KR20220035958A - 표적 분석에 관한 방법 및 조성물 - Google Patents

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시얌타누 차토라지
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Abstract

본 명세서에 기재된 기술은 표적 분자를 분석, 검출 및/또는 시각화하기 위한 방법, 시스템 및 조성물에 관한 것이다. 바코딩된 카세트를 포함하는 올리고뉴클레오티드 태그를 포함하는 조성물 및 시스템이 본 명세서에 기재되어 있다. 또한 표적 분자를 분석하기 위한 방법이 기재되어 있으며, 이 방법은 샘플을 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그와 접촉시키는 단계, 샘플을 적어도 2개의 판독 분자와 접촉시키는 단계, 및 판독 분자의 상대적인 공간적 순서를 검출하는 단계를 포함한다.

Description

표적 분석에 관한 방법 및 조성물
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 7월 30일에 출원된 미국 가출원 제62/880,216호에 대해 35 U.S.C. § 119(e)에 따른 이익을 주장하며, 상기 가출원의 내용은 그 전문이 본 명세서에 참조로 통합된다.
정부 지원
본 발명은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)이 수여한 기금 번호 GM123289 및 HG008525에 따른 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 형식으로 제출된 서열 목록을 포함하고, 그 전체가 본 명세서에 참조로 통합된다. 상기 ASCII 사본은 2020년 7월 27일에 생성되었고 002806-094580_SL.txt으로 명명되었으며 크기는 1,055바이트이다.
기술분야
본 명세서에 기재된 기술은 표적 분자를 분석, 검출, 및/또는 시각화하기 위한 방법, 시스템, 및 조성물에 관한 것이다.
세포 및 세포하 수준에서 표적의 시각화에는 일반적으로 검출 분자(예를 들어, 항체, 올리고, 합성 핵산 등)에 연결된 형광단을 사용한다. 형광 현미경의 스펙트럼 전체 한계로 인해, 4-5개의 표적만 동시에 시각화할 수 있다. 그러나, 일부 애플리케이션, 예를 들어, 5개 이상의 구성요소를 포함하는 복잡한 시스템 또는 염색체와 같은 큰 표적 분자에서는 5개 이상의 표적을 동시에 시각화해야 한다. 그에 따라, 많은 표적 또는 표적의 많은 영역을 동시에 검출할 수 있는 새로운 방법이 필요하다.
본 명세서에 기재된 기술은 종래 기술로 가능한 것에 비해 한 번에 더 많은 표적을 시각화할 수 있는 능력을 제공하는 표적 분자를 분석, 검출 및/또는 시각화하기 위한 방법, 시스템 및 조성물에 관한 것이다. 일예로, 형광 표지를 사용하여 표적 생체분자를 검출할 때, 본 방법은 4가지 색상을 사용하는 검출 프로브가 그룹 내 표적에 국재화되도록 하며, 여기서 프로브는 바코딩된 색상 시퀀스를 형성하는 그룹 내의 서로 다른 표적에 집결한다. 기존 기술로 4가지 색상을 사용하면 4가지 다른 표적만 감지할 수 있다. 단지 2-비트 바코드를 사용하여, 개시된 방법은 16개의 표적을 동시에 검출할 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, 표적 분자 분석은 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트(Oligopaint))를 포함하는, OligoCASSEQ 기술로 수행될 수 있다. 판독 분자는 특정 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)의 동일성(identity)를 검출하기 위해 비효소적으로 사용될 수 있다.
한 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 표적 분자를 분석하는 방법이 본 명세서에 기재되어 있으며, 이 방법은 (a) 상기 샘플을 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그와 접촉시키는 단계로서, 각각의 올리고뉴클레오티드 태그는, (i) 분석하고자 하는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 인식 도메인, 및 (ii) 적어도 하나의 카세트를 포함하는 적어도 하나의 스트리트를 포함하고, 각각의 카세트는, (1) 앵커 영역이 적어도 하나의 측면에 측접되어 있는(flanked), 적어도 1개의 뉴클레오티드를 포함하는 바코드 영역을 포함하며; 여기서 각각의 올리고뉴클레오티드 태그의 스트리트는 적어도, A. 상기 스트리트 내의 카세트의 공간적 순서가 상이하거나 또는 B. 상기 바코드 영역의 서열이 단계 (a)의 다른 올리고뉴클레오티드 태그의 바코드 영역과 상이하다는 점에서 단계 (a)의 다른 올리고뉴클레오티드 태그의 스트리트와 구분되는(unique), 단계; (b) 상기 샘플을 적어도 2개의 판독 분자와 접촉시키는 단계로서, 각각의 판독 분자는, (i) 단계 (a)에서 사용된 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그의 카세트와 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드; 및 (ii) 검출 분자,를 포함하며; 여기서 상기 적어도 2개의 판독 분자는 집합적으로 적어도 2개의 구별가능한 검출 분자를 포함하는, 단계; 및 (c) 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그에 혼성화된 상기 검출 분자의 상대적 공간 순서를 검출하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그는 상기 적어도 하나의 표적 분자에 혼성화되고, 그로 인해 상기 검출 분자의 상대적 공간 순서는 어떤 올리고뉴클레오티드 태그가 해당 위치에서 상기 표적 분자에 혼성화되는지에 대한 식별을 가능하게 하는, 단계를 포함한다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 바코드 영역은 1-10개의 뉴클레오티드를 포함한다.
임의의 양상의 일부 실시형태에서, 스트리트는 적어도 3개의 카세트를 포함한다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 바코드 영역은 앵커 영역에 의해 각각의 측면에 측접된다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 모든 올리고뉴클레오티드 태그의 앵커 영역은 일정하다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 카세트에 대한 판독 분자의 특이적 혼성화는 바코드 영역의 정체에 의해 결정된다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 검출 분자는 형광단이다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 검출은 형광 현미경으로 수행된다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 검출 분자는 비오틴, 아민, 금속, 앵커 분자, 또는 아크리다이트를 포함한다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 검출은 적어도 단일 세포 해상도로 수행된다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 단계 (b)는 샘플을 적어도 4개의 판독 분자와 접촉시키는 단계를 포함한다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 단계 (b)는 샘플을 적어도 3개의 구별가능한 검출 분자를 집합적으로 포함하는 판독 분자의 그룹과 접촉시키는 단계를 포함한다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 단계 (b)는 샘플을 적어도 4개의 구별가능한 검출 분자를 집합적으로 포함하는 판독 분자의 그룹과 접촉시키는 단계를 포함한다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 적어도 2개의 표적 분자가 동시에 분석된다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 적어도 3개의 표적 분자가 동시에 분석된다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 적어도 10개의 표적 분자가 동시에 분석된다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 적어도 20개의 표적 분자가 동시에 분석된다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 표적 분자는 핵산, 폴리펩티드, 세포 표면 분자, 또는 무기 물질이다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 표적 분자는 DNA 또는 mRNA이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 샘플은 세포, 세포 배양물, 또는 조직 샘플이다.
본 명세서에 기재된 또 다른 양태는 샘플에서 적어도 하나의 표적 분자를 분석하기 위한 시스템이며, 상기 시스템은, (a) 적어도 2개의 검출가능한 분자를 검출할 수 있는 검출기; (b) 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그로서, 각각의 올리고뉴클레오티드 태그는, (i) 분석하고자 하는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 인식 도메인, 및 (ii) 적어도 하나의 카세트를 포함하는 스트리트로서, 각각의 카세트는, (1) 앵커 영역이 적어도 하나의 측면에 측접되어 있는, 적어도 1개의 뉴클레오티드를 포함하는 바코드 영역을 포함하는, 스트리트를 포함하고; 각각의 올리고뉴클레오티드 태그의 스트리트는 적어도, A. 스트리트 내의 카세트의 공간적 순서가 상이하거나 또는 B. 바코드 영역의 서열이 (b)의 다른 올리고뉴클레오티드 태그의 바코드 영역과 상이하다는 점에서 (b)의 다른 올리고뉴클레오티드 태그의 스트리트와 구분되는 것인, 올리고뉴클레오티드 태그; 및 (c) 적어도 2개의 판독 분자로서, 각각의 판독 분자는 (i) (b)에서 사용된 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그의 카세트와 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드; 및 (ii) 검출 분자를 포함하고; 여기서 상기 적어도 2개의 판독 분자는 집합적으로 적어도 2개의 구별가능한 검출 분자를 포함하는 것인, 판독 분자;를 포함하고, 샘플은 상기 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그 및 적어도 2개의 판독 분자와 접촉되고, 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그에 혼성화된 검출 분자의 상대적 공간 순서가 검출되고, 여기서 상기 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그는 적어도 하나의 표적 분자에 혼성화되어, 그로 인해 검출 분자의 상대적인 공간적 순서가 어떤 올리고뉴클레오티드 태그가 해당 위치에서 상기 표적 분자에 혼성화되는지에 대한 식별을 허용한다.
도 1a-도 1h는 OligoCASSEQ로 다중화된 게놈 추적을 보여주는 일련의 이미지 및 개략도이다. 도 1a는 OligoCASSEQ에 대한 변형된 올리고페인트를 보여주는 개략도이다. 게놈 상동성 영역은 게놈 DNA에 혼성화되고 비-게놈 상동성 영역인 메인스트리트(MainStreet) 및 백스트리트(BackStreet)가 측면에 측접되어 있다. 스트리트는 올리고페인트 라이브러리의 증폭을 허용하는 범용 프라이밍 영역을 포함한다. 스트리트는 또한 다중화에 사용되는 시퀀싱 카세트(예를 들어, 카세트 1, 카세트 2, 카세트 3, 카세트 4)를 포함한다. 이 도면에는 4개의 카세트가 도시되어 있지만, 총 카세트 수에는 제한이 없다.
도 1b는 도 1a의 시퀀싱 카세트를 나타내는 개략도이다. 바코드 영역은 가변 영역(X)을 포함한다. 각 비트(X)는 4개의 뉴클레오티드(예를 들어, A, C, T, 또는 G) 중 하나로 코딩될 수 있다. 이 도면에는 5개의 뉴클레오티드(nt) 바코드가 표시되어 있지만, 바코드 길이는 다를 수 있다. 바코드 길이를 늘리면 멀티플렉싱이 증가한다. 바코드는 특정 판독 올리고에 의해 검사된다(예를 들어, 도 1c 참조). 각각의 프로브는, 다중화를 가능하게 하는, 서로 다른 바코드를 포함한다. 바코드 영역의 각 측면에는 모든 프로브 사이에 일정한 앵커 영역(예를 들어, 이 도면에는 5nt가 나타나 있지만 바코드 영역 길이는 다를 수 있음)이 있다. 앵커 영역은 안정적인 혼성화를 제공하고 바코드가 구별되도록 할 수 있다.
도 1c는 카세트 내의 2개 위치에 대한 예시적인 판독 올리고를 보여주는 개략도이다. 판독 올리고의 각 풀은 특정 바코드 위치를 검사하는 데 사용된다. 특정 위치에 있는 고유 염기(예를 들어, A, C, G, 및 T)에 특이적으로 결합된 형광-표지된(Fluor-labeled) 판독 올리고 염기쌍은 비-조사 염기("N")에 뉴클레오티드 혼합물을 포함한다. 앵커("Anch") 뉴클레오티드 서열은 카세트 특이적이다(예를 들어, 카세트 1은 특정 앵커를 공유하고, 카세트 2는 다른 앵커를 공유한다).
도 1d는 카세트 위치 1 및 2를 판독하기 위한 예시적인 OligoCASSEQ 실험 워크플로우를 보여주는 개략도이다. 왼쪽에서 오른쪽으로, 올리고페인트 프로브는 먼저 게놈 DNA에 혼성화된다. 판독 올리고의 특정 풀은 카세트 1(카세트의 "A")에서 바코드 위치 1에 혼성화되어 시퀀싱된다. 적색 "T" 판독 올리고는 카세트와 완전한 상보성으로 결합된다. 혼성화 후, 이미지가 촬영되고, 판독된 올리고는 2XSSCT 중의 60% 포름아미드로 세척된다. 그런 다음 위치 2 카세트 1 올리고가 혼성화되어 카세트 1의 위치 2를 검사할 수 있다. 다른 위치와 카세트도 같은 방식으로 검사된다.
도 1e-도 1h는 인간 염색체 2(Chr.2)를 따라 5개 유전자좌의 OligoCASSEQ 국재화를 보여주는 일련의 이미지이다. 도 1e는 Chr.2 유전자좌, 뉴클레오티드 바코드, 및 입증 실험에 사용된 컬러 바코드를 보여주는 개략도이다(예를 들어, 도 1f-도 1h 참조).
도 1f는 2개의 바코드 위치(예를 들어, 상단 및 중간 섹션 참조)에 대한 OligoCASSEQ 검사, 이어서 동일한 핵(예를 들어, 하단 섹션 참조)에서 -1번째 위치의 재검사에 관한 현미경 사진을 보여주는 이미지이다. 각 현미경 사진 위의 개략도(schematic)는 상이한 바코드 위치에서의 특정 위치의 색상 코드를 표시한다. 적색과 청록색(cyan) 표지된 프로브를 모두 사용하는 경우, 비최적(suboptimal) 현미경 필터 세트로 인해 적색과 청록색 색상이 중첩됨에 유의하여야 한다. 그러나, 적색과 청록색이 중첩되는 경우 청록색이 적색보다 더 밝다. 현미경 사진은 복수의 z-슬라이스로부터의 최대 강도 z-투영(projections)이다. 세포는 PGP1-F 세포이다.
도 1g는 바코드 식별을 보여주는 이미지이다. 적어도 2개의 위치에 대한 시퀀싱 후, OligoCASSEQ 초점은 디코딩될 수 있다.
도 1h는 모든 초점의 게놈 위치를 식별할 수 있으므로, OligoCASSEQ가 염색체 추적을 가능하게 한다는 것을 보여주는 이미지이다. 라인은 디코딩된 초점을 기반으로 하는 2D 추적이다. 화살촉은 염색체의 하부(bottom)(예를 들어, 긴(q) 암의 텔로미어에 가장 가까운 유전자좌)를 표시한다. OligoCASSEQ는 또한 호환가능한 형광단을 포함하는 판독 프로브(예를 들어, 도 1c 참조)를 사용하여 초해상도 현미경에 사용할 수 있다.
본 명세서에 기재된 기술의 실시형태는 OligoCASSEQ를 사용하여 표적 분자를 분석하는 방법을 포함한다. 본 명세서에 기재된 것과 같은, OligoCASSEQ는 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)를 포함하는 방법, 시스템 및/또는 조성물을 지칭한다. 개시된 방법은 동시에 적어도 2개의 표적 또는 하나의 표적의 적어도 2개의 영역의 시각화를 허용한다. 또한, 바코딩된 카세트의 사용을 통해, 개시된 방법은 4개 이상의 표적을 동시에 시각화할 수 있으며, 이는 기존의 올리고페인트로 현재 검출할 수 있는 것에 비해 더 많다.
이들 방법은 대안적인 방법보다 우수하다. 개시된 방법은, 대안적인 방법에 의해 요구되는, 리가제 또는 폴리머라제와 같은 효소를 필요로 하지 않는다. 개시된 방법은 또한 대안적인 기술에 필요한 것보다 더 짧은 올리고 및 더 적은 수의 올리고를 포함한다. 마지막으로, 개시된 방법은 대안보다 더 간단하고 저렴하다.
따라서, 한 양태에서 샘플에서 하나 이상의 표적 분자를 분석하는 방법이 제공되며, 이 방법은 (a) 상기 샘플을 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)와 접촉시키는 단계로서, 각각의 올리고뉴클레오티드 태그는, (i) 분석하고자 하는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 인식 도메인, 및 (ii) 적어도 하나의 카세트를 포함하는 적어도 하나의 스트리트를 포함하고, 각각의 카세트는, (1) 앵커 영역이 적어도 하나의 측면에 측접되어 있는, 적어도 1개의 뉴클레오티드를 포함하는 바코드 영역을 포함하며; 여기서 각각의 올리고뉴클레오티드 태그의 스트리트는 적어도, A. 상기 스트리트 내의 카세트의 공간적 순서가 상이하거나 또는 B. 상기 바코드 영역의 서열이 단계 (a)의 다른 올리고뉴클레오티드 태그의 바코드 영역과 상이하다는 점에서 단계 (a)의 다른 올리고뉴클레오티드 태그의 스트리트와 구분되는, 단계; (b) 상기 샘플을 적어도 2개의 판독 분자와 접촉시키는 단계로서, 각각의 판독 분자는 (i) 단계 (a)에서 사용된 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그의 카세트와 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드; 및 (ii) 검출 분자를 포함하며; 여기서 상기 적어도 2개의 판독 분자는 집합적으로 적어도 2개의 구별가능한 검출 분자를 포함하는, 단계; 및 (c) 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그에 혼성화된 상기 검출 분자의 상대적 공간 순서를 검출하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그는 상기 적어도 하나의 표적 분자에 혼성화되고, 그로 인해 상기 검출 분자의 상대적 공간 순서는 어떤 올리고뉴클레오티드 태그가 해당 위치에서 상기 표적 분자에 혼성화되는지에 대한 식별을 가능하게 하는, 단계를 포함한다.
다시 말해서, OligoCASSEQ 방법은 샘플을 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)와 접촉시키는 단계, 샘플을 적어도 2개의 판독 분자와 접촉시키는 단계, 및 바코딩된 카세트의 공간적 순서를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 또 다른 양태는 샘플에서 적어도 하나의 표적 분자를 분석하기 위한 시스템이며, 상기 시스템은, (a) 적어도 2개의 검출가능한 분자를 검출할 수 있는 검출기; (b) 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)로서, 각각의 올리고뉴클레오티드 태그는 (i) 분석하고자 하는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 인식 도메인, 및 (ii) 적어도 하나의 카세트를 포함하는 스트리트를 포함하고, 각각의 카세트는, (1) 앵커 영역이 적어도 하나의 측면에 측접되어 있는, 적어도 1개의 뉴클레오티드를 포함하는 바코드 영역을 포함하고; 여기서 각각의 올리고뉴클레오티드 태그의 스트리트는 적어도, A. 스트리트 내의 카세트의 공간적 순서가 상이하거나 또는 B. 바코드 영역의 서열이 (b)의 다른 올리고뉴클레오티드 태그의 바코드 영역과 상이하다는 점에서 (b)의 다른 올리고뉴클레오티드 태그의 스트리트와 구분되는 것인, 올리고뉴클레오티드 태그; 및 (c) 적어도 2개의 판독 분자로서, 각각의 판독 분자는, (i) (b)에서 사용된 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그의 카세트와 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드; 및 (ii) 검출 분자를 포함하고; 상기 적어도 2개의 판독 분자는 집합적으로 적어도 2개의 구별가능한 검출 분자를 포함하는 것인, 판독 분자,를 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 샘플은 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그 및 적어도 2개의 판독 분자와 접촉되고, 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그에 혼성화된 검출 분자의 상대적 공간 순서가 (예를 들어, 검출기로) 검출되며, 여기서 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그는 적어도 하나의 표적 분자에 혼성화되고, 그로 인해 검출 분자의 상대적인 공간적 순서는 어떤 올리고뉴클레오티드 태그가 해당 위치에서 표적 분자에 혼성화되는지에 대한 식별을 허용한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 검출 데이터는 디스플레이 상에 출력된다.
본 명세서에 사용된 것과 같은, 용어 "올리고뉴클레오티드 태그"는 인식 도메인 및/또는 적어도 하나의 스트리트를 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 올리고페인트, 다중화 오류-강건 형광 제자리 혼성화(MERFISH; multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization) 올리고, seqFISH 올리고, 표적의 RNA 순차 프로빙(SPOT) 올리고, 고범위 현미경-기반 기술(Hi-M) 올리고, 또는 염색질 구조의 광학적 재구성(ORCA) 올리고 또는 FISH 방법에 사용되는 임의의 올리고뉴클레오티드 및/또는 표적 분자, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 서열, DNA 서열의 일부, 또는 특정 염색체 또는 특정 염색체의 하위 염색체 영역에 상보적인 서열(예를 들어, 인식 도메인)을 갖는 임의의 올리고뉴클레오티드를 포함하나 이에 제한되지 않는 올리고뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된다. 더 자세한 내용은, 예를 들어, 각각이 그 전문으로 본 명세서에 참조로 통합되는, 다음 문헌 참조: Cardozo et al., Mol Cell. 2019 Apr 4;74(1):212-222; Mateo et al., Nature. 2019 Apr;568(7750):49-54; Wang et al., Scientific Reports volume 8, Article number: 4847 (2018); Shah et al., Neuron, Volume 92, Issue 2, 19 October 2016, Pages 342-357; Eng et al., Nat Methods. 2017 Dec;14(12):1153-1155.
본 명세서에 사용된 것과 같은, 용어 "스트리트(street)"는 표적 서열과 동일성을 갖지 않거나 표적 서열에 혼성화하지 않는 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)의 일부를 지칭한다. 본 명세서에 사용된 것과 같은, "카세트(cassette)"는 바코드 영역 및 적어도 하나의 앵커 영역을 포함하는 스트리트의 영역을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 것과 같은, "바코드 영역(barcode region)"은 적어도 1개의 뉴클레오티드를 포함하는 카세트의 영역을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 것과 같은, "앵커 영역(anchor region)"은 카세트의 영역을 지칭하며, 카세트의 세트에 특이적이고/이거나 일정하고/하거나 적어도 하나의 판독 분자의 앵커-혼성화 영역에 상보적인 카세트의 영역을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 "판독 분자(readout molecule)"는 1) 검출 분자 또는 모이어티 및 2) 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)의 적어도 하나의 카세트의 적어도 일부에 상보적이고/이거나 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)의 적어도 하나의 카세트의 적어도 일부와 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 분자를 지칭한다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)는 적어도 하나의 스트리트를 포함하고, 상기 스트리트는 적어도 하나의 카세트를 포함한다. 본 명세서에 사용된 것과 같은, "카세트"는 바코드 영역 및 적어도 하나의 앵커 영역을 포함하는 스트리트의 영역을 지칭한다. 비제한적인 예로서, 스트리트는 1개의 카세트, 2개의 카세트, 3개의 카세트, 4개의 카세트, 5개의 카세트, 6개의 카세트, 7개의 카세트, 8개의 카세트, 9개의 카세트, 또는 적어도 10개의 카세트를 포함한다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)가 적어도 1개의 카세트를 포함하고, 올리고뉴클레오티드 태그의 집단은 올리고뉴클레오티드 태그의 하위집단을 포함하고, 여기서 각각의 하위집단은 올리고뉴클레오티드 태그에 존재하는 카세트(들)의 유형에 의해 정의된다. 각각의 카세트 유형은 적어도 하나의 구분되고/되거나 구별가능한 앵커 영역을 포함하고(즉, 앵커 영역은 카세트 유형-특이적일 수 있음), 각각의 개별 카세트는 구분되고/되거나 구별가능한 바코드 영역을 포함한다. 비제한적 예로서, 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)의 집단은 유형 1 카세트 및 유형 2 카세트를 포함하고, 여기서 유형 1 카세트의 세트는 유형 2 카세트 세트에 의해 공유되는 앵커 영역(들)과 상이한 적어도 하나의 앵커 영역을 공유한다. 비제한적 예로서, 유형 1 카세트는 앵커 영역 A 및 앵커 영역 B를 포함하고, 유형 2 카세트는 앵커 영역 C 및 앵커 영역 D를 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 앵커 영역이 각각의 카세트 하위집단에 구분되고/되거나 구별가능한 것인 한, 카세트 하위집단은 앵커 영역을 공유할 수 있다. 비제한적인 예로서, 유형 1 카세트는 앵커 영역 A 및 앵커 영역 B를 포함하고, 유형 2 카세트는 앵커 영역 A 및 앵커 영역 C를 포함한다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)는 복수의 카세트를 포함하고, 여기서 각각의 카세트는 상이한 유형이다(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 태그 X는 유형 1 카세트, 유형 2 카세트, 및 유형 3 카세트를 포함한다). 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)는 복수의 카세트를 포함하고, 여기서 적어도 2개의 카세트는 동일한 유형이다(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 태그 Y는 2개의 유형 1 카세트 및 1개의 유형 2 카세트를 포함한다). 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)에 동일한 카세트 유형의 복수의 사본의 존재는 신호를 증폭(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 태그에 2개의 판독 분자를 동원)하는 데 사용할 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트) 또는 올리고뉴클레오티드 태그의 집단은 1가지 유형의 카세트, 2가지 유형의 카세트, 3가지 유형의 카세트, 4가지 유형의 카세트, 5가지 유형의 카세트, 6가지 유형의 카세트, 7가지 유형의 카세트, 8가지 유형의 카세트, 9가지 유형의 카세트, 또는 적어도 10가지 유형의 카세트를 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 각각의 유형의 카세트는 특정 식별자(예를 들어, 염색체 번호, 염색체 암, 염색체 영역, 유전자 등)를 코딩할 수 있다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 태그 세트 내의 각각의 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)는 카세트의 구분되는 배열을 가지며, 예를 들어, 카세트의 서열은 구분될 수 있지만 각각의 상이한 올리고뉴클레오티드 태그에서 카세트는 스트리트 내에서 상이한 공간 순서로 배열된다. 따라서, 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 태그 세트 내의 각각의 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)는, 예를 들어, 적어도 각각의 올리고뉴클레오티드 태그의 스트리트에서 카세트의 공간적 순서가 상이하다는 점에서 구분되는 스트리트를 갖는다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 태그 세트 내의 각각의 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)는 구분되는 카세트 또는 카세트 세트를 갖는다. 임의의 양상의 일부 실시예에서, 스트리트의 모든 카세트는 서로 동일하다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트) 내의 모든 카세트는 서로 동일하다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 카세트는 동일한 스트리트 또는 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트) 내의 다른 카세트와 상이하다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 각각의 그리고 모든 카세트는 동일한 스트리트 또는 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트) 내의 다른 카세트와 상이하다. 임의의 양상의 일부 실시예에서, 메인스트리트는 카세트 또는 카세트 세트를 포함하고, 백스트리트는 다른 카세트 또는 다른 카세트 세트를 포함한다. 임의의 양상의 일부 실시예에서, 메인스트리트 및 백스트리트는 동일한 카세트 또는 카세트 세트를 공유한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 태그 세트 내의 각각의 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)는 동일한 카세트 또는 카세트 세트를 공유하고, 여기서 올리고뉴클레오티드 태그 세트에서 상이한 표적 분자에 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 태그를 포함한다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 카세트는 바코드 영역을 포함한다. 본 명세서에 사용된 것과 같은, "바코드 영역(barcode region)"은 적어도 1개의 뉴클레오티드를 포함하는 카세트의 영역을 지칭한다. 비제한적인 예로서, 바코드 영역은 1개의 뉴클레오티드, 2개의 뉴클레오티드, 3개의 뉴클레오티드, 4개의 뉴클레오티드, 5개의 뉴클레오티드, 6개의 뉴클레오티드, 7개의 뉴클레오티드, 8개의 뉴클레오티드, 9개의 뉴클레오티드, 또는 10개의 뉴클레오티드를 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 바코드 영역의 적어도 하나의 뉴클레오티드는, 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이, 변형된 핵염기 염기를 포함한다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 바코드 영역의 서열은 다른 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)의 바코드 영역과 상이하다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 각각의 그리고 모든 카세트는 상이한 바코드 영역, 예를 들어 상이한 서열의 뉴클레오티드를 갖는 바코드 영역을 갖는다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 스트리트 내의 각각의 그리고 모든 카세트는 스트리트 내의 다른 카세트와 상이한 바코드 영역, 예를 들어, 상이한 서열의 뉴클레오티드를 갖는 바코드 영역을 갖는다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 바코드 영역의 서열은 동일하고 다른 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)의 적어도 하나의 바코드 영역과 공유된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 바코드 영역은 앵커 영역에 의해 적어도 한 측면에 측접된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 바코드 영역은 앵커 영역에 의해 양쪽 측면에 측접된다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 카세트는 적어도 하나의 앵커 영역을 포함한다. 본 명세서에 사용된 것과 같은, "앵커 영역(anchor region)"은 카세트 세트에 특이적이고/이거나 일정하고/하거나 적어도 하나의 판독 분자의 앵커-혼성화 영역에 상보적인 카세트의 영역을 지칭한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 각각의 카세트는 모든 다른 카세트의 적어도 하나의 앵커 영역과 구분되는 적어도 하나의 앵커 영역을 포함한다. 비제한적인 예로서, 앵커 영역은 적어도 1개의 뉴클레오티드를 포함한다. 비제한적인 예로서, 앵커 영역은 1개의 뉴클레오티드, 2개의 뉴클레오티드, 3개의 뉴클레오티드, 4개의 뉴클레오티드, 5개의 뉴클레오티드, 6개의 뉴클레오티드, 7개의 뉴클레오티드, 8개의 뉴클레오티드, 9개의 뉴클레오티드, 또는 10개의 뉴클레오티드를 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 앵커 영역은 적어도 5개의 뉴클레오티드를 포함한다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 5개 또는 그 미만의 뉴클레오티드(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 뉴클레오티드)를 포함하는 앵커 영역은 판독 분자의 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)에 대한 일시적 결합을 가능하게 한다. 본 명세서에 사용된 것과 같은, 용어 "일시적 결합(transient binding)"은 분자, 즉 반복적으로 결합 및 결합해제될 수 있도록 결합 친화도를 갖는 판독 분자 사이의 약한, 가역적, 및/또는 일시적인, 특이적 상호작용을 지칭한다. 이러한 결합 친화도는 해리 상수 Kd를 사용하여 측정할 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 일시적 결합은 μM 범위의 Kd를 갖는 것으로 정의될 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 표적 분자에 대한 낮은 결합 친화성을 갖는 앵커 영역이 표적 분자에 대한 일시적 결합이 바람직한 방법에 사용될 수 있다(예를 들어, DNA-교환 PAINT, 예를 들어, 각각이 그 전문으로 본 명세서에 참조로 통합되는 다음 문헌 참조: US 2016/0161472 A1, Jungmann et al., Nano Lett.2010, 10, 11, 4756-4761).
앵커 영역의 비제한적 예는 다음을 포함한다: GTCTC(서열번호: 1); CACTA(서열번호: 2); GCCCG(서열번호: 3); 및 TGTGC(서열번호: 4).
비제한적인 예로서, 카세트는 1개의 앵커 영역 또는 2개의 앵커 영역을 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 앵커 영역은 바코드 영역에 대해 5'이고/이거나 앵커 영역은 바코드 영역에 대해 3'이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 바코드 영역은 앵커 영역에 의해 각각의 측면에 측접되고, 예를 들어, 하나의 앵커 영역은 바코드 영역에 대해 5'이고, 하나의 앵커 영역은 바코드 영역에 대해 3'이다.
임의의 개별 카세트는 선택적으로 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)의 다른 카세트 또는 요소(elements)로부터 원하는 거리에 위치시키기 위해 추가 서열, 예를 들어, 링커 또는 스페이서 서열을 포함할 수 있다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 각각의 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트) 스트리트는 카세트 또는 카세트 세트로 인해 다른 올리고뉴클레오티드 태그의 스트리트와 구분된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 각각의 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트) 스트리트는 적어도 스트리트 내의 카세트의 공간적 순서가 상이하다는 점에서 다른 올리고뉴클레오티드 태그의 스트리트와 구분된다. 비제한적인 예로서, 공간 순서 5'-A-B-C-3'에서 3개의 카세트(예를 들어, 카세트 "A", "B", 및 "C")를 포함하는 스트리트는 5'-A-C-B-3', 5'-B-A-C-3', 5'-B-C-A-3', 5'-C-A-B-3', 또는 5'-C-B-A-3'에서 선택되는 공간적 순서의 카세트를 포함하는 임의의 다른 스트리트와 비교하여 다른 구분되는 공간 순서의 카세트를 가지며, 앞서 언급한 스트리트 각각은 이들 카세트의 공간적 순서에서 서로 구분되며 서로 상이하다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 각각의 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트) 스트리트는 적어도 스트리트 내의 바코드 영역이 상이하다는 점에서 다른 올리고뉴클레오티드 태그의 스트리트와 구분된다. 비제한적인 예로서, 예를 들어, 3개의 뉴클레오티드(예를 들어, 뉴클레오티드 "X", "Y", 및 "Z")를 5'-X-Y-Z-3' 순서로 포함하는 바코드를 포함하는 스트리트는 5'-X-Z-Y-3', 5'-Y-X-Z-3', 5'-Y-Z-X-3', 5'-Z-X-Y-3', 또는 5'-Z-Y-X-3' 중에서 선택된 바코드 영역을 포함하는 다른 스트리트와 비교하여 다른 구분되는 바코드를 가지며, 앞서 언급한 스트리트 각각은 이들 바코드 영역에서 서로 구분되며 다르다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 각각의 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트) 스트리트는 적어도 스트리트 내의 카세트의 공간적 순서가 상이하다는 점에서 다른 올리고뉴클레오티드 태그의 스트리트와 구분되고, 각각의 올리고뉴클레오티드 태그의 스트리트는 적어도 스트리트 내의 바코드 영역 또는 바코드 영역들이 상이하다는 점에서 다른 올리고뉴클레오티드 태그의 스트리트와 구분된다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 샘플을 판독 분자와 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 명세서에 사용된 것과 같은, "판독 분자(readout molecule)"는 1) 검출 분자 또는 모이어티 및 2) 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)의 적어도 하나의 카세트의 적어도 일부에 상보적이고/이거나 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)의 적어도 하나의 카세트의 적어도 일부와 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하는 분자를 지칭한다. 비제한적 예로서, 판독 분자는 카세트의 앵커 영역, 예를 들어 "앵커-혼성화 영역(anchor-hybridizing region)"에 상보적이고 특이적으로 혼성화하는 적어도 하나의 영역을 포함한다. 비제한적 예로서, 판독 분자는 카세트의 바코드 영역, 예를 들어, "바코드-혼성화 영역(barcode-hybridizing region)"에 상보적이고 특이적으로 혼성화하는 적어도 하나의 영역을 포함한다. 비제한적인 예로서, 판독 분자는 하나의 앵커-혼성화 영역 및/또는 2개의 앵커-혼성화 영역을 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 앵커-혼성화 영역은 바코드-혼성화 영역에 대해 5'이고/이거나 앵커-혼성화 영역은 바코드-혼성화 영역에 대해 3'이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 바코드-혼성화 영역은 앵커-혼성화 영역에 의해 각각의 양태에 측접되고, 예를 들어, 하나의 앵커-혼성화 영역은 바코드-혼성화 영역에 대해 5'이고, 하나의 앵커-혼성화 영역은 바코드 혼성화 영역에 대해 3'이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 앵커-혼성화 영역은 카세트 유형에 구분되는 앵커 영역에 대해 위에서 설명된 바와 같이, 카세트 유형에 대해 구분될 수 있다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 판독 분자는 검출 분자, 예를 들어, 광학적으로 검출가능한 검출 분자를 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 검출 분자는 형광단이고, 검출은 형광 현미경으로 수행된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 검출 분자는 비오틴, 아민, 금속, 앵커 분자, 또는 아크리다이트를 포함한다. 검출 분자, 형광단, 및 검출 기술의 비제한적인 예는 본 명세서에 추가로 기재되어 있다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 적어도 2개의 판독 분자는 집합적으로 적어도 2개의 구별가능한 검출 분자를 포함한다. 비제한적인 예로서, 2개의 판독 분자는 집합적으로 2개의 구별가능한 검출 분자를 포함하고, 3개의 판독 분자는 집합적으로 3개의 구별가능한 검출 분자를 포함하고, 4개의 판독 분자는 집합적으로 4개의 구별가능한 검출 분자를 포함하거나, 또는 적어도 5개의 판독 분자는 집합적으로 적어도 5개의 구별가능한 검출 분자를 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 판독 분자의 풀은 구별가능한 검출 분자보다 더 많은 판독 분자를 포함하며, 예를 들어, 동일한 검출 분자가 복수의 판독 분자 상에 존재할 수 있다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 검출 분자는 판독 분자의 5' 말단에 연결될 수 있고, 검출 분자는 판독 분자의 3' 말단에 연결될 수 있거나, 또는 검출 분자는 판독 분자의 5' 말단 및 3' 말단에 연결될 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 판독 분자의 5' 말단에 연결된 검출 분자는 판독 분자의 3' 말단에 연결된 검출 분자와 동일한 유형의 검출 분자이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 판독 분자의 5' 말단에 연결된 검출 분자는 판독 분자의 3' 말단에 연결된 검출 분자와 상이한 유형의 검출 분자이다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 샘플은 적어도 2개의 판독 분자와 접촉된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 샘플은 적어도 하나의 판독 분자와 접촉된다. 비제한적인 예로서, 샘플은 1개의 판독 분자, 2개의 판독 분자, 3개의 판독 분자, 4개의 판독 분자, 또는 적어도 5개의 판독 분자와 접촉된다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 방법은 검출 분자, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)에 혼성화된 판독 분자의 검출 분자를 검출하는 단계를 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 방법은 검출 분자, 예를 들어, 차례로 하나 이상의 표적에 혼성화되는 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)에 혼성화된 판독 분자의 검출 분자를 검출하는 단계를 포함한다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 검출 단계는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)에 혼성화된 검출 분자의 상대적인 공간적 순서를 검출하는 단계를 포함한다. 판독 분자의 다른 표지(예를 들어, 색상)는 하나 이상의 카세트와 상관관계가 있으며, 다른 판독 분자의 공간적 순서는 단일 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)에서 카세트의 순서에 대한 정보를 제공하여, 많은 수의 상이한 올리고뉴클레오티드 태그가 단일 스트리트에 혼성화된 판독 분자의 그룹에 의해 제공되는 바코딩된 신호에 의해 구별되도록 한다. 따라서, 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 검출 분자의 상대적인 공간적 순서는 어떤 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)가 해당 위치에서 표적 분자에 혼성화되는지에 대한 식별을 허용한다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 검출 단계는 적어도 하나의 카세트에 혼성화된 판독 분자의 검출 분자의 상대적 공간 순서를 검출하는 단계를 포함하고, 그로 인해 검출 분자의 상대적 공간 순서는 어떤 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)가 해당 위치에서 표적 분자에 혼성화되는지에 대한 식별을 허용한다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 검출 단계는 적어도 하나의 카세트에 혼성화된 판독 분자의 상대적 공간 순서를 검출하는 단계를 포함하고, 그로 인해 판독 분자의 상대적 공간 순서는 어떤 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)가 해당 위치에서 표적 분자에 혼성화되는지에 대한 식별을 허용한다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 샘플은 판독 분자의 풀, 예를 들어, "판독 풀"과 접촉된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 판독 풀은 동일한 카세트 유형에 대한 판독 분자(예를 들어, 적어도 하나의 구분되는 앵커-혼성화 영역을 공유하는 판독 분자)를 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 판독 풀은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 또는 적어도 5개의 카세트 유형에 대한 판독 분자를 포함한다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 각각의 판독 풀은 올리고뉴클레오티드 태그 세트(예를 들어, 특정 카세트 유형을 갖는 올리고페인트)의 바코드 영역 내의 특정 위치에서 뉴클레오티드의 동일성을 결정하는 것에 관한 것이다. 비제한적 예로서, 샘플은 바코드 영역의 적어도 하나의 뉴클레오티드를 검출하기 위해 적어도 2개의 판독 풀과 순차적으로 또는 동시에 접촉된다. 비제한적인 예로서, 샘플은 하나 이상의 스트리트에서 제1 및 제2 카세트 위치를 검출하기 위해 적어도 2개의 판독 풀과 순차적으로 접촉된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 판독 풀은 2개의 판독 분자, 3개의 판독 분자, 4개의 판독 분자, 또는 적어도 5개의 판독 분자를 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 판독 풀은 2개의 별개의 검출 분자, 3개의 별개의 검출 분자, 4개의 별개의 검출 분자, 또는 적어도 5개의 별개의 검출 분자를 포함한다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 판독 풀은 동일한 유형의 검출 분자에 연결된 판독 분자 세트를 포함한다. 비제한적 예로서, 동일한 유형의 검출 분자에 연결된 판독 분자 세트는 바코드-혼성화 영역의 한 위치에 동일한 뉴클레오티드 및 (1) 바코드-혼성화 영역의 다른 위치에 있는 상이한 뉴클레오티드, (2) 바코드-혼성화 영역의 다른 위치에 축퇴된 세트, 또는 (3) 바코드-혼성화 영역의 다른 위치에 범용 뉴클레오티드 중 적어도 하나를 포함한다. 범용 뉴클레오티드는 임의의 뉴클레오티드에 결합할 수 있는 범용 염기를 포함한다. 범용 염기의 비제한적 예는 이노신, 하이포잔틴, 니트로아졸, 이소카보스티릴 유사체, 아졸 카복사미드, 또는 방향족 트리아졸 유사체를 포함한다(예를 들어, 다음 문헌 참조: Loakes et al., Nucleic Acids Res. 2001 Jun 15;29(12):2437-47; Berger et al., Nucleic Acids Res. 2000 Aug 1; 28(15): 2911-2914; Liang et al., RSC Advances 3(35); June 2013).
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 판독 풀은 적어도 2개의 판독 분자의 세트를 포함하고, 여기서 각각의 세트는 동일한 유형의 검출 분자에 연결되며, 이는 판독 분자의 다른 세트(들)에 연결된 검출 분자와 구별되고, 각각의 세트는, 판독 분자의 다른 세트(들)에 의해 검출된 바코드 영역의 동일한 위치 내의 뉴클레오티드와 구별되는, 바코드 영역 내의 동일한 뉴클레오티드를 검출한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 판독 풀은 판독 분자의 적어도 1개 세트, 2개 세트, 3개 세트, 4개 세트, 또는 적어도 5개 세트를 포함한다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 샘플은 각각의 카세트의 바코드 영역의 1번째 뉴클레오티드를 인식하는(또는 스트리트 내의 1번째 카세트 위치에서 다른 카세트를 인식하는) 1번째 판독 풀과 접촉된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 샘플은 각각의 카세트의 바코드 영역의 2번째 뉴클레오티드를 인식하는(또는 스트리트 내의 2번째 카세트 위치에서 다른 카세트를 인식하는) 2번째 판독 풀과 접촉된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 샘플은 각각의 카세트의 바코드 영역의 3번째 뉴클레오티드를 인식하는(또는 스트리트의 3번째 카세트 위치에서 다른 카세트를 인식하는) 3번째 판독 풀과 접촉된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 샘플은 각 카세트의 바코드 영역의 4번째 뉴클레오티드를 인식하는(또는 스트리트 내의 4번째 카세트 위치에서 다른 카세트를 인식하는) 4번째 판독 풀과 접촉된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 샘플은 각 카세트의 바코드 영역의 5번째 뉴클레오티드를 인식하는(또는 스트리트 내의 5번째 카세트 위치에서 다른 카세트를 인식하는) 5번째 판독 풀과 접촉된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 샘플은 각각의 카세트의 바코드 영역의 n번째 뉴클레오티드를 인식하는 (또는 스트리트 내 n번째 카세트 위치에서 다른 카세트를 인식하는) n번째 판독 풀과 접촉되며, 여기서 n은 1에서 10 사이의 정수이다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 샘플은 각각의 판독 풀과 순차적으로 접촉된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 샘플을 n번째 판독 풀 및 (n+1)번째 판독 풀과 접촉시키는 사이에, 판독 풀은 본 명세서에 기재된 것과 같은 검출되고, n번째 판독 풀은 세척된다(예를 들어, 혼성화 반응에 사용하기에 적절한 임의의 완충액, 예를 들어, 2XSSCT 중의 60% 포름아미드, 여기서 SSC는 식염수-소듐 시트레이트 완충액을 지칭하고 T는 TWEEN을 지칭함).
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 샘플은 동시에 적어도 2개의 판독 풀과 접촉된다. 비제한적 예로서, 샘플은 적어도 2개의 판독 풀, 적어도 3개의 판독 풀, 적어도 4개의 판독 풀, 또는 적어도 5개의 판독 풀과 동시에 접촉된다. 샘플을 하나의 판독 풀과 접촉시키는 것과 비교하여, 동시에 적어도 2개의 판독 풀과 샘플을 접촉시키는 것은 신호의 증폭, 추가의 광학적으로 검출가능한 마커(예를 들어, 상이한 형광단의 유사색 조합물)의 도입, 및 프로세스 속도 증가를 포함하지만 이로만 제한되는 것은 아닌 부가적인 이점을 제공할 수 있다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 샘플에서 적어도 하나의 표적 분자를 분석하는 방법은 샘플을 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)와 접촉시키는 단계, 샘플을 적어도 2개의 판독 분자와 접촉시키는 단계, 및 판독 분자의 상대적인 공간적 순서를 검출하는 단계를 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 카세트에 대한 판독 분자의 특이적 혼성화는 바코드 영역의 정체에 의해 결정되거나 또는 이에 의존한다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 올리고페인트 기술과 관련된 조성물 및 방법의 개선을 포함한다. 본 명세서에 사용된 것과 같은, 용어 "올리고페인트"는 표적 분자에 상보적인 서열, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 서열, DNA 서열의 일부, 또는 특정 염색체 또는 특정 염색체의 서브염색체 영역을 갖는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
전형적으로, 형광 제자리 혼성화(FISH) 프로브는 복제된 게놈 영역 또는 흐름-분류된 염색체에서 유래하며, 이는 형광단-접합 뉴클레오티드의 존재 하에 닉 번역 또는 PCR을 통해 직접 표지되거나 또는 뉴클레오티드-접합 합텐, 예컨대 비오틴 및 디곡시제닌으로 간접적으로 표지된 다음, 2차 검출 시약으로 시각화된다. 기존의 FISH 프로브는 반복적인 서열과 가변적인(variable) 효능으로 인해 제한된다. 또한, 표적 영역은 클론의 가용성과 게놈 삽입물의 크기에 의해 제한된다. 기존의 FISH 프로브를 사용하여 더 큰 영역을 표적으로 삼는 것이 가능하지만, 이 접근 방식은 종종 어렵고 비용이 많이 들며, 이는 각각의 클론이 혼성화를 위해 별도로 제조되고 최적화되어야 하기 때문이다.
올리고페인트는 개선된 FISH 기술이며, 올리고 라이브러리는 대량 병렬 합성에 의해 생성될 수 있으며 프로브의 재생가능한 공급원으로 사용될 수 있다. 올리고 라이브러리는 (선택적으로 형광단-접합 프라이머로) PCR 증폭될 수 있다. 증폭 생성물은 수십 킬로베이스에서 메가베이스에 이르는 영역을 시각화할 수 있는 고효율 단일-가닥, 가닥-특이적 프로브를 생성하기 위해 효소적으로 처리될 수 있다. 올리고페인트는, 선택적으로 전산적으로(computationally) 패턴화되고/되거나 전산적으로 설계된 합성 프로브 및 어레이를 포함할 수 있다.
올리고페인트 및 관련 기술에 관한 간행물은, 예를 들어, 각각이 그 전문으로 본 명세서에 참조로 통합되는, 다음 문헌을 참조: Beliveau et al. OligoMiner provides a rapid, flexible environment for the design of genome-scale oligonucleotide in situ hybridization probes. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2018 115:E2183-E2192; Beliveau et al. In situ super-resolution imaging of genomic DNA with OligoSTORM and OligoDNA-PAINT. Methods Mol Biol 2017 1663:231-252; Wang et al. Spatial organization of chromatin domains and compartments in single chromosomes. Science 2016 353:598-602; Boettiger et al. Super-resolution imaging reveals distinct chromatin folding for different epigenetic states. Nature. 2016 529:418-22; Schmidt et al. Scalable amplification of strand subsets from chip-synthesized oligonucleotide libraries. Nat Commun 2015 Nov 16;6:8634; Murgha et al. Combined in vitro transcription and reverse transcription method to amplify and label complex synthetic oligonucleotide probe libraries. Biotechniques 2015 58:301-7; Beliveau et al. Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes. Nat Commun 2015 6:7147; Beliveau et al. Visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Curr Protocols Mol Biol 2014 14.23; Beliveau et al. A versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2012 109:21301-6; US 2010/0304994 A1; US 2018/0223347 A1; WO 2018/045186 A1; US 2014/0364333 A1; US 2019/0032121 A1; US 2013/0143208 A1; US 10,119,160 B2; US 2018/0057867 A1; US 2019/0127786 A1; US 2018/0292318 A1; WO 2017/189525 A1; WO 2018/183851 A1; WO 2018/183860 A1; WO 2018/045181 A1; US 2016/0040235 A1.
본 명세서에 사용된 것과 같은, 용어 ,"올리고페인팅된(Oligopainted)" 및 "올리고페인팅된 영역(Oligopainted region)"은, 각각, 하나 이상의 올리고페인트와 혼성화된, 표적 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 염색체) 또는 표적 뉴클레오티드 서열의 영역(예를 들어, 하위염색체 영역)을 지칭한다. 올리고페인트는 표적 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 간기, 전전기, 전기, 전중기, 중기, 후기, 말기 및 세포질분열(cytokinesis)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 세포 주기의 다양한 시기 동안 염색체 및 염색체의 하위염색체 영역을 표지하는 데 사용할 수 있다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, FISH 방법은 올리고페인트, 다중화 오류-강건 형광 제자리 혼성화(MERFISH), seqFISH, 표적의 RNA 순차 프로빙(SPOT), 고범위 현미경-기반 기술(Hi-M), 또는 염색질 구조의 광학적 재구성(ORCA) 또는 표적 분자, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 서열, DNA 서열의 일부, 또는 특정 염색체 또는 특정 염색체의 하위-염색체 영역에 상보적인 서열(예를 들어, 인식 도메인)을 갖는 올리고뉴클레오티드와 샘플을 접촉시키는 단계를 포함하는 임의의 방법을 포함할 수 있다. 더 세한 내용은, 예를 들어, 각각이 그 전문으로 본 명세서에 참조로 통합되는, 다음 문헌 참조: Cardozo et al., Mol Cell. 2019 Apr 4;74(1):212-222; Mateo et al., Nature. 2019 Apr;568(7750):49-54; Wang et al., Scientific Reports volume 8, Article number: 4847 (2018); Shah et al., Neuron, Volume 92, Issue 2, 19 October 2016, Pages 342-357; Eng et al., Nat Methods. 2017 Dec;14(12):1153-1155.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 샘플에서 적어도 하나의 표적 분자를 분석하는 단계를 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 표적 분자는 핵산, 폴리펩티드, 세포 표면 분자, 및/또는 무기 물질을 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 표적 분자는 게놈 DNA, 염색체로서 조직화된 게놈 DNA, 또는 상보적 DNA(cDNA)를 포함하나 이에 제한되지 않는 DNA를 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 표적 분자는 전령 RNA(mRNA) 또는 리보솜 RNA(rRNA)를 포함하나 이에 제한되지 않는 RNA를 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 표적 분자는 세포내 단백질, 막관통 단백질, 또는 세포외 단백질을 포함하나 이에 제한되지 않는 폴리펩티드를 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 표적 분자는 막관통 단백질, 막 지질, 막 수용체, 또는 막관통 수용체를 포함하나 이에 제한되지 않는 세포 표면 분자를 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 표적 분자는 유리, 세라믹, 금속, 또는 임의의 다른 고체 기재를 포함하지만 이에 제한되지 않는 무생물 공급원으로부터 유래된 임의의 물질을 포함하는 무기 물질을 포함한다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 하나의 표적 분자가 분석된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 적어도 2개의 표적 분자가 동시에 분석된다. 비제한적인 예로서, 적어도 2개의 표적 분자, 적어도 3개의 표적 분자, 적어도 4개의 표적 분자, 적어도 5개의 표적 분자, 적어도 6개의 표적 분자, 적어도 7개의 표적 분자, 적어도 8개의 표적 분자, 적어도 9개의 표적 분자, 적어도 10개의 표적 분자, 또는 적어도 20개의 표적 분자가 동시에 분석된다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 표적 분자의 하나 이상의 영역이 동시에 분석된다. 비제한적인 예로서, 표적 분자 또는 표적 분자의 2개 영역, 3개 영역, 4개 영역, 5개 영역, 6개 영역, 7개 영역, 8개 영역, 9개 영역, 10개 영역, 또는 10개 초과 영역이 분석된다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 샘플은 세포, 세포 배양물, 또는 조직 샘플이다. 비제한적인 예로서, 세포, 세포 배양물, 또는 조직 샘플은 개별 염색체가 구별될 수 있는 시간 또는 조건, 예를 들어, 유사분열에서 채취된다.
본 명세서에 사용된 것과 같은, 용어 "샘플(sample)" 또는 "시험 샘플(test sample)"은 생물학적 유기체, 예를 들어, 대상체의 혈액 또는 조직 샘플에서 채취하거나 분리한 샘플을 나타낸다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 본 발명은 생물학적 샘플의 여러 예를 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 세포, 또는 조직, 또는 말초 혈액, 또는 체액이다. 예시적인 생물학적 샘플에는 생검, 종양 샘플, 생체 유체 샘플; 혈액; 혈청; 혈장; 소변; 정액; 점액; 조직 생검; 장기 생검; 활액; 담즙액; 뇌척수액; 점막 분비물; 삼출물(effusion); 땀; 타액; 및/또는 조직 샘플 등을 포함한다. 상기 용어는 또한 상기 언급된 샘플의 혼합물을 포함한다. 용어 "시험 샘플"은 미처리 또는 전처리(또는 사전-가공)된 생물학적 샘플도 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 시험 샘플은 대상체로부터의 세포를 포함한다.
시험 샘플은 대상체로부터 샘플을 적출하여 얻을 수 있지만, 이전에 분리된 샘플(예를 들어, 이전 시점에 분리되고 동일인 또는 다른 사람에 의해 분리된 것)을 사용하여 얻을 수도 있다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 시험 샘플은 미처리 시험 샘플일 수 있다. 본 명세서에 사용된 것과 같은, "미처리된 시험 샘플(untreated test sample)"이라는 문구는 용액에 희석 및/또는 현탁을 제외하고는 어떠한 사전 샘플 전처리도 하지 않은 시험 샘플을 지칭한다. 시험 샘플을 처리하기 위한 예시적인 방법은 원심분리, 여과, 초음파 처리, 균질화, 가열, 동결 및 해동, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 시험 샘플은 동결된 시험 샘플, 예를 들어, 동결된 조직일 수 있다. 동결된 샘플은 본 명세서에 기재된 방법, 분석 및 시스템을 사용하기 전에 해동될 수 있다. 해동 후, 동결된 샘플은 본 명세서에 기재된 방법, 분석 및 시스템에 적용되기 전에 원심분리될 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 시험 샘플은, 예를 들어, 정화된 시험 샘플을 포함하는 상청액의 원심분리 및 수집에 의한 정화된 시험 샘플이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 시험 샘플은 사전-가공된 시험 샘플, 예를 들어, 원심분리, 여과, 해동, 정제, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 처리로부터 생성된 상청액 또는 여과액일 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 시험 샘플은 화학적 및/또는 생물학적 시약으로 처리될 수 있다. 화학적 및/또는 생물학적 시약은 가공 중에 생체분자(예를 들어, 핵산 및 단백질)를 포함하는 샘플의 안정성을 보호 및/또는 유지하기 위해 사용될 수 있다. 하나의 예시적인 시약은 처리 동안 단백질의 안정성을 보호하거나 유지하기 위해 일반적으로 사용되는 프로테아제 억제제이다. 당업자는 본 명세서에 기재된 바와 같은 발현 산물의 수준을 결정하는 데 필요한 생물학적 샘플의 사전-가공에 적절한 방법 및 프로세스를 잘 알고 있다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법, 검정 및 시스템은 대상체로부터 시험 샘플을 획득하거나 획득한 단계를 추가로 포함할 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 대상체는 인간 대상체일 수 있다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)는 인식 도메인을 포함한다. 본 명세서에 사용된 "인식 도메인(recognition domain)"은 분석할 표적 분자 및/또는 서열에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)의 도메인이다. 비제한적인 예로서, 인식 도메인은 표적 분자 및/또는 서열, 예를 들어, 염색체의 영역에 상보적인 핵산 서열일 수 있다. 따라서, 인식 도메인의 서열은 원하는 표적의 정체에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 이 목적을 위해 광범위하고 자유롭게 사용할 수 있는 소프트웨어(예를 들어, Primer3 또는 PrimerBank, 둘 다 월드 와이드 웹 상에서 입수가능함)를 사용하여, 특정 조건 하에서 임의의 주어진 표적에 특이적으로 혼성화할 인식 도메인을 설계하는 것은 당해 기술 분야의 기술 범위 내에 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 인식 도메인은 표적 분자 및/또는 표적 서열의 일부와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일성을 가질 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 인식 도메인은 "게놈 상동성(genomic homology)"의 도메인 또는 게놈의 영역에 특이적으로 결합하는 도메인을 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 동일하거나 상이한 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)에서 발견되는 다중 인식 도메인은 단일 표적 분자 및/또는 표적 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 비제한적 예로서, 적어도 2개의 인식 도메인, 적어도 3개의 인식 도메인, 적어도 4개의 인식 도메인, 적어도 5개의 인식 도메인, 적어도 10개의 인식 도메인, 적어도 20개의 인식 도메인, 적어도 30개의 인식 도메인, 적어도 40개의 인식 도메인, 또는 적어도 50개의 인식 도메인은 표적 분자 및/또는 표적 서열에 특이적으로 결합할 수 있다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 인식 도메인은 올리고페인트, 다중화 오류-강건 형광 제자리 혼성화(MERFISH) 올리고, seqFISH 올리고, 표적의 RNA 순차 프로빙(SPOT) 올리고, 고범위 현미경-기반 기술(Hi-M) 올리고, 또는 염색질 구조의 광학적 재구성(ORCA) 올리고 또는 또는 FISH 방법에 사용되는 임의의 올리고뉴클레오티드 및/또는 표적 분자, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 서열, DNA 서열의 일부, 또는 특정 염색체 또는 특정 염색체의 하위-염색체 영역에 상보적인 서열(예를 들어, 인식 도메인)을 갖는 임의의 올리고뉴클레오티드를 포함하나 이에 제한되지 않는 올리고뉴클레오티드를 포함하거나 이로 구성된다. 더 자세한 내용은, 각각이 그 전문으로 본 명세서에 참조로 통합되는, 다음 문헌 참조: Cardozo et al., Mol Cell. 2019 Apr 4;74(1):212-222; Mateo et al., Nature. 2019 Apr;568(7750):49-54; Wang et al., Scientific Reports volume 8, Article number: 4847 (2018); Shah et al., Neuron, Volume 92, Issue 2, 19 October 2016, Pages 342-357; Eng et al., Nat Methods. 2017 Dec;14(12):1153-1155.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 인식 도메인은 비핵산, 예를 들어, DNA-결합 폴리펩티드와 같은 임의의 핵산 결합 조성물을 포함한다. 비제한적인 예로서, 인식 도메인은 서열-특이적 단일-가닥 DNA 결합 단백질 또는 인자, 서열-특이적 이중-가닥 DNA 결합 단백질 또는 인자, DNA-RNA 결합 단백질 또는 인자, 또는 RNA 결합 단백질 또는 인자를 포함한다. 이러한 핵산-결합 조성물의 비제한적 예는 전사 인자, 제한 효소, 전사 활성화인자-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), CRISPR-Cas-유형 인자 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 핵산-결합 조성물은 뉴클레아제 활성이 결여되어 있다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 표적 분자는 비핵산, 예를 들어, 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 인식 도메인은 표적 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 임의의 조성물을 포함한다. 이러한 폴리펩티드-결합 인식 도메인의 비제한적인 예는 항체(예를 들어, 나노바디), 앱타머, 소분자, 리간드, 특정 폴리펩티드의 공지된 결합 파트너 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 태그가 인식 도메인에 연결되는 것은 아니고 관심 대상의 올리고뉴클레오티드-태깅된 개체를 검출하기 위한 개체에 연결된다는 점에서, 올리고뉴클레오티드 태그는 표적 분자를 특이적으로 인식하지 아니한다. 올리고뉴클레오티드 태그는 적어도 하나의 앵커 영역 및 적어도 바코드 영역을 포함하지만, 예를 들어, 인식 도메인이 결여된 핵산일 수 있다. 비제한적인 예로서, 이러한 올리고뉴클레오티드-태깅된 엔티티는 소분자(예를 들어, 약물 스크리닝의 목적을 위한 것), 폴리펩티드, 세포, 또는 비생물학적 물질(예를 들어, 금속, 화학물질 등)을 포함할 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드-태깅된 엔티티를 검출하는 방법은, (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 태그 내의 특정 카세트 유형에 혼성화하는 판독 분자의 풀과 접촉시키는 것과 같이) 본 명세서에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)를 검출하기 위해 사용되는 것과 동일할 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 복수 유형의 표적 분자 및/또는 태깅된 엔티티 유형은, 예를 들어, DNA를 인식하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트), 폴리펩티드를 인식하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그, 및/또는 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드-태깅된 엔티티를 사용하여, 한번에 검출될 수 있다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)는 적어도 하나의 스트리트를 포함한다. 본 명세서에 사용된 것과 같은, 용어 "스트리트(street)"는 표적 서열과 동일성을 갖지 않거나 또는 표적 서열에 혼성화하지 않는 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)의 일부를 지칭한다. 스트리트는 검출 영역 및/또는 증폭 영역을 포함한다. 비제한적 예로서, 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)는 2개의 스트리트를 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 스트리트는 "메인스트리트" 및/또는 "백스트리트" 중 하나 이상일 수 있다. 비제한적인 예로서, 메인스트리트는 인식 도메인에 대해 5', 메인스트리트는 백스트리트에 대해 5', 및/또는 메인스트리트는 인식 도메인 및 백스트리트에 대해 5'이다. 비제한적인 예로서, 백스트리트는 인식 도메인에 대해 3', 백스트리트는 메인스트리트에 대해 3', 및/또는 백스트리트는 인식 도메인 및 메인스트리트에 대해 3'이다. 비제한적인 예로서, 메인스트리트는 인식 도메인에 대해 3', 메인스트리트는 백스트리트에 대해 3', 및/또는 메인스트리트는 인식 도메인 및 백스트리트에 대해 3'이다. 비제한적인 예로서, 백스트리트는 인식 도메인에 대해 5', 백스트리트는 메인스트리트에 대해 5', 및/또는 백스트리트는 인식 도메인 및 메인스트리트에 대해 5'이다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 스트리트(예를 들어, 메인스트리트 및/또는 백스트리트)는 적어도 하나의 카세트 및/또는 적어도 하나의 범용 프라이밍 영역을 포함한다. 본 명세서에 기재된 것과 같은, 상기 카세트는 적어도 하나의 바코드 영역 및 적어도 하나의 앵커 영역을 포함한다. 본 명세서에 사용된 "범용 프라이밍 영역(universal priming region)"은 범용 프라이머(예를 들어, 범용 정방향 프라이머, 범용 역방향 프라이머)에 결합하는 영역을 의미한다. 본 명세서에 사용된 "범용 프라이머"는 복수의 개별 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트) 또는 올리고뉴클레오티드 태그 세트에 사용되는 프라이머를 의미한다. 범용 프라이머는, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 태그 또는 올리고뉴클레오티드 태그 세트의 생성을 위해, 예를 들어, PCR로 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)를 증폭할 목적으로 사용할 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 각각의 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)의 범용 프라이밍 영역은 나머지 올리고뉴클레오티드 태그, 예를 들어, 샘플이 접촉되는 임의의 다른 올리고뉴클레오티드 태그의 범용 프라이밍 영역과 동일하다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 스트리트는 적어도 하나의 범용 프라이밍 영역 및/또는 적어도 하나의 카세트를 포함한다. 비제한적인 예로서, 범용 프라이밍 영역은 적어도 하나의 카세트의 5'이다. 비제한적 예로서, 범용 정방향 프라이머에 특이적으로 결합하는, 범용 정방향 프라이밍 영역은 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)의 5' 말단에 있다. 비제한적인 예로서, 범용 프라이밍 영역은 적어도 하나의 카세트의 3이다. 비제한적인 예로서, 범용 역방향 프라이머에 특이적으로 결합하는, 범용 역방향 프라이밍 영역은 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)의 3' 말단에 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 범용 프라이밍 영역은 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)에 존재하는 임의의 카세트의 양태(5' 및 3' 둘 다)에 측접한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 범용 역 프라이밍 영역은, 예를 들어, 닉킹 엔도뉴클레아제(NE)에 노출될 때 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)가 단일 가닥이 되도록 하기 위해 닉킹 엔도뉴클레아제(NE)에 대한 인식 부위를 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)는 (예를 들어, PCR 및/또는 범용 프라이밍 영역을 통해) 반드시 증폭되지는 않는다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 기재된 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)는, 새로(de novo), 합성될 수 있고 "튜브로부터 바로(straight from the tube)" 사용할 수 있다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 검출은 적어도 단일 세포 해상도로 수행된다. 비제한적인 예로서, 검출은 적어도 200 nm, 적어도 300 nm, 적어도 400 nm, 적어도 500 nm, 적어도 600 nm, 적어도 700 nm, 적어도 800 nm, 적어도 900 nm, 적어도 1 ㎛, 적어도 2 ㎛, 적어도 3 ㎛, 적어도 4 ㎛, 적어도 5 ㎛, 적어도 6 ㎛, 적어도 7 ㎛, 적어도 8 ㎛, 적어도 9 ㎛, 또는 적어도 10 ㎛의 분해능으로 수행될 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 검출은 개별 표적 분자, 예를 들어 염색체를 구별할 수 있는 분해능으로 수행된다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 핵산, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)는 안정성 또는 다른 유익한 특성을 향상시키기 위해 화학적으로 변형된다. 본 명세서에 기술된 핵산은, 본 명세서에 참조로 통합되는 문헌["Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA"]에 기재된 것과 같은, 당업계에 잘 확립된 방법에 의해 합성 및/또는 변형될 수 있다. 변형은, 예를 들어, (a) 말단 변형, 예를 들어, 5' 말단 변형(인산화, 접합, 역전된 연결 등) 3' 말단 변형(접합, DNA 뉴클레오티드, 역전된 연결 등), (b) 염기 변형, 예를 들어, 안정화 염기, 불안정화 염기, 또는 파트너의 확장된 레퍼토리와 염기쌍을 이루는 염기로의 교체, 염기(무염기성 뉴클레오티드)의 제거, 또는 접합된 염기, (c) 당 변형(예를 들어, 2' 위치 또는 4' 위치) 또는 당의 대체, 뿐만 아니라 (d) 포스포디에스테르 결합의 변형 또는 대체를 포함하는, 백본 변형을 포함한다. 본 명세서에 기재된 실시형태에서 유용한 핵산 화합물의 특정 예는 변형된 골격을 함유하거나 천연 뉴클레오시드간 연결을 함유하지 않는 핵산을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 변형된 골격을 갖는 핵산은 무엇보다도 골격에 인 원자를 갖지 않는 것을 포함한다. 본 명세서의 목적을 위해, 그리고 때때로 당업계에서 참조되는 바와 같이, 뉴클레오사이드간 골격에 인 원자를 갖지 않는 변형된 핵산이 또한 올리고뉴클레오사이드인 것으로 간주될 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 변형된 핵산은 이의 뉴클레오시드간 골격에 인 원자를 가질 것이다.
변형된 핵산 백본은, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포아미데이트 및 아미노알킬포스포아미데이트를 포스포아미데이트, 티오노포스포아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상적인 3'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결된 유사체, 및 역 극성을 갖는 것(여기서 인접한 쌍의 뉴클레오시드 단위는 3'-5'에서 5'-3'로 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결됨)을 포함할 수 있다. 다양한 염, 혼합 염 및 유리산 형태가 또한 포함된다. 내부에 인 원자를 포함하지 않는 변형된 핵산 골격은 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드간 연결, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드간 연결, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오사이드간 연결에 의해 형성된 골격을 갖는다. 이들은 모르폴리노 연결(뉴클레오사이드의 당 부분에서 부분적으로 형성됨)을 갖는 것; 실록산 골격; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아미드 골격; 아미드 골격; 혼합된 N, O, S 및 CH2 구성 부분을 갖는 것, 및 헤테로원자 골격을 갖는 올리고뉴클레오사이드, 특히 --CH2--NH--CH2--, --CH2--N(CH3)--O--CH2--[메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 백본으로 알려짐], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2 -- 및 --N(CH3)--CH2--CH2--[여기서, 천연 포스포디에스테르 골격은 --O--P--O--CH2--로 표시됨]을 포함한다.
변형된 핵산은 또한 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 함유할 수 있다. 본 명세서에 기재된 핵산은 2' 위치에서 하기 중 하나를 포함할 수 있다: OH; F; O-, S- 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬, 여기서 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환 또는 비치환된 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있음. 예시적인 적합한 변형은 O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)·nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2를 포함하고, 여기서 n 및 m은 1 내지 약 10이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, dsRNA는 2' 위치에 다음 중 하나를 포함한다: C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단 그룹, 리포터 그룹(reporter group), 인터칼레이터(intercalator), 핵산의 약동학적 특성을 개선하기 위한 그룹, 또는 핵산의 약력학적 특성을 개선하기 위한 그룹, 및 유사한 특성을 갖는 기타 치환기를 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 변형은 2' 메톡시에톡시(2'-O--CH2CH2OCH3, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로도 공지됨)(Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504) 즉, 알콕시-알콕시 그룹을 포함한다. 또 다른 예시적인 변형은 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉, 하기 본 명세서의 실시예에 기재된 바와 같은 2'-DMAOE로도 알려진 O(CH2)2ON(CH3)2 그룹, 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시(또한 당업계에 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAOEE로도 알려짐), 즉 하기 본 명세서의 실시예에 기재된 바와 같은 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2를 포함한다.
다른 변형은 2'-메톡시(2'-OCH3), 2'-아미노프로폭시(2'-OCH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오로(2'-F)를 포함한다. 유사한 변형이 또한 핵산 상의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 상의 당의 3' 위치 또는 2'-5' 연결된 dsRNA 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 이루어질 수 있다. 핵산은 또한 펜토푸라노실 당 대신에 사이클로부틸 모이어티와 같은 당 모방체를 가질 수 있다.
핵산은 또한 핵염기(당업계에서 간단히 "염기(base)"라고 함) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "비변형된(unmodified)" 또는 "천연(natural)" 핵염기는 퓨린 염기 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 염기 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. 변형된 핵염기는 5-메틸시토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌과 구아닌의 기타 알킬 유도체, 아데닌과 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-다자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함하지만 이에 제한되지 않는 합성 및 천연 핵염기를 포함할 수 있다. 이들 핵염기 중 특정 핵염기는 본 발명에서 특징으로 하는 억제성 핵산의 결합 친화도를 증가시키는 데 특히 유용하다. 이들에는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 0-6 치환된 퓨린이 포함되며, 이에는 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신이 포함된다. 5-메틸시토신 치환은 핵산 이중나선 안정성을 0.6 내지 1.2℃ 증가시키는 것으로 밝혀졌고(Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278), 이것은 더욱 더 특별하게는 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합되는 경우 예시적인 염기 치환이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 변형된 핵염기는 d5SICS 및 dNAM을 포함할 수 있으며, 이는 염기쌍으로서 개별적으로 또는 함께 사용될 수 있는 비천연 핵염기의 비제한적 예이다(예를 들어, Leconte et. al. J. Am. Chem. Soc.2008, 130, 7, 2336-2343; Malyshev et. al. PNAS. 2012. 109 (30) 12005-12010). 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)는 당업계에 공지된 임의의 변형된 핵염기, 즉, 비변형 및/또는 천연 핵염기로부터 변형된 임의의 핵염기를 포함한다.
상기 기재된 변형된 핵산, 골격, 및 핵염기의 제조는 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명에서 특징으로 하는 핵산의 또 다른 변형은 핵산의 활성, 세포 분포, 약동학적 특성, 또는 세포 흡수를 향상시키는 하나 이상의 리간드, 모이어티 또는 접합체에 핵산을 화학적으로 연결하는 것을 포함한다. 이러한 모이어티는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 지질 모이어티, 예컨대 콜레스테롤 모이어티(Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556), 콜산(Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060), 티오에테르, 예를 들어, 베릴-S-트리틸티올(Manoharan et al., Ann. NY Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al. al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770), 티오콜레스테롤(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538), 지방족 쇄, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al., 15 Biochimie :49-54), 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-포스포네이트(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995 , 36:3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969) -973), 또는 아다만탄 아세트산(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654), 팔미틸 모이어티(Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐옥시콜레스테롤 모이어티(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937)를 포함한다.
임의의 양태 중 일부 실시형태에서, 표적 분자, 예를 들어, DNA 표적 분자, RNA 표적 분자, 또는 폴리펩티드 표적 분자의 측정, 및/또는 검출은 대상체로부터 얻은 샘플을 본 명세서에 기재된 것과 같은 시약 또는 시약들과 접촉시키는 단계를 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 시약은 검출가능하게 표지된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 시약은 검출가능한 신호를 생성할 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 시약은 표적 분자가 존재할 때 검출가능한 신호를 생성한다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 시약 중 하나 이상은 검출가능한 표지를 포함할 수 있고/있거나 (예를 들어, 화합물을 검출가능한 생성물로 전환시키는 촉매 반응에 의해) 검출가능한 신호를 생성하는 활성을 포함할 수 있다. 검출가능한 표지는, 예를 들어, 광-흡수 염료, 형광 염료, 또는 방사성 표지를 포함할 수 있다. 검출가능한 표지, 이를 검출하는 방법, 및 본 명세서에 기재된 시약에 이들을 혼입하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 검출가능한 표지, 분자 및/또는 모이어티는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전자기적, 방사선화학적, 또는 화학적 수단, 예컨대 형광, 화학형광, 또는 화학발광, 또는 기타 적절한 수단에 의해 검출될 수 있는 것을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법에 사용된 검출가능한 표지는 1차 표지(여기서 표지는 직접적으로 검출가능하거나 직접적으로 검출가능한 모이어티를 생성하는 모이어티를 포함함) 또는 2차 표지(여기서 검출가능한 표지는 다른 모이어티에 결합하여 검출가능한 신호를 생성하며, 예를 들어, 2차 및 3차 항체를 사용한 면역학적 표지에서 흔히 볼 수 있는 것과 같음)일 수 있다. 검출가능한 표지는 공유 또는 비공유 수단에 의해 시약에 연결될 수 있다. 대안적으로, 검출가능한 표지는 리간드-수용체 결합 쌍 배열 또는 다른 이러한 특이적 인식 분자를 통해 시약에 대한 결합을 달성하는 분자를 직접 표지함으로써 연결될 수 있다. 검출가능한 표지는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 방사성 동위원소, 생물발광 화합물, 발색단, 항체, 화학발광 화합물, 형광 화합물, 금속 킬레이트, 및 효소를 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 검출 시약은 형광성 화합물로 표지된다. 형광 표지된 시약이 적절한 파장의 빛에 노출되면, 형광으로 인해 그 존재를 감지할 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 검출가능한 표지는 형광 염료 분자, 또는 이로만 제한되는 것은 아니지만, 플루오레세인, 피코에리트린, 피코시아닌, o-프탈알데히드, 플루오레스카민, Cy3™, Cy5™, 알로피코시아닌, 텍사스 레드, 페리디닌 클로로필, 시아닌, 피코에리쓰린(phycoerythrin)-Cy5™, 녹색 형광 단백질, 로다민, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 및 오레곤 그린(Oregon Green)™과 같은 탠덤 접합체, 로다민 및 유도체(예를 들어, 텍사스 레드 및 테트라로디민 이소티오시아네이트(TRITC)), 비오틴, AMCA, CyDyes™,, 6-카르복시플루오레세인(일반적으로 약어 FAM 및 F로 알려짐), 6-카르복시-2',4',7',4,7-헥사클로로플루오레세인(HEX), 6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인(JOE 또는 J), N,N,N',N'-테트라메틸-6카르복시로다민(TAMRA 또는 T), 6-카르복시-X-로다민(ROX 또는 R), 5-카르복시로다민-6G(R6G5) 또는 G5), 6-카르복시로다민-6G(R6G6 또는 G6), 및 로다민 110; 시아닌 염료, 예를 들어, Cy3, Cy5 및 Cy7 염료; 쿠마린, 예를 들어, 움벨리페론; 벤즈이미드 염료, 예를 들어, 훽스트(Hoechst) 33258; 페난트리딘 염료, 예를 들어, 텍사스 레드; 에티듐 염료; 아크리딘 염료; 카바졸 염료; 페녹사진 염료; 포르피린 염료; 폴리메틴 염료, 예를 들어, Cy3, Cy5 등과 같은 시아닌 염료; BODIPY 염료 및 퀴놀린 염료를 포함하는, 형광단일 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 검출가능한 표지는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 3H,　125I,　35S,　14C,　32P, 및　33P를 포함하는 방사성 표지일 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 검출가능한 표지는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 양고추냉이 퍼옥시다제 및 알칼리성 포스파타제를 포함하는 효소일 수 있다. 효소 표지는, 예를 들어, 화학발광 신호, 색상 신호 또는 형광 신호를 생성할 수 있다. 항체 시약을 검출가능하게 표지하기 위해 사용되는 것으로 고려되는 효소는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 말산 탈수소효소, 포도상구균 뉴클레아제, 델타-V-스테로이드 이성질화효소, 효모 알코올 탈수소효소, 알파-글리세로포스페이트 탈수소효소, 트리오스 포스페이트 이성질화효소, 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코스 옥시다제, 베타-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스-VI-포스페이트 탈수소효소, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린에스테라제를 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 검출가능한 표지는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 루시게닌, 루미놀, 루시페린, 이소루미놀, 테마릭 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르를 포함하는 화학발광성 표지이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 검출가능한 표지는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 콜로이드성 금 또는 착색 유리 또는 플라스틱(예를 들어, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 및 라텍스) 비드를 포함하는 스펙트럼 비색 표지일 수 있다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 검출 시약은 또한 c-Myc, HA, VSV-G, HSV, FLAG, V5, HIS, 또는 비오틴과 같은 검출가능한 태그로 표지될 수 있다. 다른 검출 시스템, 예를 들어, 비오틴-스트렙타비딘 시스템도 사용할 수 있다. 이 시스템에서, 관심 있는 바이오마커와 면역반응성(즉, 특이적)인 항체는 비오틴화된다. 바이오마커에 결합된 비오틴화된 항체의 양은 스트렙타비딘-퍼옥시다제 접합체 및 발색 기질을 사용하여 결정된다. 이러한 스트렙타비딘 퍼옥시다제 검출 키트는 상업적으로, 예를 들어, DAKO(Carpinteria, CA)에서 입수가능하다. 시약은 또한 152Eu 또는 란탄족 계열의 다른 금속과 같은 형광 방출 금속을 사용하여 검출가능하게 표지될 수 있다. 이러한 금속은 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 금속 킬레이트 그룹을 사용하여 시약에 부착될 수 있다.
사용된 검출 방법(들)은 판독 분자에 사용된 특정 검출가능한 표지에 따라 달라질 수 있다. 특정 예시적인 실시형태에서, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트) 및/또는 이에 결합된 판독 분자를 갖는 염색체 및/또는 염색체 영역은 현미경, 분광 광도계, 튜브 발광계 또는 플레이트 발광계, x-선 필름, 신틸레이터, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 장치, 미세 유체 장치 등을 사용하기 위해 선택 및/또는 스크리닝될 수 있다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 검출 분자는 형광단 또는 형광 화합물을 포함한다. 형광 측정을 위한 시스템 및 장치는 당업계에 잘 알려져 있다. 형광 측정은 적절한 흡수 또는 여기 파장을 포함하는 빛을 방출하는 광원을 필요로 한다. 본 명세서에 기재된 화합물의 흡수 또는 여기 파장은 대략 300 내지 800 nm이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 광원은 300 내지 870 nm의 파장을 포함하거나, 본질적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 광을 방출한다. 빛은 샘플과 접촉하여 샘플 내의 특정 물질(형광단이라고도 함)의 전자를 여기시키고, 물질이 형광 형태로 빛(발광)을 방출하도록 유발한다.
형광 측정을 위한 시스템 또는 디바이스는 이후 방출된 빛을 검출한다. 일부 실시형태에서, 시스템 또는 디바이스는 원하는 파장의 광만이 시스템 또는 장치의 검출기에 도달하도록 필터 또는 모노크로메이터를 포함할 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 시스템 또는 디바이스는 300-800 nm의 파장을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 광을 검출하도록 구성된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 시스템 또는 디바이스는 300-800 nm의 파장을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된 광을 검출하도록 구성된다. 적합한 시스템 및 디바이스는 상업적으로 이용가능하며, 예를 들어, CRAIC(San Dimas, CA)의 20/30 PV™ Microspectrometer 또는 508 PV™ Microscope Spectrometer, Duetta™, FluoroMax™, Fluorolog™, QuantaMaster 8000™, DeltaFlex™, DeltaPro, 또는 Horiba(Irvine, CA)의 Nanolog™, 또는 SP8 Lightning™, SP8 Falcon™, SP8 Dive™, TCS SPE™, HCS A™, 또는 Leica(Buffalo Grove, IL)의 TCS SP8 X™ 을 포함할 수 있다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 형광 현미경법을 사용하여 당업계에 공지된 일상적인 방법을 사용하여 제자리 혼성화의 결과를 검출하고 기록할 수 있다. 대안적으로, 이미지-처리 기능이 있는 디지털(컴퓨터 구현) 형광 현미경을 사용할 수 있다. 복수의 컬러 표지가 결합된 염색체의 FISH를 영상화하기 위한 2개의 잘 알려진 시스템은 다중(multiplex)-FISH(M-FISH) 및 스펙트럼 핵형 분석(SKY)을 포함한다. 다음 문헌 참조: Schrock et al. (1996) Science 273:494; Roberts et al. (1999) Genes Chrom. Cancer 25:241; Fransz et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:14584; Bayani et al. (2004) Curr. Protocol. Cell Biol. 22.5.1-22.5.25; Danilova et al. (2008) Chromosoma 117:345; 미국 특허 제6,066,459호; 및 염색체 페인팅 및 페인팅된 염색체 검출을 위한 방법에 대한 리뷰를 위한 FISH TAG™ DNA 멀티컬러 키트 사용설명서(Molecular probes).
특정 예시적인 실시형태에서, 형광 표지된 염색체의 이미지는 변형(예를 들어, 소프트웨어, Chroma 84000 필터 세트 및 향상된 필터 휠)이 있는 Applied Imaging Corporation CytoVision™ System과 같은 컴퓨터 이미징 시스템을 사용하여 검출 및 기록된다. 다른 적절한 시스템은 문헌[Ried et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1388]에 의해 기재된 대로 처리된 이미지가 있는, Zeiss Axiohot 현미경에 결합된 쿨드(cooled) CCD 카메라(Photometrics, Kodak KAF 1400 CCD가 장착된 NU200 시리즈)를 사용하는 컴퓨터 이미징 시스템을 포함한다. 다른 적절한 이미징 및 분석 시스템은 위의 문헌[Schrock et al. (전게서) 및 Speicher et al. (1996) Nature Genet. 12:368]에 설명되어 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)는 초해상도 현미경(예를 들어, 확률적 광학 재구성 현미경(STORM) 영상화)으로 시각화된다.
본 명세서에 기재된 제자리 혼성화 방법은 세포 주기의 임의의(또는 모든) 단계(들)(예를 들어, 유사분열, 감수분열, 간기, G0, G1, S 및/또는 G2)에 있는 세포에서, 다양한 생물학적 또는 임상적 샘플에 대해 수행될 수 있다. 예에는 모든 유형의 세포 배양물, 동물 또는 식물 조직, 말초 혈액 림프구, 협측 도말, 배양되지 않은 원발성 종양에서 제조된 접촉 제조물, 암세포, 골수, 생검에서 얻은 세포 또는 체액(예를 들어, 혈액, 소변, 가래 등) 중의 세포, 양수로부터의 세포, 모체 혈액으로부터의 세포(예를 들어, 태아 세포), 고환 및 난소로부터의 세포 등을 포함한다. 샘플은 통상적인 기술을 사용하여 본 발명의 분석을 위해 준비되며, 일반적으로 샘플 또는 표본이 채취되는 출처에 따라 달라진다. 이러한 예는 본 명세서에 기재된 방법 및/또는 조성물에 적용가능한 샘플 유형을 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
표적 염색체 서열에 대한 본 발명의 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)의 혼성화는 표준 제자리 혼성화(ISH) 기술에 의해 달성될 수 있다(예를 들어, 다음 문헌 참조: Gall and Pardue (1981) Meth. Enzymol. 21:470; Henderson (1982) Int. Review of Cytology 76:1). 일반적으로, ISH는 다음 주요 단계를 포함한다: (1) 분석하고자 하는 생물학적 구조의 고정(예를 들어, 염색체 스프레드), (2) 표적 DNA의 접근성을 증가시키기 위한 생물학적 구조의 사전 하이브리드화 처리(예를 들어, 열 또는 알칼리로의 변성), (3) (예를 들어, 반복 서열의 혼성화 능력을 차단함으로써) 비특이적 결합을 감소시키기 위한 선택적 사전-혼성화 처리, (4) 생물학적 구조 또는 조직의 핵산에 대한 핵산 혼합물의 혼성화; (5) 혼성화 시 결합되지 않은 핵산 단편을 제거하기 위한 혼성화 후 세척 및 (6) 혼성화된 표지된 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 혼성화된 올리고뉴클레오티드 태그, 예를 들어, 올리고페인트)의 검출. 이러한 각 단계에서 사용되는 시약과 이들의 사용 조건은 특정 상황에 따라 달라진다. 예를 들어, 단계 3은 본 명세서에 기재된 인식 도메인이 반복적인 서열을 피하도록 설계될 수 있기 때문에 항상 필요한 것은 아니다). 혼성화 조건은 또한 미국 특허 제5,447,841호에 기재되어 있다. 제자리 혼성화 프로토콜 및 조건의 다양한 변형이 공지되어 있고 본 명세서에 제공된 지침에 따라 실시자에 의해 본 발명과 함께 사용될 수 있음이 이해될 것이다.
본 명세서에 사용된 것과 같은, 용어 "혼성화(hybridization)"는 2개의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드가 비공유적으로 결합하여 안정한 이중-가닥 폴리뉴클레오티드를 형성하는 과정을 지칭한다. 용어 "혼성화"는 또한 삼중-가닥 혼성화를 지칭할 수도 있다. 생성된 (일반적으로) 이중-가닥 폴리뉴클레오티드는 "하이브리드(hybrid)" 또는 "이중나선(duplex)"이다. "혼성화 조건(Hybridization conditions)"은 일반적으로 약 1 M 미만, 보다 일반적으로 약 500 mM 미만, 훨씬 더 일반적으로 약 200 mM 미만의 염 농도를 포함할 것이다. 혼성화 온도는 5℃만큼 낮을 수 있지만, 전형적으로 22℃ 초과, 보다 전형적으로 약 30℃ 초과, 종종 약 37℃ 초과일 수 있다. 혼성화는 일반적으로 엄격한 조건, 즉, 프로브가 이의 표적 하위서열에 혼성화되는 조건 하에 수행된다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며 상황에 따라 다르다. 더 긴 단편은 특이적 혼성화를 위해 더 높은 혼성화 온도가 필요할 수 있다. 염기 조성 및 상보적 가닥의 길이, 유기 용매의 존재 및 염기 불일치 정도를 비롯한, 다른 요인이 혼성화의 엄격성에 영향을 미칠 수 있으므로, 파라미터의 조합이 임의의 하나 단독의 절대 척도보다 더 중요하다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 Tm보다 약 5℃ 낮도록 선택된다. 예시적인 엄격한 조건은 pH 7.0 내지 8.3 및 적어도 25℃의 온도에서 적어도 0.01 M 내지 1 M 이하의 Na 이온 농도(또는 다른 염)의 염 농도를 포함한다. 예를 들어, 5×SSPE(750 mM NaCl, 50 mM Na 포스페이트, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 25-30℃의 온도의 조건이 대립유전자 특이적 프로브 혼성화에 적합하다. 엄격한 조건에 대해서는, 예를 들어, 다음 문헌 참조: Sambrook, Fritsche and Maniatis, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press (1989) and Anderson Nucleic Acid Hybridization, 1st Ed., BIOS Scientific Publishers Limited (1999). "에 특이적으로 혼성화하는(Hybridizing specifically to)" 또는 "에 특이적으로 혼성화하는(specifically hybridizing to)" 또는 유사한 표현은 해당 서열이 복잡한 혼합물(예를 들어, 전체 세포) DNA 또는 RNA 중에 존재하는 경우 엄격한 조건 하에서 특정 뉴클레오티드 서열 또는 서열들에 실질적으로 또는 이에만 결합, 이중나선화, 또는 혼성화하는 것을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 것과 같은, 용어 "특이적 결합(specific binding)"은 2개의 분자, 화합물, 세포 및/또는 입자 사이의 화학적 상호작용을 지칭하며, 여기서 제1 엔티티는 표적이 아닌 제3 엔티티에 결합하는 것 보다 더 큰 특이성 및 친화도로 제2 표적 엔티티에 결합한다. 일부 실시형태에서, 특이적 결합은 제2 표적 실체에 대한 제1 실체의 친화도를 지칭할 수 있으며, 이는 제3 비표적 엔티티에 대한 친화도에 비해 적어도 10배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 500배, 적어도 1000배 또는 그 이상이다. 주어진 표적에 대해 특이적인 시약은 이용되는 분석 조건 하에서 해당 표적에 대한 특이적 결합을 나타내는 것이다.
본 명세서에 사용된 것과 같은, 용어 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"는 일반적으로 합성 수단에 의해 제조된, 단일-가닥 DNA 또는 RNA 분자를 포함하는 것으로 의도되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 뉴클레오티드는 전형적으로 아데노신, 구아노신, 우리딘, 시티딘 및 티미딘으로부터 유래된 뉴클레오티드와 같은 자연 발생 뉴클레오티드일 것이다. 올리고뉴클레오티드가 "이중-가닥(double-stranded)"으로 언급되는 경우, 한 쌍의 올리고뉴클레오티드가, 예를 들어, DNA와 전형적으로 결합된 수소 결합된 나선 어레이에 존재한다는 것이 당업자에 의해 이해된다. 이중-가닥 올리고뉴클레오티드의 100% 상보적 형태에 추가하여, 본 명세서에 사용된 것과 같은, 용어 "이중-가닥"은 벌지(bulges) 및 루프(loops)와 같은 구조적 특징을 포함하는 형태도 포함하는 것을 의미한다(본 명세서에 그 전문이 모든 목적을 위해 참조로 통합되는, 문헌[Stryer, Biochemistry, Third Ed. (1988)] 참조). 본 명세서에 사용된 것과 같은, 용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 (예를 들어, 혼성화, 결찰, 중합 등에 의해) 함께 연결된 2개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것으로 의도되지만, 이로만 제한되는 것은 아니다.
핵산 및 리보핵산(RNA) 분자는, 당업계에 잘 알려진, 다수의 절차 중 임의의 것을 사용하여 특정 생물학적 샘플에서 분리할 수 있으며, 특정 분리 절차는 특정 생물학적 시료에 적합하도록 선택된다. 예를 들어, 동결-해동 및 알칼리 용해 절차는 고체 물질로부터 핵산 분자를 얻는 데 유용할 수 있고; 열 및 알칼리 용해 절차는 소변에서 핵산 분자를 얻는 데 유용할 수 있고; 단백질분해효소 K 추출은 혈액으로부터 핵산을 얻는 데 사용될 수 있다(Roiff, A et al. PCR: Clinical Diagnostics and Research, Springer (1994)).
특정 예시적인 실시형태에서, 범용 프라이머를 사용하여, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)와 같은 핵산 서열을 증폭할 수 있다. 용어 "범용 프라이머(universal primers)"는 복수의 폴리뉴클레오티드의 쇄 연장/증폭에 사용될 수 있는 프라이머 세트(예를 들어, 정방향 및 역방향 프라이머)를 지칭하며, 예를 들어, 프라이머는 복수의 폴리뉴클레오티드에 공통적인 부위에 혼성화한다. 예를 들어, 범용 프라이머는 단일 풀에서 모든, 또는 본질적으로 모든 폴리뉴클레오티드의 증폭에 사용될 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 동일한 서열을 갖는다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 정방향 프라이머의 서열은 역방향 프라이머의 서열과 상이하다. 또 다른 양태에서, 복수의 범용 프라이머, 예를 들어, 수십개, 수백개, 수천개 또는 그 이상의 것이 제공된다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 범용 프라이머는 효소적 또는 화학적 절단을 통한 증폭 후에 제거될 수 있는 임시적인 프라이머일 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 범용 프라이머는 효소적 또는 화학적 절단을 통한 증폭 후에 제거될 수 있는 임시적인 프라이머일 수 있다. 다른 실시형태에서, 범용 프라이머는 쇄 연장 시 폴리뉴클레오티드 분자에 통합되는 변형을 포함할 수 있다. 예시적인 변형은, 예를 들어, 3' 또는 5' 말단 캡, 표지(예를 들어, 플루오레세인), 또는 태그(예를 들어, 비오틴 등과 같은 폴리뉴클레오티드의 고정화 또는 단리를 용이하게 하는 태그)를 포함한다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열의 증폭을 포함한다. 증폭 방법은 혼성화 및 사슬 연장을 촉진하는 조건 하에서 핵산에 특이적으로 혼성화하는 하나 이상의 프라이머(예를 들어, 범용 프라이머)와 핵산을 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 핵산 증폭을 위한 예시적인 방법은 중합효소 연쇄 반응(PCR)(예를 들어, Mullis et al. (1986) Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 51 Pt 1:263 and Cleary et al. (2004) Nature Methods 1:241; 및 미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호 참조), 앵커 PCR, RACE PCR, 결찰 연쇄 반응(LCR)(예를 들어, Landegran et al.(1988) Science 241:1077-1080; 및 Nakazawa et al. al.(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:360-364), 자가 지속 서열 복제(Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874), 전사 증폭 시스템(Kwoh et al.(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173), Q-베타 복제효소(Lizardi et al.(1988) BioTechnology 6:1197), 재귀적(recursive) PCR(Jaffe et al.(2000) J. Biol. Chem. 275:2619, 및 Williams et al.(2002) J. Biol. Chem. 277:7790), 미국 특허 제6,391,544호, 제6,365,375호, 제6,294,323호, 제6,261,797호, 제6,124,090호 및 제5,612,199호에 기재된 증폭 방법, 또는 당업자에게 잘 알려진 기술을 사용하는 임의의 다른 핵산 증폭 방법을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 PCR 증폭을 이용한다.
일반적으로, PCR 절차는 (i) 핵산 샘플 또는 라이브러리 내의 특정 유전자 또는 서열에 대한 프라이머의 서열-특이적 혼성화, (ii) 열안정성 DNA 중합효소를 사용한 어닐링, 신장, 및 변성의 복수의 라운드를 포함하는 연이은 증폭, 및 (iii) PCR 생성물을 정확한 크기의 밴드에 대해 스크리닝하는 것으로 구성된 유전자 증폭을 설명한다. 사용된 프라이머는 중합 개시를 제공하기에 충분한 길이와 적절한 서열의 올리고뉴클레오티드이며, 즉, 각각의 프라이머는 증폭될 게놈 유전자좌의 가닥에 상보적이도록 특별히 설계된다. 대안적인 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자 발현 생성물의 mRNA 수준은 역전사(RT) PCR 및 정량적 RT-PCR(QRT-PCR) 또는 실시간 PCR 방법에 의해 결정될 수 있다. RT-PCR 및 QRT-PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)는 (예를 들어, PCR 및/또는 범용 프라이밍 영역을 통해) 반드시 증폭되지는 않는다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 기재된 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)는 새로(de novo) 합성될 수 있고, "튜브로부터 바로" 사용할 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 새롭 합성하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 명세서에 사용된 "올리고뉴클레오티드 합성(oligonucleotide synthesis)"은 정의된 화학 구조를 갖는 비교적 짧은 핵산 단편의 화학적 합성을 지칭한다. 비제한적인 예로서, 올리고뉴클레오티드 합성 방법은 포스포라미다이트 고상 합성, 포스포라미다이트 합성, 포스포디에스테르 합성, 포스포트리에스테르 합성, 또는 포스파이트 트리에스테르 합성을 포함한다. 예를 들어, 다음 문헌 참조: Beaucage et al. Tetrahedron Volume 48, Issue 12, 20 March 1992, Pages 2223-2311; Caruthers, J Biol Chem. 2013 Jan 11, 288(2):1420-7. 일부 실시형태에서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 별도로 합성된다. 일부 실시형태에서, 전체 올리고뉴클레오티드 세트는 하나의 반응으로 합성된다. 일부 실시형태에서, 전체 올리고뉴클레오티드 세트의 서브세트는 하나의 반응으로 합성된다. 일부 실시형태에서, 전체 올리고뉴클레오티드 세트는 복수의, 개별 반응으로 합성된다. 일부 실시형태에서, 반응 생성물은, 원하는 올리고뉴클레오티드를 고순도로 수득하기 위해, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 단리된다.
특정 예시적 실시형태에서, 키트가 제공된다. 본 명세서에 사용된 것과 같은, 용어 "키트"는 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트), 판독 분자, 및/또는 본 명세서에 기재된 방법을 수행하기 위한 시약을 전달하기 위한 임의의 전달 시스템을 지칭한다. 분석과 관련하여, 이러한 키트는 반응 시약(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 태그, 판독 분자, 프라이머(예를 들어, 존재하는 모든 올리고뉴클레오티드 태그에 특이적인 프라이머 및/또는 올리고뉴클레오티드 태그 서열의 하나 이상의 서브세트에 특이적인 프라이머의 하나 이상의 서브세트), 하나 이상의 검출 및/또는 검색가능한 표지가 결합된 프라이머), 올리고뉴클레오티드가 결합된 지지체(예를 들어, 마이크로어레이, 팔레트 등), 또는 기타의 것) 중 하나 이상을 제공하는 인클로저) 및/또는 보조(supporting) 재료(예를 들어, 완충액, 본 명세서에 기재된 분석을 수행하기 위한 서면 지침, 또는 기타의 것을 제공하는 인클로저)를 한 위치에서 다른 위치로의 저장, 운송, 또는 전달을 가능하게 하는 시스템을 포함한다. 예를 들어, 키트는 관련 반응 시약 및/또는 본 명세서에 기재된 분석을 위한 지원 재료를 포함하는 하나 이상의 인클로저(예를 들어, 상자)를 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 키트는 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 염색체) 또는 하나 이상의 표적 뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 영역(예를 들어, 서브염색체 영역)에 특이적인 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)를 포함한다. 한 양태에서, 본 발명의 키트는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)에 특이적인 판독 분자를 포함한다. 또 다른 양태에서, 키트는 하나 이상의 프라이머 서열, 그에 부착된 복수의 합성 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 지지체, 및 하나 이상의 검출가능 및/또는 회수가능한 표지를 포함한다. 이러한 내용물은 의도된 수령자에게 함께 또는 개별적으로 전달될 수 있다. 예를 들어, 제1 용기는 분석에 사용하기 위한 프라이머 서열을 포함할 수 있는 반면, 제2 용기는 복수의 합성 올리고뉴클레오티드 서열이 부착된 지지체를 포함할 수 있다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 키트는 이에 결합된 복수의 특정 올리고뉴클레오티드 서열(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트) 및/또는 판독 분자)을 갖는 하나 이상의 어레이 및/또는 팔레트를 제공한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 어레이 및/또는 팔레트는 게놈(예를 들어, 인간 게놈)에서 결합 패턴 세트에 특이적인 복수의 올리고뉴클레오티드 태그 서열(예를 들어, 올리고페인트)을 제공한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 어레이 또는 팔레트는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 장애와 관련된 소정 세트의 염색체 이상(예를 들어, 전위, 삽입, 역위, 결실, 중복, 전위, 이수성, 배수성, 복합 재배열 및 텔로미어 손실)에 특이적이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키트는 (예를 들어, 환자 진단 및/또는 예후, 산전 진단 및/또는 예후 등을 위한) 임상 환경(예를 들어, 병원, 의료 클리닉, 진료소, 진단 실험실, 연구 실험실 등)에서 본 명세서에 기재된 하나 이상의 장애를 검출하기 위한 진단 및/또는 예후 용도에 특히 적합하다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 키트는 키트 내에 제공된 복수의 특정 올리고뉴클레오티드 태그 서열(예를 들어, 올리고페인트)을 증폭하기 위한 지침을 제공한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 키트는 증폭된 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트)를 사용하여 하나 이상의 표적 핵산 서열(예를 들어, 하나 이상의 염색체 또는 하위 염색체 영역)을 검출가능하고/하거나 추적가능하게 표지하기 위한 지침을 제공한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 키트는 올리고뉴클레오티드 태그(예를 들어, 올리고페인트) 및 판독 분자를 사용하여 하나 이상의 표적 핵산 서열(예를 들어, 하나 이상의 염색체 또는 서브염색체 영역)을 검출가능하게 및/또는 추적가능하게 표지하기 위한 지침을 제공한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 키트는 제거하길 원하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 하나 이상의 비표지된 증폭 프라이머를 포함함으로써 증폭 단계 동안 하나 이상의 복수의 특정 올리고뉴클레오티드 태그 서열(예를 들어, 올리고페인트)를 효과적으로 제거하기 위한 지침을 제공하여, 하나 이상의 표적 핵산 서열이 검출가능하게 및/또는 추적가능하게 표지되지 않도록 한다.
임의의 양상의 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 시스템 및 방법은 임의의 유형의 하드웨어 및/또는 소프트웨어로 구현될 수 있고, 사전-프로그래밍된 범용 컴퓨팅 디바이스일 수 있다. 예를 들어, 시스템은 서버, 개인용 컴퓨터, 휴대용 컴퓨터, 씬 클라이언트(thin client), 또는 임의의 적절한 디바이스 또는 디바이스들을 사용하여 구현될 수 있다. 본 개시내용 및/또는 이의 구성요소는 단일 위치에 있는 단일 디바이스일 수 있거나, 또는 무선 방식으로 또는 전기 케이블, 광섬유 케이블과 같은 임의의 통신 매체를 통해 임의의 적절한 통신 프로토콜을 사용하여 함께 연결된 단일 또는 복수의 위치에 있는 복수의 디바이스일 수 있다.
또한 본 개시내용은 특정 기능을 수행하는 복수의 모듈을 갖는 것으로 본 명세서에서 설명되고 논의된다는 점에 유의해야 한다. 이러한 모듈은 명확성을 위한 목적으로만 기능을 기반으로 개략적으로 설명되어 있으며, 반드시 특정 하드웨어 또는 소프트웨어를 나타내는 것은 아님을 이해해야 한다. 이와 관련하여, 이들 모듈은 논의된 특정 기능을 실질적으로 수행하도록 구현된 하드웨어 및/또는 소프트웨어일 수 있다. 또한, 모듈은 본 개시 내에서 함께 결합되거나, 또는 원하는 특정 기능에 기초하여 추가 모듈로 분할될 수 있다. 따라서, 본 개시는 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 하며, 단지 하나의 예시적인 구현예를 제시하는 것으로 이해되어야 한다.
컴퓨팅 시스템은 클라이언트 및 서버를 포함할 수 있다. 클라이언트와 서버는 일반적으로 서로 멀리 떨어져 있으며 일반적으로 통신 네트워크를 통해 상호작용한다. 클라이언트와 서버의 관계는 각각의 컴퓨터에서 실행되고 서로 클라이언트-서버 관계를 갖는 컴퓨터 프로그램 덕분에 발생한다. 일부 구현예에서, 서버는 (예를 들어, 클라이언트 디바이스에 데이터를 표시하고 클라이언트 디바이스와 상호작용하는 사용자로부터 사용자 입력을 수신하기 위한 목적으로) 데이터(예를 들어, HTML 페이지)를 클라이언트 디바이스로 전송한다. 클라이언트 디바이스에서 생성된 데이터(예를 들어, 사용자 상호작용의 결과)는 서버에서 클라이언트 디바이스로부터 수신될 수 있다.
본 명세서에 기재된 발명 주제의 구현은, 예를 들어, 데이타 서버로서, 백엔드 구성요소를 포함하거나, 미들웨어 구성요소, 예를 들어, 애플리케이션 서버를 포함하거나, 또는 프론트 엔드 구성요소, 예를 들어, 사용자가 본 명세서에 기재된 발명 주제의 구현과 상호 작용할 수 있는 그래픽 사용자 인터페이스 또는 웹 브라우저가 있는 클라이언트 컴퓨터, 또는 하나 이상의 이러한 백엔드, 미들웨어, 또는 프런트 엔드 구성 요소의 임의의 조합을 포함하는 컴퓨팅 시스템에서 구현될 수 있다. 시스템의 구성요소는 디지털 데이터 통신의 임의의 형태 또는 매체, 예를 들어, 통신 네트워크에 의해 상호 연결될 수 있다. 통신 네트워크의 예는 근거리 통신망("LAN") 및 광역 통신망("WAN"), 상호-네트워크(예를 들어, 인터넷) 및 피어-투-피어 네트워크(예를 들어, 애드 호크 피어-투-피어 네트워크)를 포함한다.
본 명세서에 기재된 발명 주제 및 동작의 구현은 본 명세서에 개시된 구조 및 이들의 구조적 균등물을 포함하는, 디지털 전자 회로, 또는 컴퓨터 소프트웨어, 펌웨어 또는 하드웨어에서, 또는 이들의 하나 이상의 조합으로 구현될 수 있다. 본 명세서에 기술된 발명 주제의 구현은 하나 이상의 컴퓨터 프로그램, 즉, 데이터 처리 장치에 의한 실행을 위해, 또는 이의 동작을 제어하기 위해 컴퓨터 저장 매체에 코딩된, 컴퓨터 프로그램 명령의 하나 이상의 모듈로 구현될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 프로그램 명령은 인공적으로 생성된 전파 신호, 예를 들어, 데이터 처리 장치에 의한 실행을 위해 적절한 수신기 장치로 전송하기 위한 정보를 코딩하도록 생성된 머신-생성 전기적, 광학적 또는 전자기적 신호에 코딩될 수 있다. 컴퓨터 저장 매체는 컴퓨터-판독가능 저장 장치, 컴퓨터-판독가능 저장 기판(substrate), 랜덤 또는 직렬 액세스 메모리 어레이 또는 디바이스, 또는 이들 중 하나 이상의 조합일 수 있거나, 또는 이에 포함될 수 있다. 더욱이, 컴퓨터 저장 매체는 전파 신호가 아니지만, 컴퓨터 저장 매체는 인위적으로 생성된 전파 신호로 코딩된 컴퓨터 프로그램 명령의 소스 또는 목적지가 될 수 있다. 컴퓨터 저장 매체는 또한 하나 이상의 개별 물리적 구성요소 또는 매체(예를 들어, 복수의 CD, 디스크 또는 기타 저장 장치)일 수 있거나, 도는 이에 포함될 수 있다.
본 명세서에 기재된 동작은 하나 이상의 컴퓨터 판독가능 저장 장치에 저장되거나 다른 소스로부터 수신된 데이터에 대해 "데이터 처리 장치(data processing apparatus)"에 의해 수행되는 동작으로 구현될 수 있다.
"데이터 처리 장치"라는 용어는, 예를 들어, 프로그래밍가능한 프로세서, 컴퓨터, 시스템 온 칩, 또는 상기한 것들의, 여러가지, 또는 이들의 조합을 포함하는, 모든 종류의 데이터 처리용 장치, 디바이스, 및 머신을 포괄한다. 장치는 특수 목적 논리 회로, 예를 들어, FPGA(필드 프로그래밍가능한 게이트 어레이) 또는 ASIC(특정 용도용 집적 회로)을 포함할 수 있다. 장치는 또한 하드웨어 외에, 문제의 컴퓨터 프로그램에 대한 실행 환경을 생성하는 코드, 예를 들어, 프로세서 펌웨어, 프로토콜 스택, 데이터베이스 관리 시스템, 운영 체제, 플랫폼 간 런타임 환경, 가상 머신, 또는 이들 중 하나 이상의 조합을 구성하는 코드를 포함할 수 있다. 장치 및 실행 환경은 웹 서비스, 분산 컴퓨팅 및 그리드 컴퓨팅 인프라스트럭처와 같은, 다양한 다른 컴퓨팅 모델 인프라스트럭처를 실현할 수 있다.
컴퓨터 프로그램(프로그램, 소프트웨어, 소프트웨어 애플리케이션, 스크립트, 또는 코드로도 알려짐)은 컴파일 또는 해석된 언어, 선언적 또는 절차적 언어를 포함하는 임의의 형태의 프로그래밍 언어로 작성될 수 있으며, 독립 실행형 프로그램 또는 모듈, 구성요소, 서브루틴, 개체, 또는 컴퓨팅 환경에서 사용하기에 적합한 기타 유닛을 포함하는, 임의의 형태로 배포될 수 있다. 컴퓨터 프로그램은 파일 시스템의 파일에 대응할 수 있지만 반드시 그런 것은 아니다. 프로그램은 다른 프로그램이나 데이터(예를 들어, 마크업(markup) 언어 문서에 저장된 하나 이상의 스크립트)를 보유하는 파일의 일부, 해당 프로그램 전용 단일 파일, 또는 복수의 조정된 파일(예를 들어, 하나 이상의 모듈, 하위 프로그램 또는 코드 부분을 저장하는 파일)에 저장될 수 있다. 컴퓨터 프로그램은 하나의 컴퓨터 또는 한 사이트에 있거나 여러 사이트에 분산되어 있고 통신 네트워크로 상호연결된 복수의 컴퓨터에서 실행되도록 배포될 수 있다.
본 명세서에 기재된 프로세스 및 논리 흐름은 입력 데이터에 대해 동작하고 아웃풋을 생성함으로써 동작을 수행하기 위해 하나 이상의 컴퓨터 프로그램을 실행하는 하나 이상의 프로그래밍가능한 프로세서에 의해 수행될 수 있다. 프로세스 및 논리 흐름은 특수 목적 논리 회로, 예를 들어, FPGA(필드 프로그래밍가능한 게이트 어레이) 또는 ASIC(특정 용도용 집적 회로)에 의해 수행될 수 있고, 장치는 상기한 것으로 구현될 수도 있다.
컴퓨터 프로그램의 실행에 적합한 프로세서는, 예를 들어, 일반적 및 특수 목적 마이크로프로세서, 및 임의의 종류의 디지털 컴퓨터의 임의의 하나 이상의 프로세서를 포함한다. 일반적으로, 프로세서는 읽기 전용 메모리 또는 랜덤 액세스 메모리 또는 둘 다에서 명령과 데이터를 수신한다. 컴퓨터의 필수 요소는 명령에 따라 동작을 수행하기 위한 프로세서와 명령 및 데이터를 저장하기 위한 하나 이상의 메모리 디바이스이다. 일반적으로, 컴퓨터는 또한 데이터를 저장하기 위한 하나 이상의 대용량 저장 디바이스, 예를 들어, 자기, 광자기 디스크, 또는 광 디스크를 포함하거나, 또한 전술한 것으로부터 데이터를 수신하거나 이들로 데이터를 전송하거나, 둘 다를 하기 위해 작동가능하게 연결된다. 그러나, 컴퓨터는 이러한 디바이스를 필요로 하지 않는다. 또한, 컴퓨터는 또다른 디바이스, 단지 몇 가지만 언급하면, 예를 들어, 이동 전화, 개인용 정보 단말기(PDA), 모바일 오디오 또는 비디오 플레이어, 게임 콘솔, GPS(Global Positioning System) 수신기, 또는 휴대용 저장 디바이스(예를 들어, USB(범용 직렬 버스) 플래시 드라이브)에 내장될 수 있다. 컴퓨터 프로그램 명령 및 데이터를 저장하기에 적합한 디바이스는 모든 형태의 비휘발성 메모리, 매체 및 메모리 디바이스를 포함하며, 일예로, 반도체 메모리 장치, 예를 들어, EPROM, EEPROM 및 플래시 메모리 디바이스; 자기 디스크, 예를 들어, 내부 하드 디스크 또는 이동식 디스크; 자기 광 디스크; 및 CD ROM 및 DVD-ROM 디스크를 포함한다. 프로세서와 메모리는 특수 목적 논리 회로에 의해 보완되거나, 또는 통합될 수 있다.
편의를 위해, 명세서, 실시예, 및 첨부된 청구범위에 사용된 일부 용어 및 문구의 의미는 아래에 제공된다. 달리 명시되지 않거나, 문맥에서 암시되지 않는 한, 다음 용어 및 문구에는 아래 제공된 의미가 포함된다. 정의는 특정 실시형태를 기술하는 데 도움을 주기 위해 제공되고, 청구된 발명을 제한하려는 의도가 아니며, 그 이유는 본 발명의 범위는 청구범위에 의해서만 제한되기 때문이다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 해당 기술 분야에서 용어의 사용과 본 명세서에 제공된 정의 사이에 명백한 불일치가 있는 경우 명세서 내에서 제공된 정의가 우선한다.
편의를 위해, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에서, 본 명세서에 사용된 특정 용어는 여기에 모여있다.
본 명세서에 사용된 것과 같은, 용어 "염색체"는 DNA, 단백질, RNA 및 기타 관련 인자를 포함하는 살아있는 세포에서 유전성(heredity)을 운반하는 유전자에 대한 지지체를 지칭한다. 인간 게놈의 염색체를 식별하고 넘버링하기 위한 통상적인 국제 시스템이 본 명세서에 사용된다. 개별 염색체의 크기는 복수-염색체 게놈 내에서 그리고 게놈마다 다를 수 있다. 염색체는 임의의 종에서 얻을 수 있다. 염색체는 성인 대상체, 청소년 대상체, 유아 대상체로부터, 태어나지 않은 대상체(예를 들어, 태아, 예를 들어, 양수천자, 융모막 융모 샘플링 등과 같은 산전 검사를 통해 또는 태아, 예를 들어 태아 수술 동안)로부터, 생물학적 샘플(예를 들어, 생물학적 조직, 체액 또는 세포(예를 들어, 가래, 혈액, 혈액 세포, 조직 또는 미세 바늘 생검 샘플, 소변, 뇌척수액, 복막액 및 흉수, 또는 이로부터의 세포), 또는 세포 배양 샘플(예를 들어, 1차 세포, 불멸화 세포, 부분 불멸화 세포 등)로부터 얻을 수 있다. 특정 예시적인 실시형태에서, 하나 이상의 염색체는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 호모(Homo), 드로소필라(Drosophila), 카이노하비디티스(Caenorhabiditis), 다니오(Danio), 시피누스(Cyprinus), 에쿠스(Equus), 캐니스(Canis), 오비스(Ovis), 오코린쿠스(Ocorynchus), 살모(Salmo), 보스(Bos), 수스(Sus), 갈루스(Gallus), 솔라눔(Solanum), 트리티크(Triticum), 오리자(Oryza), 제아(Zea), 호르데움(Hordeum), 뮤사(Musa), 아베나(Avena), 포플러스(Populus), 브라시카(Brassica), 사카룸(Saccharum) 등을 포함하는 하나 이상의 속으로부터 얻을 수 있다.
본 명세서에 사용된 것과 같은, 용어 "염색체 밴딩(chromosome banding)"은 개별 염색체 또는 염색체 영역(즉, "밴딩 패턴")에 특징적인, 구별가능한 (예를 들어, 다르게 또는 교대로 채색된) 영역의 가로(transverse) 밴드 패턴을 초래하는 염색체의 차별적 염색을 지칭한다. 기존의 밴딩 기법은 G-밴딩(김사 염색), Q-밴딩(퀴나크린 머스타드 염색), R-밴딩(리버스-김사) 및 C-밴딩(센트로미어 밴딩)을 포함한다.
본 명세서에 사용된 것과 같은, 용어 "핵형(karyotype)"은 염색체의 수 및 형태 둘 다에 의해 정의되는 바와 같이, 주어진 종의 개별 세포, 세포주 또는 게놈의 염색체 특성을 지칭한다. 핵형은 전위, 삽입 전위, 역위, 결실, 복제, 전위, 이수성, 복합 재배열, 텔로미어 손실 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 염색체 재배열을 나타낼 수 있다. 일반적으로 핵형은 현미경 사진 또는 컴퓨터 생성 이미지에서 의향 또는 중기(또는 축약된) 염색체의 체계적인 배열로 표시된다. 간기 염색체도 검사할 수 있다.
본 명세서에 사용된 것과 같은, 용어 "염색체 이상(chromosomal aberration)" 또는 "염색체 비정상(chromosome abnormality)"은 대상 염색체 또는 핵형의 구조와 정상(즉, 비-이상) 상동 염색체 또는 핵형 사이의 편차를 지칭한다. 편차는 단일 염기쌍 또는 많은 염기쌍일 수 있다. 염색체 또는 핵형을 언급할 때, 용어 "정상(normal)" 또는 "비-이상(non-aberrant)"은 특정 종 및 성별의 건강한 개체에서 발견되는 핵형 또는 밴딩 패턴을 나타낸다. 염색체 비정상은 본질적으로 수치적 또는 구조적인 것일 수 있으며, 이수성, 배수성, 역전, 전위, 결실, 중복 등을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 염색체 비정상은 병리학적 상태의 존재 또는 병리학적 상태를 발전시키는 소인과 상관관계가 있을 수 있다. 염색체 이상 및/또는 비정상은 또한 질병, 장애 및/또는 표현형 변화와 관련이 없는 변화를 지칭할 수 있다. 이러한 이상 및/또는 비정상은 드물거나 낮은 빈도로 나타날 수 있다(예를 들어, 집단의 몇 퍼센트(예를 들어, 다형성)).
하나 이상의 염색체 비정상과 관련된 장애는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 상염색체 비정상(예를 들어, 삼염색체(다운 증후군(염색체 21)), 에드워드 증후군(염색체 18), 파타우 증후군(염색체 13), 삼염색체 9, 와카니 증후군(염색체 8), 삼염색체 22/고양이 눈 증후군, 삼염색체 16); 일염색체 및/또는 결실(월프-허쉬호른증후군 증후군(염색체 4), 크리 듀 샤(Cri du chat)/염색체 5q 결실 증후군(염색체 5), 윌리엄스 증후군(염색체 7), 야콥센(Jacobsen) 증후군(염색체 11), 밀러-디커 증후군/스미스-마제니스 증후군(염색체 17), 디 죠지 증후군(염색체 22), 게놈 각인(앙겔만 증후군/프레더-윌리 증후군(염색체 15))); X/Y-연관 이상(예를 들어, 일염색체(터너 증후군(XO), 삼염색체 또는 사염색체 및/또는 기타 핵형 또는 모자이크(클라인펠터 증후군(47(XXY)), 48(XXYY), 48(XXXY), 49(XXXYY), 49(XXXXY), 삼중 X 증후군(47(XXX)), 48(XXXX), 49(XXXXX), 47(XYY), 48(XYYY), 49(XYYYY), 46(XX/XY)); 전위(예를 들어, 백혈병 또는 림프종(예를 들어, 림프종(예를 들어, 버킷 림프종 t(8 MYC; 14 IGH)), 여포성 림프종 t(14 IGH; 18 BCL2), 외투 세포 림프종/다발성 골수종 t(11 CCND1; 14 IGH), 역형성 거대 세포 림프종 t(2 ALK; 5 NPM1), 급성 림프모구성 백혈병) 또는 골수성(예를 들어, 필라델피아 염색체 t(9 ABL; 22 BCR), 성숙을 동반한 급성 골수모구성 백혈병 t(8 RUNX1T1;21 RUNX1), 급성 전골수구성 백혈병 t(15 PML,17 RARA), 급성 거핵모구성 백혈병 t(1 RBM15;22 MKL1))) 또는 기타(예를 들어, 유잉 육종 t(11 FiI1; 22 EWS), 활액 육종 t(x SYT;18 SSX), 융기피부섬유육종(dermatofibrosarcoma protuberans) t(17 COL1A1; 22 PDGFB), 점액성 지방육종 t(12 DDIT3; 16 FUS), 결합조직형성 원형소세포 종양(desmoplastic small round cell tumor) t(11 WT1; 22 EWS), 폐포 횡문근육종 t(2 PAX3; 13 FOXO1) t (1 PAX7; 13 FOXO1))); 생식선 이형성증(예를 들어, 혼합 생식선 이형성증, XX 생식선 이형성증); 및 기타 비정상(예를 들어, 취약 X 증후군, 편부모 이염색체)를 포함한다. 하나 이상의 염색체 비정상과 관련된 장애는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 베크위드-위드만(Beckwith-Wiedmann) 증후군, 아가미-귀-신장(branchio-oto-renal) 증후군, 크리-듀-샤 증후군, 드 랑제(De Lange) 증후군, 전전뇌증(holoprosencephaly), 루빈스타인-테이비(Rubinstein-Taybi) 증후군 및 WAGR 증후군을 포함한다.
하나 이상의 염색체 비정상과 관련된 장애는 또한 세포 증식 장애(예를 들어, 암)를 포함한다. 본 명세서에 사용된 것과 같은, 용어 "세포 증식성 장애"는 다세포 유기체에서 세포의 하나 이상의 서브세트(들)의 바람직하지 않거나 부적절한 증식을 특징으로 하는 장애를 포함한다. 용어 "암"은 다양한 유형의 악성 신생물을 말하며, 이들 중 대부분이 주변 조직을 침범할 수 있고, 다른 부위로 전이될 수 있다(예를 들어, PDR Medical Dictionary 1st edition, 1995 참조). 용어 "신생물" 및 "종양"은 정상보다 더 빠르게 세포 증식에 의해 성장하고 증식을 개시시킨 자극이 제거된 후에도 계속 성장하는 비정상 조직을 지칭한다(예를 들어, PDR Medical Dictionary 1st edition, 1995 참조). 이러한 비정상 조직은 양성(즉, 양성 종양) 또는 악성(즉, 악성 종양)일 수 있는 정상 조직과의 구조적 조직 및 기능적 조정이 부분적으로 또는 완전히 결여되어 있음을 보여준다.
하나 이상의 염색체 이상과 관련된 장애는 또한 청각 신경종, 후천적 뇌 손상, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 질환, 동맥류, 실어증, 동정맥 기형, 주의력 결핍 과잉 행동 장애, 자폐증 바텐병, 베체트병, 안검경련, 뇌종양, 뇌성마비 샤르코-마리-투스병, 키아리(chiari) 기형, CIDP, 비-알츠하이머형 치매, 자율신경실조증, 난독증, 언어장애, 근긴장이상, 간질, 본태성 떨림, 프리드리히 운동실조(Friedrich's ataxia), 고셔병, 길랑-바레(Gullian-Barre) 증후군, 두통, 편두통, 헌팅턴병, 수두증, 메니에르병, 운동신경질환, 다발성 경화증, 근이영양증, 중증 근무력증(myasthenia gravis), 기면증, 파킨슨병, 말초신경병증, 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy), 하지불안 증후군, 레트 증후군, 정신분열증, 샤이 드래거(Shy Drager) 증후군, 뇌졸중, 지주막하출혈, 시드넘 증후군(Sydenham's syndrome), 테이삭스병(Tay-Sachs disease), 뚜렛 증후군, 일과성 허혈발작, 횡척수염(transverse myelitis), 삼차신경통, 결절경화증 및 폰히펠린다우증후군(von Hippel-Lindau syndrome)을 포함하나 이에 제한되지 않는 뇌 장애를 포함한다.
용어 "감소하다(decrease)", "감소된(reduced)", "감소(reduction)" 또는 "억제하다(inhibit)"는 모두 통계적으로 유의한 양만큼 감소를 의미하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 일부 실시형태에서, "감소되다(reduce)", "감소(reduction)" 또는 "감소하다(decrease)" 또는 "억제하다(inhibit)"는 일반적으로 참조 수준(예를 들어, 주어진 치료제 또는 작용제의 부재)과 비교하여 적어도 10% 감소를 의미하고, 예를 들어, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 그 이상의 감소를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "감소(reduction)" 또는 "억제(inhibition)"는 참조 수준과 비교하여 완전한 억제 또는 감소를 포함하지 않는다. "완전한 억제"는 참조 수준과 비교하여 100% 억제이다. 감소는 바람직하게는 주어진 장애가 없는 개체에 대해 정상 범위 내로 허용되는 수준까지 저하될 수 있다.
용어 "증가된(increased)", "증가하다(increase)", "향상시키다(enhance)", 또는 "활성화하다(activate)"는 모두 정적으로 유의한 양만큼 증가를 의미하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 일부 실시형태에서, 용어 "증가된(increased)", "증가하다(increase)", "향상시키다(enhance)", 또는 "활성화하다(activate)"는 참조 수준과 비교하여 적어도 10%의 증가, 예를 들어, 참조 수준과 비교하여 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 또는 이를 포함하여 최대 100% 증가 또는 10-100% 사이의 임의의 증가, 또는 참조 수준과 비교하여 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배, 또는 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 증가, 또는 2배 내지 10배 이상의 임의의 증가를 의미할 수 있다. 마커 또는 증상과 관련하여, "증가하다"는 이러한 수준의 통계적으로 유의한 증가이다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 참조 샘플 또는 수준은 본 명세서에 기재된 조성물과 접촉되기 전의 샘플 또는 샘플 자체의 수준이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 참조 샘플 또는 수준은 샘플과 접촉되기 전에 본 명세서에 기재된 샘플 또는 조성물의 수준이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 참조는 검출 분자를 포함하지 않는 조성물과 접촉된 샘플일 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 참조는 샘플에 특이적이지 않은 인식 도메인을 포함하는 조성물과 접촉된 샘플일 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 참조는 또한 대조군 샘플, 대조군 개체의 풀링된 샘플, 또는 이에 기초한 수치 값 또는 값 범위로부터 수득된 수준일 수 있다.
본 명세서에 사용된 "대상체(subject)"은 인간 또는 동물을 의미한다. 일반적으로 동물은 영장류, 설치류, 가축 또는 사냥감 동물과 같은 척추동물이다. 영장류는 침팬지, 사이노몰구스 원숭이, 거미 원숭이, 마카크, 예를 들어, 붉은털 원숭이(Rhesus)를 포함한다. 설치류는 마우스, 랫트, 우드척, 페럿, 토끼 및 햄스터를 포함한다. 가축 및 사냥감 동물은 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 버팔로, 고양이(feline) 종, 예를 들어, 집 고양이, 개(canine) 종, 예를 들어, 개, 여우, 늑대, 조류(avian) 종, 예를 들어, 닭, 에뮤, 타조, 및 어류, 예를 들어, 송어, 메기 및 연어를 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어, 영장류, 예를 들어, 인간이다. 용어 "개체", "환자" 및 "대상체"는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다.
바람직하게는, 대상체는 포유동물이다. 포유동물은 인간, 인간이 아닌 영장류, 마우스, 랫트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있지만, 이들 예로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 것과 같은, 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 인접 잔기의 알파-아미노 및 카르복시기 사이의 펩티드 결합에 의해 서로 연결된, 일련의 아미노산 잔기를 나타내기 위해 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다. 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는, 크기나 기능에 관계없이, 변형된 아미노산(예를 들어, 인산화, 당화, 글리코실화 등) 및 아미노산 유사체를 포함하는, 아미노산의 중합체를 지칭한다. "단백질" 및 "폴리펩티드"는 종종 비교적 큰 폴리펩티드와 관련하여 사용되는 반면, 용어 "펩티드"는 종종 작은 폴리펩티드와 관련하여 사용되지만, 당업계에서 이러한 용어의 사용은 중복된다. 용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 유전자 생성물 및 이의 단편을 언급할 때 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 따라서, 예시적인 폴리펩티드 또는 단백질은 유전자 생성물, 자연 발생 단백질, 상동체, 오르쏘로그(orthologs), 파라로그(paralogs), 단편 및 기타 등가물, 변이체, 단편 및 전술한 것들의 유사체를 포함한다.
본 명세서에 기재된 다양한 실시형태에서, 기재된 임의의 특정 폴리펩티드의 변이체(자연 발생 또는 기타), 대립유전자, 상동체, 보존적으로 변형된 변이체, 및/또는 보존적 치환 변이체가 포함되는 것으로 추가로 고려된다. 아미노산 서열과 관련하여, 당업자는 코딩된 서열에서 단일 아미노산 또는 적은 비율의 아미노산을 변경하는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개별적인 치환, 결실 또는 부가가 "보존적으로 변형된 변이체"이며, 여기서 변형은 아미노산의 화학적으로 유사한 아미노산으로의 치환을 초래하고 폴리펩티드의 원하는 활성을 유지하는 것임을 인지할 것이다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 개시와 일치하는 다형성 변이체, 종간 상동체, 및 대립유전자에 부가되고 이러한 것들을 배제하지 않는다.
주어진 아미노산은 유사한 물리화학적 특성을 갖는 잔기로 대체, 예를 들어, 한 지방족 잔기를 다른 것으로 치환(예컨대, Ile, Val, Leu 또는 Ala를 다른 어느 하나로), 또는 한 극성 잔기를 다른 것으로 치환(예컨대, Lys와 Arg; Glu와 Asp; 또는 Gln과 Asn 간 치환)할 수 있다. 이와 같은 다른 보존적 치환, 예를 들어, 유사한 소수성 특성을 갖는 전체 영역의 치환은 잘 알려져 있다. 보존적 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드는 원하는 활성, 예를 들어, 천연 또는 참조 폴리펩티드의 활성 및 특이성이 유지됨을 확인하기 위해 본 명세서에 기재된 분석 중 임의의 하나로 시험될 수 있다.
아미노산은 이들의 측쇄 특성의 유사성에 따라 분류될 수 있다(AL Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (1) 비-극성: Ala(A), Val(V), Leu(L), Ile(I), Pro(P), Phe(F), Trp(W), Met(M); (2) 비하전 극성: Gly(G), Ser(S), Thr(T), Cys(C), Tyr(Y), Asn(N), Gln(Q); (3) 산성: Asp(D), Glu(E); (4) 염기성: Lys(K), Arg(R), His(H). 대안적으로, 천연 생성 잔기는 공통 측쇄 특성에 따라 다음 그룹으로 나눌 수 있: (1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) 산성: Asp, Glu; (4) 염기성: His, Lys, Arg; (5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; (6) 방향족: Trp, Tyr, Phe. 비-보존적 치환은 이러한 클래스 중 하나의 구성원을 다른 클래스로 교환하는 것을 수반한다. 특정한 보존적 치환은, 예를 들어, Ala를 Gly 또는 Ser으로; Arg을 Lys로; Asn을 Gln 또는 His로; Asp를 Glu로; Cys를 Ser로; Gln을 Asn으로; Glu를 Asp로; Gly을 Ala 또는 Pro로; His을 Asn 또는 Gln으로; Ile을 Leu 또는 Val로; Leu를 Ile 또는 Val로; Lys을 Arg, Gln 또는 Glu로; Met을 Leu, Tyr 또는 Ile로; Phe을 Met, Leu 또는 Tyr로; Ser을 Thr로; Thr을 Ser으로; Trp를 Tyr로; Tyr을 Trp으로; 및/또는 Phe을 Val, Ile 또는 Leu로의 치환을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드(또는 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산)는 본 명세서에 기재된 아미노산 서열 중 하나의 기능적 단편일 수 있다. 본 명세서에 사용된 "기능적 단편"은 본 명세서에 아래에 기재된 분석에 따라 야생형 참조 폴리펩티드 활성의 적어도 50%를 유지하는 펩티드의 단편 또는 세그먼트이다. 기능적 단편은 본 명세서에 개시된 서열의 보존적 치환을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩티드는 본 명세서에 기재된 서열의 변이체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체는 보존적으로 변형된 변이체이다. 보존적 치환 변이체는, 예를 들어, 천연 뉴클레오티드 서열의 돌연변이에 의해 수득될 수 있다. 본 명세서에 언급된, "변이체"는 천연 또는 참조 폴리펩티드와 실질적으로 상동성이지만, 하나 또는 복수의 결실, 삽입 또는 치환으로 인해 천연 또는 참조 폴리펩티드와 상이한 아미노산 서열을 갖는 것이다. 변이체 폴리펩티드-코딩 DNA 서열은 천연 또는 참조 DNA 서열과 비교할 때 뉴클레오티드의 하나 이상의 추가, 결실 또는 치환을 포함하지만, 활성을 유지하는 변이체 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 서열을 포함한다. 다양한 PCR-기반 부위-특이적 돌연변이유발 접근법은 당업계에 공지되어 있고 통상의 기술자에 의해 적용될 수 있다.
변이체 아미노산 또는 DNA 서열은 천연 또는 참조 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 이상 동일할 수 있다. 예를 들어, 월드 와이드 웹(예를 들어, 기본 설정이 있는 BLASTp 또는 BLASTn) 상에서 이 목적을 위해 일반적으로 사용되는 무료로 사용가능한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 2개의 서열을 비교함으로써 천연 서열과 돌연변이 서열 사이의 상동성(동일성 백분율)의 정도를 결정할 수 있다.
천연 아미노산 서열의 변경은 당업자에게 공지된 임의의 다수의 기술에 의해 달성될 수 있다. 돌연변이는, 예를 들어, 천연 서열의 단편에 결찰을 가능하게 하는 제한 부위에 의해 측접되어 있는, 돌연변이 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 합성함으로써 특정 유전자좌에 도입될 수 있다. 결찰 후, 생성된 재구성된 서열은 원하는 아미노산 삽입, 치환, 또는 결실을 갖는 유사체를 코딩한다. 대안적으로, 올리고뉴클레오티드-지정 부위-특이적 돌연변이유발 절차를 이용하여 요구되는 치환, 결실, 또는 삽입에 따라 변경된 특정 코돈을 갖는 변경된 뉴클레오티드 서열을 제공할 수 있다. 그러한 변경을 위한 기술은 매우 잘 확립되어 있으며, 예를 들어, 전문이 본 명세서에 참조로 통합되는, 다음 문헌에 개시된 것들을 포함한다: Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); 및 미국 특허 제4,518,584호 및 제4,737,462호. 폴리펩티드의 적절한 형태를 유지하는 데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기가 또한, 일반적으로 세린으로 치환되어 분자의 산화 안정성을 개선하고 비정상적인 가교를 방지할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)은 폴리펩티드에 부가되어 안정성을 향상시키거나 올리고머화를 촉진할 수 있다.
본 명세서에 사용된 것과 같은, 용어 "핵산" 또는 "핵산 서열"은 리보핵산, 데옥시리보핵산 또는 이들의 유사체의 단위를 포함하는 임의의 분자, 바람직하게는 중합체 분자를 지칭한다. 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 단일-가닥 핵산은 변성된 이중-가닥 DNA의 한 핵산 가닥일 수 있다. 달리, 이중-가닥 DNA에서 유래하지 않은 단일-가닥 핵산일 수 있다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 단일-가닥 핵산은 시험관내(in-vitro) 전사에 이어 역전사에 의해 생성된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 단일-가닥 핵산은 닉킹 엔도뉴클레아제에 대한 노출에 의해 생성된다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 단일-가닥 핵산은 새로(de novo) 합성된다. 한 양태에서, 핵산은 DNA일 수 있다. 또 다른 양태에서, 핵산은 RNA일 수 있다. 적합한 DNA는, 예를 들어, 게놈 DNA 또는 cDNA를 포함할 수 있다. 적합한 RNA는, 예를 들어, mRNA를 포함할 수 있다.
용어 "발현"은 RNA 및 단백질을 생성하고 적절한 경우 단백질을 분비하는 데 관여하는 세포 과정을 지칭하며, 예를 들어, 적용가능한 경우, 전사, 전사체 처리, 번역 및 단백질 폴딩, 변형 및 처리을 포함하나, 이로만 제한되는 것은 아니다. 발현은 본 발명의 핵산 단편 또는 단편들로부터 유래된 센스(mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정적인 축적 및/또는 mRNA의 폴리펩티드로의 번역을 지칭할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 바이오마커(들), 표적(들), 또는 유전자/폴리펩티드의 발현은 조직 특이적이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 바이오마커(들), 표적(들), 또는 유전자/폴리펩티드의 발현은 전체적(global)이다. 일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 바이오마커(들), 표적(들), 또는 유전자/폴리펩티드의 발현은 전신적(systemic)이다.
"발현 생성물"은 유전자로부터 전사된 RNA, 및 유전자로부터 전사된 mRNA의 번역에 의해 수득된 폴리펩티드를 포함한다. 용어 "유전자"는 적절한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 경우 시험관내(in vitro) 또는 생체내에서(in vivo) RNA로 전사되는(DNA) 핵산 서열을 의미한다. 유전자는 코딩 영역 앞과 뒤에 있는 영역, 예를 들어, 5' 비번역(5'UTR) 또는 "리더" 서열 및 3' UTR 또는 "트레일러" 서열 뿐만 아니라, 개별 코딩 세그먼트(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 적어도 하나의 표적 분자의 수준을 측정, 검출 또는 결정하는 단계와 관련이 있다. 본 명세서에 사용된 것과 같은, 용어 "검출(detecting)" 또는 "측정(measuring)"은 신호, 예를 들어, 프로브, 표지, 또는 표적 분자를 관찰하여 시료 중의 분석물의 존재를 나타내는 것을 지칭한다. 특정 표지 모이어티를 검출하기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법이 검출을 위해 사용될 수 있다. 예시적인 검출 방법은, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 분광적, 형광적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 방법을 포함한다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 측정은 정량적 관찰일 수 있다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩티드, 핵산, 또는 세포가 조작될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "조작된(engineered)"은 사람의 손에 의해 조작된 양태를 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩티드의 적어도 하나의 양태, 예를 들어, 이의 서열이 사람의 손에 의해 조작되어 천연에 존재하는 양태와 달라진 경우, 폴리펩티드는 "조작된" 것으로 간주된다. 일반적인 관행이고 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 조작된 세포의 자손은 비록 실제 조작이 이전 엔티티에 대해 수행되었음에도 불구하고 일반적으로 여전히 "조작된" 것으로 지칭된다.
임의의 양태의 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 핵산(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 태그, 예를 들어, 올리고페인트)은 외인성이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 핵산(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 태그, 예를 들어, 올리고페인트)은 이소성이다. 임의의 양태의 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 핵산(예를 들어, 올리고뉴클레오티드 태그, 예를 들어, 올리고페인트)은 내인성이 아니다.
용어 "외인성(exogenous)"은 세포의 천연 공급원 이외의 세포에 존재하는 물질을 지칭한다. 본 명세서에 사용된 것과 같은, 용어 "외인성"은 인간의 손을 포함하는 과정에 의해 세포 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템 내로 도입된 핵산(예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산) 또는 폴리펩티드를 지칭할 수 있으며, 일반적으로 상기 핵산 또는 폴리펩티드는 상기 시스템 내에서 발견되지 않고 상기 핵산 또는 폴리펩티드는 이러한 세포 또는 유기체로 도입하기를 원하는 것이다. 대안적으로, "외인성"은 인간의 손을 포함하는 과정에 의해 세포 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템 내로 도입된 핵산 또는 폴리펩티드를 지칭할 수 있으며, 상기 핵산 또는 폴리펩티드는 상기 시스템 내에서 상대적으로 적은 양으로 발견되고 상기 세포 또는 유기체 내에서 상기 핵산 또는 폴리펩티드의 양을 증가, 예를 들어, 이소성 발현 또는 수준을 생성시키고자 하는 것이다. 대조적으로, 용어 "내인성(endogenous)"은 생물학적 시스템 또는 세포에 구분되는 물질을 지칭한다. 본 명세서에 사용된, "이소성(ectopic)"은 비정상적인 위치 및/또는 양에서 발견되는 물질을 지칭한다. 이소성 물질은 일반적으로 주어진 세포에서 발견되지만, 훨씬 적은 양 및/또는 다른 시기에 발견되는 것일 수 있다. 이소성은 또한 천연 환경에서 주어진 세포에서 천연적으로 발견되거나 발현되지 않는 폴리펩티드 또는 핵산과 같은 물질을 포함한다.
본 명세서에 사용된, "접촉(contacting)"은 적어도 하나의 세포에 작용제를 전달하거나, 노출시키기 위한 임의의 적합한 수단을 지칭한다. 예시적인 전달 방법은, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 세포 배양 배지로의 직접 전달, 관류, 주사, 또는 당업자에게 잘 알려진 다른 전달 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 접촉은 물리적 인간 활동, 예를 들어, 주사; 분배, 혼합, 및/또는 따라내는 행위; 및/또는 전달 디바이스 또는 머신의 조작을 포함한다.
"통계적으로 유의한" 또는 "유의하게"라는 용어는 통계적 유의성을 나타내며 일반적으로 2 표준 편차(2SD) 또는 그 이상의 차이를 지칭한다.
작동 예에서, 또는 달리 지시된 경우를 제외하고, 본 명세서에 사용된 성분의 양 또는 반응 조건을 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수정된 것으로 이해되어야 한다. 백분율과 관련하여 사용될 때 용어 "약"은 ±1%를 의미할 수 있다.
본 명세서에 사용된 것과 같은, 용어 "포함하는(comprising)"은 제시된 정의된 요소에 추가하여 다른 요소가 또한 존재할 수 있음을 의미한다. "포함하는"의 사용은 제한이 아니라 포함을 나타낸다.
용어 "구성되는(consisting of)"은 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물, 방법, 및 이들의 각각의 구성요소를 지칭하며, 실시형태의 설명에서 언급되지 않은 임의의 요소를 배제한다.
본 명세서에 사용된 것과 같은, 용어 "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)"은 주어진 실시형태에 필요한 요소를 지칭한다. 이 용어는 본 발명의 실시형태의 기본적이고 신규한 또는 기능적 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가 요소의 존재를 허용한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "상응하는(corresponding to)"은 제1 폴리펩티드 또는 핵산 중의 열거된 위치에 있는 아미노산 또는 뉴클레오티드, 또는 제2 폴리펩티드 또는 핵산 중의 열거된 아미노산 또는 뉴클레오티드와 동등한 아미노산 또는 뉴클레오티드를 지칭한다. 동등한 열거된 아미노산 또는 뉴클레오티드는 당업계에 공지된 상동성 프로그램, 예를 들어, BLAST를 사용하여 후보 서열의 정렬에 의해 결정될 수 있다.
단수 용어 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 달리 명백하게 나타내지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다. 유사하게, "또는"이라는 단어는 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는 한, "및"을 포함하도록 의도된다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 개용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 아래에 기재되어 있다. 약어, "예(e.g.)" 라틴어 exempli gratia에서 파생되었으며, 비제한적인 예를 나타내기 위해 여기에서 사용된다. 따라서, 약어 "예(e.g.)" "예를 들어(for example)"라는 용어와 동의어이다.
본 명세서에 개시된 본 발명의 대안적 요소 또는 실시형태의 그룹화는 제한으로 해석되어서는 안된다. 각 그룹 구성원은 개별적으로 또는 그룹의 다른 구성원 또는 본 명세서에서 발견되는 다른 요소와 임의의 조합으로 참조 및 청구될 수 있다. 그룹의 하나 이상의 구성원은 편의 및/또는 특허성을 이유로 그룹에 포함되거나 그룹에서 삭제될 수 있다. 임의의 그러한 포함 또는 삭제가 발생하면, 명세서는 수정된 그룹을 포함하는 것으로 간주되어 첨부된 청구범위에 사용된 모든 마쿠쉬(Markush) 그룹의 서면 설명을 충족한다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원과 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 본 개시가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 본 발명은 본 명세서에 기술된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않고 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정 실시형태를 설명하기 위해 사용된 것으로, 청구범위에 의해서만 정의되는 본 발명의 범위를 한정하려는 의도가 아니다. 면역학 및 분자 생물학에서 일반적인 용어의 정의는, 문헌 내용 모두가 그 전문으로 본 명세서에 참조로 통합되는, 다음 문헌에서 확인할 수 있다: The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 20th Edition, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2018 (ISBN 0911910190, 978-0911910421); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, published by Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908); 및 Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), W. W. Norton & Company, 2016 (ISBN 0815345054, 978-0815345053); Lewin's Genes XI, published by Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005; 및 Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737).
다른 용어는 본 발명의 다양한 양태의 설명 내에서 본 명세서에 정의된다.
본 출원 전반에 걸쳐 인용된, 참고 문헌, 발행된 특허, 공개된 특허 출원, 및 동시 계류 중인 특허 출원을 포함하는, 모든 특허 및 기타 간행물은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 기술과 연계하여 사용될 수 있는 그러한 간행물에 기재된 방법론을 설명 및 개시하기 위한 목적으로 본 명세서에 참조로 명시적으로 통합된다. 이러한 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 이들의 개시에 대한 목적으로만 제공된다. 이와 관련하여 어떠한 것도 발명가가 선행 발명으로 인해 또는 다른 이유로 그러한 개시보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이들 문서의 내용에 대한 날짜 또는 표현에 대한 모든 진술은 출원인이 이용가능한 정보에 기초한 것이며 이들 문서의 날짜 또는 내용의 정확함에 대해 인정하는 것은 아니다.
본 개시의 실시형태에 대한 설명은 완전한 형태로 개시되거나 개시된 정확한 형태로 개시를 제한하도록 의도되지 않는다. 본 개시의 특정 실시형태, 및 예는 예시적 목적으로 본 명세서에 기재되어 있지만, 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자가 인식하는 바와 같이, 본 개시의 범위 내에서 다양한 균등 변형이 가능하다. 예를 들어, 방법 단계 또는 기능이 주어진 순서로 제시되는 동안, 대안적인 실시형태는 다른 순서로 기능을 수행할 수 있거나, 또는 기능은 실질적으로 동시에 수행될 수 있다. 본 명세서에 제공된 개시에 대한 교시는 적절한 다른 절차 또는 방법에 적용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 다양한 실시형태는 추가 실시형태를 제공하기 위해 결합될 수 있다. 본 개시의 양태는, 필요하다면, 본 개시의 또 다른 실시형태를 제공하기 위해 상기 참조 및 적용의 구성, 기능 및 개념을 사용하도록 수정될 수 있다. 이러한 변경 및 기타 변경은 상세한 설명에 비추어 본 개시에 대해 이루어질 수 있다. 이러한 모든 수정은 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되도록 의도된다.
임의의 전술한 실시형태의 특정 요소는 다른 실시형태의 요소에 대해 조합되거나 대체될 수 있다. 또한, 본 개시의 특정 실시형태와 관련된 이점은 이러한 실시형태의 맥락에서 설명되었지만, 다른 실시형태가 또한 이러한 장점을 나타낼 수 있으며, 모든 실시형태가 본 개시의 범위 내에 속하기 위해 반드시 그러한 장점을 나타낼 필요는 없다.
본 명세서에 기재된 기술은 어떤 식으로든 추가 제한으로 해석되어서는 안 되는 이하의 실시예에 의해 추가로 설명된다.
본 명세서에 기재된 기술의 일부 실시형태는 아래의 번호매겨진 항목 중 임의 항목에 따라 정의될 수 있다:
1. 샘플에서 적어도 하나의 표적 분자를 분석하는 방법으로서, 상기 방법은
a. 상기 샘플을 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그와 접촉시키는 단계로서, 각각의 올리고뉴클레오티드 태그는,
i. 분석하고자 하는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 인식 도메인, 및
ii. 적어도 하나의 카세트를 포함하는 적어도 하나의 스트리트
를 포함하고, 각각의 카세트는,
1. 앵커 영역이 적어도 하나의 측면에 측접되어 있는, 적어도 1개의 뉴클레오티드를 포함하는 바코드 영역을 포함하며;
여기서 각각의 올리고뉴클레오티드 태그의 스트리트는 적어도, A. 상기 스트리트 내의 카세트의 공간적 순서가 상이하거나 또는 B. 상기 바코드 영역의 서열이 단계 (a)의 다른 올리고뉴클레오티드 태그의 바코드 영역과 상이하다는 점에서 단계 (a)의 다른 올리고뉴클레오티드 태그의 스트리트와 구분되는, 단계;
b. 상기 샘플을 적어도 2개의 판독 분자와 접촉시키는 단계로서, 각각의 판독 분자는
i. 단계 (a)에서 사용된 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그의 카세트와 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드; 및
ii. 검출 분자,
를 포함하며;
여기서 상기 적어도 2개의 판독 분자는 집합적으로 적어도 2개의 구별가능한 검출 분자를 포함하는, 단계;
c. 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그에 혼성화된 상기 검출 분자의 상대적 공간 순서를 검출하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그는 적어도 하나의 표적 분자에 혼성화되고, 그로 인해 상기 검출 분자의 상대적 공간 순서는 어떤 올리고뉴클레오티드 태그가 해당 위치에서 상기 표적 분자에 혼성화되는지에 대한 식별을 가능하게 하는, 단계,
를 포함하는, 방법.
2. 전술한 항목 중 어느 한 항목에 있어서,
상기 바코드 영역이 1-10개의 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
3. 전술한 항목 중 어느 한 항목에 있어서,
상기 스트리트가 적어도 3개의 카세트를 포함하는, 방법.
4. 전술한 항목 중 어느 한 항목에 있어서,
상기 바코드 영역이 앵커 영역에 의해 각 양태에 측접하는, 방법.
5. 전술한 항목 중 어느 한 항목에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드 태그 모두의 상기 앵커 영역이 일정한 것인, 방법.
6. 전술한 항목 중 어느 한 항목에 있어서,
카세트에 대한 상기 판독 분자의 특이적 혼성화가 상기 바코드 영역의 동일성(identity)에 의해 결정되는, 방법.
7. 전술한 항목 중 어느 한 항목에 있어서,
상기 검출 분자가 형광단인, 방법.
8. 전술한 항목 중 어느 한 항목에 있어서,
상기 검출이 형광 현미경으로 수행되는, 방법.
9. 전술한 항목 중 어느 한 항목에 있어서,
상기 검출 분자가 비오틴, 아민, 금속, 앵커 분자, 또는 아크리다이트를 포함하는, 방법.
10. 전술한 항목 중 어느 한 항목에 있어서,
상기 검출이 적어도 단일 세포 해상도로 수행되는, 방법.
11. 전술한 항목 중 어느 한 항목에 있어서,
단계 (b)가 상기 샘플을 적어도 4개의 판독 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
12. 전술한 항목 중 어느 한 항목에 있어서,
단계 (b)가 상기 샘플을 적어도 3개의 구별가능한 검출 분자를 집합적으로 포함하는 판독 분자의 그룹과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
13. 전술한 항목 중 어느 한 항목에 있어서,
단계 (b)가 상기 샘플을 적어도 4개의 구별가능한 검출 분자를 집합적으로 포함하는 판독 분자의 그룹과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
14. 전술한 항목 중 어느 한 항목에 있어서,
적어도 2개의 표적 분자가 동시에 분석되는, 방법.
15. 전술한 항목 중 어느 한 항목에 있어서,
적어도 3개의 표적 분자가 동시에 분석되는, 방법.
16. 전술한 항목 중 어느 한 항목에 있어서,
적어도 10개의 표적 분자가 동시에 분석되는, 방법.
17. 전술한 항목 중 어느 한 항목에 있어서,
적어도 20개의 표적 분자가 동시에 분석되는, 방법.
18. 전술한 항목 중 어느 한 항목에 있어서,
상기 표적 분자가 핵산, 폴리펩티드, 세포 표면 분자, 또는 무기 물질인, 방법.
19. 전술한 항목 중 어느 한 항목에 있어서,
상기 표적 분자가 DNA 또는 mRNA인, 방법.
20. 전술한 항목 중 어느 한 항목에 있어서,
상기 샘플이 세포, 세포 배양물, 또는 조직 샘플인, 방법.
21. 샘플에서 적어도 하나의 표적 분자를 분석하기 위한 시스템으로서, 상기 시스템은,
a. 적어도 2개의 검출가능한 분자를 검출할 수 있는 검출기;
b. 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그로서, 각각의 올리고뉴클레오티드 태그는,
i. 분석하고자 하는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 인식 도메인, 및
ii. 적어도 하나의 카세트를 포함하는 스트리트로서, 각각의 카세트는,
1. 앵커 영역이 적어도 하나의 측면에 측접되어 있는, 적어도 1개의 뉴클레오티드를 포함하는 바코드 영역을 포함하는 것인, 스트리트
를 포함하고;
각각의 올리고뉴클레오티드 태그의 스트리트는 적어도, A. 스트리트 내의 카세트의 공간적 순서가 상이하거나 또는 B. 바코드 영역의 서열이 (b)의 다른 올리고뉴클레오티드 태그의 바코드 영역과 상이하다는 점에서 (b)의 다른 올리고뉴클레오티드 태그의 스트리트와 구분되는 것인,
올리고뉴클레오티드 태그; 및
c. 적어도 2개의 판독 분자로서, 각각의 판독 분자는
i. (b)에서 사용된 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그의 카세트와 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드; 및
ii. 검출 분자를 포함하고;
상기 적어도 2개의 판독 분자는 집합적으로 적어도 2개의 구별가능한 검출 분자를 포함하는 것인, 판독 분자;
를 포함하고,
샘플은 상기 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그 및 적어도 2개의 판독 분자와 접촉되고, 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그에 혼성화된 검출 분자의 상대적 공간 순서가 검출되고, 여기서 상기 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그는 적어도 하나의 표적 분자에 혼성화되어, 그로 인해 검출 분자의 상대적인 공간적 순서가 어떤 올리고뉴클레오티드 태그가 해당 위치에서 상기 표적 분자에 혼성화되는지에 대한 식별을 가능하게 하는, 시스템.
실시예
실시예 1
기존 기술과 비교하여, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은, 동일한 세포 내의 수천 개의 표적을 시각화하고 식별하기 위해, 다중화 기술인 OligoCASSEQ를 사용함으로써, 단일 세포 수준에서 현미경을 사용하여, DNA, mRNA, 단백질 등 분석을 허용하여, 세포 프로세스에 대한 보다 전체적(global)이고 완전한 시야(view)를 제공한다. 한 번에 4-5개의 표적을 분석하는 것으로 제한된 현재의 현미경 기술과 달리, OligoCASSEQ는 효율적이고 비용 효율적인 방식으로 높은 수준의 다중화를 달성한다. 첫째, OligoCASSEQ는, 비용이 많이 들고 비효율적일 수 있는, 효소를 사용하지 않는다. 둘째, OligoCASSEQ는, 비용은 증가하지만 정확성은 떨어지는, 길이가 긴 올리고를 필요로 하지 않는다.
때때로 "OligoCASSEQ"로 지칭되는, 본 명세서에 기술된 기술은 단일 세포 수준에서 고도로 다중화된 표적 식별을 가능하게 하는 기술이다. 이 예시적인 실시형태에서, DNA는 "카세트"를 포함하는 "스트리트"가 있는 올리고페인트에 의해 표적화된다(예를 들어, 도 1a 참조). 카세트는 각 측면 상에 일정한 앵커 영역이 측접되어 있는 가변 바코드 영역으로 구성된다(예를 들어, 도 1b 참조). 바코드는 각각의 바코드 위치에서 뉴클레오티드에 특이적인 형광 표지된 올리고(예를 들어, 판독체(Readouts), 판독 분자라고도 함)를 사용하여 시퀀싱된다(예를 들어, 도 1c 참조). 판독체는 앵커 영역을 통해 카세트를 인식하고 경쟁적으로 결합한다. 상보적 결합은 특정 바코드 서열의 판독체 인식에 의해 결정된다(예를 들어, 도 1d 참조). 이 디자인은 카세트를 콤팩트하게 만들고 필요한 판독체의 양을 줄일 수 있다. 5개의 뉴클레오티드 바코드는 1024(45)개의 표적을 구별할 수 있다.
OligoCASSEQ는 올리고페인트 기술을 보완한다. 즉, OligoCASSEQ는 올리고뉴클레오티드 태그가 있는 어떤 것이든 다중화/디코딩할 수 있으며, 이에는 올리고뉴클레오티드-태깅된 올리고(예를 들어, 올리고페인트 또는 임의의 기타 DNA-결합 엔티티), 올리고뉴클레오티드-태깅된 항체(예를 들어, 나노바디), 올리고뉴클레오티드-태깅된 소분자(예를 들어, 약물 스크리닝 목적), 올리고뉴클레오티드-태깅된 세포, 및 올리고뉴클레오티드 태그가 있는 비-생물학적 물질(금속, 화학 물질 등)이 포함될 수 있으나, 이로만 제한되는 것은 아니다. DNA 표적은 올리고페인트와 혼성화된다. 주요 차이점은 OligoCASSEQ를 사용하는 경우 뉴클레오티드 카세트 서열이 올리고페인트 비-게놈 표적 "스트리트"로 코딩된다는 것이다. 이러한 카세트는 올리고페인트의 바코딩을 가능하게 하여, 높은 수준의 다중화를 가능하게 한다.
본 명세서에 기재된 것과 같은, 표적은 DNA일 수 있다. OligoCASSEQ는 다른 표적(예를 들어, RNA, 단백질 등)에도 적용할 수 있다. OligoCASSEQ는 현미경을 통해 수많은 표적에 대한 식별을 가능하게 한다. 이러한 표적은, 이로만 제한되는 것은 아니지만, DNA, RNA, 단백질, 세포, 무기 물질을 포함한다.
본 명세서에서는 제자리에서(in-situ) 염색체를 추적하기 위한 OligoCASSEQ의 용도를 입증한다. 비제한적 예로서, OligoCASSEQ를 사용하여 인간 염색체 2(Chr.2; 예를 들어, 도 1e 내지 도 1h 참조)를 따라 5개 유전자좌의 국재화를 결정할 수 있다. 2개 뉴클레오티드 4색 바코드를 사용했다(예를 들어, 도 1e 참조). PGP1-F 세포의 현미경 사진 이미지는 2개의 바코드 위치(예를 들어, 상단 및 중간 섹션 참조)의 OligoCASSEQ 검사를 보여주고, 이어서 동일한 핵의 1번째 위치에 대한 재검사(예를 들어, 하단 섹션 참조)를 보여준다. 각 현미경 사진 위의 개략도는 상이한 바코드 위치에서 특정 유전자좌의 색상 코드를 나타낸다(예를 들어, 도 1f 참조). 바코드 상의 판독값을 식별한 다음 디코딩하였다(예를 들어, 도 1g 참조). 그런 다음, 각 염색체의 공간적 위치를 추적하였다(예를 들어, 도 1h 참조).
OligoCASSEQ는 한 번에 복수개(>5) 표적을 표적화하고 식별해야 할 필요성을 해결한다. 현미경은 한 번에 4-5개의 색상만 구별할 수 있기 때문에, 현재 한 번에 4-5개의 타겟만 연구할 수 있다. OligoCASSEQ는 바코딩 및 다중화를 통해 이 문제를 해결한다. 표적을 1색으로 나타내는 대신, 표적이 4가지 배열(sequence)의 색상으로 표시되어, 검사할 수 있는 표적의 수가 기하급수적으로 증가한다.
OligoCASSEQ는 1) 효소가 필요하지 않고, 2) 올리고 길이가 감소하고, 3) 필요한 판독 올리고의 복잡성과 수가 감소하기 때문에 다른 것들에 비해 우수하다.
SEQUENCE LISTING <110> PRESIDENT AND FELLOWS OF HARVARD COLLEGE <120> METHODS AND COMPOSITIONS RELATED TO TARGET ANALYSIS <130> 002806-094580WOPT <150> 62/880,216 <151> 2019-07-30 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 1 gtctc 5 <210> 2 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 2 cacta 5 <210> 3 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 3 gcccg 5 <210> 4 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 4 tgtgc 5

Claims (21)

  1. 샘플에서 적어도 하나의 표적 분자를 분석하는 방법으로서, 상기 방법은
    a. 상기 샘플을 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그와 접촉시키는 단계로서, 각각의 올리고뉴클레오티드 태그는,
    i. 분석하고자 하는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 인식 도메인, 및
    ii. 적어도 하나의 카세트를 포함하는 적어도 하나의 스트리트를 포함하고, 각각의 카세트는,
    1. 적어도 하나의 측면이 앵커 영역에 의해 측접되어 있는(flanked), 적어도 1개의 뉴클레오티드를 포함하는 바코드 영역을 포함하며;
    여기서 각각의 올리고뉴클레오티드 태그의 스트리트는 적어도, A. 상기 스트리트 내의 카세트의 공간적 순서가 상이하거나 또는 B. 상기 바코드 영역의 서열이 단계 (a)의 다른 올리고뉴클레오티드 태그의 바코드 영역과 상이하다는 점에서, 단계 (a)의 다른 올리고뉴클레오티드 태그의 스트리트와 구분되는, 단계;
    b. 상기 샘플을 적어도 2개의 판독 분자와 접촉시키는 단계로서, 각각의 판독 분자는
    i. 단계 (a)에서 사용된 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그의 카세트와 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드; 및
    ii. 검출 분자,
    를 포함하며;
    여기서 상기 적어도 2개의 판독 분자는 전체적으로(collectively) 적어도 2개의 구별가능한 검출 분자를 포함하는, 단계;
    c. 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그에 혼성화된 상기 검출 분자의 상대적 공간 순서를 검출하는 단계로서, 상기 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그는 적어도 하나의 표적 분자에 혼성화되고, 그로 인해 상기 검출 분자의 상대적 공간 순서는 어떤 올리고뉴클레오티드 태그가 해당 위치에서 상기 표적 분자에 혼성화되는지에 대한 식별을 가능하게 하는, 단계,
    를 포함하는, 방법.
  2. 청구항 1 내지 청구항 2 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바코드 영역이 1-10개의 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  3. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 스트리트가 적어도 3개의 카세트를 포함하는, 방법.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바코드 영역이 앵커 영역에 의해 각 측면에 측접하는, 방법.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 모든 올리고뉴클레오티드 태그의 상기 앵커 영역이 일정한(constant) 것인, 방법.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    카세트에 대한 판독 분자의 특이적 혼성화가 상기 바코드 영역의 동일성에 의해 결정되는, 방법.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 검출 분자가 형광단인, 방법.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 검출이 형광 현미경으로 수행되는, 방법.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 검출 분자가 비오틴, 아민, 금속, 앵커 분자, 또는 아크리다이트를 포함하는, 방법.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 검출이 적어도 단일 세포 해상도로 수행되는, 방법.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (b)가 상기 샘플을 적어도 4개의 판독 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  12. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (b)가 상기 샘플을 적어도 3개의 구별가능한 검출 분자를 전체적으로 포함하는 판독 분자의 그룹과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  13. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (b)가 상기 샘플을 적어도 4개의 구별가능한 검출 분자를 전체적으로 포함하는 판독 분자의 그룹과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 2개의 표적 분자가 동시에 분석되는, 방법.
  15. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 3개의 표적 분자가 동시에 분석되는, 방법.
  16. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 10개의 표적 분자가 동시에 분석되는, 방법.
  17. 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 20개의 표적 분자가 동시에 분석되는, 방법.
  18. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적 분자가 핵산, 폴리펩티드, 세포 표면 분자, 또는 무기 물질인, 방법.
  19. 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적 분자가 DNA 또는 mRNA인, 방법.
  20. 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 샘플이 세포, 세포 배양물, 또는 조직 샘플인, 방법.
  21. 샘플에서 적어도 하나의 표적 분자를 분석하기 위한 시스템으로서, 상기 시스템은,
    a. 적어도 2개의 검출가능한 분자를 검출할 수 있는 검출기;
    b. 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그로서, 각각의 올리고뉴클레오티드 태그는,
    i. 분석하고자 하는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 인식 도메인, 및
    ii. 적어도 하나의 카세트를 포함하는 스트리트로서, 각각의 카세트는,
    1. 적어도 하나의 측면이 앵커 영역에 의해 측접되어 있는, 적어도 1개의 뉴클레오티드를 포함하는 바코드 영역을 포함하는 것인, 스트리트
    를 포함하고;
    각각의 올리고뉴클레오티드 태그의 스트리트는 적어도 A. 스트리트 내의 카세트의 공간적 순서가 상이하거나 또는 B. 바코드 영역의 서열이 (b)의 다른 올리고뉴클레오티드 태그의 바코드 영역과 상이하다는 점에서 (b)의 다른 올리고뉴클레오티드 태그의 스트리트와 구분되는 것인,
    올리고뉴클레오티드 태그; 및
    c. 적어도 2개의 판독 분자로서, 각각의 판독 분자는
    i. (b)에서 사용된 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그의 카세트와 특이적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드; 및
    ii. 검출 분자를 포함하고;
    상기 적어도 2개의 판독 분자는 전체적으로 적어도 2개의 구별가능한 검출 분자를 포함하는 것인, 판독 분자,
    를 포함하고;
    샘플은 상기 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그 및 적어도 2개의 판독 분자와 접촉되고, 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그에 혼성화된 검출 분자의 상대적 공간 순서가 검출되고, 여기서 상기 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 태그는 적어도 하나의 표적 분자에 혼성화되어, 그로 인해 검출 분자의 상대적인 공간적 순서가 어떤 올리고뉴클레오티드 태그가 해당 위치에서 상기 표적 분자에 혼성화되는지에 대한 식별을 가능하게 하는, 시스템.
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