JP2017507946A - Ｒｎａを胃腸内投与するための組成物 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）およびカチオン性剤を含み、胃腸管へ投与するための固形剤として製剤化されている医薬組成物に関する。さらに、本発明は、上記医薬組成物のＲＮＡの全身送達のための使用、および、上記医薬組成物を胃腸管に投与する工程を含む、ＲＮＡを対象へ全身送達する方法に関する。さらに、本発明は、キットに関する。

Description

本発明は、ポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）およびカチオン性剤を含み、胃腸管へ投与するための固形剤として製剤化されている医薬組成物に関する。本発明は、さらに、ＲＮＡを全身送達するための上記医薬組成物の使用、および、上記医薬組成物を胃腸管へ経口投与する工程を含む、ＲＮＡを対象に全身送達する方法に関する。さらに、本発明は、キットに関する。
核酸療法の実現可能性は、結局のところ、核酸を細胞内、および／または、１つまたは複数の組織（内）に送達する効率的な方法の利用可能性に依存している。
一般に、核酸の送達では、細胞をトランスフェクションするのに、場合によっては、裸の核酸の使用が好適であり且つ充分である（非特許文献１）。しかしながら、想定される実際の用途の多くで、核酸を少なくとも１つの第二の剤であって、送達の間に核酸を分解から保護し、かつ／または、核酸の標的組織（内）への分布を促進し、かつ／または、核酸の細胞内取り込みを促進して好適な細胞内プロセッシングを可能にするものと配合することが有利であるか、または、常に必要とされている。そのような核酸送達用の製剤は、科学文献においてベクターと呼ばれている。これまでに、核酸のベクター化用の化合物、いわゆる、トランスフェクション試薬が非常に多数報告されている。これら化合物は、大抵、ポリカチオンか、またはカチオン性脂質若しくはリピドイドのような脂質様化合物を含む化合物のどちらかである（特許文献１）。核酸とポリカチオンとの複合体はポリプレックスと呼ばれ、カチオン性脂質を含むこれらをリポプレックスと呼ぶ（非特許文献２）。同様に、ポリカチオンと脂質との両方を含む複合体が報告されている（非特許文献３）。トランスフェクション試薬は、核酸に結合して核酸を圧縮し、ナノメートルサイズの範囲の一次複合体を生じることに用いられる。塩含有媒体では、これら複合体が凝集する傾向にあり、これは塩誘導凝集としても知られ、細胞培養物でのトランスフェクションまたはインビボでの局所的投与に有利である（非特許文献４および５）。凝集を回避することができ、核酸とトランスフェクション試薬との複合体を、ポリ(エチレングリコール)のようなポリマーで表面を遮蔽することによって安定化することができる。遮蔽は、核酸とトランスフェクション試薬との複合体のオプソニン化および該複合体による捕耐活性化を回避することにも用いられる（非特許文献６）。トランスフェクション試薬による核酸の前記圧縮は、それらをヌクレアーゼによる分解に対して保護するだけでなく、それらをエンドサイトーシスによる細胞内取り込みに適したものとする。多数の直鎖状および分枝状ポリカチオンは、核酸に結合して圧縮することに適しており、特に限定されないが、ポリ(エチレンイミン)、ポリ(アミドアミン)デンドリマー、ポリ(２−(ジメチルアミノ)エチルメタクリレート)（ｐＤＭＡＥＭＡ）またはポリ(Ｎ−(２−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド)（ｐＨＰＭＡ）のカチオン性誘導体、ポリ(β−アミノエステル)（非特許文献７）、ポリ(リジン)、ヒストン、ＨＭＧタンパク質のような天然もしくは合成のカチオン性ポリ(アミノ酸)もしくはペプチド、またはキトサンのような炭水化物が挙げられる。核酸の複合体化および送達の目的のためには、上述する一級アミン、二級アミンおよび／または三級アミンに加えて、グアニジル部分を含有する構造体が、重要な種類の分子である。アルギニンベースの構造体（非特許文献８）、アルギニンで修飾したＰＡＭＡＭ（非特許文献９）またはグアニジル化ＰＥＩ（非特許文献１０）のようなグアニジル修飾したポリマーは、そのような系の効率性を目立たせる。特にＲＮＡ相互作用の場合には、当該グアニジル部分の分子的特徴が、ユニークな結合特性を示す（非特許文献１１）。そのような構造体の形成のために、カトリッツキー（Ｋａｔｒｉｔｚｋｙ）およびロゴボイ（Ｒｏｇｏｖｏｙ）によって検討された方法を用いることができる（非特許文献１２）。多くの場合、ポリプレックスは、更に修飾されて、細胞標的指向化もしくは細胞内標的指向化部分、ならびに／または、不活性化ウイルス（非特許文献１３）、ウイルスカプシドまたはウイルスタンパク質もしくはペプチド（非特許文献１４および１５）または膜破壊性合成ペプチド（非特許文献１６および１７）のような膜不安定化成分を含有する。
しかしながら、いくつか利点があるにもかかわらず、現行の遺伝子送達用ウイルスベクターは強い免疫原性、挿入突然変異などの安全性の懸念を伴う。非ウイルスベクターは遺伝子導入効率が低く、制限される（Ｅｖａｎｓ、２０１２）。後者の主な原因は、プラスミドＤＮＡの核内への輸送が不十分であるためである。
エンドサイトーシス性取り込みに際して、複合体は、エンドソームおよびリソソームのような細胞内小胞の中へ隔離されて、細胞分解機構に曝露される。よって、効率的で機能的な核酸送達のためには、細胞内小胞からの脱出が必須であることが認識されており、その必要性は機能的ウイルス感染にも当てはまる（非特許文献１６および１７）。自然物がウイルスの感染性に対して進化してきたメカニズムは、合成ベクターによる効率的な核酸送達を達成するために模倣されてきた。結局のところ、ポリカチオン性トランスフェクション試薬をエンドソーム脱出機能で補うためにＩＮＦペプチド、ＧＡＬＡペプチドおよびＫＡＬＡペプチドまたはメリチンおよびメリチン誘導体（非特許文献１８）のような両親媒性の膜不安定化ペプチドが使用されて、大きな成功を収めている（非特許文献１９）。リポプレックスでは、その脂質部分が細胞膜に融合する能力によって、当該機能が固有のものとなっている（非特許文献２０および２１）。ボウシフ（Ｂｏｕｓｓｉｆ）らによる重要な中心的論文（非特許文献２２）以降、ポリプレックスのエンドソーム脱出機能は、物理化学的手段によって実現できることが知られている。ポリプレックスを形成するのにポリ(エチレンイミン)（ＰＥＩ）がポリカチオンとして用いられる場合、酸性ｐＨでのＰＥＩの緩衝能力は、エンドソーム脱出を引き起こすのに十分である。エンドソームの内腔は、エンドソームの膜に存在するプロトンポンプによって酸性にされることが知られている（非特許文献２３）。この酸性化は、インフルエンザまたはアデノウイルスのような幾つかのウイルスのエンドソーム脱出のトリガーである。実験的証拠に裏付けられた、いわゆるプロトンスポンジ理論は、ＰＥＩの化学構造特徴を備えたポリマーの推定機構的作用：ＰＥＩの複数のアミノ基のかなりの割合が中性（生理学的な）ｐＨで非プロトン化されている、を説明する（非特許文献２４）。プロトン化およびそれによる正電荷を帯びた複数のアミノ基のおかげで、ＰＥＩ様ポリマーは、核酸に結合して核酸を圧縮することができる。前記非プロトン化アミンは、酸性ｐＨでプロトン化された状態となることができ、よって、エンドソーム内部で緩衝能力を持つことができる。プロトンポンプによるエンドソーム酸性化は、塩化物イオンの蓄積を伴う（非特許文献２５）。ＰＥＩのような緩衝分子がエンドソーム内腔に存在する場合、プロトンポンプは、塩化物の蓄積と共に、エンドソーム内腔へ、多くのプロトンを緩衝分子が存在しない場合と同様に本来の酸性エンドソームｐＨに到達するまで輸送する。エンドソーム内部の不均衡なイオンの蓄積は、小胞の浸透圧の不安定化をもたらし、最終的には、小胞破裂と細胞質への前記核酸複合体の放出とをもたらすと考えられる。
前記プロトンスポンジ理論に基づき、数え切れないほどの研究者達が、酸性ｐＨで緩衝能力を有するアミンを含む新規なポリマーライブラリーの創出において、ＰＥＩの構造的特徴を取り上げてきた。特許文献２および３では、カタオカらが、酸性ｐＨでプロトン化できるアミン側鎖でカルボン酸側鎖が誘導体化されている、ポリ(グルタミン酸)またはポリ(アスパラギン酸)骨格に基づくポリマーを報告している。しかしながら、ポリカチオンにおけるトランスフェクション増強部分として役立つ、互い違いになった非同一アルキレンアミン単位を含有するオリゴ(アルキルアミン)の豊富な構造空間は、調査されていない。特に、これまで、ｍＲＮＡトランスフェクションについて研究されてこなかった。
対照的に、カタオカらの科学的研究の多くは、ポリ{Ｎ−[Ｎ’−(２−アミノエチル)−２−アミノエチル]アスパルトアミド}に焦点が当てられてきた。ウチダらによる出版物（非特許文献２６）では、一般式−(ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ)ｍ−Ｈの側鎖に繰り返しアミノエチレン単位を有する一連のＮ置換ポリアスパルトアミド類で同じ基を検討している。興味深いことに、その著者らがプラスミドＤＮＡのトランスフェクションにおける該ポリマーファミリーの効率を検討したところ、“エンドソーム脱出効率および幾つかの細胞株へのトランスフェクション効率に関して、該ポリマー側鎖の繰り返しアミノエチレン単位の特徴的な奇遇効果が観察された。偶数の繰り返しアミノエチレン単位を含むポリマー由来のポリプレックス（ＰＡ−Ｅ）は、目立った細胞毒性を伴うことなく、奇数の繰り返しアミノエチレン単位を含むポリマー由来のポリプレックス（ＰＡ−Ｏ）のものよりも１桁高いトランスフェクション効率を達成した。この奇遇効果は、これらポリマーの緩衝能力、およびエンドソームｐＨで選択的に膜の完全性を破壊してＰＡ−Ｅポリプレックスの高効率エンドソーム脱出をもたらす機能とよく合致していた。更に、前記ポリマー側鎖の複数のプロトン化アミノ基間で正確な間隔を有する多価に帯電した配列の形成は、エンドソーム膜の効率的な破壊に不可欠であり、それによって細胞質内への前記ポリプレックスの輸送を促進することが示された”（非特許文献２６）。興味深いことに、同グループの研究者らが、１，２−ジアミノエチレン側鎖を有するポリ(アスパルトアミド)誘導体［ＰＡｓｐ(ＤＥＴ)］を１，３−ジアミノプロパン側鎖を有する類似体［ＰＡａｐ(ＤＰＴ)］に対して比較したところ、ＰＡａｐ(ＤＰＴ)は、粒子サイズおよびζ電位における［ＰＡｓｐ(ＤＥＴ)］との物理学的相違が僅かであったにも関わらず、Ｎ／Ｐによる細胞毒性の漸増的増加のために高いＮ／Ｐ比でプラスミドＤＮＡのトランスフェクション効率の著しい落ち込みを示したことが観察された（非特許文献２７）。従って、この奇遇ルールに基づき、３個のプロトン化可能なアミノ基とプロピレンスペーサー基とを含むポリマーは、ＰＡｓｐ(ＤＥＴ)より劣ること、１，３−ジアミノプロパン含有側鎖が毒性の問題に関連すること、を予想する。このようなポリマーのｍＲＮＡトランスフェクションに対する構造−活性関係について何も知られていない。
ゲアール（Ｇｅａｌｌ）と同僚らは、一般式：−ＮＨ−ＣＨ２−(ＣＨ２)ｎ−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−(ＣＨ２)ｍ−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−(ＣＨ２)ｎ―ＮＨ２（式中、ｍは０、１または２であり、ｎは０または１である）を有するポリアミン部分を含むコレステロール−ポリアミンカルバメートについて報告している（非特許文献２８）。彼らは、これら物質の仔ウシ胸腺ＤＮＡの圧縮におけるｐＫａ値およびそれらの特性を調べた。彼らは、コレステロールポリアミンカルバメートに沿った正電荷の位置化学的分配が、ＤＮＡ結合親和性およびリポフェクション効率の調節に重要な役割を果たしていることを見出した。彼らは、調べたコレステロール−ポリアミンカルバメートのうち、ポリアミン部分−ＨＮ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２（プロピル／ブチル／プロピル）の構成要素であるスペルミンは、βガラクトシダーゼをコードするプラスミドＤＮＡの細胞培養物でのトランスフェクションについて遥かに高いレポーター遺伝子発現を生じた一方、例えば、−ＨＮ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２（エチル／プロピル／エチル）は３〜１０倍少ない効率であったことを見出した。従って、カタオカらの教示（奇遇ルール）およびゲアールらの知見に照らし、当業者は、核酸送達において後者の構造を却下するであろう。
ワン（Ｗａｎｇ）らは、ポリ(メチルメタクリレート)−グラフト−オリゴアミンを、プラスミドＤＮＡに対する効率的且つ低細胞毒性のトランスフェクション試薬として報告している（非特許文献２９）。これらポリマーは、一般式Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−(ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２)ｍ−ＮＨ２（式中、ｍは１、２または３である）のオリゴアミンを有するポリ(メチルメタクリレート)のアミノ分解によって得られた。著者らは、アミノ酸が長くなるにつれてトランスフェクション効率が上昇したことを見出した。
オウ（Ｏｕ）らは、Ｄｄｅ−ＨＮ−(ＣＨ２)ａ−ＨＮ−(ＣＨ２)ｂ−ＨＮ−(ＣＨ２)ａ−ＮＨ−Ｄｄｅの構造を有する末端保護オリゴアミンからＮ，Ｎ’−シスタミンビスアクリルアミドとの共重合によって誘導されるポリ(ジスルフィドアミドアミン)を報告している（非特許文献３０、特許文献４）。彼らは、ａが２且つｂが２、ａが２且つｂが３、ａが３且つｂが２、ａが３且つｂが３、ａが３且つｂが４（スペルミン）の組み合わせを調べた。Ｄｄｅは２−アセチルジメドン保護基である。前記保護基の除去後、合成はポリ(ジスルフィドアミドアミン)を生成し、本来の内部の二級アミンは該ポリマー主鎖の一部としての三級アミンとなり、三級アミンは未反応のままのエチレンまたはプロピレンアミン側鎖の一部となる。当該ポリマーは、核酸送達に適したｐＨ範囲において緩衝能力を有し、細胞へのプラスミドＤＮＡのトランスフェクションに有用である。
近年、インビトロおよびインビボでの核酸送達に対して、新しい種類の、脂質様であるが脂質でない合成構造体、いわゆるリピドイドの有用性が発見された（特許文献１および５、非特許文献３１および３２）。リピドイドは、アミン含有化合物を脂肪族エポキシド、脂肪族アクリレート、脂肪族アクリルアミドまたは脂肪族アルデヒドと反応させることによって得られる。それらの著者ら／発明者らは、リピドイドライブラリーを得る合成手法と、インビトロで細胞への核酸送達における有用性を有する有益な化合物を選択するスクリーニング手法とを提供している。
上記から明らかなとおり、プラスミドＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたは核酸類似体のような他の核酸分子の送達に関して、多数の研究および開発活動が過去に行われてきた。ｍＲＮＡ送達は、非常に深くは調べられていない。ある著者らは、ＤＮＡまたはｓｉＲＮＡ送達に十分役に立つ化合物および製剤がｍＲＮＡ送達に同様に役に立つであろうと主張してきた。しかしながら、プラスミドＤＮＡまたはｓｉＲＮＡと対照的に、ｍＲＮＡは一本鎖分子である。したがって、構造的考察だけに基づくと、ｍＲＮＡ送達には、ＤＮＡまたはｓｉＲＮＡ送達とは異なる化合物および製剤の要求が予想される。
上で引用した先の文献は、プラスミドＤＮＡまたはｓｉＲＮＡのような二本鎖核酸の細胞内または１つまたは複数の組織内への送達を報告している。特に、ＤＮＡ、主にプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の経口または直腸内投与に基づく遺伝子治療アプローチが適用されている。代表例は、ダス（Ｄａｓs）（非特許文献３３）、バブサル（Ｂｈａｖｓａｒ）（非特許文献３４〜３６)、ダドワー（Ｄｈａｄｗａｒ）（非特許文献３７）、チェン（Ｃｈｅｎ）（非特許文献３８）、ロイ（Ｒｏｙ）（非特許文献３９）、ボウマン（Ｂｏｗｍａｎ）（非特許文献４０）、カンベ（Ｋａｎｂｅ）（非特許文献４１）、タイ（Ｔａｉ）（非特許文献４２）、および、ジーン（Ｊｅａｎ）（非特許文献４３）に記載されている。これに関して、キトサンを介在させたＤＮＡ送達が、例えばキトサン／ＤＮＡナノ粒子を使用して、一般的に適用されていた（非特許文献３３、３７〜４０、４３）。ナノ粒子−イン−マイクロスフィア経口システム（ＮｉＭＯＳ）も採用されている（非特許文献３４〜３６）。ベクターを使用しない遺伝子治療も提案されている（非特許文献４１）。しかしながら、上記報告された方法および化合物がｍＲＮＡのような一本鎖ＤＮＡを細胞内または１つまたは複数の組織内へ送達することができるかどうかは、ＲＮＡの経口投与により達成され得るかは言うまでもなく、未知である。特に、ｍＲＮＡのトランスフェクションは、細胞内へのプラスミドＤＮＡのトランスフェクションと実質的に異なることが以前から認められている（非特許文献４４および４５）。
これを踏まえ、本発明者らが、特許文献６に開示されたポリマーファミリーの１００を超えるメンバーを、ＲＮＡ送達、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡの送達における適合性についてスクリーニングしたところ、いずれの化合物も、該ｍＲＮＡによってコードされる遺伝子の発現を生じる様式でｍＲＮＡをトランスフェクションするには有用でなかった。対照的に、それら化合物は全て、プラスミドＤＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡの送達に有用である。従って、細胞への二本鎖核酸の送達について確立されたルールは、一本鎖ｍＲＮＡには先験的に当てはまらない。特許文献６の開示は、２〜６０単位のオリゴ(アルキレンアミノ)酸ユニットであり、一般式：ＨＯＯＣ−Ｚ−Ｒ−ＮＨ−[(ＣＨ２)ｂ−ＮＨ]ａ−Ｈ（式中、Ｚは、一連のメチレンまたは様々な他の基（ｇｒｏｕｐｉｎｇｓ）であり、Ｒは、メチレン基またはカルボキシ基であり、ａおよびｂは、独立して、それぞれ１〜７または２〜７の整数である）に相当する化学的に規定されたオリゴマー群を含む。このオリゴマーファミリーは、いわゆるプロトンスポンジ効果を発揮することができるプロトン化可能なアミノ基を含み、インビトロおよびインビボでプラスミドＤＮＡおよびｓｉＲＮＡのトランスフェクションにおいて高活性であることが示されている。重要なことに、特許文献６および関連する科学出版物は、どのようにして一般式：ＨＯＯＣ−Ｚ−Ｒ−ＮＨ−[(ＣＨ２)ｂ−ＮＨ]ａ−Ｈに相当する構成要素から配列を規定したオリゴマー／ポリマーライブラリーを確立することができるかを非常に詳細に教示している。
ＤＮＡに基づく遺伝子治療に代替するものはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の送達である。特に、近年、ｍＲＮＡは非ウイルス遺伝子治療を代替するものとして台頭している。ｍＲＮＡはその機能を細胞質内で発揮するため、核膜通過輸送に関する制限は克服される。これらの制限は、ｍＲＮＡに基づく転写産物治療では無関係である。
しかしながら、単純かつ耐容性の良好なＲＮＡに基づく遺伝子治療を可能とする好適かつ信頼性の高いアプローチは、未だにない。
米国特許第８，４５０，２９８号明細書 米国特許第７，７８０，９５７号明細書 米国特許第７，８２９，６５７号明細書 国際公開第２０１０／０６５６６０号 国際公開第２００６／１３８３８０号 国際公開第２０１１／１５４３３１号
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よって、本発明の根底にある技術的課題は、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡを細胞内または組織に高効率で送達する単純かつ信頼性の高い耐容性の良好な手段および方法を、特に遺伝子治療アプローチに関して、提供することである。
この課題は、特許請求の範囲で特徴付けられ、かつ、以下の一般的な説明および実施例によって更に詳細に例示される実施形態の提供によって達成される。
したがって、本発明は、本明細書中で更に規定される様々な実施形態で、下記を提供する：
（ｉ）ＲＮＡおよびカチオン性剤を含み、胃腸管（内）に投与（例えば、直腸内投与、好ましくは経口投与）するための固形剤として製剤化されている（医薬）組成物；
（ｉｉ）ＲＮＡおよび／または該ＲＮＡから翻訳されたタンパク質を全身送達するための、および／または、ＲＮＡを、特に胃腸管の、細胞内および／または組織内に送達するための、本発明の医薬組成物の使用；
（ｉｉｉ）ＲＮＡおよび／または該ＲＮＡから翻訳されたタンパク質を対象に全身送達するか、対象の、特に胃腸管の、細胞および／または組織にＲＮＡを送達する方法であって、本発明の医薬組成物を胃腸管（内）に経口投与（例えば、直腸内投与、好ましくは経口投与）する工程を含む、方法。
驚くべきことに、ｍＲＮＡなどのＲＮＡは、カチオン性剤（例えば、ＰＥＩまたはＣ１２−（２−３−２））と共に投与し、かつ、固形剤内にまたは固形剤として製剤化（例えば、カプセル中に提供）すると、分解されず、そのため、その所望する治療機能が失われずに経口投与することができることが見出された。
特に、リピドイド／ｍＲＮＡ複合体を固形剤（例えば、硬質ゼラチンカプセル中で（図３５を参照））として経口投与すると、ｍＲＮＡがラット胃腸管で効果的に発現する（ルシフェラーゼシグナル）ことが見出された。該リピドイド／ｍＲＮＡ複合体は、トレハロースで凍結乾燥することができ、かつ／または、ナノ粒子および／またはマイクロ粒子中にローディングすることができた。これに対して、主要な臓器（心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓）において、また、ｍＲＮＡを非固形、すなわち液体製剤として経口投与した場合には、顕著な発現は検出されなかった。
他の驚くべき発見は、ＰＥＩと共に投与すると、ヘルパー脂質および／またはマイクロ粒子を使用しなくても効果的なｍＲＮＡの発現を達成できたことである（図３６を参照）。しかしながら、ナノ粒子および／またはマイクロ粒子としての、または、ナノ粒子および／またはマイクロ粒子中の製剤もｍＲＮＡ発現に関して非常に良好な結果を示した（図３６を参照）。
原則として、カチオン性剤とは、正電荷を提供するため核酸（通常、負に帯電している）と複合化して核酸と複合体を形成することができる、本発明に係る任意の剤である。通常、本発明に関して使用されるカチオン性剤は、オリゴカチオン性剤またはポリカチオン性剤である。カチオン性剤は、カチオン性オリゴマー、カチオン性ポリマー、または、カチオン性脂質もしくはカチオン性リピドイドであり得る。
非限定的な好適なカチオン性ポリマーの１つは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。原則として、本発明に従って任意のＰＥＩを使用することができる。そのため、ＰＥＩは未分岐、部分分岐または分岐ＰＥＩ（ｂｒＰＥＩ）であり得る。分岐ＰＥＩ（ｂｒＰＥＩ）が好ましい。
他の一実施形態において、カチオン性剤、特にカチオン性のオリゴマー、ポリマーまたはリピドイドは、ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０６３７５６に記載されているように、例えば、特徴的なオリゴ（アルキレンアミン）部分のようなオリゴ（アルキレンアミン）部分を含み得る。特には、ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０６３７５６に記載されているように、カチオン性剤はオリゴマー、ポリマーまたはリピドイドであり得る。非限定的な好適なカチオン性リピドイドの１つは、ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０６３７５６に記載され、かつ、本明細書に定義および記載されているように、「Ｃ１２−（２−３−２）」である。
具体的な一実施形態において、医薬組成物またはその成分の少なくとも１つ、特に、含まれているＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡは、単離されており、かつ／または、非天然である。
特に、本発明および本明細書中で更に規定される本発明の様々な実施形態に関して、下記のものが使用される：
・異なるアルキレンアミン単位を交互に含有するオリゴ(アルキレンアミン)を含む、細胞内または組織へのＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡを送達することに有用なカチオン性のオリゴマー、ポリマーまたはリピドイドであって、前記ＲＮＡを含み、かつ、胃腸内投与することができるため固形剤（例えば、本明細書の他の箇所に規定されているように（硬質または軟ゼラチン）カプセル剤、錠剤、坐剤、ペレット剤、顆粒剤または（分包）散剤）の形態を取り得る医薬組成物に含有される場合に特に有用であるもの。
・交互の異なるアルキレンアミン単位を含有するオリゴ(アルキレンアミン)を含む前記オリゴマー、ポリマーまたはリピドイドをＲＮＡ、特にｍＲＮＡと共に含む、細胞内または組織へのＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡを送達することに有用な（医薬）組成物。特に、前記（医薬）組成物は胃腸内投与され得るため、上記剤形のいずれかを取り得る。
・前記化合物および組成物を調製する方法。
・前記化合物および組成物を用いて細胞内へＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡを送達する方法、ならびに、本発明による前記組成物のＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡを送達する能力を活用する医療用途および治療方法。
ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡを送達するのに有用な組成物に含まれる、直線状、分枝状および樹枝状のランダムもしくは配列規定された化合物を含むオリゴマー化合物もしくはポリマー化合物中、またはリピドイド化合物中の、交互に異なるアルキレンアミン単位を含有するオリゴ(アルキレンアミン)の豊富な構造空間は、調査されていない。当該化合物の配列空間それ自体も、調査されていない。
さらに驚くべきことに、本発明に関して、オリゴマー、ポリマーおよびリピドイドについての一般原理として、３つ以上の単位の基で長さを交互にし且つエチレンアミン単位を含有する複数のアルキレンアミン単位の配置が、細胞をＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡでトランスフェクションするための組成物において、長さが交互でない複数のアルキレンアミン単位の類似配置よりも一貫して効率的であったことを見いだした。よって、下記式（Ｉ）で例示され下で更に説明される共通の構造実体を共有する、オリゴマー、ポリマーまたはリピドイド、特にカチオン性のオリゴマー、ポリマーまたはリピドイドが本発明に関して使用される。
（Ｉ）
特に、本発明の医薬組成物は、第一の態様で、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡ、および、オリゴ(アルキレンアミン)を含む成分（を含む組成物）を含み、該成分は下記（ａ）〜（ｃ）から選択される。
（ａ）複数の式（ＩＩ）の基を側鎖および／もしくは末端基として含む、オリゴマーまたはポリマー、特にカチオン性のオリゴマーまたはポリマー：
（ＩＩ）
（式中、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎおよびＲ２〜Ｒ６は、下で定義する通りであり、複数の式（ＩＩ）の基において、各式（ＩＩ）の基はそれぞれ独立しており：
ａは１であり且つｂは２〜４の整数であるか；またはａは２〜４の整数であり且つｂは１であり、
ｐは１または２であり、
ｍは１または２であり；ｎは０または１であり且つｍ＋ｎ≧２であり；
Ｒ２〜Ｒ５は、互いに独立して、水素；基−ＣＨ２−ＣＨ(ＯＨ)−Ｒ７、−ＣＨ(Ｒ７)−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−Ｏ−Ｒ７、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−ＮＨ−Ｒ７もしくは−ＣＨ２−Ｒ７（式中、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルもしくは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）；アミノ基の保護基；およびポリ(エチレングリコール)鎖から選択され、
Ｒ６は、水素；基−ＣＨ２−ＣＨ(ＯＨ)−Ｒ７、−ＣＨ(Ｒ７)−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−Ｏ−Ｒ７、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−ＮＨ−Ｒ７もしくは−ＣＨ２−Ｒ７（式中、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルもしくは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）；アミノ基の保護基；−Ｃ(ＮＨ)−ＮＨ２；ポリ(エチレングリコール)鎖；および受容体リガンドから選択され、
式（ＩＩ）中で表示される１個以上の窒素原子は、プロトン化されて、式（ＩＩ）のカチオン基を提供してもよい）、
（ｂ）複数の式（ＩＩＩ）の基を反復単位として含む、オリゴマーまたはポリマー、特にカチオン性のオリゴマーまたはポリマー：
（ＩＩＩ）
（式中、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎおよびＲ２〜Ｒ５は、下で定義する通りであり、複数の式（ＩＩＩ）の基において、各式（ＩＩＩ）の基はそれぞれ独立しており：
ａは１であり且つｂは２〜４の整数であるか；またはａは２〜４の整数であり且つｂは１であり、
ｐは１または２であり、
ｍは１または２であり；ｎは０または１であり且つｍ＋ｎ≧２であり；
Ｒ２〜Ｒ５は、互いに独立して、水素；基−ＣＨ２−ＣＨ(ＯＨ)−Ｒ７、−ＣＨ(Ｒ７)−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−Ｏ−Ｒ７、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−ＮＨ−Ｒ７もしくは−ＣＨ２−Ｒ７（式中、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルもしくは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）；アミノ基の保護基；−Ｃ(ＮＨ)−ＮＨ２；およびポリ(エチレングリコール)鎖から選択され；
式（ＩＩＩ）中で表示される１個以上の窒素原子は、プロトン化されて、式（ＩＩＩ）のカチオン基を提供してもよい）、
（ｃ）式（ＩＶ）の構造を有するリピドイド、特にカチオン性リピドイド：
（ＩＶ）
（式中、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎおよびＲ１〜Ｒ６は、下で定義する通りであり：
ａは１であり且つｂは２〜４の整数であるか；または、ａは２〜４の整数であり且つｂは１であり、
ｐは１または２であり、
ｍは１または２であり；ｎは０または１であり且つｍ＋ｎ≧２であり；
Ｒ１〜Ｒ６は、互いに独立して、水素；基−ＣＨ２−ＣＨ(ＯＨ)−Ｒ７、−ＣＨ(Ｒ７)−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−Ｏ−Ｒ７、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−ＮＨ−Ｒ７もしくは−ＣＨ２−Ｒ７（式中、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルもしくは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）；アミノ基の保護基；−Ｃ(ＮＨ)−ＮＨ２；ポリ(エチレングリコール)鎖；および受容体リガンドから選択され；ただし、Ｒ１〜Ｒ６のうちの少なくとも２つの残基は、基−ＣＨ２−ＣＨ(ＯＨ)−Ｒ７、−ＣＨ(Ｒ７)−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−Ｏ−Ｒ７、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−ＮＨ−Ｒ７もしくは−ＣＨ２−Ｒ７（式中、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルもしくは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）であり；
式（ＩＶ）中で表示される１個以上の窒素原子は、プロトン化されて、式（ＩＶ）のカチオン基を提供してもよい）。
更なる態様では、本発明で使用される組成物の調製に有用な中間体としての上記定義のオリゴマー、ポリマーまたはリピドイド、ならびに、前記組成物を含む医薬組成物が、本発明に関して使用される。また、本発明の前記オリゴマー、ポリマーまたはリピドイド、ならびに、本発明の前記組成物および医薬組成物の製造方法が本明細書で記載される。
更に別の態様は、標的細胞内または組織へＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡを、特に胃腸管（内）へ固形剤として投与して送達するための、本発明の（医薬）組成物または本発明のカチオン性のポリマーもしくはデンドリマーもしくはリピドイドの使用、および、本発明の（医薬）組成物を細胞または組織に接触させる工程を含む、細胞または組織内へＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡを、特に胃腸管（内）へ固形剤として投与することにより送達する方法を記載する。
ｍＲＮＡによる様々な細胞種のトランスフェクション効率に対する、ポリ(アクリル酸)のオリゴ(アルキレンアミン) 側鎖修飾型の効果。側鎖修飾（２−３−２）または（３−２−３）を有するポリ(アクリル酸)（ＭＷ：８，０００Ｄａ）と、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡとを、表示した細胞種に対して４〜４４のＮ／Ｐ比で用いて、ポリプレックスを形成した。様々な量のＲＮＡ（５００、２５０、１２５または６２．５ｎｇ）でトランスフェクションした細胞を２４時間後に溶解して、ルシフェラーゼ活性を分析した。 ｍＲＮＡによる様々な細胞種のトランスフェクション効率に対する、ポリ(アクリル酸)のオリゴ(アルキレンアミン) 側鎖修飾型の効果。コントロール基（３−３−３）または（２−２−２）を有するポリ(アクリル酸)（ＭＷ：８，０００Ｄａ）と、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡとを、表示した細胞種に対して４〜４４のＮ／Ｐ比で用いて、ポリプレックスを形成した。様々な量のＲＮＡ（５００、２５０、１２５または６２．５ｎｇ）でトランスフェクションした細胞を２４時間後に溶解して、ルシフェラーゼ活性を分析した。 ｍＲＮＡによる様々な細胞種のトランスフェクション効率に対する、ポリ(アクリル酸)のオリゴ(アルキレンアミン) 側鎖修飾型の効果。コントロール基（２−２）または（３−４−３）を有するポリ(アクリル酸)（ＭＷ：８，０００Ｄａ）と、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡとを、表示した細胞種に対して４〜４４のＮ／Ｐ比で用いて、ポリプレックスを形成した。様々な量のＲＮＡ（５００、２５０、１２５または６２．５ｎｇ）でトランスフェクションした細胞を２４時間後に溶解して、ルシフェラーゼ活性を分析した。 （２−３−２）または（３−２−３）修飾したＰＡＡ８ｋの複合体形成能力を決定するためのゲル移動度アッセイ。説明したように、表示したＮ／Ｐ比でポリプレックスを形成した。ポリマーとｍＲＮＡとの相互作用を、アガロースゲル上の移動度によって分析した。前記相互作用が良好である程、ｍＲＮＡの移動の完全な妨害に必要とされるポリマー量が低減する。 （２−３−２）または（３−２−３）修飾したＰＡＡ８ｋの複合体形成能力を決定するためのリボグリーンアッセイ。説明したように、表示したＮ／Ｐ比でポリプレックスを形成した。ポリマーとｍＲＮＡとの相互作用を、リボグリーンの添加によって分析した。この分子は、核酸と相互作用して、大量のｍＲＮＡで蛍光シグナルの増加を生じる。核酸とポリマーとの相互作用が良好である程、検出される蛍光シグナルは低下する。シグナルは、同量の遊離ｍＲＮＡを含有するコントロールに比べた相対蛍光強度として表示されている。 様々なＮ，Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１，３−プロパンジアミン（２−３−２）修飾ポリマーのトランスフェクション効率。表示した複数のＮ，Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１，３−プロパンジアミン（２−３−２）修飾ポリマー（ＰＡＡ８ｋ：ポリ(アクリル酸)、ＭＷ：８，０００Ｄａ；Ｇｌｕ９．８ｋ：ポリ(グルタミン酸)、ＭＷ：９，８００Ｄａ；ＰＭＡ９．５ｋ：ポリ(メタクリレート)、ＭＷ：９，５００Ｄａ；Ｇｌｕ６４ｋ：ポリ(グルタミン酸)、ＭＷ：６，４００Ｄａ；ＧｌｕＬｙｓ：ポリ(グルタミン酸)−ポリ(リジン)−コポリマー）、２０，０００〜５０，０００Ｄａ）とホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡとを、４〜２０のＮ／Ｐ比で用いて、ポリプレックスを形成した。様々な量のＲＮＡ（５００、２５０、１２５または６２．５ｎｇ）でトランスフェクションした細胞を２４時間後に溶解して、ルシフェラーゼ活性を分析した。 様々な分子量のＮ，Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１，３−プロパンジアミン（２−３−２）修飾ポリマーのトランスフェクション効率。表示した分子量のポリ(アクリル酸)をＮ，Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１，３−プロパンジアミン（２−３−２）で修飾したものとホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡとを４〜２０のＮ／Ｐ比で用いて、ポリプレックスを形成した。様々な量のＲＮＡ（５００、２５０、１２５または６２．５ｎｇ） ｍＲＮＡポリマー製剤の細胞毒性。表示したオリゴ(アルキレンアミン)で修飾したポリ(アクリル酸)（ＭＷ：８，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａおよび７０，０００Ｄａ）とホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡとを、４〜４４のＮ／Ｐ比および様々なｍＲＮＡ量で含む複合体をトランスフェクションに用いた。後述するように、２４時間後の細胞生存率を測定した。データは、非トランスフェクション細胞と比べた生存率（％）として示す。 マウス肺のレポータータンパク質発現レベル。ＰＡＡ２０ｋ−(２−３−２)とホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡとのポリプレックスを表示したＮ／Ｐ比で混合して、エアロゾルでマウスに投与する。 Ｎ，Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１，３−プロパンジアミン（２−３−２）修飾ポリ(アクリル酸)の物理化学的特性。インビボ条件下、１０のＮ／Ｐ比で、ポリプレックスを形成した。使用ポリマー：ポリ(アクリル酸)、ＭＷ：２０，０００Ｄａ。 ＰＡＡ２０ｋ−(２−３−２)およびｍＲＮＡの透過型電子顕微鏡写真。ポリプレックスを１０のＮ／Ｐ比で混合して、透過型電子顕微鏡で分析した。スケールバー：１００ｎｍ。使用ポリマー：ポリ(アクリル酸)、ＭＷ：２０，０００Ｄａ。 ポリプレックス製剤のエアロゾル投与後のブタ肺組織におけるホタルルシフェラーゼの発現。左写真：ｂｒＰＥＩ、Ｎ／Ｐ比１０。右写真：ＰＡＡ２０ｋ−(２−３−２)、Ｎ／Ｐ比１０。使用ポリマー：ポリ(アクリル酸)、ＭＷ：２０，０００Ｄａ。 ＰＡＡ２０ｋ−(２−３−２)複合体の凍結能力に対するトレハロースの効果。説明するように複合体を形成して、１％のトレハロースの存在下または非存在下で凍結乾燥させた。示されるように、トレハロースは、凍結乾燥および再水和後にこれら複合体のｍＲＮＡトランスフェクション効率を保つことができる。 ＤＮＡトランスフェクション効率に対する（２−３−２）または（３−２−３）修飾ポリマーの効果。表示した側鎖修飾を有するポリ(アクリル酸)（ＭＷ：８，０００Ｄａ）と、ホタルルシフェラーゼをコードするｐＤＮＡ（ｐＣＭＶＬｕｃ）とを４〜２０のＮ／Ｐ比で用いて、ポリプレックスを形成した。様々な量のＲＮＡ（５００、２５０、１２５または６２．５ｎｇ）でトランスフェクションした細胞を２４時間後に溶解して、ルシフェラーゼ活性を分析した。コントロールとして、２５ｋＤａの分枝状ＰＥＩ（ｂｒＰＥＩ）をトランスフェクション試薬として用いた。 ＧＬ３−Ｌｕｃ−ｓｉＲＮＡとＮ，Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１，３−プロパンジアミン（２−３−２）修飾ポリ(アクリル酸)との複合体を用いた、ＲＮＡｉ誘導性遺伝子サイレンシング。ホタルルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡであるｓｉＲＮＡ（ｓｉＬｕｃ）またはコントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＦＰ）とＰＡＡ２０ｋ−(２−３−２)との複合体を用いて、ホタルルシフェラーゼを安定に発現しているＨｅＬａ細胞を、表示したＮ／Ｐ比および様々なｓｉＲＮＡ量でトランスフェクションした。２４時間後にルシフェラーゼ発現を分析して、未処理細胞に対する相対発現量として示す。 様々なリピドイド／ｍＲＮＡ複合体でＮＩＨ３Ｔ３細胞をトランスフェクションした後のホタルルシフェラーゼ活性。ｍＲＮＡと、（２−３−２）またはコントロールオリゴ(アルキレンアミン)である（２−２−２）および（３−３−３）に基づくリピドイドとの間で、１６のｗ／ｗ比（リピドイド重量／ｍＲＮＡ重量）にて複合体を形成した。 ＤＮＡトランスフェクション効率に対するポリ(アクリル酸)のオリゴ(アルキレンアミン)側鎖修飾の効果。表示した側鎖修飾を含むポリ(アクリル酸)（ＭＷ：８，０００Ｄａ）と、ホタルルシフェラーゼをコードするｐＤＮＡ（ｐＣＭＶＬｕｃ）とを表示したＮ／Ｐ比で用いてポリプレックスを形成した。様々な量のＲＮＡ（５００、２５０、１２５または６２．５ｎｇ）でトランスフェクションした細胞を２４時間後に溶解して、ルシフェラーゼ活性を分析した。ｍＲＮＡトランスフェクション（図１を参照）とは対照的に、オリゴ(アルキレンアミン)側鎖修飾は、トランスフェクション効率に顕著な影響を及ぼさない。 リピドイド製剤の静脈内注射後のマウス肝臓および脾臓におけるホタルルシフェラーゼの発現。左：リピドイドＣ１２−(２−３−２)（Ｃ１２−(２−３−２)：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２ｋが重量比３．６：０．１８：０．７６：１である）で製剤化した、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡの注射用ＰＢＳ溶液。右：リピドイドＣ１２−(２−３−２)（Ｃ１２−(２−３−２)：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２ｋが重量比３．６：０．１８：０．７６：１である）で製剤化した、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡの注射用水溶液。ＰＢＳ中の製剤のみが、肝臓および脾臓における発現をもたらす（ＰＢＳ：１．６４０４×１０５光子／秒；水：検出せず）。 リピドイド製剤の静脈内注射後のマウス肝臓および脾臓におけるホタルルシフェラーゼの発現。Ａは、インビボでの生物発光画像を示す。左：リピドイドＣ１４−(２−３−２)（Ｃ１４−(２−３−２)：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２ｋが８：６：５：１である）で製剤化した、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡの注射用ＰＢＳ溶液。中：リピドイドＣ１６−(２−３−２)（Ｃ１６−(２−３−２)：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２ｋが８：６：５：１である）で製剤化した、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡの注射用ＰＢＳ溶液。右：リピドイドＣ１２−(２−３−２)（Ｃ１２−(２−３−２)：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２ｋが８：６：５：１である）で製剤化した、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡの注射用ＰＢＳ溶液。Ｂは、インビボでの生物発光シグナルの定量結果を示す。アルキル鎖長がＣ１２からＣ１６へ増加するのにつれて発現レベルは低下する。 リピドイド製剤の静脈内注射後のマウス肝臓および脾臓におけるホタルルシフェラーゼの発現。図１７に示す処理マウスから肝臓、脾臓、腎臓、胃、心臓、肺および脳を摘出して、ルシフェラーゼ発現を画像化した。Ａは、生物発光画像を示す。左：リピドイド１２−(２−３−２)（Ｃ１２−(２−３−２)：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２ｋが８：６：５：１である）で製剤化した、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡの注射用ＰＢＳ溶液。中：リピドイドＣ１４−(２−３−２)（Ｃ１４−(２−３−２)：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２ｋが８：６：５：１である）で製剤化した、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡの注射用ＰＢＳ溶液。右：リピドイドＣ１２−(２−３−２)（Ｃ１２−(２−３−２)：ＤＯＰＥ：コレステロール：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２ｋが８：６：５：１である）で製剤化した、ホタルルシフェラーゼをコードしたｍＲＮＡの注射用ＰＢＳ溶液。リピドイドのアルカン鎖長が増加するにつれて肝臓でのルシフェラーゼ発現量は低減し（Ｃ１６＜Ｃ１４＜Ｃ１２）、Ｃ１６については殆ど検出されなかった。脾臓におけるルシフェラーゼ発現量はＣ１４について最も高かった。肺では幾らかのルシフェラーゼ発現が観察されたが、心臓、腎臓、胃または脳では観察されなかった。Ｂは、Ａの生態蛍光シグナルの定量結果を示す。 様々なトランスフェクション試薬のｐＤＮＡおよびｍＲＮＡを送達する能力に関する効率の比較。表示したトランスフェクション試薬を用いてポリプレックスを形成した（構造体は特許文献６の一致物の命名法による：♯４６：Ｃ−Ｓｔｐ３−Ｃ−Ｋ−ＯｌｅＡ２；＃４５４：Ｃ−Ｙ３−Ｓｔｐ２−Ｋ(Ｋ−ＯｌｅＡ２)−Ｓｔｐ２−Ｙ３−Ｃ；＃５１２：Ｃ−Ｓｐｈ３−Ｋ（ＳＰｈ３−Ｃ）２）。核酸ペイロードとして、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡまたはｐＤＮＡ（ｐＣＭＶＬｕｃ）を表示したＮ／Ｐ比で用いた。様々な量のＲＮＡ（５００、２５０、１２５または６２．５ｎｇ）でトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞を２４時間後に溶解して、ルシフェラーゼ活性を分析した。 Ｎ，Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１，３−プロパンジアミン（２−３−２）またはＮ，Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１，３−ブタンジアミン（２−４−２）で修飾したＰＡＡ８ｋのトランスフェクション効率の比較。Ｎ，Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１，３−プロパンジアミン（２−３−２）またはＮ，Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１，３−ブタンジアミン（２−４−２）いずれか一方で修飾されたＰＡＡ８ｋと、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡとを表示したＮ／Ｐ比で用いてポリプレックスを形成した。様々な量のＲＮＡ（５００、２５０、１２５または６２．５ｎｇ）でトランスフェクションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞を２４時間後に溶解して、ルシフェラーゼ活性を分析した。 リポプレックスの透過型電子顕微鏡写真。説明するようにリピドイド／ｍＲＮＡ複合体を形成して、透過型電子顕微鏡で分析した。上のレーン：Ｃ１０−(２−３−２)／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＤＰＧ−ＰＥＧ。下のレーン：Ｃ１０−(２−３−２)／ＤＰＰＣ／コレステロール／ＤＰＧ−ＰＥＧ。左側の写真２枚：１００ｎｍスケールの概観像。右側の写真２枚：２０ｎｍスケールの拡大像。 １−ブロモデカンから合成したＣ１０−(２−３−２)のトランスフェクション効率。１−ブロモデカンを用いて、Ｃ１０−(２−３−２)を、後述の製造例ＶＩＩで説明するように合成した。１ウェルあたり、それぞれ、５００ｎｇ、２５０ｎｇ、１２５ｎｇの用量で用いて、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対するトランスフェクション効率を試験した。 Ｎ−ドデシルアクリルアミドから合成したＣ１２−(２−３−２)のトランスフェクション効率。Ｎ−ドデシルアクリルアミドを用いて、Ｃ１２−(２−３−２)を、後述の製造例ＶＩＩＩで説明するように合成した。１ウェルあたり、それぞれ、５００ｎｇ、２５０ｎｇ、１２５ｎｇの用量で用いて、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対するトランスフェクション効率を試験した。 ドデシルアクリレートから合成したＣ１２−(２−３−２)のトランスフェクション効率。ドデシルアクリレートを用いて、Ｃ１２−(２−３−２)を、後述の製造例ＩＸで説明するように合成した。１ウェルあたり、それぞれ、５００ｎｇ、２５０ｎｇ、１２５ｎｇの用量で用いて、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に対するトランスフェクション効率を試験した。 Ｃ１２−(２−３−２)に基づくリピドイド製剤のトランスフェクション効率。Ｃ１２−(２−３−２)およびＤＭＧ−ＰＥＧ２ｋとホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡとを、ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣと併用して、１７または８のＮ／Ｐ比でリピドイド製剤を作製した。 Ｃ１２アルキル鎖で修飾したオリゴ(アルキルアミン)である（２−３−２）、（３−３−３）および（２−２−２）のインビボでのトランスフェクション効率に対する比較。 Ｃ１２アルキル鎖飽和度およびＣ１２アルキル鎖位置がそれぞれ異なるＣ１２−(２−３−２)のトランスフェクション効率の比較。Ａ：様々なＣ１２−(２−３−２)の化学構造。Ｂ：様々な脂質を含む製剤でＮＩＨ３Ｔ３細胞をトランスフェクションした後のレポータータンパク質（ホタルルシフェラーゼ）発現レベル。 リポプレックスの凍結乾燥安定性。説明するようにリピドイドを形成し、水に対して透析し、様々な濃度のリポプロテクタント（トレハロース（Ａ，Ｄ）、スクロース（Ｂ，Ｅ）、およびラクトース（Ｃ，Ｆ））と混合した。冷凍し、凍結乾燥して再懸濁させた後に、ＮＩＨ３Ｔ３細胞へのトランスフェクション効率（Ａ〜Ｃ）および流体力学直径（Ｄ〜Ｆ）を測定して、同一条件下で新しく調製したリポプレックスと比較した。 Ｃ１２−(２−３−２)含有リピドイド製剤によるトランスフェクション後のエクスビボサンプルでのｍＲＮＡ発現。Ａ：ブタ筋肉、全サンプルを処理。Ｂ：ブタ脂肪組織、全サンプルを処理。Ｃ：ヒツジ動脈。Ｄ：ヒツジ筋肉、上側サンプル：処理、下側サンプル：未処理。Ｅ：ヒツジ肺、上側サンプル：処理、下側サンプル：未処理。 細胞溶解物のＡＣＥ−２タンパク質に対するウエスタンブロット分析。左側２レーン：ＡＣＥ−２のｍＲＮＡで処理した細胞の溶解物。右側２レーン：ｍＲＮＡを含まない空のリピドイド製剤でトランスフェクションした細胞の溶解物。上側の列：ＡＣＥ−２の染色。下側の列：ＧＡＰＤＨ、ローディングコントロール。 マウスにおけるマウスエリスロポエチンの発現。ｍＥＰＯのｍＲＮＡを含有するＣ１２−(２−３−２)製剤の静脈内投与から６時間後に、血液サンプルをｍＥＰＯについて分析した。３種類のＲＮＡ用量（２０μｇ、１０μｇまたは５μｇ）およびコントロール群（ＰＢＳ）について分析した。 様々に修飾されたポリ(アリルアミン)（ＰＡＬＡＭ）のトランスフェクション効率の比較。ＰＡＬＡＭ−(２−３−２)、ＰＡＬＡＭ−(２−２−２)またはＰＡＬＡＭ−(３−３−３)で複合化したルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡからなるポリプレックスを用いて、ＮＩＨ３Ｔ３細胞をトランスフェクションした。 様々に修飾したポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）のトランスフェクション効率の比較。ＰＰＩ−(２−３−２)、ＰＰＩ−(２−２−２)またはＰＰＩ−(３−３−３)で複合化したルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡからなるポリプレックスを用いて、ＮＩＨ３Ｔ３細胞をトランスフェクションした。 Ｃ１２−(２−３−２)製剤の皮下注射後のルシフェラーゼの発現。ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを含有するＣ１２−(２−３−２)／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＤＭＧ−ＰＥＧ ２ｋ。 ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）をコードする修飾ｍＲＮＡの（リピドイド）製剤を経口投与した後の胃腸管におけるホタルルシフェラーゼの発現。Ａ：カプセル剤として経口投与。右：実施例２９で説明するように，ＦＦＬをコードするｍＲＮＡに、リピドイドＣ１２−（２−３−２）とヘルパー脂質であるＤＳＰＣ、コレステロールおよびＤＰＧ−ＰＥＧ ２０００とを８：５．２９：４．４１：０．８８のモル比で配合した。凍結乾燥後、ｍＲＮＡ５０μｇに相当する一定分量をＰＣｃａｐｓ（登録商標）ゼラチンカプセルに充填し、強制経口投与により雌のＢｕｆｆａｌｏラットに投与した。２４時間後ラットを屠殺し、臓器を回収してＤ−ルシフェリン含有ＰＢＳ中でインキュベートした。ルシフェラーゼ活性を生物発光イメージングにより記録した。胃腸管では広範な発現が示されたが（右上の写真）、他の主要な臓器（肝臓、脾臓、腎臓、心臓、肺；右下の写真）ではルシフェラーゼシグナルは示されなかった。カラースケールコード（上の写真の右側）およびグレースケールコード（下の写真の右側）はルシフェラーゼの発現量を表す。左：同じリピドイド製剤をＰＬＧＡマイクロ粒子内にカプセル化し、凍結乾燥した。実施例２９で説明するように、ｍＲＮＡ約２５μｇに相当する１３．６ｍｇの一定分量をＰＣｃａｐｓ（登録商標）ゼラチンカプセルに充填し、強制経口投与により雌のＢｕｆｆａｌｏラットに投与した。２４時間後ラットを屠殺し、臓器を回収してＤ−ルシフェリン含有ＰＢＳ中でインキュベートした。ルシフェラーゼ活性を生物発光イメージングにより記録した。胃腸管では広範な発現が示されたが（左上の写真）、他の主要な臓器（肝臓、脾臓、腎臓、心臓、肺；左下の写真）ではルシフェラーゼシグナルは示されなかった。Ｂ：液剤として経口投与。左：実施例２９で説明するようにＦＦＬをコードするｍＲＮＡをリピドイドＣ１２−（２−３−２）およびヘルパー脂質と配合し、ＳｐｅｃｔｒａＧｅｌ（登録商標）（ＳｐｅｃｔｒｕｍＬａｂｓ社、ブレダ、オランダ）を用いて濃度１．１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、１０×ＰＢＳで調整して濃度を１×ＰＢＳ、１ｍｇ／ｍｌ ＲＮＡとした。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットをフローチャンバー内で５％イソフルランで麻酔し、強制経口投与により試験品１ｍｌを直接胃の中に投与した。全身状態が悪化したため、４時間半後に屠殺した。臓器をＤ−ルシフェリン含有ＰＢＳ（１００μｇ／ｍｌ）中でインキュベートした。ルシフェラーゼ活性を生物発光イメージングにより記録した。腸および臓器のいずれにおいても、ルシフェラーゼタンパク質が発現しなかったことが明らかにされた。中央：実施例２９で説明するようにキトサン粒子を製剤化し、凍結乾燥し、次いで、水３ｍＬに可溶化した。試験品をスケジュール通りに点滴した２４時間後、ラットを屠殺した。生物発光イメージングにより、腸および全臓器のいずれにおいてもルシフェラーゼが発現しなかったことが明らかにされた。右：実施例２９に記載されるようにＰＬＧＡマイクロ粒子を形成し、凍結乾燥後、水３ｍＬに再懸濁した。試験品をスケジュール通りに点滴した２４時間後、ラットを屠殺した。生物発光イメージングにより、腸および全臓器のいずれにおいてもルシフェラーゼが発現しなかったことが明らかにされた。 カプセル剤としての経口投与（第２試験）。トレハロース（コントロール）、マイクロ粒子を使用せずにＣ１２−（２−３−２）と複合化したＳＮＩＭ（登録商標）−ＲＮＡ、マイクロ粒子（ＭＰ）を使用してＣ１２−（２−３−２）と複合化したＳＮＩＭ（登録商標）−ＲＮＡ（国際公開第２０１１／０１２３１６号に従って修飾したＲＮＡ）、または、ＰＥＩと複合化したＳＮＩＭ（登録商標）−ＲＮＡを含むカプセルを、強制経口投与により雌のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの胃の中に直接投与した。複合体は実施例２９に記載されるように調製した。ルシフェラーゼタンパク質の発現は、全腸および臓器（肝臓、脾臓、胃、および、腎臓）において２４時間後にエクスビボで測定した。この方法では、トレハロースを充填したカプセルを投与したラットでは発現は見られなかった。腸および胃での発現は、ＳＮＩＭ（登録商標）−ＲＮＡをＣ１２−（２−３−２）と複合化し、マイクロ粒子内に導入しなかった場合に見られた。Ｃ１２−（２−３−２）と複合化したＳＮＩＭ（登録商標）−ＲＮＡをマイクロ粒子内に導入するとルシフェラーゼの発現が腸で増加したが、胃では発現しなかった。ＰＥＩと複合化したＳＮＩＭ（登録商標）−ＲＮＡは、腸および胃、そして驚くべきことに腎臓で、ルシフェラーゼの発現をもたらした。
［オリゴ(アルキレンアミン)基］
式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）のオリゴ(アルキレンアミン)構造は、短い（説明のため“Ｓ”とも称される）エチレンアミン単位（すなわち、ａまたはｂが１である）と、長い（説明のため“Ｌ”とも称される）アルキレンアミン単位（すなわち、ａまたはｂの他の一つが２〜４の整数である）とを、交互の形式で組み合わせることを特徴とする。予想外に、複数のプロトン化可能な単位がこのように配置されると、生じた基が、細胞内へのＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡを送達するためのビヒクルを提供する上で好適であるという利点が得られることが見出された。
上で指摘したように、本発明の好ましい一実施形態の（医薬）組成物で使用することができるオリゴマーまたはポリマーは、複数の式（ＩＩ）のオリゴ(アルキレンアミン)基を側鎖および／または末端基として含む：
−ＮＲ２{ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ３−[ＣＨ２−(ＣＨ２)ｂ−ＮＲ４]ｐ}ｍ−[ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ５]ｎ−Ｒ６ （ＩＩ）
（式中、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎおよびＲ２〜Ｒ６は、下で定義する通りであり、複数の式（ＩＩ）の基において、各式（ＩＩ）の基はそれぞれ独立しており：
ａは１であり且つｂは２〜４の整数であるか；またはａは２〜４の整数であり且つｂは１であり、
ｐは１または２であり、
ｍは１または２であり；ｎは０または１であり且つｍ＋ｎ≧２であり；
Ｒ２〜Ｒ５は、互いに独立して、水素；基−ＣＨ２−ＣＨ(ＯＨ)−Ｒ７、−ＣＨ(Ｒ７)−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−Ｏ−Ｒ７、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−ＮＨ−Ｒ７もしくは−ＣＨ２−Ｒ７（式中、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルもしくは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）；アミノ基の保護基；−Ｃ(ＮＨ)−ＮＨ２；およびポリ(エチレングリコール)鎖から選択され、
Ｒ６は、水素；基−ＣＨ２−ＣＨ(ＯＨ)−Ｒ７、−ＣＨ(Ｒ７)−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−Ｏ−Ｒ７、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−ＮＨ−Ｒ７もしくは−ＣＨ２−Ｒ７（式中、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１６アルキルもしくは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１６アルケニルから選択される）；アミノ基の保護基；−Ｃ(ＮＨ)−ＮＨ２；ポリ(エチレングリコール)鎖；および受容体リガンドから選択される）。好ましくは、Ｒ２〜Ｒ５が水素であり、Ｒ６が、水素、アミノ基の保護基、−Ｃ(ＮＨ)−ＮＨ２およびポリ(エチレングリコール)鎖から選択される。より好ましくは、Ｒ２〜Ｒ６が水素である。好ましくは、Ｒ７が、Ｃ８〜Ｃ１８アルキルまたは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ８〜Ｃ１８アルケニルから、より好ましくはＣ８〜Ｃ１２アルキルまたは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ８〜Ｃ１２アルケニルから、最も好ましくはＣ１０〜Ｃ１２アルキルまたは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ１０〜Ｃ１２アルケニルから、選択される。
式（ＩＩ）またはその好ましい実施形態に示される１個以上の窒素原子は、プロトン化されて式（ＩＩ）のカチオン基を提供してもよい。
複数の式（ＩＩ）の基とは、本発明のオリゴマーまたはポリマーに、式（ＩＩ）の基もしくはその好ましい実施形態が２個以上、好ましくは３個以上、含有されることを意味する。複数の式（ＩＩ）の基を含有するポリマーでは、１０個以上の式（ＩＩ）の基が存在することが好ましい。式（ＩＩ）の基またはその好ましい実施形態は、ポリマーまたはオリゴマー内で同一の構造を有していてもよく、式（ＩＩ）の範囲内で２つ以上の異なる構造を有していてもよいことが理解される。
別の好ましい一実施形態では、本発明の（医薬）組成物で使用することができるオリゴマーまたはポリマーは、複数の式（ＩＩＩ）のオリゴ(アルキレンアミン)基を反復単位として含む：
−ＮＲ２{ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ３−[ＣＨ２−(ＣＨ２)ｂ−ＮＲ４]ｐ}ｍ−[ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ５]ｎ− （ＩＩＩ）
（式中、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎおよびＲ２〜Ｒ５は、下で定義する通りであり、複数の式（ＩＩＩ）の基において、各式（ＩＩＩ）の基はそれぞれ独立しており：
ａは１であり且つｂは２〜４の整数であるか；またはａは２〜４の整数であり且つｂは１であり、
ｐは１または２であり、
ｍは１または２であり；ｎは０または１であり且つｍ＋ｎ≧２であり；
Ｒ２〜Ｒ５は、互いに独立して、水素；基−ＣＨ２−ＣＨ(ＯＨ)−Ｒ７、−ＣＨ(Ｒ７)−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−Ｏ−Ｒ７、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−ＮＨ−Ｒ７もしくは−ＣＨ２−Ｒ７（式中、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルもしくは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）；アミノ基の保護基；−Ｃ(ＮＨ)−ＮＨ２；ポリ(エチレングリコール)鎖；エンドソーム脱出エフェクターおよび受容体リガンドから選択される）。好ましくは、Ｒ２〜Ｒ５が水素である。好ましくは、Ｒ７が、Ｃ８〜Ｃ１８アルキルまたは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ８〜Ｃ１８アルケニルから、より好ましくはＣ８〜Ｃ１２アルキルまたは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ８〜Ｃ１２アルケニルから、最も好ましくはＣ１０〜Ｃ１２アルキルまたは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ１０〜Ｃ１２アルケニルから、選択される。
式（ＩＩＩ）またはその好ましい実施形態に示される１個以上の窒素原子は、プロトン化されて、式（ＩＩＩ）のカチオン基を提供してもよい。
任意で、複数の式（ＩＩＩ）の基またはその好ましい実施形態を反復単位として含むオリゴマーまたはポリマーは、更に、式（ＩＩ）の１以上のオリゴ(アルキレンアミン)基を側鎖および／または末端基として含むことができる。
反復単位としての複数の式（ＩＩＩ）の基は、本発明のオリゴマーまたはポリマーに、式（ＩＩＩ）の基またはその好ましい実施形態が、２個以上、好ましくは３個以上、含有されることを意味する。一般に、２〜９個の反復単位を含む物質は、本明細書中ではオリゴマーと呼ばれ、１０個以上の反復単位を含む物質はポリマーと呼ばれる。よって、複数の式（ＩＩＩ）の基を反復単位として含有するポリマーでは、好ましくは１０個以上の式（ＩＩＩ）の基が存在する。式（ＩＩＩ）の基またはその好ましい実施形態は、ポリマーまたはオリゴマー内で同一の構造を有していてもよく、式（ＩＩＩ）の範囲内で２つ以上の異なる構造を有していてもよいことが理解される。有利なことに、好ましい実施形態によれば、複数の式（ＩＩＩ）の基を反復単位として含有するオリゴマーまたはポリマーを、制御された段階重合で異なる式（ＩＩＩ）の基から製造される配列が決定されたポリマーのライブラリーの形態で提供することができる。
上記式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）に従って、アルキレンアミン単位は、−Ｓ−Ｌ−Ｌ−Ｓ−または−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−(Ｓは短いエチレンアミン単位を表し、Ｌは長いアルキレンアミン単位を表す）の種類のオリゴ(アルキレンアミン)部分が生じ得るように、１回交互鎖で繰り返してもよい。しかしながら、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の好ましい基は、短い単位または長い単位が二つ組で現れないように、繰り返しが起こらない、すなわちｐが１であるものである。言い換えると、式（ＩＩ）の基は、好ましくは式（ＩＩａ）のオリゴ(アルキレンアミン)基であり、式（ＩＩＩ）の基は、好ましくは（ＩＩＩａ）のオリゴ(アルキレンアミン)基である：
−ＮＲ２{ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ３−ＣＨ２−(ＣＨ２)ｂ−ＮＲ４}ｍ−[ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ５]ｎ−Ｒ６ （ＩＩａ）
（式中、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎおよびＲ２〜Ｒ６は、好ましい実施形態を含め、式（ＩＩ）で定義する通りであり、式（ＩＩａ）に示される１個以上の窒素原子はプロトン化されてカチオン性オリゴマーまたはポリマー構造を提供してもよい）；
−ＮＲ２{ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ３−ＣＨ２−(ＣＨ２)ｂ−ＮＲ４}ｍ−[ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ５]ｎ− （ＩＩＩａ）
（式中、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎおよびＲ２〜Ｒ５は、好ましい実施形態を含め、式（ＩＩＩ）で定義する通りであり、式（ＩＩＩａ）に示される１個以上の窒素原子はプロトン化されてカチオン性オリゴマーまたはポリマー構造を提供してもよい）。
更に、式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）のオリゴ(アルキレンアミン)基については、ｎが１であることが一般に好ましく、より好ましくは、ｍが１であり且つｎが１である。よって、特に好ましくは、式（ＩＩ）の基が式（ＩＩｂ）のオリゴ(アルキレンアミン)基であり、式（ＩＩＩ）の基が式（ＩＩＩｂ）のオリゴ(アルキレンアミン)基である：
−ＮＲ２−ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ３−ＣＨ２−(ＣＨ２)ｂ−ＮＲ４−ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ５−Ｒ６ （ＩＩｂ）
（式中、変数ａ、ｂおよびＲ２〜Ｒ６は、好ましい実施形態を含め、式（ＩＩ）で定義する通りであり、式（ＩＩｂ）に示される１個以上の窒素原子はプロトン化されてカチオン性オリゴマーまたはポリマー構造を提供してもよい）；
−ＮＲ２−ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ３−ＣＨ２−(ＣＨ２)ｂ−ＮＲ４−ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ５− （ＩＩＩｂ）
（式中、変数ａ、ｂおよびＲ２〜Ｒ５は、好ましい実施形態を含め、式（ＩＩＩ）で定義する通りであり、式（ＩＩＩｂ）に示される１個以上の窒素原子はプロトン化されてカチオン性オリゴマーまたはポリマー構造を提供してもよい）。
式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）および（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）のオリゴ(アルキレンアミン)基におけるアルキレンアミン単位の長さに関して、交互単位の１つがエチレンアミン単位である（すなわち、ａまたはｂの一方が１でなければならない）ことが理解される。他の交互単位は、プロピレンアミン単位、ブチレンアミン単位またはペンチレンアミン単位（すなわち、他の一方のａまたはｂが２〜４の整数）であり得る。好ましくは、他の一方のａまたはｂが２または３であり、より好ましくは、ａが１であり且つｂが２であるか、またはａが２であり且つｂが１である。従って、より一層好ましい基（ＩＩ）は式（ＩＩｃ）のオリゴ(アルキレンアミン)基であり、より一層好ましい基（ＩＩＩ）は式（ＩＩＩｃ）のオリゴ(アルキレンアミン)基である：
−ＮＲ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ４−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ５−Ｒ６ （ＩＩｃ）
（式中、Ｒ２〜Ｒ６は、好ましい実施形態を含め、式（ＩＩ）で定義する通りであり、最も好ましくは水素であり、式（ＩＩｃ）に示される１個以上の窒素原子はプロトン化されてカチオン性オリゴマーまたはポリマー構造体を提供してもよい）；
−ＮＲ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ４−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ５− （ＩＩＩｃ）
（式中、Ｒ２〜Ｒ５は、好ましい実施形態を含め、式（ＩＩＩ）で定義する通りであり、最も好ましくは水素であり、式（ＩＩＩｃ）に示される１個以上の窒素原子はプロトン化されてカチオン性オリゴマーまたはポリマー構造を提供してもよい）。
式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）および（ＩＩｃ）の基Ｒ２〜Ｒ６または式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）および（ＩＩＩｃ）の基Ｒ２〜Ｒ６のいずれかが例えば特許文献５に記載されるようなアミノ基の保護基である限りにおいて、それらの好ましい実施形態は、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、またはカルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）である。
式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）および（ＩＩｃ）の基Ｒ２〜Ｒ６または式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）および（ＩＩＩｃ）の基Ｒ２〜Ｒ６のいずれかが受容体リガンドである限りにおいて、有用な例は、フィリップおよびワグナーの「遺伝子および細胞療法−治療のメカニズムおよび戦略」第３版、第１５章（ＣＲＣ出版、テイラーアンドフランシスグループ社、ボーカラトーン、2009年）に示されている。肺組織に好ましい受容体リガンドは、フェイファー（Ｐｆｅｉｆｅｒ）らの文献（Ther. Deliv. 1(1):133-48）に記載されている。好ましい受容体リガンドとしては、ペプチドライブラリーを特定の細胞表面構造体もしくは特定の細胞型への結合についてスクリーニングして得られるような、合成の環状または直鎖状のペプチド；環状または直鎖状のＲＧＤペプチド；シアル酸、ガラクトースもしくはマンノースのような合成もしくは天然の炭水化物、または炭水化物の、例えばペプチドとの反応によって得られる合成リガンド；細胞表面構造体を特異的に認識する抗体；葉酸、上皮増殖因子およびそれらの誘導ペプチド；トランスフェリン；抗トランスフェリン受容体抗体、ナノボディおよび抗体フラグメント；既知の細胞表面分子に結合する承認薬などが挙げられる。
式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）および（ＩＩｃ）の基Ｒ１〜Ｒ６または式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）および（ＩＩＩｃ）の基Ｒ２〜Ｒ５のいずれかがポリ(エチレングリコール)鎖である限りにおいて、該ポリ(エチレングリコール)鎖の好ましい分子量は、１００〜２０，０００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは１，０００〜１０，０００ｇ／ｍｏｌ、最も好ましくは１，０００〜５，０００ｇ／ｍｏｌである。
最も好ましい基（ＩＩ）は、式（ＩＩｄ）のオリゴ(アルキレンアミン)基である：
−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｈ （ＩＩｄ）
（ここで、式（ＩＩｄ）中で表示される１個以上の窒素原子は、プロトン化されてカチオン性ポリマーまたはデンドリマー構造を提供してもよい）。
最も好ましい基（ＩＩＩ）は、式（ＩＩＩｄ）のオリゴ(アルキレンアミン)基である：
−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ− （ＩＩＩｄ）
（ここで、式（ＩＩＩｄ）中で表示される１個以上の窒素原子は、プロトン化されてカチオン性ポリマーまたはデンドリマー構造を提供してもよい）。
上で指摘したように、本発明の好ましい一実施形態の（医薬）組成物で使用することができるリピドイドは、式（ＩＶ）の構造を有する：
Ｒ１−ＮＲ２{ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ３−[ＣＨ２−(ＣＨ２)ｂ−ＮＲ４]ｐ}ｍ−[ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ５]ｎ−Ｒ６ （ＩＶ）
（式中、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎおよびＲ１〜Ｒ６は、下で定義する通りであり：
ａは１であり且つｂは２〜４の整数であるか；または、ａは２〜４の整数であり且つｂは１であり、
ｐは１または２であり、
ｍは１または２であり；ｎは０または１であり且つｍ＋ｎ≧２であり；
Ｒ１〜Ｒ６は、互いに独立して、水素；基−ＣＨ２−ＣＨ(ＯＨ)−Ｒ７、−ＣＨ(Ｒ７)−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−Ｏ−Ｒ７、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−ＮＨ−Ｒ７もしくは−ＣＨ２−Ｒ７（式中、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルもしくは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）；アミノ基の保護基；−Ｃ(ＮＨ)−ＮＨ２；ポリ(エチレングリコール)鎖；および受容体リガンドから選択され；ただし、Ｒ１〜Ｒ６のうちの少なくとも２つの残基は、基−ＣＨ２−ＣＨ(ＯＨ)−Ｒ７、−ＣＨ(Ｒ７)−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−Ｏ−Ｒ７、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−ＮＨ−Ｒ７もしくは−ＣＨ２−Ｒ７（式中、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルもしくは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）である）。好ましくは、Ｒ１〜Ｒ６は、独立して、水素；基−ＣＨ２−ＣＨ(ＯＨ)−Ｒ７もしくは−ＣＨ(Ｒ７)−ＣＨ２−ＯＨ（式中、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルもしくは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）；アミノ基の保護基；およびポリ(エチレングリコール)鎖から選択され；ただし、Ｒ１〜Ｒ６のうちの少なくとも２つの残基は、基−ＣＨ２−ＣＨ(ＯＨ)−Ｒ７もしくは−ＣＨ(Ｒ７)−ＣＨ２−ＯＨ（式中、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルもしくは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）である。より好ましくは、Ｒ１〜Ｒ６は、独立して、水素；基−ＣＨ２−ＣＨ(ＯＨ)−Ｒ７もしくは−ＣＨ(Ｒ７)−ＣＨ２−ＯＨ（式中、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１６アルキルもしくは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１６アルケニルから選択される）から選択され；ただし、Ｒ１〜Ｒ６のうちの少なくとも２つの残基は、基−ＣＨ２−ＣＨ(ＯＨ)−Ｒ７もしくは−ＣＨ(Ｒ７)−ＣＨ２−ＯＨ（式中、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルもしくは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）である。より一層好ましくは、Ｒ１〜Ｒ６は、独立して、水素；基−ＣＨ２−ＣＨ(ＯＨ)−Ｒ７もしくは−ＣＨ(Ｒ７)−ＣＨ２−ＯＨ（式中、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１６アルキルもしくは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１６アルケニルから選択される）から選択され；且つＲ２〜Ｒ５は、全て、基−ＣＨ２−ＣＨ(ＯＨ)−Ｒ７または−ＣＨ(Ｒ７)−ＣＨ２−ＯＨ（式中、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１６アルキルもしくは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１６アルケニルから選択される）である一群である。好ましくは、Ｒ７は、Ｃ８〜Ｃ１６アルキルもしくは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ８〜Ｃ１８アルケニルから、より好ましくはＣ８〜Ｃ１２アルキルもしくは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ８〜Ｃ１２アルケニルから、最も好ましくはＣ１０〜Ｃ１２アルキルもしくは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ１０〜Ｃ１２アルケニルから、選択される。
式（ＩＶ）中で表示される１個以上の窒素原子は、プロトン化されて、式（ＩＶ）のカチオン性リピドイドを提供してもよい。
上記式（ＩＶ）に従って、アルキレンアミン単位は、−Ｓ−Ｌ−Ｌ−Ｓ−または−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−（Ｓは短いエチレンアミン単位を表し、Ｌは長いアルキレンアミン単位を表す）の種類のオリゴ(アルキレンアミン)部分が生じ得るように、１回交互鎖で繰り返してもよい。しかしながら、式（ＩＶ）の好ましい基は、短い単位または長い単位が二つ組で現れないように、繰り返しが起こらない、すなわちｐが１であるものである。言い換えると、式（ＩＶ）の基は、好ましくは式（ＩＶａ）のリピドイドである：
Ｒ１−ＮＲ２{ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ３−ＣＨ２−(ＣＨ２)ｂ−ＮＲ４}ｍ−[ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ５]ｎ−Ｒ６ （ＩＶａ）
（式中、ａ、ｂ、ｍ、ｎおよびＲ１〜Ｒ６は、好ましい実施形態を含め、式（ＩＶ）で定義する通りであり、式（ＩＶａ）中で表示される１個以上の窒素原子はプロトン化されて、カチオン性リピドイドを提供してもよい）。
更に、ｎが１である式（ＩＶ）のリピドイドが一般に好ましく、より好ましくはｍが１であり且つｎが１であるものである。よって、特に好ましくは、式（ＩＶ）のリピドイドが式（ＩＶｂ）のリピドイドである：
Ｒ１−ＮＲ２−ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ３−ＣＨ２−(ＣＨ２)ｂ−ＮＲ４−ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ５−Ｒ６ （ＩＶｂ）
（式中、ａ、ｂおよびＲ１〜Ｒ６は、好ましい実施形態を含め、式（ＩＶ）で定義する通りであり、式（ＩＶｂ）中で表示される１個以上の窒素原子はプロトン化されて、カチオン性リピドイドを提供してもよい）。
式（ＩＶ）、（ＩＶａ）および（ＩＶｂ）のリピドイド中のアルキレンアミン単位の長さに関して、交互単位の一つはエチレンアミン単位である必要がある（すなわち、ａまたはｂの一方が１でなければならない）ことが理解される。他の交互単位は、プロピレンアミン単位、ブチレンアミン単位またはペンチレンアミン単位（すなわち、他の一方のａまたはｂが２〜４の整数）であり得る。好ましくは、他の一方のａまたはｂが２または３であり、より好ましくは、ａが１であり且つｂが２であるか、またはａが２であり且つｂが１である。従って、より一層好ましい式（ＩＶ）のリピドイドは式（ＩＶｃ）のリピドイドである：
Ｒ１−ＮＲ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ４−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ５−Ｒ６ （ＩＶｃ）
（式中、Ｒ１〜Ｒ６は、好ましい実施形態を含め、式（ＩＶ）で定義する通りであり、式（ＩＶｃ）中で表示される１個以上の窒素原子はプロトン化されて、カチオン性リピドイドを提供してもよい）。
式（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）および（ＩＶｃ）の基Ｒ１〜Ｒ６が例えば特許文献５に記載されるようなアミノ基の保護基である限りにおいて、それらの好ましい実施形態は、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、またはカルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）である。
式（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）および（ＩＶｃ）の基Ｒ１〜Ｒ６が受容体リガンドである限りにおいて、有用な例は、フィリップおよびワグナーの「遺伝子および細胞療法−治療のメカニズムおよび戦略」第３版、第１５章（ＣＲＣ出版、テイラーアンドフランシスグループ社、ボーカラトーン、２００９年）に示されている。肺組織に好ましい受容体リガンドは、フェイファーらの文献（Ther. Deliv. 1(1):133-48）に記載されている。好ましい受容体リガンドとしては、ペプチドライブラリーを特定の細胞表面構造体もしくは特定の細胞型への結合についてスクリーニングして得られるような、合成の環状または直鎖状のペプチド；環状または直鎖状のＲＧＤペプチド；シアル酸、ガラクトースもしくはマンノースのような合成もしくは天然の炭水化物、または炭水化物の、例えばペプチドとの反応によって得られる合成リガンド；細胞表面構造体を特異的に認識する抗体；葉酸、上皮増殖因子およびそれらの誘導ペプチド；トランスフェリン；抗トランスフェリン受容体抗体、ナノボディおよび抗体フラグメント；既知の細胞表面分子に結合する承認薬などが挙げられる。
式（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）および（ＩＶｃ）の基Ｒ１〜Ｒ６がポリ(エチレングリコール)鎖である限りにおいて、該ポリ(エチレングリコール)鎖の好ましい分子量は、１００〜２０，０００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは１，０００〜１０，０００ｇ／ｍｏｌ、最も好ましくは１，０００〜５，０００ｇ／ｍｏｌである。
上で示すように、式（Ｉ）ならびにその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）、（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｄ）および（ＩＶａ）〜（ＩＶｄ）を含む）中で表示される１個以上の窒素原子は、プロトン化されて、カチオン形態、典型的にはオリゴカチオン形態もしくはポリカチオン形態の、オリゴマーまたはポリマーまたはリピドイドを生じ得る。式（Ｉ）ならびにその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）、（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｄ）および（ＩＶａ）〜（ＩＶｄ）を含む）の基の一級および／または二級および／または三級アミノ基は、特に、水および生理液を含む水溶液中で、プロトンアクセプターとして作用することができる。よって、本発明のオリゴマー、ポリマーおよびリピドイドは、典型的に、７．５を下回るｐＨの水溶液中で全体として正電荷を有する。本明細書中で称する水溶液は、溶媒が、５０％（体積／体積）以上の水、好ましくは８０％または９０％以上の水、最も好ましくは１００％の水を含む溶液である。また、本発明の（医薬）組成物が、例えば血液および肺液などを含む、７．５を下回るｐＨを有する生理液と接触している場合、式（Ｉ）ならびにその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）、（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｄ）および（ＩＶａ）〜（ＩＶｄ）を含む）の基は、典型的に、プロトン化されたアミノ基を１個以上含有する。これら化合物のｐＫａ値は、自動ｐＫａ滴定装置を用いた酸−塩基滴定によって決定することができる。次いで、所定のｐＨ値での正味荷電は、ヘンダーソン−ハッセルバルヒの式から計算することができる。ゲオールらによると（J. Geall et al. 1998, Chem Commun, 1403-1404）、全ての電荷は幾つかの塩基性中心によって共有され、一点に起することができないことを認識することが、重要である。１，９−ジアミノ−３，７−ジアザノナン(プロピル／エチル／プロピル)は、例えば、９．３、７．６および５．７のｐＫａを有し、このことは、生理的ｐＨでアミノ基の実質的な画分がプロトン化および非プロトン化の状態であることを意味する。
しかしながら、当業者には理解されるように、本発明で使用されるオリゴマー、ポリマーおよびリピドイドならびに本発明の（医薬）組成物は、該オリゴマー、ポリマーまたはリピドイドをカチオン体で含有する乾燥した塩の形態としても提供され得る。
更に理解されるように、オリゴマー、ポリマーまたはリピドイドとＲＮＡとを含む本発明の（医薬）組成物におけるプロトン化されたアミノ基の正電荷に対する対イオン（アニオン）は、典型的に、該ＲＮＡ中に含有されるアニオン部分によって提供される。該正に帯電した基が、前記ＲＮＡ中のアニオン部分と比べて過剰に存在する場合、正電荷は、生理液中で典型的に遭遇するＣｌ−またはＨＣＯ３ −のような他のアニオンによって平衡を保たれ得る。
本発明の内容上の使用に好適なオリゴ(アルキレンアミン)は、既知の化学物質供給業者から商業的に取得してもよく、または本技術分野で既知の方法（例えば、van Alphen 1936, Recueil des Travaux Chimiques des Pays-Bas, 55, 835-840）によって合成してもよい。必要とされ得るいかなる修飾も、標準的な化学合成法によって達成することができる。
［オリゴマー／ポリマー構造］
上で示したように、式（Ｉ）およびその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）および（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｄ）を含む）の基は、様々なオリゴマーもしくはポリマー骨格構造に結合されてもよく、または様々なオリゴマーもしくはポリマー骨格構造を提供してもよい。
一般に、複数の式（ＩＩ）もしくはその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）を含む）の基を含むオリゴマーまたはポリマーは、複数の式（ＩＩ）もしくはその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）を含む）の基を側鎖および／または末端基として持つポリマー骨格とも呼ぶことができる。複数の式（ＩＩ）もしくはその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）を含む）の基を側鎖または末端基として持ち得るポリマー骨格は、直鎖状、分枝状または被架橋ポリマーおよびに樹枝状ポリマー（デンドリマー）を含む。前記ポリマーは、合成ポリマーまたは生体高分子を含む。好ましくは、直鎖状または分枝状のポリマー骨格構造である。これは、式（ＩＩ）もしくはその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）を含む）の基を側鎖または末端基として持つオリゴマーにも同様に適用され、違いは、ポリマー骨格が典型的に１０個以上の反復単位を含む一方で、オリゴマー骨格は２〜９個、好ましくは３〜９個の反復単位を含むことである。一般に、複数の式（ＩＩ）もしくはその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）を含む）の基を側鎖または末端基として含むオリゴマーまたはポリマーの中では、ポリマーが好ましい。
式（ＩＩ）もしくはその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）を含む）の側鎖または末端基は、本発明のポリマーを提供するために、既知の化学的な官能性および反応を用いて、好都合にポリマーまたはオリゴマー骨格にグラフトすることができる。当業者に理解されるように、「ポリマーまたはオリゴマーにグラフトする」という用語は、重合反応に先立って前記側鎖がモノマーに結合されるという選択肢を排除しない。式（ＩＩ）の自由電子価によって示されるように、前記側鎖または末端基は、共有結合を解してポリマーまたはオリゴマー骨格に結合されている。
更に、本明細書中で用いられる「ポリマー」および「オリゴマー」という用語は、ラジカル重合、アニオン重合またはカチオン重合を含む重付加反応および重縮合反応のような広範な反応によって得ることができるポリマーおよびオリゴマー、ならびに、段階的カップリング反応（例えば、段階的成長プロセス）によって得ることができるポリマーおよびオリゴマーを包含することが理解されるであろう。
よって、複数の式（ＩＩ）もしくはその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）を含む）の基を側鎖または末端基として持つポリマーまたはオリゴマー骨格として好適なポリマーまたはオリゴマーとしては、ポリアミド、ポリエステル、炭素鎖骨格を有するポリマー、および多糖のようなポリマーまたはオリゴマーが挙げられる。例示的なポリマーまたはオリゴマー骨格は、ポリ(グルタミン酸)およびポリ(アスパラギン酸)のような、複数のグルタミン酸単位もしくはアスパラギン酸単位を含むポリ(アミノ酸)、タンパク質、ポリアルキン、ポリアミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリマレイン酸、ポリスルホネート、ポリスチレンスルホネート、ポリホスフェート、ペントサンポリサルフェート、ポリ(ビニルリン酸)、ポリ(ブタジエン−ｃｏ−マレイン酸)、ポリ(エチルアセテート−ｃｏ−アクリル酸)、ポリ(エチレン−ｃｏ−アクリル酸)、ポリ(エチレン−ｃｏ−マレイン酸無水物)、ポリ(メチルメタクリレート−ｃｏ−メタクリル酸)、ポリ(メチルメタクリレート−ｃｏ−メタクリル酸)、ポリ(スチレンスルホン酸−ｃｏ−マレイン酸)、ポリ(塩化ビニル−ｃｏ−酢酸ビニル−ｃｏ−マレイン酸)、炭水化物、例えば、一般に、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ポリ(グルクロン酸)、ポリ(ガラクトウロン酸)、ヒアルロン酸、ポリ(ウロン酸)、またはカルボキシ末端デンドリマーによって提供される。その中でも、ポリ(グルタミン酸)およびポリ(アスパラギン酸)のような複数のグルタミン酸もしくはアスパラギン酸単位を含むポリ(アミノ酸)、ならびにポリ(メタ)アクリル酸が、好ましい。本発明の目的のために最も好ましいのは、ポリアクリル酸およびポリメタクリル酸である。
好ましくは、前記ポリマー骨格の重合度（ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）などで測定した重合単位の平均数換算）は、１０〜１０，０００、好ましくは５０〜５，０００である。
本発明のポリマーは、ホモポリマーまたはコポリマーによって与えられてもよい。コポリマーは、該ポリマー骨格がコポリマーであるように、異なる構造を有する重合単位を複数含有してもよい。あるいは、コポリマーは、ポリマー骨格としてホモポリマーに基づいて得られ、その重合単位の全てが式（ＩＩ）もしくはその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）を含む）の基を持つわけではなくてもよい。コポリマー骨格において一定のパーセンテージの重合単位に側鎖をグラフトすることによって、これら２つの代替物を組み合わせる選択肢も存在することが理解されるであろう。コポリマーは、ランダムコポリマー、グラジエントコポリマーまたはブロックコポリマーの形態でもよい。
本発明のポリマーがホモポリマーである場合、全ての重合単位が式（ＩＩ）もしくはその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）を含む）の基を持つ。本発明のポリマーがコポリマーである場合、重合単位全体の５〜１００％が式（ＩＩ）もしくはその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）を含む）の基を持つことが好ましく、より好ましくは２５〜１００％、特には５０〜１００％が式（ＩＩ）もしくはその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）を含む）の基を持つ。前記パーセンテージは、式（ＩＩ）の基を持つ重合単位の数に関し、重合単位全体に対して定められる。
上記コポリマーは、式（ＩＩ）もしくはその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）を含む）の基に加えて、側鎖または末端基を含有する他のアミンを含有してもよい。しかしながら、本発明のポリマーは、式：−ＮＨ−(ＣＨ２)ｘ−(ＮＨ(ＣＨ２)２)ｙ−ＮＨ２（式中、ｘは１〜５の整数を表し、ｙは１〜５の整数を表す）の側鎖または末端基を含まないことが好ましい。
式（ＩＩ）もしくはその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）を含む）の側鎖を持つ好ましいポリアミドは、式（Ｖ）の反復単位を含有する：
（Ｖ）
（式中、変数は、下記の意味を有する：
Ｒ８およびＲ９は、独立して、結合およびＣ１〜Ｃ６アルカンジイルから選択され；
Ｒ１０は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ１１は、結合およびＣ１〜Ｃ６アルカンジイルから選択され；
Ｌ１は、二価連結基であり；
Ａ１は、式（ＩＩ）のオリゴ(アルキレンアミン)基を表す）。
好ましくは、Ｒ８およびＲ９は、独立して、結合およびＣ１〜Ｃ５アルカンジイルから選択され、より好ましくは結合である。好ましくは、Ｒ１０は、Ｈおよびメチルから選択され、最も好ましくはＨである。Ｒ１１は、好ましくはＣ１〜Ｃ６アルカンジイルである。
連結基Ｌ１は、好ましい実施形態では、構造：−Ｚ１−Ｒ’−Ｚ２−であり、ここで、Ｚ１は、結合、−ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−、−ＮＨ−Ｃ(Ｓ)−ＮＨ−、 −ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｓ(Ｏ)２−、−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ(ＯＨ)−、−ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−Ｏ−、−ＮＨ−Ｃ(ＮＨ)−、−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−、−Ｓ−Ｓ−、−チオエーテル結合−、−Ｓ−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−、−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ−ＮＨ２−、および−アリールチオエーテル結合−から選択され；Ｒ’は、結合、Ｃ１〜Ｃ６アルカンジイルおよび−(ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ)ｎ−Ｈ（ｎは１〜３である）から選択され；Ｚ２は、結合、−(Ｃ＝Ｏ)−、−ＮＨ−Ｃ(Ｓ)−、−ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−、−Ｓ(Ｏ)２−、−Ｏ−Ｐ(Ｏ)２−、−ＣＨ(ＯＨ)−ＣＨ２、−Ｏ−(Ｃ＝Ｏ)−および−Ｃ(ＮＨ)−から選択される。好ましくは、Ｚ１が、結合、−ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−、−ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−ＮＨ−、−ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−Ｏ−および−ＮＨ−Ｃ(ＮＨ)−から選択され；Ｒ’が、結合およびＣ１〜Ｃ６アルカンジイルから選択され；Ｚ２が、結合、−(Ｃ＝Ｏ)−、−ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−および−Ｏ−(Ｃ＝Ｏ)−から選択され；ただし、Ｚ１およびＺ２のうちの一方は、結合でない。Ｌ１について最も好ましくは、Ｚ１およびＲ’が結合であり且つＺ２が−(Ｃ＝Ｏ)−であるか、またはＺ１が−ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−であり、Ｒ’がＣ１〜Ｃ６アルカンジイルであり且つＺ２が−(Ｃ＝Ｏ)−である。
Ａ１は、本明細書中で式（ＩＩ）のオリゴ(アルキレンアミン)基について規定される好ましい実施形態のうちの１つ、具体的には、式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）の基の１つであることが好ましい。
式（Ｖ）の反復単位を含有する好ましいポリアミドでは、好ましくは重合単位全体の５〜１００％、より好ましくは２５〜１００％、具体的には５０〜１００％が、式（Ｖ）の単位である。前記パーセンテージは、式（Ｖ）の単位の数に関し、重合単位全体に対して定められる。式（Ｖ）の変数について定められた上記定義および好ましい定義の中において、式（Ｖ）の反復単位は、本発明の好ましいポリマーにおいて同一であってもよく異なっていてもよい。
本発明での用途に特に好ましいポリアミンポリマーは、式（Ｖａ）および（Ｖｂ）のポリマーである。
（Ｖａ）
（Ｖｂ）
これら式中、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｌ１およびＡ１は、その好ましい実施形態も含め、式（Ｖ）について定義した通りである。Ｒ１２は、ＯＨもしくはＣ１〜Ｃ６アルコキシ、−ＮＨ２、ポリ(エチレングリコール)鎖、または受容体リガンドから選択される。Ｒ１３は、Ｈ、アミノ基の保護基、ポリ(エチレングリコール)鎖、または受容体リガンドである。Ｘ１は、Ｈ、−ＮＨ２、−ＣＯＯＨおよび−ＣＯＯＲ”（Ｒ”は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ポリ(エチレングリコール)鎖、または受容体リガンドである）から選択される。式（Ｖａ）では、ｓ（平均重合単位数を示し、例えばゲル浸透クロマトグラフィー(ＧＰＣ)で測定される）は、１０〜１０，０００、好ましくは５０〜５，０００である。式（Ｖｂ）では、括弧内の単位は、反復単位であり、ポリマー中いかなる順序で配置することもできる（具体的には、ランダム、交互またはブロック様の配置を含む）。ｑとｒの和（ｑ＋ｒ）（平均重合単位数を示し、例えばゲル浸透クロマトグラフィー(ＧＰＣ)で測定される）は、１０〜１０，０００、好ましくは５０〜５，０００であり、ｑ／(ｑ＋ｒ)の比は、０．０５〜１であり、好ましくは０．２５〜１であり、より好ましくは０．５〜１である。
式（ＩＩ）またはその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）を含む）の側鎖によって好都合に修飾することができる、例示的な好ましいポリ(アミノ酸)は、ポリ(グルタミン酸)、ポリ(アスパラギン酸)、ポリリジン、ポリオルニチンまたは、グルタミン酸単位、アスパラギン酸単位、オルニチン単位および／もしくはリジン単位を含有するポリ(アミノ酸)である。より好ましくは、ポリ(グルタミン酸)である。
式（ＩＩ）またはその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）を含む）の側鎖を持つ炭素鎖骨格を有する好ましいポリマーは、式（ＶＩ）の反復単位を含有する：
（ＶＩ）
（式中、変数は、下記の定義を有する：
Ｒ１４およびＲ１５は、独立して、結合およびＣ１〜Ｃ６アルカンジイルから選択され；
Ｒ１６は、ＨおよびＣ１〜Ｃ６アルキルから選択され；
Ｒ１７は、結合およびＣ１〜Ｃ６アルカンジイルから選択され；
Ｌ２は、二価連結基であり；
Ａ１は、式（ＩＩ）のオリゴ(アルキレンアミン)基を表す）。
好ましくは、Ｒ１４が結合であり且つＲ１５が結合または−ＣＨ２−である。より好ましくは、Ｒ１４が結合であり且つＲ１５が−ＣＨ２−である。好ましくは、Ｒ１６がＨおよびメチルから選択される。Ｒ１７は好ましくは結合または−ＣＨ２−である。
連結基Ｌ２は、好ましい実施形態では、構造：−Ｚ３−Ｒ’−Ｚ４−であり、ここで、Ｚ３は、結合、−ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−、−ＮＨ−Ｃ(Ｓ)−ＮＨ−、 −ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｓ(Ｏ)２−、−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ(ＯＨ)−、−ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−Ｏ−、−ＮＨ−Ｃ(ＮＨ)−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−、−チオエーテル結合−、−Ｓ−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−、−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ−ＮＨ２−、および−アリールチオエーテル結合−から選択され；Ｒ’は、結合、Ｃ１〜Ｃ６アルカンジイルおよび−(ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ)ｎ−Ｈ（ｎは１〜３である）から選択され；Ｚ４は、結合、−(Ｃ＝Ｏ)−、−ＮＨ−Ｃ(Ｓ)−、−ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−、−Ｓ(Ｏ)２−、−Ｏ−Ｐ(Ｏ)２−、−ＣＨ(ＯＨ)−ＣＨ２、−Ｏ−(Ｃ＝Ｏ)−および−Ｃ(ＮＨ)−から選択される。好ましくは、Ｚ３が、結合、−ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−、−ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−ＮＨ−、−ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−Ｏ−および−ＮＨ−Ｃ(ＮＨ)−から選択され；Ｒ’が、結合およびＣ１〜Ｃ６アルカンジイルから選択され；Ｚ４が、結合、−(Ｃ＝Ｏ)−、−ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−および−Ｏ−(Ｃ＝Ｏ)−から選択され；ただし、Ｚ３およびＺ４のうちの一方は、結合でない。Ｌ２について最も好ましくは、Ｚ３およびＲ’が結合であり且つＺ４が−(Ｃ＝Ｏ)−である。
Ａ１は、本明細書中で式（ＩＩ）のオリゴ(アルキレンアミン)基について規定される好ましい実施形態のうちの１つ、具体的には、式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）の基の１つであることが好ましい。
式（ＶＩ）の反復単位を含有する好ましいポリアミドでは、好ましくは重合単位全体の５〜１００％、より好ましくは２５〜１００％、具体的には５０〜１００％が、式（ＶＩ）の単位である。前記パーセンテージは、式（ＶＩ）の単位の数に関し、重合単位全体に対して定められる。式（ＶＩ）の変数について定められた上記定義および好ましい定義の中において、式（ＶＩ）の反復単位は、本発明の好ましいポリマーにおいて同一であってもよく異なっていてもよい。
式（ＩＩ）またはその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）を含む）の側鎖を持つ炭素鎖骨格を有するポリマーとして特に好ましくは、式（ＶＩａ）および（ＶＩｂ）のポリマーである。
（ＶＩａ）
（ＶＩｂ）
これらの式中、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｌ２およびＡ１は、その好ましい実施形態も含め、式（ＶＩ）について定義した通りである。Ｘ２は、−ＣＯＯＨおよび−ＣＯＯＲ”（Ｒ”は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ポリ(エチレングリコール)鎖、または受容体リガンドである）から選択される。式（ＶＩａ）では、ｓ（平均重合単位数を示し、例えばゲル浸透クロマトグラフィー(ＧＰＣ)で測定される）は、１０〜１０，０００、好ましくは５０〜５，０００である。式（ＶＩｂ）では、括弧内の単位は、反復単位であり、ポリマー中いかなる順序で配置することもできる（具体的には、ランダム、交互またはブロック様の配置を含む）。ｑとｒの和（ｑ＋ｒ）（平均重合単位数を示し、例えばゲル浸透クロマトグラフィー(ＧＰＣ)で測定される）は、１０〜１０，０００、好ましくは５０〜５，０００であり、ｑ／(ｑ＋ｒ)の比は、０．０５〜１であり、好ましくは０．２５〜１であり、より好ましくは０．５〜１である。
式（ＩＩ）またはその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）を含む）の側鎖によって好都合に修飾することができる、例示的な好ましい炭素鎖骨格を有するポリマーは、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸またはポリマレイン酸であり、より好ましくはポリアクリル酸およびポリメタクリル酸である。
式（ＩＩ）またはその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）を含む）の側鎖を持つ好ましい多糖は、式（ＶＩＩ）の反復単位を含有する：
（ＶＩＩ）
（式中、変数の定義は下記の通りである：
Ｒ１９およびＲ２２は、独立して、結合および−(ＣＨ)２−から選択され；ｔは０または１であり；Ｒ１８、Ｒ２０およびＲ２１のうちの１つは、−Ｌ３−Ａ１（ここで、Ｌ３は、二価連結基であり、Ａ１は式、（ＩＩ）のオリゴ(アルキレンアミン)基を表す）を表し、残りは、独立して、−Ｈ、−ＯＨおよび−(ＣＨ２)ｎ−ＯＨ（ｎは１または２である）から選択される）。
好ましくは、Ｒ１９およびＲ２２が結合である。好ましくは、Ｒ１８、Ｒ２０およびＲ２１のうちの１つが、−Ｌ３−Ａ１（ここで、Ｌ３は、二価連結基であり、Ａ１は式、（ＩＩ）のオリゴ(アルキレンアミン)基を表す）を表し、残りは、−ＯＨである。
連結基Ｌ３は、好ましい実施形態では、構造：−Ｚ５−Ｒ’−Ｚ６−であり、ここで、Ｚ５は、結合、−ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−、−ＮＨ−Ｃ(Ｓ)−ＮＨ−、 −ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｓ(Ｏ)２−、−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ(ＯＨ)−、−ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−Ｏ−、−ＮＨ−Ｃ(ＮＨ)−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−、−チオエーテル結合−、−Ｓ−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−、−Ｓ−、−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ−ＮＨ２−、および−アリールチオエーテル結合−から選択され；Ｒ’は、結合、Ｃ１〜Ｃ６アルカンジイルおよび−(ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ)ｎ−Ｈ（ｎは１〜３である）から選択され；Ｚ６は、結合、−(Ｃ＝Ｏ)−、−ＮＨ−Ｃ(Ｓ)−、−ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−、−Ｓ(Ｏ)２−、−Ｏ−Ｐ(Ｏ)２−、−ＣＨ(ＯＨ)−ＣＨ２、−Ｏ−(Ｃ＝Ｏ)−および−Ｃ(ＮＨ)−から選択され；ただし、Ｚ５およびＺ６のうちの一方は、結合でない。好ましくは、Ｚ５が、結合、−ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−、−ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−ＮＨ−、−ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−Ｏ−および−ＮＨ−Ｃ(ＮＨ)−から選択され；Ｒ’が、結合およびＣ１〜Ｃ６アルカンジイルから選択され；Ｚ６が、結合、−(Ｃ＝Ｏ)−、−ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−および−Ｏ−(Ｃ＝Ｏ)−から選択され；ただし、Ｚ５およびＺ６のうちの一方は、結合でない。Ｌ３について最も好ましくは、Ｚ５およびＲ’が結合であり且つＺ６が−(Ｃ＝Ｏ)−である。
Ａ１は、本明細書中で式（ＩＩ）のオリゴ(アルキレンアミン)基について規定される好ましい実施形態のうちの１つ、特に、式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）の基の１つであることが好ましい。
式（ＶＩＩ）の反復単位を含有する好ましい多糖では、好ましくは重合単位全体の５〜１００％、より好ましくは２５〜１００％、具体的には５０〜１００％が、式（ＶＩＩ）の単位である。前記パーセンテージは、式（ＶＩＩ）の単位の数に関し、重合単位全体に対して定められる。式（ＶＩＩ）の変数について定められた上記定義および好ましい定義の中において、式（ＶＩＩ）の反復単位は、本発明の好ましいポリマーにおいて同一であってもよく異なっていてもよい。
式（ＩＩ）またはその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）を含む）の側鎖を持つ多糖として特に好ましいのは、式（ＶＩＩａ）のポリマーである。
（ＶＩＩａ）
式中、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２およびｔは、その好ましい実施形態も含め、式（ＶＩＩ）について定義した通りである。ｓ（平均重合単位数を示し、例えばゲル浸透クロマトグラフィー(ＧＰＣ)で測定される）は、１０〜１０，０００、好ましくは５０〜５，０００である。
式（ＩＩ）またはその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）を含む）の側鎖によって好都合に修飾することができる、多糖骨格を有する例示的なポリマーは、デンプン、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、セルロース、デキストラン、デキストリン、シクロデキストリン、キチン、キトサン、イヌリン、プルラン、スクレログルカン、カードラン、カロース、ラミナリン、クリソラミナリン、キシラン、アラビノキシラン、マンナン、フコイダンおよびガラクトマンナン、プロテオグリカン、ポリグルクロナン、ポリグルクロナン、セロウロン酸、キトウロン酸、ポリウロン酸、ペクチン、グルコサミノグリカン、へパリン、へパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸、寒天、アルギン酸塩、アルギン酸、アラビアガム、カラギーナン、フコイダン、フコガラクタン、オクタアセチルキトビオース、ウンデカアセチルキトトリオース、マルトオリゴサッカライドである。好ましくは、キトサン、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン、デキストリン、シクロデキストリン類（α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、およびδ−シクロデキストリン）である。
修飾されて、その分枝状構造に、複数の式（ＩＩ）またはその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）を含む）の末端基を含有することができる様々なデンドリマー構造は、本技術分野で既知であり、例えば、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）（Tomalia et al. 1990, Angew. Chem. Int. Edn. Engl. 29, 138-175）または被破砕（ｆｒａｃｔｕｒｅｄ）ＰＡＭＡＭ（Tang et al, 1996, Bioconjug. Chem. 7, 703-714）、ポリアミン（Hawker et al. 1990, J. Am. Chem. Soc. 112, 7638-7647）、ポリアミド（ポリペプチド）（Sadler et al. 2002, J. Biotechnol. 90, 195-229）、ポリ(アリールエステル)（Hawker et al. 1990, J. Am. Chem. Soc. 112, 7638-7647）、ポリエステル（Ihre et al. 1996, J. Am. Chem. Soc. 118, 6388-6395; Grinstaff et al. 2002, Chemistry 8, 2838-2846）、炭水化物（Turnbull et al. 2002, J. Biotechnol. 90, 231-255）、ＤＮＡ（Nilsen et al. 1997, J. Theor. Biol. 187, 273-284; Li et al., 2004, Nat. Mater. 3, 38-42）、脂質（Ewert et al. 2006, Bioconjug Chem. 17, 877-88）、ポリ(エーテルイミン)（Thankappan et al. 2011, Bioconjug Chem. 22, 115-9.）、トリアジン（Lim et al. 2012, Adv Drug Deliv Rev. 15, 826-35）およびポリグリセロール（Fischer et al. 2010, Bioconjug Chem. 21, 1744-52）が報告されている。
複数の式（ＩＩ）またはその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）を含む）の基を末端基として含むオリゴマーは、複数の式（ＩＩ）またはその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）を含む）の基の結合に適した官能基を提供する多官能性コア構造体に、複数の当該基が末端基として共有結合されているオリゴマーを包含することも理解されるであろう。これら多官能性コア構造体として、具体的には、二価、三価もしくは更に高い価のカルボン酸またはポリアミンが挙げられる。必要に応じて、前記多官能性コア構造体の官能基は、式（ＩＩ）またはその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）を含む）の基の結合を可能にするために、活性化されてもよく、または連結基と反応させられてもよい。修飾されて複数の当該基を有することができる例示的な分枝状コア構造体は、下記の式（ＶＩＩＩａ）〜（ＶＩＩＩｇ）によって図示される。
（ＶＩＩＩａ）

（ＶＩＩＩｂ）
（ＶＩＩＩｃ）

（ＶＩＩＩｄ）

（ＶＩＩＩｅ）
（ＶＩＩＩｆ）

（ＶＩＩＩｇ）
当業者に認知されるように、式（ＩＩ）またはその好ましい実施形態（式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）を含む）を側鎖および／または末端基として含むポリマーまたはオリゴマーは、様々な合成経路によって、カップリング化学反応を受け入れられる官能基を含むまたは含むように修飾されたポリマー骨格にオリゴ(アルキレンアミン)をカップリングすることで、容易に得ることができる。そのような官能基としては、−ＣＯＯＨ、−ＣＯ−、−ＣＨＯ、−ＳＯ３Ｈ、−ＰＯ４Ｈ、−ＮＨ−、−ＮＨ２、−ＯＨまたは−ＳＨが挙げられる。理解されるように、好適なモノマーをその重合に先だって式（ＩＩ）の基で修飾して、式（ＩＩ）の側鎖および／または末端基を含有する本発明のポリマーまたはオリゴマーを提供することも可能であり得る。しかしながら、ポリマーの修飾が、一般に好ましい。
例えば、親ポリマー（すなわち、本発明のポリマーにおいてポリマー骨格を提供しているポリマー）は、必要に応じて、例えば、カルボジイミドを用いた活性化と、それに続く下記式（プレＩＩ）（式中、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎおよびＲ２〜Ｒ６は、式（ＩＩ）について定義する通りである）のオリゴ(アルキレンアミン)とのアミド結合形成とによって、直接カップリングを受け入れて式（ＩＩ）の側鎖および／または末端基を提供する、カルボン酸基を含む。
Ｈ−ＮＲ２{ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ３−[ＣＨ２−(ＣＨ２)ｂ−ＮＲ４]ｐ}ｍ−[ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ５]ｎ−Ｒ６ （プレＩＩ）
必要に応じて、式（プレＩＩ）の化合物は、その末端および／または内部のアミノ基の１個または全部を、例えば特許文献５に記載されるようなアミノ基の保護基、好ましくは、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、またはカルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）を用いて保護してもよい。
そのような反応は、架橋反応が所望されない場合、好ましくは、親ポリマーのカルボン酸基を上回る、過剰量の式（プレＩＩ）のオリゴ(アルキレンアミン)の反応性アミノ基の存在下で行われる。親ポリマーの性質に応じて、水性溶媒中または有機溶媒中でカップリング反応を行うことができる。好適なカップリング条件は、ペプチドおよびバイオコンジュゲート化学反応の技術分野で周知である（Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 2nd Edition, Academic Press 2008）。上述したように、好適なポリマー骨格としては、ポリ(グルタミン酸)およびポリ(アスパラギン酸)などの、複数のグルタミン酸またはアスパラギン酸単位を含むポリ(アミノ酸)に限定されず、タンパク質、ポリアルキン、ポリアミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリマレイン酸、ポリスルホネート、ポリスチレンスルホネート、ポリホスホネート、ペントサンポリサルフェート、ポリ(ビニルリン酸)、ポリ(ブタジエン−ｃｏ−マレイン酸)、ポリ(エチルアセテート−ｃｏ−アクリル酸)、ポリ(エチレン−ｃｏ−アクリル酸)、ポリ(エチレン−ｃｏ−マレイン酸無水物)、ポリ(メチルメタクリレート−ｃｏ−メタクリル酸)、ポリ(メチルメタクリレート−ｃｏ−メタクリル酸)、ポリ(スチレンスルホン酸−ｃｏ−マレイン酸)、ポリ(塩化ビニル−ｃｏ−酢酸ビニル−ｃｏ−マレイン酸)、炭水化物、例えば、一般に、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ポリ(グルクロン酸)、ポリ(ガラクトウロン酸)、ヒアルロン酸、ポリ(ウロン酸)など、またはカルボキシ末端デンドリマーが挙げられる。
本発明の他の実施形態について、式（ＩＩ）の側鎖および／または末端基を含むポリマーは、親ポリマーの還元的アミノ化によって得ることができる。炭水化物または糖は、アルデヒドへと酸化されて、続いてオリゴ(アルキルアミン)との反応によってイミンをもたらし、該イミンは、例えば、シアノホウ素化水素ナトリウムで還元することができ、アミンを生じることができる。
本発明の更なる一実施形態について、オリゴ(アルキルアミン)を、最初の工程で誘導体化して、例えば、親ポリマー中のヒドロキシル基およびアミノ基とカップリングし易い式（プレＩＩ’）のカルボキシ末端オリゴ(アルキルアミン)を生じることができる：
ＨＯＯＣ−(ＣＨ２)ｕ−Ｌ’−ＮＲ２{ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ３−[ＣＨ２−(ＣＨ２)ｂ−ＮＲ４]ｐ}ｍ−[ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ５]ｎ−Ｒ６ （プレＩＩ’）
（式中、ｕは１〜６の整数であり、Ｌ’は結合または−(ＣＨ)２−であり、他の変数は、式（ＩＩ）について定義する通りである）。必要に応じて、式（プレＩＩ）または（プレＩＩ’）の化合物中の末端および／または内部の全てのの二級アミノ基を、例えば特許文献５に記載されるような通常のアミノ基の保護基、好ましくは、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、またはカルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）を用いて保護してもよい。
この目的のため、オリゴ(アルキルアミン)を、ジカルボン酸無水物、ジカルボン酸またはアルデヒドと反応させて、構造体（プレＩＩ’）を生じることができる。前記構造体（プレＩＩ’）は、オリゴ(アルキレンアミン) （プレＩＩ）中のアミンに直交する保護基を提供することなく得ることができるが、そうすることが好まれ得る。構造体（プレＩＩ’）は、直接カップリングによって、例えば、ポリ(リジン)、ポリ(オルニチン)またはポリ(ビニルアミン)の修飾を可能にし、アミド結合の形成をもたらす。当該カップリング反応の完了に際して、全ての保護基を常法により除去することができる。得られたポリマーは、次いで、例えば、透析またはイオン交換もしくはサイズ排除もしくは逆相もしくは疎水性相互作用クロマトグラフィーによって、精製することができる。
中間体および最終生成物は、アミン保護基が除去された後で且つデンドリマーの場合は最終カップリング段階の前に、沈殿、透析またはサイズ排除クロマトグラフィーによって精製することができる。
複数の式（ＩＩＩ）またはその好ましい実施形態（式（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｄ）を含む）の反復単位を含有するポリマーまたはオリゴマーは、直線状、分枝状もしくは架橋ポリマー、または樹枝状ポリマー（デンドリマー）とすることができる。好ましくは、複数の式（ＩＩＩ）またはその好ましい実施形態（式（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｄ）を含む）の反復単位を含有するポリマーまたはオリゴマーは、該ポリマーまたはオリゴマー中の反復単位の総数に対して、式（ＩＩＩ）の単位の数に関し少なくとも２５％の、より好ましくは少なくとも４０％の該反復単位を含有する。特に好ましくは、複数の式（ＩＩＩ）またはその好ましい実施形態（式（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｄ）を含む）の反復単位を含有するポリマーまたはオリゴマーにおいて、全反復単位の５０％以上が、該反復単位である。分子によって提供される残りの反復単位は、式（ＩＩＩ）またはその好ましい実施形態（式（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｄ）を含む）の反復単位、特に、二価、三価または更に多価のカルボン酸から誘導された単位のカップリングを可能にする。
複数の式（ＩＩＩ）またはその好ましい実施形態（式（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｄ）を含む）の反復単位を含有するポリマーまたはオリゴマーは、式（プレＩＩＩ）：
Ｈ−ＮＲ２{ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ３−[ＣＨ２−(ＣＨ２)ｂ−ＮＲ４]ｐ}ｍ−[ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ５]ｎ−Ｒ６ （プレＩＩＩ）
（ここで、「プレ」は、式（ＩＩＩ）の前駆体である式（プレＩＩＩ）を示し、式中、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎおよびＲ２〜Ｒ５は、式（ＩＩＩ）について定義する通りであり、Ｒ６は、好ましい実施形態を含め、式（ＩＩ）について定義する通りである）の化合物を用いて、または好ましくは式（プレＩＩＩａ）〜（プレＩＩＩｄ）：
Ｈ−ＮＲ２{ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ３−ＣＨ２−(ＣＨ２)ｂ−ＮＲ４}ｍ−[ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ５]ｎ−Ｒ６ （プレＩＩＩａ）；
Ｈ−ＮＲ２−ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ３−ＣＨ２−(ＣＨ２)ｂ−ＮＲ４−ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ５−Ｒ６ （プレＩＩＩｂ）；
Ｈ−ＮＲ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ３−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ４−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＲ５−Ｒ６ （プレＩＩＩｃ）；
Ｈ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｈ （プレＩＩＩｄ）；
（式中、変数は、それぞれ、式（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）または（ＩＩＩｄ）で定義される通りである）の化合物を用いて、好都合に得てもよい。
末端アミン基を持つこれら化合物は、通常のカップリング反応を用いて、連結されて、直線状、分枝状もしくは架橋ポリマー、または樹枝状ポリマー（デンドリマー）を形成することができる。そのようなカップリング反応における反応体として使用することができる好適な化合物としては、二価、三価または更に多価のカルボン酸が挙げられる。例示的な化合物は、商業的に入手可能であり、それぞれ、式（プレＩＩＩ）、（プレＩＩＩａ）、（プレＩＩＩｂ）、（プレＩＩＩｃ）および（プレＩＩＩｄ）のリンカー化合物と反応することができ、下記式（ＶＩＩＩａ）〜（ＶＩＩＩｇ）によって例示される：
（ＶＩＩＩａ）
（ＶＩＩＩｂ）
（ＶＩＩＩｃ）
（ＶＩＩＩｄ）
（ＶＩＩＩｅ）
（ＶＩＩＩｆ）
(ＶＩＩＩｇ）
多価カルボン酸のジアミンとの直接反応は好都合に達成することができる一方、リンカー化合物は、カルボン酸基（またはその活性化形態）を提供するものに限定されないことが理解されるであろう。例えば、式（ＶＩＩＩｇ）の化合物は、コハク酸のようなジカルボン酸を用いて式（プレＩＩＩ）の化合物のジアミドが形成された後に、式（プレＩＩＩ）の化合物と反応することができる。
また、オリゴ(アルキレンアミン)を最初の工程で誘導体化して、例えば式（プレＩＩ’）の化合物の調製について上述するように、式（プレＩＩＩ'）のカルボキシ末端オリゴ(アルキレンアミン)を生じることができる：
ＨＯＯＣ−(ＣＨ２)ｕ−Ｌ”−ＮＲ２{ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ３−[ＣＨ２−(ＣＨ２)ｂ−ＮＲ４]ｐ}ｍ−[ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ５]ｎ−Ｒ６ （プレＩＩＩ’）
（式中、ｕは１〜６の整数であり、Ｌ”は結合または−(ＣＨ)２−であり、他の変数は、式（ＩＩＩ）について定義する通りである）。必要に応じて、式（プレＩＩＩ’）の化合物中の内部の全ての二級アミノ基を、例えば特許文献５に記載されるような通常のアミノ基の保護基、好ましくは、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、またはカルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）を用いて保護してもよい。残る末端アミノ基−ＮＲ５Ｒ６が、保護されてない形態で／カルボン酸基とアミド形成できる形態で存在する場合、式（プレＩＩＩ’）の化合物は、重合されてまたはオリゴマー形成されて、複数の式（ＩＩＩａ）のオリゴ(アルキレンアミン)基もしくはその好ましい実施形態（式（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｄ）を含む）を反復単位として含むオリゴマーまたはポリマーを提供することができる。そのようなポリマーは直線状であっても分枝状であってもよい。
例えば、構造体（プレＩＩＩ’）を用いて、ランダム重合または所定の様式いずれか一方によって分枝状構造体を形成することができる。共重合は、オリゴ(アルキレンアミン)、任意で、内部保護アミノ基を有するものと、水性溶媒または有機溶媒に含まれるポリカルボン酸（Ｖｌｌｌａ〜ＶＩＩＩｇ）との混合物において、カルボジイミド活性化により、インサイチュで活性化することができる。
複数の式（ＩＩＩａ）のオリゴ(アルキレンアミン)基もしくはその好ましい実施形態（式（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｄ）を含む）を反復単位として含むデンドリマーは、例えば、多価結合（coupling）分子を用いて、調製されてもよい。デンドリマーは、中心コアから放射状に生じる完全に多重分岐したモノマーからなるポリマー分子で、木を思い起こさせ、そこからデンドリマーの名前が来ている（ギリシャ語の「木々」）。デンドリマーのコアが除去されると、デンドロンと呼ばれる多数の同一フラグメントが残り、デンドロンの数は中心コアの多重性（２、３、４またはそれ以上）に左右される。デンドロンは、３つの異なる領域：コア、内部（または分岐）、および末端（または終端または末端基）に分けることができる。デンドロンのコアからその末端へ外側に向けて移動中に遭遇する分岐点の数が、その世代（Ｇ−１、Ｇ−２、Ｇ−３）を規定する；高次世代のデンドリマーが大きくなるにつれて、その末端で、低い世代のデンドリマーよりも多く分岐して多くの終端基を有する。
この合成は、指数関数的な成長を生じる発散型でもよく、またはデンドロンが別々に成長させられて最終段階でコアに結合させられる収束型でもよい。デンドリマーは、固相ポリペプチドおよびオリゴヌクレオチド合成にしようされる方法と同様な段階的な方法で調製され、従って、その生成物は、鎖の成長が統計的であり多分散の生成物が得られる従来のポリマー合成とは対照的に、サイズが理論的に単分散である。単分散の生成物は、合成の再現性のためだけでなく、実験上および理論上の変動性も低減するため、非常に望ましい。実際には、単分散の生成物は、低世代（Ｇ−３まで）のデンドリマーについて簡単に得ることができるが、高次世代では、構造的に非常に類似しているため、微小欠陥を伴うデンドリマー群から完全なデンドリマーを精製することが、時に不可能であり、典型的には僅かなものであるが、絶対的な単分散性からの逸脱を生じる。
複数の式（ＩＩＩ）のオリゴ(アルキレンアミン)基またはその好ましい実施形態（式（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｄ）を含む）を含む本発明のポリマーとして好ましいデンドリマーは、Ｇ１〜Ｇ１０の世代数を有し、より好ましくはＧ２〜Ｇ８の世代数、特にはＧ３〜Ｇ６の世代数を有する。これらデンドリマーの分子量（反応段階で組み合わさった反応体を基に計算することができる）は、好ましくは１，５００〜１，０００，０００、より好ましくは３，０００〜２３０，０００、特には６，０００〜６０，０００、更に好ましくは１５，０００〜３０，０００である。
所定のポリ(アミドアミン)デンドリマーの製造のため、（保護された）構造体（プレＩＩＩ）および／または（プレＩＩＩ’）を、既に文献で報告された（例えば、Lee et al. 2005, Nat Biotechnol 23, 1517 - 1526）ような分岐コアの段階的生成に用いることができる。出発分子として、ジ−カルボン酸、アルデヒドもしくはアクリル酸またはポリカルボン酸（例えば、ＶＩＩＩａ〜ＶＩＩＩｇ）によって活性化したオリゴ(アルキルアミン)（例えば、プレＩＩＩ）を用いることができる。このコアを用いて、構造体（プレＩＩＩ）のオリゴ(アルキルアミン)と段階的に反応させて、次いで精製、および、例えばアクリル酸による、末端アミノ基の活性化を行う。精製の後、このコアをオリゴ(アルキルアミン)の更なる層を追加することに用いることができる。デンドリマーを得るための反応条件は、文献で詳細に説明されている（例えば、上記Lee et al.およびその中に含まれる参考文献を参照されたい）。
更なる実施形態によれば、必要に応じて、両末端がカルボキシル基で終端したオリゴ(アルキレンアミン)の一方の末端を保護し、かつ／または、その内部アミンを保護することができ、ジアミン、もしくは末端にアミン基を有する樹枝状出発構造体と、または当該オリゴ(アルキレンアミン)自体と共重合させることができる。
中間体および最終生成物は、アミン保護基が除去された後、デンドリマーの場合は最終カップリング段階の前に、沈殿、透析またはサイズ排除クロマトグラフィーによって精製することができる。
更に別の実施形態では、末端カルボキシ基（または、その好適に保護もしくは活性化された形態）および末端アミノ基（または、その好適に保護された形態）を有するオリゴ(アルキルアミン)、例えば、式（プレＩＩＩ’）のオリゴ(アルキレンアミン)を、特許文献６およびシャファートらの文献（Schaffert et al. 2011, Angew Chem Int Ed Engl 50(38), 8986-9）に記載されているのと同様な、充分に定義されたペプチド性直線状または分枝状構造体の段階的生成に用いることができる。段階的生成は、ペプチド化学反応の原理に従って行うことができ、自動ペプチド合成機で行うことができる。ペプチド合成の分野の当業者に既知であるように、リジンまたはオルニチンのようなジアミノ酸を、分枝状構造体を構築することに用いることができる。従って、多種多様な直線状および分枝状のホモポリマーだけでなく、式（Ｉ）の異なる複数のオリゴ(アルキレンアミン)をポリマーの所望の位置に含むヘテロポリマーも、提供することができる。加えて、そのような定義された構造体の任意の位置に、標準的なアミノ酸を組み込むこともできる。
式Ｉ（ＩＶ）ならびにその好ましい実施形態（式（ＩＶａ），（ＩＶｄ）および（ＩＶｃ）を含む）のリピドイドの調製のために、米国特許出願公開第２０１０／０３３１２３４号明細書、特許文献１および５、非特許文献３１および３２に記載された方法と類似する方法を用いることができる。
例えば、式Ｉ（ＩＶ）ならびにその好ましい実施形態（式（ＩＶａ），（ＩＶｄ）および（ＩＶｃ）を含む）のリピドイドは、Ｒ７−エポキシドまたはＲ７−Ｏ−(Ｃ＝Ｏ)−ＣＨ＝ＣＨ２またはＲ７−ＮＨ−(Ｃ＝Ｏ)−ＣＨ＝ＣＨ２またはＲ７−(Ｃ＝Ｏ)−Ｈを、式（プレＩＶ）のオリゴ(アルキレンアミン)：
Ｈ−ＮＲ２{ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ３−[ＣＨ２−(ＣＨ２)ｂ−ＮＲ４]p}ｍ−[ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＲ５]ｎ−Ｒ６ （プレＩＶ）
（式中、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎは式（ＩＶ）中で定義する通りであり、Ｒ２〜Ｒ６は、互いに独立して、水素またはアミノ基の保護基であり、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルまたは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルキレンから選択される）と反応させることによって得ることができる。好ましくは、Ｒ７が、Ｃ８〜Ｃ１６アルキルまたはアルケニルであり、より好ましくはＣ８〜Ｃ１２アルキルまたはアルケニルであり、最も好ましくはＣ１０〜Ｃ１２アルキルまたはアルケニルである。有利なことに、一方の末端がエポキシド、アクリレート、アクリルアミドまたはアルデヒドで終端した脂肪族化合物は、多数市販されている。
好ましくは、式（ＩＶ）のリピドイドが、（プレＩＶ’）のオリゴ(アルキレンアミン)から調製される。
Ｈ−ＮＨ−{ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＨ−[ＣＨ２−(ＣＨ２)ｂ−ＮＨ]p}ｍ−[ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＨ]ｎ−Ｈ （プレＩＶ’）
より好ましくは、式（プレＩＶ）の前駆体が、４個以上のアミノ基を有する。最も好ましくは、式(ＩＶ)のリピドイドが、（プレＩＶ”）のオリゴ(アルキレンアミン)から調製される。
Ｈ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｈ （プレＩＶ”）
上記反応は、５０℃〜９０℃の高温で、溶媒を用いてまたは用いずに行うことができる。好適な溶媒は、例えば、ＣＨ２Ｃｌ２、ＣＨ２Ｃｌ３、メタノール、エタノール、ＴＨＦ、ヘキサン、トルエン、ベンゼンなどである。
式（プレＩＶ’）のオリゴ(アルキルアミン)中の複数の窒素原子に、例えば特許文献５で説明されるような直交保護基を提供することができることが当業者に知られている：
Ｈ−ＮＨ−{ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＨ−[ＣＨ２−(ＣＨ２)ｂ−ＮＨ]p}ｍ−[ＣＨ２−(ＣＨ２)ａ−ＮＨ]ｎ−Ｈ （プレＩＶ’）。
これに関して、保護基は、式（プレＩＶ’）の化合物中の１個または複数個の窒素を、反応を同一分子中の他の非保護窒素で選択的に行うことができるように、一時的に遮断することに適する。前記反応の後、前記保護基は、同一分子内で窒素原子に連結されている他の残基に影響を及ぼさない化学反応によって外される。直交保護基は、所定の分子内で１種の保護基に特異的に影響を及ぼす化学反応によって選択的に外すことができる保護基とは異なる。例えば、実施例で説明するように、式（プレＩＶ’）のオリゴ(アルキレンアミン)中の末端一級アミン基を、保護基９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）で選択的に保護することができると同時に、内部二級アミンを保護基ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）で保護することができる。Ｆｍｏｃ基は塩基によって選択的に外すことができ、Ｂｏｃ基は酸によって選択的に外すことができる。保護されたまたは部分的に保護された中間体は、クロマトグラフィーによって分離することができる。よって、直交保護基の所定の配置および／または選択的除去のため、例えば、式（プレＩＶ’）のオリゴ(アルキレンアミン)中の内部二級アミノ基の全部もしくは一部または末端二価一級アミン基の全部もしくは一部いずれか一方を、一方の末端がエポキシドもしくはアクリレートもしくはアクリルアミドで終端した脂肪族鎖と選択的に反応させることが可能である。同じ原理により、Ｒ７−エポキシドまたはＲ７−Ｏ−(ＣＯ)−ＣＨ＝ＣＨ２またはＲ７−ＮＨ−(ＣＯ)−ＣＨ＝ＣＨ２またはＲ７−(ＣＯ)−Ｈの１種以上を、式（プレＩＶ）のオリゴ(アルキレンアミン)にカップリングすることが可能である（ここで、「種」は、アルキルもしくはアルケニルに関しては異なる種類のＲ７残基いい、脂肪族鎖長に関しては末端エポキシド、アクリレート、アクリルアミドもしくはアルデヒドをいう）。このような反応における式（プレＩＶ’）のオリゴ(アルキレンアミン)の誘導体化の度合いは、先に挙げた文献に記載されたような反応体の化学量論によって制御することができる。保護基を外した後、窒素原子の残る価数を、グアニジン基（−Ｃ(ＮＨ)−ＮＨ２）、ポリ(エチレングリコール)鎖または受容体リガンドとの結合に用いることができる。式（ＩＶ）のリピドイドは、沈殿、抽出またはクロマトグラフィーによって精製することができる。保護基の助けを借りて制御された段階的反応によって式（ＩＶ）のリピドイドを調製することができ、式（プレＩＶ’）のオリゴ(アルキレンアミン)の誘導体化の度合いをその反応体の化学量論によって制御できるという選択肢に基づき、本発明のリピドイドは、一級、二級、三級および／または四級アミン、ならびにそれらの塩を含有することができる。その結果、リピドイドのｐＫａ値は、式（ＩＶ）中の１個以上の窒素原子はプロトン化されて、ＲＮＡに結合し圧縮し保護することに適した式（ＩＶ）のカチオン性リピドイドを提供するように、誘導体化の度合いの合理的設計によって変化させることもできる。更に、前記ｐＫａ値は、式（ＩＶ）中の１個以上の窒素原子は、酸性ｐＨで緩衝機能を有し、それにより細胞内へのエンドサイトーシス取り込みについてプロトンスポンジ効果を発揮し得るように、変化させることができる。好ましくは、式（ＩＶ）のリピドイドの複数のｐＫａ値が３．０〜９．０であり、より好ましくは、少なくとも１つのｐＫａ値が５．０〜８．０である。
式（ＩＶ）のリピドイドを得るために、式（プレＩＶ’）のオリゴ(アルキルアミン)に結合することができる脂肪族側鎖の最大数は、（ｐ＋１）×ｍ＋ｎ＋３であり、その最小数は１であり、ｐ、ｍおよびｎは式（ＩＶ）で定義される通りである。好ましくは、脂肪族側鎖の数は、残基Ｒ１〜Ｒ６のうち水素または−ＣＨ２−ＣＨ(ＯＨ)−Ｒ７、−ＣＨ(Ｒ７)−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ(Ｏ)−Ｏ−Ｒ７、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ−Ｒ７もしくは−ＣＨ２−Ｒ７以外のものがない場合は、少なくとも２であり、最大で（ｐ＋１）×ｍ＋ｎ＋２であり、好ましくは、残基Ｒ１〜Ｒ６のうち１つがアミノ基の保護基または−ＣＨ(ＮＨ)−ＮＨ２またはポリ(エチレングリコール)鎖または受容体リガンドである場合、脂肪族側鎖の数は最大で（ｐ＋１）×ｍ＋ｎ＋１である。
本発明で使用される好ましい非限定的なカチオン性のオリゴマー、ポリマーまたはリピドイドの一例は、１００ｍｇのＮ，Ｎ’−ビス（２−アミノエチル）−１，３−プロパンジアミン（０．６２３ｍｍｏｌ）と５７５．０７ｍｇの１，２−エポキシドデカン（３．１２ｍｍｏｌ、（Ｎ−１）等量：ここでＮは、オリゴ(アルキレンアミン)１つあたりの、一級アミン量×２と二級アミン量×１との和である）とを混合し、常時撹拌しながら、８０℃で９６時間混合することにより調製されたものである。このようなカチオン性のオリゴマー、ポリマーまたはリピドイドは、リピドイド「Ｃ１２−（２−３−２）」とも称される。該脂質（および、本発明で使用される他のカチオン性のオリゴマー、ポリマーまたはリピドイド）の調製に関する指針は、本明細書および実施例で提供される。
［核酸］
本発明の（医薬）組成物は、核酸、好ましくはＲＮＡ、より一層好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡを含む。
「核酸」という用語は、天然に存在する種類の核酸ならびに化学的におよび／または酵素的に合成された核酸の全ての形態を包含し、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、オリゴヌクレオシドのチオリン酸エステルおよびリン酸トリエステル、モリホルノオリゴヌクレオチド、カチオン性オリゴヌクレオチド（米国特許第６０１７７００号明細書、国際公開第２００７／０６９０９２号）、置換リボオリゴヌクレオチドまたはホスホロチオエートのような、核酸アナログおよび核酸誘導体も包含する。更に、「核酸」という用語は、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含むあらゆる分子もいう。本発明の組成物に含まれる核酸の配列またはサイズに関して、如何なる限定も存在しない。核酸は、本発明の組成物が送達される生物学的標的で達成される生物学的効果によって、主に規定される。一例を挙げると、遺伝子または核酸療法における用途の場合、核酸または核酸配列は、発現される遺伝子もしくは遺伝子フラグメントによって、または置換もしくは修復が意図される欠陥遺伝子もしくは任意の遺伝子標的配列によって、または阻害、ノックダウンもしくはダウンレギュレートされる遺伝子の標的配列によって、規定することができる。
好ましくは、「核酸」という用語は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。ＲＮＡに関して、原則として、本発明に関してあらゆる種類のＲＮＡを用いることができる。好ましい一実施形態では、ＲＮＡが一本鎖ＲＮＡである。「一本鎖ＤＮＡ」という用語は、２本以上の別個の鎖が該別個の鎖のハイブリダイゼーションにより１つの２本鎖分子を形成しているＲＮＡ分子とは対照的に、リボヌクレオチドの連続した一本の鎖を意味する。「一本鎖ＲＮＡ」という用語は、ループ、二次構造または三次構造のような、一本鎖分子がそれ自体で二本鎖構造を形成するものを排除しない。
「ＲＮＡ」という用語は、アミノ酸配列をコードするＲＮＡおよびアミノ酸配列をコードしないＲＮＡを網羅する。ゲノムの８０％超が、タンパク質をコードしない機能的ＤＮＡ要素を含有することが示唆されている。これらの非コード配列は、調節ＤＮＡ要素（転写因子、レギュレーターおよびコレギュレーターなどの結合部位）ならびにタンパク質に翻訳されない転写産物をコードする配列を含む。これら、ゲノムによってコードされＲＮＡへ転写されるがタンパク質に翻訳されない転写産物は、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）と呼ばれる。このように、一実施形態では、ＲＮＡがノンコーディングＲＮＡである。好ましくは、ノンコーディングＲＮＡが一本鎖ＲＮＡである。ｎｃＲＮＡは、遺伝子制御、ゲノムの完全性の維持、細胞分化、および成長において重要な役割を果たしており、様々なヒト疾患で誤制御されていることが、研究で証明されている。異なる種類のｎｃＲＮＡ：短い（２０〜５０ｎｔ）ｎｃＲＮＡ、中間長の（５０〜２００ｎｔ）ｎｃＲＮＡ、および長い（＞２００ｎｔ）ｎｃＲＮＡが存在している。短いｎｃＲＮＡとしては、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、および転写開始ＲＮＡ（ｔｉＲＮＡ）が挙げられる。中間長のｎｃＲＮＡの例は、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、転写開始点関連ＲＮＡ（ＴＳＳａＲＮＡ）、プロモーター関連小型ＲＮＡ（ＰＡＳＲ）、およびプロモーター上流転写産物ＲＮＡ（ＰＲＯＭＰＴ）である。長いノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）としては、遺伝子間の長いノンコーディングＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）、アンチセンスｌｎｃＲＮＡ、イントロンｌｎｃＲＮＡ、転写超保存(領域)ＲＮＡ（Ｔ−ＵＣＲ）、およびその他（Bhan A, Mandal SS, ChemMedChem. 2014 Mar 26. doi: 10.1002/cmdc.201300534）が挙げられる。上述するノンコーディングＲＮＡのうち、ｓｉＲＮＡのみが二本鎖である。よって、好ましい実施形態では、ノンコーディングＲＮＡが一本鎖ＤＮＡであることから、ノンコーディングＲＮＡはｓｉＲＮＡで無いことが好ましい。別の実施形態では、ＲＮＡがコードＲＮＡ、すなわち、アミノ酸配列をコードするＲＮＡである。そのようなＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）とも呼ばれ、一本鎖ＲＮＡ分子である。核酸は、当業者に既知の合成化学的および酵素的方法論によって、もしくは組換え技術の使用によって、作製されてもよく、または天然供給源から単離されてもよく、またはそれらの組み合わせによって作製されてもよい。オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、任意で非天然ヌクレオチドを含んでもよく、一本鎖または二本鎖または三本鎖であってもよい。「核酸」は、センスおよびアンチセンスのオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、つまり、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ中の特定のヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列もいう。
好ましくは、核酸という用語はｍＲＮＡ、より好ましくは修飾ｍＲＮＡをいう。
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、ヌクレオシドとしてのアデノシン、シチジン、ウリジンおよびグアノシンを主に含むヌクレオシドリン酸構成単位で作られたポリマーであり、細胞核中のＤＮＡから遺伝情報をそれがタンパク質へと翻訳される場である細胞質へ運ぶ仲介担体である。よって、これらは、遺伝子発現の代替物として好適である。
本発明に関して、ｍＲＮＡは、細胞内に入ると、タンパク質もしくはそのフラグメントの発現に適しているまたはタンパク質もしくはそのフラグメントを翻訳し得る、あらゆるポリリボヌクレオチド分子を意味するものと理解されるべきである。「タンパク質」という用語は、本明細書中において、あらゆる種類のアミノ酸配列、すなわち、ペプチド結合を介して各々連結された２個以上のアミノ酸の鎖を包含し、ペプチドおよび融合タンパク質も含む。ｍＲＮＡは、細胞内でもしくは細胞付近でその機能が必要とされるもしくは有益であるタンパク質、例えば、その欠損もしくは欠陥形態が疾患もしくは病気の引き金であり、その供給が疾患若しくは病気を緩和するもしくは予防することができるタンパク質、または身体にとって有益な過程を細胞内もしくはその付近で促進することができるタンパク質、あるいはそのフラグメントをコードするリボヌクレオチド配列を含有する。ｍＲＮＡは、完全なタンパク質またはその機能性変異体の配列を含有し得る。さらに、リボヌクレオチド配列は、因子、誘導物質、調節物質、刺激物質もしくは酵素、またはそれらのフラグメントとして作用するタンパク質をコードすることができ、当該タンパク質は、その機能が、疾患、特に代謝疾患を治療するために、またはインビボで新たな血管、組織などの形成のような過程を開始させるために必要なものである。本明細書中で、機能性変異体とは、細胞内で機能が必要とされる、またはその欠損若しくは欠陥形態が病原性であるタンパク質の機能を細胞内で引き受けるフラグメントを意味すると理解される。加えて、ｍＲＮＡは、更なる機能性領域および／または３’もしくは５’非コード領域を有してもよい。３’もしくは５’非コード領域は、タンパク質コード配列に天然に隣接する領域またはＲＮＡの安定化に貢献する人工配列とすることができる。当業者は、各々の事例でこのために適する配列を慣例的な実験によって決定することができる。
好ましい実施形態では、ｍＲＮＡは、特に翻訳を改善するために、ｍ７ＧｐｐｐＧキャップ、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）および／または３’末端にポリＡ尾部を有する。ｍＲＮＡは、更に、翻訳を促進する領域を有することができる。
好ましい実施形態では、ｍＲＮＡは修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドとの組み合わせを含有するｍＲＮＡである。好ましくは、国際公開第２０１１／０１２３１６号に記載されるような修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドとの組み合わせを含有するｍＲＮＡである。このようなｍＲＮＡは「ＳＮＩＭ（登録商標）−ＲＮＡ」としても知られ、かつ市販されている。国際公開第２０１１／０１２３１６号に記載されたｍＲＮＡは、安定性の増加と免疫原性の低減とを示すことが報告されている。好ましい実施形態では、そのような修飾ｍＲＮＡにおいて、シチジンヌクレオチドの５〜５０％およびウリジンヌクレオチドの５〜５０％が修飾されている。アデノシンおよびグアノシン含有ヌクレオチドは、非修飾とすることができる。アデノシンおよびグアノシンヌクレオチドは、修飾されていなくても部分的に修飾されていてもよく、好ましくは非修飾形態で存在する。好ましくは、シチジンヌクレオチドの１０〜３５％およびウリジンヌクレオチドの１０〜３５％が修飾されており、特に好ましくは、修飾シチジンヌクレオチドの含有量が７．５〜２５％であり、修飾ウリジンヌクレオチドの含有量が７．５〜２５％である。実際、比較的低含有量、例えば、修飾シチジンヌクレオチドおよび修飾ウリジンヌクレオチド各１０％で所望の特性を達成できることが見出された。特に好ましくは、修飾シチジンヌクレオチドが５−メチルシチジン残基であり、修飾ウリジンヌクレオチドが２−チオウリジン残基である。最も好ましくは、修飾シチジンヌクレオチドの含有量および修飾ウリジンヌクレオチドの含有量が、それぞれ２５％である。
別の好ましい一実施形態では、関連する細胞内でのみ所望のｍＲＮＡの活性化を可能にするために、ｍＲＮＡを、標的結合部位、標的指向化配列および／またはマイクロＲＮＡ結合部位と組み合わせてもよい。更に好ましい実施形態では、ＲＮＡを、３’ポリＡ尾部の下流でマイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡと組み合わせることができる。
さらに、「核酸」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはそれらの混成物またはそれらの修飾物をいうことがあり、それらは本技術分野の最高水準で公知である（例えば、米国特許第８２７８０３６号、国際公開第２０１３／０５２５２３号、国際公開第２０１１／０１２３１６号、米国特許第５５２５７１１号、米国特許第４７１１９５５号、米国特許第５７９２６０８号、または欧州特許公開第３０２１７５号、修飾物の例としては、Lorenz et al. 2004, Bioorg Med Chem Lett, 14, 4975-4977; Soutschek et al. 2004, Nature, 432, 173-178）。そのような核酸分子は、一本鎖または二本鎖、直線状または環状、天然または合成であり、いかなるサイズ限定も伴わない。一例として、核酸分子は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボソーム、または小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ阻害剤（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、または短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｔＲＮＡまたは長い二本鎖ＲＮＡまたはそれらのＲＮＡをコードするＤＮＡ構築体またはキメラプラスト（Colestrauss et al. 1996, Science, 273, 1386-1389）、またはアプタマー、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＲＮＡ誘導部位特異的ＤＮＡ切断用の「ＣＲＩＳＰＲ」）（Cong et al. 2013, Science, 339, 819-823）、すなわちＲＮＡおよびＤＮＡである。前記核酸分子は、プラスミド、コスミド、人工クロモソーム、ウイルス性ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、コーディングおよび非コーディング一本鎖（ｍＲＮＡ）もしくは二本鎖ＲＮＡ、ならびにオリゴヌクレオチドの形態であってよく、糖骨格および／または上述の塩基における最高水準の修飾ならびに３’または５’修飾が含まれる。特に好ましい実施形態では、核酸がＲＮＡであり、より好ましくはｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡであり、より一層好ましくは、ｍＲＮＡである。
核酸は、標的細胞で発現されるポリペプチドをコードする核酸配列を含有してもよい。当業者に周知の方法を用いて、組換え核酸分子を構築することができる；例えば、次に記載された技術を参照されたい：Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (2001) N.Y.; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)。
好ましい実施形態では、前記核酸は、上で列挙された全ての種類の核酸および修飾ならびに治療若しくは予防効果を有し得ることが当業者に既知のすべての種類の核酸および修飾を含めた、治療上または医薬上活性な核酸である。そのため、前記核酸は遺伝子治療および関連する用途に使用され得る。これに関して、本発明では、ＲＮＡを一般的に使用されているＤＮＡ（ｐＤＮＡなど）の代わりに使用してもよい。一般に、治療または予防効果は、核酸と、細胞質の物質および細胞小器官との相互作用によって達成することができる。そのような相互作用は、単独で、例えば、トール様および他の細胞外または細胞内受容体と特異的に相互作用するように設計されたある種のＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび配列の場合のように、先天性免疫系を活性化することができる。更に、細胞への核酸の取り込みまたは導入は、核酸に含まれる遺伝子のようなヌクレオチド配列の発現をもたらすように意図することができ、導入された外来性核酸の細胞内存在の結果としての内在性遺伝子の発現のダウンレギュレーション、サイレンシングもしくはノックダウンを意図することができ、内在性核酸配列の選択された塩基もしくは一続き全体の修復、除去、挿入もしくは交換のような内在性核酸配列の修飾を意図することができ、または、導入された外来性核酸の細胞内存在および相互作用の結果としての、事実上如何なる細胞内プロセスでの干渉をも意図することができる。導入された外来性核酸の過剰発現は、特に、外来性遺伝子が不完全であるもしくは無発現性で、何ももたらさない、不充分である場合において、または、２〜３例を挙げると、のう胞性線維症、血友病もしくは筋ジストロフィーのような多くの代謝性および遺伝性疾患が原因である事例のような遺伝子発現の不完全なもしくは非機能性の産物の場合において、内在性遺伝子の発現を埋め合わせるまたは補うように意図されてもよい。導入された外来性核酸の過剰発現は、遺伝子発現の制御、シグナル伝達および他の細胞内プロセスのような、あらゆる内因性細胞内プロセスと相互作用するまたは該過程に干渉する発現の産物を有するように意図されてもよい。導入された外来性核酸の過剰発現は、トランスフェクションされたもしくはトランスダクションされた細胞が常在するまたは常在するようにさせられた生物に免疫応答を引き起こすように意図されてもよい。例としては、ワクチン接種目的のため抗原を提示させるための、樹状細胞のような抗原提示細胞の遺伝的修飾である。他の例は、腫瘍特異的免疫応答を誘発するための、腫瘍でのサイトカインの過剰発現である。更に、導入された外来性核酸の過剰発現は、再生医療用の改変されたＴ細胞もしくは前駆体細胞もしくは幹細胞もしくは他の細胞のような、細胞療法用の遺伝的に修飾された細胞を一時的にインビボまたはエクスビボで生成するように意図されてもよい。
治療目的の内在性遺伝子の発現のダウンレギュレーション、サイレンシングまたはノックダウンは、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｔＲＮＡ、長い二本鎖ＲＮＡによって達成することができ、そのようなダウンレギュレーションは、配列特異的または非特異的とすることができ、長い二本鎖ＲＮＡが細胞に導入される場合のように細胞死をもたらすこともできる。内在性または先在性遺伝子の発現のダウンレギュレーション、サイレンシングまたはノックダウンは、ウイルス性感染および癌を含む、後天性疾患、遺伝性疾患または自然発生的疾患の治療に有用であり得る。細胞への核酸の導入は、例えば、ウイルス感染または新生物形成を予防するための予防的手段として行うことができることを予測することもできる。内在性遺伝子の発現のダウンレギュレーション、サイレンシングまたはノックダウンは、転写レベルおよび翻訳レベルで発現することができる。多数のメカニズムは、当業者に公知であり、例えば、後成性修飾、クロマチン構造の変化、導入核酸による転写因子の選択的結合、導入核酸のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ種における相補性配列との塩基対形成によるハイブリダイゼーションを含み、三重ヘリックス形成のような異例の塩基対形成メカニズムも含まれる。同様に、遺伝子修復、塩基もしくは配列の変更は、ゲノムレベル、およびエクソンスキッピングを含めたｍＲＮＡレベルで達成することができる。塩基または配列の変更は、例えば、ＲＮＡ誘導性部位特異的ＤＮＡ切断によって、トランススプライシング、トランススプライシングリボザイム、キメラプラスト、スプライソソーム仲介性ＲＮＡトランススプライシングを利用する、カットアンドペーストメカニズムによって、またはグループＩＩもしくは再標的化イントロンの利用によって、またはウイルスにより仲介される挿入突然変異の利用によって、または原核生物、真核生物もしくはウイルスのインテグラーゼシステムを用いた標的化ゲノム挿入の利用によって、達成することができる。核酸は、生体系の構築計画の担い手であることから、また核酸は、直接的および間接的な手法で多数の細胞内プロセスに関与することから、理論的には、外部から細胞内への核酸の導入によって、あらゆる細胞内プロセスに影響を及ぼすことができる。特に、この導入は、細胞または臓器培養物にインビボおよびエクスビボで直接的に行うことができ、そのようにして改変した臓器または細胞をレシピエントに移植することができる。核酸を活性薬剤として含む本発明の複合体は、上述する目的の全てに有用であり得る。
［組成物または（該組成物を含む）各医薬組成物］
上述したように、本発明の組成物および各医薬組成物は、核酸と、カチオン性剤、例えば、ＰＥＩまたはオリゴ(アルキレンアミン)を含む成分とを含み、該成分は、下記（ａ）〜（ｃ）から選択される：
（ａ）複数の式（ＩＩ）の基を側鎖および／もしくは末端基として含む、オリゴマーまたはポリマー：
（ＩＩ）
（式中、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎおよびＲ２〜Ｒ６は、上で定義する通りであり、好ましい実施形態、特には好ましい式（ＩＩａ）〜（ＩＩｄ）の基を含み；式（ＩＩ）中で表示される１個以上の窒素原子は、プロトン化されて、式（ＩＩ）のカチオン基を提供してもよい）；
（ｂ）複数の式（ＩＩＩ）の基を反復単位として含む、オリゴマーまたはポリマー：
（ＩＩＩ）
（式中、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎおよびＲ２〜Ｒ５は、上で定義する通りであり、好ましい実施形態、特には好ましい式（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｄ）の基を含み；式（ＩＩＩ）中で表示される１個以上の窒素原子は、プロトン化されて、式（ＩＩＩ）のカチオン基を提供してもよい）；または、
（ｃ）式（ＩＶ）の構造を有するリピドイド：
（ＩＶ）
（式中、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎおよびＲ１〜Ｒ６は、上で定義する通りであり、好ましい実施形態、特には好ましい式（ＩＶａ）〜（ＩＶｃ）の基を含み；式（ＩＶ）中で表示される１個以上の窒素原子は、プロトン化されて、式（ＩＶ）のカチオン基を提供してもよい）。
本発明は、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡと、ＰＥＩまたは本明細書中で規定される成分（ａ）〜（ｃ）からその好ましい実施形態も含めて選択されるオリゴ(アルキレンアミン)を含む成分のようなカチオン性剤とからなる（または含む）（医薬）組成物も包含する。前記（医薬）組成物は、更なる成分、例えば、脂質形成用成分ならびに／またはＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡを細胞（内）および／または１つまたは複数の組織（内）へ送達する間にエフェクター機能を発揮する成分を含んでもよい。
本発明の（医薬）組成物は、一般的に、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡを、ＰＥＩまたはオリゴマー、ポリマーもしくはリピドイドのようなカチオン性剤、および、任意の更なる成分と会合させ、これらは、適用の間（例えば、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡを送達する所望経路の間）、生物標的または生物標的の周囲に到達するまで、前記成分のかなりの割合の会合を維持するのに充分安定した１つの有限物質とされることが理解されよう。
本発明のオリゴマー、ポリマーもしくはリピドイドまたはＰＥＩなどのカチオン性剤中にはプロトン化し得るアミノ基が存在するため、これらのカチオン性剤は（例えば、式（ＩＩ）もしくは（ＩＩＩ）の基または式（ＩＶ）の構造体に）正電荷を含み得る。その結果、これらは、プロトンの存在下で、例えば、水中もしくは水溶液中で、またはプロトン供与酸の存在下で、カチオン、典型的には、複数のカチオン性部分を含有するオリゴカチオンまたはポリカチオンを形成する。よって、好ましくは、本発明の（医薬）組成物は、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡと本発明のカチオン性剤との複合体を含むかまたは該複合体からなる。言い換えると、本発明に関して使用するＲＮＡおよびカチオン性剤は複合体を形成し得る。そのような複合体において、カチオン性剤とアニオン性核酸とは、一般的に、静電相互作用を介して会合していることが理解されるであろう。しかしながら、カチオン性剤、および、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡの特定の構造に応じて、水素結合および共有結合を含む他の引力相互作用が前記複合体の安定化に関与し得る。本発明の複合体の非限定的な例は、リポソームまたはリポプレックスであるか、リポソームまたはリポプレックスに含有される。各カチオン性剤はカチオン性のリピドイドまたは脂質であり得る。
具体的な一態様では、例えばリポソームまたはリポプレックスのような複合体の形態のＲＮＡおよびカチオン性剤は、ナノ粒子であり得る（ナノ粒子として製剤化され得る）か、ナノ粒子中に含有され得る。このようなナノ粒子は、（ａ）「ヘルパー脂質」のような１つ以上の更なる成分、例えば、本明細書の他の箇所に記載の１つ以上のヘルパー脂質を含み得る。ナノ粒子は、直径が約１〜１０００ｎｍ、好ましくは約５〜９００ｎｍである粒子である。
他の具体的の一態様では、例えばリポソームまたはリポプレックスのような複合体の形態のＲＮＡおよびカチオン性剤は、マイクロ粒子（マイクロスフィアとも称されることがある）として製剤化され得るか、ＭＰ中に含有され得る。このようなマイクロ粒子は、ポリラクチド酸を（更に）含み得るか、ポリラクチド酸マイクロ粒子であり得る。本発明のポリラクチド酸の非限定的な好ましい一例は、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）である。好ましい非限定的なマイクロ粒子は、マイクロ粒子として製剤化された、ＲＮＡ、カチオン性剤およびポリラクチド酸（ＰＬＧＡなど）である。さらに具体的な一態様では、本明細書で規定されるナノ粒子は本明細書で規定されるマイクロ粒子に含有される。同様のアプローチがＤＮＡの経口投与について知られており、「ナノ粒子−イン−マイクロスフィア経口システム」（ＮｉＭＯＳ；非特許文献３４〜３６）と呼ばれている。原則として、ＮｉＭＯＳも本発明に関連して適用され得るが、ＤＮＡの代わりにＲＮＡを使用する。マイクロ粒子は、直径が約１〜１０００μｍ、好ましくは約２〜１０００μｍである粒子である。
当業者は、本発明の複合体、ナノ粒子、および、マイクロ粒子を容易に製造および製剤化することができる。これに関して、当業者は、本明細書に記載の手段および方法、ならびに、実施例を参考にすることができると考えられる。さらに、当業者は非特許文献３４〜３６を参考にすることができると考えられる。例えば、ナノ粒子は、カチオン性剤、ＲＮＡ（および、任意で１つ以上のヘルパー脂質）を混合することにより製造／製剤化され得る。各比率の例は本明細書の他の箇所に記載されている。同様に、マイクロ粒子は、カチオン性剤、ＲＮＡ（および、任意で１つ以上のヘルパー脂質）、または、これらを含むナノ粒子をマイクロ粒子用材料（本明細書に記載のポリラクチド酸など）と混合することにより製造／製剤化され得る。各比率の例も本明細書の他の箇所に記載されている。
本発明の（医薬）組成物では、カチオン性剤と、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡとを、例えば、０．２５／１〜５０／１、好ましくは、０．５／１〜３０／１、より好ましくは１／１〜２０／１のオリゴマー、ポリマーまたはリピドイド重量／核酸重量（ｗ／ｗ）比で含有することができる。
より好ましくは、前記（医薬）組成物が、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡと本発明のカチオン性剤との複合体を含有する場合、本発明の（医薬）組成物における該カチオン性剤と、該ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡとの相対比は、相互電荷中和の程度を考慮して選択され得る。ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡと、カチオン性剤との複合体を用いたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡの送達では、一般的に、ＲＮＡの負電荷を少なくとも中和、好ましくはＲＮＡの負電荷を過剰補償する量のカチオン性剤が、所定量のＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡと混合される。
カチオン性剤とＲＮＡとの好適な比率は、ゲル遅延度アッセイ、臭化エチジウム置換／消光アッセイのような蛍光消光法によって、粒子サイジングおよびゼータ電位測定によって、容易に決定することができる。カチオン性剤とＲＮＡとの有用な比率は、通常、アガロースゲル電気泳動を行った場合の該カチオン性剤との複合体に含まれる該ＲＮＡの少なくとも部分的、好ましくは完全な遅延；該ＲＮＡにインターカレートした臭化エチジウム、リボグリーン（ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ）またはＹＯＹＯのような色素の高程度の蛍光消光；または、カチオン性剤とＲＮＡとの混合における(ナノ)粒子の形成によって、特徴づけられる。化学的に十分に定義されているカチオンについては、算出されたＮ／Ｐ比が、カチオン性剤とＲＮＡとの相対比を選択し規定する上で好適なファクターである。例えば、前記Ｎ／Ｐ比は、本発明の（医薬）組成物における、本発明のオリゴマー、ポリマーまたはリピドイドの式（ＩＩ）の基（もしくはその好ましい実施形態）中、式（ＩＩＩ）の基（もしくはその好ましい実施形態）中または式（ＩＶ）の構造体（もしくはその好ましい実施形態）中のプロトン化可能な窒素原子の、ＲＮＡのリン酸基に対するモル比を示す。前記Ｎ／Ｐ比は、このようなＲＮＡとカチオン性ビヒクルとの複合体をキャラクタライズするための確立されたパラメータであり、例えば、アミド結合の窒素原子はプロトン化可能な窒素原子として数えないことを当業者は理解するであろう。カチオン性オリゴマーまたはポリマーの場合、Ｎ／Ｐ比は、通常、例えば、次式：

(式中、Ｗｐは、オリゴマーまたはポリマーの重量であり、ｎは、反復単位１つあたりのプロトン化可能なアミノ基の数であり、Ｍｗｐは、反復単位（対イオンを含む）の分子量であり、Ｗｎａは、ＲＮＡの重量であり、Ｍｂａｓｅは、ＲＮＡのヌクレオチドの平均分子量であり、ＲＮＡの場合は３４６である)に従って算出することができる。本発明のＲＮＡ送達用のポリカチオン／ＲＮＡ２成分複合体では、カチオン性剤の該ＲＮＡに対する相対量は、好ましくは、正のゼータ電位の最終２成分（医薬）組成物を生じるＮ／Ｐ比を提供するように用いられるべきである。式（ＩＶ）のリピドイドとＲＮＡとを含む（医薬）組成物については、Ｎ／Ｐ比は、通常、該リピドイド中のプロトン化可能な窒素原子の数と、組成物に用いられる該リピドイドのモル数とを考慮して算出することができる。本発明に関して、本発明の２成分（医薬）組成物について、１〜１００のＮ／Ｐ比が好ましく、より好ましくは３〜６０のＮ／Ｐ比であり、最も好ましくは４〜４４のＮ／Ｐ比である。
本発明の（医薬）組成物は、任意で、脂質形成用の更なる成分を含む。例えば、式（ＩＶ）のリピドイドまたはその好ましい実施形態（式（ＩＶａ）〜（ＩＶｃ）を含む）のようなカチオン性剤を含む（医薬）組成物は、更に、科学文献において「ヘルパー脂質」と呼ばれる、コレステロール、ＤＯＰＥ、ＤＯＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＰＧ（ＤＰＧ−ＰＥＧ ２ｋのようなＤＰＧ−ＰＥＧなど）もしくはＤＭＧ（ＤＭＧ−ＰＥＧ２００など）のような脂質、および／または、ＰＥＧ化脂質（ＤＭＧ−ＰＥＧ２００、ＤＭＰＥ−ＰＥＧなど）またはリポプレックスの調製に有用な任意の他の脂質を含み得る。本発明に関して、好ましいヘルパー脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、コレステロール、ＤＭＧ（ＤＭＧ−ＰＥＧ２００など）、および、ＤＰＧ（ＤＰＧ−ＰＥＧ ２ｋのようなＤＰＧ−ＰＥＧなど）である。ある実施形態では、リピドイドを含有する組成物が、（該組成物の総重量に対する重量パーセントで）約４０〜６０％のリピドイドと、約４０〜６０％のコレステロールと、約５〜２０％のＰＥＧ脂質とを含む。ある実施形態では、リピドイドを含有する組成物が、約５０〜６０％のリピドイドと、約４０〜５０％のコレステロールと、約５〜１０％のＰＥＧ脂質とを含む。ある実施形態では、リピドイドを含有する組成物が、約５０〜７５％のリピドイドと、約２０〜４０％のコレステロールと、約１〜１０％のＰＥＧ脂質とを含む。ある実施形態では、リピドイドを含有する組成物が、約６０〜７０％のリピドイドと、約２５〜３５％のコレステロールと、約５〜１０％のＰＥＧ脂質とを含む。前記組成物は、本技術分野で既知のいずれかの手法（例えば、Akinc et al, 2007, Nat Biotech, 26, 561-569; Akinc et al, 2009, Mol Ther, 17, 872-9; Love et al, 2010, PNAS, 107, 1864-9;特許文献１または６に記載されるような）によって提供され得る。ＲＮＡ／リピドイド複合体は、細胞内へのＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡの送達に有用な粒子を形成してもよい。複数のリピドイド分子が、１分子のＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡと会合し得る。例えば、複合体は、１〜１００個のリピドイド分子、１〜１，０００個のリピドイド分子、１０〜１，０００個のリピドイド分子、または１００〜１０，０００個のリピドイド分子を含み得る。(ｍ)ＲＮＡとリピドイドとの複合体は、粒子を形成し得る。前記粒子の直径は、例えば、１０〜１，２００ｎｍでもよく、より好ましくは、前記粒子の直径が１０〜５００ｎｍであり、最も好ましくは２０〜１５０ｎｍである。
本発明の組成物は、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡを細胞および細胞内へ送達する間にエフェクター機能を発揮する成分を任意で含む。そのような成分は、特に限定されないが、ポリアニオン、上述のような脂質、本明細書の他の箇所で具体的に規定された使用されたカチオン性剤以外のポリカチオン（カチオン性ペプチドを含む）、遮蔽オリゴマー、遮蔽ポリマー、ポロキサマー（プルロニックとしても既知）、ポロキサミン、標的指向化リガンド、エンドソーム融解剤、細胞透過性ペプチド、シグナルペプチド、磁気ナノ粒子、非磁気ナノ粒子、ＲＮＡｓｅ阻害剤、蛍光色素、放射性同位体、または医用画像用の造影剤とすることができる。「エフェクター機能」という用語は、生物学的標的でもしくはその中でまたは生物学的標的の周囲でもしくはその中で前記組成物のＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡの意図される生物学的効果を達成することを支援するあらゆる機能を包含する。例えば、核酸送達用の組成物は、非コード核酸または非核酸アニオンをスタッファー材料として含むように配合されている（Kichler et al. 2005, J Gene Med, 7, 1459-1467）。そのようなスタッファー材料は、意図される生物学的効果を有する核酸の用量を低減しつつ、該スタッファー材料の非存在下、高用量の核酸で得られる効果の程度または度合いを維持することに適する。非核酸ポリアニオンは、延長した遺伝子発現をインビボで低減された毒性で得るためにも用いられている（Uchida et al. 2011, J Control Release, 155, 296-302）。本発明の組成物は、リポポリプレックスにおける場合のようなカチオン性、アニオン性または中性脂質を含むこともできる（Li and Huang in “Nonviral Vectors for Gene Therapy”, Academic Press 1999, Chapter 13, 295-303）。リポポリプレックスは、本発明の式（ＩＶ）に相当するリピドイドを用いて、ＰＥＩ、特にはｂｒＰＥＩから、または、本発明の式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）に相当するポリマーから有利に調製してもよい。更に、本発明の組成物は、本発明に関して記載したカチオン性剤以外のオリゴカチオンまたはポリカチオンを含むことができる。そのような追加のポリカチオンは、核酸の所望の圧縮度を達成することに有用であり、ポリカチオン性ペプチドの場合は以前に報告されたような核局在化シグナル機能を有することができる（Ritter et al. 2003, J Mol Med, 81, 708-717）。同様にポリ(エチレングリコール)（ＰＥＧ）のような遮蔽ポリマーは、本発明の組成物に含めることができ、生物学的環境における凝集および／または所望でない相互作用（オプソニン化）、例えば、血清成分、血球または細胞外基質との相互作用に対して、ポリプレックスおよびリポプレックスを安定化することに頻繁に用いられる。遮蔽は、核酸含有組成物の毒性を低減することにも適し得る（Finsinger et al. 2000, Gene Ther, 7, 1183-1192）。ＰＥＧのような遮蔽ポリマーは、本発明のポリマーまたはリピドイドに直接的に共有カップリングすることができる。前記カップリングは、ポリマー骨格において、好ましくは、可能であれば、ポリマー骨格またはデンドリマーの末端へ行うことができる。しかしながら、前記カップリングは、例えば、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）のアミノ基にも行うことができる。
ＰＶＰのようなポリビニル誘導体およびポロキサマーは、筋肉内注射のときのトランスフェクションを増強することに有用であることが見出されており（Mumper et al. 1996, Pharm Res, 13, 701-709; Lemieux et al. 2000, Gene Ther, 7, 986-991）、従って、本発明の組成物に有用に含むことができる。
核酸送達用の組成物に含まれる抗体を含む標的指向化リガンドは、標的細胞の優先的かつ改良されたトランスフェクションに有用である（Philipp and Wagner, “Gene and Cell Therapy - Therapeutic Mechanisms and Strategy”, 3rd Edition, Chapter 15. CRC Press, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton 2009）。標的指向化リガンドは、本発明の組成物に、直接的または間接的なやり方で標的認識および／または標的結合機能を付与する任意の成分でよい。最も一般的に言うと、標的は、標的指向化リガンドが分子相互作用を介して特異的に結合することができる特徴的な生物学的構造（体）であり、そのような結合は、最終的には、標的組織においておよび／または標的細胞でもしくはその中で前記組成物に含まれる核酸の優先的蓄積をもたらすであろう。ＰＥＧ鎖と同様に、標的指向化リガンドは、ポリマー骨格またはデンドリマーの末端にカップリングすることができる。しかしながら、前記カップリングは、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）のアミノ基にも行うことができる。
さらに、エンドソーム融解ペプチド（Plank et al. 1998, Adv Drug Deliv Rev, 34, 21-35）のようなエンドソーム融解剤、または取り込まれた核酸のエンドソーム放出を増強するのに適する他の化合物は、本発明の組成物の有用な成分である。同様に、細胞透過ペプチド（別の状況では、タンパク質トランスダクションドメインとしても知られている）（Lindgren et al. 2000, Trends Pharmacol Sci, 21, 99-103）は、核酸の細胞内送達を仲介するために、本発明の組成物の有用な成分であり得る。いわゆるＴＡＴペプチドは、この分類に含まれ、核局在化機能も有する（Rudolph et al. 2003, J Biol Chem, 278, 11411-11418）。
本発明の組成物に含まれ得る磁気ナノ粒子は、磁力による送達の物理的標的指向化に有用であり、核酸転移の効率の劇的な増強、マグネトフェクションとしても知られているメカニズム（欧州特許出願公開第１２９７１６９号；Plank et al. 2011, Adv Drug Deliv Rev, 63, 1300-1331）に有用である。同様に、本発明の組成物は、超音波を介する核酸送達の物理的増強および標的指向化、ならびに任意で磁界適用に有用な非磁性または磁性マイクロバブルとすることもできる（Holzbach et al. 2010, J Cell Mol Med, 14, 587-599, Vlaskou et al. 2010, Adv Funct Mater, 20, 3881-3894）。量子ドット（Zintchenko et al. 2009, Mol Ther, 17, 1849-1856）、放射性トレーサーおよび医用画像用の造影剤を、核酸送達の追跡および核酸送達用組成物の生体内分布の決定に有利に用いることができる。まとめると、核酸送達用の非常に多数のエフェクターが報告されており、本発明の核酸とカチオン性剤とを含む組成物に有用な成分とすることができる。
本発明の（医薬）組成物に含まれる各成分の物質量に関しては非常に融通が効くことが当業者に周知である。例えば、プラスミドＤＮＡ用にいわゆる単分子２成分ポリプレックスが記載されており、組成物は、ポリカチオンとプラスミドＤＮＡとの混合により形成され、正確に１つのプラスミドＤＮＡ分子と、電荷の中和または電荷の過剰補償（負電荷よりも正電荷が多い）に必要な数のポリカチオン分子とを含むナノ粒子からなる（DeRouchey et al. 2006, J Phys Chem B. 110(10):4548-54）。トランスフェクションで多用されるＮ／Ｐ比のＰＥＩ−ＤＮＡ複合体については、蛍光相関分光法によって、平均３．５（±１）個のＤＮＡプラスミド分子と３０個のＰＥＩ分子とを含有する一方、該複合体の調製に用いられた該ＰＥＩ分子の約８６％が遊離形態であったことが見出された（Clamme et al. 2003, Biophys J 84,1960-1968）。対照的に、ＰＥＩとプラスミドＤＮＡとの複合体凝集物は、該成分分子を多数（１０〜１００個）含むことが推測され、トランスフェクションにおいて、小さな別々に離散したＰＥＩ−ＤＮＡナノ粒子よりも良い性能であったことが見出された（Ogris et al. 1998, Gene Ther, 5, 1425-1433; Ogris et al. 2001, AAPS PharmSci, 3, E21）。従って、本発明の（医薬）組成物は、少数のＲＮＡ分子、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡの分子を含む(ナノおよび／またはマイクロ)粒子とすることができるか、または、該粒子を含むことができるが、同様に、非常に多数のＲＮＡ分子、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡの分子を含む沈殿物または乾燥粉末のような微小物体であってもよいか、または、該微小物を含んでもよい。まとめると、本発明の組成物は、自己集合の前にそれら成分の投入比率によって特徴付けられる。ＲＮＡ成分、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡ成分に対する、個々の成分の代表的な投入重量／重量(ｗ／ｗ)比は、１〜５０である。Ｎ／Ｐ比は、カチオン性剤が化学的に十分定義付けられている場合、２成分カチオン性剤組成物についての投入比の好適な尺度である。本発明の組成物が更なる成分を含む場合、Ｎ／Ｐ比の割り当ては曖昧となり得る。この場合は、好適な投入比は、限定されないが、ゲル遅延度アッセイ、臭化エチジウム置換／消光アッセイのような蛍光消光アッセイを含む実験；粒子サイジングおよびゼータ電位測定；および、本明細書中で記載するようなトランスフェクションアッセイのような機能性アッセイによって決定される。追加のポリアニオンまたは遮蔽ポリマーを含む三重複合体では、正味の電荷比（負電荷に対する正電荷）が１より小さくなる場合があり、ゼータ電位は中立または負となる場合がある。
本発明の（医薬）組成物は、下に説明するように製造することができる。自己集合過程の後、本発明の組成物は、組み込まれていない成分から分離してもよく、同じ工程で、懸濁媒体を、遠心分離または限外濾過またはサイズ排除クロマトグラフィーまたは透析または関連する任意の方法によって置換することができる。精製または未精製の、本発明の組成物の成分の化学量論は、ＵＶ／ＶＩＳ分光法もしくは蛍光相関分光法（DeRouchey et al. 2006, J Phys Chem B. 110(10):4548-54）のような分光法を含む様々な分析方法によって、個々の成分の直交蛍光もしくは放射性同位体標識によって、または該組成物の分解(物)に対するＮＭＲおよびＩＲ分光法もしくはクロマトグラフィー分析および定量によって、決定することができる。分解は、例えば、本明細書中で記載するようなヘパリンまたはコンドロイチン硫酸のようなポリアニオンを過剰量添加することによって、またはドデシル硫酸ナトリウムの添加によって、達成することができる。
本発明は、本発明の（医薬）組成物の製造方法にも関する。ＰＥＩまたは本発明のオリゴマー、ポリマーもしくはリピドイドのようなカチオン性剤は、本明細書中に記載するように製造し精製することができる。これらは、水溶液中でまたは乾燥粉末として保存することができ、乾燥粉末の場合には、前記組成物を製造する前に、該オリゴマー、ポリマーまたはリピドイドが、水性媒体、好ましくは水に再溶解される。前記溶液のｐＨは、必要に応じて、酸、好ましくは塩酸もしくはクエン酸を用いて、中性または僅かに酸性（最低でｐＨ４．５）に調整される。前記組成物に含まれる核酸がＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡである場合、前記ｐＨは、約４．５〜５．５、好ましくは約４．９〜５．１、より好ましくは約５．０に調整されることが好ましい。核酸は、当業者に周知の最高水準の技術に従って、生産され、精製される。前記核酸は、溶液として、水性媒体、好ましくは水中に提供される。任意で、前記カチオン性剤と前記核酸のいずれか一方またはその両方は、標的指向化リガンド、シグナルペプチド、細胞透過ペプチド、エンドソーム融解物質もしくは遮蔽ポリマーのようなエフェクター分子と化学的に連結される。しかしながら、前記エフェクター分子の化学的性質に応じて、該エフェクター分子は、化学結合によって結合される必要が無く、むしろ非共有結合、すなわち、静電相互作用、疎水性相互作用またはファンデルワールス相互作用に基づき、組成物の他のいずれかの成分との自己集合によって、本発明の組成物に組み込むことができる。この目的のため、個々の成分溶液のイオン強度、対イオンの種類、ｐＨまたは有機溶媒含有量を調整することが有利であり得る。
有機溶媒は、カチオン性剤、特に式（ＩＶ）のリピドイドのストック溶液の調製に用いることができ、脂質または疎水性オリゴマーもしくはポリマーのような、更なる弱水溶性または非水溶性成分の共集合に必要であり得る。適切な有機溶媒は、例えば、エタノールおよび他のアルコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、またはグリコフロールならびに国際公開第２０１３／０４５４５５号に記載される他の溶媒のような水混和性溶媒である。一実施形態では、本発明のリピドイド含有組成物は、リピドイドと、前記溶媒のいずれか、好ましくはエタノールに溶解されたヘルパー脂質のような更なる成分と、水性媒体に溶解され、好ましくは酸性ｐＨに緩衝化されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡとから調製される。第一工程では、有機相に溶解された成分が所望の化学量論比で混合されて、最適な有機溶媒で所望の最終体積まで希釈される。前記脂質に対して所望の最終比率に相当する量のＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡを水性媒体に希釈する。好ましくは水性媒体の体積は、少なくとも、有機溶媒の該複合成分溶液の体積と等しい。好ましくは、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡを含む水相の体積は、有機溶媒の該複合成分溶液の体積を超えており、最も好ましくは、水相と有機相との体積／体積（ｖ／ｖ）比が４：１である。第二工程では、リピドイド含有有機混合液が、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡの水溶液に、好ましくはボルテックスしながら、迅速に投入される。任意で、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡの溶液およびリピドイド含有成分の溶液は、この工程の前または後に最高７０℃まで加熱される。必要であるまたは所望される場合、前記有機溶媒は、直ちに、蒸発、透析、限外濾過、透析濾過またはサイズ排除クロマトグラフィーによって除去することができると同時に、同工程で、分散媒をＰＢＳのような最終的に所望する緩衝組成に交換することができる。任意で、前記組成物は、無菌化のためにおよび／または単分散製剤を得るために所望の孔サイズの膜フィルターから押し出すことができる。
上述する混合手法の代替として、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡと、リピドイド成分とを、例えばヒロタら（Hirota et al. 1999, Biotechniques, 27, 286-290）もしくはカスパーら（Kasper et al. 2011, Eur J Pharm Biopharm, 77, 182-185）によって報告されたようなマイクロ混合用自動化装置を用いて、またはクアンら（Xuan et al. 2010, Microfluidics and Nanofluidics, 9, 1-16）によって検討されたようなマイクロ流体集束によって、混合することができる。
本発明のリピドイド含有組成物を得る代替法は、中間体としてリポソームまたはミセルを介することである。リポプレックスは、水性懸濁液に含まれるミセルまたはリポソームであり、多くの場合、市販のトランスフェクション試薬から調製される。本発明のリピドイドを、ミセルまたはリポソームを調製することに用いてもよい。ミセルおよびリポソームを調製する多数の手法が本技術分野で公知であり、いずれかの方法を本発明のリピドイドと共に用いて、ミセルおよびリポソームを作製すればよい。加えて、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡ、小型分子、タンパク質、ペプチド、金属、有機金属化合物などを含むあらゆる化学物質をミセルまたはリポソームに含めることができる。ある実施形態では、リポソーム（脂質またはリピドイドのビヒクル）が自発的集合によって形成される。別の実施形態では、薄い脂質フィルムまたは脂質ケーキが水和されて脂質結晶性二重層の積み重ねが流動性になり膨張するときに、リポソームが形成される。攪拌の間に水和した脂質シートが脱離し、自己閉鎖して、大きな多重膜ビヒクル（ＬＭＶ）を形成する。これは、端で、水と前記二重層の炭水化物コアとの相互作用を阻む。これらリポソームを一旦形成すると、超音波エネルギーの投入（超音波処理）または機械的エネルギーの投入（押出）（Szoka et al, 1980, Ann Rev Biophys Bioeng, 9, 467-508）によって、前記粒子のサイズを修正し縮小することができる。リポソームの調製は、水和用のリピドイドを準備し、撹拌しながら該リピドイドを水和させ、リポソームの均一分布を達成するために該ビヒクルをサイジングすることを伴う。個の目的のため、本発明の組成物に含まれる脂質成分を、クロロホルムのような有機溶媒に溶解してストック溶液とする。次いで、前記成分を所望の化学量論比で混合し、丸底フラスコのような適切な容器内での回転蒸発によって前記有機溶媒を除去して、該容器の壁の上に薄い脂質のフィルムを生じさせる。好ましくは、前記フィルムを、高真空中で乾燥させる。リピドイドフィルム／ケーキの水和は、乾いたリピドイドの容器に水性媒体を添加し、その混合物を撹拌することによって、行われる。超音波エネルギーを用いたＬＭＶ懸濁液の破壊は、１５〜５０ｎｍの直径を有する小さな単層ビヒクル（ＳＵＶ）を生成する。脂質押出は、脂質懸濁液を、所定の孔サイズを有するポリカーボネートフィルターに強制的に通して、用いた該フィルターの孔サイズに近い直径を有する粒子を得る手法である。１００ｎｍの孔を有するフィルターによる押出は、典型的に、１２０〜１４０ｎｍの平均直径を有する大きな単層ビヒクル（ＬＵＶ）を生成する。ある種のリピドイドは、核酸（例えば、ＤＮＡおよびｍＲＮＡ）のような、ある種の分子の周囲で自発的に自己集合して、リポソームを形成することができる。幾つかの実施形態では、その用途が、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡの送達である。これらリピドイドの使用は、追加の工程または押出機のような追加の装置を必要とすることなく、リポソームの単純な会合を可能にする。
ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡを含む本発明の組成物は、次いで、前記成分の溶液の混合の際の自己集合によって調製することができる。自己集合は、ピペッティングおよび振盪／ボルテックスを用いた手動混合によって、または例えばヒロタら（Hirota et al. 1999, Biotechniques, 27, 286-290）もしくはカスパーら（Kasper et al. 2011, Eur J Pharm Biopharm, 77, 182-185）によって報告されたようなマイクロ混合用自動化装置を用いて、またはクアンら（Xuan et al. 2010, Microfluidics and Nanofluidics, 9, 1-16）によって検討されたようなマイクロ流体集束によって、行うことができる。本発明の組成物が、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡと、本発明のカチオン性剤とに加えて更なる成分を含む場合は、連続する混合が必要とされ得る。この場合、更なる成分は、前記カチオン性剤と該ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡとの自己集合の後に添加されてもよく、またはそれらのいずれか一方に混合の前に添加されてもよい。混合工程の最適な順序は、追加成分の化学的性質に左右されるであろう。例えば、前記追加成分が負に帯電している場合、カチオン性剤との混合の前のＲＮＡ成分、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡ成分に、または該カチオン性剤と該ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡとの予備形成複合体に、該追加成分を最適に加えることができ、該予備形成複合体では、該オリゴマー、ポリマーまたはリピドイド、該(ｍ)ＲＮＡとアニオン性追加成分との負電荷の合計に対する正電荷の比において、過剰量で存在する。逆もまた同様に、前記追加成分がカチオン性である場合には、(ｍ)ＲＮＡとの混合の前に、オリゴマー、ポリマーまたはリピドイドに該追加成分を加えることが最適である。または、前記追加成分を化学量論で用いて(ｍ)ＲＮＡの負電荷を部分的に中和し、次いで本発明のオリゴマー、ポリマーまたはリピドイド溶液と混合してもよい。マグネトフェクション用の(ｍ)ＲＮＡ含有複合体の場合、塩誘導性コロイド凝集が、(ｍ)ＲＮＡとポリカチオンまたはカチオン脂質と磁気粒子とを含む組成物の調製に適した手段であることが示されている（欧州特許出願公開第１２９７１６９号）。(ｍ)ＲＮＡがカチオン性オリゴヌクレオチドである特別な事例では、ポリアニオンを、本発明のオリゴマー、ポリマーまたはリピドイドと該(ｍ)ＲＮＡとの自己集合に用いることができる。この場合、本発明のカチオン性剤は、前記カチオン性オリゴヌクレオチドと混合されてから、前記ポリアニオンと混合される。本発明の組成物を得るために非常に多くの配合選択肢が利用可能であることは、当業者に周知である。個々の成分の濃度は、本発明の組成物の意図される使用に従って選択される。関連するパラメータは、(ｍ)ＲＮＡ成分の最終濃度、および上述する成分の比率である。細胞培養物中の(ｍ)ＲＮＡ送達のために、１〜１００μｇ／ｍＬの最終(ｍ)ＲＮＡ濃度が一般に好ましい。インビボ用途のためには、有用な最終(ｍ)ＲＮＡ濃度を最高５ｍｇ／ｍＬとすることができる。
本発明の（医薬）組成物、または１つ以上のその成分（ＲＮＡおよびカチオン性剤、１つ以上のヘルパー脂質、ナノ粒子およびマイクロ粒子など）は、水性懸濁液で保存することもでき、乾燥させることもできる。従って、好ましい一実施形態では、本発明の（医薬）組成物または１つ以上のその成分が、乾燥形態、任意でフリーズドライ（凍結乾燥）形態で保存される。他の好ましい一実施形態では、前記（医薬）組成物、または、ＲＮＡおよびカチオン性剤（またはその複合体）のような１つ以上のその成分は、例えばリオプロテクタントと共に凍結乾燥される。より好ましい一実施形態では、乾燥または凍結乾燥された複合体または（医薬）組成物（または１つ以上のその成分）が、リオプロテクタントも含む。リオプロテクタントは、（凍結）乾燥された物質を保護する分子である。そのような分子は、典型的には、糖類（単糖類、二糖類および多糖類）、多価アルコール、ならびにそれらの誘導体のようなポリヒドロキシ化合物である。トレハロースおよびスクロースは、乾燥処理加工の天然の保護剤であることが知られている。トレハロースは、干ばつ期の間に休眠状態（無水生活としても知られている）にある様々な植物、菌類および無脊椎動物によって生産される。糖類、例えば、トレハロース、ラクトース、ラフィノース、スクロース、マンノース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、ポリエチレングリコール、デキストリン、尿素、マルトデキストリン、フルクタン、マルトオリゴ糖、マンノオリゴ糖、シクロイヌロヘキサオース、ヒドロキシエチルデンプン、デキストラン、イヌリン、ポリビニルピロリドンなど、またはアミノ酸、例えばトリプトファン、グリシンおよびフェニルアラニンなどが、本発明の範囲で特に適したリオプロテクタントである。最も好ましくは、トレハロースが本発明に関して用いられる。そのため、より具体的な一態様では、本発明の医薬組成物は、トレハロースまたは１つまたは複数の他のリオプロテクタントを更に含む。
［医薬品態様］
本発明の医薬組成物は、胃腸管（内）に投与する（「胃腸内投与」とも称される）するために固形剤として製剤化される。胃腸内投与とは、本発明の医薬組成物が最終的に胃腸管内に送達される任意の投与（形態）を意味する。胃腸内投与には、経口投与、直腸内投与、および、プローブ／チューブ（胃チューブ、腸プローブ、および、腹部プローブ（腹壁を通したプローブ）など）を介した投与が含まれる。一般的には、直腸内投与が好ましく、本発明では経口投与が特に好ましい。特に、本発明の医薬組成物は：
（ｉ）胃腸内投与（経口投与、直腸内投与、または、プローブ／チューブを介した投与など）されるかまたはすることができ；
（ｉｉ）胃腸内投与（経口投与、直腸内投与、または、プローブ／チューブを介した投与など）用に設計または製剤化されるかまたはすることができ；
（ｉｉｉ）胃腸内投与（経口投与、直腸内投与、または、プローブ／チューブを介した投与など）用であり；かつ／または
（ｉｖ）胃腸内投与（経口投与、直腸内投与、または、プローブ／チューブを介した投与など）を予定している。
そのため、医薬組成物は胃腸内投与（経口投与、直腸内投与、または、プローブ／チューブを介した投与など）に好適となるように設計される。胃腸内投与するために、本発明の化合物（ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ、および、カチオン性剤、好ましくは該ＲＮＡと複合化したもの）を含む医薬組成物、または、該ＲＮＡおよび該カチオン性剤を含む本明細書に規定の組成物は、固形剤として製剤化される。本発明の医薬組成物は、例えば、顆粒剤、スフィア剤、ペレット剤、錠剤、坐剤、コーティング錠、フィルム剤、分包散剤、硬質または軟ゼラチンカプセル剤の形態を取り得る。本発明の剤形、特に固形剤は、例えば、特にフィドラーの“Lexikon der Hilfstoffe” 5th Edition, Editio Cantor Verlag Aulendorf 2002、“The Handbook of Pharmaceutical Excipients”, 4th Edition, American Pharmaceuticals Association, 2003で言及されている、製剤で通常使用されている１つ以上の賦形剤を使用し、“Pharmazeutische Technologie”, 11th Edition Deutscher Apotheker Verlag 2010”または“Pharmazeutische Techologie”, 9th Edition. Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart, 2012”などに記載されているような当業者に周知の方法に従って製剤化され得る。これらは、原則として、担体、希釈剤または充填剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動化剤、安定化剤、界面活性剤、膜形成剤、軟化剤、湿潤剤、甘味剤、色素／着色剤、抗酸化剤、保存料などから選択され得る。このような１つまたは複数の賦形剤は固体であることが好ましいが、固形剤が得られる範囲で他の１つまたは複数の賦形剤も使用してもよい。
原則として、「固形剤」は固体として提供かつ／または投与することができる任意の剤形である。より具体的には、本発明の「固形剤」は、本発明の医薬組成物に含まれるＲＮＡに対して何らかの保護（例えば、胃腸管内での分解からの保護）を付与し、かつ／または、該ＲＮＡの（例えば胃腸管内での分解に対する）耐性に寄与しかつ／または該耐性を向上する剤形である。本発明に関して使用される固形剤は当該技術分野で周知であり、例えば、“Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie”, 8th edition, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart (チャプタ−１４)に記載されている。
固形剤は、例えば、顆粒剤、スフィア剤、１つまたは複数のペレット剤、１つまたは複数の錠剤、１つまたは複数の坐剤、１つまたは複数のコーティング錠、１つまたは複数のフィルム剤、１つまたは複数の散剤、１つまたは複数の分包散剤、１つまたは複数の丸剤、および、１つまたは複数のカプセル剤（１つまたは複数の２ピース式カプセル剤など）からなる群から選択され得る。このような剤形はまた当該技術分野で周知であり、例えば、上述の“Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie”、“Pharmazeutische. Technologie”, 10th edition, Deutscher Apotheker Verlag Stuttgart、および、“Innovative Arzneiformen”, 2010 (ISBN 978-3-8047-2455-6), Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgartに記載されている。
より具体的には、散剤（およびその製造）は上述の“Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie”のチャプター１４．２に、顆粒剤（およびその製造）はそのチャプター１４．３に記載されている。丸剤、錠剤（およびその製造）は上述の“Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie”のチャプター１４．４に記載されている。ペレット剤（およびその製造）は上述の“Innovative Arzneiformen”のチャプター８に記載されている。カプセル剤（およびその製造）は上述の“Pharmazeutische Technologie”のチャプター１１に記載されている。坐剤（およびその製造）は上述の“Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie”のチャプター１３，１４、および、上述の“Pharmazeutische Technologie”のチャプター１３に記載されている。
例えば、本発明によれば、散剤を使用して顆粒剤を製造したり、散剤および／または顆粒剤を使用してペレット剤を製造したり、かつ／または、散剤および／または顆粒剤および／またはペレット剤を使用して１つまたは複数の錠剤、丸剤またはカプセル剤を製造してもよい。
具体的な一態様では、１つまたは複数のカプセル剤は１つまたは複数のゼラチンカプセル剤であり得る。典型的には、ゼラチンカプセル剤は硬質または軟ゼラチンカプセル剤である。本発明に関して特に好ましいのは硬質ゼラチンカプセル剤である。好適なカプセル、特にゼラチンカプセルは、当該技術分野で周知であって市販されており、例えば、Ｃａｐｓｕｇｅｌ（登録商標）ベルギーＮＶ（ベルギー、ボルネム）から「Ｃｏｎｉ−Ｓｎａｐ（登録商標）」カプセル、「ＯＢｃａｐｓ（登録商標）」カプセル、「ＰＣｃａｐｓ（登録商標）」カプセル（または他のカプセル）として入手でき、上述の“Pharmazeutische Technologie”のチャプター１１に記載されている。
他の具体的な一態様では、坐剤は、例えば上述の“Pharmazeutische Technologie”のチャプター１３に記載されているように直腸坐剤であり得る。
好適な結合剤には、限定されないが、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、α化（コーン）スターチ、および、それらの組み合わせが含まれる。
好適な担体／充填剤／希釈剤には、限定されないが、微結晶セルロース、マンニトール、ショ糖、または、ラクトースなどの他の糖もしくは糖誘導体、リン酸水素カルシウム、スターチ、好ましくはコーンスターチ、低置換ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、および、それらの組み合わせが含まれる。
好適な滑沢剤には、限定されないが、ステアリン酸マグネシウム、ケイ酸アルミニウムまたはカルシウム、ステアリン酸、硬化ヒマシ油、ＰＥＧ４０００−８０００、タルク、ベヘン酸グリセリル、ステアリン酸フマル酸ナトリウム、および、それらの組み合わせが含まれる。
好適な流動化剤には、限定されないが、コロイダルシリカ（Ａｅｒｏｓｉｌ ２００など）、三ケイ酸マグネシウム、粉末化セルロース、タルク、および、それらの組み合わせが含まれる。
好適な崩壊剤には、限定されないが、カルボキシメチルセルロースカルシウム（ＣＭＣ−Ｃａ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ−Ｎａ）、架橋ＰＶＰ（例えば、クロスポビドン、ポリプラスドンまたはコリドンＸＬ）、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ポテトスターチ、グアーガム、架橋ＣＭＣ（クロスカルメロースナトリウム、例えばＡｃ−Ｄｉ−Ｓｏｌ）、カルボキシメチルスターチＮａ（スターチグリコール酸ナトリウム、例えばＰｒｉｍｏｊｅｌまたはＥｘｐｌｏｔａｂ）が含まれる。
好適な湿潤剤には、ラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤が含まれる。
さらに、本発明の胃腸内投与用の固体医薬組成物／固剤形は、フィルム形成ポリマー、不透明化剤、着色剤および可塑剤などの混合物などの市販のコーティング材を使用した当業者に周知のコーティング法によって、例えば、フィルムコーティングまたは放出調整コーティングを使用してコーティングしてもよい。各コーティングは胃液耐性コーティングとしてもよい。しかしながら、発明に関して実証されるように、コーティング、特に胃液耐性コーティングは、ＲＮＡを本発明に従って固形剤として経口投与（または直腸内投与もしくはプローブ／チューブを介した投与）する場合、すなわち、ＲＮＡが本発明の医薬組成物に含まれる場合は、効果的にＲＮＡを発現させるために必ずしも必要ではない。
胃腸内投与用の調製物は、本発明の化合物（例えば、ｍＲＮＡとカチオン性剤との複合体）の制御放出／調整放出を図るために、放出制御マトリックスなどの他の手段によって好適に製剤化され得る。
好適な賦形剤のリストはまた、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (Alfonso R. Gennaro, ed.; Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990)；Remington: the Science and Practice of Pharmacy 19th Ed.( Lippincott, Williams & Wilkins, 1995)；Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rdEd. (Arthur H. Kibbe, ed.; Amer. Pharmaceutical Assoc, 1999)；the Pharmaceutical Codex: Principles and Practice of Pharmaceutics 12th Ed. (Walter Lund ed.; Pharmaceutical Press, London, 1994)；The United States Pharmacopeia: The National Formulary (United States Pharmacopeial Convention)；および、 Goodman and Gilman's: the Pharmacological Basis of Therapeutics (Louis S. Goodman and Lee E. Limbird, eds.; McGraw Hill, 1992)などの教科書に見出され得、それらの開示内容を本明細書に参照により援用する。好適な賦形剤（ゼラチンなど）、担体およびコーティングは、上述の“Lehrbuch der Pharmazeutischen Technologie”にも記載されている。
具体的な一実施形態では、本発明の医薬組成物は食事／食物サプリメントまたは食物の形態である。これに関して、本発明の医薬組成物は食事／食物に添加かつ／または食事／食物と共に投与され得る。さらに、本発明の医薬組成物は食物と共にまたは食物として投与され得る。再度述べるが、本実施形態に関しても、医薬組成物が固形剤として製剤化されていることが肝要である。そのため、各食事／食物も固体であることが想定される。そうでない場合、食事／食物に含まれる少なくとも医薬組成物が、消化中および／または消化後に固体形状を維持するように製剤化されることが想定される。各剤形の例は、（難溶または不溶な）顆粒剤、ペレット剤、（小）カプセル剤などである。各食事／食物の例は、シリアルバー、ビスケット、スナック、キャンディー、ペストリー、パン、ミューズリー、パスタなどである。
具体的な一態様では、本実施形態の医薬組成物は小児問題に関して使用するためのもの、すなわち、子供の疾病の治療（予防）に使用するためのものである。
食事／食物として（食事／食物の形態で）提供される場合、医薬組成物は特に子供に耐容がある。
食事／食物としては、人間の食事／食物だけでなく、動物用の餌も含まれる。
更なる一態様では、本発明は、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡを、特に固形剤として胃腸内投与することによって、組織または標的細胞内へ送達するための本発明の（医薬）組成物または記載したカチオン性剤の使用に関する。「ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡを細胞へ送達する」という用語は、好ましくは、該ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡを細胞内へ移動させることを意味する。前記使用は、インビボまたはインビトロで行うことができる。
本発明はまた、本発明の（医薬）組成物を、特に固形剤として胃腸内投与することにより、標的細胞または標的組織と接触させる工程を含む、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡを標的細胞または標的組織へ送達する方法に関する。そのような方法は、インビボで行うことができる。前記接触は、当業者に既知の手段および方法によって達成し得る。インビボでは、細胞または組織との接触は、例えば、当業者に既知の投与経路によって、特に遺伝子治療の分野でも原則用いられている胃腸内投与によって、前記組成物を個体に投与することにより達成することができる。前記組成物の製剤化および個体への投与の可能な方法は、本明細書の別の箇所にも記載されている。
「インビボ」という用語は、生きている生物の身体にもたらされるあらゆる適用をいい、前記生物は、好ましくは、多細胞生物であり、より好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。「インビトロ」という用語は、生きている生物の身体から単離されて該生物の外側にある部分、例えば、細胞、組織および臓器にもたらされるあらゆる適用をいい、前記生物は、好ましくは、多細胞生物であり、より好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
本発明はまた、本発明の組成物、および／または、ＲＮＡと、ＰＥＩまたは本明細書に記載のオリゴマー、ポリマーもしくはリピドイドのようなカチオン性剤と、任意で医薬として許容される担体および／または希釈剤とを含む、医薬組成物に関する。「医薬組成物」という用語は、対象に投与することができる、本明細書に記載の組成物の医薬として許容される形態をいう。
「医薬として許容される」という用語は、本発明の組成物が医薬組成物として製剤化されることを意味し、該医薬組成物は、更に医薬として許容される担体および／または希釈剤を含み得る。そのため、本発明の医薬組成物は、医薬として許容される担体および／または希釈剤を更に含み得る。適切な医薬担体の例は、当該技術分野で周知であり、得られる医薬組成物が本発明の固形剤として製剤化される限りにおいて、（上述の）結合剤、担体、充填剤、希釈剤、滑沢剤、流動化剤、崩壊剤、賦形剤、および、様々な種類の湿潤剤などが挙げられる。そのような担体を含む組成物は、周知の常法によって製剤化することができる。
本発明の医薬組成物は、好適な用量で対象に投与することができる。投与計画は、担当医および臨床学的因子によって決定されるであろう。医療分野で周知のように、ある一対象に対する投与量は、対象の大きさ、体表面積、年齢、投与される特別な化合物、性別、投与の期間および経路、全身の健康状態、ならびに同時に投与される他の薬剤を含む、多数の要因によって左右される。活性物質の典型的な用量は、例えば、１ｎｇから数グラムの範囲とすることができる。(ｍ)ＲＮＡ療法への適用では、発現用または発現阻害用の(ｍ)ＲＮＡの用量が、この範囲に相当するべきであるものの、この例示的範囲を下回るまたは上回る用量が、特に上述する要因を考慮して、想定される。一般に、医薬組成物の標準的な投与としての投与計画は、１日あたり、体重１キログラムあたり０．１μｇ〜１０ｍｇ単位の範囲とすべきである。投与法が持続注入である場合、前記用量は、各々、体重１キログラムあたり１μｇ〜１０ｍｇ単位の範囲とすべきである。進捗は、定期評価によってモニタリングすることができる。投与量は変動するであろうが、本発明の組成物の構成成分としての(ｍ)ＲＮＡの静脈内投与に好ましい用量は、およそ１０６〜１０１９コピーの(ｍ)ＲＮＡ分子である。
原則として、「投与（される）」という用語は、前記組成物を対象の体内に導入するのに適したあらゆる方法を包含する。しかしながら、上述したとおり、本発明に関して使用する場合は、胃腸内投与法を主に包含する。そのため、好適な組成物の投与は様々な方法で達成され得るが、特に経口もしくは直腸内投与、または、プローブ／チューブを介した投与によって達成され得る。本発明の組成物は、特に、シェイらによって報告され（Shea et al. 1999, Nat Biotechnol, 17, 551-554）また欧州特許出願公開第１１９８４８９号明細書に記載されるような遺伝活性化マトリックスとして投与されてもよい。
原則として、本発明の医薬組成物は全身的に投与され得る。本発明はまた、本明細書の別の箇所に規定および記載されたように、ＲＮＡおよび／または該ＲＮＡから翻訳されたタンパク質を全身送達するための本発明の医薬組成物の使用、および、本発明の医薬組成物を胃腸内投与する工程を含む、前記ＲＮＡおよび／または該ＲＮＡから翻訳されたタンパク質を（それを必要とする）対象に全身送達する方法に関する。
例えば、（全身送達された）ＲＮＡから翻訳された（される）タンパク質は分泌タンパク質であり得る。これは、ＲＮＡが送達された胃腸管の上皮細胞により（腸細胞などにより）産生され得る。そのため、例えば血流を介して全身に送達され得る（腎臓内のシグナルを示す図３６の「ｂｒＰＥＩ」を参照）。よって、本発明は、本発明の医薬組成物を使用してタンパク質を全身送達する手段および方法を更に提供する。このタンパク質は本発明の医薬組成物に含まれるＲＮＡによりコードされている。
更に、本発明の医薬組成物は、該医薬組成物の意図される用途に応じて、インターロイキンまたはインターフェロンのような更なる薬剤を含んでもよい。
他の一実施形態では、本発明は、本発明の医薬組成物を、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡを該組成物に含有させて予防効果または治療効果を引き起こさせるために、（それを必要とする）患者に経口投与する工程を含む、治療（または予防）方法に関する。特に、「患者」という用語は、動物および人間を含む。
本発明は、更に、疾病、例えば本明細書の別の箇所に記載および定義された疾患の治療（または予防）に使用される本発明の医薬組成物に関する。
これに関して、医薬組成物は胃腸内投与され、かつ、固形剤として製剤化されることが想定される。
本発明の医薬組成物を投与することによって、疾患を治療、予防またはワクチン接種することができる。「疾患」という用語は、本発明の実施形態を用いることによって、治療、予防またはそれに対するワクチン接種することができる想定されるあらゆる病状をいう。
前記方法または医薬組成物の好ましい実施形態では、前記疾患が、先天性、後天性、感染性もしくは非感染性、加齢に伴う、心血管系、代謝性、消化器系、新生物性（特に癌）または遺伝性のものであり得る。疾患は、例えば、生体内での生理的過程、分子過程、生化学反応の異常に基づき得るし、それらは同様に、生体の遺伝的素養、化学物質または放射線への曝露のような行動的、社会的または環境的要因に基づき得る。特に好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、国際公開第２０１１／０１２３１６号に開示されるように治療（予防）のために／治療（予防）に用いられる。
原則として、本発明の医薬組成物ならびに各使用および各方法は、所定の１つまたは複数の疾患または疾病の治療（または予防）に限定されない。むしろ、本発明に従ってＲＮＡの胃腸内投与をすることにより、すなわち、本発明の医薬組成物を胃腸内に投与することにより、任意の疾患または疾病を治療（または予防）することを想定している。この点、以下の３つの治療（予防）領域が想定される。
第１は、（胃）腸管に関する局所的な疾患を治療（または予防）するための患者への胃腸内投与である。それぞれの最も著名な例はクローン病および潰瘍性大腸炎（炎症性腸疾患）である。この領域に関しては、ｍＲＮＡは、例えば、関連するシグナル伝達経路と相互作用する任意の抗炎症因子をコードし得る。ＩＬ−１０などが例として挙げられ得る。同様に、対応する１つまたは複数のシグナル伝達経路と相互作用する胃腸管内の抗体の局所的な発現が想定される（例えば、抗ＴＮＦα抗体；Ｈｕｍｉｒａ）。更なる局所的（例えば局所的炎症性）疾患が存在し得る。
第２は、欠損タンパク質、特に通常全身で産生される欠損タンパク質を置換するための患者への胃腸内投与である。この領域に関しては、胃腸管の上皮細胞がｍＲＮＡを発現し、また、翻訳されたタンパク質が患者の血液循環中に分泌されてその機能を全身的に発揮することが期待される。非限定的な例は、ＥＰＯ、ｈＧＨ、ｈＣＳＦ、血液凝固因子（ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ）などである。各疾患は代謝または遺伝疾患であり得る。他の非限定的な例は、リソソーム蓄積病などの酵素置換が必要な治療の場合における機能性酵素の発現であり得る（Leader, Nature Reviews Drug Discovery 7, 2008, 21-39を参照）。さらに、血流中に分泌された際に、抗体が局所的に発現され、遠位部の臓器においてその機能を発揮することが考えられる（例えば、炎症性疾患、癌など；http://www.pharmazeutische-zeitung.de/index.php?id=35238またはhttp://www.vfa.de/de/arzneimittel-forschung/datenbanken-zu-arzneimitteln/amzulassungen-gentec.htmlなども参照）。
この領域に関して、本発明の医薬組成物は下記化合物を代表し得る（すなわち、各ＲＮＡは下記化合物をコードし得る）。各疾患は治療（または予防）され得る。
ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）、または、ペガプタニブ（Ｍａｃｕｇｅｎ（登録商標））のような血管形成阻害剤。オマリズマブ（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標））のような抗喘息薬。エポエチンα（Ｅｐｒｅｘ（登録商標）、Ｅｒｙｐｏ（登録商標））、エポエチンα、バイオシミラー（エポエチンαＨｅｘａｌ（登録商標）、Ｂｉｎｏｃｒｉｔ（登録商標）、Ａｂｓｅａｍｅｄ（登録商標））、エポエチンθ（Ｂｉｏｐｏｉｎ（登録商標）、Ｅｐｏｒａｔｉｏ（登録商標））、エポエチンζ、バイオシミラー（Ｓｉｌａｐｏ（登録商標）、Ｒｅｔａｃｒｉｔ（登録商標））、エポエチンβ（Ｎｅｏｒｅｃｏｒｍｏｎ（登録商標））、エポエチンδ（Ｄｙｎｅｐｏ（登録商標））、ダーベポエチンα（Ａｒａｎｅｓｐ（登録商標），Ｎｅｓｐｏ（登録商標））、または、メトキシ−ポリエチレングリコール−エポエチンβ（Ｍｉｒｃｅｒａ（登録商標））のような抗貧血薬。ヒトインスリン、遺伝子組換え体（Ｉｎｓｕｍａｎ（登録商標）、Ａｃｔｒａｐｈａｎｅ（登録商標）、Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｗｉｎｔｈｒｏｐ（登録商標）など）、インスリンリスプロ（Ｈｕｍａｌｏｇ（登録商標））、インスリンアスパルト（ＮｏｖｏＲａｐｉｄ（登録商標））、インスリングルリジン（Ａｐｉｄｒａ（登録商標））、インスリングラルギン（Ｌａｎｔｕｓ（登録商標）、Ｏｐｔｉｓｕｌｉｎ（登録商標））、インスリンデテミル（Ｌｅｖｅｍｉｒ（登録商標））、グルカゴン（Ｇｌｕｃａｇｅｎ（登録商標））、エキセナチド（Ｂｙｒｅｔｔａ（登録商標））、または、リラグルチド（Ｖｉｃｔｏｚａ（登録商標））のような抗糖尿病薬。インターフェロン−α−２ａ（Ｒｏｆｅｒｏｎ Ａ（登録商標））、ペグインターフェロン−α−２ａ（Ｐｅｇａｓｙｓ（登録商標））、インターフェロン−α−２ｂ（Ｉｎｔｒｏｎ Ａ（登録商標）），ペグインターフェロン−α−２ｂ（Ｐｅｇｉｎｔｒｏｎ（登録商標）、Ｖｉｒａｆｅｒｏｎｐｅｇ（登録商標）、Ｖｉｔｒｏｎ（登録商標））、インターフェロン−γ−１ｂ（Ｉｍｕｋｉｎ（登録商標））、パリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）、または、エンフビルチド（Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標））のような抗感染薬／呼吸系治療薬。エファリズマブ（Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標））、アレファセプト（Ａｍｅｖｉｖｅ（登録商標））、ウステキヌマブ（Ｓｔｅｌａｒａ（登録商標））、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、または、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））のような抗乾癬薬。リツキシマブ（ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標））、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、ゴリムマブ（Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標）），セルトリズマブペゴル（Ｃｉｍｚｉａ（登録商標））、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、アナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標））、アバタセプト（Ｏｒｅｎｉｃａ（登録商標））、トシリズマブ（Ｒｏａｃｔｅｍｒａ（登録商標））、または、カナキヌマブ（Ｉｌａｒｉｓ（登録商標））のような抗リウマチ薬。ストレプトキナーゼ（Ｓｔｒｅｐｔａｓｅ（登録商標））、ウロキナーゼ（Ｃｏｒａｓｅ ５００．０００（登録商標））、アブシキシマブ（Ｒｅｏｐｒｏ（登録商標））、アンチトロンビンα（Ａｔｒｙｎ（登録商標））、レピルジン（Ｒｅｆｌｕｄａｎ（登録商標））、デシルジン（Ｒｅｖａｓｃ（登録商標））、ビバリルジン（Ａｎｇｉｏｘ（登録商標））、レテプラーゼ（Ｒａｐｉｌｙｓｉｎ（登録商標））、または、テネクテプラーゼ（Ｍｅｔａｌｙｓｅ（登録商標））のような抗血栓薬／線維素溶解薬。エプタコグα（活性型）（Ｎｏｖｏｓｅｖｅｎ（登録商標））、オクタコグα（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ（登録商標）、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）、Ｈｅｌｉｘａｔｅ（登録商標）、Ｋｏｇｅｎａｔｅ（登録商標））、モロクトコグα（Ｒｅｆａｃｔｏ（登録商標））、または、ノナコグα（Ｂｅｎｅｆｉｘ（登録商標））のような凝固因子。エクリズマブ（Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標））のような溶血阻害薬。フォリトロピンβ（Ｐｕｒｅｇｏｎ（登録商標）、Ｆｅｒｔａｖｉｄ（登録商標））、フォリトロピンα（Ｇｏｎａｌ−ｆ（登録商標））、コリフォリトロピンα（Ｅｌｏｎｖａ（登録商標））、ルトロピンα（Ｌｕｖｅｒｉｓ（登録商標））、フォリトロピンα／ルトロピンα（Ｐｅｒｇｏｖｅｒｉｓ（登録商標））、または、コリオゴナドトロピンα（Ｏｖｉｔｒｅｌｌｅ（登録商標））のような受胎障害治療（または予防）用ホルモン。インターフェロン−β−１ｂ（Ｂｅｔａｆｅｒｏｎ（登録商標），Ｅｘｔａｖｉａ（登録商標））、インターフェロン−β−１ａ（Ｒｅｂｉｆ（登録商標）、Ａｖｏｎｅｘ（登録商標））、ナタリズマブ（Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標））、または、グラチラマーアセテート（Ｃｏｐａｘｏｎｅ（登録商標））のような免疫系（多発性硬化症など）調節薬。（ウサギ由来）抗ヒトＴリンパ球グロブリン（ＡＴＧ−Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ（登録商標）Ｓ）、（ウサギ由来）抗Ｔ細胞グロブリン（Ｔｈｙｍｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅ（登録商標））、バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標））、または、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標））のような免疫抑制薬（移植片対宿主病の予防など）。Ｂ型肝炎（ｒＤＮＡ）ワクチン（ＨＢＶＡＸＰＲＯ（登録商標）、Ｆｅｎｄｒｉｘ（登録商標）、Ｅｎｇｅｒｉｘ（登録商標）−Ｂ）、ヒトパピローマウイルスワクチン（Ｃｅｒｖａｒｉｘ（登録商標）、Ｇａｒｄａｓｉｌ（登録商標））、肺炎球菌結合型ワクチン（Ｓｙｎｆｌｏｒｉｘ（登録商標））、または、経口コレラワクチン（Ｄｕｋｏｒａｌ（登録商標））のようなワクチン。ジボテルミンα（Ｉｎｄｕｃｔｏｓ（登録商標））、または、エプトテルミンα（Ｏｓｉｇｒａｆｔ（登録商標））のような骨成長因子。ドルナーゼα（Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標））のような嚢胞性線維症治療薬。テリパラチド（Ｆｏｒｓｔｅｏ（登録商標））、パラチロイドホルモン（Ｐｒｅｏｔａｃｔ（登録商標））、サケカルシトニン（Ｆｏｒｃａｌｔｏｎｉｎ（登録商標））、または、デノスマブ（Ｐｒｏｌｉａ（登録商標））のような骨粗鬆症治療薬。ドロトレコギンα（Ｘｉｇｒｉｓ（登録商標））のような敗血症治療薬。イミグルセラーゼ（Ｃｅｒｅｚｙｍｅ（登録商標））、アガルシダーゼα（Ｒｅｐｌａｇａｌ（登録商標））、アガルシダーゼβ（Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標））、ラロニダーゼ（Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ（登録商標））、イデュルスルファーゼ（Ｅｌａｐｒａｓｅ（登録商標））、ガルスルファーゼ（Ｎａｇｌａｚｙｍｅ（登録商標））、または、アグルコシダーゼα（Ｍｙｏｚｙｍｅ（登録商標））のような酵素補充薬。ロミプロスチム（Ｎｐｌａｔｅ（登録商標））のようの血小板成長因子。アルデスロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標））、タソネルミン（Ｂｅｒｏｍｕｎ（登録商標））、インターフェロンα−２ａ（Ｒｏｆｅｒｏｎ（登録商標）−Ａ）、インターフェロンα−２ｂ（ＩｎｔｒｏｎＡ（登録商標））、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、パニツムバム（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））、ニモツズマブ（Ｔｈｅｒａｌｏｃ（登録商標））、トラスツマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、ペルツズマブ（Ｏｍｎｉｔａｒｇ（登録商標））、エルツマキソマブ（Ｒｅｘｏｍｕｍ（登録商標））、リツキシマブ（ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標））、イブリツモマブ−チウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標））、アレムツズマブ（ＭａｂＣａｍｐａｔｈ（登録商標））、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、アスパラギナーゼ（アスパラギナーゼ ｍｅｄａｃ（登録商標））、ペグアスパラガーゼ（Ｏｎｃａｓｐａｒ（登録商標））、フィルグラスチム（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標））、フィルグラスチム、バイオシミラー（Ｂｉｏｇｒａｓｔｉｍ（登録商標）、フィグラスチムＨｅｘａｌ（登録商標）、フィグラスチム ｒａｔｉｏｐｈａｒｍ（登録商標）、Ｒａｔｉｏｇｒａｓｔｉｍ（登録商標）、Ｚａｒｚｉｏ（登録商標）、Ｔｅｖａｇｒａｓｔｉｍ（登録商標））、ペグフィグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））、レノグラスチム（Ｇｒａｎｏｃｙｔｅ（登録商標））、パリフェルミン（Ｋｅｐｉｖａｎｃｅ（登録商標））、ラスブリカーゼ（Ｆａｓｔｕｒｔｅｃ（登録商標））、チロトロピンα（Ｔｈｙｒｏｇｅｎ（登録商標））、または、オファツムマブ（Ａｒｚｅｒｒａ（登録商標））のような癌／腫瘍治療薬。ソマトロピン（Ｈｕｍａｔｒｏｐｅ（登録商標）、Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（登録商標）ＭｉｎｉＱｕｉｃｋ、ＮｕｔｒｏｐｉｎＡｑ（登録商標）、Ｚｏｍａｃｔｏｎ（登録商標）、ノルジトロピン Ｎｏｄｉｆｌｅｘ（登録商標）、ノルジトロピン Ｓｉｍｐｌｅｘｘ（登録商標）、Ｓａｉｚｅｎ（登録商標）、Ｏｍｎｉｔｒｏｐｅ（登録商標）、Ｖａｌｔｒｏｐｉｎ（登録商標））、メカセルミン（Ｉｎｃｒｅｌｅｘ（登録商標））、または、ペグビソマント（Ｓｏｍａｖｅｒｔ（登録商標））のような成長ホルモン。ベカプレルミン（Ｒｅｇｒａｎｅｘ（登録商標））のような創傷治療薬。
第３は、（組換え）タンパク質の免疫原性を回避するなどのために患者に局所的な寛容（経口寛容など）を誘発することである（Wang, Advanced Drug Delivery Reviews 65, 2013, 759-73を参照）。経口寛容とは、食物タンパク質などの無毒な抗原を経口投与することにより導入される、局所的および全身的に免疫不応答な状態である（Pabst, Mucosal Immunology 5(3), 2012, 232-9を参照）。経口寛容は、抗原に対するホルモン性および／または細胞性の免疫応答を、同じ抗原を経口経路で投与することにより特異的に抑制することと定義される。これは、胃腸管を使用して患者の血流内にタンパク質を翻訳および分泌する場合のｍＲＮＡ技術の更なる利点である。これにより、発現タンパク質に係る全ての免疫上の懸念を払拭することができる。これは特に、遺伝的欠陥により発現タンパク質が発現されていなかったために身体が該発現タンパク質に曝されたことがない遺伝的疾患に罹患する患者において、重要であると思われる。このような患者に未知のタンパク質を与えると（あるいは未知のタンパク質が発現すると）、免疫系はこのようなタンパク質を異物として認識する可能性が高い。免疫系が成熟する過程において存在していなかったからである。このような場合に、免疫寛容が確立されていると有益である。
そのため、具体的な一実施形態では、本発明の医薬組成物は、（例えば、上記第２の領域に関して、または、本明細書の別の箇所に記載および定義されているように、遺伝的疾患および／または治療（または予防）対象の疾患の治療と併用して）患者に局所的な（免疫）寛容（経口（免疫）寛容など）を誘発するために使用されるものである。
上記治療方法を踏まえ、他の一実施形態では、本発明は、組成物中に含有される前記ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡのような一本鎖ＲＮＡを疾患に罹患した患者の身体内の組織または臓器へ提供することによって治療することができる疾患の治療用医薬組成物を調製するための、本発明の組成物の使用に関する。
本発明の医薬組成物は、使用説明書または使用説明小冊子と共に提供され得る。この使用説明書／小冊子は、当業者／担当医が本発明に従って本明細書に記載の疾患または疾病をどのように治療または予防すべきかについての指針を含み得る。特に、この使用説明書／小冊子は、本明細書に記載の投与形態／投与レジメン（例えば、投与経路、用量レジメン、投与時間、投与頻度）についての指針を含み得る。特に、この使用説明書／小冊子は、医薬組成物を胃腸管（内）に投与（例えば、経口投与、直腸内投与、または、プローブ／チューブを介した投与（胃チューブなど））する旨の指示を含み得る。このような指示は、医薬組成物を、例えば、経口または直腸内投与するための（に設計された）固形剤として、投与する旨の指示を含み得る。原則として、投与形態／投与レジメンについて本明細書の別の箇所に記載した事項は、使用説明書／小冊子中に当業者／担当医のための指針として含まれ得る。
本発明の医薬組成物は、キット内に（またはキットの形態で）提供され得る。このキットは、本発明の医薬組成物の１つ以上の成分を、例えば１つ以上の個別の容器内に含み得る。例えば、このキットは、ＲＮＡ、カチオン性剤、および／または、１つまたは複数のヘルパー脂質を、例えば１つ、２つ、３つ（またはそれ以上の）個別の容器内にそれぞれ含み得る。このキットはまた、使用説明書または使用説明小冊子を含み得る。
さらなる説明のため、本発明の好ましい態様を次項にまとめる。これらは、先行する一般的開示の一部を形成し、そこで開示される好ましい実施形態も同様である。
下記実施例は、本発明を説明するものである。
［製造例Ｉ：Ｎ,Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１,３−プロパンジアミン修飾ポリ(アクリル酸)、ＭＷ：８，０００Ｄａ、ＰＡＡ８ｋ−(２-３-２)の合成］
５０ｍＭのＭＥＳを含有する反応バッファー（ｐＨ６．０）２ｍＬにポリ(アクリル酸)ナトリウム塩（ＭＷ：８，０００Ｄａ、シグマアルドリッチ社）１０ｍｇを希釈した。同じバッファー２ｍＬにＮ,Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１,３−プロパンジアミン（１００当量／カルボキシル基、シグマアルドリッチ社）１．６９ｇを希釈した。該オリゴ(アルキレンアミン)は遊離塩基として購入したため、ｐＨを３２％ＨＣｌの滴下によってｐＨ６．０に再調整した。前記ポリ(アクリル酸)溶液と前記オリゴ(アルキレンアミン)溶液とを混合した。反応を開始させるため、カルボキシル基あたり１０倍モル過剰量の１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（ＥＤＣ、シグマアルドリッチ社、反応バッファー２ｍＬに希釈）を加えた。最終体積を１０ｍＬに調整した。得られた混合物をオーバーヘッド型振盪機上で室温にて３時間インキュベーションした。得られた生成物を透析で精製した。この目的のため、該反応混合物をｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒ透析カセット（３〜１２ｍＬ、ＭＷＣＯ：３，５００Ｄａ、テルモフィッシャーサイエンティフィック社）内に充填し、水に対して７２時間透析を行った。水は、１日あたり２回交換した。透析後、精製したポリマーを凍結乾燥させた。同一条件下で、次の表１に列挙するポリマーを合成し、試験した。
［製造例ＩＩ：固相担持ペプチド合成によるブラシ様ポリマーの作製用のオリゴ(アルキレンアミン)構成要素の合成］
＜Ｉ．トリ(Ｂｏｃ)保護Ｎ，Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１，３−プロパンジアミン（ＥＰＥ(Ｂｏｃ)３）の合成＞
５ｇのＮ，Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１，３−プロパンジアミン（３１．２ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）に可溶化して、０℃まで冷却した。４．４３ｇのエチルトリフルオロアセテート（３１．２ｍｍｏｌ、１当量／分子）を１００ｍＬのＤＣＭに希釈して、該撹拌溶液に４時間かけて滴下した。添加後、得られた溶液を室温で一晩撹拌した。翌日、得られた反応混合物に１９．４６ｍＬのトリエチルアミン（１４．２ｇ、０．１４０４ｍｏｌ、１．５当量／遊離アミン）を加えた。３０．６４ｇのジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（０．１４０４ｍｏｌ、１．５当量／アミン）を１００ｍＬのＤＣＭに可溶化し、該撹拌溶液に滴下して、一定撹拌下、室温で２４時間インキュベーションした。反応の後、有機相をおよそ１００ｍＬにまで濃縮して、５％ＮａＨＣＯ３で３回、水で３回洗浄した。この有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、濾過し、溶媒を蒸発させた。得られた生成物を１００ｍＬのメタノールおよび２００ｍＬの３Ｍ ＮａＯＨ（２０当量／分子）に希釈して、室温で一晩撹拌した。メタノールを蒸発させて、水溶液をＤＣＭで３回洗浄した。有機相を集めて無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。得られた分子（ＥＰＥ(Ｂｏｃ)３）をＨ１−ＮＭＲで分析した。
＜ＩＩ．Ｆｍｏｃ−グルタミン酸修飾Ｂｏｃ化Ｎ，Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１，３−プロパンジアミン（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ(ＥＰＥ(Ｂｏｃ)３)−ＯＨ）の合成＞
３．５ｇのＮ−(９−フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−グルタミン酸（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯＨ、９．４７ｍｍｏｌ）を１００ｍＬの無水酢酸に混合して、油浴中で、還流しながら、溶液が透明になるまで撹拌しながら、１００℃に加熱した。得られた溶液を氷中で冷却して、６０℃の真空蒸発により溶媒を除去した。得られた生成物を１００ｍＬのテトラヒドロフランに可溶化した。５．２４ｇのＥＰＥ(Ｂｏｃ)３（１１．３７ｍｍｏｌ、１．２当量／分子）を１００ｍＬのテトラヒドロフランに希釈して、３．３ｍＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１８．９４ｍｍｏｌ、２当量／分子）と混合し、グルタミン酸含有溶液に加えた。得られた反応混合物を室温で２時間撹拌した。得られた溶液を蒸発によって濃縮した後、それをＤＣＭに希釈して、クエン酸三ナトリウムバッファー（０．１Ｍ、ｐＨ５．５）で３回洗浄した。有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後、このサンプルを、乾式カラムフラッシュクロマトグラフィーによりシリカカラム上でヘプタン／酢酸エチル（５０／５０から０／１００）および酢酸エチル／メタノール（１００／０から８０／２０）の段階グラジエントを用いて精製した。シリカＴＬＣ上でＵＶシグナルを含有する画分をプールし、溶媒を蒸発させて、得られた生成物をＨ１−ＮＭＲで分析した。
［製造例ＩＩＩ：固相担持ペプチド合成による直線状ポリマーおよび分枝状ポリマーの作製用のオリゴ(アルキレンアミン)構成要素の合成］
＜Ｉ．ジ(Ｂｏｃ)保護Ｎ，Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１，３−プロパンジアミン（ＥＰＥ(Ｂｏｃ)２）の合成＞
５ｇのＮ，Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１，３−プロパンジアミン（３１．２ｍｍｏｌ）を１００ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）に可溶化して、０℃まで冷却した。８．８６ｇのエチルトリフルオロアセテート（６２．４ｍｍｏｌ、２当量／分子）を１００ｍＬのＤＣＭに希釈して、該撹拌溶液に４時間かけて滴下した。添加後、得られた溶液を室温で一晩撹拌した。翌日、得られた反応混合物に１３ｍＬのトリエチルアミン（９．４７ｇ、０．０９３６ｍｏｌ、１．５当量／遊離アミン）を加えた。２０．４３ｇのジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（０．０９３６ｍｏｌ、１．５当量／アミン）を１００ｍＬのＤＣＭに可溶化し、該撹拌溶液に滴下して、一定撹拌下、室温で２４時間インキュベーションした。反応の後、有機相をおよそ１００ｍＬにまで濃縮して、５％ＮａＨＣＯ３で３回、水で３回洗浄した。この有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、濾過し、溶媒を蒸発させた。得られた生成物を１００ｍＬのメタノールおよび２００ｍＬの３Ｍ ＮａＯＨ（２０当量／分子）に希釈して、室温で一晩撹拌した。メタノールを蒸発させて、水溶液をＤＣＭで３回洗浄した。有機相を集めて無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。得られた分子（ＥＰＥ(Ｂｏｃ)２）をＨ１−ＮＭＲで分析した。
＜ＩＩ．サクシニル化Ｆｍｏｃ保護Ｂｏｃ化Ｎ，Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１，３−プロパンジアミン（Ｆｍｏｃ−ＥＰＥ(Ｂｏｃ)２−ＯＨ）の合成＞
３．０ｇの（ＥＰＥ(Ｂｏｃ)２）（８．３ｍｍｏｌ）を５０ｍＬのテトラヒドロフランに再溶解して、０℃まで冷却した。０．９９６ｇの無水コハク酸（１０ｍｍｏｌ、１．２当量／分子）を２００ｍＬのテトラヒドロフランに溶解して、該攪拌溶液に滴下した。添加後、得られた溶液を室温で更に１時間撹拌した。４．３４ｍＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３３．２ｍｍｏｌ、４当量／分子）を加えた。次いで、アセトニトリル／テトラヒドロフランに溶解した４．２ｇのＦｍｏｃ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（１２．４５ｍｍｏｌ、１．５当量／分子）を、該反応混合物に滴下した。得られた溶液を一晩攪拌した。得られた反応混合物をおよそ１００ｍＬにまで濃縮し、１００ｍＬのジクロロメタンと混合し、０．１Ｍクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．２）で５回洗浄した。この有機相を乾燥させ、濃縮し、得られた生成物を、乾式カラムフラッシュクロマトグラフィーによりシリカカラム上でｎ−ヘプタンから酢酸エチルへ（１００／０から０／１００）および更に酢酸エチル／メタノールまで（１００／０から８０／２０）の段階グラジエントを用いて精製した。シリカＴＬＣ上でＵＶシグナルを含有する画分をプールし、溶媒を蒸発させて、得られた生成物をＨ１−ＮＭＲで分析した。
［製造例ＩＶ：Ｎ，Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１，３−プロパンジアミンに基づくリピドイドの合成］
１００ｍｇのＮ，Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１，３−プロパンジアミン（０．６２３ｍｍｏｌ）を５７５．０７ｍｇの１，２−エポキシドデカン（３．１２ｍｍｏｌ、(Ｎ−１)当量：ここで、Ｎは、オリゴ(アルキレンアミン)１つあたりの、一級アミン量×２と二級アミン量×１との和である）と混ぜ、常時撹拌しながら８０℃で９６時間混合した。反応の後、得られたリピドイドを２５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５）で１００μｇ／ｍＬの濃度に希釈して、トランスフェクションに用いた。
同じ条件下で表２に列挙したリピドイドを合成した。
［製造例Ｖ：Ｎ,Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１,３−プロパンジアミン修飾ポリ(アリルアミン)；（ＰＡＬＡＭ−(２-３-２)）の合成］
５００ｍｇのポリ(アリルアミン)溶液（シグマアルドリッチ社、２０％ｗ／ｗ、分子量：１７，０００Ｄａ）を、５０ｍＭのＭＥＳを含有する２ｍＬの反応バッファー（ｐＨ６．０）に希釈した。１０．３３ｇのコハク酸（５０当量／アミン、シグマアルドリッチ社）を同じ反応バッファー５ｍＬに希釈した。これら溶液をプールして、ｐＨを６．０に調整した。反応を開始させるため、５ｍＬの反応バッファーに希釈した３．３６ｇの１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（ＥＤＣ、１０当量／アミン、シグマアルドリッチ社）を加えた。得られた混合物を、オーバーヘッド型振盪機上で室温にて３時間インキュベーションした。得られた生成物を透析によって精製した。この目的のため、該反応混合物をｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒ透析カセット（３〜１２ｍＬ、ＭＷＣＯ：１０，０００Ｄａ、テルモフィッシャーサイエンティフィック社）内に充填し、水に対して７２時間透析を行った。水は、１日あたり２回交換した。透析後、精製したポリマーを凍結乾燥させた。
５ｍｇの凍結乾燥させたコハク酸修飾ポリ(アリルアミン)を、５０ｍＭのＭＥＳを含有する２ｍＬの反応バッファー（ｐＨ６．０）に希釈した。５１０．３８ｍｇのＮ,Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１,３−プロパンジアミン（１００当量／カルボキシル基、シグマアルドリッチ社）を、同じバッファー２ｍＬに希釈した。該オリゴ(アルキレンアミン)は遊離塩基として購入したため、ｐＨを３２％ＨＣｌの滴下によってｐＨ６．０に再調整した。前記ポリ(アリルアミン)溶液と前記オリゴ(アルキレンアミン)溶液とを混合した。反応を開始させるため、カルボキシル基あたり１０倍モル過剰量の１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（ＥＤＣ、シグマアルドリッチ社、反応バッファー４ｍＬに希釈）を加えた。最終体積を１０ｍＬに調整した。得られた混合物をオーバーヘッド型振盪機上で室温にて３時間インキュベーションした。得られた生成物を透析で精製した。この目的のため、該反応混合物をｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒ透析カセット（３〜１２ｍＬ、ＭＷＣＯ：３，５００Ｄａ、テルモフィッシャーサイエンティフィック社）内に充填し、水に対して７２時間透析を行った。水は、１日あたり２回交換した。透析後、精製したポリマーを凍結乾燥させた。
同一条件下で、次の表３に列挙するポリマーを合成し、試験した。
［製造例ＶＩ：Ｎ,Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１,３−プロパンジアミン修飾ポリプロピレンイミン（ＰＰＩ−(２-３-２)）の合成］
１００ｍｇのポリプロピレンイミンヘキサデカアミンデンドリマー（ＰＰＩ、世代３．０、シグマアルドリッチ社）を、５０ｍＭのＭＥＳを含有する１．５ｍＬの反応バッファー（ｐＨ６．０）に希釈した。１１．２ｇのコハク酸（１００当量／一級アミン、シグマアルドリッチ社）を、３０ｍＬの同一反応バッファーに希釈した。これら溶液をプールして、ｐＨを６．０に再調整した。反応を開始させるため、２ｍＬの反応バッファーに希釈した１．８１ｇの１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（ＥＤＣ、１０当量／一級アミン、シグマアルドリッチ社）を加えた。得られた混合物を、オーバーヘッド型振盪機上で室温にて一晩インキュベーションした。得られた生成物を透析によって精製した。この目的のため、該反応混合物をｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒ透析カセット（３〜１２ｍＬ、ＭＷＣＯ：２，０００Ｄａ、テルモフィッシャーサイエンティフィック社）内に充填し、水に対して７２時間透析を行った。水は、１日あたり２回交換した。透析後、精製したポリマーを凍結乾燥させた。
１０ｍｇの凍結乾燥させたコハク酸修飾ＰＰＩを、５０ｍＭのＭＥＳを含有する２ｍＬの反応バッファー（ｐＨ６．０）に希釈した。０．７７６ｇのＮ,Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１,３−プロパンジアミン（１００当量／カルボキシル基、シグマアルドリッチ社）を、２ｍＬの同一バッファーに希釈した。該オリゴ(アルキレンアミン)は遊離塩基として購入したため、３２％ＨＣｌの滴下によってｐＨをｐＨ６．０に再調整した。前記ポリプロピレンイミン溶液と前記オリゴ(アルキレンアミン)溶液とを混合した。反応を開始させるため、カルボキシル基あたり１０倍モル過剰量の１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（ＥＤＣ、シグマアルドリッチ社、４ｍＬの反応バッファーに希釈）を加えた。最終体積を１０ｍＬに調整した。得られた混合物をオーバーヘッド型振盪機上で室温にて５時間インキュベーションした。得られた生成物を透析で精製した。この目的のため、該反応混合物をｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒ透析カセット（３〜１２ｍＬ、ＭＷＣＯ：３，５００Ｄａ、テルモフィッシャーサイエンティフィック社）内に充填し、水に対して７２時間透析を行った。水は、１日あたり２回交換した。透析後、精製したポリマーを凍結乾燥させた。
同一条件下で、次の表４に列挙するポリマーを合成し、試験した。
［製造例ＶＩＩ：Ｎ,Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１,３−プロパンジアミンおよび１−ブロモデカンに基づくリピドイドの合成］
１００ｍｇのＮ，Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１，３−プロパンジアミン（０．６２３μｍｏｌ）を１０ｍＬのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）と混合した。８１５．２μＬのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）と６９０．１ｍｇの１−ブロモデカン（３．１２μｍｏｌ、(Ｎ−１)当量：ここで、Ｎは、オリゴ(アルキレンアミン)１つあたりの、一級アミン量×２と二級アミン量×１との和である）と加え、常時撹拌しながら室温で２２時間混合した。得られた生成物を冷ｎ−ヘキサン中で２回沈殿させて、ＤＣＭに溶解した。溶媒を６０℃の蒸発によって除去した。得られたリピドイドをエタノールで５０ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈して、４℃で保存した。
［製造例ＶＩＩＩ：Ｎ,Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１,３−プロパンジアミンおよびＮ−ドデシルアクリルアミドに基づくリピドイドの合成］
１００ｍｇのＮ，Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１，３−プロパンジアミン（０．６２３μｍｏｌ）を７４６．９ｍｇのＮ−ドデシルアクリルアミド（３．１２μｍｏｌ、(Ｎ−１)当量：ここで、Ｎは、オリゴ(アルキレンアミン)１つあたりの、一級アミン量×２と二級アミン量×１との和である）と混ぜ、常時撹拌しながら９０℃で１９２時間混合した。得られたリピドイドをエタノールで５０ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈して、４℃で保存した。
［製造例ＩＸ：Ｎ,Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１,３−プロパンジアミンおよびドデシルアクリレートに基づくリピドイドの合成］
１００ｍｇのＮ，Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１，３−プロパンジアミン（０．６２３μｍｏｌ）を７５０ｍｇのドデシルアクリレート（３．１２μｍｏｌ、(Ｎ−１)当量：ここで、Ｎは、オリゴ(アルキレンアミン)１つあたりの、一級アミン量×２と二級アミン量×１との和である）と混ぜ、常時撹拌しながら９０℃で２２時間混合した。得られたリピドイドをエタノールで５０ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈して、４℃で保存した。
［製造例Ｘ：Ｎ,Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１,３−プロパンジアミンおよび１，２−エポキシドデカンに基づくリピドイドの合成］
１００ｍｇのＮ，Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１，３−プロパンジアミン（０．６２３μｍｏｌ）を５７５．０７ｍｇの１，２−エポキシドデカン（３．１２ｍｍｏｌ、(Ｎ−１)当量：ここで、Ｎは、オリゴ(アルキレンアミン)１つあたりの、一級アミン量×２と二級アミン量×１との和である）と混ぜ、常時撹拌しながら８０℃で９６時間混合した。得られたリピドイドをエタノールで５０ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈して、４℃で保存した。
［実施例１］
様々な細胞株内へのカチオン性ポリマーのｍＲＮＡ輸送能力の試験
＜材料および方法＞
（ポリプレックス形成）
インビトロでのトランスフェクションのため、ポリプレックスを４４μＬの体積で形成した。ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ（５−メチルシチジンおよび２−チオウリジンをそれぞれ２５％含む化学修飾ｍＲＮＡ）を１１００ｎｇ含有する注射用の水２２μＬを、所望量のポリマーを含有する注射用の水２２μＬと混合した。前記ポリマーのＲＮＡに対する比率を、核酸リン酸基あたりのポリマー窒素（Ｎ／Ｐ）として規定し、一定量の核酸を用いて試験を行った。該核酸と前記ポリマーとを混合した後、サンプルを室温にて３０分インキュベーションしてトランスフェクションに用いた。
（ポリプレックスのインビトロでのトランスフェクション）
ポリマーを２つの異なる細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３およびＡ５４９）に対するトランスフェクション効率について試験した。処理の２４時間前、５，０００個の細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）または７，０００個の細胞（Ａ５４９）を含む培地１００μＬを９６ウェルプレートの１ウェル内に播種した。トランスフェクション当日、記載されたようにポリプレックスを形成した。様々なｍＲＮＡ量を試験するため、５０％のポリプレックス溶液を同量の培地（ＦＣＳ無添加）と混合し、この溶液を用いて同様に更なる希釈などを行って、最終濃度６２．５ｎｇ／２０μＬに到達するまで、希釈系列を実施した。各希釈段階の２０μＬを、培地交換を行わずに、細胞に添加した。トランスフェクションから２４時間後、培地を除去した。１００μＬの溶解バッファー（２５ｍＭトリスＨＣｌ、０．１％トライトンＸ１００、ｐＨ７．８）の添加および室温で２０分間のインキュベーションによって、細胞を溶解した。溶解物８０μＬを９６ウェルプレートの１ウェル内に入れてＷａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２（パーキンエルマー社）でのルシフェラーゼ活性測定に用いた。この目的のため、１００μＬのルシフェラーゼアッセイ試薬（０．５ｍＭ Ｄ−ルシフェリン、０．３ｍＭ 補酵素Ａ、３３ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ炭酸マグネシウム、２．７ｍＭ硫酸マグネシウム、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，２０ｍＭトリシン）を加えて、化学発光を測定した。実験は三連で行った。
＜結果＞
図１に示すように、ルシフェラーゼの発現レベルは、様々な修飾ポリマー間で非常に変動する。ＰＡＡ８ｋ−(２−３−２)またはＰＡＡ８ｋ−(３−２−３) を用いると全ての細胞種で最も効率的なトランスフェクションレベルを達成でき、対照的に、アルキル鎖の１個が置換えられた（(２−２−２)および(３−３−３)）または除去された（２−２）オリゴ(アルキレンアミン)側鎖を含有する修飾ポリマーでは、当該効率が１０〜１０００倍と劇的に低減した。該オリゴ(アルキレンアミン)中のすべてのアルキル鎖の伸長（３−４−３）も当該効率が１００倍低下した。
［実施例２］
（２−３−２）および（３−２−３）修飾ＰＡＡ８ｋの複合体形成およびｍＲＮＡ結合能力
＜材料および方法＞
（ゲル移動度アッセイ）
ポリプレックスを１、２、４、８および１２のＮ／Ｐ比で実施例１に記載したように形成した。インキュベーションの後、５μＬのサンプルを、５μＬの２×ＲＮＡローディング色素（フェルメンタス社）と混合し、７０℃で１０分間インキュベーションし、臭化エチジウムを含有する１％アガロースゲルにローディングした。ＴＢＥバッファー中で１５０Ｖにて３０分間ゲル移動を行った。移動した核酸を２６０ｎｍのＵＶ吸収によって可視化した。
（リボグリーンアッセイ）
ポリプレックスを１、２、４、８および１２のＮ／Ｐ比で実施例１に記載したように形成した。インキュベーションの後、２μＬのサンプルを、９６ウェルプレートで、１４８μＬの水および５０μＬのリボグリーン溶液（１：２００、ＱｕａｎｔｉＴ Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ ＲＮＡアッセイキット、インビトロジェン社）と混合した。このサンプルを光の遮断下で室温にて５分間インキュベーションし、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２（パーキンエルマー社、１ｓ、Ｅｘ.：４８５ｎｍ、Ｅｍ.：５３５ｎｍ）を用いて蛍光を測定した。
＜結果＞
ポリマーが核酸と相互作用して安定な複合体を形成する能力は、効率的な輸送システムにとって重要な性質である。修飾ポリマーのｍＲＮＡとの相互作用を、ゲル移動度（図２）およびリボグリーンアッセイ（図３）によって分析した。ポリマーは、核酸と相互作用できる場合、安定な複合体を形成し、ナノサイズの粒子および電荷反転をもたらす。その両方の効果は、アガロースゲル電気泳動中の移動妨害である。図２に示されるように、（２−３−２）または（３−２−３）で修飾したＰＡＡ８ｋは、ポリマーを含まない（Ｎ／Ｐ比０）コントロールと比べ、遊離ｍＲＮＡの非存在／大幅な減少をもたらし、強い相互作用を示している。この結合は、至適基準分枝状ＰＥＩ（ｂｒＰＥＩ）と同じくらい効率的である。
これらデータは、リボグリーンアッセイを用いて確かめることができた。このアッセイでは、結合効率の増加が蛍光シグナルの低減を生じる。図３に示されるように、ＰＡＡ８ｋ−(２−３−２)およびＰＡＡ８ｋ−(３−２−３)の蛍光シグナルの低減は、ｂｒＰＥＩのものと同じくらい強い。よって、同様な安定性を有する複合体が生成されている。
［実施例３］
トランスフェクション効率がポリマー骨格と無関係であること
＜材料および方法＞
ポリプレックス形成は、実施例１に従って行った。
（ポリプレックスのインビトロでのトランスフェクション）
ポリプレックスのインビトロでのトランスフェクションおよび効率試験のため、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いた。処理の２４時間前に、５，０００個の細胞を含む１０％ＦＣＳ含有培地１００μＬを９６ウェルプレートの１ウェルに播種した。トランスフェクション当日、培地を、ＦＣＳ無添加培地１００μＬと交換した。ポリプレックスを、記載したように形成した。様々なｍＲＮＡ量を試験するため、２０μＬ（５００ｎｇ）、１０μＬ（２５０ｎｇ）、５μＬ（１２５ｎｇ）および２．５μＬ（６２．５ｎｇ）を該培地に加えた。３７℃にて５％ＣＯ２で４時間インキュベーションした後、培地を、新鮮な１０％ＦＣＳ含有培地と交換した。トランスフェクションから２４時間後、培地を除去した。細胞を、実施例１に記載したように、溶解して分析した。
＜結果＞
（２−３−２）修飾ポリマーを使用した細胞内への核酸の輸送能力がポリマー骨格構造と無関係であることを確認するため、様々な種類のポリマー（実施例１のポリ(アクリル酸)８，０００Ｄａに加えて）を、記載した条件下で（２−３−２）にて修飾した（表１）。結果は、様々な種類の骨格ポリマー（図４）および様々な鎖長（図５）は、オリゴ(アルキレンアミン)で修飾した場合に、顕著なレポーター遺伝子発現をもたらすことを示す。
［実施例４］
様々な種類のオリゴ(アルキレンアミン)で修飾したポリマーの細胞毒性の評価
＜材料および方法＞
実施例３に従って、トランスフェクションを行った。ＴＡＣＳ ＭＴＴ細胞増殖アッセイ（トレビジェン社）を用いて、生存細胞の決定を行った。トランスフェクションから２４時間後、培地を１００μＬの新鮮な培地と交換した。１０μＬのＭＴＴ試薬を加えた後、細胞を３７℃にて５％ＣＯ２で４時間インキュベーションした。１００μＬの溶解試薬を加えてから、室温で一晩インキュベーションした。読み取りは、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２（パーキンエルマー社）を用いて５７０ｎｍの吸光測定によって行った。結果は、未処理のコントロールに対する生存細胞の百分率として示される。
＜結果＞
図６に示すように、様々な修飾ポリマーは細胞毒性で相違した。（２−３−２）および（３−２−３）修飾ポリ(アクリル酸)（ＰＡＡ８ｋ−(２−３−２)、ＰＡＡ８ｋ−(３−２−３)、ＰＡＡ２０ｋ−(２−３−２)、ＰＡＡ７０ｋ−(２−３−２)）を含有する複合体で処理した細胞は、ほぼ１００％の生存率を示す一方、他の側鎖交互物（ＰＡＡ８ｋ−(３−４−３)、ＰＡＡ８ｋ−(３−３−３)）は、毒性標準（ｂｒＰＥＩ）と比べて強い毒性をもたらした。
［実施例５］
マウスにおけるメッセンジャーＲＮＡ輸送効率
＜材料および方法＞
（動物）
６〜８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスをジャンビエール社（Ｊａｎｖｉｅｒ，フランス）から得て、特定の病原体フリーの条件下で維持した。マウスを、実験前少なくとも７日間、動物施設の環境に慣れさせた。全ての動物実験手法は、地元の倫理委員会により承認され管理され、ドイツの動物保護法のガイドラインに従って実施した。
（ポリプレックス形成）
ポリプレックスを次のように形成した：ｍＲＮＡおよびＰＡＡ２０ｋ−(２−３−２)を４．０ｍＬの再蒸留水で希釈して、ｍＲＮＡ濃度を５００μｇ／ｍＬとし、また、ＰＡＡ２０ｋ−(２−３−２)を１０、２０、３０または４０のＮ／Ｐ比に相当する濃度とした。ｍＲＮＡ溶液をポリマー溶液にピペットで加え、上下のピペッティングによって混合し、２５０μｇ／ｍＬの最終ｍＲＮＡ濃度を得た。得られた複合体を、使用前に、周囲温度で２０分間インキュベーションした。
（エアロゾル装置の設計）
全身装置での噴霧手段のため、蓋で密封できる９．８ｃｍ×１３．２ｃｍ×２１．５ｃｍのプラスチックボックスにマウスを入れた。ボックスの狭い一側面に、エアロゾル流出穴として４個の小さい穴を配置した。このボックスを、反対側の狭い一側面の穴を通して直径２．１ｃｍの接続部品で幅１５．４ｃｍ×長さ４１．５ｃｍのプラスチックシリンダーに接続した。このシリンダーの底部は、このシリンダーの別の端に節側されたジェットネブライザー（ＰＡＲＩ ＢＯＹ(登録商標)ＬＣ ｐｌｕｓ，ＰＡＲＩ ＧｍｂＨ）により生成されるエアロゾルを乾燥させるため１５０ｇのシリカゲル（１〜３ｍｍ、＃８５３３０；フルカ社、スイス）で全体的に覆われている。（詳細は、ルドルフ(Ｒｕｄｏｌｐｈ)ら、J Gene Med. 2005, 7: 59-66に記載されている）
（インビボでの生物発光イメージングを用いたマウス肺でのルシフェラーゼ活性の測定）
投与から２４時間後、マウスを頸椎脱臼によって安楽死させた。正中線切開によって腹膜を開けた後、動物から肺を解剖してＰＢＳで灌流させた。肺を液体窒素中でカチカチに凍結させて凍った状態でホモジナイズした。４００μＬの溶解バッファー（２５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．８、トライトンＸ−１００、ロシュＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌタブレット）を加えた後、氷上で２０分間インキュベーションして、Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７チューブルミノメーター（ＥＧ＆Ｇベルトールド社、ドイツ）で上清中のルシフェラーゼ活性を測定した。
＜結果＞
実験は、ＰＡＡ２０ｋ−(２−３−２)と併用した経肺エアロゾル送達でマウスの肺細胞内でｍＲＮＡが効率的に発現したことを示し、該ポリマーがインビボで肺細胞内へｍＲＮＡを効率的に輸送できることを示している（図７参照）。
［実施例６］
ブタにおけるメッセンジャーＲＮＡ輸送効率
＜材料および方法＞
（ポリプレックス形成）
インビボでのトランスフェクションのために、ポリプレックスを２８ｍＬの体積で形成した。ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ５．８３ｍｇとβガラクトシダーゼをコードするｍＲＮＡ１．１７ｍｇとを含有する注射用の水１４ｍＬと、所望量のポリマーを含有する注射用の水１４ｍＬとを準備し、２チャネルシリンジポンプ（ＫＤＳ−２１０−ＣＥ；ＫＤサイエンティフィック社）で混合した。この装置の引張り機能を用いて、２本の２０ｍＬシリンジを満たした。シリンジをＴピース（Ｄｉｓｃｏｆｉｘ Ｃ ３ＳＣ、ビー・ブラウン社）によって接続し、この混合装置の注入機能を利用して、混合を行った。ポリマーのｍＲＮＡに対する比率は、核酸リン酸基あたりのポリマー窒素（Ｎ／Ｐ）で規定し、Ｎ／Ｐ比１０で試験した。核酸をポリマーと混合した後、サンプルを室温で３０分間インキュベーションし、２４ｍＬを噴霧に用いた。残りの容量は、物理化学的分析に用いた。純粋なサンプルの粒子サイズおよびゼータ電位を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ(マルバーン社)を用いて測定した。
（ブタへのエアロゾル投与の実験手法）
ブタの鎮静は、体重１ｋｇあたりアザペロン２ｍｇ、体重１ｋｇあたりケタミン１５ｍｇ、体重１ｋｇあたりアトロピン０．１ｍｇの前投薬およびその後の静脈ラインから側耳介静脈への挿入によって開始した。要量の体重１ｋｇあたり３〜５ｍｇのプロポフォールの必静脈注射により、ブタを麻酔した。必要量の１％プロポフォールの連続静脈注射で麻酔を維持した。換気パラメータを呼気終末二酸化炭素分圧と一致させ、必要に応じて調整した。麻酔、呼吸および心血管パラメータを、パルスオキシメトリー、カプノグラフ、直腸温プローブおよび反射状態を用いて連続的にモニタリングした。ブタに１０ｍＬ／ｋｇ／ｈの平衡電解液を注入した。麻酔の持続時間はおよそ８０〜１２０分であった。エアロゾル投与（エアロネブ(Ａｅｒｏｎｅｂ)メッシュネブライザー）が完了した後の術後鎮静後に側耳静脈を介し体重１ｋｇあたり１００ｍｇのペントバルビタールのボーラス注射によってブタを屠殺した。肺を切り取っておよそ１ｃｍの棒状にスライスし、肺の様々な領域から組織標本を集めてから、細胞培地に入れて３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータ内で２４時間インキュベーションした。ルシフェラーゼ活性の測定のため、組織標本を、Ｄ−ルシフェリン基質を含むＰＢＳ（１００μｇ／ｍＬ）を含む培地浴に入れて３７℃で３０分間インキュベーションし、エクスビボでのルシフェラーゼ生物発光イメージングを行った（ＩＶＩＳ １００、キセノゲン社、アメリカ）。
（ポリプレックスの透過型電子顕微鏡検査）
透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）のため、エアロゾル投与用に製造した混合物の液滴を用いた。この液滴を格子（プラノ社、ドイツ）上に置いた。５分間のインキュベーションの後、ろ紙を用いて液滴を除去した。サンプルを酢酸ウラニル溶液で染色して、透過型電子顕微鏡（Ｊｅｍ１０１１、日本電子株式会社）で分析した。
＜結果＞
図８に示すように、Ｎ／Ｐ比１０のＰＡＡ２０ｋ−(２−３−２)およびｍＲＮＡは、１００ｎｍ以下の流体力学複合体直径と４０ｍＶの表面電荷（ゼータ電位）とを有する複合体を生じた。両パラメータ範囲はｂｒＰＥＩベースの複合体と同じサイズで、これは、インビボで細胞内へ核酸を効率的に輸送することが既に示されている。この粒子は、ＴＥＭで分析して、丸い形状および均一なサイズを示す（図９）。図１０に示すように、これら粒子は、エアロゾル投与後に肺組織内へｍＲＮＡ（ホタルルシフェラーゼをコードする）を効率的に送達でき、標的タンパク質の発現を生じることができる。その発現レベルは、至適ｂｒＰＥＩを用いて形成したポリプレックスの噴霧と同等であった。
［実施例７］
複合体の凍結乾燥安定性
＜材料および方法＞
（サンプルの調製）
ＰＡＡ２０ｋ−(２−３−２)／ｍＲＮＡ（メトリディアルシフェラーゼをコードする）複合体を、異なる４本のバイアル中にＮ／Ｐ比２０、体積１ｍＬで、実施例１に記載するように形成した。１本のバイアルは更なる処理を行わずにトランスフェクションに用い、第２のバイアルには１１％トレハロース溶液を１００μＬ加えて、最終容量では１％トレハロースとした。第３のバイアルを凍結乾燥させて、１ｍＬの水で再水和させた。第４のバイアルは、１１％トレハロース１００μＬで処理してから、凍結乾燥させて、１ｍＬの水で再水和させた。
（トランスフェクション）
トランスフェクションの２４時間前に、５，０００個のＮＩＨ３Ｔ３細胞を含む１００μＬの培地を９６ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションした。トランスフェクション当日、培地を新鮮なＦＣＳ無添加培地１００μＬと置換した。２０μＬ、１０μＬ、５μＬおよび２．５μＬの各複合体溶液を細胞に三連で加えて、５００ｎｇ、２５０ｎｇ、１２５ｎｇおよび６２．５ｎｇでのトランスフェクションとした。トランスフェクションから２４時間後、培地を取り除き、収集して、新鮮な培地で置換えた。これを４８時間後および７２時間後にも繰り返した。収集した培地をメトリディアルシフェラーゼ活性について分析した。その目的のため、５０μＬの培地を９６ウェル白色プレートに入れ、２０μＬのセレンテラジン溶液（５０μＭセレンテラジンを含む５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー）と混合し、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２（パーキンエルマー社）を用いて化学発光シグナルを測定した。
＜結果＞
図１１に示すように、作りたての複合体は２４時間後にメトリディアルシフェラーゼの発現をもたらした。その発現は、更に２４時間安定した状態を保ち、次いで緩やかに低減した。この効果は、トレハロースの添加により悪影響を受けず、発現レベルの僅かな増加を生じた。凍結乾燥処理後、未処理の複合体は細胞をトランスフェクションすることができず、レポータータンパク質の発現が欠如した。対照的に、トレハロースの添加により、複合体および得られるトランスフェクション効率が保たれた。
［実施例８］
ＰＡＡ８ｋ−(２−３−２)およびＰＡＡ８ｋ−(３−２−３)のプラスミドＤＮＡ用輸送システムとしての利用
＜材料および方法＞
（ポリプレックス形成）
ｍＲＮＡの代わりにホタルルシフェラーゼをコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶＬｕｃ、プラスミドファクトリー社）を用いて、実施例１に記載するように、ポリプレックスを形成した。
（ポリプレックスを用いたインビトロでのトランスフェクション）
トランスフェクション実験を、実施例３に記載するように行った。
＜結果＞
この実験では、Ｎ，Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１，３−プロパンジアミン（２−３−２）修飾ポリマー（ポリ(アクリル酸)）のＤＮＡ輸送および生じるタンパク質発現における効率を、至適標準の分枝状ＰＥＩ（ｂｒＰＥＩ）と比較して分析した（図１２）。ｐＤＮＡとオリゴ(アルキレンアミン)(２−３−２)および(３−２−３)修飾ポリマーとからなる複合体を用いたＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクションが、レポータータンパク質の発現に顕著な増加をもたらしたことが明らかに示された。発現レベルは、至適標準のものよりも高かった。
［実施例９］
ＲＮＡ干渉を誘導するためのｓｉＲＮＡ用輸送システムとしてのＰＡＡ２０ｋ−(２−３−２)の利用
＜材料および方法＞
ＧＬ３−Ｌｕｃ ｓｉＲＮＡ（キアゲン社）を用いて、実施例１に記載するように、複合体を形成した。ｓｉＲＮＡ量の用量設定のため、その複合体を室温で３０分間インキュベーションした後に段階的に希釈した。その目的のため、２２μＬの複合体溶液を、ＦＣＳ無添加培地２２μＬと混合した。この希釈液２２μＬをＦＣＳ無添加培地２２μＬと再び混合した。この希釈系列を、２０μＬあたり７．８ｎｇのｓｉＲＮＡ濃度が達成されるまで繰り返した。ホタルルシフェラーゼを安定に発現しているＨｅＬａ細胞（ＨｅＬａ−Ｌｕｃ）を用い、各希釈段階２０μＬを実施例１で記載するようなトランスフェクションに用いた。ルシフェラーゼ発現のダウンレギュレーションに基づくＲＮＡ干渉の特異性に対するコントロールとして、細胞内発現に影響しないコントロールｓｉＲＮＡ（ＧＦＰ２２−ｓｉＲＮＡ、キアゲン社）を同一条件下のトランスフェクションに用いた。結果を、未処理コントロール細胞に対する相対ルシフェラーゼ発現量として示す。
＜結果＞
図１３に示すように、ＧＬ３-Ｌｕｃ−ｓｉＲＮＡ（ｓｉＬｕｃ）とＰＡＡ２０ｋ−(２−３−２)との複合体は、ルシフェラーゼ発現のダウンレギュレーションをもたらした。この効果は、用量依存的（低いｓｉＲＮＡ量で効果が低減した）かつ特異的（非特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＧＦＰ）に対して効果が無かった）であった。より高いＮ／Ｐ比では、ｓｉＧＦＰ処理細胞のシグナル減少によって示されるように、追加の非特異的効果が観察された。
［実施例１０］
オリゴ(アルキレンアミン)（２−３−２）に基づくリピドイド構造体の有益なｍＲＮＡ輸送効率
＜材料および方法＞
（リピドイド／ｍＲＮＡ複合体形成）
製造例ＩＶに記載するように、リピドイドを合成して希釈した。トランスフェクションのため、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ２５０ｎｇを含む５０μＬの水を、最適条件下で、４，０００ｎｇのリピドイドを含む５０μＬの水と混合して、ｗ／ｗ比（リピドイド重量／ｍＲＮＡ重量）を１６とした。室温で３０分間インキュベーションした後、サンプルをトランスフェクションに用いた。
（リピドイド／ｍＲＮＡ複合体を用いたインビトロでのトランスフェクション）
処理２４時間前に、５，０００個のＮＩＨ３Ｔ３細胞を含む培地１００μＬを、９６ウェルプレートの１ウェルに播種した。トランスフェクション当日、記載するようにポリプレックスを形成した。様々なｍＲＮＡ量を試験するため、５０％の複合体溶液を同量の培地（ＦＣＳ無添加）と混合し、この溶液を用いて同様の更なる希釈などを行い、１５．６ｎｇ／５０μＬの最終濃度に到達するまで希釈系列を行った。トランスフェクションに先だって、細胞から培地を除去してＦＣＳ無添加培地１００μＬで置換えた。各希釈段階の５０μＬを細胞に加えて、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベーションした。その後、培地を再び新鮮な１０％ＦＣＳ含有培地で置き換えた。トランスフェクションから２４時間後、培地を除去した。実施例１に記載するように、細胞を溶解して、溶解物をレポータータンパク質活性について分析した。
＜結果＞
図１４に示すように、構造体（２−３−２）に基づくリピドイドは、（２−２−２）または（３−３−３）に基づく類似構造体よりも高いホタルルシフェラーゼ発現レベルをもたらした。この効果は、取り付けたアルキル鎖（Ｃ１２またはＣ１４）とは無関係であることが実証できた。ホタルルシフェラーゼの活性はその細胞内での発現レベルと相関し、ひいては細胞内へのｍＲＮＡ輸送の効率と相関する。そのため、これら結果は、（２−３−２）に基づくリピドイドがインビトロでより効率的に細胞内へｍＲＮＡを輸送することを示す。
［実施例１１］
静脈内投与後のマウスにおけるリピドイド製剤のメッセンジャーＲＮＡ輸送効率
＜材料および方法＞
（動物）
６〜８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスをジャンビエール社（Ｊａｎｖｉｅｒ，フランス）から得て、特定の病原体フリーの条件下で維持した。マウスを、実験前少なくとも７日間、動物施設の環境に慣れさせた。全ての動物実験手法は、地元の倫理委員会により承認され管理され、ドイツの動物保護法のガイドラインに従って実施した。
（リピドイド製剤）
リピドイドは、ｍＲＮＡを用いて次のように形成した：Ｃ１２−(２−３−２)、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２ｋ（３．６：０．１８：０．７６：１重量比）をエタノールに溶解して、ホタルルシフェラーゼをコードする化学修飾ｍＲＮＡを含むクエン酸緩衝化溶液（１０ｍＭクエン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝４．５）中に脂質／ｍＲＮＡ重量比１０．５で速やかに注入して、最終エタノール濃度２０％を得て、水に対して透析を行った。得られたリピドイド／ｍＲＮＡ複合体は、正に帯電したナノ粒子（９２．６±０．７ｎｍ；２１．０±０．２ｍＶ）を生じ、これを、拘束したマウスの尾静脈内に静脈注射した。第二の実験では、前記リピドイド／ｍＲＮＡ複合体を静脈注射前にＰＢＳで調整して、殆ど帯電していないナノ粒子（９１．５±０．６ｎｍ；−０．７±０．２ｍＶ）を得た。
（インビボでの生物発光イメージングを用いたマウスにおけるルシフェラーゼ活性の測定）
投与から２４時間後、マウスを、メデトミジン（体重１ｋｇあたり１１．５μｇ）、ミダゾラム（体重１ｋｇあたり１１５μｇ）およびフェンタニル（体重１ｋｇあたり１．１５μｇ）の腹腔内注射によって麻酔した。Ｄ−ルシフェリン基質（マウス１匹あたり３ｍｇ／ＰＢＳ１００μＬ）を腹腔内注射によって投与した。１０分後に、ＩＶＩＳ １００イメージングシステム（キセノゲン社、アメリカ）およびカメラ設定；Ｂｉｎ(ＨＳ)、視野１０、ｆ１ ｆ−ｓｔｏｐ、高解像度ビニングおよび露出時間５分を用いて、生物発光を測定した。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン２．５０（キセノゲン社、アメリカ）を用いて、シグナルを定量し、分析した。
＜結果＞
実験は、リピドイド／ｍＲＮＡ複合体がほぼ中性の電荷を含むＰＢＳ中で製剤化された場合にのみ、マウスの腹部領域でｍＲＮＡが効率的に発現したが、水中で配合した場合は発現しなかったことを示す（図１６を参照）。
［実施例１２］
静脈内投与後のマウスにおける様々な臓器へのリピドイド製剤のメッセンジャーＲＮＡ輸送効率
＜材料および方法＞
（動物）
６〜８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスをジャンビエール社（Ｊａｎｖｉｅｒ，フランス）から得て、特定の病原体フリーの条件下で維持した。マウスを、実験前少なくとも７日間、動物施設の環境に慣れさせた。全ての動物実験手法は、地元の倫理委員会により承認され管理され、ドイツの動物保護法のガイドラインに従って実施した。
（リピドイド製剤）
リピドイドは、ｍＲＮＡを用いて次のように形成した：リピドイド、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＰＥ−ＰＥＧ２ｋ（８：６：５：１モル比）をエタノールに溶解して、ホタルルシフェラーゼをコードする化学修飾ｍＲＮＡを含むクエン酸緩衝化溶液（１０ｍＭクエン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝４．５）中にＮ／Ｐ比１５で速やかに注入して、最終エタノール濃度２０％を得て、水に対して透析を行った。得られたリピドイド／ｍＲＮＡ複合体は、正に荷電したナノ粒子を生じた。前記リピドイド／ｍＲＮＡ複合体を静脈注射前にＰＢＳで調整して、殆ど帯電していないナノ粒子を得た（表５参照）。
（インビボでの生物発光イメージングを用いたマウスでのルシフェラーゼ活性の測定）
投与から２４時間後、マウスを、メデトミジン（体重１ｋｇあたり１１．５μｇ）、ミダゾラム（体重１ｋｇあたり１１５μｇ）およびフェンタニル（体重１ｋｇあたり１．１５μｇ）の腹腔内注射によって麻酔した。Ｄ−ルシフェリン基質（マウス１匹あたり３ｍｇ／ＰＢＳ１００μＬ）を腹腔内注射によって投与した。１０分後に、ＩＶＩＳ １００イメージングシステム（キセノゲン社、アメリカ）およびカメラ設定；Ｂｉｎ(ＨＲ)、視野１０、ｆ１ ｆ−ｓｔｏｐ、高解像度ビニングおよび露出時間３０秒を用いて、生物発光を測定した。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン２．５０（キセノゲン社、アメリカ）を用いて、シグナルを定量し、分析した。続いて、臓器を解剖して、別々に再度イメージングを行った。
＜結果＞
実験は、マウスの腹部領域でｍＲＮＡが効率的に発現し、アルカン鎖長が短くなるにつれて増加したことを示した（図１７Ａ，Ｂを参照）。更に、実験は、肝臓へのｍＲＮＡ送達が、リピドイドのアルカン鎖長が増加するにつれて低減し（Ｃ１６＜Ｃ１４＜Ｃ１２）、Ｃ１６については殆ど検出できなかったことを示した。脾臓におけるルシフェラーゼ発現量は、Ｃ１４について最も高かった。肺ではルシフェラーゼ発現が幾らか観察されたが、心臓、腎臓、胃または脳では全く観察されなかった（図１８Ａ，Ｂを参照）。
［実施例１３］
様々なトランスフェクション試薬のｐＤＮＡおよびｍＲＮＡの送達能力の効率の比較
＜材料および方法＞
（ポリプレックス形成）
ホタルルシフェラーゼをコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶＬｕｃ、プラスミドファクトリー社）またはホタルルシフェラーゼをコードするプラスミドｍＲＮＡを用いて、実施例１に記載するように、ポリプレックスを形成した。
（ポリプレックスを用いたインビトロでのトランスフェクション）
トランスフェクション実験を、実施例３に記載するように行った。
＜結果＞
実験を行って、トランスフェクション効率が、もっぱらトランスフェクション媒体（ポリマー／リピドイド）に関連するか、または核酸の種類にも関連するかを実証した。ｐＤＮＡを効率的に輸送するトランスフェクション試薬が必ずしもｍＲＮＡ輸送の効率的なビヒクルでないことが明らかに示された（図１９）。このように、ｐＤＮＡに対して高いトランスフェクション効率を有する担体システムでは、ｍＲＮＡに対する効率の予測をすることができない。
［実施例１４］
Ｎ,Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１,３−プロパンジアミン（２−３−２）またはＮ,Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１,３−ブタンジアミン（２−４−２）で修飾したＰＡＡ８ｋのトランスフェクション効率の比較
＜材料および方法＞
（ポリプレックス形成）
ポリプレックスを、実施例１に記載するように形成した。
（ポリプレックスを用いたインビトロでのトランスフェクション）
トランスフェクション実験を、実施例３に記載するように行った。
＜結果＞
（２−３−２）で修飾したポリマーの効率が、構造（２−３−２）に強く関連するのか、または他のいずれかの構造２−Ｘ−２（Ｘ＞２）に対して同様の効率を示すのかを更に調べるため、ＰＡＡ８ｋをＮ,Ｎ’−ビス(２−アミノエチル)−１,３−ブタンジアミン（２−４−２）で修飾した。ＰＡＡ８ｋ−(２−３−２)とＰＡＡ８ｋ−(２−４−２)との比較（図２０）は、両ポリマーが、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡのトランスフェクション後に殆ど同一の高いルシフェラーゼ発現レベルを生じたことを示した。このことは、構造２−Ｘ−２（Ｘ＞２）で修飾したポリマーが、他のオリゴ(アルキルアミン)での修飾と比べて、一般にｍＲＮＡ輸送効率が向上したトランスフェクション試薬を生じることを裏付けた。
［実施例１５］
リピドイド製剤の透過型電子顕微鏡検査
＜材料および方法＞
（リピドイド製剤）
リピドイドは、ｍＲＮＡを用いて次のように形成した：Ｃ１０−(２−３−２)、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）または１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、コレステロールおよび１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−２０００]（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２ｋ）または１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＤＰＧ−ＰＥＧ２ｋ）（９：６：５：１モル比）をエタノールに溶解して、ホタルルシフェラーゼをコードする化学修飾ｍＲＮＡを含むクエン酸緩衝化溶液（１０ｍＭクエン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝４．５）中に脂質−窒素／ｍＲＮＡ−リン酸のモル比１７で速やかに注入して、最終エタノール濃度２０％を得て、水に対して２４時間透析を行った。
（透過型電子顕微鏡検査）
サイズ分析のため、ＴＥＭ（透過型電子顕微鏡検査）を倍率１０，０００および６０，０００で用いた。第１工程として、銅をベースとするプレート（プラノ社；Ｓ１６２−３）をプラズマ洗浄した。この処理の後、８μＬのリピドイド製剤を銅プレートに３分間接触させた。前記リピドイド製剤の液滴を除去した後、リピドイドを積載した銅プレートを８μＬの酢酸ウラニル溶液１滴と２度接触させて３０秒間おくことによって、サンプルを染色した。各工程の後、ろ紙で吸い取ることによって、液体を除去した。最後に、当該担体プレートを、室温で更に３０分間乾燥させて、Ｊｅｍ１０１１（日本電子株式会社）で分析した。
＜結果＞
ＴＥＭ写真（図２１）は、形成されたリピドイド製剤が、均一なサイズ分布を有する球形粒子であることを示す（概観像）。拡大写真では、これら粒子のサイズが６０〜８０ｎｍであると推定することができる。
［実施例１６］
アルキルハライドで合成したＣ１０−(２−３−２)のｍＲＮＡ輸送効率
＜材料および方法＞
（合成）
Ｃ１０−(２−３−２)の合成を、製造例ＶＩＩで記載するように行った。
（リピドイド製剤）
Ｃ１０−(２−３−２)、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＤＰＧ−ＰＥＧ２ｋ）を９：６：５：１のモル比で、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡとＮ／Ｐ比１７で用いて、実施例１５に記載するようにリピドイド／ｍＲＮＡ複合体を形成した。
（インビトロでのトランスフェクション）
処理の２４時間前に、５，０００個のＮＩＨ３Ｔ３細胞を含む培地１００μＬを９６ウェルプレートの１ウェルに播種した。トランスフェクション当日、リピドイドを、記載したように形成して、１０×ＰＢＳ溶液を用いて１×ＰＢＳに調整した。リピドイド製剤を希釈して、５００ｎｇ、２５０ｎｇまたは１２５ｎｇを含む５０μＬとし、細胞に加えて、３７℃にて５％ＣＯ２で４時間インキュベーションた。トランスフェクションから２４時間後、培地を除去した。実施例１に記載するように、細胞を溶解して、溶解物をレポータータンパク質活性について分析した。
＜結果＞
図２２に示すように、アルキルハライドで合成したＣ１０−(２−３−２)は、ｍＲＮＡを細胞内へ輸送し、レポータータンパク質であるルシフェラーゼの発現をもたらすことができた。
［実施例１７］
Ｎ−ドデシルアクリルアミドで合成したＣ１２−(２−３−２) のｍＲＮＡ輸送効率
＜材料および方法＞
（合成）
Ｃ１２−(２−３−２)の合成を、製造例ＶＩＩＩで記載するように行った。
（リピドイド製剤）
Ｃ１２−(２−３−２)、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＤＰＧ−ＰＥＧ２ｋ）を９：６：５：１のモル比で、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡとＮ／Ｐ比１７で用いて、実施例１５に記載するようにリピドイド／ｍＲＮＡ複合体を形成した。
（インビトロでのトランスフェクション）
トランスフェクション実験は、１ウェルあたり５００ｎｇ、２５０ｎｇまたは１２５ｎｇのｍＲＮＡ用量を用いて、実施例１６に記載するように行った。
＜結果＞
図２３に示すように、Ｎ−ドデシルアクリルアミドで合成したＣ１２−(２−３−２)は、ｍＲＮＡを細胞内へ輸送し、レポータータンパク質であるルシフェラーゼの発現をもたらすことができた。
［実施例１８］
ドデシルアクリレートで合成したＣ１２−(２−３−２) のｍＲＮＡ輸送効率
＜材料および方法＞
（合成）
Ｃ１２−(２−３−２)の合成を、製造例ＩＸで記載するように行った。
（リピドイド製剤）
Ｃ１２−(２−３−２)、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＤＰＧ−ＰＥＧ２ｋ）を９：６：５：１のモル比で、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡとＮ／Ｐ比１７で用いて、実施例１５に記載するようにリピドイド／ｍＲＮＡ複合体を形成した。
（インビトロでのトランスフェクション）
トランスフェクション実験は、１ウェルあたり５００ｎｇ、２５０ｎｇまたは１２５ｎｇのｍＲＮＡ用量を用いて、実施例１６に記載するように行った。
＜結果＞
図２４に示すように、ドデシルアクリレートで合成したＣ１２−(２−３−２)は、ｍＲＮＡを細胞内へ輸送し、レポータータンパク質であるルシフェラーゼの発現をもたらすことができた。
［実施例１９］
様々なヘルパー脂質および様々なリピドイド対ｍＲＮＡ（Ｎ／Ｐ）比率を用いて形成したＣ１２−(２−３−２)のｍＲＮＡ輸送効率
（リピドイド製剤）
Ｃ１２−(２−３−２)を、ＰＥＧ脂質としての１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ−ＰＥＧ２ｋ）と、ヘルパー脂質としてのＤＯＰＥまたはＤＳＰＣと組み合わせて用いて、Ｎ／Ｐ比を１７または８として、実施例１５に記載するようにリピドイド／ｍＲＮＡ複合体を形成した。
（インビトロでのトランスフェクション）
トランスフェクション実験は、１ウェルあたり２５０ｎｇのｍＲＮＡ用量を用いて、実施例１６に記載するように行った。
＜結果＞
図２５に示すように、Ｃ１２−(２−３−２)は、様々なヘルパー脂質（ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ）と組み合わせ、かつ、様々なＮ／Ｐ比（１７または８）において、ｍＲＮＡを細胞内へ輸送し、レポータータンパク質であるルシフェラーゼの発現をもたらすことができた。このように、Ｃ１２−(２−３−２)は、ヘルパー脂質およびＮ／Ｐ比とは無関係にＲＮＡを細胞内へ効率的に輸送できる。
［実施例２０］
Ｃ１２−(２−２−２)およびＣ１２−(３−３−３)と比べたＣ１２−(２−３−２)を含むリピドイド製剤の静脈投与後のマウスにおけるｍＲＮＡ輸送効率の向上
＜材料および方法＞
（動物）
実施例１１に記載する通りである。
（リピドイド製剤）
Ｃ１２−(２−３−２)、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、コレステロール、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ−ＰＥＧ２ｋ）と、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡとをＮ／Ｐ比１７で用いて、実施例１５に記載するように形成した。
（インビボ生物発光イメージングを用いたマウスにおけるＬｕｃ活性の測定）
実施例１１に記載するようにして、投与から６時間後に動物を麻酔した。
＜結果＞
図２６に示すように、Ｃ１２−(２−３−２)が含まれるリピドイド製剤は、Ｃ１２−(３−３−３) およびＣ１２−(２−２−２)と比較して、マウスでのレポーター遺伝子発現量の顕著な増加をもたらした。このことは、Ｃ１２−(２−３−２)の有益なｍＲＮＡ輸送能力を示している。
［実施例２１］
様々な量のアルキル鎖Ｃ１２で飽和したオリゴ(アルキレンアミン)（２−３−２）のｍＲＮＡ輸送効率の比較
＜材料および方法＞
（リピドイド製剤）
透析を行わず、様々な修飾度および修飾位置を有するオリゴ(アルキルアミン)（２−３−２）を用いて（図２７Ａの合成化合物を参照）、実施例１５に記載するように行った。
（インビトロでのトランスフェクション）
トランスフェクション実験は、１ウェルあたり２５０ｎｇのｍＲＮＡ用量を用いて、実施例１６に記載するように行った。
＜結果＞
図２７Ａに示すように、３種類のＣ１２−(２−３−２)を合成して、オリゴ(アルキレンアミン)１つあたりのアルキル鎖の量および位置のｍＲＮＡ輸送能力に対する影響を評価した。トランスフェクション効率（図２７Ｂ）は、レポータータンパク質発現量に相違を示さず、ｍＲＮＡ輸送効率における相違が観察できないことが証明された。このように、様々な種類のＣ１２-(２−３−２)リピドイド製剤が同一の効率でｍＲＮＡを輸送する。
［実施例２２］
リピドイド製剤の凍結乾燥
＜材料および方法＞
（リピドイド製剤）
実施例１５に記載するように形成した。
（凍結乾燥方法）
トレハロース、スクロースおよびラクトースのプロテクタント溶液を水で調製した（ｃ：２０％ｗ／ｖ）。２倍希釈系列を調製して、２０％から０．６２５％（ｗ／ｖ）までのプロテクタント溶液を作製した。これら溶液に対して同一体積のリピドイド製剤を加えて、ぴペッティングにより混合した。得られた溶液を、液体窒素中で凍結して、シグマα１−４（マーチン・クリスト社）を用いて凍結乾燥させた。凍結乾燥の後、粒子を同一体積の水で再懸濁して、分析に用いた。コントロールとして、リポプレックスを同一濃度でプロテクタント溶液と混合して、凍結および凍結乾燥を行わなかった。
（インビトロでのトランスフェクション）
１ウェルあたり２３３ｎｇのｍＲＮＡを用いて、実施例１５に記載するように行った。
（サイズ測定）
ＺｅｔａＳｉｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（マルバーン社）を用いて、粒子の流体力学直径を測定した。
＜結果＞
図２８に示すように、試験した糖類は全て、様々な濃度で粒子サイズおよびトランスフェクション効率を維持することができた。対して、プロテクタントを含まない（０％）粒子は、凝集プロセスのため、トランスフェクション効率が低下し、サイズが著しく増大した。
［実施例２３］
エクスビボでの哺乳動物組織へのＲＮＡ輸送
＜材料および方法＞
（リピドイド製剤）
Ｃ１２−(２−３−２)、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＤＰＧ−ＰＥＧ２ｋと、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡとをＮ／Ｐ比１７で用い、透析を行わずに、実施例１５に記載するように形成した。
（組織サンプルの処理）
新たに屠殺した動物（ブタまたはヒツジ；表参照）から約１ｃｍ３の組織片（筋肉、脂肪、動脈または肺；表参照）を取り出し、ＰＢＳ中で洗浄した。各組織片内に、１０μｇのＲＮＡを含有する１００μＬのリピドイド製剤または２０μｇのＲＮＡを含有する２００μＬのリピドイド製剤を注射した（表参照）。ヒツジ動脈の処理では、両端を糸で閉じた血管の内腔にリピドイド製剤を注射した。これら組織を、１０％ＦＣＳを含有する細胞培養液（ＤＭＥＭ）中で２４時間培養した。
（ルシフェラーゼ発現の分析）
２４時間後、サンプルを、ルシフェリン含有（１００μｇ／ｍＬ）ＰＢＳ中で３０分間インキュベーションした。インビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ、パーキンエルマー社）を用いて、ルシフェラーゼ活性を測定した。
＜結果＞
図２９に示すように、Ｃ１２−(２−３−２)は、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを異なる種の様々な異なる組織の細胞内に輸送して、ルシフェラーゼを発現することができた。対照的に、未処理サンプル（Ｄ、Ｅ、下側の組織片）は、イメージングシグナルを示さなかった。
［実施例２４］
インビトロでのアンジオテンシンＩ変換酵素２（ＡＣＥ−２）の発現
（リピドイド製剤）
Ｃ１２−(２−３−２)、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＤＰＧ−ＰＥＧ２ｋを用い、ｍＲＮＡを加えずに、実施例１５に記載するようにして、空のリポプレックスを作製した。ポストローディングによりリピドイドｍＲＮＡ複合体の形成を行った。この目的のため、ＡＣＥ−２をコードするｍＲＮＡ（１ｍｇ／ｍＬ）１μＬを４μＬのリポプレックス含有溶液と混合して、室温で１０分間インキュベーションした。
（インビトロでの細胞のトランスフェクション）
インビトロでのトランスフェクションのため、処理２４時間前に、３００，０００個のＨｅｐＧ２細胞を１０％ＦＣＳ含有培地２ｍＬで６ウェルプレートの１ウェルに播種した。トランスフェクション当日、培地を２ｍＬの新鮮な培地と交換した。記載するようにリピドイド製剤を調製して、５００ｎｇのｍＲＮＡを含有する２．５μＬを各ウェルに加えた。コントロールウェルには、製剤化においてｍＲＮＡを添加しなかったリピドイド製剤を同一量注入した。
（ウエスタンブロットによるＡＣＥ−２発現の検出）
トランスフェクションから２４時間後に、培地を除去して、細胞を１ｍＬのＰＢＳで洗浄した。細胞を、２５０μＬの溶解バッファー（２５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１％トライトンＸ、ｐＨ７．４）を用いて、氷上で１０分間溶解した。溶解物をかき集めた後、１４，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離によって破片を除去した。
タンパク質量の推定後（ＢＣＡアッセイ、テルモフィッシャーサイエンティフィック社）、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（テルモフィッシャーサイエンティフィック社）に１レーンあたり１０μｇをローディングした。１００Ｖにて１．５時間の電気泳動の後、ゲルをＰＶＤＦ膜（ＴｒａｎｓＢｌｏｔ、バイオラッド社）上にブロッティングした。ブロッティングの後、５％粉乳を含むＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて、前記膜を３０分間ブロッキングした。
ブロッキングの後、抗ＡＣＥ２抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を１：１０，０００希釈で用いて、前記膜を４℃で一晩プロービングした。３回の洗浄工程（各１０分、ＴＢＳ−Ｔ）の後、抗ヤギＨＲＰ抗体（ＳＣＢＴ）を１：１０，０００希釈で用いて、前記膜を室温で１時間プロービングしてから、３回の洗浄工程（各１０分、ＴＢＳ−Ｔ）を行った。発光ＨＲＰ基質（ＧＥヘルスケア社）を用いてシグナルを検出し、カメラ（ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋、バイオラッド社）を用いて前記シグナル分析した。ＡＣＥ２シグナルの検出後、抗ＧＡＰＤＨ抗体（ＮＥＢ）を１：１，０００希釈で用いて、均等なローディングであるかの分析を室温にて４時間行った。
＜結果＞
トランスフェクションのウエスタンブロット結果を図３０に示す。左側２レーンは、処理細胞の溶解物を示し、右側２レーンは、未処理細胞の溶解物を示す。明らかに分かるように、ＡＣＥ−２発現は、ＡＣＥ−２をコードするｍＲＮＡをポストローディングしたリピドイド製剤で処理したサンプルのみで観察された。この実験は、Ｃ１２−(２−３−２)含有リピドイド製剤によってＡＣＥ−２のｍＲＮＡも輸送できることを示す。また、空のリポプレックスにポストローディングする方法でも細胞内への効率的なｍＲＮＡ輸送をもたらすことを示す。
［実施例２５］
Ｂａｌｂ／ｃマウスでのマウスエリスロポエチン（ｍＥＰＯ）の発現
＜材料および方法＞
（リピドイド製剤）
Ｃ１２−(２−３−２)、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＤＭＰＥ−ＰＥＧ２ｋと、マウスエリスロポエチン（ｍＥＰＯ）をコードするｍＲＮＡとをＮ／Ｐ比１５で用いて、実施例１５に記載するように形成した。
（動物）
実施例１１に記載する通りである。
（動物の処理）
リピドイド製剤を１×ＰＢＳに調整し、各１３０μＬにｍＲＮＡをそれぞれ５μｇ、１０μｇおよび２０μｇ含むように希釈した。各用量につき、３匹のマウスを静脈注射で処理した。コントロールとしては、マウスをＰＢＳで処理した。処理から６時間後に血液を採取してマウスＥＰＯレベルについて分析した。
（マウスＥＰＯの定量）
マウスエリスロポエチンの定量を、マウスＥＰＯ ＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄシステムズ社）によって、製造業者のプロトコルに従って行った。
＜結果＞
この実験では、Ｃ１２−(２−３−２)含有リピドイド製剤中に配合したマウスＥＰＯのｍＲＮＡによる処理後のマウスでのマウスエリスロポエチンの発現量を定量した。図３１に示されるように、６時間後、全ての処理群において、ＰＢＳ処理コントロール群よりも顕著に高い濃度でマウスＥＰＯが検出できた。このように、マウスＥＰＯのｍＲＮＡは、細胞内に効率的に輸送されて、当該タンパク質の発現をもたらした。
［実施例２６］
オリゴ(アルキレンアミン)(２−３−２)修飾直線状ポリマーポリ(アリルアミン)のメッセンジャーＲＮＡ輸送効率
＜材料および方法＞
（ポリプレックス形成）
オリゴ(アルキレンアミン)（２−３−２）、（２−２−２）または（３−３−３）で修飾したポリ(アリルアミン)（ＰＡＬＡＭ）を用いて、実施例１に記載するように形成した。ポリマー合成は、製造例Ｖを参照。
（ポリプレックスのインビトロでのトランスフェクション）
５００ｎｇのｍＲＮＡを用いて、Ｎ／Ｐ比を１２として、実施例１に記載するように、ＮＩＨ３Ｔ３細胞をトランスフェクションした。
＜結果＞
図３２に示すように、ｍＲＮＡとＰＡＬＡＭ−(２−３−２)とのポリプレックスでトランスフェクションした後の細胞は、ＰＡＬＡＭ−(２−２−２)／ｍＲＮＡ複合体またはＰＡＬＡＭ−(３−３−３)／ｍＲＮＡ複合体でトランスフェクションした後の細胞よりも顕著に高いルシフェラーゼ発現量を示した。このように、これら結果は、交互アルキル鎖を有するオリゴ(アルキレンアミン)による直線状アミン末端ポリマーの修飾が、直線状カルボキシル末端ポリマー骨格におけるものと同じ有利な効果をもたらすことを示す。
［実施例２７］
オリゴ(アルキレンアミン)（２−３−２）で修飾した樹枝状ポリマーポリプロピレンイミンのメッセンジャーＲＮＡ輸送効率
＜材料および方法＞
（ポリプレックス形成）
オリゴ(アルキレンアミン)（２−３−２）、（２−２−２）または（３−３−３）で修飾したポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）を用いて、実施例１に記載するように形成した。ポリマー合成は、製造例ＶＩを参照。
（ポリプレックスのインビトロでのトランスフェクション）
５００ｎｇのｍＲＮＡを用いて、Ｎ／Ｐ比を３２として、実施例１に記載するように、ＮＩＨ３Ｔ３細胞をトランスフェクションした。
＜結果＞
図３３に示すように、ｍＲＮＡとＰＰＩ−(２−３−２)とのポリプレックスでトランスフェクションした後の細胞は、ＰＰＩ−(２−２−２)／ｍＲＮＡ複合体またはＰＰＩ−(３−３−３)／ｍＲＮＡ複合体でトランスフェクションした後の細胞よりも顕著に高いルシフェラーゼ発現量を示した。このように、これら結果は、交互アルキル鎖を有するオリゴ(アルキレンアミン)による樹枝状ポリマーの修飾が、直線状ポリマー骨格におけるものと同じ有利な効果をもたらすことを示す。
［実施例２８］
皮下注射後のラットにおけるＣ１２−(２−３−２)製剤の細胞内へのＲＮＡ輸送効率
＜材料および方法＞
（リピドイド製剤）
Ｃ１２−(２−３−２)、ＤＯＰＥ、コレステロール、ＤＭＧ−ＰＥＧ２ｋと、ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡとをＮ／Ｐ比１７で用いて、実施例１５に記載するように製造した。
（動物の処理）
リピドイド製剤を１×ＰＢＳに調整した。６３μｇのＲＮＡを含有する製剤５００μＬを、雌のＢｕｆｆａｌｏラットに皮下注射した。投与から６時間後に、前記ラットを、メデトミジン（体重１ｋｇあたり１１．５μｇ）、ミダゾラム（体重１ｋｇあたり１１５μｇ）およびフェンタニル（体重１ｋｇあたり１．１５μｇ）の腹腔内注射によって麻酔した。Ｄ−ルシフェリン基質（マウス１匹あたり３０ｍｇを含むＰＢＳ）を腹腔内注射によって投与した。１０分後に、ＩＶＩＳ １００イメージングシステム（キセノゲン社、アメリカ）を用いて、生物発光を測定した。
＜結果＞
図３４で示されるように、ラットは、注射の側で鮮やかな発光シグナルを示し、該ＲＮＡの周囲組織内への輸送が非常に効率的であったことを示した。また、コードタンパク質を産生することができるため、ＲＮＡの機能性が損なわれないままであることも示される。
［実施例２９］
ラットに強制経口投与した後の胃腸管におけるｍＲＮＡコードタンパク質の発現
＜材料および方法＞
（リピドイド製剤（複合体製剤））
リピドイドＣ１２−(２−３−２)を、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社、アラバスター、アラバマ州、米国）、コレステロール、および、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＤＰＧ−ＰＥＧ ２０００；ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標） ＧＰ−０２０；ＮＯＦ Ａｍｅｒｉｃａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ホワイト・プレインズ、ニューヨーク州、米国）と配合した。この目的のために、これらの化合物を、それぞれ濃度が５０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌとなるようにエタノールに溶解した。５３．２μｌのＣ１２−(２−３−２)、６４．２μｌのＤＳＰＣ、２６．２μｌのコレステロール、および、３４．８μｌのＤＰＧ−ＰＥＧ ２０００を１つのマイクロ遠心チューブ内で混合し、エタノールで最終体積２００μｌに希釈し、モル比を８：５．２９：４．４１：０．８８とした。ホタルルシフェラーゼをコードする修飾ｍＲＮＡ（２５％のシチジンモノマーおよび２５％のウリジンモノマーを、それぞれ、５−メチルシチジンおよび２−チオウリジンで置換し、インビトロで転写して調製したもの）２００μｇを、８００μｌのクエン酸バッファー（１０ｍＭクエン酸、ｐＨ４．５、０．９％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）溶液として得た。リポプレックスの形成は、迅速な溶媒交換により行った。脂質混合物のエタノール溶液を、３０Ｇ針（Ｕ−４０インシュリンシリンジ ＢＤ Ｍｉｃｒｏ−Ｆｉｎｅ（商標）＋）を通して８００μｌのｍＲＮＡ溶液に注入し、次いで、ボルテックスした。室温で３０分間インキュベーションした後、該混合液を水１０Ｌに対して１２時間透析した。これにより、Ｎ／Ｐ比：１７、最終ｍＲＮＡ濃度：１５０μｇ／ｍｌとした。
（リピドイド製剤の凍結乾燥、および、ゼラチンカプセルへの充填）
新しく調製したリピドイド製剤を室温で３０分間インキュベーションした後、２５．６μｌの４０％（ｗ／ｖ）トレハロース水溶液を添加して（最終濃度：１％（ｗ／ｖ））、次いで、液体窒素中で凍結させた。その後、該サンプルを一晩凍結乾燥した。乾燥物の３分の１（ｍＲＮＡ６７μｇに相当）を、ゼラチンカプセル（ＰＣｃａｐｓ（登録商標）；Ｃａｐｓｕｇｅｌ（登録商標）ベルギーＮＶ（ベルギー、ボルネム））に、該製造業者から提供されているキット（ＰＣｃａｐｓ（登録商標）キット）を使用して充填した。
（ＰＥＩ複合体製剤）
ＦＦＬをコードするＳＮＩＭ（登録商標）−ＲＮＡ１ｍｇおよびｂｒＰＥＩ（シグマアルドリッチ社）１．３ｍｇを、それぞれ、水２ｍＬに希釈した。複合体を形成するために、ＲＮＡ溶液をＰＥＩ溶液にピペットで移し、上下に３回ピペッティングして混合した。得られた溶液を室温で３０分間インキュベーションした。複合体の形成後、複合体溶液を同体積の２％トレハロース溶液と混合し、最終トレハロース濃度を１％（ｗ／ｖ）とした。液体窒素中で凍結した後、該サンプルを凍結乾燥装置（ａｌｐｈａ２−４、Ｃｈｒｉｓｔ社）で凍結乾燥した。
（マイクロ粒子製剤）
マイクロ粒子を、ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ乳化によりポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）から作製した。ホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ２００μｇと、８：５．２９：４．４１：０．８８のモル比でＣ１２−(２−３−２)、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＤＰＧ−ＰＥＧ ２０００とを含むリピドイド製剤を上述のように正確に調製した。該製剤１ｍｌをＰＢＳで２ｍｌに希釈した。この水相を、ジクロロメタン２ｍｌに溶解したＰＬＧＡ ７５５−Ｓ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ社、ドイツ）１００ｍｇと混合した。得られた混合物を、ホーンソニケーター（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ、モデル２５０−Ｄ；ソニケーターホーンモデル１０２−Ｃ）を使用して、強度：２０％振幅、バースト：０．５秒としたソニケーションで乳化した。次いで、得られたエマルジョンを、４％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）水溶液６ｍｌを含む５０ｍｌファルコンチューブに滴下した。次いで、この混合液を１０秒間ボルテックスした。得られた生成物を、０．６％ＰＶＡ溶液８ｍｌを含むガラスビーカー（直径：９．２ｃｍ）に、マグネット撹拌プレート上で適度の速度で撹拌しながら滴下した。室温で３時間撹拌後、得られた粒子を、１０００ｒｐｍで５分間遠心した後に上清を置換することにより、注射用水で２回洗浄した。該粒子を注射用水５ｍｌに再懸濁した後、液体窒素中で凍結し、１４時間凍結乾燥した。得られた乾燥粉末はそのまま使用できるものであった。１３．６ｍｇをゼラチンカプセル（ＰＣｃａｐｓ（登録商標）；Ｃａｐｓｕｇｅｌ（登録商標）ベルギーＮＶ（ベルギー、ボルネム））に、該製造業者から提供されているキット（ＰＣｃａｐｓ（登録商標）キット）を使用して充填した。これは、使用成分の物質収支ベースで２５μｇの推定ｍＲＮＡ量に相当する。
（キトサン粒子製剤）
それぞれ濃度が１００μｇ／ｍＬであるキトサン（Ｐｒｏｔａｓａｎ ＵＰ Ｇ ２１３）およびＳＮＩＭ（登録商標）−ＲＮＡの５０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ４．５）溶液を、別々に５５℃に加熱した。各溶液１０ｍＬを一定のボルテックス下で混合した。室温で３０分間インキュベーションした後、粒子を水に対して１２時間透析し、凍結乾燥し、使用するまで凍結保存した。使用当日、適用する前に粒子を水３ｍＬに再懸濁した。
（動物実験）
Ｓｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（または雌のＢｕｆｆａｌｏラット）を５％イソフランで満たしたチャンバー内で麻酔した。上記カプセルを強制経口投与により投与した。２４時間後、ペントバルビタールナトリウムの注射により屠殺し、臓器を回収した。ルシフェラーゼ活性を測定するために、ＰＢＳ中にＤ−ルシフェリン基質を含む（１００μｇ／ｍｌ）培地浴において組織標本を３７℃で３０分間インキュベーションし、エクスビボのルシフェラーゼ生物発光イメージング（ＩＶＩＳ １００、キセノゲン社、アラメダ、米国）に供した。
＜結果＞
リピドイド／ｍＲＮＡ複合体をトレハロースと凍結乾燥するかマイクロ粒子内にローディングし、カプセルを使用して経口投与すると、ｍＲＮＡがラット胃腸管で効果的に発現することが実験により示された（図３５を参照）。その他の主要な臓器（心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓）において、また、ｍＲＮＡを液体製剤として経口投与すると、実質的なルシフェラーゼシグナルが検出されない。

Claims (26)

  1. ポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）およびカチオン性剤を含み、胃腸管へ投与するための固形剤として製剤化されている、医薬組成物。
  2. 経口投与用の固形剤として製剤化されている、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 直腸内投与用の固形剤として製剤化されている、請求項１に記載の医薬組成物。
  4. 前記カチオン性剤が、カチオン性のオリゴマー、ポリマーまたはリピドイドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  5. 前記カチオン性剤が、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  6. 前記カチオン性剤が、オリゴ（アルキレンアミン）を含む成分であり、該成分が下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物：
    （ａ）複数の式（ＩＩ）の基を側鎖および／または末端基として含む、オリゴマーまたはポリマー：
    （ＩＩ）
    （式中、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎおよびＲ２〜Ｒ６は、下で定義する通りであり、複数の式（ＩＩ）の基において、各式（ＩＩ）の基はそれぞれ独立しており：
    ａは１であり且つｂは２〜４の整数であるか；またはａは２〜４の整数であり且つｂは１であり、
    ｐは１または２であり、
    ｍは１または２であり；ｎは０または１であり且つｍ＋ｎ≧２であり；
    Ｒ２〜Ｒ５は、互いに独立して、水素；基−ＣＨ２−ＣＨ(ＯＨ)−Ｒ７、−ＣＨ(Ｒ７)−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−Ｏ−Ｒ７、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−ＮＨ−Ｒ７または−ＣＨ２−Ｒ７（式中、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルもしくは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）；アミノ基の保護基；およびポリ(エチレングリコール)鎖から選択され、
    Ｒ６は、水素；基−ＣＨ２−ＣＨ(ＯＨ)−Ｒ７、−ＣＨ(Ｒ７)−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−Ｏ−Ｒ７、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−ＮＨ−Ｒ７または−ＣＨ２−Ｒ７（式中、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルもしくは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）；アミノ基の保護基；−Ｃ(ＮＨ)−ＮＨ２；ポリ(エチレングリコール)鎖；および受容体リガンドから選択され、
    式（ＩＩ）中に表示される１個以上の窒素原子はプロトン化されて、式（ＩＩ）のカチオン基を提供してもよい）；
    （ｂ）複数の式（ＩＩＩ）の基を反復単位として含む、オリゴマーまたはポリマー：
    （ＩＩＩ）
    （式中、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎおよびＲ２〜Ｒ５は、下で定義する通りであり、複数の式（ＩＩＩ）の基において、各式（ＩＩＩ）の基はそれぞれ独立しており：
    ａは１であり且つｂは２〜４の整数であるか；またはａは２〜４の整数であり且つｂは１であり、
    ｐは１または２であり、
    ｍは１または２であり；ｎは０または１であり且つｍ＋ｎ≧２であり；
    Ｒ２〜Ｒ５は、互いに独立して、水素；基−ＣＨ２−ＣＨ(ＯＨ)−Ｒ７、−ＣＨ(Ｒ７)−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−Ｏ−Ｒ７、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−ＮＨ−Ｒ７または−ＣＨ２−Ｒ７（式中、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルもしくは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）；アミノ基の保護基；−Ｃ(ＮＨ)−ＮＨ２；およびポリ(エチレングリコール)鎖から選択され；
    式（ＩＩＩ）中で表示される１個以上の窒素原子は、プロトン化されて、式（ＩＩＩ）のカチオン基を提供してもよい）；および、
    （ｃ）式（ＩＶ）の構造を有するリピドイド：
    （ＩＶ）
    （式中、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎおよびＲ１〜Ｒ６は、下で定義する通りであり：
    ａは１であり且つｂは２〜４の整数であるか；または、ａは２〜４の整数であり且つｂは１であり、
    ｐは１または２であり、
    ｍは１または２であり；ｎは０または１であり且つｍ＋ｎ≧２であり；
    Ｒ１〜Ｒ６は、互いに独立して、水素；基−ＣＨ２−ＣＨ(ＯＨ)−Ｒ７、−ＣＨ(Ｒ７)−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−Ｏ−Ｒ７、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−ＮＨ−Ｒ７または−ＣＨ２−Ｒ７（式中、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルもしくは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）；アミノ基の保護基；−Ｃ(ＮＨ)−ＮＨ２；ポリ(エチレングリコール)鎖；および受容体リガンドから選択され；ただし、Ｒ１〜Ｒ６のうちの少なくとも２つの残基は、基−ＣＨ２−ＣＨ(ＯＨ)−Ｒ７、−ＣＨ(Ｒ７)−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−Ｏ−Ｒ７、−ＣＨ２−ＣＨ２−(Ｃ＝Ｏ)−ＮＨ−Ｒ７または−ＣＨ２−Ｒ７（式中、Ｒ７は、Ｃ３〜Ｃ１８アルキルもしくは１個のＣ−Ｃ二重結合を有するＣ３〜Ｃ１８アルケニルから選択される）であり；
    式（ＩＶ）中で表示される１個以上の窒素原子は、プロトン化されて、式（ＩＶ）のカチオン性リピドイドを提供してもよい）。
  7. オリゴ（アルキレンアミン）を含む前記成分が、成分（ａ）および（ｂ）からなる群から選択され、
    該成分（ａ）が、複数の式（ＩＩａ）の基を側鎖および／または末端基として含む、オリゴマーまたはポリマー：
    −ＮＲ２{ＣＨ２-(ＣＨ２)ａ-ＮＲ３-ＣＨ２-(ＣＨ２)ｂ-ＮＲ４}ｍ-[ＣＨ２-(ＣＨ２)ａ-ＮＲ５]ｎ-Ｒ６ （ＩＩａ）
    （式中、ａ、ｂ、ｍ、ｎおよびＲ２〜Ｒ６は請求項１に定義する通りであり、式（ＩＩａ）中で表示される１個以上の窒素原子はプロトン化されて、カチオン性オリゴマーもしくはポリマー構造体を提供してもよい）であり、
    該成分（ｂ）が、複数の式（ＩＩＩａ）の基を反復単位として含む、オリゴマーまたはポリマー：
    −ＮＲ２{ＣＨ２-(ＣＨ２)ａ-ＮＲ３-ＣＨ２-(ＣＨ２)ｂ-ＮＲ４}ｍ-[ＣＨ２-(ＣＨ２)ａ-ＮＲ５]ｎ− （ＩＩＩａ）
    （式中、ａ、ｂ、ｍ、ｎおよびＲ２〜Ｒ５は請求項１に定義する通りであり、式（ＩＩＩａ）中で表示される１個以上の窒素原子はプロトン化されて、カチオン性オリゴマーもしくはポリマー構造体を提供してもよい）である、請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 前記リピドイドが、式（ＩＶａ）の構造：
    Ｒ１−ＮＲ２{ＣＨ２-(ＣＨ２)ａ-ＮＲ３-ＣＨ２-(ＣＨ２)ｂ-ＮＲ４}ｍ-[ＣＨ２-(ＣＨ２)ａ-ＮＲ５]ｎ-Ｒ６（ＩＶａ）
    （式中、ａ、ｂ、ｍ、ｎおよびＲ１〜Ｒ６は請求項１に定義する通りであり、式（ＩＶａ）中で表示される１個以上の窒素原子はプロトン化されて、カチオン性リピドイドを提供してもよい）を有する、請求項６に記載の医薬組成物。
  9. 前記式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＶ）または（ＩＶａ）において、ｎが１である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  10. 前記式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＶ）または（ＩＶａ）において、ｍが１であり且つｎが１である、請求項６〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  11. 前記式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＶ）または（ＩＶａ）において、ａが１であり且つｂが２であるか、またはａが２であり且つｂが１である、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  12. 前記カチオン性剤が、前記ＲＮＡと複合体を形成する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  13. 前記複合体がリポソームである、請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. 前記ＲＮＡおよび前記カチオン性剤が、ナノ粒子として製剤化されている、請求１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  15. 前記ＲＮＡおよび前記カチオン性剤が、マイクロ粒子として製剤化されているかまたは凍結乾燥形態である、請求１〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  16. ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）および／またはリオプロテクタントを更に含む、請求１〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  17. 前記ＲＮＡ、前記カチオン性剤および前記ＰＬＧＡが、マイクロ粒子として製剤化されている、請求項１６に記載の医薬組成物。
  18. 前記リオプロテクタントがトレハロースである、請求項１６または１７に記載の医薬組成物。
  19. 前記固形剤が、（ｉ）カプセル剤、（ｉｉ）錠剤、（ｉｉｉ）坐剤、（ｉｖ）１つまたは複数のペレット剤、（ｖ）丸剤、（ｖｉ）顆粒剤、および、（ｖｉｉ）散剤からなる群から選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載に記載の医薬組成物。
  20. 前記固形剤がゼラチンカプセル剤である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  21. 前記固形剤が、硬質または軟ゼラチンカプセル剤である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  22. 前記ＲＮＡが一本鎖ＲＮＡである、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  23. 前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  24. 前記ＲＮＡが、５〜５０％の修飾シチジンヌクレオチドおよび／または５〜５０％の修飾ウリジンヌクレオチドを有する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  25. 前記ＲＮＡおよび／または該ＲＮＡから翻訳されたタンパク質を全身送達するための、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
  26. ＲＮＡおよび／または該ＲＮＡから翻訳されたタンパク質を対象に全身送達する方法であって、
    請求項１〜２４のいずれか一項に記載の医薬組成物を胃腸管に投与する工程を含む、方法。
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