JP2018019683A - 対象中の治療剤の活性を判定するアッセイおよび方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】対象に投与される治療遺伝子を含む組成物の活性を判定する方法及びアッセイの提供。【解決手段】対象中のｉＲＮＡ薬剤の活性を判定する方法において：ｉ）組織中で発現されるＲＮＡを標的化するｉＲＮＡ薬剤を投与された対象から採取された、エキソソームを含む生物試料を、ＲＮＡ収量を増加させる試薬と接触させること、ｉｉ）前記生物試料から前記標的ＲＮＡ又はその開裂産物を含むペレットを得ること、ｉｉｉ）前記ペレットからＲＮＡを単離すること、及びｉｖ）前記単離ＲＮＡ中の前記標的ＲＮＡ又はその開裂産物のレベルを検出することを含み、前記エキソソームを、前記標的ＲＮＡ又は開裂産物のレベルの検出前に前記生物試料からエキソソーム結合分子を使用して精製せず、かつ、参照試料と比較した前記標的ＲＮＡのレベルの変化又は前記開裂産物のレベルの増加は、前記ｉＲＮＡ薬剤が前記対象中で活性であることを示す、方法。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年６月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／４９９，６６４号明細書、２０１１年７月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／５０７，０９３号明細書、２０１１年９月１日に出願された米国仮特許出願第６１／５３０，１１２号明細書、および２０１１年９月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／５３３，７３７号明細書の優先権を主張する。これらの先行出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
本発明は、対象中の治療剤の活性を判定する方法に関する。
二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として公知の高度に保存された調節機序において遺伝子発現を遮断することが示されている。ｄｓＲＮＡは、種々の生物、例として蠕虫（例えば、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ））、植物、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、および哺乳動物中の標的ＲＮＡを分解することも示されている。この天然機序は、目下、異常または不所望な遺伝子の調節により引き起こされる障害を治療するための新たなクラスの医薬剤の開発のための焦点となっている。ＲＮＡｉは、疾患の治療において標的遺伝子の発現を活性化させるために使用することもできる。
本明細書において、対象中の核酸、例えば、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）の活性を判定するための方法、キットおよび組成物が提供される。このような方法は、治療核酸、例えば、ＲＮＡエフェクター分子（例えば、ｄｓＲＮＡ）またはＤＮＡエフェクター分子（例えば、遺伝子産物をコードするウイルスベクター）の効力の判定、または核酸、もしくは核酸活性の産物の検出による対象の治療のモニタリングに有用である。本明細書において提供される方法は、部分的には、標的ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ開裂産物を、ｄｓＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングの部位から離隔した生物試料中で検出することができるという発見に基づく。例えば、ｄｓＲＮＡは、肝臓中の標的ｍＲＮＡの遺伝子サイレンシングを媒介し得、標的ｍＲＮＡ（またはその開裂産物）のレベルを血清中で検出および／または定量することができる。血清中のｍＲＮＡレベルをｄｓＲＮＡ投与の前後に検出することによりｄｓＲＮＡの活性を評価またはモニタリングすることができる。遺伝子治療送達法（例えば、アデノウイルスまたはレトロウイルスを使用するウイルス送達、ネイキッドＤＮＡ送達など）を使用して送達された１つ以上の外因性遺伝子（例えば、トランス遺伝子、例えば、治療トランス遺伝子）の発現のレベルを判定する方法も提供される。このような方法は、外因性遺伝子発現の部位から離隔した生物試料中、例えば、血清または尿中の治療または外因性遺伝子のｍＲＮＡを計測することを含む。
本発明において挙げられる一態様は、対象の組織中の遺伝子の活性についてアッセイする方法において、（ｉ）対象から生物試料を採取すること（生物試料は、組織から離隔しており、生物試料は、エキソソームを含有する）、および（ｉｉ）生物試料中のＲＮＡのレベルを検出すること（ＲＮＡは、対象の組織中の遺伝子から発現され、エキソソームを、生物試料中のＲＮＡのレベルの検出前に生物試料から精製しない）を含み、参照試料と比較したＲＮＡ、または標的ＲＮＡの下流標的のＲＮＡのレベルの変化は、遺伝子の活性の変化を示し、遺伝子の活性の変化は、疾患進行もしくは縮退、対象に対するモジュレーターの効果、または対象における疾患リスクの増加もしくは減少を示す方法に関する。
本発明において挙げられる一態様は、対象中の治療核酸、例えば、ＲＮＡもしくはＤＮＡエフェクター分子またはｉＲＮＡ薬剤の活性を判定する方法において、ｉ）生物試料から離隔した組織中の核酸を標的化または発現する治療核酸を投与された対象から生物試料を採取すること（生物試料は、エキソソームを含有する）、およびｉｉ）対象の生物試料中の標的化もしくは発現される核酸、または生物試料中のその産物、例えば、その開裂産物のレベルを検出することを含み、核酸の存在、または参照試料と比較した核酸の産物のレベルの変化は、治療核酸が対象中で有効であることを示す方法に関する。一実施形態において、エキソソームは、標的化または発現される核酸のレベルの検出前に生物試料から精製しない。治療核酸は、例えば、ｄｓＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ；マイクロＲＮＡ、例えば、マイクロＲＮＡ模倣物；または遺伝子置換治療剤であり得る。
一実施形態において、本方法は、対象に投与される治療核酸の用量を増加させることをさらに含み、別の実施形態において、本方法は、対象に投与される治療核酸の用量を増加または減少させることをさらに含む。
一実施形態において、生物試料は、標的化または発現される核酸のレベルの検出前に遠心分離を受けている。遠心分離は、高速遠心分離、例えば、１０００００ｇから１５００００ｇ、例えば、１１００００ｇから１４００００ｇにおけるものであり得る。
一実施形態において、治療核酸は、ＲＮＡエフェクター分子、例えば、アンタゴｍｉｒまたはｍｉＲＮＡ模倣物であり、標的ＲＮＡは、ｍＲ−１２２、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９２、またはｍｉＲ−１９４である。他の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、ｄｓＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、プロモーター指向性ＲＮＡ（ｐｄＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ＲＮＡ活性化分子、発現干渉ＲＮＡ（ｅｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、デコイＲＮＡまたはアプタマーである。
一実施形態において、治療核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
別の実施形態において、治療核酸は、外因性ＤＮＡ分子、発現ＤＮＡ、ドミナントネガティブ突然変異体、改変遺伝子産物、突然変異遺伝子産物、生体異物遺伝子、またはトランス遺伝子を発現するＤＮＡエフェクター分子である。一実施形態において、治療核酸は、ウイルスベクターまたはプラスミドＤＮＡを含むＤＮＡエフェクター分子（例えば、ネイキッドＤＮＡ）である。ウイルスベクターは、例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルスベクターであり得る。一実施形態において、治療核酸（例えば、ネイキッドＤＮＡ）は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、マグネトフェクション、直接注射、または脂質複合体を使用して投与する。
ＤＮＡエフェクター分子は、誘導性または構成的に活性なプロモーターを含み得る。一部の実施形態において、ＤＮＡエフェクター分子は、対象のゲノム中に、例えば、対象のゲノム中にランダムに挿入し、または相同組換えを使用して特定部位に標的化する。
一態様において、本発明は、対象中のｉＲＮＡ薬剤の活性を判定する方法において、ｉ）生物試料から離隔した組織中のＲＮＡを標的化するｉＲＮＡ薬剤を投与された対象から生物試料を採取すること（試料は、エキソソームを含有する）、およびｉｉ）生物試料中の標的ＲＮＡまたはその開裂産物のレベルを検出すること（エキソソームを、標的ＲＮＡまたはその開裂産物のレベルの検出前に生物試料から精製しない）を含み、参照試料と比較した標的ＲＮＡのレベルの変化または開裂産物のレベルの増加は、ｉＲＮＡ薬剤が対象中で活性であることを示す方法を挙げる。
一実施形態において、本方法は、ｉＲＮＡ薬剤が対象中で不活性である判定に基づき対象に投与されるｉＲＮＡ薬剤の用量を増加させることをさらに含み、別の実施形態において、本方法は、ｉＲＮＡ薬剤が対象中で活性である判定に基づき対象に投与されるｉＲＮＡ薬剤の用量を増加または減少させることをさらに含む。
一実施形態において、生物試料は、エキソソームを含み、一部の実施形態において、生物試料中のＲＮＡの分画は、エキソソーム中に局在する。エキソソームは、標的ＲＮＡまたはその開裂産物の検出前に精製しなくてよい。一部の実施形態、例えば、ＲＮＡ開裂産物をアッセイする実施形態において、エキソソームは、開裂産物の検出前に生物試料から単離する。
一実施形態において、生物試料は、標的ＲＮＡまたは開裂産物のレベルの検出前に遠心分離を受けている。遠心分離は、１０００００ｇから１５００００ｇ、例えば、１１００００ｇから１４００００ｇにおけるものであり得る。
別の実施形態において、生物試料は、微小胞を含み、一部の実施形態において、生物試料中のＲＮＡの分画は、微小胞中に局在する。微小胞は、標的ＲＮＡまたはその開裂産物の検出前に生物試料から精製してもしなくてもよい。
別の実施形態において、生物試料は、細胞外小胞（例えば、エキソソームおよび微小胞）を含み、一部の実施形態において、生物試料中のＲＮＡの分画は、細胞外小胞中に局在する。細胞外小胞は、標的ＲＮＡまたはその開裂産物の検出前に精製してもしなくてもよい。
一部の実施形態において、対象は、組織、例えば、肝臓、腎臓、脳、脊髄、脈絡叢、末梢ニューロンもしくは神経、筋肉、内皮細胞、心臓、免疫細胞、皮膚、眼、肺、胃、小腸もしくは大腸、結腸、副腎、腫瘍、癌病巣、または脾臓中のＲＮＡを標的化するｉＲＮＡ薬剤により治療する。一実施形態において、ｉＲＮＡ薬剤は、肝臓中のＲＮＡを標的化する。ｉＲＮＡ薬剤を投与された対象から得られる生物試料は、例えば、体液、例えば、血液、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、羊水、唾液、母乳、気管支肺胞洗浄液、滑液、または悪性腹水からのものであり得る。血液試料は、例えば、全血試料（赤血球および白血球、ならびに無細胞タンパク質および核酸を含む）、または血漿もしくは血清試料であり得る。
生物試料から単離される標的ＲＮＡまたはＲＮＡ開裂産物は、当分野において公知の方法により、例えば、５’ＲＡＣＥ、ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）、または逆転写連結型ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により計測することができる。
一部の実施形態において、ｉＲＮＡ薬剤は、中枢神経系（ＣＮＳ）に投与する。例えば、ＣＮＳにｉＲＮＡを投与される対象は、神経疾患、例えば、ハンチントン病、パーキンソン病、またはアルツハイマー病などを有し得る。例えば、一実施形態において、対象、例えば、患者は、ハンチントン病を有し、標的ＲＮＡは、ハンチンチン（Ｈｔｔ）ＲＮＡである。別の実施形態において、対象、例えば、患者は、パーキンソン病を有し、標的ＲＮＡは、アルファ−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）ＲＮＡである。別の実施形態において、対象、例えば、患者は、軟髄膜／中枢神経系形態のトランスチレチン（ＴＴＲ）アミロイドーシスを有し、標的ＲＮＡは、ＴＴＲＲＮＡである。
治療核酸、例えば、ＲＮＡもしくはＤＮＡエフェクター分子またはｉＲＮＡ薬剤は、種々の方法により、例えば、直接注射、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、吸入、局所、脳内、例として、実質内、脳室内、硬膜外、鞘内、動脈内、硝子体内、皮内、経口、または心臓内送達により対象に投与することができる。治療すべき生物が哺乳動物、例えば、ヒトである場合、組成物は、当分野において公知の任意の手段、例として、限定されるものではないが、経口、腹腔内、または非経口経路、例として、頭蓋内（例えば、脳室内、実質内および鞘内）、硬膜外、筋肉内、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアゾール）、鼻腔、直腸、膣、および局所（例として、バッカルおよび舌下）投与により投与することができる。
一部の実施形態において、治療核酸は、末梢投与により投与し、他の実施形態において、治療核酸は、ＣＮＳ中に直接投与する。一部の実施形態において、本明細書に記載の医薬組成物は、静脈内、鞘内または頭蓋内注入または注射により投与する。一実施形態において、治療核酸は、静脈内送達により投与し、別の実施形態において、治療核酸は、頭蓋内送達により投与する。
本明細書に開示の方法において使用されるｉＲＮＡ薬剤は、任意のＲＮＡ、例えば、任意のｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを標的化し得る。例えば、標的ＲＮＡは、前駆タンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１７４９３６）、トランスチレチン（ＴＴＲ）（ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＮＭ＿０００３７１．３）、血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０２５３６６．２）、キネシン様タンパク質（ＫＳＰ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４５２３）、耳下腺プロリンリッチ唾液タンパク質Ｐｃ（ＰＣＳ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２０８７２．１）、アンギオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１４４９５．２）、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ（ＡｐｏＣ３）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００４０．１）、ヘプシジン（ＳＬＣ１１Ａ２）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１７４１２９．１）、ｅｇｌ９ホモログ（ＥＧＬＮ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ１１１０５７．１）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＫ３６７３８４．１）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ６０２８１８．１）、ポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５０３０．３）、アルファ−アンチトリプシン（ＡＡＴ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００２９５．４）、活性化タンパク質Ｃ、膜貫通セリンプロテアーゼ６（ＴＭＰＲＳＳ６）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１５３６０９．２）、クルッペル様因子４（ＫＬＦ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ６５８２４１．１）、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２２８９３．３）、ｐ５３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１２６１１４．１）、カスパーゼ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２２４．４）、β−カテニン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１９０４．３）、プロテインキナーゼＮ３（ＰＫＮ３）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１３３５５．３）、ハンチンチン（ＨＴＴ）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２１１１．６）またはアルファシヌクレイン（ＳＮＣＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００７３０８．２）であり得る。
ｉＲＮＡ薬剤を投与された対象、例えば、ヒトから得られる生物試料は、対象が治療核酸による治療を受けた後、例えば、対象が治療核酸による治療を受けてから３時間から２８日後、例えば、対象がｉＲＮＡ薬剤による治療を受けてから３時間もしくは６、１２、２４、３６、４８、７２、９６、１２０または１６８時間後に対象から単離することができる。
一実施形態において、標的ＲＮＡは、肝臓中で発現され、標的ＲＮＡレベルは、生物試料中の別の肝臓タンパク質、例えば、第ＶＩＩ因子、アルブミン、またはアルファ−アンチトリプシン（ＡＡＴ）などのＲＮＡのレベルに正規化する。あるいは、標的ＲＮＡレベルは、１８ｓＲＮＡ、ＧＡＰＤＨ ＲＮＡまたはβ−アクチンＲＮＡに正規化する。別の実施形態において、標的ＲＮＡは、平滑筋細胞中で発現され、標的ＲＮＡは、別の平滑筋細胞関連タンパク質、例えば、Ａｃｔａ２のＲＮＡのレベルに正規化する。別の実施形態において、標的ＲＮＡは、中枢神経系中で発現され、標的ＲＮＡは、別の中枢神経系タンパク質のＲＮＡのレベルに正規化する。
ある実施形態において、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡである。
一態様において、本発明は、対象中のｉＲＮＡ薬剤の活性を判定する方法において、アッセイは、（ｉ）生物試料から離隔した組織中のＲＮＡを標的化するｉＲＮＡ薬剤を投与された対象から生物試料を採取すること、および（ｉｉ）生物試料中の標的ＲＮＡの開裂産物のレベルを検出することを含み、参照試料と比較した開裂産物のレベルの増加は、ｉＲＮＡ薬剤が対象中で活性であることを示し、参照試料と比較した開裂産物のレベルの減少または静止は、ｉＲＮＡ薬剤が対象中で不活性であることを示す方法を挙げる。開裂産物は、ｉＲＮＡ薬剤によるＲＮＡ干渉の結果であり得る。
一実施形態において、本方法は、ｉＲＮＡ薬剤が対象中で不活性である判定に基づき対象に投与されるｉＲＮＡ薬剤の用量を増加させることをさらに含み、別の実施形態において、本方法は、ｉＲＮＡ薬剤が対象中で活性である判定に基づき対象に投与されるｉＲＮＡ薬剤の用量を増加または減少させることをさらに含む。
一実施形態において、生物試料は、標的ＲＮＡまたは開裂産物のレベルの検出前に遠心分離を受けている。遠心分離は、高速遠心分離、例えば、１０００００ｇから１５００００ｇ、例えば、１１００００ｇから１４００００ｇにおけるものであり得る。
一実施形態において、生物試料は、エキソソーム、微小胞またはそれらの組合せを含有し、ある実施形態において、生物試料中の標的ＲＮＡ開裂産物の分画は、エキソソームおよび／または微小胞中に存在する。一部の実施形態において、エキソソームまたは微小胞は、開裂産物の検出前に精製し、他の実施形態において、エキソソームまたは微小胞は、開裂産物の検出前に精製しない。
一実施形態において、組織、例えば、肝臓に由来するエキソソームは、開裂産物の検出前に、例えば、組織特異的マーカーにより選択する。
一実施形態において、開裂産物は、５’ＲＡＣＥ、ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイ、または逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により検出する。
一実施形態において、生物試料は、血液またはＣＳＦであり、ある実施形態において、ｉＲＮＡ薬剤は、肝臓またはＣＮＳ中で発現されるＲＮＡを標的化する。
一態様において、本発明は、対象中のｉＲＮＡ薬剤の活性を判定するアッセイにおいて、（ｉ）生物試料から離隔した組織中のＲＮＡを標的化するｉＲＮＡ薬剤を投与された対象からの生物試料を、標的ＲＮＡまたはその開裂産物の量を検出するためのプローブと接触させること（生物試料は、エキソソームを含有する）、および（ｉｉ）生物試料中の標的ＲＮＡまたはその開裂産物の量を検出すること（エキソソームを、標的ＲＮＡまたはその開裂産物の量の計測前に生物試料から精製しない）、（ｉｉｉ）標的ＲＮＡまたはその開裂産物の量を参照試料と比較することを含み、参照試料と比較した標的ＲＮＡの量の減少または開裂産物の量の増加は、対象中のｉＲＮＡ薬剤活性を示すアッセイを挙げる。開裂産物は、ｉＲＮＡ薬剤によるＲＮＡ干渉の結果であり得る。
一実施形態において、生物試料は、血液またはＣＳＦであり、ある実施形態において、ｉＲＮＡ薬剤は、肝臓またはＣＮＳ中で発現されるＲＮＡを標的化する。
一実施形態において、本方法は、ｉＲＮＡ薬剤が対象中で不活性である判定に基づき対象に投与されるｉＲＮＡ薬剤の用量を増加させることをさらに含み、別の実施形態において、本方法は、ｉＲＮＡが対象中で活性である判定に基づき対象に投与されるｉＲＮＡ薬剤の用量を増加または減少させることをさらに含む。
一実施形態において、生物試料は、標的ＲＮＡまたは開裂産物のレベルの検出前に遠心分離を受けている。遠心分離は、１０００００ｇから１５００００ｇ、例えば、１１００００ｇから１４００００ｇにおけるものであり得る。
一態様において、本発明は、対象中のｉＲＮＡ薬剤の活性を判定するアッセイにおいて、（ｉ）ｉＲＮＡ薬剤を投与された対象からの生物試料を、標的ＲＮＡの開裂産物の量を検出するためのプローブと接触させること（生物試料は、エキソソームを含有する）、および（ｉｉ）生物試料中の開裂産物の量を検出すること、および（ｉｉｉ）開裂産物の量を参照試料と比較することを含み、参照試料と比較した開裂産物の量の変化は、対象中のｉＲＮＡ薬剤活性を示すアッセイを挙げる。開裂産物は、ｉＲＮＡ薬剤によるＲＮＡ干渉の結果であり得る。参照試料は、ｉＲＮＡ薬剤により標的化されないＲＮＡ、例えば、１８ｓＲＮＡまたはＧＡＤＰＨＲＮＡであり得る。
一実施形態において、生物試料は、血液またはＣＳＦであり、ある実施形態において、ｉＲＮＡ薬剤は、肝臓またはＣＮＳ中で発現されるＲＮＡを標的化する。
一実施形態において、本方法は、ｉＲＮＡ薬剤が対象中で不活性である判定に基づき対象に投与されるｉＲＮＡ薬剤の用量を増加させることをさらに含み、別の実施形態において、本方法は、ｉＲＮＡ薬剤が対象中で活性である判定に基づき対象に投与されるｉＲＮＡ薬剤の用量を増加または減少させることをさらに含む。
一実施形態において、生物試料は、標的ＲＮＡまたは開裂産物のレベルの検出前に遠心分離を受けている。遠心分離は、１０００００ｇから１５００００ｇ、例えば、１１００００ｇから１４００００ｇにおけるものであり得る。
一態様において、本発明は、対象中のモジュレーターの活性を判定する方法において、アッセイは、（ｉ）生物試料から離隔した組織中のタンパク質またはＲＮＡを標的化するモジュレーターを投与された対象から生物試料を採取すること（標的タンパク質またはＲＮＡを、前駆タンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、トランスチレチン（ＴＴＲ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、キネシン様タンパク質（ＫＳＰ）、耳下腺プロリンリッチ唾液タンパク質Ｐｃ（ＰＣＳ）、アンギオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）、ヘプシジン、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ｅｇｌ９ホモログ（ＥＧＬＮ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ）、アルファ−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）、膜貫通セリンプロテアーゼ６（ＴＭＰＲＳＳ６）、クルッペル様因子４（ＫＬＦ）、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）、ｐ５３、カスパーゼ２、β−カテニン、プロテインキナーゼＮ３（ＰＫＮ３）、ハンチンチン（ＨＴＴ）、およびアルファシヌクレイン（ＳＮＣＡ）からなる群から選択し、生物試料は、エキソソームを含む）、および（ｉｉ）生物試料中の標的ＲＮＡ、標的ＲＮＡの下流のＲＮＡまたは標的ＲＮＡの開裂産物のレベルを検出すること（エキソソームを、標的ＲＮＡ、下流ＲＮＡまたは標的ＲＮＡの開裂産物の量の検出前に生物試料から精製しない）を含み、参照試料と比較した標的ＲＮＡ、標的ＲＮＡの下流のＲＮＡまたは標的ＲＮＡの開裂産物のレベルの変化の検出は、モジュレーターが対象中で活性であることを示す方法を挙げる。
一実施形態において、生物試料は、血液またはＣＳＦであり、ある実施形態において、ｉＲＮＡ薬剤は、肝臓またはＣＮＳ中で発現されるＲＮＡを標的化する。
一実施形態において、本方法は、モジュレーターが対象中で不活性である判定に基づき対象に投与されるモジュレーターの用量を増加させることをさらに含み、別の実施形態において、本方法は、モジュレーターが対象中で活性である判定に基づき対象に投与されるモジュレーターの用量を増加または減少させることをさらに含む。
一実施形態において、生物試料は、標的ＲＮＡまたは開裂産物のレベルの検出前に遠心分離を受けている。遠心分離は、１０００００ｇから１５００００ｇ、例えば、１１００００ｇから１４００００ｇにおけるものであり得る。
一態様において、本発明は、対象中のモジュレーターの活性を判定する方法において、アッセイは、（ｉ）生物試料から離隔した組織中のタンパク質またはＲＮＡを標的化するモジュレーターを投与された対象から生物試料を採取すること（標的タンパク質またはＲＮＡを、前駆タンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、トランスチレチン（ＴＴＲ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、キネシン様タンパク質（ＫＳＰ）、耳下腺プロリンリッチ唾液タンパク質Ｐｃ（ＰＣＳ）、アンギオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）、ヘプシジン、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、ｅｇｌ９ホモログ（ＥＧＬＮ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ）、アルファ−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）、膜貫通セリンプロテアーゼ６（ＴＭＰＲＳＳ６）、クルッペル様因子４（ＫＬＦ）、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）、ｐ５３、カスパーゼ２、β−カテニン、プロテインキナーゼＮ３（ＰＫＮ３）、ハンチンチン（ＨＴＴ）、およびアルファシヌクレイン（ＳＮＣＡ）からなる群から選択する）、および（ｉｉ）生物試料中の標的ＲＮＡの開裂産物の量を検出することを含み、参照試料と比較した標的ＲＮＡの開裂産物の量の変化の検出は、モジュレーターが対象中で活性であることを示す方法を挙げる。
一実施形態において、生物試料は、血液またはＣＳＦであり、ある実施形態において、ｉＲＮＡ薬剤は、肝臓またはＣＮＳ中で発現されるＲＮＡを標的化する。
一実施形態において、本方法は、モジュレーターが対象中で不活性である判定に基づき対象に投与されるモジュレーターの用量を増加させることをさらに含み、別の実施形態において、本方法は、モジュレーターが対象中で活性である判定に基づき対象に投与されるモジュレーターの用量を増加または減少させることをさらに含む。
一実施形態において、生物試料は、開裂産物の量の検出前に遠心分離を受けている。遠心分離は、１０００００ｇから１５００００ｇ、例えば、１１００００ｇから１４００００ｇにおけるものであり得る。
一態様において、対象中の治療核酸の活性を判定するアッセイが提供される。１つのそのようなアッセイは、例えば：ｉ）治療核酸を投与された対象から得られた生物試料を、核酸の活性を検出するためのプローブと接触させること；ｉｉ）活性レベルを計測すること；およびｉｉｉ）活性レベルを参照試料において観察された活性レベルと比較することを含む。活性レベルの計測値は、対象中の核酸の活性を示す。プローブは、例えば、標的ＲＮＡにハイブリダイズし、場合により、それを増幅させるプライマーもしくはプライマーのセットであり得、またはプローブは、例えば、標的ＲＮＡまたは遺伝子治療物のタンパク質産物を計測する抗体であり得る。
一実施形態において、治療核酸は、ｉＲＮＡ薬剤であり、活性レベルは、生物試料中の標的ＲＮＡの量、または生物試料中の標的ＲＮＡ開裂産物の量を計測することによりアッセイする。別の実施形態において、治療核酸は、アンタゴｍｉｒであり、アンタゴｍｉｒの活性レベルは、生物試料中の標的ｍｉＲＮＡの量を計測することによりアッセイする。さらに別の実施形態において、治療核酸は、マイクロＲＮＡ模倣物であり、ｍｉＲＮＡ模倣物の活性レベルは、生物試料中の標的ＲＮＡの量を計測することによりアッセイする。別の実施形態において、治療核酸は、遺伝子治療物であり、遺伝子治療物の活性は、生物試料中の遺伝子産物、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質産物の発現を検出することによりアッセイする。
例えば、対象中のｉＲＮＡ薬剤の活性を判定するアッセイが提供される。１つのそのようなアッセイは、例えば、ｉ）ｉＲＮＡ薬剤を投与された対象から得られた生物試料を、標的ＲＮＡの量を検出するためのプローブと接触させること、ｉｉ）標的ＲＮＡまたはその開裂産物の量を計測すること、およびｉｉｉ）工程（ｉｉ）において計測された標的ＲＮＡまたはその開裂産物の量を、参照試料と比較することを含む。参照試料と比較した標的ＲＮＡの量の変化または開裂産物の量の増加は、対象中のｉＲＮＡ薬剤活性を示す。
本明細書において、対象中のモジュレーターの活性を判定する方法も提供される。１つのそのような方法は、例えば、ｉ）モジュレーター、例えば、組織中のタンパク質またはＲＮＡを標的化するモジュレーターを投与された対象からの生物試料を提供すること（組織は、生物試料から離隔している）、およびｉｉ）生物試料中の標的ＲＮＡもしくはその開裂産物、または標的ＲＮＡによりコードされるタンパク質の下流標的のＲＮＡのレベルを検出することを含む。参照試料と比較した標的ＲＮＡもしくはその開裂産物、または標的ＲＮＡによりコードされるタンパク質の下流標的のＲＮＡのレベルの変化は、モジュレーターが対象中で活性であることを示す。標的ＲＮＡは、例えば、前駆タンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、トランスチレチン（ＴＴＲ）、血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦ）、キネシン様タンパク質（ＫＳＰ）、耳下腺プロリンリッチ唾液タンパク質Ｐｃ（ＰＣＳ）、ヘプシジン、ｅｇｌ９ホモログ（ＥＧＬＮ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ）、アルファ−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）、膜貫通セリンプロテアーゼ６（ＴＭＰＲＳＳ６）、クルッペル様因子４（ＫＬＦ）、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）、ｐ５３、カスパーゼ２、β−カテニン、プロテインキナーゼＮ３（ＰＫＮ３）、ハンチンチン（ＨＴＴ）、およびシヌクレイン（ＳＮＣＡ）であり得る。
モジュレーターは、タンパク質、またはタンパク質を発現するＲＮＡを標的化し得る。モジュレーターは、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルにおいて所望のタンパク質の発現を阻害し、または活性化させ得る。モジュレーターは、例えば、小分子、タンパク質、ペプチド、抗体、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ断片、アプタマー、ｄｓＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アンタゴｍｉｒ、マイクロＲＮＡ模倣物または遺伝子治療物であり得る。
本明細書において提供される別の態様は、標的ＲＮＡを検出する方法において、例えば：ｉ）モジュレーターを投与された対象からの生物試料を提供すること、およびｉｉ）生物試料中の標的ＲＮＡまたはその開裂産物のレベルを検出することを含む方法である。参照試料と比較した標的ＲＮＡ、もしくはその開裂産物、または標的ＲＮＡによりコードされるタンパク質の下流標的のＲＮＡのレベルの変化は、モジュレーターが対象中で活性であることを示す。標的は、例えば、前駆タンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、トランスチレチン（ＴＴＲ）、血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦ）、キネシン様タンパク質（ＫＳＰ）、耳下腺プロリンリッチ唾液タンパク質Ｐｃ（ＰＣＳ）、ヘプシジン（ＳＬＣ１１Ａ２）、ｅｇｌ９ホモログ（ＥＧＬＮ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ）、アルファ−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）、膜貫通セリンプロテアーゼ６（ＴＭＰＲＳＳ６）、クルッペル様因子４（ＫＬＦ）、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）、ｐ５３、カスパーゼ２、β−カテニン、プロテインキナーゼＮ３（ＰＫＮ３）ハンチンチン（ＨＴＴ）、またはシヌクレイン（ＳＮＣＡ）であり得る。
本明細書において、ｉＲＮＡ薬剤を投与された対象からのエキソソームリッチ生物試料を含む組成物も提供される。エキソソームは、例えば、ｉＲＮＡ薬剤の活性または標的ｍＲＮＡから生じる開裂産物を含有し得る。
本明細書に記載の方法を実施するためのキットも提供される。一実施形態において、キットは、対象の生物試料中の標的ＲＮＡまたはその開裂産物を検出するアッセイを実施するための１つ以上のプライマーおよび少なくとも１つの追加の試薬を含む。標的ＲＮＡは、例えば、治療剤がｄｓＲＮＡもしくは遺伝子治療物もしくはｍｉＲＮＡ模倣物である場合、ｍＲＮＡであり得、または標的ＲＮＡは、例えば、治療ＲＮＡがアンタゴｍｉｒである場合、ｍｉＲＮＡであり得る。
キットは、使用説明書をさらに含み得、説明書は、対象がｉＲＮＡ薬剤を投与されていることを要求し得る。
別の実施形態において、キットは、対象からの生物試料からＲＮＡまたは開裂産物を単離するための試薬をさらに含む。キットは、カラム、ビーズ、および１つ以上の緩衝液または試薬も含み得る。１つ以上のプライマー、例えば、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズするプライマーをキットに含めることもできる。プライマーは、逆転写のためのオリゴ−ｄＴプライマーまたは遺伝子特異的プライマーまたはランダムヘキサマーならびに場合によりＰＣＲのためのフォワードおよびリバースプライマーを含み得る。一実施形態において、１つ以上のプライマーは、５’ＲＡＣＥ用である。
別の実施形態において、キットは、ＲＮＡ収量を増加させるための１つ以上の試薬、例えば、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）または酢酸ナトリウムを含む。ＬｉＣｌは、使用準備済の濃度において、例えば、０．１から５Ｍ、例えば、１Ｍの濃度において含めることができ、またはＬｉＣｌは、濃縮形態で提供することができる。別の実施形態において、ＲＮＡまたは開裂産物を単離するための試薬は、ＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬、クロロホルム、フェノール／クロロホルム、またはそれらの組合せである。キットは、ＲＮＡの沈殿を向上させるための試薬、例えば、グリコーゲンまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）も含み得る。一実施形態において、キットは、ＲＮアーゼ活性を阻害する試薬、例えば、ＲＮアーゼインヒビターまたはＥＤＴＡを含む。一部の実施形態において、キットは、対象から生物試料を単離するための１つ以上のツールを含む。キットは、生物試料からのＲＮＡ収量を増加させるためのいくつかの試薬（洗浄剤）を含み得る。
一実施形態において、キットは、例えば、遺伝子治療物またはｄｓＲＮＡの活性をモニタリングするための抗体、および／または抗体検出試薬を含む。
一実施形態において、阻害ＲＮＡエフェクター分子の投与は、疾患の少なくとも１つの症状を少なくとも５％だけ、例えば、少なくとも１０％だけ、少なくとも１５％だけ、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、または少なくとも６０％以上だけ低減させる。一部の実施形態において、治療すべき疾患の少なくとも１つの症状は、治療前レベルと比較して少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、または少なくとも６０％以上だけ減少される。別の実施形態において、疾患の少なくとも１つの症状の減少は、少なくとも５、１０、２０、３０、または４０日以上維持される。
一実施形態において、本明細書に記載のｉＲＮＡは、野生型標的ＲＮＡ転写物を標的化し、別の実施形態において、ｉＲＮＡは、突然変異体転写物を標的化する。例えば、ｉＲＮＡ薬剤は、多型バリアント、例えば、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を標的化し得る。別の実施形態において、ｉＲＮＡ標的は、野生型および突然変異体転写物の両方を標的化する。さらに別の実施形態において、ｉＲＮＡは、転写物バリアントを標的化する。
一実施形態において、本発明において挙げられるｉＲＮＡは、標的ＲＮＡ転写物の非コード領域、例えば、５’または３’非翻訳領域を標的化する。
別の態様において、実施形態は、生物、一般に、ヒト対象中の標的遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物を含む。組成物は、典型的には、本明細書に記載のｉＲＮＡの１つ以上および薬学的に許容可能な担体または送達ビヒクルを含む。一実施形態において、組成物は、障害の治療に使用する。
別の実施形態において、医薬組成物は、本明細書に記載の投与量レジメン、例えば、２か月毎に１回以下、１か月に１回以下、１か月に２回以下、４週間毎に１回以下、３週間毎に１回以下、２週間毎に１回以下、または毎週１回以下の投与のために配合する。別の実施形態において、医薬組成物の投与は、１か月以上、例えば、１、２、３、または６か月、または１年、または５年、または１０年以上、例として対象の残り寿命にわたり維持することができる。
一実施形態において、医薬組成物は、少なくとも５分間のＣＮＳ（例えば、連続注入）中への連続投与のために配合し；他の実施形態において、組成物は、ＣＮＳ中に連続注入により少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも５０分間、少なくとも６０分間、少なくとも９０分間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間以上投与する。
別の実施形態において、本明細書に記載のｉＲＮＡ、例えば、所望の遺伝子を標的化するｄｓＲＮＡを含有する組成物は、非ｉＲＮＡ治療剤、例えば、ｉＲＮＡ薬剤により標的化すべき障害を治療することが公知の薬剤とともに投与する。
別の実施形態において、ｉＲＮＡを患者に投与し、次いで非ｉＲＮＡ薬剤を患者に投与する（またはその逆）。別の実施形態において、ｉＲＮＡおよび非ｉＲＮＡ治療剤を同時に投与する。
対象に投与されるｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡは、遺伝子サイレンシングが望まれる任意の組織中で遺伝子発現を阻害し得る。例えば、ｉＲＮＡは、肝臓、腎臓、脳、脊髄、脈絡叢、末梢ニューロンもしくは神経、筋肉、内皮細胞、心臓、免疫細胞、脂肪細胞、膀胱、皮膚、眼、膵臓、肺、胃、小腸もしくは大腸、結腸、副腎、腫瘍、癌病巣、または脾臓中のＲＮＡを標的化し得る。一実施形態において、対象に投与されるｉＲＮＡは、肝臓細胞、例えば、肝細胞、星細胞、またはクッパー細胞中で遺伝子発現を阻害する。別の実施形態において、対象に投与されるｉＲＮＡは、肝臓細胞中で遺伝子発現を活性化させる。
一態様において、本発明は、例えば、対象からの生物試料を提供すること（生物試料は、組織から離隔している）、および生物試料中のＲＮＡのレベルを検出すること（ＲＮＡは、対象の組織中の遺伝子から発現される）により対象の組織中の遺伝子の活性をアッセイする方法を提供する。参照試料と比較したＲＮＡ、または標的ＲＮＡの下流標的のＲＮＡのレベルの変化は、遺伝子の活性の変化を示し、遺伝子の活性の変化は、例えば、疾患進行もしくは縮減、対象に対するモジュレーターの効果、または対象における疾患リスクの増加もしくは減少を示す。本明細書において提供される方法は、例えば、診断、予後診断、および薬理遺伝学的目的などに有用である。
一態様において、本発明は、例えば、生物試料中の標的ＲＮＡまたはその開裂産物のレベルを検出することにより、例えば、対象中のｉＲＮＡ薬剤の活性の情報を採取すること（生物試料は、エキソソームを含み、ｉＲＮＡ薬剤は、生物試料から離隔した組織中のＲＮＡを標的化し、参照試料と比較した標的化または発現されるＲＮＡのレベルの変化は、ｉＲＮＡ薬剤が対象中で活性であることを示す）、および対象に有効量のｉＲＮＡ薬剤を投与すること（有効量を、対象中のｉＲＮＡ薬剤の活性の情報に基づき判定する）により、対象を治療する方法を挙げる。
一実施形態において、本方法は、ｉＲＮＡ薬剤が対象中で不活性である判定に基づき対象に投与されるｉＲＮＡ薬剤の用量を増加させることをさらに含み、別の実施形態において、本方法は、ｉＲＮＡ薬剤が対象中で活性である判定に基づき対象に投与されるｉＲＮＡ薬剤の用量を増加または減少させることをさらに含む。
一実施形態において、生物試料は、開裂産物のレベルの検出前に、例えば、１０００００ｇから１５００００ｇ、例えば、約１１００００ｇから約１４００００ｇにおいて遠心分離を受けている。
別の実施形態において、生物試料は、血液またはＣＳＦであり、さらに別の実施形態において、ｉＲＮＡ薬剤は、肝臓またはＣＮＳ中で発現されるＲＮＡを標的化する。一実施形態において、標的ＲＮＡは、ＴＴＲであり、対象を、トランスチレチン（ＴＴＲ）アミロイドーシスについて治療する。
一態様において、本発明は、対象の組織中の標的遺伝子の活性を評価する方法において、（ｉ）対象からエキソソームを含む非生検試料を採取すること、および（ｉｉ）試料中の前記標的遺伝子の発現産物のレベルを検出することを含む方法を挙げる。一実施形態において、本方法は、標的遺伝子についてのｍＲＮＡのｍＲＮＡ開裂産物のレベルを検出することを含む。別の実施形態において、標的遺伝子は、ＴＴＲ遺伝子であり、別の実施形態において、エキソソームは、非生検試料中のＲＮＡのレベルの検出前に非生検試料から精製しない。
一実施形態において、本方法は、（ｉｉｉ）参照試料と比較して標的ＲＮＡもしくは下流ＲＮＡのレベルが増加または減少される場合、または標的ＲＮＡ開裂産物のレベルが増加もしくは減少される場合、遺伝子の活性が変化したと判定することをさらに含む。
別の実施形態において、本方法は、（ｉｖ）遺伝子の活性が変化したと判定される場合、疾患が進行もしくは退縮したと、または対象の疾患リスクが悪化もしくは改善されたとを判定することをさらに含む。
さらに別の実施形態において、非生検試料は、組織中のＲＮＡを標的化するｉＲＮＡ薬剤と投与された対象からのものである。本方法は、例えば、対象にＲＮＡを標的化するｉＲＮＡ薬剤を投与することを含み得る。
一実施形態において、投与は、試料の採取前に実施し、別の実施形態において、投与は、試料の採取後に実施する。一実施形態において、ｉＲＮＡ薬剤を不活性であると判定し、対象に投与されるｉＲＮＡ薬剤の用量を増加させ、別の実施形態において、ｉＲＮＡ薬剤を活性であると判定し、対象中のｉＲＮＡ薬剤の活性を増加または減少させるようにｉＲＮＡ薬剤の用量を調整する。
一実施形態において、生物試料は、微小胞およびエキソソームを含み、ＲＮＡの分画は、は、微小胞中に存在する。
別の実施形態において、ＲＮＡの分画は、エキソソーム中に存在する。
一実施形態において、生物試料は、標的ＲＮＡまたは開裂産物のレベルの検出前に遠心分離を受けており、一部の実施形態において、遠心分離は、１０００００ｇから１５００００ｇ、例えば、１１００００ｇから１４００００ｇにおいて実施する。
一実施形態において、ｉＲＮＡ薬剤は、肝臓、腎臓、脳、脊髄、脈絡叢、末梢ニューロンもしくは神経、筋肉、内皮細胞、心臓、免疫細胞、皮膚、眼、膵臓、肺、胃、小腸もしくは大腸、結腸、副腎、腫瘍、癌病巣、または脾臓中のＲＮＡを標的化する。
一実施形態において、ｉＲＮＡ薬剤は、肝臓中のＲＮＡを標的化し、別の実施形態において、ｉＲＮＡ薬剤は、中枢神経系中で発現されるＲＮＡを標的化する。
一実施形態において、生物試料は、血液、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、羊水、唾液、母乳、気管支肺胞洗浄液、滑液、または悪性腹水からなる群から選択する。一実施形態において、生物試料は、血清試料である。
本明細書において、対象中の例えば、外因性遺伝子、例えば、治療外因性遺伝子の遺伝子送達を検出する方法およびアッセイも提供される。例えば、対象からの生物試料を提供すること（生物試料は、外因性遺伝子発現についての標的組織から離隔している）、ならびに生物試料中のＲＮＡの存在および／またはレベルを検出すること（ＲＮＡは、対象に送達される外因性遺伝子から発現される）。したがって、本明細書に記載の方法およびアッセイは、例えば、遺伝子治療法、例えば、ウイルス送達、プラスミドＤＮＡ送達などを使用して送達される外因性遺伝子の発現のレベルの検出において有用である。
本発明の種々の実施形態の詳細を以下の詳細な説明に記載する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかである。
定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用したマウス血清中のＴＴＲ、ＧＡＰＤＨ、およびＲｐｌｐ２ｍＲＮＡの検出を示すグラフである。 ラット血清中のＴＴＲ、ＦＶＩＩ、ＧＡＰＤＨ、ベータアクチン、およびＡｃｔａ２ｍＲＮＡの検出を示すグラフである。図２Ａは、それぞれのｍＲＮＡについての生発現データを示す。図２Ｂは、ＧＡＰＤＨ発現に対するｍＲＮＡ発現レベルを示す。 ２つの異なるＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを使用したラット血清中の全長ＴＴＲｍＲＮＡ（例えば、未開裂ｍＲＮＡ）レベルを示す棒グラフである。 カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ；「カニクイザル」）からの血清中のＴＴＲおよび１８ｓｍＲＮＡの検出を示す棒グラフである。図４Ａは、出発材料中の総ＲＮＡに正規化されたＴＴＲｍＲＮＡレベルに関するデータを示す。図４Ｂは、１８ｓＲＮＡに正規化されたＴＴＲｍＲＮＡ発現レベルを示す。 カニクイザル血清およびヒト血清中のユビキタス（例えば、１８ｓＲＮＡ、ＧＡＰＤＨ）および肝臓特異的（例えば、ＴＴＲ、ＡＡＴ、アルブミン）ｍＲＮＡ転写物の検出を示すグラフである。図５Ａは、カニクイザル血清中のＧＡＰＤＨ、１８ｓＲＮＡ、ＴＴＲおよびＡＩＡＴのｍＲＮＡ発現を示す。図５Ｂは、ヒト血清中のＧＡＰＤＨ、１８ｓＲＮＡ、Ｐ０、ＴＴＲ、ＡＡＴおよびアルブミンのｍＲＮＡ発現を示す。 定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用したヒト血清中のＴＴＲ、ＡＡＴ、および１８ｓｍＲＮＡの検出を示す棒グラフである。図６Ａは、ＡＡＴｍＲＮＡ発現に対するＴＴＲｍＲＮＡ発現を示す。図６Ｂは、１８ｓｍＲＮＡ発現に対するＴＴＲｍＲＮＡ発現を示す。 脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＴＴＲ、ＳＮＣＡ、ＨＴＴ、およびＤｒＤ２ｍＲＮＡの検出を示す棒グラフである。 血清ＲＮＡがエキソソームを介してヌクレアーゼ消化から保護されることを示す棒グラフである。図８Ａは、ＲＮアーゼにより未処理の、処理され、またはＴｘ−１００の存在下でＲＮアーゼ酵素により処理された単離ラットエキソソーム中のＲＮＡの正規化濃度を示す。図８Ｂは、ＲＮアーゼ酵素により未処理の、処理され、またはＴｘ−１００の存在下でＲＮアーゼ酵素により処理された単離ヒトエキソソーム中のＲＮＡの正規化濃度を示す。 ＡＦ−０１１−１８５３４二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用したラット血清中のＴＴＲｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介サイレンシングの検出を示すグラフである。図９Ａは、肝臓組織中のＧＡＰＤＨ発現に正規化されたＴＴＲｍＲＮＡ発現を示す。図９Ｂは、血清中のＧＡＰＤＨ発現に対するＴＴＲｍＲＮＡ発現を示す。 ＴＴＲｍＲＮＡのＡＦ−０１１−１８５３４媒介サイレンシングをラット血清中で検出することができることを示す一連のグラフである。図１０Ａ〜１０Ｂは、肝細胞特異的遺伝子ＡＡＴ（図１０Ａ）およびアルブミン（図１０Ｂ）の血清ｍＲＮＡに対する血清ＴＴＲｍＲＮＡ発現のサイレンシングを示す。 図１０Ｃ〜１０Ｄは、ユビキタス遺伝子ＧＡＰＤＨ（図１０Ｃ）および１８ｓ（図１０Ｄ）の血清ｍＲＮＡに対する血清ＴＴＲｍＲＮＡ発現のサイレンシングを示す。 ラット血清中の肝細胞特異的遺伝子ＡＡＴまたはアルブミンのｍＲＮＡ発現レベルに対するＡＦ−０１１−１８５３４の効果を示す一連のグラフである。図１１Ａは、ラット血清中のＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルに正規化されたＡＡＴのｍＲＮＡ発現を示す。図１１Ｂは、個々の動物からの血清試料中のＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルに正規化されたＡＡＴのｍＲＮＡ発現を示す。 図１１Ｃは、ラット血清中のＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルに正規化されたアルブミンのｍＲＮＡ発現を示す。図１１Ｄは、個々の動物からの血清試料中のＧＡＰＤＨｍＲＮＡレベルに正規化されたアルブミンのｍＲＮＡ発現を示す。 ラット肝臓組織中のＴＴＲｍＲＮＡのＡＦ−０１１−１８５３４媒介サイレンシングの用量応答関係を示すグラフである。 ラット血清中のＴＴＲｍＲＮＡのＡＦ−０１１−１８５３４媒介サイレンシングの用量応答関係を示すグラフである。 ＳＮＡＬＰ−１８３２４二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用したカニクイザル肝臓組織および血清中のＴＴＲｍＲＮＡのＲＮＡｉ媒介サイレンシングの検出を示すグラフである。図１４Ａは、カニクイザル肝臓組織中のＧＡＰＤＨｍＲＮＡに対するＴＴＲｍＲＮＡ発現についてのデータを示す。 図１４Ｂは、カニクイザル血清中の１８ｓｍＲＮＡ発現に対するＴＴＲｍＲＮＡ発現についてのデータを示す。 ＳＮＡＬＰ−１８３２４の投与４８時間後においてＥＬＩＳＡを使用して計測されたＴＴＲタンパク質の血清濃度を示す棒グラフである。 肝臓および血清中のｍＲＮＡレベルを使用して検出されたラットモデル中のＴＭＰＲＳＳ６のサイレンシングを示すグラフである。 ＴＴＲ標的化または対照ｓｉＲＮＡ投与後の規定時間間隔におけるＴＴＲｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである。図１７Ａは、ラット血清および肝臓中のｍＲＮＡレベルのサイレンシング後回復を示す。図１７Ｂは、最初のｓｉＲＮＡ投与２４時間後以内のＴＴＲｍＲＮＡ低減を示す。 １Ｍの塩化リチウム（ＬｉＣｌ）の存在または不存在下でのＲＮＡ単離の効果を示す棒グラフである。ＧＡＰＤＨ、アルブミン、ベータアクチン、およびＴＴＲの相対ｍＲＮＡ発現レベルを示す。 ＴＴＲｍＲＮＡの５’ＲＡＣＥ産物と全長ＴＴＲ配列とのアラインメントを示す。図１９Ａは、ラットＴＴＲｍＲＮＡの２つの５’ＲＡＣＥ産物と全長ラットＴＴＲｍＲＮＡとのアラインメントを示す。図１９Ｂは、カニクイザルＴＴＲｍＲＮＡの２つの５’ＲＡＣＥ産物と全長カニクイザルＴＴＲｍＲＮＡとのアラインメントを示す。 ＧＦＰを発現するアデノウイルス（Ａｄ−ＧＦＰ）またはヒトＡｐｏＥを発現するアデノウイルス（Ａｄ−ｈＡｐｏＥ）を注射されたラット中のヒトＡｐｏＥの発現を示す棒グラフである。 ＧＦＰを発現するアデノウイルス（Ａｄ−ＧＦＰ）またはヒトＡｐｏＥを発現するアデノウイルス（Ａｄ−ｈＡｐｏＥ）を注射されたラット中のＧＦＰの発現を示す棒グラフである。 ｍｉＲＮＡ標的化オリゴヌクレオチドの活性のモニタリングにおける循環エキソソームｍＲＮＡの検出の適用可能性を実証する。図２２Ａは、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−１２２に対して指向されたオリゴヌクレオチド、またはミスマッチオリゴヌクレオチド対照を注射されたラット中の血清および肝臓ｍｉＲ−１２２の検出を示す棒グラフである。図２２Ｂは、ｍｉＲ−１２２に対して指向されたオリゴヌクレオチド、またはミスマッチオリゴヌクレオチド対照を注射されたラットの血清および肝臓中のｍｉＲ−１２２標的アルドラーゼＡｍＲＮＡの検出を示す棒グラフである。 Ｓｎｃａ標的化ｓｉＲＮＡを注入されたラット中の線条体およびＣＳＦのＳＮＣＡｍＲＮＡレベルの検出を示す棒グラフである。 ラット血清中で同定された細胞外ＲＮＡのレベルを示す棒グラフである。
本明細書に記載のアッセイ、組成物および方法は、部分的には、サイレンシングすべき標的ＲＮＡが異なる生物学的区画（例えば、肝臓組織）中で発現される場合であっても、血液または脳脊髄液（ＣＳＦ）中の標的ＲＮＡのレベルを計測することによりｉＲＮＡ媒介（例えば、ｄｓＲＮＡ媒介）遺伝子サイレンシングを検出することができるという発見に基づく。したがって、本明細書において、ｉＲＮＡ薬剤を投与された対象から得られた生物試料（例えば、血液、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、母乳、唾液、尿など）中のＲＮＡ発現を検出することによりｉＲＮＡの活性または効力を判定するアッセイおよび方法において、ｉＲＮＡ標的は、生物試料から離隔した（例えば、遠位の）組織中のＲＮＡを標的化するアッセイおよび方法が提供される。本明細書に記載のアッセイは、ｉＲＮＡ薬剤以外の薬剤の活性のモニタリングに有用である。例えば、他の治療核酸、アンタゴｍｉｒ、ｍｉＲＮＡ模倣物および遺伝子治療剤の活性を、治療核酸が試料回収部位から遠位の特定組織中で活性である場合であっても、生物試料、例えば、血清、血液、尿またはＣＳＦ試料中の標的ＲＮＡレベル、または遺伝子治療発現産物を検出することによりアッセイすることができる。
生物試料から離隔した組織は、試料から遠位であり得る。一実施形態において、組織は、生物試料と接触するが、膜、例えば、脂質二重層により生物試料から離隔している。例えば、組織が生物試料に曝される場合、例えば、組織は、臓器であり得、生物試料は、組織と接触する体液であり得る。例えば、組織は、肝臓であり得、肝臓中のＲＮＡレベルをモニタリングするために使用される生物試料は、血液試料であり得る。血液試料は、当分野において公知の方法により、例えば、対象中の静脈から回収することができる。一態様において、脳組織中のＲＮＡレベルは、脳脊髄液中のＲＮＡレベルをアッセイすることによりモニタリングすることができる。
一実施形態において、脳を標的化するｉＲＮＡ薬剤は、脳脊髄液中の標的ＲＮＡまたは開裂産物をアッセイすることによりサイレンシング活性についてモニタリングすることができ；肝臓、腎臓または心臓を標的化するｉＲＮＡ薬剤は、例えば、血液、血清、または尿中の標的ＲＮＡまたは開裂産物をアッセイすることによりサイレンシング活性についてモニタリングすることができる。本明細書に記載の方法およびアッセイは、対象に投与されたｉＲＮＡの活性を非侵襲的に判定する利点を有する。
二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として公知の高度に保存された調節機序において遺伝子発現を遮断することが示されている。国際公開第９９／３２６１９号パンフレット（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．）は、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）中の遺伝子の発現を阻害するための少なくとも２５ヌクレオチド長のｄｓＲＮＡの使用を開示した。ｄｓＲＮＡは、他の生物、例として、植物（例えば、国際公開第９９／５３０５０号パンフレット、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．；および国際公開第９９／６１６３１号パンフレット、Ｈｅｉｆｅｔｚ ｅｔ ａｌ．参照）、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）（例えば、Ｙａｎｇ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．（２０００）１０：１１９１−１２００参照）、および哺乳動物（国際公開第００／４４８９５号パンフレット、Ｌｉｍｍｅｒ；およびＤＥ１０１００５８６．５号明細書、Ｋｒｅｕｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．参照）中の標的ＲＮＡを分解することも示されている。この天然機序は、目下、異常または不所望な遺伝子の調節により引き起こされる障害を治療するための新たなクラスの医薬剤の開発のための焦点となっている。
障害を治療するために対象に投与されるｉＲＮＡは、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的な３０ヌクレオチド長以下、すなわち、１５〜３０ヌクレオチド長、一般に、１９〜２４ヌクレオチド長の領域を有するＲＮＡストランド（アンチセンスストランド）を含み得る。これらのｉＲＮＡの使用は、特定疾患に関与する遺伝子のｍＲＮＡの標的化分解を可能とする。特に、極めて低い投与量のｉＲＮＡは、特異的および効率的にＲＮＡｉを媒介し得、遺伝子の発現の顕著な阻害をもたらす。
対象の治療に有用な医薬組成物の実施形態は、標的遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的な３０ヌクレオチド長以下、一般に、１９〜２４ヌクレオチド長の領域を有するアンチセンスストランドを有するｉＲＮＡも、薬学的に許容可能な担体とともに含む。本発明において挙げられる組成物の実施形態は、３０ヌクレオチド長以下、一般に、１９〜２４ヌクレオチド長であり、標的遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的な相補性の領域を有するアンチセンスストランドを有するｉＲＮＡも含む。
Ｉ．定義
便宜のため、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において使用されるある用語および語句の意味を以下に提供する。本明細書の他の部分における用語の使用法と本セクションにおいて提供されるその定義との間に明らかな不一致が存在する場合、本セクションにおける定義が優先される。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」および「Ｕ」は、それぞれ、一般に、グアニン、シトシン、アデニン、チミジンおよびウラシルをそれぞれ塩基として含有するヌクレオチドを意味する。しかしながら、用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」は、さらに以下に記載される改変ヌクレオチド、または代理置換部分も指し得ることが理解される。当業者は、置換部分を担持するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性を実質的に変化させることなく、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルを他の部分により置き換えることができることを十分認識する。例えば、限定されるものではないが、イノシンを塩基として含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対合し得る。したがって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、例えば、イノシンを含有するヌクレオチドにより本明細書において挙げられるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列中で置き換えることができる。別の例において、オリゴヌクレオチド中のいずれのアデニンおよびシトシンも、グアニンおよびウラシルによりそれぞれ置き換えて標的ｍＲＮＡとのＧ−Ｕゆらぎ塩基対を形成することができる。このような置換部分を含有する配列は、本明細書に記載の組成物および方法に好適である。
本明細書において使用される用語「ｉＲＮＡ」は、用語が本明細書に定義されるＲＮＡを含有し、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介するＲＮＡ転写物の標的化開裂を媒介する薬剤を指す。一実施形態において、本明細書に記載のｉＲＮＡは、標的遺伝子発現の阻害をもたらす。
本明細書において挙げられる組成物中に含まれるｉＲＮＡは、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的な３０ヌクレオチド以下、一般に、１９〜２４ヌクレオチド長である領域を有するＲＮＡストランド（アンチセンスストランド）を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を包含する。一実施形態において、ｄｓＲＮＡは、少なくとも１５連続ヌクレオチドの領域を含む。
一実施形態において、標的遺伝子の発現を阻害するためのｉＲＮＡは、互いに相補的な少なくとも２つの配列を含む。ｉＲＮＡは、第１の配列を有するセンスストランドおよび第２の配列を有するアンチセンスストランドを含む。アンチセンスストランドは、標的遺伝子をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、相補性の領域は、３０ヌクレオチド以下であり、少なくとも１５ヌクレオチド長である。一般に、ｉＲＮＡは、１９から２４、例えば、１９から２１ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ｉＲＮＡは、約１５から約２５ヌクレオチド長であり、他の実施形態において、ｉＲＮＡは、約２５から約３０ヌクレオチド長である。ｉＲＮＡは、標的遺伝子を発現する細胞との接触時、例えば、本明細書に記載の方法によりアッセイした場合、標的遺伝子の発現を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％または少なくとも４０％以上だけ阻害する。一実施形態において、ｉＲＮＡは、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）中に配合する。
一実施形態において、本明細書において挙げられるｉＲＮＡは、表２のセンス配列からなる群から選択されるｄｓＲＮＡの第１の配列、および表２の対応するアンチセンス配列からなる群から選択される第２の配列を含む。一実施形態において、本明細書において挙げられるｉＲＮＡは、表３のセンス配列からなる群から選択されるｄｓＲＮＡの第１の配列、および表３の対応するアンチセンス配列からなる群から選択される第２の配列を含む。
本明細書において使用される用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的遺伝子をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡへの塩基対合および翻訳機構の物理的妨害により化学量論的に翻訳を阻害し得る、Ｄｉａｓ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １：３４７−３５５参照。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ標的に結合し、ＲＮアーゼＨを介するｍＲＮＡ標的破壊を促進することにより標的タンパク質発現も阻害し得る。
本明細書において使用される用語「ｍｉＲＮＡ」または「マイクロＲＮＡ」は、標的ｍＲＮＡ上の相補的配列に結合することにより転写後調節因子として作用する真核細胞から産生される短いＲＮＡ配列（例えば、約２２ヌクレオチド）を指す。マイクロＲＮＡは、典型的には、翻訳抑制および遺伝子サイレンシングを誘導する。
本明細書において使用される「標的配列」は、阻害すべき遺伝子の転写の間に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続部分、例として、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を指す。配列の標的部分は、少なくともその部分またはその近傍においてｉＲＮＡ指向開裂のための基質として機能するために十分長い。例えば、標的配列は、一般に、９〜３６ヌクレオチド長、例えば、１５〜３０ヌクレオチド長であり、その間の全ての下位範囲を含む。非限定的な例として、標的配列は、１５〜３０ヌクレオチド、１５〜２６ヌクレオチド、１５〜２３ヌクレオチド、１５〜２２ヌクレオチド、１５〜２１ヌクレオチド、１５〜２０ヌクレオチド、１５〜１９ヌクレオチド、１５〜１８ヌクレオチド、１５〜１７ヌクレオチド、１８〜３０ヌクレオチド、１８〜２６ヌクレオチド、１８〜２３ヌクレオチド、１８〜２２ヌクレオチド、１８〜２１ヌクレオチド、１８〜２０ヌクレオチド、１９〜３０ヌクレオチド、１９〜２６ヌクレオチド、１９〜２３ヌクレオチド、１９〜２２ヌクレオチド、１９〜２１ヌクレオチド、１９〜２０ヌクレオチド、２０〜３０ヌクレオチド、２０〜２６ヌクレオチド、２０〜２５ヌクレオチド、２０〜２４ヌクレオチド、２０〜２３ヌクレオチド、２０〜２２ヌクレオチド、２０〜２１ヌクレオチド、２１〜３０ヌクレオチド、２１〜２６ヌクレオチド、２１〜２５ヌクレオチド、２１〜２４ヌクレオチド、２１〜２３ヌクレオチド、または２１〜２２ヌクレオチドであり得る。
本明細書において使用される用語「配列を含むストランド」は、標準的なヌクレオチド命名法を使用して称される配列により記載されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
本明細書において使用され、特に記載のない限り、用語「相補的」は、第１のヌクレオチド配列を第２のヌクレオチドに関して記載するために使用される場合、当業者により理解されるとおり、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの、ある条件下で第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズし、デュプレックス構造を形成する能力を指す。このような条件は、例えば、ストリンジェントな条件であり得、ストリンジェント条件は：４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０℃または７０℃、１２〜１６時間に続く洗浄を含み得る。他の条件、例えば、生物内部で受け得る生理学的に関連する条件を適用することができる。当業者は、ハイブリダイズされるヌクレオチドの最終用途に従って２つの配列の相補性の試験に最も適切な条件のセットを判定することができる。
本明細書に記載のｉＲＮＡ内、例えば、ｄｓＲＮＡ内の相補的配列は、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの、一方または両方のヌクレオチド配列の全長を越える塩基対合を含む。このような配列は、本明細書において、互いに関して「完全に相補的」と称することができる。しかしながら、本明細書において、第１の配列が第２の配列に関して「実質的に相補的」と称される場合、２つの配列は、完全に相補的であり得、またはそれらは、３０塩基対（ｂｐ）までのデュプレックスについてのハイブリダイゼーション時に１つ以上の、しかし、一般に５、４、３または２つ以下のミスマッチ塩基対を形成し得る一方、それらの最終用途、例えば、ＲＩＳＣ経路を介する遺伝子発現の阻害に最も関連する条件下でハイブリダイズする能力を保持する。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション時に１つ以上の一本鎖オーバーハングを形成するように設計される場合、そのようなオーバーハングは、相補性の判定に関してミスマッチとみなされない。例えば、あるオリゴヌクレオチド２１ヌクレオチド長および別のヌクレオチド２３ヌクレオチド長を含み、長いオリゴヌクレオチドが短いオリゴヌクレオチドと完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡは、本明細書に記載の目的のために依然として「完全に相補的」と称することができる。
本明細書において使用される「相補的」配列は、それらのハイブリダイズする能力に関する上記要件が満たされる限り、非ワトソン・クリック塩基対ならびに／または非天然および改変ヌクレオチドから形成される塩基対も含み得、またはそれらから完全に形成することができる。このような非ワトソン・クリック塩基対としては、限定されるものではないが、Ｇ：Ｕゆらぎまたはフーグスティーン塩基対合が挙げられる。
本明細書における用語「相補的」、「完全に相補的」および「実質的に相補的」は、それらが使用される文脈から理解されるとおり、ｄｓＲＮＡのセンスストランドとアンチセンスストランドとの、またはｉＲＮＡ薬剤のアンチセンスストランドと標的配列との塩基マッチングに関して使用することができる。
本明細書において使用される、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部と実質的に相補的」なポリヌクレオチドは、関心ｍＲＮＡの連続部分と実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、配列が標的遺伝子をコードするｍＲＮＡの非中断部分と実質的に相補的な場合、標的ｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である。
本明細書において使用される用語「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」は、標的ＲＮＡに関して「センス」および「アンチセンス」配向を有すると称される２つの逆平行の実質的に相補的な核酸ストランドを含むハイブリダイズされたデュプレックス領域を有するＲＮＡ分子または分子の複合体を含むｉＲＮＡを指す。デュプレックス領域は、ＲＩＳＣ経路を介する所望の標的ＲＮＡの特異的分解を可能とする任意の長さのものであり得るが、典型的には、９から３６塩基対長、例えば、１５〜３０塩基対長の範囲である。９から３６塩基対長のデュプレックスを考慮すると、デュプレックスは、この範囲の任意の長さ、例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６およびそれらの間の任意の下位範囲、例として、限定されるものではないが、１５〜３０塩基対、１５〜２６塩基対、１５〜２３塩基対、１５〜２２塩基対、１５〜２１塩基対、１５〜２０塩基対、１５〜１９塩基対、１５〜１８塩基対、１５〜１７塩基対、１８〜３０塩基対、１８〜２６塩基対、１８〜２３塩基対、１８〜２２塩基対、１８〜２１塩基対、１８〜２０塩基対、１９〜３０塩基対、１９〜２６塩基対、１９〜２３塩基対、１９〜２２塩基対、１９〜２１塩基対、１９〜２０塩基対、２０〜３０塩基対、２０〜２６塩基対、２０〜２５塩基対、２０〜２４塩基対、２０〜２３塩基対、２０〜２２塩基対、２０〜２１塩基対、２１〜３０塩基対、２１〜２６塩基対、２１〜２５塩基対、２１〜２４塩基対、２１〜２３塩基対、または２１〜２２塩基対であり得る。Ｄｉｃｅｒおよび類似酵素によるプロセシングにより細胞中で生成されるｄｓＲＮＡは、一般に、１９〜２２塩基対長の範囲である。ｄｓＤＮＡのデュプレックス領域の一方のストランドは、標的ＲＮＡの領域と実質的に相補的な配列を含む。デュプレックス構造を形成する２つのストランドは、少なくとも１つの自己相補的領域を有する単一ＲＮＡ分子からのものであり得、または２つ以上の別個のＲＮＡ分子から形成されていてよい。
デュプレックス領域が単一分子の２つのストランドから形成される場合、分子は、デュプレックス構造を形成する一方のストランドの３’末端とそれぞれの他方のストランドの５’末端と間でヌクレオチドの一本鎖（本明細書において「ヘアピンループ」と称される）により離隔されたデュプレックス領域を有し得る。ヘアピンループは、少なくとも１つの不対合ヌクレオチドを含み得；一部の実施形態において、ヘアピンループは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも２３以上の不対合ヌクレオチドを含み得る。ｄｓＲＮＡの２つの実質的に相補的なストランドが別個のＲＮＡ分子により含まれる場合、それらの分子は共有結合する必要はないが、共有結合していてよい。２つのストランドがヘアピンループ以外の手段により共有結合している場合、結合構造は「リンカー」と称される。用語「ｓｉＲＮＡ」は、本明細書において、上記ｄｓＲＮＡを指すためにも使用される。
一態様において、ＲＮＡ干渉剤は、標的ＲＮＡ配列と相互作用して標的ＲＮＡの開裂を指向する一本鎖ＲＮＡを含む。理論により拘束されるものではないが、植物または脊椎動物細胞中に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒとして公知のＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによりｓｉＲＮＡに分解される（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００１，１５：４８５）。ＤｉｃｅｒのリボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素は、ｄｓＲＮＡを、特徴的な２塩基３’オーバーハングを有する１９〜２３塩基対の短い干渉ＲＮＡにプロセシングする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。次いで、ｓｉＲＮＡはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中に取り込まれ、１つ以上のヘリカーゼがｓｉＲＮＡデュプレックスをほどき、相補的アンチセンスストランドが標的認識をガイドすることを可能とする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。ＲＩＳＣ内の１つ以上のエンドヌクレアーゼは、適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、標的を開裂してサイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。したがって、一態様において、本発明は、ＲＩＳＣ複合体の形成を促進して標的遺伝子のサイレンシングをもたらす一本鎖ＲＮＡに関する。
本明細書において使用される用語「ヌクレオチドオーバーハング」は、ｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡのデュプレックス構造から突出する少なくとも１つの不対合ヌクレオチドを指す。例えば、ｄｓＲＮＡの一方のストランドの３’末端が他方のストランドの５’末端を越えて伸び、またはこの逆である場合、ヌクレオチドオーバーハングが存在する。ｄｓＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含み得；あるいは、オーバーハングは、少なくとも２つのヌクレオチド、少なくとも３つのヌクレオチド、少なくとも４つのヌクレオチド、少なくとも５つのヌクレオチド以上を含み得る。ヌクレオチドオーバーハングは、ヌクレオチド／ヌクレオシドアナログ、例として、デオキシリボヌクレオチド／ヌクレオシドを含み得、またはそれからなり得る。オーバーハングは、センスストランド、アンチセンスストランドまたはそれらの任意の組合せ上に存在し得る。さらに、オーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンスストランドのいずれかの５’末端、３’末端または両末端上に存在し得る。
一実施形態において、ｄｓＲＮＡのアンチセンスストランドは、３’末端および／または５’末端において１〜１０ヌクレオチドオーバーハングを有する。一実施形態において、ｄｓＲＮＡのセンスストランドは、３’末端および／または５’末端において１〜１０ヌクレオチドオーバーハングを有する。別の実施形態において、オーバーハング中のヌクレオチドの１つ以上は、ヌクレオシド三リン酸により置き換えられている。
ｄｓＲＮＡを参照して本明細書において使用される用語「平滑」または「平滑末端」は、不対合ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログがｄｓＲＮＡの所与の末端において存在しない、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングが存在しないこと意味する。ｄｓＲＮＡの一方または両末端は、平滑であり得る。ｄｓＲＮＡの両末端が平滑である場合、ｄｓＲＮＡは、平滑末端であると言われる。明確性のため、「平滑末端」ｄｓＲＮＡは、両末端において平滑である、すなわち、分子のいずれの末端においてもヌクレオチドオーバーハングが存在しないｄｓＲＮＡである。このような分子は、その全長にわたり二本鎖であることが最も多い。
用語「アンチセンスストランド」または「ガイドストランド」は、標的配列と実質的に相補的な領域を含むｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡのストランドを指す。本明細書において使用される用語「相補性の領域」は、ある配列、例えば、本明細書に定義の標的配列と実質的に相補的なアンチセンスストランド上の領域を指す。相補性の領域が標的配列と完全に相補的でない場合、ミスマッチが分子の内部または末端領域中に存在し得る。一般に、ほとんどの認容されるミスマッチは、末端領域中、例えば、５’および／または３’末端の５、４、３、または２ヌクレオチド以内に存在する。
本明細書において使用される用語「センスストランド」または「パッセンジャーストランド」は、用語が本明細書に定義されるアンチセンスストランドの領域と実質的に相補的な領域を含むｉＲＮＡのストランドを指す。
一実施形態において、本明細書において使用される用語「ＳＮＡＬＰ」は、安定核酸脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰは、核酸、例えば、ｉＲＮＡまたはｉＲＮＡが転写されるプラスミドを含む低減された水性内部をコートする脂質の小胞を表す。ＳＮＡＬＰは、例えば、米国特許出願公開第２００６０２４００９３号明細書、米国特許出願公開第２００７０１３５３７２号明細書および国際出願国際公開第２００９０８２８１７号パンフレットに記載されている。「ＳＮＡＬＰ」配合物の例は、本明細書の他箇所に記載され、当分野において公知である。
「細胞中に導入する」は、ｉＲＮＡを指す場合、当業者により理解されるとおり、細胞中への取り込みまたは吸収を易化し、またはもたらすことを意味する。ｉＲＮＡの吸収または取り込みは、自発的拡散もしくは活性細胞プロセスを介して、または助剤もしくはデバイスにより生じ得る。この用語の意味は、インビトロでの細胞に限定されず；ｉＲＮＡは、生物の一部である「細胞中に導入」することもできる。このような例において、細胞中への導入は、生物への送達を含む。例えば、インビボ送達のため、ｉＲＮＡを組織部位中に注射し、または全身投与することができる。インビボ送達は、β−グルカン送達系、例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第５，０３２，４０１号明細書および米国特許第５，６０７，６７７号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００５／０２８１７８１号明細書に記載のものによるものでもあり得る。細胞中へのインビトロ導入としては、当分野において公知の方法、例えば、エレクトロポレーションおよびリポフェクションが挙げられる。さらなるアプローチは、本明細書において以下に記載され、当分野において公知である。
本明細書において使用される用語「の発現をモジュレートする」は、未処理細胞中での標的遺伝子の発現と比較した本明細書に記載の組成物により処理された細胞中での標的遺伝子発現の少なくとも部分的な「阻害」または部分的な「活性化」を指す。したがって、「モジュレーター」は、標的遺伝子の発現をモジュレート（例えば、阻害または活性化）するＲＮＡまたはＤＮＡエフェクター分子を指す。
用語「活性化させる」、「向上させる」、「の発現を上方調節する」、「の発現を増加させる」などは、それらが標的遺伝子を指す限り、本明細書において、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、処理されていない第２の細胞または細胞群（対照細胞）と比較した、標的遺伝子が転写され、標的遺伝子の発現が増加されるように処理された第１の細胞または細胞群から単離し、またはその中で検出することができる標的ｍＲＮＡの量の増加により顕在化される標的遺伝子の発現の少なくとも部分的な活性化を指す。
一実施形態において、標的遺伝子の発現は、ｉＲＮＡの投与により少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％だけ活性化される。一部の実施形態において、標的遺伝子は、ｉＲＮＡの投与により少なくとも約６０％、７０％、または８０％だけ活性化される。一部の実施形態において、標的遺伝子の発現は、本明細書に記載のｉＲＮＡの投与により少なくとも約８５％、９０％、または９５％以上だけ活性化される。一部の実施形態において、標的遺伝子発現は、本明細書に記載のｉＲＮＡにより処理された細胞中で未処理細胞中の発現と比較して少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍以上だけ増加される。小分子ｄｓＲＮＡによる発現の活性化は、例えば、それぞれが参照により本明細書に組み込まれるＬｉ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３：１７３３７−４２、ならびに米国特許出願公開第２００７／０１１１９６３号明細書および米国特許出願公開第２００５／２２６８４８号明細書に記載されている。
用語「サイレンシングする」、「の発現を阻害する」、「の発現を下方調節する」、「の発現を抑制する」などは、それらが標的遺伝子を指す場合、本明細書において、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、処理されていない第２の細胞または細胞群（対照細胞）と比較した、標的遺伝子が転写され、標的遺伝子の発現が阻害されるように処理された第１の細胞または細胞群から単離し、またはその中で検出することができる標的ｍＲＮＡの量の低減により顕在化される標的遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を指す。阻害の程度は、通常、
Figure 2018019683
 を単位として表現される。
あるいは、阻害の程度は、標的遺伝子発現に機能的に関連するパラメーター、例えば、遺伝子によりコードされるタンパク質の量、またはある表現型を示す細胞の数の低減を単位として与えることができる。原則として、遺伝子サイレンシングは、構成的に、またはゲノムエンジニアリングにより標的遺伝子を発現する任意の細胞中でおよび任意の適切なアッセイにより判定することができる。
例えば、ある例において、標的遺伝子の発現は、ｉＲＮＡの投与により少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％だけ抑制される。一部の実施形態において、標的遺伝子は、本明細書に記載のｉＲＮＡの投与により少なくとも約６０％、７０％、または８０％だけ抑制される。一部の実施形態において、標的遺伝子は、本明細書に記載のｉＲＮＡの投与により少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％以上だけ抑制される。
標的遺伝子発現に関して本明細書において使用される用語「治療する」、「治療」などは、標的遺伝子の発現により媒介される病理学的プロセスからの軽減または緩和を指す。本発明に関して、用語「治療する」、「治療」などは、それが本明細書に以下に記載される他の病態のいずれかに関する限り、治療すべき病態に伴う少なくとも１つの症状を軽減もしくは緩和すること、またはそのような病態の進行もしくは見込まれる進行を遅延もしくは反転させることを意味する。
疾患マーカーまたは症状に関する「低下させる」は、そのようなレベルの統計的に有意な減少を意味する。減少は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％以上であり得、例えば、そのような障害を有さない個体についての正常の範囲内として許容されるレベルに下がる。
本明細書において使用される語句「治療有効量」および「予防有効量」は、標的遺伝子の発現により媒介される病理学的プロセスまたはそのような発現により媒介される病理学的プロセスの明らかな症状の治療、予防、または管理における治療利益を提供する量を指す。治療有効である具体的な量は、通常の医師が容易に判定することができ、当分野において公知の要因、例えば、標的遺伝子の発現により媒介される病理学的プロセスのタイプ、患者の既往歴および年齢、標的遺伝子発現により媒介される病理学的プロセスの病期、ならびに標的遺伝子発現により媒介される病理学的プロセスを阻害する他の薬剤の投与などに応じて変動し得る。
本明細書において使用される「医薬組成物」は、薬理学的有効量の治療核酸、例えば、ｉＲＮＡ、および薬学的に許容可能な担体を含む。本明細書において使用される「薬理学的有効量」、「治療有効量」または単に「有効量」は、意図される薬理学的、治療または予防結果を産生するために有効なｉＲＮＡの量を指す。例えば、所与の臨床治療が疾患または障害に関連する計測可能なパラメーターの少なくとも１０％の低減が存在する場合に有効とみなされる場合、その疾患または障害の治療のための薬物の治療有効量は、そのパラメーターの少なくとも１０％の低減をもたらすために必要な量である。
用語「薬学的に許容可能な担体」は、治療剤の投与のための担体を指す。このような担体としては、限定されるものではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストローズ、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せが挙げられる。この用語は、特に細胞培養培地を除外する。経口投与される薬物のため、薬学的に許容可能な担体としては、限定されるものではないが、薬学的に許容可能な賦形剤、例えば、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、着色剤および保存剤が挙げられる。好適な不活性希釈剤としては、炭酸ナトリウムおよびカルシウム、リン酸ナトリウムおよびカルシウム、ならびにラクトースが挙げられる一方、トウモロコシデンプンおよびアルギン酸が好適な崩壊剤である。結合剤としては、デンプンおよびゼラチンを挙げることができる一方、滑沢剤は、存在する場合、一般にステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクである。所望により、錠剤を、材料、例えば、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートによりコートして胃腸管中の吸収を遅延させることができる。薬物配合物中に含まれる薬剤は、本明細書においてさらに以下に記載される。
本明細書において使用される「対象」は、哺乳動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、および他の非ヒト霊長類である。一実施形態において、対象は、ヒトである。
本明細書において使用される用語「ＲＮＡ活性化またはＲＮＡａ」は、細胞または哺乳動物中の標的遺伝子の発現を上方調節するためのＲＮＡ活性化剤（例えば、ｄｓＲＮＡ）の使用を指す。
本明細書において使用される用語「生物試料から遠位」および「生物試料から離隔」は、分析のために対象から得られる生物試料から区別される部位を指し；すなわち、得られる生物試料は、治療核酸が所望の遺伝子産物の発現をモジュレートする（例えば、ＲＮＡエフェクター分子、ＤＮＡエフェクター分子など）意図される部位でない。一実施形態において、生物試料は、治療遺伝子が発現について標的化される同一組織から得ない。例えば、治療核酸は、肝臓組織中で発現させることができ、対象から得られる生物試料は、血液または血清である。一実施形態において、組織は生物試料と接触するが、膜、例えば、脂質二重層により生物試料から離隔している。例えば、組織が生物試料に曝される場合、例えば、組織は、臓器であり得、生物試料は、組織と接触する体液であり得る。例えば、組織は、肝臓であり得、肝臓中のＲＮＡレベルをモニタリングするために使用される生物試料は、血液試料であり得る。生物試料は、当分野において公知の方法により回収することができる。例えば、血液試料は、対象中の静脈から回収することができる。一態様において、脳組織中のＲＮＡレベルは、脳脊髄液中のＲＮＡレベルをアッセイすることによりモニタリングする。
一実施形態において、脳を標的化するｉＲＮＡ薬剤は、脳脊髄液中の標的ＲＮＡまたは開裂産物をアッセイすることによりサイレンシング活性についてモニタリングすることができ；肝臓、腎臓または心臓を標的化するｉＲＮＡ薬剤は、例えば、血液、血清、または尿中の標的ＲＮＡまたは開裂産物をアッセイすることによりサイレンシング活性についてモニタリングすることができる。本明細書に記載の方法およびアッセイは、対象に投与されたｉＲＮＡの活性を非侵襲性が最小な技術を使用することにより判定する利点を有する。
本明細書において使用される用語「ＬＮＰＸＸ」（「ＸＸ」は、数字である）は、本明細書において「ＡＦ−０ＸＸ」とも称される。例えば、ＬＮＰ１１は、ＡＦ−０１１とも称される。
本明細書において使用される用語「採取する」または「採取すること」は、物理的実体または値を「直接的に採取すること」または「間接的に採取すること」により物理的実体、または値、例えば、数値の所有を得ることを指す。「直接的に採取すること」は、プロセスを実施（例えば、合成または分析法を実施）して物理的実体または値を得ることを意味する。「間接的に採取すること」は、別の団体または供給源（例えば、物理的実体または値を直接的に採取した第三者の実験室）から物理的実体または値を受容することを指す。物理的実体を直接的に採取することとしては、物質、例えば、出発材料の物理的変化を含むプロセスを実施することが挙げられる。例示的な変化としては、２つ以上の出発材料から物理的実体を作製すること、物質を剪断または断片化すること、物質を分離または精製すること、２つ以上の別個の実体を混合物に合わせること、共有または非共有結合の分解または形成を含む化学反応を実施することが挙げられる。値を直接的に採取することとしては、試料または別の物質の物理的変化を含むプロセスを実施すること、例えば、物質、例えば、試料、分析物、または試薬の物理的変化を含む分析プロセス（本明細書において、「物理的分析」と称されることがある）を実施すること、分析法、例えば、以下の１つ以上の含む方法を実施することが挙げられる：物質、例えば、分析物、もしくはその断片もしくは他の誘導体を別の物質から分離または精製すること；分析物、もしくはその断片もしくは他の誘導体を、別の物質、例えば、緩衝液、溶媒、または反応物質と合わせること；または分析物、もしくはその断片もしくは他の誘導体の構造を、例えば、分析物の第１の原子と第２の原子との共有もしくは非共有結合の分解もしくは形成により変化させること；または試薬、もしくはその断片もしくは他の誘導体の構造を、例えば、試薬の第１の原子と第２の原子との共有もしくは非共有結合の分解もしくは形成により変化させることによる。
本明細書において使用される用語「試料を採取すること」は、試料を「直接的に採取すること」または「間接的に採取すること」により試料、例えば、組織試料または核酸試料の所有を得ることを指す。「試料を直接的に採取すること」は、プロセスを実施（例えば、物理的方法、例えば、手術または抽出を実施）して試料を得ることを意味する。「試料を間接的に採取すること」は、別の団体または供給源（例えば、試料を直接的に採取した第三者の実験室）から試料を受容することを指す。試料を直接的に採取することとしては、物質、例えば、出発材料、例えば、組織、例えば、ヒト患者中の組織または患者から事前に単離された組織の物理的変化を含むプロセスを実施することが挙げられる。例示的な変化としては、出発材料から物理的実体を作製すること、組織を切除または掻爬すること；物質（例えば、試料組織または核酸試料）を分離または精製すること；２つ以上の別個の実体を混合物に合わせること；共有または非共有結合の分解または形成を含む化学反応を実施することが挙げられる。試料を直接的に採取することとしては、例えば、上記の試料または別の物質の物理的変化を含むプロセスを実施することが挙げられる。
本明細書において使用される用語「含むこと」または「含む」は、本発明に不可欠な組成物、方法、およびそれぞれのその構成要素を参照して使用され、不可欠か否かに関わらず、不特定要素の包含もさらに受け入れられる。
本明細書において使用される用語「から本質的になること」は、所与の実施形態に要求される要素を指す。この用語は、本発明において挙げられるその実施形態の基礎および新規または機能的特徴に実質的に影響しない要素の存在を可能とする。
用語「からなること」は、本明細書に記載の組成物、方法、およびそれぞれのその構成要素を指し、実施形態のその記載に引用されないいかなる要素も除外する。
ＩＩ．アッセイ
本明細書において、ｉＲＮＡ薬剤を投与された対象から得られた生物試料中の標的ＲＮＡの発現を検出することによりｉＲＮＡ薬剤の活性を判定するアッセイが提供される。本明細書に記載の方法は、ｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングが生じる組織から離隔した生物試料中のｉＲＮＡ活性の検出を可能とする。このようなアッセイは、生物試料を非侵襲的に得て所望の組織中のｉＲＮＡ作用の活性および／または効力を確認するという利点を有する。
生物試料
サイレンシングすべき標的遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを計測するために、本質的に任意の生物試料を使用することができる。典型的には、生物試料は、生物体液、例えば、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、羊水、唾液、母乳、気管支肺胞洗浄液、滑液、痰、髄液、胸膜液、乳頭吸引液、リンパ液、呼吸器、腸および尿生殖路の体液、涙液、リンパ系からの体液、精液、臓器系内体液、悪性腹水、腫瘍嚢胞液ならびにそれらの組合せである。
一実施形態において、生物試料は、血清であり、別の実施形態において、生物試料は、ＣＳＦである。
一部の実施形態において、最小の侵襲性を有する方法を使用して得ることができる生物試料（例えば、血漿、尿、血清、血液）が望まれる。本明細書において提供される方法およびアッセイは、最小の侵襲技術を使用する連続ｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ媒介サイレンシングの検出を可能とし、高価および／またはリスクを伴う組織生検（例えば、肝臓生検）を回避する利点を提供する。
生物試料は、当業者、例えば、医師などに公知の方法を使用して対象から得ることができる。例えば、試料は、シリンジまたは綿棒を使用して得ることができる。
生物試料は、直接的または間接的に得、または提供することができる。直接的に得、または提供することは、試料を得るためのプロセスを実施することを意味する。間接的に得、または提供することは、別の団体または供給源から、例えば、試料を直接的に得た第３の団体実験室から試料を受容することを指す。
生物試料は、標的ＲＮＡレベルの検出前に貯蔵することができる。典型的には、温度が低下すれば、試料をより長く安定的に貯蔵することができる。一実施形態において、温度は、−５℃から−８０℃である。他の実施形態において、貯蔵温度は、−１５℃から−２０℃である。他の実施形態において、貯蔵温度は、試料からのＲＮＡの単離前に−２０℃または−８０℃である。別の実施形態において、試料は、試料からのＲＮＡ単離前に４℃において、例えば、２時間から１６８時間貯蔵することができる。
生物試料は、ＲＮＡ単離前に、例えば、０．２μＭから０．５μＭフィルター、例えば、０．４μＭフィルターに通す濾過に供することができる。さらに、または代替的に、生物試料は、試料からのＲＮＡ単離前に遠心分離、例えば、高速遠心分離に供することができる。例えば、試料は、１０００ｇから１００００ｇ、例えば、２０００ｇから５０００ｇにおいて遠心分離することができる。一部の実施形態において、試料は、１０００００ｇから１５００００ｇ、例えば、１１００００ｇから１４００００ｇにおいて遠心分離（例えば、さらに遠心分離）する。一部の実施形態において、遠心分離工程の１つ以上の前にＬｉＣｌを試料に添加する。ＬｉＣｌは、例えば、０．５Ｍ、１Ｍ、１．５Ｍ、２Ｍ以上の濃度において添加することができる。
エキソソーム
一部の実施形態において、生物試料は、エキソソームを含有する。本明細書において使用される用語「エキソソーム」は、エンドサイトーシスおよび分泌経路に存在する多小胞体（ＭＶＢ）の内部小胞として生じるナノメートルサイズ（３０ｎｍから１５０ｎｍ、例えば、４０ｎｍから１００ｎｍ）小胞である。エキソソームは、内腔が細胞質とトポロジー的に同等である膜に囲まれた区画を引き起こす陥入プロセスまたは内部への出芽により形成される。「微小胞」は、細胞膜の脂質ラフト領域から出芽プロセスにより産生されるより大きい小胞（例えば、１００ｎｍから１０００ｎｍ）である。
ＲＮＡ、例として、ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡは、エキソソーム内に内在化される。エキソソームは、正常および病理学的条件の両方の下で異なる細胞タイプにより細胞外環境中に調節様式で放出され、それらが生じた細胞からのＲＮＡ、タンパク質および細胞内オルガネラを含有する。エキソソームを発現する細胞タイプとしては、神経細胞、肝臓細胞、およびほとんどの他の臓器の細胞が挙げられる。これらのタンパク質、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ）および脂質組成物は、微小胞体のレベルにおける選別事象の結果である。エキソソームは、共通および細胞タイプ特異的タンパク質およびＲＮＡを含む。エキソソームは、多くのタイプの体液、例として、血液、血漿、血清、脳脊髄液、尿、唾液、羊水、母乳、気管支肺胞洗浄液および滑液、ならびに悪性腹水中に存在する。
一部の実施形態において、生物試料中の標的ＲＮＡまたはその開裂産物の分画は、エキソソーム中に存在する。例えば、典型的には、生物試料中の標的ＲＮＡまたはその開裂産物の少なくとも０．０００００１％がエキソソーム中に存在し；例えば、標的ＲＮＡまたは開裂産物の少なくとも０．００００１％、少なくとも０．００１％、少なくとも０．０１％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、またはさらには１００％（すなわち、全分画）が、エキソソーム中に存在し得る。例えば、肝臓マーカーについてのエキソソームＲＮＡは、肝臓細胞ＲＮＡよりも約１０５から１０６低い（例えば、ＲＮＡの０．００００１％から０．０００００１％がエキソソーム中に存在する）。
一実施形態において、生物試料は、エキソソームについて濃縮する。生物試料は、例えば、遠心分離および／またはクロマトグラフィー、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーによりエキソソームについて濃縮することができる。生物試料は、エキソソームについて濃縮することができるが、「精製」されたエキソソームを含まなくてよい。エキソソームは、エキソソーム結合分子、例えば、抗体、レプチンまたは他のタンパク質リガンドの使用を介して精製する。
一実施形態において、エキソソームは、標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）またはその開裂産物（例えば、ＲＩＳＣ開裂産物）の検出前に精製しない。生物試料から精製されなかったエキソソームは、抗体またはレプチンまたは他のタンパク質リガンドの使用に選択されなかったものである。例えば、エキソソームは、例えば、抗体またはレプチンまたは他のタンパク質リガンドを使用することによりエキソソーム上で濃縮されるタンパク質について選択することにより精製しない。エキソソーム上で濃縮されるタンパク質としては、例えば、シャペロン、テトラスパニン、アドヘシン分子、ｒａｂタンパク質、細胞骨格タンパク質および代謝酵素が挙げられる。エキソソームと会合する例示的なタンパク質としては、例えば、ＣＤ６３、ＣＤ９、ベータ１−インテグリン、ＣＤ８１、ＩＣＡＭ−１、Ｍｆｇ−Ｅ８、トランスフェリン受容体、シアル酸、ムチン、Ｔｓｇ１０１（腫瘍感受性遺伝子１０１）、Ａｉｐ１／Ａｌｉｘ、アネキシンＩＩ、ＥＦ１ａ（転写伸長因子１ａ）、ＣＤ８２、セラミド、およびスフィンゴミエリンが挙げられる（例えば、Ｃｏｎｄｅ−Ｖａｎｃｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．７：５１５７−５１６６，２００８）。
本明細書において使用される「濃縮」は、操作前に含有される試料よりも大きい割合の特定の構成要素を含有するように選択、プロセシング、または操作された試料（例えば、エキソソームについて濃縮され、またはより肝臓特異的なエキソソームについて濃縮された生物試料）を指す。例えば、濃縮試料は、少なくとも１０％の所望の構成要素（例えば、エキソソーム）を含み、他の実施形態において、濃縮試料は、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の所望の構成要素を含む。したがって、エキソソーム濃縮試料は、例えば、エキソソーム細胞表面抗原、例えば、米国特許第７，１９８，９２３号明細書に記載のもののレベルを計測することにより判定された少なくとも１０％のエキソソームを含む試料を指す。他の実施形態において、エキソソーム濃縮試料は、例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％のエキソソームを含む。
本明細書において使用される「精製」は、生物試料の他の構成要素、例えば、細胞および無細胞タンパク質および核酸から実質的に分離されることを意味する。構成要素は、例えば、抗体またはレプチンまたは他のタンパク質リガンドを使用して精製して精製構成要素を生物試料中の他の構成要素から分離する。
一部の実施形態において、遺伝子サイレンシングが標的化される組織に由来するエキソソームは、ＲＮＡの検出前に選択しない。本明細書において使用される用語「について選択」は、マーカー、例えば、細胞表面マーカーによる小胞の精製を指す。例えば、抗体、例えば、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、またはペプチドリガンドは、エキソソームの表面上の組織特異的マーカーについて選択するため、例えば、エキソソームを特異的組織、例えば、肝臓から精製するために使用しない。エキソソームは、エキソソームの表面上で発現されるタンパク質について選択することにより精製しない。
一部の実施形態において、例えば、ｓｉＲＮＡ開裂産物をアッセイする場合、遺伝子サイレンシングが標的化される組織に由来するエキソソームをＲＮＡの検出前に選択する。例えば、抗体、例えば、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体、またはペプチドリガンドを使用してエキソソームの表面上の組織特異的マーカーについて選択し、例えば、エキソソームを特異的組織、例えば肝臓から精製する。例えば、ＳＲＢＩは、肝臓からエキソソームについて選択するために使用することができる肝細胞マーカーである。本発明において挙げられる生物試料中のエキソソームは、当分野において公知の他の方法により精製することができる。例えば、分画遠心を使用してエキソソームを精製することができる（例えば、Ｒａｐｏｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ（１９９６）１８３：１１６１−１１７２参照）。他の方法としては、アニオン交換クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー（例えば、米国特許第６，８９９，８６３号明細書および米国特許第６，８１２，０２３号明細書）、スクロース密度勾配、オルガネラ電気泳動（例えば、米国特許第７，１９８，９２３号明細書）磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）（Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｇｅｒｃｅｌ−Ｔａｙｌｏｒ，Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ （２００８）１１０（１）：１３−２１）およびナノ膜限外濾過濃縮器（Ｃｈｅｒｕｖａｎｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ（２００７）２９２（５）：Ｆ１６５７−６１）が挙げられる。エキソソームを精製する他の方法は、参照により全体として本明細書に組み込まれるＧｉｂｂｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．（米国特許出願公開第２０１１／０１７７０５４号明細書）に記載されている。
生物試料中のエキソソームは、特異的細胞タイプ、例えば、肝臓、肺、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸直腸、乳房、前立腺、脳、脊髄、脈絡叢、末梢ニューロンもしくは神経、食道、副腎、脾臓、胎盤、腫瘍、癌病巣、または胎児細胞などから生じたものについて濃縮することができる。エキソソームは、それらのドナー細胞からの表面分子、例えば、抗原を担持するため、表面分子を使用して特異的ドナー細胞タイプからエキソソームを同定することができる（Ａｌ−Ｎｅｄａｗｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（２００８）１０：６１９−６２４；Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｇｅｒｃｅｌ−Ｔａｙｌｏｒ，Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２００８）１１０（１）：１３−２１）。このように、区別される細胞集団から生じたエキソソームは、それらの核酸（例えば、ＲＮＡ）内容物について分析することができる。例えば、腫瘍（悪性および非悪性）エキソソームは、腫瘍関連表面抗原を担持し、腫瘍関連表面抗原を介して検出することができる。
例えば、ＲＮＡ開裂産物についてのアッセイのための特異的細胞タイプからのエキソソームの精製は、例えば、所望の表面抗原について特異的な抗体、アプタマー、アプタマーアナログまたは分子インプリントポリマーを使用することにより達成することができる。一実施形態において、表面抗原は、癌タイプについて特異的である。別の実施形態において、表面抗原は、必ずしも癌性でない細胞タイプについて特異的である。細胞表面抗原に基づくエキソソーム分離の方法の一例は、米国特許第７，１９８，９２３号明細書に提供されている。例えば、米国特許第５，８４０，８６７号明細書および米国特許第５，５８２，９８１号明細書、ならびに国際公開第２００３／０５０２９０号パンフレットに記載のとおり、アプタマーおよびそれらのアナログは、表面分子に特異的に結合し、細胞タイプ特異的エキソソームを回収するために分離ツールとして使用することができる。分子インプリントポリマーも、例えば、米国特許第６，５２５，１５４号明細書；米国特許第７，３３２，５５３号明細書；および米国特許第７，３８４，５８９号明細書に記載のとおり表面分子に特異的に認識し、細胞タイプ特異的エキソソームを回収および単離するためのツールである。エキソソームは、マイクロ流体プラットフォームを使用するマイクロチップ技術により生物試料から同定および精製して腫瘍由来微小胞を効率的および選択的に分離することもできる（Ｎａｇｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００７）４５０：１２３５−９）。
分析前に生物試料から核酸（例えば、ＲＮＡ）を抽出することが利益的またはそうでなければ望ましいことがある。核酸分子は、当分野において周知の任意数の手順を使用して試料から単離することができ、選択される特定の単離手順は、特定の生物試料に適切なものである。一部の例において、いくつかの技術を用いて、生物試料からの抽出なしで核酸を分析することも可能である。
一実施形態において、抽出された核酸、例として、ＲＮＡは、増幅工程なしで直接的に分析する。直接分析は、種々の方法、例として、限定されるものではないが、分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）またｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ技術を用いて実施することができる。ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ技術は、色分けされた蛍光レポーターをそれぞれの標的分子に付着させることにより生物試料中の個々の標的分子の同定および定量を可能とする。このアプローチは、バーコードをスキャンすることにより在庫を計測する概念と類似する。レポーターは、数百またはさらには数千の異なるコードを用いて作製することができ、高度に多重化した分析を可能とする。この技術は、Ｇｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００８）２６：３１７−３２５）により記載されており、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
「微小胞」は、細胞膜から削られ、または千切れた膜断片である。微小胞は、一般に、エキソソームよりも大きいと考えられる（例えば、１００ｎｍから１０００ｎｍ）が、それらの特徴および生物生成は類似すると思われる。ＲＮＡ、例として、ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡは、エキソソームと類似の調節様式で放出される微小胞中に存在する。一部の実施形態において、生物試料中の標的ＲＮＡまたはその開裂産物の分画は、微小胞中に存在する。微小胞は、典型的には、標的ＲＮＡの検出前に生物試料から単離しない。
一部の実施形態において、標的ＲＮＡまたはその開裂産物は、エキソソームおよび微小胞（例えば、細胞外小胞）を含む生物試料から単離する。
一部の実施形態において、エキソソームは、例えば、サイズ使用により、例えば、密度勾配遠心または当分野において公知の他の方法により微小胞から分離する。
ＲＮＡの単離および増幅
生物試料から得られたＲＮＡは、当業者に公知の任意の標準的手段により単離することができる。本明細書において一般に使用されるＲＮＡ単離の標準的方法、および組換え核酸法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｙ，１９９５に記載されている。
核酸は、当業者に明らかな有機溶媒を用いる抽出、クロロホルム抽出、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール、イソプロパノールもしくは任意の他の低級アルコールを用いる沈殿により、クロマトグラフィー、例として、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、シリカゲルクロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーにより、または電気泳動法、例として、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびアガロースゲル電気泳動により生物試料から回収することができる。
一実施形態において、標的ＲＮＡは、フェノールクロロホルム抽出を使用して生物試料から単離する。別の実施形態において、ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標），Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．から入手可能）を使用して生物試料から単離する。
単離後、ＲＮＡは、当分野において周知の技術により場合により精製することができる。一実施形態において、精製は、汚染ＤＮＡもタンパク質も実質的に含まないＲＮＡをもたらす。さらなる精製は、核酸回収のための上記技術のいずれかにより達成することができる。ＲＮＡは、低級アルコールを使用する、特にエタノールまたはイソプロパノールを用いる沈殿により精製することができる。沈殿は、沈殿を易化する担体、例えば、グリコーゲンの存在下で実施することができる。
生物試料からのＲＮＡは、一部はＰＣＲを用い得る種々の機序により増幅させることができる。例えば、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｅｄ．Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，１９９２）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｅｄｓ．Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４９６７（１９９１）；Ｅｃｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １：１７（１９９１）；ＰＣＲ（Ｅｄｓ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）；ならびに米国特許第４，６８３，２０２号明細書；米国特許第４，６８３，１９５号明細書；米国特許第４，８００，１５９号明細書；米国特許第４，９６５，１８８号明細書；および米国特許第５，３３３，６７５号明細書参照、これらのそれぞれは、参照により全体として本明細書に組み込まれる。試料は、アレイ上で増幅させることができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，３００，０７０号明細書および米国特許出願第０９／５１３，３００号明細書参照。
他の好適な増幅法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０（１９８９），Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７（１９８８）およびＢａｒｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ８９：１１７（１９９０））、転写増幅（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３（１９８９）および国際公開第８８／１０３１５号パンフレット）、自家持続配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１８７４（１９９０）および国際公開第９０／０６９９５号パンフレット）、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅（米国特許第６，４１０，２７６号明細書）、コンセンサス配列プライムポリメラーゼ連鎖反応（ＣＰ−ＰＣＲ）（米国特許第４，４３７，９７５号明細書）、任意プライムポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）（米国特許第５，４１３，９０９号明細書；米国特許第５，８６１，２４５号明細書）ならびに核酸ベース配列増幅（ＮＡＢＳＡ）。（米国特許第５，４０９，８１８号明細書；米国特許第５，５５４，５１７号明細書；および米国特許第６，０６３，６０３号明細書参照；これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。使用することができる他の増幅法は、米国特許第５，２４２，７９４号明細書；米国特許第５，４９４，８１０号明細書；米国特許第４，９８８，６１７号明細書；および米国特許第６，５８２，９３８号明細書に記載されており、これらのそれぞれは、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
本発明の方法により単離されるＲＮＡとしては、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を挙げることができる。一実施形態において、ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。別の実施形態において、ＲＮＡは、ｍＲＮＡ開裂産物である。別の実施形態において、ＲＮＡは、ＲＩＳＣ開裂産物である。
典型的には、ＲＮＡの単離は、物質、例えば、出発材料、例えば、生物試料および試料の内容物（例えば、ＲＮＡ）の物理的変化を含むプロセスを要求する。例示的な変化としては、２つ以上の出発材料から物理的実体を作製すること（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応による）、物質を剪断もしくは断片化すること、物質を分離もしくは精製すること、２つ以上の別個の実体を混合物に合わせること、または共有もしくは非共有結合の分解もしくは形成を含む化学反応を実施することが挙げられる。
標的ＲＮＡまたはその開裂産物を検出する方法
ＲＮＡレベル、例えば、ｍＲＮＡレベルを評価する方法は、当業者に周知である。ＲＮＡ転写物の検出は、公知の増幅法を使用して達成することができる。例えば、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、次いでポリメラーゼ連鎖反応を行うこと（ＲＴ−ＰＣＲ）；または、米国特許第５，３２２，７７０号明細書に記載の両方の工程のために単一酵素を使用すること、またはＲ．Ｌ．Ｍａｒｓｈａｌｌ，ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ４：８０−８４（１９９４）により記載されているとおりｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、次いで対称ギャップリガーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）を行うことは、本発明の範囲内である。
一実施形態において、遺伝子発現は、定量的リアルタイムＰＣＲを使用して計測する。定量的リアルタイムＰＣＲは、通常、蛍光により、増幅プロセスの間、経時的にモニタリングして特定配列の増幅の程度に関するパラメーターを計測するポリメラーゼ連鎖反応を指す。増幅サイクルの間に放出される蛍光の量は、それぞれのＰＣＲサイクルにおいて増幅された産物の量に比例する。
ハイブリダイゼーション法を用いることもでき、例えば、放射または蛍光標識アンチセンスＲＮＡプローブを単離ＲＮＡにハイブリダイズさせ、洗浄し、ＲＮアーゼにより開裂させ、可視化する。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイを実施する方法は、当分野において十分に開発されている。ハイブリダイゼーションアッセイ手順および条件は、用途に応じて変動し、公知の一般的な結合方法、例として、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）；Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）；Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｄａｖｉｓｍ，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ，８０：１１９４（１９８３）に参照されるものに従って選択する。反復および制御ハイブリダイゼーション反応を実施するための方法および装置は、例えば、米国特許第５，８７１，９２８号明細書；米国特許第５，８７４，２１９号明細書；米国特許第６，０４５，９９６号明細書および米国特許第６，３８６，７４９号明細書；米国特許第６，３９１，６２３号明細書に記載されており、これらのそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。ＲＮＡ発現、例として、ｍＲＮＡ発現は、ＤＮＡアレイ、チップまたはマイクロアレイ上で検出することができる。標的ＲＮＡに対応するオリゴヌクレオチドはチップ上に固定し、次いで対象から得られた生物試料の標識ＲＮＡとハイブリダイズさせる。陽性ハイブリダイゼーションシグナルは、標的遺伝子の転写物を含有する試料について得られる。ＤＮＡアレイを調製する方法およびそれらの使用は、当分野において周知である。（例えば、米国特許第６，６１８，６７９６号明細書；米国特許第６，３７９，８９７号明細書；米国特許第６，６６４，３７７号明細書；米国特許第６，４５１，５３６号明細書；米国特許第５４８，２５７号明細書；米国特許出願公開第２００３０１５７４８５号明細書ならびにＳｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．１９９５ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０：４６７−４７０；Ｇｅｒｈｏｌｄ ｅｔ ａｌ．１９９９ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２４，１６８−１７３；およびＬｅｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ． ２０００ Ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ５：５９−６５参照、これらは、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。遺伝子発現連続分析（ＳＡＧＥ）を実施することもできる（例えば、米国特許出願第２００３０２１５８５８号明細書参照）。
５’ＲＡＣＥ（「ｃＤＮＡ末端の急速増殖」）技術を開裂産物の検出において用いることができ、これを使用して例えば、開裂産物と会合する全長ＲＮＡを得ることができる。５’ＲＡＣＥ技術は、典型的には、逆転写を使用する関心ＲＮＡ配列のｃＤＮＡコピーの産生に続くそのｃＤＮＡコピーのＰＣＲ増幅を含む。増幅されたｃＤＮＡコピーを配列決定し、全長ｍＲＮＡ配列にマッピングすることができる。５’ＲＡＣＥを実施するための方法およびキットは、当分野において公知である。
典型的には、ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡレベル）の検出または分析または計測は、物質、例えば、出発材料、例えば、単離ＲＮＡの物理的変化を含むプロセスを要求する。例示的な変化としては、２つ以上の出発材料から物理的実体を作製すること（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応による）、物質を剪断もしくは断片化すること、物質を分離もしくは精製すること、２つ以上の別個の実体を混合物に合わせること、または共有もしくは非共有結合の分解もしくは形成を含む化学反応を実施することが挙げられる。試料の分析としては、物質、例えば、ＲＮＡ試料、分析物、または試薬の物理的変化を含む分析プロセス（本明細書において、「物理的分析」と称されることがある）を実施すること、分析法、例えば、以下の１つ以上の含む方法を実施することを挙げることができる：核酸、分析物、またはその断片もしくは他の誘導体を、別の物質、例えば、緩衝液、溶媒、もしくは反応物質と合わせること；核酸、分析物、またはその断片もしくは他の誘導体の構造を、例えば、核酸もしくは分析物の第１の原子と第２の原子との間の共有もしくは非共有結合の分解もしくは形成により変化させること；または試薬、もしくはその断片もしくは他の誘導体の構造を、例えば、試薬の第１の原子と第２の原子との間の共有もしくは非共有結合の分解もしくは形成により変化させること；または物質、例えば、核酸分析物、もしくはその断片もしくは他の誘導体を別の物質から分離もしくは精製すること。
参照試料
本明細書において使用される「参照試料」は、例えば、ｉＲＮＡを受容していない患者から得られ、またはｉＲＮＡの受容前の患者から得られた生物試料である。例えば、ｉＲＮＡの投与後の試料中の標的ｉＲＮＡレベルを計測するため、または標的ＲＮＡ分解に対するｉＲＮＡの活性を判定する本明細書に記載のアッセイの結果は、ｉＲＮＡの受容前の患者から単離された生物試料中の標的ＲＮＡレベルと比較することができる。
同様に、例えば、遺伝子治療有効性を判定するため、および／または外因性遺伝子（例えば、トランス遺伝子）の発現のレベルを計測するための本明細書に記載のアッセイの結果は、ＲＮＡレベル、例えば、外因性遺伝子の受容前の患者から単離された生物試料中の対応する遺伝子（すなわち、ベースラインまたはバックグラウンドレベルの遺伝子）と比較することができる。例えば、対応する遺伝子は、突然変異を有し得、対応する遺伝子は、患者中でＲＮＡに転写され、または転写されない。一部の実施形態において、遺伝子治療前の対応する遺伝子のレベルは、不存在であり得、または発現は、血清および／または組織試料中で検出不能なほどに低くてよい。一実施形態において、外因性遺伝子に対応する遺伝子は、患者中で発現されない（例えば、外因性遺伝子は、合成ペプチドまたはウイルスペプチドをコードする）。外因性ＲＮＡの発現は、外因性遺伝子の投与前後の患者中の内因性ＲＮＡ（例えば、ハウスキーピング遺伝子からのもの）の発現を比較することによりモニタリングすることができる。
一部の実施形態において、計測された標的ＲＮＡレベル（例えば、第１および第２の時点におけるもの）は、ｉＲＮＡ治療により変動が予期されない遺伝子（例えば、ハウスキーピング遺伝子または非標的化組織特異的遺伝子）のＲＮＡレベルと比較することができる。一実施形態において、ｉＲＮＡの投与後の試料中の標的ＲＮＡレベルは、ｉＲＮＡの投与前後のユビキタス対照ＲＮＡ（例えば、ＧＡＰＤＨ、β−アクチンまたはリボソーム（例えば、１８Ｓ））のレベルと比較することができる。別の実施形態において、ｉＲＮＡの投与後の試料中の標的ＲＮＡレベルは、ｉＲＮＡの投与前後の非標的組織特異的ＲＮＡのレベルと比較することができる。例えば、非標的肝臓ＲＮＡ、例えば、アルファアンチトリプシン（ＡＡＴ）のレベルは、ＴＴＲを標的化するｉＲＮＡの投与後のＴＴＲ標的ＲＮＡレベルと比較することができる。一部の実施形態において、標的ＲＮＡレベルは、ｉＲＮＡ治療により変動することが予期されない遺伝子のＲＮＡレベルに正規化する。
一部の実施形態において、参照試料は、例えば、正常集団および／または疾患集団の個体のうちの生物試料中で計測された標的ＲＮＡレベルを平均化することにより判定された集団標準である。疾患集団は、標的ＲＮＡレベルの計測および集団標準の判定のためにさらに未治療およびｉＲＮＡ治療群に分けることができる。このような集団標準は、例えば、個体の標的ＲＮＡレベルとの比較のために診療所において使用することができる標的ＲＮＡレベルの許容可能な範囲または閾値の判定において有用である。したがって、一部の実施形態において、参照試料は、数字（例えば、閾値、カットオフ値、許容可能な範囲など）である。
キット
本明細書において考察される方法およびアッセイのための構成要素は、キットで提供することができる。キットは、例えば、生物試料からの標的ＲＮＡを逆転写および／または増幅させるためのプライマーを含み得る。キットは、例えば、ＲＮＡの５’ＲＡＣＥ増幅用のプライマーを含み得る。
一実施形態において、キットは、それぞれのペアが所望の標的転写物を増幅させ得る１つ以上のプライマーペアを提供し、それにより、１つの反応またはいくつかの並行反応における生物試料中の１つ以上の標的の発現の分析のためのキットを提供する。キット中のプライマーは、標識、例えば、蛍光標識して増幅産物の検出および標的ＲＮＡまたはその開裂産物の発現レベルの結果分析を易化することができる。
一実施形態において、２つ以上の標的遺伝子を１つの分析において検出することができる。したがって、組合せキットは、異なる標的ＲＮＡを増幅させ得るプライマーを含む。プライマーは、例えば、異なる蛍光標識を使用して別々に標識して検出すべき標的ＲＮＡを区別することができる。
キット内に含有されるプライマーは、本明細書において実施例６に示される１つ以上の例示的なプライマーを含み得る。あるいは、プライマーは、以下の標的ＲＮＡの１つ以上のための配列を使用する５’ＲＡＣＥ、逆転写またはＴａｑＭａｎ（登録商標）定量的ＰＣＲのために設計することができる：前駆タンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１７４９３６）、トランスチレチン（ＴＴＲ）（ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＮＭ＿０００３７１．３）、血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０２５３６６．２）、キネシン様タンパク質（ＫＳＰ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４５２３）、耳下腺プロリンリッチ唾液タンパク質Ｐｃ（ＰＣＳ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２０８７２．１）、アンギオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１４４９５．２）、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ（ＡｐｏＣ３）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００４０．１）、ヘプシジン（ＳＬＣ１１Ａ２）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１７４１２９．１）、ｅｇｌ９ホモログ（ＥＧＬＮ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ１１１０５７．１）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＫ３６７３８４．１）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ６０２８１８．１）、ポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５０３０．３）、アルファ−アンチトリプシン（ＡＡＴ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００２９５．４）、活性化タンパク質Ｃ、膜貫通セリンプロテアーゼ６（ＴＭＰＲＳＳ６）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１５３６０９．２）、クルッペル様因子４（ＫＬＦ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ６５８２４１．１）、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２２８９３．３）、ｐ５３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１２６１１４．１）、カスパーゼ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２２４．４）、β−カテニン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１９０４．３）、プロテインキナーゼＮ３（ＰＫＮ３）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１３３５５．３）、ハンチンチン（ＨＴＴ）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２１１１．６）またはアルファシヌクレイン（ＳＮＣＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００７３０８．２）。
キットは、１つ以上のプライマーに加え、他の成分、例えば、溶媒もしくは緩衝液、安定剤、または保存剤を含み得る。薬剤は、任意の形態、例えば、液体、乾燥または凍結乾燥形態、ならびに実質的に純粋および／または無菌の形態で提供することができる。薬剤を液体溶液で提供する場合、液体溶液は、例えば、水溶液である。薬剤を乾燥形態で提供する場合、再構成は一般に、好適な溶媒の添加による。溶媒、例えば、無菌水または緩衝液を、キット中で場合により提供することができる。
キットは、例えば、増幅プロトコルおよび結果の分析のための説明書も含み得る。説明書は、対象者がｉＲＮＡ薬剤を投与されていることも規定し得る。あるいは、キットは、増幅および増幅産物の分析を実施するための緩衝液、酵素、および容器も含み得る。キットの情報材料は、その形態において限定されない。例えば、情報材料は、アッセイの実施の仕方、要求される試薬の濃度、期限日、バッチまたは生産場所の情報などについての情報を含み得る。一実施形態において、情報材料は、生物試料を得、標的ＲＮＡまたはその開裂産物を単離し、そのレベルを計測する方法に関する。情報は、種々のフォーマット、例として、印刷テキスト、コンピュータ読取材料、録画、もしくは録音、または実質的な材料へのリンクもしくはアドレスを提供する情報（例えば、ＵＲＬ）で提供することができる。
一実施形態において、キットは、アッセイを実施および解釈するための情報材料を含み得る。別の実施形態において、キットは、アッセイの結果を報告する場所、例えば、研究施設、治療センターまたはヘルスケア提供者に関する指針を提供し得る。キットは、本明細書に記載のアッセイの結果を報告するための形態、ならびにそのような形態または他の関連情報を送付する場所に関するアドレスおよび連絡先；またはオンラインデータベースもしくはオンラインアプリケーション（例えば、ａｐｐ）において結果を報告するためのＵＲＬ（ユニフォーム・リソース・ロケータ（Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｌｏｃａｔｏｒ））アドレスを含み得る。別の実施形態において、情報材料は、アッセイの結果に応じて患者がｉＲＮＡ薬剤による治療を受容すべきかどうか、またはその治療を受容し続けるべきかどうかに関する指針を含み得る。
キットは、生物試料からＲＮＡを単離するための試薬、例として、例えば、フェノール／クロロホルムまたは試薬ＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬も含み得る。一部の実施形態において、単離の間のＲＮＡ収量を増加させる試薬もキット中に含める。一実施形態において、ＲＮＡ収量を増加させるための試薬は、塩化リチウムであり、例えば、それを０．１〜５Ｍ（例えば、０．５、１、１．５、２、２．５または３Ｍ）の最終濃度において試料に添加することができる。キットは、共沈殿剤として作用して小容量のＲＮＡのペレット化を助ける試薬、例えば、グリコーゲンをさらに含み得る。キットは、ＲＮアーゼ活性を阻害するための試薬、またはＲＮＡ担持小胞（エキソソーム）を溶解させるための洗浄剤を含み得る。
キットは、生物試料中のＲＮアーゼ活性を阻害するため、またはＲＮＡ沈殿を向上させるための薬剤をさらに含み得る。例えば、キットは、ＲＮアーゼインヒビターもしくはＲＮアーゼ活性を阻害するためのＥＤＴＡを含み得、および／またはＲＮＡ沈殿を向上させるためのＰＥＧもしくは塩化リチウムを含み得る。
キットは、他のツール、例えば、ＤＮＡマイクロアレイを含むスクリーニング、診断または予後診断キットの構成要素でもあり得る。キットは、１つ以上の対照テンプレート、例えば、正常血清もしくは組織試料から単離された標的ＲＮＡまたは組換え標的ＲＮＡも含み得る。あるいは、ｉＲＮＡ薬剤またはモジュレーターを投与される前の患者から単離された生物試料を対照として使用することができる。
キットは、薬剤を含有する１つまたは複数の組成物のための１つ以上の容器を含み得る。一部の実施形態において、キットは、組成物および情報材料のための別個の容器、仕切りまたは区画を含む。例えば、組成物は、瓶、バイアル、またはシリンジ中に含有させることができ、情報材料は、プラスチックスリーブまたはパケット中に含有させることができる。他の実施形態において、キットの別個の要素は、単一の無仕切り容器内に含有させる。例えば、組成物は、情報材料がラベルの形態で付着している瓶、バイアルまたはシリンジ中に含有させる。一部の実施形態において、キットは、複数（例えば、パック）の個々の容器を含み、それぞれは、薬剤の１つ以上の単位剤形（例えば、本明細書に記載の剤形）を含有する。容器は、組合せ単位、例えば、ＲＴ−ＰＣＲのためのプライマー、または２つ以上のＲＮＡを標的化するプライマーを含む単位を含み得る。一例において、キットは、複数のシリンジ、アンプル、ホイルパケット、ブリスターパック、または医療デバイスを含み、例えば、それぞれは、例えば、生物試料を得、試料から標的ＲＮＡを単離および検出するための単一の組合せ単位を含有する。キットの容器は、気密性、防水性（例えば、湿気または蒸発の変化を防ぐ）、および／または遮光性であり得る。
ＩＩＩ．治療核酸
本明細書において使用される用語「治療核酸」は、例えば、疾患または障害の治療のために対象に投与される核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡエフェクター分子を指す。治療核酸は、所望の遺伝子産物の発現を増加させるため、または所望の遺伝子産物の発現を減少させるために使用することができる。例えば、治療核酸は、例えば、治療核酸がトランス遺伝子を発現する外因性ＤＮＡである場合、または、核酸がＲＮＡ活性化により機能する場合、所望の遺伝子産物の発現を増加させ得る。治療核酸は、例えば、治療核酸が阻害ＲＮＡエフェクター分子、ドミナントネガティブ突然変異体を発現する核酸、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドである場合、所望の遺伝子産物の発現を減少させ得る。
治療核酸は、リボヌクレオチドのみ、デオキシリボヌクレオチドのみ（例えば、オリゴデオキシヌクレオチド）、またはデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの両方を含み得る。以下に記載されるＤＮＡまたはＲＮＡエフェクター分子のいずれも、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの両方を含み得る。
ＤＮＡエフェクター分子
本明細書において使用される用語「ＤＮＡエフェクター分子」は、宿主細胞内で遺伝子産物の発現を増加させ（例えば、治療遺伝子）、またはタンパク質の活性を減少させ得る（例えば、ドミナントネガティブ突然変異体）デオキシリボヌクレオチド薬剤を指す。このようなＤＮＡエフェクター分子は、例えば、プラスミドまたはベクターによりコードされるＤＮＡ、例えば、発現ｃＤＮＡを含み得る。ＤＮＡエフェクター分子を使用してトランス遺伝子、外因性遺伝子産物、生体異物遺伝子産物、突然変異遺伝子産物、ドミナントネガティブ突然変異体、または改変遺伝子産物などを発現させることができる。ＤＮＡエフェクター分子は、遺伝子治療の過程で送達することができる。
一部の実施形態において、ＤＮＡエフェクター分子を使用して所望の遺伝子を対象のゲノム中に挿入すること、例えば、非機能遺伝子を置き換えることができる。このような遺伝子は、ゲノム中にランダムに挿入することができ、または相同組換え技術を使用して非機能遺伝子についてスワッピングすることができる。
遺伝子をインビボで送達するための多数の異なるベクター技術および遺伝子送達法、例として、ウイルスベクターおよび種々の核酸封入技術が提案および試験されている。例えば、ＤＮＡエフェクター分子は、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、シュードタイプベクター、エプスタイン・バーウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスを使用して送達することができる。遺伝子のための代替的なウイルス送達ビヒクルとしては、ネズミレトロウイルス、組換えアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス、ＨＳＶ、ＨＩＶベクター、およびバキュロウイルスが挙げられる。宿主細胞への遺伝子の送達のためのこのようなウイルスベクターの改変は、当業者に公知である。
非ウイルス遺伝子送達法としては、カチオン性または中性リポソームまたはポリマーの使用が挙げられる。例えば、遺伝子移入の効率は、例えば、リポソームまたはポリマーとの組合せにおける融合ペプチドの使用を介して向上させてエンドソームからのプラスミドＤＮＡの放出を易化することができる。
一部の実施形態において、ＤＮＡエフェクター分子は、ネイキッドＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡとして送達することができる。例えば、ネイキッドＤＮＡは、コードされる遺伝子の発現が望まれる組織中に注射することができる。さらに、いくつかの物理的方法、例として、限定されるものではないが、遺伝子銃、エレクトロポレーション、ソノポレーションおよびマグネトフェクションを利用して宿主細胞または組織中へのネイキッドＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡの取り込みを誘導することができる。
ＤＮＡエフェクター分子は、リポプレックス（例えば、カチオン性脂質）、ポリプレックス（例えば、カチオン性脂質複合体）、またはデンドリマー（例えば、エンドサイトーシスを介して細胞により取り込まれる球状の高度に分枝鎖化した巨大分子）を使用して送達することができる。
ＤＮＡエフェクター分子は、例えば、筋肉組織または腫瘍中に局所注射により送達することもできる。特定組織または細胞への標的化送達は、標的化基とのＤＮＡのコンジュゲート、例えば、肝臓を標的化するためのプラスミドＤＮＡ／ポリリジン／肝臓標的化基を使用して達成することができる。一実施形態において、治療プラスミドのコンジュゲート（例えば、腫瘍抑制遺伝子を有する）は、遺伝子治療のために腸中に直接的に導入して結腸癌を治療することができ、またはリポソームとコンジュゲートされたプラスミドＤＮＡは、遺伝子治療のために皮膚細胞に直接的に局所送達して黒色腫またはＢ型血友病を治療することができる。ＤＮＡエフェクター分子の標的化送達は、静脈内送達によるものであり得る。
例えば、受容体媒介エンドサイトーシスによる巨大分子の選択的取り込みを利用することにより、受容体媒介送達ビヒクルを用いて治療遺伝子をコードする核酸を細胞中に送達することもできる。種々の受容体の細胞タイプ特異的分布のため、送達は高度に特異的であり得る。
遺伝子送達のためのベクターまたはプラスミドは、宿主細胞中のＤＮＡエフェクター分子からの遺伝子産物の発現を制御するための構成性または誘導性プロモーターを含み得る。構成的プロモーターとしては、限定されるものではないが、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）前初期プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、リゾチームプロモーター、初期および後期ＣＭＶプロモーター、初期および後期ＨＳＶプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ならびに熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）プロモーターが挙げられる。
誘導性プロモーターは、遺伝子が取り込まれた細胞内で転写制御エレメントにより産生または認識される物質により調節される。一部の実施形態において、誘導性プロモーターは、誘導物質の存在下を除き不活性であり、または比較的低い活性を示す（またはその逆）プロモーターである。誘導性プロモーターの一部の例としては、限定されるものではないが、ＭＴＩＩ、ＭＭＴＶ、コラゲナーゼ、ストロメリシン、ＳＶ４０、ネズミＭＸ遺伝子、α−２−マクログロブリン、ＭＨＣクラスＩ遺伝子ｈ−２ｋｂ、プロリフェリン、腫瘍壊死因子、または甲状腺刺激ホルモンα遺伝子が挙げられる。
誘導性プロモーターとしては、組織特異的プロモーター、発生調節プロモーター、および化学誘導性プロモーターも挙げられる。組織特異的プロモーターの例としては、グルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６Ｐ）プロモーター、ビテロゲニンプロモーター、オボアルブミンプロモーター、オボムコイドプロモーター、コンアルブミンプロモーター、オボトランスフェリンプロモーター、プロラクチンプロモーター、腎臓ウロモジュリンプロモーター、および胎盤性ラクトゲンプロモーターが挙げられる。
化学誘導性プロモーターの例としては、生殖ホルモン誘導プロモーターおよび抗生物質誘導性プロモーター、例えば、テトラサイクリン誘導性プロモーターおよび亜鉛誘導性メタロチオニンプロモーターが挙げられる。他の誘導性プロモーター系としては、ＩＰＴＧ（イソプロピルベータ−Ｄ−チオガラクトシド）により誘導されるＬａｃオペレーターリプレッサー系、エクジソンベース誘導系；エストロゲンベース誘導系；ＧＡＬ４結合ドメインおよび単純ヘルペスウイルス転写活性化ドメインＶＰ１６、ならびにリガンド結合能を保持し、ＲＵ４８６により刺激され得るヒトプロゲステロン受容体のトランケート形態からなるハイブリッドタンパク質であるキメラ調節因子ＧＬＶＰを使用するプロゲステロンベース誘導系が挙げられる。化学誘導性プロモーターを活性化させる化学物質は、当業者に公知の任意の方法を介して関心トランス遺伝子を含有する動物に投与することができる。遺伝子発現を制御するための当業者に公知の追加のプロモーターを、本明細書に記載の方法およびアッセイについて取り入れることもできる。
本明細書において、遺伝子産物を発現またはコードするＤＮＡエフェクター分子の活性を判定するアッセイおよび方法が記載される。
ＲＮＡエフェクター分子
本明細書において使用される用語「ＲＮＡエフェクター分子」は、宿主細胞内の標的遺伝子の発現を低減もしくは予防し得るリボヌクレオチド薬剤、または宿主細胞内の標的遺伝子の発現レベルを低減させ得る分子を形成し得るリボヌクレオチド薬剤を指す。ＲＮＡエフェクター分子としては、例えば、ＲＮＡ活性化により所望の遺伝子産物の発現を増加させ得るリボヌクレオチド薬剤も挙げられる。ＲＮＡエフェクター分子としては、例えば、ｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ模倣物、アンチセンスＲＮＡ、プロモーター指向性ＲＮＡ（ｐｄＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮａ（ｐｉＲＮＡ）、ＲＮＡ活性化分子、発現干渉ＲＮＡ（ｅｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、デコイＲＮＡおよびアプタマーが挙げられる。
少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、または少なくとも２０ヌクレオチド長であるＲＮＡエフェクター分子の一部分は、標的遺伝子と実質的に相補的である。好ましくは、ＲＮＡエフェクター分子の少なくとも１５連続ヌクレオチドが、標的配列と相補的である（例えば、ＲＮＡエフェクター分子の少なくとも１６、１７、少なくとも１８、少なくとも１９以上の連続ヌクレオチドが、標的配列と相補的である）。ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子のＲＮＡ転写物と相互作用し、それらの選択的分解を媒介し、またはそうでなければそれらの翻訳を妨げる。
ＲＮＡエフェクター分子は、単一ＲＮＡストランドまたは２つ以上のＲＮＡストランドを含み得る。ＲＮＡエフェクター分子の例としては、例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、プロモーター指向性ＲＮＡ（ｐｄＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、発現干渉ＲＮＡ（ｅｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンタゴｍｉｒ、デコイＲＮＡ、およびアプタマーが挙げられる。ＲＮＡエフェクター分子は、一本鎖または二本鎖であり得る。一本鎖ＲＮＡエフェクター分子は、二本鎖領域を有し得、二本鎖ＲＮＡエフェクター分子は、一本鎖領域を有し得る。好ましくは、ＲＮＡエフェクター分子は、アンチセンスストランドが標的遺伝子と実質的に相補的な配列を含む二本鎖ＲＮＡである。
ＲＮＡエフェクター分子内、例えば、ｄｓＲＮＡ（二本鎖リボ核酸）内の相補的配列は、完全に相補的または実質的に相補的であり得る。一般に、３０塩基対までのデュプレックスについて、ｄｓＲＮＡは、ハイブリダイゼーション時に５、４、３または２つ以下のミスマッチ塩基対を含む一方、その標的遺伝子の発現を調節する能力を保持する。
一部の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子のＲＮＡ転写物と相互作用し、その開裂を指向する一本鎖オリゴヌクレオチドを含む。例えば、一本鎖ＲＮＡエフェクター分子は、５’改変、例として、ヌクレアーゼ分解からエフェクター分子を保護するための１つ以上のホスフェート基またはそのアナログを含む。ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子の「センス」核酸と相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖アンチセンス核酸、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコードストランドまたはＲＮＡ配列、例えば、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくはプレｍｉＲＮＡであり得る。したがって、アンチセンス核酸は、センス核酸標的と水素結合を形成し得る。
コードストランド配列（例えば、ｃＤＮＡ分子のセンスストランドの配列）を考慮して、アンチセンス核酸は、ワトソン・クリック塩基対合の規則に従って設計することができる。アンチセンス核酸は、ＲＮＡのコードまたは非コード領域、例えば、プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの翻訳開始部位を包囲する領域、例えば、５’ＵＴＲと相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約１０から２５ヌクレオチド長（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４ヌクレオチド長）であり得る。一部の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、分子の生物学的安定性および／またはアンチセンス核酸と標的核酸との間に形成されるデュプレックスの物理的安定性を増加させるために設計された１つ以上の改変ヌクレオチド、例えば、ホスホロチオエート誘導体および／またはアクリジン置換ヌクレオチドを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドのみ、デオキシリボヌクレオチドのみ（例えば、オリゴデオキシヌクレオチド）、または、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの両方を含み得る。例えば、リボヌクレオチドのみからなるアンチセンス薬剤は、相補的ＲＮＡにハイブリダイズし得、標的ＲＮＡ転写物への翻訳機構の接近を妨げ得、それによりタンパク質合成を妨げる。アンチセンス分子、例として、デオキシリボヌクレオチドのみ、またはデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドは、相補的ＲＮＡにハイブリダイズし得、続いてＲＮＡ標的を酵素、例えば、ＲＮアーゼＨにより開裂させて翻訳を妨げることができる。フランキングＲＮＡ配列は、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチド、およびホスホロチオエート結合を含み得、内部ＤＮＡ配列は、ホスホロチオエートヌクレオチド内結合を含み得る。内部ＤＮＡ配列は、好ましくは、ＲＮアーゼＨ活性による標的化が望まれる場合、少なくとも５ヌクレオチド長である。
ある実施形態において、ＲＮＡエフェクターは、（ａ）互いに実質的に相補的なセンスストランドおよびアンチセンスストランドを含み；（ｂ）前記アンチセンスストランドは、標的遺伝子の１つと実質的に相補的な相補性の領域を含み、前記相補性の領域は、１０から３０ヌクレオチド長である二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含む。
一部の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、二本鎖オリゴヌクレオチドである。典型的には、２つのストランドにより形成されるデュプレックス領域は小さく、約３０ヌクレオチド長以下である。このようなｄｓＲＮＡは、ｓｉＲＮＡとも称される。例えば、ｓｉＲＮＡは、１５から３０ヌクレオチド長、１０から２６ヌクレオチド長、１７から２８ヌクレオチド長、１８から２５ヌクレオチド長、または１９から２４ヌクレオチド長、などであり得る。
デュプレックス領域は、ＲＩＳＣ経路を介する所望の標的ＲＮＡの特異的分解を可能とする任意の長さのものであり得るが、典型的には、９から３６塩基対長、例えば、１５から３０塩基対長の範囲である。例えば、デュプレックス領域は、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、もしくは３６塩基対長、またはその間の任意の下位範囲、例として、例えば、１５から３０塩基対、１５から２６塩基対、１５から２３塩基対、１５から２２塩基対、１５から２１塩基対、１５から２０塩基対、１５から１９塩基対、１５から１８塩基対、１５から１７塩基対、１８から３０塩基対、１８から２６塩基対、１８から２３塩基対、１８から２２塩基対、１８から２１塩基対、１８から２０塩基対、１９から３０塩基対、１９から２６塩基対、１９から２３塩基対、１９から２２塩基対、１９から２１塩基対、１９から２０塩基対、２０から３０塩基対、２０から２６塩基対、２０から２５塩基対、２０から２４塩基対、２０から２３塩基対、２０から２２塩基対、２０から２１塩基対、２１から３０塩基対、２１から２６塩基対、２１から２５塩基対、２１から２４塩基対、２１から２３塩基対、または２１から２２塩基対であり得る。
ｄｓＲＮＡのデュプレックス構造を形成する２つのストランドは、少なくとも１つの自己相補的領域を有する単一ＲＮＡ分子からのものであり得、または２つ以上の別個のＲＮＡ分子から形成されていてよい。デュプレックス領域が単一分子の２つのストランドから形成される場合、分子は、デュプレックス構造を形成する一方のストランドの３’末端とそれぞれの他方のストランドの５’末端との間でヌクレオチドの一本鎖（「ヘアピンループ」）により離隔されたデュプレックス領域を有し得る。ヘアピンループは、少なくとも１つの不対合ヌクレオチドを含み得；一部の実施形態において、ヘアピンループは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも２３以上の不対合ヌクレオチドを含み得る。ｄｓＲＮＡの２つの実質的に相補的なストランドが別個のＲＮＡストランドにより形成される場合、２つのストランドは、場合により共有結合していてよい。２つのストランドがヘアピンループ以外の手段により共有結合している場合、結合構造は、「リンカー」と称される。
２０から２３、しかし特に２１塩基対のデュプレックス構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉の導入に特に有効であると支持されていることは公知である。Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，２０ ＥＭＢＯ ６８７７−８８（２００１）。
二本鎖オリゴヌクレオチドは、二本鎖オリゴヌクレオチド、例えば、ｄｓＲＮＡのデュプレックス構造の末端から突出する１つ以上の不対合ヌクレオチドである１つ以上の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含み得る。二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーハングを含み得；あるいは、オーバーハングは、少なくとも２つのヌクレオチド、少なくとも３つのヌクレオチド、少なくとも４つのヌクレオチド、少なくとも５つのヌクレオチド以上を含み得る。オーバーハングは、センスストランド、アンチセンスストランドまたはそれらの任意の組合せ上に存在し得る。さらに、オーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンスストランドのいずれかの５’末端、３’末端、または両末端上に存在し得る。
一実施形態において、ｄｓＲＮＡの少なくとも一方の末端は、１から４、一般に、１または２ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを有する。
オーバーハングは、デオキシリボヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログを含み得る。さらに、オーバーハング中のヌクレオシド内結合の１つ以上は、ホスホロチオエートにより置き換えられていてよい。一部の実施形態において、オーバーハングは、１つ以上のデオキシリボヌクレオシドを含み、またはオーバーハングは、１つ以上のｄＴ、例えば、配列５’−ｄＴｄＴ−３’もしくは５’−ｄＴｄＴｄＴ−３’を含む。一部の実施形態において、オーバーハングは、配列５’−ｄＴ＊ｄＴ−３（＊は、ホスホロチオエートヌクレオシド内結合である）を含む。
本明細書に記載のＲＮＡエフェクター分子は、標的配列に対する１つ以上のミスマッチを含有し得る。好ましくは、本明細書に記載のＲＮＡエフェクター分子は、３つ以下のミスマッチを含有する。ＲＮＡエフェクター分子のアンチセンスストランドが標的配列に対する１つ以上のミスマッチを含有する場合、ミスマッチは、相補性の領域の中央に局在しないが、相補性の領域の５’または３’末端のいずれかからの最後の５ヌクレオチド内に限定されることが好ましい。例えば、２３ヌクレオチドＲＮＡエフェクター分子薬剤ＲＮＡについて、アンチセンスストランドは、一般に、中央の１３ヌクレオチド内にいかなるミスマッチも含有しない。
ｄｓＲＮＡは、さらに以下に考察される当分野において公知の標準的方法により、例えば、自動化ＤＮＡ合成装置、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）などから市販されているものの使用により合成することができる。
一部の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物の非コード領域と実質的に相補的なプロモーター指向性ＲＮＡ（ｐｄＲＮＡ）である。一実施形態において、ｐｄＲＮＡは、転写開始部位から上流に、例えば、転写開始部位から１００超、２００超、または１０００塩基超上流に局在する部位における標的遺伝子ｍＲＮＡのプロモーター領域と実質的に相補的である。別の実施形態において、ｐｄＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物の３’−ＵＴＲと実質的に相補的である。一実施形態において、ｐｄＲＮＡは、それぞれのストランド上に３’ジまたはトリヌクレオチドオーバーハングを場合により有する１８〜２８塩基のｄｓＲＮＡを含む。別の実施形態において、ｐｄＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物のプロモーターまたは３’−ＵＴＲと実質的に相補的なＤＮＡ配列を含む一本鎖ポリヌクレオチドからなり、細胞ヌクレアーゼからギャップマーを保護する１つ以上の改変ヌクレオチド、例えば、２’ＭＯＥ、２’ＯＭｅ、またはロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）塩基（ＬＮＡ）を含むポリヌクレオチド配列（例えば、ギャップマーの５’および３’末端のそれぞれにおいて５末端塩基を含む）をフランキングするギャップマーを含む。
ｐｄＲＮＡは、標的遺伝子の発現を選択的に増加、減少させ、またはそうでなければモジュレートするために使用することができる。理論に限定されるものではないが、ｐｄＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物の非コード領域と重複する内因性アンチセンスＲＮＡ転写物に結合し、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質（ｄｓＲＮＡの場合）または宿主細胞ヌクレアーゼ（例えば、ＲＮアーゼＨ）（ギャップマーの場合）をリクルートして内因性アンチセンスＲＮＡを選択的に分解することにより標的遺伝子の発現をモジュレートすると思われる。一部の実施形態において、内因性アンチセンスＲＮＡは、標的遺伝子の発現を負に調節し、ｐｄＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子の発現を活性化させる。したがって、一部の実施形態において、ｐｄＲＮＡを使用して内因性アンチセンスＲＮＡによる標的遺伝子発現の負の調節を阻害することにより標的遺伝子の発現を選択的に活性化させることができる。標的遺伝子のプロモーター配列によりコードされるアンチセンス転写物を同定する方法ならびにプロモーター指向性ＲＮＡを作製および使用する方法は、公知であり、例えば、国際公開２００９／０４６３９７号パンフレット参照。
一部の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、非核酸リガンド、例えば、有機小分子またはタンパク質、例えば、転写または翻訳因子に結合し、続いて活性を改変（例えば、阻害）するアプタマーを含む。アプタマーは、非核酸リガンド上の標的化結合部位の認識を指向する特異的構造にフォールドし得る。アプタマーは、本明細書に記載の改変のいずれかを含有し得る。
一部の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、アンタゴｍｉｒを含む。アンタゴｍｉｒは、マイクロＲＮＡを標的化する一本鎖、二本鎖、部分的に二本鎖またはヘアピン構造である。アンタゴｍｉｒは、内因性ｍｉＲＮＡ、より特定すると、ｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡヌクレオチド配列の標的配列と実質的に相補的な少なくとも１０以上の連続ヌクレオチドから本質的になり、またはそれを含む。アンタゴｍｉｒは、好ましくは、アンタゴｍｉｒが標的配列にハイブリダイズすることを可能とするために約１２から２５ヌクレオチド、例えば、約１５から２３ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ標的配列と十分に相補的なヌクレオチド配列を有する。より好ましくは、標的配列は、アンタゴｍｉｒの配列と１、２、または３ヌクレオチド以下だけ異なる。一部の実施形態において、アンタゴｍｉｒは、例えば、オリゴヌクレオチド薬剤の３’または５’末端に付着していてよい非ヌクレオチド部分、例えば、コレステロール部分を含む。
一部の実施形態において、アンタゴｍｉｒは、改変、例えば、ヌクレオチド改変の取り込みにより核酸分解に対して安定化させる。例えば、一部の実施形態において、アンタゴｍｉｒは、ヌクレオチド配列の５’または３’末端において少なくとも第１、第２、および／または第３のヌクレオチド内結合を含むホスホロチオエートを含有する。さらなる実施形態において、アンタゴｍｉｒは、２’−改変ヌクレオチド、例えば、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）を含む。一部の実施形態において、アンタゴｍｉｒは、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物の非コード領域と実質的に相補的なプロモーター指向性ＲＮＡ（ｐｄＲＮＡ）である。ｐｄＲＮＡは、転写開始部位から上流に、例えば、転写開始部位から１００超、２００超、または１０００塩基超上流に局在する部位における標的遺伝子ｍＲＮＡのプロモーター領域と実質的に相補的であり得る。さらに、ｐｄＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物の３’−ＵＴＲと実質的に相補的であり得る。例えば、ｐｄＲＮＡは、それぞれのストランド上に３’ジまたはトリヌクレオチドオーバーハングを場合により有する１８から２８塩基のｄｓＲＮＡを含む。ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物のプロモーター領域または３’−ＵＴＲ領域と実質的に相補的である。別の実施形態において、ｐｄＲＮＡは、標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物のプロモーターまたは３’−ＵＴＲと実質的に相補的なＤＮＡ配列を含む一本鎖ポリヌクレオチドからなり、細胞ヌクレアーゼからギャップマーを保護する１つ以上の改変ヌクレオチド、例えば、２’ＭＯＥ、２’ＯＭｅ、またはロックド核酸塩基（ＬＮＡ）を含むポリヌクレオチド配列（例えば、ギャップマーの５’および３’末端のそれぞれにおいて５末端塩基を含む）をフランキングするギャップマーを含む。
発現干渉ＲＮＡ（ｅｉＲＮＡ）は、標的遺伝子の発現を選択的に増加、減少させ、またはそうでなければモジュレートするために使用することができる。典型的には、ｅｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡを第１の形質移入細胞中で発現ベクターから発現させる。このようなベクターにおいて、ｄｓＲＮＡのセンスストランドおよびアンチセンスストランドは、例えば、核酸配列のいずれかの末端における２つのコンバージェント（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ）プロモーターまたはセンスもしくはアンチセンス配列のいずれかを転写する別個のプロモーターを使用して同一核酸配列から転写させることができる。あるいは、２つのプラスミドを、プラスミドの一方をｄｓＲＮＡの一方のストランドを転写するように設計する一方、他方を他方のストランドを転写するように設計して同時形質移入することができる。ｅｉＲＮＡエフェクター分子を作製および使用する方法は、当分野において公知である。例えば、国際公開第２００６／０３３７５６号パンフレット；米国特許出願公開第２００５／０２３９７２８号明細書および米国特許出願公開第２００６／００３５３４４号明細書参照。
一部の実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、標的遺伝子と実質的に相補的であり、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質のＰｉｗｉまたはＡｕｂｅｒｇｉｎｅサブクラスのタンパク質に選択的に結合する小分子一本鎖Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡエフェクター分子）を含む。ｐｉＲＮＡエフェクター分子は、約１０から５０ヌクレオチド長、約２５から３９ヌクレオチド長、または約２６から３１ヌクレオチド長であり得る。例えば、米国特許出願公開第２００９／００６２２２８号明細書参照。
マイクロＲＮＡは、植物および動物のゲノム中のＤＮＡから転写されるが、タンパク質に翻訳されない高度に保存されたクラスのＲＮＡ小分子である。プレマイクロＲＮＡは、ｍｉＲＮＡにプロセシングされる。プロセシングされたマイクロＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中に取り込まれ、発生、細胞増殖、アポトーシスおよび分化のキー調節因子と同定されている一本鎖の約１７から２５ヌクレオチド（ｎｔ）ＲＮＡ分子である。これらは、特異的ｍＲＮＡの３’−非翻訳領域への結合により遺伝子発現の調節の役割を担うと思われる。マイクロＲＮＡは、例えば、標的化ｍＲＮＡの翻訳を阻害し、またはその分解を開始させることにより特異的標的遺伝子の転写後サイレンシングを引き起こす。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、標的核酸と完全に相補的である。他の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、標的核酸と非相補性の領域を有し、非相補性の領域における「突起」をもたらす。一部の実施形態において、非相補性の領域（突起）は、デュプレックス形成を可能とするために十分な相補性、例えば、完全な相補性の領域によりフランキングされる。例えば、相補性の領域は、少なくとも８から１０ヌクレオチド長（例えば、８、９、または１０ヌクレオチド長）である。
ｍｉＲＮＡは、例えば、ｍｉＲＮＡが標的核酸と完全に相補的でない場合、例えば、翻訳を抑制することにより、またはｍｉＲＮＡが完全なまたは高程度の相補性でその標的に結合する場合、標的ＲＮＡ分解を引き起こすことにより遺伝子発現を阻害し得る。さらなる実施形態において、ＲＮＡエフェクター分子は、内因性ｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡを標的化するオリゴヌクレオチド薬剤を含み得る。例えば、ＲＮＡエフェクターは、ＲＮＡエフェクターが標的遺伝子のｍｉＲＮＡベース阻害を緩和するように、標的遺伝子の発現を負に調節する内因性ｍｉＲＮＡを標的化し得る。
ｍｉＲＮＡは、天然に生じたヌクレオ塩基、糖、およびヌクレオチド内（骨格）共有結合を含み得、または所望の特性、例えば、細胞取り込みの向上、内因性ｍｉＲＮＡ標的についての親和性の向上、および／またはヌクレアーゼの存在下での安定性の増加を付与する１つ以上の非天然に生じた特徴部を含み得る。一部の実施形態において、特異的内因性ｍｉＲＮＡに結合するように設計されたｍｉＲＮＡは、標的ｍｉＲＮＡの少なくとも１０、２０、または２５以上の塩基と実質的な相補性、例えば、少なくとも７０％、８０％、９０％、または１００％の相補性を有する。ｍｉＲＮＡおよびプレｍｉＲＮＡを標的化する例示的なオリゴヌクレオチド薬剤は、例えば、米国特許出願公開第２００９０３１７９０７号明細書、米国特許出願公開第２００９０２９８１７４号明細書、米国特許出願公開第２００９０２９１９０７号明細書、米国特許出願公開第２００９０２９１９０６号明細書、米国特許出願公開第２００９０２８６９６９号明細書、米国特許出願公開第２００９０２３６２２５号明細書、米国特許出願公開第２００９０２２１６８５号明細書、米国特許出願公開第２００９０２０３８９３号明細書、米国特許出願公開第２００７００４９５４７号明細書、米国特許出願公開第２００５０２６１２１８号明細書、米国特許出願公開第２００９０２７５７２９号明細書、米国特許出願公開第２００９００４３０８２号明細書、米国特許出願公開第２００７０２８７１７９号明細書、米国特許出願公開第２００６０２１２９５０号明細書、米国特許出願公開第２００６０１６６９１０号明細書、米国特許出願公開第２００５０２２７９３４号明細書、米国特許出願公開第２００５０２２２０６７号明細書、米国特許出願公開第２００５０２２１４９０号明細書、米国特許出願公開第２００５０２２１２９３号明細書、米国特許出願公開第２００５０１８２００５号明細書、および米国特許出願公開第２００５００５９００５号明細書に記載されている。
ｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡは、１０から２００ヌクレオチド長、例えば、１６から８０ヌクレオチド長であり得る。成熟ｍｉＲＮＡは、１６から３０ヌクレオチド、例えば、２１から２５ヌクレオチドの長さ、特に２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長を有し得る。ｍｉＲＮＡ前駆体は、７０から１００ヌクレオチドの長さを有し得、ヘアピン立体構造を有し得る。一部の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、酵素ｃＤｉｃｅｒおよびＤｒｏｓｈａによりプレｍｉＲＮＡからインビボで生成される。ｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡは、細胞ベース系によりインビボで合成することができ、または化学合成することができる。ｍｉＲＮＡは、例えば、１つ以上の所望の特性、例えば、優れた安定性、標的核酸とのハイブリダイゼーション熱力学、特定の組織または細胞タイプへの標的化、および／またはエンドサイトーシス依存性もしくは非依存性機序による細胞浸透性を付与する改変を含み得る。改変は、配列特異性も増加させ得、結果的にオフサイト標的化を減少させ得る。
本明細書において、対象中の標的遺伝子の発現をモジュレートする治療核酸、例えば、ＲＮＡエフェクター分子の活性を判定するアッセイおよび方法が記載される。
ＩＶ．二本鎖ＲＮＡ
一実施形態において、ｉＲＮＡ薬剤は、細胞または哺乳動物中の標的遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含む。ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子の発現において形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部と相補性の領域を有するアンチセンスストランドを含む。相補性の領域は、３０ヌクレオチド長以下、一般に、１９〜２４ヌクレオチド長であり、ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子を発現する細胞との接触時、標的遺伝子の発現を、例えば、ＰＣＲもしくは分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）ベース法により、またはタンパク質ベース法により、例えば、ウエスタンブロットによりアッセイして少なくとも１０％だけ阻害する。一実施形態において、ｉＲＮＡ薬剤は、細胞または哺乳動物中の標的遺伝子の発現を活性化させる。細胞培養物、例えば、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、初代肝細胞、ＨｅｐＧ２細胞、初代培養細胞または対象からの生物試料中の標的遺伝子の発現は、、例えば、ｂＤＮＡもしくはＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイによりｍＲＮＡレベルを計測することにより、または例えば、ウエスタンブロッティングまたはフローサイトメトリック技術などを使用する免疫蛍光分析によりタンパク質レベルを計測することにより、アッセイすることができる。
ｄｓＲＮＡは、相補的であり、ｄｓＲＮＡが使用される条件下でハイブリダイズしてデュプレックス構造を形成する２つのＲＮＡストランドを含む。ｄｓＲＮＡの一方のストランド（アンチセンスストランド）は、標的配列と実質的に相補的な、一般に、完全に相補的な相補性の領域を含む。標的配列は、標的遺伝子の発現の間に形成されるｍＲＮＡの配列に由来し得る。他方のストランド（センスストランド）は、好適な条件下で合わせた場合、２つのストランドがハイブリダイズし、デュプレックス構造を形成するようにアンチセンスストランドと相補的な領域を含む。一般に、デュプレックス構造は、１５から３０塩基対（両端含む）、より一般には、１８から２５（両端含む）、さらにより一般には、１９から２４（両端含む）、最も一般には１９から２１塩基対長（両端含む）である。同様に、標的配列と相補性の領域は、１５から３０塩基対長（両端含む）、より一般には、１８から２５（両端含む）、さらにより一般には、１９から２４（両端含む）、最も一般には、１９から２１ヌクレオチド長（両端含む）である。一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、１５から２０ヌクレオチド長（両端含む）であり、他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、２５から３０ヌクレオチド長（両端含む）である。当業者は、開裂のために標的化されるＲＮＡの標的化領域が、より大きいＲＮＡ分子、多くはｍＲＮＡ分子の一部であることが最も多いことを認識する。関連する場合、ｍＲＮＡ標的の「一部」は、ＲＮＡｉ指向性開裂（すなわち、ＲＩＳＣ経路を介する開裂）のための基質であるために十分な長さのｍＲＮＡ標的の連続配列である。９塩基対ほどの短いデュプレックスを有するｄｓＲＮＡは、同一状況下で、ＲＮＡｉ指向性ＲＮＡ開裂を媒介し得る。標的は、少なくとも１５ヌクレオチド長、例えば、１５〜３０ヌクレオチド長であることが最も多い。
当業者は、デュプレックス領域、例えば、９から３６、例えば、１５〜３０塩基対のデュプレックス領域がｄｓＲＮＡの主要機能部分であることも認識する。したがって、一実施形態において、開裂のために所望のＲＮＡを標的化する例えば、１５〜３０塩基対の機能的デュプレックスにプロセシングされる程度で、３０塩基対超のデュプレックス領域を有するＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子の複合体は、ｄｓＲＮＡである。したがって、当業者は、一実施形態において、ｍｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであることを認識する。別の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、天然に生じたｍｉＲＮＡでない。別の実施形態において、標的遺伝子発現を標的化するために有用なｉＲＮＡ薬剤は、より大きいｄｓＲＮＡの開裂により標的細胞中で生成させない。
本明細書に記載のｄｓＲＮＡは、１つ以上の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含み得る。ｄｓＲＮＡは、さらに以下に考察される当分野において公知の標準的方法により、例えば、自動化ＤＮＡ合成装置、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．などから市販されているものの使用により合成することができる。一実施形態において、標的遺伝子は、ヒト遺伝子である。別の実施形態において、標的遺伝子は、マウスまたはラット遺伝子である。
一部の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、前駆タンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１７４９３６）、トランスチレチン（ＴＴＲ）（ＧｅｎＢａｎｋ参照番号ＮＭ＿０００３７１．３）、血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０２５３６６．２）、キネシン様タンパク質（ＫＳＰ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４５２３）、耳下腺プロリンリッチ唾液タンパク質Ｐｃ（ＰＣＳ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２０８７２．１）、アンギオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１４４９５．２）、アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ（ＡｐｏＣ３）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００４０．１）、ヘプシジン（ＳＬＣ１１Ａ２）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１７４１２９．１）、ｅｇｌ９ホモログ（ＥＧＬＮ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ１１１０５７．１）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＫ３６７３８４．１）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ６０２８１８．１）、ポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５０３０．３）、アルファ−アンチトリプシン（ＡＡＴ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００２９５．４）、活性化タンパク質Ｃ、膜貫通セリンプロテアーゼ６（ＴＭＰＲＳＳ６）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿１５３６０９．２）、クルッペル様因子４（ＫＬＦ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ６５８２４１．１）、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０２２８９３．３）、ｐ５３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１２６１１４．１）、カスパーゼ２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２２４．４）、β−カテニン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１９０４．３）、プロテインキナーゼＮ３（ＰＫＮ３）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１３３５５．３）、ハンチンチン（ＨＴＴ）（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２１１１．６）またはアルファシヌクレイン（ＳＮＣＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００７３０８．２）を標的化する。
したがって、一態様において、ｄｓＲＮＡは、少なくとも２つのヌクレオチド配列、センスおよびアンチセンス配列を含み、センスストランドは、表２または表３に提供される配列の群から選択される。この態様において、２つの配列の一方は、２つの配列の他方と相補的であり、配列の一方は、標的遺伝子の発現において生成されるｍＲＮＡの配列と実質的に相補的である。したがって、この態様において、ｄｓＲＮＡは、２つのオリゴヌクレオチドを含み、一方のオリゴヌクレオチドは、表２または表３におけるセンスストランドと記載され、第２のオリゴヌクレオチドは、表２または表３からのセンスストランドの対応するアンチセンスストランドとして記載される。本明細書の他箇所において記載されるとおり、および当分野において公知のとおり、ｄｓＲＮＡの相補的配列は、別個のオリゴヌクレオチド上での存在とは対照的に、単一核酸分子の自己相補的領域として含有させることもできる。
当業者は、２０から２３、しかし特に２１塩基対のデュプレックス構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉の誘導において特に有効であると支持されていることを十分認識する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ ２００１，２０：６８７７−６８８８）。しかしながら、より短いまたはより長いＲＮＡデュプレックス構造も有効であり得ることが見出されている。上記実施形態において、表２または表３に提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質のため、本明細書に記載のｄｓＲＮＡは、最低２１ｎｔの長さの少なくとも１つのストランドを含み得る。一端または両端上の数ヌクレオチドのみ不足する表２または表３の配列の１つを有するより短いデュプレックスが、上記ｄｓＲＮＡと比較して同様に有効であり得ることを合理的に予期することができる。したがって、表２または表３の配列の１つからの少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の連続ヌクレオチドの部分的配列を有し、完全配列を含むｄｓＲＮＡと５、１０、１５、２０、２５、または３０％以下の阻害だけ標的遺伝子の発現を阻害する能力が異なるｄｓＲＮＡが、本発明により企図される。
さらに、表２または表３に提供されるＲＮＡは、ＲＩＳＣ媒介開裂を受けやすいＴＴＲまたはＨＴＴ転写物中の部位を同定する。したがって、本発明は、このような配列の１つ内で標的化するｉＲＮＡをさらに挙げる。本明細書において使用されるｉＲＮＡは、その特定部位内のいずれかでｉＲＮＡが転写物の開裂を促進する場合、ＲＮＡ転写物の特定部位内で標的化すると言われる。このようなｉＲＮＡは、一般に、ＴＴＲまたはＨＴＴ遺伝子中の選択配列に連続する領域から取られた追加のヌクレオチド配列に結合している表２または表３に提供される配列の１つからの少なくとも１５連続ヌクレオチドを含む。
標的配列は、一般に、１５〜３０ヌクレオチド長である一方、任意の所与の標的ＲＮＡの開裂を指向するためのこの範囲での特定配列の好適性は広く変動する。本発明に記載の種々のソフトウエアパッケージおよび指針は、任意の所与の遺伝子標的のための最適な標的配列の同定のためのガイダンスを提供するが、所与のサイズ（非限定的な例として、２１ヌクレオチド）の「ウインドウ」または「マスク」を標的ＲＮＡ配列上に文字または図として（例として、例えば、インシリコで）配置して標的配列として機能し得るサイズ範囲の配列を同定する実験的アプローチを採用することもできる。配列「ウインドウ」を開始標的配列位置の１ヌクレオチド上流または下流に漸次移動させることにより、考えられる配列の完全なセットが選択される任意の所与の標的サイズについて同定されるまで、次の潜在的な標的配列を同定することができる。このプロセスは、系統的合成および最適に機能する配列を同定するための同定配列の試験（本明細書に記載のまたは当分野において公知のアッセイを使用）と連結させると、ｉＲＮＡ薬剤により標的化する場合、標的遺伝子発現の最良の阻害を媒介するＲＮＡ配列を同定し得る。したがって、例えば、表２および表３に同定される配列がＴＴＲおよびＨＴＴに対して有効な標的配列を表す一方、所与の配列の１ヌクレオチド上流または下流に漸次「ウインドウを歩行させ」て同等またはより良好な阻害特徴を有する配列を同定することにより阻害効率のさらなる最適化を達成することができることが企図される。
さらに、例えば、表２または表３に同定される任意の配列について、より長いまたはより短い配列を生成するようにヌクレオチドを系統的に追加または除去し、そのポイントから標的ＲＮＡの上方または下方により長いまたはより短いサイズのウインドウを歩行させることにより生成された配列を試験することによりさらなる最適化を達成することができることが企図される。ここでも、新たな候補標的を生成するためのこのアプローチを当分野において公知のまたは本明細書に記載の阻害アッセイにおける標的配列に基づくｉＲＮＡの有効性についての試験と連結させることは、阻害の効率のさらなる改善を導き得る。さらに依然として、このような最適化配列は、例えば、本明細書に記載のもしくは当分野において公知の改変ヌクレオチドの導入、オーバーハングの追加もしくは変化、または当分野において公知のおよび／もしくは本明細書において考察される他の改変により調整して発現インヒビターとして分子をさらに最適化することができる（例えば、血清安定性または循環半減期の増加、熱安定性の増加、膜貫通送達、特定位置または細胞タイプへの標的化の向上、サイレンシング経路酵素との相互作用の増加、エンドソームからの放出の増加など）。
本明細書に記載のｉＲＮＡは、標的配列に対する１つ以上のミスマッチを含有し得る。一実施形態において、本明細書に記載のｉＲＮＡは、３つ以下のミスマッチを含有する。ｉＲＮＡのアンチセンスストランドが標的配列に対するミスマッチを含有する場合、ミスマッチの領域は相補性の領域の中央に局在しないことが典型的である。ｉＲＮＡのアンチセンスストランドが標的配列に対するミスマッチを含有する場合、ミスマッチは相補性の領域の５’または３’末端のいずれかから最後の５ヌクレオチド内に限定されることが典型的である。例えば、標的遺伝子の領域と相補的な２３ヌクレオチドｉＲＮＡ薬剤ＲＮＡストランドについて、ＲＮＡストランドは、一般に、中央の１３ヌクレオチド内にいかなるミスマッチも含有しない。本明細書に記載の方法または当分野において公知の方法を使用して標的配列に対するミスマッチを含有するｉＲＮＡが標的遺伝子の発現の阻害において有効かどうかを判定することができる。標的遺伝子の発現の阻害におけるミスマッチを有するｉＲＮＡの効力の考慮は、特に標的遺伝子中の特定の相補性の領域が集団内の多型配列バリエーションを有することが公知である場合、重要である。
一実施形態において、ｄｓＲＮＡの少なくとも一端は、１から４、一般に、１または２ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを有する。少なくとも１つのヌクレオチドオーバーハングを有するこのようなｄｓＲＮＡは、それらの平滑末端相当物に対して意外にも優れた阻害特性を有する。さらに別の実施形態において、ｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡのＲＮＡは、安定性または他の利益特徴を向上させるように化学的に改変する。本発明において挙げられる核酸は、当分野において十分確立された方法、例えば、参照により本明細書に組み込まれる“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載のものにより合成および／または改変することができる。当業者に公知の任意の改変を、対象中の疾患の治療のための治療ｉＲＮＡの設計において使用することができる。改変としては、例えば、（ａ）末端改変、例えば、５’末端改変（リン酸化、コンジュゲーション、逆位結合など）３’末端改変（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆位結合など）、（ｂ）塩基改変、例えば、安定化塩基、脱安定化塩基、またはパートナーの拡張されたレパートリーと塩基対合する塩基による置き換え、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）、またはコンジュゲート塩基、（ｃ）糖改変（例えば、２’位または４’位における）または糖の置き換え、ならびに（ｄ）骨格改変、例として、ホスホジエステル結合の改変または置き換えが挙げられる。
一実施形態において、ｉＲＮＡは、ｉＲＮＡ薬剤の分布、標的化または寿命を変化させるリガンドを含有する。ある実施形態において、リガンドは、このようなリガンドが存在しない種と比較して選択標的、例えば、分子、細胞または細胞タイプ（例えば、肝臓細胞、例えば、肝細胞）、区画、例えば、細胞または臓器区画、組織、臓器または身体の領域についての親和性の向上を提供する。あるリガンドは、デュプレックス核酸におけるデュプレックス対合に関与しない。
リガンドとしては、天然に生じた物質、例えば、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、またはグロブリン）；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）；または脂質を挙げることができる。リガンドは、組換えまたは合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸でもあり得る。ポリアミノ酸の例としては、ポリアミノ酸が、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬアスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンであることが挙げられる。ポリアミンの例としては：ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、またはαヘリカルペプチドが挙げられる。
リガンドとしては、標的化基、例えば、細胞または組織標的化基、例えば、レクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、規定の細胞タイプ、例えば、腎細胞に結合する抗体も挙げることができる。標的化基は、サイロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントプロテインＡ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパラギネート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、ホレート、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ビオチン、またはＲＧＤペプチドもしくはＲＧＤペプチド模倣物であり得る。
リガンドの他の例としては、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サプフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、脂溶性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メンソール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾールコンジュゲート、テトラアザ大員環のＥｕ３＋錯体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰが挙げられる。
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、コリガンドについての特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、規定の細胞タイプ、例えば、癌細胞、内皮細胞、もしくは骨細胞に結合する抗体であり得る。リガンドとしては、ホルモンおよびホルモン受容体も挙げることができる。これらとしては、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、または多価フコースも挙げることができる。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化物質、またはＮＦ−κＢの活性化物質であり得る。
リガンドは、例えば、細胞骨格を破壊することにより、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、および／または中間フィラメントを破壊することにより細胞中へのｉＲＮＡ薬剤の取り込みを増加させ得る物質、例えば、薬物であり得る。薬物は、薬物は、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であり得る。
一部の実施形態において、本明細書に記載のｉＲＮＡに付着しているリガンドは、ＰＫモジュレーターとして作用する。本明細書において使用される「ＰＫモジュレーター」は、薬物動態モジュレーターを指す。ＰＫモジュレーターとしては、脂溶性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質アナログ、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫモジュレーターとしては、限定されるものではないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられる。多数のホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレオチドが血清タンパク質に結合することも公知であり、したがって、骨格中で複数のホスホロチオエート結合を含む短いオリゴヌクレオチド、例えば、約５塩基、１０塩基、１５塩基または２０塩基のオリゴヌクレオチドもリガンドとして（例えば、ＰＫモジュレートリガンドとして）本発明に従う。さらに、血清構成要素（例えば、血清タンパク質）に結合するアプタマーも、本明細書に記載の実施形態においてＰＫモジュレートリガンドとしての使用に好適である。
一部の実施形態において、ｉＲＮＡは、細胞のエンドソームまたはリソソーム区画中のｉＲＮＡの捕獲を妨げる配合物を含む。ある実施形態において、本発明のエンドソーム分解構成要素は、ｐＨ依存性膜活性および／または融合性を示すポリアニオンペプチドまたはペプチド模倣物であり得る。ペプチド模倣物は、ペプチドを模倣するように設計された小分子タンパク質様鎖であり得る。ペプチド模倣物は、分子の特性を変化させるための既存のペプチドの改変、または非天然アミノ酸もしくはそれらのアナログを使用するペプチド様分子の合成から生じ得る。ある実施形態において、これらは、ペプチドと比較して改善された安定性および／または生物活性を有する。ある実施形態において、エンドソーム分解構成要素は、エンドソームｐＨ（例えば、ｐＨ５〜６）においてその活性立体構造を取る。「活性」立体構造は、エンドソーム分解構成要素がエンドソームの溶解およびエンドソームから細胞の細胞質への、本発明において挙げられるモジュール組成物、またはその構成要素（例えば、核酸）のそのいずれかの輸送を促進する立体構造である。
例示的なエンドソーム分解構成要素としては、ＧＡＬＡペプチド（Ｓｕｂｂａｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７，２６：２９６４−２９７２）、ＥＡＬＡペプチド（Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９６，１１８：１５８１−１５８６）、およびそれらの誘導体 （Ｔｕｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２００２，１５５９：５６−６８）が挙げられ。ある実施形態において、エンドソーム分解構成要素は、ｐＨの変化に応答して電荷の変化またはプロトン化を受ける化学基（例えば、アミノ酸）を含有し得る。エンドソーム分解構成要素は、直鎖または分枝鎖であり得る。エンドソーム分解構成要素の例示的な一次配列としては、Ｈ２Ｎ−（ＡＡＬＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＥＡＡＡＡＧＧＣ）ＣＯ２Ｈ（配列番号２）；Ｈ２Ｎ−（ＡＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＡＡＡＧＧＣ）−ＣＯ２Ｈ（配列番号３）；およびＨ２Ｎ−（ＡＬＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＥＡ）−ＣＯＮＨ２（配列番号４）が挙げられる。
ある実施形態において、２つ以上のエンドソーム分解構成要素を本発明において挙げられるｉＲＮＡ薬剤中に取り込むことができる。一部の実施形態において、これは、ｉＲＮＡ薬剤中への同一のエンドソーム分解構成要素の２つ以上の取り込みを伴う。他の実施形態において、これは、ｉＲＮＡ薬剤中への２つ以上の異なるエンドソーム分解構成要素の取り込みを伴う。
脂質コンジュゲート
一実施形態において、リガンドまたはコンジュゲートは、脂質または脂質ベース分子である。このような脂質または脂質ベース分子は、典型的には、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、標的組織、例えば、身体の非腎臓標的組織へのコンジュゲートの分布を可能とする。例えば、標的組織は、肝臓、例として、肝臓の実質細胞であり得る。ＨＳＡに結合し得る他の分子をリガンドとして使用することもできる。例えば、ネプロキシンまたはアスピリンを使用することができる。脂質または脂質ベースリガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する耐性を増加させ得、（ｂ）標的細胞または細胞膜中への標的化もしくは輸送を増加させ得、および／または（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調整するために使用することができる。
脂質ベースリガンドは、標的組織へのコンジュゲートの結合をモジュレート、例えば、制御するために使用することができる。例えば、ＨＳＡにより強く結合する脂質または脂質ベースリガンドは、腎臓に標的化される可能性が低く、したがって、身体からクリアランスされる可能性が低い。ＨＳＡにそれほど強く結合しない脂質または脂質ベースリガンドは、コンジュゲートを腎臓に標的化させるために使用することができる。
一実施形態において、脂質ベースリガンドは、ＨＳＡに結合する。典型的には、これは、コンジュゲートが非腎臓組織に分布されるように十分な親和性でＨＳＡに結合する。しかしながら、親和性は、ＨＳＡリガンド結合が解かれ得ないほど強くあるべきではない。
別の実施形態において、脂質ベースリガンドは、コンジュゲートが腎臓に分布されるようにＨＳＡに弱く結合し、または全く結合しない。腎臓細胞を標的化する他の部分を、脂質ベースリガンドに代えて、またはそれに加えて使用することもできる。
別の態様において、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖細胞により取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。これらは、例えば、悪性または非悪性タイプ、例えば、癌細胞の不所望な細胞増殖を特徴とする障害の治療に特に有用である。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫが挙げられる。他の例示的なビタミンとしては、Ｂビタミン、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサルまたは癌細胞により取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素が挙げられる。ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も挙げられる。
細胞浸透ペプチド
対象へのｉＲＮＡの投与における使用に好適なペプチドは、天然ペプチド、例えば、ｔａｔまたはアンテナペディアペプチド、合成ペプチド、またはペプチド模倣物であり得る。さらに、ペプチドは、改変ペプチドであり得、例えば、ペプチドは、非ペプチドまたはシュードペプチド結合、およびＤ−アミノ酸を含み得る。ペプチド模倣物（本明細書においてオリゴペプチド模倣物とも称される）は、天然ペプチドと類似の規定の三次元構造にフォールドし得る分子である。ｉＲＮＡへのペプチドおよびペプチド模倣物の付着は、例えば、細胞認識および吸収を向上させることによりｉＲＮＡの薬物動態分布に影響し得る。ペプチドまたはペプチド模倣物部分は、約５〜５０アミノ酸長、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長であり得る。
ペプチドまたはペプチド模倣物は、例えば、細胞浸透ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば、主としてＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束ペプチドまたは架橋ペプチドであり得る。別の代替例において、ペプチド部分としては、疎水性膜輸送配列（ＭＴＳ）を挙げることができる。例示的疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号５）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦアナログ（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号６））も標的化部分であり得る。ペプチド部分は、巨大極性分子、例として、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を細胞膜を越えて担持し得る「送達」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶＴａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号７））およびショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）アンテナペディアタンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号８））からの配列が、送達ペプチドとして機能し得ることが見出されている。ペプチドまたはペプチド模倣物、例えば、ファージディスプレイライブラリーまたはワン・ビーズ・ワン化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ−ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから同定されたペプチドをＤＮＡのランダム配列によりコードさせることができる（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−８４，１９９１）．。例えば、脂質に繋留しているペプチドまたはペプチド模倣物は、細胞標的化ペプチド、例えば、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチド、またはＲＧＤ模倣物であり得る。ペプチド部分は、約５アミノ酸から約４０アミノ酸の長さの範囲であり得る。ペプチド部分は、例えば、安定性を増加させ、または立体構造特性を指向するための構造的改変を有し得る。以下に記載される構造的改変のいずれかを利用することができる。
ＲＧＤペプチド部分は、腫瘍細胞、例えば、内皮腫瘍細胞または乳癌腫瘍細胞を標的化するために使用することができ（Ｚｉｔｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６２：５１３９−４３，２００２）る。ＲＧＤペプチドは、種々の他の組織、例として、肺、腎臓、脾臓、または肝臓の腫瘍へのｄｓＲＮＡ薬剤の標的化を易化し得る（Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：７８３−７８７，２００１）。一部の実施形態において、ＲＧＤペプチドは、腎臓へのｉＲＮＡ薬剤の標的化を易化する。ＲＧＤペプチドは、直鎖または環状であり得、改変、例えば、グリコシル化またはメチル化して規定の組織への標的化を易化することができる。例えば、グリコシル化ＲＧＤペプチドは、αＶβ３を発現する腫瘍細胞にｉＲＮＡ薬剤を送達し得る（Ｈａｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４２：３２６−３３６，２００１）。
増殖細胞中で濃縮されるマーカーを標的化するペプチドを使用することができる。例えば、ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチド模倣物は、癌細胞、特にαｖβ３インテグリンを示す細胞を標的化し得る。したがって、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤを含有する環状ペプチド、Ｄ−アミノ酸を含むＲＧＤペプチド、および合成ＲＧＤ模倣物を使用することができる。ＲＧＤに加え、αｖβ３インテグリンリガンドを標的化する他の部分を使用することができる。一般に、このようなリガンドは、増殖細胞および血管新生を制御するために使用することができる。
「細胞浸透ペプチド」は、細胞、例えば、微生物細胞、例えば、細菌もしくは真菌細胞、または哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞に浸透し得る。微生物細胞浸透ペプチドは、例えば、α−ヘリカル直鎖ペプチド（例えば、ＬＬ−３７またはセロピン（Ｃｅｒｏｐｉｎ）Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α−デフェンシン、β−デフェンシンまたはバクテネシン）、または１もしくは２つの優勢アミノ酸のみを含有するペプチド（例えば、ＰＲ−３９またはインドリシジン）であり得る。細胞浸透ペプチドは、核定位シグナル（ＮＬＳ）も含み得る。例えば、細胞浸透ペプチドは、二分両親媒性ペプチド、例えば、ＨＩＶ−１ｇｐ４１およびＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳの融合ペプチドドメインに由来するＭＰＧであり得る（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７−２７２４，２００３）．。
炭水化物コンジュゲート
一部の実施形態において、本明細書に記載のｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、炭水化物コンジュゲートをさらに含み得る。炭水化物コンジュゲートは、本明細書に記載のインビボ治療使用に好適な核酸、および組成物のインビボ送達に有利である。本明細書において使用される「炭水化物」は、少なくとも６つの炭素原子（直鎖、分枝鎖または環状であり得る）をそれぞれの炭素原子に結合している酸素、窒素または硫黄原子とともに有する１つ以上の単糖単位から構成されるそれ自体炭水化物である化合物；または少なくとも６つの炭素原子（直鎖、分枝鎖または環状であり得る）をそれぞれの炭素原子に結合している酸素、窒素または硫黄原子とともにそれぞれ有する１つ以上の単糖単位から構成される炭水化物部分を一部として有する化合物を指す。代表的な炭水化物としては、糖（約４〜９つの単糖単位を含有する単糖、二糖、三糖およびオリゴ糖）、および多糖、例えば、デンプン、グリコーゲン、セルロースおよび多糖ゴムが挙げられる。具体的な単糖としては、Ｃ５および上記（例えば、Ｃ５〜Ｃ８）糖が挙げられ；二糖および三糖としては、２または３つの単糖単位（例えば、Ｃ５〜Ｃ８）を有する糖が挙げられる。一部の実施形態において、炭水化物コンジュゲートは、他のリガンド、例えば、限定されるものではないが、ＰＫモジュレーター、エンドソーム分解リガンド、および細胞浸透ペプチドをさらに含む。
リンカー
一部の実施形態において、本明細書に記載のコンジュゲートは、開裂可能または開裂不能であり得る種々のリンカーによりｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに付着させることができる。用語「リンカー」または「結合基」は、化合物の２つの部分を結合させる有機部分を意味する。リンカーは、典型的には、直接結合または原子、例えば、酸素または硫黄、単位、例えば、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨまたは原子の鎖、例えば、限定されるものではないが、置換または非置換アルキル、置換または非置換アルケニル、置換または非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘレロシクリルアルキニル（ａｌｋｙｌ ｈｅｒｅｒｏｃｙｃｌｙｌａｌｋｙｎｙｌ）、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘレロアリール（ａｌｋｙｎｙｌｈｅｒｅｒｏａｒｙｌ）を含み、１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換複素環化合物により中断または終結されていてよく；Ｒ８は、水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族化合物である。一実施形態において、リンカーは、１〜２４原子、例えば、４〜２４原子、６〜１８原子、８〜１８原子、または８〜１６原子であり得る。
他の改変
ある例において、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンド基により改変することができる。ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取り込みを向上させるために多数の非リガンド分子がｉＲＮＡにコンジュゲートされており、そのようなコンジュゲーションを実施するための手順は、科学文献において利用可能である。このような非リガンド部分としては、脂質部分、例えば、コレステロール（Ｋｕｂｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００７，３６５（１）：５４−６１；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０：１１１；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）が挙げられている。
このようなＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許は、上記に列記した。典型的なコンジュゲーションプロトコルは、配列の１つ以上の位置においてアミノリンカーを担持するＲＮＡの合成を含む。次いで、適切なカップリングまたは活性化試薬を使用してアミノ酸をコンジュゲートされる分子と反応させる。コンジュゲーション反応は、固体担体に依然として結合しているＲＮＡを用いて、またはＲＮＡの開裂後に溶液相中で実施することができる。ＨＰＬＣによるＲＮＡコンジュゲートの精製は、典型的には、純粋なコンジュゲートをもたらす。
ｉＲＮＡの送達
ｉＲＮＡの、それを必要とする対象への送達は、多数の異なる手法において達成することができる。インビボ送達は、ｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡを含む組成物を対象に投与することにより直接的に実施することができる。あるいは、送達は、ｉＲＮＡをコードし、その発現を指向する１つ以上のベクターを投与することにより間接的に実施することができる。
ｉＲＮＡ組成物の直接送達
一般に、核酸分子を送達する任意の方法を、ｉＲＮＡを用いる使用に適合させることができる（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるＡｋｈｔａｒ Ｓ．ａｎｄ Ｊｕｌｉａｎ ＲＬ．（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（５）：１３９−１４４および国際公開第９４／０２５９５号パンフレット参照）。ｉＲＮＡの非特異的効果は、局所投与により、例えば、組織（非限定的な例として、腫瘍）中への直接注射もしくは植込みにより、または調製物を局所投与することにより最小化することができる。治療部位への局所投与は、薬剤の局所濃度を最大化し、他では薬剤により害され得、または薬剤を分解し得る全身組織への薬剤の曝露を限定し、投与すべきｉＲＮＡ分子のより低い総用量を可能とする。
疾患の治療のためにｉＲＮＡを全身投与するため、ＲＮＡを改変し、または薬物送達系を使用して送達することができ；両方法は、インビボでのエンドおよびエキソヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの急速な分解を妨げるように作用する。ＲＮＡまたは医薬担体の改変は、標的組織へのｉＲＮＡ組成物の標的化も可能とし、不所望なオフターゲット効果を回避し得る。ｉＲＮＡ分子は、細胞取り込みを向上させ、分解を妨げるために脂溶性基、例えば、コレステロールへの化学コンジュゲーションにより改変することができる。
代替的実施形態において、ｉＲＮＡは、薬物送達系、例えば、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達系を使用して送達することができる。正荷電カチオン性送達系は、ｉＲＮＡ分子（負荷電）の結合を易化し、負荷電細胞膜における相互作用も向上させて細胞によるｉＲＮＡの効率的な取り込みを可能とする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、ｉＲＮＡに結合させ、またはｉＲＮＡを包む小胞もしくはミセルを形成するように誘導することができる（例えば、Ｋｉｍ ＳＨ．，ｅｔ ａｌ（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １２９（２）：１０７−１１６参照）。小胞またはミセルの形成は、全身投与時のｉＲＮＡの分解をさらに妨げる。
カチオン性ｉＲＮＡ複合体を作製および投与する方法は、十分に当業者の能力の範囲内である（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるＳｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ３２７：７６１−７６６；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．，ｅｔ ａｌ（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：１２９１−１３００；Ａｒｎｏｌｄ，ＡＳ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２５：１９７−２０５参照）。ｉＲＮＡの全身送達に有用な薬物送達系の一部の非限定的な例としては、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ（２００３）、前掲；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．，ｅｔ ａｌ（２００３）、前掲）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、“ｓｏｌｉｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｌｉｐｉｄ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ”（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＴＳ．，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１−１１４）、カルジオリピン（Ｃｈｉｅｎ，ＰＹ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：３２１−３２８；Ｐａｌ，Ａ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｉｎｔ Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１０８７−１０９１）、ポリエチレンイミン（Ｂｏｎｎｅｔ ＭＥ．，ｅｔ ａｌ（２００８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．Ａｕｇ １６ Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ；Ａｉｇｎｅｒ，Ａ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７１６５９）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Ｌｉｕ，Ｓ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．３：４７２−４８７）、およびポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ，ＤＡ．，ｅｔ ａｌ（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：６１−６７；Ｙｏｏ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１７９９−１８０４）が挙げられる。一部の実施形態において、ｉＲＮＡは、全身投与のためのシクロデキストリンと複合体を形成する。ｉＲＮＡおよびシクロデキストリンの投与方法および医薬組成物は、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第７，４２７，６０５号明細書に見出すことができる。
ベクターコードｉＲＮＡ
一態様において、本明細書に記載のアッセイおよび方法は、ベクター発現ｉＲＮＡにより治療された対象から得られた試料中の標的ＲＮＡを計測することによりｉＲＮＡ活性を判定するために使用することができる。一実施形態において、ベクターは、本明細書に記載のｉＲＮＡの少なくとも１つのストランドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に結合している少なくとも１つの調節配列を含む。
別の態様において、所望の遺伝子を標的化するｉＲＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に挿入された転写単位から発現させることができる（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５−１０；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ国際公開第００／２２１１３号パンフレット、Ｃｏｎｒａｄ、ＰＣＴ国際公開第００／２２１１４号パンフレット、およびＣｏｎｒａｄ、米国特許第６，０５４，２９９号明細書参照）。発現は、使用される特異的構築物および標的組織または細胞タイプに応じて一過的（約数時間から数週間のオーダー）または持続的（数週間から数か月以上）であり得る。これらのトランス遺伝子は、直鎖構築物、環状プラスミド、または統合もしくは非統合ベクターであり得るウイルスベクターとして導入することができる。トランス遺伝子は、それの染色体外プラスミドとしての遺伝を可能とするように構築することもできる（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。
ｉＲＮＡの個々の１つまたは複数のストランドは、発現ベクター上のプロモーターから転写させることができる。２つの別個のストランドを発現させ、例えば、ｄｓＲＮＡを生成すべき場合、２つの別個の発現ベクターを標的細胞中に同時導入することができる（例えば、形質移入または感染による）。あるいは、ｄｓＲＮＡのそれぞれの個々のストランドは、両方とも同一の発現プラスミド上に局在するプロモーターにより転写させることができる。一実施形態において、ｄｓＲＮＡのストランドは、ｄｓＲＮＡがステムおよびループ構造を有するようにリンカーポリヌクレオチド配列により結合している逆位反復ポリヌクレオチドとして発現させる。
ｉＲＮＡ発現ベクターは、一般に、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。真核細胞と適合可能な発現ベクター、例えば、脊椎動物細胞と適合可能なものを、本明細書に記載のｉＲＮＡの発現のための組換え構築物を産生させるために使用することができる。真核細胞発現ベクターは、当分野において周知であり、多数の市販源から入手可能である。典型的には、所望の核酸セグメントの挿入のための簡便な制限部位を含有するこのようなベクターが提供される。ｉＲＮＡ発現ベクターの送達は、例えば、静脈内もしくは筋肉内投与による、患者から取り出された標的細胞への投与に続く患者への再導入による、または所望の標的細胞中への導入を可能とする任意の他の手段による全身的なものであり得る。
ｉＲＮＡ発現プラスミドは、カチオン性脂質担体（例えば、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）または非カチオン性脂質ベース担体（例えば、Ｔｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯＴＭ）との複合体として標的細胞中に形質移入することができる。１週間以上の期間にわたる標的ＲＮＡの異なる領域を標的化するｉＲＮＡ媒介ノックダウンのための複数の脂質形質移入も、本発明により企図される。宿主細胞中へのベクターの連続導入は、種々の公知の方法を使用してモニタリングすることができる。例えば、一過的形質移入は、レポーター、例えば、蛍光マーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）によりシグナル発生させることができる。エクスビボでの細胞の安定的形質移入は、規定の環境因子（例えば、抗生物質および薬物）に対する耐性、例えば、ハイグロマイシンＢ耐性を有する形質移入細胞を提供するマーカーを使用して確保することができる。
本明細書に記載の方法および組成物について利用することができるウイルスベクター系としては、限定されるものではないが、（ａ）アデノウイルスベクター；（ｂ）レトロウイルスベクター、例として、限定されるものではないが、レンチウイルスベクター、モロニーネズミ白血球ウイルスなど；（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター；（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクター；（ｇ）パピローマウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウイルスベクター；（ｉ）ポックスウイルスベクター、例えば、オルソポックス、例えば、ワクシニアウイルスベクターまたはアビポックス、例えば、カナリア痘または鶏痘；および（ｊ）ヘルパー依存性またはガットレスアデノウイルスが挙げられる。複製欠損ベクターも有利であり得る。異なるベクターを細胞のゲノム中に取り込み、または取り込まない。構築物は、所望により形質移入のためのウイルス配列を含み得る。あるいは、構築物は、エピソーム複製可能なベクター、例えば、ＥＰＶおよびＥＢＶベクター中に取り込むことができる。ｉＲＮＡの組換え発現のための構築物は、一般に、例えば、標的細胞中のｉＲＮＡの発現を確保するために調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサーなどを要求する。ベクターおよび構築物について考慮する他の態様を以下にさらに記載する。
ｉＲＮＡの送達に有用なベクターは、所望の標的細胞または組織中のｉＲＮＡの発現に十分な調節配列（プロモーター、エンハンサーなど）を含む。調節配列は、構成性または調節／誘導性発現のいずれかを提供するように選択することができる。
ｉＲＮＡの発現は、例えば、ある生理学的調節因子、例えば、循環グルコースレベル、またはホルモンに感受性の誘導性調節配列を使用することにより正確に調節することができる（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＦＡＳＥＢ Ｊ．８：２０−２４）。細胞または哺乳動物中のｄｓＲＮＡ発現の制御に好適なこのような誘導性発現系としては、例えば、エクジソンによる、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、ダイマー化の化学誘導物質、およびイソプロピル−β−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による調節が挙げられる。当業者は、ｉＲＮＡトランス遺伝子の意図される使用に基づき適切な調節／プロモーター配列を選択することができる。
具体的な実施形態において、ｉＲＮＡをコードする核酸配列を含有するウイルスベクターを使用することができる。例えば、レトロウイルスベクターを使用することができる（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３）参照）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正確なパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡ中への統合に必要な構成要素を含有する。ｉＲＮＡをコードする核酸配列は、１つ以上のベクター中でクローニングし、患者中への核酸の送達を易化する。レトロウイルスベクターについてのさらなる詳細は、例えば、Ｂｏｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２（１９９４）に見出すことができ、それは、ｍｄｒ１遺伝子を造血幹細胞に送達して幹細胞を化学療法に対してより耐性とするためのレトロウイルスベクターの使用を記載している。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参照文献は：Ｃｌｏｗｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９９４）；Ｋｉｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３（１９９４）；Ｓａｌｍｏｎｓ ａｎｄ Ｇｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９−１４１（１９９３）；およびＧｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３：１１０−１１４（１９９３）である。使用について企図されるレンチウイルスベクターとしては、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，１４３，５２０号明細書；米国特許第５，６６５，５５７号明細書；および米国特許第５，９８１，２７６号明細書に記載のＨＩＶベースベクターが挙げられる。
アデノウイルスも、ｉＲＮＡの送達における使用について企図される。アデノウイルスは、例えば、遺伝子を呼吸上皮に送達するために魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは天然には呼吸上皮に感染し、それらはそこで軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルスベース送達系のための他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染し得るという利点を有する。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用も企図される（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号明細書）。一実施形態において、ｉＲＮＡは、例えば、Ｕ６もしくはＨ１ＲＮＡプロモーターまたはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかを有する組換えＡＡＶベクターから２つの別個の相補的一本鎖ＲＮＡ分子として発現させることができる。本発明において挙げられるｄｓＲＮＡを発現させるための好適なＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築する方法、およびベクターを標的細胞中に送達する方法は、全開示が参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０−５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２６；米国特許第５，２５２，４７９号明細書；米国特許第５，１３９，９４１号明細書；国際特許出願国際公開第９４／１３７８８号パンフレット；および国際特許出願国際公開第９３／２４６４１号パンフレットに記載されている。
別の例示的ウイルスベクターは、ポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルス、例えば、減衰ワクシニア、例えば、改変ウイルスアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）またはＮＹＶＡＣ、アビポックス、例えば、鶏痘またはカナリア痘である。
ウイルスベクターの向性は、ベクターを他のウイルスからのエンベロープタンパク質もしくは他の表面抗原によりシュードタイプ化することにより、または異なるウイルスキャプシドタンパク質を置換することにより適宜改変することができる。例えば、レンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラなどからの表面タンパク質によりシュードタイプ化することができる。ＡＡＶベクターは、異なるキャプシドタンパク質血清型を発現するようにベクターをエンジニアリングすることにより異なる細胞を標的化するように作製することができる、例えば、全開示が参照により本明細書に組み込まれるＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７９１−８０１参照。
ベクターの医薬調製物は、ベクターを許容可能な希釈剤中で含み得、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放マトリックスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクター、例えば、レトロウイルスベクターを組換え細胞からインタクトで産生することができる場合、医薬調製物は、遺伝子送達系を産生する１つ以上の細胞を含み得る。
Ｖ．治療核酸を含有する医薬組成物
本明細書に記載のアッセイは、標的組織への治療核酸、例えば、ｉＲＮＡ薬剤の送達を検出するためおよび治療核酸の活性をモニタリングするために有用である。対象に投与すべき治療核酸は、治療核酸、例えば、ｉＲＮＡ、および薬学的に許容可能な担体を含有する医薬組成物として配合する。例えば、ｉＲＮＡを含有する医薬組成物は、標的遺伝子の発現または活性に伴う疾患または障害、例えば、標的遺伝子発現により媒介される病理学的プロセスの治療に有用である。このような医薬組成物は、送達方式に基づき配合する。一例としては、組成物を、非経口送達を介する、例えば、静脈内（ＩＶ）送達による全身投与のために配合することが挙げられる。
医薬組成物は、標的遺伝子の発現を阻害するために十分な投与量で投与する。一般に、治療核酸、例えば、ｉＲＮＡの好適な用量は、１日当たり受容者の体重１キログラム当たり０．００１から２００．０ミリグラムの範囲、一般に、１日当たり体重１キログラム当たり０．０１から５０ｍｇの範囲である。例えば、ｉＲＮＡは、単一用量当たり０．０１、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇにおいて投与することができる。医薬組成物は、１日１回、または１週間に１回、または１か月に１回、または２か月に１回投与することができる。あるいは、組成物は、１週間に２回もしくは１か月に２回、または２、３もしくは４週間に１回投与することができる。一部の実施形態において、治療核酸は、１日にわたり適切な間隔において２、３つ以上の下位用量としてまたはさらには制御放出配合物を介する連続注入もしくは送達を使用して投与する。その場合、それぞれの下位用量に含有される治療核酸は、総１日投与量を達成するために相応により小さくなければならない。別の場合、治療核酸は、連続注入により、例えば、ＣＮＳ中への、例えば、脳実質中への連続頭蓋内注入、連続脳室内注入、または連続鞘内注入により投与することができる。投与量単位は、例えば、数日の期間にわたる治療核酸の徐放を提供する慣用の徐放配合物を使用して数日にわたる送達のために配合することもできる。徐放配合物は、当分野において周知であり、例えば、本発明の薬剤について使用することができる特定部位における薬剤の送達に特に有用である。この実施形態において、投与量単位は、対応する複数の１日用量を含有する。
一実施形態において、標的ｍＲＮＡレベルに対するｉＲＮＡの単一用量の効果は、後続の用量を３、４、もしくは５日間隔以下において、または１、２、３、もしくは４週間以下の間隔において投与するように長時間持続し得る。
当業者は、ある要因、例として、限定されるものではないが、疾患もしくは障害の重症度、以前の治療、対象の全身健康状態および／または年齢、ならびに存在する他の疾患が対象を効率的に治療するために要求される投与量およびタイミングに影響し得ることを認識する。さらに、治療有効量の組成物による対象の治療としては、単一治療または一連の治療を挙げることができる。本発明により包含される個々のｉＲＮＡについての有効投与量およびインビボ半減期の推定は、慣用の方法を使用して、または本明細書の他箇所に記載の適切な動物モデルを使用するインビボ試験に基づき行うことができる。
マウス遺伝学の進歩により、種々のヒト疾患の研究のために多数のマウスモデルが生成されている。このようなモデルは、治療核酸のインビボ試験に、および治療有効用量の判定に使用することができる。好適なマウスモデルは、例えば、ヒト標的遺伝子を発現するトランス遺伝子を含有するマウスである。
医薬組成物は、望まれる治療が局所か全身かに応じて、および治療すべき区域に応じて多数の手法において投与することができる。投与は、局所（例えば、経皮貼付剤による）、肺（例えば、粉末またはエアゾールの吸入または吹送、例として、ネブライザーによる）；気管内、鼻腔内、上皮および経皮、経口または非経口投与であり得る。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射または注入；皮下、例えば、植込みデバイスを介するもの；または頭蓋内、例えば、実質内、鞘内または脳室内投与によるものが挙げられる。
治療核酸、例えば、ｉＲＮＡは、特定組織、例えば、肝臓（例えば、肝臓の肝細胞）を標的化する様式で送達することができる。
局所投与のための医薬組成物および配合物としては、経皮貼付剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、点眼剤、坐剤、噴霧剤、液剤および散剤を挙げることができる。慣用の医薬担体、水性粉末または油性基剤、増粘剤などが必要なまたは望まれることがある。被覆コンドーム、手袋なども有用であり得る。好適な局所配合物としては、本明細書において挙げられるｉＲＮＡが局所送達剤、例えば、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤および界面活性剤との混合物として存在するものが挙げられる。好適な脂質およびリポソームとしては、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。本発明において挙げられるｉＲＮＡは、リポソーム内に封入することができ、またはそれとの複合体、特にカチオン性リポソームとの複合体を形成し得る。あるいは、ｉＲＮＡは、脂質、特にカチオン性脂質と複合体化させることができる。好適な脂肪酸およびエステルとしては、限定されるものではないが、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセイル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アクリルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１〜２０アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリステートＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリドまたは薬学的に許容可能なそれらの塩が挙げられる。局所配合物は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳述されている。
リポソーム配合物
一部の実施形態において、ＲＮＡもしくはＤＮＡエフェクター分子またはｉＲＮＡ配合物は、リポソームを含む。異なるリポソーム配合物の一部の非限定的な例を以下に考察する。
リポソームは、２つの広いクラスに分けられる。カチオン性リポソームは、負荷電ＤＮＡ分子と相互作用して安定複合体を形成する正荷電リポソームである。正荷電ＤＮＡ／リポソーム複合体は、負荷電細胞表面に結合し、エンドソーム中で内在化される。エンドソーム内の酸性ｐＨに起因して、リポソームは破裂し、それらの内容物を細胞質中に放出する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０−９８５）。
ｐＨ感受性または負荷電のリポソームは、核酸と複合体化せずに核酸を捕獲する。ＤＮＡおよび脂質の両方が類似の荷電を示すため、複合体形成ではなく破裂が生じる。これにもかかわらず、一部のＤＮＡは、これらのリポソームの水性内部に捕獲される。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードする核酸を培養物中の細胞単層に送達するために使用されている。外因性遺伝子の発現は、標的細胞中で検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９−２７４）。
１つの主要なタイプのリポソーム組成物としては、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質が挙げられる。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は、一般に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成する一方、アニオン性融合リポソームは、主としてジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成する。別のタイプのリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、例えば、ダイズＰＣ、卵ＰＣなどから形成する。別のタイプは、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成する。
非イオン性リポソーム系、特に非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む系も、皮膚への薬物の送達のそれらの有用性を判定するために試験されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（グリセリルジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（グリセリルジステアレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム配合物は、シクロスポリン−Ａをマウス皮膚の真皮中に送達するために使用された。結果は、そのような非イオン性リポソーム系が皮膚の異なる層中へのシクロスポリンＡの沈着の易化において有効であることを示した（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９９４，４，６，４６６）。
リポソームとしては、リポソーム中に取り込まれた場合、特殊化脂質を欠くリポソームに対して循環寿命の向上をもたらす１つ以上の特殊化脂質を含むリポソームを指す本明細書において使用される用語「立体安定化」リポソームも挙げられる。立体安定化リポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が（Ａ）１つ以上の糖脂質、例えば、モノシアロガングリオシドＧＭ１を含み、または（Ｂ）１つ以上の親水性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分により誘導体化されているものである。いかなる特定の理論によっても拘束されるものではないが、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含有する立体安定化リポソームについて、それらの立体安定化リポソームの循環半減期の向上は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞中への取り込みの低減に由来すると当分野において考えられる（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２２３，４２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３，３７６５）。
１つ以上の糖脂質を含む種々のリポソームは、当分野において公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、ガラクトセレブロシドスルフェートおよびホスファチジルイノシトールの、リポソームの血中半減期を改善させる能力を報告した。これらの知見は、Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５，６９４９）により十分説明された。両方ともＡｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許第４，８３７，０２８号明細書および国際公開第８８／０４９２４号パンフレットは、（１）スフィンゴミエリンおよび（２）ガングリオシドＧＭ１またはガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームを開示している。米国特許第５，５４３，１５２号明細書（Ｗｅｂｂ ｅｔ ａｌ．）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、国際公開第９７／１３４９９号パンフレット（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ）に開示されている。
１つ以上の親水性ポリマーにより誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、およびその調製方法は、当分野において公知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９８０，５３，２７７８）は、ＰＥＧ部分を含有する非イオン性洗浄剤２Ｃ１２１５Ｇを含むリポソームを記載した。Ｉｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９８４，１６７，７９）は、ポリマーグリコールによるポリスチレン粒子の親水性コーティングが血中半減期の顕著な向上をもたらすことを着目した。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボキシル基の付着により改変された合成リン脂質は、Ｓｅａｒｓ（米国特許第４，４２６，３３０号明細書および米国特許第４，５３４，８９９号明細書）により記載されている。Ｋｌｉｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２６８，２３５）は、ＰＥＧまたはＰＥＧステアレートにより誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが血中循環半減期の顕著な増加を有することを実証する実験を記載した。Ｂｌｕｍｅ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１）は、他のＰＥＧ誘導体化リン脂質、例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）およびＰＥＧの組合せから形成されたＤＳＰＥ−ＰＥＧにそのような観察を拡張した。外表面上に共有結合ＰＥＧ部分を有するリポソームは、Ｆｉｓｈｅｒの欧州特許第０４４５１３１Ｂ１号明細書および国際公開第９０／０４３８４号パンフレットに記載されている。１〜２０モルパーセントのＰＥＧにより誘導体化されたＰＥを含有するリポソーム、およびその使用方法は、Ｗｏｏｄｌｅ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，０１３，５５６号明細書および米国特許第５，３５６，６３３号明細書）およびＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，２１３，８０４号明細書および欧州特許第０４９６８１３Ｂ１号明細書）により記載されている。多数の他の脂質ポリマーコンジュゲートを含むリポソームは、国際公開第９１／０５５４５号パンフレットおよび米国特許第５，２２５，２１２号明細書（両方ともＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．）ならびに国際公開第９４／２００７３号パンフレット（Ｚａｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ．）に開示されている。ＰＥＧ改変セラミド脂質を含むリポソームは、国際公開第９６／１０３９１号パンフレット（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ）に記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号明細書（Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．）および米国特許第５，５５６，９４８号明細書（Ｔａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．）は、表面上の機能的部分によりさらに誘導体化することができるＰＥＧ含有リポソームを記載している。
核酸を含む多数のリポソームが当分野において公知である。Ｔｈｉｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．の国際公開第９６／４００６２号パンフレットは、高分子量核酸をリポソーム中に封入する方法を開示している。Ｔａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，２６４，２２１号明細書は、タンパク質結合リポソームを開示し、そのようなリポソームの内容物がｄｓＲＮＡを含み得ることを主張している。Ｒａｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，６６５，７１０号明細書は、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソーム中に封入するある方法を記載している。Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．の国際公開第９７／０４７８７号パンフレットは、ｒａｆ遺伝子に標的化されるｄｓＲＮＡを含むリポソームを開示している。
トランスファーソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）は、さらに別のタイプのリポソームであり、薬物送達ビヒクルのための魅力的な候補である高度に変形可能な脂質凝集物である。トランスファーソームは、それらが液滴よりも小さい細孔を介して容易に浸透し得るほど高度に変形可能な脂質液滴として記載することができる。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適合可能であり、例えば、それらは自己最適化性（皮膚中の細孔の形状に適合可能）であり、自己修復性であり、断片化せずにそれらの標的に高頻度で到達し、自己負荷性であることが多い。トランスファーソームを作製するため、表面縁部活性化物質、通常、界面活性剤を標準的なリポソーム組成物に添加することが可能である。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚に送達するために使用されている。血清アルブミンのトランスファーソーム媒介送達は、血清アルブミンを含有する液剤の皮下注射と同程度に有効であることが示されている。
界面活性剤は、配合物、例えば、エマルション（例として、マイクロエマルション）およびリポソーム中に広く適用されている。天然および合成の両方の多くの異なるタイプの界面活性剤の特性を分類および順位付けする最も一般的な手法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基（「頭部」としても公知）の性質は、配合物中で使用される異なる界面活性剤をカテゴライズする最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
界面活性剤分子がイオン化されていない場合、それは、非イオン性界面活性剤と分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬および化粧製品中に広く適用されており、広範なｐＨ値にわたり使用可能である。一般に、これらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２から約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、非イオン性エステル、例えば、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシ化エステルが挙げられる。非イオン性アルカノールアミドおよびエーテル、例えば、脂肪酸アルコールエトキシレート、プロポキシ化アルコール、およびエトキシ化／プロポキシ化ブロックポリマーもこのクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスの最も一般的なメンバーである。
界面活性剤分子が水中に溶解または分散されたときに負電荷を担持する場合、界面活性剤はアニオン性と分類される。アニオン性界面活性剤としては、カルボキシレート、例えば、石鹸、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、硫酸のエステル、例えば、アルキルスルフェート、エトキシ化アルキルスルフェート、スルホネート、例えば、アルキルベンゼンスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレートおよびスルホスクシネート、およびホスフェートが挙げられる。アニオン性界面活性剤クラスの最も重要なメンバーは、硫酸アルキルおよび石鹸である。
界面活性剤分子が水中に溶解または分散されたときに正電荷を担持する場合、界面活性剤はカチオン性と分類される。カチオン性界面活性剤としては、第四級アンモニウム塩およびエトキシ化アミンが挙げられる。第四級アンモニウム塩は、このクラスの最も使用されるメンバーである。
界面活性剤分子が正電荷または負電荷のいずれも担持する能力を有する場合、界面活性剤は両性と分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタインおよびホスファチドが挙げられる。薬物製品、配合物およびエマルション中での界面活性剤の使用は、概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
核酸脂質粒子
一実施形態において、対象に投与されるｄｓＲＮＡは、脂質配合物中に完全に封入して例えば、ＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＳＮＡＬＰ、または他の核酸脂質粒子を形成する。
本明細書において使用される用語「ＳＮＡＬＰ」は、安定核酸脂質粒子、例として、ＳＰＬＰを指す。本明細書において使用される用語「ＳＰＬＰ」は、脂質小胞内に封入されたプラスミドＤＮＡを含む核酸脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、典型的には、カチオン性またはイオン化脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を妨げる脂質（例えば、ＰＥＧ−脂質コンジュゲート）を含有する。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、全身適用に極めて有用である。これというのも、これらが静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に循環寿命の延長を示し、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離隔した部位）において蓄積するためである。ＳＰＬＰとしては、ＰＣＴ国際公開第００／０３６８３号パンフレットに記載の封入された縮合剤−核酸複合体を含む「ｐＳＰＬＰ」が挙げられる。
粒子は、典型的には、約５０ｎｍから約１５０ｎｍ、より典型的には、約６０ｎｍから約１３０ｎｍ、より典型的には、約７０ｎｍから約１１０ｎｍ、最も典型的には、約７０ｎｍから約９０ｎｍの平均直径を有し、実質的に非毒性である。さらに、本発明の核酸−脂質粒子中に存在する核酸は、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に対する耐性を示す。核酸−脂質粒子およびそれらの調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号明細書；米国特許第５，９８１，５０１号明細書；米国特許第６，５３４，４８４号明細書；米国特許第６，５８６，４１０号明細書；米国特許第６，８１５，４３２号明細書；およびＰＣＴ国際公開第９６／４０９６４号パンフレットに開示されている。
一実施形態において、脂質と薬物との比（質量／質量比）（例えば、脂質とｄｓＲＮＡとの比）は、約１：１から約５０：１、約１：１から約２５：１、約３：１から約１５：１、約４：１から約１０：１、約５：１から約９：１、または約６：１から約９：１の範囲である。
カチオン性およびイオン化脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、または３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏ）（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）またはそのアナログ、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３），１，１’−（２−（４−（２−（（２−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）エチルアザネジイル）ジドデカン−２−オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）、またはそれらの混合物であり得る。カチオン性またはイオン化脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２０ｍｏｌ％から約５０ｍｏｌ％または約４０ｍｏｌ％含まれ得る。
別の実施形態において、化合物２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランを脂質−ｓｉＲＮＡナノ粒子を調製するために使用することができる。２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランの合成は、参照により本明細書に組み込まれる２００８年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／１０７，９９８号明細書に記載されている。
一実施形態において、脂質−ｓｉＲＮＡ粒子は、４０％の２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン：１０％のＤＳＰＣ：４０％のコレステロール：１０％のＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（モルパーセント）を含み、粒子サイズは、６３．０±２０ｎｍであり、ｓｉＲＮＡ／脂質比は、０．０２７である。
非カチオン性脂質は、アニオン性脂質または中性脂質、例として、限定されるものではないが、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−ｌ−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはそれらの混合物であり得る。非カチオン性脂質は、コレステロールが含まれる場合、粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％から約９０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％、または約５８ｍｏｌ％であり得る。
粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質、例として、限定されるものではないが、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）、またはそれらの混合物であり得る。ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ４）、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ６）、またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ］８）であり得る。粒子の凝集を妨げるコンジュゲート脂質は、粒子中に存在する総脂質の０ｍｏｌ％から約２０ｍｏｌ％または約２ｍｏｌ％であり得る。
一部の実施形態において、核酸−脂質粒子は、コレステロールを、例えば、粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％から約６０ｍｏｌ％または約４８ｍｏｌ％においてさらに含む。
ＬＮＰ０１
一実施形態において、脂質−ｄｓＲＮＡナノ粒子（すなわち、ＬＮＰ０１粒子）を調製するためにリピドイドＮＤ９８・４ＨＣｌ（ＭＷ１４８７）（参照により全体として本明細書に組み込まれる２００８年３月２６日に出願された米国特許出願第１２／０５６，２３０号明細書参照）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＰＥＧ−Ｃｅｒａｍｉｄｅ Ｃ１６（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を使用することができる。エタノール中のそれぞれの原液を以下のとおり調製することができる：ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍｌ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ−セラミドＣ１６、１００ｍｇ／ｍｌ。次いで、ＮＤ９８、コレステロール、およびＰＥＧ−セラミドＣ１６原液を例えば、４２：４８：１０のモル比で合わせることができる。合わせた脂質溶液を水性ｄｓＲＮＡ（例えば、酢酸ナトリウムｐＨ５中）と、最終エタノール濃度が約３５〜４５％になり、最終酢酸ナトリウム濃度が約１００〜３００ｍＭになるように混合することができる。脂質−ｄｓＲＮＡナノ粒子は、典型的には、混合時に自然に形成する。所望の粒子サイズ分布に応じて、得られたナノ粒子混合物を、例えば、サーモバレル（ｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ）押出機、例えば、Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）を使用してポリカーボネート膜（例えば、１００ｎｍカットオフ）を介して押出することができる。一部の例において、押出工程は、省略することができる。エタノール除去および同時緩衝液交換は、例えば、透析またはタンジェンシャルフロー濾過により達成することができる。緩衝液は、例えば、約ｐＨ７、例えば、約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、または約ｐＨ７．４におけるリン酸緩衝液（ＰＢＳ）と交換することができる。
Figure 2018019683
ＬＮＰ０１配合物は、例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる国際出願公開国際公開第２００８／０４２９７３号パンフレットに記載されている。
追加の例示的な脂質−ｄｓＲＮＡ配合物としては、以下のものが挙げられる：
Figure 2018019683
ＳＮＡＬＰ（１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ））を含む配合物は、参照により本明細書に組み込まれる２００９年４月１５日に出願された国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレットに記載されている。
ＸＴＣを含む配合物は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる２００９年９月３日に出願された米国仮特許出願第６１／２３９，６８６号明細書に記載されている。
ＭＣ３を含む配合物は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる２００９年９月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／２４４，８３４号明細書、２００９年６月１０日に出願された米国仮特許第６１／１８５，８００号明細書および２０１０年６月１０日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２８２２４号明細書に記載されている。
ＡＬＮＹ−１００を含む配合物は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる２００９年１１月１０日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／６３９３３号明細書に記載されている。
Ｃ１２−２００を含む配合物は、参照により本明細書に組み込まれる２００９年５月５日に出願された米国仮特許出願第６１／１７５，７７０号明細書および２０１０年５月５日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／３３７７７号明細書に記載されている。
経口投与のための組成物および配合物としては、散剤または顆粒剤、微粒子剤、ナノ粒子剤、水性または非水性媒体中の懸濁液または液剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ剤、錠剤または小型錠剤が挙げられる。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望ましいことがある。一部の実施形態において、経口配合物は、本発明において挙げられるｄｓＲＮＡが１つ以上の浸透向上剤、界面活性剤およびキレート化剤とともに投与されるものである。好適な界面活性剤としては、脂肪酸および／またはそのエステルもしくは塩、胆汁酸および／またはその塩が挙げられる。好適な胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、グリコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、ナトリウムタウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシデートおよびナトリウムグリコジヒドロフシデートが挙げられる。好適な脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリドまたは薬学的に許容可能なそれらの塩（例えば、ナトリウム）が挙げられる。一部の実施形態において、浸透向上剤の組合せ、例えば、脂肪酸／塩を胆汁酸／塩との組合せにおいて使用する。１つの例示的な組合せは、ラウリン酸のナトリウム塩、カプリン酸およびＵＤＣＡである。さらなる浸透向上剤としては、ポリエオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリエオキシエチレン−２０−セチルエーテルが挙げられる。本発明において挙げられるｄｓＲＮＡは、顆粒形態、例として、噴霧乾燥粒子で経口送達し、または複合体化させてマイクロもしくはナノ粒子を形成することができる。ｄｓＲＮＡ複合体化剤としては、ポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン、ポリアルキルシアノアクリレート；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミ、ポルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎ）、セルロースおよびデンプンが挙げられる。好適な複合体化剤としては、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミンおよびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギネート、ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡのための経口配合物およびそれらの調製は、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，８８７，９０６号明細書、米国特許出願公開第２００３００２７７８０号明細書、および米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳述されている。
非経口、実質内（脳中）、鞘内、脳室内、または肝内投与のための組成物および配合物としては、緩衝液、希釈剤および他の好適な添加剤、例えば、限定されるものではないが、浸透向上剤、担体化合物および他の薬学的に許容可能な担体または賦形剤も含有し得る無菌水溶液を挙げることができる。
本発明の医薬組成物としては、限定されるものではないが、液剤、エマルション、およびリポソーム含有配合物が挙げられる。これらの組成物は、限定されるものではないが、既成液体、自己乳化固体および自己乳化半固体が挙げられる種々の構成要素から生成することができる。典型的な配合物は、肝障害、例えば、肝癌が治療される場合、肝臓を標的化する。
医薬配合物は、簡便には、単位剤形で提供することができ、薬学産業において周知の慣用の技術に従って調製することができる。このような技術は、活性成分を医薬担体または賦形剤と会合させる工程を含む。一般に、配合物は、活性成分を液体担体または微粉固体担体またはその両方と均等および緊密に会合させ、次いで、必要により、製品に成形することにより調製する。
本発明の組成物は、多くの考えられる剤形のいずれか、例えば、限定されるものではないが、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、軟ゲル剤、坐剤、および浣腸剤に配合することができる。本発明の組成物は、水性、非水性または混合媒体中の懸濁液として配合することもできる。水性懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例として、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランをさらに含有し得る。懸濁液は、安定剤も含有し得る。
追加の配合物
エマルション
対象に投与すべきｉＲＮＡは、エマルションとして調製および配合することができる。エマルションは、典型的には、ある液体が通常直径０．１μｍを超過する液滴の形態で別のものに分散している不均一系である（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐ．３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１参照）。エマルションは、互いに緊密に混合および分散された２つの非混和性液相を含む二相系であることが多い。一般に、エマルションは、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）種のいずれかのものであり得る。水相が微細化され、微小液滴としてバルク油相中に分散している場合、得られる組成物は油中水型（ｗ／ｏ）エマルションと呼ばれる。あるいは、油相が微細化され、バルク水相中に微小液滴として分散している場合、得られる組成物は水中油型（ｏ／ｗ）エマルションと呼ばれる。エマルションは、分散相、および水相、油相のいずれかの溶液または別個の相としてそれ自体として存在し得る活性薬物に加えて追加の構成要素を含有し得る。医薬賦形剤、例えば、乳化剤、安定剤、色素、および酸化防止剤も、必要によりエマルション中に存在し得る。医薬エマルションは、例えば、油中水中油型（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションの場合のような、３つ以上の相からなる多相エマルションでもあり得る。このような複合配合物は、単純な二元エマルションが提供しないある利点を提供することが多い。ｏ／ｗエマルションの個々の油液滴が小さい水液滴を包む多相エマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを構成する。同様に、油連続相中で安定化された水の小球中に包まれた油液滴の系は、ｏ／ｗ／ｏエマルションを提供する。
エマルションは、熱力学安定性をほとんど有さず、または有さないことを特徴とする。エマルションの分散または不連続相は、外部または連続相中に十分分散しており、乳化剤の手段または配合物の粘度を介してこの形態で維持されることが多い。エマルションの相のいずれも、エマルション型軟膏基剤およびクリーム剤の場合と同様、半固体または固体であり得る。エマルションを安定化させる他の手段は、エマルションのいずれの相中にも取り込むことができる乳化剤の使用を伴う。乳化剤は、４つのカテゴリーに広く分類することができる：合成界面活性剤、天然に生じた乳化剤、吸収基剤、および微細分散固体（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９参照）。
合成界面活性剤は、表面活性剤としても公知であり、エマルションの配合物中に広い適用可能であり、文献に概説されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９参照）。界面活性剤は、典型的には、両親媒性であり、親水性および疎水性部分を含む。界面活性剤の親水性の性質と疎水性の性質との比は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と称され、配合物の調製における界面活性剤のカテゴライズおよび選択における有益なツールである。界面活性剤は、親水性基の性質に基づき異なるクラス：非イオン性、アニオン性、カチオン性および両性に分類することができる（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ （８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５参照）。
エマルション配合物中で使用される天然に生じた乳化剤としては、ラノリン、ミツロウ、ホスファチド、レシチンおよびアカシアガムが挙げられる。吸収基剤、例えば、無水ラノリンおよび親水性ワセリンは、それらが水を吸い上げ、ｗ／ｏエマルションを形成し、依然としてそれらの半固体コンシステンシーを保持し得るように親水特性を有する。微粉固体も、良好な乳化剤として特に界面活性剤との組合せにおいて、および粘性調製物中に使用されている。これらとしては、極性無機固体、例えば、重金属水酸化物、非膨潤クレー、例えば、ベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウムおよびコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウム、顔料および非極性固体、例えば、カーボンまたはグリセリルトリステアレートが挙げられる。
多種多様の非乳化材料もエマルション配合物中に含まれ、エマルションの特性に寄与する。これらとしては、脂肪、油、ロウ、脂肪酸、脂肪族アルコール、脂肪族エステル、保湿剤、親水性コロイド、保存剤および酸化防止剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。
親水性コロイドまたは親水コロイドとしては、天然に生じたガムおよび合成ポリマー、例えば、多糖（例えば、アカシアガム、寒天、アルギン酸、カラギナン、グアーガム、カラヤガム、およびトラガカントガム）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）が挙げられる。これらは、水中で分散または膨潤し、分散相液滴周囲に強力な界面皮膜を形成し、外部相の粘度を増加させることによりエマルションを安定化させるコロイド溶液を形成する。
エマルションは、微生物の成長を容易に支持し得る多数の成分、例えば、炭水化物、タンパク質、ステロールおよびホスファチドを含有することが多いため、これらの配合物は、保存剤を取り込むことが多い。エマルション配合物中に一般に使用される保存剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が挙げられる。酸化防止剤も、配合物の劣化を妨げるためにエマルション配合物に添加する。使用される酸化防止剤は、フリーラジカルスカベンジャー、例えば、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、または還元剤、例えば、アスコルビン酸およびメタ重硫酸ナトリウム、および酸化防止剤相乗剤、例えば、クエン酸、酒石酸、およびレシチンであり得る。
皮膚、経口および非経口経路を介するエマルション配合物の適用ならびにそれらの製造方法は、文献に概説されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，およびＡｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９参照）。経口送達のためのエマルション配合物は、配合の容易性、ならびに吸収およびバイオアベイラビティーの観点からの効力のため極めて広く使用されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９参照）。鉱油ベース緩下剤、油溶性ビタミンおよび高脂肪栄養調製物は、ｏ／ｗエマルションとして一般に経口投与される材料のものである。
本発明の一実施形態において、ｉＲＮＡおよび核酸の組成物は、マイクロエマルションとして配合する。マイクロエマルションは、単一の光学的等方性および熱力学安定性の液体溶液である水、油および両新媒性の系と定義することができる（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５参照）。典型的には、マイクロエマルションは、最初に油を水性界面活性剤溶液中で分散させ、次いで十分量の第４の構成要素、一般に、中間鎖長アルコールを添加して透明系を形成することにより調製された系である。したがって、マイクロエマルションは、表面活性分子の界面皮膜により安定化された２つの非混和性液体の熱力学的に安定な、等方的に澄明な分散液と記載することもできる（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ，ｉｎ：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ １８５−２１５）。マイクロエマルションは、一般に、油、水、界面活性剤、コサーファクタントおよび電解質を含む３から５つの構成要素の組合せを介して調製する。マイクロエマルションが油中水型（ｗ／ｏ）タイプか水中油型（ｏ／ｗ）タイプかは、使用される油および界面活性剤の特性、ならびに界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的充填に依存する（Ｓｃｈｏｔｔ，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。
相ダイアグラムを利用する現象学的アプローチは、広範に研究されており、マイクロエマルションの配合の仕方の包括的な知識を当業者にもたらした（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５参照）。慣用のエマルションと比較して、マイクロエマルションは、水不溶性薬物を自然に形成された熱力学的に安定な液滴の配合物中で可溶化させる利点を提供する。
マイクロエマルションの調製において使用される界面活性剤としては、限定されるものではないが、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレエート（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）の単独物またはコサーファクタントとの組合せが挙げられる。コサーファクタント、通常、短鎖アルコール、例えば、エタノール、１−プロパノール、および１−ブタノールは、界面活性剤皮膜中に浸透し、結果的に界面活性剤分子間に生成された隙間のため不規則皮膜を作出することにより界面流動率を増加させるように機能する。しかしながら、マイクロエマルションは、コサーファクタントの使用なしで調製することができ、アルコール不含自己乳化マイクロエマルション系が、当分野において公知である。水相は、典型的には、限定されるものではないが、水、薬物の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコールの誘導体であり得る。油相としては、限定されるものではないが、材料、例えば、Ｃａｐｔｅｘ３００、Ｃａｐｔｅｘ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）モノ、ジ、およびトリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪族アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油ならびにシリコーン油を挙げることができる。
マイクロエマルションは、薬物可溶化および薬物吸収の向上の観点から特に興味深い。脂質ベースマイクロエマルション（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの両方）は、薬物、例として、ペプチドの経口バイオアベイラビティーを向上させることが提案されている（例えば、米国特許第６，１９１，１０５号明細書；米国特許第７，０６３，８６０号明細書；米国特許第７，０７０，８０２号明細書；米国特許第７，１５７，０９９号明細書；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５−１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５参照）。マイクロエマルションは、薬物可溶化の改善、酵素加水分解からの薬物の保護、膜流動性および浸透性の界面活性剤誘導変化に起因して考えられる薬物吸収の向上、調製の容易性、固体剤形と比べた経口投与の容易性、臨床力価の改善、ならびに毒性の減少の利点をもたらす（例えば、米国特許第６，１９１，１０５号明細書；米国特許第７，０６３，８６０号明細書；米国特許第７，０７０，８０２号明細書；米国特許第７，１５７，０９９号明細書；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８−１４３参照）。マイクロエマルションは、それらの構成要素が周囲温度において一緒にされたときに自然に形成し得ることが多い。これは、熱不安定薬物、ペプチドまたはｉＲＮＡを配合する場合に特に有利である。マイクロエマルションは、化粧および医薬用途の両方において活性構成要素の経皮送達においても有効である。本発明のマイクロエマルション組成物および配合物は、胃腸管からのｉＲＮＡおよび核酸の全身吸収の増加を易化し、ｉＲＮＡおよび核酸の局所的な細胞取り込みを改善することが予期される。
本発明のマイクロエマルションは、配合物の特性を改善するためならびに本発明のｉＲＮＡおよび核酸の吸収を向上させるための追加の構成要素および添加剤、例えば、ソルビタンモノスレアレート（Ｇｒｉｌｌ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、および浸透向上剤も含有し得る。本発明のマイクロエマルション中で使用される浸透向上剤は、５つの広いカテゴリー、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤の１つに属すると分類することができる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらのクラスのそれぞれは、上記に考察した。
浸透向上剤
一実施形態において、本発明は、動物の皮膚への核酸、特にｉＲＮＡの効率的な送達をもたらすための種々の浸透向上剤を用いる。ほとんどの薬物は、溶液中でイオン化および非イオン化形態の両方で存在する。しかしながら、通常、脂溶性または親油性薬物のみが、細胞膜を容易に越える。非親油性薬物でさえ、越えるべき膜が浸透向上剤により処理された場合、細胞膜を越え得ることが発見されている。浸透向上剤は、細胞膜を越える非親油性薬物の拡散を支援することに加え、親油性薬物の浸透性も向上させる。
浸透向上剤の一部の非限定的な例としては、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤が挙げられる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２参照）。
界面活性剤：界面活性剤（または「表面活性剤」）は、溶液の表面張力または水溶液と別の液体との界面張力を低減させ、結果として粘膜を介するｉＲＮＡの吸収を向上させる。さらに、胆汁酸塩および脂肪酸に加え、これらの浸透向上剤としては、例えば、ナトリウムラウリルスルフェート、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル）（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２参照）；ならびにペルフルオロ化学エマルション、例えば、ＦＣ−４３．Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）が挙げられる。
脂肪酸：浸透向上剤として作用する種々の脂肪酸およびそれらの誘導体としては、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１〜２０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピルおよびｔ−ブチル）、ならびにそれらのモノおよびジグリセリド（すなわち、オレエート、ラウレート、カプレート、ミリステート、パルミテート、ステアレート、リノレエートなど）が挙げられる（例えば、Ｔｏｕｉｔｏｕ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９２，４４，６５１−６５４参照）。
胆汁酸塩：胆汁の生理学的役割としては、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の易化が挙げられる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３８ ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４−９３５参照）。用語「胆汁酸塩」としては、胆汁の天然に生じた構成要素のいずれかおよびそれらの合成誘導体のいずれかが挙げられる。好適な胆汁酸塩としては、例えば、コール酸（または薬学的に許容可能なそのナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、ナトリウムタウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシデート（ＳＴＤＨＦ）、ナトリウムグリコジヒドロフシデートおよびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３９ Ｉｎ： Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐａｇｅｓ ７８２−７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９−５８３参照）。
キレート化剤：キレート化剤は、錯体を形成することにより溶液から金属イオンを除去し、結果として粘膜を介するｉＲＮＡの吸収を向上させる化合物と定義することができる。浸透向上剤としてのこれらの使用に関して、キレート化剤は、ＤＮアーゼインヒビターとしても機能する追加の利点を有する。これというのも、ほとんどの特性決定されたＤＮＡヌクレアーゼは触媒のために二価金属イオンを要求し、したがってキレート化剤により阻害されるためである（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５−３３９）。好適なキレート化剤としては、限定されるものではないが、ジナトリウムエチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチレート（例えば、ナトリウムサリチレート、５−メトキシサリチレートおよびホモバニレート）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９およびβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）が挙げられる（例えば、Ｋａｔｄａｒｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３−５１参照）。
非キレート化非界面活性剤：本明細書において使用される非キレート化非界面活性剤の浸透向上化合物は、キレート化剤としてまたは界面活性剤としてのわずかな活性を実証するが、それにもかかわらず、消化器粘膜を介するｉＲＮＡの吸収を向上させる化合物である（例えば、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３参照）。このクラスの浸透向上剤としては、例えば、不飽和環状尿素、１−アルキル−および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２）ならびに非ステロイド抗炎症剤、例えば、ジクロフェナクナトリウム、インドメタシンおよびフェニルブタゾン（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１−６２６）が挙げられる。細胞レベルにおけるｉＲＮＡの取り込みを向上させる薬剤を、本発明の医薬および他の組成物に添加することもできる。例えば、カチオン性脂質、例えば、リポフェクション（Ｊｕｎｉｃｈｉ ｅｔ ａｌ，米国特許第５，７０５，１８８号明細書）、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリカチオン性分子、例えば、ポリリジン（Ｌｏｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ出願国際公開第９７／３０７３１号パンフレット）も、ｄｓＲＮＡの細胞取り込みを向上させることが公知である。市販の形質移入試薬の例としては、例えば、とりわけ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ Ｑ２形質移入試薬（Ｒｏｃｈｅ；Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＴＡＰリポソーム形質移入試薬（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＳＰＥＲリポソーム形質移入試薬（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、またはＦｕｇｅｎｅ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）形質移入試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）−２０試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）−５０試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＴｒａｎｓＰａｓｓａ Ｄ１形質移入試薬（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＬｙｏＶｅｃ（商標）／ＬｉｐｏＧｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎ形質移入試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲ形質移入試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ形質移入試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ２形質移入試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ形質移入試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲ形質移入試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ（商標）形質移入試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＲｉｂｏＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＰｌａｓＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、またはＨｉＦｅｃｔ（商標）（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）が挙げられる。
他の薬剤、例として、グリコール、例えば、エチレングリコールおよびプロピレングリコール、ピロール、例えば、２−ピロール、アゾン、およびテルペン、例えば、リモネンおよびメントンを、投与される核酸の浸透を向上させるために利用することができる。
担体
本発明のある組成物は、配合物中に担体組成物も取り込む。本明細書において使用される「担体化合物」または「担体」は、不活性である（すなわち、それ自体生物学的活性を有さない）が、例えば、生物活性核酸を分解することまたは循環からのその除去を促進することにより生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビティーを低減させるインビボプロセスにおいて核酸と認識される核酸、またはそのアナログを指し得る。核酸および担体化合物の同時投与（典型的には、担体物質が過剰）は、おそらく共通の受容体についての担体化合物と核酸との競合に起因して肝臓、腎臓または他の循環外溜め中に回収される核酸の量の実質的な低減をもたらし得る。例えば、肝組織中の部分的ホスホロチオエートｄｓＲＮＡの回収は、それがポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸または４−アセトアミド−４’−イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と同時投与された場合、低減させることができる（Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５−１２１；Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ ＆ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７−１８３。
賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬担体」または「賦形剤」は、薬学的に許容可能な溶媒、懸濁化剤または動物への１つ以上の核酸の送達のための任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体または固体であり得、所与の医薬組成物の核酸および他の構成要素と合わせた場合、所望のバルク、コンシステンシーなどを提供するように、計画された投与様式を考慮して選択する。典型的な医薬担体としては、限定されるものではないが、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；増量剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素ナトリウムなど）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、硬化植物油、トウモロコシデンプン、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられる。
核酸と有害反応しない非経口投与に好適な薬学的に許容可能な有機または無機賦形剤も、本発明の組成物を配合するために使用することができる。好適な薬学的に許容可能な担体としては、限定されるものではないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
核酸の局所投与のための配合物としては、一般の溶媒、例えば、アルコール中の無菌および非無菌水性溶液、非水性溶液、または液体もしくは固体油性基剤中の核酸の溶液を挙げることができる。溶液は、緩衝液、希釈剤および他の好適な添加剤も含有し得る。核酸と有害反応しない非経口投与に好適な薬学的に許容可能な有機または無機賦形剤を使用することができる。
好適な薬学的に許容可能な賦形剤としては、限定されるものではないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
他の構成要素
組成物は、医薬組成物中に慣用的に見出される他の付加構成要素を、それらの当分野において確立された使用量レベルにおいてさらに含有し得る。したがって、例えば、組成物は、追加の適合性の薬学的に活性な材料、例えば、鎮痒剤、収斂剤、局所麻酔剤もしくは抗炎症剤などを含有し得、または本発明の組成物の種々の剤形の物理的配合において有用な追加の材料、例えば、色素、着香剤、保存剤、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤および安定剤を含有し得る。しかしながら、このような材料は、添加される場合、本発明の組成物の構成要素の生物学的活性を過度に干渉すべきでない。配合物は、安定化させ、所望により、配合物の核酸と有害相互作用しない助剤、例えば、滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝液、着色剤、着香剤および／または芳香物質などと混合することができる。
水性懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例として、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストランを含有し得る。懸濁液は、安定剤も含有し得る。
一部の実施形態において、医薬組成物は、（ａ）１つ以上のｉＲＮＡ化合物および（ｂ）非ＲＮＡｉ機序により機能する１つ以上の抗サイトカイン生物剤を含み得る。このような生物剤の例としては、ＩＬ１β（例えば、アナキンラ）、ＩＬ６（例えば、トシリズマブ）、またはＴＮＦ（例えば、エタネルセプト、インフリキシマブ、アドリムマブ、またはセルトリズマブ）を標的化する生物剤が挙げられる。
このような化合物の毒性および治療効力は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％の致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％における治療有効用量）を判定するための細胞培養物または実験動物において標準的な薬学的手順により判定することができる。毒性効果と治療効果との用量比は、治療指数であり、それは、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表現することができる。高い治療指数を示す化合物が典型的である。
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータは、ヒトにおける使用のための一連の投与量の配合において使用することができる。本明細書において挙げられる組成物の投与量は、一般に、毒性をほとんど有さず、または有さないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変動し得る。本発明において挙げられる方法において使用される任意の化合物について、治療有効用量は、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。用量は、細胞培養物において判定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む化合物の、または適宜、標的配列のポリペプチド産物（例えば、ポリペプチドの濃度の減少を達成）の循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて配合することができる。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に判定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより計測することができる。
本明細書に記載のｉＲＮＡは、上記で考察されるこれらの投与に加え、標的発現により媒介される病理学的プロセスの治療において有効な他の公知の薬剤との組合せで投与することができる。任意のイベントにおいて、投与する医師は、当分野において公知のまたは本明細書に記載の効力の標準的な尺度を使用して観察された結果に基づきｉＲＮＡ投与の量およびタイミングを調整することができる。
ＶＩ．アンタゴｍｉｒ
本明細書に記載の方法は、例えば、アンタゴｍｉｒを対象に投与した後のアンタゴｍｉｒ活性のモニタリングに有用であり得る。
アンタゴｍｉｒは、ＲＮアーゼ保護および薬理学的特性のための種々の改変、例えば、向上した組織および細胞取り込みを保有するＲＮＡ様オリゴヌクレオチドである。これらは、通常のＲＮＡとは、例えば、糖の完全な２’−Ｏ−メチル化、ホスホロチオエート骨格および、例えば、３’末端におけるコレステロール部分が異なる。アンタゴｍｉｒは、アンタゴｍｉｒおよび内因性ｍｉＲＮＡを含むデュプレックスを形成し、それによりｍｉＲＮＡ誘導遺伝子サイレンシングを妨げることにより内因性ｍｉＲＮＡを効率的にサイレンシングするために使用することができる。アンタゴｍｉｒ媒介ｍｉＲＮＡサイレンシングの一例は、参照により全体として本明細書に明確に組み込まれるＫｒｕｔｚｆｅｌｄｔ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２００５，４３８：６８５−６８９に記載のｍｉＲ−１２２のサイレンシングである。アンタゴｍｉｒＲＮＡは、標準的な固相オリゴヌクレオチド合成プロトコルを使用して合成することができる。米国特許出願１１／５０２，１５８第号明細書および米国特許出願第１１／６５７，３４１号明細書（それぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）参照。アンタゴｍｉｒは、リガンドコンジュゲートモノマーサブユニットおよびオリゴヌクレオチド合成のためのモノマーを含み得る。例示的なモノマーは、米国特許出願公開第２００５０１０７３２５号明細書に記載されている。アンタゴｍｉｒは、例えば、国際公開第２００４／０８０４０６号パンフレットに記載のＺＸＹ構造を有し得る。アンタゴｍｉｒは、両親媒性部分と複合体化することができる。オリゴヌクレオチド薬剤とともに使用される例示的な両親媒性部分は、国際公開第２００４／０８０４０６号パンフレットに記載されている。
アンタゴｍｉｒは、マイクロＲＮＡを標的化する一本鎖、二本鎖、部分的二本鎖またはヘアピン構造、化学的改変オリゴヌクレオチドであり得る。アンタゴｍｉｒは、内因性ｍｉＲＮＡと実質的に相補的な約１２以上の連続ヌクレオチドから本質的になり、またはそれを含み得、より特定すると、ｍｉＲＮＡまたはプレｍｉＲＮＡヌクレオチド配列の標的配列と実質的に相補的な約１２以上の連続ヌクレオチドを含む薬剤である。ある実施形態において、本発明において挙げられるアンタゴｍｉｒは、約１２から２５ヌクレオチド、一部の例において約１５から２３ヌクレオチドのｍｉＲＮＡ標的配列にハイブリダイズするために十分に相補的なヌクレオチド配列を含む。
アンタゴｍｉｒは、例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／０２１８９６号パンフレットにさらに記載されている。
アンタゴｍｉｒの活性は、例えば、アンタゴｍｉｒの投与前後の生物試料、例えば、生物体液、例えば、血液、血清、尿またはＣＳＦ試料中の標的ｍｉＲＮＡレベルを検出することによりアッセイすることができる。例えば、アンタゴｍｉｒは、例えば、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９２、またはｍｉＲ−１９４を標的化し得、アンタゴｍｉｒの効力は、生物試料中の標的ｍｉＲＮＡのレベルをモニタリングすることにより評価することができる。
ＶＩＩ．ｍｉＲＮＡ模倣物
本明細書に記載の方法は、例えば、ｍｉ模倣物を対象に投与した後のｍｉＲＮＡ模倣物の活性のモニタリングに有用であり得る。
ｍｉＲＮＡ模倣物は、１つ以上のｍｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング能を模倣するために使用することができる分子のクラスを表す。したがって、用語「マイクロＲＮＡ模倣物」は、ＲＮＡｉ経路に入り、遺伝子発現を調節し得る合成非コードＲＮＡを指す（すなわち、ｍｉＲＮＡは、内因性ｍｉＲＮＡの資源からの精製により得ない）。ｍｉＲＮＡ模倣物は、成熟分子（例えば、一本鎖）または模倣前駆体（例えば、プリまたはプレｍｉＲＮＡ）として設計することができる。ｍｉＲＮＡ模倣物は、限定されるものではないが、ＲＮＡ、改変ＲＮＡ、ＤＮＡ、改変ＤＮＡ、ロックド核酸、または２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン−架橋核酸（ＥＮＡ）、または上記のものの任意の組合せ（例として、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド）を含むオリゴヌクレオチドを含む核酸（改変または改変核酸）からなり得る。さらに、ｍｉＲＮＡ模倣物は、送達、細胞内区画化、安定性、特異性、機能性、ストランド頻度、および／または力価に影響し得るコンジュゲートを含み得る。１つの設計において、ｍｉＲＮＡ模倣物は、二本鎖分子（例えば、約１６から約３１ヌクレオチド長のデュプレックス領域を有する）であり、所与のｍｉＲＮＡの成熟ストランドとの同一性を有する１つ以上の配列を含有する。改変は、核酸安定性および／または特異性を向上させる分子の一方または両方のストランド上の２’改変（例として、２’−Ｏメチル改変および２’Ｆ改変）およびヌクレオチド内改変（例えば、ホスホロチオエート改変）を含み得る。
さらにｍｉＲＮＡ模倣物は、オーバーハングを含み得る。オーバーハングは、いずれかのストランドの３’または５’末端上のいずれかの１〜６ヌクレオチドからなり得、安定性または機能性を向上させるように改変することができる。一実施形態において、ｍｉＲＮＡ模倣物は、１６から３１ヌクレオチドのデュプレックス領域および以下の化学改変パターンの１つ以上を含み：センスストランドは、１および２つ目のヌクレオチド（センスオリゴヌクレオチドの５’末端からカウント）、ならびにＣおよびＵの全ての２’−Ｏ−メチル改変を含有し；アンチセンスストランド改変は、ＣおよびＵの全ての２’Ｆ改変、オリゴヌクレオチドの５’末端のリン酸化、ならびに２ヌクレオチド３’オーバーハングと会合する安定化ヌクレオチド内結合を含み得る。
ｍｉＲＮＡ模倣物の活性は、ｍｉＲＮＡ模倣物の投与前後の生物試料、例えば、血液もしくは血清、または尿またはＣＳＦ試料中の標的ｍＲＮＡのレベルを検出することによりアッセイすることができる。
ＶＩＩＩ．遺伝子治療
本明細書において、対象への治療（例えば、外因性）遺伝子治療物の導入を検出し、遺伝子治療物の活性（例えば、発現）を検出およびモニタリングするアッセイおよび方法が提供される。例えば、遺伝子治療物のＲＮＡ産物は、本明細書に記載の方法およびアッセイを使用して検出することができる。一実施形態において、遺伝子治療物の活性は、対象の生物試料、例えば、血液、血清、尿またはＣＳＦ試料中の遺伝子治療物から発現されるタンパク質を検出することによりモニタリングする。遺伝子治療物は、ＤＮＡエフェクター分子の送達に有用である。
遺伝子治療は、一般に、発現が遺伝性障害の改善または治療をもたらす細胞中への１つ以上の治療遺伝子（例えば、トランス遺伝子）の導入を含む。含まれる治療遺伝子は、タンパク質、構造または酵素ＲＮＡ、阻害産物、例えば、アンチセンスＲＮＡもしくはＤＮＡ、または任意の他の遺伝子産物をコードするものであり得る。発現は、そのような遺伝子産物の生成またはそのような遺伝子産物の生成の得られる効果である。したがって、発現の向上としては、任意の治療遺伝子のより多い産生または細胞、組織、臓器または生物の状態の判定におけるその産物の役割の増大が挙げられる。
核酸を細胞中に導入するための技術は、核酸をインビトロで培養細胞中に移すかインビボで意図される宿主の細胞中に直接注射するかに応じて変動する。核酸をインビトロで哺乳動物細胞中に移すために好適な技術としては、リポソーム、エレクトロポレーション（Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇ Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．７（１１）：１６４７−１６６４（２００７）；Ｋｅｓａｒａｊｕ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４（３）：４１６−４２２（２００６）；Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（２４（２１）：４４９０−４４９３（２００６））、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などの使用が挙げられる。
他の例示的遺伝子移入技術としては、ウイルス（典型的には、レトロウイルス）ベクターによる形質移入およびウイルスコートタンパク質−リポソーム媒介形質移入（Ｄｚａｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１（５）：２０５−１０（１９９３））、幹細胞治療、ならびにｃＤＮＡによるワクチン接種が挙げられる。
細胞免疫応答エレメントまたはその断片が哺乳動物中で発現されるようにポリヌクレオチドをインビボで哺乳動物に投与することは、哺乳動物遺伝子発現についての分野において公知の方法を使用して達成することができる。例えば、発現系および送達系を含む発現可能なポリヌクレオチドを哺乳動物に投与するそのような方法は、米国特許第６，８７５，７４８号明細書、米国特許第５，７６３，２７０号明細書、米国特許第５，５８０，８５９号明細書、米国特許第６，０４０，２９５号明細書、および米国特許第６，０３４，０７２号明細書に見出すことができる。
治療遺伝子は、カセット内の核酸の発現のための必須エレメントを含有するプラスミドとして投与することができる。発現は、挿入遺伝子、核酸配列、またはプラスミドを有する核酸カセットの効率的な転写を含む。発現産物は、タンパク質、ポリペプチドまたはＲＮＡであり得る。核酸配列は、核酸カセット中に含有させることができる。核酸の発現は、連続的または規則的であり得る。
本明細書において、遺伝子治療物の活性をモニタリングする方法が提供される。例えば、遺伝子治療物により発現されるＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡまたはｉＲＮＡ薬剤）は、遺伝子治療物が発現されているかどうかおよびどの程度発現されているかを判定するための手段として対象における生物試料中で検出することができる。一部の実施形態において、遺伝子治療物の効力は、遺伝子治療物から発現されるタンパク質産物を検出することによりモニタリングする。
標的遺伝子の発現により引き起こされる疾患を治療する方法
ｉＲＮＡ薬剤またはモジュレーターを使用して治療すべき疾患としては、典型的には、遺伝子産物の過剰活性を有し、またはその活性を欠損する疾患が挙げられる。したがって、ｉＲＮＡ薬剤またはモジュレーターを投与して過剰活性を有する遺伝子の発現を阻害することができる。あるいは、遺伝子発現を活性化させる治療遺伝子、ＤＮＡエフェクター分子、またはＲＮＡ活性化剤を使用して遺伝子産物の活性欠損を補うことができる。標的遺伝子を疾患の発病または伝播に関与すると同定することができる本質的に任意の疾患を、ｉＲＮＡ薬剤またはモジュレーターを使用して治療することができる。本明細書に記載のアッセイは、対象中のｉＲＮＡ薬剤またはモジュレーターの効力のモニタリングに有用である。
ＲＮＡまたはＤＮＡエフェクター分子は、追加の治療剤との組合せで投与することができる。ＲＮＡもしくはＤＮＡエフェクター分子および追加の治療剤は、同一組成物中で、例えば、非経口投与することができ、または追加の治療剤は、別個の組成物の一部として、もしくは本明細書に記載の別の方法により投与することができる。治療遺伝子および追加の治療剤の投与は、同時または任意の順序での異なる時点であり得る。本明細書に記載のアッセイは、組合せ治療の投与の任意の段階において、例えば、ＲＮＡもしくはＤＮＡエフェクター分子の投与前後；ＲＮＡもしくはＤＮＡエフェクター分子および追加の治療剤の組合せの投与後；または例えば、ＲＮＡもしくはＤＮＡエフェクター分子および追加の治療剤を連続投与する場合、ＲＮＡもしくはＤＮＡエフェクター分子の投与後および追加の治療剤のさらなる投与前および／もしくは後に実施することができる。
本発明は、所望の遺伝子を標的化するｉＲＮＡ薬剤を、標的発現により媒介される疾患または障害を有する患者に投与し、標的遺伝子発現に対するｉＲＮＡ薬剤の効果をさらにアッセイする方法を挙げる。ｄｓＲＮＡの投与は、治療すべき疾患の少なくとも１つの症状を５％、１０％、１５％、２０％、２５％以上だけ低下させ得る。少なくとも１つの症状のレベルは、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３５％以下に低下させることができる。
本文脈に関する「低下させる」は、そのようなレベルの統計的に有意な減少を意味する。減少は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％以上であり得、例えば、そのような障害を有さない個体についての正常の範囲内として許容されるレベルに下がる。
標的遺伝子発現に対するＲＮＡまたはＤＮＡエフェクターの効果のアッセイに加え、疾患の治療または予防の効力を、例えば、疾患進行、疾患寛解、症状の重症度、疼痛の低減、生活の質、治療効果を維持するために要求される医薬の用量、疾患マーカーのレベルまたは治療もしくは予防のために標的化される所与の疾患に適切な計測可能な任意の他のパラメーターを計測することにより評価することができる。このようなパラメーターのいずれか１つ、またはパラメーターの任意の組合せを計測することにより治療または予防の効力をモニタリングすることは十分に当業者の能力の範囲内である。
治療または予防効果は、疾患状態の１つ以上のパラメーターの統計的に有意な改善が存在する場合、または他では予期される症状の悪化または発達が見られないことにより明らかである。一例として、疾患の計測可能なパラメーターの少なくとも１０％の好ましい変化、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％以上は、有効な治療を示し得る。所与のｉＲＮＡ薬物またはその薬物の配合物についての効力は、当分野において公知の所与の疾患についての実験動物モデルを使用して判断することもできる。実験動物モデルを使用する場合、治療の効力は、マーカーまたは症状の統計的に有意な低減が観察される場合に証明される。
あるいは、効力は、臨床的に許容される疾患重症度評点スケールに基づき診断の当業者により判定される疾患の重症度の低減により計測することができる。
患者には、治療量のＲＮＡまたはＤＮＡエフェクター分子、例えば、ｉＲＮＡを、例えば、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、または２．５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡにおいて投与することができる。ｉＲＮＡは、ある期間にわたり、例えば、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間、６０分間、９０分間または１２０分間の期間にわたり静脈内注入により投与することができる。投与は、例えば、規則的に、例えば、１か月、２か月、３か月、４か月以上にわたり隔週（すなわち、２週間毎）で繰り返す。最初の治療レジメン後、治療は、より少ない頻度で施すことができる。例えば、３か月にわたる隔週投与後、投与を、６ヵ月または１年以上にわたり１か月当たり１回繰り返すことができる。別の例において、投与は、例えば、規則的に、例えば、２か月、３か月、４か月以上にわたり４週間毎）に繰り返す。最初の治療レジメン後、治療は、より少ない頻度で施すことができる。例えば、３か月にわたる４週間毎の投与後、投与を、６ヵ月または１年以上にわたり２か月当たり１回繰り返すことができる。ｉＲＮＡの投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、尿または他の区画中の遺伝子発現レベルを少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％以上だけ低減させ得る。
ｉＲＮＡの全用量の投与前、患者により小さい用量、例えば、５％の注入反応物を投与し、悪影響、例えば、アレルギー反応または症状の悪化についてモニタリングすることができる。別の例において、患者は、不所望な免疫賦活効果、例えば、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−αまたはＩＮＦ−α）レベルの増加についてモニタリングすることができる。
標的遺伝子の発現をモジュレートする方法
さらに別の態様において、対象に、哺乳動物中の標的遺伝子の発現をモジュレート（例えば、阻害または活性化）するための薬剤を投与し、本明細書において提供される方法は、標的遺伝子発現に対する薬剤の効果のモニタリングに有用である。
一実施形態において、本方法は、標的遺伝子の発現が、例えば、延長された持続時間、例えば、少なくとも２、３、４日以上、例えば、１週間、２週間、３週間、または４週間以上減少されるように、ＲＮＡエフェクター分子、例えば、ｉＲＮＡを投与することを含む。本明細書に記載のアッセイは、そのような持続時間にわたる標的遺伝子発現のモニタリングに有用である。
別の実施形態において、本方法は、本明細書に記載の組成物を哺乳動物に、標的遺伝子の発現が、例えば、未処理動物と比較して少なくとも１０％だけ増加されるように投与することを含む。一部の実施形態において、標的遺伝子の活性化は、延長された持続時間、例えば、少なくとも２、３、４日以上、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間以上にわたり生じる。理論により拘束されるものではないが、ＲＮＡ活性化剤は、標的ｍＲＮＡ転写物を安定化し、ゲノム中のプロモーターと相互作用し、および／または標的遺伝子発現のインヒビターを阻害することにより標的遺伝子発現を活性化させ得る。
本発明において挙げられる方法および組成物に有用なｉＲＮＡは、標的遺伝子のＲＮＡ（一次またはプロセシングされたもの）を特異的に標的化し得る。ｉＲＮＡを使用してこれらの遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法は、本明細書の他箇所に記載のとおり調製および実施することができる。
一実施形態において、本方法は、ｉＲＮＡを含有する組成物において、ｉＲＮＡは、治療すべき哺乳動物の標的遺伝子のＲＮＡ転写物の少なくとも一部と相補的なヌクレオチド配列を含む組成物を投与することを含む。治療すべき生物が哺乳動物、例えば、ヒトである場合、組成物は、当分野において公知の任意の手段、例として、限定されるものではないが、経口、腹腔内、または非経口経路、例として、頭蓋内（例えば、脳室内、実質内および鞘内）、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアゾール）、鼻腔、直腸、および局所（例として、バッカルおよび舌下）投与により投与することができる。ある実施形態において、組成物は、静脈内注入または注射により投与する。
特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似または均等の方法および材料を本発明において挙げられるｉＲＮＡおよび方法の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書において挙げられる全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および実施例は、説明にすぎず、限定を意図するものではない。
実施例１
干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）合成
試薬の資源
試薬の資源は、本明細書に具体的に挙げないが、そのような試薬は、分子生物学用試薬の任意の供給業者から分子生物学における用途のための品質／純度標準において得ることができる。
オリゴヌクレオチド合成
本出願人らは、いくつかの異なる方法を使用して対象の治療に有用なｉＲＮＡ分子を生成した。本実施例は、使用された１つのアプローチを記載する。当業者は、当分野において公知の任意の方法を使用して本明細書に記載のｉＲＮＡを調製することができる。
オリゴヌクレオチドは、ＡＫＴＡｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ合成装置上で合成する。市販の制御細孔ガラス固体担体（ｄＴ−ＣＰＧ、５００Å、Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）および標準的な保護基を有するＲＮＡホスホラミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチルＮ６−ベンゾイル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチルｌ−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−−イソブチル（ｉｓｏｂｕｔｒｙｌ）−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト、および５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト（Ｐｉｅｒｃｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、オリゴヌクレオチド合成に使用した。２’−Ｆホスホラミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−フルオロ−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホラミダイトおよび５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−フルオロ−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイトを（Ｐｒｏｍｅｇａ）から購入する。全てのホスホラミダイトは、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中０．２Ｍの濃度において使用するが、但しグアノシンは１０％のＴＨＦ／ＡＮＣ（ｖ／ｖ）中０．２Ｍの濃度において使用する。１６分のカップリング／再循環時間を使用する。活性化物質は、５−エチルチオテトラゾール（０．７５Ｍ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）であり；ＰＯ酸化のためにヨウ素／水／ピリジンを使用し、ＰＳ酸化のために２，６−ルチジン／ＡＣＮ（１：１ｖ／ｖ）中のＰＡＤＳ（２％）を使用する。
３’リガンドコンジュゲートストランドは、対応するリガンドを含有する固体担体を使用して合成する。例えば、配列中へのコレステロール単位の導入は、ヒドロキシプロリノール−コレステロールホスホラミダイトから実施する。コレステロールは、トランス−４−ヒドロキシプロリノールに６−ヘキサノエート結合を介して繋留させてヒドロキシプロリノールコレステロール部分を得る。５’末端Ｃｙ−３およびＣｙ−５．５（フルオロフォア）標識ｉＲＮＡは、対応するＱｕａｓａｒ−５７０（Ｃｙ−３）ホスホラミダイトから合成し、それはＢｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入する。５’末端およびまたは内部位置へのリガンドのコンジュゲーションは、適切に保護されたリガンド−ホスホラミダイトビルディングブロックを使用することにより達成する。５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール活性化物質の存在下でのホスホラミダイトの無水ＣＨ３ＣＮ中０．１Ｍ溶液と、固体担体結合オリゴヌクレオチドの延長された１５分間のカップリング。ヌクレオチド内ホスファイトのホスフェートへの酸化は、報告された（１）標準的なヨウ素−水を使用して、またはｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド／アセトニトリル／水（１０：８７：３）により１０分間の酸化待機時間でコンジュゲートオリゴヌクレオチドを処理することにより実施する。ホスホロチオエートは、硫黄転移試薬、例えば、ＤＤＴＴ（ＡＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入）、ＰＡＤＳおよびまたはＢｅａｕｃａｇｅ試薬を使用することによるホスファイトのホスホロチオエートへの酸化により導入する。コレステロールホスホラミダイトは、インハウスで合成し、ジクロロメタン中０．１Ｍの濃度において使用する。コレステロールホスホラミダイトのためのカップリング時間は、１６分間である。
脱保護Ｉ（ヌクレオ塩基脱保護）
合成の完了後、担体を１００ｍＬのガラス瓶（ＶＷＲ）に移す。エタノール性アンモニア［アンモニア：エタノール（３：１）］の８０ｍＬの混合物により塩基およびホスフェート基を同時に５５℃において６．５時間脱保護することによりオリゴヌクレオチドを担体から開裂させる。瓶を氷上で短時間冷却し、次いでエタノール性アンモニア混合物を新たな２５０ｍＬの瓶中に濾過する。ＣＰＧを２×４０ｍＬのエタノール／水（１：１ｖ／ｖ）の部分により洗浄する。次いで、混合物の容量を約３０ｍＬにロータリーエバポレーターにより低減させる。次いで、混合物をドライアイス上で凍結させ、ｓｐｅｅｄ ｖａｃ上で真空下で乾燥させる。
脱保護ＩＩ（２’−ＴＢＤＭＳ基の除去）
乾燥残留物を２６ｍＬのトリエチルアミン、トリエチルアミントリヒドロフルオリド（ＴＥＡ・３ＨＦ）またはピリジン−ＨＦおよびＤＭＳＯ（３：４：６）中に再懸濁させ、６０℃において９０分間加熱して２’位におけるｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去する。次いで、反応を５０ｍＬの２０ｍＭ酢酸ナトリウムによりクエンチし、ｐＨを６．５に調整する。オリゴヌクレオチドは、精製までフリーザー中に貯蔵する。
分析
オリゴヌクレオチドは、精製前に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析し、緩衝液およびカラムの選択は、配列およびまたはコンジュゲートリガンドの性質に依存する。
ＨＰＬＣ精製
リガンドコンジュゲートオリゴヌクレオチドは、逆相分取ＨＰＬＣにより精製する。未コンジュゲートオリゴヌクレオチドは、インハウスで充填されたＴＳＫゲルカラム上でのアニオン交換ＨＰＬＣにより精製する。緩衝液は、１０％のＣＨ３ＣＮ中２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）（緩衝液Ａ）および１０％のＣＨ３ＣＮ、１ＭのＮａＢｒ中２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．５）（緩衝液Ｂ）である。全長オリゴヌクレオチドを含有する分画をプールし、脱塩し、凍結乾燥させる。約０．１５のＯＤの脱塩オリゴヌクレオチドを水中で１５０μＬに希釈し、次いでＣＧＥおよびＬＣ／ＭＳ分析のための特殊バイアル中にピペッティングする。次いで、化合物をＬＣ−ＥＳＭＳおよびＣＧＥにより分析する。
ｉＲＮＡ調製
ｉＲＮＡの一般的な調製のため、等モル量のセンスおよびアンチセンスストランドを１×ＰＢＳ中で９５℃において５分間加熱して、室温にゆっくりと冷却する。デュプレックスの統合性は、ＨＰＬＣ分析により確認する。
標準的な命名法、具体的には表１の略語を使用して核酸配列を以下に提示する。
Figure 2018019683
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実施例２
血清中の組織特異的ｍＲＮＡの検出
肝臓中のＲＮＡｉ活性は、目下、肝臓組織試料の分子分析を介して、および分泌タンパク質については、血清または血漿試料中の標的タンパク質の循環レベルの定量を介してモニタリングする。臨床試験において、ヒト対象から肝臓生検物を得ることは、関連リスク、例えば、出血を伴う。結果として、正常ヒト被験者において、手順は正当化されず、肝臓生検物を得ることができない。患者のうち、肝臓生検は、疾患状態、例えば、肝臓癌の小サブセットにおいてのみ許容可能であり、それらの患者のうちでさえ、同意率は低いことがある。
肝臓組織試料の不存在下で、循環標的タンパク質の定量は、肝臓中のＲＮＡｉ活性をモニタリングする主要な方法である。このアプローチは、標的タンパク質が血液中に分泌されることを要求し、このことは、対応するタンパク質が分泌されない肝臓中の、および他の組織中の多数の分子標的を排除し、これらの非分泌タンパク質について、現在のところ、肝臓組織生検物の不存在下でＲＮＡｉをモニタリングする方法は存在しない。本明細書に記載の本発明（血清試料中の標的ＲＮＡまたはその開裂産物の検出）は、血清の分子評価を介して非分泌タンパク質標的についてＲＮＡｉをモニタリングする能力を提供する。
分泌タンパク質について、肝臓中のＲＮＡｉをモニタリングするため、標的タンパク質は、容易に検出および定量することができる血液レベルに到達しなければならない。関心標的についてのタンパク質アッセイは、関心組織中のＲＮＡｉ活性についてのキー読出しとしての標的タンパク質の循環レベルに依存するために十分に感受性、選択性、正確性および再現性を示さなければならない。さらに、標的タンパク質の循環レベルは、肝臓ｍＲＮＡのレベルと同一のｉＲＮＡ投与に対する用量応答を示しても示さなくてもよく；この場合、標的ＲＮＡレベルが対応するタンパク質レベルよりもｉＲＮＡ投与に感受性である場合、より低いｉＲＮＡ用量レベルにおけるＲＮＡｉ活性を明らかにし得る標的ＲＮＡレベルをモニタリングする能力を有することが有用である。
複数の組織が所与の標的タンパク質の循環レベルに寄与し、ＲＮＡｉが送達系の結果としてそれらの組織の１つまたはそのサブセットにおいてのみ生じる場合、ＲＮＡｉ活性は、循環中の総標的タンパク質の計測可能な低下をもたらさないことがある。しかしながら、標的ＲＮＡからの開裂産物の血清中の検出は、組織中のＲＮＡｉ活性の定性的な指標を提供する。さらに、特定組織、例えば、肝臓に由来するエキソソームの単離を介して、またはそのようなエキソソームについて濃縮された生物試料（例えば、血液または血清試料）の単離を介して、その特定組織のみからの標的ＲＮＡを、他の組織寄与と無関係に定量することができる。
本明細書に記載の方法およびアッセイは、作用部位として機能する組織のサンプリングを必要とせずインビボでＲＮＡ干渉を評価するためのバイオマーカーを検出し、非分泌タンパク質についての遺伝子サイレンシングの臨床モニタリングを可能とし、分泌タンパク質についての遺伝子サイレンシングの臨床モニタリングを易化する。
血清からのＲＮＡ単離
マウス、ラット、カニクイザル、またはヒトから得られた血清試料（新鮮または貯蔵）を、０．４μｍフィルターを使用する濾過に供し、または２０００〜５０００ｇにおいて１０分間回転させた。一部の例において、塩化リチウムを濾過試料に１ＭのＬｉＣｌの最終濃度まで添加した。試料を４℃において２時間インキュベートし、次いで１１００００〜１４００００ｇにおいて１時間３５分遠心分離した。
ＲＮＡは、得られたペレットから、ＴＲＩｚｏｌ（商標）クロロホルム法を使用して単離した。ＲＮＡは、共沈殿剤であるグリコーゲンの存在下でイソプロパノールを使用して沈殿させた。直鎖ポリアクリルアミドを共沈殿剤としてグリコーゲンに代えて使用することができる。
このプロトコルは、図２４に示すとおりユビキタス、肝臓および組織特異的ＲＮＡの単離をもたらす。
ＲＮＡ定量
ＲＮＡは、Ｎａｎｏｄｒｏｐ技術を使用して定量した。約１００〜１０００ｎｇのＲＮＡを、製造業者の説明書を使用してＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ合成キットを使用するｃＤＮＡ合成に使用した。定量ＰＣＲは、Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０中でＲｏｃｈｅ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いて実施した。
血清試料
血清は、マウス、ラット、カニクイザルおよびヒト対象から得た。一部の実験においては個々の血清試料を別個に分析した一方、他の実験においては個々の血清試料を分析前にプールした。
４ｍｌの血清をそれぞれのカニクイザル対象から得、分析前に凍結貯蔵した。１群当たり２ｍｌのプールカニクイザル血清を分析に使用した。４〜５ｍｌのヒト血清を使用した。
血清試料中のＲＮＡ検出
マウス
１２９Ｓ雄マウスからの１４ｍＬの凍結血清を、肝細胞特異的（例えば、ＴＴＲ、ＦＶＩＩ）およびユビキタス（ＧＡＰＤＨ、Ｒｐｌｐ２）ｍＲＮＡの分析のためにプールした。図１は、Ｒｐｌｐ２、ＧＡＰＤＨ、およびＴＴＲｍＲＮＡがプール血清試料中でそれぞれ検出可能であったことを示す。
ラット
ラットからの１４ｍＬの新鮮血清を、組織特異的ｍＲＮＡの分析のためにプールした。図２Ａおよび２Ｂは、肝細胞特異的（ＴＴＲ、ＦＶＩＩ）、平滑筋特異的（Ａｃｔａ２）およびユビキタス（ＧＡＰＤＨ、ベータアクチン）ｍＲＮＡをラット血清中で検出することができることを示す。肝臓発現遺伝子ＡＡＴおよびアルブミンに対応するｍＲＮＡは、ユビキタス発現遺伝子１８ｓとともに逆転写定量的ＰＣＲにより検出した。血清中で検出されたＴＴＲｍＲＮＡが全長ＴＴＲｍＲＮＡを表すかどうかを評価するため、２つの異なるＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを用い、一方のアッセイはｍＲＮＡの５’末端を増幅するプライマーを利用し、第２のアッセイはｍＲＮＡの３’末端を増幅するプライマーを利用した。図３は、ＴＴＲの５’および３’末端のレベルが類似であったことを示し、それにより、検出されたＴＴＲｍＲＮＡの少なくとも一部が全長ｍＲＮＡであったことを示す。
カニクイザルおよびヒト
個々のカニクイザル対象からの４ｍＬの凍結血清を、血清中の肝細胞特異的ＲＮＡについて分析した。２つの技術的反復をそれぞれの試料について実施した。図４Ａおよび４Ｂは、肝細胞特異的（ＴＴＲ）およびユビキタス（１８ｓ）ｍＲＮＡをカニクイザル血清中で検出することができることを示す。図５Ａは、カニクイザル血清中のＧＡＰＤＨ、１８ｓ、ＴＴＲおよびＡＩＡＴｍＲＮＡの検出を示すデータを示す。図５Ｂは、ヒト血清中のＧＡＰＤＨ、１８ｓ、ＴＴＲ、ＡＡＴおよびアルブミンｍＲＮＡの検出を示すデータを示す。
新鮮血清試料（それぞれ４〜５ｍＬ）をヒト対象から得た。２つの技術的反復を試料毎に実施した。ｍＲＮＡのレベルは、ＴＴＲｍＲＮＡを１８ｓに正規化した場合、試料間で８〜１０倍変動した。試料間のｍＲＮＡのレベルは、肝臓特異的ｍＲＮＡ（すなわち、アルファアンチトリプシン（ＡＡＴ））に正規化すると３倍のみ変動した。４〜５ｍＬの血清をそれぞれの対象から得、２つの技術的反復を試料毎に実施した。
図６Ａは、３つの個々の血清試料中のＡＡＴに正規化されたＴＴＲｍＲＮＡを示す。図６Ｂは、３つの個々の血清試料中の１８ｓリボソームＲＮＡに正規化されたＴＴＲｍＲＮＡを示す。図５Ｂは、血清中の追加のｍＲＮＡマーカー、例として、ＧＡＰＤＨ、１８ｓＲＮＡ、Ｐ０、ＴＴＲ、ＡＡＴおよびアルブミンの発現を示す。
脳脊髄液（ＣＳＦ）中のＲＮＡ検出
ＣＳＦ試料を３０匹のナイーブラットからプールすることにより合計８ｍＬのＣＳＦを得た。ＲＮＡの総濃度（ｎａｎｏｄｒｏｐ技術を使用して２６０のＯＤにおいて判定）は、約２μｇであった。ＣＳＦは、１００００ｇにおいて１０分間遠心分離して試料から血液および細胞を除去した。次いで、上澄みを１１００００ｇにおいて１時間３５分遠心分離して核酸を含むペレットを得た。ペレットをＲＮＡの単離のためにＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬中で再懸濁させた。ＲＮＡは、グリコーゲンを使用して沈殿させた。
図７は、ＳＮＣＡ、ＴＴＲ、ＨＴＴおよびＤＲＤ２ｍＲＮＡがラットからのＣＳＦ試料中で検出可能であったことを示す。ＣＳＦ試料は、３０匹の動物から得、分析のためにプールした。
実施例３
血清ＲＮＡはエキソソームと会合する
血清ＲＮＡは、ＲＮＡをＲＮアーゼ消化から保護し得るエキソソームと会合し得る。したがって、一部の実施形態において、当業者は、ｍＲＮＡ発現レベルの検出前にエキソソームを単離することができる。
エキソソーム単離およびｍＲＮＡの検出
ラット血清を回収し、４０μＭフィルターを介する濾過に供し、次いで１１００００×ｇにおいて遠心分離工程に供した。得られたペレットを再懸濁させ、０．２５Ｍ〜２Ｍのスクロース勾配上にロードし、遠心分離に供した。１ｍＬの分画を密度勾配から回収した。
ペレットの細胞内構成要素を、密度勾配遠心分離により４つの主分画中に分解した。最小密度分画はチューブの頂部に存在し、最大密度分画は底部に存在し；頂部から底部への細胞内構成要素分画の順序は以下のとおりである：（ｉ）小胞分画、（ｉｉ）リソソーム分画、（ｉｉｉ）ペルオキシソーム分画、および（ｉｖ）核含有画分。
ＲＮＡは、それぞれのスクロース勾配分画から検出された。しかしながら、ＲＮＡの最大レベルは、分画２〜７（密度約１．０７５−１．１３）中で検出された。この検出パターンは、エキソソームについて報告された密度値（密度約１．０５〜１．１９）と一致し、血清中に存在するＲＮＡのほとんどがエキソソーム中に存在することを示す。
血清中のＲＮＡがエキソソーム内に封入されるかどうかを判定するため、エキソソームを遠心分離により単離してペレットを産生し、それを膜破壊洗浄剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｔｘ−１００）の存在または不存在下でＲＮアーゼ消化に供した。
図８Ａおよび８Ｂは、単離エキソソーム中のＲＮＡの大多数がＲＮアーゼ消化から保護されることを示し、ＲＮＡのほとんどがエキソソーム小胞内に封入されることを示す。ＲＮアーゼ処理前に０．２％のＴｘ−１００により前処理された試料において、ＲＮアーゼによるＲＮＡ分解は増加され、このことは、膜が破壊され、ＲＮアーゼ酵素が試料中のＲＮＡにより多く接近したことを示す。ＲＮＡの４０〜５０％がＲＮアーゼ酵素によるヌクレアーゼ消化から保護されることが判定された。まとめると、これらのデータは、血清ＲＮＡは、エキソソーム内に存在し、エキソソーム膜によりヌクレアーゼ消化から保護されることを示す。
エキソソームマーカー
エキソソームマーカーＡｌｉｘおよびＣＤ９についてのウエスタンブロッティングを、ＳＤＳを有するＲＩＰＡ緩衝液中で再懸濁されたエキソソームペレットに対して、または粉末化ラット肝臓粉末に対して実施した。タンパク質含有率は、ＢＣＡアッセイにより判定し、それぞれのレーンに等量のタンパク質をロードした。
エキソソームマーカーＡｌｉｘおよびＣＤ９は、単離ヒト、ラットおよびマウスエキソソーム分画中に存在したが、ラット肝臓試料中で検出されなかった。肝細胞マーカーＳＲＢＩもヒト、ラットおよびマウス血清のエキソソーム分画中で検出された。
エキソソーム特徴
エキソソームペレットの凍結割断電子顕微鏡法は、約１００ｎｍの平均サイズを有する小胞の存在を示した。
エキソソームと類似の特徴を有する小胞は、動的光散乱により検出された。マウス、ラットおよびヒト試料についての粒子についての動的光散乱計測値は、以下のとおりである：
マウス Ｚ−平均：７９．８ｎｍ ＰＤＩ ０．５７７
ラット Ｚ−平均：１３４ｎｍ ＰＤＩ ０．９４４
ヒト Ｚ−平均：９７ｎｍ ＰＤＩ ０．９０７
実施例４
血清試料中の遺伝子サイレンシングの検出
肝臓肝細胞への送達のために脂質ナノ粒子中に配合されたげっ歯類ＴＴＲを標的化するｄｓＲＮＡを含むＡＦ−０１１−１８５３４を使用してナイーブラット中の肝臓遺伝子ＴＴＲをサイレンシングした。肝臓肝細胞への送達のために脂質ナノ粒子中に配合された霊長類ＴＴＲを標的化するｄｓＲＮＡを含むＳＮＡＬＰ−１８３２４を使用してナイーブカニクイザル中の肝臓遺伝子ＴＴＲをサイレンシングした。非哺乳動物遺伝子ルシフェラーゼを標的化するＡＦ−０１１−１９５５およびＳＮＡＬＰ−１９５５を、本明細書においてｄｓＲＮＡ対照として使用し、これはインビボで投与された場合にいかなる遺伝子サイレンシング効果も有さないことが公知である。
ナイーブラット中の遺伝子サイレンシング
実験１：単一ＩＶボーラスの０．３ｍｐｋ（ｍｇ／ｋｇ）のＡＦ−０１１−１８５３４（ｎ＝６）またはＡＦ−０１１−１９５５（ｎ＝６）をラットに投与して肝臓遺伝子サイレンシングを血清試料中のｍＲＮＡレベルの計測により検出することができるかどうかを判定した。肝臓および血清ＴＴＲｍＲＮＡレベルは、ボーラス投与２４時間後に計測した。１４ｍＬの新鮮血清試料をそれぞれの群のためにプールした。２〜４回の技術的反復を群毎に実施した。
図９Ａ中のデータは、ＡＦ−０１１−１８５３４投与後のＴＴＲの肝臓ｍＲＮＡの低減を示す。図９Ｂは、対照ｄｓＲＮＡのＡＦ−０１１−１９５５により処理された動物からのプール血清と比較した、ＡＦ−０１１−１８５３４より処理された動物からのプール血清中のＴＴＲｍＲＮＡレベルの類似の低減を示す。したがって、ＡＦ−０１１−１８５３４により媒介される肝臓中のＴＴＲ遺伝子サイレンシングは、血清中のＴＴＲｍＲＮＡ低下として検出可能である。
図１０Ａ〜１０Ｄは、ＡＡＴ、アルブミン、ＧＡＰＤＨ，および１８ｓｍＲＮＡにそれぞれ正規化されたラット血清中のＴＴＲｍＲＮＡレベルを示す。図１０Ａ〜１０Ｄのそれぞれのデータは、肝臓中のＡＦ−０１１−１８５３４媒介ＴＴＲ遺伝子サイレンシングを、肝細胞特異的またはユビキタス遺伝子のいずれかに正規化した場合、血清試料中の類似のＴＴＲｍＲＮＡ低下として検出することができることを示す。
図１１Ａ〜１１Ｄは、ラットに投与されたＡＦ−０１１−１８５３４が、血清試料中の非標的肝細胞特異的遺伝子（すなわち、ＡＡＴまたはアルブミン）のｍＲＮＡレベルを変えないことを示す。
単一ＩＶボーラスの抗ＴＴＲＲＮＡｉ薬剤により処理された動物において、膵臓中のＴＴＲｍＲＮＡの明らかなノックダウンは存在しなかった。
実験２：単一ＩＶボーラスの０．００１ｍｐｋ、０．００３ｍｐｋ、０．０１ｍｐｋ、０．０３ｍｐｋまたは０．１ｍｐｋのＡＦ−０１１−１８５３４をラット（ｎ＝４〜５）に投与して肝臓遺伝子サイレンシングの用量応答関係を、血清試料中のｍＲＮＡレベルの計測により検出することができるかどうかを判定した。対照群において、単一ＩＶボーラスの０．１ｍｐｋのＡＦ−０１１−１９５５（ｎ＝３）をｄｓＲＮＡ対照として使用し、ＰＢＳ（ｎ＝３）をビヒクル対照として投与した。肝臓および血清ＴＴＲｍＲＮＡレベルは、ＩＶボーラスの投与２４時間後に計測した。
ＡＦ−０１１−１８５３４媒介ＴＴＲ遺伝子サイレンシングの用量応答関係は、図１２Ａおよび１２Ｂにおいて示すとおり肝臓試料中で予期されるとおり明らかであった。ＡＦ−０１１−１８５３４媒介遺伝子サイレンシングの類似の用量応答関係は、図１３Ａおよび１３Ｂに示すとおり血清試料中で計測されたＴＴＲｍＲＮＡレベルについて観察された。
ナイーブカニクイザル中の遺伝子サイレンシング
実験３：単一１５分間ＩＶ注入の０．３ｍｐｋ、１ｍｐｋもしくは３ｍｐｋのＳＮＡＬＰ−１８３２４（ｎ＝３）、または３ｍｐｋのＳＮＡＬＰ−１９５５（ｎ＝３）をカニクイザルに投与して肝臓遺伝子サイレンシングを血清試料中のｍＲＮＡレベルの計測により検出することができるかどうかを判定した。肝臓および血清ＴＴＲｍＲＮＡレベルは、ＩＶ投与４８時間後に計測した。
図１４Ａは、肝臓組織中のＴＴＲｍＲＮＡのＳＮＡＬＰ−１８３２４媒介サイレンシングについての用量応答関係を示す。図１４Ｂは、血清試料中のＴＴＲｍＲＮＡのＳＮＡＬＰ−１８３２４媒介サイレンシングについて観察された用量応答関係を示す。
図１５は、ＳＮＡＬＰ−１８３２４の投与４８時間後における血清試料中のＴＴＲタンパク質の濃度（ＥＬＩＳＡを使用して計測）を示す。
３ｍｇ／ｋｇのＳＮＡＬＰ−１８３２４において、血清中のＴＴＲｍＲＮＡ抑制の程度は、肝臓中のＴＴＲｍＲＮＡ抑制の程度と区別不能であった一方、血清中のＴＴＲタンパク質抑制の程度は、約２０％だけ弱かった。
ＴＭＰＲＳＳ６のサイレンシングの血清検出
血清ｍＲＮＡ発現レベルを使用する遺伝子サイレンシングの検出は、ＴＴＲ以外の遺伝子に拡張することができる。例えば、図１６Ａおよび１６Ｂは、ＴＭＰＲＳＳ６ｍＲＮＡのサイレンシングを肝臓および血清試料の両方で検出することができること示す。
この実験において、０．３ｍｇ／ｋｇにおける単一ＩＶボーラスを雄ラット（１群当たりｎ＝４）に投与した。肝臓および血清ＴＭＰＲＳＳ６ｍＲＮＡレベルは、投与２４時間後に計測した。
ＲＮＡｉのボーラス投与後のサイレンシングの持続時間
ラット（１群当たり６〜８匹の動物）に、単一ＩＶボーラスの０．１ｍｇ／ｋｇの抗ＴＴＲｓｉＲＮＡ調製物または対照抗ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ調製物を投与した。肝臓および血清を動物屠殺の異なる時点において回収し（例えば、１日目、２日目、５日目、８日目、１０日目、および１４日目）、ＴＴＲｍＲＮＡ発現について分析した。図１７Ａは、血清中のＴＴＲｍＲＮＡレベルの回復は、肝臓試料中のＴＴＲｍＲＮＡの回復と並行することを示す。これらのデータは、血清中のＴＴＲレベルの計測が、投与されたＲＮＡｉ薬剤の臨床効果を検出する実行可能な方法であることを示す。
第２の試験において、肝臓および血清ＴＴＲｍＲＮＡの低減がｓｉＲＮＡ投与後のより短い時点において計測された。処理の３時間以内に、肝臓および血清ＴＴＲｍＲＮＡレベルの両方が４０〜５０％だけ低減され、約９０％のピーク標的低減が肝臓および血清中で１２時間までに達成された（図１７Ｂ）。したがって、標的遺伝子サイレンシングの開始および持続時間の両方に関してＬＮＰ−ｓｉＲＮＡによる処理後に経時的な肝臓中および血清中の相対ＴＴＲｍＲＮＡレベルの顕著な一致が存在した。これらの結果は、循環エキソソームｍＲＮＡ検出による肝臓遺伝子の循環ｍＲＮＡレベルのモニタリングが、組織特異的標的遺伝子サイレンシングの正確な提示を提供することを示す。
実施例５
ＲＮＡ収量の改善
一部の実施形態において、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）を１Ｍの最終濃度において使用して単離の間のＲＮＡ収量を増加させた。これらの実験において、血清試料は、１ＭのＬｉＣｌの存在または不存在下で４℃において濾過後１時間インキュベートした。続いて、ＲＮＡを上記のスクロース密度勾配超遠心を介して単離し、ＴａｑＭａｎ（登録商標）定量的ＰＣＲを介して分析した。図１８に示すとおり、ＧＡＰＤＨ、アルブミン、ベータアクチン、およびＴＴＲの相対ｍＲＮＡ発現レベルは、ＬｉＣｌの存在下で増加する。ＬｉＣｌとのインキュベーションは、超遠心工程の間のＲＮＡの沈殿を向上させる可能性が高く、したがって、単離の間の全ＲＮＡ収量を向上させる。
実施例６
Ｑ−ＰＣＲおよび５’ＲＡＣＥ
定量的ＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー系を使用して実施した。使用されるプライマー／アッセイは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入することができ、ヒトトランスチレチン（ＴＴＲ）（カタログ番号Ｈｓ００１７４９１４＿ｍ１）、ヒトアルファアンチトリプシン（ＡＡＴ）（カタログ番号Ｈｓ０１０９７８００＿ｍ１）、およびヒトアルブミン（カタログ番号Ｈｓ００９１０２２５＿ｍ１）を含む。
カスタムＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマーは、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（「カニクイザル」）ＴＴＲについて設計し、以下のものを含む：
カニクイザル ＴＴＲフォワードプライマー：ＴＧＧ ＣＡＴ ＣＴＣ ＣＣＣ ＡＴＴ ＣＣＡ
カニクイザル ＴＴＲリバースプライマー：ＣＧＧ ＡＡＴ ＣＧＴ ＴＧＧ ＣＴＧ ＴＧＡ Ａ
カニクイザル ＴＴＲ ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ：６ＦＡＭＡＧＣ ＡＴＧ ＣＡＧ ＡＧＧ ＴＧＧＭＧＢＮＦＱ
ヒトトランスチレチン（ＴＴＲ）の逆転写または５’ＲＡＣＥ（他のプライマーとの組合せにおける）のためのカスタムプライマーを設計し、以下のものを含む：
リバースプライマー：
５’ ｔｔｔｔａｃａｇａａｔｇｔｇｔｃｔｔｔｔｔａａｔｇｇｃｔｇｃ ３’
５’ ｇｃｔｇｃａｇａｔｃａｔａｔｔｔａａｔａｃｇｔｇｃ ３’
５’ ｇｃｔｔｇｃａａｇａｃａａｔｇｇａａａｔｔｔｇｇａｔｃ ３’
フォワードプライマー
５’ ｇａｃｔａａｇｔｃａａｔａａｔｃａｇａａｔｃａｇｃａｇ ３’
カスタム５’ＲＡＣＥプライマーは、ラットＴＴＲ配列を使用して設計し、以下のものを含む：
５’ ｔｔｔｔｔｔｇａａｔｇａａａｔａａａｇｇｔｇｇ ３’
５’ ｇａａｔｇａａａｔａａａｇｇｔｇｇ ３’
５’ ｇｇｔｇｇｔｔｔａａｔａａｇａａｃｇ ３’
５’ ｔａａｔａａｇａａｃｇｔｔｔｃａｃｇｇｃ ３’
５’ ｔｔｔｔｔｔｔｔｇａａｔｇａａａｔａａａｇｇｔ ３’
５’ ｃｃａｃｔｇｃｔｇｔｃｇｔｃａｇｔａａｃｃ ３’
５’ ｇａａｃｔｇａｇｇｇａｃｃｃａｇｃｃｃａｃ ３’
５’ ｃｃａｃｇａｇｇａｃｃａａｇａｔｃｔｔｇｃ ３’
５’−ＲＡＣＥ
ラット（１群当たりｎ＝６）に、ＬＮＰ−ｓｉＴＴＲまたはＬＮＰ−ｓｉＬｕｃ（０．１ｍｇ／ｋｇ）を注射し、ラットを２４時間後に分析のために屠殺した。それぞれの群の動物からの血清を分析のためにプールした。ＲＮＡをプール血清から抽出し、５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の５’急速増幅）のためにプロセシングした。正確なサイズのネステッドＰＣＲからのバンドを溶出させ、クローニングおよび配列決定した。
配列の２０％がｓｉＴＴＲ処理群において正確な開裂産物を実証した一方、対照ＬＮＰ−ｓｉＬｕｃ群において正確な開裂産物を有する配列は検出されなかった（表４）。さらに、図１９Ａは、開裂産物についての２つの配列と全長ラットＴＴＲｍＲＮＡとのアラインメントを示す。
Figure 2018019683
ラットにおける上記５’ＲＡＣＥ分析の結果も非ヒト霊長類モデルと一致し、配列の８４％がｓｉＴＴＲ処理群において正確な開裂産物を実証した一方、対照ＬＮＰ−ｓｉＬｕｃ群において正確な開裂産物を有する配列は検出されなかった（表５）。さらに、図１９Ｂは、開裂産物についての２つの配列と全長カニクイザルＴＴＲｍＲＮＡとのアラインメントを示す。
Figure 2018019683
これらのデータは、５’ＲＡＣＥを使用してＲＮＡｉ処理ラットの血清中でＴＴＲ開裂産物を検出することができることを示す。すなわち、肝臓ＲＮＡｉは、血清中の特異的５’ＲＡＣＥ産物の検出により確認することができる。
実施例７
遺伝子治療後の血清および肝臓中のｍＲＮＡの検出
外因性遺伝子の発現は、ＧＦＰを発現するアデノウイルス（Ａｄ−ＧＦＰ）またはヒトＡｐｏＥを発現するアデノウイルス（Ａｄ−ｈＡｐｏＥ）を注射されたラットモデルの血清中でｍＲＮＡの血清レベルの計測により検出することができることが判定された。同様に、外因性または治療遺伝子の発現は、ラットモデルの肝臓中で治療遺伝子の肝臓ｍＲＮＡレベルの計測により検出することができる。
１日目にラットにＡｄ−ＧＦＰまたはＡｄ−ｈＡｐｏＥ（１×１０１１のｍｏｉ）のいずれかを静脈内注射し；５日目に血清および肝臓全体を分析のために摘出した。アデノウイルス発現は肝臓全体にわたり均等でないため、２つの別個のＲＮＡ調製物をそれぞれの肝臓から調製して組織サンプリングを増加させた。
図２０および図２１は、アデノウイルスを使用して送達された外因性ＧＦＰおよびＡｐｏＥのｍＲＮＡを処理動物の肝臓および血清中の両方で検出することができることを示す。発現レベルは、予期されるとおり動物毎に変動した。データは、処理動物の肝臓および血清中の相対ｍＲＮＡレベル間で相関が存在することも示した。
まとめると、これらのデータは、本明細書に記載の方法およびアッセイを使用して血清または肝臓中の遺伝子治療法を使用して送達された外因性遺伝子のｍＲＮＡレベルを評価することができることを示す。したがって、このようなアッセイおよび方法を使用して比較的非侵襲的様式で、例えば、血清試料中のｍＲＮＡレベルの計測により患者における遺伝子治療レジメンの成功を判定および／またはモニタリングすることができる。
実施例８
血清および肝臓試料中のｍｉＲＮＡ阻害の検出
ｍＲＮＡおよびタンパク質に加え、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が循環エキソソーム中で検出されている。ｍｉＲＮＡ標的化オリゴヌクレオチドの活性をモニタリングするための循環エキソソームｍＲＮＡ検出の適用可能性を試験するため、ラットに肝臓特異的ｍｉＲＮＡのｍｉＲ−１２２に対して指向されたＬＮＰ−配合オリゴヌクレオチドを投与した。対照マウスは、ミスマッチオリゴヌクレオチドを受容した。３日後、ｍｉＲ−１２２レベルを肝臓および血清から単離された総ＲＮＡ中で計測した。図２２Ａに示すとおり、ｍｉＲ１２２特異的オリゴヌクレオチドによる処理は、肝臓ｍｉＲ−１２２レベルを８８％だけ低減させ、血清中でも同様に８６％減少した。ｍｉＲ−１２２レベルの低減がｍｉＲ−１２２の非特異的下方調節により引き起こされないことをさらに確認するため、ｍｉＲ−１２２標的アルドラーゼＡの発現レベルを計測した。図２２Ｂに示すとおり、ｍｉＲ１２２特異的オリゴヌクレオチドによる処理は、肝臓中の標的アルドラーゼＡｍＲＮＡ発現の増加を引き起こした。しかしながら、この上方調節は、血清中では検出することができず、おそらく、アルドラーゼＡがユビキタスに発現されるためである。まとめると、これらの結果は、肝臓中のｍｉＲＮＡ阻害をモニタリングするための、循環エキソソームｍＲＮＡ検出の使用を確立する。
実施例９
脳脊髄液中の遺伝子サイレンシングの検出
エキソソームは、脳脊髄液（ＣＳＦ）中で検出されている。循環エキソソームｍＲＮＡ検出をＣＳＦに適用して脳中の遺伝子サイレンシングをモニタリングすることができるかどうかを判定するため、パーキンソン病関連遺伝子Ｓｎｃａを標的化するｓｉＲＮＡを、ラットの線条体中に両側注入した。雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを麻酔し、定位固定フレーム（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ（商標）Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ，ｍｙＮｅｕｒｏＬａｂ）中に配置した。３０ゲージ浸透圧ポンプ注入カニューラ（Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｏｎｅ，Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ，ＣＮ）を左右の脳半球中に植込み、線条体を標的化した（ブレグマに対する定位座標ＡＰ０．５、ＭＬ３およびＤＶ５．１；門歯バーは両耳間線の３．３ｍｍ下）。ＰＢＳ中に配合されたＬｕｃまたはＳＮＣＡｓｉＲＮＡを含有する浸透圧ポンプ（１μｌ／ｈｒの流速、Ａｌｚｅｔ）を製造業者の説明書に従って０．９％の生理食塩水中で３７℃において一晩プライミングし、次いでカニューラに接続し、皮下に植え込んだ。１ｕｌ／ｈｒの流速においてラットに投与される４ｍｇ／ｍｌのｓｉＲＮＡの濃度は、線条体のそれぞれの部位について０．０９６ｍｇ／日の用量に対応する。注入の７日後、ラットを麻酔し、定位固定フレーム中にマウントした。環椎後頭膜を曝露し、３０ゲージニード（ｎｅｅｄ）を有するシリンジを使用して環椎後頭膜を介してＣＳＦを回収した。ＣＳＦ回収後、ラットを屠殺し、脳を取り出した。ｍＲＮＡ定量のため、前部から後部へのラット脳にわたる１ｍｍ厚の冠状スライスを、脳マトリックス（Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ，ＭＡ）を使用して得、線条体をそれぞれのスライスから切開し、液体窒素中でスナップ凍結し、次いでｍＲＮＡ定量を実施するまで−８０℃において貯蔵した。線条体ＲＮＡを調製するため、組織をＱｉａｚｏｌ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）中でホモジナイズし、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を使用して総ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡの合成は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施し、ラットＳｎｃａおよびＧａｐｄｈ発現は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して定量した。ＣＳＦからＲＮＡを単離するため、試料をプールし（それぞれ５ｍｌ）、ＬｉＣｌを１Ｍの最終濃度まで添加した。４℃における１時間のインキュベーション後、試料を１１００００×ｇにおいて１００分間遠心分離し、ＲＮＡをペレットからＴｒｉｚｏｌ抽出およびイソプロパノール沈殿により調製した。ｃＤＮＡの合成およびＴａｑＭａｎ（登録商標）分析を標準的プロトコル毎に実施した。
７日の注入期間の終了時、脳およびＣＳＦを分析のために回収した。ナイーブ動物と比較して線条体ＳｎｃａｍＲＮＡの３３％の低減が、ＳｎｃａｓｉＲＮＡを受容した動物において計測された（図２３）。ＣＳＦエキソソームＲＮＡを分析するため、プール試料を高速遠心分離に供し、総ＲＮＡをペレットから単離した。対照に対してＳｎｃａｍＲＮＡの６１％の低減が、ＳｎｃａｓｉＲＮＡ処理動物からのＣＳＦ中で計測された（図２３）。線条体と比較したＣＳＦのＳｎｃａｍＲＮＡの低減のより大きい相対程度は、脳の異なる領域によるエキソソームの分泌の変動性に起因し得た。これらの結果は、ＣＳＦＲＮＡのアッセイにより脳発現遺伝子のサイレンシングをモニタリングするための循環エキソソームｍＲＮＡ検出の好適性を確認する。
他の実施形態は、特許請求の範囲に存在する。

Claims (66)

  1. 対象中のｉＲＮＡ薬剤の活性を判定する方法において：
    ｉ）組織中で発現されるＲＮＡを標的化するｉＲＮＡ薬剤を投与された対象から採取された、エキソソームを含む生物試料を、ＲＮＡ収量を増加させる試薬と接触させること、
    ｉｉ）前記生物試料から前記標的ＲＮＡまたはその開裂産物を含むペレットを得ること、
    ｉｉｉ）前記ペレットからＲＮＡを単離すること、および
    ｉｖ）前記単離ＲＮＡ中の前記標的ＲＮＡまたはその開裂産物のレベルを検出することを含み、
    ここで、前記エキソソームを、前記標的ＲＮＡまたは開裂産物のレベルの検出前に前記生物試料からエキソソーム結合分子を使用して精製せず、かつ
    参照試料と比較した前記標的ＲＮＡのレベルの変化または前記開裂産物のレベルの増加は、前記ｉＲＮＡ薬剤が前記対象中で活性であることを示す、方法。
  2. 前記ｉＲＮＡ薬剤が前記対象中で不活性である判定に基づき、前記対象に投与されるｉＲＮＡ薬剤の用量を増加させることをさらに含む；または前記ｉＲＮＡ薬剤が前記対象中で活性である判定に基づき、前記対象に投与されるｉＲＮＡ薬剤の用量を増加または減少させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記生物試料は、微小胞をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記生物試料中の前記ＲＮＡの分画は、前記エキソソーム中に存在する、請求項１に記載の方法。
  5. 前記ペレットを得ることは、前記生物試料を１１００００ｇから１４００００ｇで遠心分離することを含む、請求項１に記載の方法。
  6. 前記ｉＲＮＡ薬剤は、肝臓、中枢神経系（ＣＮＳ）、腎臓、脳、脊髄、脈絡叢、末梢ニューロンもしくは神経、筋肉、内皮細胞、心臓、免疫細胞、皮膚、眼、膵臓、肺、胃、小腸もしくは大腸、結腸、副腎、腫瘍、癌病巣、または脾臓中で発現されるＲＮＡを標的化する、請求項１に記載の方法。
  7. 前記標的ＲＮＡまたは開裂産物を、５’ＲＡＣＥ、ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイ、または逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により計測する、請求項１に記載の方法。
  8. 前記標的ＲＮＡは、ハンチンチン（Ｈｔｔ）、アルファシヌクレイン（ＳＮＣＡ）、前駆タンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）、トランスチレチン（ＴＴＲ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、キネシン様タンパク質（ＫＳＰ）、耳下腺プロリンリッチ唾液タンパク質Ｐｃ（ＰＣＳ）、アンギオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３）、ヘプシジン、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡ、ｅｇｌ９ホモログ（ＥＧＬＮ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＲＮＡ、ポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ）、アルファ−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）、膜貫通セリンプロテアーゼ６（ＴＭＰＲＳＳ６）、クルッペル様因子４（ＫＬＦ）、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）、ｐ５３、カスパーゼ２、β−カテニン、またはプロテインキナーゼＮ３（ＰＫＮ３）である、請求項１に記載の方法。
  9. 前記対象は、神経障害、ハンチントン病またはパーキンソン病から選択される障害を有する、請求項１に記載の方法。
  10. 前記ｉＲＮＡ薬剤を、直接注射もしくは注入、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、吸入、局所、頭蓋内、脳室内、硬膜外、鞘内、動脈内、硝子体内、皮内、経口、または心臓内送達により前記対象に投与した、請求項１に記載の方法。
  11. 前記生物試料を、前記対象が前記ｉＲＮＡ薬剤を投与されて６、１２、２４、３６、４８、７２、９６、１２０、または１６８時間後に得る、請求項１に記載の方法。
  12. 前記標的ＲＮＡのレベルを、肝臓タンパク質をコードするＲＮＡ、１８ｓＲＮＡ、ＧＡＰＤＨ ＲＮＡ、β−アクチン ＲＮＡ、平滑筋細胞関連タンパク質をコードするＲＮＡから選択される、前記生物試料中のＲＮＡに正規化し、前記肝臓タンパク質は第ＶＩＩ因子、アルブミン、またはアルファアンチトリプシン（ＡＡＴ）から選択され、平滑筋細胞関連タンパク質は、Ａｃｔａ２である、請求項１に記載の方法。
  13. 前記標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡまたはマイクロＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
  14. 請求項１に記載の方法において：
    ｉ）生物試料から離隔した組織中で発現されるＲＮＡを標的化するｉＲＮＡ薬剤を投与された対象から採取された、エキソソームを含む生物試料を、ＬｉＣｌと接触させること、
    ｉｉ）前記生物試料から前記標的ＲＮＡの開裂産物を含むペレットを得ること、
    ｉｉｉ）前記ペレットからＲＮＡを単離すること、および
    ｉｖ）前記単離ＲＮＡ中の前記標的ＲＮＡの開裂産物のレベルを検出することを含み、
    ここで、前記エキソソームを、前記標的ＲＮＡまたは開裂産物のレベルの検出前に前記生物試料からエキソソーム結合分子を使用して精製せず、かつ
    参照試料と比較した開裂産物のレベルの増加は、前記ｉＲＮＡ薬剤が前記対象中で活性であることを示し、参照試料と比較した開裂産物のレベルの減少または静止は、前記ｉＲＮＡ薬剤が前記対象中で不活性であることを示す、請求項１に記載の方法。
  15. 対象中のｉＲＮＡ薬剤の活性を判定するアッセイにおいて：
    ｉ）組織中で発現されるＲＮＡを標的化するｉＲＮＡ薬剤を投与された対象から得られた生物試料を、ＲＮＡ収量を増加させる試薬と接触させることであって、前記生物試料は、エキソソームを含み、
    ｉｉ）前記生物試料から前記標的ＲＮＡまたはその開裂産物を含むペレットを得ること、
    ｉｉｉ）前記ペレットからＲＮＡを単離すること、
    ｉｖ）前記単離ＲＮＡを、前記標的ＲＮＡまたはその開裂産物のレベルを検出するためのプローブと接触させること、
    ｖ）前記単離ＲＮＡ中の前記標的ＲＮＡまたは開裂産物のレベルを検出することであって、前記エキソソームを、前記標的ＲＮＡまたはその開裂産物の量の計測前に前記生物試料からエキソソーム結合分子を使用して精製しない、検出すること、および
    ｖｉ）工程ｖ）において検出された前記標的ＲＮＡまたは開裂産物のレベルを参照試料と比較することを含み、
    ここで、前記参照試料と比較した前記標的ＲＮＡのレベルの変化または前記開裂産物のレベルの増加は、前記対象中のｉＲＮＡ薬剤活性を示す、アッセイ。
  16. 前記生物試料は、血液またはＣＳＦ試料である、請求項１５に記載のアッセイ。
  17. 前記ｉＲＮＡ薬剤は、肝臓またはＣＮＳ中で発現されるＲＮＡを標的化する、請求項１５に記載のアッセイ。
  18. 前記ｉＲＮＡ薬剤が前記対象中で不活性である判定に基づき、前記対象に投与されるｉＲＮＡ薬剤の用量を増加させることをさらに含む；または前記ｉＲＮＡ薬剤が前記対象中で活性である判定に基づき、前記対象に投与されるｉＲＮＡ薬剤の用量を増加または減少させることをさらに含む、請求項１５に記載のアッセイ。
  19. 前記ペレットを得ることは、前記生物試料を１１００００ｇから１４００００ｇで遠心分離することを含む、請求項１５に記載のアッセイ。
  20. 対象中の治療核酸またはモジュレーターの活性を判定する方法において：
    ｉ）組織中で発現されるＲＮＡを標的化する治療核酸またはモジュレーターを投与された対象から採取された、エキソソームを含む生物試料であって、前記標的ＲＮＡは、前駆タンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９） ｍＲＮＡ、トランスチレチン（ＴＴＲ） ｍＲＮＡ、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ） ｍＲＮＡ、キネシン様タンパク質（ＫＳＰ） ｍＲＮＡ、耳下腺プロリンリッチ唾液タンパク質Ｐｃ（ＰＣＳ） ｍＲＮＡ、アンギオポエチン様３（ＡＮＧＰＴＬ３） ｍＲＮＡ、ヘプシジン ｍＲＮＡ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡ、ｅｇｌ９ホモログ（ＥＧＬＮ） ｍＲＮＡ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＲＮＡ、ポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ） ｍＲＮＡ、アルファ−アンチトリプシン（ＡＡＴ） ｍＲＮＡ、活性化タンパク質Ｃ（ＡＰＣ） ｍＲＮＡ、膜貫通セリンプロテアーゼ６（ＴＭＰＲＳＳ６） ｍＲＮＡ、クルッペル様因子４（ＫＬＦ） ｍＲＮＡ、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ） ｍＲＮＡ、ｐ５３ ｍＲＮＡ、カスパーゼ２ ｍＲＮＡ、β−カテニン ｍＲＮＡ、プロテインキナーゼＮ３（ＰＫＮ３） ｍＲＮＡ、ハンチンチン（ＨＴＴ） ｍＲＮＡ、アルファシヌクレイン（ＳＮＣＡ） ｍＲＮＡ、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９２、およびｍｉＲ−１９４からなる群から選択される、前記生物試料をＬｉＣｌと接触させること、
    ｉｉ）前記生物試料から前記標的ＲＮＡ、前記標的ＲＮＡの下流のＲＮＡ、またはその開裂産物を含むペレットを得ること、
    ｉｉｉ）前記ペレットからＲＮＡを単離すること、および
    ｉｖ）前記単離ＲＮＡ中の前記標的ＲＮＡ、前記標的ＲＮＡの下流のＲＮＡ、またはその開裂産物のレベルを検出することを含み、
    ここで、前記エキソソームを、前記標的ＲＮＡ、下流ＲＮＡ、または開裂産物のレベルの検出前に前記生物試料からエキソソーム結合分子を使用して精製せず、かつ
    参照試料と比較した前記標的ＲＮＡ、下流ＲＮＡまたは開裂産物のレベルの変化の検出は、前記治療核酸またはモジュレーターが前記対象中で活性であることを示す、方法。
  21. 前記治療核酸またはモジュレーターが前記対象中で不活性である判定に基づき、前記対象に投与される治療核酸またはモジュレーターの用量を増加させることをさらに含む；または前記治療核酸またはモジュレーターが前記対象中で活性である判定に基づき、前記対象に投与される治療核酸またはモジュレーターの用量を増加または減少させることをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記ペレットを得ることは、前記生物試料を１１００００ｇから１４００００ｇで遠心分離することを含む、請求項２０に記載の方法。
  23. 前記治療核酸は、アンタゴｍｉｒ、ｍｉＲＮＡ模倣物、ｄｓＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、プロモーター指向性ＲＮＡ（ｐｄＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、ＲＮＡ活性化分子、発現干渉ＲＮＡ（ｅｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、デコイＲＮＡ、アプタマーまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択されるＲＮＡエフェクター分子である、請求項２０に記載の方法。
  24. 前記治療核酸は、外因性ＤＮＡ分子、発現ＤＮＡ、ドミナントネガティブ突然変異体、改変遺伝子産物、突然変異遺伝子産物、生体異物遺伝子、もしくはトランス遺伝子を発現するＤＮＡエフェクター分子、またはウイルスベクターもしくはプラスミドＤＮＡを含むＤＮＡエフェクター分子であって、前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはエプスタイン・バーウイルスベクターである、請求項２０に記載の方法。
  25. 対象を治療するインビトロ方法において：
    ａ）対象中のｉＲＮＡ薬剤の活性の情報を採取することであって：
    ｉ）生物試料を、ＲＮＡ収量を増加させる試薬と接触させること、
    ｉｉ）前記生物試料から標的ＲＮＡまたはその開裂産物を含むペレットを得ること、
    ｉｉｉ）前記ペレットからＲＮＡを単離すること、および
    ｉｖ）前記単離ＲＮＡ中の前記標的ＲＮＡまたはその開裂産物のレベルを検出することを含み、
    ここで、前記生物試料は、エキソソームを含み、前記ｉＲＮＡ薬剤は、組織中で発現されるＲＮＡを標的化し、
    前記エキソソームを、前記標的ＲＮＡまたは開裂産物のレベルの検出前に前記生物試料からエキソソーム結合分子を使用して精製せず、かつ
    参照試料と比較した前記標的化または発現されるＲＮＡまたは開裂産物のレベルの変化は、前記ｉＲＮＡ薬剤が前記対象中で活性であることを示す、採取すること、および
    ｂ）前記対象に有効量のｉＲＮＡ薬剤を投与することであって、前記有効量を、前記対象中のｉＲＮＡ薬剤の活性の情報に基づき判定することとを含む、方法。
  26. 前記ｉＲＮＡ薬剤が前記対象中で不活性である判定に基づき、前記対象に投与されるｉＲＮＡ薬剤の用量を増加させることをさらに含む；または前記ｉＲＮＡ薬剤が前記対象中で活性である判定に基づき、前記対象に投与されるｉＲＮＡ薬剤の用量を増加または減少させることをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記生物試料は、１１００００ｇから１４００００ｇで遠心分離されている、請求項２５に記載の方法。
  28. 前記生物試料は、血液またはＣＳＦ試料である、請求項２５に記載の方法。
  29. 前記ｉＲＮＡ薬剤は、肝臓またはＣＮＳ中で発現されるＲＮＡを標的化する、請求項２５に記載の方法。
  30. 前記標的ＲＮＡは、ＴＴＲであり、前記対象を、トランスチレチン（ＴＴＲ）アミロイドーシスについて治療する、請求項２５に記載の方法。
  31. ＴＴＲ遺伝子をコードするｍＲＮＡの開裂産物のレベルを検出することを含む、請求項２５に記載の方法。
  32. ＲＮＡ収量を増加させる試薬は、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）を含む、請求項１に記載の方法。
  33. ＬｉＣｌは、１Ｍの最終濃度において使用される、請求項３２に記載の方法。
  34. ＲＮＡ収量を増加させる試薬はＬｉＣｌを含む、請求項１５に記載の方法。
  35. ＬｉＣｌは、１Ｍの最終濃度において使用される、請求項３４に記載の方法。
  36. ＬｉＣｌは、１Ｍの最終濃度において使用される、請求項２０に記載の方法。
  37. 前記エキソソーム結合分子は、抗体、レクチン、またはタンパク質リガンドである、請求項１に記載の方法。
  38. 前記エキソソーム結合分子は、抗体、レクチン、またはタンパク質リガンドである、請求項１５に記載のアッセイ。
  39. 前記エキソソーム結合分子は、抗体、レクチン、またはタンパク質リガンドである、請求項２０に記載の方法。
  40. 前記エキソソーム結合分子は、抗体、レクチン、またはタンパク質リガンドである、請求項２５に記載の方法。
  41. 前記ＲＮＡ収量を増加させる試薬は、ＬｉＣｌを含む、請求項２５に記載の方法。
  42. ＬｉＣｌは、１Ｍの最終濃度において使用される、請求項４１に記載の方法。
  43. 対象中のｉＲＮＡ薬剤の活性を判定する方法において：
    ｉ）肝臓中で発現されるＲＮＡを標的化するｉＲＮＡ薬剤を投与された対象から採取された、エキソソームを含む生物試料を、ＬｉＣｌと接触させること、
    ｉｉ）標的ＲＮＡまたはその開裂産物を含むペレットを得ること、
    ｉｉｉ）前記ペレットからＲＮＡを単離すること、および
    ｉｖ）前記単離ＲＮＡ中の前記標的ＲＮＡまたはその開裂産物のレベルを検出することを含み、
    ここで、参照試料と比較した前記標的ＲＮＡのレベルの変化または前記開裂産物のレベルの増加は、前記ｉＲＮＡ薬剤が前記対象中で活性であることを示す、方法。
  44. 前記ＲＮＡは、肝臓特異的ＲＮＡである、請求項４３に記載の方法。
  45. 生物学試料中の標的ＲＮＡまたはその開裂産物のレベルを検出する方法において：
    ｉ）組織中で発現されるＲＮＡを標的化するｉＲＮＡ薬剤を投与された対象から採取された、エキソソームを含む生物試料を、ＲＮＡ収量を増加させる試薬と接触させること、
    ｉｉ）前記生物試料から標的ＲＮＡまたはその開裂産物を含むペレットを得ること、
    ｉｉｉ）前記ペレットからＲＮＡを単離すること、および
    ｉｖ）前記単離ＲＮＡ中の前記標的ＲＮＡまたはその開裂産物のレベルを検出することを含み、
    ここで、前記エキソソームを、前記標的ＲＮＡまたは開裂産物のレベルの検出前に前記生物試料からエキソソーム結合分子を使用して精製しない、方法。
  46. ＲＮＡ収量を増加させる試薬は、ＬｉＣｌを含む、請求項４５に記載の方法。
  47. ＲＮＡ収量を増加させる試薬は、酢酸ナトリウムを含む、請求項４５に記載の方法。
  48. 前記生物試料は、前記ＲＮＡが発現について標的化される同一組織から得ない、請求項４５に記載の方法。
  49. 前記ｉＲＮＡ薬剤は、肝臓、中枢神経系（ＣＮＳ）、腎臓、脳、脊髄、脈絡叢、末梢ニューロンもしくは神経、筋肉、内皮細胞、心臓、免疫細胞、皮膚、眼、膵臓、肺、胃、小腸もしくは大腸、結腸、副腎、腫瘍、癌病巣、または脾臓中で発現されるＲＮＡを標的化する、請求項４５に記載の方法。
  50. 前記ｉＲＮＡ薬剤は肝臓中で発現されるＲＮＡを標的化する、請求項４５に記載の方法。
  51. 前記ｉＲＮＡ薬剤は、脳中で発現されるＲＮＡを標的化し、かつ前記生物試料はＣＳＦ試料である、請求項４５に記載の方法。
  52. 前記生物試料は、前記ＲＮＡが発現について標的化される同一組織から得ない、請求項１に記載の方法。
  53. 前記生物試料は、前記ＲＮＡが発現について標的化される同一組織から得ない、請求項１５に記載のアッセイ。
  54. 前記生物試料は、前記ＲＮＡが発現について標的化される同一組織から得ない、請求項２０に記載の方法。
  55. 前記生物試料は、前記ＲＮＡが発現について標的化される同一組織から得ない、請求項２５に記載の方法。
  56. 前記ｉＲＮＡ薬剤は肝臓中で発現されるＲＮＡを標的化する、請求項１に記載の方法。
  57. 前記ｉＲＮＡ薬剤は、脳中で発現されるＲＮＡを標的化し、かつ前記生物試料はＣＳＦ試料である、請求項１に記載の方法。
  58. 前記ｉＲＮＡ薬剤は、肝臓、中枢神経系（ＣＮＳ）、腎臓、脳、脊髄、脈絡叢、末梢ニューロンもしくは神経、筋肉、内皮細胞、心臓、免疫細胞、皮膚、眼、膵臓、肺、胃、小腸もしくは大腸、結腸、副腎、腫瘍、癌病巣、または脾臓中で発現されるＲＮＡを標的化する、請求項１５に記載のアッセイ。
  59. 前記ｉＲＮＡ薬剤は肝臓中で発現されるＲＮＡを標的化する、請求項１５に記載のアッセイ。
  60. 前記ｉＲＮＡ薬剤は、脳中で発現されるＲＮＡを標的化し、かつ前記生物試料はＣＳＦ試料である、請求項１５に記載のアッセイ。
  61. 前記ｉＲＮＡ薬剤は、肝臓、中枢神経系（ＣＮＳ）、腎臓、脳、脊髄、脈絡叢、末梢ニューロンもしくは神経、筋肉、内皮細胞、心臓、免疫細胞、皮膚、眼、膵臓、肺、胃、小腸もしくは大腸、結腸、副腎、腫瘍、癌病巣、または脾臓中で発現されるＲＮＡを標的化する、請求項２０に記載の方法。
  62. 前記ｉＲＮＡ薬剤は肝臓中で発現されるＲＮＡを標的化する、請求項２０に記載の方法。
  63. 前記ｉＲＮＡ薬剤は、脳中で発現されるＲＮＡを標的化し、かつ前記生物試料はＣＳＦ試料である、請求項２０に記載の方法。
  64. 前記治療核酸またはモジュレーターは、肝臓、中枢神経系（ＣＮＳ）、腎臓、脳、脊髄、脈絡叢、末梢ニューロンもしくは神経、筋肉、内皮細胞、心臓、免疫細胞、皮膚、眼、膵臓、肺、胃、小腸もしくは大腸、結腸、副腎、腫瘍、癌病巣、または脾臓中で発現されるＲＮＡを標的化する、請求項２５に記載の方法。
  65. 前記治療核酸またはモジュレーターは、肝臓中で発現されるＲＮＡを標的化する、請求項２５に記載の方法。
  66. 前記ｉＲＮＡ薬剤は、脳中で発現されるＲＮＡを標的化し、かつ前記生物試料はＣＳＦ試料である、請求項２５に記載の方法。
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