KR20210071003A - 멀티플렉스 형광 및 서열분석을 사용한 질환 진단 방법 - Google Patents

멀티플렉스 형광 및 서열분석을 사용한 질환 진단 방법 Download PDF

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KR20210071003A
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Abstract

본 발명은 멀티플렉스 형광 계내 혼성화(FISH)를 통해 질환 관련 바이오마커의 mRNA 종 및/또는 적어도 하나의 miRNA 종이 대상체로부터 수득한 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 단계, 및 멀티플렉스 서열분석에 의해 질환 관련 바이오마커의 상기 mRNA 종 및/또는 단계(a)의 질환 관련 바이오마커의 상기 miRNA 종이 상기 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 단계에 의해 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본원에 기재되고 제공된 바와 같은 진단 방법을 수행하기 위한 키트 뿐만 아니라 본원에 기재되고 제공된 바와 같은 진단 방법을 수행하기 위한 이러한 키트의 용도에 관한 것이다.

Description

멀티플렉스 형광 및 서열분석을 사용한 질환 진단 방법
본 발명은 멀티플렉스 형광 계내 혼성화(multiplex fluorescence in situ hybridization; FISH)를 통해 질환 관련 바이오마커의 mRNA 종 및/또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개, 또는 10 개 초과의 miRNA 종이 대상체로부터 수득한 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 단계, 및 멀티플렉스 서열분석에 의해 질환 관련 바이오마커의 상기 mRNA 종 및/또는 단계(a)의 질환 관련 바이오마커의 상기 miRNA 종이 상기 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 단계에 의해 질환을 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본원에 기재되고 제공된 바와 같은 진단 방법을 수행하기 위한 키트 뿐만 아니라 본원에 기재되고 제공된 바와 같은 진단 방법을 수행하기 위한 이러한 키트의 용도에 관한 것이다.
초기 상태에 가능한 한 믿을 수 있게 질환을 진단하는 것은 후속 요법의 성공률을 높이는 데 가장 중요하다. 바이오마커는 miRNA(microRNA)와 같은 바이오마커를 포함하여 모든 종류의 질환을 진단하는 데 점점 더 중요해지고 있다. miRNA와 같은 풍부한 바이오마커를 검출하는 데 적합한 FISH 방법은 피부암을 검출하기 위해 일찍 기재되었다(Renwick et al., JCI (2013), 123(6): 2694-2702). 그러나, 이러한 방법은 miRNA와 같은 매우 풍부하고 세포-유형 특이적 핵산에 대해 개발되었으며 다른 바이오마커 핵산에 대해서는 용이하게 사용되지 않았다. 더욱이, 단일 분자 RNA FISH를 포함한 현재 FISH 방법은 특히 신호 강도만 정량화되고 바이오마커 정량화에 사용될 때 정확한 전사체 풍부도 측정을 보장하지 않는다.
유방암(BCa)은 여성에 대한 모든 세포 유형 중에서 1위를 차지한다. 여성 8 명 중 1 명은 그들의 일생에 BCa가 발생하며 2017년에는 전 세계적으로 연간 550 000 명이 사망한 것으로 추정되었다. 미국에서는 44 000 명의 여성이 BCa로 사망한 반면, 유럽에서는 143 000 명의 사망으로 상황이 훨씬 더 나쁘다. 2017년에 유럽에서 약 571 000 명의 신규 환자가 침습성 BCa로 진단되었다. 2 가지 주요한 문제가 있다: 1. 현재 의료 표준은 종종 재진단을 허용하지 않는다; 2. 오늘날의 진단 테스트는 정확도 및 정밀도가 부족하여 거짓 양성(20-30%), 거짓 음성(20-25%) 및 과잉진단(10-20%) 결과를 제공한다. 따라서, BCa 환자는 오진/과잉진단되며, 약 280 000 명의 BCa 환자(약 50%)의 잘못된/과소/과잉 치료를 초래하여 유럽에서 많은 수의 BCa 사망에 심각하게 기여하며, 또한 환자 및 전체 사회의 사회적 및 경제적 부담을 증가시킨다.
유방암(BCa)은 여성에서 가장 흔한 암이며, 2012년에 전 세계적으로 170 만 건의 신규 사례가 진단되었다. 이 수치는 노화, 오염, 폐경 호르몬 사용, 생활방식, 비만 등으로 인해 2030년에는 두 배가 될 것으로 예상된다. 유럽에서의 발병률은 약 60만 명으로 여성 8 명 중 1 명에 영향을 미친다. BCa는 여성에서 암 사망의 두번째 주요 원인이다. 오늘날, BCa 환자의 거의 50%가 오진되고 나중에 잘못된/과소/과잉 치료를 받아 생명의 위협을 받으며 종종 사망을 야기한다. 이 비율을 개선하기 위해, BCa 진단 및 치료는 더 정확하고 개인화되어야 한다. BCa 진단이 이루어질 때, 종양 크기, 결절 병발, 종양 등급, 에스트로겐 수용체 상태, 프로게스테론 수용체 상태, 형태학, HER2/neu 상태 등과 같이 종양전문의가 알아야 할 질환의 특이적 특징이 있다. 이들 특징은 암의 전반적인 상태를 생성한 다음 환자를 위한 특이적 치료 계획을 세우는 데 사용된다. 종종, 이 정보는 화학요법이 효과적인지 결정하기에 충분히 분명하지 않다. 종양전문의는 BCa 환자의 46%가 화학요법에서 이득을 얻지 못한다는 것을 인식하였다. 이들 환자(BCa가 재발하지 않음)가 화학요법을 받는 경우, 부작용 및 가능한 합병증이 약제의 임의의 이익을 능가할 가능성이 있었다. 가장 효과적인 요법, 치료 지속기간, 및 환자가 화학요법으로 이익을 받는지 아닌지를 직접 정의하는 단일 진단 테스트로부터 100% 정확한 BCa 진단을 하는 것은 BCa 진단, 예후 및 치료에 이익일 것이다.
그러나, 단일 테스트에 제공된 데이터는 단지 제한적이다: BCa를 진단하는 통상적인 임상 프로토콜(IHC, H&E, 혈액 검사 등)은 완전히 정량적이지 않다(BCa 마커의 수준을 정확하게 측정할 수 없음). 반면에, 표준 정량적 RNA-기반 방법(RT-qPCR, 마이크로어레이 등)은 BCa 마커의 발현 수준을 측정하기 위해 조직으로부터 단리된 샘플에서 수행된다. 그러나, 이들은 단지 몇 개의 BCa 마커를 측정할 수 있으며 이질적인 BCa의 치료에 필수적인 조직-형태학 정보가 부족하다. 따라서, 종양전문의는 제한된 수의 임상적으로 검증된 바이오마커에 의존하여 BCa 치료법을 선택하고 정량적 측정 및 물리적 특징을 수득하기 위해 여러 테스트를 수행해야 한다. 따라서, 통상적인 진단은 31% 암 오진 + 10-20% 과잉진단을 초래한다.
또한, 신뢰할 수 없는 진단율이 있다(~50%): 기존 암 프로파일링 방법은 대부분 암 마커를 신뢰할 수 있게 측정하지 않는다. IHC를 사용하여 조직 절편에서 수행된 HER2 상태 테스팅은 거짓 양성/음성 비율(>30%)을 생성할 수 있다. ER/PR 거짓 음성 비율은 20-25% 범위이고, HER2 거짓 양성 비율은 20-30%이며 과잉진단은 10-20%이다(ISH 및 IHC 모두에서). 암의 잘못된 분류는 불필요한 독성 치료를 초래하여 종종 사망을 야기한다.
또한, 진단은 대부분의 경우 너무 오래 걸린다(>4 주): 현재 진단 테스트로부터 가장 정확한 진단을 달성하기 위해, 여러 테스트를 수행할 필요가 있으며(이는 종종 현재 의료 표준에 의해 허용되지 않음), 종종 상이한 실험실을 수반한다. 이로 인해 1 개월 초과의 검사소요 시간(turnaround time)이 발생하면서 거짓 양성/음성 비율의 위험이 더 높아진다. 다른 진단 해결책(Oncotype DX, MammaPrint, Prosigna)은 임상 정보를 제공하는 데 느리다. 결과를 받기까지 공식적으로 2 주가 걸리지만, 이들 진단 테스트는 궁극적으로 4 주보다 더 오래 걸린다.
더욱이 많은 불필요한 화학요법 사례가 있다(~46%): 매우 제한된 BCa 프로파일링 및 예후 테스트로 인해, 많은 BCa 환자가 불필요한 화학요법을 겪으며, BCa 환자의 46%에서는 화학요법이 필요하지 않다.
이들 및 추가 단점을 극복해야 한다. 따라서 본 발명은 이러한 요구 및 기술적 목적을 다루고 본원에 기재되고 청구범위에 정의된 바와 같은 해결책을 제공한다.
본 발명은 질환을 진단하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 하기 단계를 포함하고:
(a) 멀티플렉스 형광 계내 혼성화(FISH)에 의해 질환 관련 바이오마커의 mRNA 종 및/또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개, 또는 10 개 초과의 miRNA 종이 대상체로부터 수득한 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 단계; 및
(b) 멀티플렉스 서열분석에 의해, 단계(a)의 질환 관련 바이오마커의 상기 mRNA 종 및/또는 질환 관련 바이오마커의 상기 miRNA 종이 상기 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 단계,
바람직하게는, 여기서 질환 관련 바이오마커의 상기 mRNA 종 및/또는 적어도 하나의 miRNA 종이 존재하는 것으로 단계(a)에서 결정된 상기 샘플의 해당 부분은 단계(b)를 수행하기 전에 레이저 포획에 적용된다.
본 발명의 방법에 적용된 레이저 포획은 바람직하게는 레이저 포획 미세해부이다. 레이저 미세해부는 예를 들어, 샘플, 특히 육안 선택에 기초한 조직 절편 샘플에서 별개의 샘플을 단리시킨다. 육안 선택은 컴퓨터 및 소프트웨어 지원을 받을 수 있다. 육안 선택은 그 중에서도, 슬라이드 스캐닝, RNA 시각화, RNA 바이오마커 정량화, 스펙트럼 영상, 디믹싱(de-mixing), 멀티플렉스 시각화, 전체-슬라이드 스캐닝, 영상 분석을 포함한다. 레이저 포획 미세해부를 위한 수단 및 방법은 예를 들어 Arcturus 또는 Leica에 의해 제공된다(예를 들어, Hipp et al., J Path Inform 2018; 9, 45 참조).
바람직하게는, 형광 신호, 면역조직화학 신호 또는 헤마톡실린 및/또는 에오신으로부터의 신호와 같은 신호는 멀티플렉스 FISH가 수행될 때 현미경검사에 의해 검출될 수 있다. 이러한 현미경검사는 자동화, 컴퓨터 및/또는 소프트웨어 지원을 받을 수 있다.
본 발명자들은 레이저 포획이 본 발명의 방법에 의해 수득된 결과를 유의하게 개선시킴을 관찰하였다. 특히, 이들은 레이저 포획 미세해부가 이질적인 조직을 샘플링함으로써 도입된 편향을 줄이고 RNA FISH 및 RNA 서열분석 사이의 일치를 보장함을 관찰하였다(도 6 참조). 따라서, 본 발명의 방법의 맥락에서 멀티플렉스 RNA FISH를 수행한 후, 질환 관련 바이오마커의 mRNA 종 및/또는 적어도 하나의 miRNA 종이 RNA FISH에 의해 존재하는 것으로 결정된 샘플의 해당 부분(들)이 RNA의 멀티플렉스 서열분석을 수행하기 전에 레이저 포획, 특히 레이터 포획 미세해부에 적용되는 것이 바람직하다. 그로 인해, 하나 이상의 질환 관련 바이오마커에 대한 RNA FISH에서 신호를 나타내는 샘플의 해당 부분은 말하자면 농축되고 멀티플렉스 RNA 서열분석을 수행함으로써 잠재적인 확인 단계에 적용된다. 사실, 멀티플렉스 RNA FISH에 의해 검출된 RNA 및/또는 miRNA가 멀티플렉스 RNA 서열분석에 의해 (다시) 검출될 수 있는지 여부를 결정하여, 멀티플렉스 RNA FISH에 의해 수득된 결과를 확인한다. 이 2-단계 절차는 멀티플렉스 RNA FISH에 의해 검출된 RNA 및/또는 miRNA가 멀티플렉스 RNA 서열분석에 의해 (재)검출될 필요가 있기 때문에, 예를 들어, RNA FISH 및/또는 RNA 서열분석에 의해 수득된 거짓-양성 및/또는 거짓-음성 결과를 방지한다.
본 발명의 방법, 특히 레이저 포획 미세해부를 수행하는 맥락에서, 샘플, 특히 조직 절편 샘플을 유리 슬라이드, 바람직하게는 양으로 하전된 유리 슬라이드, 프레임 슬라이드, PET 막이 있는 프레임 슬라이드, 또는 막이 있는 유리 슬라이드 상에 배치하는 것 바람직하다.
레이저 포획 미세해부는 바람직하게는 첨부된 실시예에 기재된 바와 같이 수행된다.
본 발명의 방법에 사용된 바람직한 샘플은 조직 절편 샘플이다. 조직 절편 샘플은 포름알데히드 고정 급속 동결(FFFF) 또는 포름알데히드 고정(FF) 및/또는 파라핀 포매(PE), 바람직하게는 포름알데히드 고정 파라핀 포매(FFPE)일 수 있다. 포름알데히드 고정은 바람직하게는 물 중 포름알데히드의 37% 수용액인 포르말린에 의해 수행된다.
바람직하게는, 본 발명의 맥락에서 사용될 때 샘플은 바람직하게는 추가적으로 포름알데히드 고정된 파라핀 포매 샘플의 마이크로톰 절편화에 의해 수득된다. 이상적으로 및 바람직하게는, 마이크로톰 절편화에 의해 수득된 상기 샘플은 수득 후 25℃ 내지 0℃의 온도에서 배양된다. 실제로, 본 발명자들은 바람직하게는 수득 후 마이크로톰 절편화에 의해 수득된 샘플을, 이상적으로 즉시, 25℃ 내지 0℃, 예를 들어, 25℃, 24℃, 23℃, 22℃, 21℃, 20℃, 19℃, 18℃, 17℃, 16℃, 15℃, 14℃, 13℃, 12℃, 11℃, 10℃, 9℃, 8℃, 7℃, 6℃, 5℃, 4℃, 3℃, 2℃, 1℃, 또는 0℃, 보다 바람직하게는, 10℃, 9℃, 8℃, 7℃, 6℃, 5℃, 4℃, 3℃, 2℃, 1℃, 또는 0℃의 온도에서 배치하는 것이 유리함을 발견하였다. 바람직하게는, 이러한 온도에서 샘플을 배양하기 위해 빙수조가 사용될 수 있다. 마이크로톰 절편화는 바람직하게는 첨부된 실시예에 기재된 바와 같이 수행된다.
도 4에 제시된 바와 같이, 샘플, 바람직하게는 25℃ 내지 0℃의 온도에서 수득 후, 빙냉 수조에 의해 달성된 마이크로톰 절편화에 의해 바람직하게 수득된 바람직하게는 포름알데히드 고정 파라핀 포매된 조직 절편 샘플을 배치할 때, RNA, 특히 작은 RNA, 예를 들어, 샘플에 의해 포함된 세포에서 떨어진 miRNA의 확산을 방지하여, 고농도의 RNA, 특히, 작은 RNA를 보장한다. 실제로, 도 4는 기준선 대조군으로 제공되는 FFFF 조직 샘플을 나타낸다. 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같이 처리된 샘플은 25℃ 내지 0℃의 온도에서 마이크로톰 절편화를 통해 수득된 후 배치된 반면, 선행 기술의 교시에 따라 제조된 샘플은 이러한 저온에서 배치되지 않았다. 사실, 선행 기술은 이러한 온도에서 마이크로톰 절편화를 통해 수득된 샘플을 배치하는 것을 교시하지 않는다. 오히려, 선행 기술은 마이크로톰 절편화된 샘플을 평평하게 하기 위해 약 45℃ 내지 42℃의 온도에서 샘플을 즉시 배치하는 것을 교시한다.
파라핀 포매될 수 있는 샘플이 본 발명의 방법에 의해 진단되어야 하는 경우, 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같은 방법의 단계(a) 및/또는 단계(b)를 수행하기 전에 탈파라핀화된다. 탈파라핀화는 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같이, 특히 첨부된 실시예에서 달성된다.
본 발명은 다중 바이오마커(mRNA 및/또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개, 또는 10 개 초과의 상이한 miRNA 종)의 발현 수준을 평가하는 암(예를 들어, 유방암(BCa))을 포함하나 이에 제한되지 않는 여러 질환에 대한 신규 개인 맞춤형 진단 테스트를 제공한다. 이는 시각화 기술(FISH) 및 후속 다중-샘플 서열분석 기술을 특이성 및 감수성 수준이 높은 하나의 단일 테스트로 조합한다. 이는 분석 편향을 줄이고 단일 환자의 샘플에서 다중 RNA 바이오마커(예를 들어 BCa의 경우, 예를 들어, 9 내지 25 개의 바이오마커)를 동시에 평가한다. 본 발명의 방법은 2 가지 독립적인 정성적/정량적 기술을 조합하여, 바이오마커 분석을 교차 검증하고, 진단 오류를 제거하거나 또는 대폭 줄인다. 그 다음에 종양전문의가 개인 맞춤형의 효과적인 치료를 설계하는데 도움이 될 특이적인 개인 맞춤형 치료 및 요법 길이 뿐만 아니라 재발 확률이 제안될 수 있다. 본원에 기재되고 제공된 본 발명의 방법은 상이한 질환, 특히 암, 바람직하게는 임의의 고형 종양(예를 들어, 유방암) 및 임의의 암 단계에 적용될 수 있다.
본원에 정의된 바와 같이, 본원에 사용된 용어 "microRNA", "miRNA" 또는 "miR"은 상호교환가능하게 사용되며 전형적으로 효소 Dicer에 의해 프리-miRNA의 절단 생성물일 수 있는 18 내지 26 개 핵염기 길이의 비코딩 RNA를 포함한다. 성숙 miRNA의 예는 miRBase(http://microma.sanger.ac.uk/)와 같은 당업계에 알려진 miRNA 데이터베이스에서 발견된다.
본원에 사용되고 당업계에 알려진 바와 같이, 용어 "mRNA"는 "메신저 RNA"와 상호교환가능하게 사용되고 DNA에서 리보솜으로 유전 정보를 전달하는 RNA 분자를 의미하며, 이들은 유전자 발현의 단백질 산물에 대한 아미노산 서열을 명시한다. mRNA는 상이한 유전자에 대해 고유하며 예를 들어, 종양 조직과 같은 상이한 종류의 조직에서 특이적 발현 패턴을 나타낼 수 있다.
일반적으로, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산" 또는 "핵산 분자"는 동의어로 해석되어야 한다. 일반적으로, 핵산 분자는 그 중에서도 DNA 분자(cDNA, 상보적 DNA 포함), RNA 분자(예를 들어, miRNA, mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, siRNA, scRNA, snoRNA, 및 당업계에 알려진 다른 것들), LNA(잠금 핵산) 분자(예를 들어, Kaur et al., Biochem (2006), 45(23): 7347-7355 참조), 올리고뉴클레오티드 티오포스페이트, 치환된 리보-올리고뉴클레오티드 또는 PNA(펩티드 핵산) 분자를 포함할 수 있다. 또한, 용어 "핵산 분자"는 당업계에 알려진 DNA 또는 RNA 또는 이의 하이브리드 또는 이의 임의의 변형을 지칭할 수 있다(예를 들어, 변형의 예에 대해 US 5525711, US 471 1955, US 5792608 또는 EP 302175 참조). 폴리뉴클레오티드 서열은 단일 또는 이중 가닥, 선형 또는 원형, 천연 또는 합성일 수 있으며 임의의 크기 제한이 없다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열은 게놈 DNA, cDNA, 미토콘드리아 DNA, mRNA, 안티센스 RNA, 리보솜 RNA 또는 이러한 RNA 또는 키메로플라스트(chimeroplast)를 암호화하는 DNA일 수 있다(Gamper, Nucleic Acids Research, 2000, 28, 4332 - 4339). 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 벡터 형태, 플라스미드 형태 또는 바이러스 DNA 또는 RNA 형태일 수 있다. 또한 본원에는 상기 기재된 핵산 분자에 상보적인 핵산 분자 및 본원에 기재된 핵산 분자와 혼성화할 수 있는 핵산 분자가 기재된다. 본원에 기재된 핵산 분자는 또한 본 발명의 맥락에서 핵산 분자의 단편일 수 있다. 특히, 이러한 단편은 기능적 단편이다. 이러한 기능적 단편에 대한 예는 프라이머로서 역할을 할 수 있는 핵산 분자이다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산 분자는 자연 발생 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드, 및 인공 뉴클레오티드를 포함하는 상이한 유형의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 뉴클레오티드는 일반적으로 뉴클레오시드, 자연 발생 뉴클레오시드, 변형된 뉴클레오시드, 및 인공 뉴클레오시드를 포함한다. 당업계에 알려진 바와 같이, 자연 발생 뉴클레오시드는 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기를 포함한다. 자연 발생 뉴클레오시드에 대한 예는 (데옥시)아데노신, (데옥시)구아노신, (데옥시)우리딘, 티미딘, 및 (데옥시)시티딘을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드(및, 따라서, 핵산 분자)의 일부로서 뉴클레오시드는 일반적으로 임의의 퓨린 또는 피리미딘 뉴클레오시드 및 이의 유도체 및 유사체를 포함하는 구조를 포괄할 수 있다. 즉, 본 발명의 맥락에서 사용된 바와 같은 "퓨린 뉴클레오시드" 또는 "피리미딘 뉴클레오시드"는 일반적으로 임의의 종류의 퓨린 또는 피리미딘 뿐만 아니라 각각 본원에 기재된 바와 같은 이의 유도체 또는 유사체, 뿐만 아니라 당, 예를 들어, 5탄당을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 퓨린 뉴클레오시드는 (데옥시)아데노신, 이노신, 및 (데옥시)구아노신 및 이의 유도체 또는 유사체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 유도체는 예를 들어 데아자퓨린, 아지도퓨린, 알킬퓨린, 티오퓨린, 브로모퓨린, O-알킬퓨린, 및 이소퓨린, 예를 들어, 7-데아자퓨린과 같은 데아자퓨린으로 이루어진 군으로부터 선택된 퓨린을 갖는 뉴클레오시드일 수 있다. 즉, 본 발명의 일 측면에서, 퓨린 뉴클레오시드는 데아자퓨린, 아지도퓨린, 알킬퓨린, 티오퓨린, 브로모퓨린, O-알킬퓨린, 및 이소퓨린으로 이루어진 군으로부터 선택된 퓨린을 갖는 뉴클레오시드, 예를 들어, 7-데아자퓨린과 같은 데아자퓨린일 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 퓨린 뉴클레오시드는 1-메틸(데옥시)아데노신, 2-메틸-(데옥시)아데노신, N6-메틸(데옥시)아데노신, N6,N6-디메틸(데옥시)아데노신, 7-데아자(데옥시)아데노신, 7-데아자-8-아자(데옥시)아데노신, 7-데아자-7-브로모(데옥시)아데노신, 7-데아자-7-요오도(데옥시)아데노신, 8-아지도(데옥시)아데노신, 8-브로모(데옥시)아데노신, 8-요오도(데옥시)아데노신, 8-브로모-2'-데옥시(데옥시)아데노신, 2'-O-메틸아데노신, 이노신, 1-메틸이노신, 2'-O-메틸이노신, 1-메틸(데옥시)구아노신, 7-메틸(데옥시)구아노신, N2-메틸(데옥시)구아노신, N2,N2-디메틸-구아노신, 이소구아노신, 7-데아자(데옥시)구아노신, 7-데아자-8-아자(데옥시)구아노신, 7-데아자-7-브로모(데옥시)구아노신, 7-데아자-7-요오도(데옥시)구아노신, 6-티오(데옥시)구아노신, O6-메틸(데옥시)구아노신, 8-아지도(데옥시)구아노신, 8-브로모(데옥시)구아노신, 8-요오도(데옥시)구아노신, 2'-O-메틸구아노신, 8-아지도이노신, 7-아자이노신, 8-브로모이노신, 8-요오도이노신, 1-메틸이노신, 및 4-메틸이노신으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 추가 측면에서, 퓨린 뉴클레오시드는 큐오신, 아르케오신, 와이오신 및 N6-트레오닐카르바모일아데노신으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 일 측면에서, 피리미딘 뉴클레오시드는 (데옥시)시티딘, (데옥시)티미딘, (데옥시)리보티미딘, (데옥시)우리딘, 및 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 유도체는 예를 들어, 알킬피리미딘, 티오피리미딘, 브로모피리미딘, O-알킬피리미딘, 이소피리미딘, 아세틸피리미딘 하이드로피리미딘, 및 슈도피리미딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 피리미딘을 갖는 뉴클레오시드일 수 있다. 즉, 본 발명의 일 측면에서, 피리미딘 뉴클레오시드는 알킬피리미딘, 티오피리미딘, 브로모피리미딘, O-알킬피리미딘, 이소피리미딘, 아세틸피리미딘 하이드로피리미딘, 및 슈도피리미딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 피리미딘을 갖는 뉴클레오시드일 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 피리미딘 뉴클레오시드는 3-메틸-(데옥시)시티딘, N4-메틸(데옥시)시티딘, N4,N4-디메틸(데옥시)시티딘, 이소(데옥시)시티딘, 슈도(데옥시)시티딘, 슈도이소(데옥시)시티딘, 2-티오(데옥시)시티딘, N4-아세틸(데옥시)시티딘, 3-메틸(데옥시)우리딘, 슈도(데옥시)우리딘, 1-메틸-슈도(데옥시)우리딘, 5,6-디하이드로(데옥시)우리딘, 2-티오(데옥시)우리딘, 4-티오(데옥시)우리딘, 5-브로모데옥시(데옥시)우리딘, 2'-데옥시우리딘, 4-티오(데옥시)티미딘, 5,6-디하이드로(데옥시)티미딘, O4-메틸티미딘, 디플루오르톨루엔, 및 다른 핵염기 대용물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 언급된 바와 같이, 본원에 기재되고 제공된 바와 같은 뉴클레오시드는 일반적으로 본원에 기재된 바와 같은 퓨린 또는 피리미딘 또는 이의 유도체 또는 유사체 뿐만 아니라 예를 들어, 5탄당과 같은 당 모이어티를 포함한다. 일반적으로, 본원에 기재된 바와 같은 퓨린 또는 피리미딘 뉴클레오시드 또는 이의 유도체 또는 유사체의 일부로서 5탄당은 그 중에서도, 리보스, 데옥시리보스, 아라비노스, 또는 메틸리보스(2-O-메티리보스), 예를 들어, 리보스 또는 데옥시리보스일 수 있다. 즉, 뉴클레오시드는 예를 들어, (리보실)뉴클레오시드, 데스옥시(리보실)뉴클레오시드, 아라비노실뉴클레오시드 또는 (메틸리보실)뉴클레오시드, 예를 들어 (리보실)뉴클레오시드 또는 데옥시(리보실)뉴클레오시드일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 분자 용어의 접두사로서 용어 "데스옥시" 및 "데옥시"는 동의어로 사용되며 예를 들어, 리보스 또는 다른 것과 같은 주어진 5탄당에서 산소 원자 또는 하이드록실-기의 부재를 나타낸다.
본 발명의 맥락에서, 단계(a) 및 단계(b)에서 상기 질환 관련 바이오마커의 존재는 바람직하게는 상기 질환을 나타낸다.
본 발명의 추가 구현예에서, 본원에 기재되고 제공된 방법은 상기 질환 관련 바이오마커의 존재 또는 부재에 대한 질환의 진단을 허용한다.
일반적으로, 본 발명의 맥락에서, 본원에 기재되고 제공된 방법으로 진단될 질환은 FISH로 검출가능한 특이적 바이오마커의 존재와 연결되어 있고 서열분석될 수 있는 임의의 질환일 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 이러한 바이오마커는 핵산 분자, 바람직하게는 miRNA 또는 mRNA, 가장 바람직하게는 각각의 질환에 특이적인 mRNA 분자이다. 본 발명의 일 구현예에서, 질환은 암이다. 이 맥락에서, 암은 임의의 유형의 암일 수 있으며, 예를 들어 고형암이다. 구체적으로, 질환이 암인 경우, 예를 들어, 고형암(예를 들어, 소세포 폐암, 유방암, 결장직장암, 췌장암, 난소암, 피부암, 전립선암, 뇌 또는 신경계의 암, 두경부암, 고환암, 폐암, 간암, 신장암, 방광암, 위장관암, 골암, 내분비계의 암, 림프계의 암, 섬유육종, 신경배엽 종양, 중피종, 표피 암종, 또는 카포시(Kaposi) 육종), 및 혈액암(예를 들어, 백혈병)일 수 있다. 본 발명의 구체적 구현예에서, 질환은 유방암(BCa)이다.
본 발명에 따르면, 본원에 기재되고 제공된 방법에 의해 검출될 mRNA 종은 상승 또는 감소된 발생 또는 발현이 본원에 기재된 바와 같이 진단될 특정 질환에 특이적인 임의의 mRNA일 수 있다. 또한 이의 상승 또는 감소된 발생 또는 발현은 특이적 질환 조직, 예를 들어, 종양 조직(암의 경우)에 대해 전형적일 수 있다. 예를 들어, 유방암의 경우, 본 발명의 방법에 따라 검출될 전형적인 mRNA 종은 HER2(HER2, GRB7), 증식(Ki-67, STK15, 서비빈, 사이클린 B1, MYBL2), 에스트로겐(ER, PR, Bcl2, SCUBE2), 침습(스트로멜리신 3, 카텝신 L2), 및 다른 것들(GSTM1, BAG1, CD68)에 특이적인 것들을 포함하며, 여기서 HER2, ER 및 PR은 본 발명에 따른 가장 관련된 마커를 나타낸다. 본 발명의 방법에 따라 존재가 결정될 수 있는 추가의 mRNA 마커는 다음을 포함한다: HER2, ER, PR(가장 관련된 유방암 진단/예후 전사체), NUPR1(탁솔 내성에 대한 마커), 및 CSF1(삼중 음성 유방암 사례에서 침습에 대한 마커). 따라서, 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따라 존재가 결정될 수 있는 mRNA 종은 HER2, ER, PR, NUPR1, CSF1, GRB7, Ki-67, STK15, 서비빈, 사이클린 B1, MYBL2, ER, PR, Bcl2, SCUBE2, 스트로멜리신 3, 카텝신 L2, GSTM1, BAG1, 및 CD68로 이루어지며, 바람직하게는 HER2, ER, 및 PR을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 물론, 본 발명의 방법에서 질환 관련 바이오마커인 임의의 mRNA가 본원에 기재된 바와 같이 상승 또는 감소된 발생에 대해 검정될 수 있다.
본 발명에 따르면, 본원에 기재되고 제공된 방법에 의해 검출될 적어도 1, 2, 3 개 이상, 예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개, 또는 10 개 초과의 miRNA 종은 상승 또는 감소된 발생 또는 발현이 본원에 기재된 바와 같이 진단될 특정 질환에 특이적인 임의의 miRNA일 수 있다. 또한 이의 상승 또는 감소된 발생 또는 발현은 특이적 질환 조직, 예를 들어, 종양 조직(암의 경우)에 전형적일 수 있다. 예를 들어, 유방암의 경우, 본 발명의 방법에 따라 검출될 전형적인 miRNA 종은 miR-21, miR-29a, miR-221, 및 miR-375를 포함한다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명에 따라 존재가 결정될 수 있는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개, 또는 10 개 초과의 miRNA 종은 miR-21, miR-29a, miR-221, 및 miR-375로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 물론, 본 발명의 방법에서 질환 관련 바이오마커인 임의의 miRNA는 본원에 기재된 바와 같은 상승 또는 감소된 발생에 대해 검정될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 단계(a)는 멀티플렉스 FISH에 의해 질환 관련 바이오마커의 snRNA(작은 핵 RNA) 종 및/또는 scRNA(작은 조건부 RNA) 종이 상기 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 것을 추가로 포함한다. 본 발명에 따르면, 본원에 기재되고 제공된 방법에 의해 검출될 snRNA 또는 scRNA 종은 상승 또는 감소된 발생 또는 발현이 본원에 기재된 바와 같이 진단될 특정 질환에 특이적인 임의의 snRNA 또는 scRNA일 수 있다. 또한 이의 상승 또는 감소된 발생 또는 발현은 특이적 질환 조직, 예를 들어, 종양 조직(암의 경우)에 대해 전형적일 수 있다. 예를 들어, 유방암의 경우, 본 발명의 방법에 따라 검출될 전형적인 snRNA 또는 scRNA 종은 U2 snRNA 및 7SL scRNA(주요 유방암 하위유형에 대한 신규 바이오마커-쌍)를 포함한다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명에 따라 존재가 결정될 수 있는 snRNA 또는 scRNA 종은 U2 snRNA 및 7SL scRNA로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 물론, 본 발명의 방법에서 질환 관련 바이오마커인 임의의 snRNA 또는 scRNA가 본원에 기재된 바와 같이 상승 또는 감소된 발생에 대해 검정될 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 대조군 마커의 존재는 단계(a)에서 멀티플렉스 FISH에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 28S rRNA, poly(A) RNA, 베타-액틴, GAPDH, RPLPO, GUS, 및 TFRC로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 하나 이상의 RNA의 존재는 대조군으로서 FISH에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 추가 구현예에서, 단계(b)는 멀티플렉스 서열분석에 의해 질환 관련 바이오마커의 snRNA 및/또는 scRNA 종이 상기 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 것을 추가로 포함한다. 이 맥락에서 바람직한 구현예에서, 단계(b)는 또한 단계(a)가 멀티플렉스 FISH에 의해 질환 관련 바이오마커의 snRNA(작은 핵 RNA) 종 및/또는 scRNA(작은 조건부 RNA)가 상기 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 것을 추가로 포함하는 경우 멀티플렉스 서열분석에 의해 질환 관련 바이오마커의 snRNA 및/또는 scRNA 종이 상기 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 것을 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 본원에 기재되고 제공된 방법의 첫번째 단계에서, 멀티플렉스 형광 계내 혼성화(FISH)를 사용하여 질환 관련 바이오마커의 mRNA 종 및/또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개, 또는 10 개 초과의 miRNA가 대상체로부터 수득한 샘플에 존재하는지 여부를 결정한다. 본원에 사용된 바와 같이, "멀티플렉스 FISH"는 당업자에게 알려진 바와 같은 FISH 검정이며(예를 들어, Lee et al., RNA (2011), 17(6): 1076-1089 참조) 여기서 mRNA 및/또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개, 또는 10 개 초과의 상이한 miRNA 종의 존재가 결정된다. 본 발명의 일 구현예에서, 여러 mRNA, scRNA, snRNA, rRNA, 다른 RNA, 및/또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개, 또는 10 개 초과의 miRNA 종의 존재는 "멀티플렉스" FISH 검정에 의해 동시에 결정된다. 본 발명에 따르면, 상이한 RNA 종의 동시 FISH 측정은 상이한 RNA 종이 상이한 염료 라벨을 사용하여 검출될 수 있으므로 다색 FISH를 초래할 수 있다.
바람직하게는, 멀티플렉스 RNA FISH는 첨부된 실시예에 기재된 바와 같이 수행된다.
예를 들어, 특히 본 발명의 방법에 의해 진단될 질환이 유방암인 경우, 본 발명의 일 구현예에서, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개, 또는 10 개 초과의 mRNA(HER2, ER, PR)의 존재가 동시에 결정된다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, HER2, ER 및/또는 PR의 mRNA에 추가하여, (i) U2 snRNA 및/또는 7SL scRNA, (ii) 28SrRNA 및/또는 poly(A) RNA(대조군 및 악성 리포터로서), (iii) NUPR1(탁솔 내성 마커), 및/또는 (iv) CSF1(삼중 음성 유방암에서 침습에 대한 마커)의 존재는 멀티플렉스 FISH에 의해 동시에 결정된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 특히 본 발명의 방법에 의해 진단될 질환이 유방암인 경우, 최대 25 개 바이오마커의 존재가 멀티플렉스 FISH에 의해 동시에 결정된다: HER2(HER2, GRB7) 및/또는 에스트로겐(ER, PR, Bcl2, SCUBE2)과 관련된 mRNA, 뿐만 아니라 하기 클러스터 중 임의의 것과 관련된 하나 이상의 RNA: 증식(Ki-67, STK15, 서비빈, 사이클린 B1, MYBL2), 침습(스트로멜리신 3, 카텝신 L2), 참조(베타-액틴, GAPDH, RPLPO, GUS, TFRC), miRNA(miR-21, miR-29a, miR-221, 또는 miR-375 중 임의의 하나 중 적어도 3 개), 및/또는 다른 것들(GSTM1, BAG1, CD68).
일반적으로, 본 발명의 맥락에서, 본원에 기재되고 제공된 진단 방법은 생검 또는 수술 도중에 제거된 환자의 조직(예를 들어, BCa 조직과 같은 암 조직)으로부터 시작하여 수행된다. 조직은 먼저 여러(BCa에서 최대 9-25 개) 대표적인 바이오마커의 동시 시각화 및 정량화를 허용하는 멀티플렉스 FISH 검정에 의해 분석된다. 검정은 선택된 mRNA 또는 miRNA 표적은 인식하는 형광으로 표지된 핵산 프로브(예를 들어, MultiplexDX®에서 이용가능)를 기반으로 한다. FISH 프로브를 RNA에 혼성화하는 것은 통상의 형광 현미경검사에 의해 단일 세포 내의 바이오마커를 시각화한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명은 특이적 RNA 표적에 대한 2 개의 밀접한 이웃 프로브의 화학적 융합에 기초하여 FISH 프로브의 결합 친화성을 증가시킬 수 있다(도 2 참조). 따라서, RNA의 형광 계내 혼성화(FISH)에 사용되는 프로브는 클릭 화학(click chemistry)에 의해 접합될 수 있는 것이 바람직하다. 프로브의 클릭 화학 교차 결합은 바람직하게는 첨부된 실시예에 기재된 바와 같이 수행된다. 본 발명에 따르면, FISH 프로브의 특이성은 동시에 다중 바이오마커(다색 FISH)의 검출(멀티플렉스 FISH) 및 FISH 신호 강도로부터 유도된 정확한 바이오마커의 정량화를 허용한다.
당업자에게 알려진 바와 같이, FISH에서, 풍부한 RNA에 대한 임의의 비교적 안정된 잘못된 혼성화(mis-hybridization)는 특이성을 감소시키는 거짓-양성 신호를 초래할 것이다. FISH 검정에서 프로브 혼성화는 PCR 또는 RNAi에서 각각 프라이머 또는 siRNA의 혼성화와 직접적으로 비교될 수는 없지만, PCR 동안, 효소적 연쇄 반응을 시작하는 데 완벽한 결합이 필요한 프라이머의 끝은 프라이머-표적 듀플렉스 내의 임의의 불일치 또는 돌출에 대해 가장 민감하여 비정상적인 PCR 반응을 초래하는 것이 분명하다. 리보솜 RNA(rRNA)와 같은 풍부한 RNA에 대한 siRNA의 1% 잘못된 혼성화는 상관없지만, RNA FISH에서 풍부한 오프-표적(off-target) 전사체에 대한 이러한 잘못된 혼성화 수준은 주로 rRNA 신호에서 초래될 것이다(rRNA가 mRNA보다 적어도 1000-100,000 배 더 풍부하기 때문에, rRNA에 대한 1% 잘못된 혼성화는 표적 mRNA 신호보다 최대 1,000 배 더 높을 것이다). 따라서, 프로브 잘못된 혼성화는 큰 기술적 장벽으로 남아있다.
본원에 기재된 본 발명의 방법에서 이용될 프로브는 당업계에 알려진 바와 같이 FISH에 적용하기에 적합한 임의의 종류의 것일 수 있다. 바람직하게는, 프로브는 핵산 분자를 기반으로 한다. 본 발명의 일 구현예에서, 프로브는 LNA 분자이다. 프로브는 본 발명의 방법에 따라 존재가 결정된 RNA 분자에 따라 임의의 길이일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 구현예에서, 프로브는 최대 40 개 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 최대 35, 30 또는 20 개 뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 추가 구현예에서, 프로브는 적어도 7 개 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 적어도 8, 9 또는 10 개 뉴클레오티드이다.
FISH에서 RNA 검출을 위한 프로브는 당업계에 통상적으로 알려진 바와 같이 설계될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따르면, 다음 매개변수가 사전 설정된다: 1. 표적 서열(관심 RNA), 2. RNA FISH 프로토콜의 혼성화 온도, 및, 3. 표적 당 원하는 FISH 프로브 수. 그 다음에 DNA 합성기의 합성 프로그램에 후속적으로 삽입될 수 있는 서열 목록이 MultiplexDX®에 의해 제공된 프로그램 또는 다른 상업적으로 이용가능한 프로그램에 의해 생성될 수 있다. 예측된 혼성화 거동 및 가장 풍부한 RNA(예를 들어, rRNA, ncRNA, tRNA, mt-RNA, scRNA 등)에 대한 최소 교차-혼성화를 기반으로 하여, 프로브에 적절한 서열이 선택될 수 있다. 본 발명에 따르면, 최적의 프로브는 다음과 같은 특성을 충족할 수 있다: (a) 가장 풍부한 RNA의 교차-혼성화 최소화, 및 (b) 프로브 길이, 프로브의 정확한 위치, 및 프로브 당 LNA 함량을 변경시켜 LNA/DNA 프로브 용융 온도(TMs)/결합 친화성 동등화. 선택된 혼성화 조건에 기초하여, RNA FISH 프로브는 예를 들어, 프로브 당 ~3 내지 5 개의 LNA 변형을 갖는 11- 내지 15-nt 길이 잠금 핵산(LNA)-변형된 DNA 프로브(LNA/DNA)일 수 있다. TM 예측은 예를 들어, 주요 입력 매개변수로서 표적 유형(DNA 또는 RNA), 올리고 농도, 및 Na+ 농도를 취하여 DNA/DNA, DNA/RNA, 및 LNA/DNA 듀플렉스에 대한 IDT DNA 올리고 분석기에 의해 현재 사용되는 알고리즘을 기반으로 할 수 있다. 임의적으로, 이는 변성제로서 RNA FISH 프로토콜에 사용될 수 있는 50% 포름아미드에 대해 본 발명에 따라 변형될 수 있다.
본 발명의 방법의 맥락에서 이용될 때 멀티플렉스 FISH의 경우, 예를 들어 짧은 형광 다중-표지된 LNA/DNA 프로브(약 11-15 nt 길이, 프로브 당 약 4-8 개의 형광단, 표적 당 약 20-50 개의 프로브)가 임의의 RNA 표적(최대 5 kb)의 시각화에 사용될 수 있다. 프로브는 예를 들어, 자동화 Dr. Oligo 48(http://www.biolytic.com/t-dr-oligo-48-dna-rna-oligo-synthesizer.aspx 참조) 또는 Dr. Oligo 768(https://www.biolytic.com/t-dna-rna-oligo-synthesizer.aspx 참조) DNA/RNA 합성기 또는 당업계에 알려진 다른 수단으로 합성, 탈보호, 및 탈염될 수 있으며, 각각은 필요한 경우 여러 원하는 변형을 갖는다. 각각의 형광 다중-표지된 프로브(예를 들어, 약 11-15 nt)는 다중(4-8) 5-옥타디이닐-dU 또는 무염기성-알킨 또는 다른 적합한 염료를 함유하는 신장 세그먼트로 제조될 수 있으며, 각각 예를 들어, 5-nt 세그먼트 또는 C18 스페이서(GlenResearch)에 의해 분리된다. 본 발명에 따르면, 이는 아지드-표지된 형광단 또는 임의의 관심 형광단(예를 들어, ATTO-, Alexa-, Cy, BODIPY-, DyLight-, Cyto-, Seta-, RadiantDy- 및 CF-염료는 가장 밝고 가장 광- 및 수용성인 일부를 선택하며, 비특이적 단백질 결합을 피함)으로 가장 강력하고 선택적이고 효율적인 클릭 화학 표지화를 허용한다. 클릭 화학은 NHS-에스테르 화학과 비교할 때 이의 강력한 특이성 및 정량적 효율성으로 인해 본 발명에 따르면 프로브 당 5 개 이상의 형광단으로 프로브의 다중 표지화를 가능하게 하는 적합한 접근법이다. 클릭 화학 표지화와 NHS-에스테르 표지화를 비교하여, 형광단-아지드가 형광단-NHS 에스테르보다 33-50% 더 비싸더라도, 본 발명에 따르면 통상적으로 단지 1.2X 초과 아지드가 사용될 수 있지만, 예를 들어, 올리고를 사용한 표지화 반응에서 약 10X 초과 NHS-에스테르는 클릭 화학을 더 비용-효율적으로 만든다.
본 발명에 따르면, 본원에 기재되고 제공된 방법에 이용될 때 멀티플렉스 FISH는 예를 들어 다음과 같이 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 조직 세포는 본원에 기재된 바와 같은 바이오마커의 검출 전에 고정될 수 있다. 세포 및 조직 고정 및 후속 바이오마커 검출에 적합한 방법은 당업계에 알려져 있으며 또한 예를 들어, US 9359636, US 9005893 및 US 8394588에 기재되어 있다. 본 발명에 따르면, 2 개의 밀접한 이웃 프로브(약 15-nt 길이)의 계내 클릭 결찰에 의해, 더 안정된 30-nt 길이 이중-프로브가 형성된 다음(도 2 참조), 잘못된 혼성화를 표적화하는 엄격한 세척이 수행될 수 있으며, 이는 잘못 혼성화된 프로브를 완전히 세척 제거하고 모든 프로브의 특이적 결합을 완벽하게 보존하면서 배경을 제거할 것이다(도 2 참조). 이는 풍부하지 않은 RNA 표적의 특이적 RNA FISH 신호를 달성하게 한다.
상기 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 바와 같은 방법의 단계(a)를 수행하기 전에 샘플을 고정하는 것이 바람직하다. 고정은 바람직하게는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 또는 5-에틸티오-1H-테트라졸(ETT)로 처리하여 달성될 수 있다. 즉, 고정은 바람직하게는 특히 첨부된 실시예에서 본원에 기재된 바와 같이 수행된다.
본 발명의 맥락에서 기재된 바와 같은 클릭-표지화와 관련하여, 예를 들어, 하나의 프로브는 아지드(3'-아미노-변형된 LNA/DNA 올리고뉴클레오티드를 통해)로 표지될 수 있고, 또 다른 것은 올리고뉴클레오티드 합성에서 직접적으로 표지된 5'-단부 상의 알킨으로 태그될 수 있다(도 2 참조). 각 프로브는 바람직하게는 동일한 형광단으로 표지될 수 있다. 이러한 접근법은 도 2에 제시된 바와 같이 시험관 내에서 테스트되었다. 그 다음에, 클릭 화학은 실온에서 수행되어 프로브와 접합될 수 있다. 이는 형성된 이중-프로브의 결합 친화성을 상당히 증가시킨다. 이는 차례로 세척 온도를 이전 혼성화 온도보다 증가시킴으로써 15-nt 길이 프로브에서 나오는 잘못된 혼성화를 완전히 세척 제거하는 잘못된 혼성화를 표적화하는 엄격한 세척의 사용을 가능하게 할 수 있다(예를 들어, 혼성화 온도가 40℃이면, 엄격한 세척은 45-50℃일 수 있다). 접합 및 엄격한 세척 후 이중-프로브의 안정성 증가는 모든 프로브의 완벽하고 특이적인 결합을 보존할 수 있다. 본 발명에 따르면, 멀티플렉스 FISH 접근법은 다음과 같이 수행될 수 있다: 1. 40℃에서 15nt 길이 LNA/DNA 프로브를 사용하는 RNA FISH; 2. 실온에서 수행된 냉각 및 클릭-화학; 3. 45-50℃(이전 혼성화 온도보다 5-10℃ 초과)에서 엄격한 세척.
본원에 제시된 바와 같이, 본원에 기재되고 제공된 본 발명의 방법의 맥락에서 이용될 멀티플렉스 FISH는 본원에 기재된 바와 같은 여러 RNA 종의 존재를 동시에 결정하게 한다. 예를 들어, 본 발명에 따르면, 8-색 멀티플렉스 FISH는 다음과 같이 적용될 수 있다. 도 3은 부분적으로 중첩되는 스펙트럼으로 7 개 이상의 별개의 형광단을 동시에 검출할 수 있는 8-색 멀티플렉스 FISH를 도시한다. 이러한 RNA는 별개의 하위세포 국소화(U1, U2 snRNA: 핵, mt-RNA: 미토콘드리아, 7SL scRNA: 세포질, U3 snoRNA: 핵소체, rRNA: 핵소체, poly(A): 핵/세포질)로 풍부하기 때문에, 신호의 특이성은 시각적으로 결정될 수 있다(하나의 세포에 대한 특이적 신호를 나타내는 빨간색 사각형 참조, 도 3). 선형 불혼합과 함께 스펙트럼 영상을 사용하여, 전체 스펙트럼 내의 모든 개별 신호(모든 스펙트럼의 합)가 거의 동일해야 하는지 여부를 조사할 수 있으며, 현재 방법의 가장 관련된 한계 중 하나인 것으로 보인다. 다음 매개변수가 본 발명에 따라 선택될 수 있다 1. TM-동등화 특이적 프로브는 첨가 방식(4 개의 프로브의 신호 강도 = 4x 단일 프로브의 강도)으로 검출가능하며, 표적 당 프로브 수의 제어를 허용한다(너무 강하거나 또는 너무 약한 신호의 경우, 프로브 수는 각각 감소되거나 또는 증가될 수 있음). 2. 프로브 수의 증가가 가능하지 않는 경우, 양자 수율이 더 강한 염료가 사용될 수 있다; 3. 더 강한 형광단이 불충분한 경우, 프로브 당 형광단의 2 배수가 사용될 수 있다. 또한, 신호 증폭없이 직접적으로 표지된 LNA/DNA 프로브를 사용하여, 각 RNA 표적에 대한 신호 강도를 정확하게 정량화하게 한다(표 1 참조). 정규화된 상대적 RNA FISH 강도는 RNA 서열분석 데이터와 완전히 상관되며, 본 발명의 맥락에서 기재되고 제공된 방법의 정량화 가능성을 나타낸다.
표 1. RNA FISH로부터 유도된 ncRNA 작은 RNAseq 서열분석 계수 및 정규화된 강도의 비교. 판독 계수는 다양한 조직으로부터 >2000 작은 RNA cDNA 라이브러리를 사용하여 결정되었다. 모든 프로브는 동일한 ATTO-550 염료에 접합되었고 강도는 ~200 개 세포와 함께 동일한 창 크기를 사용하여 측정되었다. mRNA의 poly(A) 꼬리를 표적화하는 Poly(T) 프로브는 ATTO-647N에 접합되었고, 다른 프로브와 조합하여 사용되었으며 poly(A) 신호는 다음과 같은 강도를 정규화하기 위해 후속적으로 사용되었다: poly(A)에 대해 정규화된 상대적 형광 강도 = [측정된 강도/(프로브 세트 중 형광단의 수*노출 시간)]/[측정된 강도/(poly(A) 프로브 중 형관단의 수*노출 시간).
Figure pct00001
본 발명에 따르면, 신호 정량화는 마우스 뇌 피질 절편에서 마우스 28S rRNA를 표적화하는 8 개의 LNA/DNA 프로브 및 이들의 강도를 나타내는 표 2에 예시적으로 제시된 바와 같이 도달될 수 있다. 프로브는 혼성화 온도보다 적어도 10-20℃ 높은 유사한 TM에 의해 제시된 유사한 결합 친화성을 갖도록 설계되었다. 표 2는 모든 강도가 거의 동일함을 나타내며 또한 8 개 프로브를 모두 풀링하면 개별 프로브에 대한 것보다 8 배 더 높은 총 신호 강도가 산출됨을 입증한다. 함께 풀링된 8 개 프로브 모두의 형광 신호 강도(498472)는 높은 정확도를 보여주는 단일 프로브에서 나오는 모든 신호 강도(492126)의 합보다 단지 1.2% 더 높았다. 이러한 선형 증가는 프로브가 유사한 결합 친화성을 갖고 혼성화 동안 세척 제거되지 않는 경우(프로브의 TM이 혼성화 온도보다 적어도 10℃ 더 높을 때), 본 발명의 방법이 정확한 표적 정량화에 사용될 수 있음을 나타낸다.
표 2. 마우스 28S rRNA 프로브 서열. 8 개의 올리고뉴클레오티드 프로브는 RNA FISH를 사용하여 마우스 뇌 피질의 뉴런에서 마우스 28S rRNA를 검출하도록 설계하였으며; LNA 잔기는 소문자로 표시된다. 신호 강도는 각 프로브에 대해 개별적으로, 조합하여(rRNA1-8), 및 부재 하에(블랭크) 기록하였다. 각 프로브에 대한 신호 강도는 블랭크 대조군보다 약 100 배 더 높았다. 8 개의 프로브를 모두 풀링하여 개별 프로브보다 8x 더 높은 신호 강도가 산출되었으며, 이는 RNA FISH가 정확한 표적 정량화에 사용될 수 있음을 나타낸다(∑[rRNA1,..,rRNA8]=492126). 선택 프로브에 대한 용융 온도(TM)가 제시되어 있으며; TM은 50% 포름아미드, 1 M NaCl, 50 mM 포스페이트(pH 7.0)를 사용하여 측정되었다.　 모든 프로브(100 nM)는 50% FA 및 1 M NaCl을 함유하는 혼성화 완충액에서 16 시간 동안 55℃에서 혼성화되었다.　　N≥100 개 세포.
Figure pct00002
본원에 기재된 바와 같은 miR, mRNA, DNA, cDNA, LNA, 및 다른 것들, 또는 이의 일부 또는 단편을 포함한 핵산 분자/서열의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같은 용어 "혼성화" 또는 "혼성화하다"는 엄격한, 낮은 엄격한 또는 비엄격한 조건 하에 혼성화와 관련될 수 있다. 일 구현예에서, 조건은 바람직하게는 엄격하다. 상기 혼성화 조건은 예를 들어, Sambrook, Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001); Current Protocols in Molecular Biology, Update May 9, 2012, Print ISSN: 1934-3639, Online ISSN: 1934-3647; Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), 또는 Higgins and Hames (Eds.), " Nucleic acid hybridization, a practical approach", IRL Press Oxford, Washington DC, (1985)에 기재된 통상적인 프로토콜에 따라 달성될 수 있다. 조건의 설정은 당업자의 기술 내에 있으며 당업계에 기재된 프로토콜에 따라 결정될 수 있다. 따라서, 특이적으로 혼성화하는 서열만을 검출하는 것은 통상적으로 65℃에서 0.1 x SSC, 0.1% SDS(본원에 사용된 바와 같은 "엄격한 조건")와 같은 엄격한 혼성화 및 세척 조건이 필요할 것이다. 상동성이거나 또는 정확히 상보적이지 않은 서열의 검출을 위한 비엄격한 혼성화 조건은 65℃에서 6 x SSC, 1% SDS(본원에 사용된 바와 같은 "비엄격한 조건")로 설정될 수 있다. 잘 알려진 바와 같이, 프로브의 길이 및 결정될 핵산의 조성은 혼성화 조건의 추가 매개변수를 구성한다. 상기 조건의 변경은 혼성화 실험에서 배경을 억제하는데 사용되는 대체 차단 시약의 포함 및/또는 대체를 통해 달성될 수 있다. 전형적인 차단 시약은 덴하르트(Denhardt) 시약, BLOTTO, 헤파린, 변성된 연어 정자 DNA, 및 상업적으로 이용가능한 전용 제형을 포함한다. 특이적 차단 시약의 포함은 호환성 문제로 인해 상기 기재된 혼성화 조건의 변형이 필요할 수 있다. 본원에 기재된 본 발명에 따르면, 상동성이거나 또는 정확히 상보적이지 않은 서열의 검출을 위한 낮은 엄격한 혼성화 조건은 예를 들어, 65℃에서 6 x SSC, 0.5% SDS(본원에 사용된 바와 같은 "낮은 엄격한 조건")로 설정될 수 있다. 잘 알려진 바와 같이, 프로브의 길이 및 결정될 핵산의 조성은 혼성화 조건의 추가 매개변수를 구성한다.
핵산 분자를 혼성화하는 것은 또한 상기 기재된 분자의 단편을 포함한다. 이러한 단편은 본원에 기재된 바와 같은 억제제 또는 이의 기능적 단편으로서 역할을 하는 핵산 분자를 나타낼 수 있다. 또한, 상기 언급된 핵산 분자 중 임의의 것과 혼성화하는 핵산 분자는 또한 이들 분자의 상보적 단편, 유도체 및 변이체를 포함한다. 추가로, 혼성화 복합체는 상보적 G 및 C 염기 사이 및 상보적 A 및 T(또는 당업자에게 알려진 바와 같이 RNA의 경우 U) 염기 사이의 수소 결합 형성으로 인해 2 개의 핵산 서열(예를 들어, cDNA/LNA) 사이의 복합체를 지칭하며; 이들 수소 결합은 염기 쌓기 상호작용 염기에 의해 추가로 안정화될 수 있다. 2 개의 상보적 핵산 서열은 역평행 구성으로 수소 결합한다. 혼성화 복합체는 용액에서(예를 들어, Cot 또는 Rot 분석) 또는 용액에 존재하는 하나의 핵산 서열 및 고체 지지체(예를 들어 세포가 고정되어 있는, 예를 들어, 막, 필터, 칩, 핀, 또는 유리 슬라이드) 상에 고정화된 또 다른 핵산 서열 사이에 형성될 수 있다. 용어 "상보적" 또는 "상보성"은 염기-쌍에 의한 허용 염 및 온도 조건 하에 폴리뉴클레오티드의 천연 결합을 지칭한다. 예를 들어, 서열 "A-G-U"는 상보적 서열 "U-C-A"에 결합한다. 2 개의 단일 가닥 분자 사이의 상보성은 "부분적"일 수 있으며, 여기서 핵산의 일부만 결합하거나, 또는 단일 가닥 분자 사이에 전체 상보성이 존재할 때 완전할 수 있다. 핵산 가닥 사이의 상보성 정도는 핵산 가닥 사이의 혼성화의 효율 및 강도에 상당한 영향을 미친다. 이는 핵산 가닥 사이의 결합에 의존하는 증폭 반응에서 특히 중요하다.
본원에 기재된 바와 같이 RNA FISH를 수행하면서, RNA의 FISH를 수행한 후 샘플을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하는 것이 바람직하다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법의 맥락에서, 그 중에서도 28S rRNA 및 poly(A) RNA는 대조군으로서 FISH에 의해 결정된다. 이 대조군, 즉, 28S rRNA 및 poly(A) RNA는 poly(A) RNA 및 28S rRNA 사이의 비율이 샘플에서 RNA의 잠재적인 분해를 나타내기 때문에, 대조군으로서 특히 관심있는 것이다. 따라서, 상기 방법의 단계(a) 및/또는 단계(b)를 수행하기 전에, 상기 샘플을 poly(A)(m)RNA 및 28S rRNA 사이의 비율에 대해 확인하는 것이 바람직하다.
실제로, 본 발명자들은 멀티플렉스 RNA FISH 및/또는 멀티플렉스 RNA 서열분석을 수행하기 전에 본원에 기재된 바와 같은 샘플의 품질 관리가 도움이 될 수 있다는 것을 관찰하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 RNA 분해에 미치는 영향이 PolyA(m)RNA/28S rRNA의 비율에 의해 반영된다는 것을 밝혀내었다. 도 5에 도시된 바와 같이, PolyA(m) RNA/28S rRNA의 비율(형광 활성/단위)을 사용하여 샘플, 예를 들어, 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직 절편 샘플에서 RNA 분해를 평가하였으며, 1 미만의 비율은 분해된 RNA를 의미한다(아마도 이상적인 비율 1.15는 도 5에서 점선으로 표시됨).
따라서, 본 발명의 방법의 맥락에서 멀티플렉스 RNA FISH(본원에 언급된 단계(a)) 및/또는 멀티플렉스 RNA 서열분석(본원에서 언급된 단계(b))을 수행하기 전에, 본원에 기재된 바와 같은 샘플은 polyA(m)RNA 및 28S rRNA 사이의 비율이 1:1 또는 1 초과:1, 예를 들어 1.05:1, 1.1:1, 1.15:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 2:1 또는 3:1인지 확인하는 것이 바람직하다.
그러나, 대안적으로, 본 발명의 방법의 맥락에서 멀티플렉스 RNA FISH(본원에서 언급된 단계(a)) 및/또는 멀티플렉스 RNA 서열분석(본원에서 언급된 단계(b))을 수행하기 전에, 본원에 기재된 샘플은 polyA(m)RNA 및 28S rRNA 사이의 비율이 1:1 또는 1 미만:1, 예를 들어 1:1.05, 1:1.1, 1:1.15, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:2, 또는 1:3인지 확인하는 것이 바람직하다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명에 의해 제공된 방법에 따르면, 멀티플렉스 FISH 단계 후, 멀티플렉스 서열분석 단계가 이어진다(단계(b)). 따라서, FISH 단계 후, 단계(a) (멀티플렉스 FISH)의 결과를 확인하고/하거나 각각의 질환을 나타내는 추가 바이오마커의 존재를 결정하기 위해 서열분석 단계가 수행된다. 즉, 본 발명의 맥락에서, 동일한 바이오마커는 단계(a)에서 존재가 결정된 단계(b)에서 서열분석될 수 있거나, 또는 단계(a)의 것들 이외에 다른 또는 추가 바이오마커가 단계(b)에서 서열분석될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 동일한 바이오마커는 단계(a)에서 존재가 결정된 단계(b)에서 서열분석될 수 있다. 바이오마커의 서열분석은 당업계에 알려진 방법에 의해 본원에 기재되고 예시된 바와 같이 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따르면, FISH 검정 동안 단계(a)에서 조직이 염색된 후, 그리고 진단될 질환이 암(예를 들어, 유방암)인 경우, 종양은 예를 들어, 레이저 미세해부에 의해 정상 조직 및 면역 세포에서 선택적으로 단리될 수 있다. 그 다음에 암 세포의 상동 집단으로부터, 총 RNA를 추출하고 RNAseq(
Figure pct00003
et al., Sci Reports (2014), 4 (art. no. 5297), doi: 10.1038/srep05297 참조)에 적용하여 첫번째 분석의 정량화(단계(a)의 멀티플렉스 FISH에서 시각화)를 확인하고 동일하거나 또는 심지어 더 광범위한 특이적 바이오마커 패널의 존재 및 양을 입증할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법의 맥락에서, RNA의 멀티플렉스 서열분석이 수행될 때 샘플에서 RNA를 추출하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, RNA 추출은 첨부된 실시예에 기재된 바와 같이 수행된다. 기재된 바와 같은 상이한 RNA 마커의 서열분석은 당업계에 알려진 적합한 cDNA 라이브러리(서열분석을 위한 주형으로 사용된 RNA 집단으로부터 합성된 DNA)에 기초할 수 있다(예를 들어, https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/library-construction-kits에 기재된 바와 같은 예를 들어 Illumina TrueSeq cDNA 라이브러리, 또는 ClontechSMART cDNA 라이브러리). 서열분석은 일반적으로 당업계에 알려진 RNA 서열분석 방법에 의해 수행되고 예를 들어, Illumina TrueSeq cDNA 라이브러리 제조 프로토콜(https://support.illumina.com/content/dam/illumine-support/documents/documentation/chemistry_documentation/samplepreps_truseq/truseqrna/truseq-rna-sample-prep-v2-guide-15026495-f.pdf)에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 바람직하게는, RNA 서열분석은 첨부된 실시예에 기재된 바와 같이 수행된다.
상기 기재된 바와 같이, RNA의 멀티플렉스 서열분석의 맥락에서, cDNA 라이브러리가 제조될 수 있다. 따라서, cDNA 라이브러리의 제조를 위해 바코드를 포함하는 3'-어댑터 분자를 사용하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 바코드를 포함하는 이들 3'-어댑터 분자는 프리아데닐화된다. 또한 바코드를 포함하는 이들 3'-어댑터 분자가 수집물인 것이 바람직하다. 바람직하게는 프리아데닐화될 수 있는 바코드를 포함하는 이들 3'-어댑터 분자는 풀링되거나 또는 풀링되지 않으며, 풀링되는 것이 바람직하다. 보다 정확하게, 바람직하게는 프리아데닐화될 수 있는 바코드를 포함하는 이들 3'-어댑터 분자의 수집물은 바람직하게는 풀링되거나 또는 풀링되지 않을 수 있으며, 풀링된 수집물이 바람직하다. 이러한 수집물은 바코드를 포함하고 바람직하게는 프리아데닐화될 수 있는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 개, 또는 그 이상의 3'-어댑터 분자를 포함한다.
실제로, 아주 놀랍게도, 본 발명자들은 멀티플렉스 RNA 서열분석을 수행하는 맥락에서 cDNA 라이브러리의 제조를 위해 3'-어댑터 분자를 사용할 때 바코드를 포함하는 해당 3'-어댑터 분자가 RNA 서열분석에서 결찰 및 기술적 편향을 줄인다는 것을 관찰하였다. 사실, 본 발명과 대조적으로, 선행 기술에서 RNA 서열분석을 위한 cDNA 라이브러리의 제조는 바코드를 갖지 않는 3'-어댑터 분자를 사용하여 이루어질 수 있다. 선행 기술에서 수행된 cDNA 라이브러리 제조의 경우, 바코드는 cDNA 라이브러리의 제조 동안 오직 나중에 결찰된다.
도 7에 도시된 바와 같이, 바코드를 포함하는 3'-어댑터를 사용한 cDNA 라이브러리와 비교할 때 표준 3'-어댑터를 사용하여 생성된 cDNA 라이브러리(샘플 I-1 - I-3), 예를 들어, 풀링된 MDX 바코드처리된 프리아데닐화 3'-어댑터(MDX-4a-c) 풀링되지 않은 MDX 바코드처리된 프리아데닐화 3'-어댑터(MDX-7 - MDX-9)는 예상된 판독 계수(0에서 점선으로 나타냄)에 더 가까운 밀도 추정치에 의해 나타낸 바와 같은 결찰 편향을 줄이지 않는 반면, 바코드를 포함하고 바람직하게는 프리아데닐화될 수 있는 본 발명의 방법의 맥락에서 사용되는 3'-어댑터는 예상된 판독 계수(0에서 점선으로 나타냄)에 더 가까운 밀도 추정치에 의해 나타낸 바와 같은 결찰 편향을 줄인다. 따라서, 본 발명의 3' 어댑터는 멀티플렉스 RNA 서열분석을 수행할 때 cDNA 라이브러리의 제조에 유리하다. 이러한 이점은 예상되지 않을 수 있다.
본 발명은 본원에 기재되고 제공된 바와 같은 방법을 수행하기 위한 키트와 추가로 관련된다.
바람직하게는, 키트는 유리 슬라이드, 바람직하게는 양으로 하전된 유리 슬라이드, 프레임 슬라이드, PET 막이 있는 프레임 슬라이드, 또는 막이 있는 유리 슬라이드를 포함한다. 또한 키트가 포름알데히드 및/또는 파라핀을 추가로 포함하는 것이 바람직하다,
키트는 바람직하게는 또한 EDC 또는 ETT 및/또는 헤마톡실린 및/또는 에오신을 포함할 수 있다.
키트는 바람직하게는 또한 실리콘처리된 뉴클레아제 무함유 용기를 포함할 수 있다.
더욱이, 키트는 바람직하게는 RNA의 형광 계내 혼성화를 위한 프로브 및/또는 RNA로부터 cDNA를 제조하기 위한 바코드를 포함하는 3'-어댑터 분자를 추가로 포함한다. 키트에 포함될 수 있는 바코드를 포함하는 이들 3'-어댑터 분자는 바람직하게는 프리아데닐화된다.
바람직하게는 키트에 포함된 RNA FISH용 프로브는 바람직하게는 HER2, ER, PR, NUPR1, CSF1, GRB7, Ki-67, STK15, 서비빈, 사이클린 B1, MYBL2, ER, PR, Bcl2, SCUBE2, 스트로멜리신 3, 카텝신 L2, GSTM1, BAG1, 및 CD68에 특이적일 수 있다.
또한, 바람직하게는 키트에 추가로 포함된 RNA FISH용 프로브는 바람직하게는 miR-21, miR-29a, miR-221, 및 miR-375에 특이적일 수 있다.
유사하게, 바람직하게는 키트에 추가로 포함된 RNA FISH용 프로브는 바람직하게는 U2 snRNA 및/또는 7SL scRNA에 특이적일 수 있다.
바람직하게는, 대조군으로서, 키트는 또한 28S rRNA, poly(A) RNA, 베타-액틴, GAPDH, RPLPO, GUS, TFRC에 특이적인 프로브를 포함할 수 있다.
또한 키트에 포함될 수 있는 바코드를 포함하는 3'-어댑터 분자는 바코드를 포함하는 3'-어댑터 분자의 수집물인 것이 바람직하다. 바람직하게는, 키트에 포함된 바코드를 포함하는 3'-어댑터 분자는 풀링되거나 또는 풀링되지 않으며, 풀링되지 않는 것이 바람직하다.
본 발명은 이러한 키트의 용도와 추가로 관련된다.
본 발명을 특성화하는 구현예는 본원에 기재되고, 도면에 도시되고, 실시예에 예시되고, 청구범위에 반영된다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태가 달리 문맥상 분명하게 나타내지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "시약"에 대한 언급은 이러한 상이한 시약 중 하나 이상을 포함하고 "방법"에 대한 언급은 본원에 기재된 방법으로 변형되거나 또는 대체될 수 있는 당업자에게 알려진 동등한 단계 및 방법에 대한 언급을 포함한다.
달리 나타내지 않는 한, 일련의 요소 앞에 "적어도"라는 용어는 일련의 모든 요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 단지 일상적인 실험, 본원에 기재된 본 발명의 구체적 구현예에 대한 많은 등가물을 사용하여 인지하거나 또는 확인할 수 있다. 이러한 등가물은 본 발명에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
본원의 어디서든 사용되는 용어 "및/또는"은 "및", "또는" 및 "상기 용어에 의해 연결된 요소의 모든 또는 임의의 다른 조합"의 의미를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "약" 또는 "대략적으로"는 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 바람직하게는 10% 이내, 보다 바람직하게는 5% 이내, 가장 바람직하게는 3% 이내를 의미한다.
본 명세서 및 뒤따르는 청구범위 전반에 걸쳐, 달리 문맥상 요구되지 않는 한, 단어 "포함하다", 및 "포함한다" 및 "포함하는"과 같은 변형은 명시된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 제외하지 않음을 암시하는 것으로 이해될 것이다. 본원에 사용될 때 용어 "포함하는"은 용어 "함유하는" 또는 "포함한"으로 대체될 수 있거나 때때로 본원에서 사용될 때 용어 "갖는"으로 대체된다.
본원에 사용될 때 "로 이루어진"은 청구범위 요소에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계, 또는 성분을 제외한다. 본원에 사용될 때, "로 본질적으로 이루어진"은 청구범위의 기본 및 신규 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 물질 또는 단계를 제외하지 않는다.
달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원의 각 경우에 용어 "포함하는, "로 본질적으로 이루어진" 및 "로 이루어진" 중 임의의 것은 다른 두 용어 중 어느 하나로 대체될 수 있다. 예를 들어, 주어진 특성, 화합물 또는 범위가 각각의 더 넒은 용어"에 의해 포함되는" 것으로 나타낸 경우, 이러한 더 넓은 용어는 또한 이러한 특성, 화합물 또는 범위"로 이루어질 수" 있다.
본 발명은 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜, 및 시약 등으로 제한되지 않으며 그 자체로 달라질 수 있음이 이해되어야 한다. 본원에 사용되는 방법론은 특정 구현예를 설명하려는 목적으로만 사용되며 청구범위에 의해서만 정의되는 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
본 명세서의 텍스트 전반에 걸쳐 인용된 모든 간행물 및 특허(모든 특허, 특허 출원, 과학 간행물, 제조업체의 사양, 지침 등 포함)는 상기든 하기든 전문이 본원에 참조로 포함된다. 본원의 어떤 것도 본 발명이 선행 발명으로 인해 이러한 개시내용을 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 참조로 포함된 자료가 본 명세서와 모순되거나 또는 일치하지 않으면, 명세서는 임의의 이러한 자료를 대체할 것이다.
도면은 다음을 도시한다.
도 1 RNA FISH 및 더 짧은 DNA 프로브를 사용하여 FFPE 유방암 세포주 구별. ATTO-550에 접합된 45 개 DNA(24 내지 30-nt), 39 개 DNA(14 내지 21-nt) 또는 53 개(11 내지 15-nt) LNA/DNA 프로브를 사용하여 HER2 양성(HCC-1954) 및 HER2-음성(MDA-MB231) 유방암 세포주를 구별하고, 염색하고 동시에 시각화하였다. 5 개의 rRNA 프로브를 ATTO-488에 접합시켰다.　 프로브를 40℃에서 25% 포름아미드 및 1M NaCl을 사용하여 혼성화하였다. HCC-1954 세포주는 DNA 프로브의 rRNA 잘못된 혼성화로 인해 MDA-MB231과 구별되지 않을 수 있었다. 그러나, LNA/DNA 프로브는 최종적으로 HER2+ 및 HER2- 세포 사이를 구별하며, 이는 이들 프로브가 특이적임을 나타난다. rRNA 및 HER2에 대한 노출 시간은 각각 80 ms 및 200 ms였다. 스케일 바, 50 μm.
도 2 계내 클릭 표지화. 예시적인 설정. 2 개의 짧은 형광단-표지된 이웃 프로브는 아지드 및 알킨으로 태그되고 클릭 화학에 의해 함께 융합한다. 엄격한 세척 후, 잘못 혼성화된 프로브가 제거된다. TM을 각각의 약 15-nt 길이 LNA/DNA 프로브(RNA가 있는 듀플렉스에서)에 대해 측정하였다. 두 TMs는 50% 포름아미드/1M NaCl을 함유하는 포스페이트 완충액에서 ~50℃로 유사하였다.
도 3 6 개의 ncRNA, poly(A) RNA 및 DAPI 핵 DNA 염색의 RNA FISH. HCC-1954 세포주를 사용하여 RNA FISH를 수행하였다. 본 발명자들은 ATTO-488, ATTO-532, ATTO-Rho12, ATTO-Rho 14, ATTO-647N, ATTO-680 및 ATTO-550에 접합된 poly(A)를 표적화하는 각각 U2 snRNA, 7SL 작은 세포질(sc)RNA, U1 snRNA, mt-RNA, rRNA, U3 snoRNA 및 poly(T)를 프로브를 표적화하는 12 내지 17nt 길이 LNA-변형된 DNA 프로브를 사용하였다. Vectra Intelligent Slide Analysis System(PerkinElmer)를 사용하여 세포를 스캔하였다.
도 4 샘플 처리의 전통적인(선행 기술) 방법과 비교한 샘플 처리의 MultiplexDX(MDX) 방법. 본 발명의 방법은 작은 RNA(예를 들어, microRNA)가 세포 밖으로 확산되는 것을 방지하여, 고농도의 작은 RNA를 보장한다. 즉시(0 초, 기준선 대조군) 처리된 포르말린 고정 급속 동결(FFFF) 조직 또는 5, 60, 180, 및 600 초(s) 후 처리된 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직으로부터 마이크로톰을 사용하여 마우스 뇌 조직 절편(10 μm)을 수득하였다. MDX 파라핀 리본만 빙냉 수조에 잠시 배치한 다음, 42℃ 수조에 배치한 후 5 초(MDX 방법, 음영처리된 상자에 동봉된 데이터 점) 또는 60, 180, 및 600 초(다른 방법) 후 유리 슬라이드 상에 배치하였다. 전통적인(선행 기술) 방법에 의해 처리된 파라핀 리본은 마이크로톰 절편화로부터 수득된 후 빙냉 수조에 배치되지 않았다는 점에 유의한다. 조직을 탈파라핀화하고 건조시킨 다음, Ambion® PureLink® miRNA 단리 키트를 사용하여 microRNA를 추출하였고 microRNA의 농도를 NanoDrop을 사용하여 측정하였다.
도 5 RNA 분해 효과. 실온(25℃) 또는 고온(37℃)에서 0, 1, 3, 6, 및 12 시간 동안 토끼 간 조직을 배양한 후 PolyA mRNA/28S rRNA의 비율(a) 및 PolyA mRNA 발현의 평균 형광 강도(b)에 미치는 RNA 분해 효과. a, PolyA mRNA/28S rRNA의 비율(형광활성/단위)을 사용하여 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직에서 RNA 분해를 평가할 수 있으며, 1 미만의 비율은 분해된 RNA를 의미한다(아마도 이상적인 비율 1.15는 점선으로 표시됨). b, 시점에 걸쳐 형광 강도의 감소를 나타내는 PolyA mRNA 발현의 공초점 현미경 사진.
도 6 레이저 포획 미세해부(LMD)는 이질적인 조직을 샘플링함으로써 도입된 편향을 줄이고 RNA 형광 계내 혼성화(FISH, a) 및 RNA 서열분석(b) 사이의 일치를 보장한다. a, RNA FISH는 환자 A(좌측 패널)의 유방암 생검 조직에서 Her2 증폭을 나타내지만, 환자 B(우측 패널)에서는 나타나지 않는다. b, Her2+ 세포 집단(대략적으로 100 개의 세포가 정사각형 삽입에 나타남)의 레이저 포획 미세해부 이어서 RNA 서열분석은 RNA FISH에 의해 평가된 Her2 발현과 높은 일치는 나타낸다. c, 전체 조직 샘플링 이어서 RNA 서열분석은 이질적인 세포 집단으로부터의 샘플링으로 인해 RNA FISH와 낮은 일치를 입증한다. 이는 환자 A의 Her2 상태의 부정확한 진단 및 결과적으로 부적절하거나 또는 비효과적인 치료로 이어질 수 있다.
도 7 바코드처리된 프리아데닐화된 3'-어댑터는 작은 RNA 서열분석에서 결찰(a) 및 기술적(b) 편향을 줄인다. a, 962 개의 고유한 microRNA 서열의 등몰 풀을 함유하는 miRXplore Universal Reference를 사용하여 제조된 작은 RNA 서열분석 라이브러리의 밀도 추정치를 예시하는 바이올린(Violin) 플롯. 표준 경쟁자-I 3'-어댑터(샘플 I-1 - I-3), 풀링된 MDX 바코드처리된 프리아데닐화된 3'-어댑터(MDX-4a-c) 또는 풀링되지 않은 MDX 바코드처리된 프리아데닐화된 3'-어댑터(MDX-7 - MDX-9)를 사용하여 라이브러리를 생성하였다. MDX 3'-어댑터는 경쟁자 I 3'-어댑터와 비교하여 예상된 판독 계수(0에서 점선으로 나타냄)에 더 가까운 밀도 추정치에 의해 제시된 바와 같이 결찰 편향을 줄인다. b, 상자 수염 플롯은 MDX 바코드처리된 프리아데닐화된 3'-어댑터의 풀링이 풀링되지 않은 MDX 바코드처리된 프리아데닐화된 3'-어댑터를 사용할 때 miR-21, miR-29a, miR-221, 및 miR-375에서 관찰된 기술적 편향을 줄인다는 것을 입증한다. 풀링된 MDX 바코드처리된 프리아데닐화된 3'-어댑터는 좌측에 제시되는 반면, 풀링되지 않은 MDX 바코드처리된 프리아데닐화된 3'-어댑터는 우측에 제시된다는 것에 유의한다.
하기 서열이 본원에 제공된다:
서열번호: 1
무스 무스쿨루스(Mus musculus)(mmu)
RNA
GGAAAAGAAACTAACCAGGA
서열번호: 2
무스 무스쿨루스(mmu)
RNA
ATCAGACCCCAGAAAAG
서열번호: 3
무스 무스쿨루스(mmu)
RNA
CTAAGGAGTGTGTAACAACT
서열번호: 4
무스 무스쿨루스(mmu)
RNA
CTGAAAATGGATGGCGCTG
서열번호: 5
무스 무스쿨루스(mmu)
RNA
CGGAACGGGACGGGA
서열번호: 6
무스 무스쿨루스(mmu)
RNA
AGTCGGTCCTGAGAGATG
서열번호: 7
무스 무스쿨루스(mmu)
RNA
GGAGCAGAAGGGCAAA
서열번호: 8
무스 무스쿨루스(mmu)
RNA
TCAGTACGAGAGGAACC
서열번호: 9
인공
LNA
LNA 잔기는 소문자로 표시된다
TCcTGGtTAgTTtCTtTTCC
서열번호: 10
인공
LNA
LNA 잔기는 소문자로 표시된다
CtttTCtGggGTcTGaT
서열번호: 11
인공
LNA
LNA 잔기는 소문자로 표시된다
AGTtGTtACACAcTCcTtaG
서열번호: 12
인공
LNA
LNA 잔기는 소문자로 표시된다
CAGcGCcATcCAtTTtCAG
서열번호: 13
인공
LNA
LNA 잔기는 소문자로 표시된다
TCCcGTcCCgTTCCG
서열번호: 14
인공
LNA
LNA 잔기는 소문자로 표시된다
CATCTcTcAGGAcCgAcT
서열번호: 15
인공
LNA
LNA 잔기는 소문자로 표시된다
TtTGCCcTTCTGCtCc
서열번호: 16
인공
LNA
LNA 잔기는 소문자로 표시된다
GGTtCctCtCGtACTgA
본 발명은 또한 하기 항목을 특징으로 할 수 있다:
1. 질환을 진단하는 방법으로, 하기 단계를 포함하는 방법:
(a) 멀티플렉스 형광 계내 혼성화(FISH)에 의해 질환 관련 바이오마커의 mRNA 종 및/또는 적어도 3 개의 miRNA 종이 대상체로부터 수득한 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 단계; 및
(b) 멀티플렉스 서열분석에 의해 질환 관련 바이오마커의 상기 mRNA 종 및/또는 단계(a)의 질환 관련 바이오마커의 상기 miRNA 종이 상기 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 단계.
2. 항목 1에 있어서, 상기 단계(a)가 멀티플렉스 FISH에 의해 질환 관련 바이오마커의 snRNA 종 및/또는 scRNA 종이 상기 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
3. 항목 1 또는 2 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계(b)가 멀티플렉스 서열분석에 의해 질환 관련 바이오마커의 snRNA 및/또는 scRNA 종이 상기 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
4. 상기 항목 1 내지 3 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 단계(a) 및 단계(b)에서 상기 질환 관련 바이오마커의 존재가 상기 질환을 나타내는 것인, 방법.
5. 항목 1 내지 4 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 방법이 상기 질환 관련 바이오마커의 존재 또는 부재 하에 질환의 진단을 허용하는 것인, 방법.
6. 항목 1 내지 5 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 질환이 암인, 방법.
7. 항목 6에 있어서, 상기 암이 유방암인, 방법.
8. 항목 1 내지 7 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 mRNA가 HER2, ER, PR, NUPR1, CSF1, GRB7, Ki-67, STK15, 서비빈, 사이클린 B1, MYBL2, ER, PR, Bcl2, SCUBE2, 스트로멜리신 3, 카텝신 L2, GSTM1, BAG1, 및 CD68로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
9. 항목 1 내지 8 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 miRNA가 miR-21, miR-29a, miR-221, 및 miR-375로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
10. 항목 1 내지 9 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 snRNA가 U2 snRNA인, 방법.
11. 항목 1 내지 10 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 scRNA가 7SL scRNA인, 방법.
12. 항목 1 내지 11 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 28S rRNA, poly(A) RNA, 베타-액틴, GAPDH, RPLPO, GUS, TFRC로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 하나 이상의 RNA가 대조군으로서 FISH에 의해 결정되는, 방법.
13. 항목 1 내지 12 중 어느 한 항목의 방법을 수행하기 위한 키트.
14. 항목 1 내지 12 중 어느 한 항목의 방법을 수행하기 위한 항목 13의 키트의 용도.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되지만, 실시예 또는 실시예의 임의의 구체적 구현예에 의해 제한되지 않는다.
실시예
프로브 설계 테스트
RNA FISH 프로브 설계를 테스트하고 다른 상업적으로 이용가능한 설계와 비교하기 위해, 2 개의 유방암 세포주, HER2+(HCT1954) 및 HER2-(MDA-MB231)를 사용하였다. Stellaris 프로브 설계 프로그램(Biosearch Technologies)을 사용하여 ERBB2 mRNA 프로브를 제조하였다. 20-nt 길이 프로브 대신에, 24 내지 30-nt 길이 DNA 프로브를 설계하여 결합 친화성을 증가시키고, 프로브 길이를 변경시켜 TMs를 동등화하였다(생성된 TMs는 50% 포름아미드(FA), 1 M NaCl, 50 mM 포스페이트(pH 7.0)에서 48.1 내지 56.9℃로 달라짐). GC 함량은 Stellaris에 의해 제시된 바와 같이 50 내지 64%로 제한되었다. 후속 RNA FISH에서, rRNA 프로브를 또한 신호 특이성 및 RNA 함량에 대한 내부 대조군 및 표준으로 사용하였다. 후속적으로, DNA 프로브(24 내지 30-nt 길이)를 5'-단부 또는 3'-단부로부터 단축하여 rRNA 잘못된 혼성화(rRNA 서열 상보성이 있는 8 nt보다 긴 세그먼트 없음)를 방지하여 39 개의 더 짧은 DNA 프로브(14 내지 21-nt 길이)를 산출하였다. 이들 DNA 프로브의 용융 온도는 38.8에서 47.1℃까지 달라졌다. HER2+ 및 HER2- 유방암 세포 사이에 작은 차이가 관찰되었지만, rRNA 잘못된 혼성화가 여전히 우세하였다. 잘못된 혼성화를 방지하고 프로브 특이성을 증가시키기 위해, 53 개의 짧은(11- 내지 15-nt 길이) 직접적으로 표지된 LNA-변형된 DNA(LNA/DNA) 올리고뉴클레오티드 프로브를 본원에 기재된 바와 같은 RNA FISH 프로브 설계를 사용하여 가장 풍부한 RNA(rRNA, tRNA, snRNA, 미토콘드리아 rRNA 등)와 교차 혼성화하는 6-nt 이하의 서열 세그먼트가 있는 ERBB2 mRNA에 대해 합성하였다. 이들 LNA/DNA 프로브의 용융 온도는 44.2에서 52.1℃까지 달라졌다. 이들 LNA/DNA 프로브는 최종적으로 MDA-MB231(HER2-) 유방암 세포로부터 특이적이고 구별되는 HCC-1954(HER2+)인 것으로 나타났다(도 1 참조). 더욱이, 이들 두 HER2+ 및 HER2- 세포주의 mRNA FISH로부터 100 개 세포의 신호 강도 및 mRNA 심층 서열분석으로부터 ERRB2 전사체의 카피 수를 비교할 때, mRNA FISH와의 차이는 mRNA 서열분석과의 49-배 차이에 비해 51-배였다. 이는 매우 높은 특이성이 달성되었음을 나타낸다.
RNA FISH:
참고 1: 프로테이나제 K 투과화, 4% PFA 고정, 아세틸화 및 차단 내인성 비오틴 단계는 생략될 수 있다.
참고 2: FFFF(포름알데히드 고정 급속 동결) 조직이 사용되는 경우, 해동 및 공기 건조 후, 슬라이드를 1-메틸이미다졸 완충액(pH 8.0) 50 ml에서 2 분 동안 25℃에서 배양하고 EDC 고정을 즉시 시작하여 단계 14를 진행한다.
마이크로톰 절편화
1 파라핀 블록을 샘플을 포함하는 최적의 절단면으로 다듬었다.
2 5 μm 슬라이스로 절단하였고; 브러시를 사용하여 나이프 홀더 위에 절편을 끌어당겼다.
3 파라핀 리본 또는 절편(슬라이스)을 2번째 습식 브러시를 사용하여 빙냉 수조에 배치하였다(이는 팽창할 수 있고, 주름이 없어질 수 있음).
4 떠 있는 파라핀 절편을 유리 슬라이드를 사용하여 건져내고, 파라핀 리본을 팽창되어 주름이 없어질 때까지 42℃ 수조에 배치한 다음 파라핀 절편을 2번째 습식 브러시로 건져내어 절편을 배치하였다. 참고: 42℃보다 높은 온도의 수조를 사용하면, 파라핀 용융으로 인해 조직으로부터 특히 짧은 RNA의 확산을 야기할 수 있다.
5 절편을 유리 슬라이드가 완전히 건조되고 조직 및 유리 슬라이드 사이에 갇혀 있는 물이 증발될 때까지 적어도 1 시간 동안 실온에서 건조시켰다.
6 절편을 1 시간 동안 56℃에서 베이킹하였다.
탈파라핀화
7 슬라이드를 Histo-Clear II 50 ml에서 5 분 동안 25℃에서 2 회 배양하였다.
8 슬라이드를 100% 에탄올 50 ml에서 2 분 동안 25℃에서 배양하였다.
9 슬라이드를 100% 에탄올 50 ml에서 1 분 동안 25℃에서 1 회 배양하였다.
10 슬라이드를 70% 에탄올 50 ml에서 1 분 동안 25℃에서 배양하였다.
11 슬라이드를 50% 에탄올 50 ml에서 1 분 동안 25℃에서 배양하였다.
12 슬라이드를 Coplin 병에 넣고 흐르는 차가운 수돗물로 헹구었다.
EDC/5-ETT를 사용한 조직 고정
참고 3: EDC 고정은 긴 RNA(mRNA 및 rRNA)가 표적화될 때 생략될 수 있지만, 사용된 조직이 잘 보존되었고 높은 수준의 가수분해된 RNA를 함유하지 않는다는 것을 보장해야 한다.
참고 4: 5'-포스페이트를 함유하는 tRNA를 표적화하기 위해, EDC 고정이 유리할 것이다.
13 슬라이드를 1-메틸이미다졸 완충액(pH 8.0) 50 ml에서 2 분 동안 25℃에서 배양하였다. 이 단계는 잔여 1X TBS 완충액을 제거하는 것이었다.
14 새로운 EDC/5-ETT 용액을 사용 전에 제조하였다.
15 가습 챔버에서, 슬라이드를 슬라이드 랙에 위를 향하도록 배치하였다. 슬라이드를 기울이고 용액을 따라내어 1-메틸이미다졸 완충액(pH 8.0)을 제거하였다. 가습 챔버에서, 슬라이드를 슬라이드 랙에 위를 향하도록 배치하였다.
16 EDC/5-ETT 용액 500 μl를 각 슬라이드에 첨가하고 샘플을 밀봉된 가습 챔버에서 50℃에서 3 시간 동안 배양하였다.
고정 후 세척 단계
17 샘플을 1X TBS 50 ml로 3 분 동안 25℃에서 2 회 세척하였다.
프로브 및 RNA의 사전 혼성화 및 혼성화
18 슬라이드를 가습 챔버의 슬라이드 랙에 조직면이 위를 향하도록 배치한다.
19 신선하게 제조된 혼성화 완충액 500 μl를 소수성 장벽 내의 각 슬라이드에 첨가하였다. 조직을 완전히 덮었다. 슬라이드를 밀봉된 가습 챔버에서 1 시간 동안 25℃에서 배양하였다.
20 슬라이드를 기울이고 용액을 따라내어 혼성화 완충액을 제거하였다.
프로브 및 혼성화 준비
21 원하는 프로브를 선택하고 오븐을 TM보다 대략적으로 20℃ 낮은 적절한 혼성화 온도로 예열하였다.
22 프로브를 함유하는 혼성화 용액 500 μl를 각 슬라이드에 첨가하였다. mRNA 프로브의 농도: 4 nM, 풍부한 ncRNA: 10 nM, rRNA 프로브: 20 nM.
23 슬라이드를 밀봉된 가습 챔버에서 6 내지 16 시간 동안 혼성화 온도(37-50℃)에서 배양하였다.
혼성화 후 세척
24 샘플을 세척 완충액 1 50 ml가 채워진 유리 Coplin 병에서 5-10 분 동안 25℃에서 2 회 세척하였다. 참고: 혼성화 완충액(50% FA)이 사용되는 경우 세척 완충액 1(50% FA)을 사용하지만, 혼성화 완충액(25% FA)이 사용되는 경우 세척 완충액 1(25% FA)을 사용한다.
24 샘플을 세척 완충액 2 50 ml에서 5 분 동안 25℃에서 세척하였다.
26 샘플을 1X TBS-T 완충액 50 ml에서 3 분 동안 25℃에서 헹구었다.
계내 클릭 화학 교차 결합
27 에펜도르프 튜브에서(하나의 슬라이드에 대해), 20 mM CuSO4 63 μl 및 50 mM 리간드 THPTA 125 μl의 용액을 제조하였다. 튜브 내 구리의 최종 농도는0.25 mM이었고 튜브 내 리간드 1의 최종 농도는 1.25 mM(리간드 대 구리 비, 5:1)이었다.
28 100 mM 나트륨 아스코르베이트 250 μl를 첨가하였다. 튜브 내 나트륨 아스코르베이트의 최종 농도는 5 mM이었다.
29 튜브를 닫고 튜브를 여러 번 뒤집어 혼합하였다(더 많은 산소가 확산되는 것을 방지하기 위함).
30 새로 제조된 CuSO4/THPTA/나트륨 아스코르베이트 용액 400 μl를 각 슬라이드에 첨가하였다.
31 슬라이드를 밀봉된 가습 챔버에서 빛을 방지하면서 1 내지 2 시간 동안 실온에서 배양하였다.
32 샘플을 1X TBS-T 50 ml로 3 분 동안 25℃에서 2 회 세척하였다.
원하는 경우 엄격한 세척
32a 세척 완충액 1 ml를 각 슬라이드에 첨가하였다. 슬라이드를 밀봉된 가습 챔버에서 5-10 분 동안 40-50℃(또는 이전 혼성화 온도보다 0-10℃ 높은 온도)에서 배양하였다. 참고: 혼성화 완충액(50% FA)이 사용되는 경우 세척 완충액 1(50% FA)을 사용하지만, 혼성화 완충액(25% FA)이 사용되는 경우 세척 완충액 1(25% FA)을 사용한다.
32b 샘플을 세척 완충액 2 50 ml에서 5 분 동안 25℃에서 세척하였다.
32c 샘플을 1X TBS-T 완충액 50 ml에서 3 분 동안 25℃에서 헹구었다.
현미경검사용 슬라이드 장착
33 슬라이드를 가습 슬라이드 랙에서 위로 향하도록 수평으로 배치하고 DAPI 작동 용액 500 μl를 10 분 동안 25℃에서 각 슬라이드에 첨가하였다.
34 슬라이드를 1X TBS 50 ml에서 3 분 동안 25℃에서 2 회 세척하였다.
35 슬라이드를 가습 슬라이드 랙에서 위로 향하도록 수평으로 배치하고 장착 용액 2 방울을 조직 절편에 첨가하였다.
36 유리 커버 슬립을 조직 절편 위에 조심스럽게 배치하였다.
37 커버 슬립된 슬라이드를 10 분 동안 공기 건조시켰다.
38 커버 슬립된 슬라이드를 어두운 슬라이드 랙에서 저장하였다.
형광 슬라이드 영상
39 슬라이드 스캐닝, RNA 시각화, RNA 바이오마커 정량화, 스펙트럼 영상, 디믹싱, 멀티플렉스화 시각화, 전체-슬라이드 스캐닝, 영상 분석 등을 포함하여 Perkin Elmer Vectra 3.0 정량적 병리 영상 시스템의 사용을 위해 사용자 매뉴얼: https://www.perkinelmer.com/Content/LST_Software_Downloads/Vectra-User-Manual-3-0-3.pdf를 참조한다
레이저 포획 미세해부: 조직 미세해부 및 RNA 추출
40 RNA FISH에 의해 이전에 염색되고 시각화된 5-μm 조직 절편을 추가 병리학적 검토를 위해 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다.
41 관심 조직 부분(영역)을 현미경검사로 식별하고 RNA FISH 및 H&E 영상을 비교하고, 영상 소프트웨어로 원을 그린 다음, 이들 H&E 슬라이드를 Leica LMD7에 의해 레이저 미세해부하였다(https://www.leica-microsystems.com/applications/life-science/laser-microdissection/ 참조).
42 실리콘처리된 뉴클레아제 무함유 에펜도르프 튜브에서 RNA 추출 전에 5 내지 10 개의 5-μm 절편을 미세해부하였다.
43 조직 건조, RNA 손상 및 기술적 차이를 방지하기 위해 조직 미세해부와 같은 날에 일치하는 사례-대조군 표본에서 RNA 추출을 수행하였다.
44 TRIzol@ 시약 500 μl를 조직 조각을 함유하는 에펜도르프 튜브에 첨가하고, 조직을 위아래로 피펫팅하여 균질화하고, 조직을 5 분 동안 실온에서 배양하였다.
45 클로로포름 200 μl를 첨가하고, 15 초 동안 격렬하게 흔들고(볼텍싱), 샘플을 실온에서 3 분 동안 배양하였다.
46 샘플을 Sorvall fresco 원심분리기를 사용하여 4℃에서 10 분 동안 11,500 rpm(12,568 x g)에서 원심분리하였다.
47 상을 분리한 후, 탁한 중간상 또는 하부 유색 층을 건드리지 않고 RNA를 함유하는 투명한 상부 수성 상을 수집하였다. 수성 상의 pH는 산성(약 4)으로 설정하였다.
48 수성 상을 옮기고 각각 대략적으로 용해물 500 μl를 함유하는 2 개의 새로운 튜브에 나누었다.
49 빙냉 이소프로필 알코올 500 μl를 각 튜브에 첨가하고 얼음 상에서 30 분 동안 배양하고 샘플을 4℃에서 10 분 동안 11,500 rpm(12,568 x g)에서 원심분리하였다.
50 상청액을 제거하였다. 그 다음에 튜브를 동일한 방향으로 원심분리기에 다시 배치하고, 추가 10 초 동안 회전시켜 남아있는 액체를 수집하였다. 작은 펠릿의 경우, 펠릿을 세척할 필요가 없었다.
51 큰 펠릿의 경우, 빙냉 75% EtOH 용액 500 μl를 첨가하고, 펠릿을 건드리지 않고 튜브를 1 회 뒤집고, 4℃에서 10 분 동안 11,500 rpm(12,568 x g)에서 원심분리하여 액체를 수집하고, 액체를 제거하고, 다시 원심분리하여 나머지 액체를 제거하였다.
52 상청액을 완전히 제거하였다(즉, 2번째 10초 회전 사용). RNA 샘플을 Millipore 물 100 μl에 재용해하고 용량을 재조합하였다.
53 RNA를 Bioanalyzer(Agilent, 미국 코네티컷주 댄베리 소재)의 총 RNA 칩에서 정량화하였다.
RNA 서열분석:
54 미세해부된 조직(1-2 μg)으로부터 추출된 RNA의 RNA 서열분석을 Illumina TrueSeq cDNA 라이브러리 제조 프로토콜: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/samplepreps_truseq/truseqrna/truseq-rna-sample-prep-v2-guide-15026495-f.pdf을 사용하여 수행하였다.
SEQUENCE LISTING <110> MultiplexDX <120> Method for diagnosing diseases using multiplex fluorescence and sequencing <130> MUL16368PCT <150> EP 18198751.2 <151> 2018-10-05 <150> LU 100954 <151> 2018-10-05 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 ggaaaagaaa ctaaccagga 20 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 atcagacccc agaaaag 17 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 ctaaggagtg tgtaacaact 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 4 ctgaaaatgg atggcgctg 19 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 cggaacggga cggga 15 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 agtcggtcct gagagatg 18 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 ggagcagaag ggcaaa 16 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 8 tcagtacgag aggaacc 17 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> probe containing LNA <220> <221> misc_RNA <222> (3)..(3) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (7)..(7) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (10)..(10) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (13)..(13) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (16)..(16) <223> LNA residue <400> 9 tcctggttag tttcttttcc 20 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> artificial <220> <223> probe containing LNA <220> <221> misc_RNA <222> (2)..(4) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (7)..(7) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (9)..(10) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (13)..(13) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (16)..(16) <223> LNA residue <400> 10 cttttctggg gtctgat 17 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220> <223> probe containing LNA <220> <221> misc_RNA <222> (4)..(4) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (7)..(7) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (13)..(13) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (16)..(16) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (18)..(19) <223> LNA residue <400> 11 agttgttaca cactccttag 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> artificial <220> <223> probe containing LNA <220> <221> misc_RNA <222> (4)..(4) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (7)..(7) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (10)..(10) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (13)..(13) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (16)..(16) <223> LNA residue <400> 12 cagcgccatc cattttcag 19 <210> 13 <211> 15 <212> DNA <213> artificial <220> <223> probe containing LNA <220> <221> misc_RNA <222> (4)..(4) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (7)..(7) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (10)..(10) <223> LNA residue <400> 13 tcccgtcccg ttccg 15 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> artificial <220> <223> probe containing LNA <220> <221> misc_RNA <222> (6)..(6) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (8)..(8) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (13)..(13) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (15)..(15) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (17)..(17) <223> LNA residue <400> 14 catctctcag gaccgact 18 <210> 15 <211> 16 <212> DNA <213> artificial <220> <223> probe containing LNA <220> <221> misc_RNA <222> (2)..(2) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (7)..(7) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (14)..(14) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (16)..(16) <223> LNA residue <400> 15 tttgcccttc tgctcc 16 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> artificial <220> <223> probe containing LNA <220> <221> misc_RNA <222> (4)..(4) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (6)..(6) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (7)..(7) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (9)..(9) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (12)..(12) <223> LNA residue <220> <221> misc_RNA <222> (16)..(16) <223> LNA residue <400> 16 ggttcctctc gtactga 17

Claims (47)

  1. 질환을 진단하는 방법으로서,
    (a) 멀티플렉스 형광 계내 혼성화(FISH)에 의해 질환 관련 바이오마커의 mRNA 종 및/또는 적어도 하나의 miRNA 종이 대상체로부터 수득한 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 단계; 및
    (b) 멀티플렉스 서열분석에 의해, 단계(a)에서 질환 관련 바이오마커의 상기 mRNA 종 및/또는 질환 관련 바이오마커의 상기 miRNA 종이 상기 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 단계
    를 포함하되,
    여기서 질환 관련 바이오마커의 상기 mRNA 종 및/또는 적어도 하나의 miRNA 종이 존재하는 것으로 단계(a)에서 결정된 상기 샘플의 해당 부분은 단계(b)를 수행하기 전에 레이저 포획에 적용되는 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계(a)가 멀티플렉스 FISH에 의해 질환 관련 바이오마커의 snRNA 종 및/또는 scRNA 종이 상기 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계(b)가 멀티플렉스 서열분석에 의해 질환 관련 바이오마커의 snRNA 및/또는 scRNA 종이 상기 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계(a) 및 단계(b)에서 상기 질환 관련 바이오마커의 존재가 상기 질환을 나타내는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 질환 관련 바이오마커의 존재 또는 부재 하에 질환의 진단을 허용하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환이 암인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 암이 유방암인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mRNA가 HER2, ER, PR, NUPR1, CSF1, GRB7, Ki-67, STK15, 서비빈, 사이클린 B1, MYBL2, ER, PR, Bcl2, SCUBE2, 스트로멜리신 3, 카텝신 L2, GSTM1, BAG1, 및 CD68로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miRNA가 miR-21, miR-29a, miR-221, 및 miR-375로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 snRNA가 U2 snRNA인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 scRNA가 7SL scRNA인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 28S rRNA, poly(A) RNA, 베타-액틴, GAPDH, RPLPO, GUS, TFRC로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 하나 이상의 mRNA가 대조군으로서 FISH에 의해 결정되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레이저 포획이 레이저 포획 미세해부(microdissection)인, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 조직 절편 샘플인, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 포름알데히드 고정된 것(formaldehyde-fixed)인, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 파라핀 포매된 것(paraffin embedded)인, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 파라핀 포매 샘플의 마이크로톰 절편화(microtome sectioning)에 의해 수득되는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 마이크로톰 절편화에 의해 수득된 샘플이 수득 후 25℃ 내지 0℃의 온도에서 배양되는, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 파라핀 포매 샘플이 단계(a) 전에 탈파라핀화되는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 단계(a) 전에 고정되는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 샘플이 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 또는 5-에틸티오-1H-테트라졸(ETT)로 처리하여 고정되는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 멀티플렉스 FISH가 수행될 때 형광 신호가 현미경검사에 의해 검출되는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 클릭 화학(click chemistry)에 의해 접합된 RNA 프로브의 형광 계내 혼성화(FISH)를 위해 사용되는, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 RNA의 FISH가 수행된 후 헤마톡실린 및 에오신으로 염색되는, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA가 RNA의 멀티플렉스 서열분석이 수행될 때 상기 샘플로부터 추출되는, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법의 단계(a) 및/또는 단계(b)를 수행하기 전에, 상기 샘플이 polyA mRNA 및 28S rRNA 사이의 비율에 대해 확인되는, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법의 단계(a) 및/또는 단계(b)를 수행하기 전에, 상기 샘플이 polyA mRNA 및 28S rRNA 사이의 비율이 1:1 또는 1 초과:1, 바람직하게는 1.05:1, 1.1:1, 1.15:1, 1,2:1인지 확인되는, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA의 멀티플렉스 서열분석을 위해 cDNA 라이브러리가 바코드를 포함하는 3'어댑터 분자를 사용하여 제조되는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 바코드를 포함하는 3'-어댑터 분자가 프리아데닐화되는(preadenylated), 방법.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 바코드를 포함하는 3'-어댑터 분자가 수집물인, 방법.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바코드를 포함하는 3'-어댑터 분자가 풀링되는, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 키트.
  33. 제32항에 있어서, 유리 슬라이드, 바람직하게는 양으로 하전된 유리 슬라이드, 프레임 슬라이드, PET 막이 있는 프레임 슬라이드, 또는 막이 있는 유리 슬라이드를 포함하는, 키트.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 포름알데히드 및/또는 파라핀을 포함하는, 키트.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, RNA의 형광 계내 혼성화를 위한 프로브 및/또는 RNA로부터 cDNA 라이브러리를 제조하기 위한 바코드를 포함하는 3'-어댑터 분자를 포함하는, 키트.
  36. 제35항에 있어서, 상기 바코드를 포함하는 3'-어댑터 분자가 프리아데닐화된 것인, 키트.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 바코드를 포함하는 3'-어댑터 분자가 수집물인, 키트.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바코드를 포함하는 3'-어댑터 분자가 풀링되지 않은(unpooled), 키트.
  39. 제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, EDC 또는 ETT를 포함하는, 키트.
  40. 제32항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 헤마톡실린 및/또는 에오신을 포함하는, 키트.
  41. 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA의 FISH용 프로브가 HER2, ER, PR, NUPR1, CSF1, GRB7, Ki-67, STK15, 서비빈, 사이클린 B1, MYBL2, ER, PR, Bcl2, SCUBE2, 스트로멜리신 3, 카텝신 L2, GSTM1, BAG1, 및 CD68에 특이적인, 키트.
  42. 제35항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA의 FISH용 프로브가 miR-21, miR-29a, miR-221, 및 miR-375에 특이적인, 키트.
  43. 제35항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA의 FISH용 프로브가 U2 snRNA에 특이적인, 키트.
  44. 제35항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA의 FISH용 프로브가 7SL scRNA에 특이적인, 키트.
  45. 제35항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA의 FISH용 프로브가 대조군으로서 28S rRNA, poly(A) RNA, 베타-액틴, GAPDH, RPLPO, GUS, TFRC에 특이적인, 키트.
  46. 제32항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 실리콘처리된 뉴클레아제 무함유 용기(siliconized nuclease-free containers)를 포함하는, 키트.
  47. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 제32항 내지 제46항 중 어느 한 항의 키트의 용도.
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