮＡ ＴＣ／ｓｉＳＰＯＴＲ１（配列番号２８））のコード配列（ＣＤＳ）内の予測結合領域に対してアラインメントされた抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤の模式図。（図１Ｄ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン２（配列番号１３０）内の特定されたループ１領域（配列番号１４５）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（Ｇ０、配列番号１）の模式図。（図１Ｅ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１０（配列番号１３８）内の特定されたループ５（配列番号１４９）及びループ６（配列番号１５０）領域に対してアラインメントされた、５つの例示的なＡＳＯ配列（ＧＤ（配列番号７、ＭＵ（配列番号９６）、ＭＴ（配列番号９９）、ＭＳ（配列番号９９）、及びＧ３（配列番号８））の模式図。（図１Ｆ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１１（配列番号１３９）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（ＭＪ（配列番号８９）、ＴＨ（配列番号２２、ＭＩ（配列番号９０）、Ｙ９（配列番号８８）、ＴＫ（配列番号７４）、Ｙ８（配列番号８７、ＴＩ（配列番号７６、ＣＵ（配列番号３９）、及びＹ７（配列番号６２））を示す模式図。（図１Ｇ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補ＡＳＯ剤によるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのレポーターノックダウン率（表２も参照されたい）。（図１Ｈ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤について非特異的なホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）の減少。（図１Ｉ）空の対照ベクターからの残留ｆｆｌｕｃ発現の関数としてのＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡノックダウン率を示す散布図（標的化されたｆｆｌｕｃノックダウン及び非特異的なｆｆｌｕｃノックダウンの関係）。（図１Ｊ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｋ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｌ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｍ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｎ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｏ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｐ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験される１９ｂｐのｓｉＲＮＡの各々におけるＧ又はＣとして特定される塩基の率（ＧＣ含有量）の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｑ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのＧＣ含有量の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。 図１Ａ～１Ｑは、細胞におけるＧｌｕＫ２タンパク質の発現をノックダウン（ＫＤ）するためのグルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（Ｇｒｉｋ２） ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）構築物の特定及び評価を示す。（図１Ａ）セントロイドエントロピーモデルであるＲＮＡｆｏｌｄによって予測されるような、ヒトＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡバリアント１（配列番号１１５）の予測二次構造。（図１Ｂ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに対する複数の抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯの予測結合領域。例示的な結合領域には、特定されたループ領域（１＝ループ１（配列番号１４５）、２＝ループ２（配列番号１４６）、３＝ループ３（配列番号１４７）、４＝ループ４（配列番号１４８）、５＝ループ５（配列番号１４９）、６＝ループ６（配列番号１５０）、７＝非対形成１（配列番号１５９）、８＝非対形成２（配列番号１６０）、９＝ループ７（配列番号１５１）、１０＝ループ８（配列番号１５２）、１１＝ループ９（配列番号１５３）、１２＝ループ１０（配列番号１５４）、１３＝非対形成３（配列番号１６１）、１４＝ループ１１（配列番号１５５）、１５＝非対形成４（配列番号１６２）、１６＝非対形成５（配列番号１６３）、１７＝ループ１２（配列番号１５６）、１８＝ループ１３（配列番号１５７）、及び１９＝ループ１４（配列番号１５８））、並びにステム様非対形成領域（それぞれ、配列番号１５９～１６３に対応するアラビア数字１５～１９によって示される）が含まれる。（図１Ｃ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）の５’ＵＴＲ（配列番号１２６、ｓｉＲＮＡ Ｄ３（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＸＺ（配列番号５４）、ｓｉＲＮＡ ＣＹ（配列番号４３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ１（配列番号４６）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ Ｙ０（配列番号５５）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ０（配列番号４５）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ（配列番号２６）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＥ（配列番号２５）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＦ（配列番号２４）、ｓｉＲＮＡ ＹＢ／ｓｉＳＰＯＴＲ１５（配列番号６７）、ｓｉＲＮＡ ＺＺ／ｓｉＳＰＯＴＲ１６（配列番号１００）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ／ｓｉＳＰＯＴＲ１７（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ Ｄ３／ｓｉＳＰＯＴＲ１８（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ／ｓｉＳＰＯＴＲ１９（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２０（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ／ｓｉＳＰＯＴＲ２１（配列番号６６）、ｓｉＲＮＡ ＴＪ／ｓｉＳＰＯＴＲ２２（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ／ｓｉＳＰＯＴＲ２３（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ／ｓｉＳＰＯＴＲ２４（配列番号２６）、及びｓｉＲＮＡ ＴＦ／ｓｉＳＰＯＴＲ２５（配列番号２４））、並びにエクソン１（配列番号１２９、ｓｉＲＮＡ ＣＫ（配列番号２９）、ｓｉＲＮＡ ＴＣ（配列番号２８）、及びｓｉＲＮＡ ＴＣ／ｓｉＳＰＯＴＲ１（配列番号２８））のコード配列（ＣＤＳ）内の予測結合領域に対してアラインメントされた抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤の模式図。（図１Ｄ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン２（配列番号１３０）内の特定されたループ１領域（配列番号１４５）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（Ｇ０、配列番号１）の模式図。（図１Ｅ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１０（配列番号１３８）内の特定されたループ５（配列番号１４９）及びループ６（配列番号１５０）領域に対してアラインメントされた、５つの例示的なＡＳＯ配列（ＧＤ（配列番号７、ＭＵ（配列番号９６）、ＭＴ（配列番号９９）、ＭＳ（配列番号９９）、及びＧ３（配列番号８））の模式図。（図１Ｆ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）のエクソン１１（配列番号１３９）に対してアラインメントされた、例示的なＡＳＯ剤（ＭＪ（配列番号８９）、ＴＨ（配列番号２２、ＭＩ（配列番号９０）、Ｙ９（配列番号８８）、ＴＫ（配列番号７４）、Ｙ８（配列番号８７、ＴＩ（配列番号７６、ＣＵ（配列番号３９）、及びＹ７（配列番号６２））を示す模式図。（図１Ｇ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補ＡＳＯ剤によるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのレポーターノックダウン率（表２も参照されたい）。（図１Ｈ）デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、種々の候補抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤について非特異的なホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）の減少。（図１Ｉ）空の対照ベクターからの残留ｆｆｌｕｃ発現の関数としてのＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡノックダウン率を示す散布図（標的化されたｆｆｌｕｃノックダウン及び非特異的なｆｆｌｕｃノックダウンの関係）。（図１Ｊ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｋ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での標的開放エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。標的開放エネルギーが９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関していた。（図１Ｌ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｍ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での二本鎖形成のエネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央及び右側の棒グラフ）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｎ）ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて試験される全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｏ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのｋｃａｌ／ｍｏｌ単位での総結合エネルギーの平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。（図１Ｐ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験される１９ｂｐのｓｉＲＮＡの各々におけるＧ又はＣとして特定される塩基の率（ＧＣ含有量）の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフは、左から右へ、以下を表す。試験された全ての１９ｂｐのｓｉＲＮＡ、レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡ、又はレポーター発現を６６％未満までノックダウンしたｓｉＲＮＡ。（図１Ｑ）ルシフェラーゼレポーターアッセイによって試験されるような、その１９ｂｐの等価物のノックダウン率に対する、全ての２１ｂｐのガイドについてのＧＣ含有量の平均（ＳＥＭを含む）値の棒グラフ。データの棒グラフ（中央、右側）は、レポーター誘導性Ｇｌｕｋ２発現を６６％を超えてノックダウンした等価なｓｉＲＮＡ、又は発現を６６％未満までノックダウンした等価なｓｉＲＮＡによって分けられた。 図２Ａ～２Ｊは、ウイルスベクター媒介性Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡサイレンシングによるＧｌｕＫ２ノックダウンの検証を示す。（図２Ａ～２Ｄ）図２Ａ～２Ｊに記載される実験に利用される例示的なベクター。（図２Ａ）ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８２）の制御下で、対照スクランブル配列（配列番号７７１）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ８４５）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｂ）Ｕ６プロモーター（配列番号７７２）の制御下で、ｓｈＲＮＡとしてＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ９４６）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｃ）ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８３）の制御下で、ｍｉＲＮＡとしてＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ９６２）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｄ）ｈＳｙｎプロモーター（ｐＡＡＶ－ｈＳｙｎ－ＥＧＦＰ、配列番号６８２）の制御下で、ＧＦＰをコードするＡＡＶベクターについての例示的なプラスミドマップ。（図２Ｅ）レンチウイルス（ＬＶ）－ヒトシナプシンプロモーター（ｈＳｙｎ（配列番号６８２））－緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）プラスミド構築物で感染した、培養されたラット海馬ニューロンの明視野画像（左パネル）及び蛍光画像（右パネル）。ＧＦＰ免疫蛍光は、培養されたニューロンの８０％より多くで観察された。（図２Ｆ）短ヘアピンＲＮＡ（ＬＶ－Ｕ６（配列番号７７２）－Ｇ９（ｓｈＲＮＡ）、又はＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするマイクロＲＮＡ（ＬＶ－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－Ｇ９（ｍｉＲＮＡ）構築物、又は対照配列（配列番号７７１、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８２）の制御下）のいずれかで、レンチウイルスにより媒介されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのノックダウン後のラット海馬ニューロンから得られたＧｌｕＫ２タンパク質及びアクチンのウェスタンブロット。（図２Ｇ）細胞においてＡＡＶ媒介性ウイルス形質導入に使用されるＡＡＶ発現カセットの模式図。（図２Ｈ）抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ配列（Ｇ９、配列番号６８）、又はスクランブル対照配列（ＬＶ：配列番号７７１、ＡＡＶ：ＧＣ－配列番号１０１）をコードするレンチウイルス又はＡＡＶ９ベクターで感染した海馬ニューロンについて、対照条件における値に対して正規化された、アクチンに対するＧｌｕＫ２タンパク質の相対的レベルを表す棒グラフ。（図２Ｉ）異なるウイルスによりコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ配列（Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＸＹ（配列番号８３）、Ｙ９（配列番号８８）、ＧＧ（配列番号９１））、及び対照配列（ＧＣ、配列番号１０１）で治療したマウス初代皮質ニューロンにおける、ウェスタンブロットによってアッセイされるような、ＧｌｕＫ２タンパク質の相対的レベルを示すプロット。（図２Ｊ）ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定されるような、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８３）の調節制御下で、５種類のＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、Ｙ９（配列番号８８）、ＸＹ（配列番号８３）、又はＭＵ（配列番号９６））、又はスクランブル対照配列（ＧＣ、配列番号１０１）のうちの１つをコードするプラスミドベクターを用いた、細胞密度１７，５００個の細胞／ウェル（１７．５ｋ ｃ／ｗ）で培養された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のグルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）の脂質ベースのトランスフェクションから５日後に測定されたＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ発現の倍率変化の棒グラフを示す。 図２Ａ～２Ｊは、ウイルスベクター媒介性Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡサイレンシングによるＧｌｕＫ２ノックダウンの検証を示す。（図２Ａ～２Ｄ）図２Ａ～２Ｊに記載される実験に利用される例示的なベクター。（図２Ａ）ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８２）の制御下で、対照スクランブル配列（配列番号７７１）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ８４５）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｂ）Ｕ６プロモーター（配列番号７７２）の制御下で、ｓｈＲＮＡとしてＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ９４６）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｃ）ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８３）の制御下で、ｍｉＲＮＡとしてＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ９６２）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｄ）ｈＳｙｎプロモーター（ｐＡＡＶ－ｈＳｙｎ－ＥＧＦＰ、配列番号６８２）の制御下で、ＧＦＰをコードするＡＡＶベクターについての例示的なプラスミドマップ。（図２Ｅ）レンチウイルス（ＬＶ）－ヒトシナプシンプロモーター（ｈＳｙｎ（配列番号６８２））－緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）プラスミド構築物で感染した、培養されたラット海馬ニューロンの明視野画像（左パネル）及び蛍光画像（右パネル）。ＧＦＰ免疫蛍光は、培養されたニューロンの８０％より多くで観察された。（図２Ｆ）短ヘアピンＲＮＡ（ＬＶ－Ｕ６（配列番号７７２）－Ｇ９（ｓｈＲＮＡ）、又はＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするマイクロＲＮＡ（ＬＶ－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－Ｇ９（ｍｉＲＮＡ）構築物、又は対照配列（配列番号７７１、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８２）の制御下）のいずれかで、レンチウイルスにより媒介されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのノックダウン後のラット海馬ニューロンから得られたＧｌｕＫ２タンパク質及びアクチンのウェスタンブロット。（図２Ｇ）細胞においてＡＡＶ媒介性ウイルス形質導入に使用されるＡＡＶ発現カセットの模式図。（図２Ｈ）抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ配列（Ｇ９、配列番号６８）、又はスクランブル対照配列（ＬＶ：配列番号７７１、ＡＡＶ：ＧＣ－配列番号１０１）をコードするレンチウイルス又はＡＡＶ９ベクターで感染した海馬ニューロンについて、対照条件における値に対して正規化された、アクチンに対するＧｌｕＫ２タンパク質の相対的レベルを表す棒グラフ。（図２Ｉ）異なるウイルスによりコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ配列（Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＸＹ（配列番号８３）、Ｙ９（配列番号８８）、ＧＧ（配列番号９１））、及び対照配列（ＧＣ、配列番号１０１）で治療したマウス初代皮質ニューロンにおける、ウェスタンブロットによってアッセイされるような、ＧｌｕＫ２タンパク質の相対的レベルを示すプロット。（図２Ｊ）ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定されるような、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８３）の調節制御下で、５種類のＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、Ｙ９（配列番号８８）、ＸＹ（配列番号８３）、又はＭＵ（配列番号９６））、又はスクランブル対照配列（ＧＣ、配列番号１０１）のうちの１つをコードするプラスミドベクターを用いた、細胞密度１７，５００個の細胞／ウェル（１７．５ｋ ｃ／ｗ）で培養された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のグルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）の脂質ベースのトランスフェクションから５日後に測定されたＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ発現の倍率変化の棒グラフを示す。 図２Ａ～２Ｊは、ウイルスベクター媒介性Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡサイレンシングによるＧｌｕＫ２ノックダウンの検証を示す。（図２Ａ～２Ｄ）図２Ａ～２Ｊに記載される実験に利用される例示的なベクター。（図２Ａ）ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８２）の制御下で、対照スクランブル配列（配列番号７７１）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ８４５）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｂ）Ｕ６プロモーター（配列番号７７２）の制御下で、ｓｈＲＮＡとしてＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ９４６）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｃ）ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８３）の制御下で、ｍｉＲＮＡとしてＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ９６２）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｄ）ｈＳｙｎプロモーター（ｐＡＡＶ－ｈＳｙｎ－ＥＧＦＰ、配列番号６８２）の制御下で、ＧＦＰをコードするＡＡＶベクターについての例示的なプラスミドマップ。（図２Ｅ）レンチウイルス（ＬＶ）－ヒトシナプシンプロモーター（ｈＳｙｎ（配列番号６８２））－緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）プラスミド構築物で感染した、培養されたラット海馬ニューロンの明視野画像（左パネル）及び蛍光画像（右パネル）。ＧＦＰ免疫蛍光は、培養されたニューロンの８０％より多くで観察された。（図２Ｆ）短ヘアピンＲＮＡ（ＬＶ－Ｕ６（配列番号７７２）－Ｇ９（ｓｈＲＮＡ）、又はＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするマイクロＲＮＡ（ＬＶ－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－Ｇ９（ｍｉＲＮＡ）構築物、又は対照配列（配列番号７７１、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８２）の制御下）のいずれかで、レンチウイルスにより媒介されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのノックダウン後のラット海馬ニューロンから得られたＧｌｕＫ２タンパク質及びアクチンのウェスタンブロット。（図２Ｇ）細胞においてＡＡＶ媒介性ウイルス形質導入に使用されるＡＡＶ発現カセットの模式図。（図２Ｈ）抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ配列（Ｇ９、配列番号６８）、又はスクランブル対照配列（ＬＶ：配列番号７７１、ＡＡＶ：ＧＣ－配列番号１０１）をコードするレンチウイルス又はＡＡＶ９ベクターで感染した海馬ニューロンについて、対照条件における値に対して正規化された、アクチンに対するＧｌｕＫ２タンパク質の相対的レベルを表す棒グラフ。（図２Ｉ）異なるウイルスによりコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ配列（Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＸＹ（配列番号８３）、Ｙ９（配列番号８８）、ＧＧ（配列番号９１））、及び対照配列（ＧＣ、配列番号１０１）で治療したマウス初代皮質ニューロンにおける、ウェスタンブロットによってアッセイされるような、ＧｌｕＫ２タンパク質の相対的レベルを示すプロット。（図２Ｊ）ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定されるような、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８３）の調節制御下で、５種類のＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、Ｙ９（配列番号８８）、ＸＹ（配列番号８３）、又はＭＵ（配列番号９６））、又はスクランブル対照配列（ＧＣ、配列番号１０１）のうちの１つをコードするプラスミドベクターを用いた、細胞密度１７，５００個の細胞／ウェル（１７．５ｋ ｃ／ｗ）で培養された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のグルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）の脂質ベースのトランスフェクションから５日後に測定されたＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ発現の倍率変化の棒グラフを示す。 図２Ａ～２Ｊは、ウイルスベクター媒介性Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡサイレンシングによるＧｌｕＫ２ノックダウンの検証を示す。（図２Ａ～２Ｄ）図２Ａ～２Ｊに記載される実験に利用される例示的なベクター。（図２Ａ）ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８２）の制御下で、対照スクランブル配列（配列番号７７１）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ８４５）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｂ）Ｕ６プロモーター（配列番号７７２）の制御下で、ｓｈＲＮＡとしてＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ９４６）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｃ）ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８３）の制御下で、ｍｉＲＮＡとしてＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ９６２）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｄ）ｈＳｙｎプロモーター（ｐＡＡＶ－ｈＳｙｎ－ＥＧＦＰ、配列番号６８２）の制御下で、ＧＦＰをコードするＡＡＶベクターについての例示的なプラスミドマップ。（図２Ｅ）レンチウイルス（ＬＶ）－ヒトシナプシンプロモーター（ｈＳｙｎ（配列番号６８２））－緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）プラスミド構築物で感染した、培養されたラット海馬ニューロンの明視野画像（左パネル）及び蛍光画像（右パネル）。ＧＦＰ免疫蛍光は、培養されたニューロンの８０％より多くで観察された。（図２Ｆ）短ヘアピンＲＮＡ（ＬＶ－Ｕ６（配列番号７７２）－Ｇ９（ｓｈＲＮＡ）、又はＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするマイクロＲＮＡ（ＬＶ－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－Ｇ９（ｍｉＲＮＡ）構築物、又は対照配列（配列番号７７１、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８２）の制御下）のいずれかで、レンチウイルスにより媒介されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのノックダウン後のラット海馬ニューロンから得られたＧｌｕＫ２タンパク質及びアクチンのウェスタンブロット。（図２Ｇ）細胞においてＡＡＶ媒介性ウイルス形質導入に使用されるＡＡＶ発現カセットの模式図。（図２Ｈ）抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ配列（Ｇ９、配列番号６８）、又はスクランブル対照配列（ＬＶ：配列番号７７１、ＡＡＶ：ＧＣ－配列番号１０１）をコードするレンチウイルス又はＡＡＶ９ベクターで感染した海馬ニューロンについて、対照条件における値に対して正規化された、アクチンに対するＧｌｕＫ２タンパク質の相対的レベルを表す棒グラフ。（図２Ｉ）異なるウイルスによりコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ配列（Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＸＹ（配列番号８３）、Ｙ９（配列番号８８）、ＧＧ（配列番号９１））、及び対照配列（ＧＣ、配列番号１０１）で治療したマウス初代皮質ニューロンにおける、ウェスタンブロットによってアッセイされるような、ＧｌｕＫ２タンパク質の相対的レベルを示すプロット。（図２Ｊ）ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定されるような、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８３）の調節制御下で、５種類のＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、Ｙ９（配列番号８８）、ＸＹ（配列番号８３）、又はＭＵ（配列番号９６））、又はスクランブル対照配列（ＧＣ、配列番号１０１）のうちの１つをコードするプラスミドベクターを用いた、細胞密度１７，５００個の細胞／ウェル（１７．５ｋ ｃ／ｗ）で培養された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のグルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）の脂質ベースのトランスフェクションから５日後に測定されたＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ発現の倍率変化の棒グラフを示す。 図２Ａ～２Ｊは、ウイルスベクター媒介性Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡサイレンシングによるＧｌｕＫ２ノックダウンの検証を示す。（図２Ａ～２Ｄ）図２Ａ～２Ｊに記載される実験に利用される例示的なベクター。（図２Ａ）ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８２）の制御下で、対照スクランブル配列（配列番号７７１）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ８４５）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｂ）Ｕ６プロモーター（配列番号７７２）の制御下で、ｓｈＲＮＡとしてＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ９４６）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｃ）ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８３）の制御下で、ｍｉＲＮＡとしてＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ９６２）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｄ）ｈＳｙｎプロモーター（ｐＡＡＶ－ｈＳｙｎ－ＥＧＦＰ、配列番号６８２）の制御下で、ＧＦＰをコードするＡＡＶベクターについての例示的なプラスミドマップ。（図２Ｅ）レンチウイルス（ＬＶ）－ヒトシナプシンプロモーター（ｈＳｙｎ（配列番号６８２））－緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）プラスミド構築物で感染した、培養されたラット海馬ニューロンの明視野画像（左パネル）及び蛍光画像（右パネル）。ＧＦＰ免疫蛍光は、培養されたニューロンの８０％より多くで観察された。（図２Ｆ）短ヘアピンＲＮＡ（ＬＶ－Ｕ６（配列番号７７２）－Ｇ９（ｓｈＲＮＡ）、又はＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするマイクロＲＮＡ（ＬＶ－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－Ｇ９（ｍｉＲＮＡ）構築物、又は対照配列（配列番号７７１、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８２）の制御下）のいずれかで、レンチウイルスにより媒介されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのノックダウン後のラット海馬ニューロンから得られたＧｌｕＫ２タンパク質及びアクチンのウェスタンブロット。（図２Ｇ）細胞においてＡＡＶ媒介性ウイルス形質導入に使用されるＡＡＶ発現カセットの模式図。（図２Ｈ）抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ配列（Ｇ９、配列番号６８）、又はスクランブル対照配列（ＬＶ：配列番号７７１、ＡＡＶ：ＧＣ－配列番号１０１）をコードするレンチウイルス又はＡＡＶ９ベクターで感染した海馬ニューロンについて、対照条件における値に対して正規化された、アクチンに対するＧｌｕＫ２タンパク質の相対的レベルを表す棒グラフ。（図２Ｉ）異なるウイルスによりコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ配列（Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＸＹ（配列番号８３）、Ｙ９（配列番号８８）、ＧＧ（配列番号９１））、及び対照配列（ＧＣ、配列番号１０１）で治療したマウス初代皮質ニューロンにおける、ウェスタンブロットによってアッセイされるような、ＧｌｕＫ２タンパク質の相対的レベルを示すプロット。（図２Ｊ）ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定されるような、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８３）の調節制御下で、５種類のＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、Ｙ９（配列番号８８）、ＸＹ（配列番号８３）、又はＭＵ（配列番号９６））、又はスクランブル対照配列（ＧＣ、配列番号１０１）のうちの１つをコードするプラスミドベクターを用いた、細胞密度１７，５００個の細胞／ウェル（１７．５ｋ ｃ／ｗ）で培養された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のグルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）の脂質ベースのトランスフェクションから５日後に測定されたＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ発現の倍率変化の棒グラフを示す。 図２Ａ～２Ｊは、ウイルスベクター媒介性Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡサイレンシングによるＧｌｕＫ２ノックダウンの検証を示す。（図２Ａ～２Ｄ）図２Ａ～２Ｊに記載される実験に利用される例示的なベクター。（図２Ａ）ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８２）の制御下で、対照スクランブル配列（配列番号７７１）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ８４５）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｂ）Ｕ６プロモーター（配列番号７７２）の制御下で、ｓｈＲＮＡとしてＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ９４６）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｃ）ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８３）の制御下で、ｍｉＲＮＡとしてＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ９６２）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｄ）ｈＳｙｎプロモーター（ｐＡＡＶ－ｈＳｙｎ－ＥＧＦＰ、配列番号６８２）の制御下で、ＧＦＰをコードするＡＡＶベクターについての例示的なプラスミドマップ。（図２Ｅ）レンチウイルス（ＬＶ）－ヒトシナプシンプロモーター（ｈＳｙｎ（配列番号６８２））－緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）プラスミド構築物で感染した、培養されたラット海馬ニューロンの明視野画像（左パネル）及び蛍光画像（右パネル）。ＧＦＰ免疫蛍光は、培養されたニューロンの８０％より多くで観察された。（図２Ｆ）短ヘアピンＲＮＡ（ＬＶ－Ｕ６（配列番号７７２）－Ｇ９（ｓｈＲＮＡ）、又はＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするマイクロＲＮＡ（ＬＶ－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－Ｇ９（ｍｉＲＮＡ）構築物、又は対照配列（配列番号７７１、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８２）の制御下）のいずれかで、レンチウイルスにより媒介されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのノックダウン後のラット海馬ニューロンから得られたＧｌｕＫ２タンパク質及びアクチンのウェスタンブロット。（図２Ｇ）細胞においてＡＡＶ媒介性ウイルス形質導入に使用されるＡＡＶ発現カセットの模式図。（図２Ｈ）抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ配列（Ｇ９、配列番号６８）、又はスクランブル対照配列（ＬＶ：配列番号７７１、ＡＡＶ：ＧＣ－配列番号１０１）をコードするレンチウイルス又はＡＡＶ９ベクターで感染した海馬ニューロンについて、対照条件における値に対して正規化された、アクチンに対するＧｌｕＫ２タンパク質の相対的レベルを表す棒グラフ。（図２Ｉ）異なるウイルスによりコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ配列（Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＸＹ（配列番号８３）、Ｙ９（配列番号８８）、ＧＧ（配列番号９１））、及び対照配列（ＧＣ、配列番号１０１）で治療したマウス初代皮質ニューロンにおける、ウェスタンブロットによってアッセイされるような、ＧｌｕＫ２タンパク質の相対的レベルを示すプロット。（図２Ｊ）ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定されるような、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８３）の調節制御下で、５種類のＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、Ｙ９（配列番号８８）、ＸＹ（配列番号８３）、又はＭＵ（配列番号９６））、又はスクランブル対照配列（ＧＣ、配列番号１０１）のうちの１つをコードするプラスミドベクターを用いた、細胞密度１７，５００個の細胞／ウェル（１７．５ｋ ｃ／ｗ）で培養された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のグルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）の脂質ベースのトランスフェクションから５日後に測定されたＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ発現の倍率変化の棒グラフを示す。 図２Ａ～２Ｊは、ウイルスベクター媒介性Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡサイレンシングによるＧｌｕＫ２ノックダウンの検証を示す。（図２Ａ～２Ｄ）図２Ａ～２Ｊに記載される実験に利用される例示的なベクター。（図２Ａ）ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８２）の制御下で、対照スクランブル配列（配列番号７７１）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ８４５）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｂ）Ｕ６プロモーター（配列番号７７２）の制御下で、ｓｈＲＮＡとしてＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ９４６）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｃ）ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８３）の制御下で、ｍｉＲＮＡとしてＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ９６２）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｄ）ｈＳｙｎプロモーター（ｐＡＡＶ－ｈＳｙｎ－ＥＧＦＰ、配列番号６８２）の制御下で、ＧＦＰをコードするＡＡＶベクターについての例示的なプラスミドマップ。（図２Ｅ）レンチウイルス（ＬＶ）－ヒトシナプシンプロモーター（ｈＳｙｎ（配列番号６８２））－緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）プラスミド構築物で感染した、培養されたラット海馬ニューロンの明視野画像（左パネル）及び蛍光画像（右パネル）。ＧＦＰ免疫蛍光は、培養されたニューロンの８０％より多くで観察された。（図２Ｆ）短ヘアピンＲＮＡ（ＬＶ－Ｕ６（配列番号７７２）－Ｇ９（ｓｈＲＮＡ）、又はＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするマイクロＲＮＡ（ＬＶ－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－Ｇ９（ｍｉＲＮＡ）構築物、又は対照配列（配列番号７７１、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８２）の制御下）のいずれかで、レンチウイルスにより媒介されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのノックダウン後のラット海馬ニューロンから得られたＧｌｕＫ２タンパク質及びアクチンのウェスタンブロット。（図２Ｇ）細胞においてＡＡＶ媒介性ウイルス形質導入に使用されるＡＡＶ発現カセットの模式図。（図２Ｈ）抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ配列（Ｇ９、配列番号６８）、又はスクランブル対照配列（ＬＶ：配列番号７７１、ＡＡＶ：ＧＣ－配列番号１０１）をコードするレンチウイルス又はＡＡＶ９ベクターで感染した海馬ニューロンについて、対照条件における値に対して正規化された、アクチンに対するＧｌｕＫ２タンパク質の相対的レベルを表す棒グラフ。（図２Ｉ）異なるウイルスによりコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ配列（Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＸＹ（配列番号８３）、Ｙ９（配列番号８８）、ＧＧ（配列番号９１））、及び対照配列（ＧＣ、配列番号１０１）で治療したマウス初代皮質ニューロンにおける、ウェスタンブロットによってアッセイされるような、ＧｌｕＫ２タンパク質の相対的レベルを示すプロット。（図２Ｊ）ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定されるような、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８３）の調節制御下で、５種類のＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、Ｙ９（配列番号８８）、ＸＹ（配列番号８３）、又はＭＵ（配列番号９６））、又はスクランブル対照配列（ＧＣ、配列番号１０１）のうちの１つをコードするプラスミドベクターを用いた、細胞密度１７，５００個の細胞／ウェル（１７．５ｋ ｃ／ｗ）で培養された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のグルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）の脂質ベースのトランスフェクションから５日後に測定されたＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ発現の倍率変化の棒グラフを示す。 図２Ａ～２Ｊは、ウイルスベクター媒介性Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡサイレンシングによるＧｌｕＫ２ノックダウンの検証を示す。（図２Ａ～２Ｄ）図２Ａ～２Ｊに記載される実験に利用される例示的なベクター。（図２Ａ）ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８２）の制御下で、対照スクランブル配列（配列番号７７１）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ８４５）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｂ）Ｕ６プロモーター（配列番号７７２）の制御下で、ｓｈＲＮＡとしてＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ９４６）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｃ）ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８３）の制御下で、ｍｉＲＮＡとしてＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ９６２）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｄ）ｈＳｙｎプロモーター（ｐＡＡＶ－ｈＳｙｎ－ＥＧＦＰ、配列番号６８２）の制御下で、ＧＦＰをコードするＡＡＶベクターについての例示的なプラスミドマップ。（図２Ｅ）レンチウイルス（ＬＶ）－ヒトシナプシンプロモーター（ｈＳｙｎ（配列番号６８２））－緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）プラスミド構築物で感染した、培養されたラット海馬ニューロンの明視野画像（左パネル）及び蛍光画像（右パネル）。ＧＦＰ免疫蛍光は、培養されたニューロンの８０％より多くで観察された。（図２Ｆ）短ヘアピンＲＮＡ（ＬＶ－Ｕ６（配列番号７７２）－Ｇ９（ｓｈＲＮＡ）、又はＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするマイクロＲＮＡ（ＬＶ－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－Ｇ９（ｍｉＲＮＡ）構築物、又は対照配列（配列番号７７１、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８２）の制御下）のいずれかで、レンチウイルスにより媒介されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのノックダウン後のラット海馬ニューロンから得られたＧｌｕＫ２タンパク質及びアクチンのウェスタンブロット。（図２Ｇ）細胞においてＡＡＶ媒介性ウイルス形質導入に使用されるＡＡＶ発現カセットの模式図。（図２Ｈ）抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ配列（Ｇ９、配列番号６８）、又はスクランブル対照配列（ＬＶ：配列番号７７１、ＡＡＶ：ＧＣ－配列番号１０１）をコードするレンチウイルス又はＡＡＶ９ベクターで感染した海馬ニューロンについて、対照条件における値に対して正規化された、アクチンに対するＧｌｕＫ２タンパク質の相対的レベルを表す棒グラフ。（図２Ｉ）異なるウイルスによりコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ配列（Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＸＹ（配列番号８３）、Ｙ９（配列番号８８）、ＧＧ（配列番号９１））、及び対照配列（ＧＣ、配列番号１０１）で治療したマウス初代皮質ニューロンにおける、ウェスタンブロットによってアッセイされるような、ＧｌｕＫ２タンパク質の相対的レベルを示すプロット。（図２Ｊ）ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定されるような、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８３）の調節制御下で、５種類のＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、Ｙ９（配列番号８８）、ＸＹ（配列番号８３）、又はＭＵ（配列番号９６））、又はスクランブル対照配列（ＧＣ、配列番号１０１）のうちの１つをコードするプラスミドベクターを用いた、細胞密度１７，５００個の細胞／ウェル（１７．５ｋ ｃ／ｗ）で培養された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のグルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）の脂質ベースのトランスフェクションから５日後に測定されたＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ発現の倍率変化の棒グラフを示す。 図２Ａ～２Ｊは、ウイルスベクター媒介性Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡサイレンシングによるＧｌｕＫ２ノックダウンの検証を示す。（図２Ａ～２Ｄ）図２Ａ～２Ｊに記載される実験に利用される例示的なベクター。（図２Ａ）ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８２）の制御下で、対照スクランブル配列（配列番号７７１）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ８４５）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｂ）Ｕ６プロモーター（配列番号７７２）の制御下で、ｓｈＲＮＡとしてＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ９４６）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｃ）ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８３）の制御下で、ｍｉＲＮＡとしてＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ９６２）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｄ）ｈＳｙｎプロモーター（ｐＡＡＶ－ｈＳｙｎ－ＥＧＦＰ、配列番号６８２）の制御下で、ＧＦＰをコードするＡＡＶベクターについての例示的なプラスミドマップ。（図２Ｅ）レンチウイルス（ＬＶ）－ヒトシナプシンプロモーター（ｈＳｙｎ（配列番号６８２））－緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）プラスミド構築物で感染した、培養されたラット海馬ニューロンの明視野画像（左パネル）及び蛍光画像（右パネル）。ＧＦＰ免疫蛍光は、培養されたニューロンの８０％より多くで観察された。（図２Ｆ）短ヘアピンＲＮＡ（ＬＶ－Ｕ６（配列番号７７２）－Ｇ９（ｓｈＲＮＡ）、又はＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするマイクロＲＮＡ（ＬＶ－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－Ｇ９（ｍｉＲＮＡ）構築物、又は対照配列（配列番号７７１、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８２）の制御下）のいずれかで、レンチウイルスにより媒介されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのノックダウン後のラット海馬ニューロンから得られたＧｌｕＫ２タンパク質及びアクチンのウェスタンブロット。（図２Ｇ）細胞においてＡＡＶ媒介性ウイルス形質導入に使用されるＡＡＶ発現カセットの模式図。（図２Ｈ）抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ配列（Ｇ９、配列番号６８）、又はスクランブル対照配列（ＬＶ：配列番号７７１、ＡＡＶ：ＧＣ－配列番号１０１）をコードするレンチウイルス又はＡＡＶ９ベクターで感染した海馬ニューロンについて、対照条件における値に対して正規化された、アクチンに対するＧｌｕＫ２タンパク質の相対的レベルを表す棒グラフ。（図２Ｉ）異なるウイルスによりコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ配列（Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＸＹ（配列番号８３）、Ｙ９（配列番号８８）、ＧＧ（配列番号９１））、及び対照配列（ＧＣ、配列番号１０１）で治療したマウス初代皮質ニューロンにおける、ウェスタンブロットによってアッセイされるような、ＧｌｕＫ２タンパク質の相対的レベルを示すプロット。（図２Ｊ）ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定されるような、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８３）の調節制御下で、５種類のＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、Ｙ９（配列番号８８）、ＸＹ（配列番号８３）、又はＭＵ（配列番号９６））、又はスクランブル対照配列（ＧＣ、配列番号１０１）のうちの１つをコードするプラスミドベクターを用いた、細胞密度１７，５００個の細胞／ウェル（１７．５ｋ ｃ／ｗ）で培養された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のグルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）の脂質ベースのトランスフェクションから５日後に測定されたＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ発現の倍率変化の棒グラフを示す。 図２Ａ～２Ｊは、ウイルスベクター媒介性Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡサイレンシングによるＧｌｕＫ２ノックダウンの検証を示す。（図２Ａ～２Ｄ）図２Ａ～２Ｊに記載される実験に利用される例示的なベクター。（図２Ａ）ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８２）の制御下で、対照スクランブル配列（配列番号７７１）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ８４５）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｂ）Ｕ６プロモーター（配列番号７７２）の制御下で、ｓｈＲＮＡとしてＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ９４６）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｃ）ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８３）の制御下で、ｍｉＲＮＡとしてＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするレンチウイルスベクター（ＣＭ９６２）についての例示的なレンチウイルスプラスミドマップ。（図２Ｄ）ｈＳｙｎプロモーター（ｐＡＡＶ－ｈＳｙｎ－ＥＧＦＰ、配列番号６８２）の制御下で、ＧＦＰをコードするＡＡＶベクターについての例示的なプラスミドマップ。（図２Ｅ）レンチウイルス（ＬＶ）－ヒトシナプシンプロモーター（ｈＳｙｎ（配列番号６８２））－緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）プラスミド構築物で感染した、培養されたラット海馬ニューロンの明視野画像（左パネル）及び蛍光画像（右パネル）。ＧＦＰ免疫蛍光は、培養されたニューロンの８０％より多くで観察された。（図２Ｆ）短ヘアピンＲＮＡ（ＬＶ－Ｕ６（配列番号７７２）－Ｇ９（ｓｈＲＮＡ）、又はＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするマイクロＲＮＡ（ＬＶ－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－Ｇ９（ｍｉＲＮＡ）構築物、又は対照配列（配列番号７７１、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８２）の制御下）のいずれかで、レンチウイルスにより媒介されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのノックダウン後のラット海馬ニューロンから得られたＧｌｕＫ２タンパク質及びアクチンのウェスタンブロット。（図２Ｇ）細胞においてＡＡＶ媒介性ウイルス形質導入に使用されるＡＡＶ発現カセットの模式図。（図２Ｈ）抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ配列（Ｇ９、配列番号６８）、又はスクランブル対照配列（ＬＶ：配列番号７７１、ＡＡＶ：ＧＣ－配列番号１０１）をコードするレンチウイルス又はＡＡＶ９ベクターで感染した海馬ニューロンについて、対照条件における値に対して正規化された、アクチンに対するＧｌｕＫ２タンパク質の相対的レベルを表す棒グラフ。（図２Ｉ）異なるウイルスによりコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ配列（Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＸＹ（配列番号８３）、Ｙ９（配列番号８８）、ＧＧ（配列番号９１））、及び対照配列（ＧＣ、配列番号１０１）で治療したマウス初代皮質ニューロンにおける、ウェスタンブロットによってアッセイされるような、ＧｌｕＫ２タンパク質の相対的レベルを示すプロット。（図２Ｊ）ＲＴ－ｑＰＣＲによって測定されるような、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８３）の調節制御下で、５種類のＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、Ｙ９（配列番号８８）、ＸＹ（配列番号８３）、又はＭＵ（配列番号９６））、又はスクランブル対照配列（ＧＣ、配列番号１０１）のうちの１つをコードするプラスミドベクターを用いた、細胞密度１７，５００個の細胞／ウェル（１７．５ｋ ｃ／ｗ）で培養された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のグルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）の脂質ベースのトランスフェクションから５日後に測定されたＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ発現の倍率変化の棒グラフを示す。 図３Ａ～３Ｄは、マウスインビトロモデルにおける海馬てんかん性活性に対する、ウイルスによりコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤の効果を示す。（図３Ａ）スクランブル配列（配列番号１０１）を含有するＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８２）－ＧＦＰ－スクランブル構築物で感染した器官型海馬脳切片を示す蛍光画像。切片を、プロスペロホメオボックスタンパク質１（Ｐｒｏｘ１）抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で免疫染色し、海馬の歯状回（ＤＧ）細胞を標識した。（図３Ｂ）マウス器官型海馬切片から記録されたＥＤの例示的な細胞外電圧トレース。（図３Ｃ）ｈＳｙｎプロモーター（ＬＶ及びＡＡＶ９－ＧＣ：配列番号６８２、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ－Ｇ９：配列番号６８３）の制御下でのｍｉＲＮＡ構築物としての抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ配列（Ｇ９、配列番号６８、＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊、ｐ＜０．０１）、又はスクランブル対照配列（ＡＡＶ－ＧＣ（配列番号１０１）、ＬＶ－スクランブル（配列番号７７１））をコードするレンチウイルス又はＡＡＶ９ベクター、又はＡＡＶ９－ＧＦＰ対照ベクターに感染したマウス海馬切片における、ＥＤの周波数を表す棒グラフ。（図３Ｄ）指定のＡＡＶ９によってコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤で治療されたマウス器官型海馬切片におけるＥＤの周波数を表す棒グラフ（ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－Ｇ９（配列番号６８）－ｐ＝０．０００４、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－ＸＹ（配列番号９１）－ｐ＝０．０００８、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－ＧＩ（配列番号８５）－ｐ＝０．０４７８）、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－Ｙ９（配列番号９６）、及びＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－ＧＧ（配列番号９１）、又は対照スクランブル配列及びＧＦＰタグ（ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８２）－ＧＦＰ－ＧＣ（配列番号１０１））。 図３Ａ～３Ｄは、マウスインビトロモデルにおける海馬てんかん性活性に対する、ウイルスによりコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤の効果を示す。（図３Ａ）スクランブル配列（配列番号１０１）を含有するＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８２）－ＧＦＰ－スクランブル構築物で感染した器官型海馬脳切片を示す蛍光画像。切片を、プロスペロホメオボックスタンパク質１（Ｐｒｏｘ１）抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で免疫染色し、海馬の歯状回（ＤＧ）細胞を標識した。（図３Ｂ）マウス器官型海馬切片から記録されたＥＤの例示的な細胞外電圧トレース。（図３Ｃ）ｈＳｙｎプロモーター（ＬＶ及びＡＡＶ９－ＧＣ：配列番号６８２、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ－Ｇ９：配列番号６８３）の制御下でのｍｉＲＮＡ構築物としての抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ配列（Ｇ９、配列番号６８、＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊、ｐ＜０．０１）、又はスクランブル対照配列（ＡＡＶ－ＧＣ（配列番号１０１）、ＬＶ－スクランブル（配列番号７７１））をコードするレンチウイルス又はＡＡＶ９ベクター、又はＡＡＶ９－ＧＦＰ対照ベクターに感染したマウス海馬切片における、ＥＤの周波数を表す棒グラフ。（図３Ｄ）指定のＡＡＶ９によってコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤で治療されたマウス器官型海馬切片におけるＥＤの周波数を表す棒グラフ（ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－Ｇ９（配列番号６８）－ｐ＝０．０００４、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－ＸＹ（配列番号９１）－ｐ＝０．０００８、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－ＧＩ（配列番号８５）－ｐ＝０．０４７８）、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－Ｙ９（配列番号９６）、及びＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－ＧＧ（配列番号９１）、又は対照スクランブル配列及びＧＦＰタグ（ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８２）－ＧＦＰ－ＧＣ（配列番号１０１））。 図３Ａ～３Ｄは、マウスインビトロモデルにおける海馬てんかん性活性に対する、ウイルスによりコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤の効果を示す。（図３Ａ）スクランブル配列（配列番号１０１）を含有するＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８２）－ＧＦＰ－スクランブル構築物で感染した器官型海馬脳切片を示す蛍光画像。切片を、プロスペロホメオボックスタンパク質１（Ｐｒｏｘ１）抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で免疫染色し、海馬の歯状回（ＤＧ）細胞を標識した。（図３Ｂ）マウス器官型海馬切片から記録されたＥＤの例示的な細胞外電圧トレース。（図３Ｃ）ｈＳｙｎプロモーター（ＬＶ及びＡＡＶ９－ＧＣ：配列番号６８２、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ－Ｇ９：配列番号６８３）の制御下でのｍｉＲＮＡ構築物としての抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ配列（Ｇ９、配列番号６８、＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊、ｐ＜０．０１）、又はスクランブル対照配列（ＡＡＶ－ＧＣ（配列番号１０１）、ＬＶ－スクランブル（配列番号７７１））をコードするレンチウイルス又はＡＡＶ９ベクター、又はＡＡＶ９－ＧＦＰ対照ベクターに感染したマウス海馬切片における、ＥＤの周波数を表す棒グラフ。（図３Ｄ）指定のＡＡＶ９によってコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤で治療されたマウス器官型海馬切片におけるＥＤの周波数を表す棒グラフ（ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－Ｇ９（配列番号６８）－ｐ＝０．０００４、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－ＸＹ（配列番号９１）－ｐ＝０．０００８、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－ＧＩ（配列番号８５）－ｐ＝０．０４７８）、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－Ｙ９（配列番号９６）、及びＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－ＧＧ（配列番号９１）、又は対照スクランブル配列及びＧＦＰタグ（ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８２）－ＧＦＰ－ＧＣ（配列番号１０１））。 図３Ａ～３Ｄは、マウスインビトロモデルにおける海馬てんかん性活性に対する、ウイルスによりコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤の効果を示す。（図３Ａ）スクランブル配列（配列番号１０１）を含有するＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８２）－ＧＦＰ－スクランブル構築物で感染した器官型海馬脳切片を示す蛍光画像。切片を、プロスペロホメオボックスタンパク質１（Ｐｒｏｘ１）抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で免疫染色し、海馬の歯状回（ＤＧ）細胞を標識した。（図３Ｂ）マウス器官型海馬切片から記録されたＥＤの例示的な細胞外電圧トレース。（図３Ｃ）ｈＳｙｎプロモーター（ＬＶ及びＡＡＶ９－ＧＣ：配列番号６８２、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ－Ｇ９：配列番号６８３）の制御下でのｍｉＲＮＡ構築物としての抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ配列（Ｇ９、配列番号６８、＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊、ｐ＜０．０１）、又はスクランブル対照配列（ＡＡＶ－ＧＣ（配列番号１０１）、ＬＶ－スクランブル（配列番号７７１））をコードするレンチウイルス又はＡＡＶ９ベクター、又はＡＡＶ９－ＧＦＰ対照ベクターに感染したマウス海馬切片における、ＥＤの周波数を表す棒グラフ。（図３Ｄ）指定のＡＡＶ９によってコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤で治療されたマウス器官型海馬切片におけるＥＤの周波数を表す棒グラフ（ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－Ｇ９（配列番号６８）－ｐ＝０．０００４、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－ＸＹ（配列番号９１）－ｐ＝０．０００８、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－ＧＩ（配列番号８５）－ｐ＝０．０４７８）、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－Ｙ９（配列番号９６）、及びＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－ＧＧ（配列番号９１）、又は対照スクランブル配列及びＧＦＰタグ（ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８２）－ＧＦＰ－ＧＣ（配列番号１０１））。 図４Ａ～４Ｆは、側頭葉てんかん（ＴＬＥ）のインビボマウスモデルにおける、Ｇｒｉｋ２標的化ＡＳＯ剤の有効性を示す。（図４Ａ）新規物体認識（ＮＯＲ）タスクの実験設計の模式図。（図４Ｂ）ウイルスによりコードされるスクランブル配列（ＧＣ、配列番号１０１、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８２）－ＧＦＰ－ＧＣ）、又は抗Ｇｒｉｋ２配列（Ｇ９、配列番号６８、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－Ｇ９）のいずれかを注射する７日前、又は注射して１５日後に測定されるような、ＮＯＲタスクを受けたマウスの識別指数（ＤＩ）を示す棒グラフ。（図４Ｃ）ウイルスによりコードされるスクランブル配列（ＧＣ、配列番号１０１）、又は抗Ｇｒｉｋ２配列（Ｇ９、配列番号６８）のいずれかを注射する７日前、又は注射して１５日後に測定されるような、ＮＯＲタスクにおけるマウスによる総移動距離（ｃｍ）を示す棒グラフ。（図４Ｄ）ピロカルピンによる治療後のマウスから記録されるような、ＴＬＥのピロカルピンモデルにおいて誘導される脳波上のてんかん発作の例示的な電圧トレース。（図４Ｅ）ウイルスによりコードされるスクランブル対照配列（ＧＣ、配列番号１０１、ｎ＝３）、又はウイルスによりコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤（Ｇ９、配列番号６８、ｎ＝４）で治療したマウスにおける、５日間にわたる累積的てんかん発作持続時間（分）を示す棒グラフ。（図４Ｆ）ウイルスによりコードされるスクランブル対照配列（ＧＣ、配列番号１０１、ｎ＝５）、又はウイルスによりコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤（Ｇ９、配列番号６８、ｎ＝６）で治療したマウスにおける、５日間にわたる累積的てんかん発作数を示す棒グラフ。 図４Ａ～４Ｆは、側頭葉てんかん（ＴＬＥ）のインビボマウスモデルにおける、Ｇｒｉｋ２標的化ＡＳＯ剤の有効性を示す。（図４Ａ）新規物体認識（ＮＯＲ）タスクの実験設計の模式図。（図４Ｂ）ウイルスによりコードされるスクランブル配列（ＧＣ、配列番号１０１、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８２）－ＧＦＰ－ＧＣ）、又は抗Ｇｒｉｋ２配列（Ｇ９、配列番号６８、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－Ｇ９）のいずれかを注射する７日前、又は注射して１５日後に測定されるような、ＮＯＲタスクを受けたマウスの識別指数（ＤＩ）を示す棒グラフ。（図４Ｃ）ウイルスによりコードされるスクランブル配列（ＧＣ、配列番号１０１）、又は抗Ｇｒｉｋ２配列（Ｇ９、配列番号６８）のいずれかを注射する７日前、又は注射して１５日後に測定されるような、ＮＯＲタスクにおけるマウスによる総移動距離（ｃｍ）を示す棒グラフ。（図４Ｄ）ピロカルピンによる治療後のマウスから記録されるような、ＴＬＥのピロカルピンモデルにおいて誘導される脳波上のてんかん発作の例示的な電圧トレース。（図４Ｅ）ウイルスによりコードされるスクランブル対照配列（ＧＣ、配列番号１０１、ｎ＝３）、又はウイルスによりコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤（Ｇ９、配列番号６８、ｎ＝４）で治療したマウスにおける、５日間にわたる累積的てんかん発作持続時間（分）を示す棒グラフ。（図４Ｆ）ウイルスによりコードされるスクランブル対照配列（ＧＣ、配列番号１０１、ｎ＝５）、又はウイルスによりコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤（Ｇ９、配列番号６８、ｎ＝６）で治療したマウスにおける、５日間にわたる累積的てんかん発作数を示す棒グラフ。 図４Ａ～４Ｆは、側頭葉てんかん（ＴＬＥ）のインビボマウスモデルにおける、Ｇｒｉｋ２標的化ＡＳＯ剤の有効性を示す。（図４Ａ）新規物体認識（ＮＯＲ）タスクの実験設計の模式図。（図４Ｂ）ウイルスによりコードされるスクランブル配列（ＧＣ、配列番号１０１、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８２）－ＧＦＰ－ＧＣ）、又は抗Ｇｒｉｋ２配列（Ｇ９、配列番号６８、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－Ｇ９）のいずれかを注射する７日前、又は注射して１５日後に測定されるような、ＮＯＲタスクを受けたマウスの識別指数（ＤＩ）を示す棒グラフ。（図４Ｃ）ウイルスによりコードされるスクランブル配列（ＧＣ、配列番号１０１）、又は抗Ｇｒｉｋ２配列（Ｇ９、配列番号６８）のいずれかを注射する７日前、又は注射して１５日後に測定されるような、ＮＯＲタスクにおけるマウスによる総移動距離（ｃｍ）を示す棒グラフ。（図４Ｄ）ピロカルピンによる治療後のマウスから記録されるような、ＴＬＥのピロカルピンモデルにおいて誘導される脳波上のてんかん発作の例示的な電圧トレース。（図４Ｅ）ウイルスによりコードされるスクランブル対照配列（ＧＣ、配列番号１０１、ｎ＝３）、又はウイルスによりコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤（Ｇ９、配列番号６８、ｎ＝４）で治療したマウスにおける、５日間にわたる累積的てんかん発作持続時間（分）を示す棒グラフ。（図４Ｆ）ウイルスによりコードされるスクランブル対照配列（ＧＣ、配列番号１０１、ｎ＝５）、又はウイルスによりコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤（Ｇ９、配列番号６８、ｎ＝６）で治療したマウスにおける、５日間にわたる累積的てんかん発作数を示す棒グラフ。 図４Ａ～４Ｆは、側頭葉てんかん（ＴＬＥ）のインビボマウスモデルにおける、Ｇｒｉｋ２標的化ＡＳＯ剤の有効性を示す。（図４Ａ）新規物体認識（ＮＯＲ）タスクの実験設計の模式図。（図４Ｂ）ウイルスによりコードされるスクランブル配列（ＧＣ、配列番号１０１、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８２）－ＧＦＰ－ＧＣ）、又は抗Ｇｒｉｋ２配列（Ｇ９、配列番号６８、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－Ｇ９）のいずれかを注射する７日前、又は注射して１５日後に測定されるような、ＮＯＲタスクを受けたマウスの識別指数（ＤＩ）を示す棒グラフ。（図４Ｃ）ウイルスによりコードされるスクランブル配列（ＧＣ、配列番号１０１）、又は抗Ｇｒｉｋ２配列（Ｇ９、配列番号６８）のいずれかを注射する７日前、又は注射して１５日後に測定されるような、ＮＯＲタスクにおけるマウスによる総移動距離（ｃｍ）を示す棒グラフ。（図４Ｄ）ピロカルピンによる治療後のマウスから記録されるような、ＴＬＥのピロカルピンモデルにおいて誘導される脳波上のてんかん発作の例示的な電圧トレース。（図４Ｅ）ウイルスによりコードされるスクランブル対照配列（ＧＣ、配列番号１０１、ｎ＝３）、又はウイルスによりコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤（Ｇ９、配列番号６８、ｎ＝４）で治療したマウスにおける、５日間にわたる累積的てんかん発作持続時間（分）を示す棒グラフ。（図４Ｆ）ウイルスによりコードされるスクランブル対照配列（ＧＣ、配列番号１０１、ｎ＝５）、又はウイルスによりコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤（Ｇ９、配列番号６８、ｎ＝６）で治療したマウスにおける、５日間にわたる累積的てんかん発作数を示す棒グラフ。 図４Ａ～４Ｆは、側頭葉てんかん（ＴＬＥ）のインビボマウスモデルにおける、Ｇｒｉｋ２標的化ＡＳＯ剤の有効性を示す。（図４Ａ）新規物体認識（ＮＯＲ）タスクの実験設計の模式図。（図４Ｂ）ウイルスによりコードされるスクランブル配列（ＧＣ、配列番号１０１、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８２）－ＧＦＰ－ＧＣ）、又は抗Ｇｒｉｋ２配列（Ｇ９、配列番号６８、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－Ｇ９）のいずれかを注射する７日前、又は注射して１５日後に測定されるような、ＮＯＲタスクを受けたマウスの識別指数（ＤＩ）を示す棒グラフ。（図４Ｃ）ウイルスによりコードされるスクランブル配列（ＧＣ、配列番号１０１）、又は抗Ｇｒｉｋ２配列（Ｇ９、配列番号６８）のいずれかを注射する７日前、又は注射して１５日後に測定されるような、ＮＯＲタスクにおけるマウスによる総移動距離（ｃｍ）を示す棒グラフ。（図４Ｄ）ピロカルピンによる治療後のマウスから記録されるような、ＴＬＥのピロカルピンモデルにおいて誘導される脳波上のてんかん発作の例示的な電圧トレース。（図４Ｅ）ウイルスによりコードされるスクランブル対照配列（ＧＣ、配列番号１０１、ｎ＝３）、又はウイルスによりコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤（Ｇ９、配列番号６８、ｎ＝４）で治療したマウスにおける、５日間にわたる累積的てんかん発作持続時間（分）を示す棒グラフ。（図４Ｆ）ウイルスによりコードされるスクランブル対照配列（ＧＣ、配列番号１０１、ｎ＝５）、又はウイルスによりコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤（Ｇ９、配列番号６８、ｎ＝６）で治療したマウスにおける、５日間にわたる累積的てんかん発作数を示す棒グラフ。 図４Ａ～４Ｆは、側頭葉てんかん（ＴＬＥ）のインビボマウスモデルにおける、Ｇｒｉｋ２標的化ＡＳＯ剤の有効性を示す。（図４Ａ）新規物体認識（ＮＯＲ）タスクの実験設計の模式図。（図４Ｂ）ウイルスによりコードされるスクランブル配列（ＧＣ、配列番号１０１、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８２）－ＧＦＰ－ＧＣ）、又は抗Ｇｒｉｋ２配列（Ｇ９、配列番号６８、ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－Ｇ９）のいずれかを注射する７日前、又は注射して１５日後に測定されるような、ＮＯＲタスクを受けたマウスの識別指数（ＤＩ）を示す棒グラフ。（図４Ｃ）ウイルスによりコードされるスクランブル配列（ＧＣ、配列番号１０１）、又は抗Ｇｒｉｋ２配列（Ｇ９、配列番号６８）のいずれかを注射する７日前、又は注射して１５日後に測定されるような、ＮＯＲタスクにおけるマウスによる総移動距離（ｃｍ）を示す棒グラフ。（図４Ｄ）ピロカルピンによる治療後のマウスから記録されるような、ＴＬＥのピロカルピンモデルにおいて誘導される脳波上のてんかん発作の例示的な電圧トレース。（図４Ｅ）ウイルスによりコードされるスクランブル対照配列（ＧＣ、配列番号１０１、ｎ＝３）、又はウイルスによりコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤（Ｇ９、配列番号６８、ｎ＝４）で治療したマウスにおける、５日間にわたる累積的てんかん発作持続時間（分）を示す棒グラフ。（図４Ｆ）ウイルスによりコードされるスクランブル対照配列（ＧＣ、配列番号１０１、ｎ＝５）、又はウイルスによりコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤（Ｇ９、配列番号６８、ｎ＝６）で治療したマウスにおける、５日間にわたる累積的てんかん発作数を示す棒グラフ。 図５は、ＡＡＶ９ベクターにおいてコードされる種々のＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ標的化マイクロＲＮＡ構築物のノックダウン有効性を示す棒グラフである。ＡＡＶ９ベクターは、Ａ－ｍｉＲ－３０（Ｓ１）、Ｅ－ｍｉＲ－３０（Ｓ２）、Ｅ－ｍｉＲ－１５５（Ｓ３）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８（Ｓ４）、及びＥ－ｍｉＲ－１２４（Ｓ５）を含む、内因性マイクロＲＮＡからの５’隣接領域、マイクロＲＮＡループ配列、及び３’隣接領域を含有する５種類のマイクロＲＮＡ足場のうちの１つを組み込む。試験されるアンチセンス配列は、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０）、ＧＵ（配列番号９６）、ＴＯ（配列番号１４）、ＴＫ（配列番号７４）、ＴＨ（配列番号２２）、ＣＱ（配列番号３５）、ＸＵ（配列番号５１）、ＸＹ（配列番号８３）、Ｙ９（配列番号８８）、ＹＡ（配列番号６３）、ＧＧ（配列番号９１）、Ｇ８（配列番号９２）、ＭＥ（配列番号６９）、及びＭＤ（配列番号７０）であった。ノックダウン有効性は、「脂質のみ」対照と比較した、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡメジアンの倍率変化として表される。ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）の制御下で、ｍｉＲＮＡを発現するプラスミドのこのより大きなパネルを、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のグルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）へとトランスフェクトし、ＲＴ－ｑＰＣＲによって、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡレベルを減少させる能力について評価した。トランスフェクトされていない細胞（破線）と比較して、メジアン絶対偏差（ＭＡＤ）＝２を使用して機能的構築物（点線）を特定する場合に、構築物の大部分は、機能的であると決定された（すなわち、これらは、ＭＡＤを下回るノックダウンＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡを示す）。試験された構築物の全ての中で、ＧＩ（配列番号７７）－Ｓ２（配列番号７９８）、ＭＷ（配列番号８０）－Ｓ４（配列番号７９９）、ＭＷ－Ｓ５（配列番号８００）、及びＧ９（配列番号６８）－Ｓ５（配列番号８０１）は、最も高い程度までＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡをノックダウンすることがわかった（すなわち、２０％以上のノックダウン）。 図６Ａ～６Ｇは、内因性ｍｉＲＮＡからの５’隣接領域、マイクロＲＮＡループ配列、及び３’隣接領域を含有するＡ－ｍｉＲ－３０（Ｓ１）足場に組み込まれたアンチセンスガイド配列を含有する合成ＡＡＶ９－ｍｉＲＮＡ構築物の構成の模式図を示す。構築物１（図６Ａ）は、単一ｍｉＲＮＡ単一プロモーター構築物（配列番号７７５）であり、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター配列（配列番号７９０）、ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５２）、Ｇ９（配列番号６８）の抗Ｇｒｉｋ２配列に対して実質的に相補的なパッセンジャー鎖配列、ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７５８）、Ｇ９（配列番号６８）のガイド配列、ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７５３）、ウサギベータ－グロビン（ＲＢＧ）ポリＡシグナル（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）を含有する。構築物２（図６Ｂ）は、単一ｍｉＲＮＡ二重プロモーター構築物（配列番号７７７）であり、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、Ｃ１ｑｌ２プロモーター配列（配列番号７９１）、ｈＳｙｎプロモーター配列（配列番号７９０）、ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５２）、Ｇ９（配列番号６８）の抗Ｇｒｉｋ２配列に対して実質的に相補的なパッセンジャー鎖配列、ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７８５）、Ｇ９（配列番号６８）のガイド配列、ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７５３）、ＲＢＧポリＡシグナル（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。構築物３（図６Ｃ）は、自己相補性の二重ｍｉＲＮＡ（Ｇ９、配列番号６８の２個のコピー）の単一プロモーター構築物（配列番号７７９）であり、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）に隣接した５’末端に（すまわち、５’に）野生型ＡＡＶ（ｗｔ）ＩＴＲ、及びポリＡ配列の下流に変異体ＩＴＲ（ｍＩＴＲ）を含有する。構築物４（図６Ｄ、配列番号７８１）は、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）がｍＩＴＲに隣接しており、ポリＡ配列がｗｔＩＴＴＲに隣接していることを除き、構築物３と同様である。構築物５（配列番号７８３）及び構築物６（配列番号７８４）は、プレｍｉＲステム－ループ構造（５’隣接、ステム－ループ、及び３’隣接）が、３回連結しており、その結果、構築物が、同じｍｉＲＮＡ配列の３個のコピー（例えば、Ｇ９、配列番号６８、構築物５）、又は異なるｍｉＲＮＡ配列の３個のコピー（図６Ｅ、構築物６、Ｇ９、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＵ（配列番号９６））を含有することを除き、構築物１と同様である。構築物７（図６Ｆ、配列番号８０４）は、単一ｍｉＲＮＡ単一プロモーター構築物であって、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター配列（配列番号７９０）、ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５２）、Ｇ９（配列番号６８）の抗Ｇｒｉｋ２配列に対して実質的に相補的なパッセンジャー鎖配列、ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７５８）、Ｇ９（配列番号６８）のガイド配列、ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７５３）、ＲＢＧポリＡシグナル（配列番号７９２）、非コードスタッファー配列、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）を含有する。構築物８（図６Ｇ、配列番号８１０）は、単一ｍｉＲＮＡ単一プロモーター構築物であって、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター配列（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡシグナル（配列番号７９２）、非コードスタッファー配列、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）を含有する。 図６Ａ～６Ｇは、内因性ｍｉＲＮＡからの５’隣接領域、マイクロＲＮＡループ配列、及び３’隣接領域を含有するＡ－ｍｉＲ－３０（Ｓ１）足場に組み込まれたアンチセンスガイド配列を含有する合成ＡＡＶ９－ｍｉＲＮＡ構築物の構成の模式図を示す。構築物１（図６Ａ）は、単一ｍｉＲＮＡ単一プロモーター構築物（配列番号７７５）であり、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター配列（配列番号７９０）、ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５２）、Ｇ９（配列番号６８）の抗Ｇｒｉｋ２配列に対して実質的に相補的なパッセンジャー鎖配列、ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７５８）、Ｇ９（配列番号６８）のガイド配列、ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７５３）、ウサギベータ－グロビン（ＲＢＧ）ポリＡシグナル（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）を含有する。構築物２（図６Ｂ）は、単一ｍｉＲＮＡ二重プロモーター構築物（配列番号７７７）であり、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、Ｃ１ｑｌ２プロモーター配列（配列番号７９１）、ｈＳｙｎプロモーター配列（配列番号７９０）、ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５２）、Ｇ９（配列番号６８）の抗Ｇｒｉｋ２配列に対して実質的に相補的なパッセンジャー鎖配列、ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７８５）、Ｇ９（配列番号６８）のガイド配列、ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７５３）、ＲＢＧポリＡシグナル（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。構築物３（図６Ｃ）は、自己相補性の二重ｍｉＲＮＡ（Ｇ９、配列番号６８の２個のコピー）の単一プロモーター構築物（配列番号７７９）であり、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）に隣接した５’末端に（すまわち、５’に）野生型ＡＡＶ（ｗｔ）ＩＴＲ、及びポリＡ配列の下流に変異体ＩＴＲ（ｍＩＴＲ）を含有する。構築物４（図６Ｄ、配列番号７８１）は、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）がｍＩＴＲに隣接しており、ポリＡ配列がｗｔＩＴＴＲに隣接していることを除き、構築物３と同様である。構築物５（配列番号７８３）及び構築物６（配列番号７８４）は、プレｍｉＲステム－ループ構造（５’隣接、ステム－ループ、及び３’隣接）が、３回連結しており、その結果、構築物が、同じｍｉＲＮＡ配列の３個のコピー（例えば、Ｇ９、配列番号６８、構築物５）、又は異なるｍｉＲＮＡ配列の３個のコピー（図６Ｅ、構築物６、Ｇ９、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＵ（配列番号９６））を含有することを除き、構築物１と同様である。構築物７（図６Ｆ、配列番号８０４）は、単一ｍｉＲＮＡ単一プロモーター構築物であって、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター配列（配列番号７９０）、ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５２）、Ｇ９（配列番号６８）の抗Ｇｒｉｋ２配列に対して実質的に相補的なパッセンジャー鎖配列、ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７５８）、Ｇ９（配列番号６８）のガイド配列、ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７５３）、ＲＢＧポリＡシグナル（配列番号７９２）、非コードスタッファー配列、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）を含有する。構築物８（図６Ｇ、配列番号８１０）は、単一ｍｉＲＮＡ単一プロモーター構築物であって、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター配列（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡシグナル（配列番号７９２）、非コードスタッファー配列、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）を含有する。 図６Ａ～６Ｇは、内因性ｍｉＲＮＡからの５’隣接領域、マイクロＲＮＡループ配列、及び３’隣接領域を含有するＡ－ｍｉＲ－３０（Ｓ１）足場に組み込まれたアンチセンスガイド配列を含有する合成ＡＡＶ９－ｍｉＲＮＡ構築物の構成の模式図を示す。構築物１（図６Ａ）は、単一ｍｉＲＮＡ単一プロモーター構築物（配列番号７７５）であり、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター配列（配列番号７９０）、ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５２）、Ｇ９（配列番号６８）の抗Ｇｒｉｋ２配列に対して実質的に相補的なパッセンジャー鎖配列、ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７５８）、Ｇ９（配列番号６８）のガイド配列、ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７５３）、ウサギベータ－グロビン（ＲＢＧ）ポリＡシグナル（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）を含有する。構築物２（図６Ｂ）は、単一ｍｉＲＮＡ二重プロモーター構築物（配列番号７７７）であり、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、Ｃ１ｑｌ２プロモーター配列（配列番号７９１）、ｈＳｙｎプロモーター配列（配列番号７９０）、ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５２）、Ｇ９（配列番号６８）の抗Ｇｒｉｋ２配列に対して実質的に相補的なパッセンジャー鎖配列、ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７８５）、Ｇ９（配列番号６８）のガイド配列、ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７５３）、ＲＢＧポリＡシグナル（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。構築物３（図６Ｃ）は、自己相補性の二重ｍｉＲＮＡ（Ｇ９、配列番号６８の２個のコピー）の単一プロモーター構築物（配列番号７７９）であり、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）に隣接した５’末端に（すまわち、５’に）野生型ＡＡＶ（ｗｔ）ＩＴＲ、及びポリＡ配列の下流に変異体ＩＴＲ（ｍＩＴＲ）を含有する。構築物４（図６Ｄ、配列番号７８１）は、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）がｍＩＴＲに隣接しており、ポリＡ配列がｗｔＩＴＴＲに隣接していることを除き、構築物３と同様である。構築物５（配列番号７８３）及び構築物６（配列番号７８４）は、プレｍｉＲステム－ループ構造（５’隣接、ステム－ループ、及び３’隣接）が、３回連結しており、その結果、構築物が、同じｍｉＲＮＡ配列の３個のコピー（例えば、Ｇ９、配列番号６８、構築物５）、又は異なるｍｉＲＮＡ配列の３個のコピー（図６Ｅ、構築物６、Ｇ９、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＵ（配列番号９６））を含有することを除き、構築物１と同様である。構築物７（図６Ｆ、配列番号８０４）は、単一ｍｉＲＮＡ単一プロモーター構築物であって、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター配列（配列番号７９０）、ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５２）、Ｇ９（配列番号６８）の抗Ｇｒｉｋ２配列に対して実質的に相補的なパッセンジャー鎖配列、ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７５８）、Ｇ９（配列番号６８）のガイド配列、ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７５３）、ＲＢＧポリＡシグナル（配列番号７９２）、非コードスタッファー配列、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）を含有する。構築物８（図６Ｇ、配列番号８１０）は、単一ｍｉＲＮＡ単一プロモーター構築物であって、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター配列（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡシグナル（配列番号７９２）、非コードスタッファー配列、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）を含有する。 図６Ａ～６Ｇは、内因性ｍｉＲＮＡからの５’隣接領域、マイクロＲＮＡループ配列、及び３’隣接領域を含有するＡ－ｍｉＲ－３０（Ｓ１）足場に組み込まれたアンチセンスガイド配列を含有する合成ＡＡＶ９－ｍｉＲＮＡ構築物の構成の模式図を示す。構築物１（図６Ａ）は、単一ｍｉＲＮＡ単一プロモーター構築物（配列番号７７５）であり、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター配列（配列番号７９０）、ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５２）、Ｇ９（配列番号６８）の抗Ｇｒｉｋ２配列に対して実質的に相補的なパッセンジャー鎖配列、ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７５８）、Ｇ９（配列番号６８）のガイド配列、ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７５３）、ウサギベータ－グロビン（ＲＢＧ）ポリＡシグナル（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）を含有する。構築物２（図６Ｂ）は、単一ｍｉＲＮＡ二重プロモーター構築物（配列番号７７７）であり、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、Ｃ１ｑｌ２プロモーター配列（配列番号７９１）、ｈＳｙｎプロモーター配列（配列番号７９０）、ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５２）、Ｇ９（配列番号６８）の抗Ｇｒｉｋ２配列に対して実質的に相補的なパッセンジャー鎖配列、ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７８５）、Ｇ９（配列番号６８）のガイド配列、ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７５３）、ＲＢＧポリＡシグナル（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。構築物３（図６Ｃ）は、自己相補性の二重ｍｉＲＮＡ（Ｇ９、配列番号６８の２個のコピー）の単一プロモーター構築物（配列番号７７９）であり、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）に隣接した５’末端に（すまわち、５’に）野生型ＡＡＶ（ｗｔ）ＩＴＲ、及びポリＡ配列の下流に変異体ＩＴＲ（ｍＩＴＲ）を含有する。構築物４（図６Ｄ、配列番号７８１）は、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）がｍＩＴＲに隣接しており、ポリＡ配列がｗｔＩＴＴＲに隣接していることを除き、構築物３と同様である。構築物５（配列番号７８３）及び構築物６（配列番号７８４）は、プレｍｉＲステム－ループ構造（５’隣接、ステム－ループ、及び３’隣接）が、３回連結しており、その結果、構築物が、同じｍｉＲＮＡ配列の３個のコピー（例えば、Ｇ９、配列番号６８、構築物５）、又は異なるｍｉＲＮＡ配列の３個のコピー（図６Ｅ、構築物６、Ｇ９、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＵ（配列番号９６））を含有することを除き、構築物１と同様である。構築物７（図６Ｆ、配列番号８０４）は、単一ｍｉＲＮＡ単一プロモーター構築物であって、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター配列（配列番号７９０）、ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５２）、Ｇ９（配列番号６８）の抗Ｇｒｉｋ２配列に対して実質的に相補的なパッセンジャー鎖配列、ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７５８）、Ｇ９（配列番号６８）のガイド配列、ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７５３）、ＲＢＧポリＡシグナル（配列番号７９２）、非コードスタッファー配列、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）を含有する。構築物８（図６Ｇ、配列番号８１０）は、単一ｍｉＲＮＡ単一プロモーター構築物であって、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター配列（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡシグナル（配列番号７９２）、非コードスタッファー配列、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）を含有する。 図６Ａ～６Ｇは、内因性ｍｉＲＮＡからの５’隣接領域、マイクロＲＮＡループ配列、及び３’隣接領域を含有するＡ－ｍｉＲ－３０（Ｓ１）足場に組み込まれたアンチセンスガイド配列を含有する合成ＡＡＶ９－ｍｉＲＮＡ構築物の構成の模式図を示す。構築物１（図６Ａ）は、単一ｍｉＲＮＡ単一プロモーター構築物（配列番号７７５）であり、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター配列（配列番号７９０）、ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５２）、Ｇ９（配列番号６８）の抗Ｇｒｉｋ２配列に対して実質的に相補的なパッセンジャー鎖配列、ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７５８）、Ｇ９（配列番号６８）のガイド配列、ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７５３）、ウサギベータ－グロビン（ＲＢＧ）ポリＡシグナル（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）を含有する。構築物２（図６Ｂ）は、単一ｍｉＲＮＡ二重プロモーター構築物（配列番号７７７）であり、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、Ｃ１ｑｌ２プロモーター配列（配列番号７９１）、ｈＳｙｎプロモーター配列（配列番号７９０）、ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５２）、Ｇ９（配列番号６８）の抗Ｇｒｉｋ２配列に対して実質的に相補的なパッセンジャー鎖配列、ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７８５）、Ｇ９（配列番号６８）のガイド配列、ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７５３）、ＲＢＧポリＡシグナル（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。構築物３（図６Ｃ）は、自己相補性の二重ｍｉＲＮＡ（Ｇ９、配列番号６８の２個のコピー）の単一プロモーター構築物（配列番号７７９）であり、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）に隣接した５’末端に（すまわち、５’に）野生型ＡＡＶ（ｗｔ）ＩＴＲ、及びポリＡ配列の下流に変異体ＩＴＲ（ｍＩＴＲ）を含有する。構築物４（図６Ｄ、配列番号７８１）は、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）がｍＩＴＲに隣接しており、ポリＡ配列がｗｔＩＴＴＲに隣接していることを除き、構築物３と同様である。構築物５（配列番号７８３）及び構築物６（配列番号７８４）は、プレｍｉＲステム－ループ構造（５’隣接、ステム－ループ、及び３’隣接）が、３回連結しており、その結果、構築物が、同じｍｉＲＮＡ配列の３個のコピー（例えば、Ｇ９、配列番号６８、構築物５）、又は異なるｍｉＲＮＡ配列の３個のコピー（図６Ｅ、構築物６、Ｇ９、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＵ（配列番号９６））を含有することを除き、構築物１と同様である。構築物７（図６Ｆ、配列番号８０４）は、単一ｍｉＲＮＡ単一プロモーター構築物であって、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター配列（配列番号７９０）、ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５２）、Ｇ９（配列番号６８）の抗Ｇｒｉｋ２配列に対して実質的に相補的なパッセンジャー鎖配列、ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７５８）、Ｇ９（配列番号６８）のガイド配列、ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７５３）、ＲＢＧポリＡシグナル（配列番号７９２）、非コードスタッファー配列、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）を含有する。構築物８（図６Ｇ、配列番号８１０）は、単一ｍｉＲＮＡ単一プロモーター構築物であって、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター配列（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡシグナル（配列番号７９２）、非コードスタッファー配列、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）を含有する。 図６Ａ～６Ｇは、内因性ｍｉＲＮＡからの５’隣接領域、マイクロＲＮＡループ配列、及び３’隣接領域を含有するＡ－ｍｉＲ－３０（Ｓ１）足場に組み込まれたアンチセンスガイド配列を含有する合成ＡＡＶ９－ｍｉＲＮＡ構築物の構成の模式図を示す。構築物１（図６Ａ）は、単一ｍｉＲＮＡ単一プロモーター構築物（配列番号７７５）であり、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター配列（配列番号７９０）、ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５２）、Ｇ９（配列番号６８）の抗Ｇｒｉｋ２配列に対して実質的に相補的なパッセンジャー鎖配列、ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７５８）、Ｇ９（配列番号６８）のガイド配列、ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７５３）、ウサギベータ－グロビン（ＲＢＧ）ポリＡシグナル（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）を含有する。構築物２（図６Ｂ）は、単一ｍｉＲＮＡ二重プロモーター構築物（配列番号７７７）であり、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、Ｃ１ｑｌ２プロモーター配列（配列番号７９１）、ｈＳｙｎプロモーター配列（配列番号７９０）、ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５２）、Ｇ９（配列番号６８）の抗Ｇｒｉｋ２配列に対して実質的に相補的なパッセンジャー鎖配列、ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７８５）、Ｇ９（配列番号６８）のガイド配列、ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７５３）、ＲＢＧポリＡシグナル（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。構築物３（図６Ｃ）は、自己相補性の二重ｍｉＲＮＡ（Ｇ９、配列番号６８の２個のコピー）の単一プロモーター構築物（配列番号７７９）であり、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）に隣接した５’末端に（すまわち、５’に）野生型ＡＡＶ（ｗｔ）ＩＴＲ、及びポリＡ配列の下流に変異体ＩＴＲ（ｍＩＴＲ）を含有する。構築物４（図６Ｄ、配列番号７８１）は、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）がｍＩＴＲに隣接しており、ポリＡ配列がｗｔＩＴＴＲに隣接していることを除き、構築物３と同様である。構築物５（配列番号７８３）及び構築物６（配列番号７８４）は、プレｍｉＲステム－ループ構造（５’隣接、ステム－ループ、及び３’隣接）が、３回連結しており、その結果、構築物が、同じｍｉＲＮＡ配列の３個のコピー（例えば、Ｇ９、配列番号６８、構築物５）、又は異なるｍｉＲＮＡ配列の３個のコピー（図６Ｅ、構築物６、Ｇ９、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＵ（配列番号９６））を含有することを除き、構築物１と同様である。構築物７（図６Ｆ、配列番号８０４）は、単一ｍｉＲＮＡ単一プロモーター構築物であって、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター配列（配列番号７９０）、ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５２）、Ｇ９（配列番号６８）の抗Ｇｒｉｋ２配列に対して実質的に相補的なパッセンジャー鎖配列、ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７５８）、Ｇ９（配列番号６８）のガイド配列、ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７５３）、ＲＢＧポリＡシグナル（配列番号７９２）、非コードスタッファー配列、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）を含有する。構築物８（図６Ｇ、配列番号８１０）は、単一ｍｉＲＮＡ単一プロモーター構築物であって、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター配列（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡシグナル（配列番号７９２）、非コードスタッファー配列、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）を含有する。 図６Ａ～６Ｇは、内因性ｍｉＲＮＡからの５’隣接領域、マイクロＲＮＡループ配列、及び３’隣接領域を含有するＡ－ｍｉＲ－３０（Ｓ１）足場に組み込まれたアンチセンスガイド配列を含有する合成ＡＡＶ９－ｍｉＲＮＡ構築物の構成の模式図を示す。構築物１（図６Ａ）は、単一ｍｉＲＮＡ単一プロモーター構築物（配列番号７７５）であり、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター配列（配列番号７９０）、ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５２）、Ｇ９（配列番号６８）の抗Ｇｒｉｋ２配列に対して実質的に相補的なパッセンジャー鎖配列、ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７５８）、Ｇ９（配列番号６８）のガイド配列、ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７５３）、ウサギベータ－グロビン（ＲＢＧ）ポリＡシグナル（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）を含有する。構築物２（図６Ｂ）は、単一ｍｉＲＮＡ二重プロモーター構築物（配列番号７７７）であり、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、Ｃ１ｑｌ２プロモーター配列（配列番号７９１）、ｈＳｙｎプロモーター配列（配列番号７９０）、ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５２）、Ｇ９（配列番号６８）の抗Ｇｒｉｋ２配列に対して実質的に相補的なパッセンジャー鎖配列、ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７８５）、Ｇ９（配列番号６８）のガイド配列、ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７５３）、ＲＢＧポリＡシグナル（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。構築物３（図６Ｃ）は、自己相補性の二重ｍｉＲＮＡ（Ｇ９、配列番号６８の２個のコピー）の単一プロモーター構築物（配列番号７７９）であり、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）に隣接した５’末端に（すまわち、５’に）野生型ＡＡＶ（ｗｔ）ＩＴＲ、及びポリＡ配列の下流に変異体ＩＴＲ（ｍＩＴＲ）を含有する。構築物４（図６Ｄ、配列番号７８１）は、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）がｍＩＴＲに隣接しており、ポリＡ配列がｗｔＩＴＴＲに隣接していることを除き、構築物３と同様である。構築物５（配列番号７８３）及び構築物６（配列番号７８４）は、プレｍｉＲステム－ループ構造（５’隣接、ステム－ループ、及び３’隣接）が、３回連結しており、その結果、構築物が、同じｍｉＲＮＡ配列の３個のコピー（例えば、Ｇ９、配列番号６８、構築物５）、又は異なるｍｉＲＮＡ配列の３個のコピー（図６Ｅ、構築物６、Ｇ９、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＵ（配列番号９６））を含有することを除き、構築物１と同様である。構築物７（図６Ｆ、配列番号８０４）は、単一ｍｉＲＮＡ単一プロモーター構築物であって、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター配列（配列番号７９０）、ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５２）、Ｇ９（配列番号６８）の抗Ｇｒｉｋ２配列に対して実質的に相補的なパッセンジャー鎖配列、ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７５８）、Ｇ９（配列番号６８）のガイド配列、ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７５３）、ＲＢＧポリＡシグナル（配列番号７９２）、非コードスタッファー配列、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）を含有する。構築物８（図６Ｇ、配列番号８１０）は、単一ｍｉＲＮＡ単一プロモーター構築物であって、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター配列（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡシグナル（配列番号７９２）、非コードスタッファー配列、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）を含有する。 図７は、図６Ａ～６Ｅに記載される単一及び二重ｍｉＲＮＡ発現構築物（構築物１～６）のアルカリ性アガロースゲル電気泳動分析を示す写真である。単一プロモーター及び単一ｍｉＲＮＡカセットをコードするプラスミドから産生されるベクターのゲノム内容（予想長さ：１．５ｋｂ）は、単一（１．５ｋｂ）、二重（３．０ｋｂ）、及び三重（４．５ｋｂ）パッケージングされたゲノムの混合物で構成されることがわかった。レーン番号は、以下のベクター構築物に対応している。１＝構築物１（配列番号７７５）、２＝構築物２（配列番号７７７）、３＝構築物３（配列番号７７９）、４＝構築物４（配列番号７８１）、５＝構築物５（配列番号７８３）、６＝構築物６（配列番号７８４）。 図８Ａ～８Ｇは、ＡＡＶベクターとともに使用するのに適した二重プロモーターを有するＡＡＶ９二重ｍｉＲＮＡ発現構築物の模式図を示す。図８Ａは、二重ｍｉＲＮＡ二重プロモーターベクター（ＤＭＴＰＶ１）発現構築物（配列番号７８５）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー（「Ｐ」）鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド（「Ｇ」）配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｂは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ２、配列番号７８６）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ５’隣接配列（配列番号７６５）、ＭＷ（配列番号８０）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ループ配列（配列番号７６７）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ３’隣接配列（配列番号７６６）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｃは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ３、配列番号７８７）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｄは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ４、配列番号７８８）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｅは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ５）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ５’隣接配列（配列番号７６５）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ループ配列（配列番号７６７）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ３’隣接配列（配列番号７６６）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｆは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ６）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ５’隣接配列（配列番号７６５）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ループ配列（配列番号７６７）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ３’隣接配列（配列番号７６６）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、非コードスタッファー配列、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｇは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ７）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。 図８Ａ～８Ｇは、ＡＡＶベクターとともに使用するのに適した二重プロモーターを有するＡＡＶ９二重ｍｉＲＮＡ発現構築物の模式図を示す。図８Ａは、二重ｍｉＲＮＡ二重プロモーターベクター（ＤＭＴＰＶ１）発現構築物（配列番号７８５）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー（「Ｐ」）鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド（「Ｇ」）配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｂは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ２、配列番号７８６）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ５’隣接配列（配列番号７６５）、ＭＷ（配列番号８０）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ループ配列（配列番号７６７）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ３’隣接配列（配列番号７６６）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｃは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ３、配列番号７８７）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｄは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ４、配列番号７８８）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｅは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ５）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ５’隣接配列（配列番号７６５）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ループ配列（配列番号７６７）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ３’隣接配列（配列番号７６６）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｆは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ６）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ５’隣接配列（配列番号７６５）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ループ配列（配列番号７６７）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ３’隣接配列（配列番号７６６）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、非コードスタッファー配列、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｇは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ７）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。 図８Ａ～８Ｇは、ＡＡＶベクターとともに使用するのに適した二重プロモーターを有するＡＡＶ９二重ｍｉＲＮＡ発現構築物の模式図を示す。図８Ａは、二重ｍｉＲＮＡ二重プロモーターベクター（ＤＭＴＰＶ１）発現構築物（配列番号７８５）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー（「Ｐ」）鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド（「Ｇ」）配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｂは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ２、配列番号７８６）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ５’隣接配列（配列番号７６５）、ＭＷ（配列番号８０）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ループ配列（配列番号７６７）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ３’隣接配列（配列番号７６６）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｃは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ３、配列番号７８７）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｄは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ４、配列番号７８８）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｅは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ５）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ５’隣接配列（配列番号７６５）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ループ配列（配列番号７６７）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ３’隣接配列（配列番号７６６）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｆは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ６）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ５’隣接配列（配列番号７６５）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ループ配列（配列番号７６７）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ３’隣接配列（配列番号７６６）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、非コードスタッファー配列、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｇは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ７）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。 図８Ａ～８Ｇは、ＡＡＶベクターとともに使用するのに適した二重プロモーターを有するＡＡＶ９二重ｍｉＲＮＡ発現構築物の模式図を示す。図８Ａは、二重ｍｉＲＮＡ二重プロモーターベクター（ＤＭＴＰＶ１）発現構築物（配列番号７８５）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー（「Ｐ」）鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド（「Ｇ」）配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｂは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ２、配列番号７８６）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ５’隣接配列（配列番号７６５）、ＭＷ（配列番号８０）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ループ配列（配列番号７６７）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ３’隣接配列（配列番号７６６）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｃは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ３、配列番号７８７）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｄは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ４、配列番号７８８）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｅは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ５）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ５’隣接配列（配列番号７６５）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ループ配列（配列番号７６７）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ３’隣接配列（配列番号７６６）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｆは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ６）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ５’隣接配列（配列番号７６５）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ループ配列（配列番号７６７）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ３’隣接配列（配列番号７６６）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、非コードスタッファー配列、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｇは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ７）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。 図８Ａ～８Ｇは、ＡＡＶベクターとともに使用するのに適した二重プロモーターを有するＡＡＶ９二重ｍｉＲＮＡ発現構築物の模式図を示す。図８Ａは、二重ｍｉＲＮＡ二重プロモーターベクター（ＤＭＴＰＶ１）発現構築物（配列番号７８５）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー（「Ｐ」）鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド（「Ｇ」）配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｂは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ２、配列番号７８６）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ５’隣接配列（配列番号７６５）、ＭＷ（配列番号８０）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ループ配列（配列番号７６７）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ３’隣接配列（配列番号７６６）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｃは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ３、配列番号７８７）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｄは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ４、配列番号７８８）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｅは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ５）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ５’隣接配列（配列番号７６５）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ループ配列（配列番号７６７）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ３’隣接配列（配列番号７６６）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｆは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ６）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ５’隣接配列（配列番号７６５）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ループ配列（配列番号７６７）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ３’隣接配列（配列番号７６６）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、非コードスタッファー配列、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｇは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ７）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。 図８Ａ～８Ｇは、ＡＡＶベクターとともに使用するのに適した二重プロモーターを有するＡＡＶ９二重ｍｉＲＮＡ発現構築物の模式図を示す。図８Ａは、二重ｍｉＲＮＡ二重プロモーターベクター（ＤＭＴＰＶ１）発現構築物（配列番号７８５）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー（「Ｐ」）鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド（「Ｇ」）配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｂは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ２、配列番号７８６）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ５’隣接配列（配列番号７６５）、ＭＷ（配列番号８０）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ループ配列（配列番号７６７）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ３’隣接配列（配列番号７６６）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｃは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ３、配列番号７８７）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｄは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ４、配列番号７８８）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｅは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ５）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ５’隣接配列（配列番号７６５）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ループ配列（配列番号７６７）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ３’隣接配列（配列番号７６６）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｆは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ６）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ５’隣接配列（配列番号７６５）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ループ配列（配列番号７６７）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ３’隣接配列（配列番号７６６）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、非コードスタッファー配列、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｇは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ７）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。 図８Ａ～８Ｇは、ＡＡＶベクターとともに使用するのに適した二重プロモーターを有するＡＡＶ９二重ｍｉＲＮＡ発現構築物の模式図を示す。図８Ａは、二重ｍｉＲＮＡ二重プロモーターベクター（ＤＭＴＰＶ１）発現構築物（配列番号７８５）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー（「Ｐ」）鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド（「Ｇ」）配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｂは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ２、配列番号７８６）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ５’隣接配列（配列番号７６５）、ＭＷ（配列番号８０）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ループ配列（配列番号７６７）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ３’隣接配列（配列番号７６６）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｃは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ３、配列番号７８７）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｄは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ４、配列番号７８８）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｅは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ５）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ５’隣接配列（配列番号７６５）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ループ配列（配列番号７６７）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ３’隣接配列（配列番号７６６）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｆは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ６）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ５’隣接配列（配列番号７６５）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ループ配列（配列番号７６７）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ３’隣接配列（配列番号７６６）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、非コードスタッファー配列、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。図８Ｇは、二重ｓｉＲＮＡ発現構築物（ＤＭＴＰＶ７）を示し、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有する。 図９Ａ及び９Ｂは、単一ｓｉＲＮＡベクター構築物（図９Ａ、Ｇ９、配列番号６８－構築物１（配列番号７７５）、ＧＣ、配列番号１０１）、及び二重ｍｉＲＮＡベクター構築物（図９Ｂ、ＤＭＴＰＶ１～４、配列番号それぞれ７８５～７８８）から産生されるベクターのｃＤＮＡのアルカリ性アガロースゲル分析を示す写真である。４種類全ての二重ｍｉＲＮＡベクター構築物にわたる単一バンドは、二重発現構築物のベクターが、ＡＡＶ９ベクターに単一パッケージングされていることを示す。 図９Ａ及び９Ｂは、単一ｓｉＲＮＡベクター構築物（図９Ａ、Ｇ９、配列番号６８－構築物１（配列番号７７５）、ＧＣ、配列番号１０１）、及び二重ｍｉＲＮＡベクター構築物（図９Ｂ、ＤＭＴＰＶ１～４、配列番号それぞれ７８５～７８８）から産生されるベクターのｃＤＮＡのアルカリ性アガロースゲル分析を示す写真である。４種類全ての二重ｍｉＲＮＡベクター構築物にわたる単一バンドは、二重発現構築物のベクターが、ＡＡＶ９ベクターに単一パッケージングされていることを示す。 ｑＰＣＲによって測定されるような、単一で、又は異なるｍｉＲＮＡ配列（Ｇ９－Ｓ１（配列番号７７５）、ＧＩ－Ｓ１（配列番号７９６）、ＧＩ－Ｓ２（配列番号７９８）、ＭＷ－Ｓ４（配列番号７９９）、Ｇ９－Ｓ５（配列番号８００）、若しくはこれらの組み合わせ）を含有する別の単一ｍｉＲＮＡ ＡＡＶ９構築物と組み合わせて送達される単一ｍｉＲＮＡ ＡＡＶ９構築物を使用した、ＧｌｕＫ２タンパク質ノックダウンのインビトロ有効性を示す棒グラフを示す。２種類の異なる抗Ｇｒｉｋ２ ｍｉＲＮＡ配列（両方ともｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０の制御下））の組み合わせでトランスフェクトされたＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓは、単一の種類の抗Ｇｒｉｋ２ ｍｉＲＮＡ配列でトランスフェクトされたＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓと同様のＧｌｕＫ２タンパク質のノックダウンを示し、このことは、ＧｌｕＫ２発現をノックダウンするためのＧｒｉｋ２に対する１つより多い固有のアンチセンスガイド配列をコードするベクターの使用を裏付けている。ノックダウン有効性は、「脂質のみ」対照群と比較した、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡレベルの倍率変化のメジアンの倍率変化として測定された。 ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）の制御下で、異なる単一ｍｉＲＮＡ ＡＡＶ９発現ベクターの組み合わせ（ＧＣ（配列番号１０１）、Ｇ９－Ｓ１（配列番号７７５）、ＧＩ－Ｓ１（配列番号７９６）、又はＧ９－Ｓ１＋ＧＩ－Ｓ１）でトランスフェクトされた、脱阻害されたマウス器官型海馬切片におけるてんかん性活性の周波数の棒グラフを示す。ｍｉＲＮＡ構築物の組み合わせであるＧ９－Ｓ１及びＧＩ－Ｓ１は、各々のベクター個々と等価なてんかん性活性よく制度を示し、このことは、海馬回路におけるてんかん性活性を抑制するためのＧｒｉｋ２に対する１つより多い固有のアンチセンスガイド配列の使用を裏付けている。 ｈＳｙｎ．ＧＩ（配列番号７７）．Ｓ２（配列番号７９８）、ｈＳｙｎ．ＭＷ（配列番号８０）．Ｓ４（配列番号７９９）、ｈＳｙｎ．ＭＷ．Ｓ５（配列番号８００）、ｈＳｙｎ．Ｇ９（配列番号６８）．Ｓ５（配列番号８０１）、ＣａＭＫＩＩ．ＧＩ．Ｓ４、ＣａＭＫＩＩ．ＭＷ．Ｓ５、ＣａＭＫＩＩ．Ｇ９．Ｓ５、ＤＭＴＰＶ１（配列番号７８５）、ＤＭＴＰＶ２（配列番号７８６）、ＤＭＴＰＶ３（配列番号７８７）、及びＤＭＴＰＶ４（配列番号７８８）を含むいくつかのアンチセンス構築物のうちの１つを使用する、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓにおけるＧｒｉｋ２のＡＡＶ９ベクター媒介性ノックアウトの後のｑＰＣＲによって測定されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのレベルを表す棒グラフを示す。ｍＲＮＡレベルを、ＲＮＡを産生しない全長ゲノムを含有するＡＡＶ．ヌルベクターで形質導入されたＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓと比較した。 図１３Ａ及び１３Ｂは、ピロカルピンで処理されたマウス、及びいくつかの単一ｍｉＲＮＡベクター構築物（ＧＣ（配列番号１０１）、Ｇ９－Ｓ１（配列番号７７５）、又はＧＩ－Ｓ１（配列番号７９６））のうちの１つで治療したマウスを用いて行われたオープンフィールド試験の結果を示す。図１３Ａは、オープンフィールドにおける単一マウスについての追跡された運動の例示的なトレースを示す。図１３Ｂは、抗Ｇｒｉｋ２ ｍｉＲＮＡ配列をコードするＡＡＶ９ベクターで治療したマウスによる、オープンフィールド試験における総移動距離を示す棒グラフを示す。非てんかん性マウス（すなわち、ピロカルピンで処理されていないマウス、ｎ＝２０）、及びＧＣ、Ｇ９－Ｓ１又はＧＩ－Ｓ１で治療された慢性てんかん性マウス（それぞれｎ＝９、ｎ＝８、ｎ＝９）。注射前及び注射後のデータを、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して比較した。＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１。Ｇ９及びＧＩを用いた過剰運動の有意な減少に留意されたい。 図１３Ａ及び１３Ｂは、ピロカルピンで処理されたマウス、及びいくつかの単一ｍｉＲＮＡベクター構築物（ＧＣ（配列番号１０１）、Ｇ９－Ｓ１（配列番号７７５）、又はＧＩ－Ｓ１（配列番号７９６））のうちの１つで治療したマウスを用いて行われたオープンフィールド試験の結果を示す。図１３Ａは、オープンフィールドにおける単一マウスについての追跡された運動の例示的なトレースを示す。図１３Ｂは、抗Ｇｒｉｋ２ ｍｉＲＮＡ配列をコードするＡＡＶ９ベクターで治療したマウスによる、オープンフィールド試験における総移動距離を示す棒グラフを示す。非てんかん性マウス（すなわち、ピロカルピンで処理されていないマウス、ｎ＝２０）、及びＧＣ、Ｇ９－Ｓ１又はＧＩ－Ｓ１で治療された慢性てんかん性マウス（それぞれｎ＝９、ｎ＝８、ｎ＝９）。注射前及び注射後のデータを、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して比較した。＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１。Ｇ９及びＧＩを用いた過剰運動の有意な減少に留意されたい。 図１４は、抗Ｇｒｉｋ２構築物Ｇ９－Ｓ１（配列番号７７５）、ＧＩ－Ｓ１（配列番号７９６）、又はスクランブル対照構築物ＧＣ（配列番号１０１）（それぞれｎ＝５、ｎ＝５、ｎ＝５）をコードするＡＡＶ９で治療した、ピロカルピン処理されたマウスにおける１日当たりのてんかん性発作の総数を示す棒グラフである。Ｇ９－Ｓ１及びＧＩ－Ｓ１の生データを、一元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用して、ＧＣと比較した。ｐ＜０．０１。Ｇ９－Ｓ１及びＧＩ－Ｓ１を用いたてんかん発作の抑制に留意されたい。 図１５は、異なる用量で抗Ｇｒｉｋ２構築物Ｇ９（配列番号６８）をコードするＡＡＶ９ベクターで治療したマウスによるオープンフィールド試験において、総移動距離を示す棒グラフである。異なる用量のＧ９：Ｇ９／１、Ｇ９／１０、Ｇ９／１００及びＧ９／１０００（それぞれ、ｎ＝８、ｎ＝５、ｎ＝５、ｎ＝５）で治療した、慢性てんかん性マウス。ＧＣは、対照構築物である（ｎ＝９）。注射前及び注射後のデータを、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して比較した。＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１。Ｇ９及びＧ９／１０の同様の効果に留意されたい。 図１６は、以下のいくつかの用量のうちの１つでの抗Ｇｒｉｋ２構築物Ｇ９－Ｓ１／Ｇ９（配列番号７７５）をコードするＡＡＶ９ベクターで治療した、ピロカルピン処理されたマウスにおける１日当たりのてんかん性発作の総数を示す棒グラフである。Ｇ９／１、Ｇ９／１０、Ｇ９／１００及びＧ９／１０００（それぞれ、ｎ＝６、ｎ＝４、ｎ＝２、ｎ＝２）。Ｇ９／１０００を用いた場合とは異なり、Ｇ９及びＧ９／１０を用いた同様の効果に留意されたい。 図１７は、いくつかの二重ｍｉＲＮＡ二重プロモーター構築物（ＤＭＴＰＶ１～４）のうちの１つをコードするＡＡＶ９ベクターで治療された、ピロカルピンで処理されたマウスによるオープンフィールド試験における総移動距離を示す棒グラフである。ＤＭＴＰＶ１（配列番号７８５）、ＤＭＴＰＶ２（配列番号７８６）、ＤＭＴＰＶ３（配列番号７８７）、又はＤＭＴＰＶ４（配列番号７８８）（それぞれｎ＝６、ｎ＝５、ｎ＝６、及びｎ＝６）で治療した、非てんかん性マウス（ｎ＝２０）及び慢性てんかん性マウス。注射前及び注射後のデータを、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用して比較した。＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１。ＤＭＴＰＶ３及びＤＭＴＰＶ４を用いた過剰運動の有意な減少に留意されたい。 図１８は、ピロカルピン処理されたマウスにおける１日当たりの自然発生するてんかん性発作の数に対する、オープンフィールド試験における総移動距離（ｃｍ）を示す散布図である。回帰分析は、過剰運動とてんかん発作の起こりやすさとの間の有意な相関関係を示す（Ｒ２＝０．７３８８、ｐ＜０．０００１）。 図１９は、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＤＭＴＰＶ１（配列番号７８５）、ＤＭＴＰＶ２（配列番号７８６）、ＤＭＴＰＶ３（配列番号７８７）、及びＤＭＴＰＶ４（配列番号７８８）を含む、いくつかの抗Ｇｒｉｋ２ ｍｉＲＮＡ配列のうちの１つ、及び対照ＡＡＶ９．ｈＳｙｎ．ＧＦＰベクターでのＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓの形質導入後のＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ発現を示す棒グラフである。試験した全ての二重ｍｉＲＮＡ構築物は、ＲＮＡ配列決定を使用して測定される場合、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓにおけるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡレベルを減少させた。倍率変化は、対照に対するものである。 図２０は、単一抗Ｇｒｉｋ２ ｍｉＲＮＡ配列Ｇ９（配列番号６８）、二重ｍｉＲＮＡベクターＤＭＴＰＶ３（配列番号７８７）をコードするベクターで治療したマウス、又は対照ＡＡＶ９．ｈＳｙｎ．ＧＦＰベクターで治療したマウスのオープンフィールド試験における運動を示す棒グラフである。ＷＴマウスを別個の対照として使用した。前＝治療前、後＝治療後。Ｇ９及びＤＭＴＰＶ３をコードするベクターは両方とも、マウスにおける過剰運動活性を有意に抑制し（ｐ＜０．０１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）、このことは、過剰運動の抑制に対するこれらのベクターの強固な効果を示唆している。 図２１は、ＤＭＴＰＶ３（３．６×１０１０個のＧＣ／脳）、ＤＭＴＰＶ３／１０（３．６×１０９個のＧＣ／脳）、ＤＭＴＰＶ３／１００（３．６×１０８個のＧＣ／脳）、及びＤＭＴＰＶ３／１０００（３．６×１０７個のＧＣ／脳）を含む、様々な用量のＤＭＴＰＶ３（配列番号７８７）で治療したマウスにおける、オープンフィールド試験における過剰運動活性の用量依存的減少を示す棒グラフである。対照マウスを、ＡＡＶ９．ｈＳｙｎ．ＧＦＰベクター（３．６×１０１０個のＧＣ／脳）で治療した。前＝治療前、後＝治療後。ＤＭＴＰＶ３及びＤＭＴＰＶ３／１０で治療したマウスは、対照マウスと比較して、過剰運動活性の有意な減少を示した（ｐ＜０．０１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。 図２２は、抗Ｇｒｉｋ２単一ｍｉＲＮＡ構築物Ｇ９（配列番号６８）若しくはＧＩ（配列番号７７）、又は二重ｍｉＲＮＡ構築物ＤＭＴＰＶ３（配列番号７８７）をコードするベクターで更に治療した、ピロカルピン処理されたマウスにおける１日当たりのてんかん発作の数を示す棒グラフである。また、マウスを、スクランブルＲＮＡ配列ＧＣ（配列番号１０１）又はＡＡＶ９．ｈＳｙｎ．ＧＦＰをコードする対照ベクターで治療した。Ｇ９、ＧＩ、及びＤＭＴＰＶ３で治療したマウスは、１日当たりのてんかん発作数の有意な減少を示し、ＤＭＴＰＶは、Ｇ９及びＧＩと比較して、より大きな減少を示す（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定）。 図２３、ＤＩＶ １の後にＡＡＶ９．ＧＣ（配列番号１０１）．ＧＦＰで感染した、ＴＬＥを有するヒト患者から切除され、歯状回顆粒細胞のマーカー（ＰＲＯＸ１）で染色された、器官型海馬脳切片の蛍光画像を示す。ＰＲＯＸ１標識化は、歯状回の歯状回顆粒細胞において観察された。ＧＦＰ標識化も、歯状回顆粒細胞において観察された。多くの細胞は、ＰＲＯＸ１及びＧＦＰの共標識化を示し、このことは、ＡＡＶ９．ＧＣ．ＧＦＰが、歯状回顆粒細胞に強固に形質導入することができたことを示している。 図２４は、ヒトＴＬＥ患者から切除された海馬組織における、抗Ｇｒｉｋ２ ｍｉＲＮＡ配列（Ｇ９、配列番号６８、ｎ＝６対象からの１７切片）、又はＧＩ（配列番号７７、２対象からの２切片）をコードするＡＡＶ９発現ベクターを使用したＧｌｕＫ２タンパク質ノックダウンの有効性を示す散布図である。ＧｌｕＫ２タンパク質発現のノックダウンは、Ｇ９をコードするベクターで治療したヒト海馬組織の５種類のセットのうちの５種類で観察された。 図２５は、ＴＬＥを有し、Ｇ９（配列番号６８）をコードするベクターで治療したヒト患者から切除された器官型海馬切片からのＧｌｕＫ２タンパク質発現を示すウェスタンブロットゲルの画像を示す。Ｇ９は、ＧｌｕＫ２タンパク質発現を、未治療切片と比較して４０％減少させることができた。ＧｌｕＫ２発現を、対照に対して正規化した。 図２６Ａ～２６Ｃは、生理学的条件（ＡＣＳＦ）下でＴＬＥを有するヒト患者からの器官型海馬切片からの実例となる局所電場電位の記録、及び記録されたてんかん性放電の定量化を示す。切片を、抗Ｇｒｉｋ２配列Ｇ９－Ｓ１（配列番号７７５、７切片、図２６Ａ）をコードするベクター、又はスクランブル配列ＧＣ及びＧＦＰレポーター（配列番号１０１、６切片、図２６Ｂ）をコードするベクターで治療した。挿入図は、より高い時間分解能での個々のてんかん性放電の電圧トレースを示す。４名のヒトＴＬＥ患者から得られた切片の中で、Ｇ９－Ｓ１は、てんかん性放電の発生を効果的に減少させるか、又は完全に排除することができた（図２６Ｃ、＊＊ｐ＜０．０１）。 図２６Ａ～２６Ｃは、生理学的条件（ＡＣＳＦ）下でＴＬＥを有するヒト患者からの器官型海馬切片からの実例となる局所電場電位の記録、及び記録されたてんかん性放電の定量化を示す。切片を、抗Ｇｒｉｋ２配列Ｇ９－Ｓ１（配列番号７７５、７切片、図２６Ａ）をコードするベクター、又はスクランブル配列ＧＣ及びＧＦＰレポーター（配列番号１０１、６切片、図２６Ｂ）をコードするベクターで治療した。挿入図は、より高い時間分解能での個々のてんかん性放電の電圧トレースを示す。４名のヒトＴＬＥ患者から得られた切片の中で、Ｇ９－Ｓ１は、てんかん性放電の発生を効果的に減少させるか、又は完全に排除することができた（図２６Ｃ、＊＊ｐ＜０．０１）。 図２６Ａ～２６Ｃは、生理学的条件（ＡＣＳＦ）下でＴＬＥを有するヒト患者からの器官型海馬切片からの実例となる局所電場電位の記録、及び記録されたてんかん性放電の定量化を示す。切片を、抗Ｇｒｉｋ２配列Ｇ９－Ｓ１（配列番号７７５、７切片、図２６Ａ）をコードするベクター、又はスクランブル配列ＧＣ及びＧＦＰレポーター（配列番号１０１、６切片、図２６Ｂ）をコードするベクターで治療した。挿入図は、より高い時間分解能での個々のてんかん性放電の電圧トレースを示す。４名のヒトＴＬＥ患者から得られた切片の中で、Ｇ９－Ｓ１は、てんかん性放電の発生を効果的に減少させるか、又は完全に排除することができた（図２６Ｃ、＊＊ｐ＜０．０１）。 図２７Ａ～２７Ｄは、ヒトＴＬＥ患者から切除された器官型海馬切片におけるＧｒｉｋ２発現の抑制を示す。ＤＭＴＰＶ３（配列番号７８７）、又はＡＡＶ．ｈＳｙｎ．ＧＦＰ対照ベクターで治療したヒト器官型海馬切片におけるＧｒｉｋ２遺伝子発現の散布図。ＤＭＴＰＶ３は、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定されるように、Ｇｒｉｋ２レベルのかなりの減少を示した（図２７Ａ）。ＤＭＴＰＶ３、又はスクランブル対照配列ＧＣ（配列番号１０１、図２７Ｂ）をコードするベクターで治療したヒトＴＬＥ患者から得られた、切除された器官型海馬脳切片から記録された例示的な電圧トレース。各々のアスタリスクは、てんかん性放電を表す。挿入図は、単一てんかん性放電のトレースを拡大したものを示す。ＤＭＴＰＶ３で治療した切片は、てんかん性放電の完全な除外を示した（図２７Ｃ）。ＧＣ、Ｇ９、ＡＡＶ９．ｈＳｙｎ．ＧＦＰ、又はＤＭＴＰＶ３で治療した切片において記録されたてんかん性放電の周波数の定量化を示す棒グラフ（図２７Ｄ）。最初の２つの棒グラフ（ＧＣ及びＧ９で治療した群に対応する）は、図２６Ｃに示されるものと同じであり、ＤＭＴＰＶ３治療群との比較のために含まれることを留意されたい。 図２７Ａ～２７Ｄは、ヒトＴＬＥ患者から切除された器官型海馬切片におけるＧｒｉｋ２発現の抑制を示す。ＤＭＴＰＶ３（配列番号７８７）、又はＡＡＶ．ｈＳｙｎ．ＧＦＰ対照ベクターで治療したヒト器官型海馬切片におけるＧｒｉｋ２遺伝子発現の散布図。ＤＭＴＰＶ３は、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定されるように、Ｇｒｉｋ２レベルのかなりの減少を示した（図２７Ａ）。ＤＭＴＰＶ３、又はスクランブル対照配列ＧＣ（配列番号１０１、図２７Ｂ）をコードするベクターで治療したヒトＴＬＥ患者から得られた、切除された器官型海馬脳切片から記録された例示的な電圧トレース。各々のアスタリスクは、てんかん性放電を表す。挿入図は、単一てんかん性放電のトレースを拡大したものを示す。ＤＭＴＰＶ３で治療した切片は、てんかん性放電の完全な除外を示した（図２７Ｃ）。ＧＣ、Ｇ９、ＡＡＶ９．ｈＳｙｎ．ＧＦＰ、又はＤＭＴＰＶ３で治療した切片において記録されたてんかん性放電の周波数の定量化を示す棒グラフ（図２７Ｄ）。最初の２つの棒グラフ（ＧＣ及びＧ９で治療した群に対応する）は、図２６Ｃに示されるものと同じであり、ＤＭＴＰＶ３治療群との比較のために含まれることを留意されたい。 図２７Ａ～２７Ｄは、ヒトＴＬＥ患者から切除された器官型海馬切片におけるＧｒｉｋ２発現の抑制を示す。ＤＭＴＰＶ３（配列番号７８７）、又はＡＡＶ．ｈＳｙｎ．ＧＦＰ対照ベクターで治療したヒト器官型海馬切片におけるＧｒｉｋ２遺伝子発現の散布図。ＤＭＴＰＶ３は、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定されるように、Ｇｒｉｋ２レベルのかなりの減少を示した（図２７Ａ）。ＤＭＴＰＶ３、又はスクランブル対照配列ＧＣ（配列番号１０１、図２７Ｂ）をコードするベクターで治療したヒトＴＬＥ患者から得られた、切除された器官型海馬脳切片から記録された例示的な電圧トレース。各々のアスタリスクは、てんかん性放電を表す。挿入図は、単一てんかん性放電のトレースを拡大したものを示す。ＤＭＴＰＶ３で治療した切片は、てんかん性放電の完全な除外を示した（図２７Ｃ）。ＧＣ、Ｇ９、ＡＡＶ９．ｈＳｙｎ．ＧＦＰ、又はＤＭＴＰＶ３で治療した切片において記録されたてんかん性放電の周波数の定量化を示す棒グラフ（図２７Ｄ）。最初の２つの棒グラフ（ＧＣ及びＧ９で治療した群に対応する）は、図２６Ｃに示されるものと同じであり、ＤＭＴＰＶ３治療群との比較のために含まれることを留意されたい。 図２７Ａ～２７Ｄは、ヒトＴＬＥ患者から切除された器官型海馬切片におけるＧｒｉｋ２発現の抑制を示す。ＤＭＴＰＶ３（配列番号７８７）、又はＡＡＶ．ｈＳｙｎ．ＧＦＰ対照ベクターで治療したヒト器官型海馬切片におけるＧｒｉｋ２遺伝子発現の散布図。ＤＭＴＰＶ３は、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定されるように、Ｇｒｉｋ２レベルのかなりの減少を示した（図２７Ａ）。ＤＭＴＰＶ３、又はスクランブル対照配列ＧＣ（配列番号１０１、図２７Ｂ）をコードするベクターで治療したヒトＴＬＥ患者から得られた、切除された器官型海馬脳切片から記録された例示的な電圧トレース。各々のアスタリスクは、てんかん性放電を表す。挿入図は、単一てんかん性放電のトレースを拡大したものを示す。ＤＭＴＰＶ３で治療した切片は、てんかん性放電の完全な除外を示した（図２７Ｃ）。ＧＣ、Ｇ９、ＡＡＶ９．ｈＳｙｎ．ＧＦＰ、又はＤＭＴＰＶ３で治療した切片において記録されたてんかん性放電の周波数の定量化を示す棒グラフ（図２７Ｄ）。最初の２つの棒グラフ（ＧＣ及びＧ９で治療した群に対応する）は、図２６Ｃに示されるものと同じであり、ＤＭＴＰＶ３治療群との比較のために含まれることを留意されたい。 図２８は、発現ベクターＤＭＳＰＶ１（配列番号８１１）及びＤＭＴＰＶ８（配列番号８１３）で治療したマウス皮質ニューロンにおける、対照ＡＡＶ９．ｈＳｙｎ．ＧＦＰベクター及びｈＳｙｎ．Ｇ９－Ａ－ｍｉＲ－３０ベンチマークベクター（配列番号７７５）と比較した、ＧｌｕＫ２発現の割合を示す棒グラフである。データは、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表される。発現構築物ＤＭＳＰＶ１及びＤＭＰＴＶ８は、マウス皮質ニューロンにおいて、ベンチマークｈＳｙｎ．Ｇ９－Ａ－ｍｉＲ－３０ベクターに匹敵するＧｌｕＫ２のノックダウンを引き起こした。 図２９は、対照ベクターＡＡＶ９．ｈｓｙｎ．ＧＦＰ（３．６Ｅ＋９ＭＯＩ、ｎ＝２）、ＤＭＳＰＶ１（３．６Ｅ＋９又は３．６Ｅ＋８ＭＯＩ、各ＭＯＩについてｎ＝３）、ＤＭＴＰＶ８（３．６Ｅ＋９又は３．６Ｅ＋８ＭＯＩ、各ＭＯＩについてｎ＝３）で治療する前（白色の棒グラフ）及び後（黒色の棒グラフ）のオープンフィールド箱における１０分間の自然発生する探索の間の慢性てんかん性マウスによる総移動距離を示す棒グラフである。ＤＭＳＰＶ１及びＤＭＴＰＶ８は、てんかん原性の行動代理である、マウスにおける過剰運動活性の用量依存的減少をもたらした。 図３０は、本開示のＡＡＶベクターの模式図であり、このＡＡＶベクターは、５’から３’へ、 （ａ）ＡＡＶ ５’ＩＴＲ配列（例えば、配列番号７４６及び７４７のうちのいずれか１つ）と、 （ｂ）プロモーター配列、例えば、 （ｉ）ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２、６８３、６８４、及び６８５のうちのいずれか１つ）、 （ｉｉ）ＮｅｕＮプロモーター（例えば、配列番号６８６）、 （ｉｉｉ）ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）、 （ｉｖ）ＮＳＥプロモーター（例えば、配列番号６９２若しくは３９３）、 （ｖ）ＰＤＧＦ－ベータプロモーター（例えば、配列番号６９４～６９６のうちのいずれか１つ）、 （ｖｉ）ＶＧｌｕＴプロモーター（例えば、配列番号６９７～７０１のうちのいずれか１つ）、 （ｖｉｉ）ＳＳＴプロモーター（例えば、配列番号７０２若しくは７０３）、 （ｖｉｉｉ）ＮＰＹプロモーター（例えば、配列番号７０４）、 （ｉｘ）ＶＩＰプロモーター（例えば、配列番号７０５若しくは７０６）、 （ｘ）ＰＶプロモーター（例えば、配列番号７０７～７０９のうちのいずれか１つ）、 （ｘｉ）ＧＡＤ６５プロモーター（例えば、配列番号７１０～７１３のうちのいずれか１つ）、 （ｘｉｉ）ＧＡＤ６７プロモーター（例えば、配列番号７１４若しくは７１５）、 （ｘｉｉｉ）ＤＲＤ１プロモーター（例えば、配列番号７１６）、 （ｘｉｖ）ＤＲＤ２プロモーター（例えば、配列番号７１７若しくは７１８）、 （ｘｖ）Ｃ１ＱＬ２プロモーター（例えば、配列番号７１９）、 （ｘｖｉ）ＰＯＭＣプロモーター（例えば、配列番号７２０）、 （ｘｖｉｉ）ＰＲＯＸ１プロモーター（例えば、配列番号７２１若しくは７２２）、 （ｘｖｉｉｉ）ＭＡＰ１Ｂプロモーター（例えば、配列番号７２３～７２５のうちのいずれか１つ）、 （ｘｉｘ）ＴＵＢＡ１Ａプロモーター（例えば、配列番号７２６若しくは７２７）、 （ｘｘ）Ｕ６プロモーター（例えば、配列番号７２８～７３３のうちのいずれか１つ）、 （ｘｘｉ）Ｈ１プロモーター（例えば、配列番号７３４）、 （ｘｘｉｉ）７ＳＫプロモーター（例えば、配列番号７３５）、 （ｘｘｉｉｉ）ＡｐｏＥ．ｈＡＡＴプロモーター（例えば、配列番号７３６）、 （ｘｘｉｖ）ＣＡＧプロモーター（例えば、配列番号７３７）、 （ｘｘｖ）ＣＢＡプロモーター（例えば、配列番号７３８）、 （ｘｘｖｉ）ＣＫ８プロモーター（例えば、配列番号７３９）、 （ｘｘｖｉｉ）ＭＵ１Ａプロモーター（例えば、配列番号７４０）、 （ｘｘｖｉｉｉ）ＥＦ１－アルファプロモーター（例えば、配列番号７４１）、及び （ｘｘｉｘ）ＴＢＧプロモーター（配列番号７４２）のうちのいずれか１つと、 （ｃ）ステム－ループ配列であって、 （ｉ）５’隣接配列（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、及び７６８のうちのいずれか１つ）、 （ｉｉ）ガイド鎖（例えば、配列番号１～１００のうちのいずれか１つ）、又はパッセンジャー鎖配列（例えば、配列番号１～１００うちのいずれか１つに対して実質的若しくは完全に相補的である配列）を含有する５ｐステム－ループアーム、 （ｉｉｉ）マイクロＲＮＡループ配列（例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、及び７７０のうちのいずれか１つ）、及び （ｉｖ）パッセンジャー鎖（例えば、配列番号１～１００のうちのいずれか１つに対して実質的若しくは完全に相補的である配列）、又はガイド鎖配列（例えば、配列番号１～１００のうちのいずれか１つ）を含有する３ｐステム－ループアーム、及び （ｖ）３’隣接配列（例えば、配列番号７５３、７５４、７５７、７６０、７６３、７６６、及び７６９のうちのいずれか１つ）を含有する、ステム－ループ配列と、 （ｄ）３’非翻訳領域（ＵＴＲ、例えば、配列番号７５０及び７５１のうちのいずれか１つ）と、 （ｅ）ＡＡＶ ３’ＩＴＲ配列（例えば、配列番号７４８及び７４９のうちのいずれか１つ）と、を含有する。上述の要素のうちのいずれか１つの組み合わせを含有するＡＡＶベクターは、本明細書に開示される方法に従って使用するのに適したものであり得る。 図３１は、３．６Ｅ＋９ＭＯＩの対照ベクター（ＣＶ、ｎ＝３）、３．６Ｅ＋９ＭＯＩの構築物ＳＭＳＰＶ４（ｎ＝４）、３．６Ｅ＋８ＭＯＩの構築物ＳＭＳＰＶ４（ｎ＝４）、３．６Ｅ＋９ＭＯＩの構築物ＳＭＳＰＶ５（ｎ＝４）、３．６Ｅ＋８ＭＯＩの構築物ＳＭＳＰＶ５（ｎ＝４）、３．６Ｅ＋９ＭＯＩの構築物ＳＭＳＰＶ６（ｎ＝４）、及び３．６Ｅ＋８ＭＯＩの構築物ＳＭＳＰＶ６（ｎ＝４）で治療する前（白色の棒グラフ）及び後（黒色の棒グラフ）のオープンフィールド箱における１０分間の自然発生する探索の間の慢性てんかん性マウスによる総移動距離を示す棒グラフである。ＳＭＳＰＶ４、ＳＭＳＰＶ５、及びＳＭＳＰＶ６によるマウスの治療は、対照構築物とは異なり、てんかん性行動の代理となるマウスの過剰運動を減少させた。前＝治療前、後＝治療後、Ｅ８＝３．６Ｅ＋８ＭＯＩ、Ｅ９＝３．６Ｅ＋９ＭＯＩ。
対象（例えば、哺乳動物対象、例えば、ヒト）におけるてんかん、例えば、側頭葉てんかん（ＴＬＥ、例えば、治療に難治性のＴＬＥ）の治療のための組成物及び方法が本明細書で記載される。例えば、グルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（Ｇｒｉｋ２）遺伝子によってコードされるｍＲＮＡを標的化する、治療有効量の阻害性ＲＮＡ分子（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）又はこれらをコードする核酸ベクター、例えば、本明細書に記載されるもの）を、例えば、本明細書に記載の方法に従って投与し、てんかんを治療することを必要とする対象においてそれを行うことができる。ＴＬＥの治療のためのＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化するＡＳＯ剤をコードする核酸ベクター（例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター）を含有する組成物が本明細書で記載される。
Ｇｒｉｋ２
Ｇｒｉｋ２は、カイニン酸型アゴニストによって選択的に活性化させることができるイオンチャネル型グルタミン酸受容体サブユニットＧｌｕＫ２をコードする遺伝子である。ＧｌｕＫ２含有カイニン酸型受容体（ＫＡＲ）は、他のイオンチャネル型グルタミン酸受容体と同様に、グルタメートによる迅速なリガンドゲーティングを示し、ナトリウム及びカリウムに透過性のカチオンチャンネル孔を開放することによって作用する。ＫＡＲ複合体は、ＫＡＲサブユニットのヘテロマー集合体又はホモマー集合体としていくつかのサブユニットから組み立てられ得る。かかる受容体は、細胞外Ｎ末端と、リガンド結合ドメイン及び細胞内Ｃ末端が合わさって形成する大きなペプチドループを特徴とする。イオンチャネル型グルタミン酸受容体複合体自体は、リガンド依存性イオンチャンネルとして作用し、グルタメートが結合すると、神経膜を通る帯電イオンの通過を媒介する。一般に、ＫＡＲは、ＧｌｕＫ１、２及び／又は３（以前にはそれぞれＧｌｕＲ５、ＧｌｕＲ６及びＧｌｕＲ７と命名されていた）、ＧｌｕＫ４（ＫＡ１）及びＧｌｕＫ５（ＫＡ２）サブユニットのマルチマー集合体である（Ｃｏｌｌｉｎｇｒｉｄｇｅ，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．２００９ Ｊａｎ；５６（１）：２－５）。ＫＡＲ複合体に関与するサブユニットの種々の組み合わせは、多くの場合、特定のＫＡＲサブユニットをコードするｍＲＮＡのＲＮＡスプライシング及び／又はＲＮＡ編集（例えば、アデノシンデアミナーゼによる、アデノシンからイノシンへの変換）によって決定される。更に、係るＲＮＡ修飾は、受容体の特性（例えば、チャンネルのカルシウム透過性を変化させること）に影響を与え得る。ＧｌｕＫ２含有ＫＡＲは、イオンチャネル型グルタミン酸受容体活性、及びその後にてんかん原性に関連する症状の緩和の調整に適した標的である。
側頭葉てんかん
てんかん原性は、てんかんの確立を引き起こし、病的な神経ネットワーク再編成を引き起こす細胞、分子、及び形態学的変化を引き起こしつつ、潜在的にあらわれ得るプロセスである。ＴＬＥは、てんかん原性病巣の解剖学的起源に基づいて、２つの主要な型によって特徴付けられる。内側側頭葉（特に、例えば、海馬、海馬傍回、海馬支脚、及び扁桃体）に由来するＴＬＥは、内側ＴＬＥ（ｍＴＬＥ）と呼ばれ、一方で、外側側頭葉（例えば、側頭新皮質）に由来するＴＬＥは、外側ＴＬＥ（ｌＴＬＥ）と称される。ＴＬＥの特徴的な追加の特徴としては、海馬のＣＡ１、ＣＡ３、歯状回門、及び歯状回（ＤＧ）領域における神経細胞の死、ＧＡＢＡ逆転電位の逆転、ＤＧにおける顆粒細胞（ＧＣ）の分散、並びに歯状回ＧＣ上での病態生理学的な再発性興奮性シナプス（ｒＭＦ－ＤＧＣシナプス）の形成を生じさせる再発性ＧＣ苔状線維の発芽が挙げられ得る。
様々な原因因子は、内側側頭葉硬化、外傷性脳損傷、脳感染（例えば、脳炎及び髄膜炎）、低酸素性脳損傷、卒中、脳腫瘍、遺伝的症候群、及び熱性てんかん発作を含むＴＬＥの病因に起因している。ＣＮＳの可塑性は、発達状態及び脳領域に特異的な影響の受けやすさの両方に依存するため、脳損傷を有する全ての対象が、てんかんを発症するわけではない。ＤＧを含む海馬は、ＴＬＥを引き起こす損傷に特に影響を受けやすい脳領域であることが特定されており、いくつかの場合において、治療抵抗性（すなわち、難治性）のてんかんと関連がある（Ｊａｒｅｒｏ－Ｂａｓｕｌｔｏ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，２０１８，１１，１７；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｐｈ１１０１００１７）。興奮性グルタミン酸作動性シグナル伝達の増幅は、自然発生するてんかん発作を容易にし得る（Ｋｕｒｕｂａ，ｅｔ ａｌ．Ｅｐｉｌｅｐｓｙ Ｂｅｈａｖ．２００９，１４（Ｓｕｐｐｌ．１），６５－７３）。化学的グルタミン酸阻害剤、例えば、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニストは、グルタミン酸媒介性興奮毒性及び急性てんかん発作発生によるニューロンの死をブロックするか、又は減少させることが示されている。しかしながら、かかる薬剤は、ＴＬＥにおいて、良くない有効性を示す（Ｆｏｓｔｅｒ，ＡＣ，ａｎｄ Ｋｅｍｐ，ＪＡ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００６，６，７－１７）。
理論によって束縛されることを望まないが、異常なｒＭＦ－ＤＧＣシナプスは、異所性ＧｌｕＫ２含有ＫＡＲを介して作動し（Ｅｐｓｚｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００５、Ａｒｔｉｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１，２０１５）、ＴＬＥにおいて、慢性てんかん発作において重要な役割を果たし得る（Ｐｅｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。例えば、発作間欠期スパイク及び発作時イベント（すなわち、てんかん性脳活性の電気生理学的シグネチャ）は、ＧｌｕＫ２受容体サブユニットを欠くトランスジェニックマウスにおいて、又はＧｌｕＫ２／ＧｌｕＫ５受容体を阻害する薬理学的薬剤の存在下で、減少した（Ｐｅｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４、Ｃｒｅｐｅｌ ａｎｄ Ｍｕｌｌｅ，２０１５）。これらの理論を試験するために設計されたトランスジェニック動物モデルにおいて、ＧｌｕＫ２のノックダウン又はサイレンシングが実行可能であるが、ＧｌｕＫ２サブユニットにとって選択的であり、かつヒトにおいて使用するのに安全な阻害剤を設計することは、困難である。ＧｌｕＫサブユニットは、構造的に保存されており、そのＤＮＡコード配列は、顕著な相同性を共有する。ホモマー及びヘテロマーのイオンチャネル型及び代謝調節型のグルタミン酸受容体に関する脳の複雑な遺伝子発現パターンは、任意の療法戦略を更に複雑化する。本明細書に開示される方法及び組成物は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化し、ニューロン又はアストログリアにおけるＧｌｕＫ２含有ＫＡＲの発現を低下させる（例えば、ノックダウンする）ことによる、ＴＬＥ（例えば、ｍＴＬＥ又はｌＴＬＥ）の治療に適しており、例えば、神経回路（例えば、海馬回路）における自然発生するてんかん性放電の減少を促進する。そのように、本明細書に記載の組成物及び方法は、その疾患の生理学的原因を標的化し、根治療法に使用することができる。
Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化するオリゴヌクレオチド剤
ＴＬＥの臨床管理は、困難なことで有名であり、ＴＬＥ患者の最大３分の１は、利用可能な医薬を使用して、衰弱させるてんかん発作を十分に制御することができない。これらの患者は、多くの場合、治療に難治性である再発性てんかん発作を経験する。かかるシナリオにおいて、ＴＬＥ患者は、側頭葉におけるてんかん原性病巣の侵襲的かつ不可逆的な外科的切除に頼る場合があり、望ましくない認知欠損を引き起こす可能性がある。したがって、ＴＬＥ患者のうちのかなりの割合が、薬剤抵抗性ＴＬＥを治療するための新規な療法手段を必要としている。本明細書に記載の組成物及び方法は、ＴＬＥの発症及び進行を引き起こす、その基礎にある分子病態生理学を治療するという利益を提供する。
本明細書に記載の組成物は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（例えば、配列番号１１５～１２５のうちのいずれか１つ）を標的化する阻害性ＲＮＡ構築物をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＡＳＯ剤、又はそれらをコードする核酸ベクター）を、本明細書に記載の方法に従って投与して、ＴＬＥを治療することができる。本明細書に記載の方法及び組成物を使用して、任意の種類のＴＬＥ、例えば、焦点てんかん発作を伴うＴＬＥ、全般てんかん発作を伴うＴＬＥ、ｍＴＬＥ、又はｌＴＬＥを有するＴＬＥ患者を治療することができる。更に、本明細書に開示される方法及び組成物を使用して、任意の病因、例えば、内側側頭葉硬化、外傷性脳損傷、脳感染（例えば、脳炎及び髄膜炎）、低酸素性脳損傷、卒中、脳腫瘍、遺伝的症候群、又は熱性てんかん発作から生じるＴＬＥを治療し得る。本明細書に記載の組成物及び方法はまた、ＴＬＥを発症するリスクがある対象、例えば、ＴＬＥ進行の潜伏期にある対象に予防的治療として投与され得る。
本明細書に開示される方法及び組成物によれば、ＡＳＯは、細胞（例えば、ニューロン、例えば、海馬ニューロン、例えば、歯状回の海馬ニューロン、例えば、歯状回顆粒細胞（ＤＧＣ））においてＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡの分解を引き起こし、それによって、ｍＲＮＡから機能的ＧｌｕＫ２タンパク質への翻訳を防止することによって、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの発現を阻害し得る。
本明細書に開示されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化するＡＳＯ剤は、１つ以上の脳領域において、てんかん性脳活性（例えば、てんかん性放電）の発生の頻度を低下させるか、又はその発生を完全に阻害するように作用し得る。かかる脳領域としては、限定されないが、内側側頭葉、外側側頭葉、前頭葉、又はより特定的には、海馬（例えば、ＤＧ、ＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３、海馬支脚）、若しくは新皮質が挙げられ得る。ＤＧのｒＭＦ－ＤＧＣにおけるＧｌｕＫ２含有ＫＡＲの異常な発現に起因して、てんかん性脳活性の発生は、ＤＧにおいて阻害され得る。
したがって、本開示は、ＣＮＳ細胞におけるてんかん性放電（例えば、ＤＧＣ）を減少させるための方法及び組成物であって、細胞と、有効量の配列番号１～１００のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するＡＳＯ、又はこれらをコードする核酸ベクターとを接触させることによる、方法及び組成物を提供する。
本開示のＡＳＯ剤は、ＧｌｕＫ２阻害剤であり得る。特に、ＧｌｕＫ２阻害剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ発現阻害剤であり得る。ＧｌｕＫ２の発現の阻害は、ＧｌｕＫ５のレベルも阻害し得る（Ｒｕｉｚ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００５）。何らかの理論によって束縛されることを望まないが、本開示は、ＧｌｕＫ５サブユニットのみではホモマー集合体を形成することができないため、ＧｌｕＫ２のみを十分に除去すると、全てのＧｌｕＫ２／ＧｌｕＫ５ヘテロマーを除去するはずであるという原理に基づく。
開示される方法及び組成物によれば、本明細書に開示されるＡＳＯ剤は、１５～５０個のヌクレオチド（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、ｏｒ ２５、３０、３５、４０、４５、又は最大５０個のヌクレオチド）の長さを有し得る。例えば、本明細書に開示されるＡＳＯ剤は、１５個のヌクレオチドの長さを有し得る。別の例において、ＡＳＯ剤は、１６個のヌクレオチドの長さを有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、１７個のヌクレオチドの長さを有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、１８個のヌクレオチドの長さを有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、１９個のヌクレオチドの長さを有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、２０個のヌクレオチドの長さを有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、２１個のヌクレオチドの長さを有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、２２個のヌクレオチドの長さを有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、２３個のヌクレオチドの長さを有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、２４個のヌクレオチドの長さを有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、２５個のヌクレオチドの長さを有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、２５～３０個のヌクレオチドの長さを有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、３０～３５個のヌクレオチドの長さを有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、３５～４０個のヌクレオチドの長さを有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、４０～４５個のヌクレオチドの長さを有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、４５～５０個のヌクレオチドの長さを有する。
本開示のＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの配列（例えば、配列番号１１５～６８９のうちのいずれか１つ）、又はそれらのバリアントの領域に対して少なくとも実質的に相補的又は完全に相補的である配列を含み、この相補性は、細胞内条件下で特異的な結合を得るのに十分である。例えば、本開示は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の少なくとも７個の（例えば、少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２個、又はそれより多くの）連続ヌクレオチドに対して相補的であるアンチセンス配列を有するＡＳＯ剤を企図する。特定の例において、ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の７個の連続ヌクレオチドに対して相補的であるアンチセンス配列を有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の８個の連続ヌクレオチドに対して相補的であるアンチセンス配列を有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の９個の連続ヌクレオチドに対して相補的であるアンチセンス配列を有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の１０個の連続ヌクレオチドに対して相補的であるアンチセンス配列を有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の１１個の連続ヌクレオチドに対して相補的であるアンチセンス配列を有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の１２個の連続ヌクレオチドに対して相補的であるアンチセンス配列を有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の１３個の連続ヌクレオチドに対して相補的であるアンチセンス配列を有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の１４個の連続ヌクレオチドに対して相補的であるアンチセンス配列を有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の１５個の連続ヌクレオチドに対して相補的であるアンチセンス配列を有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の１６個の連続ヌクレオチドに対して相補的であるアンチセンス配列を有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の１７個の連続ヌクレオチドに対して相補的であるアンチセンス配列を有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の１８個の連続ヌクレオチドに対して相補的であるアンチセンス配列を有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の１９個の連続ヌクレオチドに対して相補的であるアンチセンス配列を有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の２０個の連続ヌクレオチドに対して相補的であるアンチセンス配列を有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の２１個の連続ヌクレオチドに対して相補的であるアンチセンス配列を有する。別の例において、ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域の２２個の連続ヌクレオチドに対して相補的であるアンチセンス配列を有する。なお別の例において、ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域のヌクレオチドに対して１００％相補的であるアンチセンス配列を有する。
本開示は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域（例えば、配列番号１１５～６８１に記載されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡの領域のうちのいずれか１つ）に結合すると、７～２２個の（例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２個の）ヌクレオチド長のＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡと二本鎖構造を形成するＡＳＯ剤を企図する。例えば、ＡＳＯ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二本鎖構造は、７個のヌクレオチド長であり得る。別の例において、ＡＳＯ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二本鎖構造は、８個のヌクレオチド長であり得る。別の例において、ＡＳＯ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二本鎖構造は、９個のヌクレオチド長であり得る。別の例において、ＡＳＯ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二本鎖構造は、１０個のヌクレオチド長であり得る。別の例において、ＡＳＯ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二本鎖構造は、１１個のヌクレオチド長であり得る。別の例において、ＡＳＯ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二本鎖構造は、１２個のヌクレオチド長であり得る。別の例において、ＡＳＯ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二本鎖構造は、１３個のヌクレオチド長であり得る。別の例において、ＡＳＯ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二本鎖構造は、１４個のヌクレオチド長であり得る。別の例において、ＡＳＯ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二本鎖構造は、１５個のヌクレオチド長であり得る。別の例において、ＡＳＯ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二本鎖構造は、１６個のヌクレオチド長であり得る。別の例において、ＡＳＯ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二本鎖構造は、１７個のヌクレオチド長であり得る。別の例において、ＡＳＯ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二本鎖構造は、１８個のヌクレオチド長であり得る。別の例において、ＡＳＯ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二本鎖構造は、１９個のヌクレオチド長であり得る。別の例において、ＡＳＯ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二本鎖構造は、２０個のヌクレオチド長であり得る。別の例において、ＡＳＯ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二本鎖構造は、２１個のヌクレオチド長であり得る。なお別の例において、ＡＳＯ剤とＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの間の二本鎖構造は、１０個のヌクレオチド長であり得る。
開示される方法及び組成物によれば、ＡＳＯ剤（例えば、本明細書に開示されるＡＳＯ剤のうちのいずれか１つ、例えば、配列番号１～１００のＡＳＯ配列のうちのいずれか１つ、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域とによって形成される二本鎖構造は、少なくとも１個の（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個の）ミスマッチを含み得る。例えば、二本鎖構造は、１個のミスマッチを含有し得る。別の例において、二本鎖構造は、２個のミスマッチを含有する。別の例において、二本鎖構造は、３個のミスマッチを含有する。別の例において、二本鎖構造は、４個のミスマッチを含有する。別の例において、二本鎖構造は、５個のミスマッチを含有する。別の例において、二本鎖構造は、６個のミスマッチを含有する。別の例において、二本鎖構造は、７個のミスマッチを含有する。別の例において、二本鎖構造は、８個のミスマッチを含有する。別の例において、二本鎖構造は、９個のミスマッチを含有する。別の例において、二本鎖構造は、１０個のミスマッチを含有する。別の例において、二本鎖構造は、１１個のミスマッチを含有する。別の例において、二本鎖構造は、１２個のミスマッチを含有する。別の例において、二本鎖構造は、１３個のミスマッチを含有する。別の例において、二本鎖構造は、１４個のミスマッチを含有する。なお別の例において、二本鎖構造は、１５個のミスマッチを含有する。
したがって、本開示の目的は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化する単離されたＡＳＯ剤、合成ＡＳＯ剤、又は組換えＡＳＯ剤に関する。本開示のＡＳＯ剤は、ＲＮＡ又はＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、任意の適切な型のものであり得る。したがって、開示される方法及び組成物は、ＡＳＯ剤であるＧｒｉｋ２発現阻害剤を特徴とする（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｓｈｍｉＲＮＡ、又はｓｈｍｉＲＮＡ）。アンチセンスＲＮＡ分子及びアンチセンスＤＮＡ分子を含む、ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、タンパク質翻訳を防止するか、又はｍＲＮＡ分解を増加させ、それによって、ＧｌｕＫ２タンパク質のレベル及び活性を低下させることによって、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの翻訳を直接的にブロックするように作用し得る。例えば、少なくとも約１９個の塩基を有し、ＧｌｕＫ２をコードするｍＲＮＡ転写産物配列の固有領域に対する相補性を有するＡＳＯ剤は、例えば、従来の技術（例えば、本明細書に開示される技術）によって合成され、例えば、本明細書に記載の他の経路の中で特に、静脈内注射又は注入、例えば、脳の領域への直接的な注射によって投与され得る。配列が既知である遺伝子の遺伝子発現を特異的に軽減するためのアンチセンス技術を使用するための方法は、当該技術分野でよく知られている（例えば、その各々が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５６６，１３５号、第６，５６６，１３１号、第６，３６５，３５４号、第６，４１０，３２３号、第６，１０７，０９１号、第６，０４６，３２１号、及び第５，９８１，７３２号を参照されたい）。
特定の例において、本開示のＧｒｉｋ２ ＡＳＯ剤は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であり得る。Ｇｒｉｋ２遺伝子発現は、対象又は細胞を、低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、又はそれをコードするベクターと接触させることによって減少し、それによって、配列特異的な方法で（例えば、ＲＮＡ干渉経路によって）、ｍＲＮＡの分解によってＧｒｉｋ２発現を特異的に阻害することができる低分子二本鎖ＲＮＡを産生することができる。適切なｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択するための方法は、配列が既知である遺伝子について、当該技術分野で知られている（例えば、各々が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）、Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００１）、Ｈａｎｎｏｎ，ＧＪ．（２００２）、ＭｃＭａｎｕｓ，ＭＴ．ｅｔ ａｌ．（２００２）、Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，ＴＲ．ｅｔ ａｌ．（２００２）、米国特許第６，５７３，０９９号及び第６，５０６，５５９号、並びに国際特許公開第０１／３６６４６号、同第９９／３２６１９号、及び同第０１／６８８３６号を参照されたい）。
本開示のＧｒｉｋ２ ＡＳＯ剤はまた、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり得る。ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするために使用することができる密なヘアピンターンを作製するＲＮＡの配列である。ｓｈＲＮＡは、一般に、標的細胞に導入されるベクターを使用して発現され、一方で、ベクターは、多くの場合、ｓｈＲＮＡが構成的に発現されることを確実にするために、ユビキタスＵ６プロモーターを利用する。このベクターは、通常、娘細胞に伝わり、遺伝子サイレンシングを細胞分裂後に維持することを可能にする。ｓｈＲＮＡヘアピン構造は、ｓｉＲＮＡ内の細胞機構によって切断され、次いで、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合する。この複合体は、それに結合するｓｉＲＮＡ配列にマッチするｍＲＮＡに結合し、これを切断する。
これに加えて、本開示のＧｒｉｋ２発現阻害剤は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であり得る。ｍｉＲＮＡは、当該技術分野で一般的な意味を有し、例えば、一般に、２１～２２個のヌクレオチドの長さであるが、１９個から最大２３個のヌクレオチドの長さが報告されており、これを使用して標的とされたｍＲＮＡの翻訳を抑制することができる、マイクロＲＮＡ分子を指す。ｍｉＲＮＡは各々、より長い前駆体ＲＮＡ分子（「前駆体ｍｉＲＮＡ」）からプロセシングされる。前駆体ｍｉＲＮＡは、非タンパク質コード遺伝子から転写される。前駆体ｍｉＲＮＡは、動物において、Ｄｉｃｅｒと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ様ヌクレアーゼ酵素によって切断される、ステム－ループ構造又はフォールド－バック様（ｆｏｌｄ－ｂａｃｋ－ｌｉｋｅ）構造を形成することを可能にする２つの相補性を有する領域を有する。プロセシングされたｍｉＲＮＡは、典型的には、標的ｍＲＮＡの領域に対して完全又は実質的に相補的である「シード配列（ｓｅｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」（典型的には６～８個のヌクレオチド）を含有するステムの一部である。プロセシングされたｍｉＲＮＡ（「成熟ｍｉＲＮＡ」とも呼ばれる）は、大きな複合体の一部となり、特定の標的遺伝子を下方調節する（例えば、翻訳を低下させるか、又はｍＲＮＡを分解する）。
更に、本開示のＧｌｕＫ２阻害剤は、ｍｉＲＮＡ適合ｓｈＲＮＡ（ｓｈｍｉＲＮＡ）である。ｓｈｍｉＲＮＡ剤は、マイクロＲＮＡ隣接配列及びループ配列を含有するマイクロＲＮＡ足場（例えば、ｍｉＲ－３０足場）の－５ｐアーム又は－３ｐアーム内にアンチセンス配列を組み込んだキメラ分子を指す。ｓｈＲＮＡと比較して、ｓｈｍｉＲＮＡは、一般に、マイクロＲＮＡ由来の配列に基づいて、より長いステム－ループ構造を有し、完全又は実質的な相補性（例えば、ミスマッチ、Ｇ：Ｕゆらぎ）を示す－５ｐ及び－３ｐアームを有する。それらのより長い配列及びプロセシングの必要性に起因して、ｓｈｍｉＲＮＡは、一般に、Ｐｏｌ ＩＩプロモーターから発現される。これらの構築物はまた、ｓｈＲＮＡ系の薬剤と比較して、毒性の減少を示すことが示されている。
複数のｍｉＲＮＡを使用して、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ発現（及びその後のその遺伝子産物ＧｌｕＫ２）をノックダウンし得る。ｍｉＲＮＡは、異なる標的転写産物に対して、又は単一標的転写産物の異なる結合部位に対して相補的であり得る。多重遺伝子又は多重遺伝子転写産物も利用して、標的遺伝子ノックダウンの有効性を増強させ得る。同じｍｉＲＮＡ又は異なるｍｉＲＮＡをコードする多重遺伝子は、単一転写産物において一緒に調節されてもよく、又は単一ベクターカセット中の別個の転写産物として調節されてもよい。本開示のｍｉＲＮＡは、ベクター、例えば、ウイルスベクター（限定されないが、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びレトロトランスポゾン系のベクター系）にパッケージングされ得る。
Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのセンス標的配列に対して相補的（例えば、実質的又は完全に相補的）であるＡＳＯは、一般に、上述の阻害剤（例えば、ｓｉＲＮＡｓ、ｓｈＲＮＡｓ、ｍｉＲＮＡｓ、又はｓｈｍｉＲＮＡ）のうちのいずれかの産生のためにＤＮＡ配列によってコードされる。目的の二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡは、遺伝子カセット（例えば、ＤＮＡの転写がプロモーターによって制御される発現カセット）に組み込まれ得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチド配列
本開示の方法及び組成物によれば、本明細書に開示される阻害性ＲＮＡ剤は、以下に示されるように、表２に開示されるＡＳＯ薬剤（例えば、配列番号１～１００）、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの対応する核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントのうちのいずれか１つ以上を含み得る。ＡＳＯ剤は、以下の表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡの対応する標的配列、又は以下の表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される対応する標的配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントに結合し得る。
上述の配列は、本開示のベクターに組み込むことができるＤＮＡ（すなわち、ｃＤＮＡ）配列として表されるが、これらの配列はまた、細胞内のベクターから合成される対応するＲＮＡ配列として表されてもよい。当業者は、ｃＤＮＡ配列が、ウリジンをチミジンに置換したことを除き、ｍＲＮＡ配列と等価であり、本明細書の同じ目的、すなわち、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの発現を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの生成のために使用することができることを理解するだろう。ＤＮＡベクター（例えば、ＡＡＶ）の場合において、アンチセンス核酸を含有するポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列である。ＲＮＡベクターの場合において、導入遺伝子カセットは、本明細書に記載のアンチセンスＤＮＡ配列のＲＮＡ等価物である。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号１の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号１の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号１の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号１の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号２の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号２の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号２の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号２の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号３の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号３の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号３の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号３の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号４の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号４の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号５の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号５の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号５の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号５の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号６の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号６の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号６の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号６の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号７の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号７の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号７の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号８の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号８の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号８の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号８の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号９の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号９の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号９の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号９の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号１０の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号１０の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号１０の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号１０の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号１１の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号１１の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号１１の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号１１の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号１２の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号１２の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号１２の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号１２の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号１３の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号１３の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号１３の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号１３の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号１４の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号１４の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号１４の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号１４の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号１５の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号１５の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号１５の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号１５の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号１６の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号１６の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号１６の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号１６の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号１７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号１７の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号１７の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号１７の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号１８の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号１８の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号１８の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号１８の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号１９の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号１９の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号１９の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号１９の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号２０の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号２０の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号２０の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号２０の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号２１の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号２１の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号２１の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号２１の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号２２の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号２２の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号２２の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号２２の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号２３の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号２３の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号２３の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号２３の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号２４の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号２４の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号２４の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号２４の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号２５の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号２５の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号２５の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号２５の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号２６の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号２６の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号２６の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号２６の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号２７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号２７の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号２７の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号２７の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号２８の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号２８の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号２８の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号２８の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号２９の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号２９の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号２９の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号２９の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号３０の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号３０の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号３０の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号３０の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号３１の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号３１の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号３１の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号３１の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号３２の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号３２の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号３２の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号３２の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号３３の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号３３の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号３３の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号３３の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号３４の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号３４の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号３４の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号３４の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号３５の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号３５の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号３５の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号３５の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号３６の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号３６の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号３６の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号３６の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号３７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号３７の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号３７の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号３７の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号３８の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号３８の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号３８の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号３８の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号３９の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号３９の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号３９の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号３９の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号４０の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号４０の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号４０の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号４０の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号４１の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号４１の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号４１の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号４１の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号４２の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号４２の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号４２の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号４２の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号４３の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号４３の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号４３の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号４３の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号４４の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号４４の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号４４の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号４４の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号４５の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号４５の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号４５の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号４５の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号４６の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号４６の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号４６の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号４６の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号４７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号４７の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号４７の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号４７の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号４８の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号４８の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号４８の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号４８の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号４９の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号４９の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号４９の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号４９の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号５０の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号５０の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号５０の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号５０の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号５１の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号５１の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号５１の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号５１の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号５２の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号５２の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号５２の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号５２の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号５３の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号５３の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号５３の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号５３の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号５４の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号５４の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号５４の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号５４の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号５５の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号５５の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号５５の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号５５の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号５６の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号５６の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号５６の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号５６の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号５７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号５７の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号５７の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号５７の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号５８の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号５８の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号５８の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号５８の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号５９の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号５９の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号５９の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号５９の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号６０の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号６０の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号６０の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号６０の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号６１の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号６１の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号６１の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号６１の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号６２の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号６２の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号６２の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号６２の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号６３の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号６３の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号６３の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号６３の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号６４の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号６４の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号６４の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号６４の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号６５の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号６５の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号６５の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号６５の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号６６の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号６６の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号６６の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号６６の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号６７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号６７の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号６７の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号６７の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号６８の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号６８の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号６８の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号６８の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号６９の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号６９の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号６９の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号６９の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号７０の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号７０の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号７０の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号７０の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号７１の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号７１の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号７１の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号７１の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号７２の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号７２の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号７２の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号７２の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号７３の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号７３の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号７３の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号７３の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号７４の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号７４の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号７４の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号７４の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号７５の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号７５の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号７５の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号７５の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号７６の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号７６の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号７６の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号７６の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号７７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号７７の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号７７の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号７７の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号７８の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号７８の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号７８の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号７８の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号７９の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号７９の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号７９の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号７９の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号８０の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号８０の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号８０の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号８０の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号８１の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号８１の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号８１の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号８１の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号８２の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号８２の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号８２の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号８２の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号８３の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号８３の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号８３の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号８３の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号８４の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号８４の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号８４の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号８４の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号８５の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号８５の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号８５の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号８５の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号８６の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号８６の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号８６の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号８６の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号８７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号８７の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号８７の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号８７の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号８８の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号８８の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号８８の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号８８の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号８９の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号８９の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号８９の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号８９の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号９０の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号９０の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号９０の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号９０の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号９１の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号９１の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号９１の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号９１の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号９２の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号９２の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号９２の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号９２の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号９３の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号９３の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号９３の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号９３の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号９４の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号９４の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号９４の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号９４の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号９５の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号９５の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号９５の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号９５の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号９６の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号９６の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号９６の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号９６の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号９７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号９７の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号９７の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号９７の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号９８の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号９８の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号９８の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号９８の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号９９の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号９９の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号９９の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号９９の核酸配列を有し得る。
本開示のＡＳＯ配列は、配列番号１００の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。例えば、ＡＳＯは、配列番号１００の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。別の例において、ＡＳＯは、配列番号１００の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有し得る。更なる例において、ＡＳＯは、配列番号１００の核酸配列を有し得る。
ゆらぎ塩基対を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド
本開示は、１つ以上のゆらぎ塩基対を有するＡＳＯ剤を更に特徴とする。４つの主なゆらぎ塩基対は、グアニン－ウラシル（Ｇ－Ｕ）、ヒポキサンチン－ウラシル（Ｉ－Ｕ）、ヒポキサンチン－アデニン（Ｉ－Ａ）、及びヒポキサンチン－シトシン（Ｉ－Ｃ）であり、ヒポキサンチンは、ヌクレオシドイノシンを表す。Ｇ－Ｕゆらぎ塩基対は、Ｇ－Ｃ、Ａ－Ｔ及びＡ－Ｕと同様の熱力学的安定性を示すことが示されている（Ｓａｘｅｎａ ｅｔ ａｌ，２００３，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７８（４５）：４４３１２－９）。
したがって、本開示は、配列番号１１５又は配列番号１１６の標的領域の補体に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するヌクレオチド配列を有するＡＳＯ剤を提供する（例えば、ＡＳＯは、Ｇｒｉｋ２遺伝子配列のアンチセンス鎖に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し得る）。特に、本開示のＡＳＯ剤は、対応するアラインメントされたヒトＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ転写産物（配列番号１１５又は配列番号１１６）に対して相補的ではない１、２、又は３個のヌクレオチドを有し得る。そのように、本開示のＡＳＯ剤は、配列番号１１６又は配列番号１１５の標的領域の補体に対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれより多く）、少なくとも８６％（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれより多く）、少なくとも８７％（例えば、少なくとも８７％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれより多く）、少なくとも８８％（例えば、少なくとも８８％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれより多く）、少なくとも８９％（例えば、少なくとも８９％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれより多く）、又は少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれより多く）同一であるヌクレオチド配列を有し得る。
アラインメントされたＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ配列の相補的な配列に対して１００％同一ではないヌクレオチドは、ゆらぎヌクレオチドであり得る。
本明細書の表２に示されるように、５’末端において小文字「ｕ」を有するＡＳＯ剤は、表２に列挙される他のヒトＡＳＯ剤と比較して、ヒトＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡの相補的な配列に対して同一である１つ少ないヌクレオチドを有する。５’末端に「ｕ」を含むこと（Ｇ：Ｕゆらぎ塩基対が得られる）は、ＲＩＳＣローディングを改善するために実行された（ｓｉＳＰＯＴＲソフトウエア、Ｂｏｕｄｒｅａｕ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ ２０１３， ４１（１）：ｅ９）。
Ｇｒｉｋ２転写産物上の特定の領域に対して設計されたアンチセンスＲＮＡによって媒介されるオフターゲット効果の可能性は、任意の数の公的に利用可能なアルゴリズムを使用して測定され得る。例えば、オンラインツールｓｉＳＰＯＴＲ（ワールドワイドウェブ．ｓｉｓｐｏｔｒ．ｉｃｔｓ．ｕｉｏｗａ．ｅｄｕ／ｓｉｓｐｏｔｒ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ＿で入手可能な「ｓｉＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ－ｏｆ－Ｏｆｆ－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ」を使用することができる）。
特定のＧｒｉｋ２アンチセンス配列は、（オフターゲット予測因子プログラムｓｉＳＰＯＴＲに基づいて）「特異的な」ｓｉＳＰＯＴＲガイドであると決定され、配列番号１１５又は配列番号１１６（表３を参照されたい）を含む転写産物の配列特異的な阻害を維持しつつ、ヒトゲノムにおけるオフターゲット配列特異的遺伝子抑制を回避するか、又は減少させると予測されたアンチセンスＲＮＡである。
特定のＧｒｉｋ２アンチセンスＲＮＡは、（オフターゲット予測因子プログラムｓｉＳＰＯＴＲに基づいて）「共有される」ｓｉＳＰＯＴＲガイドであると決定され、ヒトゲノムにおけるオフターゲット配列特異的遺伝子抑制を回避するか、又は減少させ、ヒト、サル及びマウスＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ配列間の有意な共有された相同性を有すると予測されたアンチセンスＲＮＡであり、配列番号１１５、配列番号１１６（が、配列番号１１７～１２５も）を含む転写産物の配列特異的な阻害を維持すると予想される。
本明細書に開示されるＡＳＯ剤は、ＧｌｕＫ２タンパク質（例えば、配列番号１０２～１１４のうちのいずれか１つを含むＧｌｕＫ２タンパク質、又は配列番号１０２の少なくともアミノ酸１～５０９を含むＧｌｕＫ２タンパク質）をコードするｍＲＮＡを標的化する。ＧｌｕＫ２タンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号１０２～１１４のうちのいずれか１つの配列を有するポリペプチドに対して、１つ以上のアミノ酸置換、例えば、１つ以上の保存的アミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上のアミノ酸置換、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上の保存的アミノ酸置換）を含有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得る。
本明細書に開示されるＧｒｉｋ２ ＡＳＯ剤は、例えば、バイオインフォマティクスツールを使用することによって、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの配列を開始点として使用することによって設計され得る。Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ番号２８９８中に見出され得る。別の例において、配列番号１０２をコードするポリヌクレオチド配列、配列番号１０２の連続アミノ酸１～５０９をコードするポリヌクレオチド配列、又は配列番号１０２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ１３００２－１）、配列番号１０３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ１３００２－２）、配列番号１０４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ１３００２－３）、配列番号１０５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ１３００２－４）、配列番号１０６（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ１３００２－５）、配列番号１０７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ１３００２－６）、配列番号１０８（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ１３００２－７）、配列番号１０９（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１１０４７３８．２）、配列番号１１０（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０３４４７９．３）、配列番号１１１（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０３４４７９．３）、配列番号１１２（ＮＣＢＩアクセッション番号ＸＰ＿０１４９９２４８１．１）、配列番号１１３（ＮＣＢＩアクセッション番号ＸＰ＿０１４９９２４８３．１）、及び配列番号１１４（ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０６２１８２．１）のうちのいずれか１つのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を、ＧｌｕＫ２タンパク質をコードするｍＲＮＡを標的化する核酸配列を設計するための基礎として使用することができる。ＧｌｕＫ２受容体をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１１５～１２５のうちのいずれか１つから選択され得る。
ＧｌｕＫ２ポリペプチドは、配列番号１０２のアミノ酸配列を有していてもよく、又は配列番号１０２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであってもよく、以下に示される（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ１３００２－１、ＧＲＩＫ２＿ＨＵＭＡＮグルタミン酸受容体イオンチャネル型、カイニン酸型２）。
ＭＫＩＩＦＰＩＬＳＮＰＶＦＲＲＴＶＫＬＬＬＣＬＬＷＩＧＹＳＱＧＴＴＨＶＬＲＦＧＧＩＦＥＹＶＥＳＧＰＭＧＡＥＥＬＡＦＲＦＡ
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（配列番号１０２）
ＧｌｕＫ２ポリペプチドは、配列番号１０３のアミノ酸配列を有していてもよく、又は配列番号１０３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであってもよく、以下に示される（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ１３００２－２、グルタミン酸受容体イオンチャネル型のＧＲＩＫ２＿ＨＵＭＡＮアイソフォーム２、カイニン酸型２）。
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（配列番号１０３）
ＧｌｕＫ２ポリペプチドは、配列番号１０４のアミノ酸配列を有していてもよく、又は配列番号１０４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであってもよく、以下に示される（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ１３００２－３、グルタミン酸受容体イオンチャネル型のＧＲＩＫ２＿ＨＵＭＡＮアイソフォーム３、カイニン酸型２）。
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（配列番号１０４）
ＧｌｕＫ２ポリペプチドは、配列番号１０５のアミノ酸配列を有していてもよく、又は配列番号１０５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであってもよく、以下に示される（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ１３００２－４、グルタミン酸受容体イオンチャネル型のＧＲＩＫ２＿ＨＵＭＡＮアイソフォーム４、カイニン酸型２）。
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（配列番号１０５）
ＧｌｕＫ２ポリペプチドは、配列番号１０６のアミノ酸配列を有していてもよく、又は配列番号１０６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであってもよく、以下に示される（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ１３００２－５、グルタミン酸受容体イオンチャネル型のＧＲＩＫ２＿ＨＵＭＡＮアイソフォーム５、カイニン酸型２）。
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（配列番号１０６）
ＧｌｕＫ２ポリペプチドは、配列番号１０７のアミノ酸配列を有していてもよく、又は配列番号１０７のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであってもよく、以下に示される（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ１３００２－６、グルタミン酸受容体イオンチャネル型のＧＲＩＫ２＿ＨＵＭＡＮアイソフォーム６、カイニン酸型２）。
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（配列番号１０７）
ＧｌｕＫ２ポリペプチドは、配列番号１０８のアミノ酸配列を有していてもよく、又は配列番号１０８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであってもよく、以下に示される（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ１３００２－７、グルタミン酸受容体イオンチャネル型のＧＲＩＫ２＿ＨＵＭＡＮアイソフォーム７、カイニン酸型２）。
ＭＫＩＩＦＰＩＬＳＮＰＶＦＲＲＴＶＫＬＬＬＣＬＬＷＩＧＹＳＱＧＴＴＨＶＬＲＦＧＧＩＦＥＹＶＥＳＧＰＭＧＡＥＥＬＡＦＲＦＡ
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（配列番号１０８）
ＧｌｕＫ２ポリペプチドは、配列番号１０９のアミノ酸配列を有していてもよく、又は配列番号１０９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであってもよく、以下に示される（ＮＰ＿００１１０４７３８．２、グルタミン酸受容体イオンチャネル型のＧＲＩＫ２＿ＭＯＵＳＥアイソフォーム１前駆体、カイニン酸型２）。
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（配列番号１０９）
ＧｌｕＫ２ポリペプチドは、配列番号１１０のアミノ酸配列を有していてもよく、又は配列番号１１０のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであってもよく、以下に示される（ＮＰ＿０３４４７９．３、グルタミン酸受容体イオンチャネル型のＧＲＩＫ２＿ＭＯＵＳＥアイソフォーム２前駆体、カイニン酸型２）。
ＭＫＩＩＳＰＶＬＳＮＬＶＦＳＲＳＩＫＶＬＬＣＬＬＷＩＧＹＳＱＧＴＴＨＶＬＲＦＧＧＩＦＥＹＶＥＳＧＰＭＧＡＥＥＬＡＦＲＦＡＶＮＴＩＮＲＮＲＴＬ
ＬＰＮＴＴＬＴＹＤＴＱＫＩＮＬＹＤＳＦＥＡＳＫＫＡＣＤＱＬＳＬＧＶＡＡＩＦＧＰＳＨＳＳＳＡＮＡＶＱＳＩＣＮＡＬＧＶＰＨＩＱＴＲＷＫＨＱＶＳＤＮＫＤＳＦＹＶＳＬＹＰＤＦＳＳＬＳＲＡＩＬＤＬＶＱＦＦＫＷＫＴＶＴＶＶＹＤＤＳＴＧＬＩＲＬＱＥＬＩＫＡＰＳＲＹＮＬＲＬＫＩＲＱＬＰＡＤＴＫＤＡＫＰＬＬＫＥＭＫＲＧＫＥＦＨＶＩＦＤＣＳＨＥＭＡＡＧＩＬＫＱＡＬＡＭＧＭＭＴＥＹＹＨＹＩＦＴＴＬＤＬＦＡＬＤＶＥＰＹＲＹＳＧＶＮＭＴＧＦＲＩＬＮＴＥＮＴＱＶＳＳＩＩＥＫＷＳＭＥＲＬＱＡＰＰＫＰＤＳＧＬＬＤＧＦＭＴＴＤＡＡＬＭＹＤＡＶＨＶＶＳＶＡＶＱＱＦＰＱＭＴＶＳＳＬＱＣＮＲＨＫＰＷＲＦＧＴＲＦＭＳＬＩＫＥＡＨＷＥＧＬＴＧＲＩＴＦＮＫＴＮＧＬＲＴＤＦＤＬＤＶＩＳＬＫＥＥＧＬＥＫＩＧＴＷＤＰＳＳＧＬＮＭＴＥＳＱＫＧＫＰＡＮＩＴＤＳＬＳＮＲＳＬＩＶＴＴＩＬＥＥＰＹＶＬＦＫＫＳＤＫＰＬＹＧＮＤＲＦＥＧＹＣＩＤＬＬＲＥＬＳＴＩＬＧＦＴＹＥＩＲＬＶＥＤＧＫＹＧＡＱＤＤＶＮＧＱＷＮＧＭＶＲＥＬＩＤＨＫＡＤＬＡＶＡＰＬＡＩＴＹＶＲＥＫＶＩＤＦＳＫＰＦＭＴＬＧＩＳＩＬＹＲＫＰＮＧＴＮＰＧＶＦＳＦＬＮＰＬＳＰＤＩＷＭＹＩＬＬＡＹＬＧＶＳＣＶＬＦＶＩＡＲＦＳＰＹＥＷＹＮＰＨＰＣＮＰＤＳＤＶＶＥＮＮＦＴＬＬＮＳＦＷＦＧＶＧＡＬＭＱＱＧＳＥＬＭＰＫＡＬＳＴＲＩＶＧＧＩＷＷＦＦＴＬＩＩＩＳＳＹＴＡＮＬＡＡＦＬＴＶＥＲＭＥＳＰＩＤＳＡＤＤＬＡＫＱＴＫＩＥＹＧＡＶＥＤＧＡＴＭＴＦＦＫＫＳＫＩＳＴＹＤＫＭＷＡＦＭＳＳＲＲＱＳＶＬＶＫＳＮＥＥＧＩＱＲＶＬＴＳＤＹＡＦＬＭＥＳＴＴＩＥＦＶＴＱＲＮＣＮＬＴＱＩＧＧＬＩＤＳＫＧＹＧＶＧＴＰＭＧＳＰＹＲＤＫＩＴＩＡＩＬＱＬＱＥＥＧＫＬＨＭＭＫＥＫＷＷＲＧＮＧＣＰＥＥＥＳＫＥＡＳＡＬＧＶＱＮＩＧＧＩＦＩＶＬＡＡＧＬＶＬＳＶＦＶＡＶＧＥＦＬＹＫＳＫＫＮＡＱＬＥＫＥＳＳＩＷＬＶＰＰＹＨＰＤＴＶ
（配列番号１１０）
ＧｌｕＫ２ポリペプチドは、配列番号１１１のアミノ酸配列を有していてもよく、又は配列番号１１１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであってもよく、以下に示される（ＮＰ＿００１３４５７９５．２、グルタミン酸受容体イオンチャネル型のＧＲＩＫ２＿ＭＯＵＳＥアイソフォーム１前駆体、カイニン酸型２）。
ＭＫＩＩＳＰＶＬＳＮＬＶＦＳＲＳＩＫＶＬＬＣＬＬＷＩＧＹＳＱＧＴＴＨＶＬＲＦＧＧＩＦＥＹＶＥＳＧＰＭＧＡＥＥＬＡＦＲＦＡＶＮＴＩＮＲＮＲＴＬ
ＬＰＮＴＴＬＴＹＤＴＱＫＩＮＬＹＤＳＦＥＡＳＫＫＡＣＤＱＬＳＬＧＶＡＡＩＦＧＰＳＨＳＳＳＡＮＡＶＱＳＩＣＮＡＬＧＶＰＨＩＱＴＲＷＫＨＱＶＳＤＮＫＤＳＦＹＶＳＬＹＰＤＦＳＳＬＳＲＡＩＬＤＬＶＱＦＦＫＷＫＴＶＴＶＶＹＤＤＳＴＧＬＩＲＬＱＥＬＩＫＡＰＳＲＹＮＬＲＬＫＩＲＱＬＰＡＤＴＫＤＡＫＰＬＬＫＥＭＫＲＧＫＥＦＨＶＩＦＤＣＳＨＥＭＡＡＧＩＬＫＱＡＬＡＭＧＭＭＴＥＹＹＨＹＩＦＴＴＬＤＬＦＡＬＤＶＥＰＹＲＹＳＧＶＮＭＴＧＦＲＩＬＮＴＥＮＴＱＶＳＳＩＩＥＫＷＳＭＥＲＬＱＡＰＰＫＰＤＳＧＬＬＤＧＦＭＴＴＤＡＡＬＭＹＤＡＶＨＶＶＳＶＡＶＱＱＦＰＱＭＴＶＳＳＬＱＣＮＲＨＫＰＷＲＦＧＴＲＦＭＳＬＩＫＥＡＨＷＥＧＬＴＧＲＩＴＦＮＫＴＮＧＬＲＴＤＦＤＬＤＶＩＳＬＫＥＥＧＬＥＫＩＧＴＷＤＰＳＳＧＬＮＭＴＥＳＱＫＧＫＰＡＮＩＴＤＳＬＳＮＲＳＬＩＶＴＴＩＬＥＥＰＹＶＬＦＫＫＳＤＫＰＬＹＧＮＤＲＦＥＧＹＣＩＤＬＬＲＥＬＳＴＩＬＧＦＴＹＥＩＲＬＶＥＤＧＫＹＧＡＱＤＤＶＮＧＱＷＮＧＭＶＲＥＬＩＤＨＫＡＤＬＡＶＡＰＬＡＩＴＹＶＲＥＫＶＩＤＦＳＫＰＦＭＴＬＧＩＳＩＬＹＲＫＰＮＧＴＮＰＧＶＦＳＦＬＮＰＬＳＰＤＩＷＭＹＩＬＬＡＹＬＧＶＳＣＶＬＦＶＩＡＲＦＳＰＹＥＷＹＮＰＨＰＣＮＰＤＳＤＶＶＥＮＮＦＴＬＬＮＳＦＷＦＧＶＧＡＬＭＱＱＧＳＥＬＭＰＫＡＬＳＴＲＩＶＧＧＩＷＷＦＦＴＬＩＩＩＳＳＹＴＡＮＬＡＡＦＬＴＶＥＲＭＥＳＰＩＤＳＡＤＤＬＡＫＱＴＫＩＥＹＧＡＶＥＤＧＡＴＭＴＦＦＫＫＳＫＩＳＴＹＤＫＭＷＡＦＭＳＳＲＲＱＳＶＬＶＫＳＮＥＥＧＩＱＲＶＬＴＳＤＹＡＦＬＭＥＳＴＴＩＥＦＶＴＱＲＮＣＮＬＴＱＩＧＧＬＩＤＳＫＧＹＧＶＧＴＰＭＧＳＰＹＲＤＫＩＴＩＡＩＬＱＬＱＥＥＧＫＬＨＭＭＫＥＫＷＷＲＧＮＧＣＰＥＥＥＳＫＥＡＳＡＬＧＶＱＮＩＧＧＩＦＩＶＬＡＡＧＬＶＬＳＶＦＶＡＶＧＥＦＬＹＫＳＫＫＮＡＱＬＥＫＲＳＦＣＳＡＭＶＥＥＬＲＭＳＬＫＣＱＲＲＬＫＨＫＰＱＡＰＶＩＶＫＴＥＥＶＩＮＭＨＴＦＮＤＲＲＬＰＧＫＥＴＭＡ
（配列番号１１１）
ＧｌｕＫ２ポリペプチドは、配列番号１１２のアミノ酸配列を有していてもよく、又は配列番号１１２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであってもよく、以下に示される（ＸＰ＿０１４９９２４８１．１、ＧＲＩＫ２＿ＲＨＥＳＵＳ ＭＡＣＡＱＵＥアイソフォームＸ１、グルタミン酸受容体イオンチャネル型、カイニン酸型２）。
ＭＫＩＩＦＰＩＬＳＮＰＶＦＲＲＴＶＫＬＬＬＣＬＬＷＩＧＹＳＱＧＴＴＨＶＬＲＦＧＧＩＦＥＹＶＥＳＧＰＭＧＡＥＥＬＡＦＲＦＡＶＮＴＩＮＲＮＲＴＬ
ＬＰＮＴＴＬＴＹＤＴＱＫＩＮＬＹＤＳＦＥＡＳＫＫＡＣＤＱＬＳＬＧＶＡＡＩＦＧＰＳＨＳＳＳＡＮＡＶＱＳＩＣＮＡＬＧＶＰＨＩＱＴＲＷＫＨＱＶＳＤＮＫＤＳＦＹＶＳＬＹＰＤＦＳＳＬＳＲＡＩＬＤＬＶＱＦＦＫＷＫＴＶＴＶＶＹＤＤＳＴＧＬＩＲＬＱＥＬＩＫＡＰＳＲＹＮＬＲＬＫＩＲＱＬＰＡＤＴＫＤＡＫＰＬＬＫＥＭＫＲＧＫＥＦＨＶＩＦＤＣＳＨＥＭＡＡＧＩＬＫＱＡＬＡＭＧＭＭＴＥＹＹＨＹＩＦＴＴＬＤＬＦＡＬＤＶＥＰＹＲＹＳＧＶＮＭＴＧＦＲＩＬＮＴＥＮＴＱＶＳＳＩＩＥＫＷＳＭＥＲＬＱＡＰＰＫＰＤＳＧＬＬＤＧＦＭＴＴＤＡＡＬＭＹＤＡＶＨＶＶＳＶＡＶＱＱＦＰＱＭＴＶＳＳＬＱＣＮＲＨＫＰＷＲＦＧＴＲＦＭＳＬＩＫＥＡＨＷＥＧＬＴＧＲＩＴＦＮＫＴＮＧＬＲＴＤＦＤＬＤＶＩＳＬＫＥＥＧＬＥＫＩＧＴＷＤＰＡＳＧＬＮＭＴＥＳＱＫＧＫＰＡＮＩＴＤＳＬＳＮＲＳＬＩＶＴＴＩＬＥＥＰＹＶＬＦＫＫＳＤＫＰＬＹＧＮＤＲＦＥＧＹＣＩＤＬＬＲＥＬＳＴＩＬＧＦＴＹＥＩＲＬＶＥＤＧＫＹＧＡＱＤＤＡＮＧＱＷＮＧＭＶＲＥＬＩＤＨＫＡＤＬＡＶＡＰＬＡＩＴＹＶＲＥＫＶＩＤＦＳＫＰＦＭＴＬＧＩＳＩＬＹＲＫＰＮＧＴＮＰＧＶＦＳＦＬＮＰＬＳＰＤＩＷＭＹＩＬＬＡＹＬＧＶＳＣＶＬＦＶＩＡＲＦＳＰＹＥＷＹＮＰＨＰＣＮＰＤＳＤＶＶＥＮＮＦＴＬＬＮＳＦＷＦＧＶＧＡＬＭＱＱＧＳＥＬＭＰＫＡＬＳＴＲＩＶＧＧＩＷＷＦＦＴＬＩＩＩＳＳＹＴＡＮＬＡＡＦＬＴＶＥＲＭＥＳＰＩＤＳＡＤＤＬＡＫＱＴＫＩＥＹＧＡＶＥＤＧＡＴＭＴＦＦＫＫＳＫＩＳＴＹＤＫＭＷＡＦＭＳＳＲＲＱＳＶＬＶＫＳＮＥＥＧＩＱＲＶＬＴＳＤＹＡＦＬＭＥＳＴＴＩＥＦＶＴＱＲＮＣＮＬＴＱＩＧＧＬＩＤＳＫＧＹＧＶＧＴＰＭＧＳＰＹＲＤＫＩＴＩＡＩＬＱＬＱＥＥＧＫＬＨＭＭＫＥＫＷＷＲＧＮＧＣＰＥＥＥＳＫＥＡＳＡＬＧＶＱＮＩＧＧＩＦＩＶＬＡＡＧＬＶＬＳＶＦＶＡＶＧＥＦＬＹＫＳＫＫＮＡＱＬＥＫＲＳＦＣＳＡＭＶＥＥＬＲＭＳＬＫＣＱＲＲＬＫＨＫＰＱＡＰＶＩＶＫＴＥＥＶＩＮＭＨＴＦＮＤＲＲＬＰＧＫＥＴＭＡ
（配列番号１１２）
ＧｌｕＫ２ポリペプチドは、配列番号１１３のアミノ酸配列を有していてもよく、又は配列番号１１３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであってもよく、以下に示される（ＸＰ＿０１４９９２４８３．１、ＧＲＩＫ２＿ＲＨＥＳＵＳ ＭＡＣＡＱＵＥアイソフォームＸ１、グルタミン酸受容体イオンチャネル型、カイニン酸型２）。
ＭＫＩＩＦＰＩＬＳＮＰＶＦＲＲＴＶＫＬＬＬＣＬＬＷＩＧＹＳＱＧＴＴＨＶＬＲＦＧＧＩＦＥＹＶＥＳＧＰＭＧＡＥＥＬＡＦＲＦＡＶＮＴＩＮＲＮＲＴＬ
ＬＰＮＴＴＬＴＹＤＴＱＫＩＮＬＹＤＳＦＥＡＳＫＫＡＣＤＱＬＳＬＧＶＡＡＩＦＧＰＳＨＳＳＳＡＮＡＶＱＳＩＣＮＡＬＧＶＰＨＩＱＴＲＷＫＨＱＶＳＤＮＫＤＳＦＹＶＳＬＹＰＤＦＳＳＬＳＲＡＩＬＤＬＶＱＦＦＫＷＫＴＶＴＶＶＹＤＤＳＴＧＬＩＲＬＱＥＬＩＫＡＰＳＲＹＮＬＲＬＫＩＲＱＬＰＡＤＴＫＤＡＫＰＬＬＫＥＭＫＲＧＫＥＦＨＶＩＦＤＣＳＨＥＭＡＡＧＩＬＫＱＡＬＡＭＧＭＭＴＥＹＹＨＹＩＦＴＴＬＤＬＦＡＬＤＶＥＰＹＲＹＳＧＶＮＭＴＧＦＲＩＬＮＴＥＮＴＱＶＳＳＩＩＥＫＷＳＭＥＲＬＱＡＰＰＫＰＤＳＧＬＬＤＧＦＭＴＴＤＡＡＬＭＹＤＡＶＨＶＶＳＶＡＶＱＱＦＰＱＭＴＶＳＳＬＱＣＮＲＨＫＰＷＲＦＧＴＲＦＭＳＬＩＫＥＡＨＷＥＧＬＴＧＲＩＴＦＮＫＴＮＧＬＲＴＤＦＤＬＤＶＩＳＬＫＥＥＧＬＥＫＩＧＴＷＤＰＡＳＧＬＮＭＴＥＳＱＫＧＫＰＡＮＩＴＤＳＬＳＮＲＳＬＩＶＴＴＩＬＥＥＰＹＶＬＦＫＫＳＤＫＰＬＹＧＮＤＲＦＥＧＹＣＩＤＬＬＲＥＬＳＴＩＬＧＦＴＹＥＩＲＬＶＥＤＧＫＹＧＡＱＤＤＡＮＧＱＷＮＧＭＶＲＥＬＩＤＨＫＡＤＬＡＶＡＰＬＡＩＴＹＶＲＥＫＶＩＤＦＳＫＰＦＭＴＬＧＩＳＩＬＹＲＫＰＮＧＴＮＰＧＶＦＳＦＬＮＰＬＳＰＤＩＷＭＹＩＬＬＡＹＬＧＶＳＣＶＬＦＶＩＡＲＦＳＰＹＥＷＹＮＰＨＰＣＮＰＤＳＤＶＶＥＮＮＦＴＬＬＮＳＦＷＦＧＶＧＡＬＭＱＱＧＳＥＬＭＰＫＡＬＳＴＲＩＶＧＧＩＷＷＦＦＴＬＩＩＩＳＳＹＴＡＮＬＡＡＦＬＴＶＥＲＭＥＳＰＩＤＳＡＤＤＬＡＫＱＴＫＩＥＹＧＡＶＥＤＧＡＴＭＴＦＦＫＫＳＫＩＳＴＹＤＫＭＷＡＦＭＳＳＲＲＱＳＶＬＶＫＳＮＥＥＧＩＱＲＶＬＴＳＤＹＡＦＬＭＥＳＴＴＩＥＦＶＴＱＲＮＣＮＬＴＱＩＧＧＬＩＤＳＫＧＹＧＶＧＴＰＭＧＳＰＹＲＤＫＩＴＩＡＩＬＱＬＱＥＥＧＫＬＨＭＭＫＥＫＷＷＲＧＮＧＣＰＥＥＥＳＫＥＡＳＡＬＧＶＱＮＩＧＧＩＦＩＶＬＡＡＧＬＶＬＳＶＦＶＡＶＧＥＦＬＹＫＳＫＫＮＡＱＬＥＫＲＳＦＣＳＡＭＶＥＥＬＲＭＳＬＫＣＱＲＲＬＫＨＫＰＱＡＰＶＩＶＫＴＥＥＶＩＮＭＨＴＦＮＤＲＲＬＰＧＫＥＴＭＡ
（配列番号１１３）
ＧｌｕＫ２ポリペプチドは、配列番号１１４のアミノ酸配列を有していてもよく、又は配列番号１１４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであってもよく、以下に示される（ＮＰ＿０６２１８２．１、グルタミン酸受容体イオンチャネル型のＧＲＩＫ２＿ＲＡＴ前駆体、カイニン酸型２）。
ＭＫＩＩＳＰＶＬＳＮＬＶＦＳＲＳＩＫＶＬＬＣＬＬＷＩＧＹＳＱＧＴＴＨＶＬＲＦＧＧＩＦＥＹＶＥＳＧＰＭＧＡＥＥＬＡＦＲＦＡＶＮＴＩＮＲＮＲＴＬ
ＬＰＮＴＴＬＴＹＤＴＱＫＩＮＬＹＤＳＦＥＡＳＫＫＡＣＤＱＬＳＬＧＶＡＡＩＦＧＰＳＨＳＳＳＡＮＡＶＱＳＩＣＮＡＬＧＶＰＨＩＱＴＲＷＫＨＱＶＳＤＮＫＤＳＦＹＶＳＬＹＰＤＦＳＳＬＳＲＡＩＬＤＬＶＱＦＦＫＷＫＴＶＴＶＶＹＤＤＳＴＧＬＩＲＬＱＥＬＩＫＡＰＳＲＹＮＬＲＬＫＩＲＱＬＰＡＤＴＫＤＡＫＰＬＬＫＥＭＫＲＧＫＥＦＨＶＩＦＤＣＳＨＥＭＡＡＧＩＬＫＱＡＬＡＭＧＭＭＴＥＹＹＨＹＩＦＴＴＬＤＬＦＡＬＤＶＥＰＹＲＹＳＧＶＮＭＴＧＦＲＩＬＮＴＥＮＴＱＶＳＳＩＩＥＫＷＳＭＥＲＬＱＡＰＰＫＰＤＳＧＬＬＤＧＦＭＴＴＤＡＡＬＭＹＤＡＶＨＶＶＳＶＡＶＱＱＦＰＱＭＴＶＳＳＬＱＣＮＲＨＫＰＷＲＦＧＴＲＦＭＳＬＩＫＥＡＨＷＥＧＬＴＧＲＩＴＦＮＫＴＮＧＬＲＴＤＦＤＬＤＶＩＳＬＫＥＥＧＬＥＫＩＧＴＷＤＰＡＳＧＬＮＭＴＥＳＱＫＧＫＰＡＮＩＴＤＳＬＳＮＲＳＬＩＶＴＴＩＬＥＥＰＹＶＬＦＫＫＳＤＫＰＬＹＧＮＤＲＦＥＧＹＣＩＤＬＬＲＥＬＳＴＩＬＧＦＴＹＥＩＲＬＶＥＤＧＫＹＧＡＱＤＤＶＮＧＱＷＮＧＭＶＲＥＬＩＤＨＫＡＤＬＡＶＡＰＬＡＩＴＹＶＲＥＫＶＩＤＦＳＫＰＦＭＴＬＧＩＳＩＬＹＲＫＰＮＧＴＮＰＧＶＦＳＦＬＮＰＬＳＰＤＩＷＭＹＶＬＬＡＣＬＧＶＳＣＶＬＦＶＩＡＲＦＳＰＹＥＷＹＮＰＨＰＣＮＰＤＳＤＶＶＥＮＮＦＴＬＬＮＳＦＷＦＧＶＧＡＬＭＲＱＧＳＥＬＭＰＫＡＬＳＴＲＩＶＧＧＩＷＷＦＦＴＬＩＩＩＳＳＹＴＡＮＬＡＡＦＬＴＶＥＲＭＥＳＰＩＤＳＡＤＤＬＡＫＱＴＫＩＥＹＧＡＶＥＤＧＡＴＭＴＦＦＫＫＳＫＩＳＴＹＤＫＭＷＡＦＭＳＳＲＲＱＳＶＬＶＫＳＮＥＥＧＩＱＲＶＬＴＳＤＹＡＦＬＭＥＳＴＴＩＥＦＶＴＱＲＮＣＮＬＴＱＩＧＧＬＩＤＳＫＧＹＧＶＧＴＰＭＧＳＰＹＲＤＫＩＴＩＡＩＬＱＬＱＥＥＧＫＬＨＭＭＫＥＫＷＷＲＧＮＧＣＰＥＥＥＳＫＥＡＳＡＬＧＶＱＮＩＧＧＩＦＩＶＬＡＡＧＬＶＬＳＶＦＶＡＶＧＥＦＬＹＫＳＫＫＮＡＱＬＥＫＲＳＦＣＳＡＭＶＥＥＬＲＭＳＬＫＣＱＲＲＬＫＨＫＰＱＡＰＶＩＶＫＴＥＥＶＩＮＭＨＴＦＮＤＲＲＬＰＧＫＥＴＭＡ
（配列番号１１４）
Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、表４に示されるように、５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含有し、配列番号１１５の核酸配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、又は配列番号１１５の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであってもよい（ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿０２１９５６．１：４５９２ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓグルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（ＧＲＩＫ２）、転写産物バリアント１、ｍＲＮＡ）。
Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、表４に示されるように、配列番号１１６の核酸配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、又は配列番号１１６の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであってもよい（ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿０２１９５６．４：２９４－３０２０ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓグルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（ＧＲＩＫ２）、転写産物バリアント１、ｍＲＮＡ）。
これに追加して、又は代替的に、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、表４に示されるように、配列番号１１７の核酸配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、又は配列番号１１７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであってもよい（ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿１７５７６８．３：２９４－２９０３ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓグルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（ＧＲＩＫ２）、転写産物バリアント２、ｍＲＮＡ）。
これに追加して、又は代替的に、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、表４に示されるように、配列番号１１８の核酸配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、又は配列番号１１８の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであってもよい（ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１１６６２４７．１：２９４－２９７２ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓグルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（ＧＲＩＫ２）、転写産物バリアント３、ｍＲＮＡ）。
これに追加して、又は代替的に、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、以下に示されるように、配列番号１１９の核酸配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、又は配列番号１１９の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであってもよい（ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１１１１２６８．２ Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓグルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（ＧＲＩＫ２）、転写産物バリアント４、ｍＲＮＡ）。
これに追加して、又は代替的に、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、表４に示されるように、配列番号１２０の核酸配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、又は配列番号１２０の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであってもよい（ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿０１０３４９．４ Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓグルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（ＧＲＩＫ２）、転写産物バリアント５、ｍＲＮＡ）。
これに追加して、又は代替的に、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、表４に示されるように、配列番号１２１の核酸配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、又は配列番号１２１の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであってもよい（ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿００１３５８８６６ Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓグルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（ＧＲＩＫ２）、転写産物バリアント６、ｍＲＮＡ）。
これに追加して、又は代替的に、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、表４に示されるように、配列番号１２２の核酸配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、又は配列番号１２２の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであってもよい（ＲｅｆＳｅｑ ＸＭ＿０１５１３６９９５．２ Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａグルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（ＧＲＩＫ２）、転写産物バリアント７、ｍＲＮＡ）。
これに追加して、又は代替的に、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、表４に示されるように、配列番号１２３の核酸配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、又は配列番号１２３の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであってもよい（ＲｅｆＳｅｑ ＸＭ＿０１５１３６９９７．２ Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａグルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（ＧＲＩＫ２）、転写産物バリアントＸ１、ｍＲＮＡ）。
これに追加して、又は代替的に、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、表４に示されるように、配列番号１２４の核酸配列を有するポリヌクレオチドであってもよく、又は配列番号１２４の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであってもよい（ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿０１９３０９．２ Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓグルタミン酸イオンチャネル型受容体カイニン酸型サブユニット２（ＧＲＩＫ２）、ｍＲＮＡ）。
これに追加して、又は代替的に、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、表４に示されるように、成熟ＧｌｕＫ２ペプチドコード配列に対応し、配列番号１２５の核酸配列を有するポリヌクレオチド、又は配列番号１２５の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントを含む。
開示される方法及び組成物によれば、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、表４に示されるように、５’ＵＴＲ、例えば、配列番号１２６の核酸配列を有するポリヌクレオチド、又は配列番号１２６の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントによってコードされる５’ＵＴＲを含み得る。
Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡはまた、表４に示されるように、３’ＵＴＲ、例えば、配列番号１２７の核酸配列を有するポリヌクレオチド、又は配列番号１２７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントによってコードされる３’ＵＴＲを含み得る。
これに加えて、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡは、表４に示されるように、Ｇｒｉｋ２シグナルペプチド配列、例えば、配列番号１２８の核酸配列、又は配列番号１２８の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントによってコードされるシグナルペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含み得る。
Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ標的領域
本開示のＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域（例えば、本明細書で特定される１つ以上の領域）、例えば、翻訳開始部位（ＡＵＧコドン）、コード領域中の配列（例えば、本明細書に記載されるエクソン１～１６のうちの１つ以上）、又はＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ若しくは３’ＵＴＲを有する領域を標的化し（例えば、特異的にハイブリダイズし）得る。これらの領域を標的化することによって、本開示のＡＳＯ剤は、限定されないが、タンパク質翻訳のための部位へのｍＲＮＡの移行（例えば、核から細胞質への移行）、ＧｌｕＫ２タンパク質へのｍＲＮＡの移行、ｍＲＮＡのスプライシング若しくは成熟、及び／又はＲＮＡによって担われ得る独立した触媒活性を含む、ｍＲＮＡの正常な生物学的プロセシングと干渉し得る。かかるＲＮＡ機能との干渉の全体的な効果は、Ｇｌｕｋ２タンパク質発現との干渉を引き起こし、それによって、細胞（例えば、ニューロン又はアストログリア細胞）においてＧｌｕＫ２発現を減少させるか、又は除外する。
Ｇｒｉｋ２標的配列は、アンチセンスＲＮＡによる阻害又はノックダウンに修正可能であるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ配列の一部又は領域（例えば、センス標的配列）である。核酸のいくつかの標的部位は、標的とされるＧｒｉｋ２転写産物の認識部位として特定された。以下の表４に示されるように、Ｇｒｉｋ２標的部位にハイブリダイズする（又はそれに結合する）種々のアンチセンスＲＮＡは、本願発明者らによって特定されている。Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ標的核酸は、一次転写産物（ＲＮＡ）の領域内のヌクレオチド配列、又はそれをコードするｃＤＮＡを含む。当業者は、ｃＤＮＡ配列が、ウリジンをチミジンに置換したことを除き、ｍＲＮＡ配列と等価であり、本明細書の同じ目的、すなわち、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの発現を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの生成のために使用することができることを理解するだろう。
本明細書に開示される方法及び組成物と組み合わせて使用され得る阻害性ＲＮＡ構築物（例えば、本明細書に開示されるＡＳＯ剤）は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１個以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９個、又はそれより多くの）標的領域に（例えば、それらとの相補的塩基対形成によって）結合することができるＡＳＯ剤、例えば、配列番号１１５～１２５のＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ転写産物のうちのいずれか１つ、５’ＵＴＲ（配列番号１２６）、３’ＵＴＲ（配列番号１２７）、Ｇｒｉｋ２シグナルペプチドをコードする核酸配列（配列番号１２８）、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１（配列番号１２９）、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン２（配列番号１３０）、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン３（配列番号１３１）、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン４（配列番号１３２）、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン５（配列番号１３３）、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン６（配列番号１３４）、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン７（配列番号１３５）、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン８（配列番号１３６）、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン９（配列番号１３７）、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１０（配列番号１３８）、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１１（配列番号１３９）、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１２（配列番号１４０）、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１３（配列番号１４１）、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１４（配列番号１４２）、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１５（配列番号１４３）、及びＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１６（配列番号１４４）の少なくとも一部内のものを含む。配列番号１１５、又は配列番号１１６の少なくとも一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯは、表２又は表３に列挙されるＡＳＯ剤から選択され得る。
例えば、本開示の組換えＡＳＯ剤は、配列番号１１５の少なくとも一部又は領域内のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。別の例において、ＡＳＯ剤は、配列番号１１６の少なくとも一部又は領域内のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。
更なる例において、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化する本開示のＡＳＯ剤は、５’ＵＴＲ（配列番号１２６）の少なくとも一部又は領域内のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。別の例において、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化する本開示のＡＳＯ剤は、３’ＵＴＲ（配列番号１２７）の少なくとも一部又は領域内のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。
開示されるＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上のエクソン、例えば、配列番号１１５の核酸配列、又は配列番号１１５の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントを有するＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上のエクソンにハイブリダイズし得る。したがって、ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１、例えば、配列番号１１５のヌクレオチド位置１～４０８に位置するＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１の少なくとも一部又は領域内にハイブリダイズし得る。Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１の配列は、表４に示されるように、配列番号１２９の核酸配列、又は配列番号１２９の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
例えば、Ｇｒｉｋ２は、ヌクレオチド１９７～２１７（配列番号１１５）、２１５～２３５（配列番号１１５）、２３２～２５１（配列番号１１５）、２３２～２５２（配列番号１１５）、２２７～２４７（配列番号１１５）、２９～４８（配列番号１１６）、３２２～３４１（配列番号１１５）、２９～４９（配列番号１１６）、３２２～３４２（配列番号１１５）、１８２～２０２（配列番号１１５）、２２６～２４６（配列番号１１５）、２５３～２７２（配列番号１１５）、２５３～２７３（配列番号１１５）、１３９～１５９（配列番号１１５）、１７６～１９６（配列番号１１５）、２４１～２６１（配列番号１１５）、１９５～２１５（配列番号１１５）、４２～６２（配列番号１１５）、１９６～２１６（配列番号１１５）、又は３０～４９（配列番号１１５）を含む本明細書に開示されるＡＳＯ剤を使用した標的化について企図される核酸を標的化する。これに加えて、Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤は、ヌクレオチド１９７～２１７（配列番号１１５）、２１５～２３５（配列番号１１５）、２３２～２５１（配列番号１１５）、２３２～２５２（配列番号１１５）、２２７～２４７（配列番号１１５）、２９～４８（配列番号１１６）、３２２～３４１（配列番号１１５）、２９～４９（配列番号１１６）、３２２～３４２（配列番号１１５）、１８２～２０２（配列番号１１５）、２２６～２４６（配列番号１１５）、２５３～２７２（配列番号１１５）、２５３～２７３（配列番号１１５）、１３９～１５９（配列番号１１５）、１７６～１９６（配列番号１１５）、２４１～２６１（配列番号１１５）、１９５～２１５（配列番号１１５）、４２～６２（配列番号１１５）、１９６～２１６（配列番号１１５）、３０～４９（配列番号１１５）、又はそれらの断片若しくは一部内のＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡにハイブリダイズし得る。
配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン１の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯ剤は、ｓｉＲＮＡ ＴＪ（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ ＴＦ（配列番号２４）、ｓｉＲＮＡ ＴＥ 配列番号２５）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ（配列番号２６）、ｓｉＲＮＡ ＴＣ（配列番号２８）、ｓｉＲＮＡ ＣＫ（配列番号２９）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ ＣＹ（配列番号４３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ０（配列番号４５）、ｓｉＲＮＡ Ｄ１（配列番号４６）、ｓｉＲＮＡ Ｄ３（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＸＺ（配列番号５４）、ｓｉＲＮＡ Ｙ０（配列番号５５）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＺＺ（配列番号１００）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ（配列番号６６）、若しくはｓｉＲＮＡ ＹＢ（配列番号６７）、又はｓｉＲＮＡ ＴＪ（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ ＴＦ（配列番号２４）、ｓｉＲＮＡ ＴＥ 配列番号２５）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ（配列番号２６）、ｓｉＲＮＡ ＴＣ（配列番号２８）、ｓｉＲＮＡ ＣＫ（配列番号２９）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ ＣＹ（配列番号４３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ０（配列番号４５）、ｓｉＲＮＡ Ｄ１（配列番号４６）、ｓｉＲＮＡ Ｄ３（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＸＺ（配列番号５４）、ｓｉＲＮＡ Ｙ０（配列番号５５）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＺＺ（配列番号１００）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ（配列番号６６）、若しくはｓｉＲＮＡ ＹＢ（配列番号６７）のうちのいずれかに対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択され得る。配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン１の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯ剤は、少なくとも１０％の（例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）ＧｌｕＫ２タンパク質ノックダウンを示し得る。これに加えて、Ｇｒｉｋ２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ ＴＪ（配列番号２１）、ｓｉＲＮＡ ＴＧ（配列番号２３）、ｓｉＲＮＡ ＴＦ（配列番号２４）、ｓｉＲＮＡ ＴＥ（配列番号２５）、ｓｉＲＮＡ ＴＤ（配列番号２６）、ｓｉＲＮＡ ＴＣ（配列番号２８）、ｓｉＲＮＡ ＣＫ（配列番号２９）、ｓｉＲＮＡ ＣＸ（配列番号４２）、ｓｉＲＮＡ ＣＹ（配列番号４３）、ｓｉＲＮＡ Ｄ０（配列番号４５）、ｓｉＲＮＡ Ｄ１（配列番号４６）、ｓｉＲＮＡ Ｄ３（配列番号４８）、ｓｉＲＮＡ ＸＺ（配列番号５４）、ｓｉＲＮＡ Ｙ０（配列番号５５）、ｓｉＲＮＡ ＧＦ（配列番号６４）、ｓｉＲＮＡ ＺＺ（配列番号１００）、ｓｉＲＮＡ ＧＥ（配列番号６５）、ｓｉＲＮＡ ＧＨ（配列番号６６）、若しくはｓｉＲＮＡ ＹＢ（配列番号６７）、又は少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）その配列同一性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択されてもよく、少なくとも１０％の（例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示す。
これに加えて、ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン２、例えば、配列番号１１５のヌクレオチド位置４０９～５７６に位置するＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン２の少なくとも一部又は領域内でハイブリダイズし得る。Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン２の配列は、表４に示されるように、配列番号１３０の核酸配列、又は配列番号１３０の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
例えば、Ｇｒｉｋ２は、配列番号１１５のヌクレオチド５０１～５２１、又は配列番号１１６のヌクレオチド２０８～２２８、又はそれらの断片若しくは一部を含む本明細書に開示されるＡＳＯ剤を使用した標的化について企図される核酸を標的化する。
配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン２の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯ剤は、ｓｉＲＮＡ Ｇ０（配列番号１）、又はｓｉＲＮＡ Ｇ０（配列番号１）に対して８５％より大きい（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。他の実施形態において、配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン２の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、７５％より大きいＧｌｕＫ２ノックダウンを示す。なお他の実施形態において、Ｇｒｉｋ２アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ Ｇ０（配列番号１）、又は８５％より大きい（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）その配列同一性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、７５％より大きい（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示す。
ＡＳＯ剤はまた、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン３、例えば、配列番号１１５のヌクレオチド位置５７７～８３４に位置するＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン３の少なくとも一部又は領域内でハイブリダイズし得る。Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン３の配列は、表４に示されるように、配列番号１３１の核酸配列、又は配列番号１３１の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
例えば、Ｇｒｉｋ２は、配列番号１１６のヌクレオチド３０７～３２７、又は配列番号１１５のヌクレオチド６００～６２０、配列番号１１６のヌクレオチド３５２～３７２、又は配列番号１１５のヌクレオチド６４５～６６５、配列番号１１６のヌクレオチド３８１～４００、又は配列番号１１５のヌクレオチド６７４～６９３、配列番号１１６のヌクレオチド３８１～４０１、又は配列番号１１５のヌクレオチド６７４～６９４、配列番号１１６のヌクレオチド３８０～４００、又は配列番号１１５のヌクレオチド６７３～６９３、配列番号１１６のヌクレオチド５３４～５５４、又は配列番号１１５のヌクレオチド８２７～８４７、配列番号１１６のヌクレオチド３０８～３２８、又は配列番号１１５のヌクレオチド６０１～６２１、配列番号１１６のヌクレオチド３９６～４１６、又は配列番号１１５のヌクレオチド６８９～７０９、配列番号１１６のヌクレオチド３５５～３７５、又は配列番号１１５のヌクレオチド６４８～６６８、配列番号１１６のヌクレオチド３５７～３７７、又は配列番号１１５のヌクレオチド６５０～６７０、配列番号１１６のヌクレオチド４２４～４４４、又は配列番号１１５のヌクレオチド７１７～７３７、配列番号１１６のヌクレオチド４２９～４４９、又は配列番号１１５のヌクレオチド７２２～７４２、又はそれらの断片若しくは一部を含む本明細書に開示されるＡＳＯ剤を使用した標的化について企図される核酸を標的化する。
配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン３の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯ剤は、ｓｉＲＮＡ ＴＶ（配列番号２）、ｓｉＲＮＡ ＴＵ（配列番号３）、ｓｉＲＮＡ ＣＬ（配列番号３０）、ｓｉＲＮＡ ＣＭ（配列番号３１）、ｓｉＲＮＡ ＣＲ（配列番号３６）、ｓｉＲＮＡ ＣＶ（配列番号４０）、ｓｉＲＮＡ Ｙ４（配列番号５９）、ｓｉＲＮＡ ＭＰ（配列番号７６）、ｓｉＲＮＡ ＭＷ（配列番号８０）、ｓｉＲＮＡ ＭＶ（配列番号８１）、ｓｉＲＮＡ Ｇ８（配列番号９２）、又はｓｉＲＮＡ ＭＦ（配列番号９３）、又はｓｉＲＮＡ ＴＶ（配列番号２）、ｓｉＲＮＡ ＴＵ（配列番号３）、ｓｉＲＮＡ ＣＬ（配列番号３０）、ｓｉＲＮＡ ＣＭ（配列番号３１）、ｓｉＲＮＡ ＣＲ（配列番号３６）、ｓｉＲＮＡ ＣＶ（配列番号４０）、ｓｉＲＮＡ Ｙ４（配列番号５９）、ｓｉＲＮＡ ＭＰ（配列番号７６）、ｓｉＲＮＡ ＭＷ（配列番号８０）、ｓｉＲＮＡ ＭＶ（配列番号８１）、ｓｉＲＮＡ Ｇ８（配列番号９２）、又はｓｉＲＮＡ ＭＦ（配列番号９３）に対して８５％より大きい（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するＡＳＯから選択される。これに加えて、配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン３の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯは、少なくとも１５％の（例えば、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示し得る。なお他の実施形態において、Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯは、ｓｉＲＮＡ ＴＶ（配列番号２）、ｓｉＲＮＡ ＴＵ（配列番号３）、ｓｉＲＮＡ ＣＬ（配列番号３０）、ｓｉＲＮＡ ＣＭ（配列番号３１）、ｓｉＲＮＡ ＣＲ（配列番号３６）、ｓｉＲＮＡ ＣＶ（配列番号４０）、ｓｉＲＮＡ Ｙ４（配列番号５９）、ｓｉＲＮＡ ＭＰ（配列番号７６）、ｓｉＲＮＡ ＭＷ（配列番号８０）、ｓｉＲＮＡ ＭＶ（配列番号８１）、ｓｉＲＮＡ Ｇ８（配列番号９２）、又はｓｉＲＮＡ ＭＦ（配列番号９３）、又は８５％より大きい（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）その配列同一性を有するＡＳＯから選択され、１５％より大きい（例えば、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示す。
更に、開示されるＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン４、例えば、配列番号１１５のヌクレオチド位置８３５～１０１６に位置するＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン４の少なくとも一部又は領域内でハイブリダイズし得る。Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン４の配列は、表４に示されるように、配列番号１３２の核酸配列、又は配列番号１３２の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
例えば、Ｇｒｉｋ２は、配列番号１１６のヌクレオチド５３４～５５４、又は配列番号１１５のヌクレオチド８２７～８４７、配列番号１１６）のヌクレオチド５７９～５９９、又は配列番号１１５のヌクレオチド８７２～８９２、配列番号１１６のヌクレオチド７１７～７３７、又は配列番号１１５のヌクレオチド１０１０～１０３０、配列番号１１６のヌクレオチド７２１～７４１、又は配列番号１１５）のヌクレオチド１０１４～１０３４、及び配列番号１１６のヌクレオチド５５９～５７９、又は配列番号１１５のヌクレオチド８５２～８７２、又はそれらの断片若しくは一部を含む本明細書に開示されるＡＳＯ剤を使用した標的化について企図される核酸を標的化する。
配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン４の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯは、ｓｉＲＮＡ ＣＶ（配列番号４０）、ｓｉＲＮＡ Ｙ５（配列番号６０）、ｓｉＲＮＡ Ｇ９（配列番号６８）、ｓｉＲＮＡ ＭＤ（配列番号７０）、又はｓｉＲＮＡ ＭＫ（配列番号８６）、又はｓｉＲＮＡ ＣＶ（配列番号４０）、ｓｉＲＮＡ Ｙ５（配列番号６０）、ｓｉＲＮＡ Ｇ９（配列番号６８）、ｓｉＲＮＡ ＭＤ（配列番号７０）、又はｓｉＲＮＡ ＭＫ（配列番号８６）に対して８５％より大きい（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するＡＳＯから選択される。これに加えて、配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン４の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯは、２５％より大きい（例えば、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示す。なお更に、Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯは、ｓｉＲＮＡ ＣＶ（配列番号４０）、ｓｉＲＮＡ Ｙ５（配列番号６０）、ｓｉＲＮＡ Ｇ９（配列番号６８）、ｓｉＲＮＡ ＭＤ（配列番号７０）、又はｓｉＲＮＡ ＭＫ（配列番号８６）、又は８５％より大きい（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）その配列同一性を有するＡＳＯから選択され、２５％より大きい（例えば、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示す。
これに加えて、ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン５、例えば、配列番号１１５のヌクレオチド位置１０１７～１０７０に位置するＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン５の少なくとも一部又は領域内でハイブリダイズし得る。Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン５の配列は、表４に示されるように、配列番号１３３の核酸配列、又は配列番号１３３の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
例えば、Ｇｒｉｋ２は、配列番号１１６のヌクレオチド７１７～７３７、又は配列番号１１５のヌクレオチド１０１０～１０３０、配列番号１１６のヌクレオチド７２８～７４７、又は配列番号１１５のヌクレオチド１０２１～１０４０、及び配列番号１１６のヌクレオチド７２１～７４１、又は配列番号１１５のヌクレオチド１０１４～１０３４、又はそれらの断片若しくは一部を含む本明細書に開示されるＡＳＯ剤を使用した標的化について企図される核酸を標的化する。
配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン５の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯは、ｓｉＲＮＡ Ｇ９（配列番号６８）、ｓｉＲＮＡ ＭＥ（配列番号６９）、又はｓｉＲＮＡ ＭＤ（配列番号７０）、又はｓｉＲＮＡ Ｇ９（配列番号６８）、ｓｉＲＮＡ ＭＥ（配列番号６９）配列番号６９）、又はｓｉＲＮＡ ＭＤ（配列番号７０）に対して８５％より大きい（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するＡＳＯから選択される。これに加えて、配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン５の少なくとも一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯは、７５％より大きい（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示す。なお更に、Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯは、ｓｉＲＮＡ Ｇ９（配列番号６８）、ｓｉＲＮＡ ＭＥ（配列番号６９）、又はｓｉＲＮＡ ＭＤ（配列番号７０）、又は８５％より大きい（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）その配列同一性を有するＡＳＯから選択され、７５％より大きい（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示す。
ＡＳＯ剤はまた、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン６、例えば、配列番号１１５のヌクレオチド位置１０７１～１２４４に位置するＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン６の少なくとも一部又は領域内でハイブリダイズし得る。Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン６の配列は、表４に示されるように、配列番号１３４の核酸配列、又は配列番号１３４の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
例えば、Ｇｒｉｋ２は、配列番号１１６のヌクレオチド８０６～８２６、又は配列番号１１５のヌクレオチド１０９９～１１１９、配列番号１１６のヌクレオチド９０５～９２５、又は配列番号１１５のヌクレオチド１１９８～１２１８、配列番号１１６のヌクレオチド９０４～９２４、又は配列番号１１５のヌクレオチド１１９７～１２１７、配列番号１１６のヌクレオチド８８５～９０５、又は配列番号１１５のヌクレオチド１１７８～１１９８、配列番号１１６のヌクレオチド９０８～９２７、又は配列番号１１５のヌクレオチド１２０１～１２２０、配列番号１１６のヌクレオチド９０８～９２８、又は配列番号１１５のヌクレオチド１２０１～１２２１、配列番号１１６のヌクレオチド９３４～９５４、又は配列番号１１５のヌクレオチド１２２７～１２４７、配列番号１１６のヌクレオチド９３１～９５０、又は配列番号１１５のヌクレオチド１２２４～１２４３、及び配列番号１１６のヌクレオチド９３８～９５７、又は配列番号１１５のヌクレオチド１２３１～１２５０、又はそれらの断片若しくは一部を含む本明細書に開示されるＡＳＯ剤を使用した標的化について企図される核酸を標的化する。
配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン６の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯは、ｓｉＲＮＡ ＴＴ（配列番号４）、ｓｉＲＮＡ Ｇ１（配列番号５）、ｓｉＲＮＡ Ｇ２（配列番号６）、ｓｉＲＮＡ Ｙ１（配列番号５６）、ｓｉＲＮＡ Ｙ２（配列番号５７）、ｓｉＲＮＡ Ｙ３（配列番号５８）、ｓｉＲＮＡ ＧＧ（配列番号９１）、ｓｉＲＮＡ ＭＨ（配列番号９４）、若しくはｓｉＲＮＡ ＭＧ（配列番号９５）、又はｓｉＲＮＡ ＴＴ（配列番号４）、ｓｉＲＮＡ Ｇ１（配列番号５）、ｓｉＲＮＡ Ｇ２（配列番号６）、ｓｉＲＮＡ Ｙ１（配列番号５６）、ｓｉＲＮＡ Ｙ２（配列番号５７）、ｓｉＲＮＡ Ｙ３（配列番号５８）、ｓｉＲＮＡ ＧＧ（配列番号９１）、ｓｉＲＮＡ ＭＨ（配列番号９４）、若しくはｓｉＲＮＡ ＭＧ（配列番号９５）に対して８５％より大きい（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するＡＳＯから選択される。これに加えて、配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン６の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯは、２０％より大きい（例えば、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示す。なお他の実施形態において、Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯは、ｓｉＲＮＡ ＴＴ（配列番号４）、ｓｉＲＮＡ Ｇ１（配列番号５）、ｓｉＲＮＡ Ｇ２（配列番号６）、ｓｉＲＮＡ Ｙ１（配列番号５６）、ｓｉＲＮＡ Ｙ２（配列番号５７）、ｓｉＲＮＡ Ｙ３（配列番号５８）、ｓｉＲＮＡ ＧＧ（配列番号９１）、ｓｉＲＮＡ ＭＨ（配列番号９４）、若しくはｓｉＲＮＡ ＭＧ（配列番号９５）、又は８５％より大きい（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）その配列同一性を有するＡＳＯから選択され、２０％より大きい（例えば、少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示す。
これに加えて、ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン７、例えば、配列番号１１５のヌクレオチド位置１２４５～１３８８に位置するＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン７の少なくとも一部又は領域内でハイブリダイズし得る。Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン７の配列は、表４に示されるように、配列番号１３５の核酸配列、又は配列番号１３５の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
例えば、Ｇｒｉｋ２は、配列番号１１６のヌクレオチド１０２９～１０４９、又は配列番号１１５のヌクレオチド１３２２～１３４２、配列番号１１６のヌクレオチド９８５～１００５、又は配列番号１１５のヌクレオチド１２７８～１２９８、配列番号１１６のヌクレオチド１０５７～１０７７、又は配列番号１１５のヌクレオチド１３５０～１３７０、配列番号１１６のヌクレオチド１０５８～１０７８、又は配列番号１１５のヌクレオチド１３５１～１３７１、及び配列番号１１６のヌクレオチド１０４３～１０６３、又は配列番号１１５のヌクレオチド１３３６～１３５６、又はそれらの断片若しくは一部を含む本明細書に開示されるＡＳＯ剤を使用した標的化について企図される核酸を標的化する。
配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン７の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯは、ｓｉＲＮＡ ＴＬ（配列番号２０）、ｓｉＲＮＡ ＣＳ（配列番号３７）、ｓｉＲＮＡ ＣＴ（配列番号３８）、ｓｉＲＮＡ ＣＺ（配列番号４４）、若しくはｓｉＲＮＡ Ｄ２（配列番号４７）、又はｓｉＲＮＡ ＴＬ（配列番号２０）、ｓｉＲＮＡ ＣＳ（配列番号３７）、ｓｉＲＮＡ ＣＴ（配列番号３８）、ｓｉＲＮＡ ＣＺ（配列番号４４）、若しくはｓｉＲＮＡ Ｄ２（配列番号４７）に対して８５％より大きい（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するＡＳＯから選択される。これに加えて、配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン７の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯは、４５％より大きい（例えば、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示す。なお更に、Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯは、ｓｉＲＮＡ ＴＬ（配列番号２０）、ｓｉＲＮＡ ＣＳ（配列番号３７）、ｓｉＲＮＡ ＣＴ（配列番号３８）、ｓｉＲＮＡ ＣＺ（配列番号４４）、若しくはｓｉＲＮＡ Ｄ２（配列番号４７）、又は８５％より大きい（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）その配列同一性を有するＡＳＯから選択され、４５％より大きい（例えば、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示す。
ＡＳＯ剤は更に、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン８、例えば、配列番号１１５のヌクレオチド位置１３８９～１４９６に位置するＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン８の少なくとも一部又は領域内でハイブリダイズし得る。Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン８の配列は、表４に示されるように、配列番号１３６の核酸配列、又は配列番号１３６の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。エクソン８の一部又は領域を標的化するＡＳＯ剤は、少なくとも１０％の（例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示し得る。
更に、ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン９、例えば、配列番号１１５のヌクレオチド位置１４９７～１６１０に位置するＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン９の少なくとも一部又は領域内でハイブリダイズし得る。Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン９の配列は、表４に示されるように、配列番号１３７の核酸配列、又は配列番号１３７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
例えば、Ｇｒｉｋ２は、配列番号１１６のヌクレオチド１２５２～１２７２、又は配列番号１１５のヌクレオチド１５４５～１５６５、又はそれらの断片若しくは一部を含む本明細書に開示されるＡＳＯ剤を使用した標的化について企図される核酸を標的化する。
配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン９の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯは、ｓｉＲＮＡ ＴＱ（配列番号１２）、又はｓｉＲＮＡ ＴＱ（配列番号１２）に対して８５％より大きい（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するＡＳＯである。これに加えて、配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン９の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯは、５０％より大きい（例えば、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示す。なお更に、Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯは、ｓｉＲＮＡ ＴＱ（配列番号１２）、又は８５％より大きい（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）その配列同一性を有するＡＳＯであり、５０％より大きい（例えば、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示す。
ＡＳＯ剤は、これに加えて、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１０、例えば、配列番号１１５のヌクレオチド位置１６１１～１８１７に位置するＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１０にハイブリダイズし得る。Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１０の配列は、表４に示されるように、配列番号１３８の核酸配列、又は配列番号１３８の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
例えば、Ｇｒｉｋ２は、配列番号１１６のヌクレオチド１３９６～１４１６、又は配列番号１１５のヌクレオチド１６８９～１７０９、配列番号１１６のヌクレオチド１４９６～１５１６、又は配列番号１１５のヌクレオチド１７８９～１８０９、配列番号１１６のヌクレオチド１４１７～１４３７、又は配列番号１１５のヌクレオチド１７１０～１７３０、配列番号１１６のヌクレオチド１４８３～１５０３、又は配列番号１１５のヌクレオチド１７７６～１７９６、及び配列番号１１６のヌクレオチド１４９１～１５１１、又は配列番号１１５のヌクレオチド１７８４～１８０４、又はそれらの断片若しくは一部を含む本明細書に開示されるＡＳＯ剤を使用した標的化について企図される核酸を標的化する。
配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン１０の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯは、ｓｉＲＮＡ ＧＤ（配列番号７）、Ｇ３（配列番号８）、ｓｉＲＮＡ ＭＵ（配列番号９６）、ｓｉＲＮＡ ＭＴ（配列番号９８）、若しくはｓｉＲＮＡ ＭＳ（配列番号９９）、又はｓｉＲＮＡ ＧＤ（配列番号７）、Ｇ３（配列番号８）、ｓｉＲＮＡ ＭＵ（配列番号９６）、ｓｉＲＮＡ ＭＴ（配列番号９８）、若しくはｓｉＲＮＡ ＭＳ（配列番号９９）に対して８５％より大きい（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するＡＳＯから選択される。これに加えて、配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン１０の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯは、５０％より大きい（例えば、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示す。なお更に、Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯは、ＧＤ（配列番号７）、Ｇ３（配列番号８）、ｓｉＲＮＡ ＭＵ（配列番号９６）、ｓｉＲＮＡ ＭＴ（配列番号９８）、若しくはｓｉＲＮＡ ＭＳ（配列番号９９）、又は８５％より大きい（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）その配列同一性を有するＡＳＯから選択され、５０％より大きい（例えば、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示す。
更に、ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１１、例えば、配列番号１１５のヌクレオチド位置１８１８～２０４１に位置するＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１１の少なくとも一部又は領域にハイブリダイズし得る。Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１１の配列は、表４に示されるように、配列番号１３９の核酸配列、又は配列番号１３９の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
例えば、Ｇｒｉｋ２は、配列番号１１６のヌクレオチド１５５０～１５７０、又は配列番号１１５のヌクレオチド１８４３～１８６３、配列番号１１６のヌクレオチド１６３７～１６５７、又は配列番号１１５のヌクレオチド１９３０～１９５０、配列番号１１６のヌクレオチド１６７０～１６９０、又は配列番号１１５のヌクレオチド１９６３～１９８３、配列番号１１６のヌクレオチド１５６５～１５８５、又は配列番号１１５のヌクレオチド１８５８～１８７８、配列番号１１６のヌクレオチド１５５０～１５６９、又は配列番号１１５のヌクレオチド１８４３～１８６２、配列番号１１６のヌクレオチド１５４４～１５６３、又は配列番号１１５のヌクレオチド１８３７～１８５６、配列番号１１６のヌクレオチド１５４４～１５６４、又は配列番号１１５のヌクレオチド１８３７～１８５７、配列番号１１６のヌクレオチド１５２６～１５４６、及び配列番号１１６のヌクレオチド１５４１～１５６１、又は配列番号１１５のヌクレオチド１８３４～１８５４、又はそれらの断片若しくは一部を含む本明細書に開示されるＡＳＯ剤を使用した標的化について企図される核酸を標的化する。
配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン１１の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯは、ｓｉＲＮＡ ＴＨ（配列番号２２）、ｓｉＲＮＡ ＣＵ（配列番号３９）、ｓｉＲＮＡ Ｙ７（配列番号６２）、ｓｉＲＮＡ ＴＫ（配列番号７４）、ｓｉＲＮＡ ＴＩ（配列番号７５）、ｓｉＲＮＡ Ｙ８（配列番号８７）、ｓｉＲＮＡ Ｙ９（配列番号８８）、ｓｉＲＮＡ ＭＪ（配列番号８９）、若しくはｓｉＲＮＡ ＭＩ（配列番号９０）、又は８５％より大きい（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性ｓｉＲＮＡ ＴＨ（配列番号２２）、ｓｉＲＮＡ ＣＵ（配列番号３９）、ｓｉＲＮＡ Ｙ７（配列番号６２）、ｓｉＲＮＡ ＴＫ（配列番号７４）、ｓｉＲＮＡ ＴＩ（配列番号７５）、ｓｉＲＮＡ Ｙ８（配列番号８７）、ｓｉＲＮＡ Ｙ９（配列番号８８）、ｓｉＲＮＡ ＭＪ（配列番号８９）、若しくはｓｉＲＮＡ ＭＩ（配列番号９０）を有するＡＳＯから選択される。これに加えて、配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン１１の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯは、２５％より大きい（例えば、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示す。なお更に、Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯは、ｓｉＲＮＡ ＴＨ（配列番号２２）、ｓｉＲＮＡ ＣＵ（配列番号３９）、ｓｉＲＮＡ Ｙ７（配列番号６２）、ｓｉＲＮＡ ＴＫ（配列番号７４）、ｓｉＲＮＡ ＴＩ（配列番号７５）、ｓｉＲＮＡ Ｙ８（配列番号８７）、ｓｉＲＮＡ Ｙ９（配列番号８８）、ｓｉＲＮＡ ＭＪ（配列番号８９）、若しくはｓｉＲＮＡ ＭＩ（配列番号９０）、又は８５％より大きい（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）その配列同一性を有するＡＳＯから選択され、２５％より大きい（例えば、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示す。
更なる例として、ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１２、例えば、配列番号１１５のヌクレオチド位置２０４２～２１６０に位置するＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１２の少なくとも一部又は領域にハイブリダイズし得る。Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１２の配列は、表４に示されるように、配列番号１４０の核酸配列、又は配列番号１４０の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
例えば、Ｇｒｉｋ２は、配列番号１１６のヌクレオチド１７８６～１８０５、又は配列番号１１５のヌクレオチド２０７９～２０９８、配列番号１１６のヌクレオチド１７８６～１８０６、又は配列番号１１５のヌクレオチド２０７９～２０９９、配列番号１１６のヌクレオチド１７７８～１７９７、又は配列番号１１５のヌクレオチド２０７１～２０９０、及び配列番号１１６のヌクレオチド１８３６～１８５６、又は配列番号１１５のヌクレオチド２１２９～２１４９、又はそれらの断片若しくは一部を含む本明細書に開示されるＡＳＯ剤を使用した標的化について企図される核酸を標的化する。
配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン１２の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯであって、ｓｉＲＮＡ ＸＸ（配列番号８２）、ｓｉＲＮＡ ＸＹ（配列番号８３）、ｓｉＲＮＡ ＭＭ（配列番号８４）、若しくはｓｉＲＮＡ ＭＬ（配列番号８５）、又はｓｉＲＮＡ ＸＸ（配列番号８２）、ｓｉＲＮＡ ＸＹ（配列番号８３）、ｓｉＲＮＡ ＭＭ（配列番号８４）、若しくはｓｉＲＮＡ ＭＬ（配列番号８５）に対して８５％より大きい（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するＡＳＯから選択されるもの。これに加えて、配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン１２の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯは、５０％より大きい（例えば、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示す。なお更に、Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯは、ｓｉＲＮＡ ＸＸ（配列番号８２）、ｓｉＲＮＡ ＸＹ（配列番号８３）、ｓｉＲＮＡ ＭＭ（配列番号８４）、若しくはｓｉＲＮＡ ＭＬ（配列番号８５）、又は８５％より大きい（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）その配列同一性を有するＡＳＯから選択され、５０％より大きい（例えば、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示す。
ＡＳＯ剤はまた、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１３、例えば、配列番号１１５のヌクレオチド位置２１６１～２３７８に位置するＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１３の少なくとも一部又は領域にハイブリダイズし得る。Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１３の配列は、表４に示されるように、配列番号１４１の核酸配列、又は配列番号１４１の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
例えば、Ｇｒｉｋ２は、配列番号１１６のヌクレオチド１９６８～１９８７、又は配列番号１１５のヌクレオチド２２１３～２２３３、配列番号１１６のヌクレオチド１９６８～１９８８、又は配列番号１１５のヌクレオチド２２１３～２２３３、配列番号１１６のヌクレオチド１９０６～１９２６、又は配列番号１１５のヌクレオチド２１９９～２２１９、及び配列番号１１６のヌクレオチド１９２０～１９４０、又は配列番号１１５のヌクレオチド２２１３～２２３３、又はそれらの断片若しくは一部を含む本明細書に開示されるＡＳＯ剤を使用した標的化について企図される核酸を標的化する。
配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン１３の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯは、ｓｉＲＮＡ ＴＰ（配列番号１３）、ｓｉＲＮＡ ＴＯ（配列番号１４）、ｓｉＲＮＡ ＭＲ（配列番号７２）、若しくはｓｉＲＮＡ ＭＱ（配列番号７３）、又はｓｉＲＮＡ ＴＰ（配列番号１３）、ｓｉＲＮＡ ＴＯ（配列番号１４）、ｓｉＲＮＡ ＭＲ（配列番号７２）、若しくはｓｉＲＮＡ ＭＱ（配列番号７３）に対して８５％より大きい（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するＡＳＯから選択される。これに加えて、配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン１３の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯは、３５％より大きい（例えば、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示す。なお更に、Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯは、ｓｉＲＮＡ ＴＰ（配列番号１３）、ｓｉＲＮＡ ＴＯ（配列番号１４）、ｓｉＲＮＡ ＭＲ（配列番号７２）、若しくはｓｉＲＮＡ ＭＱ（配列番号７３）、又は８５％より大きい（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）その配列同一性を有するＡＳＯから選択され、３５％より大きい（例えば、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示す。
これに加えて、ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１４、例えば、配列番号１１５のヌクレオチド位置２３７９～２６０４に位置するＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１４の少なくとも一部又は領域にハイブリダイズし得る。Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１４の配列は、表４に示されるように、配列番号１４２の核酸配列、又は配列番号１４２の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
例えば、Ｇｒｉｋ２は、配列番号１１６のヌクレオチド２２０９～２２２８、又は配列番号１１５のヌクレオチド２５０２～２５２１、配列番号１１６のヌクレオチド２２０９～２２２９、又は配列番号１１５のヌクレオチド２５０２～２５２２、配列番号１１６のヌクレオチド２３０８～２３２８、又は配列番号１１５のヌクレオチド２６０１～２６２１、配列番号１１６）のヌクレオチド２３０４～２３２３、又は配列番号１１５のヌクレオチド２５９７～２６１６、及び配列番号１１６のヌクレオチド２３０３～２３２３、又は配列番号１１５のヌクレオチド２５９６～２６１６、又はそれらの断片若しくは一部を含む本明細書に開示されるＡＳＯ剤を使用した標的化について企図される核酸を標的化する。
配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン１４の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯは、ｓｉＲＮＡ ＣＰ（配列番号３４）、ｓｉＲＮＡ ＣＱ（配列番号３５）、ｓｉＲＮＡ ＧＩ（配列番号７７）、ｓｉＲＮＡ ＭＯ（配列番号７８）、若しくはｓｉＲＮＡ ＭＮ（配列番号７９）、又はｓｉＲＮＡ ＣＰ（配列番号３４）、ｓｉＲＮＡ ＣＱ（配列番号３５）、ｓｉＲＮＡ ＧＩ（配列番号７７）、ｓｉＲＮＡ ＭＯ（配列番号７８）、若しくはｓｉＲＮＡ ＭＮ（配列番号７９）に対して８５％より大きい（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するＡＳＯから選択される。これに加えて、配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン１４の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯは、３５％より大きい（例えば、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示す。なお更に、Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯは、ｓｉＲＮＡ ＣＰ（配列番号３４）、ｓｉＲＮＡ ＣＱ（配列番号３５）、ｓｉＲＮＡ ＧＩ（配列番号７７）、ｓｉＲＮＡ ＭＯ（配列番号７８）、若しくはｓｉＲＮＡ ＭＮ（配列番号７９）、又は８５％より大きい（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）その配列同一性を有するＡＳＯから選択され、３５％より大きい（例えば、少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示す。
ＡＳＯ剤はまた、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１５、例えば、配列番号１１５のヌクレオチド位置２６０５～２８５５に位置するＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１５の少なくとも一部又は領域にハイブリダイズし得る。Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１５のヌクレオチド配列は、表４に示されるように、配列番号１４３の核酸配列、又は配列番号１４３の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
例えば、Ｇｒｉｋ２は、配列番号１１６のヌクレオチド２３０９～２３２９、又は配列番号１１５のヌクレオチド２６０２～２６２２、又はそれらの断片若しくは一部を含む本明細書に開示されるＡＳＯ剤を使用した標的化について企図される核酸を標的化する。
配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン１５の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯは、ｓｉＲＮＡ ＸＵ（配列番号５１）、又はｓｉＲＮＡ ＸＵ（配列番号Ｘ）に対して８５％より大きい（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するＡＳＯである。これに加えて、配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン１５の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯは、５０％より大きい（例えば、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示す。なお更に、Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯは、ｓｉＲＮＡ ＸＵ（配列番号５１）、又は８５％より大きい（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）その配列同一性を有するＡＳＯであり、５０％より大きい（例えば、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示す。
更に、ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１６、例えば、配列番号１１５のヌクレオチド位置２８５６～４５９２に位置するＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１６の少なくとも一部又は領域にハイブリダイズし得る。Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１６の配列は、表４に示されるように、配列番号１４４の核酸配列、又は配列番号１４４の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
例えば、Ｇｒｉｋ２は、配列番号１１６のヌクレオチド２６３２～２６５２、又は配列番号１１５のヌクレオチド２９２５～２９４５、配列番号１１５のヌクレオチド３３８２～３４０２、配列番号１１５のヌクレオチド３７９２～３８１２、配列番号１１５のヌクレオチド３３４７～３３６７、配列番号１１５のヌクレオチド３６０５～３６２５、配列番号１１６のヌクレオチド２５８１～２６０１、又はヌクレオチド２８７４～２８９３配列番号１１５、配列番号１１６のヌクレオチド２５８１～２６０１、又は配列番号１１５のヌクレオチド２８７４～２８９３、配列番号１１５のヌクレオチド４２８９～４３０９、配列番号１１５のヌクレオチド４２７４～４２９３、配列番号１１５のヌクレオチド４２７４～４２９４、配列番号１１５のヌクレオチド４０７８～４０９８、配列番号１１５のヌクレオチド３０３７～３０５７、配列番号１１５のヌクレオチド４４１７～４４３７、配列番号１１６のヌクレオチド２６０１～２６２０、又は配列番号１１５のヌクレオチド２８９４～２９１３、配列番号１１６のヌクレオチド２６０１～２６２１、又は配列番号１１５のヌクレオチド２８９４～２９１４、配列番号１１５のヌクレオチド３４７９～３４９９、及び配列番号１１５のヌクレオチド３０８５～３１０５、又はそれらの断片若しくは一部を含む本明細書に開示されるＡＳＯ剤を使用した標的化について企図される核酸を標的化する。
配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン１６の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯは、ｓｉＲＮＡ Ｇ４（配列番号９）、ｓｉＲＮＡ ＴＳ（配列番号１０）、ｓｉＲＮＡ ＴＲ（配列番号１１）、ｓｉＲＮＡ Ｇ５（配列番号１５）、ｓｉＲＮＡ ＴＮ（配列番号１６）、ｓｉＲＮＡ Ｇ６（配列番号１８）、ｓｉＲＮＡ Ｇ７（配列番号１９）、ｓｉＲＮＡ ＧＪ（配列番号２７）、ｓｉＲＮＡ ＣＮ（配列番号３２）、ｓｉＲＮＡ ＣＯ（配列番号３３）、ｓｉＲＮＡ ＣＷ（配列番号４１）、ｓｉＲＮＡ ＸＳ（配列番号４９）、ｓｉＲＮＡ ＸＴ（配列番号５０）、ｓｉＲＮＡ ＸＶ（配列番号５２）、ｓｉＲＮＡ ＸＷ（配列番号５３）、ｓｉＲＮＡ Ｙ６（配列番号６１）、若しくはｓｉＲＮＡ ＹＡ（配列番号６３）、又はｓｉＲＮＡ Ｇ４（配列番号９）、ｓｉＲＮＡ ＴＳ（配列番号１０）、ｓｉＲＮＡ ＴＲ（配列番号１１）、ｓｉＲＮＡ Ｇ５（配列番号１５）、ｓｉＲＮＡ ＴＮ（配列番号１６）、ｓｉＲＮＡ Ｇ６（配列番号１８）、ｓｉＲＮＡ Ｇ７（配列番号１９）、ｓｉＲＮＡ ＧＪ（配列番号２７）、ｓｉＲＮＡ ＣＮ（配列番号３２）、ｓｉＲＮＡ ＣＯ（配列番号３３）、ｓｉＲＮＡ ＣＷ（配列番号４１）、ｓｉＲＮＡ ＸＳ（配列番号４９）、ｓｉＲＮＡ ＸＴ（配列番号５０）、ｓｉＲＮＡ ＸＶ（配列番号５２）、ｓｉＲＮＡ ＸＷ（配列番号５３）、ｓｉＲＮＡ Ｙ６（配列番号６１）、若しくはｓｉＲＮＡ ＹＡ（配列番号６３）に対して８５％より大きい（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するＡＳＯから選択される。これに加えて、配列番号１１６、又は配列番号１１５のエクソン１６の一部又は領域内の核酸を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯは、５％より大きい（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示す。なお更に、Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯは、ｓｉＲＮＡ Ｇ４（配列番号９）、ｓｉＲＮＡ ＴＳ（配列番号１０）、ｓｉＲＮＡ ＴＲ（配列番号１１）、ｓｉＲＮＡ Ｇ５（配列番号１５）、ｓｉＲＮＡ ＴＮ（配列番号１６）、ｓｉＲＮＡ Ｇ６（配列番号１８）、ｓｉＲＮＡ Ｇ７（配列番号１９）、ｓｉＲＮＡ ＧＪ（配列番号２７）、ｓｉＲＮＡ ＣＮ（配列番号３２）、ｓｉＲＮＡ ＣＯ（配列番号３３）、ｓｉＲＮＡ ＣＷ（配列番号４１）、ｓｉＲＮＡ ＸＳ（配列番号４９）、ｓｉＲＮＡ ＸＴ（配列番号５０）、ｓｉＲＮＡ ＸＶ（配列番号５２）、ｓｉＲＮＡ ＸＷ（配列番号５３）、ｓｉＲＮＡ Ｙ６（配列番号６１）、若しくはｓｉＲＮＡ ＹＡ（配列番号６３）、又は８５％より大きい（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）その配列同一性を有するＡＳＯから選択され、５％より大きい（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）ＧｌｕＫ２ノックダウンを示す。
アンチセンスオリゴヌクレオチド及びＧｒｉｋ２標的領域の熱力学的特性
ＲＮＡ二次構造、例えば、本開示のアンチセンス剤、又はそれらにハイブリダイズする標的配列（例えば、Ｇｒｉｋ２標的配列）の対応する領域によって形成されるものは、熱力学から拝借した概念、例えば、エントロピー及び熱力学的自由エネルギーを記載して、記述することができる。熱力学的自由エネルギーは、一般に、一定温度でのプロセスにおいて系を実行し、そのプロセスが熱力学的に好ましいか、又は禁止されるかどうかを意味し得る仕事の最大量として記述される。簡潔に言うと、熱力学的自由エネルギーは、系が物理状態の変化を受ける能力を指す。ポリヌクレオチド（例えば、本開示のＡＳＯ剤、又はその実質的に相補的な配列）の文脈内で、熱力学的自由エネルギーに基づく基準は、特定の二次構造が分解され得る際の容易さ（すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその部分的若しくは完全な補体のいずれかの二次ＲＮＡ構造を開放させるのに必要なエネルギー）、ＲＮＡ分子間若しくはＲＮＡ分子内の二本鎖形成から生成するエネルギー、並びに、各ＲＮＡを分解させるのに必要な総エネルギー及びそれ自体のハイブリダイゼーションのエネルギーを考慮して、あるＲＮＡ分子からそれ自体又は別のＲＮＡ分子に対する総結合エネルギーを記述することができる。
本開示は、一部には、ＲＮＡ分子（例えば、本開示のＡＳＯ構築物、又はその実質的に相補的な配列、例えば、Ｇｒｉｋ２標的領域）の熱力学的特徴を使用して、それを用いてアンチセンス分子が標的ｍＲＮＡの発現をノックダウンすることができる有効性を予測し得るという本願発明者らによってなされた発見に基づく。したがって、本明細書に開示される組成物及び方法は、熱力学的パラメータを使用して、ＡＳＯ配列又はその標的ｍＲＮＡ配列を特性決定し、ｍＲＮＡ発現のノックダウンの尤度を予測し得る。
特に、本開示は、特定のＡＳＯ配列のその標的ｍＲＮＡ領域に対するノックダウン有効性を予測する際に有用である３つの別個の熱力学的パラメータ、すなわち、総結合自由エネルギー、二本鎖形成からのエネルギー、及び標的開放エネルギー（又は開放エネルギー）を提供する。ＲＮＡ分子の熱力学的安定性を特性決定し、特定のＡＳＯ剤のノックダウン有効性を予測するために使用され得る追加の概念は、ＲＮＡ分子のＧＣ（グアニン－シトシン、％）含有量である。本開示の文脈内で、ＡＳＯの総結合自由エネルギー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）は、ＡＳＯがその対応する標的ｍＲＮＡ配列にハイブリダイズするプロセスの自由エネルギーを指す。これには、ｍＲＮＡ（例えば、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ）の標的領域を開放するのに必要なエネルギー、一本鎖アンチセンスガイド配列を生成するのに必要なエネルギー、及びポリヌクレオチドとその補体（完全又は実質的）との間のハイブリダイゼーションのエネルギーが含まれる。これに関連して、二本鎖形成からのエネルギーは、２つのＲＮＡ分子からの二本鎖構造の形成の好ましさ、その結果として、ＲＮＡ二本鎖の安定性を示す熱力学的特性を指す。総開放エネルギーは、付近の二次構造の分解、又は標的配列と二次構造を形成する遠位配列の関与を含め、標的位置でＲＮＡ二次構造を分解する（すなわち、開放する／アクセス可能にする）のに必要なエネルギーを反映する熱力学的基準である。
したがって、本開示は、１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満（例えば、１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、９ｋｃａｌ／ｍｏｌ、８ｋｃａｌ／ｍｏｌ、７ｋｃａｌ／ｍｏｌ、６ｋｃａｌ／ｍｏｌ、５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、又は１ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満）である総開放エネルギーを有するＡＳＯ配列（例えば、本明細書に開示されるＡＳＯ配列）を企図する。特定の例において、本開示のＡＳＯ配列は、９ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満（例えば、８ｋｃａｌ／ｍｏｌ、７ｋｃａｌ／ｍｏｌ、６ｋｃａｌ／ｍｏｌ、５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、又は１ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、又はそれより小さい）である総開放エネルギーを有する。別の例において、本開示のＡＳＯ配列は、８ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満（例えば、７ｋｃａｌ／ｍｏｌ、６ｋｃａｌ／ｍｏｌ、５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、又は１ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、又はそれより小さい）である総開放エネルギーを有する。別の例において、本開示のＡＳＯ配列は、７ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満（例えば、６ｋｃａｌ／ｍｏｌ、５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、又は１ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、又はそれより小さい）である総開放エネルギーを有する。別の例において、本開示のＡＳＯ配列は、６ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満（例えば、５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、又は１ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、又はそれより小さい）である総開放エネルギーを有する。別の例において、本開示のＡＳＯ配列は、５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満（例えば、４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、又は１ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、又はそれより小さい）である総開放エネルギーを有する。別の例において、本開示のＡＳＯ配列は、４ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満（例えば、３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、又は１ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、又はそれより小さい）である総開放エネルギーを有する。別の例において、本開示のＡＳＯ配列は、３ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満（例えば、２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、又は１ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、又はそれより小さい）である総開放エネルギーを有する。別の例において、本開示のＡＳＯ配列は、２ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満（例えば、１ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、又はそれより小さい）である総開放エネルギーを有する。別の例において、本開示のＡＳＯ配列は、１ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満である総開放エネルギーを有する。
更に、－４１ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい（例えば、－４０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－３８ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－３５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きな、又はそれより大きい）二本鎖形成の／からのエネルギーを有するＡＳＯ配列が本明細書に開示される。他の例において、本開示のＡＳＯ配列は、－３８ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい（例えば、－３５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１ｋｃａｌ／ｍｏｌ、又はそれより大きい）二本鎖形成からのエネルギーを有する。いくつかの例において、本開示のＡＳＯ配列は、－３５ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい（例えば、－３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きな、又はそれより大きい）二本鎖形成からのエネルギーを有する。特定の例において、本開示のＡＳＯ配列は、－３０ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい（例えば、－２５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きな、又はそれより大きい）二本鎖形成からのエネルギーを有する。別の例において、本開示のＡＳＯ配列は、－２５ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい（例えば、－２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１ｋｃａｌ／ｍｏｌ、又はそれより大きい）二本鎖形成からのエネルギーを有する。別の例において、本開示のＡＳＯ配列は、－２０ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい（例えば、－１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きな、又はそれより大きい）二本鎖形成からのエネルギーを有する。別の例において、本開示のＡＳＯ配列は、－１５ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい（例えば、－１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きな、又はそれより大きい）二本鎖形成からのエネルギーを有する。別の例において、本開示のＡＳＯ配列は、－１０ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい（例えば、－５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１ｋｃａｌ／ｍｏｌ、又はそれより大きい）二本鎖形成からのエネルギーを有する。別の例において、本開示のＡＳＯ配列は、－５ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい（例えば、－４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きな、又はそれより大きい）二本鎖形成からのエネルギーを有する。別の例において、本開示のＡＳＯ配列は、－４ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい（例えば、－３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きな、又はそれより大きい）二本鎖形成からのエネルギーを有する。別の例において、本開示のＡＳＯ配列は、－３ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい（例えば、－３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１ｋｃａｌ／ｍｏｌ、又はそれより大きい）二本鎖形成からのエネルギーを有する。別の例において、本開示のＡＳＯ配列は、－２ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい（例えば、－２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きな、又はそれより大きい）二本鎖形成からのエネルギーを有する。別の例において、本開示のＡＳＯ配列は、－１ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい二本鎖形成からのエネルギーを有する。
これに加えて、本開示は更に、－３０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい（例えば、－２７ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きな、又はそれより大きい）総結合自由エネルギーを有するＡＳＯ配列に関する。いくつかの例において、本開示のＡＳＯ配列は、－２７ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい（例えば、－２４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きな、又はそれより大きい）総結合自由エネルギーを有する。なお別の例において、本開示のＡＳＯ配列は、－２４ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい（例えば、－２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きな、又はそれより大きい）総結合自由エネルギーを有する。別の例において、本開示のＡＳＯ配列は、－２０ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい（例えば、－１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きな、又はそれより大きい）総結合自由エネルギーを有する。別の例において、本開示のＡＳＯ配列は、－１５ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい（例えば、－１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きな、又はそれより大きい）総結合自由エネルギーを有する。別の例において、本開示のＡＳＯ配列は、－１０ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい（例えば、－５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きな、又はそれより大きい）総結合自由エネルギーを有する。別の例において、本開示のＡＳＯ配列は、－５ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい（例えば、－４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きな、又はそれより大きい）総結合自由エネルギーを有する。別の例において、本開示のＡＳＯ配列は、－４ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい（例えば、－３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きな、又はそれより大きい）総結合自由エネルギーを有する。別の例において、本開示のＡＳＯ配列は、－３ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい（例えば、－３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きな、又はそれより大きい）総結合自由エネルギーを有する。別の例において、本開示のＡＳＯ配列は、－２ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい（例えば、－２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きな、又はそれより大きい）総結合自由エネルギーを有する。別の例において、本開示のＡＳＯ配列は、－１ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい総結合自由エネルギーを有する。
更に、本開示はまた、６０％未満である（例えば、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満、又はそれより小さい）ＧＣ含有量を有するＡＳＯ配列を企図する。他の例において、ＡＳＯ配列は、５５％未満である（例えば、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満、又はそれより小さい）ＧＣ含有量を有する。なお他の例において、ＡＳＯ配列は、５０％未満である（例えば、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満、又はそれより小さい）ＧＣ含有量を有する。特定の例において、ＡＳＯ配列は、４５％未満である（例えば、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満、又はそれより小さい）ＧＣ含有量を有する。別の例において、ＡＳＯ配列は、４０％未満である（例えば、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満、又はそれより小さい）ＧＣ含有量を有する。別の例において、ＡＳＯ配列は、３５％未満である（例えば、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満、又はそれより小さい）ＧＣ含有量を有する。別の例において、ＡＳＯ配列は、３０％未満である（例えば、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満、又はそれより小さい）ＧＣ含有量を有する。別の例において、ＡＳＯ配列は、３５％未満である（例えば、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満、又はそれより小さい）ＧＣ含有量を有する。別の例において、ＡＳＯ配列は、２５％未満である（例えば、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満、又はそれより小さい）ＧＣ含有量を有する。別の例において、ＡＳＯ配列は、２０％未満である（例えば、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満、又はそれより小さい）ＧＣ含有量を有する。別の例において、ＡＳＯ配列は、１５％未満である（例えば、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満、又はそれより小さい）ＧＣ含有量を有する。別の例において、ＡＳＯ配列は、１０％未満である（例えば、５％、４％、３％、２％、１％未満、又はそれより小さい）ＧＣ含有量を有する。別の例において、ＡＳＯ配列は、５％未満である（例えば、４％、３％、２％、１％未満、又はそれより小さい）ＧＣ含有量を有する。別の例において、ＡＳＯ配列は、４％未満である（例えば、３％、２％、１％未満、又はそれより小さい）ＧＣ含有量を有する。別の例において、ＡＳＯ配列は、３％未満である（例えば、２％、１％未満、又はそれより小さい）ＧＣ含有量を有する。別の例において、ＡＳＯ配列は、２％未満である（例えば、１％未満、又はそれより小さい）ＧＣ含有量を有する。別の例において、ＡＳＯ配列は、１％未満であるＧＣ含有量を有する。
生体分子、例えば、ＲＮＡ分子（例えば、本開示のＡＳＯ ＲＮＡ分子、又はその実質的に相補的な配列）の熱力学的特徴を決定するための方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６：Ｗ７０－４，２００８）は、ＲＮＡ配列の設計、並びにＲＮＡ分子の折り畳み及び熱力学的特徴の分析に使用することができるツールの集合をまとめたものである。Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．の開示は、ＲＮＡ分子の熱力学的特性を決定する方法に関連する場合に参照により本明細書に組み込まれる。
Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ二次構造
ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む一本鎖低分子ＲＮＡ（ｓｍＲＮＡ）と、ｓｍＲＮＡ（例えば、ＡＳＯ、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ、又はｓｈｍｉＲＮＡ）に対して相補的なｍＲＮＡを切断することができるエンドヌクレアーゼ的に活性なアルゴノートタンパク質で構成されるリボ核タンパク質粒子である（Ｐｒａｔｔ ＡＪ，ＭａｃＲａｅ ＩＪ． Ｔｈｅ ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ：ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｇｅｎｅ－ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｍａｃｈｉｎｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．；２８４（２７）：１７８９７－１７９０１，２００９、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ＲＩＳＣローディングは、ｍＲＮＡのノックダウン度を管理する種々の因子によって影響を受けることが示されている。標的ｍＲＮＡのヌクレオチド配列及びアンチセンス配列は、不十分なＲＩＳＣローディング、二本鎖の巻き戻し、及び特異性の低下に寄与し得る。標的部位二次構造は、ｓｍＲＮＡ相補性とは無関係に、ＲＩＳＣ－標的アニーリングに影響を及ぼし得る。理論によって束縛されないが、低い塩基対形成確率及び／又は高い位置エントロピーを有すると判明しているＧｒｉｋ２転写産物の特定の標的部位二次構造（図１Ａ及び図１Ｂのスケールで強度を高めつつ陰影が付けられている、実施例１も参照されたい）は、ガイド（例えば、アンチセンス配列）設計について特定され、優先される。これらの領域は、明確に描写されたループ領域（「セントロイドループ」、又は単に「ループ」）と、ステム様（「対形成していない」）領域として示される領域と、を含んでおり、各々が、二次Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ構造内で塩基対形成の低い確率を有する。優先度は、１つ以上の種において（最小限でもヒト、いくつかの場合において、少なくとももう１つの種のＧｒｉｋ２転写産物、例えば、マウス又はサルにおいて）、低い塩基対形成確率及び／又は高い位置エントロピーを有すると予測された領域に与えられた。実際に、予測二次Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ構造の多くのループ及びステム様非対形成領域（表４及び図１Ｂ）は、ＲＮＡｕｐ又は等価な計算によって決定されるように、種々のｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡガイドとの対形成配置において好ましい、低いエネルギー要求、例えば、１０未満、更には７．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満の標的開放エネルギーを示す好ましい領域を含有する（実施例１Ｂ、表１２、及び表１３を参照されたい）。
そのように、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの二次構造部分又は領域内のＧｒｉｋ２標的核酸、例えば、ループ及び非対形成領域は、本開示のＡＳＯ剤（例えば、配列番号１～１０８のうちのいずれか１つ）にハイブリダイズすると、Ｇｒｉｋ２の発現を減少させることができると特定されており、本発明の実施形態である。Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ内の例示的な二次構造領域について、表４及び図１Ｂを参照されたい。
したがって、開示されるＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ内の二次構造（例えば、ループ又は非対形成二次構造）に結合し得る。例えば、ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの二次構造内のループ領域、例えば、配列番号１１５のヌクレオチド位置４９４～５２４、又は配列番号１１６のヌクレオチド位置２０１～２３１に位置するループ１領域に結合し得る。ループ１領域は、表４に示されるように、配列番号１４５の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号１４５の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。したがって、開示されるＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ１領域の少なくとも一部内で結合し得る。例えば、配列番号１１５又は１１６のループ１領域（配列番号１４５）の一部又は領域内の核酸配列を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯ剤は、ｓｉＲＮＡ Ｇ０（配列番号１）、又はｓｉＲＮＡ Ｇ０（配列番号１）の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
別の場合において、ＡＳＯ剤は、配列番号１１５のヌクレオチド位置１０９８～１１２４、又は配列番号１１６の位置８０５～８３１に位置するループ２領域に結合し得る。ループ２領域は、表４に示されるように、配列番号１４６の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号１４６の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。したがって、開示されるＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ２領域の少なくとも一部内で結合し得る。例えば、配列番号１１５又は１１６のループ２領域（配列番号１４６）の一部又は領域内の核酸配列を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯ剤は、ｓｉＲＮＡ ＴＴ（配列番号４）、又はｓｉＲＮＡ ＴＴ（配列番号４）の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
ＡＳＯ剤はまた、配列番号１１５のヌクレオチド位置１１９７～１２３７、又は配列番号１１６の位置９０４～９４４に位置するループ３領域に結合するものであり得る。ループ３領域は、表４に示されるように、配列番号１４７の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号１４７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。したがって、開示されるＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ３領域の少なくとも一部内で結合し得る。例えば、配列番号１１５又は１１６のループ３領域（配列番号１４７）の一部又は領域内の核酸配列を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯ剤は、ｓｉＲＮＡ Ｇ１（配列番号５）若しくはｓｉＲＮＡ Ｇ２（配列番号６）、又はｓｉＲＮＡ Ｇ１（配列番号５）若しくはｓｉＲＮＡ Ｇ２（配列番号６）の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
追加の例において、ＡＳＯ剤は、配列番号１１５のヌクレオチド位置１５４３～１５６９、又は配列番号１１６の位置１２５０～１２７６に位置するループ４領域に結合するものであり得る。ループ４領域は、表４に示されるように、配列番号１４８の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号１４８の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。したがって、開示されるＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ４領域の少なくとも一部内で結合し得る。
ＡＳＯ剤はまた、配列番号１１５のヌクレオチド位置１６６７～１７３１、又は配列番号１１６の位置１３７４～１４３８に位置するループ５領域に結合するものであり得る。ループ５領域は、表４に示されるように、配列番号１４９の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号１４９の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。したがって、開示されるＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ５領域の少なくとも一部内で結合し得る。例えば、配列番号１１５又は１１６のループ５領域（配列番号１４９）の一部又は領域内の核酸配列を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯ剤は、ｓｉＲＮＡ ＧＤ（配列番号７）若しくはｓｉＲＮＡ ＭＵ（配列番号９６）、又はｓｉＲＮＡ ＧＤ（配列番号７）若しくはｓｉＲＮＡ ＭＵ（配列番号９６）の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
追加の例において、ＡＳＯ剤は、配列番号１１５のヌクレオチド位置１７６７～１８３０、又は配列番号１１６の位置１４７４～１５３７に位置するループ６領域に結合するものであり得る。ループ６領域は、表４に示されるように、配列番号１５０の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号１５０の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。したがって、開示されるＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ６領域の少なくとも一部内で結合し得る。例えば、配列番号１１５又は１１６のループ６領域（配列番号１５０）の一部又は領域内の核酸配列を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯ剤は、ｓｉＲＮＡ Ｇ３（配列番号８）、ｓｉＲＮＡ ＭＳ（配列番号９９）、若しくはｓｉＲＮＡ ＭＴ（配列番号９８）、又はｓｉＲＮＡ Ｇ３（配列番号８）、ｓｉＲＮＡ ＭＳ（配列番号９９）、若しくはｓｉＲＮＡ ＭＴ（配列番号９８）の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
ＡＳＯ剤はまた、配列番号１１５のヌクレオチド位置２６９３～２７１６、又は配列番号１１６の位置２４００～２４２３に位置するループ７領域に結合するものであり得る。ループ７領域は、表４に示されるように、配列番号１５１の核酸配列、又は配列番号１５１の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。したがって、開示されるＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ７領域の少なくとも一部内で結合し得る。
ＡＳＯ剤はまた、配列番号１１５のヌクレオチド位置２９１６～２９５５、又は配列番号１１６の位置２６２３～２６６２に位置するループ８領域に結合するものであり得る。ループ８領域は、表４に示されるように、配列番号１５２の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号１５２の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。したがって、開示されるＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ８領域の少なくとも一部内で結合し得る。例えば、配列番号１１５又は１１６のループ８領域（配列番号１５２）の一部又は領域内の核酸配列を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯ剤は、ｓｉＲＮＡ Ｇ４（配列番号９）、又はｓｉＲＮＡ Ｇ４（配列番号９）の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
これに加えて、ＡＳＯ剤は、配列番号１１５のヌクレオチド位置３０６５～３０９１に位置するループ９領域に結合するものであり得る。ループ９領域は、表４に示されるように、配列番号１５３の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号１５３の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。したがって、開示されるＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ９領域の少なくとも一部内で結合し得る。例えば、配列番号１１５又は１１６のループ９領域（配列番号１５３）の一部又は領域内の核酸配列を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯ剤は、ｓｉＲＮＡ ＹＡ（配列番号６３）、又はｓｉＲＮＡ ＹＡ（配列番号６３）の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
更に、ＡＳＯ剤は、配列番号１１５のヌクレオチド位置３１４１～３１６３に位置するループ１０領域に結合するものであり得る。ループ１０領域は、表４に示されるように、配列番号１５４の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号１５４の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。したがって、開示されるＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ１０領域の少なくとも一部内で結合し得る。
更なる例において、ＡＳＯ剤は、配列番号１１５のヌクレオチド位置３３８２～３４１３に位置するループ１１領域に結合するものであり得る。ループ１１領域は、表４に示されるように、配列番号１５５の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号１５５の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。したがって、開示されるＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ１１領域の少なくとも一部内で結合し得る。例えば、配列番号１１５又は１１６のループ１１領域（配列番号１５５）の一部又は領域内の核酸配列を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯ剤は、ｓｉＲＮＡ ＴＳ（配列番号１０）、又はｓｉＲＮＡ ＴＳ（配列番号１０）の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
ＡＳＯ剤はまた、配列番号１１５のヌクレオチド位置３７８８～３８５６に位置するループ１２領域に結合するものであり得る。ループ１２領域は、表４に示されるように、配列番号１５６の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号１５６の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。したがって、開示されるＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ１２領域の少なくとも一部内で結合し得る。例えば、配列番号１１５又は１１６のループ２領域（配列番号１５６）の一部又は領域内の核酸配列を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯ剤は、ｓｉＲＮＡ ＴＲ（配列番号１１）、又はｓｉＲＮＡ ＴＲ（配列番号１１）の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
ＡＳＯ剤は、配列番号１１５のヌクレオチド位置４５５０～４５９２に位置するループ１３領域に結合するものであり得る。ループ１３領域は、表４に示されるように、配列番号１５７の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号１５７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。したがって、開示されるＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ１３領域の少なくとも一部内で結合し得る。
更なる例において、ＡＳＯ剤は、配列番号１１５のヌクレオチド位置４３６３～４３８６に位置するループ１４領域に結合するものであり得る。ループ１４領域は、表４に示されるように、配列番号１５８の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号１５８の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。したがって、開示されるＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ１４領域の少なくとも一部内で結合し得る。
代替的に、開示されるＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの二次構造内の非対形成領域、例えば、配列番号１１５のヌクレオチド位置２２０９～２２８７、又は配列番号１１６の位置１９１６～１９９４に位置する非対形成領域１に結合するものであり得る。非対形成領域１は、表４に示されるように、配列番号１５９の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号１５９の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。したがって、本開示のＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの非対形成領域１の少なくとも一部内で結合し得る。例えば、配列番号１１５又は１１６の非対形成領域１（配列番号１５９）の一部又は領域内の核酸配列を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯ剤は、ｓｉＲＮＡ ＴＰ（配列番号１３）、ｓｉＲＮＡ ＴＯ（配列番号１４）、ｓｉＲＮＡ ＭＲ（配列番号７２）、若しくはｓｉＲＮＡ ＭＱ（配列番号７３）、又はｓｉＲＮＡ ＴＰ（配列番号１３）、ｓｉＲＮＡ ＴＯ（配列番号１４）、ｓｉＲＮＡ ＭＲ（配列番号７２）、若しくはｓｉＲＮＡ ＭＱ（配列番号７３）の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
更なる例において、ＡＳＯ剤は、配列番号１１５のヌクレオチド位置２３５５～２３９１、又は配列番号１１６の位置２０６２～２０９８に位置する非対形成領域２に結合するものであり得る。非対形成領域２は、表４に示されるように、配列番号１６０の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号１６０の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。したがって、開示されるＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの非対形成領域２の少なくとも一部内で結合し得る。
追加の例として、ＡＳＯ剤は、配列番号１１５のヌクレオチド位置３３２４～３３６８に位置する非対形成領域３に結合するものであり得る。非対形成領域３は、表４に示されるように、配列番号１６１の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号１６１の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。したがって、本開示のＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの非対形成領域３の少なくとも一部内で結合し得る。例えば、配列番号１１５又は１１６の非対形成領域３（配列番号１６１）の一部又は領域内の核酸配列を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯ剤は、ｓｉＲＮＡ Ｇ５（配列番号１５）、又はｓｉＲＮＡ Ｇ５（配列番号１５）の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
本開示のＡＳＯ剤はまた、配列番号１１５のヌクレオチド位置３５８７～３６３９に位置する非対形成領域４に結合するものであり得る。非対形成領域４は、表４に示されるように、配列番号１６２の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号１６２の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの非対形成領域４の少なくとも一部内で結合し得る。例えば、配列番号１１５又は１１６の非対形成領域４（配列番号１６２）の一部又は領域内の核酸配列を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯ剤は、ｓｉＲＮＡ ＴＮ（配列番号１６）、又はｓｉＲＮＡ ＴＮ（配列番号１６）の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
更に、ＡＳＯ剤は、配列番号１１５のヌクレオチド位置３６８６～３７１３に位置する非対形成領域５に結合するものであり得る。非対形成領域５は、表４に示されるように、配列番号１６３の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号１６３の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。ＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの非対形成領域５の少なくとも一部内で結合し得る。例えば、配列番号１１５又は１１６の非対形成領域５（配列番号１６３）の一部又は領域内の核酸配列を標的化するＧｒｉｋ２ ＡＳＯ剤は、ｓｉＲＮＡ ＴＭ（配列番号１７）、又はｓｉＲＮＡ ＴＭ（配列番号１７）の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
本開示のＡＳＯ剤はまた、配列番号５８２～６８１（表２を参照されたい）から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（例えば、配列番号１１５）の領域のうちのいずれか１つ、又は配列番号１６４～５８１に記載されるヌクレオチド配列によってコードされるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡの領域のうちのいずれか１つに対して完全又は実質的に相補性で結合し得る。例えば、本開示のＡＳＯ剤は、配列番号５８２～６８１から選択されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（例えば、配列番号１１５）の領域のうちのいずれか１つ、又は配列番号５８２～６８１のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントに結合するものであり得る。別の例において、本開示のＡＳＯ剤は、配列番号５８２～６８１から選択されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（例えば、配列番号１１５）の領域のうちのいずれか１つ、又は配列番号５８２～６８１のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントに結合するものであり得る。別の例において、本開示のＡＳＯ剤は、配列番号５８２～６８１から選択されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（例えば、配列番号１１５）の領域のうちのいずれか１つ、又は配列番号５８２～６８１のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントに結合するものであり得る。別の例において、本開示のＡＳＯ剤は、配列番号５８２～６８１から選択されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（例えば、配列番号１１５）の領域のうちのいずれか１つに結合するものであり得る。別の例において、本開示のＡＳＯ剤は、配列番号１６４～５８１から選択されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（例えば、配列番号１１５）の領域のうちのいずれか１つ、又は配列番号１６４～５８１のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントに結合するものであり得る。別の例において、本開示のＡＳＯ剤は、配列番号１６４～５８１から選択されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（例えば、配列番号１１５）の領域のうちのいずれか１つ、又は配列番号１６４～５８１のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントに結合するものであり得る。別の例において、本開示のＡＳＯ剤は、配列番号１６４～５８１から選択されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（例えば、配列番号１１５）の領域のうちのいずれか１つ、又は配列番号１６４～５８１のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントに結合するものであり得る。別の例において、本開示のＡＳＯ剤は、配列番号１６４～５８１から選択されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（例えば、配列番号１１５）の領域のうちのいずれか１つに結合するものであり得る。
修飾オリゴヌクレオチド
本明細書に開示されるＡＳＯ剤は、天然に存在するヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドを含有し得る。オリゴヌクレオチドは、インビボでの安定性及び／又は療法有効性を増加させるために、修飾されてもよく、特に、化学修飾されてもよい。本開示のＡＳＯ剤の有効性を改善する修飾、例えば、安定化する修飾、及び／又は標的転写産物の分解を回避するためにＲＮａｓｅ Ｈ活性化を減少させる修飾は、当該技術分野で知られている（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ ａｎｄ Ｓｗａｙｚｅ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．５０：２５９－２９３，２０１０、及びＪｕｌｉａｎｏ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９；４４（１４）：６５１８－４８，２０１６を参照されたい）。特に、本開示の文脈で使用されるオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含み得る。化学修飾は、（ｉ）リン酸基で、（ｉｉ）糖部分上で、及び／又は（ｉｉｉ）オリゴヌクレオチドの全骨格構造上での３つの異なる部位で行われ得る。典型的には、化学修飾は、骨格修飾、ヘテロ環修飾、糖修飾、及びコンジュゲート化戦略を含む。
例えば、オリゴヌクレオチドは、オリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、低分子調節ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）、Ｕ７媒介性若しくはＵ１媒介性のＡＳＯ、若しくはそのコンジュゲート産物、例えば、ペプチドコンジュゲート化若しくはナノ粒子複合体化ＡＳＯ、骨格修飾によって化学修飾されたオリゴヌクレオチド、例えば、モルホリノ、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ホスホロジアミデートモルホリノ、ＰＭＯ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）オリゴヌクレオチド、立体化学的に純粋なホスホロチオエート（ＰＳ）オリゴヌクレオチド、ホスホロアミデート修飾されたオリゴヌクレオチド、チオホスホロアミデート修飾されたオリゴヌクレオチド、及びメチルホスホネート修飾されたオリゴヌクレオチド；ヘテロ環修飾によって化学修飾されたオリゴヌクレオチド、例えば、二環修飾されたオリゴヌクレオチド、二環核酸（ＢＮＡ）、三環修飾されたオリゴヌクレオチド、トリシクロ－ＤＮＡ－アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、核酸塩基修飾、例えば、ピリミジン核酸塩基上の５－メチル置換、５－置換ピリミジン類似体、２－チオ－チミン修飾されたオリゴヌクレオチド、及びプリン修飾されたオリゴヌクレオチド；糖部分によって化学修飾されたオリゴヌクレオチド、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチド、２’，４’－メチレンオキシ架橋核酸（ＢＮＡ）、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、拘束されたエチル（ｃＥｔ）オリゴヌクレオチド、２’－修飾されたＲＮＡ、２’－及び４’－修飾されたオリゴヌクレオチド、例えば、２’－Ｏ－Ｍｅ ＲＮＡ（２’－ＯＭｅ）、２’－Ｏ－メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－フルオロＲＮＡ（ＦＲＮＡ）、及び４’－チオ－修飾されたＤＮＡ及びＲＮＡ；コンジュゲート化戦略によって化学修飾されたオリゴヌクレオチド、例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）オリゴヌクレオチドコンジュゲート、例えば、５’－ＧａｌＮＡｃ及び３’－ＧａｌＮＡｃ ＡＳＯコンジュゲート、脂質オリゴヌクレオチドコンジュゲート、細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）オリゴヌクレオチドコンジュゲート、標的化オリゴヌクレオチドコンジュゲート、抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲート、ポリマー－オリゴヌクレオチドコンジュゲート、例えば、ＰＥＧ化及び標的リガンドを伴うもの；並びに例えば、Ｂｅｎｎｅｔｔ ａｎｄ Ｓｗａｙｚｅ，２０１０（前出）、Ｗａｎ ａｎｄ Ｓｅｔｈ，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．５９（２１）：９６４５－９６６７， ２０１１６）、Ｊｕｌｉａｎｏ，２０１６（前出）、Ｌｕｎｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２６（８）：４７５－４８５，２０１５）、及びＰｒａｋａｓｈ，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓ．８（９）：１６１６－１６４１，２０１１）に記載される化学修飾及びコンジュゲート戦略からなる群から選択され得る。実際に、インビボで使用するために、オリゴヌクレオチドを安定化してもよい。「安定化された」オリゴヌクレオチドは、インビボでの分解（例えば、エクソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼ）に比較的抵抗性であるオリゴヌクレオチドを指す。安定化は、長さ又は二次構造の関数であり得る。特に、オリゴヌクレオチド安定化は、リン酸骨格修飾、ホスホジエステル修飾、ホスホロチオエート（ＰＳ）骨格修飾、ホスホジエステル修飾とホスホロチオエート修飾の組み合わせ、チオホスホロアミデート修飾、２’修飾（２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）修飾、及び２’－フルオロ修飾）、メチルホスホネート、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ｐ－エトキシ、及びこれらの組み合わせによって達成することができる。
例えば、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート誘導体（非架橋ホスホリル酸素原子の硫黄原子による置き換え）として使用されてもよく、これによりヌクレアーゼ消化に対する抵抗性が増加する。２’－メトキシエチル（ＭＯＥ）修飾（例えば、ＩＯＮＩＳ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによって上市されている修飾骨格）も有効である。これに追加して、又は代替的に、本開示のオリゴヌクレオチドは、糖の２’位に置換を有する誘導体である、完全に、部分的に、又は組み合わせた状態で修飾されたヌクレオチド、特に、以下の化学修飾を有するものが含まれ得る。Ｏ－メチル基（２’－Ｏ－Ｍｅ）置換、２－メトキシエチル基（２’－Ｏ－ＭＯＥ）置換、フルオロ基（２’－フルオロ）置換、クロロ基（２’－Ｃｌ）置換、ブロモ基（２’－Ｂｒ）置換、シアニド基（２’－ＣＮ）置換、トリフルオロメチル基（２’－ＣＦ３）置換、ＯＣＦ３基（２’－ＯＣＦ３）置換、ＯＣＮ基（２’－ＯＣＮ）置換、Ｏ－アルキル基（２’－Ｏ－アルキル）置換、Ｓ－アルキル基（２’－Ｓ－アルキル）置換、Ｎ－アルキル基（２’－Ｎ－アルキル）置換、Ｏ－アルケニル基（２’－Ｏ－アルケニル）置換、Ｓ－アルケニル基（２’－Ｓ－アルケニル）置換、Ｎ－アルケニル基（２’－Ｎ－アルケニル）置換、ＳＯＣＨ３基（２’－ＳＯＣＨ３）置換、ＳＯ２ＣＨ３基（２’－ＳＯ２ＣＨ３）置換、ＯＮＯ２基（２’－ＯＮＯ２）置換、ＮＯ２基（２’－ＮＯ２）置換、Ｎ３基（２’－Ｎ３）置換、及び／又はＮＨ２基（２’－ＮＨ２）置換。これに追加して、又は代替的に、本開示のオリゴヌクレオチドは、完全又は部分的に修飾されたヌクレオチドを含んでいてもよく、リボース部分を使用して、ロックド核酸（ＬＮＡ）を産生し、共有結合性架橋が、リボースの２’酸素と４’酸素との間に形成され、３’－ｅｎｄｏ構成に固定する。これらの分子は、生物学的媒体中できわめて安定であり、ＬＮＡが四肢（Ｇａｐｍｅｒ）に位置する場合等にはＲＮａｓｅ Ｈを活性化し、相補的なＲＮＡ及びＤＮＡと密なハイブリッドを形成することができる。
本開示の文脈で使用されるオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ、２’－ＯＭｅ類似体、２’－Ｏ－Ｍｅｔ、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）オリゴマー、２’－ホスホロチオエート類似体、２’－フルオロ類似体、２’－Ｃｌ類似体、２’－Ｂｒ類似体、２’－ＣＮ類似体、２’－ＣＦ３類似体、２’－ＯＣＦ３類似体、２’－ＯＣＮ類似体、２’－Ｏ－アルキル類似体、２’－Ｓ－アルキル類似体、２’－Ｎ－アルキル類似体、２’－Ｏ－アルケニル類似体、２’－Ｓ－アルケニル類似体、２’－Ｎ－アルケニル類似体、２’－ＳＯＣＨ３類似体、２’－ＳＯ２ＣＨ３類似体、２’－ＯＮＯ２類似体、２’－ＮＯ２類似体、２’－Ｎ３類似体、２’－ＮＨ２類似体、トリシクロ（ｔｃ）－ＤＮＡ、Ｕ７短核内（ｓｎ）ＲＮＡｓ、トリシクロ－ＤＮＡ－オリゴアンチセンス分子、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される修飾ヌクレオチドを含み得る（２００９年４月１０日に出願された、米国仮特許出願第６１／２１２，３８４号のＴｒｉｃｙｃｌｏ－ＤＮＡ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ、その完全な内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。
特に、本開示に係るオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡオリゴヌクレオチドであり得る。「ＬＮＡ」（ロックド核酸）（又は「ＬＮＡオリゴヌクレオチド」）という用語は、ＬＮＡヌクレオチド及びＬＮＡ類似体ヌクレオチドとも呼ばれる１つ以上の二環、三環、又は多環のヌクレオシド類似体を含有するオリゴヌクレオチドを指す。ＬＮＡオリゴヌクレオチド、ＬＮＡヌクレオチド、及びＬＮＡ類似体ヌクレオチドは、一般に、国際公開第ＷＯ９９／１４２２６号及びその後の出願、国際公開第ＷＯ００／５６７４６号、第ＷＯ００／５６７４８号、第ＷＯ００／６６６０４号、第ＷＯ０１／２５２４８号、第ＷＯ０２／２８８７５号、第ＷＯ０２／０９４２５０号、第ＷＯ０３／００６４７５号、米国特許第６，０４３，０６０号、第６２６８４９０号、第６７７０７４８号、第６６３９０５１号、及び米国公開第２００２／０１２５２４１号、第２００３／０１０５３０９号、第２００３／０１２５２４１号、第２００２／０１４７３３２号、第２００４／０２４４８４０号、及び第２００５／０２０３０４２号に記載され、これらは全て、参照により本明細書に組み込まれる。ＬＮＡオリゴヌクレオチド及びＬＮＡ類似体オリゴヌクレオチドは、例えば、Ｐｒｏｌｉｇｏ ＬＬＣ、６２００ Ｌｏｏｋｏｕｔ Ｒｏａｄ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ ８０３０１ ＵＳＡから市販されている。
本開示のオリゴヌクレオチドの他の形態は、限定されないが、レンチウイルス又はアデノ随伴ウイルスに基づくウイルス移入法と組み合わせた、Ｕ１又はＵ７等の核内低分子ＲＮＡに連結したオリゴヌクレオチド配列である（Ｄｅｎｔｉ，ＭＡ，ｅｔ ａｌ，２００８、Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ，Ａ，ｅｔ ａｌ，２００４）。
本開示のオリゴヌクレオチドの他の形態は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ペプチド核酸において、オリゴヌクレオチドのデオキシリボース骨格は、糖よりもペプチドに類似する骨格と置き換えられる。各サブユニット、又はモノマーは、この骨格に接続した、天然に存在する塩基、又は天然に存在しない塩基を有する。１つのそのような骨格は、アミド結合によって連結されたＮ－（２－アミノエチル）グリシンの反復単位で構築される。デオキシリボース骨格からのラジカルの偏りのため、これらの化合物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と命名された（Ｄｕｅｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｊ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，２１，１９－３１）。ＰＮＡは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方に結合し、ＰＮＡ／ＤＮＡ又はＰＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を形成する。得られたＰＮＡ／ＤＮＡ又はＰＮＡ／ＲＮＡ二本鎖は、Ｔｍによって決定されるように、対応するＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖よりも大きな親和性で結合する。この高い熱安定性は、ＰＮＡ中の中性骨格に起因する、電荷反発の欠如に起因し得る。ＰＮＡの中性骨格はまた、ＰＮＡ／ＤＮＡ（ＲＮＡ）二本鎖のＴｍを、塩濃度とは実際に無関係なものにする。したがって、ＰＮＡ／ＤＮＡ（ＲＮＡ）二本鎖の相互作用は、イオン強度に非常に依存するＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖の相互作用よりも、更なる利点を与える。ホモピリミジンＰＮＡは、アンチパラレル配向で相補的なＤＮＡ又はＲＮＡに結合し、高い熱安定性を有する（ＰＮＡ）２／ＤＮＡ（ＲＮＡ）三本鎖を形成することが示されている（例えば、Ｅｇｈｏｌｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７、Ｅｇｈｏｌｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９２，１１４，１８９５、Ｅｇｈｏｌｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９２，１１４，９６７７を参照されたい）。親和性の増加に加えて、ＰＮＡはまた、増加した特異性でＤＮＡ又はＲＮＡに結合することが示されている。ＰＮＡ／ＤＮＡ二本鎖ミスマッチが、ＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖に対して溶融する場合、Ｔｍの８～２０℃の低下がみられる。この大きさのＴｍの低下は、ミスマッチが存在する対応するＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖ではみられない。ＤＮＡ又はＲＮＡ鎖に対するＰＮＡ鎖の結合は、２つの配向のうちの１つで起こり得る。その配向は、ＰＮＡのカルボキシル末端が、ＤＮＡ又はＲＮＡの５’末端の方を向いており、ＰＮＡのアミノ末端が、ＤＮＡ又はＲＮＡの３’末端の方を向いているように、５’から３’への配向においてＤＮＡ又はＲＮＡ鎖が相補的なＰＮＡ鎖に結合する場合、アンチパラレルと言われる。パラレル配向において、ＰＮＡのカルボキシル末端及びアミノ末端が、ＤＮＡ又はＲＮＡの５’－３’方向に対してちょうど逆である。オリゴヌクレオチドと比較したＰＮＡの更なる利点は、そのポリアミド骨格（適切な核酸塩基を有するか、又はそれに接続した他の側鎖基を有する）が、ヌクレアーゼ又はプロテアーゼのいずれかによって認識されず、切断されないことである。結果として、ＰＮＡは、核酸及びペプチドとは異なり、酵素による分解に対して抵抗性である。ＷＯ９２／２０７０２は、対応するＤＮＡよりも、相補的なＤＮＡ及びＲＮＡにより密に結合するペプチド核酸（ＰＮＡ）化合物を記載する。ＰＮＡは、相補的なＤＮＡに対して強い結合親和性及び特異性を示している（Ｅｇｈｏｌｍ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９３，８００、Ｅｇｈｏｌｍ，Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６５，５６６、及びＮｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．，ｅｔ．ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９３，２１，１９７）。更に、ＰＮＡは、細胞抽出物において、ヌクレアーゼ抵抗性及び安定性を示す（Ｄｅｍｉｄｏｖ，Ｖ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９４，４８，１３０９－１３１３）。ＰＮＡの修飾としては、伸長された骨格（Ｈｙｒｕｐ，Ｂ．，ｅｔ．ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９３，５１８）、骨格と核酸塩基との間の伸長されたリンカー、アミダ（ａｍｉｄａ）結合の反転（Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌ，Ｐ．Ｈ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４，１０８１）、及びアラニンに基づくキラル骨格の使用（Ｄｕｅｈｏｌｍ，Ｋ．Ｌ，ｅｔ．ａｌ．，ＢｉｏＭｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４，１０７７）が含まれる。ペプチド核酸は、米国特許第５，５３９，０８２号及び米国特許第５，５３９，０８３号に記載される。ペプチド核酸は、米国特許第５，７６６，８５５号に更に記載される。
本開示のオリゴヌクレオチド（例えば、ＡＳＯ剤）は、当該技術分野でよく知られている従来の方法によって得られ得る。例えば、本開示のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野でよく知られているいくつかの手順のうちのいずれかを使用して、デノボで合成され得る。例えば、ｂ－シアノエチルホスホロアミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８１）、ヌクレオシド Ｈ－ホスホネート法（Ｇａｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，１９８６、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６、Ｇａｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇａｆｆｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。これらの化学は、市場で利用可能な自動化された様々な核酸合成機によって行うことができる。これらの核酸は、合成核酸と呼ばれる場合がある。代替的に、オリゴヌクレオチドは、プラスミド中で大規模で産生され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）。オリゴヌクレオチドは、既知の技術、例えば、制限酵素、エクソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼを使用するものを使用して、既存の核酸配列から調製することができる。この方法で調製されたオリゴヌクレオチドは、単離された核酸と呼ばれ得る。
オリゴヌクレオチドの送達及び有効性を増強されるためのアプローチ及び修飾、例えば、オリゴヌクレオチドの化学修飾、脂質及びポリマー系のナノ粒子又はナノ担体、標的剤（例えば、オリゴヌクレオチド送達を改善する炭水化物、ペプチド、抗体、アプタマー、脂質又は低分子、及び低分子）に対してオリゴヌクレオチドを連結することによるリガンド－オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、例えば、Ｊｕｌｉａｎｏ（２０１６、前出）に記載されるように、当該技術分野でよく知られている。親油性コンジュゲート及び脂質コンジュゲートとしては、脂肪酸－オリゴヌクレオチドコンジュゲート、ステロール－オリゴヌクレオチドコンジュゲート、及びビタミン－オリゴヌクレオチドコンジュゲートが挙げられる。
本開示のオリゴヌクレオチドは、ＷＯ２０１４／１９５４３２に記載されるように、少なくとも３つの飽和若しくは不飽和、特に飽和、直鎖若しくは分枝鎖、特に直鎖の２～３０個の炭素原子、特に５～２０個の炭素原子、より特定的には１０～１８個の炭素原子を含む炭化水素鎖を含む部分によって、３’末端又は５’末端での置換によっても修飾されてもよい。
本開示のオリゴヌクレオチドは、ＷＯ２０１４／１９５４３０に記載されるように、少なくとも１個のケタール官能基を含む部分によって、３’末端又は５’末端での置換によって修飾されてもよく、上述のケタール官能基のケタール炭素は、２つの飽和若しくは不飽和、特に飽和、直鎖若しくは分枝鎖、特に直鎖の１～２２個の炭素原子、特に６～２０個の炭素原子、特に１０～１９個の炭素原子、更により特定的には１２～１８個の炭素原子を含む炭化水素鎖を保有する。
これに加えて、本開示のオリゴヌクレオチドは、第２の分子に対してコンジュゲート化され得る。典型的には、第２の分子は、アプタマー、抗体、又はポリペプチドからなる群から選択され得る。例えば、本開示のオリゴヌクレオチドは、細胞透過ペプチドに対してコンジュゲート化され得る。細胞透過ペプチドは、当該技術分野でよく知られており、例えば、ＴＡＴペプチドが挙げられる（例えば、Ｂｅｃｈａｒａ ａｎｄ Ｓａｇａｎ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５８７（１２）：１６９３－１７０２，２０１３を参照されたい）。
哺乳動物細胞へのオリゴヌクレオチド剤の送達
本開示のオリゴヌクレオチドはまた、当該技術分野で知られているポリマー、生分解性マイクロ粒子、又はマイクロカプセル送達デバイスを含む種々の膜分子集合体送達法を使用して送達され得る。例えば、コロイド分散系は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド剤の標的送達のために使用され得る。コロイド分散系としては、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油エマルションを含む脂質ベースの系、ミセル、混合ミセル、及びリポソームが挙げられる。リポソームは、インビトロ及びインビボで送達ビヒクルとして有用である人工膜小胞である。０．２～４．０μｍのサイズ範囲の大きな単層小胞（ＬＵＶ）が、大きな巨大分子を含有するかなりの割合の水性緩衝液を封入することができることが示されている。リポソームは、作用部位に活性成分を移入させ、送達するのに有用である。リポソーム膜は、生体膜と構造的に類似しているため、リポソームが組織に適用される場合、リポソーム二重層は、細胞膜の二重層と融合する。リポソーム及び細胞の併合が進むにつれて、オリゴヌクレオチドを含む内部の水性内容物を細胞に送達し、そこでオリゴヌクレオチドが標的ＲＮＡに特異的に結合することができ、ＲＮａｓｅ Ｈ媒介性遺伝子サイレンシングを媒介することができる。いくつかの場合において、リポソームはまた、特異的に標的とされ、例えば、特定の細胞型にオリゴヌクレオチドを向かわせる。リポソームの組成物は、通常、通常はステロイド（特にコレステロール）と組み合わせたリン脂質の組み合わせである。他のリン脂質又は他の脂質も使用され得る。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、及び二価カチオンの存在に依存して変わる。
オリゴヌクレオチドを含有するリポソームは、種々の方法によって調製することができる。一例において、リポソームの脂質構成要素は、ミセルが脂質構成要素とともに形成されるように、洗剤中に溶解される。例えば、脂質構成要素は、両親媒性カチオン性脂質又は脂質コンジュゲートであり得る。洗剤は、高い臨界ミセル濃度を有していてもよく、非イオン性であり得る。例示的な洗剤としては、コーレート（ｃｈｏｌａｔｅ）、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコーレート、及びラウロイルサルコシンが挙げられる。次いで、オリゴヌクレオチド調製物を、脂質構成要素を含むミセルに加える。脂質上のカチオン性基は、オリゴヌクレオチドと相互作用し、オリゴヌクレオチドの周囲に縮合してリポソームを形成する。縮合の後に、洗剤が、例えば、透析によって除去され、オリゴヌクレオチドのリポソーム調製物を得る。
必要な場合、縮合を補助する担体化合物は、例えば、制御された添加によって、縮合反応中に添加することができる。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマーであり得る（例えば、スペルミン又はスペルミジン）。縮合を好ましくするために、ｐＨも調節することができる。
送達ビヒクルの構造的構成要素としてポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体を組み込む、安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルを産生するための方法は、例えば、ＷＯ９６／３７１９４に更に記載されており、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。リポソーム製剤はまた、Ｆｅｉｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８：７４１３－７４１７、米国特許第４，８９７，３５５号、米国特許第５，１７１，６７８号、Ｂａｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，（１９６５）Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８、Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９７９）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５５７：９、Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：４１９４、Ｍａｙｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７２８：３３９、及びＦｕｋｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：７５７に記載される例示的な方法の１つ以上の態様を含み得る。送達ビヒクルとして使用するのに適したサイズの脂質凝集体を調製するための一般的に使用される技術としては、音波処理及び凍結解凍と抽出が挙げられる（例えば、Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８５８：１６１を参照されたい。一貫して小さく（５０～２００ｎｍ）、比較的均一な凝集体が望ましい場合、微小溶液操作を使用し得る（Ｍａｙｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９。これらの方法は、オリゴヌクレオチド調製物をリポソーム内にパッケージングするように容易に適合される。
リポソームは、２つの広いクラスに含まれる。カチオン性リポソームは、負に帯電した核酸分子と相互作用して安定な複合体を形成する、正に帯電したリポソームである。正に帯電した核酸／リポソーム複合体は、負に帯電した細胞表面に結合し、エンドソーム中に内在化される。エンドソーム内の酸性ｐＨに起因して、リポソームは破裂し、その内容物を細胞の細胞質内に放出する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４７：９８０－９８５）。
リポソームは、ｐＨ感受性であるか、又は負に帯電しており、その複合体よりも、核酸を捕捉する。核酸及び脂質は、両方とも同様に帯電しているため、複合体形成ではなく、反発が起こる。それにもかかわらず、いくつかの核酸は、これらのリポソームの水性内側の中に捕捉される。培養物中の細胞単層にチミジンキナーゼ遺伝子をコードする核酸を送達するために、ｐＨ感受性のリポソームが使用されてきた。外因性遺伝子の発現は、標的細胞において検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９：２６９－２７４）。
リポソーム組成物の１つの主な種類は、天然に由来するホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。天然のリポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）又はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成され得る。アニオン性リポソーム組成物は、一般に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、一方で、アニオン性融合性リポソームは、主に、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別の種類のリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、例えば、大豆ＰＣ及び卵ＰＣから形成される。別の種類は、リン脂質及び／又はホスファチジルコリン及び／又はコレステロールの混合物から形成される。
リポソームを細胞にインビトロ及びインビボで導入するための他の方法の例としては、米国特許第５，２８３，１８５号、米国特許第５，１７１，６７８号、ＷＯ９４／００５６９、ＷＯ９３／２４６４０、ＷＯ９１／１６０２４、Ｆｅｉｇｎｅｒ，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０、Ｎａｂｅｌ，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１３０７、Ｎａｂｅｌ，（１９９２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：６４９、Ｇｅｒｓｈｏｎ，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：７１４３、及びＳｔｒａｕｓｓ，（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１：４１７が挙げられる。
リポソームはまた、このような特定の脂質を欠くリポソームと比較して、増強された循環寿命を生じる１つ以上の特定の脂質を含み、立体的に安定化されたリポソームであり得る。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞を形成する脂質部分の一部が、（Ａ）１つ以上の糖脂質、例えば、モノシアガングリオシドＧＭ１を含むもの、又は（Ｂ）１つ以上の親水性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分で誘導体化されたものである。何らかの特定の理論によって束縛されることを望まないが、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、又はＰＥＧ誘導体化脂質を含有する、少なくとも立体的に安定化されたリポソームについて、これらの立体的に安定化されたリポソームの循環半減期の増強は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞への取り込みの減少に由来すると当該技術分野では考えられている（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２３：４２、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：３７６５）。
１つ以上の糖脂質を含む種々のリポソームが、当該技術分野で知られている。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，（１９８７），５０７：６４）は、モノシアガングリオシドＧＭ１、ガラクトセレブロシドサルフェート、及びホスファチジルイノシトールがリポソームの血液半減期を改善する能力を報告した。これらの所見は、Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，（１９８８），８５：６９４９）によって詳しく説明された。米国特許第４，８３７，０２８号及びＷＯ８８／０４９２４は、両方ともＡｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．に対するものであり、（１）スフィンゴミエリン及び（２）ガングリオシドＧＭ１、又はガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームを開示する。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂ ｅｔ ａｌ．）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示する。１，２－ｓｎ－ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、ＷＯ９７／１３４９９（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ）に開示される。
本開示によれば、カチオン性リポソームを薬物送達ビヒクルとして使用してもよい。カチオン性リポソームは、細胞膜に融合することができるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、血漿膜と効率的に融合することはできないが、インビボでマクロファージによって取り込まれ、これを使用して、オリゴヌクレオチドをマクロファージに送達することができる。
リポソームの更なる利点としては、以下のものが挙げられる。（ｉ）天然リン脂質から得られるリポソームは、生体適合性かつ生分解性であり、（ｉｉ）リポソームは、広範囲にわたる水及び脂質可溶性薬物を組み込むことができ、（ｉｉｉ）リポソームは、その内部のコンパートメント中に封入されたオリゴヌクレオチドを、代謝及び分解から保護することができる（Ｒｏｓｏｆｆ， ｉｎ ”Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，”Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（編集），１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な考慮事項は、脂質表面の電荷、小胞のサイズ、及びリポソームの水性体積である。
正に帯電した合成カチオン性脂質であるＮ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）を使用して、核酸と自然に相互作用する小さなリポソームを形成し、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合することができる脂質－核酸複合体を形成することができ、オリゴヌクレオチドの送達が起こる（例えば、Ｆｅｉｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８：７４１３－７４１７、及びＤＯＴＭＡ及びＤＮＡとのその使用の説明については米国特許第４，８９７，３５５号を参照されたい）。
ＤＯＴＭＡ類似体である１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３－（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）をリン脂質と組み合わせて使用して、ＤＮＡ複合体化小胞を形成することができる。ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）は、高度にアニオン性の核酸を、負に帯電したポリヌクレオチドと自然に相互作用して複合体を形成する正に帯電したＤＯＴＭＡリポソームを含む、生きている組織培養細胞に送達するのに有効な薬剤である。十分に正に帯電したリポソームが使用される場合、得られる複合体の正味の電荷も正である。この方法で調製された正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面と自然に接続し、血漿膜と融合し、機能的核酸を例えば組織培養細胞へと効率的に送達する。別の市販のカチオン性脂質である１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３，３－（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）は、オレオイル部分がエーテル連結ではなくエステルによって連結されているという点でＤＯＴＭＡとは異なる。
他の報告されているカチオン性脂質構成要素としては、例えば、２つの種類の脂質の１つにコンジュゲート化されているカルボキシスペルミンを含む、様々な部分にコンジュゲート化されたものが挙げられ、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミン（「ＤＯＧＳ」）（ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン ５－カルボキシスペルミル－アミド（「ＤＰＰＥＳ」）等の化合物を含む（例えば、米国特許第５，１７１，６７８号を参照されたい）。
別のカチオン性脂質コンジュゲートとしては、ＤＯＰＥと組み合わせてリポソーム内で製剤化された、コレステロールを用いた脂質の誘導体化（「ＤＣ－Ｃｈｏｌ」）が挙げられる（Ｇａｏ，Ｘ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：２８０を参照されたい）。ポリリジンをＤＯＰＥにコンジュゲート化することによって作製されるリポポリリジンは、血清存在下でのトランスフェクションにとって有効であると報告されている（Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６５：８）。特定の細胞株について、コンジュゲートカチオン性脂質を含有するこれらのリポソームは、ＤＯＴＭＡ含有組成物よりも低い毒性を示し、より効率的なトランスフェクションを提供すると言われる。他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥ及びＤＭＲＩＥ－ＨＰ（Ｖｉｃａｌ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）及びリポフェクタミン（ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に適した他のカチオン性脂質は、ＷＯ９８／３９３５９及びＷＯ９６／３７１９４に記載される。
リポソームの標的化はまた、例えば、器官特異性、細胞特異性、及びオルガネラ特異性に基づくことも可能であり、当該技術分野で知られている。リポソーム標的化送達系の場合において、リポソーム二重層と安定に会合した状態で標的化リガンドを維持するために、脂質基をリポソームの脂質二重層に組み込むことができる。様々な連結基を、脂質鎖を標的化リガンドに接続するために使用することができる。追加の方法は、当該技術分野で知られており、例えば、米国特許出願公開第２００６／００５８２５５号に記載されており、その連結基は、参照により本明細書に組み込まれる。
オリゴヌクレオチド（例えば、本明細書に記載のＡＳＯ剤）を含むリポソームは、高度に変形可能にすることができる。かかる変形性は、リポソームを、リポソームの平均半径より小さい孔を介して透過させることが可能になるだろう。例えば、トランスファーソームは、リポソームの更に別の種類であり、薬物送達ビヒクルのための魅力的な候補である、高度に変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは、高度に変形化能であるため、液滴よりも小さい孔を通って透過することが容易に可能である液体液滴として記述することができる。トランスファーソームは、表面エッジの活性化因子（通常は界面活性剤）を標準的なリポソーム組成物に加えることによって作製することができる。オリゴヌクレオチドを含むトランスファーソームは、例えば、皮膚のケラチノサイトにオリゴヌクレオチドを送達するために、感染によって皮下に送達することができる。インタクトな哺乳動物の皮膚を通過するために、脂質小胞は、適切な経皮勾配の影響下で、各々が５０ｎｍ未満の直径を有する一連の微細な孔を通過しなければならない。これに加えて、脂質特性に起因して、これらのトランスファーソームは、自己最適化し（例えば、皮膚の孔の形状に適合する）、自己修復することができ、多くの場合、断片化することなくその標的に到達することができ、多くの場合、自己装填される。血清アルブミンを皮膚に送達するために、トランスファーソームが使用されてきた。血清アルブミンのトランスファーソーム媒介性送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注射として有効であることが示されている。
本開示に修正可能な他の製剤は、２００８年１月２日に出願された米国仮出願番号第６１／０１８，６１６号、２００８年１月２日に出願された第６１／０１８，６１１号、２００８年３月２６日に出願された第６１／０３９，７４８号、２００８年４月２２日に出願された第６１／０４７，０８７号、及び２００８年５月８日に出願された第６１／０５１，５２８号に記載される。２００７年１０月３日に出願されたＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０３３１号も、本開示に修正可能である製剤を記載する。
界面活性剤は、エマルション（マイクロエマルションを含む）及びリポソーム等の製剤において幅広い用途が見出されている。天然及び合成の両方の多くの異なる種類の界面活性剤の特性を分類し、ランク分けする最も一般的な方法は、親水性親油性バランス（ＨＬＢ）の使用による方法である。親水基（「頭部」としても知られる）の性質は、製剤に使用される異なる界面活性剤をカテゴリー分けするのに最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
界面活性剤分子がイオン化されない場合、非イオン性界面活性剤と分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品及び化粧品において幅広い用途が見出されており、広範囲のｐＨ値にわたって使用可能である。一般に、そのＨＬＢ値は、その構造に応じて、２～約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、非イオン性エステル、例えば、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、及びエトキシル化エステルが挙げられる。非イオン性アルカノールアミン及びエーテル、例えば、脂肪族アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、及びエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーも、この種類に含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤の種類の最も人気のあるメンバーである。
界面活性剤分子が、水に溶解又は分散するときに、負の電荷を保有する場合、その界面活性剤は、アニオン性と分類される。アニオン性界面活性剤としては、カルボキシレート（例えば、石鹸）、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、硫酸のエステル、例えば、アルキルサルフェート及びエトキシル化アルキルサルフェート、スルホネート、例えば、アルキルベンゼンスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレート、及びスルホサクシネート、及びホスフェートが挙げられる。アニオン性界面活性剤の種類の最も重要なメンバーは、アルキルサルフェート及び石鹸である。
界面活性剤分子が、水に溶解又は分散するときに、正の電荷を保有する場合、その界面活性剤は、カチオン性と分類される。カチオン性界面活性剤としては、四級アンモニウム塩及びエトキシル化アミンが挙げられる。四級アンモニウム塩は、このクラスの最も使用されるメンバーである。
界面活性剤分子が、正又は負のいずれかの電荷を保有する能力を有している場合、その界面活性剤は、両性と分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ－アルキルベタイン、及びホスファチドが挙げられる。
薬物製品、製剤、及びエマルション中の界面活性剤の使用は、総説にされている（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
本開示の方法に使用するためのオリゴヌクレオチドは、ミセル製剤として提供することもできる。ミセルは、両親媒性分子が、分子の全ての疎水性部分が内側に向き、親水性部分が周囲の水相と接触するように残された球状構造に整列した、分子集合体の特定の種類である。環境が疎水性である場合、逆の配置が存在する。
脂質ナノ粒子ベースの送達方法
本開示のオリゴヌクレオチドは、脂質製剤（例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、又は別の核酸－脂質粒子）中に完全に封入されていてもよい。ＬＮＰは、これらが静脈内注射後に長い循環寿命を示し、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）で蓄積するため、全身適用にきわめて有用である。ＬＮＰは、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／０３６８３号に示されるような、封入された縮合剤－核酸複合体を含む「ｐＳＰＬＰ」を含む。本開示の粒子は、典型的には、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、より典型的には、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、より典型的には、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、最も典型的には、約７０ｎｍ～約９０ｎｍの平均直径を有し、実質的に非毒性である。これに加えて、核酸は、本開示の核酸－脂質粒子中に存在する場合、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に抵抗性である。核酸－脂質粒子及びそれらの調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号、第５，９８１，５０１号、第６，５３４，４８４号、第６，５８６，４１０号、第６，８１５，４３２号、米国公開第２０１０／０３２４１２０号、及びＰＣＴ公開第ＷＯ９６／４０９６４号に開示されている。
脂質と薬物の比率（質量／質量比）（例えば、脂質とオリゴヌクレオチドの比率）は、約１：１～約５０：１、約１：１～約２５：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、又は約６：１～約９：１の範囲であり得る。上述の引用される範囲の中間の範囲も、本開示の一部であると企図される。
カチオン性脂質の非限定的な例としては、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－－（Ｉ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－－（Ｉ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、若しくは３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、若しくはそれらの類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエンインテトラヒドロ－－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、１，１’－（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イエエチラザンジイエジドデカン－２－オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）、又はこれらの混合物が挙げられる。カチオン性脂質は、例えば、粒子中に存在する総脂質の約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、又は約４０ｍｏｌ％含まれ得る。
イオン化可能／非カチオン性脂質は、限定されないが、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン ４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－ｔｒａｎｓ ＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、又はこれらの混合物を含む、アニオン性脂質又は中性脂質であり得る。非カチオン性脂質は、コレステロールが含まれる場合、例えば、粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％、又は約５８ｍｏｌ％であり得る。
粒子の凝集を阻害するコンジュゲート化脂質は、例えば、限定されないが、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、又はこれらの混合物を含む、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質であり得る。ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ４）、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ６）、又はＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ］８）であり得る。粒子の凝集を防ぐコンジュゲート化脂質は、例えば、粒子中に存在する総脂質の０ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％、又は約２ｍｏｌ％であり得る。核酸－脂質粒子は、例えば、粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、又は約５０ｍｏｌ％のコレステロールを更に含み得る。
リガンドに対してコンジュゲート化されたオリゴヌクレオチド
本開示のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、又は細胞取り込みを増強する、１つ以上のリガンド、部分、又はコンジュゲートに化学的に連結され得る。かかる部分としては、限定されないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：６５５３－６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，４：１０５３－１０６０）、チオエーテル、例えば、ベリル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０：３０６－３０９、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，３：２７６５－２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０：５３３－５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）ＥＭＢＯ Ｊ，１０：１１１１－１１１８、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２５９：３２７－３３０、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，７５：４９－５４）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロール又はトリエチル－アンモニウム １，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６：３６５１－３６５４、Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：３７７７－３７８３）、ポリアミン又はポリえエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１４：９６９－９７３）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６：３６５１－３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９９５） Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２６４：２２９－２３７）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２７７：９２３－９３７）が含まれる。
リガンドは、リガンドがその中に組み込まれるオリゴヌクレオチド剤の分布、標的化、若しくは寿命を改変してもよく、及び／又は例えば、かかるリガンドが存在しない種と比較して、選択された標的、例えば、分子、細胞若しくは細胞型、コンパートメント、例えば、細胞若しくは器官コンパートメント、組織、器官、若しくは身体の領域について増強された親和性を提供してもよい。
リガンドは、天然に存在する基質、例えば、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、若しくはグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、インスリン、シクロデキストリン、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、若しくはヒアルロン酸）；又は脂質を含み得る。リガンドはまた、組換え又は合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸であり得る。ポリアミノ酸の例としては、ポリアミノ酸が挙げられ、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコール化）コポリマー、ジビニルエーテル－無水マレイン酸コポリマー、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマー、又はポリホスファジンである。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣物ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩、又はアルファヘリカルペプチドが挙げられる。
リガンドはまた、腎臓細胞等の特定の細胞型に結合する、標的化基、例えば、細胞若しくは組織標的化剤、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質若しくはタンパク質、例えば、抗体も含み得る。標的化基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、表面タンパク質Ａ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、フォレート、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチン、又はＲＧＤペプチド、又はＲＧＤペプチド模倣物であり得る。
リガンドの他の例としては、染料、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジン）及びペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾールコンジュゲート、テトラアザ大環状Ｅｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、又はＡＰが挙げられる。
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、又はペプチド、例えば、共リガンドについて特異的な親和性を有する分子、又は肝細胞等の特定の細胞型に結合する抗体（例えば、抗体）であり得る。リガンドはまた、ホルモン及びホルモン受容体を含み得る。リガンドはまた、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、共因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、又は多価フコースを含み得る。
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、及び／又は中間フィラメントを破壊することによって、細胞へのオリゴヌクレオチド剤の取り込みを増加させることができる基質（例えば、薬物）であり得る。薬物は、例えば、タクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、又はミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であり得る。
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドに接続したリガンドは、薬物動態調整剤（ＰＫ調整剤）として作用し得る。ＰＫ調整剤としては、脂溶性物、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミン等が挙げられる。例示的なＰＫ調整剤としては、限定されないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチン等が挙げられる。いくつかのホスホロチオエート連結を含むオリゴヌクレオチドはまた、血清タンパク質に結合することが知られており、そのため、骨格中に複数のホスホロチオエート連結を含む、短いオリゴヌクレオチド、例えば、約５個の塩基、１０個の塩基、１５個の塩基、又は２０個の塩基のオリゴヌクレオチドも、リガンドとして（例えば、ＰＫ調整リガンドとして）本開示に修正可能である。これに加えて、血清構成要素（例えば、血清タンパク質）に結合するアプタマーも、本明細書に記載の方法及び組成物においてＰＫを調整するリガンドとして使用するのに適している。
本開示のリガンドコンジュゲート化オリゴヌクレオチドは、例えば、オリゴヌクレオチドに対する連結分子の接続に由来するもの（以下に記載される）等、ペンダント反応性官能基を保有するオリゴヌクレオチドの使用によって合成されてもよい。この反応性オリゴヌクレオチドを、市販のリガンド、種々の保護基のうちのいずれかを保有するように合成されるリガンド、又はリガンドに接続する連結部分を有するリガンドと直接的に反応させ得る。
本開示のコンジュゲートに使用されるオリゴヌクレオチドは、固相合成のよく知られている技術によって簡便かつ日常的に行われ得る。かかる合成のための装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を含むいくつかのベンダーによって販売される。当該技術分野で知られているこのような合成のための任意の他の手段も、これに加えて、又は代替的に使用され得る。他のオリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエート及びアルキル化誘導体を調製するために同様の技術を使用することも知られている。
本開示のリガンドコンジュゲート化オリゴヌクレオチド（例えば、本開示の配列特異的に連結したヌクレオシドを保有するリガンド分子）において、オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオシドは、標準的なヌクレオチド若しくはヌクレオシド前駆体、連結部分をすでに保有するヌクレオチド若しくはヌクレオシドコンジュゲート前駆体、リガンド分子をすでに保有するリガンド－ヌクレオチド若しくはヌクレオシド－コンジュゲート前駆体、又は非ヌクレオシドリガンドを保有するビルディングブロックを利用して、適切なＤＮＡ合成機で組み立てられ得る。
すでに連結部分を保有するヌクレオチド－コンジュゲート前駆体を使用する場合、配列に特異的に連結したヌクレオシドの合成は、典型的には、完了しており、次いで、リガンド分子を連結部分と反応させ、リガンドコンジュゲート化オリゴヌクレオチドを形成する。本開示のオリゴヌクレオチド、又は連結したヌクレオシドは、市販されており、かつオリゴヌクレオチド合成で通常使用される標準的なホスホロアミダイト及び非標準的なホスホロアミダイトに加えて、リガンド－ヌクレオシドコンジュゲートに由来するホスホロアミダイトを使用して、自動化合成機によって合成され得る。
ｉ．脂質コンジュゲート
本開示によれば、リガンド又はコンジュゲートは、脂質又は脂質系分子であり得る。かかる脂質又は脂質系分子は、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に特異的に結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、標的組織、例えば、身体の非腎臓標的組織へのコンジュゲートの分布を可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含め、肝臓であり得る。ＨＳＡに結合することができる他の分子も、リガンドとして使用することができる。例えば、ナプロキセン又はアスピリンを使用することができる。脂質又は脂質系リガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する抵抗性を増加させることができ、（ｂ）標的細胞又は細胞膜内の標的化若しくは輸送を増加させることができ、かつ／又は（ｃ）これを使用して血清タンパク質、例えば、ＨＳＡに対する結合を調節することができる。
脂質系リガンドを使用して、標的組織に対するコンジュゲートの結合を阻害（例えば、制御）することができる。例えば、ＨＳＡにより強力に結合する脂質又は脂質系リガンドは、腎臓に対して標的化される可能性は低く、したがって、体内から排泄される可能性も低い。ＨＳＡにそれほど強力に結合しない脂質又は脂質系リガンドを使用して、コンジュゲートを腎臓に対して標的化することができる。
別の態様において、リガンドは、標的細胞（例えば、増殖中の細胞）によって取り込まれる部分（例えば、ビタミン）であってもよい。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、及びＫが挙げられる。
ｉｉ．細胞透過剤
リガンドはまた、細胞透過剤、例えば、ヘリカル細胞透過剤であり得る。特定の例において、この薬剤は、両親媒性である。例示的な薬剤は、ｔａｔ等のペプチド、又はアンテナペディアである。薬剤がペプチドである場合、ペプチド模倣物、逆転異性体、非ペプチド、又は擬ペプチド連結、及びＤ－アミノ酸の使用を含め、修飾され得る。ヘリカル剤は、親油相及び疎油相を有するアルファ－ヘリカル剤であり得る。
リガンドは、ペプチド又はペプチド模倣物であり得る。ペプチド模倣物（本明細書ではオリゴペプチド模倣物とも呼ばれる）は、天然ペプチドに類似した所定の三次元構造に折り畳むことができる分子である。オリゴヌクレオチド剤に対するペプチド及びペプチド模倣物の接続は、例えば、細胞認識及び吸収を増強させることによって、オリゴヌクレオチドの薬物動態分布に影響を与え得る。ペプチド又はペプチド模倣物は、約５～５０個のアミノ酸の長さ、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０個のアミノ酸の長さであり得る。
ペプチド又はペプチド模倣物は、例えば、細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、又は疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ、若しくはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束されたペプチド、又は架橋ペプチドであり得る。別の代替例において、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰを有するＲＦＧＦである。ＲＦＧＦ類似体（例えば、疎水性ＭＴＳを含有するアミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰも、標的化部分であり得る）。ペプチド部分は、「送達」ペプチドであってもよく、細胞膜を横切る、ペプチド、オリゴヌクレオチド、及びタンパク質を含む大きな極性分子を保有し得る。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）からの配列は、送達ペプチドとして機能することができることがわかっている。ペプチド又はペプチド模倣物は、ＤＮＡのランダム配列、例えば、ファージディスプレイライブラリ、又は１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリから特定されたペプチドによってコードされ得る（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２－８４，１９９１）。細胞を標的化する目的のために組み込まれるモノマー単位を介してオリゴヌクレオチドにつなぎ止められたペプチド又はペプチド模倣物の例は、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチド、又はＲＧＤ模倣物である。ペプチド部分は、約５個のアミノ酸～約４０個のアミノ酸の長さの範囲であり得る。ペプチド部分は、安定性を増加させるか、又は構成的特性を指令するような構造的修飾を有し得る。以下に記載の構造的修飾のいずれかを利用可能である。
ＲＧＤペプチドは、細胞標的に対して組成物を向かわせるための本開示の組成物において使用され得る。ＲＧＤペプチドは、線形又は環状であってもよく、特定の組織への標的化を容易にするために、修飾（例えば、グリコシル化又はメチル化）され得る。ＲＧＤ含有ペプチド及びペプチド模倣物は、Ｄ－アミノ酸、及び合成ＲＧＤ模倣物を含み得る。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的化する他の部分を使用し得る。このリガンドのいくつかのコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ－１又はＶＥＧＦを標的化する。
細胞透過ペプチドは、細胞、例えば、微生物細胞、例えば、細菌細胞若しくは真菌細胞、又は哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞を透過することができる。微生物細胞透過ペプチドは、例えば、α－ヘリカル線形ペプチド（例えば、ＬＬ－３７若しくはＣｅｒｏｐｉｎ Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α－ディフェンシン、β－ディフェンシン、若しくはバクテネシン）、又は１個若しくは２個の優勢なアミノ酸のみを含有するペプチド（例えば、ＰＲ－３９若しくはインドリシジン）であり得る。細胞透過ペプチドはまた、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。例えば、細胞透過ペプチドは、二部構成の両親媒性ペプチド、例えば、ＭＰＧであってもよく、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメイン及びＳＶ４０の大きなＴ抗原のＮＬＳに由来する（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７－２７２４，２００３）。
ｉｉｉ．炭水化物コンジュゲート
本開示の組成物及び方法によれば、オリゴヌクレオチドは、炭水化物を更に含み得る。炭水化物コンジュゲート化オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、核酸のインビボ送達、及びインビボ療法の使用に適した組成物にとって有利である。本明細書で使用される場合、「炭水化物」は、少なくとも６個の炭素原子を有し（直鎖、分枝鎖、又は環状であってもよい）、各炭素原子に結合する酸素、窒素若しくは硫黄原子を有する、１個以上の単糖単位から構成される炭水化物自体、あるいは各々が少なくとも６個の炭素原子を有し（直鎖、分枝鎖、又は環状であってもよい）、各炭素原子に結合する酸素、窒素若しくは硫黄原子を有する１つ以上の単糖単位から構成される炭水化物部分をその一部として有する化合物のいずれかである化合物を指す。代表的な炭水化物としては、糖類（単糖、二糖、三糖、及び約４、５、６、７、８、又は９個の単糖単位を含有するオリゴ糖単位）、並びに多糖、例えば、デンプン、グリコーゲン、セルロース及び多糖ガムが挙げられる。特定の単糖としては、Ｃ５及びそれより大きい（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、又はＣ８）糖が挙げられ、二糖及び三糖としては、２個又は３個の単糖単位（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、又はＣ８）を有する糖が挙げられる。
特定の例において、本開示の組成物及び方法に使用するための炭水化物コンジュゲートは、単糖である。炭水化物コンジュゲートは、上述の１つ以上の追加のリガンド、例えば、限定されないが、ＰＫモジュレーター及び／又は細胞透過ペプチドを更に含み得る。本開示の使用に適した追加の炭水化物コンジュゲート（及びリンカー）は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／１７９６２０及びＷＯ２０１４／１７９６２７に記載されるものを含み、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
ｉｖ．リンカー
本明細書に記載のコンジュゲート又はリガンドは、切断可能又は非切断可能であり得る様々なリンカーで、オリゴヌクレオチドに接続することができる。
リンカーは、典型的には、直接結合、又は酸素若しくは硫黄等の原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨ若しくは原子鎖等の単位を含み、例えば、限定されないが、置換若しくは非置換のアルキル、置換若しくは非置換のアルケニル、置換若しくは非置換のアルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘレロシクリルアルキニル（ａｌｋｙｌｈｅｒｅｒｏｃｙｃｌｙｌａｌｋｙｎｙｌ）、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘレロアリール（ａｌｋｙｎｙｌｈｅｒｅｒｏａｒｙｌ）（１つ以上のメチレンが、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）によって中断又は停止されてもよい）、置換若しくは非置換アリール、置換若しくは非置換ヘテロアリール、置換若しくは非置換ヘテロ環を含み、Ｒ８は、水素、アシル、脂肪族又は置換脂肪族である。特定の例において、リンカーは、約１～２４個の原子、２～２４、３～２４、４～２４、５～２４、６～２４、６～１８、７～１８、８～１８個の原子、７～１７、８～１７、６～１６、７～１７、又は８～１６個の原子であり得る。
切断可能連結基は、細胞の外側では十分に安定であるが、標的細胞に侵入すると切断し、リンカーが一緒に保持している２つの部分を放出するものである。好ましい実施形態において、切断可能連結基は、標的細胞において、若しくは第１の参照条件（例えば、細胞内条件を模倣するか、若しくは表すように選択することができる）下で、対象の血液におけるよりも、若しくは第２の参照条件（例えば、血液若しくは血清でみられる条件を模倣するか、若しくは表すように選択することができる）下におけるよりも、少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、若しくはそれより多く、又は少なくとも約１００倍迅速に切断する。
切断可能連結基は、切断剤（例えば、ｐＨ、酸化還元電位、又は分解性分子の存在）の影響を受けやすい。一般に、切断剤は、血清若しくは血液におけるよりも、細胞内部でより頻繁に存在するか、又はより高いレベル又は活性で見出される。かかる分解剤の例としては、特定の基質に選択的であるか、若しくは基質特異性を有しない、酸化還元剤、例えば、細胞中に存在し、還元によって酸化還元切断可能連結基を分解することができる、酸化酵素若しくは還元酵素、又はメルカプタン等の酸化剤を含む；エステラーゼ；酸性環境を作り出すことができるエンドソーム又は薬剤、例えば、５以下のｐＨを生じさせるもの；一般的な酸として作用することによって酸切断可能連結基を加水分解又は分解することが出来る酵素、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）、及びホスファターゼが挙げられる。
切断可能連結基、例えば、ジスルフィド結合は、ｐＨの影響を受けやすい場合がある。ヒト血清のｐＨは７．４であり、一方で、平均細胞内ｐＨは、これよりわずかに低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームは、より酸性のｐＨを有し（５．５～６．０の範囲）、リソソームは、ほぼ５．０であり、更に酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨで切断する切断可能連結基を有し、それによって、細胞の内側のリガンドからカチオン性脂質を放出するか、又は細胞の所望のコンパートメントへカチオン性脂質を放出する。
リンカーは、特定の酵素によって切断可能である切断可能連結基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能連結基の種類は、標的とされる細胞に応じて変わり得る。例えば、肝臓標的化リガンドを、エステル基を含むリンカーを介してカチオン性脂質に連結し得る。肝臓細胞は、エステラーゼを豊富に含み、したがって、リンカーは、エステラーゼを豊富に含まない細胞型におけるよりも、肝臓細胞においてより効率的に切断される。エステラーゼを豊富に含む他の細胞型としては、肺、腎皮質、及び精巣の細胞が挙げられる。
ペプチド結合を含有するリンカーを、ペプチダーゼを豊富に含む細胞型（例えば、肝臓細胞及び滑膜細胞）を標的化する場合に使用することができる。
一般に、候補切断可能連結基の適切さは、分解剤（又は条件）が候補連結基を切断する能力を試験することによって評価することができる。血液中の切断に抵抗する能力について、又は他の非標的組織と接触した場合に、候補切断可能連結基を試験することも望ましい場合がある。したがって、第１の条件と第２の条件との間で相対的な切断されやすさを決定することができ、第１は、標的細胞における切断の指標であるように選択され、第２は、他の組織又は生体流体、例えば、血液又は血清における切断の指標であるように選択される。評価は、無細胞系において、細胞において、細胞培養物において、器官若しくは組織培養物において、又は動物全体において行うことができる。初期の評価を無細胞条件又は培養物条件で行い、動物全体において更なる評価によって確認することが有用であり得る。いくつかの場合において、有用な候補化合物は、細胞において（又は細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）、血液若しくは血清（又は細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）と比較して、少なくとも約２倍、４倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は約１００倍迅速に切断される。
ａ．酸化還元切断可能連結基
切断可能連結基は、還元又は酸化すると切断する酸化還元切断可能連結基であり得る。還元的な切断可能連結基の一例は、ジスルフィド連結基（－－Ｓ－－Ｓ－－）である。候補切断可能連結基が、適切な「還元的な切断可能連結基」であるか、又は例えば、特定のオリゴヌクレオチド部分及び特定の標的剤とともに使用するのに適しているのかどうかを決定するために、本明細書に記載の方法に注目することができる。例えば、候補は、ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、又は細胞（例えば、標的細胞）において観察され得る切断速度を模倣する当該技術分野で知られている試薬を使用した他の完全剤とのインキュベーションによって評価することができる。候補はまた、血液又は血清条件を模倣するように選択される条件下で評価することができる。候補化合物は、血液中で、最大約１０％まで切断され得る。他の例において、有用な候補化合物は、細胞において（又は細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）、血液（又は細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）と比較して、少なくとも約２倍、４倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、又は約１００倍迅速に分解する。候補化合物の切断速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下で、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較して、標準的な酵素反応速度アッセイを使用して決定することができる。
ｂ．リン酸系切断可能連結基
切断可能リンカーはまた、リン酸系切断可能連結基を含み得る。リン酸系切断可能連結基は、リン酸基を分解又は加水分解する薬剤によって切断される。細胞においてリン酸基を切断する薬剤の一例は、細胞におけるホスファターゼ等の酵素である。リン酸系切断可能連結基の例は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、
－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、
－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、
－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－である。これらの候補は、上述のものに類似した方法を使用して評価することができる。
ｃ．酸切断可能連結基
切断可能リンカーはまた、酸切断可能連結基を含み得る。酸切断可能連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。好ましい実施形態において、酸切断可能連結基は、約６．５以下（例えば、６．０、５．７５、５．５、５．２５、５．０、又はそれより低い）ｐＨを有する酸性環境において、又は一般的な酸として作用し得る酵素等の薬剤によって、切断する。細胞において、特定の低ｐＨのオルガネラ（例えば、エンドソーム及びリソソーム）は、酸切断可能連結基のための切断環境を提供し得る。酸切断可能連結基の例としては、限定されないが、ヒドラゾン、エステル、及びアミノ酸のエステルが挙げられる。酸切断可能連結基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、又は－－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。好ましい実施形態は、エステルの酸素（アルコキシ基）に接続した炭素が、アリール基、置換アルキル基、ジメチルペンチル若しくはｔ－ブチル等の三級アルキル基である場合である。これらの候補は、上述のものに類似した方法を使用して評価することができる。
ｄ．エステル系連結基
切断可能リンカーは、エステル系切断可能連結基を含み得る。エステル系切断可能連結基は、細胞においてエステラーゼ及びアミダーゼ等の酵素によって切断される。エステル系切断可能連結基の例としては、限定されないが、アルキレン、アルケニレン及びアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステル切断可能連結基は、一般式－－Ｃ（Ｏ）Ｏ－－、又は－－ＯＣ（Ｏ）－－を有する。これらの候補は、上述のものに類似した方法を使用して評価することができる。
ｅ．ペプチド系切断基
切断可能リンカーは、ペプチド系切断可能連結基を更に含み得る。ペプチド系切断可能連結基は、細胞においてペプチダーゼ及びプロテアーゼ等の酵素によって切断される。ペプチド系切断可能連結基は、アミノ酸間で形成されるペプチド結合であり、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチド等）、及びポリペプチドが得られる。ペプチド系切断可能基は、アミド基（－－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－－）を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキネレン（ａｌｋｙｎｅｌｅｎｅ）の間に形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間に形成される特定の型のアミド結合であり、ペプチド及びタンパク質が得られる。ペプチド系切断可能基は、一般に、ペプチド及びタンパク質が得られる、アミノ酸の間に形成されるペプチド結合（すなわち、アミド結合）に限定され、完全なアミド官能基を含まない。ペプチド系切断可能連結基は、一般式－－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－－を有し、式中、ＲＡ及びＲＢは、２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上述のものに類似した方法を使用して評価することができる。
本開示のオリゴヌクレオチドは、リンカーを介して炭水化物にコンジュゲート化され得る。リンカーは、二価及び三価の分枝鎖リンカー基を含む。本開示の組成物及び方法のリンカーとの例示的なオリゴヌクレオチド炭水化物コンジュゲートは、限定されないが、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１８／１９５１６５号の式２４～３５に記載されるものが挙げられる。
オリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許としては、限定されないが、米国特許４，８２８，９７９号、第４，９４８，８８２号、第５，２１８，１０５号、第５，５２５，４６５号、第５，５４１，３１３号、第５，５４５，７３０号、第５，５５２，５３８号、第５，５７８，７１７号、第５，５８０，７３１号、第５，５９１，５８４号、第５，１０９，１２４号、第５，１１８，８０２号、第５，１３８，０４５号、第５，４１４，０７７号、第５，４８６，６０３号、第５，５１２，４３９号、第５，５７８，７１８号、第５，６０８，０４６号、第４，５８７，０４４号、第４，６０５，７３５号、第４，６６７，０２５号、第４，７６２，７７９号、第４，７８９，７３７号、第４，８２４，９４１号、第４，８３５，２６３号、第４，８７６，３３５号、第４，９０４，５８２号、第４，９５８，０１３号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，２４５，０２２号、第５，２５４，４６９号、第５，２５８，５０６号、第５，２６２，５３６号、第５，２７２，２５０号、第５，２９２，８７３号、第５，３１７，０９８号、第５，３７１，２４１号、第５，３９１，７２３号、第５，４１６，２０３号、第５，４５１，４６３号、第５，５１０，４７５号、第５，５１２，６６７号、第５，５１４，７８５号、第５，５６５，５５２号、第５，５６７，８１０号、第５，５７４，１４２号、第５，５８５，４８１号、第５，５８７，３７１号、第５，５９５，７２６号、第５，５９７，６９６号、第５，５９９，９２３号、第５，５９９，９２８号及び第５，６８８，９４１号、第６，２９４，６６４号、第６，３２０，０１７号、第６，５７６，７５２号、第６，７８３，９３１号、第６，９００，２９７号、第７，０３７，６４６号、第８，１０６，０２２号が挙げられ、その各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
特定の場合において、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドは、非リガンド基によって修飾され得る。いくつかの非リガンド分子は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、又は細胞取り込みを増強するために、オリゴヌクレオチドにコンジュゲート化されており、かかるコンジュゲート化を行うための手順は、科学文献で入手可能である。かかる非リガンド部分には、脂質部分、例えば、コレステロール（Ｋｕｂｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ，２００７，３６５（１）：５４－６１、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０：１１１、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロール又はトリエチルアンモニウム １，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１、Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミン又はポリエチレングルコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、又はオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）が含まれる。かかるオリゴヌクレオチドコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許は、上に列挙されている。典型的なコンジュゲート化プロトコルは、配列の１つ以上の位置にアミノリンカーを有するオリゴヌクレオチドの合成を伴う。次いで、アミノ基を、適切なカップリング試薬又は活性化試薬を使用してコンジュゲート化される分子と反応させる。コンジュゲート化反応は、液相において、固体支持体にまだ結合しているオリゴヌクレオチドを用いて、又はオリゴヌクレオチドの切断後のいずれかで行うことができる。ＨＰＬＣによるオリゴヌクレオチドコンジュゲートの精製は、典型的に、純粋なコンジュゲートを与える。
核酸ベクター
本明細書に開示される核酸剤の有効細胞内濃度は、その核酸剤をコードするポリヌクレオチドの安定な発現によって（例えば、哺乳動物細胞の核又はミトコンドリアゲノムへのインテグレーションによって）達成することができる。核酸は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化する阻害性ＲＮＡ（例えば、本明細書に開示されるＡＳＯ剤）である。かかる外因性核酸を哺乳動物細胞に導入するために、その薬剤のためのポリヌクレオチド配列は、ベクターに組み込まれ得る。ベクターを、形質転換、トランスフェクション、直接的な取り込み、プロジェクタイルボンバードメント、及びリポソーム中のベクターの封入を含む様々な方法によって、細胞へと導入することができる。細胞をトランスフェクト又は形質転換する適切な方法の例は、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、感染、リポフェクション、及び直接的な取り込みである。かかる方法は、例えば、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１４））、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１５））により詳細に記載され、その各々の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示される薬剤はまた、かかる薬剤をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを、細胞膜のリン脂質に対して標的化することによって、哺乳動物細胞に導入することができる。例えば、ベクターは、ベクター分子を、全ての細胞膜リン脂質に対して親和性を有するウイルスタンパク質であるＶＳＶ－Ｇタンパク質に連結することによって、細胞膜の細胞外表面上のリン脂質に対して標的化することができる。このように、構築物は、当該技術分野の従来の通常の方法を使用して産生することができる。
高速の転写及び翻訳を達成することに加えて、哺乳動物細胞における外因性ポリヌクレオチドの安定な発現は、哺乳動物細胞の核ゲノムへの遺伝子を含有するポリヌクレオチドのインテグレーションによって達成することができる。哺乳動物細胞の核ＤＮＡへの外因性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達及びインテグレーションのための様々なベクターが、開発されてきた。発現ベクターの例は、例えば、ＷＯ１９９４／０１１０２６に開示され、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の組成物及び方法に使用するための発現ベクターは、Ｇｒｉｋ２標的化ＡＳＯ剤をコードするポリヌクレオチド配列、及び例えば、これらの薬剤の発現及び／又は哺乳動物細胞のゲノムへのこれらのポリヌクレオチドのインテグレーションのために使用される追加の配列要素を含有する。使用することができる特定のベクターとしては、遺伝子転写を指令する調節配列（例えば、プロモーター及びエンハンサー領域）を含有するプラスミドが挙げられる。他の有用なベクターは、これらの遺伝子の翻訳速度を増強させるか、又は遺伝子転写から得られるｍＲＮＡの安定性又は核外排出を改善するポリヌクレオチド配列を含有する。これらの配列要素としては、例えば、５’及び３’ＵＴＲ領域、ＩＲＥＳ、及び発現ベクター上に保有される遺伝子の効率的な転写を指令するためのポリアデニル化シグナル部位が挙げられる。本明細書に記載の組成物及び方法とともに使用するのに適した発現ベクターはまた、かかるベクターを含有する細胞の選択のためのマーカーをコードするポリヌクレオチドを含有し得る。適切なマーカーの例は、抗生物質、例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ノーセオトリシンに対する抵抗性をコードする遺伝子である。
調節配列
本明細書に開示されるＡＳＯ剤は、治療利益を誘発するのに十分に高いレベルで発現することが必要な場合がある。したがって、ポリヌクレオチド発現は、開示されるＡＳＯ剤の強固な発現を駆動することができるプロモーター配列によって媒介され得る。本明細書に開示される方法及び組成物によれば、プロモーターは、異種プロモーターであり得る。「異種プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、天然で所与のコード配列に作動可能に連結することが見出されていないプロモーターを指す。有用な異種制御配列は、一般に、哺乳動物又はウイルス遺伝子をコードする配列に由来するものを含む。
本開示の目的のために、異種プロモーター及び他の制御要素（例えば、ＣＮＳ特異的誘導性プロモーター、エンハンサー等）は両方とも、特定の用途のものである。プロモーターは、その全体で、ネイティブ遺伝子（例えば、Ｇｒｉｋ２遺伝子）に由来していてもよく、又は異なる天然に存在するプロモーターに由来する異なる要素で構成されていてもよい。代替的に、プロモーターは、合成ポリヌクレオチド配列を含み得る。異なるプロモーターは、異なる組織若しくは細胞型において、又は異なる発達段階で、又は異なる環境条件に応答して、又は薬物若しくは転写補因子の存在若しくは非存在に応答して、遺伝子の発現を指令し得る。ユビキタスプロモーター、細胞型特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、発達段階特異的プロモーター、及び条件付きプロモーター、例えば、薬物応答性プロモーター（例えば、テトラサイクリン応答性プロモーター）は、当該技術分野でよく知られている。
哺乳動物系において、以下の３種類のプロモーターが存在し、発現ベクターの構築のための候補である。（ｉ）大きなリボソームＲＮＡの転写を制御するＰｏｌ Ｉプロモーター、（ｉｉ）ｍＲＮＡ（タンパク質へと翻訳される）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、及び内因性マイクロＲＮＡ（例えば、プレｍＲＮＡのイントロンから）の転写を制御するＰｏｌ ＩＩプロモーター、（ｉｉｉ）並びに低分子非コードＲＮＡを固有に転写するＰｏｌ ＩＩＩプロモーター。各々は、インビボでのＲＮＡの発現のための構築物を設計する場合に考慮すべき利点及び制約を有する。例えば、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、インビボでＤＮＡテンプレートからＡＳＯ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ、又はｓｈｍｉＲＮＡ）を合成するのに有用である。組織特異的発現に対するより大きな制御のために、Ｐｏｌ ＩＩプロモーターが好ましいが、ｍｉＲＮＡの転写にのみ使用することができる。しかしながら、Ｐｏｌ ＩＩプロモーターが使用される場合、ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡとして機能し、インビボでペプチドへと翻訳されないように、翻訳開始シグナルを省くことが好ましい場合がある。
本明細書に記載の組成物及び方法とともに使用するのに適したポリヌクレオチドはまた、哺乳動物調節配列、例えば、プロモーター配列、及び任意選択的にエンハンサー配列の制御下で、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化するＡＳＯ剤をコードするものが挙げられる。哺乳動物細胞において、開示されるＡＳＯ剤の発現に有用である例示的なプロモーターとしては、ユビキタスプロモーター、例えば、Ｈ１プロモーター、７ＳＫプロモーター、アポリポタンパク質Ｅ－ヒトアルファ１－アンチトリプシンプロモーター、ＣＫ８プロモーター、マウスＵ１プロモーター（ｍＵ１ａ）、伸長因子１αプロモーター（ＥＦ－１α）プロモーター、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＫＧ）プロモーター、ＣＡＧ（（ＣＭＶ）サイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリベータアクチンプロモーター（ＣＢＡ）及びウサギベータグロビンイントロンのコンポジット）、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルスメジャー後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、ヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶプロモーター、例えば、ＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶ－ＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、及びＵ６プロモーター、又はそれらのバリアントが挙げられる。本明細書に開示される阻害性ＲＮＡ配列の細胞型特異的発現を駆動する目的のために、細胞型特異的プロモーターを使用し得る。例えば、Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤のニューロン特異的発現は、ニューロン特異的プロモーター、例えば、ヒトシナプシン１（ｈＳｙｎ）プロモーター、ヘキサリボヌクレオチド結合タンパク質－３（ＮｅｕＮ）プロモーター、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）プロモーター、チューブリンＩ（Ｔα－１）プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、血小板由来成長因子ベータ鎖（ＰＤＧＦβ）プロモーター、小胞グルタミン酸トランスポーター（ＶＧＬＵＴ）プロモーター、ソマトスタチン（ＳＳＴ）プロモーター、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）プロモーター、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）プロモーター、パルブアルブミン（ＰＶ）プロモーター、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ６５若しくはＧＡＤ６７）プロモーター、ドーパミン－１受容体（ＤＲＤ１）及びドーパミン－２受容体（ＤＲＤ２）のプロモーター、微小管関連タンパク質１Ｂ（ＭＡＰ１Ｂ）、補体コンポーネント１ｑサブコンポーネント様２（Ｃ１ｑｌ２）プロモーター、プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）プロモーター、及びプロスペロホメオボックスタンパク質１（ＰＲＯＸ１）プロモーターを使用して与えられ得る。ｈＳｙｎ及びＣａＭＫＩＩプロモーターのバリアントは、Ｈｉｏｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ１４：８７２－８２（２００７）、及びＳａｕｅｒｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（２５）：１４９３２－７（１９９０）に以前に記載されており、その開示は、特定のｈＳｙｎ及びＣａＭＫＩＩプロモーター配列に関する場合に本明細書に参照により組み込まれる。海馬のＤＧ細胞においてポリヌクレオチド発現特異性を駆動するのに適したプロモーターとしては、Ｃ１ｑｌ２、ＰＯＭＣ、及びＰＲＯＸ１プロモーターが挙げられる。
特定の例において、本開示の発現ベクターは、ＳＹＮプロモーター（例えば、ヒトＳＹＮプロモーター（ｈＳｙｎ）、例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ、又は配列番号６８２～６８２及び７９０のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）を含む。別の例において、本開示の発現ベクターは、ＣＡＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ、又は配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）を含む。なお別の例において、本開示の発現ベクターは、Ｃ１ＱＬ２プロモーター（例えば、配列番号７１９若しくは配列番号７９１、又は配列番号７１９若しくは配列番号７９１の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）を含む。
合成プロモーター、ハイブリッドプロモーター等はまた、本明細書に開示される方法及び組成物と組み合わせて使用され得る。これに加えて、非ウイルス遺伝子、例えば、マウスメタロチオネイン遺伝子に由来する配列も、本明細書での用途が見出される。係るプロモーター配列は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から市販されている。発現ベクター（例えば、プラスミド又はウイルスベクター、例えば、ＡＡＶ又はレンチウイルスベクター）とともに使用するのに適した例示的なプロモーター配列は、以下の表５及び表６に提供される。
特定の例において、本開示のウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）は、ニューロン特異的プロモーター配列を組み込む。特定の例において、ニューロン特異的プロモーターは、ヒトＳｙｎプロモーター、例えば、配列番号６８２～６８５及び配列番号７９０のうちのいずれか１つの核酸配列を有するヒトＳｙｎプロモーター、又は配列番号６８２～６８５及び配列番号７９０のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
別の例において、ニューロン特異的プロモーターは、ＮｅｕＮプロモーター配列、例えば、配列番号６８６のＮｅｕＮプロモーター配列、又は配列番号６８６の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
別の例において、ニューロン特異的プロモーターは、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列、例えば、配列番号６８７～６９１及び配列番号８０２のうちのいずれか１つのＣａＭＫＩＩプロモーター配列、又は配列番号６８７～６９１及び配列番号８０２のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
追加のＣａＭＫＩＩプロモーターは、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．３５（１）：３７－４４，２００７）に記載されるヒトアルファＣａＭＫＩＩプロモーター配列を含んでいてもよく、その開示は、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列に関連する場合にその全体が本明細書に組み込まれる。
別の例において、ニューロン特異的プロモーターは、ＮＳＥプロモーター配列、例えば、配列番号６９２又は配列番号６９３のＮＳＥプロモーター配列、又は配列番号６９２又は配列番号６９３の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
別の例において、ニューロン特異的プロモーターは、ＰＤＧＦβプロモーター配列、例えば、配列番号６９４～６９６のＰＤＧＦβプロモーター配列、又は配列番号６９４～６９６の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
別の例において、ニューロン特異的プロモーターは、ＶＧｌｕＴプロモーター配列、例えば、配列番号６９７～７０１のＶＧｌｕＴプロモーター配列、又は配列番号７０８～７１２の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
別の例において、ニューロン特異的プロモーターは、ＳＳＴプロモーター配列、例えば、配列番号７０２若しくは配列番号７０３のＳＳＴプロモーター配列、又は配列番号７０２若しくは配列番号７０３の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
別の例において、ニューロン特異的プロモーターは、ＮＰＹプロモーター配列、例えば、配列番号７０４のＮＰＹプロモーター配列、又は配列番号７０４の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
別の例において、ニューロン特異的プロモーターは、ＶＩＰプロモーター配列、例えば、配列番号７０５若しくは配列番号７０６のＶＩＰプロモーター配列、又は配列番号７０５若しくは配列番号７０６の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
別の例において、ニューロン特異的プロモーターは、ＰＶプロモーター配列、例えば、配列番号７０７～７０９のＰＶプロモーター配列、又は配列番号７１８～７２０の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
別の例において、ニューロン特異的プロモーターは、ＧＡＤ６５プロモーター配列、例えば、配列番号７１０～７１３のＧＡＤ６５プロモーター配列、又は配列番号７１０～７１３の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
別の例において、ニューロン特異的プロモーターは、ＧＡＤ６７プロモーター配列、例えば、配列番号７１４若しくは配列番号７１５のＧＡＤ６７プロモーター配列、又は配列番号７１４若しくは配列番号７１５の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
別の例において、ニューロン特異的プロモーターは、ＤＲＤ１プロモーター配列、例えば、配列番号７１６のＤＲＤ１プロモーター配列、又は配列番号７１６の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
別の例において、ニューロン特異的プロモーターは、ＤＲＤ２プロモーター配列、例えば、配列番号７１７若しくは配列番号７１８のＤＲＤ２プロモーター配列、又は配列番号７１７若しくは配列番号７１８の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
別の例において、ニューロン特異的プロモーターは、Ｃ１ｑｌ２プロモーター配列、例えば、配列番号７１９のＣ１ｑｌ２プロモーター配列、又は配列番号７１９若しくは配列番号７９１の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
別の例において、ニューロン特異的プロモーターは、ＰＯＭＣプロモーター配列、例えば、配列番号７２０のＰＯＭＣプロモーター配列、又は配列番号７２０の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
別の例において、ニューロン特異的プロモーターは、ＰＲＯＸ１プロモーター配列、例えば、配列番号７２１若しくは配列番号７２２のＰＲＯＸ１プロモーター配列、又は配列番号７３７若しくは７３８の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
なお別の例において、ニューロン特異的プロモーターは、ＭＡＰ１Ｂプロモーター配列、例えば、配列番号７２３～７２５のＭＡＰ１Ｂプロモーター配列、又は配列番号７２３～７２５の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
なお別の例において、ニューロン特異的プロモーターは、Ｔα－１プロモーター配列、例えば、配列番号７２６若しくは配列番号７２７のＴα－１プロモーター配列、又は配列番号７２６若しくは配列番号７２７の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
別の例において、本開示のウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）は、本開示のアンチセンス構築物を発現することができるユビキタスプロモーター配列を組み込む。一例において、ユビキタスプロモーターは、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ又はＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターである。例示的なＰｏｌ ＩＩ及びＰｏｌ ＩＩＩプロモーターは、Ｐｒｅｅｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２７：４５１－８（２０２０）、及びＪａｗｄｅｋａｒ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １７７９（５）：２９５－３０５（２００８）に記載されており、その開示は、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ及びＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターに関連する場合に本明細書に参照により組み込まれる。例えば、本開示のベクターに含まれるのに適したＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、Ｕ６核内低分子１プロモーター、例えば、配列番号７２８～７３３若しくは７７２のうちのいずれか１つの核酸配列を有するＵ６核内低分子１プロモーター、又は配列番号７２８～７３３若しくは７７２のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
別の例において、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、Ｈ１プロモーター、例えば、配列番号７３４の核酸配列を有するＨ１プロモーター、又は配列番号７３４の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
別の例において、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、７ＳＫプロモーター、例えば、配列番号７３５の核酸配列を有する７ＳＫプロモーター、又は配列番号７３５の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
別の例において、ユビキタスプロモーターは、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）－ヒトアルファ１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ、ＡｐｏＥ－ｈＡＡＴ）プロモーター、例えば、配列番号７３６の核酸配列を有するＡｐｏＥ－ｈＡＡＴプロモーター、又は配列番号７３６の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
別の例において、ユビキタスプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー要素、ニワトリベータ－アクチン遺伝子のプロモーター、第１のエクソン、及び第１のイントロン、並びにウサギベータ－グロビン遺伝子のスプライスアクセプター、例えば、配列番号７３７の核酸配列を有するＣＡＧプロモーター、又は配列番号７３７の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントを含む、ＣＡＧプロモーターである。
別の例において、ユビキタスプロモーターは、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、例えば、配列番号７３８の核酸配列を有するＣＢＡプロモーター、又は配列番号７３８の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
別の例において、ユビキタスプロモーターは、筋肉クレアチンキナーゼプロモーターのバリアント（ＣＫ８プロモーター）、例えば、配列番号７３９の核酸配列を有するＣＫ８プロモーター、又は配列番号７３９の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
別の例において、ユビキタスプロモーターは、マウスＵ１核内低分子ＲＮＡ（ｍＵ１ａ）プロモーター、例えば、配列番号７４０の核酸配列を有するｍＵ１ａプロモーター、又は配列番号７４０の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
別の例において、ユビキタスプロモーターは、伸長因子１アルファプロモーター（ＥＦ－１α）プロモーター、例えば、配列番号７４１の核酸配列を有するＥＦ－１αプロモーター、又は配列番号７４１の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
別の例において、ユビキタスプロモーターは、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター、例えば、配列番号７４２の核酸配列を有するＴＢＧプロモーター、又は配列番号７４２の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
開示されるＡＳＯ剤をコードするポリヌクレオチドが、哺乳動物細胞の核ＤＮＡに組み込まれたら、このポリヌクレオチドの転写は、当該技術分野で知られている方法によって誘導され得る。例えば、発現は、哺乳動物細胞に、外部の化学試薬、例えば、哺乳動物プロモーターに対する転写因子及び／又はＲＮＡポリメラーゼの結合を調整することによって遺伝子発現を調節する薬剤に曝露することによって誘導することができる。化学試薬は、例えば、プロモーターに結合しているレプレッサータンパク質を除去することによって、哺乳動物プロモーターに対するＲＮＡポリメラーゼ及び／又は転写因子の結合を容易にするように機能し得る。代替的に、化学試薬は、プロモーターの下流に位置する遺伝子の転写速度が化学試薬の存在下で増加するように、ＲＮＡポリメラーゼ及び／又は転写因子に対する哺乳動物プロモーターの親和性を増強させるように機能し得る。上述の機構によるポリヌクレオチド転写を強化する化学試薬の例は、テトラサイクリン及びドキシサイクリンである。これらの試薬は、市販されており（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、確立されたプロトコルに従って遺伝子発現を促進するために、哺乳動物細胞に投与され得る。
本明細書に記載の組成物及び方法に使用するためのポリヌクレオチドに含まれ得る他のＤＮＡ配列要素は、エンハンサー配列である。エンハンサーは、ＤＮＡが、転写開始位置での転写因子及びＲＮＡポリメラーゼの結合にとって好ましい三次元配向に適応するように、目的の遺伝子を含有するポリヌクレオチドにおける構成の変化を誘導する、別の種類の調節要素を表す。したがって、本明細書に記載の組成物及び方法に使用するためのポリヌクレオチドは、Ｇｒｉｋ２標的化ＡＳＯ剤をコードするものを含み、それに加えて、哺乳動物エンハンサー配列を含む。現在、多くのエンハンサー配列が、哺乳動物遺伝子から既知であり、例は、哺乳動物グロビンエラスターゼ、アルブミン、α－フェトプロテイン、及びインスリンをコードする遺伝子からのエンハンサーである。本明細書に記載の組成物及び方法に使用するためのエンハンサーはまた、真核細胞を感染させることができるウイルスの遺伝材料に由来するものを含む。例は、複製起点（ｂｐ１００～２７０）の後期側でのＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側でのポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーである。真核生物遺伝子転写の活性化を誘導する追加のエンハンサー配列は、Ｙａｎｉｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９７：１７（１９８２）に記載されている。エンハンサーは、例えば、この遺伝子の５’位置又は３’位置に、本開示のアンチセンス構築物をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターへとスプライシングされ得る。特定の配向において、エンハンサーは、プロモーターの５’側に配置され、次いで、本開示のＡＳＯ剤をコードするポリヌクレオチドに対して５’に位置する。エンハンサー配列の非限定的な例は、以下の表７に提供される。
本明細書に記載の組成物及び方法に使用するためのポリヌクレオチドに含まれ得る追加の調節要素は、イントロン配列である。イントロン配列は、ＲＮＡスプライシング中に除去され、成熟ｍＲＮＡ産物を産生する、プレｍＲＮＡ中に見出される非タンパク質コードＲＮＡ配列である。イントロン配列は、他の非コードＲＮＡ分子を産生するように更にプロセシングされ得るという点で、遺伝子発現の調節にとって重要である。選択的スプライシング、ナンセンス媒介性分解、及びｍＲＮＡ核外排出は、イントロン配列によって調節されることが示されている生体プロセスである。イントロン配列はまた、イントロン媒介性の増強によって、導入遺伝子の発現を容易にし得る。イントロン配列の非限定的な例は、以下の表７に提供される。
本開示のベクターと組み合わせて使用可能な更なる調節要素としては、末端逆位反復（ＩＴＲ）配列が挙げられる。ＩＴＲ配列は、例えば、５’末端及び３’末端のＡＡＶゲノム中に見出され、各々は、典型的には、約１４５塩基対を含有する。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＡＡＶベクターが細胞に組み込まれると相補的な鎖合成を容易にすることによって、ＡＡＶゲノム多重化にとって特に重要である。更に、ＩＴＲは、宿主細胞のゲノムへのＡＡＶゲノムのインテグレーション及びＡＡＶゲノムのカプシド形成にとって重要であることが示されている。ＩＴＲ配列の非限定的な例は、以下の表７に提供される。
本開示のベクターに組み込むのに適した追加の調節要素としては、ポリアデニル化配列（すなわち、ポリＡ配列）が挙げられる。ポリＡ配列は、アデニン塩基の伸長部を含有するＲＮＡテールである。これらの配列は、ＲＮＡ分子の３’末端に付着し、成熟ｍＲＮＡ転写産物を産生する。いくつかの生体プロセスは、ｍＲＮＡプロセシングに関連しており、輸送は、核外搬出、翻訳、及び安定性を含め、ポリＡ配列によって調整される。哺乳動物細胞において、ポリＡテールを短縮化すると、ｍＲＮＡ分解の尤度が増加する。ポリＡ配列の非限定的な例は、以下の表７に提供される。
他の例において、本開示のウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）は、本開示のアンチセンス構築物の発現を容易にすることができる１つ以上の調節配列要素を組み込む。一例において、調節配列要素は、イントロン配列である。例えば、本開示のベクターに含まれるのに適したイントロン配列は、キメライントロン、例えば、配列番号７４３の核酸配列を有するキメライントロン、又は配列番号７４３の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
別の例において、イントロン配列は、免疫グロブリン重鎖可変４（ＶＨ４）イントロン、例えば、配列番号７４４の核酸配列を有するＶＨ４配列、又は配列番号７４４の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
別の例において、調節配列要素は、エンハンサー配列である。例えば、エンハンサー配列は、ＣＭＶエンハンサー、例えば、配列番号７４５の核酸配列を有するＣＭＶエンハンサー、又は配列番号７４５の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
別の例において、調節配列要素は、ＩＴＲ配列、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ配列である。例えば、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ配列、例えば、配列番号７４６若しくは配列番号７４７の核酸配列を有するＡＡＶ ５’ＩＴＲ配列、又は配列番号７４６若しくは配列番号７４７の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る。
別の例において、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ ３’ＩＴＲ配列、例えば、配列番号７４８若しくは配列番号７４９の核酸配列を有するＡＡＶ ３’ＩＴＲ配列、又は配列番号７４８若しくは配列番号７４９の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
別の例において、調節配列要素は、ポリアデニル化シグナル（すなわち、ポリＡテール）である。例えば、本明細書に開示されるベクターとともに使用するのに適したポリアデニル化シグナルとしては、ウサギβ－グロビン（ＲＢＧ）ポリアデニル化シグナル、例えば、配列番号７５０、配列番号７５１、若しくは配列番号７９２の核酸配列を有するＲＢＧポリアデニル化シグナル、又は配列番号７５０、配列番号７５１、又は配列番号７９２の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７１％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントが挙げられる。開示される組成物及び方法と組み合わせて使用することができる別のポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、例えば、配列番号７９３のＢＧＨポリアデニル化シグナル、又は配列番号７９３の核酸配列に対して少なくとも７０％（例えば、少なくとも７１％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
ウイルスベクター
ウイルスゲノムは、哺乳動物細胞への外因性ポリヌクレオチドの効率的な送達のために使用することができる豊富なベクター源を提供する。このようなゲノム内に含有されるポリヌクレオチドが、典型的には、汎用又は特定の形質導入によって哺乳動物細胞の核ゲノムへと組み込まれるため、ウイルスゲノムは、遺伝子送達のために特に有用なベクターである。これらのプロセスは、天然のウイルス複製サイクルの一部として起こり、遺伝子インテグレーションを誘導するために、タンパク質又は試薬を追加する必要はない。ウイルスベクターの例は、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））、レトロウイルス（例えば、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅファミリーウイルスベクター）、アデノウイルス（例えば、Ａｄ５、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５、及びＡｄ４８）、コロナウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えば、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病及び水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹及びセンダイ）、プラス鎖ＲＮＡウイルス、例えば、ピコルナウイルス及びアルファウイルス、及びアデノウイルスを含む二本鎖ＤＮＡウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、ヘルペス単純ウイルス１型及び２型、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス）、並びにポックスウイルス（例えば、ワクシニア、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、鶏痘及びカナリアポックス）である。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒトフォーミーウイルス、及び肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例は、トリ白血病肉腫、トリＣ型ウイルス、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、オンコレトロウイルス、ＨＴＬＶ－ＢＬＶ群、レンチウイルス、アルファレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、スピューマウイルスである（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９９６）））。他の例は、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルス、マウス乳房腫瘍ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒヒ内在性ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、Ｍａｓｏｎ Ｐｆｉｚｅｒサルウイルス、サル免疫不全ウイルス、サル肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、及びレンチウイルスである。他のベクターの例は、例えば、ＭｃＶｅｙ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，８０１，０３０号）に記載され、その教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
ＡＡＶベクター
本明細書に記載の組成物の核酸は、例えば、本明細書に開示される方法と組み合わせて、細胞への導入を容易にするために、ＡＡＶベクター及び／又はＡＡＶビリオンに組み込まれ得る。ＡＡＶベクターは、中枢神経系で使用することができ、適切なプロモーター及び血清型は、例えば、Ｐｉｇｎａｔａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ１２５（３）：５７５－８９（２０１７）に考察されており、その開示は、ＣＮＳ遺伝子療法において有用なプロモーター及びＡＡＶ血清型に関する場合に参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の組成物及び方法に有用なｒＡＡＶベクターは、（１）発現される異種配列（例えば、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ標的化ＡＳＯ剤をコードするポリヌクレオチド）及び（２）異種遺伝子のインテグレーション及び発現を容易にするウイルス配列を含む、組換え核酸構築物である。ウイルス配列は、ビリオンへのＤＮＡの複製及びパッケージングのためにシスで必要とされるＡＡＶのこれらの配列（例えば、機能的ＩＴＲ）を含み得る。かかるｒＡＡＶベクターはまた、マーカー又はレポーター遺伝子を含有し得る。有用なｒＡＡＶベクターは、全体的に、又は一部分が欠失しているが、機能的隣接ＩＴＲ配列を保持するＡＡＶ ＷＴ遺伝子のうちの１つ以上を有する。ＡＡＶ ＩＴＲは、特定の用途に適した任意の血清型のものであり得る。ｒＡＡＶベクターを使用するための方法は、例えば、Ｔａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ． Ｓｃｉ．７：２７９（２０００）、及びＭｏｎａｈａｎ ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ７：２４（２０００）に記載されており、その各々の開示は、遺伝子送達のためのＡＡＶベクターに関する場合に参照により本明細書に組み込まれる。
本開示のＡＳＯ剤（例えば、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ、又はｓｈｍｉＲＮＡ）を組み込むためのベクターとして使用することができるＡＡＶの例としては、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ＥＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ－ＴＴ、ＡＡＶ－ＤＪ８、及びＡＡＶ．ＨＳＣ１６が挙げられる。
本明細書に記載の核酸及びベクターは、細胞への核酸又はベクターの導入を容易にするために、ｒＡＡＶビリオンに組み込まれ得る。ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ビリオンの外側の非核酸部分を構成し、ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子によってコードされる。ｃａｐ遺伝子は、ビリオン集合体に必要とされる３つのウイルスコートタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３をコードする。ｒＡＡＶビリオンの構築は、例えば、ＵＳ５，１７３，４１４、ＵＳ５，１３９，９４１、ＵＳ５，８６３，５４１、ＵＳ５，８６９，３０５、ＵＳ６，０５７，１５２、及びＵＳ ６，３７６，２３７、並びにＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７９１（２００２）、及びＢｏｗｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：４２３（２００３）に記載されており、その各々の開示は、遺伝子送達のためのＡＡＶベクターに関する場合に参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載の組成物及び方法と組み合わせて有用なｒＡＡＶビリオンとしては、ＡＡＶ １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及びｒｈ７４を含む種々のＡＡＶ血清型に由来するものが挙げられる。中枢神経系中に位置し、又は中枢神経系に送達される細胞を標的化するために、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９、及びＡＡＶ１０は、特に有用であり得る。異なる血清型のＡＡＶベクター及びＡＡＶタンパク質の構築及び使用は、例えば、Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：６１９（２０００）、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：３４２８（２０００）、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２２４（１９９８）、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ７４：１５２４（２０００）、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：６６１５（２００１）、及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５（２００１）に記載されており、その各々の開示は、遺伝子送達のためのＡＡＶベクターに関する場合に参照により本明細書に組み込まれる。
シュードタイプｒＡＡＶベクターも、本明細書に記載の組成物及び方法と組み合わせて有用である。シュードタイプベクターとしては、所与の血清型（ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ＥＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ－ＴＴ、ＡＡＶ－ＤＪ８、又はＡＡＶ．ＨＳＣ１６）以外の血清型に由来するカプシド遺伝子を有する所与のシュードタイプ血清型のＡＡＶベクターが挙げられる。例えば、ＡＡＶは、シュードタイプ組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター、例えば、ｒＡＡＶ２／８又はｒＡＡＶ２／９ベクターを含み得る。シュードタイプｒＡＡＶを産生し、使用するための方法は、当該技術分野で知られている（例えば、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：７６６２－７６７１（２００１）、Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１５２４－１５３２（２０００）、Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８：１５８－１６７（２００２）、及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５－３０８１，（２００１）を参照されたい。
ビリオンカプシド内に変異を有するＡＡＶビリオンを使用して、変異していないカプシドビリオンよりも効果的に特定の細胞型を感染させ得る。例えば、適切なＡＡＶ変異体は、特定の細胞型に対してＡＡＶを標的化するのを容易にするためのリガンド挿入変異を有し得る。挿入変異体、アラニンスクリーニング変異体、及びエピトープタグ変異体を含むＡＡＶカプシド変異体の構築及び特徴は、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：８６３５（２０００）に記載される。本明細書に記載の方法に使用することができる他のｒＡＡＶビリオンとしては、ウイルスの分子育種によって、及びエクソンシャッフリングによって生成されるそれらのカプシドハイブリッドが挙げられる。例えば、Ｓｏｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２５：４３６（２０００）、及びＫｏｌｍａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：４２３（２００１）を参照されたい。
本開示の組成物及び方法に使用されるｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ＥＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６、ＡＡＶ－ＴＴ、ＡＡＶＤＪ８から選択されるＡＡＶカプシドタンパク質からのカプシドタンパク質、又はそれらの誘導体、修飾、若しくはシュードタイプ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ＥＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ－ＴＴ、ＡＡＶ－ＤＪ８若しくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶカプシド血清型の例えばｖｐ１、ｖｐ２及び／若しくはｖｐ３配列に対して少なくとも８０％同一であるか、又はより同一である、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、若しくはそれより多く、すなわち最大１００％同一であるカプシドタンパク質を含み得る。
ＡＡＶベクターは、本明細書に記載の方法に使用することができ、その全体が参照により組み込まれるＺｉｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５：１０５６－１０６８に記載されるように、Ａｎｃ８０又はＡｎｃ８０Ｌ６５ベクターであり得る。ＡＡＶベクターは、以下のアミノ酸挿入のうちの１つを含み得る。各々が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７号、及び第９，５８７，２８２号、並びに米国特許出願第２０１６／０３７６３２３号に記載されるような、ＬＧＥＴＴＲＰ（‘９５６、‘５１７、‘２８２、若しくは‘３２３の配列番号１４）、又はＬＡＬＧＥＴＴＲＰ（‘９５６、‘５１７、‘２８２、若しくは‘３２３の配列番号１５）。代替的に、本明細書に記載の方法に使用されるＡＡＶベクターは、その各々が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，１９３，９５６号、第９，４５８，５１７号、及び第９，５８７，２８２号、並びに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号に記載されるような、ＡＡＶ．７ｍ８であり得る。更になお、本明細書に記載の方法に使用されるＡＡＶベクターは、米国特許第９，５８５，９７１号に開示される任意のＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂベクターであり得る。本明細書に記載の方法に使用される別のＡＡＶベクターは、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０（８）：１１７２－１１７９，２０１７）に開示される任意のベクター、例えば、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢであってもよく、アミノ酸位置５８８と５８９との間に挿入されたペプチドと、修飾Ａ５８７Ｄ／５８８Ｇを有するＡＡＶ９カプシドタンパク質を含む。更に、本明細書に記載される方法に使用されるＡＡＶベクターは、米国特許第９，８４０，７１９号及びＷＯ２０１５／０１３３１３に開示される任意のＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ．Ｒｈ７４又はＲＨＭ４－１ベクターであってもよく、その各々が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。これに加えて、本明細書に記載の方法に使用されるＡＡＶベクターは、ＷＯ２０１４／１７２６６９に開示される任意のＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ ｒｈ．７４であってもよく、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の方法に使用されるＡＡＶベクターはまた、Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２３：８５７－８６２、及びＧｅｏｒｇｉａｄｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２５：４５０に記載されるように、ＡＡＶ２／５ベクターであってもよく、その各々が、その全体が参照により組み込まれる。更なる例において、本明細書に記載の方法に使用されるＡＡＶベクターは、ＷＯ２０１７／０７０４９１に開示される任意のＡＡＶベクター、例えば、ＡＡＶ２ｔＹＦベクターであってもよく、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。これに加えて、本明細書に記載の方法に使用されるＡＡＶベクターは、Ｐｕｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２９（９）：４１８に記載されるように、ＡＡＶＬＫ０３又はＡＡＶ３Ｂベクターであってもよく、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。追加の例において、本明細書に記載の方法に使用されるＡＡＶベクターは、米国特許第８，６２８，９６６、ＵＳ８，９２７，５１４、ＵＳ９，９２３，１２０、及びＷＯ２０１６／０４９２３０に開示される任意のＡＡＶ、例えば、ＨＳＣ１、ＨＳＣ２、ＨＳＣ３、ＨＳＣ４、ＨＳＣ５、ＨＳＣ６、ＨＳＣ７、ＨＳＣ８、ＨＳＣ９、ＨＳＣ１０、ＨＳＣ１１、ＨＳＣ１２、ＨＳＣ１３、ＨＳＣ１４、ＨＳＣ１５、又はＨＳＣ１６であってもよく、その各々が、その全体が参照により組み込まれる。
更に、本明細書に記載の方法に使用されるＡＡＶベクターは、以下の特許及び特許出願のうちのいずれかに開示されるＡＡＶベクターであってもよく、その各々が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。米国特許第７，２８２，１９９号、第７，９０６，１１１号、第８，５２４，４４６号、第８，９９９，６７８号、第８，６２８，９６６号、第８，９２７，５１４号、第８，７３４，８０９号、ＵＳ９，２８４，３５７、第９，４０９，９５３号、第９，１６９，２９９号、第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７号、及び第９，５８７，２８２号、米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号、第２０１５／０１２６５８８号、第２０１７／００６７９０８号、第２０１３／０２２４８３６号、第２０１６／０２１５０２４号、第２０１７／００５１２５７号、及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号。ｒＡＡＶベクターは、以下の特許及び特許出願のうちのいずれかに開示されるＡＡＶカプシドベクターのｖｐ１、ｖｐ２及び／又はｖｐ３アミノ酸配列に対して少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又はそれより多く同一のカプシドタンパク質を有していてもよく、その各々が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。米国特許第７，２８２，１９９号、第７，９０６，１１１号、第８，５２４，４４６号、第８，９９９，６７８号、第８，６２８，９６６号、第８，９２７，５１４号、第８，７３４，８０９号、ＵＳ９，２８４，３５７、第９，４０９，９５３号、第９，１６９，２９９号、第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７号、及び第９，５８７，２８２号、米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号、第２０１５／０１２６５８８号、第２０１７／００６７９０８号、第２０１３／０２２４８３６号、第２０１６／０２１５０２４号、第２０１７／００５１２５７号、及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号。
これに加えて、ｒＡＡＶベクターは、国際出願 公開第ＷＯ２００３／０５２０５１号（例えば、‘０５１の配列番号２を参照されたい）、第ＷＯ２００５／０３３３２１号（例えば、‘３２１の配列番号１２３及び８８を参照されたい）、第ＷＯ０３／０４２３９７号（例えば、‘３９７の配列番号２、８１、８５、及び９７を参照されたい）、第ＷＯ２００６／０６８８８８号（例えば、‘８８８の配列番号１及び３～６を参照されたい）、第ＷＯ２００６／１１０６８９号（例えば、‘６８９の配列番号５～３８を参照されたい）、第ＷＯ２００９／１０４９６４号（例えば、‘９６４の配列番号１～５、７、９、２０、２２、２４、及び３１を参照されたい）、第Ｗ０２０１０／１２７０９７号（例えば、‘０９７の配列番号５～３８を参照されたい）、及び第ＷＯ２０１５／１９１５０８号（例えば、‘０５８の配列番号８０～２９４を参照されたい）、及び米国出願公開第２０１５／００２３９２４号（例えば、‘９２４の配列番号１、５～１０を参照されたい）（その各々の内容が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるカプシドタンパク質を有していてもよく、例えば、国際出願 公開第ＷＯ２００３／０５２０５１号（例えば、‘０５１の配列番号２を参照されたい）、第ＷＯ２００５／０３３３２１号（例えば、‘３２１の配列番号１２３及び８８を参照されたい）、第ＷＯ０３／０４２３９７号（例えば、‘３９７の配列番号２、８１、８５、及び９７を参照されたい）、第ＷＯ２００６／０６８８８８号（例えば、‘８８８の配列番号１及び３～６を参照されたい）、第ＷＯ２００６／１１０６８９号（例えば、‘６８９の配列番号５～３８を参照されたい）、第ＷＯ２００９／１０４９６４号（例えば、‘９６４の配列番号１～５、７、９、２０、２２、２４、及び３１を参照されたい）、第Ｗ０２０１０／１２７０９７号（例えば、‘０９７の配列番号５～３８を参照されたい）、及び第ＷＯ２０１５／１９１５０８号（例えば、‘０５８の配列番号８０～２９４を参照されたい）、及び米国出願公開第２０１５／００２３９２４号（例えば、‘９２４の配列番号１、５～１０を参照されたい）に開示されるＡＡＶカプシドのｖｐ１、ｖｐ２及び／又はｖｐ３アミノ酸配列に対して少なくとも８０％以上同一、例えば、８５％、８５％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又はそれより多く同一であるカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶベクターであってもよい。
ＡＡＶ系ウイルスベクターの核酸配列、並びに組換えＡＡＶ及びＡＡＶカプシドを作製する方法は、例えば、米国特許第７，２８２，１９９号、第７，９０６，１１１号、第８，５２４，４４６号、第８，９９９，６７８号、第８，６２８，９６６号、第８，９２７，５１４号、第８，７３４，８０９号、ＵＳ９，２８４，３５７、第９，４０９，９５３号、第９，１６９，２９９号、第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７号、及び第９，５８７，２８２号、米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号、第２０１５／０１２６５８８号、第２０１７／００６７９０８号、第２０１３／０２２４８３６号、第２０１６／０２１５０２４号、第２０１７／００５１２５７号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９号、第ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５号、第ＷＯ２００３／０５２０５１号、第ＷＯ２００５／０３３３２１号、第ＷＯ０３／０４２３９７号、第ＷＯ２００６／０６８８８８号、第ＷＯ２００６／１１０６８９号、第ＷＯ２００９／１０４９６４号、第Ｗ０２０１０／１２７０９７号、及び第ＷＯ２０１５／１９１５０８号、及び米国出願公開第２０１５／００２３９２４号に教示される。
したがって、ｒＡＡＶベクターは、２つ以上のＡＡＶカプシド血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ＥＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ－ＴＴ、ＡＡＶ－ＤＪ８、又はＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択されるＡＡＶ血清型からのカプシドタンパク質を含有するカプシドを含み得る。
一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターを、開示される方法及び組成物と組み合わせて使用することができる。代替的に、自己相補性ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ）を使用し得る（例えば、その各々が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｕ，２００７，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１８（２）：１７１－８２、ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４、及び米国特許第６，５９６，５３５号、第７，１２５，７１７号及び第７，４５６，６８３号を参照されたい）。
中枢神経系の中の細胞（限定されないが、ニューロン及び／又はグリア細胞を含む）への向性を有する組換えＡＡＶベクターを、本開示のポリヌクレオチド剤（例えば、ＡＳＯ剤）を送達するために使用することができる。かかるベクターとしては、非複製「ｒＡＡＶ」ベクター、特にＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ１０カプシドを保有するものを挙げることができる。限定されないが、Ｗｉｌｓｏｎによって米国特許第７，９０６，１１１号に記載されるもの（その全体が参照により本明細書に組み込まれ、ＡＡＶ／ｈｕ．３１及びＡＡＶ／ｈｕ．３２が特に好ましい）、並びに米国特許第８，６２８，９６６号、米国特許第８，９２７，５１４号、及びＳｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２２：１６２５－１６３４（その各々が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって記載されるＡＡＶバリアントカプシドを含む、ＡＡＶバリアントカプシドを使用し得る。更に、Ｔｏｒｄｏ ｅｔ ａｌ．（Ｂｒａｉｎ１４１：２０１４－３１、２０１８、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって開示されるＡＡＶ－ＴＴベクターは、天然ＡＡＶ２単離物の中で保存されるアミノ酸配列を組み込んでおり、これを本開示の組成物及び方法と組み合わせて使用してもよい。ＡＡＶ－ＴＴバリアントカプシドは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９、及びＡＡＶｒｈ１０と比較して、ＣＮＳ全体で増強された向神経性及び強固な分布を示す。同様に、Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．（ＰＬｏＳＯＮＥ １２（２）：ｅ０１８８８３０、２０１７、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるＡＡＶ－ＤＪ８ベクターは、優れた向神経性を示し、本開示の組成物及び方法とともに使用するのに適している場合がある。
特定の例において、本開示は、ＡＡＶ９ベクターであって、（ｉ）調節配列の制御下で、ＩＴＲによって隣接される、ＡＳＯ配列（例えば、配列番号１～１００のうちのいずれか１つ）をコードするポリヌクレオチドを含有する発現カセット、並びに（ｉｉ）ＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸配列を有するか、又はＡＡＶ９カプシドの生物学的機能を保持しつつ、ＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは９９．９％同一であるウイルスカプシドを含む、人工ゲノムを含むＡＡＶ９ベクターを特徴とする。コードされるＡＡＶ９カプシドは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，９０６，１１１号に示される配列番号１１６の配列を有していてもよく、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のアミノ酸置換を有し、ＡＡＶ９カプシドの生物学的機能を保持している。
また、ＡＡＶｒｈ１０ベクターであって、（ｉ）調節要素の制御下で、ＩＴＲによって隣接される、ポリヌクレオチドを含有する発現カセット、並びに（ｉｉ）ＡＡＶｒｈ１０カプシドタンパク質のアミノ酸配列を有するか、又はＡＡＶｒｈ１０カプシドの生物学的機能を保持しつつ、ＡＡＶｒｈ１０カプシドタンパク質のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは９９．９％同一であるウイルスカプシドを含む、人工ゲノムを含むＡＡＶｒｈ１０ベクターが本明細書で提供される。コードされるＡＡＶｒｈ１０カプシドは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，７９０，４２７号に示される配列番号８１の配列を有していてもよく、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のアミノ酸置換を有し、ＡＡＶｒｈ１０カプシドの生物学的機能を保持している。
遺伝子調節要素は、哺乳動物細胞（例えば、ニューロン）において機能的であるように選択され得る。作動可能に連結された構成要素を含有する得られた構築物は、（５’及び３’の）機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列によって隣接される。特定の例としては、哺乳動物ＣＮＳの細胞、特にニューロンへの向性を有し、それらにおける高い形質導入効率を有するＡＡＶ血清型に由来するベクターが挙げられる。異なる血清型の形質導入効率の概要及び比較が、本特許出願で提供される。特定の例において、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ９、及びＡＡＶｒｈ１０に基づくベクターは、例えば、ニューロン及び／又はグリア細胞に形質導入することによって、ＣＮＳにおけるポリヌクレオチドの長期間にわたる発現を指令する。
ＡＡＶ ＩＴＲによって隣接される、目的のポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載のＡＳＯ剤をコードするポリヌクレオチド）を有するＡＡＶ発現ベクターは、選択した配列を、そこから切断される主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を有していたＡＡＶゲノムへと直接的に挿入することによって構築することができる。複製及びパッケージング機能が可能であるようにＩＴＲの十分な部分が保持されている限り、ＡＡＶゲノムの他の部分も、欠失していてもよい。かかる構築物を、当該技術分野でよく知られている技術を使用して設計することができる。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号及び第５，１３９，９４１号、国際公開第ＷＯ９２／０１０７０号（１９９２年１月２３日に公開された）及び第ＷＯ９３／０３７６９号（１９９３年３月４日に公開された）を参照されたい。代替的に、ＡＡＶ ＩＴＲは、ウイルスゲノムから、又はそれを含有するＡＡＶベクターから切断され、標準的な核酸ライゲーション技術を使用して、別のベクター中に存在する選択された核酸構築物の５’末端及び３’末端に融合させることができる。ＩＴＲを含有するＡＡＶベクターは、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号に記載されている。特に、いくつかのＡＡＶベクターは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）からアクセッション番号５３２２２、５３２２３、５３２２４、５３２２５、及び５３２２６で入手可能であり、そこに記載される。これに加えて、１つ以上の選択された核酸配列に対して５’及び３’に配置されたＡＡＶ ＩＴＲを含むように、キメラ遺伝子を合成によって産生し得る。哺乳動物ＣＮＳ細胞におけるキメラ遺伝子配列の発現にとって好ましいコドンを使用してもよく、特定の場合において、ポリヌクレオチドのコドン最適化を、よく知られている方法によって行うことができる。完全なキメラ配列は、標準的な方法によって調製された重複するポリヌクレオチドから組み立てられる。ＡＡＶビリオンを産生するために、ＡＡＶ発現ベクターを、既知の技術（例えば、トランスフェクションによる）を使用して、適切な宿主細胞へと導入する。いくつかのトランスフェクション技術は、当該技術分野で一般に知られている。特に適したトランスフェクション方法としては、リン酸カルシウム共沈殿、培養細胞への直接的なマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性遺伝子移入、脂質媒介性形質導入、及び高速微粒子銃を使用した核酸送達が挙げられる。
例えば、本開示の特定のウイルスベクターは、本開示の核酸配列（例えば、配列番号１～１００のうちのいずれか１つ）に加えて、ＡＡＶ２ウイルスに由来するＩＴＲを有するＡＡＶベクタープラスミドの骨格、プロモーター、例えば、Ｕ６核内低分子１プロモーター若しくはそのバリアント、Ｈ１プロモーター、７ＳＫプロモーター、ＡｐｏＥ－ｈＡＡＴプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＣＫ８プロモーター、ｍＵ１ａプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＴＢＧプロモーター、マウスＰＧＫプロモーター若しくはＣＡＧプロモーター、又は任意のニューロンプロモーター、例えば、ｈＳｙｎプロモーター、ＮｅｕＮプロモーター、ＣａＭＫＩＩプロモーター、Ｔα－１プロモーター、ＮＳＥプロモーター、ＰＤＧＦβプロモーター、ＶＧＬＵＴプロモーター、ＳＳＴプロモーター、ＮＰＹプロモーター、ＶＩＰプロモーター、ＰＶプロモーター、ＧＡＤ６５若しくはＧＡＤ６７プロモーター、ＤＲＤ１プロモーター、ＤＲＤ２プロモーター、ＭＡＰ１Ｂプロモーター、Ｃ１ｑｌ２プロモーター、ＰＯＭＣプロモーター、又はＰｒｏｘ１プロモーター（ＷＰＰＥの野生型又は変異体型を伴うか、又は伴わない）、並びにウサギベータ－グロビンポリＡ配列を含み得る（表５及び表６を参照されたい）。
本開示は更に、ｒＡＡＶであって、（ｉ）調節要素の制御下、ＩＴＲによって隣接されるポリヌクレオチドを含有する発現カセットと、（ｉｉ）ＡＡＶカプシドと、を含み、ポリヌクレオチドが、阻害性ＲＮＡ（例えば、ＡＳＯ、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ、又はｓｈｍｉＲＮＡ、特に、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列を有するＡＳＯ、又は少なくともＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡの一部又は領域（例えば、配列番号１１５～６８１に記載されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡの一部又は領域のうちのいずれか１つ）に特異的に結合し、細胞（例えば、ニューロン）におけるＧｌｕＫ２タンパク質の発現を阻害する（例えば、ノックダウンする）配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントをコードする、ｒＡＡＶに関する。
ＡＡＶベクターは、例えば、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ、又はｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ｈＳｙｎプロモーターと、を含み得る。例えば、ＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び配列番号７９０のうちのいずれか１つの核酸配列を有するｈＳｙｎプロモーター、又は配列番号６８２～６８５若しくは配列番号７９０のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含有し得る。
代替的に、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＮｅｕＮプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＮｅｕＮプロモーター（例えば、配列番号６８６の核酸配列を有するＮｅｕＮプロモーター、又は配列番号６８６の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＣａＭＫＩＩプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び配列番号８０２のうちのいずれか１つの核酸配列を有するＣａＭＫＩＩプロモーター、又は配列番号６８７～６９１及び配列番号８０２のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＮＳＥプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＮＳＥプロモーター（例えば、配列番号６９２若しくは６９３の核酸配列を有するＮＳＥプロモーター、又は配列番号６９２若しくは６９３の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＰＤＧＦβプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＰＤＧＦβプロモーター（例えば、配列番号６９４～６９６のうちのいずれか１つの核酸配列を有するＰＤＧＦβプロモーター、又は配列番号６９４～６９６のうちのいずれか１つのうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＶＧｌｕＴプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＶＧｌｕＴプロモーター（例えば、配列番号６９７～７０１のうちのいずれか１つの核酸配列を有するＶＧｌｕＴプロモーター、又は配列番号７０８～７１２のうちのいずれか１つのうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＳＳＴプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＳＳＴプロモーター（例えば、配列番号７０２若しくは配列番号７０３の核酸配列を有するＳＳＴプロモーター、又は配列番号７０２若しくは配列番号７０３のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＮＰＹプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＮＰＹプロモーター（例えば、配列番号７０４の核酸配列を有するＮＰＹプロモーター、又は配列番号７０４の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＶＩＰプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＶＩＰプロモーター（例えば、配列番号７０５若しくは配列番号７０６の核酸配列を有するＶＩＰプロモーター、又は配列番号７０５若しくは配列番号７０６の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＰＶプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＰＶプロモーター（例えば、配列番号７０７～７０９のうちのいずれか１つの核酸配列を有するＰＶプロモーター、又は配列番号７０７～７０９のうちのいずれか１つのうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＧＡＤ６５プロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＧＡＤ６５プロモーター（例えば、配列番号７１０～７１３のうちのいずれか１つの核酸配列を有するＧＡＤ６５プロモーター、又は配列番号７１０～７１３のうちのいずれか１つのうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＧＡＤ６７プロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＧＡＤ６７プロモーター（例えば、配列番号７１４若しくは配列番号７１５の核酸配列を有するＧＡＤ６７プロモーター、又は配列番号７１４若しくは７１５の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＤＲＤ１プロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＤＲＤ１プロモーター（例えば、配列番号７１６の核酸配列を有するＤＲＤ１プロモーター、又は配列番号７１６の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＤＲＤ２プロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＤＲＤ２プロモーター（例えば、配列番号７１７若しくは配列番号７１８の核酸配列を有するＤＲＤ２プロモーター、又は配列番号７１７若しくは配列番号７１８の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、Ｃ１ｑｌ２プロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、Ｃ１ｑｌ２プロモーター（例えば、配列番号７１９若しくは配列番号７９１の核酸配列を有するＣ１ｑｌ２プロモーター、又は配列番号７１９若しくは配列番号７９１の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＰＯＭＣプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＰＯＭＣプロモーター（例えば、配列番号７２０の核酸配列を有するＰＯＭＣプロモーター、又は配列番号７２０の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、を含み得る。
代替的に、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＰＲＯＸ１プロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＰＲＯＸ１プロモーター（例えば、配列番号７２１若しくは配列番号７２２の核酸配列を有するＰＲＯＸ１プロモーター、又は配列番号７２１若しくは配列番号７２２の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＭＡＰ１Ｂプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＭＡＰ１Ｂプロモーター（例えば、配列番号７２３～７２５のうちのいずれか１つの核酸配列を有するＭＡＰ１Ｂプロモーター、又は配列番号７２３～７２５のうちのいずれか１つのうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、Ｔα－１プロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、Ｔα－１プロモーター（例えば、配列番号７２６若しくは配列番号７２７の核酸配列を有するＴα－１プロモーター、又は配列番号７２６若しくは配列番号７２７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、Ｕ６プロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、Ｕ６プロモーター、例えば、配列番号７２８～７３３若しくは７７２のうちのいずれか１つの核酸配列を有するＵ６プロモーター、又は配列番号７２８～７３３若しくは７７２のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、を含み得る。
代替的に、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、Ｈ１プロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、Ｈ１プロモーター、例えば、配列番号７３４の核酸配列を有するＨ１プロモーター、又は配列番号７３４の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、を含み得る。
代替的に、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、７ＳＫプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、７ＳＫプロモーター、例えば、配列番号７３５の核酸配列を有する７ＳＫプロモーター、又は配列番号７３５の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、を含み得る。
代替的に、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＡｐｏＥ－ｈＡＡＴプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＡｐｏＥ－ｈＡＡＴプロモーター、例えば、配列番号７３６の核酸配列を有するＡｐｏＥ－ｈＡＡＴプロモーター、又は配列番号７３６の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、を含み得る。
代替的に、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＣＡＧプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＣＡＧプロモーター、例えば、配列番号７３７の核酸配列を有するＣＡＧプロモーター、又は配列番号７３７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、を含み得る。
代替的に、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＣＢＡプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＣＢＡプロモーター、例えば、配列番号７３８の核酸配列を有するＣＢＡプロモーター、又は配列番号７３８の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、を含み得る。
代替的に、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＣＫ８プロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＣＫ８プロモーター、例えば、配列番号７３９の核酸配列を有するＣＫ８プロモーター、又は配列番号７３９の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、を含み得る。
代替的に、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ｍＵ１ａプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ｍＵ１ａプロモーター、例えば、配列番号７４０の核酸配列を有するｍＵ１ａプロモーター、又は配列番号７４０の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、を含み得る。
代替的に、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＥＦ－１αプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＥＦ－１αプロモーター、例えば、配列番号７４１の核酸配列を有するＥＦ－１αプロモーター、又は配列番号７４１の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、を含み得る。
代替的に、ＡＡＶベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＴＢＧプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるＡＡＶベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＴＢＧプロモーター、例えば、配列番号７４２の核酸配列を有するＴＢＧプロモーター、又は配列番号７４２の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、を含み得る。
レトロウイルスベクター
本明細書に記載の方法及び組成物に使用される送達ベクターは、レトロウイルスベクターであり得る。本明細書に記載の方法及び組成物に使用され得るレトロウイルスベクターの１つの型は、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクター（ＬＶ）は、レトロウイルスのサブセットであり、高い有効性を有し、ポリヌクレオチドの安定な長期間の発現を与える、広範囲の分裂又は非分裂細胞型を形質導入する。ＬＶをパッケージングし、形質導入するための最適化戦略の概要は、Ｄｅｌｅｎｄａ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：Ｓ１２５（２００４）に提供され、その開示が、参照により本明細書に組み込まれる。
レンチウイルスベースの遺伝子移入技術の使用は、目的のポリヌクレオチドが収容される高度に欠失したウイルスゲノムを保有する組換えレンチウイルス粒子のインビトロ産生に依存する。特に、組換えレンチウイルスは、（１）パッケージング構築物、すなわち、Ｒｅｖと一緒にＧａｇ－Ｐｏｌ前駆体を発現する（代替的にトランスで発現する）ベクター、（２）エンベロープ受容体を発現する、一般に、異種性を有するベクター、及び（３）全てのオープンリーディングフレームを欠いているが、発現される配列が挿入される場合の複製、カプシド化及び発現に必要とされる配列を維持するウイルスｃＤＮＡで構成されるトランスファーベクターの許容される細胞株でのトランス共発現によって回収される。
本明細書に記載の方法及び組成物に使用されるＬＶは、５’の長い末端反復（ＬＴＲ）、ＨＩＶシグナル配列、ＨＩＶ Ｐｓｉシグナル５’－スプライス部位（ＳＤ）、デルタ－ＧＡＧ要素、Ｒｅｖ応答性要素（ＲＲＥ）、３’－スプライス部位（ＳＡ）、伸長因子（ＥＦ）１－アルファプロモーター、及び３’－自己不活性化ＬＴＲ（ＳＩＮ－ＬＴＲ）のうちの１つ以上を含み得る。レンチウイルスベクターは、任意選択的に、その開示がＷＰＲＥに関する場合に参照により本明細書に組み込まれるＵＳ６，１３６，５９７に記載されるように、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）と、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）と、を含む。レンチウイルスベクターは、ｐＨＲ’骨格を更に含んでいてもよく、例えば以下に提供されるものを含んでいてもよい。
Ｔｈｅ Ｌｅｎｔｉｇｅｎ ＬＶ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｉｎ Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：９６３（２００４）を使用して、ＤＮＡ分子及び／又は形質導入細胞を発現し得る。本明細書に記載の方法及び組成物に使用されるＬＶは、５’の長い末端反復（ＬＴＲ）、ＨＩＶシグナル配列、ＨＩＶ Ｐｓｉシグナル５’－スプライス部位（ＳＤ）、デルタ－ＧＡＧ要素、Ｒｅｖ応答性要素（ＲＲＥ）、３’－スプライス部位（ＳＡ）、伸長因子（ＥＦ）１－アルファプロモーター、及び３’－自己不活性化Ｌ ＴＲ（ＳＩＮ－ＬＴＲ）であり得る。任意選択的に、これらの領域のうちの１つ以上は、同様の機能を発揮する別の領域で置換される。
エンハンサー要素を使用して、修飾ＤＮＡ分子の発現を増加させるか、又はレンチウイルスインテグレーション効率を増加させることができる。本明細書に記載の方法及び組成物に使用されるＬＶは、ｎｅｆ配列を含み得る。本明細書に記載の方法及び組成物に使用されるＬＶは、ベクターインテグレーションを増強させるｃＰＰＴ配列を含み得る。ｃＰＰＴは、（＋）－鎖ＤＮＡ合成の第２の起源として作用し、そのネイティブＨＩＶゲノムの中央に部分的な鎖の重複を導入する。トランスファーベクター骨格にｃＰＰＴ配列を導入すると、核輸送、及び標的細胞のＤＮＡにインテグレーションされたゲノムの総量を強く増加させた。本明細書に記載の方法及び組成物に使用されるＬＶは、ウッドチャック転写後調節要素（ＷＰＲＥ）を含み得る。ＷＰＲＥは、転写産物の核外排出を促進することによって、及び／又は新生転写産物のポリアデニル化の効率を増加させることによって、転写レベルで作用し、したがって、細胞におけるｍＲＮＡの総量を増加させる。ＬＶにＷＰＲＥを付加することで、インビトロ及びインビボの両方で、いくつかの異なるプロモーターからのポリヌクレオチド発現のレベルを実質的に改善する。本明細書に記載の方法及び組成物に使用されるＬＶは、ｃＰＰＴ配列及びＷＰＲＥ配列を両方とも含み得る。ベクターは、単一プロモーターからの複数ポリペプチドの発現を可能にするＩＲＥＳ配列も含み得る。
ＩＲＥＳ配列に加えて、複数ポリヌクレオチドの発現を可能にする他の要素が有用である。本明細書に記載の方法及び組成物に使用されるベクターは、１つより多いポリヌクレオチドの発現を可能にする複数プロモーターを含み得る。将来的に特定される複数ポリヌクレオチドの発現を可能にする他の要素が有用であり、本明細書に記載の組成物及び方法とともに使用するのに適したベクターにおいて利用され得る。本明細書に記載の方法及び組成物に使用されるベクターは、臨床グレードのベクターであり得る。
したがって、レトロウイルスベクターは、開示される方法及び組成物と組み合わせて使用され得る。レトロウイルスは、その遺伝子を宿主ゲノムにインテグレーションし、大量の外来遺伝材料を移入し、広いスペクトルの種及び細胞型を感染させる能力に起因して、特定の細胞株にパッケージングされるために、遺伝子送達ベクターとして選択され得る。レトロウイルスベクターを構築するために、目的の遺伝子をコードする核酸を、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入して、複製欠損性であるウイルスを産生する。ビリオンを産生するために、ｇａｇ、ｐｏｌ、及び／又はｅｎｖ遺伝子を含有するが、ＬＴＲ及び／又はパッケージング構成要素を含まない、パッケージング細胞株を構築する。ｃＤＮＡを含有する組換えプラスミドが、レトロウイルスＬＴＲ及びパッケージング配列と一緒に、（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）この細胞株に導入される場合、パッケージング配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写産物をウイルス粒子内にパッケージングすることが可能であり、次いで培養培地へと分泌される。次いで、組換えレトロウイルスを含有する媒体を集め、任意選択的に濃縮し、遺伝子移入に使用する。レトロウイルスベクターは、広範囲の細胞型を感染させることができる。
これに加えて、レンチウイルスベクターは、本明細書に開示される方法及び組成物と組み合わせて使用され得る。したがって、本開示の目的は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ、又はｓｈｍｉＲＮＡ）配列（例えば、配列番号１～１００に記載されるＡＳＯ配列のうちのいずれか１つ）を含むレンチウイルスベクターに関する。
したがって、レンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントを含み得る。レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ、又はｓｈｍｉＲＮＡ）と、ｈｓｙｎプロモーターと、を含み得る。
レンチウイルスベクターは、例えば、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ、又はｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ｈＳｙｎプロモーターと、を含み得る。例えば、レンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び配列番号７９０のうちのいずれか１つのうちのいずれか１つの核酸配列を有するｈＳｙｎプロモーター、又は配列番号６８２～６８５及び配列番号７９０のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含有し得る。
代替的に、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＮｅｕＮプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＮｅｕＮプロモーター（例えば、配列番号６８６の核酸配列を有するＮｅｕＮプロモーター、又は配列番号６８６の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、を含み得る。
代替的に、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＣａＭＫＩＩプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び配列番号８０２のうちのいずれか１つのうちのいずれか１つの核酸配列を有するＣａＭＫＩＩプロモーター、又は配列番号６８７～６９１及び配列番号８０２のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含有し得る。
代替的に、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＮＳＥプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＮＳＥプロモーター（例えば、配列番号６９２若しくは配列番号６９３の核酸配列を有するＮＳＥプロモーター、又は配列番号６９２若しくは配列番号６９３の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＰＤＧＦβプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＰＤＧＦβプロモーター（例えば、配列番号６９４～６９６のうちのいずれか１つの核酸配列を有するＰＤＧＦβプロモーター、又は配列番号６９４～６９６のうちのいずれか１つのうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＶＧｌｕＴプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＶＧｌｕＴプロモーター（例えば、配列番号６９７～７０１のうちのいずれか１つの核酸配列を有するＶＧｌｕＴプロモーター、又は配列番号６９７～７０１のうちのいずれか１つのうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＳＳＴプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＳＳＴプロモーター（例えば、配列番号７０２若しくは配列番号７０３のうちのいずれか１つの核酸配列を有するＳＳＴプロモーター、又は配列番号７０２若しくは配列番号７０３のうちのいずれか１つのうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＮＰＹプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＮＰＹプロモーター（例えば、配列番号７０４の核酸配列を有するＮＰＹプロモーター、又は配列番号７０４のうちのいずれか１つのうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＶＩＰプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＶＩＰプロモーター（例えば、配列番号７０５若しくは配列番号７０６の核酸配列を有するＶＩＰプロモーター、又は配列番号７０５若しくは配列番号７０６のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＰＶプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＰＶプロモーター（例えば、配列番号７０７～７０９のうちのいずれか１つの核酸配列を有するＳＰＶプロモーター、又は配列番号７０７～７０９のうちのいずれか１つのうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＧＡＤ６５プロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＧＡＤ６５プロモーター（例えば、配列番号７１０～７１３のうちのいずれか１つの核酸配列を有するＧＡＤ６５プロモーター、又は配列番号７１０～７１３のうちのいずれか１つのうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＧＡＤ６７プロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＧＡＤ６７プロモーター（例えば、配列番号７１４若しくは配列番号７１５の核酸配列を有するＧＡＤ６７プロモーター、又は配列番号７１４若しくは配列番号７１５のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＤＲＤ１プロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＤＲＤ１プロモーター（例えば、配列番号７１６の核酸配列を有するＤＲＤ１プロモーター、又は配列番号７１６のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＤＲＤ２プロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＤＲＤ２プロモーター（例えば、配列番号７１７若しくは配列番号７１８の核酸配列を有するＤＲＤ２プロモーター、又は配列番号７１７若しくは配列番号７１８のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、Ｃ１ｑｌ２プロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、Ｃ１ｑｌ２プロモーター（例えば、配列番号７１９若しくは配列番号７９１の核酸配列を有するＣ１ｑｌ２プロモーター、又は配列番号７１９若しくは配列番号７９１の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＰＯＭＣプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＰＯＭＣプロモーター（例えば、配列番号７２０の核酸配列を有するＰＯＭＣプロモーター、又は配列番号７２０のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＰＲＯＸ１プロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＰＲＯＸ１プロモーター（例えば、配列番号７２１若しくは配列番号７２２の核酸配列を有するＰＲＯＸ１プロモーター、又は配列番号７２１若しくは配列番号７２２のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＭＡＰ１Ｂプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＭＡＰ１Ｂプロモーター（例えば、配列番号７２３～７２５のうちのいずれか１つの核酸配列を有するＭＡＰ１Ｂプロモーター、又は配列番号７２３～７２５のうちのいずれか１つのうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、Ｔα－１プロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、Ｔα－１プロモーター（例えば、配列番号７２６若しくは配列番号７２７の核酸配列を有するＴα－１プロモーター、又は配列番号７２６若しくは配列番号７２７のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含み得る。
代替的に、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、Ｕ６プロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、Ｕ６プロモーター（例えば、配列番号７２８～７３３若しくは７７２のうちのいずれか１つの核酸配列を有するＵ６プロモーター、又は配列番号７２８～７３３若しくは７７２のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、を含み得る。
代替的に、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、Ｈ１プロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、Ｈ１プロモーター、例えば、配列番号７３４のうちのいずれか１つの核酸配列を有するＨ１プロモーター、又は配列番号７３４の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、を含み得る。
代替的に、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、７ＳＫプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、７ＳＫプロモーター、例えば、配列番号７３５の核酸配列を有する７ＳＫプロモーター、又は配列番号７３５の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、を含み得る。
代替的に、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＡｐｏＥ－ｈＡＡＴプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＡｐｏＥ－ｈＡＡＴプロモーター、例えば、配列番号７３６の核酸配列を有するＡｐｏＥ－ｈＡＡＴプロモーター、又は配列番号７３６の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、を含み得る。
代替的に、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＣＡＧプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＣＡＧプロモーター、例えば、配列番号７２７の核酸配列を有するＣＡＧプロモーター、又は配列番号７３７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、を含み得る。
代替的に、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＣＢＡプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＣＢＡプロモーター、例えば、配列番号７３８の核酸配列を有するＣＢＡプロモーター、又は配列番号７３８の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、を含み得る。
代替的に、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＣＫ８プロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＣＫ８プロモーター、例えば、配列番号７３９の核酸配列を有するＣＫ８プロモーター、又は配列番号７３９の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、を含み得る。
代替的に、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ｍＵ１ａプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ｍＵ１ａプロモーター、例えば、配列番号７４０の核酸配列を有するｍＵ１ａプロモーター、又は配列番号７４０の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、を含み得る。
代替的に、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＥＦ－１αプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＥＦ－１αプロモーター、例えば、配列番号７４１の核酸配列を有するＥＦ－１αプロモーター、又は配列番号７４１の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、を含み得る。
代替的に、レンチウイルスベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するＡＳＯ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ）配列と、ＴＢＧプロモーターと、を含み得る。例えば、開示されるレンチウイルスベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、ＴＢＧプロモーター、例えば、配列番号７４２の核酸配列を有するＴＢＧプロモーター、又は配列番号７４２の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、を含み得る。
レンチウイルスは、複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖに加えて、調節機能又は構造機能を有する他の遺伝子を含有する。複雑さが増すほど、潜伏感染の経過と同様に、ウイルスにその寿命を調節させることができる。レンチウイルスのいくつかの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ１、ＨＩＶ２）、及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ毒性遺伝子の多重弱毒化によって生成されており、例えば、遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、及びｎｅｆが欠失しており、ベクターを生物学的安全なものにする。レンチウイルスベクターは、当該技術分野で知られており、例えば、その両方が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０１３，５１６号及び５，９９４，１３６号を参照されたい。一般に、ベクターは、プラスミド系又はウイルス系であり、外来核酸を組み込むために、選択のために、また、核酸を宿主細胞に移送するために、必須の配列を保有するように構成される。目的のベクターのｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子も、当該技術分野で知られている。したがって、関連する遺伝子は、選択されたベクターへとクローニングされ、次いで、これを使用して、目的の標的細胞を形質転換する。非分裂細胞を感染させることができ、適切な宿主細胞が、パッケージングタンパク質（すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ、並びにｒｅｖ及びｔａｔ）を保有する２つ以上のベクターにトランスフェクトされる組換えレンチウイルスは、米国特許第５，９９４，１３６号に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。この刊行物は、ウイルスのｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子をコードする核酸を提供することができる第１のベクターと、ウイルスのｅｎｖをコードする核酸を提供してパッケージング細胞を産生することができる第２のベクターと、を提供する。上述のパッケージング細胞に、異種遺伝子を提供するベクターを導入すると、目的の外来遺伝子を保有する感染性ウイルス粒子を放出するプロデューサー細胞が得られる。ｅｎｖは、ヒト及び他の種の細胞の形質導入を可能にする、両種性エンベロープタンパク質であり得る。典型的には、本開示の核酸分子又はベクターは、「制御配列」を含み、制御配列は、まとめて、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写停止配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサー等、まとまってレシピエント細胞におけるコード配列の複製、転写及び翻訳を提供するものを指す。選択されるコード配列が、適切な宿主細胞において複製され、転写され、翻訳され得る限り、これらの制御配列の全てが常に存在する必要はない。
ウイルス調節要素
ウイルス調節要素は、核酸分子を宿主細胞に導入するために使用される送達ビヒクルの構成要素である。ウイルス調節要素は、任意選択的に、レトロウイルス調節要素である。例えば、ウイルス調節要素は、ＨＳＣ１又はＭＳＣＶからのＬＴＲ及びｇａｇ配列であり得る。レトロウイルス調節要素は、レンチウイルスからのものであってもよく、又は他のゲノム領域から特定される異種配列であってもよい。他のウイルス調節要素が既知のものになるにつれて、これらを、本明細書に記載の方法及び組成物とともに使用してもよい。
Ｇｒｉｋ２アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするウイルスベクター
本開示は、異種ポリヌクレオチドの送達のための核酸ベクターであって、ポリヌクレオチドが、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに特異的に結合し、細胞においてＧｌｕＫ２タンパク質の発現を阻害する、阻害性ＡＳＯ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ、又はｓｈｍｉＲＮＡ）構築物をコードする、核酸ベクターに関する。したがって、本開示の目的は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの少なくとも領域又は一部（例えば、配列番号１１５～６８１のうちのいずれか１つから選択されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡの領域又は一部のうちのいずれか１つ、又は配列番号１１５～６８１のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントに対して完全又は実質的に相補的であるオリゴヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。本開示のベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの１つ以上の領域に対して完全又は実質的に相補的であるオリゴヌクレオチド配列の任意のバリアントを含み得る。これに加えて、本開示のベクターは、ＧｌｕＫ２タンパク質の任意のバリアントをコードするＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡに対して完全又は実質的に相補的であるオリゴヌクレオチド配列の任意のバリアントを含み得る。
したがって、目的の二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡは、遺伝子カセット（例えば、ＤＮＡの転写がプロモーター及び／又は他の調節要素によって制御される発現カセット）に組み込まれる。ＤＮＡは、目的のＧｒｉｋ２ ＡＳＯ（例えば、配列番号１～１００のうちのいずれか１つ）を発現するベクターのかかる発現カセットに組み込まれ、標的細胞への送達のために目的のウイルスベクターによってカプシド化される。したがって、本開示のウイルスベクターは、任意のＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ転写産物アイソフォーム（例えば、配列番号１１５～１２４のうちのいずれか１つ）にハイブリダイズする任意のアンチセンスＲＮＡをコードする。ウイルスベクターは、例えば、表２又は表３に列挙されるｓｉＲＮＡのうちのいずれか１つをコードする。
本開示のベクターは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの少なくとも一部又は領域（例えば、配列番号１１５～６８１に記載されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡの領域又は一部のうちのいずれか１つ、又は配列番号１１５～６８１のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントを認識するか、又はそれに結合するＡＳＯをコードするポリヌクレオチドを送達する。ＡＳＯ剤をコードする異種ポリヌクレオチドは、細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞、例えば、神経細胞、例えば、ＤＧＣ）内のかかるＡＳＯの処理を確実にする、より大きな構築物又は足場の一部であり得る。表２又は表３に列挙されるｓｉＲＮＡのうちのいずれか１つをコードするポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ遺伝子の前駆体若しくは一部（例えば、特に、ｍｉＲ－３０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－２８１－１、若しくはｍｉＲ－１２４－３）、例えば、マイクロＲＮＡ遺伝子の５’隣接領域、３’隣接領域、又はループ配列を含み得る。
したがって、本開示の目的は、発現ベクターであって、異種ポリヌクレオチドを含み、５’から３’へ、例えば、プロモーター（例えば、表５及び表６に記載されるプロモーターのうちのいずれか１つ）と、任意選択的に、イントロン（例えば、表７に記載されるイントロンのうちのいずれか１つ）と、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ発現を阻害するＡＳＯ剤（例えば、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列を有するＡＳＯ剤、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントをコードするヌクレオチド配列と、ポリＡ配列（例えば、表７に記載されるポリＡ配列のうちのいずれか１つ）を含有する、発現ベクターに関する。発現ベクターはまた、５’末端逆位反復（ＩＴＲ）から３’ＩＴＲへ、５’ＩＴＲ（例えば、表７に記載される５’若しくは３’ＩＴＲ配列のうちのいずれか１つ）と、プロモーターと、任意選択的に、イントロンと、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ発現を阻害するＡＳＯをコードするヌクレオチド配列と、ポリＡ配列と、３’ＩＴＲと、を含み得る。発現ベクターは、更に、上述のベクター要素のうちのいずれかに接続したスペーサー及び／又はリンカー配列を含有し得る。
特定の例において、発現ベクター又はポリヌクレオチドは、ステム－ループ構造を形成するステム及びループをコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよく、ループは、表２又は表３二列挙されるＡＳＯ剤のうちのいずれか１つをコードするヌクレオチド配列を含む。例えば、発現ベクター又はポリヌクレオチドは、ループ領域をコードする核酸配列を含んでいてもよく、ループ領域は、全体的に、又は一部分が野生型マイクロＲＮＡ配列遺伝子（例えば、特に、ｍｉＲ－３０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－２８１－１、又はｍｉＲ－１２４－３）に由来していてもよく、又は完全に人工であってもよい。特定の例において、ループ領域は、ｍｉＲ－３０ａループ配列であり得る。更に、ステム－ループ構造は、ガイド配列（例えば、アンチセンスＲＮＡ配列、例えば、配列番号１～１００のうちのいずれか１つ）と、ガイド配列の全て又は一部に対して相補的であるパッセンジャー配列と、を含み得る。例えば、パッセンジャー配列は、ガイド配列の１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のヌクレオチドを除き、ガイド配列のヌクレオチドの全てに対して相補的であってもよく、又はパッセンジャー配列は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つに対して相補的であってもよい。
プレｍｉＲＮＡ又はプリｍｉＲＮＡ足場は、本開示のガイド（すなわち、アンチセンス）配列を含む。プリｍｉＲＮＡ足場は、プレｍｉＲＮＡ足場を含み、プリｍｉＲＮＡは、５０～８００ヌクレオチド長（例えば、５０～８００、７５～７００、１００～６００、１５０～５００、２００～４００、又は２５０～３００個のヌクレオチド）であり得る。特定の例において、プレｍＲＮＡは、５０～１００個のヌクレオチド（例えば、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、若しくは９０～１００個のヌクレオチド）、１００～２００個のヌクレオチド（例えば、１１０～１２０、１２０～１３０、１３０～１４０、１４０～１５０、１５０～１６０、１６０～１７０、１７０～１８０、１８０～１９０、若しくは１９０～２００個のヌクレオチド）、２００～３００個のヌクレオチド（例えば、２００～２１０、２１０～２２０、２２０～２３０、２３０～２４０、２４０～２５０、２５０～２６０、２６０～２７０、２７０～２８０、２８０～２９０、若しくは２９０～３００個のヌクレオチド）、３００～４００個のヌクレオチド（例えば、３００～３１０、３１０～３２０、３２０～３３０、３３０～３４０、３４０～３５０、３５０～３６０、３６０～３７０、３７０～３８０、３８０～３９０、若しくは３９０～４００個のヌクレオチド）、４００～５００個のヌクレオチド（例えば、４００～４１０、４１０～４２０、４２０～４３０、４３０～４４０、４４０～４５０、４５０～４６０、４６０～４７０、４７０～４８０、４８０～４９０、若しくは４９０～５００個のヌクレオチド）、５００～６００個のヌクレオチド（例えば、５００～５１０、５１０～５２０、５２０～５３０、５３０～５４０、５４０～５５０、５５０～５６０、５６０～５７０、５７０～５８０、５８０～５９０、若しくは５９０～６００個のヌクレオチド）、６００～７００個のヌクレオチド（例えば、６００～６１０、６１０～６２０、６２０～６３０、６３０～６４０、６４０～６５０、６５０～６６０、６６０～６７０、６７０～６８０、６８０～６９０、若しくは６９０～７００個のヌクレオチド）、又は７００～８００個のヌクレオチド（例えば、７００～７１０、７１０～７２０、７２０～７３０、７３０～７４０、７４０～７５０、７５０～７６０、７６０～７７０、７７０～７８０、７８０～７９０、若しくは７９０～８００個のヌクレオチド）であり得る。これらの操作された足場は、プレｍｉＲＮＡから、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖を含む二本鎖ＲＮＡへのプロセシングを可能にする。そのように、プレｍｉＲＮＡは、ガイド（すなわち、アンチセンス）ＲＮＡをコードする配列を含む５’アームと、野生型ｍｉＲＮＡ（例えば、特に、ｍｉＲ－３０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－２８１－１、又はｍｉＲ－１２４－３）に通常由来するループ配列と、ガイド鎖に対して完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー（すなわち、センス）鎖をコードする配列を含む３’アームと、を含む。プレｍｉＲＮＡ「ステム－ループ」構造は、一般に、５０個のヌクレオチドより長く、例えば、５０～１５０個のヌクレオチド（例えば、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０、１１０～１２０、１２０～１３０、１３０～１４０、若しくは１４０～１５０個のヌクレオチド）、５０～１１０個のヌクレオチド（例えば、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０個のヌクレオチド）、又は５０～８０ヌクレオチド（例えば、５０～６０、６０～７０、７０～８０個のヌクレオチド）の長さである。プリｍｉＲＮＡは、それぞれ５’アーム及び３’アームに隣接する、５’隣接配列及び３’隣接配列を更に含む。隣接配列は、必ずしも他の配列（アーム領域又はガイド配列）と連続しておらず、構造化されていない非対形成領域であり、また、全体的に、又は一部分が１つ以上の野生型プリｍｉＲＮＡ足場（例えば、特に、全体的に、又は一部分がｍｉＲ－３０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－２８１－１、又はｍｉＲ－１２４－３に由来するプリｍｉＲＮＡ足場）に由来していてもよい。隣接配列は、各々が、少なくとも４個のヌクレオチドの長さ、又は最大３００個のヌクレオチドの長さ、又はそれより大きな長さ（例えば、４～３００、１０～２７５、２０～２５０、３０～２２５、４０～２００、５０～１７５、６０～１５０、７０～１２５、８０～１００、又は９０～９５個のヌクレオチド）である。スペーサー配列は、上述の配列構造の間に中断するものとして存在していてもよく、ほとんどの場合において、連結ポリヌクレオチド、例えば、１～３０個のヌクレオチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のヌクレオチド）を提供し、全体的なプレｍｉＲＮＡ構造に対して機能性と干渉することなく柔軟性を提供する。スペーサーが、二本鎖ＲＮＡのプロセシングと干渉せず、スペーサーが、ガイドＲＮＡと標的ｍＲＮＡ配列との結合／相互作用と干渉しない限り、スペーサーは、天然に存在するＲＮＡ、天然に存在する連結基の一部、ポリＡ若しくはポリＵ、又はヌクレオチドのランダム配列からの天然に存在する連結基に由来していてもよい。
本明細書に開示される方法及び組成物によれば、ヌクレオチド配列を含む発現ベクター又はポリヌクレオチドは、（ｉ）ガイド（例えば、アンチセンス）鎖、及び任意選択的に５’スペーサー配列を含む５’ステム－ループアームと、（ｉｉ）パッセンジャー（例えば、センス）鎖、及び３’スペーサー配列を含む３’ステム－ループアームと、更にコードし得る。別の例において、ヌクレオチド配列を含む発現ベクター又はポリヌクレオチドは、（ｉ）パッセンジャー鎖、及び任意選択的に５’スペーサー配列を含む５’ステム－ループアーム、並びに（ｉｉ）ガイド鎖、及び任意選択的に３’スペーサー配列を含む３’ステム－ループアームを更にコードし得る。別の例において、ウリジンゆらぎ塩基は、ガイド鎖の５’末端に存在する。更なる例において、発現ベクター又はポリヌクレオチドは、ガイド配列の上流にリーディング５’隣接領域を含み、隣接領域は、任意の長さのものであってもよく、全体的に、若しくは一部分が野生型マイクロＲＮＡ配列に由来していてもよく、異種であるか、又は他の隣接領域若しくはループからの異なる起源のｍｉＲＮＡに由来していてもよく、又は完全に人工であってもよい。３’隣接領域は、サイズ及び起源において、５’隣接領域を忠実に映し出すものであってもよく、３’隣接領域は、ガイド配列の下流（すなわち、３’）であってもよい。なお別の例において、５’隣接配列及び３’隣接配列の一方又は両方が存在しない。
発現ベクター又はポリヌクレオチドは、第１の隣接領域（例えば、表８に記載される５’隣接領域のうちのいずれか１つ）を更にコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよく、上述の第１の隣接領域は、５’隣接配列と、任意選択的に、５’スペーサー配列と、を含む。特定の例において、第１の隣接領域は、上述のパッセンジャー鎖に対して上流（すなわち、５’）に位置する。別の例において、第２の隣接領域（例えば、表８に記載される３’隣接領域のうちのいずれか１つ）をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター又はポリヌクレオチドであって、上述の第２の隣接領域は、３’隣接配列と、任意選択的に、３’スペーサー配列と、を含む。特定の例において、第１の隣接領域は、ガイド鎖に対して５’に位置する。
本明細書に開示される方法及び組成物によれば、発現ベクター又はポリヌクレオチドは、
（ａ）ステム－ループ配列であって、５’から３’へ、
（ｉ）表２若しくは表３に列挙されるＡＳＯ配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０）、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多く）同一であるガイドヌクレオチド配列を含む５’ステム－ループアーム、
（ｉｉ）ループ領域にマイクロＲＮＡループ配列（例えば、ｍｉＲ－３０ａ、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－２１８－１、若しくはｍｉＲ－１２４－３ループ配列（例えば、配列番号７５８、７６４、７６７、若しくは７７０のうちのいずれか１つから選択される核酸を有するマイクロＲＮＡループ配列）を含むマイクロＲＮＡループ領域、
（ｉｉｉ）ガイド鎖に対して相補的又は実質的に相補的なパッセンジャーヌクレオチド配列を含む３’ステム－ループアームを含む、ステム－ループ配列と、
（ｂ）５’隣接配列と、任意選択的に、５’スペーサー配列と、を含む第１の隣接領域であって、ガイド鎖に対して５’に位置する第１の隣接領域（例えば、表８に記載される５’隣接領域のうちのいずれか１つ）と、
（ｃ）３’隣接配列と、任意選択的に、３’スペーサー配列と、を含む第２の隣接領域であって、パッセンジャー鎖に対して３’に位置する第２の隣接領域（例えば、表８に記載される３’隣接領域のうちのいずれか１つ）と、をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
別の例において、発現ベクター又はポリヌクレオチドは、
（ａ）ステム－ループ配列であって、５’から３’へ、
（ｉ）ガイドヌクレオチド配列に対して相補的又は実質的に相補的であるパッセンジャーヌクレオチド配列を含む５’ステム－ループアーム、
（ｉｉ）ループ領域にマイクロＲＮＡループ配列（例えば、ｍｉＲ－３０ａ、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－２１８－１、若しくはｍｉＲ－１２４－３ループ配列（例えば、配列番号７５８、７６４、７６７、若しくは７７０のうちのいずれか１つから選択される核酸を有するマイクロＲＮＡループ配列）を含むマイクロＲＮＡループ領域、
（ｉｉｉ）表２若しくは表３に列挙されるＡＳＯ配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０）、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多く）同一であるガイドヌクレオチド配列を含む３’ステム－ループアームを含む、ステム－ループ配列と、
（ｂ）パッセンジャー鎖に対して５’に位置する第１の隣接領域（例えば、表８に記載される５’隣接領域のうちのいずれか１つ）と、
（ｃ）３’隣接配列と、任意選択的に、３’スペーサー配列と、を含む第２の隣接領域であって、ガイド鎖に対して３’に位置する第２の隣接領域（例えば、表８に記載される３’隣接領域のうちのいずれか１つ）と、をコードするヌクレオチド配列を含む。
別の例において、発現ベクター又はポリヌクレオチドは、
（ａ）ステム－ループ配列であって、５’から３’へ、
（ｉ）表２若しくは表３に列挙されるＡＳＯ配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０）、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多く）同一であるガイドヌクレオチド配列を含む５’ステム－ループアーム、
（ｉｉ）ループ領域にマイクロＲＮＡループ配列（例えば、ｍｉＲ－３０ａ、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－２１８－１、若しくはｍｉＲ－１２４－３ループ配列（例えば、配列番号７５８、７６４、７６７、若しくは７７０のうちのいずれか１つから選択される核酸を有するマイクロＲＮＡループ配列）を含むマイクロＲＮＡループ領域、
（ｉｉｉ）ガイドヌクレオチド配列に対して相補的又は実質的に相補的であるパッセンジャーヌクレオチド配列を含む３’ステム－ループアームを含む、ステム－ループ配列と、
（ｂ）ガイド鎖に対して５’に位置する５’隣接領域（例えば、表８に記載される５’隣接領域のうちのいずれか１つ）と、
（ｃ）第２の隣接領域が、３’隣接配列と、任意選択的に、３’スペーサー配列と、を含む、パッセンジャー鎖に対して３’に位置する３’隣接領域（例えば、表８に記載される３’隣接領域のうちのいずれか１つ）と、をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
上述のガイド鎖及びパッセンジャー鎖の長さは、１９～５０（例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６～３０、３１～３５、３６～４０、４１～４５、又は４６～５０）ヌクレオチド長であり得る。特定の例において、ガイド鎖の長さは、１９個のヌクレオチドである。別の例において、ガイド鎖の長さは、２０個のヌクレオチドである。別の例において、ガイド鎖の長さは、２１個のヌクレオチドである。別の例において、ガイド鎖の長さは、２２個のヌクレオチドである。別の例において、ガイド鎖の長さは、２３個のヌクレオチドである。別の例において、ガイド鎖の長さは、２４個のヌクレオチドである。別の例において、ガイド鎖の長さは、２５個のヌクレオチドである。別の例において、ガイド鎖の長さは、２６～３０個のヌクレオチドである。別の例において、ガイド鎖の長さは、３１～３５個のヌクレオチドである。別の例において、ガイド鎖の長さは、３６～４０個のヌクレオチドである。別の例において、ガイド鎖の長さは、４１～４５個のヌクレオチドである。別の例において、ガイド鎖の長さは、４６～５０個のヌクレオチドである。特定の例において、パッセンジャー鎖の長さは、１９個のヌクレオチドである。別の例において、パッセンジャー鎖の長さは、２０個のヌクレオチドである。別の例において、パッセンジャー鎖の長さは、２１個のヌクレオチドである。別の例において、パッセンジャー鎖の長さは、２２個のヌクレオチドである。別の例において、パッセンジャー鎖の長さは、２３個のヌクレオチドである。別の例において、パッセンジャー鎖の長さは、２４個のヌクレオチドである。別の例において、パッセンジャー鎖の長さは、２５個のヌクレオチドである。別の例において、パッセンジャー鎖の長さは、２６～３０個のヌクレオチドである。別の例において、パッセンジャー鎖の長さは、３１～３５個のヌクレオチドである。別の例において、パッセンジャー鎖の長さは、３６～４０個のヌクレオチドである。別の例において、パッセンジャー鎖の長さは、４１～４５個のヌクレオチドである。別の例において、パッセンジャー鎖の長さは、４６～５０個のヌクレオチドである。
ガイド配列及びパッセンジャー配列の長さは、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖が組み込まれるｍｉＲＮＡ足場に基づいて変動し得る。所与のガイドが、ｍｉＲＮＡ足場に適合される場合、ガイドの長さは、所与のｍｉＲＮＡ足場の天然構造及びプロセシングに合うように伸長され得る。例えば、Ｅ－ｍｉＲ－３０足場によって産生されるガイド配列は、典型的には、２２個のヌクレオチド長さである。ほとんどの足場について、ガイド配列は、標的ｍＲＮＡ配列に対して更に相補的であるように３’末端で伸長するが、いくつかの場合において、ｍｉＲＮＡ足場の配列に応じて、ガイドの５’開始部位を修飾することを伴っていてもよい。
特定の場合において、所与の構築物の標的化能力を改善するか、又は改変するために、ｍｉＲＮＡガイド及びパッセンジャー鎖発現レベル及び／又はプロセシングパターンを改変することが望ましい場合がある。そのように、所与のｍｉＲＮＡフレームワーク／足場内で、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖の位置は、交換されてもよい（図６Ｇ）。このことは、スタッファー配列を含む設計の文脈においても可能性があり、又はスタッファーを含まない設計の文脈においても可能性がある。これに加えて、このことは、二重構築物（図８Ｇに示されるような）、又は連結した構築物（図８Ｆに示されるような）の文脈においても可能性がある。この変化に適応するために、ガイド鎖及び／又はパッセンジャー鎖の配列は、テンプレートの「親」設計から修飾され得る。代替的に、修飾は、ガイド及びパッセンジャー鎖の発現及び／又はプロセシングパターンにおける変化に影響を与えるために、ガイド及び／又はパッセンジャー鎖配列に対して行われ得る。
特定の例において、ベクター又はポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－３０ａ配列を含み、第１の隣接領域は、配列番号７５２、７５４、７５６、及び７５９のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多く）同一であるヌクレオチド配列を含む（表８を参照されたい）。
いくつかの実施形態において、ベクター又はポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－３０ａ配列を含み、第２の隣接領域は、配列番号７５３、７５５、７５７、及び７６０のうちのいずれか１つに対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多く）同一であるヌクレオチド配列を含む（表８を参照されたい）。
別の例において、ベクター又はポリヌクレオチドは、ループ領域が、配列番号７５８若しくは配列番号７６１のヌクレオチド配列、又は配列番号７５８若しくは配列番号７６１に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多く）同一である配列を含む、ｍｉＲ－３０ａ構造を含む（表８を参照されたい）。
特定の例において、ベクター又はポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－１５５配列を含み、第１の隣接領域は、配列番号７６２に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多く）同一であるヌクレオチド配列を含む（表８を参照されたい）。
いくつかの実施形態において、ベクター又はポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－１５５配列を含み、第２の隣接領域は、配列番号７６３に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多く）同一であるヌクレオチド配列を含む（表６を参照されたい）。
別の例において、ベクター又はポリヌクレオチドは、ループ領域が、配列番号７６４のヌクレオチド配列、又は配列番号７６４に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多く）同一である配列を含む、ｍｉＲ－１５５構造を含む（表８を参照されたい）。
特定の例において、ベクター又はポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－２１８－１配列を含み、第１の隣接領域は、配列番号７６５に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多く）同一であるヌクレオチド配列を含む（表８を参照されたい）。
いくつかの実施形態において、ベクター又はポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－２１８－１配列を含み、第２の隣接領域は、配列番号７６６に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多く）同一であるヌクレオチド配列を含む（表８を参照されたい）。
別の例において、ベクター又はポリヌクレオチドは、ループ領域が、配列番号７６７のヌクレオチド配列、又は配列番号７６７に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多く）同一である配列を含む、ｍｉＲ－２１８－１構造を含む（表８を参照されたい）。
特定の例において、ベクター又はポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－１２４－３配列を含み、第１の隣接領域は、配列番号７６８に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多く）同一であるヌクレオチド配列を含む（表８を参照されたい）。
いくつかの実施形態において、ベクター又はポリヌクレオチドは、ｍｉＲ－１２４－３配列を含み、第２の隣接領域は、配列番号７６９に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多く）同一であるヌクレオチド配列を含む（表８を参照されたい）。
別の例において、ベクター又はポリヌクレオチドは、ループ領域が、配列番号７７０のヌクレオチド配列、又は配列番号７７０に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多く）同一である配列を含む、ｍｉＲ－１２４－３構造を含む（表８を参照されたい）。
発現ベクターは、プラスミドであってもよく、例えば、イントロン配列（例えば、配列番号７４３若しくは配列番号７４４のイントロン配列、又は配列番号７４３若しくは配列番号７４４の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくはそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント、リンカー配列、又はスタッファー配列を含み得る。
したがって、本開示の目的は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列を有するポリヌクレオチド、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントを含むベクターに関する。例えば、ベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９０％の（少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するポリヌクレオチドを含み得る。別の例において、ベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも９５％の（少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するポリヌクレオチドを含み得る。本開示のベクターは、更に、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列を有するポリヌクレオチドを含み得る。
特に、ベクターは、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、プロモーター（例えば、表５又は表６、又はａに列挙されるプロモーターのうちのいずれか１つ）と、を含み得る。
上で考察されるバリアントは、例えば、個々（例えば、多型）、選択的スプライシング形態等の間の対立遺伝子変動に起因して、天然に存在するバリアントを含み得る。バリアントという用語はまた、他の供給源又は生物からの本開示の遺伝子配列も含む。バリアントは、本開示に係る配列に対して実質的に相同性であり得る。本開示の遺伝子のバリアントはまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、上に定義される配列（又はその相補的な鎖）にハイブリダイズする核酸配列を含む。典型的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、３０℃を超えるか、３５℃を超えるか、又は４２℃より過剰な温度、及び／又は約５００ｍＭ未満、又は２００ｍＭ未満の塩分濃度を含む。ハイブリダイゼーション条件は、例えば、温度、塩分濃度、及び／又はＳＤＳ、ＳＳＣ等の他の試薬の濃度等を調整することによって調節され得る。
本開示は、更に、目的の標的細胞に異種ポリヌクレオチドを送達するための非ウイルスベクター（例えば、本明細書に開示されるＧｒｉｋ２標的化ＡＳＯ剤をコードするポリヌクレオチドを含有するプラスミド）を提供する。他の例において、本開示のウイルスベクターは、ＡＡＶベクターアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、又はヘルペスウイルスベクターであり得る。
１つ以上の発現カセットを使用し得る。各発現カセットは、目的のＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーター配列（例えば、神経細胞プロモーター）を少なくとも含み得る。各発現カセットは、追加の調節要素、スペーサー、イントロン、ＵＴＲ、ポリアデニル化部位等からなり得る。発現カセットは、例えば、２つ以上のＡＳＯ剤をコードするポリヌクレオチドに関して多重遺伝子であり得る。発現カセットは、更に、プロモーターと、目的の１つ以上のＡＳＯ剤をコードする核酸と、ポリＡ配列と、を含み得る。特定の例において、発現カセットは、５’プロモーター配列と、目的の第１のＡＳＯ剤（例えば、配列番号１～１００のうちのいずれか１つ）をコードするポリヌクレオチド配列と、目的の第２のＡＳＯ剤（例えば、配列番号１～１００）をコードする配列と、ポリＡ配列－３’と、を含む。
ウイルスベクターは、抵抗性ＡｍｐＲ、カナマイシン、ハイグロマイシンＢ、ジェネティシン、ブラストサイジンＳ、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ノーセオトリシン、又はピューロマイシンの遺伝子などの抗生物質抵抗性遺伝子をコードする核酸配列を更に含み得る。
例示的な発現カセット
本開示は、発現ベクター（例えば、プラスミド若しくはウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ若しくはレンチウイルスベクター））に組み込まれると、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡにハイブリダイズし、その発現を阻害するＡＳＯ剤（例えば、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列を有するＡＳＯ剤）をコードする異種ポリヌクレオチドの発現を促進する、発現カセットを提供する。一般に、核酸ベクターに組み込まれた発現カセットは、異種遺伝子調節配列（例えば、プロモーター（例えば、表５若しくは表６に記載されるプロモーターのうちのいずれか１つ）、及び任意選択的に、エンハンサー配列（例えば、表７に記載されるエンハンサー配列））と、５’隣接配列（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、若しくは７６８のうちのいずれか１つ）と、ステム－ループ５’アーム、ループ配列（例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、若しくは７７０のうちのいずれか１つ）、ステム－ループ３’アームを含有するステム－ループ配列と、３’隣接配列（例えば、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、若しくは７６９のうちのいずれか１つ）と、任意選択的に、ウッドチャック肝炎転写後調節要素（ＷＲＰＥ）と、ポリＡ配列（例えば、配列番号７５０、７５１、７９２、若しくは７９３）と、を含有する異種ポリヌクレオチドを含むだろう。ＡＡＶの場合において、発現カセットは、それぞれ、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列（例えば、表７に記載される５’又は３’ＩＴＲ配列のうちのいずれか１つ）によって、その５’末端及び３’末端で隣接され得る。典型的には、本明細書に開示される方法及び組成物と組み合わせて使用するためのＡＡＶ２ ＩＴＲ配列が企図されるが、本明細書に開示される他のＡＡＶ血清型からのＩＴＲ配列も使用され得る（上の「ＡＡＶベクター」のセクションを参照されたい）。本開示の範囲を限定するものではないが、単に開示される方法及び組成物とともに使用するのに適した発現カセットを例示するために、表９及び表１０（米国仮特許出願第６３／０５０，７４２号からその全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、それぞれ、ニューロン又はユビキタス的に導入遺伝子発現を誘導するのに有用な５’から３’方向へと移動する発現カセット要素を有する例示的な発現カセット構築物を特徴とする。構築物の一般的なアーキテクチャは、５’から３’の方向に配向する、
（ｉ）５’ＩＴＲ配列（ＡＡＶベクターのみについて、例えば、配列番号７４６若しくは配列番号７４７）と、
（ｉｉ）プロモーター配列（例えば、表５若しくは表６に列挙されるプロモーター配列のうちのいずれか１つ）と、
（ｉｉｉ）５’隣接配列（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、若しくは７６８のうちのいずれか１つ）と、
（ｉｖ）ステム－ループ配列であって、５’から３’方向に、
ａ．ステム－ループ５’アームであって、少なくとも配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して相補的若しくは実質的に相補的である（例えば、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、若しくは１個以下のミスマッチヌクレオチドを含有する）パッセンジャー配列を含有するガイド配列を含むステム－ループ５’アーム、
ｂ．ループ配列（例えば、ｍｉＲ－３０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－２１８－１、若しくはｍｉＲ－１２４－３ループ配列、例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、若しくは７７０のうちのいずれか１つのループ配列）、及び
ｃ．ステム－ループ３’アームであって、少なくとも、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して実質的に相補的である（例えば、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、若しくは１個以下のミスマッチヌクレオチドを含有する）パッセンジャー配列を含有するガイド配列を含むステム－ループ３’アームを含む、ステム－ループ配列と、
（ｖ）３’隣接配列（例えば、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、若しくは７６９のうちのいずれか１つ）と、
（ｖｉ）任意選択的に、ＷＰＲＥ配列と、
（ｖｉｉ）ポリＡ配列（例えば、配列番号７５０、配列番号７５１、配列番号７９２、若しくは配列番号７９３）と、
（ｖｉｉｉ）３’ ＩＴＲ配列（ＡＡＶベクターのみについて、例えば、配列番号７４８、配列番号７４９、若しくは配列番号７８９）を少なくとも含む。
特定の例において、本開示は、表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される標的配列、又は表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される対応する標的配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ標的配列に対して完全又は実質的に相補的である抗Ｇｒｉｋ２ガイド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ）と、ガイド配列に完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列と、を含む、発現カセットを提供する。
別の例において、本開示は、表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される標的配列、又は表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される対応する標的配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ標的配列に対して完全又は実質的に相補的である抗Ｇｒｉｋ２ガイド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）と、ガイド配列に完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列と、を含む、発現カセットを提供する。
別の例において、本開示は、表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される標的配列、又は表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される対応する標的配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ標的配列に対して完全又は実質的に相補的である抗Ｇｒｉｋ２ガイド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＣＡＧプロモーター（例えば、配列番号７３７）と、ガイド配列に完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列と、を含む、発現カセットを提供する。
別の例において、本開示は、表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される標的配列、又は表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される対応する標的配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ標的配列に対して完全又は実質的に相補的である抗Ｇｒｉｋ２ガイド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＣＢＡプロモーター（例えば、配列番号７３８）と、ガイド配列に完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列と、を含む、発現カセットを提供する。
別の例において、本開示は、表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される標的配列、又は表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される対応する標的配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ標的配列に対して完全又は実質的に相補的である抗Ｇｒｉｋ２ガイド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＵ６プロモーター（例えば、配列番号７２８～７３３のうちのいずれか１つ）と、ガイド配列に完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列と、を含む、発現カセットを提供する。
別の例において、本開示は、表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される標的配列、又は表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される対応する標的配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ標的配列に対して完全又は実質的に相補的である抗Ｇｒｉｋ２ガイド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＨ１プロモーター（例えば、配列番号７３４）と、ガイド配列に完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列と、を含む、発現カセットを提供する。
別の例において、本開示は、表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される標的配列、又は表４、若しくは配列番号１６４～６８１のうちのいずれか１つに記載される対応する標的配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ標的配列に対して完全又は実質的に相補的である抗Ｇｒｉｋ２ガイド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結された７ＳＫプロモーター（例えば、配列番号７３５）と、ガイド配列に完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列と、を含む、発現カセットを提供する。
別の例において、本開示は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つ、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択される抗Ｇｒｉｋ２ガイド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ）と、ガイド配列に完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列と、を含む、発現カセットを提供する。
別の例において、本開示は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つ、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択される抗Ｇｒｉｋ２ガイド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）と、ガイド配列に完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列と、を含む、発現カセットを提供する。
別の例において、本開示は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つ、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択される抗Ｇｒｉｋ２ガイド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＣＡＧプロモーター（例えば、配列番号７３７）と、ガイド配列に完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列と、を含む、発現カセットを提供する。
別の例において、本開示は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つ、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択される抗Ｇｒｉｋ２ガイド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＣＢＡプロモーター（例えば、配列番号７３８）と、ガイド配列に完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列と、を含む、発現カセットを提供する。
別の例において、本開示は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つ、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択される抗Ｇｒｉｋ２ガイド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＵ６プロモーター（例えば、配列番号７２８～７３３のうちのいずれか１つ）と、ガイド配列に完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列と、を含む、発現カセットを提供する。
別の例において、本開示は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つ、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択される抗Ｇｒｉｋ２ガイド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＨ１プロモーター（例えば、配列番号７３４）と、ガイド配列に完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列と、を含む、発現カセットを提供する。
別の例において、本開示は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つ、又は配列番号１～１００のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントからなる群から選択される抗Ｇｒｉｋ２ガイド配列を含むポリヌクレオチドに作動可能に連結された７ＳＫプロモーター（例えば、配列番号７３５）と、ガイド配列に完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列と、を含む、発現カセットを提供する。
別の例において、本開示は、以下の表９に記載される発現カセットのうちのいずれか１つから選択される発現カセットを提供する。
別の例において、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して５個以下（例えば、５、４、３、２、又は１個以下）のミスマッチヌクレオチド（すなわち、ミスマッチ）を有する。別の例において、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して４個以下（例えば、４、３、２、又は１個以下）のミスマッチを有する。別の例において、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して３個以下（例えば、３、２、又は１個以下）のミスマッチを有する。別の例において、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して２個以下（例えば、２、又は１個以下）のミスマッチを有する。なお別の例において、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して１個以下のミスマッチを有する。
別の例において、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して１０個以下（例えば、１０、９、８、７、又は６個以下）のミスマッチヌクレオチド（すなわち、ミスマッチ）を有する。別の例において、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して９個以下（例えば、９、８、７、又は６個以下）のミスマッチを有する。別の例において、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して８個以下（例えば、８、７、又は６個以下）のミスマッチを有する。別の例において、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して７個以下（例えば、７、又は６個以下）のミスマッチを有する。別の例において、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して６個以下のミスマッチを有する。別の例において、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して５個以下のミスマッチを有する。別の例において、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して４個以下のミスマッチを有する。別の例において、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して３個以下のミスマッチを有する。別の例において、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して２個以下のミスマッチを有する。別の例において、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して実質的に相補的であるパッセンジャー配列は、配列番号１～１００のうちのいずれか１つのＡＳＯ配列に対して１個以下のミスマッチを有する。
米国仮特許出願第６３／０５０，７４２号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の表９又は表１０に例示される発現構築物は、追加のベクター要素、例えば、調節配列（例えば、１つ以上のエンハンサー配列、ターミネーター配列、又はＷＰＲＥ配列）、上述の配列のいずれかの間、又はそれらの内部にあるスタッファー配列及びリンカー配列、並びに細胞において異種ポリヌクレオチドの発現を促進するために使用することができる当該技術分野で知られている任意の他の従来の発現構築物要素を更に含み得る。表９及び表１０は、例示的な発現カセットを提供し、その各々が、単一の行に示されており、識別子番号によって示されており（例えば、表９の例示的な発現カセット構成１～３８００、及び表１０の構成１～２０００）、発現カセットの各要素は、５’から３’への方向に配向した一連の欄で表されている。
本開示の例示的な単シストロン性（すなわち、単一ＡＳＯコード）構築物は、Ａ－ｍｉＲ－３０足場に組み込まれたｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）及びＡＳＯ Ｇ９（配列番号６８）を含有するＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）構築物を含み得る（構築物１、図６Ａを参照されたい）。かかる構築物は、配列番号７７５の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号７７５の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る（以下を参照されたい）。
注釈：太字＝５’ＩＴＲ配列、一本下線＝プロモーター配列、斜体＝５’隣接配列－ガイド配列－マイクロＲＮＡループ配列－パッセンジャー配列－３’隣接配列、斜体＋太字＋一本下線：Ｇ９ガイド配列をコードするＤＮＡ、斜体＋波状下線：Ｇ９パッセンジャー配列をコードするＤＮＡ、二本下線：ポリＡ配列、太字＋小文字：３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）。
上述の例示的な単シストロン性抗Ｇｒｉｋ２構築物は、Ａ－ｍｉＲ－３０足場に組み込まれたＧｒｉｋ２アンチセンスガイド配列（例えば、Ｇ９、配列番号６８）を含んでいてもよく、その結果、マイクロＲＮＡコード配列が、配列番号７９５の核酸配列を有するポリヌクレオチドであるか、又は配列番号７９５の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
注釈：斜体＝５’隣接配列－ガイド配列－マイクロＲＮＡループ配列－パッセンジャー配列－３’隣接配列、斜体＋波状下線：パッセンジャー配列をコードするＤＮＡ、斜体＋太字＋一本下線：Ｇ９ガイド配列をコードするＤＮＡ。
本開示の別の例示的な単シストロン性抗Ｇｒｉｋ２構築物は、Ｃ１ｑｌ２プロモーター（配列番号７９１）及びｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）をタンデムで含有し、Ａ－ｍｉＲ－３０足場に組み込まれたＡＳＯ Ｇ９（配列番号６８）を含有するＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９構築物を含み得る（構築物２、図６Ｂを参照されたい）。かかる構築物は、配列番号７７７の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号７７７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る（以下を参照されたい）。
注釈：太字＝５’ＩＴＲ配列、一本下線＋斜体＝Ｃ１ｑｌ２プロモーター配列、一本下線：ｈＳｙｎプロモーター配列、斜体＝５’隣接配列－ガイド配列－マイクロＲＮＡループ配列－パッセンジャー配列－３’隣接配列、斜体＋波状下線：パッセンジャー配列をコードするＤＮＡ、斜体＋太字＋一本下線：Ｇ９ガイド配列をコードするＤＮＡ、二本下線：ポリＡ配列、太字＋小文字：３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）。
上述の例示的な単シストロン性抗Ｇｒｉｋ２構築物は、マイクロＲＮＡ足場に組み込まれたＧｒｉｋ２アンチセンスガイド配列（例えば、Ｇ９、配列番号６８）を含んでいてもよく、その結果、マイクロＲＮＡコード配列が、配列番号７７８の核酸配列を有するポリヌクレオチドであるか、又は配列番号７７８の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
注釈：斜体＝５’隣接配列－ガイド配列－マイクロＲＮＡループ配列－パッセンジャー配列－３’隣接配列、斜体＋波状下線：パッセンジャー配列をコードするＤＮＡ、斜体＋太字＋一本下線：Ｇ９ガイド配列をコードするＤＮＡ。
本開示の別の例示的な単シストロン性抗Ｇｒｉｋ２構築物は、Ａ－ｍｉＲ－３０足場に組み込まれた、５’ＩＴＲ配列の下流にｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、及びＡＳＯ Ｇ９（配列番号６８）を含有する自己相補性（ｓｃ）ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）構築物を含み得る（構築物３、図６Ｃを参照されたい）。かかる構築物は、配列番号７７９の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号７７９の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る（以下を参照されたい）。
注釈：太字＝５’ＩＴＲ配列、一本下線＋斜体＝ｈＳｙｎプロモーター配列、一本下線：ｈＳｙｎプロモーター配列、斜体＝５’隣接配列－ガイド配列－マイクロＲＮＡループ配列－パッセンジャー配列－３’隣接配列、斜体＋波状下線：パッセンジャー配列をコードするＤＮＡ、斜体＋太字＋一本下線：Ｇ９ガイド配列をコードするＤＮＡ、二本下線：ＲＢＧポリＡ配列、二本下線＋太字＝ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、太字＋小文字：３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）。
上述の例示的な単シストロン性抗Ｇｒｉｋ２構築物は、マイクロＲＮＡ足場に組み込まれたＧｒｉｋ２アンチセンスガイド配列（例えば、Ｇ９、配列番号６８）を含んでいてもよく、その結果、マイクロＲＮＡコード配列が、配列番号７８０の核酸配列を有するポリヌクレオチドであるか、又は配列番号７８０の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
注釈：斜体＝５’隣接配列－ガイド配列－マイクロＲＮＡループ配列－パッセンジャー配列－３’隣接配列、斜体＋波状下線：パッセンジャー配列をコードするＤＮＡ、斜体＋太字＋一本下線：Ｇ９ガイド配列をコードするＤＮＡ。
本開示の別の例示的な単シストロン性抗Ｇｒｉｋ２構築物は、Ａ－ｍｉＲ－３０足場に組み込まれた、３’ＩＴＲに近位のｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）（「ＦＬＩＰ」）、及びＡＳＯ Ｇ９（配列番号６８）を含有するｓｃＡＡＶ（例えば、ｓｃＡＡＶ９）構築物を含み得る（構築物４、図６Ｄを参照されたい）。かかる構築物は、配列番号７８１の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号７８１の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る（以下を参照されたい）。
注釈：太字＝５’ＩＴＲ配列、一本下線＋斜体＝ｈＳｙｎプロモーター配列、一本下線：ｈＳｙｎプロモーター配列、斜体＝５’隣接配列－ガイド配列－マイクロＲＮＡループ配列－パッセンジャー配列－３’隣接配列、斜体＋波状下線：パッセンジャー配列をコードするＤＮＡ、斜体＋太字＋一本下線：Ｇ９ガイド配列をコードするＤＮＡ、二本下線：ＲＢＧポリＡ配列、二本下線＋太字＝ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、太字＋小文字：３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）。なお、この場合において、ガイド配列は、全カセットが、５’ＩＴＲから３’ＩＴＲへとではなく、３’ＩＴＲから５’ＩＴＲへと読まれるため、「逆」である。
上述の例示的な単シストロン性抗Ｇｒｉｋ２構築物は、マイクロＲＮＡ足場に組み込まれたＧｒｉｋ２アンチセンスガイド配列（例えば、Ｇ９、配列番号６８）を含んでいてもよく、その結果、マイクロＲＮＡコード配列が、配列番号７８２（上鎖）若しくは配列番号７９４（下鎖）の核酸配列を有するポリヌクレオチドであるか、又は配列番号７８２若しくは配列番号７９４の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
注釈：斜体＝５’隣接配列－ガイド配列－マイクロＲＮＡループ配列－パッセンジャー配列－３’隣接配列、斜体＋波状下線：パッセンジャー配列をコードするＤＮＡ、斜体＋太字＋一本下線：Ｇ９ガイド配列をコードするＤＮＡ。
本開示の別の例示的な単シストロン性抗Ｇｒｉｋ２構築物は、Ａ－ｍｉＲ－３０足場に組み込まれた、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）及びＡＳＯ Ｇ９（配列番号６８）の３つの連結したコピーを含有するＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）構築物を含み得る（構築物５、図６Ｅを参照されたい）。かかる構築物は、配列番号７８３の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号７８３の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る（以下を参照されたい）。
注釈：太字＝５’ＩＴＲ配列、一本下線＝プロモーター配列、斜体＝５’隣接配列－ガイド配列－マイクロＲＮＡループ配列－パッセンジャー配列－３’隣接配列、斜体＋波状下線：パッセンジャー配列をコードするＤＮＡ、斜体＋太字＋一本下線：Ｇ９ガイド配列をコードするＤＮＡ、二本下線：ポリＡ配列、太字＋小文字：３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）、＾＝第１のコンカテマーの境界、＊＝第２のコンカテマーの境界、及び＃＝第３のコンカテマーの境界。
本開示の別の例示的な単シストロン性抗Ｇｒｉｋ２構築物は、各々がＡ－ｍｉＲ－３０足場に組み込まれた、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、及びＧ９（配列番号６８、ＧＩ（配列番号７７、若しくはＭＵ（配列番号９６）を含む、異なるアンチセンス配列の３つの連結したコピーを含有するＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）構築物を含み得る（構築物６、図６Ｅを参照されたい）。かかる構築物は、配列番号７８４の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号７８４の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る（以下を参照されたい）。
注釈：太字＝５’ＩＴＲ配列、一本下線＝プロモーター配列、斜体＝５’隣接配列－ガイド配列－マイクロＲＮＡループ配列－パッセンジャー配列－３’隣接配列、斜体＋波状下線：ガイド配列（この順序で、Ｇ９、ＧＩ、ＭＵ）に対して相補的なパッセンジャー配列をコードするＤＮＡ、斜体＋太字＋一本下線：ガイド配列（この順序で、Ｇ９、ＧＩ、ＭＵ）をコードするＤＮＡ、二本下線：ポリＡ配列、太字＋小文字：３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）、＾＝第１のコンカテマーの境界、＊＝第２のコンカテマーの境界、及び＃＝第３のコンカテマーの境界。
他の場合において、Ｇ９ ＡＳＯ配列（配列番号６８）は、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３足場に組み込まれてもよく、その結果、マイクロＲＮＡコード配列が、配列番号８０１の核酸配列を有するポリヌクレオチドであるか、又は配列番号８０１の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
注釈：斜体＝５’隣接配列－ガイド配列－マイクロＲＮＡループ配列－パッセンジャー配列－３’隣接配列、斜体＋波状下線：Ｇ９パッセンジャー配列をコードするＤＮＡ、斜体＋太字＋一本下線：Ｇ９ガイド配列をコードするＤＮＡ。
本開示の別の単シストロン性抗Ｇｒｉｋ２構築物は、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３足場に組み込まれた、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）抗Ｇｒｉｋ２アンチセンス配列Ｇ９（配列番号６８）を含有するＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）構築物である。かかる構築物は、配列番号８０９の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号８０９の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る（以下を参照されたい）。配列番号８０９の発現構築物は、配列番号８１０の核酸配列、又は配列番号８１０の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントを有するベクターに組み込まれ得る。
注釈：一本下線：プロモーター配列、太字：ガイド配列及びパッセンジャー配列を含有するマイクロＲＮＡステム－ループ構造、二本下線ポリＡ配列、斜体：スタッファー配列１、斜体＋下線：スタッファー配列２。
本開示の別の単シストロン性抗Ｇｒｉｋ２構築物は、Ａ－ｍｉＲ－３０足場に組み込まれた、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）及びＡＳＯ ＧＩ（配列番号７７）を含有するＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）構築物である。かかる構築物は、配列番号７９６の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号８１７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る（以下を参照されたい）。
注釈：一本下線＝プロモーター配列、斜体＝５’隣接配列－ガイド配列－マイクロＲＮＡループ配列－パッセンジャー配列－３’隣接配列、斜体＋波状下線：ＧＩパッセンジャー配列をコードするＤＮＡ、斜体＋太字＋一本下線：ＧＩガイド配列をコードするＤＮＡ、二本下線：ポリＡ配列。
配列番号８１７の構築物は、配列番号７９６において以下に示されるように、５’ＩＴＲ配列及び３’ＩＴＲ配列を更に含有するベクターに組み込まれ得る。
注釈：太字＝５’ＩＴＲ配列、一本下線＝プロモーター配列、斜体＝５’隣接配列－ガイド配列－マイクロＲＮＡループ配列－パッセンジャー配列－３’隣接配列、斜体＋波状下線：ＧＩパッセンジャー配列をコードするＤＮＡ、斜体＋太字＋一本下線：ＧＩガイド配列をコードするＤＮＡ、二本下線：ポリＡ配列、太字＋小文字：３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）。
上述の例示的な単シストロン性抗Ｇｒｉｋ２構築物は、Ａ－ｍｉＲ－３０足場に組み込まれたＧｒｉｋ２アンチセンスガイド配列（例えば、ＧＩ、配列番号７７）を含んでいてもよく、その結果、マイクロＲＮＡコード配列が、配列番号７９７の核酸配列を有するポリヌクレオチドであるか、又は配列番号７９７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
注釈：斜体＝５’隣接配列－ガイド配列－マイクロＲＮＡループ配列－パッセンジャー配列－３’隣接配列、斜体＋波状下線：ＧＩパッセンジャー配列をコードするＤＮＡ、斜体＋太字＋下線：ＧＩガイド配列をコードするＤＮＡ。
ＧＩ抗Ｇｒｉｋ２配列（配列番号７７）を組み込んだ別の抗Ｇｒｉｋ２構築物は、Ｅ－ｍｉＲ－３０足場を含んでいてもよく、その結果、マイクロＲＮＡコード配列が、配列番号７９８の核酸配列を有するポリヌクレオチドであるか、又は配列番号７９８の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
注釈：斜体＝５’隣接配列－ガイド配列－マイクロＲＮＡループ配列－パッセンジャー配列－３’隣接配列、斜体＋太字＋一本下線：ＧＩガイド配列をコードするＤＮＡ、斜体＋波状下線：ＧＩパッセンジャー配列をコードするＤＮＡ。
本開示の別の単シストロン性抗Ｇｒｉｋ２構築物は、Ｅ－ｍｉＲ－３０足場に組み込まれた、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、ＡＳＯ ＧＩ（配列番号７７）、並びにスタッファー配列（配列番号８１５及び８１６）を含有するＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）構築物である。かかる構築物は、配列番号８０３の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号８０３の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る（以下を参照されたい）。配列番号８０３の発現構築物、又はそのバリアントは、配列番号８０４の核酸配列、又は配列番号８０４の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントを有するベクターに組み込まれ得る。
注釈：一本下線：プロモーター配列、太字：ガイド配列及びパッセンジャー配列を含有するマイクロＲＮＡステム－ループ構造、二本下線ポリＡ配列、斜体：スタッファー配列１（配列番号８１５）、斜体＋下線：スタッファー配列２（配列番号８１６）。
アンチセンス構築物が、ＡＳＯ配列ＭＷ（配列番号８０）を含有する場合において、構築物は、Ｅ－ｍｉＲ－２１８－１足場を含んでいてもよく、その結果、マイクロＲＮＡコード配列が、配列番号７９９の核酸配列を有するポリヌクレオチドであるか、又は配列番号７９９の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
注釈：斜体＝５’隣接配列－ガイド配列－マイクロＲＮＡループ配列－パッセンジャー配列－３’隣接配列、斜体＋太字＋一本下線：ＧＩガイド配列をコードするＤＮＡ、斜体＋波状下線：ＧＩパッセンジャー配列をコードするＤＮＡ。
配列番号７９９の構築物は、以下の配列番号８１９に示されるように、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）と、ポリＡ配列と、を更に含み得る。
注釈：一本下線＝プロモーター配列、斜体＝５’隣接配列－ガイド配列－マイクロＲＮＡループ配列－パッセンジャー配列－３’隣接配列、斜体＋波状下線：ＧＩパッセンジャー配列をコードするＤＮＡ、斜体＋太字＋一本下線：ＧＩガイド配列をコードするＤＮＡ、二本下線：ポリＡ配列。
本開示の別の単シストロン性抗Ｇｒｉｋ２構築物は、Ｅ－ｍｉＲ－２１８－１足場に組み込まれた、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、ＡＳＯ ＭＷ（配列番号８０）、並びに１つ以上のスタッファー配列（例えば、配列番号８１５及び／又は配列番号８１６）を含有するＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）構築物である。かかる構築物は、配列番号８０５の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号８０５の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る（以下を参照されたい）。配列番号８０５の発現構築物、又はそのバリアントは、配列番号８０６の核酸配列、又は配列番号８０６の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントを有するベクターに組み込まれ得る。
注釈：一本下線：プロモーター配列、太字：ガイド配列及びパッセンジャー配列を含有するマイクロＲＮＡステム－ループ構造、二本下線ポリＡ配列、斜体：スタッファー配列１（配列番号８１５）、斜体＋下線：スタッファー配列２（配列番号８１６）。
代替的に、ＡＳＯ配列ＭＷ（配列番号８０）を含有するアンチセンス構築物は、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３足場を含んでいてもよく、その結果、マイクロＲＮＡコード配列が、配列番号８００の核酸配列を有するポリヌクレオチドであるか、又は配列番号８００の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントである。
注釈：斜体＝５’隣接配列－ガイド配列－マイクロＲＮＡループ配列－パッセンジャー配列－３’隣接配列、斜体＋波状下線：ＭＷパッセンジャー配列をコードするＤＮＡ、斜体＋下線＋灰色ハイライト：ＭＷガイド配列をコードするＤＮＡ。
配列番号８００の構築物は、以下の配列番号８２１に示されるように、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）と、ポリＡ配列と、を更に含み得る。
注釈：一本下線＝プロモーター配列、斜体＝５’隣接配列－ガイド配列－マイクロＲＮＡループ配列－パッセンジャー配列－３’隣接配列、斜体＋波状下線：ＧＩパッセンジャー配列をコードするＤＮＡ、斜体＋太字＋一本下線：ＧＩガイド配列をコードするＤＮＡ、二本下線：ポリＡ配列。
本開示の別の単シストロン性抗Ｇｒｉｋ２構築物は、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３足場に組み込まれた、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、ＡＳＯ ＭＷ（配列番号８０）、並びに１つ以上のスタッファー配列（配列番号８１５及び／又は配列番号８１６）を含有するＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）構築物である。かかる構築物は、配列番号８０７の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号８０７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る（以下を参照されたい）。配列番号８０７の発現構築物、又はそのバリアントは、配列番号８０８の核酸配列、又は配列番号８０８の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントを有するベクターに組み込まれ得る。
注釈：一本下線：プロモーター配列、太字：ガイド配列及びパッセンジャー配列を含有するマイクロＲＮＡステム－ループ構造、二本下線ポリＡ配列、斜体：スタッファー配列１（配列番号８１５）、斜体＋下線：スタッファー配列２（配列番号８１６）。
多重遺伝子ｍｉＲＮＡカセット
隣接／ステム－ループ／隣接構築物（例えば、プリｍｉＲＮＡ）は、単一のｍｉＲＮＡ「カセット」として処理されてもよく、連結してもよい（例えば、１つ以上のプロモーターによって駆動される多重遺伝子配置で提供される）１個より多い（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれより多い）プレｍｉＲステム－ループ配列が、より長い転写産物（例えば、イントロン）の任意のポリヌクレオチド配列中に、又は内因性マイクロＲＮＡ隣接配列（各ステム－ループに対して５’及び３’、例えば、－５ｐ及び－３ｐ配列）の間に埋め込まれてもよい。各プレｍｉＲステム－ループ配列は、専用のプロモーターの制御下で発現され得る（例えば、その各々が独立して個々のプレｍｉＲステム－ループ配列の発現を調節し、すなわち、各プロモーターが、他のものとは無関係に個々のマイクロＲＮＡを産生するように機能する、別個のプロモーター配列を有する多重遺伝子構築物として）。５ｂｐ伸長されたステムを少なくとも提供することができる隣接配列が、ステム－ループのプロセシングにとって十分であることが示されている（Ｓｕｎ，ｅｔ ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．４１：５９－６３、２００６年７月、参照により本明細書に組み込まれる）。スペーサー配列は、第１のｍｉＲＮＡ発現カセットの３’隣接配列と、第２のｍｉＲＮＡ発現カセットの５’隣接配列との間に配置され得る。スペーサー配列は、コード配列又は非コード（例えば、イントロン）配列に由来していてもよく、種々の長さを有しているが、ステム－ループ－隣接配列の一部とはされない（Ｒｏｕｓｓｅｔ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，１４：３５２－６３，２０１９、参照により本明細書に組み込まれる）。
例示的な発現カセットは、（ａ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡにハイブリダイズするガイドＲＮＡ配列を含有する第１のｍｉＲＮＡ配列をコードする第１のポリヌクレオチドと、（ｂ）Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡにハイブリダイズするガイドＲＮＡ配列を含有する第２のｍｉＲＮＡ配列をコードする第２のポリヌクレオチドと、を含有するヌクレオチド配列を含み得る。例えば、発現カセットは、５’から３’へ、（ａ）ガイド鎖に対して５’に位置し、上述の第１の隣接配列が、第１の５’隣接配列（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、及び７６８のうちのいずれか１つ、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）を含む第１の５’隣接領域と、（ｂ）第１のステム－ループ構造であって、（ｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、配列番号１～１００）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するガイドヌクレオチド配列を含む５’ステム－ループアーム、（ｉｉ）表６から選択されるマイクロＲＮＡ配列、又はそれに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントを含むループ領域、（ｉｉｉ）ガイド鎖に対して相補的又は実質的に相補的なパッセンジャーヌクレオチド配列を含む３’ステム－ループアームを含む、第１のステム－ループ構造と、（ｃ）上述のパッセンジャー鎖及び３’スペーサー配列に対して３’に位置する第１の３’隣接領域（例えば、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、及び７６９のうちのいずれか１つ、又はそれに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、（ｄ）ガイド鎖に対して５’に位置する第２の５’隣接領域（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、及び７６８のうちのいずれか１つ、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、（ｅ）第２のステム－ループ構造であって、（ｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、配列番号１～１００）のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するガイドヌクレオチド配列を含む５’ステム－ループアーム、（ｉｉ）表６から選択されるマイクロＲＮＡ配列、又はそれに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントを含有するループ領域、（ｉｉｉ）ガイド鎖に対して相補的又は実質的に相補的なパッセンジャーヌクレオチド配列を含む３’ステム－ループアームを含む、第２のステム－ループ構造と、（ｆ）パッセンジャー鎖に対して３’に位置する３’隣接配列（例えば、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、及び７６９のうちのいずれか１つ、又はそれに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアントを含む第２の３’隣接領域と、を含み得る。
第１の５’隣接配列、第１の３’隣接配列、第２の５’隣接配列、及び第２の３’隣接配列は、表６から選択され得る。
二重ｍｉＲＮＡ、単一プロモーター発現カセット
多重遺伝子又は多重遺伝子ｒＡＡＶ発現構築物は、ポリヌクレオチドＸ１をコードする連続的な（例えば、連続又は非連続の）ｍｉＲＮＡで構成される導入遺伝子を含み得る（例えば、（Ｘ１）ｎ）。Ｘ１ポリヌクレオチドは、表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列のうちのいずれか１つ、ガイド配列に対して完全又は実質的に相補的であるパッセンジャー配列、表６に列挙される５’及び３’隣接配列のうちのいずれか１つ、並びに表６に列挙されるループ配列のうちのいずれか１つを含む。式（Ｘ１）ｎを有する多重遺伝子導入遺伝子は、プロモーター及び導入遺伝子が、式プロモーター－（Ｘ１）ｎを有し、ｎが１～１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）の整数であるように、導入遺伝子の５’末端に位置する単一プロモーターの制御下にある。
本開示の多重マイクロＲＮＡ構築物の非限定的な例は、単一プロモーター、例えば、内因性（Ｅ）－ｍｉＲ－３０足場に埋め込まれた、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号７９０）、ＧＩアンチセンス配列（配列番号７７）、及びＥ－ｍｉＲ－２１８－１足場に埋め込まれた、ＭＷアンチセンス配列（配列番号８０）を含む。かかる構築物は、配列番号８１１の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号８１１の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る（以下を参照されたい）。配列番号８１１の構築物、又はそのバリアントは、配列番号８１２の核酸配列、又は配列番号８１２の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントを有するベクターに組み込まれ得る。
注釈：一本下線：プロモーター配列、太字：ガイド配列及びパッセンジャー配列を含有するマイクロＲＮＡステム－ループ構造、二本下線ポリＡ配列、斜体：スタッファー配列（配列番号８１５）。
二重ｍｉＲＮＡ、二重プロモーター発現カセット
１個より多い（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれより多くの）プレｍｉＲステム－ループ配列を含有する多重遺伝子発現カセットは、各々の個々のプレｍｉＲステム－ループ配列の発現を調節するための１個より多いプロモーター配列を含んでいてもよく、その結果、各々の個々のプレｍｉＲステム－ループ配列は、専用のプロモーター配列に作動可能に連結される。このような場合において、発現構築物は、式（プロモーター－Ｘ１）ｎの構造を特徴とし、式中、Ｘ１が、表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列のうちのいずれか１つを含有するポリヌクレオチドであり、ｎが、１～１０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０）の整数である。追加の調節要素、例えば、二次構造を形成することができる、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化シグナル、イントロン、及び／又は配列、例えば、本明細書に開示される調節要素のうちのいずれか１つは、プロモーター－Ｘ１構造の５’末端及び／又は３’末端に作動可能に連結され得る。
特定の例において、二重ｍｉＲＮＡ発現カセットは、各々が個々のプロモーター配列（例えば、本明細書に開示されるプロモーター配列）の制御下で、２個のプレｍｉＲステム－ループ配列を含む。二重ｍｉＲＮＡカセット中の２個のプロモーターは、同一のプロモーター又は異なるプロモーターであり得る。
特定の例において、二重ｍｉＲＮＡ発現カセットは、５’から３’へ、（ａ）第１のプロモーター配列（例えば、本明細書に開示されるプロモーター配列のうちのいずれか１つ、例えば、表５、例えば、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ）、ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）、又はＣ１ｑｌ２プロモーター（例えば、配列番号７１９若しくは配列番号７９１）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、（ｂ）第１のパッセンジャーヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、若しくは７６８のうちのいずれか１つ）に対して５’に位置する第１の５’隣接領域と、（ｃ）第１のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、（ｉ）第１のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第１のパッセンジャーヌクレオチド配列を含む第１の５’ステム－ループアーム、（ｉｉ）第１のマイクロＲＮＡループ配列（例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、若しくは７７０のうちのいずれか１つ）を含有する第１のループ領域、（ｉｉｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０）、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれかに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する第１のガイドヌクレオチド配列を含有する第１の３’ステム－ループアームを含む、第１のステム－ループ配列と、（ｄ）第１のガイドヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、若しくは７６９のうちのいずれか１つ）に対して３’に位置する第１の３’隣接領域と、（ｅ）任意選択的に、第２のプロモーター配列（例えば、本明細書に開示されるプロモーター配列のうちのいずれか１つ、例えば、表５、例えば、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ）、ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）、又はＣ１ｑｌ２プロモーター（例えば、配列番号７１９若しくは配列番号７９１）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、（ｆ）第２のパッセンジャーヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、若しくは７６８のうちのいずれか１つ）に対して５’に位置する第２の５’隣接領域と、（ｇ）第２のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、（ｉ）第２のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第２のパッセンジャーヌクレオチド配列を含む第２の５’ステム－ループアーム、（ｉｉ）第２のマイクロＲＮＡループ配列（例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、若しくは７７０のうちのいずれか１つ）を含有する第２のループ領域、（ｉｉｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０）、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれかに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する第２のガイドヌクレオチド配列を含有する第２の３’ステム－ループアームを含む、第２のステム－ループ配列と、（ｈ）第２のガイドヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、又は７６９のうちのいずれか１つ）に対して３’に位置する第２の３’隣接領域と、を含むヌクレオチド配列を含む。
別の例において、二重ｍｉＲＮＡ発現カセットは、５’から３’へ、（ａ）第１のプロモーター配列（例えば、本明細書に開示されるプロモーター配列のうちのいずれか１つ、例えば、表５、例えば、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ）、ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）、又はＣ１ｑｌ２プロモーター（例えば、配列番号７１９若しくは配列番号７９１）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、（ｂ）第１のパッセンジャーヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、若しくは７６８のうちのいずれか１つ）に対して５’に位置する第１の５’隣接領域と、（ｃ）第１のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、（ｉ）第１のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第１のパッセンジャーヌクレオチド配列を含有する第１の５’ステム－ループアーム、（ｉｉ）第１のマイクロＲＮＡループ配列（例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、若しくは７７０のうちのいずれか１つ）を含有する第１のループ領域、（ｉｉｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０）、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれかに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する第１のガイドヌクレオチド配列を含有する第１の３’ステム－ループアームを含む、第１のステム－ループ配列と、（ｄ）第１のガイドヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、若しくは７６９のうちのいずれか１つ）に対して３’に位置する第１の３’隣接領域と、（ｅ）任意選択的に、第２のプロモーター配列（例えば、本明細書に開示されるプロモーター配列のうちのいずれか１つ、例えば、表５、例えば、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ）、ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）、又はＣ１ｑｌ２プロモーター（例えば、配列番号７１９若しくは配列番号７９１）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、（ｆ）第２のガイドヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、若しくは７６８のうちのいずれか１つ）に対して５’に位置する第２の５’隣接領域と、（ｇ）第２のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、（ｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０）、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれかに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するガイドヌクレオチド配列を含有する第２の５’ステム－ループアーム、（ｉｉ）第２のマイクロＲＮＡループ配列（例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、若しくは７７０のうちのいずれか１つ）を含有する第２のループ領域、（ｉｉｉ）第２のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第２のパッセンジャーヌクレオチド配列を含有する第２の３’ステム－ループアームを含む、第２のステム－ループ配列と、（ｈ）第２のパッセンジャーヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、又は７６９のうちのいずれか１つ）に対して３’に位置する第２の３’隣接領域と、を含むヌクレオチド配列を含む。
別の例において、二重ｍｉＲＮＡ発現カセットは、５’から３’へ、（ａ）第１のプロモーター配列（例えば、本明細書に開示されるプロモーター配列のうちのいずれか１つ、例えば、表５、例えば、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ）、ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）、又はＣ１ｑｌ２プロモーター（例えば、配列番号７１９若しくは配列番号７９１）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、（ｂ）第１のガイドヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、若しくは７６８のうちのいずれか１つ）に対して５’に位置する第１の５’隣接領域と、（ｃ）第１のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、（ｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０）、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれかに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する第１のガイドヌクレオチド配列を含有する第１の５’ステム－ループアーム、（ｉｉ）第１のマイクロＲＮＡループ配列（例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、若しくは７７０のうちのいずれか１つ）を含有する第１のループ領域、（ｉｉｉ）第１のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第１のパッセンジャーヌクレオチド配列を含有する第１の３’ステム－ループアームを含む、第１のステム－ループ配列と、（ｄ）第１のパッセンジャーヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、若しくは７６９のうちのいずれか１つ）に対して３’に位置する第１の３’隣接領域と、（ｅ）任意選択的に、第２のプロモーター配列（例えば、本明細書に開示されるプロモーター配列のうちのいずれか１つ、例えば、表５、例えば、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ）、ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）、又はＣ１ｑｌ２プロモーター（例えば、配列番号７１９若しくは配列番号７９１）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、（ｆ）第２のパッセンジャーヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、若しくは７６８のうちのいずれか１つ）に対して５’に位置する第２の５’隣接領域と、（ｇ）第２のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、（ｉ）第２のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第２のパッセンジャーヌクレオチド配列を含む第２の５’ステム－ループアーム、（ｉｉ）第２のマイクロＲＮＡループ配列（例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、若しくは７７０のうちのいずれか１つ）を含有する第２のループ領域、（ｉｉｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０）、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれかに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する第２のガイドヌクレオチド配列を含有する第２の３’ステム－ループアームを含む、第２のステム－ループ配列と、（ｈ）第２のガイドヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、又は７６９のうちのいずれか１つ）に対して３’に位置する第２の３’隣接領域と、を含むヌクレオチド配列を含む。
別の例において、二重ｍｉＲＮＡ発現カセットは、５’から３’へ、（ａ）第１のプロモーター配列（例えば、本明細書に開示されるプロモーター配列のうちのいずれか１つ、例えば、表５、例えば、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ）、ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）、又はＣ１ｑｌ２プロモーター（例えば、配列番号７１９若しくは配列番号７９１）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、（ｂ）第１のガイドヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、若しくは７６８のうちのいずれか１つ）に対して５’に位置する第１の５’隣接領域と、（ｃ）第１のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、（ｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０）、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれかに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する第１のガイドヌクレオチド配列を含有する第１の５’ステム－ループアーム、（ｉｉ）第１のマイクロＲＮＡループ配列（例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、若しくは７７０のうちのいずれか１つ）を含有する第１のループ領域、（ｉｉｉ）第１のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第１のパッセンジャーヌクレオチド配列を含有する第１の３’ステム－ループアームを含む、第１のステム－ループ配列と、（ｄ）第１のパッセンジャーヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、若しくは７６９のうちのいずれか１つ）に対して３’に位置する第１の３’隣接領域と、（ｅ）任意選択的に、第２のプロモーター配列（例えば、本明細書に開示されるプロモーター配列のうちのいずれか１つ、例えば、表５、例えば、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ）、ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）、又はＣ１ｑｌ２プロモーター（例えば、配列番号７１９若しくは配列番号７９１）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、（ｆ）第２のガイドヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、若しくは７６８のうちのいずれか１つ）に対して５’に位置する第２の５’隣接領域と、（ｇ）第２のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、（ｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０）、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれかに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するガイドヌクレオチド配列を含有する第２の５’ステム－ループアーム、（ｉｉ）第２のマイクロＲＮＡループ配列（例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、若しくは７７０のうちのいずれか１つ）を含有する第２のループ領域、（ｉｉｉ）第２のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第２のパッセンジャーヌクレオチド配列を含有する第２の３’ステム－ループアームを含む、第２のステム－ループ配列と、（ｈ）第２のパッセンジャーヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、又は７６９のうちのいずれか１つ）に対して３’に位置する第２の３’隣接領域と、を含むヌクレオチド配列を含む。
別の例において、二重ｍｉＲＮＡ発現カセットは、５’から３’へ、（ａ）５’ＩＴＲ配列（例えば、配列番号７４６若しくは配列番号７４７の核酸配列を有するポリヌクレオチド、又は配列番号７４６若しくは配列番号７４７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、（ｂ）第１のプロモーター配列（例えば、本明細書、表５に開示されるプロモーター配列のうちのいずれか１つ、又は表５に列挙されるプロモーター配列、例えば、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ）、ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）、又はＣ１ｑｌ２プロモーター（例えば、配列番号７１９若しくは配列番号７９１）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、（ｃ）第１のパッセンジャーヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、若しくは７６８のうちのいずれか１つ、又は配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、若しくは７６８のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、（ｄ）第１のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、（ｉ）第１のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第１のパッセンジャーヌクレオチド配列を含有する第１の５’ステム－ループアーム、（ｉｉ）第１のマイクロＲＮＡループ配列（例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、若しくは７７０のうちのいずれか１つ、又は配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、若しくは７７０に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）を含有する第１のループ領域、（ｉｉｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０）、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれかに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する第１のガイドヌクレオチド配列を含有する第１の３’ステム－ループアームを含む、第１のステム－ループ配列と、（ｅ）第１のガイドヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、若しくは７６９のうちのいずれか１つ、又は配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、若しくは７６９に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）に対して３’に位置する第１の３’隣接領域と、（ｆ）ＢＧＨポリＡ配列（例えば、配列番号７９３、又は配列番号７９３に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、（ｇ）任意選択的に、第２のプロモーター配列（例えば、本明細書、表５に開示されるプロモーター配列のうちのいずれか１つ、又は表５に列挙されるプロモーター配列、例えば、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ）、ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）、又はＣ１ｑｌ２プロモーター（例えば、配列番号７１９若しくは配列番号７９１）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、（ｈ）第２のパッセンジャー配列（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、若しくは７６８のうちのいずれか１つ、又は配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、若しくは７６８のうちのいずれか１つ）に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、（ｉ）第２のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、（ｉ）第２のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第２のパッセンジャーヌクレオチド配列を含有する第２の５’ステム－ループアーム、（ｉｉ）第２のマイクロＲＮＡループ配列（例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、若しくは７７０のうちのいずれか１つ、又は配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、若しくは７７０に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）を含有する第２のループ領域、（ｉｉｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０）、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれかに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する第２のガイドヌクレオチド配列を含有する第２の３’ステム－ループアームを含む、第２のステム－ループ配列と、（ｊ）第２のガイドヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、若しくは７６９のうちのいずれか１つ、又は配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、若しくは７６９に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）に対して３’に位置する第２の３’隣接領域と、（ｋ）ＲＢＧポリＡ配列（例えば、配列番号７５０、配列番号７５１、若しくは配列番号７９２、又は配列番号７５０、配列番号７５１、若しくは配列番号７９２に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、３’ＩＴＲ配列（例えば、配列番号７４８、配列番号７４９、若しくは配列番号７８９、又は配列番号７４８、配列番号７４９、若しくは配列番号７８９に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含むヌクレオチド配列を含む。
別の例において、二重ｍｉＲＮＡ発現カセットは、５’から３’へ、（ａ）５’ＩＴＲ配列（例えば、配列番号７４６若しくは配列番号７４７の核酸配列を有するポリヌクレオチド、又は配列番号７４６若しくは配列番号７４７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、（ｂ）第１のプロモーター配列（例えば、本明細書、表５に開示されるプロモーター配列のうちのいずれか１つ、又は表５に列挙されるプロモーター配列、例えば、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ）、ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）、又はＣ１ｑｌ２プロモーター（例えば、配列番号７１９若しくは配列番号７９１）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、（ｃ）第１のパッセンジャーヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、若しくは７６８のうちのいずれか１つ、又は配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、若しくは７６８のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、（ｄ）第１のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、（ｉ）第１のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第１のパッセンジャーヌクレオチド配列を含有する第１の５’ステム－ループアーム、（ｉｉ）第１のマイクロＲＮＡループ配列（例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、若しくは７７０のうちのいずれか１つ、又は配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、若しくは７７０に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）を含有する第１のループ領域、（ｉｉｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０）、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれかに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する第１のガイドヌクレオチド配列を含有する第１の３’ステム－ループアームを含む、第１のステム－ループ配列と、（ｅ）第１のガイドヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、若しくは７６９のうちのいずれか１つ、又は配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、若しくは７６９に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）に対して３’に位置する第１の３’隣接領域と、（ｆ）ＢＧＨポリＡ配列（例えば、配列番号７９３、又は配列番号７９３に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、（ｇ）任意選択的に、第２のプロモーター配列（例えば、本明細書、表５に開示されるプロモーター配列のうちのいずれか１つ、又は表５に列挙されるプロモーター配列、例えば、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ）、ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）、又はＣ１ｑｌ２プロモーター（例えば、配列番号７１９若しくは配列番号７９１）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、（ｈ）第２のパッセンジャー配列（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、若しくは７６８のうちのいずれか１つ、又は配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、若しくは７６８のうちのいずれか１つ）に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、（ｉ）第２のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、（ｉ）第２のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第２のパッセンジャーヌクレオチド配列を含有する第２の５’ステム－ループアーム、（ｉｉ）第２のマイクロＲＮＡループ配列（例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、若しくは７７０のうちのいずれか１つ、又は配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、若しくは７７０に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）を含有する第２のループ領域、（ｉｉｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０）、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれかに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するガイドヌクレオチド配列を含有する第２の３’ステム－ループアームを含む、第２のステム－ループ配列と、（ｊ）第２のパッセンジャーヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、若しくは７６９のうちのいずれか１つ、又は配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、若しくは７６９に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）に対して３’に位置する第２の３’隣接領域と、（ｋ）ＲＢＧポリＡ配列（例えば、配列番号７５０、配列番号７５１、若しくは配列番号７９２、又は配列番号７５０、配列番号７５１、若しくは配列番号７９２に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、３’ＩＴＲ配列（例えば、配列番号７４８、配列番号７４９、若しくは配列番号７８９、又は配列番号７４８、配列番号７４９、若しくは配列番号７８９に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含むヌクレオチド配列を含む。
別の例において、二重ｍｉＲＮＡ発現カセットは、５’から３’へ、（ａ）５’ＩＴＲ配列（例えば、配列番号７４６若しくは配列番号７４７の核酸配列を有するポリヌクレオチド、又は配列番号７４６若しくは配列番号７４７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、（ｂ）第１のプロモーター配列（例えば、本明細書、表５に開示されるプロモーター配列のうちのいずれか１つ、又は表５に列挙されるプロモーター配列、例えば、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ）、ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）、又はＣ１ｑｌ２プロモーター（例えば、配列番号７１９若しくは配列番号７９１）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、（ｃ）第１のガイドヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、若しくは７６８のうちのいずれか１つ、又は配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、若しくは７６８のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、（ｄ）第１のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、（ｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０）、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれかに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する第１のガイドヌクレオチド配列を含有する第１の５’ステム－ループアーム、（ｉｉ）第１のマイクロＲＮＡループ配列（例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、若しくは７７０のうちのいずれか１つ、又は配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、若しくは７７０に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントを含有する第１のループ領域、（ｉｉｉ）第１のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第１のパッセンジャーヌクレオチド配列を含有する第１の３’ステム－ループアームを含む、第１のステム－ループ配列と、（ｅ）第１のパッセンジャーヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、若しくは７６９のうちのいずれか１つ、又は配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、若しくは７６９に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）に対して３’に位置する第１の３’隣接領域と、（ｆ）ＢＧＨポリＡ配列（例えば、配列番号７９３、又は配列番号７９３に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、（ｇ）任意選択的に、第２のプロモーター配列（例えば、本明細書、表５に開示されるプロモーター配列のうちのいずれか１つ、又は表５に列挙されるプロモーター配列、例えば、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ）、ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）、又はＣ１ｑｌ２プロモーター（例えば、配列番号７１９若しくは配列番号７９１）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、（ｈ）第２のパッセンジャー配列（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、若しくは７６８のうちのいずれか１つ、又は配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、若しくは７６８のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）に対して５’に位置する第２の５’隣接領域と、（ｉ）第２のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、（ｉ）第２のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第２のパッセンジャーヌクレオチド配列を含有する第２の５’ステム－ループアーム、（ｉｉ）第２のマイクロＲＮＡループ配列（例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、若しくは７７０のうちのいずれか１つ、又は配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、若しくは７７０に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）を含有する第２のループ領域、（ｉｉｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０）、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれかに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するガイドヌクレオチド配列を含有する第２の３’ステム－ループアームを含む、第２のステム－ループ配列と、（ｊ）第２のガイドヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、若しくは７６９のうちのいずれか１つ、又は配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、若しくは７６９に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）に対して３’に位置する第２の３’隣接領域と、（ｋ）ＲＢＧポリＡ配列（例えば、配列番号７５０、配列番号７５１、若しくは配列番号７９２、又は配列番号７５０、配列番号７５１、若しくは配列番号７９２に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、３’ＩＴＲ配列（例えば、配列番号７４８、配列番号７４９、若しくは配列番号７８９、又は配列番号７４８、配列番号７４９、若しくは配列番号７８９に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含むヌクレオチド配列を含む。
別の例において、二重ｍｉＲＮＡ発現カセットは、５’から３’へ、（ａ）５’ＩＴＲ配列（例えば、配列番号７４６若しくは配列番号７４７の核酸配列を有するポリヌクレオチド、又は配列番号７４６若しくは配列番号７４７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、（ｂ）第１のプロモーター配列（例えば、本明細書、表５に開示されるプロモーター配列のうちのいずれか１つ、又は表５に列挙されるプロモーター配列、例えば、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ）、ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）、又はＣ１ｑｌ２プロモーター（例えば、配列番号７１９若しくは配列番号７９１）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントと、（ｃ）第１のガイドヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、若しくは７６８のうちのいずれか１つ、又は配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、若しくは７６８のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）に対して５’に位置する第１の５’隣接領域と、（ｄ）第１のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、（ｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０）、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれかに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する第１のガイドヌクレオチド配列を含有する第１の５’ステム－ループアーム、（ｉｉ）第１のマイクロＲＮＡループ配列（例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、若しくは７７０のうちのいずれか１つ、又は配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、若しくは７７０に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントを含有する第１のループ領域、（ｉｉｉ）第１のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第１のパッセンジャーヌクレオチド配列を含有する第１の３’ステム－ループアームを含む、第１のステム－ループ配列と、（ｅ）第１のパッセンジャーヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、若しくは７６９のうちのいずれか１つ、又は配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、若しくは７６９に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）に対して３’に位置する第１の３’隣接領域と、（ｆ）ＢＧＨポリＡ配列（例えば、配列番号７９３、又は配列番号７９３に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、（ｇ）任意選択的に、第２のプロモーター配列（例えば、本明細書、表５に開示されるプロモーター配列のうちのいずれか１つ、又は表５に列挙されるプロモーター配列、例えば、ｈＳｙｎプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ）、ＣａＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ）、又はＣ１ｑｌ２プロモーター（例えば、配列番号７１９若しくは配列番号７９１）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、（ｈ）第２のガイドヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、若しくは７６８のうちのいずれか１つ、又は配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、若しくは７６８のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）に対して５’に位置する第２の５’隣接領域と、（ｉ）第２のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、（ｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列（例えば、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０）、若しくはＭＵ（配列番号９６）、又はそれらに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）のうちのいずれかに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するガイドヌクレオチド配列を含有する第２の５’ステム－ループアーム、（ｉｉ）第２のマイクロＲＮＡループ配列（例えば、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、若しくは７７０のうちのいずれか１つ、又は配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、若しくは７７０に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）を含有する第２のループ領域、（ｉｉｉ）第２のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第２のパッセンジャーヌクレオチド配列を含有する第２の３’ステム－ループアームを含む、第２のステム－ループ配列と、（ｊ）第２のパッセンジャーヌクレオチド配列（例えば、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、若しくは７６９のうちのいずれか１つ、又は配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、若しくは７６９に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）に対して３’に位置する第２の３’隣接領域と、（ｋ）ＲＢＧポリＡ配列（例えば、配列番号７５０、配列番号７５１、若しくは配列番号７９２、又は配列番号７５０、配列番号７５１、若しくは配列番号７９２に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、３’ＩＴＲ配列（例えば、配列番号７４８、配列番号７４９、若しくは配列番号７８９、又は配列番号７４８、配列番号７４９、若しくは配列番号７８９に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアント）と、を含むヌクレオチド配列を含む。
一例において、第１のガイド配列は、Ｇ９配列（配列番号６８）、又はそれに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアントであり、第２のガイド配列は、ＧＩ配列（配列番号７７）、又はそれに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアントである。別の例において、第１のガイド配列は、Ｇ９配列（配列番号６８）、又はそれに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアントであり、第２のガイド配列は、ＭＷ配列（配列番号８０）、又はそれに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアントである。別の例において、第１のガイド配列は、ＧＩ配列（配列番号７７）、又はそれに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアントであり、第２のガイド配列は、Ｇ９配列（配列番号６８）、又はそれに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアントである。なお別の例において、第１のガイド配列は、ＧＩ配列（配列番号７７）、又はそれに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアントであり、第２のガイド配列は、ＭＷ配列（配列番号８０）、又はそれに対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアントである。
別の例において、第１のプロモーターは、ＳＹＮプロモーター（例えば、配列番号６８２～６８５及び７９０のうちのいずれか１つ、又はそれに対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアントであり、任意選択的に、第２のプロモーターは、ＣＡＭＫＩＩプロモーター（例えば、配列番号６８７～６９１及び８０２のうちのいずれか１つ、又はそれに対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそのバリアントである。
上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットにおいて記載される配列についての配列同一性は、１０～１５００個（例えば、２０～１４００、３０～１３００、４０～１２００、５０～１１００、６０～１０００、７０～９００、８０～８００、９０～７００、１００～６００、２００～５００、又は３００～４００個）のヌクレオチドの範囲にわたって決定され得る。例えば、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、１０個のヌクレオチドにわたって決定され得る。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、２０個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、３０個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、４０個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、５０個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、６０個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、７０個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、８０個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、９０個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、１００個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、１５０個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、２００個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、２５０個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、３００個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、３５０個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、４００個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、４５０個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、５００個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、５５０個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、６００個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、６５０個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、７００個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、７５０個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、８００個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、８５０個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、９００個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、９５０個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、１０００個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、１１００個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、１２００個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、１３００個のヌクレオチドにわたって決定される。別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、１４００個のヌクレオチドにわたって決定される。なお別の例において、上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットに対する配列同一性は、１５００個のヌクレオチドにわたって決定される。
上述の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットは、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、７ＳＫプロモーター、アポリポタンパク質Ｅ－ヒトアルファ１－アンチトリプシンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＣＫ８プロモーター、ｍＵ１ａプロモーター、伸長因子１αプロモーター、チロキシン結合グロブリンプロモーター、シナプシンプロモーター、ＲＮＡ結合Ｆｏｘ－１ホモログ３プロモーター、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩプロモーター、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、血小板由来成長因子サブユニットβ、小胞グルタミン酸トランスポータープロモーター、ソマトスタチンプロモーター、神経ペプチドＹプロモーター、血管作動性腸管ペプチドプロモーター、パルブアルブミンプロモーター、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５プロモーター、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６７プロモーター、ドーパミン受容体Ｄ１プロモーター、ドーパミン受容体Ｄ２プロモーター、補体Ｃ１ｑ様２プロモーター、プロオピオメラノコルチンプロモーター、プロスペロホメオボックス１プロモーター、微小管関連タンパク質１Ｂプロモーター、及びチューブリンアルファ１プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含み得る。
本明細書に開示される二重ｍｉＲＮＡ発現カセットと組み合わせて使用するのに適したマイクロＲＮＡループ配列は、ｍｉＲ－３０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－２１８－１、又はｍｉＲ－１２４－３ループ配列であり得る。
本開示の二重ｍｉＲＮＡ発現カセットはまた、発現カセットの５’末端上の５’－ＩＴＲ（例えば、配列番号７４６若しくは配列番号７４７）、及び発現カセットの３’末端上の３’－ＩＴＲ（例えば、配列番号７４８、７４９、及び７８９のうちのいずれか１つ）を組み込み得る。
更に、本明細書に開示される二重ｍｉＲＮＡ発現構築物は、第１の３’隣接領域の３’末端と第２のプロモーターの５’末端との間に作動可能に連結された第１のポリアデニル化（ポリＡ）シグナル、かつ／又は第２の３’隣接領域の第２の３’末端と３’ＩＴＲとの間に作動可能に連結された第２のポリＡシグナルを含み得る。第１のポリＡシグナル及び第２のポリＡシグナルは、同一であってもよく（例えば、両方ともＲＢＧ若しくはＢＧＨポリＡシグナル）、又は異なっていてもよい（例えば、第１のポリＡシグナルは、ＲＢＧポリＡであり、第２のポリＡシグナルは、ＢＧＨポリＡであるか、又は第１のポリＡシグナルは、ＢＧＨポリＡであり、第２のポリＡシグナルは、ＲＢＧポリＡである）。
本開示の例示的な二重ｍｉＲＮＡ抗Ｇｒｉｋ２構築物は、Ａ－ｍｉＲ－３０足場に組み込まれたＧ９（配列番号６８）ＡＳＯ配列に作動可能に連結されたｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、その後に、Ａ－ｍｉＲ－３０足場に組み込まれたＧＩ（配列番号７７）ＡＳＯ配列に作動可能に連結されたＣａＭＫＩＩプロモーター（配列番号８０２）を含有するＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）構築物を含み得る（ＤＭＴＰＶ１）。かかる構築物は、配列番号７８５の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号７８５の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る（以下を参照されたい）。
注釈：太字＝５’ＩＴＲ配列、一本下線＝プロモーター配列、斜体＝５’隣接配列－ガイド配列－マイクロＲＮＡループ配列－パッセンジャー配列－３’隣接配列、斜体＋波状下線：ガイド配列（この順序で、Ｇ９及びＧＩ）に対して相補的なパッセンジャー配列をコードするＤＮＡ、斜体＋太字＋一本下線：ガイド配列（この順序で、Ｇ９及びＧＩ）をコードするＤＮＡ、二本下線：ポリＡ配列、太字＋小文字：３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）。
本開示の別の例示的な二重ｍｉＲＮＡ抗Ｇｒｉｋ２構築物は、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３足場に組み込まれた、Ｇ９（配列番号６８）ＡＳＯ配列に作動可能に連結されたｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、その後に、Ｅ－ｍｉＲ－２１８足場に組み込まれたＭＷ（配列番号８０）ＡＳＯ配列に作動可能に連結されたＣａＭＫＩＩプロモーター（配列番号８０２）を含有するＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）構築物を含み得る（ＤＭＴＰＶ２）。かかる構築物は、配列番号７８６の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号７８６の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る（以下を参照されたい）。
注釈：太字＝５’ＩＴＲ配列、一本下線＝プロモーター配列、斜体＝５’隣接配列－ガイド配列－マイクロＲＮＡループ配列－パッセンジャー配列－３’隣接配列、斜体＋波状下線：ガイド配列（この順序で、Ｇ９及びＭＷ）に対して相補的なパッセンジャー配列をコードするＤＮＡ、斜体＋太字＋一本下線：ガイド配列（この順序で、Ｇ９及びＭＷ）をコードするＤＮＡ、二本下線：ポリＡ配列、太字＋小文字：３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）。
本開示の別の例示的な二重ｍｉＲＮＡ抗Ｇｒｉｋ２構築物は、Ｅ－ｍｉＲ－３０－３足場に組み込まれたＧＩ（配列番号７７）ＡＳＯ配列に作動可能に連結されたｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、その後に、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３足場に組み込まれたＧ９（配列番号６８）ＡＳＯ配列に作動可能に連結されたＣａＭＫＩＩプロモーター（配列番号８０２）を含有するＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）構築物を含み得る（ＤＭＴＰＶ３）。かかる構築物は、配列番号７８７の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号７８７の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る（以下を参照されたい）。
注釈：太字＝５’ＩＴＲ配列、一本下線＝プロモーター配列、斜体＝５’隣接配列－ガイド配列－マイクロＲＮＡループ配列－パッセンジャー配列－３’隣接配列、斜体＋波状下線：ガイド配列（この順序で、ＧＩ及びＧ９）に対して相補的なパッセンジャー配列をコードするＤＮＡ、斜体＋太字＋一本下線：ガイド配列（この順序で、ＧＩ及びＧ９）をコードするＤＮＡ、二本下線：ポリＡ配列、太字＋小文字：３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）。
本開示の別の例示的な二重ｍｉＲＮＡ抗Ｇｒｉｋ２構築物は、Ｅ－ｍｉＲ－３０－３足場に組み込まれたＧＩ（配列番号７７）ＡＳＯ配列に作動可能に連結されたｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、その後に、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３足場に組み込まれたＭＷ（配列番号８０）ＡＳＯ配列に作動可能に連結されたＣａＭＫＩＩプロモーター（配列番号８０２）を含有するＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）構築物を含み得る（ＤＭＴＰＶ４）。かかる構築物は、配列番号７８８の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号７８８の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る（以下を参照されたい）。
注釈：太字＝５’ＩＴＲ配列、一本下線＝プロモーター配列、斜体＝５’隣接配列－ガイド配列－マイクロＲＮＡループ配列－パッセンジャー配列－３’隣接配列、斜体＋波状下線：ガイド配列（この順序で、ＧＩ及びＭＷ）に対して相補的なパッセンジャー配列をコードするＤＮＡ、斜体＋太字＋一本下線：ガイド配列（この順序で、ＧＩ及びＭＷ）をコードするＤＮＡ、二本下線：ポリＡ配列、太字＋小文字：３’ＩＴＲ配列（配列番号７８９）。
本開示の別の例示的な二重ｍｉＲＮＡ抗Ｇｒｉｋ２構築物は、Ｅ－ｍｉＲ－３０－３足場に組み込まれたＧＩ（配列番号７７）ＡＳＯ配列に作動可能に連結されたｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、その後に、Ｅ－ｍｉＲ－２１８－１足場に組み込まれたＭＷ（配列番号８０）ＡＳＯ配列に作動可能に連結されたＣａＭＫＩＩプロモーター（配列番号８０２）を含有するＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）構築物を含み得る（ＤＭＴＰＶ８）。かかる構築物は、配列番号８１３の核酸配列を有していてもよく、又は配列番号８１３の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントであり得る（以下を参照されたい）。かかる発現カセットは、配列番号８１４の核酸配列、又は配列番号８１４の核酸配列に対して少なくとも８５％の（少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有するそれらのバリアントを有するベクターに組み込まれ得る。
注釈：一本下線：プロモーター配列、太字：ガイド配列及びパッセンジャー配列を含有するマイクロＲＮＡステム－ループ構造、二本下線ポリＡ配列、斜体：スタッファー配列（配列番号８１６）。
複数のｍｉＲＮＡ配列を含有するＡＡＶベクターの製造における改善
単一ｍｉＲＮＡ発現カセット（例えば、本明細書に開示される発現カセット）をコードするプラスミドを使用するＡＡＶベクターの調製は、潜在的に、不適切なＡＡＶゲノムパッケージングによって損なわれる可能性がある。第一に、プリｍｉＲＮＡ配列は短く（２００個未満の塩基）、適切な長さに依存して、単一ｍｉＲＮＡの発現を制御する単一プロモーターを有する導入遺伝子カセットの設計によって、ＡＡＶの最大パッケージング能力（約４．８ｋｂ）よりも顕著に短いＡＡＶゲノムを生じる可能性がある。したがって、参加する全ゲノム長が２．４ｋｂ（ＡＡＶのパッケージング能力の半分）に満たない場合には、単一カプシドが、１つより多いベクターにロードされ得る可能性がある。このことは、ＡＡＶゲノムダイマー（又はトリマー）の産生を可能にする適切なエンドヌクレアーゼニッキングを行うことなく、ポリメラーゼリードスルーによって媒介することができ、次いで、適切な長さを有する場合には、ＡＡＶカプシド内でパッケージングされ得る。これにより、その後、ＡＡＶベクター粒子の集合に顕著な異種性が導入され、薬物製品の製造及び特性決定が、顕著により困難なものになる。
第二に、ｓｈＲＮＡ系及びｍｉＲＮＡ系の導入遺伝子は、固有に、ｍｉＲＮＡヘアピンを含むことに起因する顕著な二次構造を有する。ＡＡＶゲノム内のこれらの内部二次構造は、ＡＡＶゲノム複製及びパッケージング中に「偽の」ＩＴＲとして機能する場合があり、完全及び部分的なベクターの混合物を含有するＡＡＶベクター粒子の先端切断事象及び異種集合を生じることが示されている。
本願発明者らは、追加の配列（例えば、自己相補的ＡＡＶゲノム等を使用する、追加のプレｍｉＲＮＡステム－ループ配列、第２のプロモーター配列、スタッファー配列（例えば、配列番号８１５及び／又は配列番号８１６）を用いたＡＡＶパッケージング能力を下回るサイズを有するＡＡＶゲノムのパディングが、部分的な（すなわち、先端切断された）ＡＡＶゲノムのコピーの組み込みを回避することによって、ＡＡＶパッケージングを実質的に改善することを発見した。したがって、本明細書に記載の構築物は、上述の配列をＡＡＶ発現カセットに組み込み、ベクターサイズを、最大ＡＡＶパッケージング能力に近い値まで増加させることによって、ＡＡＶゲノムの不適切なパッケージングを回避する。
例えば、単一プロモーターの制御下で１つのｍｉＲＮＡを発現するか、又は２つの別個のプロモーター（二重構築物アプローチ）から２つのｍｉＲＮＡを発現する構築物が、インビトロ／エクスビボ／インシリコ評価によって予測されるように、インビボで行ない得ない場合が存在し得る。これらの場合において、以下の戦略を実行して、ＡＡＶベクター粒子の同種の全長単一パッケージングされた集合を産生するゲノム長を確立することができる。
第一に、単一ｍｉＲＮＡ「ガイド」の発現が望ましい場合、スタッファー配列（例えば、配列番号８１５及び／又は配列番号８１６）を付加し、プロモーターを破壊することなく、ＡＡＶベクターの全長を増加させ得る。ｍｉＲカセット自体。このスタッファーは、導入遺伝子カセットの下流（ポリＡ配列の３’）に付加され得る（例えば、図６Ｆ及び図６Ｇを参照されたい）。このスタッファーの長さ及び含有量は、ＡＡＶパッケージングの均質性を改善する能力を保持しつつ、変化させ得る。これに加えて、このスタッファーは、プロモーターの上流（５’）に配置され得る。スタッファー配列は、ｓｃＡＡＶベクター又は一本鎖（ｓｓ）ＡＡＶベクターの文脈で利用され得る。いくつかの実施形態において、本開示のベクターは、１つ以上のスタッファー配列（例えば、１、２個、又はそれより多くのスタッファー配列）を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号８１５の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号８１５の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９１％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号８１５の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号８１５の核酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号８１５の核酸配列を有する。いくつかの実施形態において、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号８１６の核酸配列に対して少なくとも８５％の（例えば、少なくとも８６％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号８１６の核酸配列に対して少なくとも９０％の（例えば、少なくとも９１％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号８１６の核酸配列に対して少なくとも９５％の（例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号８１６の核酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、１つ以上のスタッファー配列は、配列番号８１６の核酸配列を有する。
第二に、１つより多いｍｉＲＮＡが発現されるが、単一プロモーター戦略が選択される場合、ベクターは、複数のｍｉＲＮＡカセットの連結によって調製することができる。同じ足場を使用する複数ｍｉＲＮＡカセット（例えば、最大５個のｍｉＲＮＡカセット）の転結は、ベクター内の相同性配列間の再組み合わせを引き起こす場合があり（図７）、非相同性隣接及びループ配列を有する異なる足場を使用するｍｉＲＮＡカセットの連結は、このパッケージングの問題を緩和することができる（図８Ｆ）。追加のｍｉＲＮＡカセットを含むことにより、適切な長さのベクターが得られない場合、スタッファー配列（例えば、配列番号８１５及び／又は配列番号８１６）を上述のように組み込み、パッケージング効率を改善するために長さを増加させ得る。
薬学的組成物
本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、又はそれをコードする核酸ベクターは、インビボで投与するのに適した生物学的に適合する形態で哺乳動物（例えば、ヒト）対象に投与するための薬学的組成物へと製剤化され得る。
本明細書に開示される組成物は、対象（例えば、ヒト）への送達のために任意の適したビヒクル中で製剤化され得る。例えば、薬学的に許容される懸濁液、分散液、溶液、又はエマルションで製剤化され得る。適切な媒体としては、生理食塩水及びリポソーム調製物が挙げられる。より特定的には、薬学的に許容される担体は、滅菌水溶液又は非水性溶液、懸濁液、及びエマルションを含み得る。組換えヒトアルブミン（ｒＡｌｂｕｍｉｎ Ｈｕｍａｎ ＮＦ ＲＥＣＯＭＢＵＭＩＮ（登録商標）Ｐｒｉｍｅ）はまた、ＡＡＶベクター（Ａｌｂｕｍｅｄｉｘ、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ ＵＫ）とともに安定剤として使用され得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、及びオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルである。水性担体としては、生理食塩水及び緩衝化媒体を含め、水、アルコール性／水性の溶液、エマルション、又は懸濁液が挙げられる。静脈内投与に適したビヒクルとしては、流体及び栄養素の補給剤、電解質補給剤（例えば、Ｒｉｎｇｅｒデキストロースに基づくもの）等が挙げられる。
防腐剤及び他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、及び不活性気体等も存在してもよい。
コロイド分散系も、標的化遺伝子送達に使用してもよい。コロイド分散系としては、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油エマルションを含む脂質ベースの系、ミセル、混合ミセル、及びリポソームが挙げられる。
本明細書に記載の組成物は、遊離塩基の形態で、塩、溶媒和物の形態で、また、プロドラッグとして使用され得る。全ての形態が、本明細書に記載の方法に含まれる。本開示の方法によれば、開示される化合物、又はその塩、溶媒和物、若しくはプロドラッグは、選択される投与経路に応じて、種々の形態で患者に投与され得る。
したがって、本明細書に記載の組成物を、例えば、経口、非経口、髄腔内、脳室内、実質内、口腔、舌下、経鼻、直腸、パッチ、ポンプ、又は経皮投与による投与のために製剤化されてもよく、それに従って製剤化された薬学的組成物であってもよい。非経口投与としては、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、経上皮、経鼻、肺内、髄腔内、脳室内、実質内、直腸、及び局所投与態様が挙げられる。非経口投与は、選択された期間にわたる連続的な注入であり得る。
本明細書に記載の薬剤の溶液を、界面活性剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースと適切に混合した水中で調製することができる。分散液を、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、ＤＭＳＯ、及びアルコールを含むか、又は含まない、これらの混合物中で、及び油中で調製することもできる。通常の貯蔵及び使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防止するために防腐剤を含有し得る。適切な製剤の選択及び調製のための従来の手順及び成分は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （２０１２，２２ｎｄ ｅｄ．）、及びＴｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（ＵＳＰ ４１ ＮＦ ３６）（２０１８年に句会された）に記載される。注射可能な用途に適した薬学的形態としては、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射溶液又は分散液のその場での調製のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、その形態は、滅菌でなければならず、シリンジによって容易に投与され得る程度まで流体でなければならない。局所、領域、又は全身投与も適切な場合がある。本明細書に記載の組成物は、有利なことに、標的部位に、例えば、およそ１ｃｍの間隔をあけられた注射又は複数の注射を行うことによって接触され得る。
本明細書に記載の組成物は、動物（例えば、ヒト）に単独で、又は薬学的に許容される担体と組み合わせて、投与されてもよく、本明細書で示される場合、その割合は、化合物の溶解性及び化学的性質、選択される投与経路、及び標準的な薬学的実施によって決定される。
したがって、本開示は、本明細書に開示されるＡＳＯ剤（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ、又はｓｈｍｉＲＮＡ）を含有する薬学的組成物に関する。特に、本開示は、本開示のＡＳＯ剤を含むベクターを含む組成物に関する。特定の例において、本開示は、本明細書に開示されるように、プロモーターに作動可能に連結された本開示のＡＳＯを含むベクター（例えば、レンチウイルス又はＡＡＶベクター）を含有する薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、（ａ）ウイルスカプシド、及び（ｂ）ＡＡＶ ＩＴＲによって隣接される発現カセットを含む人工ポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターを含んでいてもよく、発現カセットは、ＣＮＳ細胞においてポリヌクレオチドの発現を制御する１つ以上の調節配列に作動可能に連結された、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害するオリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
本明細書に開示されるＡＳＯ剤を、薬学的に許容される賦形剤、及び任意選択的に、持続放出マトリックス、例えば、生分解性ポリマーと組み合わせて、薬学的組成物を形成し得る。「薬学的に」又は「薬学的に許容される」は、適切な場合に哺乳動物、特にヒトに投与される場合に、有害なアレルギー反応又は他の不都合な反応を引き起こさない分子エンティティ及び組成物を指す。薬学的に許容される担体又は賦形剤は、任意の種類の非毒性の固体、半固体、若しくは液体の充填剤、希釈剤、封入材料、又は製剤助剤を指す。本明細書に開示される薬学的組成物は、脳内（例えば、実質内若しくは脳室内）、筋肉内、静脈内、経皮、局所、経口、舌下、皮下、又は直腸投与のために製剤化され得る。単独で、又は別の療法剤と組み合わせた本組成物の活性構成要素（例えば、Ｇｒｉｋ２を標的化するＡＳＯ剤）を、それを必要とする対象に、従来の薬学的支持体との混合物として単位投与形態で投与し得る。適切な単位投与形態としては、経口経路形態、例えば、錠剤、ゲルカプセル、粉末、顆粒及び経口懸濁液又は溶液、舌下及び口腔投与形態、エアロゾル、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、髄腔内、脳内、定位、及び経鼻投与形態、及び直腸投与形態が挙げられる。典型的には、薬学的組成物は、注射することができる製剤のために薬学的に許容されるビヒクルを含有する。これらは、特に、等張性で滅菌の生理食塩水溶液（リン酸一ナトリウム若しくは二ナトリウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム若しくはマグネシウムの塩化物等、又はこのような塩の混合物）、又は乾燥させた、特に凍結乾燥させた組成物であって、滅菌水又は生理食塩水を添加すると、場合に応じて、注射溶液の構築が可能になるものであり得る。注射可能な用途に適した薬学的形態としては、滅菌水溶液又は分散液、ゴマ油、ピーナッツ油、又は水性プロピレングリコールを含む製剤、及び滅菌注射溶液又は分散液のその場での調製のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合において、その形態は、滅菌でなければならず、容易なシリンジ取り扱い性が促進される程度まで流体でなければならない。製造条件及び貯蔵条件下で安定でなければならず、微生物（例えば、細菌及び真菌）の混入作用に対して防御されなければならない。本開示の化合物を遊離塩基又は薬学的に許容される塩として含む溶液は、界面活性剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースと適切に混合した水中で調製することができる。分散液を、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びこれらの混合物中で、及び油中で調製することもできる。通常の貯蔵及び使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を防止するために防腐剤を含有し得る。本明細書に開示されるオリゴヌクレオチド剤は、中性形態又は塩形態で、組成物へと製剤化され得る。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）が挙げられ、無機酸、例えば、塩酸若しくはリン酸、又は例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸を用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩はまた、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は第二鉄の水酸化物、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基に由来し得る。担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び脂質ポリエチレングリコール等）、これらの適切な混合物、並びに植物油を含有する溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散の場合には必要な粒径を維持することによって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の抑止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によってもたらされ得る。いくつかの場合において、本開示の薬学的組成物は、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含み得るだろう。注射可能組成物の長期間にわたる吸収は、例えば、アルミニウムモノステアレート及びゼラチン等の吸収を遅らせる薬剤の使用によってもたらされ得る。滅菌注射可能溶液は、上に列挙された他の成分のいくつかを含む適切な溶媒中、必要な量で活性薬剤を組み込み、必要な場合には、その後に濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、基本的な分散媒体及び本明細書に開示されるものからの必要な追加の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合において、好ましい調製方法は、すでに滅菌濾過した溶液から活性成分及び任意の追加の望ましい成分の粉末が得られる高減圧乾燥及び凍結乾燥技術であってもよい。製剤化時に、溶液を、投薬量の要求に適合する方法で、治療に有効な量で投与する。製剤は、種々の剤形、例えば、上述の種類の注射可能溶液で容易に投与されるが、薬物放出カプセル等も使用することができる。水溶液での非経口投与のために、例えば、溶液は、必要な場合には、適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤は、まず、十分な生理食塩水又はグルコースで等張化されるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与に特に適している。使用可能な滅菌水性媒体は、当該技術分野でよく知られている。例えば、１回の投薬量は、１ｍＬの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され、１０００ｍＬの皮下注入液に加えるか、又は提案される注入部位に注射することができる。投薬量のある程度の変動は、治療される対象の状態に応じて、必然して生じるだろう。投与を担う実施者は、任意の事象において、適切な患者情報及び当該技術分野で認識されている方法を使用して、個々の対象にとって適切な用量を決定することができる。
診断の方法
対象（例えば、ヒト対象）は、例えば、当該技術分野でよく知られている方法を使用して、てんかん（例えば、ＴＬＥ）を有すると診断され、したがって、本明細書に開示される組成物及び方法を使用した治療が必要であると特定され得る。例えば、対象におけるてんかんの診断は、対象の脳において、てんかん原性病巣及びてんかん性活性の重症度を特定するための神経生理学的試験によって導かれ得る。当該技術分野でよく知られている例示的な神経生理学的試験法としては、脳波検査（ＥＥＧ）、脳磁検査（ＭＥＧ）、機能的ＭＲＩ（ｆＭＲＩ）、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、及び陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）が挙げられる。ＥＥＧ及びＭＥＧは、高い時間分解能で皮質機能の連続的な測定値を提供し、発作間の（てんかん発作の間の期間の）てんかん性放電の検出を容易にし、これは、対象におけるてんかん性状態の陽性診断の指標であり得る。対象の年齢、病歴、及びライフスタイルに適した正常状態（例えば、参照集合、例えば、非てんかん性患者集団）と比較した対象における脳活性の比較を行い、対象におけるてんかんに関する診断を決定し得る。
対象は、限定されないが、ＴＬＥ（例えば、ｍＴＬＥ又はｌＴＬＥ）、両性ローランドてんかん、前頭葉てんかん、点頭てんかん、若年性ミオクロニーてんかん、若年性欠神てんかん、小児欠神てんかん（ピクノレプシー）、温水てんかん、レノックス・ガストー症候群、ランドウ・クレフナー症候群、ドラベ症候群、進行性ミオクローヌスてんかん、反射てんかん、ラスムッセン症候群、辺縁系てんかん、てんかん重積状態、腹性てんかん、汎発性両側ミオクローヌス、月経関連性てんかん、ジャクソン型発作障害、ラフォラ病、及び光感受性てんかんを含むいくつかのてんかん性状態のうちのいずれか１つを有すると診断され得る。てんかん性状態がＴＬＥである場合において、ＴＬＥは、焦点てんかん発作又は全般てんかん発作を特徴とし得る。
開示される方法を使用して、特定の脳領域（例えば、内側側頭葉、外側前頭葉、前頭葉等）にてんかん原性病巣が局在化することに基づいて患者を診断することができる、てんかんの種類。また、てんかん性能活性の電気生理学的シグネチャを使用して、対象において特定の種類のてんかん又はてんかんのサブタイプを特定し得る。例えば、皮質領域（例えば、海馬又は大脳皮質）における速い（２５０～６００Ｈｚ）の鋭敏なリップル波（ＳＰＷ－Ｒ）の存在は、対象におけるＴＬＥの陽性診断の指標であり得る。別の例において、レノックス・ガストー症候群は、多くの場合、新皮質及び視床にわたって記録される速く動く脳波振動（１０～１５Ｈｚ）の存在を特徴とする。更に、入院患者施設における対象の動画モニタリングは、患者が、てんかん性発作の行動学的徴候、例えば、全般けいれん、一時的な欠神（約１０秒間続く期間にわたる意識レベルの低下）、トーヌス、ミオクローヌス、腸若しくは膀胱の制御喪失、舌を噛むこと、疲労感、頭痛、発話困難、異常な行動（例えば、一点凝視、又は手又は口の自動的な運動）、精神病、及び／又は限局性脱力を明らかに示すようにみえる場合には、患者におけるてんかん診断の指標であり得る。てんかんについて診断される対象からの自己報告の症状はまた、陽性診断の指標であり得る。このような自己報告の症状としては、既視感又は未視感の感覚、前兆、健忘、自然発生する理由のない恐怖及び不安感、吐き気、聴覚、視覚、嗅覚、味覚、又は幻触、視覚のゆがみ（例えば、巨視症若しくは小視症）、解離又は現実感喪失、共感覚、不快感若しくは多幸感、恐怖、怒り、又は言葉で言い表せない感覚が挙げられ得る。
薬学的使用
上述の組成物（例えば、ＡＳＯ剤、又はそれをコードする核酸ベクター）を投与することによる、てんかん性状態を有するか、又は発症するリスクがあると診断された対象において、てんかん（例えば、ＴＬＥ）を治療するための方法が、本明細書に開示される。投与すると、本開示のＡＳＯ剤は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに結合し、その発現を阻害することができる。本明細書に開示されるＡＳＯ剤によるＧｒｉｋ２の標的化は、Ｇｒｉｋ２が転写され、（例えば、細胞若しくは複数の細胞を本開示のオリゴヌクレオチドと接触させることによって、又は本開示のオリゴヌクレオチドを、細胞が存在するか、若しくは存在した対象に投与することによって）治療されるか、又は治療されない、第１の細胞又は細胞群（例えば、神経細胞、かかる細胞は、例えば、対象中に、又は対象に由来する試料中に存在し得る）によって発現されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのレベルの低下によって表されてもよい。特定の例において、Ｇｒｉｋ２の発現は、第１の細胞又は細胞群において、第１の細胞又は細胞群と実質的に同一であるが、そのように治療されていないか、又は治療されなかった第２の細胞又は細胞群（オリゴヌクレオチドで治療されていないか、又は目的の遺伝子を標的化するオリゴヌクレオチドで治療されていない対照細胞）と比較して、低下する。目的の遺伝子（例えば、Ｇｒｉｋ２）のｍＲＮＡのレベルの低下度は、以下の観点で表現され得る。
遺伝子（例えば、Ｇｒｉｋ２遺伝子）の発現レベルの変化は、目的の遺伝子の発現に機能的に連結するパラメータ（例えば、目的の遺伝子のタンパク質発現、又はタンパク質の下流のシグナル伝達）の減少という観点で評価され得る。目的の遺伝子の発現レベルの変化は、発現構築物から内因的又は異種で、及び当該技術分野で知られている任意のアッセイのいずれかによって、目的の遺伝子を発現する任意の細胞において決定され得る。
Ｇｒｉｋ２の発現レベルの変化は、細胞又は細胞群によって発現されるＧｌｕＫ２タンパク質のレベル（例えば、対象に由来する試料において発現するＧｌｕＫ２タンパク質のレベル）の低下によって表され得る。上に説明されるように、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ抑制の評価について、治療される細胞又は細胞群におけるＧｌｕＫ２タンパク質発現のレベルの変化は、同様に、対照細胞又は細胞群におけるタンパク質のレベルの割合として表され得る。
Ｇｒｉｋ２遺伝子の発現の変化を評価するために使用され得る対照細胞又は細胞群としては、本開示のオリゴヌクレオチドとまだ接触していない細胞又は細胞群が挙げられる。例えば、対照細胞又は細胞群は、オリゴヌクレオチドによる対象の治療の前の個々の対象（例えば、ヒト、又は動物対象）に由来し得る。
細胞又は細胞群によって発現されるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのレベルは、ｍＲＮＡ発現を評価するために当該技術分野で知られている任意の方法を使用して決定され得る。例えば、試料におけるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡの発現レベルは、転写されるポリアデニル化シグナル、又はその一部（例えば、ｍＲＮＡ）を検出することによって決定され得る。例えば、酸フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出（ＲＮＡｚｏｌ Ｂ、Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ＲＮＥＡＳＹ（商標）ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）又はＰＡＸ遺伝子（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むＲＮＡ抽出技術を使用して、ＲＮＡを細胞から抽出し得る。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する典型的なアッセイフォーマットとしては、核ランオンアッセイ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、ノーザンブロッティング、インサイチュハイブリダーゼーション、及びマイクロアレイ分析が挙げられる。循環ｍＲＮＡは、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１２／１７７９０６号に記載される方法を使用して検出されてもよく、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。目的の遺伝子の発現レベルはまた、核酸プローブを使用して決定され得る。「プローブ」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の配列、例えば、ｍＲＮＡに対して選択的に結合することができる任意の分子を指す。プローブは、当該技術分野でよく知られており、かつ従来の方法を使用して合成することができるか、又は適切な生物学的調製物に由来していてもよい。プローブは、標識化されるように特定的に設計され得る。プローブとして利用することができる分子の例としては、限定されないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、及び有機分子が挙げられる。
単離されたｍＲＮＡを、限定されないが、サザン又はノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析、及びプローブアレイを含む、ハイブリダイゼーション又は増幅アッセイに使用することができる。ｍＲＮＡレベルの決定のための１つの方法は、単離されたｍＲＮＡと、目的の遺伝子のｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子（プローブ）とを接触させることを伴う。ｍＲＮＡを固体表面に固定化し、例えば、単離されたｍＲＮＡをアガロースゲル上で移動させ、ｍＲＮＡをゲルから膜（例えば、ニトロセルロース）に移すことによって、プローブと接触させ得る。また、ｍＲＮＡを固体表面に固定化してもよく、ｍＲＮＡを、例えば、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ遺伝子チップアレイにおいて、プローブと接触させる。当該技術分野で既知のｍＲＮＡ検出方法は、目的の遺伝子のｍＲＮＡのレベルを決定する際の使用に適応され得る。
試料において目的の遺伝子の発現レベルを決定するための代替的な方法は、例えば、試料中のｍＲＮＡの核酸増幅及び／又は逆転写酵素のプロセス（ｃＤＮＡを調製するため）、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，１９８７、米国特許第４，６８３，２０２号に示される実験実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９－１９３）、自立型配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４－１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３－１１７７）、Ｑ－ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，８５４，０３３号）、又は任意の核酸増幅方法、その後の当該技術分野でよく知られている技術を使用した、増幅分子の検出によるものを伴う。これらの検出スキームは、かかる分子が非常に少ない数で存在する場合、核酸分子の検出に特に有用である。本開示の特定の態様において、目的の遺伝子の発現レベルは、定量的蛍光性ＲＴ－ＰＣＲ（すなわち、ＴＡＱＭＡＮ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ）、又はＤＵＡＬ－ＧＬＯ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅアッセイによって決定される。
目的の遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルは、膜ブロット（例えば、ノーザン、サザン、ドット等のハイブリダイゼーション分析に使用されるもの）、又はマイクロウェル、試料チューブ、ゲル、ビーズ又は繊維（又は結合した核酸を含む任意の固体支持体）を使用してモニタリングされ得る。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７７０，７２２号、第５，８７４，２１９号、第５，７４４，３０５号、第５，６７７，１９５号、及び第５，４４５，９３４号を参照されたい。遺伝子発現レベルの決定はまた、溶液中の核酸プローブを使用することを含み得る。
ｍＲＮＡ発現のレベルはまた、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイ、又はリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して評価され得る。このＰＣＲ法の使用は、本明細書で提示される実施例に記載され、例示される。かかる方法を、目的の遺伝子の核酸の検出にも使用することができる。
更に、Ｇｒｉｋ２遺伝子の発現によって産生されるＧｌｕＫ２タンパク質のレベルは、タンパク質レベルを測定するための当該技術分野で知られている任意の方法を使用して決定され得る。かかる方法としては、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高拡散クロマトグラフィー（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、流体若しくはゲル沈降素反応、吸光分光法、比色アッセイ、分光光度アッセイ、フローサイトメトリー、免疫拡散（単一又は二重）、免疫電気泳動、ウェスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイ等が挙げられる。かかるアッセイはまた、目的の遺伝子によって産生されるタンパク質の存在又は複製の指標であるタンパク質の検出に使用することもできる。これに加えて、上述のアッセイを使用して、タンパク質機能の回復又は変化をもたらす目的のｍＲＮＡ配列の変化を報告し、それによって、療法の効果及び利益を対象に提供し、対象において障害を治療し、かつ／又は対象において障害の症状を減少させることができる。
したがって、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ又はＧｌｕＫ２タンパク質発現を測定するための上述のアッセイを使用して、対象（例えば、てんかん、例えば、ＴＬＥを患う対象）を、本明細書に開示される１つ以上のＡＳＯ剤（例えば、表２に記載されるＡＳＯ剤のうちのいずれか１つ）、又はそれをコードする核酸ベクターによる治療的治療を必要とすると特定してもよい。例えば、ＴＬＥを有すると特定された患者は、制御することができない（例えば、治療抵抗性の、例えば、慢性の）てんかん発作を引き起こす脳の片方の半球の側頭葉内にてんかん原性病巣を示し得る。本明細書で考察されるように、かかるてんかん原性病巣は、例えば、再発性顆粒球細胞の苔状線維の異常な発芽、及び上述の苔状線維によって形成される再発性シナプスでのＧｒｉｋ２の異常な（すなわち、増加した）発現によって生じ得る。上述のアッセイを使用して、例えば、てんかん原性半球の海馬から、また、健康な半球における同じ領域から集めた脳組織に対する小さな生検を行うことによって、対象が、本明細書に開示されるＧｒｉｋ２ ＡＳＯ剤のうちの１つ以上を使用した療法から利益を受けうるかどうかの決定を行うことができる。てんかん原性半球が、罹患していない半球と比較して、より高い（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより大きい）レベルのＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ又はＧｌｕＫ２タンパク質の発現を示すことを示すことは、その患者が、本明細書に開示される方法及び組成物を使用した療法から利益を受け得ることを示すだろう。ＴＬＥを有する対象が、両方の脳半球にてんかん原性病巣が存在する場合において、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ又はＧｌｕＫ２タンパク質レベルを、上述のアッセイを使用して、ＴＬＥに罹患した対象からの１つ以上の半球から得た海馬組織と、健康な対照対象の同じ半球から（例えば、ＴＬＥを有しない対象の死後組織から）の海馬組織との間で比較することができる。ＴＬＥに罹患した対象のてんかん原性半球が、健康な対象の同じ半球と比較して、より高い（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより大きい）レベルのＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ又はＧｌｕＫ２タンパク質の発現を示すことを示すことは、ＴＬＥに罹患した対象が、開示される組成物及び方法による治療的治療から利益を受け得ることを示すだろう。また、治療が必要であることが疑われる対象の神経細胞におけるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡレベル又はＧｌｕＫ２タンパク質レベルを、疾患状態を示すことが知られているこれらの分析物の標準又は参照レベルと比較することができる。
これに加えて、上述のアッセイを利用して、対象（例えば、ＴＬＥ等のてんかんに罹患している対象）が、本明細書に開示される組成物及び方法を使用した治療に応答したかどうかを決定し得る。例えば、上に考察したように、てんかん原性脳半球からの海馬脳組織は、本明細書に開示される組成物及び方法による治療の前の小さな生検によって、ＴＬＥに罹患した対象から得ることができ、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ又はＧｌｕＫ２タンパク質の発現は、上述のアッセイを使用して評価され得る。次いで、対象に、本明細書に開示される方法及び組成物に従って、治療を行い得る。開示される方法及び組成物による治療後（例えば、治療から１、５、１０、１５、３０、６０、９０日後、又はそれより長い日数後）の患者の回復の後に、治療前に評価したのと同じ脳領域にわたって第２の生検を行ってもよく、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ又はＧｌｕＫ２タンパク質のレベルを再び評価し得る。ＴＬＥに罹患した対象が、より低い（例えば、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより大きい）レベルのＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ又はＧｌｕＫ２タンパク質の発現を示すことを示すことは、その対象が、治療に対して応答性であることを示すだろう。代替的に、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ又はＧｌｕＫ２タンパク質レベルを、１人以上の健康な対照対象からのそれらの発現に対して比較してもよい。治療後のＴＬＥに罹患した患者におけるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ又はＧｌｕＫ２タンパク質レベルが、１人以上の健康な対照対象におけるそれらのレベルと統計的に区別することができないことを示すことは、その患者が治療に応答性であることを示すだろう。また、治療される対象の神経細胞におけるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡレベル又はＧｌｕＫ２タンパク質レベルを、疾患状態が存在しないことを示すことが知られているこれらの分析物の標準又は参照レベルと比較することができる。
治療の方法
てんかん（例えば、ＴＬＥ）を有する対象を、本明細書に記載の組成物及び方法を使用して治療してもよい。組成物（例えば、ＡＳＯ剤含有組成物、又はそれを含有するベクター）を、それを必要とする対象（例えば、てんかん（例えば、ＴＬＥ）を有するか、又は有するリスクがあると診断された対象）に予防的治療として投与し得る。てんかんを発症するリスクがある対象は、てんかんの初期症状を示していてもよく、又は治療が行われるときにはまだ症候性でなくてもよい。
投与の経路
本明細書に開示される組成物を、標準的な方法を使用して、対象（例えば、ＴＬＥを有すると特定された対象）に投与してもよい。例えば、本明細書に開示される組成物を、例えば、全身投与を含む、いくつかの異なる経路のいずれかによって投与し得る。全身投与の非限定的な例としては、経腸（例えば、経口）、又は非経口（例えば、静脈内、動脈内、経粘膜、腹腔内、皮表、粘膜内（例えば、経鼻又は舌下）、筋肉内、又は経皮）投与が挙げられる。追加の投与経路としては、皮内、皮下、及び経皮注射が挙げられ得る。
本明細書に開示される組成物はまた、ＡＳＯ剤、又はそれをコードする核酸ベクターを局所送達するのに適した方法を使用して投与され得る。局所投与の非限定的な例としては、皮表（例えば、局所）、動脈内、関節内、及び吸入経路が挙げられる。特に、開示される組成物を、対象の脳組織（例えば、神経細胞、例えば、ニューロン及び／又はアストログリア））に局所投与し得る。
特に、ＡＳＯ剤、及びそれをコードする核酸ベクターを、対象の脳組織、例えば、てんかん性活性の増加を示すと決定されている脳組織に局所投与し得る。脳への局所投与は、一般に、ＡＳＯ剤又はそれをコードする核酸ベクターの脳細胞（例えば、神経細胞）への送達に適した任意の方法を含み、その結果、選択されたシナプスによって接続した細胞集合の細胞の少なくとも一部分が、組成物と接触する。ベクターを、ニューロン、アストログリア、又は両方を含むＣＮＳの任意の細胞に送達し得る。一般に、ベクターは、例えば、脊髄、脳幹（延髄、橋、及び中脳）、小脳、間脳（例えば、視床及び視床下部）、終脳（線条体、大脳皮質（例えば、後頭葉、側頭葉、頭頂、若しくは前頭葉における皮質領域）、又はこれらの組み合わせ、又はその中の細胞の任意の適切な部分集合を含む、ＣＮＳの細胞に送達される。更なる送達部位としては、赤核、扁桃体、嗅内野、及び視床の腹外側又は前核のニューロンが挙げられる。
本開示のベクターは、ＣＮＳの柔組織又は室に直接的に定位注射又はマイクロインジェクションによって送達され得る。特定の例において、本開示のベクターは、対象の脳における１つ以上のてんかん性病巣に直接的に送達され得る。例えば、対象に、不等皮質（例えば、海馬）又は新皮質（例えば、前頭葉）の片方又は両方の半球に直接的に定位注射することによって、本開示のベクターを投与し得る。特定の例において、対象に、海馬の片方又は両方の半球に直接的に定位注射することによって、本開示のベクターを投与する。代替的に、本開示のベクターを、例えば、限定されないがＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ１０を含むＣＮＳ組織に対して向性を示すベクターの文脈で、静脈内注射によって投与し得る。
本開示のベクターを特定の領域及びＣＮＳ細胞の特定の集団に送達するために、ベクターを、定位マイクロインジェクションによって投与し得る。例えば、対象は、所定位置に外科的に固定された（頭蓋骨にネジ固定された）定位フレームベースを有し得る。定位フレームベースを有する脳（例えば、基準マーキングを有するＭＲＩに適合する定位フレームベース）を、高解像度ＭＲＩを使用して撮像する。次いで、ＭＲＩ画像をコンピュータに送り、定位ソフトウエアを走らせる。一連の冠状断画像、矢状断面画像、及び体軸断面画像を使用して、標的注射部位、及び脳へ本開示の組成物を注射するために使用されるカニューラ又は注射針の軌道を決定する。このソフトウエアは、直接的に、軌道を、定位フレームに適した三次元座標へと変換する。進入部位の上に孔をドリルで開け、定位装置を、所与の深さに移植した注射針とともに配置する。組成物（例えば、本明細書に開示される組成物）を標的部位に注射し得る。組成物が、産生するウイルス粒子ではなく、組み込みベクターを含む場合において、ベクターの広がりは最小であり、主に、注射部位からの受動的な拡散の機能による。拡散の程度は、流体担体に対するベクターの比を調節することによって制御され得る。
追加の投与経路はまた、直接的な視覚化をしながらのベクターの局所適用、例えば、表面の皮質適用、又は他の非定位適用を含んでいてもよい。ベクターを、髄腔内に（例えば、大槽に直接的に）、室に（例えば、脳室内（ＩＣＶ）注射を使用して）、又は静脈内注射によって、送達し得る。
一例において、本開示の方法は、定位注射による脳内又は脳室内投与を含む。しかしながら、他の既知の送達方法も、本開示に従って適応され得る。例えば、ＣＮＳを通過する本組成物のより幅広い分布のために、例えば、腰椎穿刺によって、脳脊髄液に注射し得る。組成物を末梢神経系に向かわせるために、脊髄、１つ以上の末梢がんグリア、又は目的の身体部分の皮膚の下（皮下又は筋肉内）に注射し得る。特定の状況において、組成物を、血管内アプローチを介して投与し得る。例えば、組成物を、血液脳関門が破壊されるか、又は破壊されない状況において、動脈（頚動脈）内投与し得る。更に、より広範な送達のために、組成物を、マンニトールを含む高張性溶液の注入によって達成される血液脳関門の「開放」中に投与し得る。
任意の所与の場合における投与に最も適した経路は、投与される特定の組成物、対象、治療される特定のてんかん、薬学的製剤化方法、投与方法（例えば、投与時間及び投与経路）、対象の年齢、体重、性別、治療される疾患の重症度、対象の食事、及び対照の排泄速度に応じて変動するだろう。
組み合わせ療法
本明細書に開示される組成物を、他の療法剤又は物理的介入（例えば、リハビリテーション療法又は外科的介入）を含む１つ以上の追加の療法モダリティ（例えば、１、２、３、又はそれより多くの追加の療法モダリティ）と組み合わせて、それを必要とする対象（例えば、ヒト対象）に投与して、てんかん（例えば、ＴＬＥ）を治療し得る。２つ以上の薬剤を同時に投与し得る（例えば、全ての薬剤の投与を１５分、１０分、５分、２分以内に行う）。薬剤はまた、共製剤によって同時に投与され得る。また、２つ以上の薬剤を、順次投与してもよく、その結果、２つ以上の薬剤の作用が重複し、その組み合わせられた効果が、ある症状、又は障害に関連する他のパラメータの減少が、１つの薬剤、又は単独で送達される治療、又は他方が存在しない状態で観察されるであろうものよりも大きくなるようなものである。２つ以上の治療の効果は、部分的に相加的、全体的に相加的、又は相加的よりも大きくてもよい（例えば、相乗的）。各療法剤の連続的又は実質的に同時の投与は、限定されないが、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、局所経路、及び粘膜組織を介する直接的な吸収を含む、任意の適切な経路によって行うことができる。療法剤を、同じ経路によって、又は異なる経路によって投与し得る。例えば、その組み合わせの第１の療法剤を静脈内注射によって投与してもよく、一方で、その組み合わせの第２の療法剤を、化合物が含浸されたマイクロカセットで局所的に投与してもよい。第１の療法剤を、第２の療法剤の直前又は直後に、最大１時間、最大２時間、最大３時間、最大４時間、最大５時間、最大６時間、最大７時間、最大８時間、最大９時間、最大１０時間、最大１１時間、最大１２時間、最大１３時間、１４時間、最大１６時間、最大１７時間、１８時間まで、最大１９時間、最大２０時間、最大２１時間、最大２２時間、最大２３時間、最大２４時間、又は最大１～７、１～１４、１～２１、又は１～３０日前又は後に投与し得る。
対象が、てんかん（例えば、ＴＬＥ）を有するか、又はそれを発症するリスクがあると診断される場合に、第２の療法剤は、１つ以上の抗てんかん薬（ＡＥＤ）を含んでいてもよく、限定されないが、バルプロエート、ラモトリギン、エトスクシミド、トピラマート、ラコサミド、レベチラセタム、クロバザム、スチリペントール、ベンゾジアゼピン、フェニトイン、カルバマゼピン、プリミドン、フェノバルビタール、ガバペンチン、プレガバリン、チアガビン、ゾニサミド、フェルバメート、及び／又はビガバトリンが挙げられる。いくつかの場合において、第２の療法モダリティは、外科的介入、例えば、当該技術分野でよく知られている方法を使用するてんかん原性脳領域の外科的切除（例えば、側頭葉切除）、例えば、放射線手術（例えば、ガンマナイフ、又はレーザーアブレーション）であり得る。本開示の方法及び組成物と一緒に投与することができる追加の療法モダリティとしては、迷走神経刺激、深部脳刺激、経頭蓋磁気刺激、及びケトジェニックダイエットが挙げられる。
特定の例において、対象に、コルチコステロイド単独、又はタロリムス若しくはラパマイシン（シロリムス）を、例えば、ミコフェノール酸と組み合わせた、又はプレドニゾロン及び／若しくはプレドニゾロン等のコルチコステロイドと組み合わせた計画を含め、免疫抑制剤を投与し得る。当該技術分野でよく知られている他の免疫抑制計画を、本開示の方法及び組成物と組み合わせて使用し得る。かかる免疫抑制治療を、遺伝子療法の前、後、又はそれと同時に行ってもよい。
投薬
本明細書に記載されるように治療され得る対象は、てんかん（例えば、ＴＬＥ）を有するか、又はそれを発症するリスクがあると診断された対象である。開示される方法及び組成物を使用して治療され得る対象としては、例えば、てんかんの治療に関連する１つ以上の以前の療法介入を有していた対象、又はてんかんの治療のための以前の療法介入を有していなかった対象が挙げられる。
本開示のＡＳＯ剤を、以下のうちの１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上）生じるのに有効な量及び時間で投与し得る。（ａ）対象の細胞におけるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ及び／又はＧｌｕＫ２タンパク質のレベルを低下させる、（ｂ）障害の発症を遅らせる、（ｃ）対象の生存期間の増加、（ｄ）対象の無増悪生存期間の増加、（ｅ）ＧｌｕＫ２タンパク質機能の回復又は変化、（ｆ）てんかん発作再発のリスク減少、（ｇ）ＣＮＳにおける興奮毒性及び関連する神経細胞死の減少、（ｈ）ＣＮＳの罹患領域（例えば、海馬）における生理学的興奮－阻害バランスの回復、並びに／あるいは（ｉ）てんかんの１つ以上の症状（例えば、てんかん性発作の頻度、持続時間、若しくは強度、脱力、欠神、突然の混乱、理解若しくは発話の問題、認識障害、運動障害、めまい、又はバランス若しくは協調運動の喪失、麻痺、及び感情の調節不全）の減少。
したがって、本開示は、てんかん（例えば、ＴＬＥ）を治療することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、本方法が、対象において、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに特異的に結合し、ＧｌｕＫ２タンパク質の発現を阻害する阻害性ＲＮＡ（例えば、ＡＳＯ、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｓｈｍｉＲＮＡ、又はｓｈｍｉＲＮＡ）をコードするオリゴヌクレオチドを含むベクターを有効量投与することを含む、方法に関する。特に、本発明は、てんかんを治療することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、対象に、治療有効量の本明細書に開示されるＡＳＯ剤、又はそれをコードする核酸ベクターを投与することを含む、方法を提供する。
開示される方法及び組成物を利用して治療されるてんかんは、ＴＬＥ（例えば、ｍＴＬＥ又はｌＴＬＥ）、両性ローランドてんかん、前頭葉てんかん、点頭てんかん、若年性ミオクロニーてんかん、若年性欠神てんかん、小児欠神てんかん（ピクノレプシー）、温水てんかん、レノックス・ガストー症候群、ランドウ・クレフナー症候群、ドラベ症候群、進行性ミオクローヌスてんかん、反射てんかん、ラスムッセン症候群、辺縁系てんかん、てんかん重積状態、腹性てんかん、汎発性両側ミオクローヌス、月経関連性てんかん、ジャクソン型発作障害、ラフォラ病、及び光感受性てんかんであり得る。例えば、対象は、ＴＬＥ（例えば、ｍＴＬＥ又はｌＴＬＥ）、例えば、焦点てんかん発作又は全般てんかん発作を特徴とするＴＬＥを有すると診断され得る。いくつかの場合において、てんかんは、慢性てんかん、例えば、治療に難治性であるてんかん（すなわち、薬剤抵抗性てんかん、例えば、薬剤抵抗性ＴＬＥ）であり得る。
てんかんの治療のために、また、本明細書で考察されるようなてんかん発作及びてんかん性放電の症状を緩和するために、有用なポリヌクレオチドを、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの発現を阻害する機能的ＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｓｈｍｉＲＮＡをコードするベクターによって配置してもよい。
開示される組成物は、当業者によって適切であると決定される量で投与され得る。いくつかの場合において、ｒＡＡＶは、対象当たり１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、又は１０１５個のゲノムコピー（ＧＣ）の用量で投与される。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、又は１０１４ＧＣ／ｋｇ（対象の総重量）の用量で投与される。
いくつかの場合において、１×１０１２～５×１０１４ＧＣが投与される。いくつかの場合において、小児患者又は成人患者に、１×１０１２～５×１０１４ＧＣの一定用量が投与される。
いくつかの場合において、投薬量は、患者の脳質量１グラム当たりの（例えば、後頭下穿刺又は腰椎穿刺によって、例えば、髄腔内に注射された）患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）に投与されるＧＣの数によって測定される。いくつかの場合において、患者の脳質量１グラム当たり１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、又は１０１５個のゲノムコピーを投与する。いくつかの場合において、患者の脳質量１グラム当たり１×１０５個のゲノムコピーを投与する。いくつかの場合において、患者の脳質量１グラム当たり１×１０６個のゲノムコピーを投与する。いくつかの場合において、患者の脳質量１グラム当たり１×１０７個のゲノムコピーを投与する。いくつかの場合において、患者の脳質量１グラム当たり１×１０８個のゲノムコピーを投与する。いくつかの場合において、患者の脳質量１グラム当たり１×１０９個のゲノムコピーを投与する。いくつかの場合において、患者の脳質量１グラム当たり１×１０１０個のゲノムコピーを投与する。いくつかの場合において、患者の脳質量１グラム当たり５×１０１０個のゲノムコピーを投与する。いくつかの場合において、患者の脳質量１グラム当たり１×１０９～１×１０１１個のゲノムコピーを投与する。いくつかの場合において、患者の脳質量１グラム当たり１×１０９～５×１０１０個のゲノムコピーを投与する。いくつかの場合において、患者の脳質量１グラム当たり２×１０９～９×１０１０個のゲノムコピーを投与する。いくつかの場合において、患者の脳質量１グラム当たり５×１０９～１×１０１１個のゲノムコピーを投与する。他の場合において、患者の脳質量１グラム当たり、１×１０１０～５×１０１０個のゲノムコピーを投与する。他の実施形態において、患者の脳質量１グラム当たり１×１０１０～９×１０１０個のゲノムコピーを投与する。患者の（対象の）脳重量の概算は、ＭＲＩ脳体積決定から得られ、これを脳質量に変換し、これを利用して、投与される薬物の正確な用量を計算する。脳重量はまた、公開されているデータベースを使用して、年齢範囲に基づいて概算され得る。
任意選択的に、開示される薬剤を、本明細書に記載されるように、対象への送達に適した薬学的に許容される組成物の一部として投与し得る。開示される薬剤は、当業者によって容易に決定され得るように、所望の投薬量を提供し、かつ／又は治療に有益な効果を誘発するのに十分な量で、これらの組成物内に含まれる。
本明細書に記載の開示される組成物を、対象を治療するか、又は上述のアウトカムのうちの１つを行う（例えば、対象における疾患の１つ以上の症状の減少）のに十分な量（例えば、有効量）及び時間で投与し得る。開示される組成物は、１回、又は１回より多く投与され得る。開示される組成物を、１日１回、１日２回、１日３回、２日ごとに１回、週に１回、週に２回、週に３回、隔週に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、１年に２回、又は１年に１回投与し得る。治療は、別個（例えば、注射）で、又は連続的（例えば、インプラント若しくは注入ポンプによる治療）であり得る。対象を、治療に使用される投与の組成及び経路に応じて、本開示の組成物の投与から１週間後、２週間後、１ヶ月後、２ヶ月後、３ヶ月後、４ヶ月後、５ヶ月後、６ヶ月以上後に、治療有効性について評価し得る。治療有効性を評価する方法は、本明細書に開示される（例えば、「薬学的使用」を参照されたい）。評価のアウトカムに応じて、治療を継続してもよく、又は止めてもよく、治療頻度又は投薬量を変えてもよく、あるいは患者を、異なる開示される組成物で治療してもよい。対象を、別個の期間（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２ヶ月間）、又は疾患若しくは状態が軽減するまで治療してもよく、又は治療は、治療される疾患若しくは状態の重症度及び性質に応じて、慢性的なものであってもよい。例えば、ＴＬＥを有すると診断され、本明細書に開示される組成物で治療される対象は、初期又はその後の治療経路が治療利益（例えば、本明細書に開示される症状のうちのいずれか１つの減少、又は対照の罹患した脳領域におけるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡのレベル又はＧｌｕＫ２タンパク質レベルの減少）を誘発しない場合、１回以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０回、又はそれより多くの）追加の治療を与えられ得る。
キット
本開示はまた、てんかん（例えば、ＴＬＥ、例えば、治療難治性ＴＬＥ）の予防又は治療において使用するための対象において、Ｇｒｉｋ２遺伝子（例えば、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化するＡＳＯ）の発現を阻害する、本明細書に開示される組成物を含む、キットを提供する。キットは、任意選択的に、対象に組成物を送達するための薬剤又はデバイスを含み得る。他の例において、キットは、１つ以上の滅菌アプリケーター、例えば、シリンジ又は針を含み得る。更に、キットは、任意選択的に、他の薬剤、例えば、麻酔薬又は抗生物質を含み得る。キットはまた、キットのユーザ、例えば、医師に本発明に開示される方法を実施させるために説明する添付文書を含み得る。
以下の実施例は、本明細書に記載の組成物及び方法をどのように使用し、作製し、評価し得るかについての記載を当業者に提供するように示され、純粋に本開示の例示を意図するものであり、本願発明者がその開示であると考える範囲を限定することを意図したものではない。
実施例１Ａ：Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ標的化アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計及び選択
Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ標的化アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計
Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの発現を標的化し、それを阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を開発するために、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、並びにＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ及びＭａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａを含む他の動物モデル種からのＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋデータベースから、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ配列の集合（５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、コード領域（ＣＤＳ）、及び３’ＵＴＲ）を得た。病巣は、最も長い転写産物バリアント（すなわち、配列番号１１５）上に配置されたが、他の転写産物バリアントが、上述の集合に含まれていた。評価された配列には、配列番号１１５（ＮＭ＿０２１９５６（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ））、配列番号１１７（ＮＭ＿１７５７６８（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ））、配列番号１１８（ＮＭ＿００１１６６２４７（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ））、配列番号１１９（ＮＭ＿００１１１１２６８（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ））、配列番号１２０（ＮＭ＿０１０３４９（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ））、配列番号１２１（ＮＭ＿００１３５８８６６（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ））、配列番号１２２（ＸＭ＿０１５１３６９９５（Ｍ．ｍｕｌａｔｔａ））、配列番号１２３（ＸＭ＿０１５１３６９９７（Ｍ．ｍｕｌａｔｔａ））、配列番号１２４（ＮＭ＿０１９３０９．２（Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））が含まれる。配列アラインメントを、配列アラインメントプログラムＭＵＳＣＬＥを使用して行い、種間の顕著な配列相同性の領域を特定し、療法開発プロセス全体にわたって、所与のガイド配列が、目的の各々の種において所望の転写産物を効果的に標的化する尤度を増加させるという目的におけるこれらの領域に対して、ガイドＲＮＡ（すなわち、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡとの相補的な塩基対形成に関与するＡＳＯ配列）設計の好ましさを与えた。
その文献は、ｍＲＮＡの二次構造が、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって標的とされる効率に顕著な影響を及ぼし得ることを示唆しており、二次構造を含有しない領域は、ＲＮＡｉ機構に更にアクセス可能であり、したがって、より効率的に標的化されるという仮説がなりたつ。逆に、塩基対形成に関与すると予測されるｍＲＮＡの領域は、ＲＮＡ－ＲＮＡ二本鎖を形成し、ＲＮＡｉ機構へのアクセス可能性が低く、ＲＮＡｉアプローチによってそれほど効率的に標的化されないという仮説がなりたつ。Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの二次構造は、任意の種について特性決定されない。したがって、折り畳まれたＲＮＡの自由エネルギーを減少させること（すなわち、最小自由エネルギー構造、すなわちＭＦＥ）、又は全ての他の可能な折り畳まれた配向と比較して塩基対距離を減少させること（セントロイド）のいずれかに基づくアルゴリズムを使用する予測ソフトウエアを使用する戦略が考案された。この評価を、ＲＮＡｆｏｌｄ ＷｅｂＳｅｒｖｅｒ（ｒｎａ．ｔｂｉ．ｕｎｉｖｉｅ．ａｃ．ａｔ／／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＲＮＡＷｅｂＳｕｉｔｅ／ＲＮＡｆｏｌｄ．ｃｇｉ）を使用して、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、及びＭａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａからのＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡバリアント１に対して行った。低い塩基対形成確率及び／又は高い位置エントロピーを有する各転写物の領域（図１Ａで黄色から青色に着色される）を、ガイド設計について特定し、優先した。これらの領域には、明確に描写されたループ領域（図１Ｂのアラビア数字１～１４によって示される、それぞれ配列番号１４５～１５８に対応する）、及びステム様領域として示されるが、塩基対形成の確率が低い領域（図１Ｂのアラビア数字１５～１９によって示される、それぞれ配列番号１５９～１６３に対応する）が含まれていた。優先度は、１つより多い種において、低い塩基対形成確率及び／又は高い位置エントロピーを有すると予測された領域に与えられた。Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１１５）に対する種々の特定されたＲＮＡｉガイド配列のアラインメントを図１Ｃ～１Ｇに示す。
次いで、上に列挙した方法によって選択されたＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ中の目的の領域をインシリコで評価し、これらの領域を標的化するように設計された低分子阻害性ＲＮＡが、他の転写産物を標的化する可能性も有しており、非標的遺伝子の誤った調節に基づく望ましくないオフターゲット効果を引き起こす尤度を予測的に決定した。Ｇｒｉｋ２転写産物上の特定の領域に対して設計されたガイドＲＮＡによって媒介されるオフターゲット効果の確率を予測的に評価するために、オンラインツールｓｉＳＰＯＴＲ（ｓｉｓｐｏｔｒ．ｉｃｔｓ．ｕｉｏｗａ．ｅｄｕ／ｓｉｓｐｏｔｒ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ＿で入手可能な「ｓｉＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ－ｏｆ－Ｏｆｆ－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ」）を使用した。目的の転写産物を入力した後、このプログラムは、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡが他の転写産物を標的化する尤度を最小限に抑えつつ、目的の転写産物を標的化すると予測されるｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡのリスト（そのいずれかが合成ＡＳＯへと変換され、そのまま送達され得る）を特定する。ｓｉＳＰＯＴＲはまた、示唆された低分子ＲＮＡ分子からのシード配列（例えば、標的ＤＮＡ又はｍＲＮＡ配列、例えば、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ配列との相補的な塩基対形成に関与する配列）が、既知の内因的に発現するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）のシード配列にも対応する場合には、候補分子が、ネイティブｍｉＲＮＡによって通常調節される経路を誤って調節し得ることを示唆する。これらの候補は、回避された。
ＲＮＡｆｏｌｄ ＷｅｂＳｅｒｖｅｒの使用の場合と同様に、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、及びＭａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａからの転写産物バリアント１を、ヒト及びマウストランスクリプトームの両方に対して、ｓｉＳＰＯＴＲを使用して評価した。これにより、ヒト細胞（例えば、インビトロのための細胞株、又はエクスビボ標的検証のためのヒト切除物）、又はマウス細胞（例えば、インビボマウス有効性モデル）のいずれかにおいて、ｍＲＮＡを標的化する尤度が低いことが予測された各転写物に由来する候補低分子ＲＮＡの特定が可能になった。また、これにより、ヒト及びマウス細胞の両方において最小限のオフターゲット効果を引き起こすことも予測された３種類全ての入力転写産物において標的化される配列において相同性であった候補低分子ＲＮＡの特定が可能になり、これは、薬物開発のプロセス中に種々のモデルにわたって有効性及びオフターゲットプロファイルの変動を両方とも最小限に抑えるために、特に関心が高いものである。
最後に、ルシフェラーゼレポーターシステムにおいて合成ＲＮＡガイドを使用して候補標的配列をスクリーニングする目的のために、ヒトゲノムから発現した任意のＲＮＡが、提案された標的に対して有意な類似性（例えば、９０％を超える、次いで８０％を超える）を有するかどうか、したがって、Ｇｒｉｋ２に対して設計されたガイドによって標的化される確率を有し得るかどうかを決定するために、対応する２１ｂｐの標的配列を、「ある程度類似の配列（Ｓｏｍｅｗｈａｔ ｓｉｍｉｌａｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」についてＢＬＡＳＴｎ（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＡＧＥ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈで入手可能）を使用して評価した。
細胞株レポーターアッセイを使用した、ＧｌｕＫ２アンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロスクリーニング
ヒトＧｒｉｋ２（転写産物バリアント１）ｍＲＮＡ（５’及び３’ＵＴＲを含む）のための配列を、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＭ＿０２１９５６．４、配列番号１１５）から得て、合成し、ｐｍｉＲ－ＧＬＯ－ｈＧｌｕＫ２と呼ばれるｐＭＩＲ－ＧＬＯ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ１３３０）二重ルシフェラーゼレポータープラスミドの観点で、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの制御下で、ホタルルシフェラーゼの３’ＵＴＲへとクローニングした。したがって、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ発現におけるＲＮＡｉ媒介性の減少も、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆｌｕｃ）受容体タンパク質を減少させるため、ＰＧＫプロモーターからの発現は、ヒトＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化する低分子ＲＮＡガイドの評価を可能にするハイブリッドホタルルシフェラーゼ－ヒトＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡを生成した。ルシフェラーゼは、当該技術分野でよく知られている種々の方法によって定量化され得る。このレポータープラスミドはまた、その３’ＵＴＲに目的の任意の標的化配列を含有しないため、ＳＶ４０プロモーターの制御下でウミシイタケルシフェラーゼレポーターをコードし、その発現が、正規化対照として機能した。次いで、ｆｆｌｕｃ：ウミシイタケシグナル（ＲＬＵで表現される）の比を報告し、無関係な低分子ＲＮＡガイド（陰性対照として使用される）が同じ方法で評価される場合に得られた比と比較した。したがって、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡノックダウンの結果は、「ＧｌｕＫ２ノックダウン％」（ＫＤ％とも呼ばれる）として報告され、ＧｌｕＫ２タンパク質発現に対する何らかの非特異的な効果は、以下のように、陰性対照から得られた比に対する「残留発現％」として測定された。
ここで、５ｎｇのｐｍｉＲ－ＧＬＯ－ｈＧｌｕＫ２を、低分子ＲＮＡガイドとともに、この特定の場合において、１０ｐｇのＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡに対して設計された合成ｓｉＲＮＡ、又は無関係な陰性対照ＡＳＯとともに、ＷＴ ２９３Ｔ細胞の９６ウェルプレートに共トランスフェクトした。追加の対照として、ＡＳＯ自体のトランスフェクションが、タンパク質発現に対してより一般的な包括的な効果を有していたかどうかを決定するために、各ＡＳＯは、ルシフェラーゼの３’ＵＴＲにＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ配列を含有せず、したがって、ｆｆｌｕｃ－ｈＧｌｕＫ２ハイブリッドｍＲＮＡを産生しない空のｐｍｉＲ－ＧＬＯプラスミドで更に（別個のウェルで）共トランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、細胞を溶解し、ホタルルシフェラーゼ及びウミシイタケルシフェラーゼの発現をＤｕａｌ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して決定し、相対発光量（ＲＬＵ）を報告した。上に考察されるように、ｐｍｉＲ－ＧＬＯ－ｈＧｌｕＫ２レポーターと組み合わせて、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに対する実験的ＡＳＯ剤の入ったウェルにおいて産生されるｆｆｌｕｃ：ウミシイタケルシフェラーゼの比を、無関係な陰性対照ｓｉＲＮＡが入ったウェルから得られた比と比較して計算し、標的ｍＲＮＡ、この場合において、ｆｆｌｕｃ－ｈＧｌｕＫ２の「ノックダウン率」（ＫＤ％）として報告した（図１Ｈ、表２）。これらの値を使用して、どの低分子ＲＮＡガイドがＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ配列を効率的に標的化するかを決定した。これに加えて、ｐｍｉＲ－ＧＬＯ－空レポーターと組み合わせて、Ｇｒｉｋ２に対する実験的ＡＳＯ剤の入ったウェルにおいて産生されるｆｆｌｕｃ：ウミシイタケルシフェラーゼの比を、無関係な陰性対照ＡＳＯが入ったウェルから得られた比と比較して計算し、非標的化ｆｆｌｕｃ ｍＲＮＡからの「残留ｆｆｌｕｃ発現率」として報告した（図１Ｉ）。これらの値を使用して、タンパク質発現のための代理物として非標的化ｆｆｌｕｃを使用して、どの低分子ＲＮＡガイドが、トランスフェクトされた細胞におけるタンパク質発現に対して非特異的な影響を有するかを決定した。これらの値を各ガイド候補についてプロットし、ｆｆｌｕｃ－ｈＧｌｕＫ２ ｍＲＮＡ発現を有意に減少させるが、非特異的な様式で非標的化ｆｆｌｕｃ発現と干渉しないガイドを特定した（図１Ｊ）。このプロットから、ガイド選択についてのカットオフ、すなわち、６６％を超えるＧｌｕＫ２ノックダウン、及び６６％を超える残留非標的化ｆｆｌｕｃ発現が確立された（グラフ上の点線）。
実施例１Ｂ：Ｇｒｉｋ２標的：ｓｉＲＮＡ二本鎖の熱力学的特性
以下の表１０及び１１に示されるように、ＲＮＡｕｐ ＷｅｂＳｅｒｖｅｒを使用して、ＲＮＡ－ＲＮＡ相互作用及びその熱力学的特性を予測した。１９個の塩基対（ｂｐ）のｓｉＲＮＡ（ＧｌｕＫ２ ｍＲＮＡとの相同性を有する１９個の塩基）及び２１個の塩基対のＧｒｉｋ２ ｓｉＲＮＡ（ＧｌｕＫ２ ｍＲＮＡとの相同性を有する１９個の塩基を有する２１個の塩基のガイドを有する）を照会し、以下のように、ＲＮＡｕｐによって熱力学的特性を評価した。好ましいガイド特性を相関付けるために、総結合自由エネルギー、二本鎖形成からのエネルギー、及び標的開放エネルギー（開放エネルギーＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ）、及びこれらの計算を、各ガイドについてのノックダウン率（ＫＤ％、実施例１Ａを参照されたい）及びＧＣ％の決定と比較した。ＲＮＡｕｐは、本質的に２つの段階におけるＲＮＡ－ＲＮＡ相互作用の熱力学を計算した。第一に、潜在的な結合部位が対形成していないままである確立（例えば、標的部位を開放するのに必要な自由エネルギー）を算出し、次いで、この「アクセス可能性」を相互作用エネルギーと組み合わせて、総結合エネルギーを得る。
表１０及び表１１についての欄の定義：
ＫＤ％：候補ｓｉＲＮＡとの共トランスフェクションによって達成される、ルシフェラーゼ－ＧｌｕＫ２ ｍＲＮＡ（Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ、バリアント１、配列番号１２２）レポーター発現のノックダウン率（等価な１９ｂｐのＲＮＡガイドの場合、実施例１Ａに記載されるアッセイによって決定される）、２個のアステリスク（＊＊）が付された細胞＝３３％未満のノックダウン（ＫＤ）、１個のアステリスク（＊）が付された細胞＝３３～６６％のＫＤ、及びアステリスクを付されていない細胞＝６６％を超えるＫＤ。
ＧＣ％：ｓｉＲＮＡのガイド配列中のグアニン及びシトシンである塩基を合わせた割合。表１０：２個のアステリスク（＊＊）が付された細胞＝６０％を超えるＧＣ、１個のアステリスク（＊）が付された細胞＝５０～６０％のＧＣ、及びアステリスクを付されていない細胞＝５０％未満のＧＣ、表１１：２個のアステリスク（＊＊）が付された細胞＝５５％を超えるＧＣ、１個のアステリスク（＊）が付された細胞＝５０～５５％のＧＣ、及びアステリスクを付されていない細胞＝５５％未満のＧＣ。
太字のＧｒｉｋ２標的領域は、本開示の特定されたループ又は非対形成領域を意味する。
総結合自由エネルギー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）：ｍＲＮＡ上の標的領域の開放、一本鎖ガイドの生成、及び一本鎖ｓｉＲＮＡガイドのその一本鎖ｍＲＮＡ標的配列に対するハイブリダイゼーションを含む、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１２２）上のその対応する標的配列にハイブリダイズするｓｉＲＮＡのプロセスの自由エネルギー。表１０：２個のアステリスク（＊＊）が付された細胞＝－２８ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満（最大のデルタＧ、最も負の値）、１個のアステリスク（＊）が付された細胞＝－２３～－２４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、及びアステリスクを付されていない細胞＝－２４ｋｃａｌ／ｍｏｌ（最小のデルタＧ、ゼロに最も近い）。表１１：２個のアステリスク（＊＊）が付された細胞＝－３０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満（最大のデルタＧ、最も負の値）、１個のアステリスク（＊）が付された細胞＝－３０．５～－２７ｋｃａｌ／ｍｏｌ、及びアステリスクを付されていない細胞＝－２７ｋｃａｌ／ｍｏｌ（最小のデルタＧ、ゼロに最も近い）。
二本鎖形成からのエネルギー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）：一本鎖ｍＲＮＡ標的配列に対する一本鎖ｓｉＲＮＡガイドのハイブリダイゼーションの自由エネルギー。表１０：２個のアステリスク（＊＊）が付された細胞＝－３８ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満（最大のデルタＧ、最も負の値）、１個のアステリスク（＊）が付された細胞＝－３８～－３５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、及びアステリスクを付されていない細胞＝－３５ｋｃａｌ／ｍｏｌ（最小のデルタＧ、ゼロに最も近い）。表１１：２個のアステリスク（＊＊）が付された細胞＝－４１ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満（最大のデルタＧ、最も負の値）、１個のアステリスク（＊）が付された細胞＝－４１～－３８ｋｃａｌ／ｍｏｌ、及びアステリスクを付されていない細胞＝－３８ｋｃａｌ／ｍｏｌ（最小のデルタＧ、ゼロに最も近い）。
開放エネルギーＧｌｕｋ２ ｍＲＮＡ（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）（標的開放エネルギーとしても知られている）：標的位置でＲＮＡ二次構造を分解するのに必要なエネルギー（付近の二次構造の分解、又は標的配列と二次構造を形成する遠位配列の関与を含み得る）。表１０：２個のアステリスク（＊＊）が付された細胞＝最大のエネルギー要求（１０ｋｃａｌ／ｍｏｌを超える＝最大の正／最も好ましくない）、１個のアステリスク（＊）が付された細胞＝中程度のエネルギー要求（７．５～１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、中程度の好ましさ）、及びアステリスクを付されていない細胞＝最小のエネルギー要求（７．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、ゼロに最も近い／最も好ましい）。表１１：２個のアステリスク（＊＊）が付された細胞＝最大のエネルギー要求（９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌを超える＝最大の正／最も好ましくない）、１個のアステリスク（＊）が付された細胞＝中程度のエネルギー要求（８～９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、中程度の好ましさ）、及びアステリスクを付されていない細胞＝最小のエネルギー要求（８ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、ゼロに最も近い／最も好ましい）。
ＧｌｕＫ２ ｍＲＮＡの開放エネルギー、二本鎖形成からのエネルギー、及び総結合自由エネルギーを決定するために、ＲＮＡｕｐ ＷｅｂＳｅｒｖｅｒ（ｒｎａ．ｔｂｉ．ｕｎｉｖｉｅ．ａｃ．ａｔ／／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＲＮＡＷｅｂＳｕｉｔｅ／ＲＮＡｕｐ．ｃｇｉ、ＶｉｅｎｎａＲＮＡ Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｉｃｅｓソフトウエアスイートの一部）を使用した（Ｌｏｒｅｎｚ，Ｒ．，Ｂｅｒｎｈａｒｔ，Ｓ．Ｈ．，Ｈｏｎｅｒ ｚｕ Ｓｉｅｄｅｒｄｉｓｓｅｎ，Ｃ．，Ｔａｆｅｒ，Ｈ．，Ｆｌａｍｍ，Ｃ．，Ｓｔａｄｌｅｒ，Ｐ．Ｆ．、及びＨｏｆａｃｋｅｒ，Ｉｖｏ Ｌ．ＶｉｅｎｎａＲＮＡ Ｐａｃｋａｇｅ ２．０，Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，６：１ ２６，２０１１，ｄｏｉ：１０．１１８６／１７４８－７１８８－６－２６）。ＲＮＡｕｐは、２つの入力ＲＮＡの各々を折り畳み（ＲＮＡｆｏｌｄサーバであるｒｎａ．ｔｂｉ．ｕｎｉｖｉｅ．ａｃ．ａｔ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ＲＮＡＷｅｂＳｕｉｔｅ／ＲＮＡｆｏｌｄ．ｃｇｉによって行われるように）、次いで折り畳まれたＲＮＡの各々の熱力学に基づいて、入力ＲＮＡのハイブリダイゼーションに関連する種々の熱力学的値を計算する。これらには、いずれかのＲＮＡ（例えば、標的ＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ）上の二次構造を開放させるのに必要なエネルギー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ単位で）、二本鎖形成（１つの折り畳まれていないＲＮＡの他の折り畳まれていないＲＮＡに対するハイブリダイゼーション）からの生成するエネルギー、及び各ＲＮＡを開放させるのに必要なエネルギーと、ハイブリダイゼーション自体のエネルギーの両方を考慮した相結合エネルギーが含まれる。
ここでＲＮＡｕｐを使用して、インビトロ又はインビボのいずれかで、実験設定においてｓｉＲＮＡ活性（例えば、ノックダウンの有効性）の予測因子であり得る閾値を決定するために、ヒトＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ（配列番号１２２（に対して結合するｓｉＲＮＡガイド配列の熱力学的パラメータを計算した。結果は、１９ｂｐの合成ＲＮＡガイドについては表１０に、２１ｂｐの成熟ｍｉＲＮＡガイドについては表１１に列挙している。この実験の目的のために、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ配列に対して相同性／相補的である２１塩基のｓｉＲＮＡ配列の１９塩基（実施例１Ａに記載されるようなインビトロルシフェラーゼレポーターアッセイで試験したそれらのｓｉＲＮＡ）を、全長ヒトＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡに対して照会した。このアプローチを、ｓｉＲＮＡ配列の１９塩基に関して行ったが、折り畳み／折り畳み解除及びハイブリダイゼーションの原理は一般的に同等であると考えられるため、これを使用して、２１ｂｐの成熟ｍｉＲＮＡについて行ったように、より長いＡＳＯ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｓｈｍｉＲＮＡを照会することもできる。上述の熱力学的パラメータを記録し（表１０及び１１を参照されたい）、ルシフェラーゼレポーターアッセイにおけるノックダウン（ＫＤ）％との相関関係、したがって、所与のガイド配列の有効性を予測する能力について評価した。
標的開放エネルギー
候補ガイド配列が、ＧｌｕＫ２ ｍＲＮＡ中のその対応する標的配列を開放するのに必要であると予測されるエネルギーに従ってランク付けされた場合、低い開放エネルギー要求を有する（０ｋｃａｌ／ｍｏｌに最も近い）ガイド標的領域と、レポーターノックダウンのためにより大きな能力を有すると決定されたそれらのガイドとの間に、明らかな相関関係が存在する。標的開放エネルギーは、０．８８～１７．７１ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲であり、平均は８．１２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、メジアンは７．４１ｋｃａｌ／ｍｏｌであった。レポーター発現を６６％を超えてノックダウンしたｓｉＲＮＡは、より低い標的開放エネルギーを有する傾向があり（平均＝７．１２ｋｃａｌ／ｍｏｌ、メジアン＝６．６６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、一方で、レポーター発現を効率的にノックダウンしなかったｓｉＲＮＡは、より高い標的開放エネルギーを有していた（平均＝８．７４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、メジアン＝８．３４ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。両方の群で外れ値が存在したが（例えば、Ｇ０：ＫＤ％＝８３であるが開放エネルギー＝１７．２４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、及びＭＴ：ＫＤ％＝４であるが開放エネルギー＝１．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、６６％を超えるレベルでレポーター発現をノックダウンしたｓｉＲＮＡガイドの中に、より小さな開放エネルギーを有する標的が明らかに豊富に存在した。機構的に、折り畳みを解除するために必要なエネルギー入力が少ない標的配列が、折り畳みを解除する方に従いやすく、したがって、ｓｉＲＮＡ結合への「アクセス可能性が高い」と考えることができるということになる。更に、図１Ｂ及び表４に示されるように、予測二次Ｇｒｉｋ２ループ及び非対形成構造が豊富に存在する。例えば、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの一本鎖領域内で特異的にハイブリダイズする２３個以下のヌクレオチドの長さを有するＲＮＡガイドは、少なくとも１０ｋｃａｌ／ｍｏｌより少ない好ましい開放エネルギーを示し、特定の場合において、７．５ｋｃａｌ／ｍｏｌより少ない開放エネルギーを示す。図１Ｂに示されるような予測二次Ｇｒｉｋ２ループ及び非対形成構造に結合する本明細書に開示されるガイドを含む、ｓｉＲＮＡの濃縮クラスターは、１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満の標的開放エネルギーを有し、６６％を超えるＧｌｕｋ２ノックダウンと相関関係にある。７．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満の標的開放エネルギー予測値を有する１９ｂｐのＧｒｉｋ２標的化ガイドは、有効である可能性が高い。一方で、１０ｋｃａｌ／ｍｏｌを超える標的開放エネルギー予測値は、いくつかの場合において、あまり好ましくない。８．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満の標的開放エネルギー予測値を有する２１ｂｐのＧｒｉｋ２標的化ガイドは、有効である可能性が高い。一方で、９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌを超える標的開放エネルギー予測値は、いくつかの場合において、あまり好ましくない（図１Ｊ及び１Ｋ）。
二本鎖形成のエネルギー
次いで、同じＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ／ｓｉＲＮＡガイド配列対を照会し、二本鎖形成の予測エネルギーを決定した。より高いレポーターノックダウンを有するガイドと、より高い二本鎖形成のエネルギー（よりゼロに近い）を有するガイドとの間に、明らかな相関関係があった。二本鎖形成のエネルギーは、－４２．７～－１２．９２ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲であり、平均が３５．２８ｋｃａｌ／ｍｏｌ、メジアンが－３５．４１ｋｃａｌ／ｍｏｌであった。６６％を超えるＫＤを有するガイドｓｉＲＮＡ配列は、平均で、より高い二本鎖形成のエネルギーを有しており（平均＝－３３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、メジアン＝－３３．３ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、一方で、６６％未満のＫＤを有するものは、平均で、より低い二本鎖形成のエネルギーを有していた（平均＝－３６．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ、メジアン＝－３７．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。より負の／より低い二本鎖形成のエネルギーは、所与の二本鎖の形成が、二本鎖形成のエネルギーが、より高い／よりゼロに近い二本鎖の形成よりも好ましいことを示す。したがって、二本鎖形成の好ましさと、ｓｉＲＮＡガイド配列ノックダウン効率の効率との逆相関が存在し、これは直感に反するように思われる。しかしながら、このことは、二本鎖形成ではなく、（その逆の）二本鎖分離の好ましさを決定する場合に、二本鎖形成のエネルギーが、より重要であることを示唆している。この文脈において、本願発明者らは、この値を二本鎖安定性の尺度として参照し、この値が小さいほど、二本鎖がより安定である。標的：ｓｉＲＮＡ二本鎖があまり安定ではない場合、ｓｉＲＮＡは、そのプロセシビティの増加に起因して、ノックダウンの視点からより効率的であり得る。すなわち、異なるｍＲＮＡ分子上の同じ領域を標的化するために、あまり安定ではない二本鎖から解かれる可能性が高く、これはその効率に直接的に関連する。逆に、標的：ｓｉＲＮＡ二本鎖が安定すぎる場合、ｓｉＲＮＡ（ＲＩＳＣに結合する）は、その標的から解かれる可能性が低い。
－３５ｋｃａｌ／ｍｏｌを超える二本鎖形成のエネルギーの予測値を有する１９ｂｐのＧｒｉｋ２標的化ガイドは、有効である可能性が高い。一方で、－３９ｋｃａｌ／ｍｏｌを超える二本鎖形成のエネルギーの予測値は、いくつかの実施形態において、あまり好ましくない。－３８ｋｃａｌ／ｍｏｌを超える二本鎖形成のエネルギーの予測値を有する２１ｂｐのＧｒｉｋ２標的化ガイドは、有効である可能性が高い。一方で、－４１ｋｃａｌ／ｍｏｌを超える二本鎖形成のエネルギーの予測値は、いくつかの実施形態において、あまり好ましくない（図１Ｌ及び１Ｍ）。
総結合エネルギー
最後に、標的ＧｌｕＫ２ ｍＲＮＡに対する各ｓｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡガイド配列について、総結合エネルギーを決定した。総結合エネルギーは、１９ｂｐのｓｉＲＮＡガイドについて、－３５．０６～－９．８９ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲であり、平均が－２５．９３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、メジアンが－２６．２９ｋｃａｌ／ｍｏｌであった。６６％を超えるのＫＤを有するｓｉＲＮＡ、又は６６％未満のＫＤを有するｓｉＲＮＡについて、総結合エネルギーの平均値は、顕著に差は無かった（－２５．６５ｋｃａｌ／ｍｏｌと、－２６．２５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）が、メジアン値の差は、これより大きく（それぞれ、－２５．３５ｋｃａｌ／ｍｏｌと、２６．６６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、６６％を超えるＫＤを有するｓｉＲＮＡガイドは、ほとんどどれも－３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満の総結合エネルギーを有していなかった（６１個のガイドのうちの１３個が－３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満の総結合エネルギーを有していた、６６％未満のＫＤのガイドと比較して、３７個のうちの１個）。したがって、このことは、－３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満の総結合エネルギーが、いくつかの場合において、所与のガイド配列が標的ｍＲＮＡを効率的にノックダウンする可能性が高いことを示すことを示唆している。
－２４ｋｃａｌ／ｍｏｌを超える総結合エネルギー予測値を有する１９ｂｐのＧｒｉｋ２標的化ガイドは、有効である可能性が高い。一方で、－２８ｋｃａｌ／ｍｏｌを超える総結合エネルギー予測値は、いくつかの実施形態において、あまり好ましくない。－２７ｋｃａｌ／ｍｏｌを超える総結合エネルギー予測値を有する２１ｂｐのＧｒｉｋ２標的化ガイドは、有効である可能性が高い。一方で、－３０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌを超える総結合エネルギー予測値は、いくつかの実施形態において、あまり好ましくない（図１Ｎ及び１Ｏ）。
グアニン－シトシン（ＧＣ）含有量（ＧＣ％）
最後に、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡガイド配列のＧＣ含有量を決定した。レポーターアッセイにおいて６６％を超えるＫＤを生じさせるｓｉＲＮＡガイドの群は、平均で、６６％未満のＫＤを有する残りのガイド（平均＝５６．４％、メジアン＝５７．９％）よりも低いＧＣ含有量を有していた（平均＝４６．２３％、メジアン＝４７．４％）。したがって、低いＧＣ含有量は、ガイド効率の強い予測因子であり、逆に、高いＧＣ含有量は、ガイド効率の非適応因子である。この相関関係に寄与する因子は、複雑であり、いくつかの熱力学的パラメータに関連する可能性がある。第一に、ガイド配列の低いＧＣ値はまた、ｓｉＲＮＡ二本鎖のパッセンジャー配列（又は前駆体ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡステム）が、低い割合のＧＣを含有することを示しており、したがって、この二本鎖は、ガイド鎖及びパッセンジャー鎖へと容易に分離しやすく、Ａ：Ｕ対形成からの「弱い」塩基対形成への寄与が豊富であることに起因して、ガイド鎖を「成熟させる」ことが可能である。ｍＲＮＡ中の標的配列が、それを標的化するガイド配列に関連し、したがって、所与のガイドが低いＧＣ含有量を有する場合、標的配列は、完全に相補的ではない場合であっても、これも低いＧＣ含有量を有する可能性がある。その標的配列の部位で顕著な二次構造が予測される場合、アンチセンスＲＮＡによってアクセスされるために、「開放させる」のに必要なエネルギーは低く、本願発明者らは、それもｓｉＲＮＡ標的化にとって好ましいパラメータであると決定した。ｓｉＲＮＡ：標的二本鎖のＧＣ含有量が低いことも、二本鎖のより低い安定性（二本鎖形成のエネルギーエネルギーによって測定されるような）を引き起こし、これも、より安定なＧ：Ｃ塩基対形成が欠如していることに起因しており、標的とされる追加のｍＲＮＡ分子を許容するようにアンチセンスＲＮＡが解かれることが可能になる。まとめると、ｓｉＲＮＡのＧＣ含有量は、ここに記載の他の熱力学的パラメータに直接的に関連し、上で確立したその相関関係と切り分けることはできないだろう。
５０％未満のＧＣ含有量値を有する１９ｂｐのＧｒｉｋ２標的化ガイドは、有効である可能性が高い。一方で、６０％を超えるＧＣ含有量値は、いくつかの実施形態において、あまり好ましくない。５０％未満のＧＣ含有量値を有する２１ｂｐのＧｒｉｋ２標的化ガイドは、有効である可能性が高い。一方で、５５％を超えるＧＣ含有量値は、いくつかの実施形態において、あまり好ましくない（図１Ｐ及び１Ｑ）。
実施例２：マウス、げっ歯類、及びヒトモデル系におけるＧｒｉｋ２標的化アンチセンスオリゴヌクレオチド構築物の抗てんかん効果の検証
材料及び方法
マウスを使用したプロトコルについて、実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ ｌａ Ｓａｎｔｅ ｅｔ ｄｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌｅ（ＩＮＳＥＲＭ）動物管理使用委員会によって承認を受け、Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｃｏｕｎｃｉｌ ｄｉｒｅｃｔｉｖｅｓ（２０１０／６３／ＵＥ）に従って、Ｍｉｎｉｓｔｅｒｅ ｄｅ ｌ’Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ， ｄｅ ｌ’Ｅｎｓｅｉｇｎｅｍｅｎｔ Ｓｕｐｅｒｉｅｕｒ ｅｔ ｄｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅによって認可を受けた。
マウス海馬器官型切片
すでに記載されているように（Ｐｅｒｅｔ ｅｔ ａｌ．２０１４）、ＭｃＩｌｗａｉｎ組織チョッパーを使用して、野生型Ｓｗｉｓｓマウス（Ｐ９～１０）から器官型海馬切片培養物（３５０μｍ）を調製した。切片を、以下の培地１ｍＬを含有する培養皿の内側のメッシュインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の上に置いた。ＭＥＭ ５０％、ＨＳ ２５％、ＨＢＳＳ ２５％、ＨＥＰＥＳ １５ｍＭ、グルコース ６．５ｍｇ／ｍＬ、及びインスリン ０．１ｍｇ／ｍＬ。培養培地を、２～３日ごとに交換し、切片を、３７℃／５％ＣＯ２で、インキュベーター中に維持した。
電気生理学的記録
マウス器官型切片を、３０～３２℃に維持した記録チャンバに、個々に移し、酸素を含む（９５％のＯ２及び５％ＣＯ２）ＡＣＳＦ（生理学的条件）、又はＧＡＢＡＡ受容体アンタゴニストであるガバジン（５μＭ、過剰興奮性の条件）を含有するＡＣＳＦ、又は５μＭのガバジン及び５０μＭの４－ＡＰを含有するＡＣＳＦ（きわめて過剰興奮性の条件）を用い、連続的に灌流させた（２～３ｍＬ／分）。局所電場電位（ＬＦＰ）の記録を、ＤＧの顆粒細胞層に配置された単極ニクロム線を用いて行った。ＤＡＭ－８０増幅器（ローパスフィルタ：０．１Ｈｚ、ハイパスフィルタ：３ＫＨｚ、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）を使用した。データを、コンピュータに対してＤｉｇｉｄａｔａ １４４０Ａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてデジタル化し（２０ｋＨｚ）、Ｃｌａｍｐｅｘ １０．１ソフトウエア（ＰＣｌａｍｐ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して取得した。Ｃｌａｍｐｆｉｔ ９．２（ＰＣｌａｍｐ）及びＭｉｎｉＡｎａｌｙｓｉｓ ６．０．１（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｆｔ、Ｄｅｃａｔｕｒ，ＧＡ）を使用して、シグナルをオフラインで分析した。
ＲＮＡｉによる、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化するウイルスベクターの設計及び産生
Ｓｍａｒｔ選択設計（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を使用して、ＲＮＡｉ（例えば、ＡＳＯ）配列を設計した（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ ｅｔ．ａｌ．，２００７）。ｍｉＲ－３０構造を使用した、ｓｈＲＮＡとして、又はｍｉＲＮＡとしてのいずれかのＲＮＡｉ配列の効率を比較した。ＣＡＧ（配列番号７３７）プロモーター又はｈＳｙｎプロモーター制御下で、ヒトＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするレンチウイルス又はＡＡＶ９ベクターを使用した。
神経細胞培養物
Ｇｅｓｔａｎｔ雌ラットをＪａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ（Ｓａｉｎｔ－Ｂｅｒｔｈｅｖｉｎ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、野生型マウスを製造した。欧州倫理規定（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｅｔｈｉｃａｌ ｒｕｌｅｓ）に従って、動物を取扱い、安楽死させた。Ｅ１８のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットハイからの解離させた海馬ニューロン、又はＰ０マウスからの解離させた皮質ニューロンを、Ｋａｅｃｈ Ｓ． ＆ Ｂａｎｋｅｒ Ｇ（Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１，２４０６－２４１５（２００６））に記載されるように調製した。ニューロンを、１ｍｇ／ｍＬのポリリジンでコーティングされた６ウェルプレートに、５００，０００個／ウェルの濃度で２時間かけて接種した。ニューロンを、馴化Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（ラット）又はＮｅｕｒｏｂａｓａｌ－Ａ培地（マウス）中で培養し、２ｍＭのＬ－グルタミン及び１ ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ ＳＭ１ Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充し、３～４日ごとに新しいものに変えた。播種から２～３日後、培地の半分を取り出し、ウイルス構築物をＭＯＩ ７５０００とともに４時間かけて加えた。体積を減らした培地中でウイルス構築物と４時間接触させた後、Ａｒａ－Ｃ（３．４ｍＭ）を補充した新しい培地を加え、グリア細胞の成長を防止した。
ウェスタンブロッティング
感染から１０日後、ＤＩＶ１２～１３マウス、又はラット神経培養物を氷冷したＰＢＳですすぎ、次いで１５０μＬの溶解緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１％のグリセロール、０．５％のｎ－ドデシル β－Ｄ－マルトシド、ｐＨ７．２、抗プロテアーゼ及び抗ホスファターゼ）内に掻き取った。ホモジネートを、冷温で２時間かけてホイール上に保持し、８０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離処理し、細胞デブリを除去した。総タンパク質含有量を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキット（２３２２５、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって、条件当たり１０μＬで２個の複製物において定量化した。
条件当たり１０μｇのタンパク質を、ウェスタンブロット分析のためにＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上にロードした。予め染色したタンパク質ラダー（２６６１９、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、重量を制御するためにロードした。試料を、４～１５％勾配のプレキャストゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で分離させ、次いで、イムノブロッティング分析のためにニトロセルロース膜に移した。Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０（ＴＢＳＴ、２８ｍＭのＴｒｉｓ、１３６．７ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）－２０、ｐＨ７．４）中の５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）でブロックした後、シェーカープラットフォーム上で、試料を室温で１時間維持した。膜を、７２ＫＤａマーカーのレベルで、ラダーに従って２つの部分に切断した。各々の部分を、ブロック試薬で希釈したそれぞれの一次抗体（３７５１６、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、抗体溶液は３回再使用することができた）を用いて、４℃で一晩インキュベートした。重い重量のタンパク質（７２～２５０ｋＤａ）を有する膜部分を、１：２０００に希釈したウサギ抗ＧｌｕＫ２抗体（０４－９２１、Ｍｅｒｃｋ）とともにインキュベートし、軽い重量のタンパク質（１７～７２ｋＤａ）を有する膜を、マウス抗β－アクチン抗体（Ａ５３１６、Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートした。次の日に、膜をＴＢＳＴで各々１５分間、３回洗浄した。ロバにおいて産生された適切なＨＲＰコンジュゲート化二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、５％のＢＳＡ－ＴＢＳＴ中で１：５０００に希釈し、膜とともに室温で１時間インキュベートした。標的タンパク質を、ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｔｏｕｃｈシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）での鮮明なＷｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ（１７０－５０６０、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）による化学発光によって検出した。ＧｌｕＫ２の理論分子量は、１０３ｋＤａである。定量化のために、各レーンの化学発光シグナルの強度を、対照条件に対して正規化し、その後に、アクチンバンドに対して正規化した。
器官型切片のウイルス形質導入
マウス切片の形質導入のために、レンチウイルス又はＡＡＶ構築物を含有する１μＬのＰＢＳを、マウス切片についてＤＩＶ０で切片に直接的に落とした。ウイルス力価は、ＬＶ－対照について８×１０８個のゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬ、ＬＶ－Ｇ９－ｓｈＲＮＡについて７．９×１０８個のＧＣ／ｍＬ、ＬＶ－Ｇ９－ｍｉＲＮＡについて３．０×１０９個のＧＣ／ｍＬ、ＡＡＶ９－Ｇ９－ｍｉＲＮＡについて２．８×１０１３個のＧＣ／ｍＬ、及びＡＡＶ９－ＧＦＰ－ＧＣについて９．０×１０１２であった。
免疫標識
Ｐｒｏｘ１、及びＧＦＰ免疫染色のために、切片を固定し、次いで、０．５％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）中に５％の正常ヤギ血清（ＮＧＳ）を含有するブロック溶液中、室温で１時間かけて透過処理した（０．５％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標））。次いで、切片を、ポリクローナルウサギ抗Ｐｒｏｘ１抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）とともに、５％のＮＧＳ中、１：２０００でインキュベートし、ポリクローナルニワトリ抗ＥＧＦＰ（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ、ＲＲＩＤ：ＡＢ－３００７９８）とともに、０．５％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）中、１：１０００で、４℃で一晩インキュベートした。切片を、二次抗体Ａｌｅｘａ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １：５００）中で２時間インキュベートし、次いで、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）でカバースリップをかけた。蛍光画像を、１０Ｘ／０．３ＮＡ及び２０Ｘ／０．８ＮＡ対物レンズを使用して、ＬＳＭ８００ Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡を用いて取得した。画像を、ＮＩＨ ＩｍａｇｅＪソフトウエアを使用して処理した。
統計分析
全ての値は、別段の特定がない限り、平均±ＳＥＭとして与えられる。統計分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して行われた。Ｓｈａｐｉｒｏ－Ｗｉｌｋ検定を使用して、データの正規性を決定した。パラメトリックスチューデントｔ検定（対応あり及び対応なし、両側）を使用して、データの正規分布した群を比較した。Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定（対応なしデータ、両側）及びＷｉｌｃｏｘｏｎ Ｓｉｇｎｅｄ Ｒａｎｋ検定（対応ありデータ）を、正規分布していないデータに使用した。累積分布の比較のために、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ－Ｓｍｉｒｎｏｆｆ検定を使用した。複数群の比較のために、一元配置及び二元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用した。有意性のレベルは、ｐ＜０．０５に設定した。群の測定値は、平均±ＳＥＭとして表され、エラーバーは、ＳＥＭも示す。
結果
ＲＮＡ干渉による、ＧｌｕＫ２の下方調節のためのウイルスベクターの設計及び検証
脳切片のてんかん性放電（ＥＤ）の生成におけるＧｌｕＫ２／ＧｌｕＫ５ ＫＡＲの具体的な役割を更に確認するために、ＧｌｕＫ２／ＧｌｕＫ５含有ＫＡＲのレベルを下方調節するウイルス媒介性ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）戦略を開発した。
ヒトＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡに対するいくつかのガイドＲＮＡ配列を、Ｓｍａｒｔ選択設計を使用して設計した（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９：２０６８－７８，２００７）。初期実験は、ニューロンにおいてＧｌｕＫ２発現を下方調節することが潜在的に可能な、１つのＲＮＡｉ配列（Ｇ９、配列番号６８）を特定することができた。このＲＮＡｉ配列の有効性を、最初にＵ６プロモーターの制御下でｓｈＲＮＡを使用して、及びｈＳｙｎ１プロモーターの制御下でヒトｍｉＲ－３０構造を使用したｍｉＲＮＡを使用して評価した。これらの構築物は、ＬＶ又はＡＡＶ９ベクターのいずれかによって送達され（図２Ａ～２Ｄ）、ウエスタンイムノブロッティングによって、ラット海馬ニューロン及びラット海馬ニューロンにおいて試験した。これらの実験に使用されるレンチウイルスベクター及びＡＡＶ９ベクターの例を以下の表１２に記載する。
感染から１０日後、ＧｌｕＫ２タンパク質の総量をアクチンに対して正規化し、スクランブル対照構築物（ＬＶ：ＴＴＴＧＴＧＡＧＧＧＴＣＴＧＧＴＣ（配列番号７７１）、ＡＡＶ９：ＧＣ（配列番号１０１）、及びＡＡＶ－ＣＡＧ（配列番号７３７）－ＥＧＦＰ構築物と比較して決定した。ＬＶ－ｈＳｙｎ（配列番号６８２）－ＥＧＦＰ構築物は、ＬＶベクターによるニューロンの感染速度を概算することが可能であり、マウス器官型切片の４０～５０％程度であった（図２Ｅ）。細胞におけるＡＡＶ媒介性ウイルス形質導入に使用されるＡＡＶ発現カセットの例示的な模式図は、図２Ｇに示されている。アンチセンス配列Ｇ９（配列番号６８）は、ｓｈＲＮＡとして、ｍｉＲＮＡとして、また、ＬＶベクター及びＡＡＶ９ベクターの両方において、総ＧｌｕＫ２タンパク質のレベルの減少において効率的であることが観察された（図２Ｆ）。ラット海馬培養物（図示せず）において、抗Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードする異なるウイルス構築物は、ＧｌｕＫ２タンパク質のレベルを有意に減少させたが、一方で、ＬＶ－スクランブル（配列番号７７１）は、有意な減少を示さなかった。ラット海馬ニューロンにおいて（図２Ｈ）、抗Ｇｒｉｋ２配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードする異なるウイルス構築物は、ＧｌｕＫ２タンパク質のレベルを有意に減少させたが、一方で、ＬＶ－スクランブル（配列番号７７１）は、有意な減少を示さなかった。
抗Ｇｒｉｋ２配列（Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＸＹ（配列番号８３）、Ｙ９（配列番号８８）、ＧＧ（配列番号９１）、及び陰性対照配列（ＧＣ：ＵＡＡＵＧＵＵＡＧＵＣＡＵＧＵＣＣＡＣｃｇ、配列番号１０１）をコードするいくつかの他のウイルスベクターを、マウス初代皮質ニューロンにおいてそれらがＧｌｕＫ２タンパク質発現をノックダウンする能力について試験した（図２Ｉ）。培養した皮質ニューロンを、ＤＩＶ３で、７．５×１０４の感染多重性で、抗Ｇｒｉｋ２配列をコードするウイルスベクターで形質導入し、各構築物を３個の複製物で試験した。形質導入の１０日後に、細胞を溶解させた。以下の表１３は、図２Ｉに提示されるデータに対して行われた統計分析のまとめを提供する。全てのアンチセンス構築物は、ＧｌｕＫ２タンパク質レベルの統計的に有意な減少を示し、一方で、対照配列は、有意なノックタウンをもたらさなかった。
内因的に発現する細胞においてＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡの発現を評価することを意図した別個の実験セットにおいて、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のグルタミン酸作動性ニューロン（ｉＣｅｌｌ（登録商標）ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ－ＦＣＤＩ）を、脂質系のトランスフェクション剤に組み込まれたｈＳｙｎプロモーターの調節制御下で、５種類のＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、Ｙ９（配列番号８８）、ＸＹ（配列番号８３）、又はＭＵ（配列番号９６））のうちの１つ、又はスクランブル対照配列（ＧＣ、配列番号１０１）をコードするプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクション効率を、２：１及び４：１の比のＤＮＡ：脂質系トランスフェクション試薬を用いて比較した。ＴａｑＭａｎ（商標）シングルプレックスリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）を使用して、トランスフェクション後の３個の複製物を含む３８４ウェルプレートにおいて、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓにおけるＧｒｉｋ２ノックダウンのレベルを定量化した。ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓを、１７，５００個の細胞／ウェル（１７．５ｋ ｃ／ｗ）の密度で播種した。Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ発現を、ＧＡＰＤＨシグナルに対して正規化した。Ｇｒｉｋ２アンチセンス構築物をコードするプラスミドのトランスフェクションは、ＤＮＡと脂質試薬の比４：１で、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、及びＹ９（配列番号８８）を含有する構築物について、５日後にＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓにおけるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ発現を有意に低下させることが示された（図２Ｊ）。これらの所見は、Ｇｒｉｋ２遺伝子を内因的に発現する細胞におけるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡの発現をノックダウンする際のＧｒｉｋ２アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性を示す。
マウス器官型海馬において、ＧｌｕＫ２ノックダウンは、てんかん性活性を抑制する
標的細胞におけるＡＡＶ９構築物の発現を確認するために、ＡＡＶ９－スクランブル－ｅＧＦＰベクターで形質導入されたマウス海馬切片に対し、Ｐｒｏｓｐｅｒｏ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ １（Ｐｒｏｘ１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）免疫組織化学を行った。実際に、Ｐｒｏｘ１及びＧＦＰの広範囲にわたる共標識を、ＤＧニューロンにおいて観察し（図３Ａ）、ＡＡＶ９ベクターが、効率的にマウスＤＧニューロンを形質導入し、目的のポリヌクレオチドを発現することができることを示している。マウス海馬器官型切片において記録されるＥＤの周波数（図３Ｂに示される例示的な細胞外電圧トレース）を減少させる際の、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡとしてのＧｒｉｋ２アンチセンス配列（Ｇ９、配列番号６８）をコードするＬＶ又はＡＡＶ構築物の有効性を、以前に記載されるように（Ｐｅｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、過剰興奮性を生成する細胞外培地において試験した（方法を参照されたい）。ＬＶ－ｈＳｙｎ（配列番号６８２）－－Ｇ９－ｍｉＲＮＡ（配列番号６８）は、対照条件（ＬＶ－ｈＳｙｎ（配列番号６８２）－スクランブル、配列番号７７１）と比較して、ＥＤの周波数を強く減少させた（ＬＶ－Ｇ９－ｍｉＲＮＡを用いると０．０４１±０．００６Ｈｚ、ｎ＝２４、ＬＶ－ｈＳｙｎ（配列番号６８２）－スクランブル（配列番号７７１）を用いると０．０６６±０．００９Ｈｚ、ｎ＝１２、ｐ＝０．０２４６、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定、図３Ｃ）。次に、これらのウイルスベクターが、ヒト遺伝子療法について一般的に選択されるため、ＡＡＶを有する構築物を試験した。ＡＡＶ９血清型をこれらの実験に使用した。ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８３）－Ｇ９（配列番号６８）は、対照条件（ＡＡＶ９－ｈＳｙｎ（配列番号６８２）－ＧＣ、配列番号１０１）と比較して、ＥＤの周波数を有意に減少させた（ＡＡＶ９－Ｇ９－ｍｉＲＮＡを用いると０．０２５±０．００７Ｈｚ、ｎ＝１８、ＡＡＶ９－ＧＦＰ－ＧＣを用いると０．０６１±０．００７Ｈｚ、ｎ＝３２、ｐ＝０．０００４、一元配置ＡＮＯＶＡ、図３Ｃ）。
種々の抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ配列をコードする追加のＡＡＶ９構築物を、マウス器官型切片においてＥＤを抑制する能力について試験した。簡単に述べると、種々の異なる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ配列をコードするＡＡＶ９ベクターを、ＤＩＶ０で、９×１０９個のゲノムコピー／ｍＬのウイルス力価で、野生型マウス器官型切片（方法を参照されたい）に形質導入した。５μＭのガバジンを含有する過剰興奮性培地における電気生理学的記録を、ＤＩＶ１０～１１で行った。脱阻害された器官型切片調製物において生成するＥＤの阻害は、試験した５種類の（５種類のうちの）構築物（すなわち、Ｇ９（配列番号７６）、ＸＹ（配列番号８３）、ＧＩ（配列番号４７７）、Ｙ９（配列番号８８）、及びＧＧ（配列番号９１、図３Ｄ）において観察された。図３Ｄに示されるデータの統計分析のまとめを以下の表１４に提供する。
実施例３：側頭葉てんかんのマウスモデルにおける、Ｇｒｉｋ２標的化アンチセンス構築物のインビボでの有効性
方法及び材料
Ｇｒｉｋ２標的化ＡＳＯ剤のインビボでの有効性を評価するために、ＴＬＥのピロカルピン誘導モデルを、マウスにおいて、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８２）の制御下でのウイルスによりコードされるスクランブル配列（ＧＣ、配列番号１０１）、又はｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８３）の制御下でのウイルスによりコードされる抗Ｇｒｉｋ２ ＡＳＯ剤（Ｇ９、配列番号６８）による治療と組み合わせて、使用した。０日目（Ｄ０）に、マウスに、背側（１ｍＬ／半球）及び腹側（１ｍＬ／半球、合計４ｍＬ／マウス）にプロカルピンの両側海馬内注射を与え、てんかん重積状態を誘導した。次いで、マウスに３～４週間与え、海馬回路の病態生理学的な再編成を起こさせた。ウイルスによりコードされるＡＳＯ剤による注射の７日前（Ｄ６０）に、マウスに対して行動評価を行った。本明細書で考察されるように、ＴＬＥの病因のための神経解剖学的基質は、記憶及び学習におけるその重要な役割がよく知られている脳領域である海馬である。学習及び記憶に対する、海馬へのＧｒｉｋ２標的化ＡＳＯ剤を投与することの効果を評価するために、１０匹のピロカルピン処理されたマウスを、まず、新規物体及びよく知っている物体を認識する能力についての新規物体認識（ＮＯＲ）タスクで試験した。ＮＯＲタスクの基本構造は、第１のセッション中に２つの同様の物体とともにマウスを存在させ、マウスに自由に探索させ、マウスを２つの物体に慣れさせることを伴う。マウスが物体に慣れてくると、これらの以前の新規であった物体を探索する傾向は減っていく。第２のセッションの開始前に、物体のうちの１つを新規物体と交換し、マウスに、再び両方の物体を探索させる。一般に、新規物体を探索するまでの待ち時間は、認識記憶の代理を提供し、すなわち、マウスは、よく知っている物体よりも、新規物体を探索するまでの待ち時間の方が短い。初期の行動評価から７日後（（Ｄ６７）に、マウスは、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８２）の制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含むスクランブル対照配列（ＧＣ、配列番号１０１）、又はｈＳｙｎプロモーター（配列番号６８３）の制御下でのＧｒｉｋ２標的化ＡＳＯ配列（Ｇ９、配列番号６８）のいずれかをコードするＡＡＶベクターの９×１０１２個のゲノムコピー／ｍＬの両側海馬注射を受けた。上述のＡＳＯをコードするベクターの詳細を以下の表１５に記載する。
ウイルス構築物（Ｄ８２）による注射を受けてから７日後、マウスに、再びＮＯＲタスクを行った。注射後ＮＯＲ評価（Ｄ８９）から７日後、マウスに、脳波検査（ＥＥＧ）電極を海馬内に移植し、Ｄ９６～Ｄ１０３までの５日間にわたって、脳波上のてんかん発作を記録した。記録は、ＣＯＶＩＤ－１９に起因して、更に継続されなかった。脳波上のてんかん発作は、ＥＥＧ振幅がＥＥＧベースラインの少なくとも２倍であり、持続時間が少なくとも６秒間である発作性事象であると定義された。
結果
ＴＬＥを有すると診断された患者は、多くの場合、てんかん性発作と組み合わせて、例えば、特に、学習及び記憶の欠損等の他の合併症を示す。ウイルスによりコードされるＧｒｉｋ２標的化アンチセンス構築物の投与によりインビボでＧｒｉｋ２発現の阻害があるかどうかを決定するために、ＮＯＲタスク（図４Ａ）を、アンチセンス構築物の注射前及び注射後にけいれん促進性ピロカルピンによって前処理されたマウスについて行った。試験及び訓練段階中の両方の物体を探索するのにかかる時間の差を測定する識別指数（ＤＩ）と、これも新規物体又はよく知っている物体を探索する傾向の代理である総移動距離とによって測定される場合、スクランブル対照配列（ＧＣ、配列番号１０１）をコードするＡＡＶベクターを用いて後で治療される対照マウスは、抗Ｇｒｉｋ２配列（Ｇ９、配列番号７６、図４Ｂ）をコードするＡＡＶベクターを用いて後で治療されるマウスと同様に動いた。ウイルスベクター注射の後に、抗Ｇｒｉｋ２構築物で治療したマウスは、対照マウスと比較して、よく知っている物体よりも新規な物体の識別の改善を示した。同様に、ベクター注射の前に、対照マウス、及び抗Ｇｒｉｋ２配列を用いて後で治療されるマウスは、よく知っている物体及び新規物体を探索しつつ、同様の距離を移動した。ウイルスベクター注射の後に、抗Ｇｒｉｋ２構築物（Ｇ９、配列番号６８）で治療したマウスは、対照マウス（すなわち、ＧＣ、配列番号１０１をコードするウイルスベクターを注射したマウス）と比較して、移動した時間の減少を示し、これは、運動探索を担う傾向の減少、及び新しい物体を探索する傾向の増加の指標である（図４Ｃ）。ＮＯＲタスクデータの定量的分析を以下の表１６及び表１７に提供する。
その後、海馬内のＥＥＧ電極を移植されたマウスから、自然発生する脳波上のてんかん発作を記録した。脳波上のてんかん発作の例示的な電圧トレースを図４Ｄに提供する。Ｇｒｉｋ２標的化ＡＳＯ剤（Ｇ９、配列番号６８）をコードするＡＡＶベクターにより治療されたマウスは、スクランブル配列（ＧＣ、配列番号１０１）を受けた対照マウスと比較して、５日間にわたって累積的てんかん発作持続時間（図４Ｅ）及び累積的てんかん発作数（図４Ｆ）の有意な減少を示した。上述の実験の定量的なまとめを以下の表１８に提供する。
合わせると、これらの所見は、ウイルスによりコードされるＧｒｉｋ２標的化を使用したＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡの発現の阻害が、ＴＬＥのマウスモデルにおいて、てんかん発作の頻度及び持続期間を減少させるのに有効であることを示す。したがって、阻害性のＧｒｉｋ２標的化ＡＳＯ剤は、ヒト患者におけるＴＬＥの治療にとって有望な療法手段である。
実施例４：Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするウイルスベクターの投与によるヒト対象におけるてんかんの治療
対象、例えば、てんかん（例えば、ＴＬＥ、例えば、ｍＴＬＥ又はｌＴＬＥ）を有すると診断されたヒト対象（例えば、小児又は成人の対象）を、本明細書に記載の組成物で治療して、限定されないが、以下のうちの１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上）を含む、多くのてんかん症状のうちの１つを減少させることができる。（ａ）てんかん発作再発のリスク、（ｂ）ＣＮＳにおける興奮毒性及び関連する神経細胞死の減少、（ｃ）ＣＮＳの罹患した領域における生理学的興奮－阻害バランスの回復、（ｄ）てんかんの１つ以上の症状（例えば、てんかん性発作の頻度、持続時間、若しくは強度、脱力、欠神、突然の混乱、理解若しくは発話の問題、認識障害、運動障害、めまい、又はバランス若しくは協調運動の喪失、麻痺、及び感情の調節不全）の減少、並びに（ｅ）海馬における歯状回顆粒細胞の再発性苔状線維の病的な発芽。治療の方法は、任意選択的に、対象における本開示の組成物による治療のための候補として、患者を診断すること、又は特定することを含み得る。組成物は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化するＡＳＯ剤、又はそれをコードするポリヌクレオチドを含有する核酸ベクター（例えば、ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクター、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．７ｍ８、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ＥＢ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣ１０、ＡＡＶ．ＨＳＣ１１、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、若しくはＡＡＶ．ＨＳＣ１６から選択される血清型のうちのいずれか１つを有するＡＡＶベクター、又はレンチウイルスベクター）を含み得る。例示的なＡＳＯは、配列番号１～１００の核酸配列のうちのいずれか１つに対して８５％以上の（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれより多くの）配列同一性を有していてもよく、又は配列番号１～１００の１つ以上の配列を有していてもよい。更に、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）は、表９若しくは表１０に提供されるリストから選択される発現カセット（米国仮特許出願第６３／０５０，７４２号から参照により組み込まれる）、又は図３０若しくは表９に記載される構築物のうちのいずれか１つを含有していてもよい。
対象に、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、若しくは経皮投与を含む任意の適切な手段によって、又は動物の中枢神経系に直接的に投与することによって（例えば、定位、実質内、髄腔内、又は脳室内注射）組成物を投与し得る。組成物は、治療有効量で投与されてもよく、例えば、対象当たり１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、又は１０１５個のゲノムコピー（ＧＣ）の用量で、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、又は１０１４個のＧＣ／ｋｇ（対象の総重量）の用量で、患者の脳室量１グラム当たり１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、又は１０１５ＧＣの用量で投与される。対象の脳重量の概算は、ＭＲＩ脳体積決定から得られ、これを脳質量に変換し、これを利用して、投与される薬物の正確な用量を計算する。脳重量はまた、公開されているデータベースを使用して、年齢範囲に基づいて概算され得る。薬剤は、２ヶ月に１回、月に１回、２週間ごとに１回、又は週に少なくとも１回、又はそれより多く（例えば、週に１、２、３、４、５、６、又は７回、又はそれより多く）投与され得る。組成物を、第２の療法モダリティ、例えば、第２の療法剤（例えば、抗てんかん薬）、外科的介入（例えば、外科切除、放射線手術、ガンマナイフ、若しくはレーザーアブレーション）、迷走神経刺激、深部脳刺激、又は経頭蓋磁気刺激と組み合わせて投与し得る。
組成物を、以下のうちの１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上）：（ａ）てんかん発作再発のリスク、（ｂ）ＣＮＳにおける興奮毒性及び関連する神経細胞死の減少、（ｃ）ＣＮＳの罹患した領域における生理学的興奮－阻害バランスの回復、（ｄ）てんかんの１つ以上の症状（例えば、てんかん性発作の頻度、持続時間、若しくは強度、脱力、欠神、突然の混乱、理解若しくは発話の問題、認識障害、運動障害、めまい、又はバランス若しくは協調運動の喪失、麻痺、及び感情の調節不全）の減少、並びに（ｅ）海馬における歯状回顆粒細胞の再発性苔状線維の病的な発芽を、１０％以上（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又はそれより多く）低下させるのに有効な量及び時間で投与し得る。上に列挙したてんかんの症状を、標準的な方法、例えば、神経学的検査、脳波図、脳磁図、ＣＴスキャン、ＰＥＴスキャン、ｆＭＲＩスキャン、動画撮影、及び視覚観察を使用して評価し得る。組成物を投与する前後からのてんかん症状の測定値を比較して、治療の有効性を評価することができる。上述のてんかんの症状の減少という所見は、その組成物が、対象において、てんかんを首尾良く治療したことを示す。
実施例５：マイクロＲＮＡ足場を使用した、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化するアンチセンス発現構築物の設計
実施例１Ａ及び実施例１Ｂに記載のｓｉＲＮＡスクリーニングからのすでに述べた選択基準に基づき、Ａ－ｍｉＲ－３０足場（Ｓ１）に他の記載されるガイドを組み込んだ、追加の構築物を設計した（図６Ａ～６Ｅ）。これらの追加のガイド配列のサブセットを、追加のｍｉＲＮＡ「足場」（内因性ｍｉＲＮＡからの５’隣接領域、ループ領域、及び３’隣接領域を含有する）に組み込み、成熟ｍｉＲＮＡの発現及びプロセシングを改善した（Ｓ２＝Ｅ－ｍｉＲ－３０足場、Ｓ３＝Ｅ－ｍｉＲ－１５５足場、Ｓ４＝Ｅ－ｍｉＲ－２１８－１足場、及びＳ５＝Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３足場）。ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）の制御下で、ｍｉＲＮＡを発現するプラスミドのこのより大きなパネルを、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のグルタミン酸作動性ニューロン（ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ）へとトランスフェクトし、ｑＰＣＲによって、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡレベルを減少させる能力について評価した。トランスフェクトされていない細胞（破線）と比較して、メジアン絶対偏差（ＭＡＤ）２を使用して機能的構築物（点線）を特定する場合に、構築物の大部分は、機能的であると決定された（すなわち、これらは、ＭＡＤを下回るノックダウンＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡを示す）（図５）。試験されるアンチセンス配列には、Ｇ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）、ＭＷ（配列番号８０）、ＧＵ（配列番号９６）、ＴＯ（配列番号１４）、ＴＫ（配列番号７４）、ＴＨ（配列番号２２）、ＣＱ（配列番号３５）、ＸＵ（配列番号５１）、ＸＹ（配列番号８３）、Ｙ９（配列番号８８）、ＹＡ（配列番号６３）、ＧＧ（配列番号９１）、Ｇ８（配列番号９２）、ＭＥ（配列番号６９）、及びＭＤ（配列番号７０）が含まれていた。これらの中で、ＧＩ（配列番号７７）－Ｓ２（配列番号７９８）、ＭＷ（配列番号８０）－Ｓ４（配列番号７９９）、ＭＷ－Ｓ５（配列番号８００）、及びＧ９（配列番号６８）－Ｓ５（配列番号８０１）は、最も高い程度までＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡをノックダウンすることがわかっており、したがって、最も機能的な構築物であると特定された（すなわち、２０％以上のノックダウン）。
単一ｍｉＲＮＡをコードするプラスミドを使用して調製されたＡＡＶベクターは、以下の理由のために、不適切にパッケージングされたＡＡＶが得られる場合がある。第一に、プリｍｉＲＮＡ配列は短く（２００個未満の塩基）、適切な長さに依存して、単一ｍｉＲＮＡの発現を制御する単一プロモーターを有する導入遺伝子カセットの設計によって、ＡＡＶの最大パッケージング能力（約４．８ｋｂ）よりも顕著に短いＡＡＶゲノムを生じる可能性がある。したがって、参加する全ゲノム長が２．４ｋｂ（ＡＡＶのパッケージング能力の半分）に満たない場合には、単一カプシドが、１つより多いベクターにロードされ得る可能性がある。このことは、ＡＡＶゲノムダイマー（又はトリマー）の産生を可能にする適切なエンドヌクレアーゼニッキングを行うことなく、ポリメラーゼリードスルーによって媒介することができ、次いで、適切な長さを有する場合には、ＡＡＶカプシド内でパッケージングされ得る。これにより、その後、ＡＡＶベクター粒子の集合に顕著な異種性が導入され、薬物製品の製造及び特性決定が、顕著により困難なものになる。
第二に、ｓｈＲＮＡ系及びｍｉＲＮＡ系の導入遺伝子は、固有に、ｍｉＲＮＡヘアピンを含むことに起因する顕著な二次構造を有する。ＡＡＶゲノム内のこれらの内部二次構造は、ＡＡＶゲノム複製及びパッケージング中に「偽の」ＩＴＲとして機能する場合があり、完全及び部分的なベクターの混合物を含有するＡＡＶベクター粒子の望ましくない先端切断事象及び異種集合を生じることが示されている。
それらが適切にパッケージングされたＡＡＶを産生する能力について、いくつかの構築物を試験した。これらの構築物の設計において実行されたこれらの戦略は、上に示した不適切なＡＡＶゲノムパッケージングの課題を克服する。
いくつかの異なる長さ及びフォーマットで合成ｍｉＲＮＡをコードするＡＡＶベクターを産生し（図６Ａ～６Ｅ）、ゲノムを抽出し、アルカリ性ゲル電気泳動によって評価し、ゲノムの長さ及び完全性を評価した（図７）。単一プロモーター及び単一ｍｉＲＮＡカセットをコードするプラスミドから産生されるベクターｐｒｅｐのゲノム内容（予想長さ：１．５ｋｂ）は、単一（１．５ｋｂ）、二重（３．０ｋｂ）、及び三重（４．５ｋｂ）パッケージングされたゲノムの混合物で構成されることがわかり、このことは、短い長さのプロモーター－ｍｉＲＮＡ導入遺伝子カセットが、モノマー、ダイマー、及びトリマーのゲノムのパッケージングを可能にし、ベクターの５７％のみが望ましいモノマーであることを示している（デンシトメトリーによる、表１９）。
第２のプロモーターを第１のプロモーターの上流に付加し（タンデムプロモーターを生じ、全長ゲノム長さを、ＡＡＶのパッケージング能力の半分よりわずかに大きな２．９ｋｂまで伸長し）た場合、ほとんど全てのベクターｐｒｅｐゲノムは、全長である（９７％）。ｍｉＲＮＡヘアピンを含むと、パッケージングされるゲノム長さが、全てがモノマー全長形態の倍数であったため、これらの２つのゲノムフォーマットのいずれかにおいて先端切断事象を誘導しなかった。
有効ゲノム長さを増加させる１つの方法は、二本鎖自己相補性ゲノムを有するＡＡＶを産生することであり、ベクターの有効長さを二倍にする。このことは、５’ＩＴＲの場合には、変異体ＩＴＲ（ｍＩＴＲ）を導入することによって達成される。２種類のｓｃＡＡＶベクター（各々が単一プロモーター及び単一ｍｉＲＮＡを含む）を、ゲノム完全性について評価した。片方は、野生型（ｗｔ）ＩＴＲに隣接してプロモーターを有し、もう一方は、ｍＩＴＲに隣接してプロモーターを有する。各配向について、ベクターの大部分は、全長であることがわかった（それぞれ、２．６ｋｂが６５％及び５６％）。しかしながら、より小さな分子量のゲノム断片が得られる、顕著なゲノム先端切断事象、及び部分的にダイマーゲノムで構成されると思われる、より大きな分子量のゲノム（例えば、１個の全長ゲノム＋１個の部分的に先端切断された断片）の証拠が存在した。約５．２ｋｂのあまり突出していない種も明らかであり、全長のダイマーｓｃＡＡＶゲノムも存在していることの証拠であった。
ｍｉＲＮＡ発現も増加させつつ、ゲノム長さも増加させる別の方法は、追加のｍｉＲＮＡモチーフ（単一ｍｉＲＮＡの複数コピー、複数ｍｉＲＮＡの単一コピー、又はこれらの組み合わせ）の導入、別個の成熟した機能的ｍｉＲＮＡを産生する複数ｍｉＲＮＡの発現であり、所与のｍＲＮＡの遠位領域を標的化する可能性も導入する。以下の連結したｍｉＲＮＡを有する２種類の構築物を試験した。一方は、Ｇ９（配列番号６８）－Ｓ１の３個のコピーを有し、もう一方は、Ｇ９－Ｓ１、ＧＩ（配列番号７７）－Ｓ１、及びＭＵ（配列番号９６）－Ｓ１の各々の１個のコピーを有し、各々が２．２ｋｂの予想された全長ゲノムを生じる（図７）。これらのゲノムが、ＡＡＶのパッケージング能力の半分より大きいくらいの短さに入るため、二重パッケージングの証拠が存在し、ゲノム集合のわずか３０％が、望ましいモノマー全長ゲノムである。これに加えて、いくつかの部分ゲノムが検出され、その長さは、全体的なゲノム集団に顕著な異種性を導入する、３種類全てのカセットについてＳ１足場が含まれることに起因して、個々のｍｉＲＮＡカセットの隣接配列における相同性配列間の組換え事象を示唆していた。これらの所見は、ベクターの長さを最大ベクター能力に近くするような単一ｍｉＲＮＡ発現構築物への追加配列の導入が、得られるゲノムの異種性を減少させ、より信頼性高く全長ベクターを産生することを示す。
実施例６：Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化する二重アンチセンス発現構築物は、ＡＡＶ９ベクター中に単一パッケージングされる
上の実施例５の所見に基づき、この設定におけるＡＡＶゲノム集合の均質性は、ｓｓＡＡＶフォーマットの長さ及び使用によってもたらされる。同様に配列したｍｉＲＮＡが連結する危険を回避しつつ、これらの要求を満たす構築物を構築するために、２プロモーター２ｍｉＲＮＡカセット戦略を適応した。このフォーマットにおいて、ここではｈＳｙｎ（配列番号７９０）として例示される１つのプロモーターが、１つの足場において単一ｍｉＲＮＡの発現を駆動し、１つのポリＡ配列では停止させ、その後に、ここではＣａＭＫＩＩとして例示される第２のプロモーターが、異なる足場において第２のｍｉＲＮＡの発現を駆動し、第２のポリＡ配列において停止させる。
このアプローチは、ゲノム内の配列相同性を最小限に抑え、ダイマー又はトリマーゲノムのパッケージングを回避するほど十分に長いゲノムが得られる（約３．７ｋｂ、全長の単一パッケージングされたＡＡＶの長さ要求に十分に含まれる）。図７に示されるプラスミドスクリーニングの結果に基づき、上位の「ヒット」の固有のｍｉＲＮＡ足場の組み合わせを使用して、４種類のこのような「二重構築物」を作製した（ＤＭＴＰＶ１～４）。
ＤＭＴＰＶ１は、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ウサギベータ－グロビン（ＲＢＧ）ポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有していた（図８Ａ）。
ＤＭＴＰＶ２は、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ５’隣接配列（配列番号７６５）、ＭＷ（配列番号８０）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ループ配列（配列番号７６７）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－２１８ ３’隣接配列（配列番号７６６）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有していた（図８Ｂ）。
ＤＭＴＰＶ３は、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、Ｇ９（配列番号６８）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、Ｇ９のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有していた（図８Ｃ）。
ＤＭＴＰＶ４は、５’から３’へ、５’ＩＴＲ配列（配列番号７４６）、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ５’隣接配列（配列番号７５９）、ＧＩ（配列番号７７）に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ループ配列（配列番号７６１）、ＧＩ（配列番号７７）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－３０ ３’隣接配列（配列番号７６０）、ＢＧＨポリＡ配列（配列番号７９３）、ＣａＭＫＩＩプロモーター配列（配列番号８０２）、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ５’隣接配列（配列番号７６８）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンス配列に対して相補的であるセンスパッセンジャー鎖配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ループ配列（配列番号７７０）、ＭＷ（配列番号８０）のアンチセンスガイド配列、Ｅ－ｍｉＲ－１２４－３ ３’隣接配列（配列番号７６９）、ＲＢＧポリＡ配列（配列番号７９２）、及び３’ＩＴＲ配列（配列番号７４８）を含有していた（図８Ｄ）。
これらの二重構築物は、ＡＡＶ９ベクターとして産生され、ゲノムの完全性に対する２つのプロモーター、２つのｍｉＲＮＡカセット戦略の影響を評価した。２種類の単一プロモーター単一ｍｉＲＮＡベクター（全長＝１．５ｋｂ、ダイマー及びトリマーのパッケージングの証拠を示す）と比較すると、これらの二重構築物ベクターのゲノム内容は、約３．７ｋｂの予想される全長サイズでの単一バンドの存在によって実証されるように、均質であることが示される（図９Ａ及び図９Ｂ）。したがって、第２のプロモーター及び第２のｍｉＲＮＡカセットの導入は、ゲノムの完全性を維持し、先端切断事象を回避し、標的化効率及び全ｍｉＲＮＡ発現を改善するという目標を伴う複数ｍｉＲＮＡの発現を可能にしつつ、ゲノムがモノマーとしてパッケージングされるようにＡＡＶゲノムの長さを増加させる有効な方法である。
実施例７：２種類の別個の抗Ｇｒｉｋ２ ｍｉＲＮＡ配列の組み合わせを使用する、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡノックダウンのインビトロでの有効性
第１に、２種類の異なるｍｉＲＮＡガイドが、同じベクター系で発現される場合、又は２つのベクターとして発現される場合に、等価ではないが、Ｇｒｉｋ２発現の効率的なノックダウンを媒介することができるかどうかを試験した。４種類のプラスミド構築物を選択し、組み合わせて二重構築物ベクターにした（図７の所見に基づく）。二重構築物ベクターのｍｉＲＮＡ構成要素は、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓにおいて（トランスフェクトされるプラスミドの総量を一定に保ちつつ）、単一で、又は互いに組み合わせてトランスフェクトされ、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲによって測定した（図１０）。合わせてトランスフェクトされる場合、抗Ｇｒｉｋ２ ｍｉＲＮＡの組み合わせ（両方ともシナプシンプロモーターの制御下）は、強固なＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡノックダウンを媒介することができ、このことは、Ｇｒｉｋ２に対する１つより多い固有のガイドを発現するベクターの使用を裏付けている。
次いで、単一プロモーター（ｈＳｙｎ）を有する異なる単一ｍｉＲＮＡカセットを含有する抗Ｇｒｉｋ２ ｍｉＲＮＡをコードするベクター調製物の能力を、以下のように、てんかん性活性を抑制する能力について試験した。
マウス海馬器官型切片：
すでに記載されているように（Ｐｅｒｅｔ ｅｔ ａｌ．２０１４）、ＭｃＩｌｗａｉｎ組織チョッパーを使用して、ＷＴ Ｓｗｉｓｓマウス（Ｐ９～Ｐ１０）から器官型切片を調製した。切片を、以下の培地１ｍＬを含有する培養皿の内側のメッシュインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の上に置いた。ＭＥＭ ５０％、ＨＳ ２５％、ＨＢＳＳ ２５％、ＨＥＰＥＳ １５ｍＭ、グルコース ６．５ｍｇ／ｍＬ、及びインスリン ０．１ｍｇ／ｍＬ。培養培地を、２～３日ごとに交換し、切片を、３７℃／５％ＣＯ２で、インキュベーター中に維持した。５ＤＩＶで培地にピロカルピン（０．５μＭ）を加え、７ＤＩＶで除去した。切片を、９ＤＩＶ～１１ＤＩＶの実験のために利用した。
器官型切片のウイルス感染
マウス器官型切片の感染のために、ＡＡＶ９構築物を含有する培地（リン酸緩衝化生理食塩水）１μＬを、切片についてＤＩＶ０で切片に直接的に落とした。
電気生理学的記録
マウス器官型切片を、３０～３２℃に維持した記録チャンバに、個々に移し、５μＭのガバジン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）存在下での酸素を含む（９５％のＯ２及び５％ＣＯ２）ＡＣＳＦ、以下を（ｍＭ単位で）ＮａＣｌ、３．５のＫＣｌ、１．２のＮａＨ２ＰＯ４、２６のＮａＨＣＯ３、１．３のＭｇＣｌ２、２．０のＣａＣｌ２、及び１０のグルコース（ｐＨ約７．４）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）含有するＡＣＳＦを用い、連続的に灌流させた（２～３ｍＬ／分）。局所電場電位（ＬＦＰ）の記録を、歯状回の顆粒細胞層に配置された単極ニクロム線を用いて行った。ＤＡＭ－８０増幅器を記録に使用した（ローパスフィルタ、０．１Ｈｚ、ハイパスフィルタ、３ＫＨｚ、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）。データを、コンピュータに対してＤｉｇｉｄａｔａ １４４０Ａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてデジタル化し（２０ｋＨｚ）、Ｃｌａｍｐｅｘ １０．１ソフトウエア（ＰＣｌａｍｐ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して取得した。Ｃｌａｍｐｆｉｔ ９．２（ＰＣｌａｍｐ）及びＭｉｎｉＡｎａｌｙｓｉｓ ６．０．１（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｆｔ、Ｄｅｃａｔｕｒ，ＧＡ）を使用して、シグナルをオフラインで分析した。
統計学
全ての値は、平均±ＳＥＭとして与えられる。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウエア５．０１）を使用して行われた。
試験構築物：Ｇ９、ＧＩ、Ｇ９＋ＧＩ。
試験されたベクターＧ９及びＧＩ（以下の表２０を参照）は、ｈＳｙｎプロモーターを使用してＡＡＶ９ウイルスベクターによって送達されるｍｉＲＮＡ配列に対応する。対照ベクターＧＣは、ＧＦＰと、ｈＳｙｎプロモーターの制御下でＡＡＶ９ウイルスベクターによって送達されたスクランブルｍｉＲＮＡ配列（ＧＣ、配列番号１０１）と、を含んでいた。
Ｇ９及びＧＩをコードする構築物は、混合し（単一送達されたものと等しい部分、同じ総ベクターコピー）、マウス器官型切片に適用すると、てんかん性活性を、少なくとも個々に各ベクターｐｒｅｐと等価な程度まで減少させることが示された（図１１、及び以下の表２１及び２２）。
次いで、二重ｍｉＲＮＡ ＡＡＶ９ベクターが、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡノックダウンを媒介する能力を、ヒトｉＰＳＣ由来のＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓにおいて評価した。細胞を、ＰＥＩ及びラミニンで予めコーティングされた３８４ウェルプレートに、１７，５００個の細胞／ウェルの密度で接種し、１１日間培養し、３×１０５個のＧＣ／細胞のＭＯＩで、ＡＡＶベクターを用いて形質導入し、形質導入から８日後に、ｑＰＣＲ分析のために採取した。ＡＡＶ９．ｎｕｌｌベクター（ＲＮＡを産生しない全長ゲノムを含有するＡＡＶ９、黒色の棒グラフ）で形質導入された細胞と比較し、メジアン絶対偏差（ＭＡＤ）２を使用して機能的構築物（点線、値＝０．９）を特定する場合、二重ＡＡＶ９構築物（格子柄の棒グラフ）が、このＭＯＩを有するこの時点で、単一構築物構成要素部分（ｈＳｙｎ構成要素＝灰色の棒グラフ、ＣａＭＫＩＩ構成要素＝白色の棒グラフ）よりも高い程度ではない場合でも、少なくとも等価な程度まで、有意なＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡノックダウンを媒介すると決定された（図１２）。
実施例８：側頭葉てんかんのピロカルピン誘導性マウスモデルにおける、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化する単一及び二重ｍｉＲＮＡ ＡＡＶ９発現構築物のインビボでの有効性
ＴＬＥのマウスピロカルピン誘導性モデルを使用して、てんかん重積状態の誘導後の種々の発現構築物の投与と組み合わせた、インビボでのＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ標的化二重ｍｉＲＮＡ ＡＡＶ発現ベクターの有効性を評価した。
材料及び方法
倫理
全ての実験は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ ｌａ Ｓａｎｔｅ ｅｔ ｄｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌｅ（ＩＮＳＥＲＭ）動物管理使用委員会によって承認を受け、Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｃｏｕｎｃｉｌ ｄｉｒｅｃｔｉｖｅｓ（２０１０／６３／ＵＥ）に従って、地域の倫理委員会（承諾番号ＡＰＡＦＩＳ＃９８９６－２０１６０５３０１１２１４９７ｖ１１）による評価に従って、Ｍｉｎｉｓｔｅｒｅ ｄｅ ｌ’Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ， ｄｅ ｌ’Ｅｎｓｅｉｇｎｅｍｅｎｔ Ｓｕｐｅｒｉｅｕｒ ｅｔ ｄｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅによって認可を受けた。
慢性てんかん性マウス
実験を雄Ｓｗｉｓｓマウスを使用して行った。マウスを、１２時間の明／暗サイクルで、餌及び水に自由にアクセス出来る状態で、室温（２０～２２℃）に維持した。マウス（３０～４０ｇ）に、スコポラミン（１ｍｇ／ｋｇ）を皮下（ｓ．ｃ．）で与えてから３０分後に、ピロカルピン（３００～３５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。傾斜プロトコルを使用して、それによって、動物に、３００ｍｇ／ｋｇの初期用量を与え、その後、てんかん発作が起こるまで、３０分ごとに半分の用量を与えた。ＷＴマウスは、典型的には、てんかん重積状態（ＳＥ）に入る前に、少なくとも２回のてんかん発作を経験した。最初のてんかん発作から１０分後に、カフェイン（４０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。てんかん重積状態（ＳＥ）の発生から１時間後に、ジアゼパム（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。
ＡＡＶ注射
てんかん性マウス（ＳＥから２ヶ月より後）を、イソフルラン麻酔薬で麻酔した（１００％のＯ２下、誘導のために５％、及び維持のために２％）。加熱パッドを使用して体温を維持し、定位固定の炎に入れた。リドカイン（２％）の局所投与の存在下で、海馬の背側及び腹側の歯状回にＡＡＶを両側注射するために、４個の孔をドリルで開けた（ＡＰ－１．８ｍｍ、ＭＬ±１ｍｍ、ＤＶ－２ｍｍ、及びＡＰ－３．３ｍｍ、ＭＬ±２．３ｍｍ、ＤＶ－２．５ｍｍ）。各々の注射について、Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジを使用した。脳組織をカニューラの上を滑らせるために５分間遅らせた後、ＡＡＶを含有する溶液の体積＝１．０μＬ／注射部位×４注射部位をゆっくりと注入した（速度：０．２μＬ／分）。注入の後、シリンジの軌跡に沿った溶液の逆流を防ぐために、シリンジを更に５分間、その場所に残した。回復の間、動物に、２４時間後及び４８時間後に５ｍｇ／ｋｇの皮下カルプロフェン（Ｒｉｍａｄｙｌ（登録商標））を与えた。
運動活性
非てんかん性マウス及びてんかん性マウス（ＳＥから２ヶ月より後）の運動を、ＡＡＶ注射の１週間前及び２週間後に評価した。マウスを、環境に慣れさせるために実験の１日前に行動分析室に移した。マウスを、９：００～１８：００の明／暗サイクルで、餌及び水に自由にアクセス出来る状態で、室温（２０～２２℃）に維持した。嗅覚による手がかりを防止するために、試験された動物と接触した全ての材料を、その後に、酢酸で洗浄した。第一に、自然発生する探索行動をオープンフィールド試験で試験した。簡単に述べると、マウスを、５０×５０×５０ｃｍの青色ポリ塩化ビニルの箱の中央に１０分間置き、追跡ソフトウエアＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎ Ｃｏｌｏｒ（Ｎｏｌｄｕｓ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に接続したビデオカメラを用い、軌跡を記録した。５分間の探索の間にマウスによってカバーされる速度及び総距離を分析した。
ＥＥＧ
てんかん性マウス（ＳＥから２ヶ月より後）に、ＡＡＶ注射から３週間後に、１つの深いワイヤ電極を移植した。上述のように、手術は、イソフルラン麻酔下で行った。電極を、歯状回（ＤＧ）に定位固定法で配置した（ブレグマからのＰａｘｉｎｏｓ ａｎｄ Ｗａｔｓｏｎ座標：ＡＰ－２．５５ｍｍ、ＭＬ＋１．６５ｍｍ、ＤＶ－２．２５ｍｍ）。小脳の上に配置された追加のネジは、接地電極として機能した。電極及びネジを、歯科用セメントで頭蓋骨に固定した。回復の間、動物に、２４時間後及び４８時間後に５ｍｇ／ｋｇの皮下カルプロフェン（Ｒｉｍａｄｙｌ（登録商標））を与えた。ＥＥＧ（増幅され（１０００倍）、０．１６～９７Ｈｚパスでフィルタリングし、５００Ｈｚで取得した）を、遠隔計測システム（Ｄａｔａ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）を使用して５日間にわたって、１日当たり２４時間モニタリングした。海馬内ＥＥＧトレースは、ＤＧに挿入された電極と、小脳の上に配置された電極との間の電位差を表していた。
統計学
全ての値は、平均±ＳＥＭとして与えられる。統計分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して行われた。群間比較のために、生データをＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定によって分析した。複数群比較のために、生データを一元配置ＡＮＯＶＡ検定によって分析した。有意性のレベルは、ｐ＜０．０５に設定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
結果
試験項目
試験されたベクターであるＧ９（配列番号６８）、ＧＩ（配列番号７７）は、ｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）下で、ＡＡＶ９ウイルスベクターによって送達されるｍｉＲＮＡ配列に対応する。ＧＣ（配列番号１０１）及びＡＡＶ９．ＧＦＰは、対照ベクターに対応する。ＧＣ及びＡＡＶ９．ＧＦＰは、ＧＦＰと、スクランブルｍｉＲＮＡ配列と、ＧＦＰ配列と、をそれぞれ含み、ｈＳｙｎプロモーター下で、ＡＡＶ９ウイルスベクターによって送達される（以下の表２３を参照されたい）。
Ｇ９及びＧＩ ｍｉＲＮＡ構築物の有効性の評価
Ｇ９及びＧＩの有効性を、慢性てんかん性マウス（てんかん重積状態から２ヶ月より長く経った後）における過剰運動、てんかんの行動マーカー、及び自然発生する再発性てんかん発作について評価した。この実験のセットにおいて、ＧＣを対照ベクターとして使用した。
過剰運動
Ｇ９及びＧＩをコードするベクターは、非てんかん性マウスと同様のレベルに対して、過剰運動の有意な低下を示した（図１３Ａ及び図１３Ｂを参照されたい）。ＧＣ、対照ベクターを用い、有意な変化は観察されない（以下の表２４を参照されたい）。
ＥＥＧ
Ｇ９及びＧＩをコードする構築物は、ＧＣをコードする構築物、対照ベクターと比較して、てんかん性発作の抑制を示した（図１４及び以下の表２５を参照されたい）。
Ｇ９をコードするＡＡＶ９構築物の用量応答
ＡＡＶ９発現ベクターにおいてコードされるＧ９を使用した用量応答試験を、慢性てんかん性マウス（ＳＥから２ヶ月より長く経った後）において行った。異なる希釈でのＧ９の用量応答の有効性（以下の表２６を参照されたい）を、過剰運動、てんかんの行動マーカー、及び自然発生する再発性てんかん発作について評価した。この実験のセットにおいて、ＡＡＶ９－ＧＣを対照ベクターとして使用した。
過剰運動
Ｇ９は、用量応答有効性を示した。Ｇ９及びＧ９／１０の同様の有効性を観察し、並びにＧＣを注射する前及び後を比較したときに、Ｇ９／１０００の有効性の消失を観察した（図１５及び以下の表２７を参照されたい）。
ＥＥＧ
初期データは、マウスにおけるＧ９をコードする構築物によるてんかん性発作の用量依存性抑制を示唆する（図１６及び以下の表２８を参照されたい）。
二重ｍｉＲＮＡ ＡＡＶ９発現構築物
インビボでのＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ標的化二重ｍｉＲＮＡ ＡＡＶ発現ベクターの有効性を決定するために、ＴＬＥのマウスピロカルピン誘導性モデルを、てんかん重積状態の誘導後の種々の単一ｓｉＲＮＡ及び二重ｍｉＲＮＡ ＡＡＶ発現構築物の投与と組み合わせて使用した。
実験の一般構造は、以下の通りであった。第一に、マウスにおいて、ピロカルピンの全身投与によって、てんかん重積状態を誘導し、その後にジアゼパムによって停止させた。マウスには、回復のために約１週間与えた。次の３週間にわたって、ピロカルピン処理されたマウスを、安定した自然に発生するてんかん性発作の再発を示すまで（ピロカルピン処理の時間から約２ヶ月より長い）、てんかん発作についてモニタリングした。このベンチマークに到達したら、マウスを、再発性てんかん性発作の確立後の最初の１週間の間、オープンフィールドにおける運動について試験した。２～３週間の間、マウスを、複数の単一ｓｉＲＮＡ又は二重ｍｉＲＮＡ ＡＡＶ発現ベクターのうちの１つで治療した。単一ｓｉＲＮＡ発現ベクターは、スクランブル対照配列（ＧＣ、配列番号１０１）、２種類のＧｒｉｋ２標的化配列（Ｇ９、配列番号６８、若しくはＧＩ、配列番号７７）のうちの１つ、又はｈＳｙｎプロモーター（配列番号７９０）制御下でのＧＦＰ導入遺伝子を含んでいた。二重ｍｉＲＮＡ発現構築物は、上に記載され、かつ以下の表２９に詳細に示される、ＤＳＰＴＶ１～４構築物のうちの１つが含まれていた。
治療から約１５日後に、オープンフィールド試験を使用して、ピロカルピン及びいくつかのｓｉＲＮＡ発現構築物の１つで治療したマウスにおいて、運動を再び評価した。ＤＳＰＴＶ３及びＤＳＰＴＶ４構築物は、マウスにおいて、ピロカルピン誘導性過剰運動の有意な抑制を示した（図１７及び以下の表３０）。ＡＡＶ９－ＧＦＰを対照ベクターとして使用した。
てんかん発作と過剰運動との相関関係
マウスにおけるオープンフィールド試験の過剰運動の測定によって、Ｇｒｉｋ２を標的化するＡＡＶによりコードされるｍｉＲＮＡ構築物の抗てんかん効果についての結論を描くために、治療後のてんかん発作数と過剰運動との間の相関関係を分析した。極端なてんかん発作の値は、外れ値分析ＲＯＵＴ（Ｑ＝１．０００％）に基づいて除外した。上述の実験条件下で、１日当たりのてんかん性発作数と、実験マウスによるオープンフィールド試験における総移動距離との間に有意な相関関係が存在した（Ｒ２＝０．７３８８、ｐ＜０．０００１）（図１８）。したがって、過剰運動の測定値を、マウスにおけるてんかん性状態の指数として使用することができ、Ｇｒｉｋ２標的化アンチセンス構築物の抗てんかん原性効果を試験するための迅速かつ人道的なアプローチを可能にする。
結論
これらのデータは、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化するＲＮＡｉ配列を保有するＡＡＶベクターを使用したＧｒｉｋ２遺伝子サイレンシングが、ＴＬＥにおける自然発生する慢性てんかん発作を予防するのに効率的な戦略であることを示す。
実施例９：マウスにおける二重抗Ｇｒｉｋ２構築物をコードするベクターのインビトロ及びインビボでの有効性
Ｇｒｉｋ２を内因的に発現する細胞における抗Ｇｒｉｋ２配列を含有する二重ｍｉＲＮＡをコードするベクターの有効性を評価することを意図した実験の第１のセットにおいて、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓを、単一抗Ｇｒｉｋ２ ｍｉＲＮＡ配列Ｇ９（配列番号６８）若しくはＧＩ（配列番号７７）、二重抗Ｇｒｉｋ２配列をコードするベクターＤＭＴＰＶ１（配列番号７８５）、ＤＭＴＰＶ２（配列番号７８６）、ＤＭＴＰＶ３（配列番号７８７）、若しくはＤＭＴＰＶ４（配列番号７８８）をコードするＡＡＶ９ベクター、又は脂質系トランスフェクション試薬に組み込まれたＲＮＡ－ｎｕｌｌベクターで形質導入した。ＴａｑＭａｎ（商標）シングルプレックスリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）を使用して、トランスフェクション後の３個の複製物を含む３８４ウェルプレートにおいて、ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓにおけるＧｒｉｋ２ノックダウンのレベルを定量化した。ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓを、１７，５００個の細胞／ウェル（１７．５ｋ ｃ／ｗ）の密度で播種した。Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ発現を、ＧＡＰＤＨシグナルに対して正規化した。Ｇｒｉｋ２アンチセンス構築物をコードするＡＡＶ９ベクターの形質導入は、Ｇ９、ＧＩ、及びＤＭＴＰＶ１～４を含有する構築物について、５日後のＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓにおけるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ発現を有意に低下させることを示した（図１９）。これらの所見は、Ｇｒｉｋ２遺伝子を内因的に発現する細胞におけるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡの発現をノックダウンする際のＧｒｉｋ２を標的化する二重ｍｉＲＮＡをコードするベクターの有効性を示す。
第２の実験のセットにおいて、自然発生する探索行動を、Ｇ９（配列番号６８）、ＤＭＴＰＶ３（配列番号７８７）、ＡＡＶ９．ｈＳｙｎ．ＧＦＰをコードするベクターで治療したマウス、又は未治療のマウスにおける歴史的な対照におけるオープンフィールド試験を用いて試験した。簡単に述べると、マウスを、５０×５０×５０ｃｍの青色ポリ塩化ビニルの箱の中央に１０分間置き、追跡ソフトウエアＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎ Ｃｏｌｏｒ（Ｎｏｌｄｕｓ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に接続したビデオカメラを用い、軌跡を記録した。１０分間の探索の間にマウスによってカバーされる総距離を分析した。Ｇ９及びＤＭＴＰＶ３で治療したマウスは、過剰運動活性において、有意な（ｐ＜０．０１）減少を示した（図２０）。
マウスにおける過剰運動活性に対するＤＭＴＰＶ３の効果の用量依存性を、以下の表３１に示される４種類の用量にわたって試験した。
ＤＭＴＰＶ３及びＤＭＴＰＶ３／１０ベクターは、マウスへの投与後に過剰運動活性の有意な減少をもたらし（ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定、図２１）、それによって、マウスにおける運動活性に対する二重アンチセンスベクターの用量依存的効果を示している。
Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化する単一及び二重ｍｉＲＮＡをコードするベクターの抗てんかん原性効果も、ピロカルピン処理されたマウスにおいて、単一Ｇ９（配列番号６８）及びＧＩ（配列番号７７）アンチセンス配列をコードするベクター、二重ｍｉＲＮＡ ＤＭＴＰＶ３（配列番号７８７）ベクター、又はスクランブル配列ＧＣ（配列番号１０１）若しくはＡＡＶ９．ｈＳｙｎ．ＧＦＰをコードする対照ベクターを使用して試験した。Ｇ９、ＧＩ、及びＤＭＴＰＶ３で治療したマウスは、１日当たりに経験したてんかん発作数の有意な減少を示し、ＤＭＴＰＶ３は、Ｇ９又はＧＩ単独よりも有意に大きな減少を示している（図２２）。これらの所見は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化する二重ｍｉＲＮＡ構築物が、マウスにおいて、てんかん発作活性を抑制する強い効力を示すことを示している。
実施例１０：ヒトてんかん患者からの器官型海馬切片において、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化するＡＡＶによりコードされるアンチセンス構築物を使用したＧｌｕＫ２タンパク質発現のノックダウン
ヒト脳組織においてＧｌｕＫ２タンパク質発現をノックダウンする際のＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ標的化アンチセンスオリゴヌクレオチドをコードするＡＡＶ９発現ベクターの有効性を評価するために、器官型海馬切片を、７名のヒトＴＬＥ患者（Ｈ７、Ｈ８、Ｈ１０、Ｈ１３、５２、ＣＢＲ１５、及びＨ１４）の切除された脳組織から得た。患者情報を以下の表３２に提供する。
第一に、器官型海馬切片を、単一ヒトＴＬＥ患者から得て、ＡＣＳＦ中インビトロで１１～１２日間育成し、ＡＡＶ９．ＧＣ（配列番号１０１）．ＧＦＰベクターで治療した。その後、切片をＰｒｏｘ１で免疫染色して、歯状回顆粒細胞を特定し、ＧＦＰで染色して、ベクターで形質導入された細胞を特定し、これを重ね合わせて、Ｐｒｏｘ１シグナルとＧＦＰシグナルとの重複度を決定した。歯状回顆粒細胞の５０％より多くが、ＧＦＰで標識され、ＧＦＰとＰｒｏｘ１との間のかなりの重複が観察された（図２３）。これらの結果は、ＲＮＡオリゴヌクレオチドをコードするＡＡＶ９ベクターが、ヒト歯状回顆粒細胞を強固にトランスフェクトすることができることを示している。
ヒト器官型切片を、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ標的化アンチセンス構築物Ｇ９（配列番号６８、６名のＴＬＥ患者からの１７切片）、又はアンチセンス構築物ＧＩ（配列番号７７、２名のＴＬＥ患者からの２切片）で治療した。ウェスタンブロットを、ベクターで治療された切片からのタンパク質溶解物について行った。ＧｌｕＫ２タンパク質レベルを、アクチンに対して正規化し、定量化した。ＧｌｕＫ２タンパク質発現のノックダウンは、Ｇ９で治療したヒト器官型海馬切片の５種類のセットのうちの５種類で観察された（図２４）。Ｇ９で治療したヒト切片に対して行われた例示的なウェスタンブロットを図２５に示し、未治療切片と比較して、ＧｌｕＫ２レベルのおよそ４０％の減少を示している。
実施例１１：ヒト海馬切片におけるＧｒｉｋ２ ｍＲＮＡ標的化二重アンチセンス発現構築物のインビトロでの有効性
Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡ標的化二重ｍｉＲＮＡ ＡＡＶ発現ベクターの有効性を、ヒト対象から得られた器官型海馬切片を使用して、インビトロで試験した。
倫理
ヒト大脳皮質組織を使用した実験について、全ての患者は、書面による同意を与え、プロトコルは、ＣＲＢ ＴＢＭ／ＡＰ－ＨＭ（Ｎ°２７１ＫＡＩ）の監督下、ＩＮＳＥＲＭ（Ｎ°２０１７－０００３１）及びＡＰ－ＨＭ（Ｎ°Ｍ１７－０６）によって承認された。
てんかん患者から培養されたヒト海馬切片：
ヒト器官型切片を、薬物抵抗性ＴＬＥを有すると診断された４名の患者（１１～５８歳）からの海馬の外科的切除から調製した（Ｈｏｐｉｔａｌ ｄｅ Ｌａ Ｔｉｍｏｎｅ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）。組織ブロックを、病院から実験室へと、冷温（２～５℃）の酸素を含む改変人工脳脊髄液（ｍＡＣＳＦ）中で注意深く輸送し、ｍＡＣＳＦは、（ｍＭ単位で）以下を含有していた。１３２のコリン、２．５のＫＣｌ、１．２５のＮａＨ２ＰＯ４、２５のＮａＨＣＯ３、７のＭｇＣｌ２、０．５のＣａＣｌ２、及び８のグルコース）。同じ溶液中、３００～４００μｍの厚い切片を、ビブラトーム（Ｌｅｉｃａ ＶＴ１２００Ｓ）を使用して、バイオセイフティーキャビネット下で調製した。切断した後、切片を、同じ日に記録したか（急性切片）、又は記録の前にインビトロで数日間培養した（器官型切片、以下を参照されたい）。培養のために、切片を、酸素を含む「洗浄媒体」中、室温（２２℃）で１５分間すすいだ。洗浄媒体は、ＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）を用いて完成させたＨａｎｋｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）を含有していた。電気生理学的記録のために、グルコース（１７ｍＭ）及び抗生物質（１％のＡｎｔｉ－Ａｎｔｉ）を加えた。器官型切片を、６ウェルプレート（３０ｍｍ Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）の個々の細胞培養インサート（ＰＩＣＭＯＲＧ５０）に配置した。１ｍＬの培養培地を各ウェルに落とした。培養培地は、５０％のＭＥＭ、２５％のウマ又はヒト血清、１５％のＨＢＳＳ、２％のＢ２７、０．５％の抗生物質、１１．８ｍＭのグルコース、及び２０ｍＭのスクロースを含有していた。培養プレートを、３７℃／５％ＣＯ２で、インキュベーター中に維持した。培養培地を２日ごとに交換し、最初の週には抗生物質が含まれていた（Ａｎｔｉ－Ａｎｔｉ）。器官型切片の電気生理学的記録を、１１～１５ＤＩＶ後に行った。
ヒト器官型切片のウイルス感染
感染のために、ＡＡＶ９構築物を含有するＰＢＳ培地を、ＤＩＶ１でヒト器官型切片に直接的に加えた。最終ウイルス力価は、それぞれ、構築物ＧＣ（配列番号１０１）Ｇ９－Ｓ１（配列番号７７５）、及びＤＭＴＰＶ３（配列番号７８７）について、１．８Ｅ＋１０ＧＣ／ｍＬであった。ＡＡＶ９．ｈＳｙｎ．ＧＦＰベクターを、Ｇ９－Ｓ１及びＤＭＴＰＶ３実験のための対照として使用した。試験したベクターについての詳細な情報を以下の表３３に提供する。
電気生理学的記録
ヒト器官型切片を、３０～３２℃に維持した記録チャンバに、個々に移し、酸素を含む（９５％のＯ２及び５％ＣＯ２）ＡＣＳＦ（生理学的条件）、又は過剰興奮性の条件（５μＭのガバジン及び５０μＭの４－ＡＰを含有するＡＣＳＦ）を用い、連続的に灌流させた（２～３ｍＬ／分）。局所電場電位（ＬＦＰ）の記録を、歯状回の顆粒細胞層に配置された単極ニクロム線を用いて行った。ＬＦＰをＤＡＭ－８０増幅器で記録した（ローパスフィルタ、０．１Ｈｚ、ハイパスフィルタ、３ＫＨｚ、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ）。データを、コンピュータに対してＤｉｇｉｄａｔａ １４４０Ａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いてデジタル化し（２０ｋＨｚ）、Ｃｌａｍｐｅｘ１０．１ソフトウエア（ＰＣｌａｍｐ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して取得した。Ｃｌａｍｐｆｉｔ ９．２（ＰＣｌａｍｐ）及びＭｉｎｉＡｎａｌｙｓｉｓ ６．０．１（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｆｔ、Ｄｅｃａｔｕｒ，ＧＡ）を使用して、シグナルをオフラインで分析した。てんかん性放電（ＥＤ）は、持続時間が３０ｍｓより長いＬＦＰを伴うマルチユニット発火の増加からなる。
統計学
全ての値は、平均±ＳＥＭとして与えられる。統計分析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して行われた。群間比較のために、生データをＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定によって分析した。有意性のレベルは、ｐ＜０．０５に設定した。
結果
Ｇｒｉｋ２標的化マイクロＲＮＡ配列Ｇ９－Ｓ１（配列番号７７５）をコードするＡＡＶ発現構築物、スクランブル対照配列ＧＣ（配列番号１０１）をコードする別個のＡＡＶ構築物、及びＧｒｉｋ２を標的化する二重ｍｉＲＮＡ構築物ＤＭＴＰＶ３（配列番号７８７）をコードする第３のベクターを、生理学的条件で試験した（方法を参照されたい）。第一に、過剰興奮性溶液（方法を参照されたい）を使用して、自然発生するＥＤを生成するためのネットワークの機能を評価した。進行中の自然発生するＥＤを伴って応答した切片を選択した。次いで、これらの切片を、標準的な生理学的媒体に切り替え、３０分間洗浄した。対照条件（例えば、ＧＣをコードする構築物による切片の感染）において、切片は、多くの自然発生する再発性ＥＤを示した（０．３±０．１１Ｈｚ、ｎ＝６切片、図２６Ａ）。注目すべきことに、切片をＧ９－Ｓ１で治療すると、ＥＤの抑制を観察した（ほぼ９３％まで、０．０１９±０．０１３Ｈｚ、ｎ＝７切片、ｐ＝０．００２９、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定、図２６Ｂ～２６Ｃ、表３４）。
更に、二重アンチセンスベクターＤＭＴＰＶ３によるヒト器官型海馬切片の治療は、ｑＲＴ－ＰＣＲに測定される場合、Ｇｒｉｋ２のレベルの実質的な減少をもたらした（図２７Ａ）。生理学的条件下（例えば、ＡＣＳＦ中）で切片に投与される場合、ＤＭＴＰＶ３は、ＡＡＶ９．ｈＳｙｎ．ＧＦＰで治療した切片（図２７Ｃ～２７Ｄ）と比較した場合、てんかん性放電における顕著な減少をもたらした（図２７Ｂ）。
したがって、これらの所見は、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡを標的化する単一及び二重のアンチセンス配列をコードするＡＡＶベクターによるＧｌｕＫ２の下方調節が、難治性ＴＬＥを有する患者からの海馬組織におけるてんかん性活性を抑制するために有効な戦略である。
実施例１２：パッケージングのベクター多重性の分析
スタッファー配列を含むことによってベクターの長さを増加させることの影響を評価した。ベクターに組み込まれるスタッファー（又はフィラー）配列は、遺伝子送達後の細胞毒性の明らかな欠如について選択された非コード配列であった。非コード配列内の転写開始又は完了に完了する調節要素の除去は、転写活性に関してスタッファー配列を不活性化した。
種々のゲノムサイズのベクターを、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ法を使用した電気泳動によって評価した。ＤＮＡ分子の分析を、Ｄ５０００ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ ＃５０６７－５５９３）を使用して、Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ（ＨＳ）Ｄ５０００ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ ＃５０６７－５５９２）のための製造業者が推奨したプロトコルに従って行った。ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎは、（一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡではなく）二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを測定し、ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ評価は、塩基対においてｄｓＡＡＶゲノム長さの等価な近似を形成するための２つの相補的なｓｓＡＡＶゲノムのアニーリングに依存する。ＳＭＳＰＶ１（配列番号８１８）、ＳＭＳＰＶ２（配列番号８２０）、及びＳＭＳＰＶ３（配列番号８２２）（ＳＭＳＰＶ＝単一マイクロＲＮＡ単一プロモーターベクター）として表３５に例示される、ＡＡＶのパッケージング能力の５０％未満を有するゲノムをコードするベクターは、各々が単一ｍｉＲＮＡカセットをコードし、１．５～１．７ｋｂのゲノム長さを有し、カプシド当たり複数の（例えば、２又は３の）ゲノムをパッケージングする可能性を有する。そのように、ＳＭＳＰＶ１、ＳＭＳＰＶ２、及びＳＭＳＰＶ３調製物からの「全」カプシドのわずか４４％～６１％が、単一ＡＡＶゲノムを含有する。スタッファー配列（例えば、配列番号８１５及び／又は配列番号８１６）の、これらの構築物（それぞれ、ＳＭＳＰＶ４（配列番号８０４）、ＳＭＳＰＶ５（配列番号８０６）、及びＳＭＳＰＶ６（配列番号８０８））の各々に対する付加は、単一ＡＡＶゲノムを含有する各ベクターｐｒｅｐ内のカプシドの割合を７２％～７５％まで増加させる。最後に、２種類の別個のｍｉＲＮＡ（例えば、ＤＭＳＰＶ１（配列番号８１２）、ＤＭＳＰＶ＝二重マイクロＲＮＡ単一プロモーターベクター）をコードする連結したゲノムに対するスタッファー配列の付加は、単一全長ＡＡＶゲノムを含有するカプシドの８７％で生じる（表３５を参照されたい）。
実施例１３：マウス皮質ニューロンにおけるＧｌｕＫ２発現のインビトロでのノックダウン
生後０日目（Ｐ０）～Ｐ１のＣ５７Ｂｌ６／Ｊマウスから解離させた皮質ニューロンを調製し、ウェル当たり５．５Ｅ＋５個の細胞の濃度で６ウェルプレートに接種した。播種から２日後又は３日後（インビボでの日数ＤＩＶ２～３）、培地の半分を除去し、ウイルスベクターをＭＯＩ ７．５Ｅ＋４で加えた。ＤＩＶ１３で、マウス神経培養物を溶解し、溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びイムノブロッティングに使用した。イムノブロッティングのために、以下の抗体を適用した。１：２０００に希釈したウサギ抗ＧｌｕＫ２／３（クローンＮＬ９ ０４－９２１、Ｍｅｒｃｋ－Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、及び１：５０００に希釈したマウス抗β－アクチン（Ａ５３１６、Ｓｉｇｍａ）を一次抗体として使用して、１：１５０００に希釈した、ヤギにおいて産生された適切な８００ｎｍフルオロフォアコンジュゲート化二次抗体（ＩＲＤｙｅ ８００ヤギ抗マウスＬｉ－ＣＯＲ ９２６－３２２１０又はＩＲＤｙｅ ８００ヤギ抗ウサギＬｉ－ＣＯＲ ９２６－３２２１１）を二次抗体として使用した。Ｌｉ－ＣＯＲで、８００ｎｍで蛍光を測定することによって、標的タンパク質を検出した。Ｅｍｐｉｒｉａ ｓｔｕｄｉｏソフトウエアを用いて分析を行った。定量化のために、各レーンの蛍光シグナルの強度を、β－アクチン発現によって正規化し、次いで対照条件によって正規化した。これらの実験条件下、発現構築物ＤＭＴＰＶ８（配列番号８１３）及びＤＭＳＰＶ１（配列番号８１２）は、それぞれ、対照ベクターに対して７３±１７％及び７１±４％の減少を提示した（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．、図２８を参照されたい）。
実施例１４：側頭葉てんかんのマウスモデルにおけるＧｌｕＫ２のインビボでのノックダウン
６～９週齢のＳｗｉｓｓ雄マウスを使用して実験を行った。マウス（３０～４０ｇ）に、スコポラミン（１ｍｇ／ｋｇ）を皮下（ｓ．ｃ．）で与えてから３０分後に、ピロカルピン（３００～３５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。最初のてんかん発作から１０分後に、カフェイン（４０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。てんかん重積状態の発生から１時間後に、ジアゼパム（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。ＡＡＶ投与のために、てんかん性マウス（てんかん重積状態から２ヶ月より後）を、イソフルラン麻酔薬で麻酔した（１００％のＯ２下、誘導のために５％、及び維持のために２％）。リドカイン（２％）の局所投与の存在下で、海馬の背側及び腹側の歯状回にＡＡＶを両側注射するために、４個の孔をドリルで開けた（ＡＰ－１．８ｍｍ、ＭＬ±１ｍｍ、ＤＶ－２ｍｍ、及びＡＰ－３．３ｍｍ、ＭＬ±２．３ｍｍ、ＤＶ－２．５ｍｍ）。各々の注射について、ＨａｍｉｌｔｏｎシリンジをＡＡＶ送達に使用した。脳組織をカニューラの上を滑らせるために５分間遅らせた後、ＡＡＶを含有する溶液の体積＝１．０μＬ／注射部位×４注射部位をゆっくりと注入した（速度：０．２μＬ／分）。てんかん性マウス（てんかん重積状態から２ヶ月より後）の運動を、ＡＡＶ注射の１週間前及び２週間後に評価した。非てんかん性マウス（野生型Ｓｗｉｓｓ雄マウス、１８～２１週齢）の運動も評価した。マウスを、環境に慣れさせるために実験の１日前に行動分析室に移した。マウスを、９：００～１８：００の明／暗サイクルで、餌及び水に自由にアクセス出来る状態で、室温（２０～２２℃）に維持した。嗅覚による手がかりを防止するために、試験された動物と接触した全ての材料を、その後に、酢酸で洗浄した。第一に、自然発生する探索行動を、上述のオープンフィールド試験で試験した。簡単に述べると、マウスを、５０×５０×５０ｃｍの青色ポリ塩化ビニルの箱の中央に１０分間置き、追跡ソフトウエアＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎ Ｃｏｌｏｒ（Ｎｏｌｄｕｓ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に接続したビデオカメラを用い、軌跡を記録した。１０分間の自然発生する探索の間にマウスによってカバーされる速度及び総距離を分析した。
ＤＭＴＰＶ８及びＤＭＳＰＶ１によるマウスの治療は、てんかん原性挙動の代理である、過剰運動を低下させた。過剰運動のこの低下は、用量依存的であった。両方の用量は、ＤＭＴＰＶ８及びＤＭＳＰＶ１についての有効性を示したが、３．６×Ｅ＋９は、３．６×Ｅ＋８よりも有効であった。ＤＭＳＰＶ１は、３．６×Ｅ＋９の高用量で、試験した全ての条件の中で最も強い効果を有していた（図２９）。
別個の実験のセットにおいて、マウスを、ベクター構築物ＳＭＳＰＶ４（配列番号８０４）、ＳＭＳＰＶ５（配列番号８０６）、又はＳＭＳＰＶ６（配列番号８０８）で治療し、上に記載したのと同じ方法で運動を試験した。これらの構築物によるマウスの治療は、過剰運動（てんかん原性挙動の代理）を低下させ、一方で、対照ベクター（ＣＶ）による治療は、何ら効果を有していなかった（図３１）。ＣＶは、ｍＲＮＡ又はタンパク質を産生しないが、その代わりに５’ＩＴＲから３’ＩＴＲまで、ＲＢＧポリＡ（配列番号７５１）、ＣｐＧ欠失ニワトリベータアクチンイントロン（配列番号８２４）、及び配列番号８２３の非コードスタッファー配列を含有するゲノムを含有するＡＡＶカプシドを模倣するように設計された。上流のＲＢＧポリＡ配列は、他のＡＡＶベクターとの正確なｄｄＰＣＲ力価比較を可能にし、５’ＩＴＲからの任意の潜在的な転写を除外する。抗Ｇｒｉｋ２構築物による治療後の過剰運動の低下は、用量依存的であった。３．６×Ｅ＋９及び３．６×Ｅ＋８の両方の用量が、ＳＭＳＰＶ６についての有効性を示したが、３．６×Ｅ＋９は、ＳＭＳＰＶ４について３．６×Ｅ＋８よりも有効であった。ＳＭＳＰＶ５について、３．６×Ｅ＋９及び３．６×Ｅ＋８の投薬量は両方とも同様の有効性を示した。ＳＭＳＰＶ４は、試験した全ての条件の３．６×Ｅ＋９の高用量で最も強い効果を有しており、一方で、３．６×Ｅ＋８の低用量では、ＳＭＳＰＶ４は、過剰運動に対して全く効果を有していなかった（図３１）。
他の実施形態
記載される開示内容の種々の修飾及び変形は、本開示の範囲及び精神から逸脱しない限り、当業者には明らかであろう。本開示は、具体的な実施形態と組み合わせて記載されてきたが、特許請求の範囲の開示が、かかる具体的な実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、当業者にとって自明な本開示を実施するために記載された態様の種々の修飾は、本開示の範囲内であることが意図される。
他の実施形態は、特許請求の範囲内にある。
参考文献
本明細書全体で、様々な参考文献が、本開示が関連する技術常識を記載している。これらの参考文献の開示は、本開示に参照により組み込まれる。
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Claims (140)

  1. Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの一本鎖領域内で特異的にハイブリダイズする８００ヌクレオチド以下の長さを有する単離されたポリヌクレオチドであって、ハイブリダイズされた前記ポリヌクレオチドが、１８ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満の標的開放エネルギー（Ｔａｒｇｅｔ Ｏｐｅｎｉｎｇ Ｅｎｅｒｇｙ）を有し、
    （ａ）前記ポリヌクレオチドが、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの核酸配列を含まないか、
    （ｂ）前記ポリヌクレオチドが、配列番号６８、若しくは配列番号６８及び配列番号６４９の核酸配列を含むか、又は
    （ｃ）前記ポリヌクレオチドが、５．５３ｋｃａｌ／ｍｏｌ～５．５５ｋｃａｌ／ｍｏｌである総開放エネルギー（Ｔｏｔａｌ Ｏｐｅｎｉｎｇ ｅｎｅｒｇｙ）を有していない、単離されたポリヌクレオチド。
  2. Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの一本鎖領域内で特異的にハイブリダイズする２３ヌクレオチド以下の長さを有する単離されたＲＮＡポリヌクレオチドであって、ハイブリダイズされた前記ポリヌクレオチドが、１８ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満の総開放エネルギーを有し、前記ポリヌクレオチドが、配列番号７７２～７７４のうちのいずれか１つの核酸配列を含まない、単離されたＲＮＡポリヌクレオチド。
  3. 前記ポリヌクレオチドが、５．４ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きいか、又は５．４ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満である総開放エネルギーを有する、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
  4. 前記ハイブリダイズされたポリヌクレオチドが、－３５ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きい二本鎖形成のエネルギー（Ｅｎｅｒｇｙ ｏｆ Ｄｕｐｌｅｘ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  5. 前記ハイブリダイズされたポリヌクレオチドが、－２４ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きな総結合エネルギー（Ｔｏｔａｌ Ｅｎｅｒｇｙ ｏｆ Ｂｉｎｄｉｎｇ）を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  6. 前記ハイブリダイズされたポリヌクレオチドが、５０％未満であるＧＣ含有量を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  7. 前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの前記一本鎖領域が、ループ領域１～１４からなる群から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  8. 前記ポリヌクレオチドが、
    （ａ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ１領域、
    （ｂ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ２領域、
    （ｃ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ３領域、
    （ｄ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ４領域、
    （ｅ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ５領域、
    （ｆ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ６領域、
    （ｇ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ７領域、
    （ｈ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ８領域、
    （ｉ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ９領域、
    （ｊ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ１０領域、
    （ｋ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ１１領域、
    （ｌ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ１２領域、
    （ｍ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ１３領域、又は
    （ｎ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのループ１４領域内で特異的にハイブリダイズする、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  9. （ａ）前記ループ１領域が、配列番号１４５の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｂ）前記ループ２領域が、配列番号１４６の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｃ）前記ループ３領域が、配列番号１４７の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｄ）前記ループ４領域が、配列番号１４８の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｅ）前記ループ５領域が、配列番号１４９の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｆ）前記ループ６領域が、配列番号１５０の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｇ）前記ループ７領域が、配列番号１５１の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｈ）前記ループ８領域が、配列番号１５２の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｉ）前記ループ９領域が、配列番号１５３の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｊ）前記ループ１０領域が、配列番号１５４の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｋ）前記ループ１１領域が、配列番号１５５の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｌ）前記ループ１２領域が、配列番号１５６の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｍ）前記ループ１３領域が、配列番号１５７の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、かつ／又は
    （ｎ）前記ループ１４領域が、配列番号１５８の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項７又は８に記載のポリヌクレオチド。
  10. 前記配列同一性が、配列番号１４５～１５８のうちのいずれか１つの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドにわたって決定される、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
  11. 前記配列同一性が、配列番号１４５～１５８のうちのいずれか１つの少なくとも３０個の連続ヌクレオチドにわたって決定される、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
  12. 配列同一性が、配列番号１４５～１５８のうちのいずれか１つの少なくとも６０個の連続ヌクレオチドにわたって決定される、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
  13. 配列同一性が、配列番号１４５～１５８のうちのいずれか１つの全長にわたって決定される、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
  14. 前記ポリヌクレオチドが、
    （ａ）配列番号１の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｂ）配列番号４の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｃ）（ｉ）配列番号５の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、又は
    （ｉｉ）配列番号６の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｄ）配列番号７の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｅ）配列番号９６の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｆ）（ｉ）配列番号８の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｉ）配列番号９８の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、又は
    （ｉｉｉ）配列番号９９の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｇ）配列番号９の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｈ）配列番号６３の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉ）配列番号１０の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、あるいは
    （ｊ）配列番号１１の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  15. 配列同一性が、配列番号１、４～１１、６３、９６、９８、又は９９のうちのいずれか１つの少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって決定される、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
  16. 配列同一性が、配列番号１、４～１１、６３、９６、９８、又は９９のうちのいずれか１つの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドにわたって決定される、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
  17. 配列同一性が、配列番号１、４～１１、６３、９６、９８、又は９９のうちのいずれか１つの少なくとも２０個の連続ヌクレオチドにわたって決定される、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
  18. 配列同一性が、配列番号１、４～１１、６３、９６、９８、又は９９のうちのいずれか１つの全長にわたって決定される、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
  19. 前記ポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドと前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの前記一本鎖領域とによって形成される二本鎖構造を含み、前記二本鎖構造が、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドと、前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの前記一本鎖領域のヌクレオチドとの間に少なくとも１個のミスマッチを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  20. 前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの前記一本鎖領域が、ループ領域１～１４からなる群から選択される、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
  21. 前記総開放エネルギー、二本鎖形成のエネルギー、総結合エネルギー、及び／又はＧＣ含有量が、２３～７９個のヌクレオチドにわたって計算される、請求項１～２０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  22. 前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの前記一本鎖領域が、非対形成領域１～５からなる群から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  23. 前記ポリヌクレオチドが、
    （ａ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの非対形成領域１、
    （ｂ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの非対形成領域２、
    （ｃ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの非対形成領域３、
    （ｄ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの非対形成領域４、又は
    （ｅ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの非対形成領域５内で特異的にハイブリダイズする、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
  24. （ａ）前記非対形成領域１が、配列番号１５９の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｂ）前記非対形成領域２が、配列番号１６０の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｃ）前記非対形成領域３が、配列番号１６１の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｄ）前記非対形成領域４が、配列番号１６２の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、かつ／又は
    （ｅ）前記非対形成領域５が、配列番号１６３の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項２２又は２３に記載のポリヌクレオチド。
  25. 配列同一性が、配列番号１５９～１６３のうちのいずれか１つの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドにわたって決定される、請求項２４に記載のポリヌクレオチド。
  26. 配列同一性が、配列番号１５９～１６３のうちのいずれか１つの少なくとも３０個の連続ヌクレオチドにわたって決定される、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
  27. 配列同一性が、配列番号１５９～１６３のうちのいずれか１つの少なくとも６０個の連続ヌクレオチドにわたって決定される、請求項２６に記載のポリヌクレオチド。
  28. 配列同一性が、配列番号１５９～１６３のうちのいずれか１つの全長にわたって決定される、請求項２７に記載のポリヌクレオチド。
  29. 前記ポリヌクレオチドが、
    （ａ）（ｉ）配列番号１３の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｉ）配列番号１４の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｉｉ）配列番号７２の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、又は
    （ｉｖ）配列番号７３の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｂ）配列番号１５の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、あるいは
    （ｃ）配列番号１６の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項２２～２８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  30. 配列同一性が、配列番号１３～１６、７２、又は７３のうちのいずれか１つの少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって決定される、請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
  31. 配列同一性が、配列番号１３～１６、７２、又は７３のうちのいずれか１つの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドにわたって決定される、請求項３０に記載のポリヌクレオチド。
  32. 配列同一性が、配列番号１３～１６、７２、又は７３のうちのいずれか１つの少なくとも２０個の連続ヌクレオチドにわたって決定される、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。
  33. 配列同一性が、配列番号１３～１６、７２、又は７３のうちのいずれか１つの全長にわたって決定される、請求項３２に記載のポリヌクレオチド。
  34. 配列同一性が、配列番号１３～１６、７２、又は７３のうちのいずれか１つの３０個以下の連続ヌクレオチドにわたって決定される、請求項２９～３３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  35. 配列同一性が、配列番号１３～１６、７２、又は７３のうちのいずれか１つの２５個以下の連続ヌクレオチドにわたって決定される、請求項３４に記載のポリヌクレオチド。
  36. 前記ポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドと前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの前記一本鎖領域とによって形成される二本鎖構造を含み、前記二本鎖構造が、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチドと、前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの前記一本鎖領域のヌクレオチドとの間に少なくとも１個のミスマッチを含む、請求項２２～３５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  37. 平均位置エントロピーが、２３～７９個のヌクレオチドにわたって計算される、請求項２２～３６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  38. 前記ポリヌクレオチドが、前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのコード配列にハイブリダイズする、請求項１～３７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  39. 前記ポリヌクレオチドが、
    （ａ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１内の領域、
    （ｂ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン２内の領域、
    （ｃ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン３内の領域、
    （ｄ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン４内の領域、
    （ｅ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン５内の領域、
    （ｆ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン６内の領域、
    （ｇ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン７内の領域、
    （ｈ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン８内の領域、
    （ｉ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン９内の領域、
    （ｊ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１０内の領域、
    （ｋ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１１内の領域、
    （ｌ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１２内の領域、
    （ｍ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１３内の領域、
    （ｎ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１４内の領域、
    （ｏ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１５内の領域、及び／又は
    （ｐ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１６内の領域にハイブリダイズする、請求項３８に記載のポリヌクレオチド。
  40. （ａ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１が、配列番号１２９の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｂ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン２が、配列番号１３０の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｃ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン３が、配列番号１３１の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｄ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン４が、配列番号１３２の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｅ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン５が、配列番号１３３の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｆ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン６が、配列番号１３４の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｇ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン７が、配列番号１３５の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｈ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン８が、配列番号１３６の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｉ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン９が、配列番号１３７の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｊ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１０が、配列番号１３８の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｋ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１１が、配列番号１３９の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｌ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１２が、配列番号１４０の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｍ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１３が、配列番号１４１の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｎ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１４が、配列番号１４２の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、
    （ｏ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１５が、配列番号１４３の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、かつ／又は
    （ｐ）前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡのエクソン１６が、配列番号１４４の少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる、請求項３９に記載のポリヌクレオチド。
  41. 前記ポリヌクレオチドが、
    （ａ）配列番号１の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｂ）（ｉ）配列番号２の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｉ）配列番号３の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｉｉ）配列番号３０の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｖ）配列番号３１の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｖ）配列番号３６の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｖｉ）配列番号４０の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｖｉｉ）配列番号５９の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｖｉｉｉ）配列番号７６の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｘ）配列番号８０の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｘ）配列番号８１の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｘｉ）配列番号９２の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、及び／又は
    （ｘｉｉ）配列番号９３の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｃ）（ｉ）配列番号４０の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｉ）配列番号６０の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｉｉ）配列番号６８の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｖ）配列番号７０の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、及び／又は
    （ｖ）配列番号８６の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｄ）（ｉ）配列番号６８の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｉ）配列番号６９の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、及び／又は
    （ｉｉｉ）配列番号７０の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｅ）（ｉ）配列番号４の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｉ）配列番号５の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｉｉ）配列番号６の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｖｉ）配列番号５６の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｖ）配列番号５７の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｖｉ）配列番号５８の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｖｉｉ）配列番号９１の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｖｉｉｉ）配列番号９４の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、及び／又は
    （ｉｘ）配列番号９５の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｆ）（ｉ）配列番号２０の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｉ）配列番号３７の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｉｉ）配列番号３８の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｖ）配列番号４４の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｖ）配列番号４６の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｇ）配列番号１２の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｈ）（ｉ）配列番号７の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｉ）配列番号８の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｉｉ）配列番号９６の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｖ）配列番号９８の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、及び／又は
    （ｖ）配列番号９９の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉ）（ｉ）配列番号２２の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｉ）配列番号３９の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｉｉ）配列番号６２の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｖｉ）配列番号７４の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｖ）配列番号７５の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｖｉ）配列番号８７の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｖｉｉ）配列番号８８の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｖｉｉｉ）配列番号８９の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、及び／又は
    （ｉｘ）配列番号９０の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｊ）（ｉ）配列番号８２の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｉ）配列番号８３の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｉｉ）配列番号８４の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、及び／又は
    （ｉｖ）配列番号８５の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｋ）（ｉ）配列番号１３の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｉ）配列番号１４の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｉｉ）配列番号７２の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、及び／又は
    （ｉｖ）配列番号７３の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｌ）（ｉ）配列番号３４の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｉ）配列番号３５の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｉｉ）配列番号７７の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｖ）配列番号７８の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、及び／又は
    （ｖ）配列番号７９の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｍ）配列番号５１の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    並びに／又は
    （ｎ）（ｉ）配列番号９の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｉ）配列番号１０の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｉｉ）配列番号１１の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｖ）配列番号１５の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｖ）配列番号１６の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｖｉ）配列番号１７の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｖｉｉ）配列番号１８の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｖｉｉｉ）配列番号２７の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｉｘ）配列番号３２の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｘ）配列番号３３の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｘｉ）配列番号４１の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｘｉｉ）配列番号４９の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｘｉｉｉ）配列番号５０の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｘｉｖ）配列番号５２の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｘｖ）配列番号５３の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、
    （ｘｖｉ）配列番号６１の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列、及び／又は
    （ｘｖｉｉ）配列番号６３の少なくとも５個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項４０に記載のポリヌクレオチド。
  42. 配列同一性が、配列番号１～１２、１３～１８、２０、２２、２７、３０～４１、４４、４６、４９～５３、５６～６３、６８～７０、７２～９２、又は９４～９９のうちのいずれか１つの少なくとも１０個の連続ヌクレオチドにわたって決定される、請求項４１に記載のポリヌクレオチド。
  43. 配列同一性が、配列番号１～１２、１３～１８、２０、２２、２７、３０～４１、４４、４６、４９～５３、５６～６３、６８～７０、７２～９２、又は９４～９９のうちのいずれか１つの少なくとも１５個の連続ヌクレオチドにわたって決定される、請求項４２に記載のポリヌクレオチド。
  44. 配列同一性が、配列番号１～１２、１３～１８、２０、２２、２７、３０～４１、４４、４６、４９～５３、５６～６３、６８～７０、７２～９２、又は９４～９９のうちのいずれか１つの少なくとも２０個の連続ヌクレオチドにわたって決定される、請求項４３に記載のポリヌクレオチド。
  45. 配列同一性が、配列番号１～１２、１３～１８、２０、２２、２７、３０～４１、４４、４６、４９～５３、５６～６３、６８～７０、７２～９２、又は９４～９９のうちのいずれか１つの全長にわたって決定される、請求項４４に記載のポリヌクレオチド。
  46. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号６８及び配列番号６４９の核酸配列を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  47. 前記ポリヌクレオチドが、前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの非コード配列にハイブリダイズする、請求項１～４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  48. 前記非コード配列が、前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、請求項４７に記載のポリヌクレオチド。
  49. 前記５’ＵＴＲが、配列番号１２６の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる、請求項４８に記載のポリヌクレオチド。
  50. 前記非コード配列が、前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲを含む、請求項４７に記載のポリヌクレオチド。
  51. 前記３’ＵＴＲが、配列番号１２７の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる、請求項５０に記載のポリヌクレオチド。
  52. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号１１５～６８１の核酸配列のうちのいずれか１つにハイブリダイズする、請求項１～５１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  53. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号１～１００のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項１～５２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  54. 前記ポリヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である、請求項１～５３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  55. 前記ＡＳＯが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、又は短ヘアピン適合ｍｉＲＮＡ（ｓｈｍｉＲＮＡ）である、請求項５４に記載のポリヌクレオチド。
  56. 前記ポリヌクレオチドが、１９～２１個のヌクレオチドである、請求項１～５５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  57. 前記ポリヌクレオチドが、１９個のヌクレオチドである、請求項５６に記載のポリヌクレオチド。
  58. 前記ポリヌクレオチドが、２０個のヌクレオチドである、請求項５７に記載のポリヌクレオチド。
  59. 前記ポリヌクレオチドが、２１個のヌクレオチドである、請求項５８に記載のポリヌクレオチド。
  60. 前記Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡが、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、又は配列番号１２４の核酸配列によってコードされる、請求項１～５９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  61. 前記ポリヌクレオチドが、細胞におけるＧｌｕｋ２タンパク質のレベルを減少させることができる、請求項１～６０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
  62. 前記ポリヌクレオチドが、前記細胞におけるＧｌｕＫ２タンパク質のレベルを、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％減少させる、請求項６１に記載のポリヌクレオチド。
  63. 前記細胞が、ニューロンである、請求項６１又は６２に記載のポリヌクレオチド。
  64. 前記ニューロンが、海馬ニューロンである、請求項６３に記載のポリヌクレオチド。
  65. 前記海馬ニューロンが、歯状回顆粒細胞（ＤＧＣ）である、請求項６４に記載のポリヌクレオチド。
  66. 請求項１～６５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  67. 前記ベクターが、複製欠損性である、請求項６６に記載のベクター。
  68. 前記ベクターが、哺乳動物ベクター、細菌ベクター、又はウイルスベクターである、請求項６６又は６７に記載のベクター。
  69. 前記ベクターが、発現ベクターである、請求項６６～６８のいずれか一項に記載のベクター。
  70. 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、オルトミクソウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、プラス鎖ＲＮＡウイルス、ピコルナウイルス、アルファウイルス、二本鎖ＤＮＡウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス、鶏痘ウイルス、及びカナリアポックスウイルスからなる群から選択される、請求項６８又は６９に記載のベクター。
  71. 前記ベクターが、ＡＡＶベクターである、請求項７０に記載のベクター。
  72. 前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ９又はＡＡＶｒｈ１０ベクターである、請求項７１に記載のベクター。
  73. 前記ベクターが、表９から選択される発現カセットを含む、請求項６６～７２のいずれか一項に記載のベクター。
  74. 発現カセットであって、
    （ａ）ステム－ループ配列であって、５’から３’へ、
    （ｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するガイドヌクレオチド配列を含む５’ステム－ループアーム、
    （ｉｉ）ループ領域であって、マイクロＲＮＡループ配列を含む、ループ領域、
    （ｉｉｉ）前記ガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的なパッセンジャーヌクレオチド配列を含む３’ステム－ループアームを含む、ステム－ループ配列と、
    （ｂ）前記ガイド配列に対して５’に位置する第１の隣接領域と、
    （ｃ）前記パッセンジャー配列に対して３’に位置する第２の隣接領域と、を含むヌクレオチド配列を含む、発現カセット。
  75. 前記発現カセットが、表９に記載される構造のうちのいずれか１つを含む、請求項７４に記載の発現カセット。
  76. 発現カセットであって、
    （ａ）ステム－ループ配列であって、５’から３’へ、
    （ｉ）ガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的であるパッセンジャーヌクレオチド配列を含む５’ステム－ループアーム、
    （ｉｉ）ループ領域であって、マイクロＲＮＡループ配列を含む、ループ領域、
    （ｉｉｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するガイドヌクレオチド配列を含む３’ステム－ループアームを含む、ステム－ループ配列と、
    （ｂ）前記ガイド配列に対して５’に位置する第１の隣接領域と、
    （ｃ）前記パッセンジャー配列に対して３’に位置する第２の隣接領域と、を含むヌクレオチド配列を含む、発現カセット。
  77. 前記発現カセットが、表９に記載される構造のうちのいずれか１つを含む、請求項７６に記載の発現カセット。
  78. 前記第１の隣接領域が、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、又は７６８のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項７４～７７のいずれか一項に記載の発現カセット。
  79. 前記第２の隣接領域が、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、又は７６９のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項７４～７８のいずれか一項に記載の発現カセット。
  80. 前記第１の隣接領域が、５’スペーサー配列と、５’隣接配列と、を含む、請求項７４～７９のいずれか一項に記載の発現カセット
  81. 前記第２の隣接領域が、３’スペーサー配列と、３’隣接配列と、を含む、請求項７４～８０のいずれか一項に記載の発現カセット。
  82. 前記マイクロＲＮＡループ配列が、ｍｉＲ－３０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－２１８－１、又はｍｉＲ－１２４－３配列である、請求項７４～８１のいずれか一項に記載の発現カセット。
  83. 前記マイクロＲＮＡループ配列が、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、又は７７０のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項８２に記載の発現カセット。
  84. 前記発現カセットが、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、７ＳＫプロモーター、アポリポタンパク質Ｅ－ヒトアルファ１－アンチトリプシンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＣＫ８プロモーター、ｍＵ１ａプロモーター、伸長因子１αプロモーター、チロキシン結合グロブリンプロモーター、シナプシンプロモーター、ＲＮＡ結合Ｆｏｘ－１ホモログ３プロモーター、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩプロモーター、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、血小板由来成長因子サブユニットβ、小胞グルタミン酸トランスポータープロモーター、ソマトスタチンプロモーター、神経ペプチドＹプロモーター、血管作動性腸管ペプチドプロモーター、パルブアルブミンプロモーター、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５プロモーター、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６７プロモーター、ドーパミン受容体Ｄ１プロモーター、ドーパミン受容体Ｄ２プロモーター、補体Ｃ１ｑ様２プロモーター、プロオピオメラノコルチンプロモーター、プロスペロホメオボックス１プロモーター、微小管関連タンパク質１Ｂプロモーター、及びチューブリンアルファ１プロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項７４～８３のいずれか一項に記載の発現カセット。
  85. 前記発現カセットが、配列番号７７５、７７７、７７９、７８１、７８３～７８８、７９６、７９８～８０１、８０３、８０５、８０７、８０９、、８１３、８１７、８１９、及び８２１のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項７６に記載の発現カセット。
  86. 発現カセットであって、５’から３’へ、
    （ａ）第１のプロモーター配列と、
    （ｂ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する第１のガイドヌクレオチド配列であって、前記第１のプロモーターに作動可能に連結される、第１のガイドヌクレオチド配列と、
    （ｃ）第２のプロモーター配列と、
    （ｂ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する第２のガイドヌクレオチド配列であって、前記第２のプロモーターに作動可能に連結される、第２のガイドヌクレオチド配列と、を含む、発現カセット。
  87. 前記第１のガイドヌクレオチド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第１のパッセンジャーヌクレオチド配列を更に含み、前記第１のパッセンジャーヌクレオチド配列が、前記第１のガイドヌクレオチド配列に対して５’又は３’に位置する、請求項８６に記載の発現カセット。
  88. 前記第２のガイドヌクレオチド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第２のパッセンジャーヌクレオチド配列を更に含み、前記第２のパッセンジャーヌクレオチド配列が、前記第２のガイドヌクレオチド配列に対して５’又は３’に位置する、請求項８６又は８７に記載の発現カセット。
  89. 前記第１のガイド配列に対して５’に位置する第１の５’隣接領域を更に含む、請求項８６～８８のいずれか一項に記載の発現カセット。
  90. 前記第１のガイド配列に対して３’に位置する第１の３’隣接領域を更に含む、請求項８６～８９のいずれか一項に記載の発現カセット。
  91. 前記第２のガイド配列に対して５’に位置する第２の５’隣接領域を更に含む、請求項８６～９０のいずれか一項に記載の発現カセット。
  92. 前記第２のガイド配列に対して３’に位置する第２の３’隣接領域を更に含む、請求項８６～９１のいずれか一項に記載の発現カセット。
  93. 前記第１のガイド配列と前記第１のパッセンジャー配列との間に位置する第１のループ領域を更に含み、前記第１のループ領域が、第１のマイクロＲＮＡループ配列を含む、請求項８６～９２のいずれか一項に記載の発現カセット。
  94. 前記第２のガイド配列と前記第２のパッセンジャー配列との間に位置する第２のループ領域を更に含み、前記第２のループ領域が、第２のマイクロＲＮＡループ配列を含む、請求項８６～９３のいずれか一項に記載の発現カセット。
  95. 前記発現カセットが、配列番号７８５～７８８のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項８６に記載の発現カセット。
  96. 発現カセットであって、５’から３’へ、
    （ａ）第１のプロモーター配列と、
    （ｂ）第１のパッセンジャーヌクレオチド配列に対して５’に位置する第１の５’隣接領域と、
    （ｃ）第１のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、
    （ｉ）第１のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である前記第１のパッセンジャーヌクレオチド配列を含む第１の５’ステム－ループアーム、
    （ｉｉ）第１のループ領域であって、第１のマイクロＲＮＡループ配列を含む、第１のループ領域、
    （ｉｉｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する第１のガイドヌクレオチド配列を含む第１の３’ステム－ループアームを含む、第１のステム－ループ配列と、
    （ｄ）前記第１のガイドヌクレオチド配列に対して３’に位置する第１の３’隣接領域と、
    （ｅ）第２のプロモーター配列と、
    （ｆ）第２のパッセンジャーヌクレオチド配列に対して５’に位置する第２の５’隣接領域と、
    （ｇ）第２のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、
    （ｉ）第２のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である前記第２のパッセンジャーヌクレオチド配列を含む第２の５’ステム－ループアーム、
    （ｉｉ）第２のループ領域であって、第２のマイクロＲＮＡループ配列を含む、第２のループ領域、
    （ｉｉｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する第２のガイドヌクレオチド配列を含む第２の３’ステム－ループアームを含む、第２のステム－ループ配列と、
    （ｈ）前記第２のガイドヌクレオチド配列に対して３’に位置する第２の３’隣接領域と、を含むヌクレオチド配列を含む、発現カセット。
  97. 発現カセットであって、５’から３’へ、
    （ａ）第１のプロモーター配列と、
    （ｂ）第１のパッセンジャーヌクレオチド配列に対して５’に位置する第１の５’隣接領域と、
    （ｃ）第１のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、
    （ｉ）第１のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第１のパッセンジャーヌクレオチド配列を含む第１の５’ステム－ループアーム、
    （ｉｉ）第１のループ領域であって、第１のマイクロＲＮＡループ配列を含む、第１のループ領域、
    （ｉｉｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する第１のガイドヌクレオチド配列を含む第１の３’ステム－ループアームを含む、第１のステム－ループ配列と、
    （ｄ）前記第１のガイドヌクレオチド配列に対して３’に位置する第１の３’隣接領域と、
    （ｅ）第２のプロモーター配列と、
    （ｆ）第２のガイドヌクレオチド配列に対して５’に位置する第２の５’隣接領域と、
    （ｇ）第２のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、
    （ｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するガイドヌクレオチド配列を含む第２の５’ステム－ループアーム、
    （ｉｉ）第２のループ領域であって、第２のマイクロＲＮＡループ配列を含む、第２のループ領域、
    （ｉｉｉ）前記第２のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第２のパッセンジャーヌクレオチド配列を含む第２の３’ステム－ループアームを含む、第２のステム－ループ配列と、
    （ｈ）前記第２のパッセンジャーヌクレオチド配列に対して３’に位置する第２の３’隣接領域と、を含むヌクレオチド配列を含む、発現カセット。
  98. 発現カセットであって、５’から３’へ、
    （ａ）第１のプロモーター配列と、
    （ｂ）第１のガイドヌクレオチド配列に対して５’に位置する第１の５’隣接領域と、
    （ｃ）第１のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、
    （ｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する第１のガイドヌクレオチド配列を含む第１の５’ステム－ループアーム、
    （ｉｉ）第１のループ領域であって、第１のマイクロＲＮＡループ配列を含む、第１のループ領域、
    （ｉｉｉ）前記第１のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第１のパッセンジャーヌクレオチド配列を含む第１の３’ステム－ループアームを含む、第１のステム－ループ配列と、
    （ｄ）前記第１のパッセンジャーヌクレオチド配列に対して３’に位置する第１の３’隣接領域と、
    （ｅ）第２のプロモーター配列と、
    （ｆ）第２のパッセンジャーヌクレオチド配列に対して５’に位置する第２の５’隣接領域と、
    （ｇ）第２のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、
    （ｉ）第２のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第２のパッセンジャーヌクレオチド配列を含む第２の５’ステム－ループアーム、
    （ｉｉ）第２のループ領域であって、第２のマイクロＲＮＡループ配列を含む、第２のループ領域、
    （ｉｉｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する第２のガイドヌクレオチド配列を含む第２の３’ステム－ループアームを含む、第２のステム－ループ配列と、
    （ｈ）前記第２のガイドヌクレオチド配列に対して３’に位置する第２の３’隣接領域と、を含むヌクレオチド配列を含む、発現カセット。
  99. 発現カセットであって、５’から３’へ、
    （ａ）第１のプロモーター配列と、
    （ｂ）第１のガイドヌクレオチド配列に対して５’に位置する第１の５’隣接領域と、
    （ｃ）第１のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、
    （ｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する第１のガイドヌクレオチド配列を含む第１の５’ステム－ループアーム、
    （ｉｉ）第１のループ領域であって、第１のマイクロＲＮＡループ配列を含む、第１のループ領域、
    （ｉｉｉ）前記第１のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第１のパッセンジャーヌクレオチド配列を含む第１の３’ステム－ループアームを含む、第１のステム－ループ配列と、
    （ｄ）前記第１のパッセンジャーヌクレオチド配列に対して３’に位置する第１の３’隣接領域と、
    （ｅ）第２のプロモーター配列と、
    （ｆ）第２のガイドヌクレオチド配列に対して５’に位置する第２の５’隣接領域と、
    （ｇ）第２のステム－ループ配列であって、５’から３’へ、
    （ｉ）表２及び／又は表３に列挙されるガイド配列のうちのいずれか１つに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するガイドヌクレオチド配列を含む第２の５’ステム－ループアーム、
    （ｉｉ）第２のループ領域であって、第２のマイクロＲＮＡループ配列を含む、第２のループ領域、
    （ｉｉｉ）前記第２のガイド配列に対して相補的又は実質的に相補的である第２のパッセンジャーヌクレオチド配列を含む第２の３’ステム－ループアームを含む、第２のステム－ループ配列と、
    （ｈ）前記第２のパッセンジャーヌクレオチド配列に対して３’に位置する第２の３’隣接領域と、を含むヌクレオチド配列を含む、発現カセット。
  100. 前記第１のプロモーター及び／又は前記第２のプロモーターが、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、７ＳＫプロモーター、アポリポタンパク質Ｅ－ヒトアルファ１－アンチトリプシンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ＣＫ８プロモーター、ｍＵ１ａプロモーター、伸長因子１αプロモーター、チロキシン結合グロブリンプロモーター、シナプシンプロモーター、ＲＮＡ結合Ｆｏｘ－１ホモログ３プロモーター、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩプロモーター、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、血小板由来成長因子サブユニットβ、小胞グルタミン酸トランスポータープロモーター、ソマトスタチンプロモーター、神経ペプチドＹプロモーター、血管作動性腸管ペプチドプロモーター、パルブアルブミンプロモーター、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５プロモーター、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６７プロモーター、ドーパミン受容体Ｄ１プロモーター、ドーパミン受容体Ｄ２プロモーター、補体Ｃ１ｑ様２プロモーター、プロオピオメラノコルチンプロモーター、プロスペロホメオボックス１プロモーター、微小管関連タンパク質１Ｂプロモーター、及びチューブリンアルファ１プロモーターからなる群から選択される、請求項８６～９９のいずれか一項に記載の発現カセット。
  101. 前記第１の５’隣接領域及び／又は前記第２の５’隣接領域が、配列番号７５２、７５４、７５６、７５９、７６２、７６５、又は７６８のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項８６～１００のいずれか一項に記載の発現カセット。
  102. 前記第１の３’隣接領域及び／又は前記第２の３’隣接領域が、配列番号７５３、７５５、７５７、７６０、７６３、７６６、又は７６９のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項８６～１０１のいずれか一項に記載の発現カセット。
  103. 前記第１のマイクロＲＮＡループ配列及び／又は前記第２のマイクロＲＮＡループ配列が、ｍｉＲ－３０、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－２１８－１、又はｍｉＲ－１２４－３配列である、請求項８６～１０２のいずれか一項に記載の発現カセット。
  104. 前記マイクロＲＮＡループ配列が、配列番号７５８、７６１、７６４、７６７、又は７７０のうちのいずれか１つの核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１０３に記載の発現カセット。
  105. 前記発現カセットが、前記発現カセットの５’末端上の５’末端逆位反復（ＩＴＲ）配列と、前記発現カセットの３’末端上の３’－ＩＴＲ配列と、を含む、請求項７４～１０４のいずれか一項に記載の発現カセット。
  106. 前記５’－ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列が、ＡＡＶ２の５’－ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列である、請求項１０５に記載の発現カセット。
  107. 前記５’－ＩＴＲ配列が、配列番号７４６又は配列番号７４７の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１０５又は１０６に記載の発現カセット。
  108. 前記３’－ＩＴＲ配列が、核酸配列配列番号７４８、配列番号７４９、又は７８９に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１０５～１０７のいずれか一項に記載の発現カセット。
  109. エンハンサー配列を更に含む、請求項７４～１０８のいずれか一項に記載の発現カセット。
  110. 前記エンハンサー配列が、配列番号７４５の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１０９に記載の発現カセット。
  111. イントロン配列を更に含む、請求項７４～１１０のいずれか一項に記載の発現カセット。
  112. 前記イントロン配列が、配列番号７４３又は配列番号７４４の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１１１に記載の発現カセット。
  113. １つ以上のポリアデニル化シグナルを更に含む、請求項７４～１１２のいずれか一項に記載の発現カセット。
  114. 前記１つ以上のポリアデニル化シグナルが、ウサギベータ－グロビン（ＲＢＧ）ポリアデニル化シグナル又はウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルである、請求項１１３に記載の発現カセット。
  115. 前記ＲＢＧポリアデニル化シグナルが、配列番号７５０、配列番号７５１、又は配列番号７９２の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１１４に記載の発現カセット。
  116. 前記ＢＧＨポリアデニル化シグナルが、配列番号７９３の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１１４に記載の発現カセット。
  117. 前記発現カセットが、請求項６６～７３のいずれか一項に記載のベクターに組み込まれる、請求項７４～１１６のいずれか一項に記載の発現カセット。
  118. 前記発現カセット配列が、配列番号７８５、配列番号７８７、又は配列番号７８８の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項９６に記載の発現カセット。
  119. 前記発現カセットが、配列番号７８６の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む、請求項９８に記載の発現カセット。
  120. スタッファー配列を更に含む、請求項７４～１１９のいずれか一項に記載の発現カセット。
  121. 前記スタッファー配列が、前記発現カセットの３’末端に配置されている、請求項１２０に記載の発現カセット。
  122. 前記スタッファー配列が、配列番号８１５又は配列番号８１６の核酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し、任意選択的に、前記スタッファー配列が、配列番号８１５又は配列番号８１６の核酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、任意選択的に、前記スタッファー配列が、配列番号８１５又は配列番号８１６の核酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、任意選択的に、前記スタッファー配列が、配列番号８１５又は配列番号８１６の核酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有し、任意選択的に、前記スタッファー配列が、配列番号８１５又は配列番号８１６の核酸配列を有する、請求項１２０又は１２１に記載の発現カセット。
  123. 細胞においてＧｒｉｋ２発現を阻害する方法であって、前記細胞を、少なくとも１つの請求項１～６５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項６６～７３のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項７４～１２２のいずれか一項に記載の発現カセットと接触させることを含む、方法。
  124. 前記ポリヌクレオチドが、Ｇｒｉｋ２ ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズし、前記細胞においてＧｒｉｋ２の発現を阻害するか、又は減少させる、請求項１２３に記載の方法。
  125. 前記方法が、前記細胞におけるＧｌｕｋ２タンパク質のレベルを減少させる、請求項１２３又は１２４に記載の方法。
  126. 前記方法が、前記細胞におけるＧｌｕＫ２タンパク質のレベルを、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、又は少なくとも７５％減少させる、請求項１２５に記載の方法。
  127. 前記細胞が、ニューロンである、請求項１２３～１２６のいずれか一項に記載の方法。
  128. 前記ニューロンが、海馬ニューロンである、請求項１２７に記載の方法。
  129. 前記海馬ニューロンが、ＤＧＣである、請求項１２８に記載の方法。
  130. 前記ＤＧＣが、異常な再発性苔状線維軸索を含む、請求項１２９に記載の方法。
  131. 障害を治療又は緩和することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記対象に、少なくとも１つの請求項１～６５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項６６～７３のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項７４～１２２のいずれか一項に記載の発現カセットを投与することを含む、方法。
  132. 前記障害が、てんかんである、請求項１３１に記載の方法。
  133. 前記てんかんが、側頭葉てんかん（ＴＬＥ）、慢性てんかん、及び／又は難治性てんかんである、請求項１３２に記載の方法。
  134. 前記てんかんが、ＴＬＥである、請求項１３３に記載の方法。
  135. 前記ＴＬＥが、外側ＴＬＥ（ｌＴＬＥ）である、請求項１３４に記載の方法。
  136. 前記ＴＬＥが、内側ＴＬＥ（ｍＴＬＥ）である、請求項１３４に記載の方法。
  137. 前記対象が、ヒトである、請求項１３１～１３６のいずれか一項に記載の方法。
  138. 請求項１～６５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項６６～７３のいずれか一項に記載のベクター、又は請求項７４～１２２のいずれか一項に記載の発現カセットと、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
  139. 請求項１３８に記載の薬学的組成物と、添付文書と、を含む、キット。
  140. 前記添付文書が、請求項１３１～１３７のいずれか一項に記載の方法において前記薬学的組成物を使用するための説明書を含む、請求項１３９に記載のキット。
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