NO832292L

NO832292L - Modifiserte merkede nukleotider og polynukleotider samt deres fremstilling, anvendelse og paavisning

Info

Publication number: NO832292L
Application number: NO832292A
Authority: NO
Inventors: Dean Engelhardt; Elazar Rabbani; Stanley Kline; Jannis G Stavrianopoulos; Dollie Kirtikar
Original assignee: Enzo Biochem Inc
Priority date: 1982-06-23
Filing date: 1983-06-23
Publication date: 1983-12-27
Also published as: EP0285058A2; EP0286898B1; EP0286898A2; EP0285057A3; JP2760466B2; AU1617983A; IL69051A0; JPH10158294A; JPH06234787A; ES547320A0; EP0618228A1; DK291183A; IL69051A; ES8802257A1; EP0285057A2; EP0097373A2; EP0285057B1; DE3382626T2; ES8700324A1; DE3382822D1

Description

Det er kjent å fremstille nukleotider eller polynukleotider

som er radioaktivt merket, som f.eks. med isotoper av

3 32 14 125 hydrogen ( H), fosfor (P), karbon ( C) eller jod ( I). Slike radioaktivt merkede forbindelser er anvendbare for å' påvise, overvåke, lokalisere og isolere nukleinsyre og andre molekyler av videnskabelig eller klinisk interesse. Bruken av radioaktivt merkede materialer medfører imidler-

tid uheldigvis faren på grunn av strålingen. Også på

grunn av den relativt korte halvtiden til de radioaktive materialer som anvendes for å merke slike forbindelser eller materialer, har de resulterende merkede forbindelsene eller materialene en tilsvarende relativt kort holdbarhets-tid.

Det er foreslått kjemisk å merke forbindelser av interesse,

som f.eks. nukleotider og polynukleotider, for å overvinne eller unngå farene og vanskelighetene som er forbundet med slike forbindelser eller materialer når de er radioaktivt merket. I artikkelen til P.R. Langer, A.A. Waldrop og D.C. Ward med tittel "Enzymatic Synthesis of Biotin-

Labeled Polynucleotides: Novel Nucleic Acid Affinity Probes",

i Proe. Nati. Acad. Sci. USA, vol. 78, nr. 11, sidene 6633-6637, november, 1981, er det beskrevet analoger av dUTP og UTP som inneholder en biotin molekyl bundet til C-5-stillingen i pyrimidinringen ved hjelp av et alkylamin-bindeledd.

De biotin-merkede nukleotider er effektive substrater for

en rekke DNA- og RNA-polymeraser in vitro. Polynukleotider som inneholder lave nivåer av biotinsubstitusjon (50 molekyler eller ferre pr. kilobase) har denaturerings-, reassosiasjons- og hybridiserings-egenskaper som usubstituerte kontroller. Biotin-merkede polynukleotider, både enkelt- og dobbelt-bundet holdes selektivt og kvantitativt tilbake på avidin-Sepharose, selv etter utstrakt vasking med 8M urea,

6M guanidin-hydroklorid eller 99%-formamid. I tillegg kan biotin-merkede nukleotider selektivt immunoutfelles i nærvær av antibiotinantilegemer og Staphylococcus aurea, Protein A. Disse enestående egenskapene ved biotin-merkede polynukleo-

tider gjør at de er brukbare affinitetssonder for påvisning og isolasjon av spesielle DNA- og RNA-sekvenser. Det angis i artikkelen at innholdet i artikkelen omfattes i en verserende U.S. patentsøknad.

Det som beskrives i denne artikkel og i den ovenfor nevnte patentsøknad inntas her og gjøres til del av denne beskrivelsen.

Den patentsøknad det refereres til i den ovenfor nevnte artikkel er U.S. patentsøknad nr. 255.223 innlevert 17. april 1981. Det som beskrives i denne patentsøknad nr. 255.223 inntas her og gjøres til del av denne beskrivelsen. I den ovennevnte U.S. søknad er gjenstanden i den ovennevnte artikkelen beskrevet og i tillegg er det beskrevet at forbindelser med strukturen:

hvori B respresenterer en purin-, deazapurin-, eller pyrimidin-del som er kovalent bundet til C 1'-stillingen i sukkerdelen, forutsatt at når B er purin eller 7-deazapurin, er den festet med N 9-stillingen i purinet eller deazapurin, og når B er pyrimidin, er den festet med N - stillingen,

hvor A representerer en del bestående av minst tre karbonatomer som er istand til å danne et påvisbart kompleks med et polypeptid når forbindelsen er innført i en dobbelt-bundet ribonukleinsyre, deoksyribonukleinsyredupleks eller en DNA-RNA-hybrid,

hvor den prikkede linjen representerer en kjemisk binding som forbinder B og A, forutsatt at dersom B er purin er bindingen festet til 8-stillingen i purinet, dersom B

er 7-deazapurin, er bindingen festet til 7-stillingen i deazapurinet, og dersom B er pyrimidin, er bindingen festet til 5-stillingen pyrimidinet, og

hvori hver av x, y og z representerer

meget brukt som probes i biomedisinsk forskning og rekombinant DNA-teknologi.

Spesielt anvendbare er forbindelser som omfattes av denne strukturen og som i tillegg har en eller flere av følgende karakteristika: A er ikke-aromatisk, A er minst C,.,

den kjemiske binding som forbinder B og A omfatter en a-olefinisk binding, Å er biotin eller iminobiotin, og B

er et pyrimidin eller 7-deazapurin.

Disse forbindelser kan fremstilles ved hjelp av en fremgangsmåte som omfatter:

(a) å omsette en forbindelse med strukturen:

med et merkurisalt i et passende løsningsmiddel under egnede betingelser slik at det dannes en kvikksølvforbindelse

med strukturen:

(b) å omsette nevnte kvikksølvforbindelse med en kjemisk gruppe som reageres med -Hg<+>-delen i nevnte kvikksølv-forbindelse og representert ved formelen ""'N, idet nevnte reaksjon utføres i et vandig løsningsmiddel og i nærvær av f^PdCl^under passende betingelser slik at det dannes en forbindelse med strukturen:

hvori N er en reaktiv funksjonell endegruppe eller er A, og (c) å gjenvinne nevnte forbindelse som nevnte modifiserte nukleotid når N er A, eller N er en reaktiv endegruppe,

å omsette nevnte forbindelse med en forbindelse med strukturen M-A, hvori M representerer en funksjonell gruppe som er reaktiv med N i et vandig løsningsmiddel under passende betingelser, slik at nevnte modifiserte nukleotid dannes, som så gjenvinnes.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også forbindelser med strukturen:

J

hvori hver av B, B<1>ogB" representerer en purin-, 7-deazapurin- eller pyrimidin-del som er kovalent bundet til C11 stillingen i sukkerdelen, forutsatt at når B, B<1>eller B"

er purin eller 7-deazapurin, er den festet ved N 9,stillingen i purinet eller 7-deazapurinet, og når B,B' eller B" er pyrimidin, er den festet ved N^-stillingen;

hvor A representerer en del bestående av minst tre karbonatomer som er i stand til å danne et påvisbart kompleks med

et polypeptid når forbindelsen innføres i et dobbelt-tvunnet dupleks dannet med en komplementær ribonuklein- eller deoksyribonukleinsyre molekyl,

hvori den prikkede linjen representerer en kjemisk binding som forbinder B og A, forutsatt at dersom B er purin er bindingen festet til 8-stillingen i purinet, dersom B

er 7-deazapurin, er bindingen festet til 7-stillingen i deazapurinet, og dersom B er pyrimidin, er bindingen festet til 5-stillingen i pyrimidinet,

hvor z representerer H- eller HO- og

hvori m og n representerer tall fra 0 opp til ca. 100 000.

Disse forbindelser kan fremstilles ved enzymatisk poly-merisasjon av en blanding av nukleotider som omfatter de modifiserte nukleotidene ifølge oppfinnelsen. Alternativt kan nukleotider som finnes i oligo- eller polynukleotider modifiseres ved bruk av kjemiske metoder.

Nukleotider som er modifisert ifølge foreliggende oppfinnelse og oligo- og polynukleotider i hvilke de modifiserte nukleotidene er innført, kan brukes som probes i biomedisinsk forskning, klinisk diagnose og rekombinant DNA-teknologi. Disse forskjellige anvendelsene er basert på evnen hos molekylene til å danne stabile komplekser med polypeptider som i sin tur kan påvises, enten ved hjelp av polypeptidet egne egenskaper eller ved hjelp av påvisbare deler som er festet til, eller som reageres med polypeptidet.

Noen anvendelser omfatter påvisning og identifisering av nukleinsyreholdige etiologiske midler, f.eks. bakterier og vira, utskillingsbakteria for antibiotisk motstand, diagnostisering av genetiske sykdommer, f.eks. thalassemi og sigd-celleanemi, kromosomalisk karyotyping og identifisering av tumor-celler .

Flere avgjørende kriterier må tilfredsstilles for at et modifisert nukleotid blir generelt egnet som en erstat-

ning for en radioaktivt-merket form av naturlig forekommende nukleotid. For det første må den modifiserte forbindelsen inneholde en substituent eller probe som er enestående,

dvs. ikke normalt forbundet med nukleotider eller poly-nukleotider. For det andre må probe reagere spesifikt med kjemiske eller biologiske reagenser for å tilveiebringe et følsomt påvisningssystem. For det tredje må analogene være relativt effektive substrater for vanlig undersøkte nukleinsyreenzymer, siden mange praktiske anvendelser krever at analogen må metaboliseres enzymatisk, f.eks.

må analogene fungere som substrater for nukleinsyrepoly-merase. For dette formål må probe-delene ikke plaseres i ringstillinger som sterisk eller på annen måte innvirker på den normale Watson-Crick-hydrogenbindingspotesialen til basene. Ellers vil substituentene gi forbindelser som er inaktive som polymerasesubstrater. Substitusjon i ringstillinger som forandrer den normale "anti"-nukleosid-bygningen må også unngås, siden slike bygningsforandringer vanligvis gjør nukleotidderivatene uakseptable som polymerasesubstrater. Normalt begrenser slike betraktninger substitusjons-stillingene til 5-stillingen i et pyrimidin og 7-stillingen i et purin eller et 7-deazapurin.

For det fjerde må påvisningssystemet være istand til å reagere med probe-substituentene som er^innført i både enkelt-tvunne og dobbelt-tvunne polynukleotider for å

være forenelige med metoder ved nukleinsyrehybridisering. For å tilfredsstille dette kriterium, foretrekkes det at probe-delen er festet til purinet eller pyrimidinet ved hjelp av en kjemisk binding eller "bindearm" slik at den lett kan reagere med antilegemer, andre detektor-proteiner eller kjemiske reagenser.

For det femte skal de fysiske og biokjemiske egenskaper

til polynukleotider som inneholder et lite antall av probe-

substituenter ikke forandres signifikant slik at de nu-værende fremgangsmåtene som bruker radioaktive hybridiseringsprober ikke behøve å modifiseres i utstrakt grad. Dette kriterium må tilfredsstilles enten probe innføres ved enzymatiske eller direkte kjemiske metoder.

Endelig skal den bindingen som fester probe-delen motstå

alle forsøksbetingelser som normale nukleotider og poly-nukleotider rutinemessig underkastes, f.eks. forlengede hybridiseringstider ved forhøyede temperaturer, ekstraksjon med fenol og organisk løsningsmidler, elektroforese osv.

Alle disse kriterier tilfredsstilles av de modifiserte nukleotidene som er beskrevet her.

Disse modifiserte nukleotidene har strukturen:

hvor B representerer en purin-, 7-deazapurin- eller pyrimi-11

din-del som er kovalent bundet til C -stillingen i sukkerdelen, forutsatt at når B er purin eller 7-deazapurin, er den festet til N°-stillingen i purinet eller 7-deazapurinet, og når B er pyrimidin, er den festet til N"*"-st ill ingen,

hvor A representerer en del som består av minst tre karbonatomer som er istand til å danne et påvisbart kompleks med et polypeptid når forbindelsen inblandes i en dobbelt-tvunnet ribonukleinsyre, deoksyribonukleinsyredupleks eller et DNA-RNA-hybrid,

hvor den prikkede linjen representerer en forbindelsesgruppe som forener B og A, forutsatt at dersom B er purin er bindingen festet til 8-stillingen av purinet, dersom B

er 7-deazapurin, er bindingen festet til 7-stillingen i deazapurinet, og dersom B er pyrimidin, er bindingen festet til 5-stillingen i pyrimidinet, og

hvor hver av x, y og z representerer

Disse forbindelser brukes meget som probe i biomedisinsk forskning og rekombinant DNA-teknologi.

Selvom i prinsippet alle forbindelser som omfattes av denne strukturformel kan fremstilles og anvendes ifølge praktiseringen av denne oppfinnelsen, fremstilles eller anvendes visse av forbindelsene lettere og foretrekkes derfor for tiden.

Selv om puriner, pyrimidiner og 7-deazapuriner i prinsippet er anvendbare, foretrekkes således pyrimidiner og 7-deazapuriner siden purinsubstitusjonen i 8-stillingen har en tendens til å gjøre nukleotidene ineffektive som polymerasesubstrater. Selv om således modifiserte puriner er anvendbare i noen henseender, er de ikke så generelt anvendbare som pyrimidiner og 7-deazpuriner. Dessuten må pyrimidiner og 7-deazapuriner som anvendbare i foreliggende oppfinnelse ikke være naturlig substituerte i hhv. 5-

eller 7-stillingene. Som resultat av dette er visse baser som f.eks. tymin, 5-metylcytosin og 5-hydroksymetyl-

cytosin ikke anvendbare. Baser som for tiden er foretrukket er cytosin, uracil, deazaadenin og deazaguanin.

A kan være en hvilken som helst del som har minst tre karbonatomer og er istand til å danne et påvisbart kompleks med et polypeptid når det modifiserte nukleotidet inkorporeres i et dobbelt-tvunnet dupleks inneholdende enten deoksyribonuklein- eller ribonuklein-syre.

A kan derfor være envær ligand som har disse egenskapene, inkludert haptener som bare er immunogene når de er festet til en passende bærer, men er istand til å reagere med passende antilegemer for å danne komplekser. Eksempler på deler som er anvendbare omfatter:

Av disse er de foretrukne A-delene biotin og iminobiotin.

Siden dessuten aromatiske deler har en tendens til å inn-skytes til en base-paret spiralformig struktur, foretrekkes det at delen A er ikke-aromatisk. Siden mindre deler også eventuelt ikke tillater tilstrekkelig molekylær-reaksjon med polypeptider, foretrekkes det at A er minst C^, slik at tilstrekkelig reaksjon kan opptre til å

tillate dannelse av stabile komplekser. Biotin og iminobiotin tilfredsstiller begge disse kriterier.

Bindingen eller gruppen som forbinder delen A med base B

kan omfatte enhver av de velkjente bindinger omfattende karbon-karbon enkeltbindinger, karbon-karbon dobbeltbindinger, karbon-nitrogen enkeltbindinger eller karbon-oksygen enkeltbindinger. Det foretrekkes imidlertid generelt at den kjemiske bindingen omfatter en olefinbinding ved a-stillingen i forhold til B. Nærvær av en slik a-olefinbinding tjener til å holde delen A vekk fra basen når basen parres med en annen i den velkjente dobbelt-spiralkonfigurasjonen. Dette gjør at reaksjonen med polypeptid opptrer lettere, hvorved kompleksdannelsen gjøres lettere. Enkeltbindinger med større rotasjonsfrihet kan dessuten ikke alltid holde delen tilstrekkelig vekk fra spiralen til å tillate gjen-kjennelser av og kompleksdannelse med polypeptidet.

Det foretrekkes enda mer at den kjemiske bindingsgruppen oppnås fra et primært amin, og har strukturen -Cr^-NH-,

siden slike bindinger lett dannes ved å anvende en hvilken som helst av de velkjente aminmodifikasjonsreaksjonene. Eksempler på foretrukne bindinger oppnådd fra allylamin og allyl-(3-amino-2-hydroksy-l-propyl)etergrupper har formlene hhv.

Selv om disse bindingene er foretrukket kan det brukes andre, inkludert spesielt olefin-bindearmer med andre modifiserbare funksjonaliteter som f.eks. tiol-, karboksylsyre-

og epoksyd-funksjonaliteter.

Bindegruppene festes i spesielle stillinger, nemlig 5-stillingen i et pyrimidin, 8-stillingen i et pyrin eller 7-stillingen i et deazapurin. Som angitt tidligere gir ikke substitusjon i 8-stillingen i et purin et modifisert nukleotid som er anvendbart i alle de fremgangsmåter som er diskutert her. Det kan være at 7-stillingen i et purin, som er opptatt av et nitrogenatom, kunne være punktet for bindingsfestet. De kjemiske, substitusjons-metodene som anvendes for tiden og er diskutert her, er imidlertid ikke egnet for dette formål.

Bokstavene x, y og z representerer grupper som er festet i 5'-3'- og 2'-stillingene i sukkerdelen. De kan være hvilke som helst av

Selv om det er tenkelig, er det usannsynlig at både x, y og

z samtidig vil være det samme. Det er mere sannsynlig at minst en av x, y og z vil være en fosfat-holdig gruppe,

enten mono-, di- eller tri-fosfat og at minst en vil være Ho- eller H-. Som det lett vil forståes vil den mest sannsynlige identiteten til z være HO- eller H- hvilket indikerer henholdsvis ribonukleotid eller deoksyribonukleotid. Eksempler på slike nukleotider omfatter 5<1->ribonukleosid-monofosfater, =<1->ribonukleosid-difosfater, 5<1->ribonukleosid-trifosfater, 5<1->deoksyribonukleosid-monofosfater, 5'-deoksy-ribonukleosid-difosfater, 5<1->deoksyribonukleosid-trifosfater, 5'p-ribonukleosid-3'p. og 5'p-deoksyribonukleosid3<1>p. Mere spesielle eksempler omfatter modifiserte nukleotider

av denne type hvori A er biotin eller iminobiotin, idet den kjemiske bindingen er

og B er uracil eller cytosin.

Den generelle syntetiske fremgangsmåten som tillempes for innføring av bindearmen og probe-delen på basen er diskutert ovenfor. (Se spesielt, J.L. Ruth og D.E. Bergstrom, J.Org. Chem., 4_3'2870, 1978, D. E. Bergstrom og M.K.Ogawa, J.Amer.Chem.Soc.100, 8106, 1978 og C.F.Bigge, P.Kalaritis, J.R.Deck og M.P. Mertes, J.Amer.Chem.Soc. 102, 2033, 1980.). De olefinsubstituenter som anvendes her, er imidlertid

ikke brukt tidligere. For å gjøre festingen av probe-delen A lettere er det funnet spesielt ønskelig å anvende olefiner med primære aminfunksjonelle grupper, som f.eks. allylamin [AA] eller allyl-(3-amino-2-hydroksy-l-propyl) eter [NAGE], som tillater probe-festing ved hjelp av standard amin modifikasjonsreaksjoner, som f.eks.

På grunn av den lette fremstilling foretrekkes det å bruke NHS-estere for probe-tilsetning. Det kan imidlertid også anvendes olefinbindearmer med andre modifiserbare funksjonelle grupper, som f.eks. tioler, karboksylsyrer, epoksyder og lignende. Videre kan både bindearm og probe tilsettes i et enkelt trinn om ønskelig.

Spesielt kan det fremstilles modifiserte nukleotider med strukturen:

hvori B representerer en purin-, 7-deazapurin eller pyrimidin-del som er kovalent bundet til C 1 •-stillingen i sukkerdelen, forutsatt at når B er purin eller 7-deazapurin, er den festet i N 9-stillingen i purinet eller deazapurinet, og når B er pyrimidin, er den festet i N^-stillingen,

hvor A representerer en del som består av minst tre karbonatomer som er istand til å danne et påvisbart kompleks med dets polypeptid når forbindelsen innføres i en dobbelt-tvunnet ribonukleinsyre, doksyribonukleinsyredupleks, DNA-RNA hybrid,

hvor den prikkede linjen representerer en kjemisk binding som forbinder B og A, forutsatt at dersom B er purin, er bindingen festet i 8-stillingen i purinet, dersom B er 7-deazapurin, er bindingen festet i 7-stillingen i deaza-

purinet, og dersom B er pyrimidin, er bindingen festet i 5-stillingen i pyrimidinet, og

hvor hver av x, y og z representerer

ved at:

(a) en forbindelse med strukturen

omsettes med et merkurisalt i et passende løsningsmiddel under passende betingelser, slik at det dannes en kvikksølv-forbindelse med strukturen: (b) nevnte kvikksølvforbindelse omsettes med en kjemisk del som er reaktiv med -Hg<+>-delen i nevnte kvikksølvfor-bindelse og representert med formelen * *'N, idet nevnte reaksjon utføres i et vandig løsningsmiddel og i nærvær av I^PdCl^under passende betingelser slik at det dannes en forbindelse med strukturen

hvori N er en reaktiv funksjonell endegruppe eller er A, og (c) nevnte forbindelse gjenvinnes som nevnte modifiserte nukleotid når N er A, eller når N er en reaktiv endegruppe, nevnte forbindelse omsettes med en forbindelse med struk-tuen M-A, hvori M representerer en funksjonell gruppe som er reaktiv med N i et vandig løsningsmiddel under passende betingelser, slik at nevnte modifiserte nukleotid dannes, hvilken så gjenvinnes.

Følgende skjema er illustrerende:

Selvom reaksjonene kan utføres ved hydrogenionekonsentrasjoner så lave som pH 1, eller så høye som pH 14, foretrekkes det å arbeide i området fra ca. 4 til ca. 8. Dette er spesielt tilfelle når det arbeides med ustabile forbindelser som f.eks. nukleosid polyfosfater, polynukleotider og nukleo-

tid koenzymer som hydrolyseres ved pH-verdier utenfor dette området. Likeledes foretrekkes det å arbeide ved en tempe-ratur i området fra ca. 20 til 30°C for å unngå mulig spaltning av labile organiske substrater. Reaksjonene kan imidlertid utføres ved temperaturer fra ca. 5 til 100°C.

Som det er vanlig med kjemiske reaksjoner, fremmer høyere temperaturer reaksjonshastigheten og lavere temperaturer senker den. I temperaturområdet fra 5 til 100°C kan således den optimale reaksjonstiden variere fra ca. 10 minutter til 98 timer. I det foretrukne temperaturområdet varierer reaksjonstidene normalt fra ca. 3 til ca. 24 timer.

Den foretrukne fremsgangsmåten for å bibeholde pH i det ønskede området er å bruke buffere. En rekke buffere kan anvendes. Disse omfatter f.eks. natrium- eller kalium-acetat-, natrium- eller kalium-citrat, kalium-citrat-fosfat-, tris-acetat og borat-natriumhydroksyd-buffere. Bufferkonsentrasjonen kan variere innenfor et bredt område, opp til ca. 2,0 molar.

Mens en spesiell fordel med merkurerings- og palladium-katalyserte addisjons-reaksjoner er at de kan utføres i vann, kan det med fordel innblandes små mengder av et organisk løsningsmiddel, som solubilitetshjel. De organiske løsningsmidlene som vanligvis velges er de som er bland-bare med vann. Disse kan velges fra etere, alkoholer, estere, ketoner, amider og lignende som f.eks. metanol, etanol, propanol, glycerol, dioksan, aceton, pyridin og dimetylformamid. Siden det imidlertid er observert at nærvær av alkoholer, som f.eks. metanol, ofte resulterer i alkoksy-addisjon over olefin-dobbeltbindingen, må

ethvert organisk løsningsmiddel som anvendes som solubili-tetshjelp velges omsorgsfullt. Innføring av alkoksy-substituenter til de eksosykliske a- eller 3-karbonatomene resulterer ofte i fremstilling av forbindelser som er mindre effektive for anvendelse som enzymsubstrater.

Selv om det kan anvendes forskjellige merkurisalter, er merkuriacetat det salt som for tiden foretrekkes. Som angitt tidligere, kan forbindelsene også fremstilles ved først å tilføre en bindearm og så delen A, eller ved å tilsette en bindearm som A allerede er festet til.

Således kan den kjemiske delen som er representert ved formelen ••*N være en hvilken som helst av de mange grupper som endelig resulterer i fremstilling av de ønskede forbindelsene .

Eksempler omfatter -CH=CH-CH2~NH2,

-CH=CH-CH2-0-CH2-CH-CH2-NH2, -CH=CH-CH2-NH-biotin og

OH

-CH=CH2-CH2-0-CH2-CH-CH2-NH-iminobiotin.

OH

Mengdene av reaktantene som anvendes i disse reaksjonene

kan variere meget. Generelt vil imidlertid mengene av ikke kvikksølvforbindelser, kvikksølvforbindelse og palladium-holdig forbindelse være i det vesentlige støkio-metriske mens merkurisaltet og forbindelsen<*>'"N vil være tilstede i molart overskudd, f.eks. 5-20 mol • • *N eller merkurisalt pr. mol av henholdsvis kikksølvforbindelse eller ikke-kvikksølvforbindele. I praksis vil mengdene variere avhengig av variasjoner i reaksjonsbetingelsene og den nøyaktige identiteten til reaktantene.

Det å ha biotin-probe direkte festet til nukleotid-derivater som er istand til å fungere som enzymsubstrater gir stor allsidighet, både i forsøksprotokollene som kan utføres og i påvisningsmetodene (mikroskopiske og ikke-mikroskopiske) som kan anvendes for analyse. Biotin-nukleotider kan eksempelvis innføres i polynukleotider som nettopp syntetiseres av celler eller rå celleekstrakter, hvilket gjør det mulig å påvise og/eller isolere voksende polynukleotidkjeder. En slik fremgangsmåte er umulig å gjennomføre ved en direkte kjemisk modifikasjonsmetode. Videre kan enzymer anvendes som reagenser for innføring

av prober, som f.eks. biotin, i høyselektive eller stillings-spesifikke steder i polynukleotider. Den kjemiske syntese av lignede probe-modifiserte produkter ville som best være meget vanskelig å oppnå.

Syntesen av nukleotider som inneholder biotin eller iminobiotin, ble oppnådd som angitt i detalj i de eksemplene som er angitt senere. Pyrimidin nukleosid trifosfater som inneholder en av disse prober festet til C-5-karbonatomet, var fra gode til utmerkede substrater for en lang rekke rensede nukleinsyrepolymeriaser av både prokaryotisk og eukaryotisk opprinnelse. Disse omfatter DNA-polymerase I fr E. coli, bakteriofag T4 DNA-polymerase, DNA-polymeraser a og 3 fra murin (A-9 og humane (HeLa)-celler av DNA-polymerase fra Herpes simplex-virus. Bekreftende data ble oppnådd med E. coli DNA-polymerase I ved bruk av enten snitt-overførings-tilstanden til R;'„gby, et al. (P.W.J. Rigby, M.Dieckmann, C. Rhodes og P. Berg, J. Mol.Biol. 113, 237, 1977) eller den spalte-fyllende reaksjon beskrevet av Bourguignon et al. (G.J. Bourguignon, P.J. Tattersall og D.C. Ward, J.Virol. 20, 290, 1976). Bio-dUTP er også funnet å

fungere som et polymerasesubstrat både i CHO-celler, som er permeabilisert ved behandling med lysolecitin ifølge metoden til Miller, et al. (M.R. Miller, J.C. Castellot,

Jr. og A.B. Pardee, Exp. Cell Res. 120, 421, 1979) og i et kjernereproduksjons-system fremstilt fra Herpes simplex-infiserte BHK-celler. Selvom biotinyl-ribonukleosid-trifosfater ble funnet å fungere som substrater for . RNA-polymerase av Ecoli og bakteriofag T7, anvendes de

ikke så effektivt som deres deoksyribonukleotid-trifosfat-motstykker. De innføres faktisk dårlig om i det hele tatt, av de eukaryotiske RNA-polymeraser som er undersøkt

(HeLa celle RNA-polymerase III,Kalve tymus RNA-polymerase

II og muse-celle RNA-polymerase II). Mens dette begrensede området forsubstratfunksjon begrenser anvendbarheten i noen in vivo- eller in vitro-kopierinsforsøk, kan biotin-merkede RNA-prober fremstilles enzymatisk fra DNA-sjabloner ved å bruke E. coli- eller T7 RNA-polymeraser eller ved 3' endemerkingsmetoder ved bruk av RNA-ligase med forbindelser som f.eks. biotinyl-pCp. AA- og NAGE-derivater av UTP er imidlertid substrater for de eukaryotiske RNA-polymerasene som er nevnt ovenfor. Med tilgjengelighet av antilegemer til disse analogene skulle isolasjonen av voksende etterligninger ved hjelp av immunologiske eller affinitetsfremgangsmåter være mulig.

Den enzymatiske polymerisasjonen av nukleotider inne-

holdende biotin- eller iminobiotin-substituenter ble ikke overvåket direkte, siden ingen av disse prober var radio-merket. To forsøksrekker viser imidlertid klart at biotinyl-nukleotider var innført. Det første er at polynukleotider som var syntetisert i nærvær av biotin-nukleotider tilbakeholdes selektivt når de kromatograferes over avidin- eller streptavidin-affinitetskolonner.

(Tabellene I og II). Mens normal DNA som eksempelvis er snittoverført med 3 2 P-dAMP, elueres kvantitativt med tilsetning av 0,5 M NaCl, forblir hovedmengden av biotinyl-DNA eller iminobiotinyl-DNA bundet til harpiksen selv etter utstrakt vasking med sterk saltløsning, urea, guanidin-HCl, formamid. eller 50 mM NaOH. Den lille del av det radiomerkede som elueres ved hjelp av disse vaskebetingelser, tilbakeholdes ikke når den påføres på harpiksen den andre gang, hvilket antyder at radioaktiviteten er forbundet med DNA-fragmenter som er fri for biotinsubstitusjon. Den andre bevisrekken er at bare biotin-merkede polynukleotider immunoutfelles når de behandles med renset anti-biotin IgG fulgt av formalin-fiksert Staphylococcus aureus . (Tabell III). Det er klart fra data i disse tabellene at ekstremt små mengder biotin kan påvises ved hjelp av denne metoden. Disse resultatene viser også at biotin-molekylene kan oppdages ved hjelp av avidin, streptavidin eller spesifikke antilegemer mens DNA fortsatt er i sin native, dobbelt-tvunne form, en tilstand som er absolutt avgjørende dersom anti-legemerbindingen eller avidin-affinitets-forsøkene skal være anvendbare ved probe-påvisning under anvendelse av hybridiseringsteknikker.

Det er således mulig å fremstille nye forbindelser med strukturen:

hvori hver av B, B' og B" representerer en purin-, deaza-

1' purin- eller pyrimidin-del som er kovalent bundet til C stillingen i sukkerdelen, forutsatt at når B,B', eller B"

er purin eller 7-deazapurin, er den festet i N 9-stillingen i purinet eller deazapurinet, og når B,B' eller B" er pyrimidin, er den festet i N^-stillingen,

hvor A representerer en del som består av minst tre karbonatomer som er istand til å danne et påvisbart kompleks med et polypeptid når forbindelsen innføres i en dobelt-tvunnet dupleks dannet med en komplementær ribonuklein- eller deoksyribonuklein-syremolekyl,

hvori den prikkede linjen representerer en bindegruppe som forener B og A, forutsatt at dersom B er purin, er bindingen festet til 8-stillingen i purinet, dersom B er 7-deazapurin,^er bindingen festet til 7-stillingen i deazapurinet og dersom B er pyrimidin, er bindingen festet til 5-stillingen i pyrimidinet,

hvori z representerer H- eller HO-, og

hvori m og n representerer tall fra 0 opp til ca. 100.000.

Det er naturligvis lett å forstå at generelt vil ikke m og

n samtidig være 0 siden forbindelsen i så tilfelle bare blir et modifisert nukleotid som beskrevet tidligere. Generelt vil B' og B" variere innenfor det samme oligo- eller poly-nukleotid, og er alternativt uracil, cytosin, thymin, guanin, adenin eller lignende. Generelt vil variasjonen også tilsvare den ordnede sekvens av nukleotider som koder for syntesen av peptider ifølge den vel kjent Genetiske kode. Det er imidlertid meningen at den viste strukturen også skal omfatte polynukleotider som poly C, poly U, poly r(A-U og poly d(A-U) såvel som kalve tymus DNA, ribosomal RNA av E. coli eller gjær, bakteriofag RNA og DNA (R17, fd), dyrevirus (SV40 DNA), kromosomal DNA, og lignende, forutsatt

bare at polynukleotidene modifiseres ifølge foreliggende oppfinnelse.

Det skal også forståes at strukturen omfatter mer enn en modifisert nukleotid i oligomeren eller polymeren, f.eks. fra to til tredve modifiserte nukleotider. Den kritiske faktor når det gjelder dette er at antallet modifikasjoner ikke skal være så stort at polynukleotidet gjøres ineffek-tivt for den tenkte anvendelse.

Endelig skal det forståes at modifiserte oligo- og polynukleotider kan forenes for å danne større enheter med den samme struktur så lenge som endegruppene gjøres forenelige eller reaktive.

Disse forbindelser kan fremstilles ved enzymatisk polymeri-sasjon av passende nukleotider, spesielt nukleotidtrifos-fater i nærvær av en nukleinsyresjablon som styrer syntesen under passende betingelser. Slike betingelser kan variere meget avhengig av det enzym som anvendes, mengdene av nukleotider som er tilstede og andre variabler. Illustrerende enzymer omfatter DNA-polymerase I av E. coli , bakteriofag T 4 DNA-polymerase, DNA-polymeraser a og 3 fra murin og humane (HeLa) celler, DNA-polymerase fra Herpes simplex-virus, RNA-polymerase av E. coli, RNA-polymerase av bakteriofag T7, eukaryocisk RNA-polymerase omfattende HeLa-celle RNA-polymerase III, kalvetymus RNA-polymerase II og muse-celle RNA-polymerase II.

Forbindelsene kan også fremstilles ved endeaddisjon til oligo- eller poly-nukleotider for å fremstille forbindelser hvor m eller n er 0 avhengig av om addisjonen foregår i 5'-eller 3<1->stillingen. Ennvidere kan forbindelser som f.eks. pCp eller pUp i-hvilke basen er biotinisert, tilsettes til eksisterende molekyler ved å anvende enzymet RNA-ligase.

Modifiserte oligo- og polynukleotider kan også fremstilles ved kjemisk modifikasjon av eksisterende oligo- eller polynukleotider ved bruk av den fremsgangsmåten som er beskrevet tidligere for modifikasjon av enkelte nukleotider.

De forskjellige modifiserte nukleotider, oligonukleotider

og polynukleotidene ifølge oppfinnelsen kanåvises ved å bringe forbindelsene i kontakt med polypeptidene som kan danne komplekser med dem under passende betingelser slik at det dannes komplekser, forutsatt at polypeptidene omfatter en eller flere deler som kan påvises når komplekset eller kompleksene dannes>generelt ved hjelp av konvensjonelle påvisningsteknikker.

En polypeptid-detektor for fen sonde av biotinyl-typen er avidin. Reaksjonen mellom avidin og biotin oppviser en av de tetteste ikke-kovalentbindingskonstantene (K .,. =10-"1" )

^ dis

som er funnet i naturen. Dersom avidin kobles med potensielt påvisbare indikatormolekyler, f.eks. fluorescerende farve-stoffer (fluoroscein, rhodamin), elektron-tette reagenser (ferritin, hemocyanin, kolloidalt gull) eller enzymer

som er istand til å utfelle uløselige reaksjonsprodukter (peroksidase, alkalisk fosfatase)kan nærværet, beliggenheten og/eller mengden av biotinsonden fastslås.

Avidin har uheldigvis en egenskap som gjør det mindre ønskelig som biotin-indikatorprotein når det brukes i forbindelse med nukleinsyrer eller kromatinmaterialer.

Det er rapportert (M.H. Heggeness, Stain Technol. , 5_2, 165, 1977,M.H. Heggeness og J.F. Ash, J. Cell. Biol., JA'783>1977, E.A. Bayer og M. Wilchek, Methods of Biochemical Analysis 26, 1, 1980) at avidin bindes fast til kondensert kromatin eller til subcellulære fraksjoner som inneholder store mengder nukleinsyre på en måte som er uavhengig av dets biotin-bindende evne. Siden avidin er et basisk glykoprotein med en pl på 10,5, er dets histon-lignende karakter eller dets karbohydrat-deler mest sannsynlig

ansvarlig for disse observerte ikke-spesifikke reaksjoner.

En foretrukken sonde for biotin-holdige nukleotider og derivater er streptavidin, et avidin-lignende protein som syntetiseres ved hjelp av jordorganismen Streptomyces avidinii. Dets fremstilling og rensing er beskrevet i Hoffman, et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 7J_, 4666 (1980). Streptavidin har

en meget lavere pl (5,0), er ikke-glykosylert og viser meget lavere ikke-spesifikbinding til DNA enn avidin og har derfor potensielle fordeler ved anvendelse som om-

fatter metoder for nukleinsyrepåvisning.

Det mest foretrukne protein for biotin-lignende sonde-påvisning er monospesifikt kanin IgG, antibiotin immunoglobulin. Denne forbindelse ble fremstilt ved immunisering av kaniner

med okseserumalbumin konjugert biotin som beskrevet tidligere.

(M. Berger, Methods in Enzymology, 6_2, 319 (1979)) og renset ved affinitetskromatografi. Selvom assosiasjonskonstanten til immunoglobulin-haptener har verdier på Kassn(10 til

-ji^q assn

10 ) som er betydelig lavere enn for avidin-biotin-komplekser, er de i det vesentlige ekvivalente med de som observeres hos avidin-iminobiotin-komplekset. Videre har anti-biotin-antilegemene vist seg svært anvendbare for påvisning av spesifikke polynukleotidsekvenser på kromo-

somer ved in situ hybridisering siden liten, om noen, ikke-spesifikk binding av antilegemet til kromatinmaterialet forekommer.

De modifiserte polynukleotidene ifølge oppfinnelsen er istand til denaturering og renaturering under betingelser som er forenelige med deres bruk som hybridiseringssonder. En analyse av varmedenatureringsprofilene og hybridiseringsegenskapene til flere biotin-substituerte DNA og RNA-poly-merer indikerer dette klart. Eksempelvis har pBR 322 DNA ellerX^DNA, som er snitt-overført for å innføre ca. 10-100 biotinrester pr. kilobase, Tm-verdier som er i det vesentlige identiske med de til kontrollen, biotin-fri DNA. Videre oppviser 32p-merket, biotin-substituert, pBR 322 DNA, den samme grad av spesifitet og autoradiografisk signalintensi-tet som kontrollen, thymidin-holdig DNA, når den brukes som en hybridiserings-sonde for påvisning av bakteriekolonier inneholdende plasmidet.

I DNA-duplekser, som f.eks. MVM RF DNA, i hvilke hver thymidinrest i en streng (1250 totalt pr. 5 Kb) erstattes med et biotinyl-nukleotid, er Tm bare 5°C mindre enn den til den usubstituerte kontrollen. Selvom Tm til poly d(A-bicU) hvori hvert basepar inneholder en bio-dUMP-rest er 15°C lavere enn poly d(A-T)-kontrollen, var graden av samarbeids-evne og graden av hyperkromitet som ble observert både under denaturering og renaturering den samme for de to polymerene. En parallellanalyse av RNA-dupleks og DNA/RNA-hybrider indikerer at deres Tm også avtar når biotin-innholdet i polymeren øker. Det er imidlertid klart at et vesentlig antall biotin-molekyler kan innføres uten signifikant å forandre hybridiseringsegenskapene til polymerene.

Disse resultater antyder i sterk grad at biotin-substituerte polynukleotider kan anvendes som sonder for påvisning og/eller lokalisering av spesifikke polynukleotidsekvenser i kromosomer, fikserte celler, eller vevseksjoner. Den generelle protokoll for påvisning av den biotin-substituerte sonden er skjematisk illustrert som følger: Dette generelle skjema illustrerer bare fremgangsmåter som anvendes for gene-kartlegging (cytogenetik), og rekombi-nante DNA-teknologier. Det kan imidlertid like godt anvendes for påvisning av nukleinsyresekvenser av bakteriell, virus-, sopp- eller parasittopprinnelse i kliniske prøver og dette danner basis for en viktig ny fremgangsmåte for klinisk diagnostikk som ikke baserer seg på bruken av radioisotoper.

Immunologiske og histokjemiske metoder for påvisning av biotin har vist at grunnfremgangsmåten er anvendbar for rask metode for genekartlegging av in situ hybridisering og ikke-radioaktive fremgangsmåter for påvisning av spesifikke nukleinsyresekvenser ved hjelp av flekkhybridiserings-metoder. Det kan gjøres bruk av denne teknologi ved utvikling av nye kliniske diagnosefremgangsmåter.

Ved å bruke denne metoden, er det mulig å bestemme nærvær av en spesifikk deoksyribonuklein- eller ribonuklein-syremolekyl, spesielt en slik molekyl som er oppnådd fra en levende organisme, f.eks. bakterier, sopp, virus, gjær eller pattedyr. Dette tillater i sin tur diagnose av nukleid-syre-holdige etiologiske midler hos en pasient eller et annet vesen.

Dessuten tilveiebringer det en metode for sikting av bakterier for å bestemme antibiotisk resistans. Således kan det eksempelvis bestemmes penicillinresistans hos Streptococcus pyogenes eller Neisseris meningitidis, tetra-cyklinresistans hos Staphylococcus aureus, Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pyogenes eller Neisseria gonorrhoeae og aminoglykosidresistans hos Mycobacterium tuberculosis.

I disse metodene fremstilles et polynukleotid som er komplementært til den nukleinsyresekvensen som karakteri-serer organismen eller dens antibiotiske resistans og som i tillegg omfatter et eller flere modifiserte nukleotider ifølge oppfinnelsen. Dette polynukleotid hybridiseres med nukleinsyre oppnådd fra den organisme som undersøkes. Svikt når det gjelder hybridisering angir fravær av organismen eller av resistansegenskaper. Hybridiserte nukleinsyreduplekser identifiseres så ved å danne et kompleks mellom duplekset og et passende polypeptid, som bærer en påvisbar del, og påvise nærvær av komplekset ved bruk av en passende påvisningsteknikk. Positiv påvisning indikerer at komplekset, duplekset og derfor den interresante nukleinsyresekvensen er tilstede.

Denne fremgangsmåten kan utstrekkes til diagnosen av genetiske sykdommer, som f.eks. thalassemi og sigdcelleanemi. Deoksyribonukleotidsyre genesekvensen hvis nærvær eller fravær (når det gjelder thalassemi) er forbundet med sykdommen kan påvises ved å følge hybridisering med en polynukleotid probe ifølge oppfinnelsen, basert på kompleksdannelse med et passende påvisbart polypeptid.

Kartlegging av gener eller deres etterligninger til spesiell beliggenhet på kromosomer har vært et vidløftig og tid-krevende arbeid, som i hovedsak omfatter teknikker med cellefusjon og somatisk cellegenetikk. Selvom hybridisering in situ med hell har vært anvendt for kartlegging av enkelt-kopier av genesekvenser i arter som undergår kromosom-polytenisasjon, som f.eks. Drosophila har påvisning av gener med spesielle sekvenser i de fleste høyere eukaryotiske kromosomer vært meget vanskelig, om ikke umulig, ved bruk av standard hybridiseringsmetoder. Nødvendigheten av polynukleotid prober med meget høy spesifik radioaktivitet for å lette autoradiografisk lokalisering av hybridiserings-stillinger resulterer i rask radionedbrytning av proben og en ledsagende økning i bakgrunnsstøyen av sølvkornavsetningen. Bruken av hybridiseringsprober med lave til moderate spesifikke radioaktiviteter krever eksponeringstider på mange dager eller uker, selv for å påvise flerkopisekvenser, som f.eks. ribosomale RNA-gener eller satelitt-DNA. Siden rekombinant DNA-teknologi har gjort den molekylære kloning av i det vesentlige enhver enkelt-kopisekvens som finnes i eukaryotiske celler mulig, ville det være meget nyttig å ha en rask og følsom metode for kartlegging av kromo-somopprinnelsen til slike klonede genomiske fragmenter.

Modifiserte nukleotider kan anvendes i fremgangsmåter for genekartlegging ved hjelp av in situ -hybridisering som omgår bruken av radioisotoper. Denne fremgangsmåten anvender seg av en thymidinanalog som inneholder biotin som kan innføres enzymatisk i DNA prober ved snittoverføring. Etter hybridisering in situ tjener botinmolekylene som antigener for affinitetsrensede anti-biotin-antilegemer fra kaniner. Immunofluorescerende antilegeme-sandwiches fremstilt med fluorescein-merket geit anti-kanin IgG muliggjør rask og spesifikk cytogenetisk lokalisering av klonede genesekvenser som grønn-gule bånd. Denne metoden har fire hovedfordeler sammenlignet med konvensjonelle autoradiografiske metoder med in situ genelokalisering, mindre bakgrunnsstøy, enøkning av oppløsningsstyrke mellom båndene, en minskning i den tiden som kreves for å bestemme stillingen til probe-hybridisering, og kjemisk stabile hybridiseringsprober.

Denne fremgangsmåten er anvendt med hell for lokalisering

av gjentatte og enkelte DNA-sekvenser i polytenkromosomet til Drosophila milanogaster og satelitt DNA på muse metafase-kromosomer.

Det er således funnet at polytenkromosomer kan anvendes som et testsystem for fastslåing av effektiviteten til prober ved bruk av de modifiserte nukleotider ifølge foreliggende oppfinnelse slik det påvises ved indirekte immunofluorescens for gene-kartlegging in situ. Probene omfattet en rekke klonede Drosophila sekvenser oppnådd fra Otto Schmidt og Dieter Soll, som f.eks. tRNA-gener som er klonet i plasmid-vektorer med innføringer med størrelser i området fra ca.

5 til ca. 22 kilobaser. Mange av disse kloner er allerede anvist til spesielle bånd på kromosomkartet til Drosophila ved hjelp av konvensjonelle in situ hybridiseringsmetoder under anvendelse av radioisotoper.

DNA-prober ble nick-overført i nærvær av Bio-dUTP. Av og

til ble 3 H dATP og/eller<3>H dCTP innført i snittoverførings-reaksjonsblandingen. Dette muliggjorde både autoradiografisk og immunofluorescent lokalisering av en sekvens på en enkelt kromosomspredning. In situ hybridisering ble ut-ført som beskrevet i M.L. Pardue, og J.G. Gall, Methods in Cell Biol., 10, 1 (1975). Etter den endelige 2 x SSC vasking for å fjerne uhybridisert probe, ble glassene renset med PBS (fosfatbuffered saltløsning) og inkubert ved 37°C med 2,5^ug/ml kanin-anti-biotin i PBS og 10.mg/ml BSA i 2-16 timer. Dette ble fulgt av inkubering av glassene med FITC-merket geit-anti-kanin IgG (Miles Laboratories, fortynnet 1:100 i PBS og 10 mg/ml BSA) i en-fire timer. Evans-blått var ofte nødvendig som en rød motfarve for å se kromosomene med fluorescerende belysning.

Når plasmider pBR 17D og pPW 539 som inneholder 5 Kb og 22 Kb, innføringer ble hybridisert ved hjelp av denne metoden, ble det funnet at hybridiseringsmønsteret er reproduserbart fra spredning til spredning og observeres utvetydig på

mere enn 90% av kromosomspredningene på et gitt objektglass.

Det klonede overflyttbare elementet pAC 104 er kjent å kunne innpasses på mange steder langs Drosophila genom. Sammen-ligning mellom autoradiogrammet og det fluorescerende bilde som oppnås ved in situ hybridisering av denne probe illustrerer en hovedfordel ved denne fremgangsmåte, dvs. at der hvor det opptrer diffuse regioner av sølvkorn på et autoradiogram, kan det skilles ut dubletter eller en serie bånd ved immunofluoreserende merking.

Den andre umiddelbart selvklare fordel med denne metoden er den betydelig mindre tid som kreves for geneutpeking ved indirekte immunofluorescens. En utpeking av et DNA-fragment til et spesielt bånd innen seks timer av hybridisering.

Dette kan sammenlignes med dager eller uker som kreves

for autoradiografiske eksponeringsmetoder. Denne faktor i kombinasjon med øket oppløsning, gjør bruken av modifiserte nukleotider påvist ved indirekte immunofluorescens umiddelbart å foretrekke fremfor de mere klassiske metodene.

Det er vist at denne immunologiske metoden også kan gjennom-føres med pattedyrkromosomer hvori satelitt DNA er funnet å ligge i de geometriske tyngdepunktsområdene i muse- . metafase-kromosomer. Resultatene utgjør et grunnlag for utvikling av en enkel gene-kartleggingsfremgangsmåte for enkle kopi-sekvenser i kromosomer fra mennesker og andre pattedyr. En slik fremgangsmåte vil lette vår forståelse av den genetiske organisasjonen i kromosomene meget og gjøre klinisk cytogenetisk diagnoser meget raskere og mere praktisk.

Mens en enkelt-trinns "antilegeme-sandwich"-metode, hvori kromosomspredningen undersøkes, etter-hybridisering, med kanin anti-biotin IgG kan dekkes, kan denne protokoll eventuelt ikke generere tilstrekkelig fluorescens for utvetydig gene-utpeking. Et meget sterkere fluorometrisk signal kan imidlertid oppnås ved å bruke "hapten-antilegeme sandwich teknikken" beskrevet av Lamm, et al. (1972),

Wofsy, et al., (1)74). I denne fremgangsmåten modifiseres det primære antilegemet, i vårt tilfelle monospesifikt,

kanin anti-biotin IgG, kjemisk med et hapteniseringsreagens, som f.eks. 2,4-dinitrofluorbenzen, fortrinnsvis mens immuno-globulinet er bundet til en antigenaffinitetkolonne (biotin-Sepharose TM). Så mange som 15-20 hapten (DNP)-grupper kan kobles til det primære antilegemet uten å minske dets antigen-bindende affinitet eller spesifisitet (Wallace og Wofsy, 1979). Dersom den primære antilegemebehandlingen

av prøven følges av en inkubering med et fluorescerende - merket anti-hapten IgG-antilegeme, i steden for et fluorescer-

ende merket anti-IgG, kan det oppnås en 5-7 gangers økning i fluorescens-signal. Siden det også er tilgjengelig monospesifikt marsvin anti-DNP IgG, kan dette sekundære antilegeme hapteniseres med biotin og således generere to anti-hapten IgG-populasjoner, DNP-merket anti-biotin IgG

og biotin-merket anti-DNP IgG. Dersom disse kan anvendes alternerende for å oppnå flere runder med hapten-antilegeme-sandwich-dannelse og så følges av fluorescerende merket protein A fra S taphylococcus aureus, som binder set spesifikt til IgG molekyler fra mange pattedyrarter,

kunne det resultere i en enorm forsterkning av det primære antilegeme-signaler med påfølgende anvendbarhet.

Proteinet streptavidin fra Streptomyces avidini er et potensielt alternativ til anti-biotin IgG som et hjelpe-middel for spesiefikt å rette et koblet synliggjørings-system [f.eks. fluorescerende prober (ovenfor) eller histokjemiske reagenser (nedenfor)] til stedet for det hybridiserte biotin-holdige polynukleotidet. En av streptavidinets fordeler fremfor anti-biotin IgG er at dets affinitet for biotin er Kassn=10 15 m7ensassosiasions-konstanter for hapten-IgG-reaksjoner er 10 til 10 . Den høye reaksjonshastigheten og ekstreme affiniteten betyr at den tid som kreves for å lokalisere den biotiniserte proben, vil være minutter med streptavidin mot timer med immunologiske reagenser.

Begynnende vurderinger av et streptavidin-påvisningssystem er fortiden i gang. Polyten-kromosomer som er hybridisert med biotiniserte DNA-prober vil inkuberes med streptavidin fulgt av en påfølgende inkubering med okse-serumalbumin, som er dobbelt-merket med biotin og FITC (FITC, biotinyl-BSA). Siden bare en av de fire streptavidinunderenhetene antas å være involvert i binding ved hvert biotinisert DNA-sted, kan potensielt en merket BSA-molekyl binde seg til hver av de gjenværende tre ikke-konjugerte underenheter i streptavidin-biotinyl-nukleotid-komplekset. Fluorescens- signalet fra dette enkle streptavidin + FITC, biotinylBSA-skiktet vil bli sammenlignet med en kontroll ved bruk av den grunnleggende "antilegeme-sandwich-metoden" som er beskrevet tidligere.

Dersom "antilegeme-Sandwich" og streptavidin + FITC, biotinyl-BSA-påvisningsintensiteter er sammenlignbare, kan det gjøres forsøk på utøke streptavidin + FITC, biotinyl-BSA-systemet til enkelt-kopi kopifølsomhet på em måte som er parallell med den multiple "hapten-antilegeme-sandwich"-metoden.

Siden noen av biotin-gruppene på BSA ikke vil være bundet til det første skiktet av streptavidin, kan det tilsettes et andre skikt av streptavidin inntil det oppnås et tilstrekkelig signal. Dersom eksempelvis i det andre skiktet bare to streptavidin-protomerer bindes til hvert første skikt BSA og hver av disse streptavidin-protomerer bindes tre FITC-biotinyl BSA-molekyler, så vil intensiteten i det andre skiktet være to ganger så stor som den fra det første skiktet, for det tredje skiktet, med analoge binde-støkio-metrier, vil fluorescens-intensiteten være 12-ganger så

stor som i det første skiktet, slik at den totale intensiteten raskt vil øke med suksessivt tilførte skikt.

Det er planer om å bruke et større bæreprotein som f.eks. thyroglobulin i steden for BSA for å maksimere mengdene av festede fluorescens- og biotin-prober. Det kan også være nødvendig å bruke en lengere bindearm mellom biotinproben og bæreproteinet. En lengere bindearm skulle sterisk optimere den teoretiske avlevering av en biotinisert fluorescerende bærermolekyl til hver ikke-konjugert streptavidin-under-enhet og maksimere antallet av streptavidinprotomere i det påfølgende skikt som vil bindes til den biotiniserte, fluorescerende bærer. Som tidligere vil passende kontroller bli utført for å sikre at substitusjon av bærerproteinet med fluorescerende prober og biotin ikke forårsaker løselig-hets- og/eller ikke-spesifikke bindingsproblemer. Streptavidin-bærerprotein-avleveringssystemet har to signifikante fordeler sammenlignet med den immunfluorescente metoden i tillegg til dens avleveringshastighet. For det første behøves bare to proteinbestanddeler for å

danne skiktene. For det andre behøver bare bærerproteinet å modifiseres og det er ikke nødvendig å bibeholde funksjonell eller til og med total strukturell integritet så lenge som biotingruppene er tilgjengelige for streptavidin.

Et alternativ til fluorescensmetoden for synliggjøring av hybridiserte sonder er å rette enzymer som f.eks. peroksydase, alkalisk fosfatase av 3-galaktosidase til hybridi-seringsstedet hvor enzymatisk omdannelse av løselige substrater til uløselige farvede utfelninger, muliggjør lysmikroskopisk synliggjøring. Den store fordel med denne teknikken er at de histokjemiske metodene er 10 til 100 ganger så følsomme som fluorecenspåvisningen. I tillegg blekner ikke de farvede utfellingene ved for stor lyseksponering og således unngår en av hovedulempene ved fluoreserende lysmikroskopi. Disse enzymer kan kobles til det siste antilegemet i steden for fluorescerende prober i "hapten-antilegeme-sandwich"-teknikken ved bruk av bifunksjonelle reagenser som f.eks. glutaraldehyd eller når det gjelder peroksydase via oksydasjon av peroksydase-karbohydrat-andelene til aldehyder og kobling av disse restene med e-amino-grupper i det ønskede protein. For metoden med streptavidin-biotinisert bæreprotein kunne et enzym med tilkoblede biotinylgrupper erstatte et fluorescens-biotinisert bærersystem. Alternativt kunne enzymet kobles via biotin til det siste skiktet av streptavidin idet forsterkning av streptavidin-steder bygges opp i de foregående skikt ved bruk av biotinisert BSA eller tyroglobulin. I den nærmeste fremtid skal det utvikles de nødvendige histokjemiske reagenser og de passende substrat/uløselig produktkombinasjoner for synliggjøring av i n situ hybridiseringer uten bakgrunns-problemer. De histokjemiske metodene for signalforsterkning

skulle derfor være klare for forsøk sommeren 1981.

Påvisning og/eller avbilding av meget lave nivåer av fluoreserende lys er mulig ved bruk av bilde-forsterkere eller--systemer som fortiden er tilgjengelig og som består av lasere og fotomultiplikatorer. Disse metoder tillater påvisning av lys ned til nivået for enkelte fotoner. Med passende digital behandlingssystemer kan det produseres bilder i hvilke hvert punkt i bildet er strengt proporsjonalt med antallet fotoner som avgis fra et punkt på objektet. Ved bruk av systemer av dette slag eller strømningssystemer i hvilke cellene eller deler av dellene størmmer forbi en laserstråle, kan det oppnås økninger av påvisningsfølsomheten for fluoreserende materialer på faktorer mellom 100 og 1000 utover det som kan påvises med øyet. Denneøkning er tilstrekkelig til å påvise fluorescensen fra enkeltkopigener.

I en foretrukket modifikasjon er det syntetisert analoger

av dUTP og UTP som inneholder et biotin-molekyl som er kovalent bundet til C-5-stillingen i pyrimidinringen ved hjelp av en allylamin-bindearm. Disse biotinyl-nukleotidene er effektive substrater for en rekke DNA og RNA-polymeraser in vitro. DNA inneholdende lave nivåer av biotinsubstitusjon (50 molekyler eller mindre/kilobaser)

har denaturerings-, reassosiasjons- og hybridiserings-egenskaper som ikke er til å skjeldne fra de hos usubsti-tuert kontroll DNA.

Således tilveiebringer foreliggende oppfinnelse også en metode for kromosom-karyotyping. I denne metoden fremstilles modifiserte polynukleotider som tilsvarer kjente gener og inkluderer modifiserte nukleotider. Visse polynukleotider hybridiseres med kromosomisk deoksyribonukleinsyre og de resulterende duplekser bringes i kontakt med passende polypeptider under passendé betingelser for å tillate kompleksdannelse.Polypeptidene omfatter påvisbare andeler slik at kompleksenes beliggenhet kan bestemmes og beliggenheten til spesielle gener derved fikseres.

En annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse omfatter påvisning av poly A-holdige sekvenser ved bruk av poly U i hvilken noen av urasilbasene er modifisert slik at de inneholder en probe. Ennu en annen utførelsesform omfatter cyklisk modifiserte nukleotider i hvilke to av x, y og z omsettes for å danne den cykliske andelen

Slike cyklisk modifiserte nukleotider kan så anvendes for

å identifisere hormonreceptorsteder på celleoverflatene som i sin tur kan anvendes som en metode for å påvise cancer eller tumor-celler.

Endelig kan tumorceller diagnostiseres ved fremstilling av polynukleotider som er modifisert ifølge foreliggende oppfinnelse og er komplementærer til den forløperribo-nukleinsyren som er syntetisert fra en deoksyribonuklein-

syre genesekvens, som er forbundet med fremstillingen av polypeptider, som f.eks. a-fosterprotein eller karcinoembry-onisk antigen, hvis nærvær er en diagnose på spesifikke fumor-celler. Hybridisering og påvisning av hybride du-

plekser ville således utgjøre en fremgangsåte for påvisning av tumor-cellene.

De eksempler som følger er angitt for å illustrere forskjellige aspekter ved foreliggende oppfinnelse, men er ikke ment å begrense dens område på noen måte slik det mere spesielt er angitt i kravene.

Eksempel 1 og 2

Syntese av biotinyl - UTP og biotinyl - dUTP

a) Fremstilling av merkurerte nukleotider

UTP (570 mg, 1,0 mmol) eller dUTP 554 mg, 1,0 mmol) ble

oppløst i 100 ml 0,1 M natriumacetatbuffer pH 6,0 og merkuri-acetat (1,59 gm, 5,0 mmol) tilsatt. Løsningen ble oppvarmet til 50°C i 4 timer, og så avkjølt på is. Litium-klorid (392 mg 9,0 mmol) ble tilsatt og løsningen ekstrahert seks ganger med et likt volum av etylacetat for å fjerne overskudd HgCl2. Effektiviteten til ekstrak-sjonsprosessen ble kontrollert ved bestemmelse av merkuri-ionkonsentrasjonen i det organiske skikte ved bruk av 4,4'-bis (dimetylamino)-tiobenzofenon (A.N. Cristoper, Analyst, 94_, 392 (1969) . Graden av nukleotid merkurering, bestemt spektrofotometrisk etter iodering av en aliquot av den vandige løsningen som beskrevet av Dale et al. (R.M.K. Dale, D.C. Ward, D.C. Livingston, og E. Martin, Nucleic

Acid Res. 2, 915 [1975]), var rutinemessig mellom 90 og 100%. Nukleotidproduktene i det vandige skiktet, som ofte ble uklar under etylacetatekstraksjonen, ble utfelt ved tilsetning av tre volumer av iskold etanol og oppsamlet ved centrifugering. Bunnfallet ble vasket to ganger med kald absolutt etanol, en gang med etyleter og så lufttørket. De således fremstilte merkurerte nukleotider ble brukt for syntese av allylamin-nukleotider uten ytterligere rensning.

b) Syntese av allylamin - dUTP og allylamin - UTP

De merkurerte nukleotider (fra tinn a) ble oppløst i

0,1 M natriumacetatbuffer ved pH 5,0 og justert til en konsentrasjon på 20 mM (200 OD/ml ved 267 nm). En ny 2,0

M løsning av allylaminacetat i vandig eddiksyre ble fremstilt ved langsom tilsetning av 1,5 ml allylamin (13,3 mmol) til 8,5 ml iskold 4 M eddiksyre. 3 ml (6,0 mmol) av den nøytraliserte allylaminlagerløsningen ble tilsatt til 25 ml (0,5 mmol) av nukleotidløsningen. En nukleotid-ekvivalent av ^PdCl^, (163 mg, 0,5 mmol) som var oppløst i 4 ml vann, ble så tilsatt for å starte reaksjonen. Ved tilsetning av palladiumsaltet (Alfa-Ventron) ble løsningen gradvis sort av metall (Hg og Pd)-avsetningen som kom til-syne på veggene av reaksjonskaret. Etter henstand ved romtemperatur i 18-24 timer ble reaksjonsblandingen ført gjennom et 0,45 mm membranfilter (nalgene) for fjerning av det meste av gjenværende metallbunnfallet. Det gule filtratet ble fortynnet fem ganger og påført på en 100 ml kolonne av DEAE-"Sephadex" TM A-25 (Pharmacia). Etter vasking med ett kolonnevolum av 0,1 M natriumacetatbuffer ved pH 5,0 ble produktene eluert ved bruk av en liter lineær gradient (0,1-0,6M) av enten natriumacetat ved pH~'8-9,

eller trietylammoniumbikarbonat (TEB) ved pH 7,5. Det ønskede produktet var i den største UV-absorberende delen som ble eluert mellom 0,3 og 0,35 M salt. Spektralanalyse viste at denne toppen inneholdt flere produkter, og slutt-rensing ble oppnådd ved motsatt fase - HPLC-kromatografi

på kolonner av "Patisil" - ODS 2, ved bruk av enten 0,5M NH^H^O^-buffer ved pH 3,3 (analytiske separasjoner), eller 0,5 M trietylammoniumacetat ved pH 4,3 (preparative separasjoner) som elueringsmidler. 5<1->trifosfater av 5-(3-aminopropen-l-yl)uridin (allylaminadduktet til uridin) var de siste delene som ble eluert fra HPLC-kolonnen og de ble klart skilt fra tre, ukarakteriserte forurensninger. Disse nukleotidene varkarakterisert vedproton NMR-elementæranalyse [AA-dUT(<C>12 H16 N3<0>14 P^a^lH20):teori C, 22,91, H, 2,88, N, 6,68, P, 14,77, Funnet, C, 23,10,

H, 2,85, N, 6,49, P, 14,75.

AA-UT(C12 HlgN3<0>15P3 Na4' 4H20): Teori, C 20,61,

H, 3,46, N, 6,01, P, 13,3. Funnet C, 20,67, H, 4,11,

N, 5,39, P, 13,54] spektralt og kromatografisk.

c) Biotinisering av AA- dUTP eller AA- UTP

Biotinyl-N-hydroksyravsyreester (NHSB) ble fremstilt fra

biotin (Sigma) som beskrevet tidligere (H. Heitzmann og F.M. Richards, Proe, Nati. Acad. Sei. USA. 71, 3537

[1974]). AA-dUTP<*>H20 (63 mg, 0,1 mmol) eller AA-UTP'4H20

(70 mg, 0,1 mmol) ble oppløst i 30 ml 0,1 M natriumboratbuffer ved pH 8,5 og NHSB (34,1 mg, 0,1 mmol) oppløst i 2 ml dimetylformamid, ble tilsatt. Reaksjonsblandingen

fikk stå ved romtemperatur i 4. timer og så ført direkte på en 30 ml kolonne av DEAE-"Sephadex" TM A-25, som på forhånd var bragt til likevekt med 0,1 M TEAB ved .pH 7,5. Kolonnen ble eluert med en 400 ml lineær gradient (0,1-0,9 M) TEAB. Fraksjoner inneholdende biotinyl-dUTP eller biotinyl-UTP som ble eluert mellom 0,55 og 0,65 M TEAB, ble avsaltet ved rotasjonsfordampning i nærvær av metanol og gjenoppløst i vann. Av og til ble det oppnådd en svakt uklar løsning. Denne uklarheten som er forårsaket av en forurensning i noen TEAB-oppløsninger, ble fjernet ved filtrering gjennom et 0,45 mm filter. For langtidslagring ble nukleotidene omdannet til natriumsalter ved kort omrøring av løsningen i nærvær av "Dowex" TM 50 (Na<+->form). Etter filtrering ble nukleotidet utfelt ved tilsetning av tre volumer av kold etanol, vasket med etyleter, tørket i vakuum over natriumhydroksydpellets og lagret i en eksikator ved -20°C. For umiddelbar bruk ble nukleotidløsningen laget 20 mM i tris-HCl ved pH 7,5 og justert til en endelig nukleotid konsentrasjon på 5 mM. Forrådsløsninger ble lagret frosne ved -20°C...

Elementæranalyse av bio-dUTP og bio-UTP produktene ga følgende resultater.Bio-dUT(<C>22<H>3Q<N>5<0>lg P3S1Na4• 1 H20). Teoretisk: C, 29,80, H 3,38, N 7,89, P, 10,47,

S, 3,61. Funnet: C, 30,14 H, 3,22, N, 7,63, P, 10,31;

S, 3,70.Bio-UT(C0~ H 3Q Nc 0, n P0 Sn Na/ 3 H„0) :

2 2 30 5 1 i) o 1 4 z Teoretisk: C, 29,15, H, 3,19,. N, 7,45, P, 9,89, S, 3,41. Funnet; C, 28,76; H, 3,35, N, 7,68, P, 9,81, S, 3,32.

-Spektralegenskapene til bio-dUTP og bio-UTP ved pH 7,5

[X maks, 289 nm ( e= 7,100): X maks, 240 nm (e = 10.700):

X min, 262 nm ( e= 4.300)] reflekterer nærvær av en ekso-cyklisk dobbeltbinding i konjugasjon med pyrimidinringen. Disse nukleotidene gir også en sterk positiv reaksjon ( en orange-rød farve) når de behandles med p-dimetylaminokanelaldehyd i etanolisk svovelsyre, en fremgangsmåte som brukes for biotinbestemmelse (D.B. McCormick og J.A. Roth, Anal. Biochem. , _34, 326, 1970). De reagerer imidlertid ikke lenger med ninhydrin, en karakteristisk reaksjon for AA-dUTP og AA-UTP-startmaterialene.

Eksempler 3 og 4 Syntese av biotinyl- CTP og biotinyl- dCTP

CTP og dCTP ble a) merkurert, b) omsatt med allylamin og

c) biotinisert med NHS-biotin, i hovedsak som beskrevet i Eksempel 1. CTP (56,3 mg, 0,1 mmol) eller dCTP (59,1 mg,

0,1 mmol) ble oppløst i 20 ml 0,1 M natriumacetatbuffer ved pH 5,0 og merkuriacetat (0,159 g, 0,5 mmol) tilsatt. Løsningen ble oppvarmet ved 50°C i 4,5 timer og så avkjølt på is. Litiumklorid (39,2 mg, 0,9 mmol) ble tilsatt og løsningen ekstrahert 6 ganger med etylacetat. Nukleotidproduktene i det vandige skiktet ble utfelt ved tilsetning av tre volumer kalt etanol og bunnfallet oppsamlet ved sentrifugering. Bunnfallet ble vasket med absolutt etanol, etyleter og så lufttørket. Disse produkter ble brukt uten ytterligere rensing for syntesen av hhv. AA-CTP og AA-dCTP. De merkurerte nukleotidene ble oppløst i 0,1 M natrium-acetatbuf f er ved pH 5,0 og justert til en konsentrasjon av 10 mM (92 OD/ml ved 275 nm). 0,6 ml (1,2 mmol) av en 2,0 M allylaminacetat forrådsløsning (fremstilt som beskrevet i eksempel 1) ble tilsatt til 10 ml nukleotidløsning (0,1 mmol) fulgt av tilsetning av- I^PdCl^ (32,6 mg, 0,1 mmol), oppløst i 1/6 ml vann. Etter henstand ved romtemperatur i 24 timer-ble løsningen filtrert gjennom et 0,45 mM membran for å fjerne metallbunnfall. Filtratet ble fortynnet fem ganger og påført på én 50 ml kolonne av DEAE- "Sephadex" A-25, som på forhånd var bragt i likevekt med 50 mM TEAB ved pH 7,5. Nukleotidproduktene ble fraksjonert ved påføring av en

500 ml lineær gradient (0,05-0,6 M) TEAB ved pH 7,5. Det ønskede produkt var i den største UV-absorberende del som ble eluert mellom 0,28 og 0,38 M salt. De samlede prøvene

ble avsaltet ved rotasjonsfordampning, oppløst i 0,5 M trietylammoniumacetat ved pH 4,2 og endelig rensing oppnådd med HPLC-kromatografi på kolonner av Partisil 0DS-2, ved bruk'av 0,5 M treietylammoniumacetat som elueringsmiddel. Passende fraksjoner ble samlet, lyofilisert og produktene oppløst i vann- Nukleotidene ble omdannet til Na<+>salt ved kort omrøring i nærvær av "Dowex"TM 50 (Na<+>form). Etter filtrering for å fjerne "Dowex"-harpiksen ble nukleotidene utfelt under tilsetning av 3 volumer kald etanol. Bunnfallet ble vasket med eter og så lufttørket. Analytiske resultater: AA-dCTP (C12 H1?<N>4<0>133<N>a4'2H20), teori,

C, 22,29, H, 2,63, N, 8,67, P, 14,40. Funnet C, 22,16,

H 2,89, N, 8,77, P, 14,18. AA-CT(<C>12H1?N4014Na4<*>2H20), teori C, -21,75, H, 2,57, N, 8,46, P, 14,01, Funnet, C, 22,03, H, 2,47, N, 8,69, P, 13,81, Spektral-egenskaper i 0,1 M borat-buffer ved pH 8,0,X maks 301 nm (e = 6.400)

X min 271'nm ( e= 3,950)X maks 250 nm (e = 9,700). Både AA-dCTP og AA-CTP gir en positiv ninhydrin-test.

AA-CTP (6,6 mg, 0,01 mmol) eller AA-dCTP (6,4 mg, 0,01 mmol) ble oppløst i 5 ml 0,1 M natriumboratbuffer ved pH 8,5,

og NHS-biotin (3,4 mg, 0,01 mmol) oppløst i 0,2 ml dimetylformamid, ble tilsatt. Etter henstand ved romtemperatur

i 4 timer ble prøven kromatografert på en 10 ml kolonne av DEAE-"Sephadex" A-25 ved bruk av 150 ml lineær gradient (0,1-0,9 M) TEAB ved pH 7,5, som elueringsmiddel. Fraksjoner inneholdende biotinyl-CTP eller biotiny1-dCTP, som ble eluert mellom 0,50 og 0,60 M TEAB, ble samlet, avsaltet ved rotasjonsfordampning, og ble etter justering til en sluttkonsentrasjon på 5 mM i 0,02 M Tris-HCl buffer ved pH 7,5, frosset-ved -20°C. Produktehe gir en sterk positiv reaksjon på biotin med p-dimetylaminokanelaldehyd i etanolisk

••'svovelsyre, men gir en negativ test på primære aminer når

de sprøytes med ninhydrin. Ytterligere strukturell karakterisering av disse produktene foregår.

Eksempler 5 og 6

Syntese av iminobiotinyl- UTP og iminobiotinyl- dUTP Iminobiotinhydrobromid ble fremstilt fra biotin som beskrevet tidligere (K. Hofmann, D.B. Melville og V. du Vigneaud,

J. Biol. Chem., 141, 207-211, 1941, K. Hofmann og A.E. Axelrod, Ibid., 187, 29-33, 1950). N-hydroksyravsyreimid (NHS)-estere av iminobiotin ble fremstilt ved å bruke den fremgangsmåten som tidligere er beskrevet for syntesen av NHS-biotin (H. Heitzmann og F.M..Richards, Proe. Nat.Acad. Sei. USA, 7J.' 5537, 1974). AA-UTP (7,0 mg, 0,01 mmol) eller AA-dUTP (6,3 mg, 0,01 mmol) fremstilt som beskrevet i eksempel 1 (del b), ble oppløst i 5 ml 0,1 M natriumboratbuffer ved pH 8^5, og NHS-iminobiotin (3,5 mg, 0,01 mmol), oppløst i 0,5 ml dimetylformamid, ble tilsatt. Reaksjonsblandingen fikk stå ved romtemperatur i 12 timer og så påført direkte på en 10 ml kolonne av DEAE-"Sephadex" A-25, som på forhånd var bragt i likevekt med 0,05 M TEAB ved pH 7,5. Kolonnen ble eluert med en 150 ml lineær gradient (0,05-0,6 M) TEAB. Fraksjoner inneholdende iminobiotin-UTP eller iminobiotin-dUTP, som ble eluert mellom 0,35 og 0,40 MTEAB ble avsaltet ved rotasjonsfordampning i nærvær av metanol og oppløst i vann. Produktene inneholdt en liten mengde allylamin-nukleotid-addukt som en forurensning, Bedømt etter et svakt positivt resultat i ninhydrintesten. Endelig rensing ble oppnådd ved affinitetskromatografi på avidin-sefarose. Fraksjoner av det urene produktet, som ble gjort 0,1M med natriumboratbuffer ved pH 8,5, ble påført på en 5 ml kolonne av avidin-sepharose og vasket med 25 ml av den samme buffer.Kolonnen ble så vasket med 50 mM ammoniumacetatbuffer ved pH 4,0, som eluerte det ønskede iminobiotin-nukleotidproduktet i en skarp topp. Nukleotidet ble utfelt ved tilsetning av 3 volumer av kald "etanol, vasket med etyleter, tørket i vakuum over natriumhydroksydpellets og lagret i en eksikator ved -20°C. Produktene blekarakterisert vedelementæranalyse, såvel som ved spektral- og kromatografiske egenskaper.

Eksempler 7 og 8

Syntese av NAGE- UTP og NAGE- dUTP

Allyl (3-amino-2-hydroksy-)propyl-eter, forkortet NAGE,

ble fremstilt fra allylglycidyleter (Age) (oppnådd fra Aldrich Chemical Co.). 10 ml Age (84 mmol) ble tilsatt langsomt (i et røkavtrekk) til 50 ml 9 M ammoniumhydroksyd og blandingen fikk stå ved romtemperatur i 6 timer. Overskudd ammoniakk ble fjernet ved rotasjonsfordampning under redusert trykk for å gi en viskos gul olje. Analyse av dette produktet med proton-NMR viste at det hadde den ønskede struktur. 5-merkuri-dUTP (0,1 mmol) eller 5-merkuri-UTP (0,2 mmol) ble oppløst i 2-4 ml 0,2 M natriumacetatbuffer ved pH 5,0, og et 16 gangers molart overskudd av NAGE-justert til pH 5,0 med eddiksyre før bruk,

ble tilsatt. De endelige reaksjonsvolumer (4,3 og 8,4 ml) hadde nukleotidkonsentrasjoner på hhv. 43 og 42 mM,

En ekvivalent av K2PdCl4(0,1 eller 0,2 mmol) ble tilsatt

for å starte reaksjonen. Etter henstand ved romtemperatur 1 18 timer, ble reaksjonsblandingen filtrert gjennom 0,45^umM membraner, prøvene fortynnet fem ganger og kromatografert på kolonner.av DEAE-"Sephadex" A-25, ved bruk av lineære gradienter (0,1-0,6 M) av natriumacetat. Fraksjoner som

inneholdt de ønskede produktene,bedømt etter deres UV-spektra og karakteristiske HPLC-elusjonsprofiler på "Partisil" ODS-2, ble samlet, fortynnet og ytterligere renset ved rekromatografi på DEAE-"Sephadex" ved bruk av trange gradienter (0,1-0,5M av ammoniumbikarbonat ved pH 8,5. Under disse betingelsene kunne hovedmengden av NAGE-dUTP (eller NAGE-UTP) klart skilles fra restforurensninger. Proton NMR-spektra ble oppnådd på dette trinn av rensingen etter at nukleotidene var lyofilisert og gjenoppløst i D20. For elementæranalyse ble produktene omdannet til deres natriumsalt-form. Typiske "analytiske resultater: Nage-dUT(<C>15H22<N>3<0>l<g>P3Na42 H20), teori, C, 24,99, H, 3,63, N, 5,83, P, 12,88.

Funnet, C, 25,39, H, 3,71, N, 5,63, P 12,88.

Eksempel 9

Bruk av merkede DNA- sekvenser

I. Karyotyping

(a) Det velges fra 100 til 200 kloner fra en human-gen-samling.. De merkes som beskrevet ovenfor, og for hver klon ble deres hybridiseringsplass eller plasser lokalisert visuelt eller med et video-system med lavt lysnivå. For de kloner som tilsvarer et gen fra en unik sekvens bestemmer dette lokaliseringen av den klonede DNA på et spesielt humankromosom. Det oppnås flere kloner for hvert kromosom. Hver av disse merkede klonene kan anvendes for å identifisere spesielle kromosomer. De kan også brukes i kombinasjon for å identifisere hver av de 46 kromosomene slik at de er ett av de 22 atosome parene eller X eller Y. Ved å tillate ett sett av merkede kloner å hybridisere til kromosomene og så tilsette en fluorescerende farve til merket, kan settet av kloner og deres beliggenhet synlig-gjøres og vil fluorescere med en spesiell farve. Et andre sett av merkede kloner kunne så anvendes og omsettes med et andre fluorescerende farvestoff. Den samme fremgangsmåten kan gjentas en rekke ganger. Man kan så, om ønsket, ha flere sett av fluorescerende "merkelapper" festet til

.det cellulære DNA ved forskjellige, men spesifikke lokaliseringer på hver av kromosomene. Disse merker kan anvendes for visuell eller computer-styrt atomatisk karyotyping. (b) For automatisk karyotyping kan det brukes ett sett kloner for å identifisere den tilnærmede lokalisering av hver av de 4 6 kromosomene ved å finne sett av flekker som tilsvarer antallet av merkede steder på hvert kromosom.

Det er således mulig ved computer-analyse av de digitaliserte"bildene å bestemme om kromosomene er passende utspredt for ytterligere analyse. Dersom de er passende utspredt kan det anvendes computeranalyse for å identifisere hver av de enkelte kromosomer ved lokalisering og fordelingen av de merkede flekkene på hver av dem.

Ved bruk av det faktum av de fluorescerende flekkene kan plaseres på spesielle lokaliseringer på hvert kromosom,

kan det utføres enten manuell eller automatisk karyotyping meget mere effektivt enn uten slike merkelapper.

II. Diagnose av genetiske sykdommer

Ved å velge de kloner som bindes spesifikt til et spesielt kromosom, som f.eks. nr. 23, er det mulig å telle antallet kopier av det spesielle kromosomet i en celle selv om kromosomet ikke er kondensert ved metafase. Når således fosterceller opptas for prenatal diagnose av trisomy 21,

kan diagnosen utføres selv om kromosomene ikke er kondensert ved metafase. Om nødvendig kan to sett av merkelapper anvendes, en som ville være spesifikk for kromosom 23 og en for et annet kromosom. Ved å måle i hver celle forholdet mellom de to merkelapper, som kan være av forskjellige farver, er det mulig å identifisere cellene som viser et unormalt antall av kromosomer nummer 23. Denne fremgangsmåten kan brukes enten på objektglass med et videosystem med lavt lysnivå eller et strømnings cytometersystem ved bruk av lasereksitering. Den kan brukes for å bestemme alle unormale kromosomtall.

III. Mikroorganismepåvisning og identifikasjon

Merking av spesifikke sekvenser av DNA som beskrevet ovenfor muliggjør identifikasjon og telling av enkelte bakterier. For å identifisere de enkelte bakterier til hvilke et spesielt fragment av DNA hybridiseres, må følsomheten være slik at en enkelt merket struktur kan påvises. Dette kan gjøres ved å bruke et videosystem med lavt lysnivå og computer-oppsummering av bilder eller ved å bruke en annen

.^innretning for forsterkning av lysbildet. Et strømnings-system kan også anvendes dersom følsomheten kan gjøres tilstrekkelig stor. Dersom bakteriene immobiliseres på

et objektglass, kan deres lokalisering finnes og antallet av slike fluorescerende flekker telles. Dette vil gi et tall på alle de bakterier som inneholder DNA som kan hybridi-

sere med den spesifikke klonen som anvendes. Dersom klonen velges å være spesifikk for en spesiell stamme eller bakterie, så kan antallet organismer av denne stammen telles. I tillegg kan enhver antibiotisk motstand for hvilken et spesielt gen er identifisert, karakteriseres på lignende måte ved å bruke som en probe, den DNA-sekvens som inneholdes i det antibiotiske motstandsgenet. I tillegg kan en probe anvendes som er spesifikk for et motstandsplasmid, inneholdende et eller flere antibiotiske motstandsgener.

I tillegg til enkelte bakterier, kan grupper av bakterie-celler av en spesiell stamme påvises og deres antall fast-slåes dersom de befinner seg i en liten flekk, slik at den totale fluorescens som er spesifikk for det hybridiserte DNA i flekken kan måles. På denne måten kan antallet organismer som inneholder en spesifikk DNA-sekvens måles i en blanding av bakterier.

Som ytterligere bakgrunn når det gjelder anvendelse av biotin-polynukleotidene som er angitt ovenfor beskriver artikkelen til Langer et al i Proe. Nati. Acad. Sei. USA

og publikasjonen til P.R. Langer-Safer, M Levine og D.C.Ward

i Genetics med tittel "An Immunlogical Method for Mapping Genes on Drosophila Polytene Chromosomes", beskrevne metode hvor det anvendes biotinerte nukleotider som en probe for lokaliseringen av DNA-sekvenser som.hybridiseres in situ

til Drosophila-polytenkromosomer. I denne søknad påvises disse prober ved å anvende affinitetsrenset kanin-antibiotin-antilegeme som det primære antilegemet og fluorescerende geite-antikanin-antilegeme som det sekundære antilegeme.

Det som beskrives i denne publikasjonen til Langer-Safer et al i Genetics inntas også i og gjøres til en del av denne beskrivelse.

Andre teknikker som anvender biotin-merkede reagenser med avidin eller enzym-merkede avidinreagenser er kjent for påvisning og bestemmelse av ligands i et flytende medium,

se U.S. patent 4.228.237. Det er også kjent å gjennomføre

gene-anrikelser basert på. avidin-biotin-reaksjon,spesielt når det anvendes på Drosophila ribosome RNA-gener, se publikasjonen til J. Manning, M. Pellegrini og N. Davidson i Biochemistry, vol. 16, nr.<7>, sidene 1364-1369 (1977). Andre publikasjoner av bekgrunnsinteresse når det gjelder praktisering av foreliggende oppfinnelse er artikkelen til D.J. Eckermann og R.H. Symons med tittelen "Sequence at the Site of Attachment of an Affinity-Label Derivative of Puromycin on 23-S Ribosomal RNA of Escherichia coli Ribosomes", J. Biochem, 82, 225-234 (1978), artikkelen til S.B. Zimmerman, S,R. Kornberg og A. Kornberg med tittelen "Glucosylation of Deoxyribonucleic Acid-II -Glucosyl Transferases from T2- and T6-Infected Escherichia coli i The Journal of Biological Chemistry, vol. 237, nr. 2, Februar 1962, og artikkelen til J. Josse og A. Kornberg "III. a- og 3-Glucosyl Transferases from T4-Infected Escherichia coli", som også forekommer i The Journal of Biological Chemistry, vol. 2 37, nr. 6. juni 1962.

Av ytterligere interesse i forbindelse med praktiseringen av foreliggende oppfinnelse er publikasjonene som forekommer i J. Biol. Chem., Vol. 236, nr. 5, mai 1961, sidene 1487-1493, den samme publikasjon vol. 237, nr. 4, sidene 1251-1259 (1962), den samme publikasjon vol. 239, nr. 9, sidene 2957-2963 (1964). Av spesiell interesse er den artikkelen som forekommer i The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, vol. 27, nr. 8, sidene 1131-1139 (1979) og i publikasjonen Nucleic Acids Research, vol. 5, nr. 9, 1977, sidene 2961-2973. Av interesse er også den artikkelen som forekommer i publikasjonen Biochimica et Biophysica Acta av A. De Waard med tittelen "Specificity Difference Between the Hyroxymethylcytosine 3-Glucosyl-Transferases Induced<x>by Bacteriophages T2, T 4 and T6", sidene 286-304., og også artikkelen til T.W. North og C.K. Mathews med. tittelen "T4Phage-Coded Deoxycytidylate Hydroxymethylase: Purification and Studies in Intermolecular Interactions", publisert av Academic Press, 1977, sidene 898-904 og artikkelen avE.A. Bayer og M. Wilchek med tittelen "The Use of Avidin-Biotin Complex as a Tool in Molecular Biology i Methods of Biochemical Analysis, vol. 26, sidene 1-45 (1980).

Andre teknikker som er anvendbare ved praktiseringen av foreliggende oppfinnelse omfatter snitt-overføring av DNA ved å anvende DNA-polymerase. En teknikk for gjennom-føring av snittoverføring er beskrevet i artikkelen til P.W. Rigby, M. Dieckmann, C. Rhodes og P. Berg, med tittelen "Labeling Deoxyribonucleic Acid to High Specific Activity in vitro by Nick Translation with DNA Polymerase" i J. Mol. Biol. (1977), 113, 237-251. Når det gjelder gjenvinning av streptavidin, som f.eks. fra en dyrkningsvæske av Streptomyc. es avidinii, beskriver artikkelen til K. Hofmann, S.W. Wood, C.C.Brinton, J.A. Montibeller og

F.M. Finn med tittelen "Iminobiotin Affinity Columns and their Application to Retrieval of Streptavidin" i Proe. Nati. Acad. Sei. USA, vol. 77, nr. 8, sidene 4666-4668 (1980),

en passende metode for gjenvinning av streptavidin fra et streptavidin-holdig materiale, som f.eks. fra en dyrkningsvæske. Streptavidin er anvendbar som et reagens i én av utførelsesformene av oppfinnelsen.

De forannevnte publikasjoner innføres heri og gjøres til

del av denne beskrivelsen.

Ifølge gjennomføringen av denne oppfinnelse modifiseres nukleotider forberedende, som f.eks. ved 5-stillingen i pyrimidin eller 7-stillingen av purin, for fremstilling derfra av nukleotid-prober som er egnet for fastgjøring til eller innblanding i DNA eller annet nukleinsyremateriale. Ved praktiseringen av foreliggende oppfinnelse modifiseres nukleotider, dvs. nukleinsyre, fortrinnsvis på en ikke-spaltende måte slik at de resulterende modifiserte nukletidene kan inblandes i nukleinsyrer og når de en gang er innblandet i nukleinsyrene innvirker de modifiserte nukletidene ikke signifikant på dannelsen eller stabili- seringen av den dobbelte spiralen som dannes fra de resulterende nukleinsyrene som inneholder de modifiserte nukleotidene. Den ikke-spaltende modifikasjonen av nukleotidene og nukleinsyrene og de nukleinsyrene som inneholder slike modifiserte nukleotider, står i kontrast til de modifikasjoner av nukleotider som erkarakterisertsom spaltende modifikasjoner i den betydning at de resulterende spaltende modifiserte nukleotidene og nukleinsyrene som inneholder de samme, blokkerer riktig dobbelt-spiraldannelse. Ved praktiseringen av foreliggende oppfinnelse modifiseres nukleotidene ønskelig i 5-stillingen i pyrimidinet eller 7-stillingen i purinet. De således modifiserte nukleotidene er ikke-spaltende modifisert og nukleinsyrer som inneholder slike nukleotider er istand til å danne et dobbeltspiralarrangement.

I et annet aspekt ved utføringen av foreliggende oppfinnelse er forskjellige metoder anvendbare for merking av DNA på en ikke-spaltende måte. Biotin tilsettes eksempelvis på enden av et DNA- eller RNA-molekyl. Tilsetningen av biotin gjennomføres ved tilsetning av et ribonukleotid. Det 3',4<1->vicinale hydroksylgrupper oksyderes ved periodat oksydasjon og reduseres så av borhydrid i nærvær av biotinhydrazid. Alternativt kan karbodiimid også anvendes for å koble biotin til aldehyd-gruppen.

En annen teknikk for merking av nukleinsyremateriale som f.eks..DNA eller RNA omfatter tilsetning av en stor markør til enden av et DNA- eller RNA-molekyl. Ett eksempel på denne teknikk er tilsetningen av et molekyl, f.eks. lysylglycin, hvo'r aminogruppene er merket med biotin.

Et annet eksempel ville være å følge den fremgangsmåte som ér angitt ovenfor, men anvende karbodiimid som tverrbindings-middel. Ytterligere et eksempel på denne teknikken ville være å fremstille en biotinylert dA:dU dobbelspiral-polymer og binde denne polymeren til den proben som er fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse.

En annen teknikk for merking av DNA på en ikke-spaltende måte omfatter isolasjonen av dPyrTP med et putricin eller spermidin i 5-stillingen fra PS16 eller fage-infiserte celler. Om ønsket lages dPyrTP fra fage DNA og fosforyleres dPyrTP fulgt av modifikasjon av polyamin-sidekjeden ved hjelp av standard nukleofilt reagens NHS-biotin.

En annen teknikk for merking av DNA på en ikke-spaltende måte omfatter tilsetning av glukose til 5-hydroksy-metylcytosin (5 HMC) i DNA ved å bruke T4 fage-glycosylerende enzymer fulgt av sikting ved hjelp av et lecitin-basert forsøk.

Enda en fremgangsmåte for merking av DNA på én ikke-spaltende måte omfatter 5-HMC-trifosfat fremstilt fra hydrolysen av T4-DNA fulgt av fosforylering av 5HMCMP til 5 HMCTP.

5HMCTP innblandes så i DNA ved bruk av polymerase I. Således kan ethvert DNA modifiseres slik at det får innført 5 HMC på ikke-spaltende måte.

En fremgangsmåte for merking av DNA på en svakt spaltende måte omfatter å omsette nukleinsyrer i dobbelt spiralform med alylerende reagenser som f.eks. benz(o)pyren-diol-epoksyd eller aflatoksin. Under passende betingelser alkyleres N 2-gruppen i guanin, N 4 -gruppen i adenosin eller N 4-gruppen i cytosin. Disse modifiserte nukleotider kan direkte påvises med antilegemer eller kan anvendes som bindearmer for tilsetning av en merkemolekyl som f.eks. biotin.

Følgende eksempler illustrerer forskjellige utførelsesformer ved gjennomføring av foreliggende oppfinnelse:

- Eksempel I

Biotinyl-N-hydroksyravsyreimidester (BNHS) ble fremstilt ifølge fremgangsmåten til Bécker et al, P.N.A.S. 68 26o4

(1971). Biotin (0,24 g, 1,0 mmol) ble,oppløst i 5 ml tørt dimetylformamid. Dicykloheksylkarbodiimid (0,21 g, 1,0 mmol) og N-hydroksyravsyreimid (0,12 g, 1,0 mmol) ble tilsatt og løsningen omrørt ved romtemperatur i 15 timer. Etter filtrering av det påfølgende bunnfall, ble filtratet inndampet ved redusert trykk og resten vasket to ganger med etanol og gjenvunnet fra varm isopropylalkohol for å gi et hvitt, krystallinsk produkt med et smp. på 216-218°C.

Eksempel II

Biotinyl-1,6-diaminoheksan-amid ble fremstilt som følger:

En løsning av 1>6-diaminoheksan (320 mg, 2,0 mmol), oppløst

i 50 ml vann, ble bragt til pH 8,5 ved tilsetning av karbondioksyd. Biotinyl-N-hydroksy-ravsyreimid-ester (100 mg, 0,29 mmol), oppløst i 10 ml dimetylformamid, ble tilsatt. Etter 18 timer ved romtemperatur ble blandingen fordampet og resten vasket med eter og deretter tørket i en eksikator.

Eksempel III

Polybiotinylert poly-L-lysin ble fremstilt ved hjelp av følgende fremgangsmåte. Polylysin (100^umol lysin) oppløst i 2 ml 0,1 M. natriumborat, pH 8,5 ble tilsatt til biotinyl-N-hydroksyravsyre.imid-ester (17,5 mg, 50^umol) oppløst i 0,5 ml dimetylformamid. Etter omrøring ved romtemperatur i 18 timer ble blandingen dialysert mot 10 mM tris-buffér, pH 7,5.

Eksempel IV

Oligodeoksyribonukleotid ble endemerket ved bruk av cytidin-5'-trifosfat og terminal transferase som følger. Renset Fage DNA, alkalibehandlet med 0,2 N natriumhydroksyd og fortynnet til 2 & 26Q enneter/ml i kalium-kakodylat (0,1M), tris-base (25 mm), koboltklorid (ImM) og ditiotreitol (0,2M ble brukt. Til denne DNA-løsningen (lml) ble det tilsatt cytidin-5'-tifosfat (10 mmol) og terminal transferase (200 enheter). Etter inkubering ved 37°C i 5 til 8 timer ble reaksjonen stanset ved tilsetning av nøytra-lisert fenol (100^ul), 0,5M EDTA (lOO^ul) og 1% natrium-dodecylsulfat . (lOO^ul) . DNA ble renset ved gelfiltrerings- kromatografi gjennom "Sephadex" G-100 fulgt av utfelling med etanol.

Eksempel V

Biotin og polybiotinylert poly-L-lysin ble koblet til oligoribonukleotider ved bruk av en karbodiimid-koblings-fremgangsmåte beskrevet av Halloran og Parker, J. Immunol., 96 373 (1966). Som et eksempel ble DNA (l^ug/ml), 1 ml)

i tris-buffer pH 8,2 behandlet med 0,1 N natriumhydroksyd denaturert ved koking i 10 minutter og rask avkjøling i et isbad. Biotinyl-1,6-diaminoheksanamid (2 mg, 6^umol) eller polybiotinylert poly-L-lysin (2 mg) og l-etyl-3-diiso-propylaminokarboimid-HCl (10 mg, 64^umol) ble tilsatt, og pH justert tilbake til 8,2. Etter 24 timer ved romtempera--tur i mørke ble blandingen dialysert mot 10 mM tris-buffret saltløsning. DNA ble utfelt med etanol.

Eksempel VI

Biotin, konjugert til cytokrom C, ble fremstilt ved hjelp av følgende fremgangsmåte. Til en løsning av cytokrom C (10 mg) i 1 ml 0,1 M natriumborat, pH 8,5 ble det tilsatt biotinyl-N-hydroksyravsyreimid-ester (10 mg, 29^umol)

i 1 ml dimetylformamid. Etter 4 timer ved romtemperatur ble det biotinylerte proteinet renset ved gelfiltrerings-kromatografi gjennom en "Sephadex G-50-kolonne.

Eksempel VII

Formaldehydkobling av cytokrom-C-biotin og polybiotinylert poly-L-lysin til oligodeoksyribonukleotider ble utført ved hjelp av en metode som er lik den som er beskrevet av Manning et al, Chromosoma, 53, 107 (1975). Oligodeoksyribonukleotid-fragmenter oppnådd ved natriumhydroksyd "behandling av renset DNA (100^ug/ml i 10 mM trietanolamin, pH 7,8 ble denaturert ved koking i 10 minutter fulgt av rask kjøling i is. Cytokrom-C-biotin 0,05 g ml eller polybiotinylert poly-L-lysin løsning (0,05 ml) oppløst 3 mg/ml i 10 mM trietanolamin, pH 7,8 ble tilsatt til 1 ml av den denaturerte oligodeoksyribonukleotidløsningen sammen med 0,1 ml 6% formaldehyd i 10 mM trietylanolamin, pH 7,8. Etter omrøring ved 40°C i 30 minutter ble blandingen dialysert mot den samme buffer. Oligodeoksyribonukleotid-biotin-komplekset ble endelig renset ved gl-filtrerings-kromatografi på "Sephadex" G-100 fulgt av utfelling fra etanol.

Eksempel VIII

Dobbeltstrenget polydeoxyadenylsyre:polybiotinylert deoksyridylsyre ble syntetisert som følger. Det dobbelt-strengede oligonukleotidet polydeoksyadenylsyre:polytymidyl-syre (20^ug) med lengde 300 basepar, oppløst i 200^ul eksonuklease III buffer bestående av tris-HCl pH 8,0 (70 mM), magnesiuklorid (1,0 mM) og ditiotreitol (10 mM) ble inkubert med 100 enheter eksonuklease III i 20 minutter ved 20°C. Det delvis fordøyede oligonukleotidet ble umiddelbart ekstrahert med fenol, og DNA ble utfelt med 70%-ig vandig etanol. Det delvis fordøyde oligonukleotidet ble gjenoppløst i 20 ,ul 5mM tris-HCl pH 7,6 og inkubert ved 20 oCi 2 timer i en reaksjonsblanding inneholdende 2'-deoksy-adenosin-5'-trifosfat (15^uM), tymidin-5'-trifosfat (mengden bestemmer substitusjonsgraden) og biotinylert 5-(3-amino-l-propen) 2'-deoksyuridin-5<1->trifosfat (5^uM), Klenow DNA-polymerase I (200 enheter) oppløst i 0,1 mM-' kaliumfosfat, pH 8,0 ved en konsentrasjon på 0,2 enheter/^ul. Det biotinylerte poly-dA:poly-dT, biotinyl dU ble renset ved gel-filtreringskromatografi på "Sephadex" G-100. DNA

ble utfelt med etanol og gjenoppløst i 20^ul løsning inneholdende natriumacetat pH 4,6 (30 mM), natriumklorid (50 mM), sinksulfat (1 mM) og glycerol (5%). S^-nuklease (200 enheter) ble tilsatt, og reaksjonsblandingen ble inkubert ved 37 C

i 10 minutter. Reaksjonen ble stanset med 1 ml ammoniumacetat (4 M) og 6 ml etanol. DNA ble renset på ny med G-100 gel-filtrerings-kromatografi og etanolutfelling.

Eksempel IX

Sammenbinding av poly-dA:poly-dT, biotinyl-dU med oligo-deoksy-ribonukleotider ble gjennomført som følger:

DNA-fragmenter fra alkalibehandlet, renset DNA (som

beskrevet i eksempel VIII) ble fordøyet med S^-nuklease og renset på nytt ved fenolekstraksjon og etanolutfelling. DNA-fragmenter med butte ender (l^ug) og poly-dA:poly-dT, biotinyl-dU (2^,ug) ble oppløst i 6yul av en buffer inneholdende tris-HCl pH 7,4 (66 mM), magnesiumklorid (6,6 mM), adenosintrifosfat (24 mM) og ditiotreitol (1,0 mM). T4DNA ligase (50 enheter) ble tilsatt, og volumet bragt

til 20^ul med vann. Reaksjonsblandingen ble inkubert 3

timer ved 3 7°C. DNA ble renset ved gel-filtreringskromatografi gjennom "Sephadex" G-100 og ble utfelt med etanol.

Eksempel X

5-hydroksymetyl-2<1->deoksycytidylsyre ble fremstilt ved enzymatisk hydrolsyse av ikke-glykosylaert fag T4DNA.

Renset fag-DNA (2mg), oppløst i 1 ml 50 mM tris pH 7,4 og

10 mM magnesium-klorid ble inkubert 20 timer med deoksyribonuklease I ved 37°C. pH ble justert til 9,0 og natriumklorid (20 mM tilsatt. •Slangegift-fosfordiesterase (0,05 g enheter i 0,5 ml vann) ble tilsatt og inkuberingen fortsatt ved 37°C i 5 timer. Ytterligere 0,05 enheter fosfodiesterase ble tilsatt og inkuberingen fortsatt i

•18 timer. Nukleotider ble fraskilt ved gel-filtrerings-kromatograf i gjennom ''Sephadex" G-50: 5-hydroksymetyl-2 '-deoksycytidylsyre ble renset ved høytrykks væskekromatografi

i motsatt fase.

Eksempel XI

5-(4-aminobutylaminometyl)-2'-deoksyuridylsyre ble oppnådd Ved enzymatisk hydrolyse av DNA fra fag ØW-14. Fagen ble dyrket på Pseudomonas acidovorans 29 ifølge Kropinski og Warren, Gen. Virol. 6 , 85 (1970) og fag DNA renset

ifølge Kropinski et al, Biochem. 12 , 151 (1973). DNA ble enzymatisk hydrolsyert med deoksyribonuklease I og

slangegift fosfodiesterase ved å bruke den fremgangsmåte som er beskrevet foran (Eksempel X). 5-(4-mainobutylamino-metyl)-2'-deoksyuridylsyre ble renset ved høytrykks væskekromatografi i motsatt fase.

Eksempel XII

Biotinylert-5-(4-aminobutylaminometyl)-2<1->deoksy-uridylsyre ble fremstilt som følger: biotinyl-n-hydroksyravsyreimid-ester (70 mg, 0,2 m mol) oppløst i 1 ml dimetylformamid ble tilsatt til 5-(4-aminobutylaminometyl)-2'-deoksyuridyl-syre i 20 ml 0,1 M natriumborat pH 8,5. Etter 4 timer ble løsningen konsentrert til 0,5 ml ved fordampning,

og det biotinylerte nukleotidet ble renset ved høytrykks-væskekromatografi i motsat fase.

Eksempel XIII

5-fprmyl-2'-deoksyuridin fremstilt ifølge Mertes og Shipchandler, J. Heterocyclic Chem. 1, 751 (1970). 5-hydroksymetyluricil (1 mmol) oppløst i 20 ml dimetyl-sulfonat ble oppvarmet ved 100°C med mangandioksyd (2,5 mmol) i 15 minutter. Løsningsmidlet ble fordampet ved redusert trykk. Resten ble opptatt i varm etanol og omkrystallisert fra etanol for å gi 5-formyluracil, 5-formyluracil (0,10 g) ble silylert og oppløst i tørr acetonitril (2,5 ml), 2-deoksy-3,5-di-0-p-tolyl-D-ribofuranosyl-klorid (Bhat, Syn. Proe, in Nucleic Acid Chem., vol. I, side 521 (1968) (0,22 g) og molekylærsikter (0,2 g) ble tilsatt og blandingen omrørt ved 25°C i 40 timer under vannfrie betingelser. Blandingen ble filtrert og inndampet. Den resulterende oljen ble behandlet med vannfri etanol (2 mol) og kromatografert på silikagél for å 'oppnå den delvis rene anomeren som ble omkrystallisert fra etanol (smp. 195-196°C). Toluyl-gruppene ble fjernet ved reaksjon mellom produktet i metanolbenzen og natriummetoksyd. Blandingen ble nøytrali-sert med "Dowex" 50 (H+). 5-formyl-2'-deoksyuridin ble omkrystallisert fra etanol (smp. 175-176°C).

Eksempel XIV

Biotin ble koblet til 5-formyl-2<1->deoksyuridin som følger: Til 5-formyl-2'-deoksyuridin (0,320 g , 1,0 mmol) oppløst

i 300 ml 0,05 M natriumborat, ble det tilsatt biotinyl-1,6-diaminoheksanamid (0,74 g, 2 mmol). Etter omrøring i 1 time ble natriumborhydrid (0,2 g, 5 mmol) tilsatt og omrøring fortsatt i ytterligere 4 timer fulgt av tilsetning av 8 ml IM maursyre. Den biotinerte forbindelsen ble renset ved motsatt fag-HPLC-eluering med metanol:0,5 M trietylammoniumacetat, pH- 4,0.

Eksempel XV

Biotin ble koblet til 5-amino-2<1->deoksyuridin som følger: 5-amino-2<1->deoksyuridin (0,24 g, 1 mmol) , biotin (.0,25 g, 1 mmol) og dicykloheksylkarboimid (0,21 g, 1 mmol) ble oppløst i tørt dimetylformamid og omrørt ved romtemperatur over natten. Etter filtrering og fordampning av løsnings-midlet ble resten vasket med eter. Det biotin-koblede produktet ble renset ved høytrykks væskekromatografi i motsatt fase ved bruk av en vann-metanol-gradient.

EksempelXVI

5-(oksy)eddiksyre-2<1->deoksyuridin ble fremstilt ifølge fremgangsmåten til Deschamps og DeClerq, J. Med. Chem., 21 228 (1978). 5-hydroksy-2-deoksyuridin (282 mg, 1,15 mmol) ble oppløst i 1,16 ml, IN kaliumhydroksyd (1,16 mmol) hvoretter jod-eddiksyre (603 mg, 3,4 mmol) i 1 ml vann ble tilsatt. Etter reaksjon ved romtemperatur i 48 timer ble IN HC1 (1,06 ml) tilsatt. Konsentering av denne løsning

og tilsetning av etanol ga et bunnfall som ble filtrert, vasket med kald etanol og omkrystallisert fra varm etanol.

Eksempel XVII

Biotinyl-1,6-diaminoheksan-amid ble koblet til 5-(oksy) eddiksyre-2<1->deoksyuridin som følger: Biotinyl-1,5-diaminoheksan-amid (0,74 g, 02, mmol), 5-(oksy)eddiksyre-2<1->deoksyuridin (0,60 g, 02, mmol) og dicykloheksylkarboimid

0,41 g, 0,2 mmol) ble oppløst i 5 ml tørt dimetylformamid og fikk stå over natten ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble deretter filtrert og løsningsmidlet fjernet ved fordampning. Resten ble vasket med 0,1 N HC1 og eter. Det bio.tinerte uridinderivatet ble renset ved høytrykksvæskekromatografi i motsatt fase ved bruk av en vann-metanolgradient.

Eksempel XVIII Fosforylering av 5-substituerte pyrimidin nukleosider ble gjennomført ved hjelp av den generelle fremgangsmåten som er beskrevet nedenfor for biotinert-5-(oksy)eddiksyre-2'-deoksyuridin. Nukleotidet (0,16 g, 0,5 mmol) bie tørket ved gjentatt fordampning fra tørr pyridin og gjenoppløst i 10 ml tørt pyridin. Monometoksytritylklorid (0,3 g, 0,8 mmol) ble tilsatt og blandingen omrørt ved romtemperatur i mørket i 18 timer. Løsningen ble fortynnet med kloroform (200 ml) og ekstrahert med 0,1 M natriumbikarbonat. Det organiske skiktet ble tørket og inndampet. Det tritylerte nukleosidet ble gjenoppløst i tørt pyridin (20 ml) og acetylert ved reaksjon ved romtemperatur med éddiksyre-anhydrid (0,1 ml, 20 mmol). Blandingen ble avkjølt til 4°C, og metanol (40 ml) tilsatt. Etter omrøring i 10

timer ved romtemperatur ble reaksjonsblandingen konsentrert ved inndampning. Forbindelsen ble detritylert ved opp-løsning i 1% benzensulfonsyre i kloroform (20 ml). Etter fordampning av løsningsmidlet ble nukleosidet renset ved kromatografi på silikagel og eluert med 2% metanol:kloroform. Det 3'-acetylerte nukleosidet ble tørket ved gjentatt fordampning av tørt pyridin. En blanding av fosforoksyklorid (lOO^ul, 1 mmol)', (1-H), 1,2,4-triazoic (140 mg, 2,2 mmol) og trietylamin (260 ul, 2,0 mmol) ble omrørt i 5 ml vann-lEritt dioksan ved 10-15°C i 30 minutter og ved romtemperatur i 1 time. Dette ble tilsatt til 3'-acetylerte nukleosid,

og blandingen omrørt ved romtemperatur.i 1 time hvoretter den ble avkjølt til 0°C. Vann (5 ml) ble tilsatt og reaksjonsblandingen omrørt ved romtemperatur i 18 timer.

Bariumklorid (100 mg., 5 mmol) ble tilsatt og bariumsaltet av nukleotidet oppsamlet ved filtrering. Saltet ble vasket med vann og eter. Bariumsaltet ble omdannet til natrium-saltet ved omrøring med "Dowex"50 (Na<+>form) i 10 ml vann i 4 timer ved romtemperatur. 2 N natriumhydroksyd (2N, 10 ml) ble tilsatt og reaksjonsblandingen omrørt i 15 minutter ved romtemperatur, hvoretter den ble nøytralisert ved tilsetning av overskudd "Dowex" 50 (H<+>) form. Det deacetylerte nukleotidet ble konsentrert ved fordampning og renset ved høytrykkskromatografi i motsatt fase.

Eksempel XIX

5-substituerte pyrimidintrifosfater ble kjemisk frem-

stilt fra deres respektive 5<1->monofosfater ved bruk av fremgangsmåten til Michelson, Biochem Biophys Acta, 91, 1,

(1964). Som eksempel skal angis 5-hydroksymetyl-2<1->deoksycytidin-5'-trifosfat. De andre ble fremstilt på lignende måte. 5-hydroksymetyl-2<1->deoksycytidylsyre (fri syre) (0,63 g, 0,2 mmol) ble omdannet til dens tri-n-oktylammoniumsalt ved suspendering i metanol og tilsetning av tri-n-oktylammoniumhydroksyd (0,74 g, 0,2 mmol). Suspensjonen ble tilbakeløpsbehandlet inntil det ble oppnådd en klar løsning og løsningsmidlet fjernet under vakuum.

Saltet ble tørket ved oppløsning i og etterfølgende fordampning fra tørt pyridin flere ganger. Til saltet, opp-løst i tørt dimetylformamid (0,1 ml) og dioksan (1 ml) ble det tilsatt difenylfosfokloridat (0,1 ml) og tri-n-butylamin (0,2 ml). Etter 25 timer ved romtemperatur ble løsningsmidlet fjernet og eter ble tilsatt for å felle ut nukleosid-5'-difenylpyrofosfatet. Dette ble oppløst i dioksan (0,5 ml)"og en løsning av di (tri-n-butylammonium) pyrofosfat (0,5 mmol) i 1 ml pyridin ble tilsatt. Etter •-4 5 minutter ved romtemperatur ble blandingen konsentrert under vakuum til et lite volum. Råproduktet ble utfelt med eter. Dette ble oppløst i 0,1 M fosfatbuffer pH 8,0. Trifosfatet ble renset ved kromatografi på DEAE-cellulose og eluert med en gradient av 0,1 til 0,6 M trietylammonium-

bikarbonat pH 7,5.

Eksempel XX

DNA ble merket med 5-substituerte pyrimidintrifosfater ved snittoverføring av DNA i nærvær av det passende trifosfatet. Et eksempel følger på merking av renset DNA med biotinylert 5-formyl-2<1->deoksyuridin. DNA (20^ug/ml) ble inkubert ved 14°C i nærvær av magnesiumklorid (5 mM) 2'-deoksycytidin-5<1->trifosfat (15 mM), 2<1->deoksyadenosin-'5 1-trifosfat (15^uM), 2'-deoksyguanosin-5'-trifosfat (15^,uM) , biotinylert 5-f ormyl-2 '-deoksyuridin-5 1 -tri-fosfat (20 ^,uM) , aktivert pankreatisk deoksyribonuklease I (13 mg/ml), E. coli deoksyribonuklease syre, polymerase I (40 enheter/ml) og tris-HCL, pH 7,4 (50 mM). Etter 2 timer ble reaksjonen stanset ved tilsetning av 0,3 M EDTA (0,05 ml) fulgt av oppvarming ved 65°C i 5 minutter. Merket oligonukleotid ble renset ved gelfiltrerings-kromatografi gjennom "Sephadex". G-100 og utfelling fra kald etanol.

Eksempel XXI

Utfelling av glukosylert DNA med Concanavalin A Reaksjonsblandinger (1,0 ml) ble fremstilt i 1,5 ml eppendorfrør som følger:

"Reaksjoner ble startet ved tilsetning'av concanavalin A (Con A). Løsningene ble blandet og fikk stå ved romtemperatur i 60 minutter. Rørene ble sentrifugert ved 1200 gi 15-20 minutter. De overstående væskene ble fortynnet og A260ble målt.

Siden Con A absorberer ved 260 nanometer, ble det fremstilt kontrolløsninger som manglet DNA, men inneholdt Con A. Absorbansen for Con A ble substrahert fra absorbansen som ble oppnådd i de fullstendige reaksjonsblandingene.

Resultatene av denne reaksjon er vist i den medfølgende figur 1.

Eksempel XXII

Binding av glukosylert DNA til concanavalin A

3

Fag-T4 DNA og fag-DNA ble merket ved innføring av H - deoksyadenosin-trifosfat i DNA ved snittoverføring ifølge fremgangsmåten til Rigby et al. T4 DNA ble snitt-overført til én spesifik aktivitet på 5xl0<5>cpm/mikrogram og en gjennomsnitlig dobbeltstrenget størrelse på 5 kilobaser. Lambda DNA ble snittoverført til en spesifikk aktivitet på 3xl0~<*>cpm/mikrogram og en gjennomsnitlig dobbeltstrenget størrelse på 6,0 kilobaser bestemt ved hjelp av agarose-gel-elektroforese. Uinnblandede nukleotider ble fjernet fra reaksjonsblandingene ved Bio-Gel P-60-kromatografi.

Con-A-sefarose ble fremstilt som beskrevet av fabrikanten (Pharmacia). 1 ml av avsatt gel inneholdt 18 mg bundet

Con A. 1 ml kolonner ble fremstilt i sterile pasteur-pippetterog ble bragt i likevekt med PBS (0,15 M NaCl,

0,01 M natrium-kalium^fosfat, pH 6,5).

H 3-DNA prøver ble fremstilt i 0,5 ml buffer (som beskrevet

i Eksempel XXI, men uten Con A). T4 DNA løsninger inneholdt 176.000 cpm/0,5 ml og DNA-løsninger inneholdt 108.000 cp./0,5 ml. En 0,5 ml prøve ble påført på kolonnen.

Et 10,5 ml volum buffer ble ført gjennom kolonnen og eluat-fraksjonene (0,33 m) ble oppsamlet og helt i en Beckman LSC-100 gnistteller i en 3,5 ml"reafluor cocktail" -(Beckman). Resultatene (fig. 2A og 2B) viser at ikke-glukosylert DNA ikke var bundet, mens glukosylert T4 DNA var bundet til kolonnen. Det bundne T4 DNA ble fjernet ved vasking av kolonnen med en buffer med høy pH (Tris-HCl, pH 7,2-8,2).

Videre, overensstemmende med reaksjonen mellom glukose

og Con A, hindrer mannose, når den innblandes i bufferen der DNA er påført på kolonnen, binding av glukosylert DNA til Con A-sefarose. Mannoseholdig buffer (PBS-holdig 0,056 M mannose) fjerer også bundet T4 DNA fra Con A-sefarose (figurene 3A og 3B).

For videre illustrasjon av gjennomføringen av foreliggende oppfinnelse rettet på ikkeradioaktive metoder eller teknikker for prøver på spesifikke nukleinsyrer, om-handler det følgende eksempel bruken av sukker-lectin-systemet. Dette eksempel behandler bruken av DNA som

av natur ikke er glykosylert men i steden er tilført en maltotriosegruppe ved snittoverføring som er beskrevet her. Det maltotriosemodifiserte dUTP.og DNA modifisert derved bindes spesifikt til en kolonne av concanavalin A kovalent bundet til sefarose. Ved denne teknikken og ifølge gjennom-føringen av foreliggende oppfinnelse er det oppnådd en metode for spesifikk merking av nukleinsyrer med sukker. Som tidligere, angitt er snittoverføring bare en av en rekke teknikker og fremgangsmåter som er mulige for f rems/tilling av de modifiserte nukleinsyrene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Eksempel XXIII

Lambda DNA .ble snittoverført som beskrevet her med maltotriose som var koblet til 5-(3-amino-l-propenyl)-2'-deoksyuridin-5<1->trifosfat og<3>H-2'-deoksyadenosin-5<1->trifosfat. Under disse betingelsene ble DNA substituert til 40% av dens tymidinrester med maltotriosenukleotider og hadde en spesifik aktivitet på 8x10^ tellinger pr. minutt (cpm) pr. mikrogram DNA. En kontrollprøve av DNA-substituert bare med<3>H-dATP hadde en spesifik.aktivitet på 6x10"* cpm pr. mikrogram DNA. De snittoverførte DNA-prøvene ble renset fri fra reaksjonsblandingsbestanddeler ved Biogel P-60-kromatografi som beskrevet her.

De rensede prøvene ble påført på Con A-sefarose-kolonner

som beskrevet i figurene 2A og 2B. Det maltotriose-

merkede DNA ble tilbakeholdt på kolonnen når den ble vasket med PBS, men ble fjernet ved etterfølgende eluering med lOmM tris-HCl, pH 8,2 (Figur 4A). Det usubstituerte tritierte DNA ble ikke bundet til kolonnen ved pH 7,4

(Figur 4B).

Eksempel XXIV

Potensielt immunogen heptener kan innføres i 5-stillingen

i uridin ved hjelp av en rekke metoder i litteraturen. 5-(perfluorbutyl)-2'-deoksyuridin ble syntetisert ved å bruke metoden til Cech et al, Nucl. Acids Res. 2, 2183 (1979). Kobber-bronse ble fremstilt ved å omsette kobbersulfitt

(5 g, 20 mmol) med sinkpulver (2 g) i 20 ml vann. Blandingen ble dekanter, og resten vasket med vann og så med 5% saltsyre og vann. Like før bruk ble faststoffet (2 g) aktivert med 2% jod i aceton (20 ml). Etter filtrering ble resten vasket med aceton:konsentrert saltsyre og så

med rent aceton. Aktivert kobber-bronse (130 mg,2 mmol)

og 1-jod-1<1>,2,2',3,3<1>,4,4'-heptafluorbutan (1,3 mg,4 mol)

ble omrørt i 3 ml dimetylsulfoksyd ved 110°C i 1 time.

Etter avkjøling og filtrering ble 2<1->deoksyuridin (245 mg

1 mmol) tilsatt, og blandingen oppvarmet ved 110°C i 1 time. Vann (5 ml) ble tilsatt og blandingen ekstrahert med eter. Eterekstraktene ble tørket og inndampet under redusert

trykk. Resten ble kromatografert på en silikagelkolonne og eluert med etylacetat.

Eksempel XXV

Tubericydin ble substituert i 5-stillingen ved derivati-sering av 5-cyano-forbindelsen, toyokamycin. Et eksempel er syntesen av 4-amino5 (tetrazol)-5-yl)-7- (B-g-ribofuranosyl) pyrrolo[2,3-d]pyrimidin ved bruk av metoden til Schram og Townsend, J . Carbohydra. te , Nucleosides :Nucleotides 1, 38

(1974). Toyokamycin (1,0 g) oppløst i vann (100 ml) og

iseddik (13 ml) ble oppvarmet til tilbakeløp. Natrium azid (7,5 g) ble tilsatt i 1,25 g porsjoner i løpet av 10 timer. Løsningen ble avkjølt til 5°C og det utfelte produktet oppsamlet, smp. 276-277°C.

Eksempel XXVI

5-cyano-2<1->deoksyuridin ble fremstilt ifølge Bleckley et al, Nucl. Acis Res. 2, 683 (1975). 5-jod-2<1->deoksyuridin

(1,0 g, 2,82 mmol) ble oppløst i tilbakeløpende heksa-metyldisilizan (HMDS) (10 ml). Overskudd HMDS ble fjernet ved redusert trykk og den resulterende oljen ble oppløst i tørt pyridin (50 ml). Kuproscyanid (350 mg, 3,8 mmol) ble tilsatt, og løsningen oppvarmet ved 160°C i 20 timer. Pyridin ble fjernet ved redusert trykk og resten ekstrahert med toluen som deretter ble fordampet. Resten ble oppvarmet i 50% vandig etanol ved 100°C i 2 timer. Pdofuktet ble renset ved høytrykksvæskekromatografi i motsatt fase og omkrystallisert fra etanol, smp. 161°C.

Eksempel XXVIl4-amino-5-amino-metylen-7-(Ø-D-2-deoksy-furanosyl)-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-dihydroklorid ble oppnådd som følger. 4-amino-5-cyano-7-(3~D-2-deoksy-furanosyl)pyrrolo[2,3-d]pyrimidin (Toyocamycin) (0,2 g)

ble oppløst i saltsyre (10 ml). 10% palladium-på-kull

(0,1 g) ble tilsatt og blandingen hydrogenert ved 2,8 kg/cm 2i 5 timer ved romtemperatur. Etter filtrering ble vannet fordampet ved redusert trykk. Resten ble utgnitt med etanol og produktet omkrystallisert fra 50%-ig etanol.

Eksempel XXVIII

5-amino-2'-deoksyuridin ble fremstilt fra 5-brom-2'-deoksyuridin ifølge fremgangsmåten til Roberts og Visser,

J. Am. Chem. Soc. 14:665-669 (1952). 5-brom-2<1->deoksyuridin

(2g, 6,2 mmol) oppløst i flytende ammoniakk (20 ml) ble innmålt i et glassrør og oppvarmet ved 50°C i 5 dager. Røret ble åpnet og ammoniakken fordampet. 5-amino-2'-deoksyuridin ble omkrystallisert fra 5 ml vann og 75 ml varm isopropylalkohol.

Eksempel XXIX

5-(metylamino)-2<1->deoksyuridin (0,2 g) ble fremstilt som følger. 5-cyano-2'-doeksyuridin (0,2 g 0,05 mol) ble oppløst i 1 N saltsyre (10 ml). 10% palladium-på-kull (0,1 g) ble tilsatt, og blandingen hydrogenert ved 2,8 kg/cm 2i 10 timer ved romtemperatur. Blandingen ble filtrert og vannet fordampet ved redusert trykk. Resten ble utgnidd med eter,.og produktet ble omksystallisert fra 80%-ig etanol.

Eksempel XXX

Maltosetriose ble oksydert til den. tilsvarende karboksylsyre ved hjelp av følgende fremgangsmåte. Maltosetriose (0,5 g, 0,94 mmol) ble oppløst i vann (5 ml). Blykarbonat (0,42 g, 1,1 mmol) og brom (0,17 ml), 3,3 mmol) ble tilsatt,

og blandingen fikk reagere ved romtemperatur i 6 dager hvoretter det ikke ble igjen noe reduserende sukker. Blandingen ble filtrert, og sølvkarbonat (0,2 g) tilsatt. Etter ny filtrering ble filtratet avionisert ved eluering gjennom "Dowex" 50 (H<+>form). Fordampning av vann og tørking i nærvær av fosforpentoksyd ga det ønskede produkt.

Eksempel XXXI

Maltosetriose ble koblet til 5-(3-amino-l-propenyl)-2'-deoksyuridin-5<1>trifosfat ved hjelp av følgende fremgangsmåte. Oksydert maltose triose (190 mg, 0,18 mmol) ble oppløst i dimetylformamid (0,8 ml og avkjølt til 4°C. Isobutylklorformat (25 mg, 0,18 mmol) og tri-n-butylamin (43,ul, 0,38 mmol) ble tilsatt og løsningen fikk reagere ved 4 oC i 15 minutter. 5-(3-amino-l-propenyl)-2<1->deoksyuridin-5 1 -trif os f at (9,0 yumol), oppløst i dimetylformamid

(1,2 ml) og 0,1 M natriumborat og avkjølt til 4°C, ble tilsatt til den ovenstående løsning. Blandingen ble inkubert ved 4°C i 1 time og ved romtemperatur i 18 timer. Den ble så påført på en DEAE-cellulose-kolonne og eluert med en gradient av 0,1 til 0,6 M trietylammoniumbikarbonat, pH 7,5. Produktet ble endelig renset ved høytrykks-væskekromatografi.i motsatt fase.

I følgende er Eksemplene XXXII og XXXIII. Eksempel XXXII er en fremgangsmåte for merking av allylaminmodifisert dUTP med en fluorescein-substituent.. Dette er et eksempel på fremstilling av en selvpåvisende nukleinsyreprobe. Eksempel XXXIII er en fremgangsmåte for å merke forhånds-dannede dobbeltspiralformede nukleinsyrer i N 2-stilling av guanin og i N -stilling i adenin. I eksempel XXXVII er■detektormolekylen bundet til proben. Chromosoma 84: 1-18 (1981) og Exp. Cell Res. 128:485-490, beskriver ende-merking av RNA med rhodamin. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er imidlertid mindre spaltende og merker interne nukleotider.

Eksempel XXXII

Fluorescein ble koblet til 5-(3-amino-l-propyl)-2<1->deoksyuridin-5'-trifosfat (AA-dUTP) som følger. AA-dUTP (10 ^umol) oppløst i 2 ml natriumboratbuffer (0,1 m), pH 9,0, ble tilsatt til fluorescein-isotiocyanat (10 mg, 25^,umol) oppløst i 1 ml dimetylformamid. Etter 4 timer ved romtemperatur ble blandingen påført på en DEAE-cellulose-kolonne som var bragt i likevekt i trietylammonium-bikarbonatbuffer, pH 7,5. Det fluorescein-koblede AA-dUTP ble renset ved e-luering med en gradient på fra 0,1 til 0,6 m trietylammoniumbikarbonat, pH 7,5.

E ksempel XXXIII

DNA kan modifiseres ved reaksjon med kjemiske alkylerings-midler. Lambda DNA ble alkylert i N 2-stilling i guanin og N^-stilling i adenin ved omsetning av DNA med det aromatiske hydrokarbon 7-brommetylbenz[a]antracen. 7-brommetylbenz[a]-antracen ble oppnådd som følger. 7-metyl[a]antracen i karbondisulfidoppløsning ble avkjølt i en fryseblanding og behandlet dråpevis med en mol ekvivalent brom. Etter 30 minutter ble produktet i suspensjonen oppsamlet, og vasket med tør eter og omkrystallisert fra benzen. Ut-byttet var 66% med smeltepunkt 190,5-191,5°C.

DNA, renset fra fag. Lambda, (1,6 mg) ble solubilisert i

5,0 ml av 20 mM kaliumfosfat pH 6,5. Til 4,0 ml av DNA-løsningen ble det tilsatt 500 mikrogram 7-brommetylbenz[a]-antracen i tørt aceton. Etter 30 minutter ved 20°C ble DNA utfelt med to volumer kald etanol. Bunnfallet ble vasket i rekkefølge med etanol, aceton og eter for å fjerne - ubundet 7-brommetylbenz[a]antracen. Enzymatisk hydrolyse av DNA til nukleosider og påfølgende kromatografi av produktene på "Sephadex" LH-20-kolonner, indikerte at 18% av adeninet og 48% av guaninet i DNA ble modifisert i

6 2

henholdsvis N og N -stillingene.

Det modifiserte DNA ble gjort enkeltstrenget enten ved (1)•oppvarming til 100°C i 5 minutter og rask avkjøling eller (2) inkubering med et likt volum 0,1M NaOH i 10 minutter og så dialysering av løsningen i 4 timer mot 1

ml tris-HCl pH 8,0 inneholdende 0,5.ml EDTA for å holde DNA i enkelt-strenget form.

Eksempel XXXIV

En DNA-probe ble ligatert (ligated) til et syntetisk DNA bestående av gjentatte sekvenser av E. coli lac operator DNA. Etter hybridisering for å påvise antiprobe-sekvenser, ble det hybridiserte DNA påvist ved reaksjon med biotinylert

lac repressor som i sin tur ble påvist ved hjelp av en enzymbundet immunosorbentprøve ved bruk av geiteantibiotin-IGG- for å reagere med biotinet og et andre antilegeme koblet til pepperrodperoksydase. Lac polyoperator DNA

er beskrevet av Caruthers (Second Annual Congress for

Recombinant DNA Research,Los Angeles, 1982), og den ble ligatert, i en ligatering med butt ende, ved bruk av T4-ligase, til en adenovirus-DNA-probe. In situ hybridisering av den polyoperator-merkde probe-DNA ble utført som beskrevet av Gerhard et al ( Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 78, 3755 (1981). Biotinylert lac repressor ble fremstilt som beskrevet av Manning et al ( Chromosoma, 53 , 107-117

(1075) og ble påført på adenovirus infiserte.celler,

fiksert til et• objektglass, i Binding-buffer bestående (0,01 Mk Cl, 0,01 M tris (pH 7,6), 0,01 M MgSO , 10~4 MEDTA, 10 MDTT, 5%DMSO (dimetylsulfoksyd) og 50 ^ug/ml okse-serumalbumin av J. Miller, E xperiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1972). Glassene ble vasket i binding-buffer for å fjerne ubundet biotinylert lac repressor og så undersøkt på biotin ved bruk av fremgangsmåten med pepperrot-peroksydase-bundet antilegeme. Denne fremgangsmåten kan tilpasses for å skape affinitetskolonne hvor proben kan bindes til immobilisert represor-protein og så fjernes ved eluering med en spesifikk induser, f.eks. isopropyltiogalaktosid eller tiometylgalaktosid. Affiniteten til repressor-operator-komplekset er ganske

høy 10 M. Når en spesifkk induser bindes til'

repressor faller operator-repressor-komplekset sammen. Eksempel XXXV

5-brom-2<1->deoksyuridin-5<1->fosfat ble fremstilt som følger: 2<1->deoksyuridin-5'-fosfat (6,2 g) ble suspendert i en blanding av 60 ml pyridin og 30 ml eddiksyre. Brom (0,84 ml) ble tilsatt under omrøring i et isvann-bad og omrøringen ble fortsatt i 20 timer under romtemperatur. Løsningen ble konsentrert i vakuum. Etter gjenoppløsning i et minimum av vann ble det utfelt et produkt ved tilsetning av etanol. Råproduktet ble kromatografert på "Dowex" 50 (H ) og eluert med vann. Det frie syreproduktet ble utfelt fra det konsentrerte elueringsmidlet ved tilsetning av etanol.

Eksempel XXXVI -

Alkalisk- fosfat fra kalvetarmer ble biotinylert som følger: Enzymet (1 mg, 7,7 mmol) ble kromatografert på

en G-50 kolonne og eluert. med 0,1 M Hepes-buffer pH 8,0 inneholdende 0,1 M natriumklorid. De samlede fraksjonene ble omsatt med N-biotinyl-6-amino-kapronsyre-N-hydroksyravsyreimidester (0,675 mg, O,77^umol) oppløst i 10 ml dimetylformamid ved romtemperatur i 1 time. Natrium-per-jodat (0,1 M 125 ,ul) ble tilsatt og omrøring fortsatt i 2 timer. Blandingen ble dialysert ved 4 oC over natten i 0,1 M Hepes-buffer pH 8,0 med 0,1 M NaCl hvoretter pH

ble justert til 7,4. Biotin-hydrazid (0,1 M, 0,5 ml) oppløst i 0,1 M Hepes-buffer pH 7,4 og 0,1 M NaCl ble tilsatt og reaksjonsblandingen omrørt i 30 minutter ved romtemperatur. pH ble justert til 8,0 med 0,2M natriumkarbonat og 0,5 ml av nyfremstilt 0,1 M natriumborhydrid i vann ble tilsatt, løsningen ble dialysert mot 0,1 M tris-buffer pH 8,0 med 0,1 M NaCl.

Eksempel XXXVII

,6-cyano-2'-deoksyuridin-5'-fosfat ble fremstilt på samme måten som i fremgangsmåten til Veder et al, J. Carbohydr. Nucleosides, Nucleotides, 5, 261 (1978). 5-brom-2'-doksyuridin-5'-fosforsyre (2,0 g, 15 mmol) tørket ved gjentatt fordampning fra pyridin ble oppløst i 50 ml dimetyl-sulfid. Natriumcyanid (490 mg, 10 mmol) ble tilsatt og løsningen omrørt ved romtemperatur i 2 dager. Løsningen ble fortynnet med 400 ml vann og pH justert til 7,5. Den ble påført på enDEAE-cellulose-kolonne (HCO ^ form) og vasket med 2000 ml 0,02 M trietylammonium-bikarbonat for å gi det ønskede produkt.

\ Eksempel XXXVIII

6-(metylamino)-21-deoksyuridin-51-fosforsyre ble fremstilt som følger: 6-cyano2<1->doksyuridin-5'-fosforsyre (0,2 g,

60 mmol) ble oppløst i 0,1 M saltsyre. Etter tilsetning

av 10% palladium-på-kull (0,1 g) ble blandingen hydrogenert

med 2,8 kg/cm 2 ig 20 timer ved romtemperatur. Blandingen ble filtrert, nøytralisert med litiumhydroksyd og lyofilisert. Produktresten ble ekstrahert med etanol.

Eksempel XXXIX

Pepperrots-peroksydase (20 mg) oppløst i 5 ml destillert vann ble tilsatt til 1,0 ml nyfremstilt 0,1 M natrium-perjodatløsning.. Etter omrøring ved romtemperatur i 20 min. ble den dialysert over natten ved 4°C mot ImM natriumacetat pH 4,4. Biotinhydrazid (2,6 mg, 5x10-2 mmol) oppløst i

2,0, 0,1 M Hepes-buffer pH 7,4 med 0,1 M natriumklorid ble bragt til pH 8,0 med 0,2 M natriumkarbonat og 0,5 ml av en nyfremstilt 0,1 M natriumborhydridløsning i vann ble tilsatt. Etter 2 timer ved 4°C ble proteinet renset på

en "Sephadex" G-50 kolonne og eluert med 0,1 M Hepes og 0,1 M NaCl.

Eksempel XL

Gulrotsyre fosfatase er nevnt av Brunngraber og Chargaff, J. Biol Chem,, (1967) 242, 4834-4840 som et biprodukt ved rensing av fosfortransferase og er renset til en spesifikk aktivitet på 4 60 uM/mg/min. ved 3 7°C med paranitrofenyl-fosfat som substrat. Rensingen omfattet trinnene (a) absorbsjon av ikke-spesifikke proteiner ved DEA-cellulose, (b) syrerensing av enzymet, (c) acetonfraksjonering; (d) concanvalin A affinitetskromatografi, (e)hydroksyapatitt-kromatografi og (f) "Sephadex" G-100 fraksjonering. Den spesifike aktiviteten til det enzym som underkastes "Sephadex" G-100-fraksjoneringen var på grunn av tap av aktivitet i det foregående affinitetskromatografi-trinnet (d) 170 uM/mg/m.- Ved å- forandre elueringsbetingelsene i trinn (d), kan disse tapene unngås med det resultat at

•den spesifikke aktiviteten til enzymet før "Sephadex" G-100-fraksjoneringen kan forbedret til 340 uM/mg/m. "Sephadex" G-100-fraksjoneringstrinnet bør gi et enzym med en spesifikk aktivitet på 800 uM/mg/m eller høyere. Gulerotsyre-fosfatåse ble biotinylert ved bruk av fremgangsmåten til

Wilchek et al Biochemistry 6, 247 (1967). Til enzymet

(20 mg) oppløst i 0,1 M NaCl, pH 5, ble det tilsatt biotin-hydrazid (2,0 mg, 7x10 -3 mmol) og l-etyl-3-(3-dimetylamino-propyl)karbodiimidhydroklorid (1 mg, 7x10 mmol) oppløst i 0,1 M NaCl, pH 5. Etter 2 timer ved 4°C ble enzymet kromatografert på "Sephadex" G-50 og eluert med 0,1 M natriumacetat, pH 5,0.

Av spesiell betydning og signifikans ved utførelsen av foreliggende oppfinnelse er anvendelsen av selv-signaliserende eller selv-indikerende eller selv-påvisende. nukleinsyrer, spesielt slike nukleinsyrer som kan innføres i dobbelt-strenget DNA og lignende. Slike selv-signaliserende eller selv-påvisende nukleinsyrer kan fremstilles ved kovalent binding til en allylamin-substituent slik at det dannes- et modifisert nukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse, et molekyl som vil gelatere spesielle ioner, f.eks. tungmetaller, -sjeldne jordarter, etc. Generelt kan den gelaterte ion påvises enten (a) ved radioaktiv utstråling eller (b) ved å anvende ionen for å katalysere en kromogen eller fluorogen reaksjon.

Eksempelvis reduseres en løsning av 3,4-dinitrofenol til 3,4-diaminocykloheksan

Dette materiale bromeres så

for å danne 3,4-diamino-brom-cykloheksan (dABCH). Denne forbindelse omsettes med en halogenid (Cl, Br, I)-substituert karboksymetylforbindelse for å danne et tetra-karboksy-metyl-derivat eller dABCH (TCM-dABCH): brom substitueres med en aminogruppe ved bruk av løselig ammoniakk

Denne forbindelse omsettes så med klortiofosgen for å danne isotiocyanatderivatet av (TCM-dANCH). Endelig omsettes denne forbindelse med dUTP-allylamin-derivat for å fremstille modifisert dUTP.

Kobolt eller andre tungmetallioner eller andre sjeldne jordaksioner kan gelateres til forbindelsen etter trinn 3 ovenfor. Eller nukleinsyren kan substitueres med dette addukt og så kan ionen tilsettes. (Eksempelvis tilsettes

-19

kobolt ved pH 6 der bindingskonstanten er 10 M).

Kobolt kan påvises ved radioaktivitet. Det kan også

påvises ved dets evne til å oksydere metylenblått til leukoformen i nærvær av molekylært oksygen. Det kan anvendes for å oksydere løselige sulfhydrogrupper til disulfidbindinger, også dette i nærvær av molekylært oksygen.

Denne type av selv-signaliserende molekyler kan anvendes

for å overvåke enhver nukleinsyrehybridiseringsreaksjon.

Den er spesielt viktig for påvisning av nukleinsyrer i

geler (eksempelvis i sekvensdannende geler).

Når det gjelder dens anvendelse i radioaktivitet, kan den anvendes for å skreddersy den ønskede isotop, dvs. dersom det behøves en sterk 3- eller y-emitter, kan denne isotop gelateres. Eksempler på isotoper som kan anvendes er oppført nedenfor. Streptavidin, et protein fremstilt av en Streptomyces avidinii er en bestanddel med stor molekylvekt i et syner-gistisk par av forbindelser som begge foreligger i dyrknings-filtratene av denne mikroorganismen. Hver av bestanddelene i paret er inaktiv, men er i kombinasjon aktive mot gram-negative mikroorganismer. Det er funnet at den lille bestanddelen i dette antibiotikum hindrer de novo-syntesen av vitaminet biotin og viser således i det minste i syntetiske media, antimikrobiell aktivitet. I komplekse media må imidlertid den store bestanddelen inkluderes for å utøve samme virkning på bakterier. Dette er vist å være forårsaket av nærvær av eksternt biotin i det komplekse medium. Den store molekylbestanddelen er funnet å binde ekstern biotin og viser således den samme slags virkning som avidin fra egg og oviduktvev fra verpende fugler.

Streptavidin er renset og vist å være et polypeptid med 60.000 dalton. Lik avidin inneholder streptavidin fire underenheter og binder tett fire biotinmolekyler. Til forskjell fra avidin er det imidlertid ikke-glykosylert og det har PI på 5,0 sammenlignet med avidin som har PI = 10,5. På grunn av forskjellen i pl har ikke streptavidin tendens til ikke-spesifikt å reagere med DNA.

Fremstilling av streptayidin

Et semi-syntetisk medium inneholdende salt, 1% glukose,

0,1% asparagin, 0,05% gjærekstrakt og sporelementer ble fremstilt. Kulturene ble dyrket ved 26°C i tre dager. Mycellium ble fjernet ved sentrifugering og protein i den overstående væsken ble absorbert på DEAE-cellulose i en satsvis fremgangsmåte etterat pH var justert med IM HC1 til 7,2. DEAE-cellulose ble frafiltrert og vasket med 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) inntil det ikke kunne fastslås noen absorbans ved 280 nm. Streptavidin ble eluert med 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) inneholdende 0,5 M NaCl. Ammoniumsulfat-utfelling ble brukt for ytterliger å konsentrere streptavidin (50% W/v ved 4°C.

Bunnfallet ble oppløst i vann og dialysert mot 1,0 M NaCl,

50 mM Na2C0^. I det neste trinnet ble det brukt affinitetskolonne-kromatografi på iminobiotinsefarose. Eluert streptavidin fra iminobiotin sefarose-kolonnen ble vist å

være kromatografisk rent ved ikke-denaturerende agarose-gel-elektroforese.

Den endelige rensingen av streptavidin fremføres ved affini-tetsrensing ved hjelp av en iminobiotin-sefarosekolonne. Iminobiotin er en analog av biotin hvori karbonylen i ureadelen er substituert med en iminfunksjon. Iminobiotin vil binde avidin og streptavidin ved en basisk pH, men komplekset er dissosierbart ved det sure pH.

Iminobiotin fremstilles fra biotin i flere trinn. Biotin hydrolyseres av bariumhydroksyd til cis-3,4-diamino-2-tetrahydrotiofen-valeriansyre som omsettes med cyanogen-bromid til iminobiotin. Iminobiotinet kobles til aminosefarose via N-hydroksyravsyreimidesteren av dets hydrobromidsalt.

Den rå proteinblandingen fra DEAE-eluerte Streptomyces avidinii-inkuberingsmedia oppløses i 50 mM natriumkarbonat og 1,0 M natriumklorid (pH 11) og påført på en iminobiotin-kolonne som på forhånd er bragt i likevekt med denne løsning. Kolonnen elueres ved pH 11. Streptavidin elueres deretter med 50 mM ammoniumacetat, pH 4,0 inneholdende 0,5 M natriumklorid. Elueringsmidlet dialyseres tre ganger mot 1 mM Tris pH 7,4 og lyofiliseres til tørrhet.

Ved gjennomføringen av foreliggende oppfinnelse er avidin anvendbar som en påvisningsmekanisme for merket DNA, som f.eks. biotin-merket DNA. Ved omtrent nøytralt pH dannes imidlertid avidin selv komplekser med DNA, med det resultat at eventuelle signaler som kunne oppnås fra et kompleks mellom biotin-merket DNA og avidin kan tapes eller være ikke-påvisbart i bakgrunnen på grunn av kompleksdannelsen mellom avidin og umerket DNA. Denne ulempe ved bruken av avidin ved utførelsen av foreliggende oppfinnelse forekommer ikke med streptavidin, som ikke danner et kompleks med DNA ved ca. nøytral pH, men er istand til å danne et kompleks med biotindelen av biotin-merket DNA.

I et annet aspekt rettet på den brede anvendbarheten av

avidin og streptavidin foråvisning av merkede forbindelser bortsett fra DNA, er avidin og streptavidin spesielt effektive som påvisningsmekanisme for merkede proteiner, polysakkarider og lipider. Eksempelvis kan det til en fast matrise festes et spesielt antigen og til dette antigen binde et antilegeme som er rettet mot dette antigen som selv er biotinylert.

Det kan så undersøkes på nærvær av dette biotinylerte antilegemet ved å omsette det med avidin eller streptavidin i kompleks med et enzym, som f.eks. alkalisk fosfatase fra kalvetarmer, eller i hvilket det er bundet et fluorescerende molekyl, som f.eks. fluoroscein.

Bruken av antigen-antilegemesystemet for påvisning av enten antigen eller antilegeme er vel kjent. Et sammenlignbart system er et system basert på et glykosylert substrat eller molekyl og avpasset eller passende lektin. I dette systemet ville lektinet bære et merke, som f.eks. fluorescein eller et passende enzym. I dette glykosyl-lektin-systemet danner det merkede lektinet et kompleks med glykosyldelen, sammenlignbar med antigen-antilegeme-komplekset, og dette kompleks omfattende det glykosylerte molekylet og passende merket lektin med den nødvendige glykosyl- eller sukker-delspesifisiteten ville så vise seg ved å oppvise den ønskede respons fra merkedelen av det merkede lektinet som danner glykosyl-lektin-komplekset.

Et annet aspekt ved gjennomføringen av foreliggende oppfinnelse som er spesielt fordelaktig er å utføre påvisningen eller hybridiseringen i den flytende fase mellom det DNA

som skal påvises og den DNA-påvisende probe. I dette væske-fasesystemet festes hverken DNA-molekylet som skal påvises

eller den passende DNA-påvisende proben til noe uløselig substrat eller noen uløselig kjemisk del. Fordelene med påvisningssystemet i flytende fase ligger i hastigheten ved hybridiseringen eller hybriddannelsen mellom DNA som skal påvises og den passende DNA-proben for dette. I et fast-stoff-væske-system er eksempelvis den tiden som kreves for å gjennomføre gjenkjennelse og hybridiseringsdannelse ca. 10 ganger større enn om den ble utført i et fullstendig flytende system, dvs. både DNA som skal påvises og det påvisende DNA er ikke festet til en uløselig del.

Probene som fremstilles ifølge praktiseringen av foreliggende oppfinnelse kan tilpasses for bruk ved påvisning av virus og bakterier i væsker som angitt ovenfor. Der de væsker som skal undersøkes ikke inneholder store mengder protein, kan virus deri konsentreres ved absorbsjon på hydroksyapatitt og elueres i en liten mengde fosfatbuffer. Når den væske som skal undersøkes inneholder store mengder protein, kan virus konsentreres ved sentrifugering ved høy hastighet.

Dersom antilegemer var tilgjengelige ville absorbsjonen på en affinitetskolonne og eluering med syre være foretrukket, fordi det ville være mulig å behandle mange prober ifølge utførelsen av oppfinnelsen på samme tid. Bakteriene som skal undersøkes konsentreres vanligvis lett ved sentrifugering.

Ifølge gjennomføringen av foreliggende oppfinnelse ville identifikasjon eller karakterisering av de isolerte partiklene, virus og bakterier, være hybridisering av den karakteriserende eller identifiserende DNA derav med en spesifikk enkelstrenget DNA-probe fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse. Etter hybridisering, ville overskudd ikke-hybridisert probe DNA fordøyes med S^-nuklease og eksonuklease I fra E. coli ved høyt saltinnhold for å under-trykke snittaktiviteten til S-^-nuklease, se Vogt, Methods in Enzymology, vol. 65, sidene 248-255 (1980). Denne nukleasebehandling ville produsere mononukleotider fra overskuddet av ikke-hybridisert, senkelt-strenget DNA-proben, men ville etterlate den dobbelt-strengede, hybridiserte DNA intakt. Denne ville så bli absorbert ved høyt saltinnhold på "Dowex" anionveksler (nukleotidene og den lille mengden av oligonukleotider vil ikke bindes til harpiksen ved høy saltkonsentrasjon). Den resulterende hybridiserte DNA ville så bli identifisert ellerkarakterisert vedhjelp av forskjellige fremgangsmåter som er anvendbare ved utførelsen av foreliggende oppfinnelse.

De spesielle nukleotider ifølge oppfinnelsen omfatter en fosforsyre P-del, en sukker- eller monosakkarid S-del, en base B-del, et purin eller et pyrimidin og en signaliserende kjemisk del Sig kovalent festet dertil, enten til P-, S-eller B-delen. Det følger strukturformler for forskjellige baser B-deler og nukleotider som er modifisert ifølge oppfinnelsen.

Hovedpurinene

De spesielle nukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse som angitt ovenfor, omfatter i tillegg til P-, S- og is-delene en kjemisk del Sig som er kovalent bundet til P-, S- og/eller B-delene. Av spesiell interesse overensstemmende med utførelsen av foreliggende oppfinnelse vil det være de nukleotidene som har den generelle formel

hvor P er fosforsyredelen, inkludert mono-, di-, tri-

eller tetrafosfatet, S sukker eller monosakkarid-delen,

B basedelen, enten et purin eller et pyrimidin. Fosforsyredelen P er festet til 3' og/eller 5<1->stillingen i S-delen når nukleotidet er et deoksyribonukleotid og i 2',

3'- og/eller 5'-stillingen når nukleotidet er et ribo-nykleotid. Base B-delen er festet fra Nl-stillingen eller N9-stillingen til 1'-stillingen i S-delen når basedelen

er henholdsvis et pyrimidin eller et purin. Uttrykket Sig-delen er kovalent festet til B-delen i nukleotidet og når den er festet slik er den istand til å signalisere selv eller gjøre seg selv selv-påvisende eller sitt nærvær kjent og tillater ønskelig eller fortrinnsvis inn-føring av det resulterende nukleotidet P - S - B - Sig i eller til å danne en dobbelt-strenget spiralformig DNA eller RNA eller DNA-RNA-hybrid og/eller å være påvisbar derpå.

Et annet spesielt nukleotid ifølge oppfinnelsen erkarakterisert vedden generelle formel:

Slike nukleotider ifølge oppfinnelsen ville karakteriseres som ribonukleotider. Fosforsyredelen er festet i 2'-, 3'-og/eller 5<1->stillingen i sukker S-delen og basen B festet fra Nl-stillingen eller N9-stillingen til 1'-stillingen i sukker S-delen når nevnte base er henholdsvis et pyrimidin

I

l

eller et purin. Den kjemiske Sig-delen er kovalent festet til sukker S-delen og nevnte kjemiske Sig-del er når den er festet til nevnte S-del i stand til å signalisere selv eller gjøre seg selv-påvisende eller sitt nærvær kjent og tillater fortrinnsvis innføring av ribonukleotidet i dets tilsvarende dobbelt-strengede RNA eller DNA-RNA-hybrid.

Slike nukleotider

harønskelig den kjemiske Sig-

delen festet til C2<1->stillingen i S-delen eller C3'-stillingen i S-delen.

Nukleotider ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter ytterligere de nukleotider som har formelen:

hvori P er fosforsyredelen, S sukkerdelen og B basedelen.

I disse spesielle nukleotider er P-delen festet til 3'-og/eller 5'-stillingen i S-delen, når nukleotidet er deoksyribonukleotid og i 2'-, 3'- og/eller 5'-stillingen når nukleotidet er et ribonukleotid. Basen B er enten et purin eller et pyrimidin og B-delen er festet fra NI- eller N9-stillingen til 1<1->stillingen i sukkerdelen når nevnte B-del er hhv. et pyrimidin eller purin. Den kjemiske Sig-delen er kovalent festet til fosforsyre P-delen via den kjemiske binding

i det nevnte Sig, når den er festet til nevnte P-del ..er i stand til å signalisere selv eller gjøre seg selvpåvisende eller sitt nærvær kjent og ønskelig er nukleotidet i stand

til å innføres i et dobbelt-strenget polynukleotid, som f. eks. DNA, RNA eller DNA-RNA-hybrid og fortsatt være selvpåvisende når den er innført slik.

Det skal påpekes at de spesielle nukleotider ifølge oppfinnelsen som er beskrevet eller definert ovenfor ved den generelle formel P-S-B-Sig, også omfatter nukleotider hvor den kjemiske Sig-delen er kovalent festet til B-delen i N^ - eller 6-aminogruppe-stillingen når B-delen er adenin eller i N 2- eller 2-aminogruppe-stillingen når B-delen er guanin eller i N 4- eller 4-aminogruppe-stillingen når B-delen er cytosin. De resulterende nukleotidene som inneholder Sig-delen festet dertil er istand til selv å signalisere eller gjøre seg selv-påvisende eller sitt nærvær kjent og være påvisbare er en dobbelt-strenget eller DNA,

RNA eller DNA-RNA-hybrid.

Som angitt ovenfor når det gjelder sammensetningen av de forskjellige spesielle nukleotidene ifølge oppfinnelsen kan som en oppsummering de spesielle nukleotidene beskrives som omfattende en fosforsyredel P, en sukkerdel S og en base-del B, et purin eller pyrimidin, hvilken kombinasjon av P-S-B er vel kjent når det gjelder å definere nukleotider, båede deoksyribonukleotider og ribonukleotider. Nukleotidene modifiseres så ifølge oppfinnelsen ved kovalent å ha bundet en kjemisk del Sig til P-delen og/eller S-delen og/eller B-delen. Den kjemiske delen Sig som på denne måten er festet til nukleotidet P-S-B kan gjøre det resulterende nukleotidet som nu omfatter P-S-B hvor Sig-delen er festet til en eller flere av de andre delene, selv-påvisende eller selv-signaliserende eller i stand til å gjøre sitt nærvær kjent, når det innføres i et polynukleotid, spesielt et dobbelt-strenget polynukleotid, som en dobbelt-strenget DNA, en dobbelt-strenget RNA eller en dobbelt-strenget DNA-RNA-hybrid. Sig-delen skal ønskelig ikke innvirke på nukleotidets evne til å danne et dobbelt-strenget polynukleotid inneholdende det speielle Sig-holdige nukleotidet ifølge oppfinnelsen og, når innført deri, er det Sig-holdige nukleotidet istand til påvisning, lokalisering eller observasjon.

Den Sig-del som anvendes ved fremstilling av de spesielle nukleotidene ifølge oppfinnelsen kan omfatte et enzym eller et enzym-materiale, som f.eks. alkalisk fosfatase, glukose-oksydase, pepperrotsperoksydase eller ribonuklease. Sig-delen kan også>: inneholde en f luoreserende bestanddel som f.eks. fluorescein eller rhodamin eller dansyl. Om ønsket kan Sig-delen omfatte en magnetisk bestanddel som er forbundet med eller festet dertil, som f.eks, et magnetisk oksyd eller magnetisk jernoksyd, hvilket vil gjøre nukleotidet eller polynukleotidet som inneholder en slik magnet-holdig-del påvisbar ved hjelp av magnetiske midler. Sig-delen kan også inkludere en elektrontett komponent som f.eks. ferritin,

slik at den blir tilgjengelig for observasjon. Sig-delen kan også omfatte en radioaktiv isotop-bestanddel som f.eks. radioaktivt kobolt, hvilket gjør det resulterende nukleotidet observerbart ved strålingspåvisende midler. Sig-delen kan omfatte en haptenbestanddel eller i og for seg være istand til å danne komplekser med et antilegeme som er spesifikt for dette. Mest anvendbart er Sig-delen et polysakkarid eller oligosakkarid eller monosakkarid, som er istand til å danne komplekser med eller festes til et sukker- eller polysakkarid-bindende protein, som f.eks. et lektin, eksempelvis Concanavilin A. Sig-komponenten eller delen av de spesielle nukleotidene ifølge oppfinnelsen kan også omfatte en chemiluminescent-bestanddel.

Som angitt ifølge utførelsen av foreliggende oppfinnelse

kan Sig-bestanddelen omfatte en hvilken som helst kjemisk del som kan festes enten direkte eller ved hjelp av en kjemisk binding eller bindearm til nukleotidet, som til base B-bestanddelen deri, eller sukker S-bestanddelen deri, eller fosforsyre P-bestanddelen derav.

Sig-bestanddelen i nukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse og nukleotidene og polynukleotidene som inneholder nukleotidene ifølge oppfinnelsen inneholdende Sig-bestanddelen er ekvivalent med og anvendbar for samme formål som nukleotidene beskrevet i den ovenfor nevnte U.S. patent-søknad nr. 255.223. Mere spesielt er den kjemiske delen A beskrevet i U.S. søknad nr. 255.223 funksjonelt ekvivalent til Sig-bestanddelen eller kjemiske delen i de spesielle nukleotidene ifølge oppfinnelsen. Sig-bestanddelen eller kjemiske delen til nukleotidene ifølge oppfinnelsen kan festes kovalent direkte til P-, S- eller B-delene eller festes dertil via en kjemisk binding eller bindingsarm som beskrevet i U.S. patentsøknad 255,223, som angitt ved den prikkede linjen som forbinder B og A i nukleotidene i U.S. søknad 255,223. De forskjellige bindingsarmene eller bindingene som er identifisert i U.S. søknad nr. 255.223

er anvendbare på og nyttige ved fremstillingen av de spesielle nukleotidene ifølge oppfinnelsen.

Et spesielt viktig og anvendbart aspekt på de spesielle nukleotidene ifølge oppfinnelsen er bruken av slike nukleotider ved fremstilling av DNA- eller RNA-prober. Slike prober vil inneholde en nukleotidsekvens som i det vesentlige passer til DNA- eller RNA-sekvensen i det genetiske materiale som skal lokaliseres og/eller identifiseres. Proben vil inneholde en eller flere av de spesielle nukleotidene ifølge oppfinnelsen. En probe med en ønsket nukleotidsekvens, som f.eks. et enkelt-strenget polynukleotid, enten en DNA- eller RNA-prope vil så bli bragt i kontakt med genetisk DNA eller RNA-materiale som skal identifiseres. Ved lokalisering av proben og dannelsen av ét dobbelt-strenget polynukleotid inneholdende proben og det passende DNA- eller RNA-materiale som skal identifiseres, vil det resulterende dannede dobbelt-strengede DNA- eller RNA-holdige materiale så være observerbart og identifiseres.

En probe ifølge foreliggende oppfinnelse kan inneholde i

det vesentlige hvilket som helst antall nukleotid-enheter, fra ca. 5 nukleotider opp til ca. 500 eller mere, slik det

måtte være nødvendig. Det synes derfor som om 12 passende, fortrinnsvis på hverandre følgende, nukleotidenheter ville være tilstrekkelig til å gjennomføre en identifikasjon av det meste av det DNA- eller RNA-materiale som skal under-søkes eller identifiseres, dersom sekvensen på 12 nukleotider i proben passer til en tilsvarende samarbeidende sekvens i det DNA- eller RNA-materiale som undersøkes eller skal identifiseres. Som angitt kan slike prober inneholde et eller flere av de spesielle Sig-holdige nukleotider ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis minst ca.

ett spesielt nukleotid pr. 5-10 av nukleotidene i proben.

Som angitt ovenfor kan forskjellige teknikker anvendes ved utførelsen av foreliggende oppfinnelse for innføring av de spesielle nukleotidene ifølge oppfinnelsen i DNA- og beslektede strukturer. En spesielt anvendbar teknikk som er referert til ovenfor omfatter anvendelsen av terminal-transferase for tilsetning av biotinert dUMP i 3'- endene i et polypyrimidin eller til enkelt-strenget DNA. Det resulterende produkt, som f.eks. en enkelt-strenget eller klonet DNA, som har biotinert dUMP festet i 3'-endene,

kan gjenvinnes ved hjelp av en Sepharose-avidin-kolonne hvori avidin vil danne kompleks med det biotinerte dUMP i endene av DNA og deretter gjenvinnes. Ifølge utførelsen av foreliggende oppfinnelse kan hybridisering til mRNA gjennomføres i løsning og det resulterende hybrid gjenvinnes via en Sepharose-avidin-kolonne og mRNA-gjenvinnes derfra. Lignende teknikker kan anvendes for å isolere DNA-RNA-hybridet.

Denne teknikk med å anvende terminal transferase for tilsetning av de spesielle nukleotidene ifølge oppfinnelsen er bredt anvendbare og de resulterende modifiserte nukleotidene inneholdende de spesielle nukleotidene ifølge oppfinnelsen omfattende de spesielle biotinerte nukleotidene eller de spesielle glykosylerte nukleotidene kan gjenvinnes selektivt ved hjelp av kompleksdannelse med avidin på en Sepharose-avidin-kolonne eller kompleksdannelse med et lektin, som f.eks. Concanavalin A eller en Sepharose-Concanavalin A-kolonne.

Som illustrasjon av utførelsen av foreliggende oppfinnelse

ble biotinert dUTP tilsatt til 3'-endene av dpT^, såvel som enkelt- og dobbelt-strenget dpT^under anvendelse av terminal transferase og det resulterende produktet ble renseg gjennom G-50 "Sepharose" og separert på en Sepharose-avidin-affinitetskolonne. Det ble funnet at 69% av dpT^-molekylene var biotinert og gjenvunnet på Sepharose-avidin-kolonnen. Resultatene av dette forsøk fastslo at terminal-transferase tilsatte biotinert dUMP til 3'-endene i et polypyrimidin.

Påvisning av nukleinsyrer til hvilke spesielle molekyler er kovalent festet kan gjennomføres ved bruk av mange naturlig forekommende proteiner til hvilke små molekyler er kjent å binde seg spesifikt. I denne fremgangsmåte bindes de små molekylene til nukleotidet ved bruk av allylamin sidekjeden. Disse nukleotider innføres så i spesielle nukleinsyrer ved å bruke en DNA- eller RNA-polymerase eller -ligase-reaksjon eller en kjemisk binding. Etter varmebehandling av denne probe med en komplementær antiprobesekvens, bestemmes nærværet av proben ved den spesiefikke binding av proteinet til liganden som er kovalent bundet til proben.

Eksempler på protein-ligand-reaksjoner som passer for denne type av detekrorsystem omfatter: 1. Enzymer og allosteriske effektor- eller modellator-molekyler. Et eksempel på dette er enzymet treonindehydratase som er et heterotropisk enzym ved at effektormolekylet, L-isoleucin, er forskjellig fra substratet, L-treonin,

J. Monod, J. Wyman og J.P. Changeux (1965), J. Moi. Biol. 12:88-118.

2. Effektormolekyler involvert i regulering. Et eksempel på dette er den spesifikke binding for 3',5-cyklisk adenosin-monofosfat til det cykliske AMP-reseptorproteinet, I.Pastan og R. Perlman, Science 169:339-344 (1969). Et annet eksempel

er laktoserepressormolekylet og induseringsmolekylene isopropyltiogalaktosid eller tiometylgalaktosid. Disse to induseringsmolekylene kalles grauitous-induserings-forbindelser idet de ikke metaboliseres av de enzymer de induserer, W. Gilbert og B. Muller-Hill, Proe. Nati. Acad. Sei. (US), 70:3581-3584, (1973). 3. Hormonreseptorer og andre reseptorer på overflaten av cellen til hvilke organiske molekyler vil bindes spesifikt. Et eksempel på dette er epinephrine-epinephrin-reaktor-systemet i hvilket epinefrin er bundet på en steriospesifikk måte med en høy affinitet til reseptoren. Siden reseptorproteinet er uløselig i vann, vil det i dette systemet være innleiret i en lipid-toskikts-struktur som f.eks. en liposom. Passende detektorsystemer vil omfatte spesifikke enzymer eller fluorescente molekyler inne i eller innenfor det dobbelte lipidskiktet. 4. Spesifikke ligand-bindende-proteiner inbefattet i transport av små molekyler. Et eksempel på dette er de periplastmiske binde-proteinene i bakterier som er vist å binde mange aminosyrer, glukose, galaktose, ribose og andre sukker, Pardee, A. Science, 162:632-637, (1968), G.L. Hazelbaur og J. Adler, Nature New Bio. 230: 101-104 (1971).

I de ovenfor nevnte eksempler reagerer liganden som er bundet til nukleinsyren, med et naturlig forekommende protein. Det spesielle ved denne reaksjonen beror på ligand-bindestedet i proteinet.

Et ytterligere eksempel på innvirkning av små molekyler

på naturlig forekommende proteiner omfatter den spesifikke binding av koenzym eller andre prostetiske molekyler til enzymer. Eksempler på slike koenzymer omfatter tiamin-pyrofosfat, flavin-mononukleotid, flavinadenin-dinukleotid, nikotinamidadenindinukleotid, nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat, koenzym A, pyridoksyl-fosfat, biotin, tetrahydrofol-

syre, koenzym B, 2, lipoin- og askorbinsyre. Mange av disse molekyler danner kovalente bindinger med deres apoenzymer. Noen, som for eksempel koenzym A, koenzym B^°9tetra-hydrofolsyre, forbinder seg imidlertid på en ikke-kovalent, men spesifikk måte med deres kognat-apoenzymer. Et spesifikt koenzym-apoenzym-system for anvendelse i dette systemet er flavin adenin-dinukleotid (FAD) og flavin adenin dinukleotid-reduktase isolert fra Escherichia coli. Med dette systemet er bindingen av FAD tilstrekkelig sterk å muliggjøre påvisning ..

De spesielle nukleotider ifølge oppfinnelsen og polynukleotider som omfatter slike nukleotider, enten enkelt-strengede eller dobbelt-strengede polynukleotider, DNA og/eller RNA, omfattende bestanddelene, fosforsyredelen P, sukker- eller monosakkarid-delen S, basedelen B, et purin eller et pyrimidin, og den signaliserende eller selv-påvisende delen,

Sig, som er kovalent festet til enten P-.. S- eller B-delene, som angitt ovenfor, har mange anvendelser. Eksempelvis er nukleotidene ifølge oppfinnelsen og polynukleotidene som inneholder nukleotidene ifølge oppfinnelsen anvendbare som immun-stimulerende midler, som hjelpemidler i vaksiner,

som middel for stimulering eller induksjon fra kompetente celler, som f.eks. lymocytter, for fremstilling av lymfokiner, cytokiner eller cytokininer, interferon eller andre cellulære produkter.

Det er vel kjent at dobbelt-strenget poly A:U er en stimulator eller et induseringsmiddel for fremstilling av interferon, selvom det er et svakt middel. På lignende måte er poly I:C også kjent som en stimulator eller et induseringsmiddel for fremstilling av interferon.

Fordelen med nukleotider, som f.eks. dobbelt-strengede poly-nukleotider som inneholder en eller flere nukleotider ifølge oppfinnelsen, er at slike nukleotider faktisk vil være mere effektive og krafigere indusering- eller stimulerings-midler for fremstilling av interferon og beslektede materialer fra celler. Eksempelvis er nukleotider ifølge oppfinnelsen som inneholder de ovenfor beskrevne bestanddelene P , S-, B og Sig, passende fremstilt slik at nukleotidene og polynukleotidene som er fremstilt derfra er mere resistente overfor nukleaser. Slike nukleotider og polynukleotider som inneholder de samme og er passende fremstilt, er på lignende måte mere istand til å komme i kontakt med, stimulere og gjennomtrenge celleoverflater eller -membraner, som f.eks. celle-overflåtene eller -membranene til lymfocytter og andre celler for å stimulere de samme for fremstilling av et ønsket cellulært produkt, som f.eks. interferon.

Særlig anvendbare blant disse spesielle nukleotidene ifølge oppfinnelsen med formelen P-S-B-Sig og spesielt anvendbare er de hvor Sig-bestanddelen er i 5-stilling i pyrimidinet eller 7-stilling i purinet eller et deazapurin eller N 2-stillingen i guanin eller N -stillingen i adenin. Slike nukleotider og polynukleotider som inneholder de samme, både enkelt-strengede og dobbelt-strengede nukleotider,

DNA og/eller RNA fremstilles ifølge oppfinnelsen for å tilveiebringe øket stabilitet når det gjelder den dobbelt-strengede spiralen i DNA eller RNA eller DNA-RNA-hydrid som inneholder de samme. Øket resistens overfor nukleaser er også oppnåelig såvel som forandringer eller fordelaktige endringer i de hydrofobe egenskapene eller de elektriske eller ladnings-egenskapene til nukleotidene og polynukleotidene som inneholder dem. Det fremstilles også nukleotider og polynukleotider ifølge oppfinnelsen, som når de administreres til mennesker, har redusert pyrogenisitet eller oppviser mindre av andre hele legemstoksiske responser.

I tillegg fremstilles nukleotidene og polynukleotidene ifølge oppfinnelsen for å tilveiebringe en ligand, som f.eks. bestanddelen Sig, til hvilken spesifikke polypeptider kan kombineres for å starte eller medføre dannelsen av RNA-komplekser. Det kan derfor sees at nukleotidene ifølge oppfinnelsen omfatter P-, S-, B- og Sig-bestanddeler hvori Sig er kovalent bundet til enten P-, S- eller B-delene, tilveiebringer en rekke kjemiske midler som spesielle biologiske effekter inkludert, terapeutiske effekter og cytotoksiske effekter.

De spesielle nukleotidene ifølge oppfinnelsen, inkludert polynukleotider som inneholder disse nukleotider, er i tillegg til å være stimulerende eller induserende midler for fremstilling av cellulært materiale eller produkter,

som f.eks. interferoner, lymfokiner og/eller cytokiner,

også anvendbare på grunn av deres kjemoterapeutiske effekt og for fremstillingen av kjemoterapeutiske midler basert derpå, men også for sine cytotoksiske effekter og fremstillingen av cytotoksiske midler basert derpå. Delen Sig som er festet til de spesielle nukleotidene ifølge oppfinnelsen inneholdende de andre delene eller bestanddelene P,.S og B tilveiebringer et sted i og for seg for festing

av spesielle midler med kjent kjemoterapeutisk eller cytotoksisk effekt. Slike nukleotider kan innføres eller administreres til den som behandlet, f.eks. menneskelegeme eller et dyr, slik at de innføres i DNA-og/eller RNA-bestanddelene i legemet eller cellen slik at de enten innvirker på syntesen i legemet eller cellulært DNA og/eller RNA eller å angripe tumorer eller faktisk drepe eller på annen måte innvirke på veksten av uønskede celler.

Administrasjonen av nukleotidene og/eller polynukleotidene inneholdende nukleotidene til legemet, menneskelegemet eller dyret, kan gjennomføres på en rekke passende måter. Spesielt effektiv. ville den intravenøse innføringen i legemet av preparatet inneholdende nukleotidene ifølge oppfinnelsen og en passende fysiologisk godtagbar bærer være, eller nukleotidene kunne administreres subkutant, trans-dermalt eller intramuskulært eller ved direkte innføring til det sted der den kjemoterapeutiske eller cytotoksiske virkningen til nukleotidene søkes eller er ønsket å være effektiv. Ikke bare>kanønskede kjemoterapeutiske eller cytotoksiske effekter oppnås systemisk eller lokalt, men også som angitt ovenfor, er de spesielle P-, S-, B- og Sig-holdige nukleotider ifølge oppfinnelsen, inkludert polynukleotider som inneholder slike nukleotider anvend-

bare som immun-stimmulerende midler og hjelpemidler derfor. Vaksiner som inneholder de spesielle nukleotider og poly-nukleotider ifølge oppfinnelsen kan derfor fremstilles med forbedret effektivitet og allsidighet.

Av spesiell interesse ved utførelsen av foreliggende oppfinnelse anvendes forbedrede polynukleotider som inneholder de spesielle nukleotidene ifølge oppfinnelsen som induserings-og stimulerings-midler for fremstilling av interferon.

Slike polynukleotider vil være enkelt-strengede eller dobbel-strengede ribonukleotider, dsRNA, med strukturene,

hvor A og B er komplementære basepar, som f.eks. et purin,

et 7-deazapurin eller pyrimidin modifisert ved tilsetning av en organisk del Sig ifølge oppfinnelsen i 5-stilling i pyrimidinringen eller 7-stilling i purinringen eller N 2 i guanin, eller N 6 i adenin eller N 4 i cytosin som beskrevet her. modifikasjonene av polynukleotidene i disse stillingene fører til relativt uspaltbare eller ikke-spaltende dobbelt-strengede nukleinsyrermolekyler slik det måles ved asossia-sjonshastigheter og smeltepunkter. I de spesielle poly-

nukleotidene ifølge oppfinnelsen som anvendes som induseringsmidler for interferon og andre cellulære eller humorale faktorer eller bestanddeler, som f.eks. lymfokiner eller cytokiner, vil følgende grupper være festet til dem som angitt ved formlene,

Ved anvendelsen av de spesielle polynukleotidene ifølge oppfinnelsen, som f.eks. det spesielle dsRNA ifølge oppfinnelsen, i induksjonsprosessen for fremstilling av interferon er det vist at DEAE-dekstran letter denne opera-sjonen. Siden DEAE-dekstran danner komplekser med dsRNA og beskytter ..det mot nukleasenedbrytning, økes derved interferon-induksjonen. Det er også bemerket at poly:nC:rI tas inn i cellene mere effektivt når det er kompleksdannet med DEAE-dekstran. Ved utførelsen av denne oppfinnelsen er derfor de hydrofobe egenskapene og de ioniske eller elektron-ladningsegenskapene til det spesielle dsRNA ifølge oppfinnelsen viktige faktorer og istand til manipulasjon i anvendbarheten av disse materialene for å indusere inter-feronproduksjon. Det er observert at slike betingelser eller faktorer som fremmer induksjon av interferon også fører til og fremmer induksjon av andre cellulære eller humorale bestanddeler, som f.eks. lymfokiner og cytokiner. Det er derfor • tydelig at de spesielle nukleotidene og polynukleotidene inneholdende de spesielle nukleotidene ifølge oppfinnelsen, opptrer som immunmodulatorer og stimulatorer for andre immunresponser enn bare å være effektive som induseringsmidler for interferonfremstilling. Gode midler for det ovenstående ifølge utførelsen av oppfinnelsen vil omfatte nukleotider hvori Sig-delen inneholder biotin eller streptavidin eller avidin.

Poly-rl:poly-rC kompleksdannet med poly-L-lysin oppviser hjelpemiddelegenskaper og slike egenskaper økes og forbedres ifølge oppfinnelsen når poly-rl og poly-rC- bestanddelene modifiseres slik at de omfatter en eller flere av de spesielle nukleotidene ifølge oppfinnelsen.

Fremstillingen av DNA-prober ifølge et annet aspekt ved oppfinnelsen kan utføres på en måte som ikke krever fremstilling eller anvendelse av de spesielle nukleotidene som er beskrevet her. For eksempel kan dobbelt-strenget DNA omsettes med et karcinogent eller alkylerings-middel. Etterat karcinogenet har reagert med eller alkylert den dobbelt-strengede DNA, smeltes den resulterende modifiserte DNA for å fremstille en DNA-hybridiserende probe inneholdende reaksjonsproduktet mellom DNA og karcinogenet eller alkyleringsmidlet. Når således modifisert eller omsatt • ■ DNA anvendes som en hybridiserende probe, ville enhver resulterende dannet dobbeltspiral eller dobbelt-strenget DNA påvises eller finnes frem til ved hjelp av dobbelt-antilegemeteknikken. Det primære antilegemet ville være et anti-karcinogen og det sekundære antilegemet ville være pepperrots-peroksydase-konjugert anti-peroksydase-antilegeme. Fordelen med denne teknikk er at det vil være lett å merke det dobbelt-strengede DNA. Denne spesielle fremgangsmåte er angitt ovenfor i eksemplene som følger beskrivelsen av oppfinnelsen og er generelt anvendbar for fremstilling av DNA-prober fra dobbeltstrenget eller dobbelt-spiralformet DNA. Denne fremgangsmåte er imidlertid en spaltende fremgangsmåte som omfatter modifikasjon av den dobbelt-spiral-formede deoksyribonukleotid-polymeren eller DNA.

I beskrivelsen av de spesielle nukleotidene og det modifiserte DNA som anvendes eller utvikles ved utførelsen av foreliggende oppfinnelse, er det nevnt mono-, oligo- og polysakkarider. Det er påpekt at derivater av mono-, oligo-og polysakkarider også er anvendbare ved fremstilling av de spesielle nukleotidene ifølge oppfinnelsen. For eksempel er det mulig å modifisere enkelte sukkerdeler som anvendes ved fremstillingen av de spesielle nukleotidene og anvende de resulterende modifiserte sukkerdelene for å gjennomføre eller utføre kjemiske tilleggsreaksjoner. Slike modifiserte mono-, oligo- og polysakkarid-deler, når de anvendes som Sig-delen ved fremstillingen av de spesielle nukleotidene ifølge oppfinnelsen, tilveiebringer en øket allsidighet når det gjelder påvisning av nukleotidene eller andre forbindelser som inneholder slike modifiserte sakkarider, enten som sukkeret S eller som Sig-delen derav.

I et annet aspekt av oppfinnelsen kan Sig-delen i steden for å festes til et nukleotid også festes til proteinet. Ikke bare kan slike proteiner festes til nukleotider eller poly-nukleotider, men også kan slike proteiner identifiseres per se enten de er festet til et nukleotid eller poly-nukleotid eller de ikke er festet. Ifølge utførelsen av dette aspekt av oppfinnelsen vil et passende slikt protein-addukt ha formelen

hvori R^er OH eller en aminosyre eller syrer og R2er sidekjeden i en aminosyre og R^ er H eller en aminosyre eller syrer og Sig er festet til R^og/eller R2og/eller R^•

j

Claims

1. Nukleotid med den generelle formel P-S-B-Sig, karakterisert ved atPer fosforsyre-delen, S sukker- eller monosakkarid-delen og B er basedelen, idet fosforsyre-delen er festet i 3' og/eller 5'-stillingen i sukkerdelen når nukleotidet er et deoksyribonukleotid og i 2'-, 3'- og/eller 5'-stillingen når nevnte nukleotid er et ribonukleotid, basen er et purin eller et pyrimidin, som er festet fra Nl-stillingen eller N9-stillingen til 1'-stillingen i sukkerdelen når basen er hhv. et pyrimidin eller et purin og hvor Sig er en kjemisk del som er kovalent festet til basen B i nevnte nukleotid, idet Sig når det er festet til basen B er istand til selv å signalisere eller gjøre seg selvpåvisende eller sitt nærvær kjent.

2. Nukleotid ifølge krav 1, karakterisert ved a t Sig er festet til B i en stilling slik at nukleotidet er istand til å innfø res i eller å danne en dobbelt-strenget ribonukleinsyre, en dobbelt-strenget deoksyribonukleinsyre eller en dobbelt-strenget doksyribonukleinsyre-ribonuklein-syre-hybrid.

3. Nukleotid ifølge krav 1, karakterisert ved at Sig er festet til B i en stilling slik at når nukleotidet innføres i eller festes til eller forbindes med en dobbelt-strenget deoksyribonukleinsyre eller dobbelt-strenget ribonukleinsyre eller DNA-RNA-hybrid er den nevnte kjemiske del Sig istand til selv å signalisere eller gjøre seg selv-påvisende eller sitt nærvær kjent.

4. Nukleotid ifølge krav 1, karakterisert ved at Sig er festet til nevnte base B i C5-stillingen når basen B er et pyrimidin eller i C7-stillingen når basen B er et deazapurin.

5. Nukleotid ifølge krav 1, karakterisert ved at basen B er et pyrimidin og den kjemiske delen Sig er festet til pyrimidinet i N3-stillingen.

6. Nukleotid ifølge krav 1, karakterisert ved at den kjemiske delen Sig er en alifatisk kjemisk del inneholdende minst 3 karbonatomer og minst en dobbeltbinding.

7. Nukleotid ifølge krav 1, karakterisert ved at basen B er et pyrimidin og den kjemiske delen Sig er festet til pyrimidinet i C5-stillingen.

8. Nukleotid ifølge krav 1, karakterisert ved at den kjemiske delen Sig er et sukker valgt fra gruppen bestående av triose eller tetrose, eller pentose, en heksose eller heptose, og en oktose.

9. Nukleotid ifølge krav 1, karakterisert ved at den kjemiske delen Sig omfatter en bestanddel valgt fra gruppen bestående av en elektrontett bestanddel, en magnetisk bestanddel, et enzym, en hormonbestanddel, en radioaktiv bestanddel, en metall-holdig bestanddel, en fluorescerende bestanddel og et antigen eller en antilegeme-bestanddel.

10. Nukleotid ifølge krav 1, karakterisert ved at den kjemiske delen Sig er en sukkerrest og sukkeret er kompleksdannet med eller festet til et sukker- eller polysakkarid-bindende protein.

11. Nukleotid ifølge krav 1, karakterisert ved at den kjemiske delen Sig somfatter en radioaktiv isotop.

12. Nukleotid ifølge krav 1, karakterisert ved at den kjemiske delen Sig omfatter en antigen- eller haptenbestanddel som er istand til å danne kompleks med et antilegeme som er spesifikt overfor nevnte bestanddel.

13. Nukleotid ifølge krav 1, karakterisert ved at den kjemiske delen Sig er forbundet med basen B ved hjelp av en kjemisk binding.

14. Nukleotid ifølge krav 1, karakterisert ved at den kjemiske bindingen velges fra eller omfatter en del valgt fra gruppen bestående av

15. Polynukleotid koblet eller festet til et polysakkarid, karakterisert ved at polynukleotidet er terminalt ligatert til polysakkaridet.

16. Polydeoksyribonukleotid som er koblet eller festet til et polypeptid, karakterisert ved at poly-deoksyribonukleotidet er terminalt ligatert eller festet til nevnte polypeptid.

17. Ribonukleotid med den generelle formel:

karakterisert ved atPer fosforsyredelen, S sukkerdelen og B basedelen, idet fosforsyredelen er festet i 2'-,; 3'- og/eller 5'-stillingen i sukkerdelen, basen B er festet fra Nl-stillingen eller N9-stillingen til 1 <1-> stillingen i sukkerdelen når basen er henholdsvis et pyrimidin eller et purin, og Sig er en kjemisk del som er kovalent festet til sukkeret S, idet Sig, når det er festet til sukkeret S, er istand til selv å signalisere eller gjøre seg selv-påvisende eller sitt nærvær kjent.

18. Polyribonukleotid koblet eller festet til et polypeptid.

19. Polyribonukleotid ifølge krav 18, karakterisert ved at polypeptidet er terminalt festet eller ligatert til polyribonukleotidet.

20. Nukleotid med den generelle formel

karakterisert ved atPer fosforsyredelen, S sukkerdelen og B basedelen, idet fosforsyredelen er festet til 3'- og/eller 5 <1-> stillingen i sukkerdelen når nukleotidet er et deoksyribonukleotid og i 2'-, 3' og/eller 5'-stillingen når nukleotidet er et ribonukleotid, basen B er et purin eller pyrimidin, idet basen B er festet fra Nl-stillingen eller N9-stillingen til 1'-stillingen i sukkerdelen når basen B er henholdsvis et pyrimidin eller et purin, og Sig er en kjemisk del som er kovalent festet til. fosforsyredelen via den kjemiske bindingen

idet Sig, når den er festet til fosforsyre-delen P er istand til selv å signalisere eller gjøre seg selvpåvisende eller sitt nærvær kjent.

21. Nukleotid med den generelle formel

karakterisert ved at P er fosforsyredelen, S sukker- og monosakkarid-delen, og B basedelen, idet fosforsyredelen er festet til 3'- og/eller 5'-stillingen i sukkerdelen når nukleotidet er deoksyribonukleotid og i 2'-, 3'- og/eller 5'-stillingen når nukleotidet er et et ribonukleotid, basen er et purin eller et pyrimidin, idet basen er festet fra Nl-stillingen eller N9-stillingen til Cl'-stillingen i sukkerdelen når basen er henholdsvis et pyrimidin eller et purin, og Si- er en kjemisk del som er kovalent festet til basen B i nukleotidet, idet Sig er festet til N - eller 6-amino-gruppen når basen B er adenin eller N 2 eller 2-amino-gruppen når basen B er guanin eller N 4- eller 4-amino-gruppen nrå basen B er cytosin, idet Sig når den er festet til basen B er istand til selv å signalisere eller gjøre seg selvpåvisende eller sitt nærvær kjent.

22: Nukleotid med den generelle formel P-S-B, karakterisert ved atPer fosforsyre-delen, S sukker-eller monosakkarid-delen og B basedelen, idet nukleotidet har kovalent festet til P-eller S- eller B-delen en kjemisk del Sig, og hvor den kjemiske delen Sig når den er festet til P-delen er festet til den ved hjelp av den kjemiske bindingen,

og når Sig er festet til S-delen, er S-delen en ribosegruppe, idet den kjemiske delen Sig, når den er festet til nevnte P, S eller B er istand til selv å signalisere, eller gjøre seg selv-påvisende eller sitt nærvær kjent.

23. Polynukleotid omfattende ett eller flere nukleotider ifølge krav 1 eller krav 17 eller krav 20 eller krav 21 eller krav 22, karakterisert ved at det er festet eller koblet til et polypeptid, idet det til polypeptidet er festet en eller flere kjemiske deler Sig , idet Sig, når den er festet til polypeptidet er istand til selv å signalisere eller gjøre seg selvpåvisende eller sitt nærvær kjent. Nukleotid ifølge krav 1 eller krav 17 eller krav 20 eller krav 21 eller krav 22, karakterisert ved at det inneholder et gelateringsmiddel med følgende formel

hvor M er H eller et substituerbart metall.

25. Polynukleotid inneholdende ett eller flere nukleotider ifølge krav 1 eller krav 17 eller krav 20 eller krav 21 eller krav 22, karakterisert ved at den kjemiske delen Sig omfatter et gelateringsmiddel.

26. Forbindelsen

karakterisert ved at M er hydrogen eller et metall.

27. Forbindelsen

karakterisert ved atMer hydrogen eller et metall.

28. Nukleotid ifølge krav 1 eller krav 17 eller krav 20 eller krav 21 eller krav 22, karakterisert ved at den kjemiske delen Sig omfatter den kjemiske delen

29. Aminosyre eller polypeptid, karakterisert ved at en del Sig er festet til den.

30. Aminosyre eller polypeptid ifølge krav 29, karakterisert ved at nevnte del Sig omfatter en sakkarid-bestanddel.

31. Monosakkarid eller polysakkarid, karakterisert ved at det er festet en del Sig til dem.

32. Fremgangsmåte for påvisning av en første forbindelse som omfatter et nukleotid ifølge krav 1 som del av første forbindelse, karakterisert ved å bringe den første forbindelsen i kontakt med den andre forbindelse som er istand til å danne et kompleks med den under egnede betingelser, slik at komplekset dannes, idet komplekset omfatter den første forbindelsen og den andre forbindelsen og å påvise komplekset.

33. Fremgangsmåte for å fastslå nærværet av en deoksyribonuklein- eller ribonukleinsyremolekyl, karakterisert ved å danne et dobbel-strenget hybrid polynukleotid-dupleks som omfatter en enkelt streng av deoksyribonukleinsyre eller ribonukleinsyre som svarer til eller er oppnådd fra deoksyribonuklein- eller ribonuklein-syremolekylet og et nukleotid ifølge krav 22 og påvise nevnte dupleks.

34. Fremgangsmåte for diagnostisering av en genetisk sykdom hos en person, karakterisert ved å fremstille et polynukleotid som er komplementært til deoksyribonukleinsyre-gene-sekvensen til nevnte person som er forbundet med nevnte genetiske sykdom og inkluderer en forbindelse ifølge krav 1 som er innført deri, bringe nevnte polynukleotid under egnede betingelser i kontakt med deoksyribonukleinsyre oppnådd fra nevnte person, slik at det dannes et dobbelt-strenget hybrid-dupleks og påvise nærvær av hybridduplekset, idet nærvær eller fravær av hybrid-duplekset indikerer nærvær eller fravær av nevnte genetiske sykdom.

35. Fremgangsmåte for diagnostisering av en genetisk sykdom hos en person, karakterisert ved å fremstille et polynukleotid som er komplementært til deoksyribonukleinsyre-genesekvensen hos nevnte person som er forbundet med nevnte genetiske sykdom og inkluderer en forbindelse ifølge krav 20 som er innført deri, bringe polynukleotidet under egnede betingelser i kontakt med deoksyribonukleinsyren som er oppnådd fra nevnte person for å danne et dobbelt-strenget hybrid-dupleks og påvise nærvær av hybrid-duplekset, idet nærvær eller fravær av hybrid-duplekset indikerer nærvær eller fravær av nevnte genetiske sykdom.

36. Fremgangsmåte for kromosom-karyotyping, karakterisert ved å fremstille en serie av modifiserte polynukleotider tilsvarende en serie av definerte genetiske sekvenser lokalisert på kromosomer, idet polynukleotidene omfatter en eller flere forbindelser ifølge krav 1, bringe polynukleotidene i kontakt med deoksyribonukleinsyre av eller oppnådd fra kromosomer for å danne hybrid-duplekser og påvise nevnte duplekser hvorved lokaliseringen av dupleksene på kromosomene og lokaliseringen av de genetiske sekvensene på kromosomene derved bestemmes.

37. Fremgangsmåte for identifisering eller lokalisering av hormonreseptor-steder på overflaten av celler, karakterisert ved å binde en forbindelse ifølge krav 1 eller krav 17 eller krav 20 eller krav 21 eller krav 22 til stedene under egnede betingelser som tillater binding av forbindelsen til reseptorstedene og påvise forbindelsene bundet til reseptorstedene.

38. Diagnosekasse som er anvendbar for bestemmelse av nærvær av en nukleinsyre-holdig organisme eller lignende, karakterisert ved at den omfatter et polynukleotid som i sin sammensetning inneholder en forbindelse valgt fra forbindelsene i krav 1, krav 17, krav 20, krav 21 eller krav 22, og som er komplementær til alle eller en identifiserbar, distikt eller enestående del av nukleinsyren som inneholdes i nevnte organisme og midler ■ for å påvise eller uttrykke nærvær eller fravær av et resulterende dannet hybrid mellom polynukleotidet og nukleinsyren i organismen når polyonukleotidet bringes i kontakt med nukleinsyren i organismen eller lignende under hybrid-dannende betingelser.

39. Fremgangsmåte for å bestemme eller identifisere eller diagnostisere en første forbindelse som er istand til å danne kompleks med eller bindes til en første bestanddel i en andre forbindelse, idet den andre forbindelsen omfatter den første bestanddelen og en andre bestanddel, og den andre bestanddelen er festet til eller kompleksdannet med den første bestanddelen, karakterisert ved å bringe den første forbindelsen i kontakt med den andre forbindelsen, hvorved den første bestanddelen i den andre forbindelsen danner kompleks med den første forbindelsen for å danne en tredje forbindelse omfattende den første forbindelsen og den andre forbindelsen og bringe den resulterende tredje forbindelsen i kontakt med en fjerde forbindelse som er istand til å binde seg til eller feste seg til den andre bestanddelen i den andre forbindelsen for å danne den tredje forbindelsen.

40. Fremgangsmåte for bestemmelse eller identifisering eller diagnostisering i en organisme, cellulært materiale eller vev av en første forbindelse omfattende en receptor-molekyl med et receptorsted som spesifikt bindes til en andre molekyl, karakterisert ved å bringe organismen, materialet eller vevet inneholdende receptor-molekylet i kontakt med en andre forbindelse, idet den andre forbindelsen omfatter en første bestanddel som er istand til å danne kompleks med eller bindes til receptor-molekylet idet den andre forbindelsen også omfatter en andre bestanddel, hvilken andre bestanddel er festet til eller kompleksdannet med den første bestanddelen, den første bestanddelen i den andre forbindelsen danner kompleks med receptormolekylen når den bringes i kontakt med nevnte receptor-molekyl for å danne en tredje forbindelse omfattende den første forbindelsen og den andre forbindelsen, og bringe den tredje forbindelsen i kontakt med .en fjerde forbindelse som kan binde seg til eller feste seg til den andre bestanddelen i den andre forbindelsen for å danne den tredje forbindelsen, idet den første bestanddelen i den andre forbindelsen velges fra gruppe A bestående av en aminosyre, et peptid eller et protein, eller fra gruppen B bestående av et sukker, et oligosakkarid eller polysakkarid eller fra gruppen C bestående av et purin, et pyrimidin,etnukleosid, et nukleotid, et oligonukleotid eller polynukleotid, idet den andre bestanddelen i den andre forbindelsen er et sukker, et oligosakkarid eller et polysakkarid og den fjerde forbindelsen velges fra gruppen bestående av et peptid eller polypeptid, et lektin eller et antilegeme.

41. Nukleotid ifølge krav 1, karakterisert ved at den kjemiske delen Sig som er kovalent festet til basen B i nukleotidet omfatter et koenzym.

42. Nukleotid ifølge krav 1, karakterisert ved at bestanddelen Sig omfatter en radioaktiv bestanddel.

43 Dobbelt-strenget polynukleotid, karakterisert ved at det omfatter ett eller flere nukleotider ifølge krav 1 og hvor bestanddelen Sig derav er radioaktiv.

44. Polynukleotid inneholdende ett eller flere nukleotider ifølge krav 1, eller krav 17, eller krav 20, eller krav 21, eller krav 22, karakterisert ved at delen Sig er radioaktivt merket.