JP6745272B2

JP6745272B2 - 核酸を細胞内へ導入するための組成物

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Description

本発明は、核酸、特にＲＮＡで細胞をトランスフェクションするための運搬体として有用な特徴的なアルキレンアミン繰り返し単位を含むポリマーに関する。本発明はまた、少なくとも、核酸と上記アルキレンアミン繰り返し単位を含むポリマーとを含む組成物、および、前記組成物を用いた細胞のトランスフェクション方法に関する。さらに、本発明は、医薬組成物および使用に関する。

核酸療法の実現可能性は、究極的には、細胞へ核酸を送達する効率的な方法が利用できるかに依存する。

一般的な核酸送達では、裸の核酸の使用が細胞のトランスフェクションに適切かつ十分である（非特許文献１）。しかしながら、最も想定されている実用的な用途では、送達中における核酸の分解からの保護、および／または、標的組織（内）への分布の促進、および／または、細胞取り込みを促進し適切な細胞内処理を可能とする、少なくとも第２の薬剤を核酸に配合することが有利であり、更には必要とされている。このような核酸送達用配合物は科学文献でベクターと呼ばれている。核酸をベクター化するための非常に多様な化合物、いわゆるトランスフェクション試薬が、従前より文献に記載されている。これらの化合物は、通常、ポリカチオン、または、カチオン性脂質または脂質様化合物（例えば、リピドイド）を含む組成物である（特許文献１）。核酸とポリカチオンとの複合体はポリプレックスと呼ばれ、カチオン性脂質との複合体はリポプレックスと呼ばれている（非特許文献２）。ポリカチオンおよび脂質の両方を含む複合体も同様に文献に記載されている（非特許文献３）。トランスフェクション試薬を使用して核酸に結合させて核酸を圧縮して、ナノメートルサイズ範囲の一次複合体を得ている。塩含有培地中では、これらの複合体は凝集する傾向があり（塩誘導凝集としても知られている）、これは、細胞培養物中でのトランスフェクションまたはインビボ局所投与に有利であり得る（非特許文献４および５）。凝集は回避可能であり、核酸とトランスフェクション試薬との複合体は、ポリ（エチレングリコール）などのポリマーによる表面遮蔽によって安定化させることができる。遮蔽はまた、トランスフェクション試薬との核酸複合体のオプソニン化および該核酸複合体による補体活性化を回避するためにも使用される（非特許文献６）。トランスフェクション試薬による核酸の圧縮は、核酸をヌクレアーゼによる分解から保護するだけでなく、エンドサイトーシスによる細胞取り込に適したものにする。多数の直鎖および分岐ポリカチオンが核酸への結合および核酸の圧縮に適しており、例えば、限定されないが、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（アミドアミン）デンドリマー、ポリ（２−（ジメチルアミノ）エチルメタクリレート）（ｐＤＭＡＥＭＡ）またはポリ（Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）（ｐＨＰＭＡ）のカチオン誘導体、ポリ（β−アミノエステル）（非特許文献７）、天然および合成のカチオン性ポリ（アミノ酸）つまりペプチド（例えばポリ（リジン））、ヒストン、ＨＭＧタンパク質、キトサンなどのカチオン性炭水化物が挙げられる。第一級アミン、第二級アミンおよび／または第三級アミンを含む上述のポリマーの他には、グアニジル部分を含む構造体が核酸を複合体化および送達するための分子の重要なクラスである。アルギニン系構造などのグアニジル修飾ポリマー（非特許文献８）、アルギニン修飾ＰＡＭＡＭ（非特許文献９）、または、グアジニル化ＰＥＩ（非特許文献１０）が、このようなシステムの効率性を明らかにしている。特にＲＮＡ相互作用の場合、グアニジル部分の分子特性が独特の結合特性を示す（非特許文献１１）。かかる構造の生成には、KatritzkyおよびRogovoyによりレビューされた方法（非特許文献１２）を使用することができる。多くの場合、ポリプレックスは、細胞標的化部分または細胞内標的化部分、および／または、不活性化ウイルス（非特許文献１３）、ウイルスカプシドまたはウイルスタンパク質もしくはペプチド（非特許文献１４および１５）または膜破壊性合成ペプチド（非特許文献１６および１７）などの膜不安定化成分を含むように更に修飾される。

エンドサイトーシスによる細胞取り込みの際に、複合体は、エンドソームおよびリソソームなどの細胞内小胞に隔離されて細胞分解機構に曝される。そのため、細胞内小胞からの脱出は効率的な機能的核酸送達に必須であると認識されており、これは機能的なウイルス感染にも当てはまる要件である（非特許文献１６および１７）。自然界がウイルス感染のために進化させたメカニズムを模倣して、合成ベクターによる効率的な核酸送達を達成している。かかる目的のために、ＩＮＦ、ＧＡＬＡペプチド、ＫＡＬＡペプチドや、メリチンおよびメリチン誘導体（非特許文献１８）などの両親媒性膜不安定化ペプチドが、ポリカチオン性トランスフェクション試薬にエンドソーム脱出機能を補完するために使用され、大きな成功を収めている（非特許文献１９）。リポプレックスでは、そのような機能は、脂質部分が細胞膜と融合する能力を有するため元来備わっている（非特許文献２０および２１）。Boussifらによる重要な論文（非特許文献２２）以来、ポリプレックスのエンドソーム脱出機能は物理化学的手段によって実現できることが知られている。ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）をポリカチオンとして使用してポリプレックスを形成した場合、酸性ｐＨでのその緩衝能は、エンドソーム脱出を引き起こすのに十分である。エンドソームの内腔は、エンドソーム膜に存在するプロトンポンプによって酸性化されることが知られている（非特許文献２３）。この酸性化は、インフルエンザやアデノウイルスなどの一部のウイルスのエンドソーム脱出の引き金となる。実験的証拠によって支持されているいわゆる「プロトンスポンジ理論」により、ＰＥＩの化学構造的特徴（すなわち、ＰＥＩのアミノ基のかなりの部分が中性（生理学的）ｐＨでプロトン化されていないという特徴）を有するポリマーの推定の機構的作用が説明されている（非特許文献２４）。プロトン化されて正に荷電したアミノ基によって、ＰＥＩ様ポリマーは核酸に結合し、核酸を圧縮することができる。非プロトン化アミンは酸性ｐＨでプロトン化され、それによりエンドソーム内で緩衝能を有することができる。プロトンポンプによるエンドソーム酸性化は、塩化物イオンの蓄積を伴う（非特許文献２５）。エンドソーム内腔内にＰＥＩなどの緩衝分子が存在する状況下、プロトンポンプは、緩衝分子が存在しない場合と同様、自然の酸性エンドソームｐＨに達するまで、塩化物イオンを蓄積しながらより多くのプロトンをエンドソーム内腔に移動させる。そして、エンドソーム内にイオンが不均衡に蓄積することにより、小胞体の浸透圧が不安定となり、最終的に小胞体が破裂し核酸複合体が細胞質へ放出すると考えられている。

前記プロトンスポンジ理論に基づき、多くの研究者が、酸性ｐＨで緩衝能を有するアミンを含む新規なポリマーライブラリーを作製する際にＰＥＩの構造的特徴を取り上げている。特許文献２および３（Kataokaら）には、ポリ（グルタミン酸）またはポリ（アスパラギン酸）骨格ベースのポリマーであって、カルボン酸側鎖が酸性ｐＨでプロトン化可能なアミン側鎖で誘導体化されているものが記載されている。しかしながら、ポリカチオンにおいてトランスフェクション増強部分として働く、非同一のアルキレンアミン単位を交互に含むオリゴ（アルキレンアミン）のリッチな構造的空間は探究されていない。特に、ｍＲＮＡトランスフェクションに関しては調べられていない。

対照的に、Kataokaらの研究の多くはポリ｛Ｎ−［Ｎ’−（２−アミノエチル）−２−アミノエチル］アスパルトアミド｝に焦点を当てている。Uchidaらによる出版物（非特許文献２６）によれば、同グループは、側鎖に一般式−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ）_ｍ−Ｈの繰返しアミノエチレン単位を有する一連のＮ−置換ポリアスパルトアミドを検討している。興味深いことに、著者らがこのポリマーファミリーをプラスミドＤＮＡのトランスフェクション効率について調べたところ「エンドソーム脱出および一部の細胞株へのトランスフェクション効率に対して、ポリマー側鎖の繰り返しアミノエチレン単位の特徴的な奇数・偶数効果」が観察された。偶数個の繰り返しアミノエチレン単位（ＰＡ−Ｅ）を有するポリマー由来のポリプレックスでは、奇数個の繰り返しアミノエチレン単位（ＰＡ−Ｏ）を有するポリマーと比較して、顕著な細胞毒性を伴わずに、１桁高いトランスフェクション効率が得られた。この奇数・偶数効果は、これらポリマーの緩衝能力、およびエンドソームｐＨで選択的に膜の完全性を破壊してＰＡ−Ｅポリプレックスの高効率エンドソーム脱出をもたらす機能とよく合致していた。更に、ポリマー側鎖において複数のプロトン化アミノ基を正確な間隔で配置した多価帯電アレイの形成は、エンドソーム膜の効率的な破壊に不可欠であり、それによって細胞質内への前記ポリプレックスの輸送を促進することが示された（非特許文献２６の要約）。興味深いことに、同グループの研究者らが、１，２−ジアミノエタン側鎖を有するポリ(アスパルトアミド)誘導体［ＰＡｓｐ(ＤＥＴ)］を１，３−ジアミノプロパン側鎖を有する類似体［ＰＡｓｐ(ＤＰＴ)］と比較したところ、ＰＡｓｐ(ＤＰＴ)ポリプレックスでは、粒子サイズおよびζ電位に関して［ＰＡｓｐ(ＤＥＴ)］との物理化学的相違は僅かであるにもかかわらず、Ｎ／Ｐ増加と共に細胞毒性が次第に上昇したため、高Ｎ／Ｐ比ではプラスミドＤＮＡのトランスフェクション効率が著しく低下したことが観察された（非特許文献２７）。したがって、この奇数・偶数ルールに基づき、３個のプロトン化可能なアミノ基とプロピレンスペーサー基とを含むポリマーはＰＡｓｐ(ＤＥＴ)よりも劣ることと、１，３−ジアミノプロパン含有側鎖が毒性問題と関連することが予想されよう。このようなポリマーのｍＲＮＡトランスフェクションに対する構造−活性関係については何も知られていない。

非特許文献２８には、プロピレンイミン側鎖または末端基でグラフトされ得るＰＥＩベースのデンドリマー粒子を用いた遺伝子トランスフェクションが記載されている。

Geallらは、一般式：−ＮＨ−ＣＨ_２−(ＣＨ_２)_ｎ−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_２−(ＣＨ_２)_ｍ−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_２−(ＣＨ_２)_ｎ―ＮＨ_２（式中、ｍは０、１または２であり、ｎは０または１である）を有するポリアミン部分を含むコレステロール−ポリアミンカルバメートについて報告している（非特許文献２９）。彼らが当該物質のｐＫａ値および仔ウシ胸腺ＤＮＡの圧縮におけるそれらの特性を調べたところ、コレステロールポリアミンカルバメートに沿った正電荷の位置化学的分配がＤＮＡ結合親和性およびリポフェクション効率の調節に重要な役割を果たしていることを見出した。彼らは、調査したコレステロール−ポリアミンカルバメートのうち、ポリアミン部を構成するスペルミン（−ＨＮ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２（プロピル／ブチル／プロピル））は、βガラクトシダーゼをコードするプラスミドＤＮＡの細胞培養物でのトランスフェクションの際に遥かに高いレポーター遺伝子発現を生じた一方、ポリアミン部が、例えば、−ＨＮ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２（エチル／プロピル／エチル）ではその効率が３〜１０倍小さいことを見出した。したがって、Kataokaらの教示（奇数−偶数ルール）およびGeallらの知見に照らすと、当業者は、核酸送達において後者の構造を排除するであろう。

Wangらは、ポリ(メチルメタクリレート)−グラフト−オリゴアミンを、プラスミドＤＮＡ用の効率的かつ低細胞毒性のトランスフェクション試薬として報告している（Wang et al. 2010, Molecular BioSystems, 6, 256-263）。これらのポリマーは、一般式Ｈ_２Ｎ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−(ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２)_ｍ−ＮＨ_２（式中、ｍは１、２または３である）のオリゴアミンを有するポリ(メチルメタクリレート)のアミノ分解によって得られたものである。著者らは、アミノ酸が長くなるにつれてトランスフェクション効率が上昇したことを見出した。

Ouらは、Ｄｄｅ−ＨＮ−(ＣＨ_２)_ａ−ＨＮ−(ＣＨ_２)_ｂ−ＨＮ−(ＣＨ_２)_ａ−ＮＨ−Ｄｄｅの構造を有する末端保護オリゴアミンからＮ，Ｎ’−シスタミンビスアクリルアミドとの共重合によって誘導されるポリ(ジスルフィドアミドアミン)を報告している（非特許文献３０、特許文献４）。彼らは、ａが２且つｂが２、ａが２且つｂが３、ａが３且つｂが２、ａが３且つｂが３、ａが３且つｂが４（スペルミン）の組み合わせを調べた。Ｄｄｅは２−アセチルジメドン保護基である。保護基の除去後、元の内部二級アミンはポリマー主鎖の一部として三級アミンとなり、三級アミンは垂れ下がったエチレンアミン側鎖またはプロピレンアミン側鎖の一部となったポリ(ジスルフィドアミドアミン)が合成された。このようなポリマーは、核酸送達に適したｐＨ範囲において緩衝能力を有し、細胞へのプラスミドＤＮＡのトランスフェクションに有用である。

近年、脂質様ではあるが非脂質性の合成構造体の新規なクラス、いわゆるリピドイドのインビトロおよびインビボ核酸送達における有用性が発見されている（特許文献１、非特許文献３１、特許文献５、非特許文献３２）。リピドイドは、アミン含有化合物を脂肪族エポキシド、アクリレート、アクリルアミドまたはアルデヒドと反応させることによって得られる。これらの著者／発明者らは、リピドイドライブラリーを得るための合成手順、および、インビトロでの細胞への核酸送達に役立つ有用化合物を選択するためのスクリーニング手順を提供している。

上記から明らかなように、プラスミドＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたは核酸アナログなどの他の核酸分子の送達について多くの研究開発が行われてきたが、ｍＲＮＡ送達は深く研究されていない。ＤＮＡやｓｉＲＮＡの送達に良好に作用する化合物および配合物はｍＲＮＡの送達でも良好に作用すると主張している著者もいる。しかしながら、プラスミドＤＮＡやｓｉＲＮＡとは対照的に、ｍＲＮＡは一本鎖の分子である。そのため、構造的考察のみに基づいても、ｍＲＮＡ送達用の化合物および配合物は、ＤＮＡやｓｉＲＮＡ送達用のものとは要件が異なることが予想されよう。

上記先行文献では、プラスミドＤＮＡやｓｉＲＮＡなどの二本鎖核酸を細胞内へ送達することついては記載されているが、記載されている方法および化合物がｍＲＮＡなどの一本鎖の核酸を細胞内へ送達できるかどうかはわからない。注目すべきことに、ｍＲＮＡのトランスフェクションは、細胞へのプラスミドＤＮＡのトランスフェクションとは実質的に異なることが観察されている（非特許文献３３および３４）。

これを踏まえ、特許文献６に開示されているポリマーファミリーの１００種を超えるメンバーを細胞へのＲＮＡの送達、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡの送達に適しているかについてスクリーニングしたところ、本発明者らは、ｍＲＮＡによりコードされる遺伝子が発現するようにｍＲＮＡをトランスフェクションするには、いずれの化合物も有用ではないことを見出した。対照的に、これらの化合物はすべて、プラスミドＤＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡの送達に効率的である。したがって、二本鎖の核酸を細胞内に送達するための確立されたルールは一本鎖ｍＲＮＡには先験的に当てはまらない。特許文献６には化学的に規定されたオリゴマーが記載されており、これは、一般式ＨＯＯＣ−Ｚ−Ｒ−ＮＨ−［（ＣＨ_２）_ｂ−ＮＨ］_ａ−Ｈ（Ｚは一連のメチレンまたは種々の他の基であり、Ｒはメチレンまたはカルボキシ残基であり、ａおよびｂは、それぞれ、独立して１〜７の整数または２〜７の整数である）に相当する２〜６０単位のオリゴ（アルキレンアミノ）酸単位である。このファミリーのオリゴマーは、いわゆるプロトンスポンジ効果を発揮することができるプロトン化可能なアミノ基を含み、インビトロおよびインビボでのプラスミドＤＮＡおよびｓｉＲＮＡのトランスフェクションに高活性であることが示されている。重要なことに、特許文献６および関連する科学文献は、一般式ＨＯＯＣ−Ｚ−Ｒ−ＮＨ−［（ＣＨ_２）_ｂ−ＮＨ］_ａ−Ｈに相当する構造単位から、配列が特定されたオリゴマー／ポリマーのライブラリーをどのように確立することができるかについて詳細に教示している。

米国特許第８，４５０，２９８号明細書米国特許第７，７８０，９５７号明細書米国特許第７，８２９，６５７号明細書国際公開第２０１０／０６５６６０号国際公開第２００６／１３８３８０号国際公開第２０１１／１５４３３１号

Wolff et al. 1990, Science, 247, 1465-1468 Felgner et al. 1997, Hum Gene Ther, 8, 511-512 Li and Huang in "Nonviral Vectors for Gene Therapy", Academic Press 1999, Chapter 13, 295-303 Ogris et al. 1998, Gene Ther, 5, 1425-1433 Ogris et al. 2001, AAPS PharmSci, 3, E21 Finsinger et al. 2000, Gene Ther, 7, 1183-1192 Akinc et al. 2003, Bioconj Chem 14(5):979-88 Yamanouchi et al. 2008, Biomaterials 29(22):3269-77 Son et al. 2013, Bull. Korean Chem. Soc. Vol 34 No. 3 Lee et al. 2008, Bull. Korean Chem. Soc. 2008, Vol. 29, No. 3 Calnan et al. 19991, Science 252(5009), 1167-1171 Katritzky & Rogovoy 2005, ARKIVOC (iv) 49-87 Curiel et al. 1991, ProcNatl Acad Sci USA, 88, 8850-8854 Fender et al. 1997, Nat Biotechnol, 15, 52-56 Zhang et al. 1999, Gene Ther, 6, 171-181 Wagner et al. 1992, Proc Natl Acad Sci USA, 89, 7934-7938 Plank et al. 1994, J Biol Chem, 269, 12918-12924 Boeckle et al. 2006, J Control Release, 112, 240-248 Plank et al. 1998, Adv Drug Deliv Rev, 34, 21-35 Xu and Szoka 1996, Biochemistry, 35, 5616-5623 Zelphati and Szoka 1996, Proc Natl Acad Sci USA, 93, 11493-11498 Boussif et al. 1995, Proc Natl Acad Sci USA, 92, 7297-7301 Lafourcade et al. 2008, PLoS One, 3, e2758 Ziebarth and Wang 2010, Biomacromolecules, 11, 29-38 Sonawane et al. 2003, J Biol Chem, 278, 44826-44831 Uchida et al. 2011, J Am Chem Soc, 133, 15524-15532 Miyata et al. 2008, J Am Chem Soc, 130, 16287-16294 M. Kramer, "Polymeric Nanocarriers with Dendritic Core-Shell Architectures", Dissertation, Albert-Ludwigs-Universitat Freiburg i.Br., 2004 Geall et al. 1999, FEBS Lett, 459, 337-342 Ou et al. 2009, Biomaterials 30, 5804-5814 Love et al. 2010, PNAS 107, 1864-1869 Akinc et al. 2008, Nat Biotechnol 26, 561-569 Bettinger et al. 2001, Nucleic Acids Res, 29,3882-91 Uzgun et al, 2011, Pharm Res, 28, 2223-32

したがって、本発明の解決すべき技術的課題は、核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡを細胞内または組織へ高効率で送達するのに適した組成物を提供することである。

かかる課題は、特許請求の範囲において特徴付けられ、かつ、以下の一般的な説明および実施例で更に詳細に示される実施形態を提供することにより達成される。

驚くべきことに、核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡを細胞にトランスフェクションするための組成物において、長さが互い違いのアルキレンアミン繰り返し単位が統計／ランダム配置されてなるコポリマーは、長さが互い違いではないアルキレンアミン繰り返し単位が類似配置されてなるポリマーよりも常に効果が高いことが見出された。

したがって、本発明は、第１の態様において、下記式（ａ１）および（ａ２）の繰り返し単位から独立して選択される複数の繰り返し単位（ａ）と、
下記式（ｂ１）〜（ｂ４）の繰り返し単位から独立して選択される複数の繰り返し単位（ｂ）と、を含む統計コポリマーであって、
繰り返し単位（ｂ）の合計に対する繰り返し単位（ａ）の合計のモル比が０．７／１．０〜１．０／０．７の範囲にあり、
コポリマー中に含まれる繰り返し単位（ａ）および／または（ｂ）の窒素原子の１または２以上がプロトン化されてカチオン性コポリマーを提供し得る、統計コポリマーを提供する。

さらなる態様において、本発明は、核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡと、上記コポリマーとを含む組成物を提供する。

さらなる態様において、本発明は、本発明に係る組成物を含む医薬組成物に関する。本発明はまた、本発明に係るコポリマー、ならびに、本発明に係る組成物および医薬組成物の製造方法を包含する。

さらなる態様は、核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡを標的細胞内または標的組織へ送達するための本発明に係る組成物またはコポリマーの使用、および、本発明に係る組成物を細胞に接触させる工程を含む、核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡを細胞内に送達する方法に関する。

０．８／１、１／０または０／１（エチルアミン／プロピルアミン単位）コポリマーおよびホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを示されたＮ／Ｐ比で用いてポリプレックスを形成した。２４時間後、異なる量（１２５ｎｇまたは６２．５ｎｇ）のｍＲＮＡでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を分析した。０．８／１、１／０または０／１（エチルアミン／プロピルアミン単位）コポリマー、ＰＥＩ（および市販の分岐ＰＥＩ、２５ｋＤａ、シグマアルドリッチ社）およびホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡをＮ／Ｐ比＝１０で用いてポリプレックスを形成した。ブタにエアロゾル投与した２４時間後、肺を摘出し、肺組織切片のホタルルシフェラーゼ活性を生物発光イメージングによって分析した。分岐０．８／１（エチルアミン／プロピルアミン単位）コポリマー（「ｂｒ−Ｈｏｍｏ」）およびホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡのポリプレックス、ならびに、分岐ポリエチレンイミン（「ｂｒ−ＰＥＩ」）および当該ｍＲＮＡのポリプレックスを、気管内液剤および気管内スプレー剤としてマウスに投与した。図は、ＩＶＩＳＬｕｍｉｎａＸＲイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、ＵＳＡ）を用いた生物発光イメージング試験の結果を示す。

本発明に係るコポリマーは、より短い繰り返し単位（ａ）およびより長い繰り返し単位（ｂ）を統計コポリマーの形態、特にランダムコポリマーの形態で、所定比率で組み合わせたものである。繰り返し単位（ａ）および（ｂ）のこのような配置は、核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡを細胞内へ送達するための運搬体としての得られるコポリマーの適合性に関して、予想外の利点が得られることがわかった。

上述したとおり、本発明に係るコポリマーは、下記式（ａ１）および（ａ２）の繰り返し単位から独立して選択される複数の繰り返し単位（ａ）と、
下記式（ｂ１）〜（ｂ４）の繰り返し単位から独立して選択される複数の繰り返し単位（ｂ）と、を含む統計コポリマーであって、
繰り返し単位（ｂ）の合計に対する繰り返し単位（ａ）の合計のモル比が０．７／１．０〜１．０／０．７の範囲にあり、
コポリマー中に含まれる繰り返し単位（ａ）および／または（ｂ）の窒素原子の１または２以上がプロトン化されてカチオン性コポリマーを提供し得る、統計コポリマーである。

上記コポリマーは、任意の繰り返し単位（ａ）および任意の繰り返し単位（ｂ）がコポリマー高分子中に統計的に分布している統計コポリマーである。これは、典型的には、重合反応中に繰り返し単位（ａ）を生じるモノマーと、重合反応中に繰り返し単位（ｂ）を生じるモノマーとの混合物を共重合させることにより得られる。好ましくは、上記コポリマーは、任意の繰り返し単位（ａ）および任意の繰り返し単位（ｂ）がポリマー高分子中にランダムに分布しているランダムコポリマーである。

本発明に係るコポリマーは、直鎖、分岐または樹状コポリマーであり得る。当業者に理解されるように、２価（すなわち、隣接する単位に開かれた結合）である式（ａ１）、（ｂ１）または（ｂ３）の繰り返し単位は、コポリマー構造を直線的に延ばす。よって、本発明の直鎖コポリマーは、式（ａ１）の繰り返し単位と、式（ｂ１）および式（ｂ３）の繰り返し単位の１または２種以上とを含むが、式（ａ２）、式（ｂ２）または式（ｂ４）の繰り返し単位を含まない。さらに理解されるように、３価である式（ａ２）、式（ｂ２）または式（ｂ４）の繰り返し単位が存在するとコポリマー構造中に分岐点が生じる。よって、分岐コポリマーは、式（ａ２）、式（ｂ２）および式（ｂ４）の繰り返し単位の１または２種以上を含み、さらに、式（ａ１）、式（ｂ１）および式（ｂ３）の繰り返し単位の１または２種以上を含み得る。

本発明に係るコポリマーは、上記定義の式（ａ１）および式（ａ２）の繰り返し単位から独立して選択される複数の繰り返し単位（ａ）と、上記定義の式（ｂ１）〜（ｂ４）の繰り返し単位から独立して選択される複数の繰り返し単位（ｂ）とを含む。好ましくは、上記定義の式（ａ１）および式（ａ２）の繰り返し単位から独立して選択される複数の繰り返し単位（ａ）と、上記定義の式（ｂ１）および式（ｂ２）の繰り返し単位から独立して選択される複数の繰り返し単位（ｂ）とを含むコポリマーである。

また、本発明に係るコポリマーは、式（ａ２）、式（ｂ２）および式（ｂ４）の繰り返し単位から選択される繰り返し単位の１または２種以上を含み、任意で、更に式（ａ１）、式（ｂ１）および式（ｂ３）の繰り返し単位の１または２種以上を含む分岐コポリマーであることも好ましく、特に、式（ａ２）の繰り返し単位と式（ｂ２）および式（ｂ４）の繰り返し単位の１または２種以上とを含み、任意で、更に、式（ａ１）、式（ｂ１）および式（ｂ３）の繰り返し単位の１または２種以上を含むコポリマーであることも好ましい。上記を踏まえると、より好ましいコポリマーは、式（ａ２）の繰り返し単位および式（ｂ２）の繰り返し単位を含み、任意で、更に式（ａ１）および式（ｂ１）の繰り返し単位の１または２種以上を含む分岐コポリマーである。

本発明に係るコポリマーにおいて、繰り返し単位（ａ）および繰り返し単位（ｂ）の合計数は、典型的には、２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上である。典型的には、繰り返し単位（ａ）および繰り返し単位（ｂ）の合計数は、５０００個以下、好ましくは２５００個以下、より好ましくは１０００個以下、特に５００個以下である。

さらに、本発明に係るコポリマーは、繰り返し単位（ａ）および（ｂ）がコポリマー中の全ての繰り返し単位の８０モル％以上、より好ましくは９０モル％以上を占めることが好ましい。さらに好ましいコポリマーは、（ａ１）および（ａ２）から選択される繰り返し単位（ａ）と、（ｂ１）および（ｂ２）から選ばれる繰り返し単位（ｂ）とが、コポリマー中の全ての繰り返し単位の８０モル％以上、より好ましくは９０モル％以上を占めるものである。コポリマー中の繰り返し単位の全てが繰り返し単位（ａ）または（ｂ）であることが最も好ましく、特に、コポリマー中の繰り返し単位の全てが（ａ１）および（ａ２）から選択される繰り返し単位（ａ）、または、（ｂ１）および（ｂ２）から選択される繰り返し単位（ｂ）であることが最も好ましい。

本発明に係るコポリマーの重量平均分子量は、例えば、直鎖状ポリ（エチレンオキシド）標準に対するサイズ排除クロマトグラフィーによる測定で、一般的に、１０００〜５０００００Ｄａ、好ましくは２０００〜２５００００Ｄａ、より好ましくは５０００〜５００００Ｄａの範囲である。

本発明に係るコポリマーの末端基は、典型的には、下記式（ｃ１）〜（ｃ３）の基から、好ましくは下記式（ｃ１）および（ｃ２）の基から独立して選択される１または２種以上の基（ｃ）を含む。

好ましくは、コポリマーの末端基は、式（ｃ１）〜（ｃ３）の基から、好ましくは式（ｃ１）および（ｃ２）の基から独立して選択される１または２種以上の基（ｃ）からなる。当業者に理解されるように、末端基の数は、本発明に係るコポリマーの構造に依存する。直鎖コポリマーの末端は２つだけであるが、分岐コポリマー、特に樹状コポリマーには多数の末端基が含まれる。さらに理解されるように、コポリマーに含まれる末端基（ｃ）の窒素原子の１または２以上がプロトン化されてカチオン性コポリマーが提供され得る。

本発明に係るコポリマーにおいて、繰り返し単位（ｂ）の合計に対する繰り返し単位（ａ）の合計のモル比は０．７／１．０〜１．０／０．７、好ましくは０．８／１．０〜１．０／０．８の範囲である。このモル比はＮＭＲなどによって測定することができる。よって、この比は、通常、本発明に係るコポリマーの複数の巨大分子について決定され、典型的には、当該複数の巨大分子における、繰り返し単位（ｂ）の合計に対する繰り返し単位（ａ）の合計の全体的な比を示すことが理解されよう。

上述したとおり、本発明に係るコポリマーの窒素原子の１または２以上はプロトン化されて、カチオン形態、典型的にはオリゴカチオン形態またはポリカチオン形態のコポリマーが生じ得る。繰り返し単位（ａ）もしくは（ｂ）または末端基（ｃ）中の第一級アミノ基、第二級アミノ基または第三級アミノ基は、特に水や生理学的流体などの水溶液中で、プロトン受容体として作用し得ることが理解されよう。そのため、本発明のコポリマーは、典型的には、７．５未満のｐＨの水溶液中で全体的に正の電荷を有する。本願明細書で言及される水溶液は、溶媒の５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）以上、好ましくは８０％または９０％以上、最も好ましくは１００％が水である溶液である。また、本発明に係る組成物がｐＨ７．５未満の生理学的流体（例えば、血液や肺液）と接触している場合、組成物は、典型的には、窒素原子がプロトン化されている繰り返し単位（ａ）および（ｂ）を含む。本発明に係る組成物に使用されるコポリマーのｐＫａ値は、自動化ｐＫａ滴定装置を用いた酸塩基滴定により求めることができる。所定のｐＨ値での正味の電荷は、例えば、ヘンダーソン−ハッセルバッハ方程式から算出することができる。あらゆる電荷が幾つかの塩基中心で共有され得、必ずしも単一のポイントに起因しない。典型的には、生理学的ｐＨの溶液中では、本発明に係る組成物に使用されるコポリマーは、プロトン化された状態のアミノ基を有する繰り返し単位と、未プロトン化状態のアミノ基を有する繰り返し単位とを含む。

しかしながら、当業者には理解されるように、本発明に係るコポリマーおよび本発明に係る組成物は、コポリマーをカチオン形態で含む乾燥塩形態として提供されてもよい。

さらに理解されるように、コポリマーと、核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡとを含む本発明の組成物中のプロトン化アミノ基の正電荷に対する対イオン（アニオン）は、典型的には、核酸中に含まれるアニオン性部分により提供される。正に帯電した基が核酸中のアニオン性部分よりも過剰に存在する場合、正電荷は、他のアニオン、特にはＣｌ⁻やＨＣＯ_３ ⁻など生理学的流体中で典型的に接触するアニオンによって均衡化され得る。

上記を踏まえると、本発明に係る好ましいコポリマーは、ランダムコポリマーであって、
全ての繰り返し単位の８０モル％以上、より好ましくは全ての繰り返し単位が、
下記式（ａ１）および（ａ２）の繰り返し単位から独立して選択される複数の繰り返し単位（ａ）と、
下記式（ｂ１）および（ｂ２）の繰り返し単位から独立して選択される複数の繰り返し単位（ｂ）とから形成され、
繰り返し単位（ｂ）の合計に対する繰り返し単位（ａ）の合計のモル比が０．７／１．０〜１．０／０．７、好ましくは０．８／１．０〜１．０／０．８の範囲であり；
コポリマーの末端基が、
下記式（ｃ１）および（ｃ２）の基から独立して選択される基（ｃ）から形成され、
コポリマー中に含まれる繰り返し単位（ａ）および／または（ｂ）および／または末端基（ｃ）の窒素原子の１または２以上がプロトン化されてカチオン性コポリマーを提供し得る、コポリマーである。また、上記コポリマーは、単位（ａ２）および（ｂ２）を、任意で単位（ａ１）および／または（ｂ１）と共に含む分岐コポリマーであることが更に好ましい。

本発明に係るコポリマーは、分岐または直鎖ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのポリアルキレンイミンの製造に知られている手順と類似のもので都合よく製造することができる。コポリマーの製造に使用されるモノマーをそれに応じて調整しなければならないことが理解されるであろう。本発明に関して、モノマーを定量的に都合よく反応させることができ、それにより、重合に供されるモノマー混合物におけるモノマー比率を適宜調整することによってコポリマー中の単位（ａ）および（ｂ）の比が調整できることが見出された。ポリアジリジンとも呼ばれるポリエチレンイミンは、例えば、アジリジンの開環重合により製造することができるが、本発明に係るコポリマーは、アジリジンおよびアゼチジンと、適用可能な場合、ピロリジンとを含むかまたはこれらからなるモノマー混合物（あるいは、好ましい一実施形態ではアジリジンおよびアゼチジンからなるモノマー混合物）の開環重合によって調製することができる。なお、「適用可能な場合」という表現は、ピロリジンによって形成され得る繰り返し単位（ｂ３）および（ｂ４）または末端基（ｃ３）が存在する場合または存在しない場合をいうことが理解されよう。非置換環状アミンを開環重合すると、通常、分岐コポリマーが生じる。本発明に係る直鎖コポリマーは、例えば、適切なＮ−置換アジリジン、Ｎ−置換アゼチジンおよびＮ−置換ピロリジン、または、Ｎ−置換アジリジンおよびＮ−置換アゼチジンを重合して調製することができ、その後、例えば、 Katrien F. Weyts, Eric J. Goethals, New synthesis of linear polyethyleneimine, Polymer Bulletin, January 1988, Volume 19, Issue 1, pp 13-19に記載された手順等と同様に、得られたポリアルキレンイミン鎖に結合したＮ−置換基が加水分解開裂され得る。

デンドリマー（つまり樹枝状コポリマー）の調製では、ポリエチレンイミンデンドリマーまたはポリプロピレンアミンデンドリマーの製造で知られている合成戦略を同様に適用することができる。ポリプロピレンイミンデンドリマーは、第１級アミンへのマイケル付加を繰り返し行い、次いで不均一触媒水素化を行うことにより、アクリロニトリル構成単位から合成される（Newkome and Shreiner Poly(amidoamine), polypropylenimine, and related dendrimers and dendrons possessing different 1→2 branching motifs: An overview of the divergent procedures. Polymer 49 (2008) 1-173; De Brabander-Van Den Berg et al. Large-scale production of polypropylenimine dendrimers, Macromolecular Symposia (1994) 77 (1) 51-62）。ポリエチレンイミンデンドリマーは、臭化ビニル構成単位を第１級アミンに反復してマイケル付加し、続いてガブリエルアミン合成法を用いてアルキルブロマイドをアミンに変換することにより製造することができる（Yemul & Imae, Synthesis and characterization of poly(ethyleneimine) dendrimers, Colloid Polym Sci (2008) 286:747-752）。よって、当業者は、例えばプロピレンイミンおよびエチレンイミンの厳格な交互層を有するデンドリマーも製造することができるであろう。同様に、式（ａ２）、式（ｂ２）および式（ｂ４）の繰り返し単位，好ましくは繰り返し単位（ａ２）および（ｂ２）のランダム組成物を含むか当該ランダム組成物からなる層を有するデンドリマーを生成することができる。

アジリジンおよびアゼチジンの開環重合、または、アジリジン、アゼチジンおよびピロリジンの開環重合は、溶液中、例えば、水中で行うことができる。総モノマー濃度は特に限定されないが、典型的な濃度は１０％（ｗｔ/ｗｔ）〜８０％（ｗｔ/ｗｔ）、好ましくは３０％（ｗｔ/ｗｔ）〜６０％（ｗｔ/ｗｔ）の範囲である。典型的には、重合はプロトンによって開始される。そのため、ブレンステッド酸、特に硫酸などの鉱酸を反応系に添加することが好ましい。通常、酸は少量で十分であり、モノマーの全濃度に基づいて、例えば０．００１〜０．０１当量である。反応は、例えば、５０〜１５０℃、特に９０〜１４０℃の温度範囲で好都合な速度で進行する。これらの温度範囲では、より高分子量のコポリマーは、通常、より高い温度であり、低分子量のコポリマーは、より低い温度である。

［核酸］
上述のとおり、本発明の中心的な態様は、核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡと、本発明に係る上記コポリマーとを含む組成物である。

「核酸」という用語は、天然に存在する種類の核酸ならびに化学的におよび／または酵素的に合成された核酸の全ての形態を包含し、例えば、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、オリゴヌクレオシドのチオリン酸エステルおよびリン酸トリエステル、モルホリノオリゴヌクレオチド、カチオン性オリゴヌクレオチド（米国特許第６０１７７００号明細書、国際公開第２００７／０６９０９２号）、置換リボオリゴヌクレオチドまたはホスホロチオエートなどの、核酸アナログおよび核酸誘導体も包含する。更に、「核酸」という用語は、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを含むあらゆる分子もいう。本発明の組成物に含まれる核酸の配列またはサイズは限定されない。核酸は、本発明の組成物が送達される生物学的標的で達成される生物学的効果によって主に規定される。一例を挙げると、遺伝子または核酸療法における用途の場合、核酸または核酸配列は、発現される遺伝子もしくは遺伝子フラグメントによって、または置換もしくは修復が意図される欠陥遺伝子もしくは任意の遺伝子標的配列によって、または阻害、ノックダウンもしくはダウンレギュレートされる遺伝子の標的配列によって、規定することができる。

好ましくは、「核酸」という用語は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。ＲＮＡに関して、原則として、本発明に関してあらゆる種類のＲＮＡを用いることができる。好ましい一実施形態では、ＲＮＡは一本鎖ＲＮＡである。「一本鎖ＲＮＡ」という用語は、２本以上の別個の鎖が該別個の鎖のハイブリダイゼーションにより１つの２本鎖分子を形成しているＲＮＡ分子とは対照的に、リボヌクレオチドの連続した一本の鎖を意味する。「一本鎖ＲＮＡ」という用語は、ループ、二次構造または三次構造などの、一本鎖分子がそれ自体で二本鎖構造を形成することを排除しない。

「ＲＮＡ」という用語は、アミノ酸配列をコードするＲＮＡおよびアミノ酸配列をコードしないＲＮＡを網羅する。ゲノムの８０％超が、タンパク質をコードしない機能的ＤＮＡ要素を含有することが示唆されている。これらの非コード配列には、調節ＤＮＡ要素（転写因子、レギュレーターおよびコレギュレーターなどの結合部位）ならびにタンパク質に翻訳されない転写産物をコードする配列が含まれる。ゲノムによってコードされＲＮＡへ転写されるがタンパク質に翻訳されないこれらの転写産物は、ノンコーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）と呼ばれる。このように、一実施形態では、ＲＮＡがノンコーディングＲＮＡである。好ましくは、ノンコーディングＲＮＡは一本鎖ＲＮＡである。ｎｃＲＮＡは、遺伝子制御、ゲノムの完全性の維持、細胞分化、および成長において重要な役割を果たしており、様々なヒト疾患で誤制御されていることが研究で証明されている。以下の様々な種類のｎｃＲＮＡが存在する。すなわち、短い（２０〜５０ｎｔ）ｎｃＲＮＡ、中間長の（５０〜２００ｎｔ）ｎｃＲＮＡ、および、長い（＞２００ｎｔ）ｎｃＲＮＡである。短いｎｃＲＮＡとしては、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、および転写開始ＲＮＡ（ｔｉＲＮＡ）が挙げられる。中間長のｎｃＲＮＡの例は、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、転写開始点関連ＲＮＡ（ＴＳＳａＲＮＡ）、プロモーター関連小型ＲＮＡ（ＰＡＳＲ）、およびプロモーター上流転写産物ＲＮＡ（ＰＲＯＭＰＴ）である。長いノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）としては、遺伝子間の長いノンコーディングＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）、アンチセンスｌｎｃＲＮＡ、イントロンｌｎｃＲＮＡ、転写超保存(領域)ＲＮＡ（Ｔ−ＵＣＲ）、およびその他（Bhan A, Mandal SS, ChemMedChem. 2014 Mar 26. doi: 10.1002/cmdc.201300534）が挙げられる。上述のノンコーディングＲＮＡのうち、ｓｉＲＮＡのみが二本鎖である。よって、好ましい一実施形態では、ノンコーディングＲＮＡは一本鎖であることから、ノンコーディングＲＮＡはｓｉＲＮＡでないことが好ましい。別の一実施形態では、ＲＮＡはコードＲＮＡ、すなわち、アミノ酸配列をコードするＲＮＡである。そのようなＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）とも呼ばれ、一本鎖ＲＮＡ分子である。核酸は、当業者に既知の合成化学的や酵素的方法、または組換え技術の使用によって作製されてもよいし、天然供給源から単離されてもよいし、それらの組み合わせによって作製されてもよい。オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、任意で非天然ヌクレオチドを含んでもよく、一本鎖または二本鎖または三本鎖であってもよい。「核酸」は、センスおよびアンチセンスのオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド、つまり、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ中の特定のヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列もいう。

好ましくは、本発明に関して、核酸という用語は、ＲＮＡ、より好ましくは一本鎖ＲＮＡ、特にｍＲＮＡ、特に好ましくは修飾ｍＲＮＡをいう。

メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、ヌクレオシドとしてのアデノシン、シチジン、ウリジンおよびグアノシンを主に含むヌクレオシドリン酸構成単位で構成されたコポリマーである。メッセンジャーＲＮＡは仲介担体として細胞核のＤＮＡから遺伝情報を細胞質へ運び、遺伝情報は細胞質においてタンパク質へと翻訳される。このように、メッセンジャーＲＮＡは、遺伝子発現の代わりとして適している。

本発明に関して、ｍＲＮＡは、細胞内に入った場合にタンパク質またはそのフラグメントの発現に適しているか、あるいは、タンパク質またはそのフラグメントへ翻訳可能な、全てのポリリボヌクレオチド分子を意味するものと理解されるべきである。「タンパク質」という用語は、本明細書中において、全ての種類のアミノ酸配列、すなわち、ペプチド結合を介して連結された２個以上のアミノ酸の鎖を包含し、ペプチドおよび融合タンパク質も含む。

ｍＲＮＡは、細胞内または細胞付近においてその機能が必要とされるか有益であるタンパク質（例えば、その欠損もしくは欠陥形態が疾患もしくは病気の引き金となり、供給することにより疾患若しくは病気を軽減または予防することができるタンパク質）、または、身体にとって有益な過程を細胞内もしくはその付近で促進することができるタンパク質をコードするリボヌクレオチド配列を含有する。ｍＲＮＡは、完全なタンパク質またはその機能性変異体の配列を含有し得る。さらに、リボヌクレオチド配列は、因子、誘導物質、調節物質、刺激物質もしくは酵素、またはそれらのフラグメントとして作用するタンパク質をコードすることができ、当該タンパク質は、その機能が、疾患、特に代謝疾患を治療するために、あるいは、新たな血管、組織などの形成などのプロセスをインビボで開始させるために必要なものである。本明細書中、機能性変異体とは、細胞内で機能が必要とされるかその欠損若しくは欠陥形態が病原性であるタンパク質の機能を細胞内で引き受けるフラグメントを意味すると理解される。また、ｍＲＮＡは、更なる機能性領域および／または３’もしくは５’非コード領域を有してもよい。３’および／または５’非コード領域は、タンパク質コード配列に天然に隣接する領域またはＲＮＡの安定化に貢献する人工配列とすることができる。当業者は、各々の事例でこのために適する配列をルーチンの実験によって決定することができる。

好ましい一実施形態では、ｍＲＮＡは、特に翻訳を増加するために、ｍ７ＧｐｐｐＧキャップ、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）および／または３’末端にポリＡ尾部を有する。ｍＲＮＡは、更に、翻訳を促進する領域を有することができる。

好ましい一実施形態では、ｍＲＮＡは修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドとの組み合わせを含有するｍＲＮＡである。好ましくは、国際公開第２０１１／０１２３１６号に記載されるような修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドとの組み合わせを含有するｍＲＮＡである。国際公開第２０１１／０１２３１６号に記載されているｍＲＮＡは、安定性の増加と免疫原性の低減とを示すことが報告されている。好ましい一実施形態では、そのような修飾ｍＲＮＡにおいて、シチジンヌクレオチドの５〜５０％およびウリジンヌクレオチドの５〜５０％が修飾されている。アデノシンおよびグアノシンを含有するヌクレオチドは、非修飾とされ得る。アデノシンヌクレオチドおよびグアノシンヌクレオチドは、修飾されていなくても部分的に修飾されていてもよく、好ましくは非修飾形態で存在する。好ましくは、シチジンヌクレオチドおよびウリジンヌクレオチドの１０〜３５％が修飾されており、特に好ましくは、修飾シチジンヌクレオチドの含有量は７．５〜２５％であり、修飾ウリジンヌクレオチドの含有量は７．５〜２５％である。実際、比較的低含有量、例えば、修飾シチジンヌクレオチドおよび修飾ウリジンヌクレオチドはそれぞれ１０％で所望の特性を達成できることが見出されている。特に好ましくは、修飾シチジンヌクレオチドは５−メチルシチジン残基であり、修飾ウリジンヌクレオチドは２−チオウリジン残基である。最も好ましくは、修飾シチジンヌクレオチドの含有量および修飾ウリジンヌクレオチドの含有量は、それぞれ２５％である。

別の好ましい一実施形態では、関連細胞内でのみ所望のｍＲＮＡを活性化するために、ｍＲＮＡを、標的結合部位、ターゲティング配列および／またはマイクロＲＮＡ結合部位と組み合わせてもよい。更に好ましい一実施形態では、ＲＮＡを、３’ポリＡ尾部の下流でマイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡと組み合わせることができる。

さらに、「核酸」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはそれらのハイブリッドまたはそれらの修飾物をいうことがある。それらは本技術分野で公知である（修飾物の例としては、例えば、米国特許第８２７８０３６号明細書、国際公開第２０１３／０５２５２３号、国際公開第２０１１／０１２３１６号、米国特許第５５２５７１１号明細書、米国特許第４７１１９５５号明細書、米国特許第５７９２６０８号明細書または欧州特許公開第３０２１７５号、Lorenz et al. 2004, Bioorg Med Chem Lett, 14, 4975-4977；Soutschek et al. 2004, Nature, 432, 173-178を参照）。そのような核酸分子は、一本鎖または二本鎖、直鎖状または環状、天然または合成であり、いかなるサイズ限定も伴わない。一例として、核酸分子は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、または小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ阻害剤（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、または短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ｔＲＮＡまたは長い二本鎖ＲＮＡまたはそのようなＲＮＡをコードするＤＮＡ構築体またはキメラプラスト（Colestrauss et al. 1996, Science, 273, 1386-1389）、またはアプタマー、規則的な間隔でクラスター化された短鎖反復回文配列（ＲＮＡ誘導部位特異的ＤＮＡ切断用の「ＣＲＩＳＰＲ」）（Cong et al. 2013, Science, 339, 819-823）、またはＲＮＡおよびＤＮＡである。前記核酸分子は、プラスミド、コスミド、人工クロモソーム、ウイルスＤＮＡ若しくはＲＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、コーディングおよび非コーディング一本鎖（ｍＲＮＡ）もしくは二本鎖ＲＮＡ、ならびにオリゴヌクレオチドの形態であってよく、糖骨格および／または上述の塩基における最高水準の修飾ならびに３’または５’修飾が含まれる。特に好ましい一実施形態では、核酸はＲＮＡであり、より好ましくはｍＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである。

核酸は、標的細胞で発現されるポリペプチドをコードする核酸配列を含有してもよい。当業者に周知の方法を用いて組換え核酸分子を構築することができる（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (2001) N.Y.; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)に記載の技術を参照）。

好ましい一実施形態では、前記核酸は治療または予防効果を有し得る治療上または医薬上活性な核酸であって、上述の核酸種および修飾ならびに当業者に知られている核酸種および修飾の全てを含むものである。一般に、治療または予防効果は、核酸と、細胞分子および細胞小器官との相互作用によって得られる。そのような相互作用は、単独で、例えば、ある種のＣｐＧオリゴヌクレオチドや、toll様受容体および他の細胞外または細胞内受容体と特異的に相互作用するように設計された配列の場合のように、先天性免疫系を活性化することができる。更に、細胞への核酸の取り込みまたは導入は、核酸に含まれる遺伝子のようなヌクレオチド配列の発現；導入された外来性核酸が細胞内に存在する結果としての内在性遺伝子の発現のダウンレギュレーション、サイレンシングもしくはノックダウン；内在性核酸配列の選択された塩基もしくは一続き全体の修復、除去、挿入もしくは交換のような内在性核酸配列の修飾；または、導入された外来性核酸の細胞内存在および相互作用の結果として、事実上全ての細胞内プロセス干渉を意図することができる。導入された外来性核酸の過剰発現は、内在性遺伝子の発現を補足・補完するように意図されてもよい。これは特に、内在性遺伝子が欠損しているかサイレントであり、のう胞性線維症、血友病、筋ジストロフィーなどの多くの代謝性・遺伝性疾患の場合などと同様、遺伝子発現産物が全くなかったり、不十分であったり、欠損していたり、機能不全である場合に意図される。導入された外来性核酸の過剰発現は、遺伝子発現の制御、シグナル伝達および他の細胞内プロセスなどのあらゆる細胞内プロセスと相互作用または干渉する発現産物が得られるように意図されてもよい。導入された外来性核酸の過剰発現はまた、トランスフェクションもしくはトランスダクションされた細胞が常在するかまたは常在させられた生物に免疫応答を引き起こすように意図されてもよい。例としては、ワクチン接種目的のため抗原を提示させるための、樹状細胞のような抗原提示細胞の遺伝的修飾である。他の例は、腫瘍特異的免疫応答を誘発するための、腫瘍でのサイトカインの過剰発現である。更に、導入された外来性核酸の過剰発現は、再生医療用の改変されたＴ細胞もしくは前駆体細胞もしくは幹細胞もしくは他の細胞のような、細胞療法用の遺伝的に修飾された細胞を一時的にインビボまたはエクスビボで産生するように意図されてもよい。

治療目的の内在性遺伝子の発現のダウンレギュレーション、サイレンシングまたはノックダウンは、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｔＲＮＡ、長い二本鎖ＲＮＡによって達成することができ、そのようなダウンレギュレーションは、配列特異的または非特異的とすることができ、長い二本鎖ＲＮＡが細胞に導入される場合のように細胞死をもたらすこともできる。内在性または先在性遺伝子の発現のダウンレギュレーション、サイレンシングまたはノックダウンは、ウイルス性感染および癌を含む、後天性疾患、遺伝性疾患または自然発生的疾患の治療に有用であり得る。細胞への核酸導入は、例えば、ウイルス感染または新生物形成を予防するための予防的手段として行うことができることも想定できる。内在性遺伝子の発現のダウンレギュレーション、サイレンシングまたはノックダウンは、転写レベルおよび翻訳レベルで発現することができる。多数のメカニズムが当業者に公知であり、例えば、エピジェネティック修飾、クロマチン構造変化、導入核酸による転写因子の選択的結合、導入核酸のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ種における相補性配列との塩基対形成によるハイブリダイゼーションを含み、これには三重ヘリックス形成のような異例の塩基対形成メカニズムも含まれる。同様に、遺伝子修復、塩基または配列の変更は、ゲノムレベル、およびエクソンスキッピングを含むｍＲＮＡレベルで達成することができる。塩基または配列の変更は、例えば、ＲＮＡ誘導性部位特異的ＤＮＡ切断によって、トランススプライシング、トランススプライシングリボザイム、キメラプラスト、スプライソソーム仲介性ＲＮＡトランススプライシングを利用する、カットアンドペーストメカニズムによって、またはグループＩＩもしくは再標的化イントロンの利用によって、またはウイルスにより仲介される挿入突然変異の利用によって、または原核生物、真核生物もしくはウイルスのインテグラーゼシステムを用いた標的化ゲノム挿入の利用によって、達成することができる。核酸は、生体の構築プランの担い手であることから、また核酸は、直接的・間接的な態様で多数の細胞内プロセスに関与することから、理論的には、外部から細胞内への核酸の導入によって、あらゆる細胞内プロセスが影響を受ける。特に、この導入は、細胞または臓器培養物にインビボおよびエクスビボで直接的に行うことができ、そのように改変した臓器または細胞をレシピエントに移植することができる。核酸を活性薬剤として含む本発明の複合体は、上述する目的の全てに有用であり得る。

[組成物]
上に開示したように、本発明に係る組成物は、核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡと、本発明に係るコポリマーとを含む。

本発明はまた、核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡと、本発明に係るコポリマーとからなる組成物を包含する。しかしながら、上記組成物はまた、更なる成分、例えば、脂質を配合するための成分および／または核酸を細胞（内）に送達する間にエフェクター機能を発揮する成分を含み得る。典型的には、核酸および本発明に係るコポリマーの合計重量は、組成物の総重量の５０重量％以上、好ましくは７０重量％以上を占める。

本発明に係る組成物は、一般的に、核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡをコポリマーおよび任意の更なる成分と会合させるものであって、これらの成分は、適用の間（例えば核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡを送達する所望経路の間）、生物標的または生物標的の周囲に到達するまでかなりの割合の会合を維持するのに充分安定した、１つの有限物質とされることが理解されよう。

本発明に係るコポリマーにはプロトン化可能なアミノ基が存在するため、このコポリマーは式（ａ）および／または（ｂ）の繰り返し単位中にカチオン性電荷を含み得る。その結果、このコポリマーは、プロトンの存在下（例えば、水または水溶液中）またはプロトン供与酸の存在下、複数のカチオン性部分を含むカチオン、典型的にはオリゴカチオンまたはポリカチオンを形成する。したがって、好ましくは、本発明に係る組成物は、核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡと、カチオン性コポリマーである本発明に係るコポリマーとの複合体を含むか、または、該複合体からなる。カチオン性コポリマーおよびアニオン性核酸は、一般的に、このような複合体における静電相互作用を介して会合されることが理解されるであろう。しかしながら、水素結合や共有結合を含む、他の引力性相互作用も複合体の安定化に関与し得る。

本発明の組成物中、コポリマーおよび核酸（特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡ）は、例えば、０．２５／１〜５０／１、好ましくは、０．５／１〜３０／１、より好ましくは１／１〜２０／１のコポリマー重量／核酸重量（ｗ／ｗ）比で典型的に含有される。

より好ましくは、前記組成物が、核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡと本発明に係るカチオン性コポリマーとの複合体を含有する場合、本発明の組成物における該コポリマーと該核酸との相対比は、相互の電荷中和の程度を考慮して選択され得る。核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡをカチオン性コポリマーとの複合体を用いて送達する場合、一般的に、核酸の負電荷を少なくとも中和、好ましくは核酸の負電荷を過剰補償する量のカチオン性コポリマーが所定量の核酸と混合される。

カチオン性コポリマーと、核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡとの好適な比率は、ゲル遅延アッセイや、臭化エチジウム置換／消光アッセイなどの蛍光消光法、粒子サイジングおよびゼータ電位測定によって、容易に決定することができる。コポリマーと、核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡとの有用な比率は、通常、アガロースゲル電気泳動を行った場合の該コポリマーとの複合体に含まれる該核酸の少なくとも部分的、好ましくは完全な遅延；核酸にインターカレートした臭化エチジウム、リボグリーン（ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ）またはＹＯＹＯなどの色素の高程度の蛍光消光；または、コポリマーおよび核酸の混合時の(ナノ)粒子の形成によってキャラクタライズされる。

化学的に十分に規定された本発明のカチオン性コポリマーを含む組成物については、算出されたＮ／Ｐ比は、コポリマーと、核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡとの相対比を選択・規定する上で好適なファクターである。Ｎ／Ｐ比は、本発明のコポリマーの繰り返し単位（ａ）および（ｂ）中のプロトン化可能な窒素原子の、本発明の組成物中の核酸のリン酸基に対するモル比を示す。Ｎ／Ｐ比は、このような核酸とカチオン性運搬体との複合体をキャラクタライズするための確立されたパラメータである。繰り返し単位（ａ）および（ｂ）を近接する繰り返し単位に連結するアミノ基および末端アミノ基中の窒素原子がプロトン化可能な窒素原子として考えられることが当業者に理解されるであろう。一方、アミド結合の窒素原子（通常、本発明のコポリマー中には存在しない）はプロトン化可能な窒素原子としてカウントされない。本発明のカチオン性コポリマーと、核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡとを含む本発明の組成物の場合、Ｎ／Ｐ比は、通常、例えば、次式に従って都合よく算出することができる。
式中、ｗ_ｐはコポリマーの重量（ｇ）であり、ｎは繰り返し単位１つあたりのプロトン化可能なアミノ基の数であり、Ｍ_ｗｐは、コポリマーに含まれる繰り返し単位（ａ）および（ｂ）の平均分子量であり、ｗ_ｎａは核酸の重量（ｇ）であり、Ｍ_ｂａｓｅは核酸中のヌクレオチドの平均分子量であり、例えば、ＲＮＡの場合は３４６ｇ／モルである。

具体的に本発明のコポリマーの場合、ｎは１である。Ｍ_ｗｐは、重合した繰り返し単位の比率（例えば、ＮＭＲにより決定）およびそれぞれの分子量に基づいて算出される。例えば、モル比（ａ）／（ｂ）が０．９／１．０であって、分子量がそれぞれ４２ｇ／ｍｏｌおよび５６ｇ／ｍｏｌである重合した単位（ａ２）および（ｂ２）を含む分岐コポリマーでは、Ｍ_ｗｐは次の式により算出される。

本発明に係るコポリマーと、核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡとからなる、本発明に係る核酸送達のための本発明に係る２元系複合体において、コポリマーの核酸に対する相対量は、好ましくは、最終２元系組成物のゼータ電位が正となるＮ／Ｐ比が得られる量とするべきである。本発明に関して、本発明の２元系組成物の場合、Ｎ／Ｐ比は１〜１００が好ましく、より好ましくは３〜６０、最も好ましくは４〜４４である。

本発明の組成物は、任意で他の成分を含む。特に、核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡを細胞（内）へ送達する間にエフェクター機能を発揮し得る成分を任意で含む。そのような成分は、特に限定されないが、ポリアニオン、脂質、本発明のコポリマー以外のポリカチオン（カチオン性ペプチドを含む）、遮蔽オリゴマー、遮蔽ポリマー、ポロキサマー（プルロニックとしても知られている）、ポロキサミン、ターゲティングリガンド、エンドソーム融解剤、細胞透過性ペプチド、シグナルペプチド、磁気ナノ粒子、非磁気ナノ粒子、ＲＮＡｓｅ阻害剤、蛍光色素、放射性同位体、または医用画像用造影剤であり得る。「エフェクター機能」という用語は、組成物の核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡの所要の生物学的効果を、生物学的標的（中）またはその周囲において得ることをサポートするあらゆる機能を包含する。例えば、核酸送達用組成物は、非コード核酸または非核酸アニオンをスタッファー材料として含むように配合されている（Kichler et al. 2005, J Gene Med, 7, 1459-1467）。そのようなスタッファー材料は、所要の生物学的効果を有する核酸の量を、スタッファー材料の非存在下で多量の核酸を使用して得られる効果を維持しつつ、低減するのに適している。非核酸ポリアニオンを使用し、低インビボ毒性で長期間の遺伝子発現が得られている（Uchida et al. 2011, J Control Release, 155, 296-302）。本発明の組成物は、リポポリプレックスにおける場合と同様、カチオン性、アニオン性または中性の脂質を含むこともできる（Li and Huang in “Nonviral Vectors for Gene Therapy”, Academic Press 1999, Chapter 13, 295-303）。更に、本発明の組成物は、本発明のコポリマー以外のオリゴカチオンまたはポリカチオンを含むことができる。そのような追加のオリゴカチオンまたはポリカチオンは、核酸の所望の程度に圧縮するのに有用であり、ポリカチオン性ペプチドの場合は以前から報告されているような核局在化シグナル機能を有することができる（Ritter et al. 2003, J Mol Med, 81, 708-717）。ポリ(エチレングリコール)（ＰＥＧ）などの遮蔽ポリマーも本発明の組成物に含有させることが可能であり、生物学的環境における凝集および／または所望でない相互作用（オプソニン化）、例えば、血清成分、血球または細胞外基質との相互作用に対して、ポリプレックスおよびリポプレックスを安定化することに頻繁に用いられている。遮蔽は、核酸含有組成物の毒性を低減することにも適し得る（Finsinger et al. 2000, Gene Ther, 7, 1183-1192）。ＰＥＧなどの遮蔽ポリマーは、本発明のコポリマーに直接共有結合的にカップリングすることができる。カップリングは、例えば、末端基（ｃ）、あるいは、式（ａ１）、（ｂ１）または（ｂ３）の繰り返し単位のアミノ基に対して行うことができる。

ＰＶＰなどのポリビニル誘導体およびポロキサマーは、筋肉内注射時のトランスフェクションの増強に有用であることが見出されており（Mumper et al. 1996, Pharm Res, 13, 701-709; Lemieux et al. 2000, Gene Ther, 7, 986-991）、従って、本発明の組成物に含まれると有用であり得る。

核酸送達用の組成物に含まれる抗体を含むターゲティングリガンドは、標的細胞の優先的かつ改良されたトランスフェクションに有用である（Philipp and Wagner, “Gene and Cell Therapy - Therapeutic Mechanisms and Strategy”, 3rd Edition, Chapter 15. CRC Press, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton 2009）。ターゲティングリガンドは、本発明の組成物に標的認識および／または標的結合機能を直接的または間接的な手法で付与する任意の成分とされ得る。端的に言うと、標的は、ターゲティングリガンドが分子相互作用を介して特異的に結合することができる特徴的な生物学的構造体であり、そのような結合によって、最終的に、標的組織においておよび／または標的細胞（中）で前記組成物に含まれる核酸が優先的に蓄積される。ＰＥＧ鎖と同様、ターゲティングリガンドは、例えば、末端基（ｃ）、あるいは、式（ａ１）、（ｂ１）または（ｂ３）の繰り返し単位のアミノ基に対してカップリングすることができる。

さらに、エンドソーム融解ペプチドなどのエンドソーム融解剤（Plank et al. 1998, Adv Drug Deliv Rev, 34, 21-35）や、取り込まれた核酸のエンドソーム放出の増強に適する他の化合物が本発明の組成物の有用な成分である。同様に、細胞透過ペプチド（別の文脈では、タンパク質トランスダクションドメインとしても知られている）（Lindgren et al. 2000, Trends Pharmacol Sci, 21, 99-103）は、核酸の細胞内送達を仲介するために、本発明の組成物の有用な成分であり得る。いわゆるＴＡＴペプチドは、この分類に含まれ、核局在化機能をも有する（Rudolph et al. 2003, J Biol Chem, 278, 11411-11418）。

本発明の組成物に含まれ得る磁気ナノ粒子は、磁力による送達の物理的ターゲティングおよび核酸導入効率の劇的な増強に有用であり、マグネトフェクションとしても知られているメカニズムである（欧州特許出願公開第１２９７１６９号；Plank et al. 2011, Adv Drug Deliv Rev, 63, 1300-1331）。同様に、本発明の組成物は、超音波と任意の磁界印加による核酸送達の物理的増強およびターゲティングに使用される非磁性または磁性マイクロバブルとすることもできる（Holzbach et al. 2010, J Cell Mol Med, 14, 587-599, Vlaskou et al. 2010, Adv Funct Mater, 20, 3881-3894）。量子ドット（Zintchenko et al. 2009, Mol Ther, 17, 1849-1856）、放射性トレーサーおよび医用画像用の造影剤を、核酸送達の追跡および核酸送達用組成物の生体内分布の決定に有利に用いることができる。まとめると、多数の核酸送達用エフェクターが報告されており、核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡとコポリマーとを含む本発明に係る組成物の有用な成分であり得る。

本発明の組成物に含まれる各成分の物質量の自由度が高いことは当業者に周知である。例えば、プラスミドＤＮＡ用にいわゆる単分子２成分ポリプレックスが報告されており、組成物は、ポリカチオンとプラスミドＤＮＡとの混合により形成されるナノ粒子であって、正確に１つのプラスミドＤＮＡ分子と、電荷の中和または電荷の過剰補償（負電荷よりも正電荷が多い）に必要な数のポリカチオン分子とを含むものからなる（DeRouchey et al. 2006, J Phys Chem B. 110(10):4548-54）。トランスフェクションで多用されるＮ／Ｐ比のＰＥＩ−ＤＮＡ複合体については、蛍光相関分光法によって、平均３．５（±１）個のＤＮＡプラスミド分子と３０個のＰＥＩ分子とを含有する一方、該複合体の調製に用いられるＰＥＩ分子の約８６％が遊離形態であったことが見出された（Clamme et al. 2003, Biophys J 84,1960-1968）。対照的に、ＰＥＩとプラスミドＤＮＡとの複合体凝集物は、該成分分子を多数（１０〜１００個）含むことが推測され、トランスフェクションにおいて、小さな別々に離散したＰＥＩ−ＤＮＡナノ粒子よりも良い性能であったことが見出された（Ogris et al. 1998, Gene Ther, 5, 1425-1433; Ogris et al. 2001, AAPS PharmSci, 3, E21）。したがって、本発明の組成物は、核酸分子、特にＲＮＡ分子、好ましくはｍＲＮＡ分子などの一本鎖ＲＮＡ分子を２〜３個含む粒子、特にナノ粒子とすることができるが、多数の核酸分子、特にＲＮＡ分子、好ましくはｍＲＮＡ分子などの一本鎖ＲＮＡ分子を含む、沈殿物や乾燥粉末などの巨視的な物体としてもよい。まとめると、本発明の組成物は、自己集合する前の各成分の投入比率によって特徴付けられる。核酸成分、特にＲＮＡ成分、好ましくはｍＲＮＡ成分などの一本鎖ＲＮＡ成分に対する、それぞれの成分の典型的な投入重量／重量(ｗ／ｗ)比は、１〜５０である。Ｎ／Ｐ比は、コポリマーが化学的に十分規定されている場合、本発明のコポリマーと、核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡとを含む２成分組成物の投入比についての好適な尺度である。上述したとおり、Ｎ／Ｐ比の値は１〜１００が好ましく、３〜６０がより好ましく、４〜４４が最も好ましい。

本発明の組成物が更なる成分を含む場合、Ｎ／Ｐ比の割り当ては曖昧となり得る。この場合は、好適な投入比は、限定されないが、ゲル遅延アッセイ、臭化エチジウム置換／消光アッセイなどの蛍光消光アッセイを含む実験；粒子サイジングおよびゼータ電位測定；および、本明細書中で記載するようなトランスフェクションアッセイなどの機能性アッセイによって決定される。追加のポリアニオンまたは遮蔽ポリマーを含む三元系複合体では、正味の電荷比（負電荷に対する正電荷）が１より小さくなる場合があり、ゼータ電位は中立または負となる場合がある。

本発明の組成物は下記のとおり製造することができる。典型的には、負に帯電している核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡ、および、好ましくはカチオン形態である本発明のコポリマーは、特に、好適な溶媒中で接触させられると、自己集合することができる。自己集合プロセス後、本発明の組成物は、組み込まれていない成分から分離してもよく、同じ工程で、懸濁媒体を、遠心分離、限外濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、透析または任意の関連する方法によって置換することができる。精製または未精製の本発明の組成物の各成分の化学量論は、ＵＶ／ＶＩＳ分光法もしくは蛍光相関分光法（DeRouchey et al. 2006, J Phys Chem B. 110(10):4548-54）などの分光法を含む様々な分析方法、個々の成分の直交蛍光もしくは放射性同位体標識、または、組成物を分解した際のＮＭＲ分光法・ＩＲ分光分析もしくはクロマトグラフィー分析・定量によって、決定することができる。分解は、例えば、本明細書中で記載するようにヘパリンまたはコンドロイチン硫酸などのポリアニオンの過剰添加やドデシル硫酸ナトリウムの添加によって達成することができる。

本発明はまた、本発明の組成物の製造方法に関する。本発明に係るコポリマーは本明細書で記載するように製造・精製することができる。これらのコポリマーは、水性媒体中でまたは乾燥粉末などの乾燥形態で保存することができ、乾燥形態の場合、組成物を製造する前に、水性媒体、好ましくは水に再溶解することができる。溶液のｐＨは、必要に応じて、酸、好ましくは塩酸もしくはクエン酸を用いて、中性または僅かに酸性（ｐＨ４．５に低下）に調整される。組成物に含まれる核酸がＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡである場合、ｐＨは、約４．５〜５．５、好ましくは約４．９〜５．１、より好ましくは約５．０に調整されることが好ましい。核酸は、当業者に周知の最高水準の技術に従って生成・精製される。核酸は、水性媒体、好ましくは水中の溶液として提供される。任意で、コポリマーおよび核酸としてのＲＮＡのいずれか一方またはその両方は、ターゲティングリガンド、シグナルペプチド、細胞透過ペプチド、エンドソーム融解物質もしくは遮蔽ポリマーなどのエフェクター分子と化学的に連結される。しかしながら、エフェクター分子の化学的性質に依っては、エフェクター分子は化学結合によって結合される必要は無く；組成物の他のいずれかの成分との非共有結合（すなわち、静電相互作用、疎水性相互作用またはファンデルワールス相互作用）に基づいた自己集合によって本発明の組成物に組み込むことができる。この目的のために、個々の成分の溶液のイオン強度、対イオンの種類、ｐＨまたは有機溶媒含有量を調整することが有利であり得る。

上述の混合手法の代替法として、核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡと、コポリマー成分とを、例えばhirotaら（Hirota et al. 1999, Biotechniques, 27, 286-290）もしくはKasperら（Kasper et al. 2011, Eur J Pharm Biopharm, 77, 182-185）によって報告されているようなマイクロ混合用自動化装置を用いて、または、Xuanら（Xuan et al. 2010, Microfluidics and Nanofluidics, 9, 1-16）によって検討されているようなマイクロ流体集束によって、混合することができる。

核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡを含む本発明の組成物は、前記各成分の溶液の混合の際の自己集合によって調製することができる。自己集合は、ピペッティングおよび振盪／ボルテックスを用いた手動混合によって、または例えばHirotaら（Hirota et al. 1999, Biotechniques, 27, 286-290）もしくはKasperら（Kasper et al. 2011, Eur J Pharm Biopharm, 77, 182-185）によって報告されたようなマイクロ混合用自動化装置を用いて、または、Xuanら（Xuan et al. 2010, Microfluidics and Nanofluidics, 9, 1-16）によって検討されたようなマイクロ流体集束によって、行うことができる。本発明の組成物が、核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡと、本発明のコポリマーとに加えて更なる成分を含む場合、混合を順次行う必要な場合がある。この場合、更なる成分は、コポリマーと核酸との自己集合の後に添加してもよいし、それらのいずれか一方に、混合前に添加してもよい。混合工程の最適な順序は追加成分の化学的性質に左右される。例えば、追加成分が負に帯電している場合、コポリマーとの混合前に核酸成分に添加するか、あるいは、コポリマーと核酸とのプレ形成複合体に添加する（本発明のコポリマーが、核酸とアニオン性追加成分の負電荷の合計に対する正電荷の比に関して過剰量で存在する）ことが最適であり得る。逆もまた同様に、追加成分がカチオン性である場合には、核酸との混合前に本発明のコポリマーに添加することが最適であり得る。あるいは、追加成分を化学量論で用いて核酸の負電荷を部分的に中和し、次いで本発明のコポリマーと混合してもよい。マグネトフェション用の複合体を含む核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡの場合、塩誘導性コロイド凝集が、核酸と、ポリカチオンまたはカチオン脂質と、磁気粒子とを含む組成物の調製に適した手段であることが示されている（欧州特許出願公開第１２９７１６９号明細書）。核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡ成分がカチオン性オリゴヌクレオチドである特殊なケースでは、ポリアニオンを使用して本発明のコポリマーと核酸とを自己集合させることができる。かかる場合、本発明のコポリマーは、カチオン性オリゴヌクレオチドと混合されてから、ポリアニオンと混合される。本発明の組成物を得るために多くの配合オプションが利用できることが当業者に周知である。個々の成分の濃度は本発明の組成物の用途に応じて選択される。関連するパラメータは、核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡ成分の最終濃度、および上述した成分比率である。細胞培養物中で核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡを送達する場合、１〜１００μｇ／ｍＬの最終核酸濃度が一般的に好ましい。インビボ用途では有用な最終核酸濃度の例は最大５ｍｇ／ｍＬであり得る。

本発明の組成物は、水性懸濁液中で保存することも、あるいは乾燥させることもできる。そのため、好ましい一実施形態では、本発明の組成物は、乾燥形態で、任意でフリーズドライ（凍結乾燥）形態で保存される。より好ましい一実施形態では、乾燥または凍結乾燥させた複合体または組成物はまた、リオプロテクタントを含む。リオプロテクタントは、（凍結）乾燥された物質を保護する分子である。そのような分子は、典型的には、糖類（単糖類、二糖類および多糖類）、多価アルコール、および、それらの誘導体などのポリヒドロキシ化合物である。トレハロースおよびスクロースが乾燥プロセス用の天然の保護剤であることが知られている。トレハロースは、干ばつ期の間に休眠状態（無水生活としても知られている）にある様々な植物、菌類および無脊椎動物によって生産される。糖類、例えば、トレハロース、ラクトース、ラフィノース、スクロース、マンノース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、ポリエチレングリコール、デキストリン、尿素、マルトデキストリン、フルクタン、マルトオリゴ糖、マンノオリゴ糖、シクロイヌロヘキサオース、ヒドロキシエチルスターチ、デキストラン、イヌリン、ポリビニルピロリドンなど、または、アミノ酸、例えばトリプトファン、グリシンおよびフェニルアラニンなどが、本発明の範囲で特に適したリオプロテクタントである。最も好ましくは、トレハロースが本発明に関して用いられる。

［医薬品態様］
さらなる態様において、本発明は、核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡを組織へまたは標的細胞内へ送達するための、本発明の組成物または本発明のコポリマーの使用に関する。「核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡを細胞へ送達する」とは、好ましくは、核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡを細胞内へ移動させることを意味する。前記使用は、インビボまたはインビトロで行うことができる。

本発明はまた、本発明の組成物を標的細胞または標的組織と接触させる工程を含む、核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡを標的細胞または標的組織へ送達する方法に関する。この方法は、インビトロまたはインビボで行うことができる。前記接触は、当業者に既知の手段および方法によって達成され得る。例えば、上記方法をインビトロで実施する場合、接触は、組成物の存在下、培地中で細胞を培養することによって、または、組成物を細胞に添加することによって達成することができる。インビボで実施する場合、細胞または組織との接触は、例えば、当業者に既知の投与経路によって、特には遺伝子治療分野で通常用いられている任意の投与経路によって、組成物を個体に投与することにより達成することができる。考えられる組成物の製剤化方法および個体への投与方法は下記にも記載されている。

「インビボ」という用語は、生きている生物の身体にもたらされるあらゆる適用をいい、生物は、好ましくは、多細胞生物であり、より好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。「インビトロ」という用語は、生きている生物の身体から単離されて該生物の外側にある部分、例えば、細胞、組織および臓器にもたらされるあらゆる適用をいい、生物は、好ましくは、多細胞生物であり、より好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。

本発明はまた、本発明に係る組成物と、任意で、薬学的に許容される担体および／または希釈剤とを含む医薬組成物に関する。これに関連して、本願明細書で定義される本発明に係る組成物は、単独で、医薬組成物であるか、または医薬組成物として使用され得ることが理解されるだろう。「医薬組成物」という用語は、本願明細書に記載の組成物の、対象に投与することが可能な医薬として許容される形態をいう。医薬組成物は、治療（予防を含む）によってヒトまたは動物の身体を処置するための使用に適している。

「医薬として許容される形態」という用語は、組成物が医薬組成物として製剤化されていることを意味し、該医薬組成物は、更に医薬として許容される担体および／または希釈剤を含んでもよい。好適な医薬担体の例は、当該技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油/水エマルジョンなどのエマルジョン、各種湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。そのような担体を含む組成物は、従来周知の方法によって製剤化することができる。これらの医薬組成物は、好適な用量で対象に投与することができる。投与レジメンは、担当医および臨床学的因子によって決定されよう。医療分野で周知のように、ある一対象に対する投与量は、対象の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の期間および経路、全身の健康状態、併用する他の薬剤などの多数の要因によって左右される。活性物質の典型的な用量は、例えば、１ｎｇから数グラムの範囲とすることができる。核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡ療法への適用では、発現用または発現阻害用の核酸の用量はこの範囲に相当するべきであるが、特に上述した要因を考慮すると、この例示的な範囲以下または以上とすることも想定される。一般に、医薬組成物の標準的な投与としての投与レジメンは、０．１μｇ〜１０ｍｇユニット／体重１ｋｇ／日の範囲とするべきである。投与法が持続注入である場合、用量は、それぞれ、１μｇ〜１０ｍｇユニット／体重１ｋｇの範囲とすべきである。進捗は、定期評価によってモニタリングすることができる。投与量は変動するが、本発明の組成物の構成成分としての核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡの静脈内投与に好ましい用量は、核酸分子およそ１０^６〜１０^１９コピーである。

「投与」という用語は、組成物を対象の体内に導入するのに適したあらゆる方法を包含する。好適な組成物の投与は様々な方法、例えば、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、経皮投与、髄腔内投与、筋肉内投与、局所投与、皮内投与、鼻腔内投与、吸入による肺内投与、気管支内投与、経口投与または直腸投与により達成され得る。本発明の組成物は、特に、Sheaらによって報告され（Shea et al. 1999, Nat Biotechnol, 17, 551-554）また欧州特許出願公開第１１９８４８９号明細書に記載されるような遺伝活性化マトリックスとして投与されてもよい。

原則として、本発明の医薬組成物は、局所的にまたは全身的に投与され得る。他の投与方法も本発明の範囲内であるが、投与は好ましくは非経口的に、例えば静脈内に行われる。標的部位への直接投与、例えば、血管内部位へのカテーテルによる投与も考えられる。投与は、例えば、腫瘍などの標的部位への直接注射によっても行われ得る。また、エアロゾル化または噴霧化や、経口投与による投与も本発明の範囲内である。非経口投与のための調製物としては、滅菌した水性または非水性溶液、懸濁液、および、エマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、フルオロカーボン、オリーブ油などの植物油、および、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガーまたは固定油が含まれる。静脈用ビヒクルには、流体および栄養補充剤、電解質補充剤（リンガーデキストロース系のものなど）などが含まれる。防腐剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどが存在してもよい。さらに、医薬組成物は、用途に応じてインターロイキンやインターフェロンなどの更なる薬剤を含んでもよい。

他の一実施形態において、本発明は、本発明の医薬組成物に含まれる核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡに予防または治療効果を発揮させるために、本発明の医薬組成物を患者に投与するステップを含む治療方法に関する。特に、「患者」との用語は動物およびヒトを含む。

本発明の医薬組成物を投与することにより、疾患を治療または予防することができる。「疾患」との用語は、本発明の実施形態を使用することによって治療、予防または予防接種することができる全ての考えられる病的状態を指す。上記方法の好ましい実施形態では、前記疾患は、遺伝性、後天性、感染性もしくは非感染性、加齢性、心血管性、代謝性、腸関連、新生物（特に癌）性または遺伝子性であり得る。疾患は、例えば、生体内の生理学的プロセス、分子的プロセス、生化学反応の不規則性に基づき得る、そして、この不規則性は、生物の遺伝装置や、行動的、社会的または環境的要因（例えば化学物質や放射線への暴露）などに基づき得る。特に好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、国際公開第２０１１／０１２３１６号に開示されているような治療に使用される。

上記の治療方法を踏まえ、本発明は、他の一実施形態において、本発明の組成物に含まれる核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡを疾患を有する患者の体内の組織または器官へ提供することにより治療可能な疾患を治療するための医薬組成物を調整するための、本発明の組成物の使用に言及する。

さらなる例示のために、本発明の好ましい態様を以下の態様にまとめる。前記態様は、前記の一般的開示の一部を形成し、その中に開示された好ましい態様も同様に適用される。

[態様１]
下記式（ａ１）および（ａ２）の繰り返し単位から独立して選択される複数の繰り返し単位（ａ）と、
下記式（ｂ１）〜（ｂ４）の繰り返し単位から独立して選択される複数の繰り返し単位（ｂ）と、を含む統計コポリマーであって
繰り返し単位（ｂ）の合計に対する繰り返し単位（ａ）の合計のモル比が０．７／１．０〜１．０／０．７の範囲にあり、
コポリマー中に含まれる繰り返し単位（ａ）および／または（ｂ）の窒素原子の１または２以上がプロトン化されてカチオン性コポリマーを提供し得る、統計コポリマー。
[態様２]
繰り返し単位（ａ２）、（ｂ２）および（ｂ４）から選択される繰り返し単位の１または２種以上を含む分岐または樹状コポリマーである、態様１に記載のコポリマー。
[態様３]
繰り返し単位（ａ１）および（ｂ１）を含む直鎖コポリマーである、態様１に記載のコポリマー。
[態様４]
繰り返し単位（ａ）および（ｂ）が、コポリマー中の全ての繰り返し単位の８０モル％以上を占める、態様１〜３のいずれかに記載のコポリマー。
[態様５]
コポリマー中の全ての繰り返し単位が、繰り返し単位（ａ）または（ｂ）である、態様１〜３のいずれかに記載のコポリマー。
[態様６]
繰り返し単位（ａ１）および（ａ２）から選択される繰り返し単位（ａ）と、繰り返し単位（ｂ１）および（ｂ２）から選択される繰り返し単位（ｂ）とが、コポリマー中の全ての繰り返し単位の８０モル％以上を占める、態様１〜３のいずれかに記載のコポリマー。
[態様７]
コポリマー中の全ての繰り返し単位が、繰り返し単位（ａ１）および（ａ２）から選択される繰り返し単位（ａ）、または、繰り返し単位（ｂ１）および（ｂ２）から選択される繰り返し単位（ｂ）である、態様１〜３のいずれかに記載のコポリマー。
[態様８]
ランダムコポリマーである、態様１〜７のいずれかに記載のコポリマー。
[態様９]
繰り返し単位（ａ）および繰り返し単位（ｂ）の合計数が、２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上である、態様１〜８のいずれかに記載のコポリマー。
[態様１０]
繰り返し単位（ａ）および繰り返し単位（ｂ）の合計数が、５０００個以下、好ましくは２５００個以下、より好ましくは１０００個以下である、態様１〜９のいずれかに記載のコポリマー。
[態様１１]
重量平均分子量が、２０００〜２５００００Ｄａ、好ましくは５０００〜５００００Ｄａである、態様１〜１０のいずれかに記載のコポリマー。
[態様１２]
コポリマーの末端基が、下記式（ｃ１）〜（ｃ３）の基から独立して選択される１または２種以上の基（ｃ）を含む、態様１〜１１のいずれかに記載のコポリマー。
[態様１３]
コポリマーの末端基が、式（ｃ１）および（ｃ２）の基から独立して選択される１または２種以上の基（ｃ）を含む、態様１２に記載のコポリマー
[態様１４]
繰り返し単位（ｂ）に対する繰り返し単位（ａ）のモル比が、０．８／１．０〜１．０／０．８の範囲である、態様１〜１３のいずれかに記載のコポリマー。
[態様１５]
カチオン性コポリマーである、態様１〜１４のいずれかに記載のコポリマー。
[態様１６]
アジリジン、アゼチジン、および任意でピロリジンを含むモノマー混合物を重合することによって得られる、態様１〜１５のいずれかに記載のコポリマー。
[態様１７]
核酸と、態様１〜１６のいずれかに記載のコポリマーとを含む、組成物。
[態様１８]
核酸がＲＮＡである、態様１７に記載の組成物。
[態様１９]
核酸が一本鎖ＲＮＡである、態様１７に記載の組成物。
[態様２０]
核酸がｍＲＮＡ、好ましくは修飾ｍＲＮＡである、態様１７に記載の組成物。
[態様２１]
コポリマーがカチオン性コポリマーであり、カチオン性コポリマーが核酸と複合体を形成する、態様１７〜２０のいずれかに記載の組成物。
[態様２２]
凍結乾燥形態である、態様１〜２１のいずれかに記載の組成物。
[態様２３]
リオプロテクタントを更に含む、態様２２に記載の組成物。
[態様２４]
リオプロテクタントがトレハロースである、態様２３に記載の組成物。
[態様２５]
医薬組成物である、態様１〜２２のいずれかに記載の組成物。
[態様２６]
態様１７〜２５のいずれかに記載の組成物と、任意で、追加の薬学的に許容される担体および／または希釈剤とを含む、医薬組成物。
[態様２７]
細胞内へ核酸を送達するための、態様１〜１６のいずれかに記載のコポリマーの使用。
[態様２８]
細胞内へ核酸を送達するための、態様１７〜２６のいずれかに記載の組成物または医薬組成物の使用。
[態様２９]
核酸がＲＮＡである、態様２７または２８に記載の使用。
[態様３０]
核酸が一本鎖ＲＮＡである、態様２７または２８に記載の使用。
[態様３１]
核酸がｍＲＮＡ、好ましくは修飾ｍＲＮＡである、態様２７または２８に記載の使用。
[態様３２]
態様１７〜２６のいずれかに記載の組成物または医薬組成物を標的細胞または標的組織に接触させるステップを含む、標的細胞または標的組織へ核酸を送達する方法。
[態様３３]
アジリジン、アゼチジン、および、任意でピロリジンを含むモノマー混合物を重合させるステップを含む、態様１〜１５のいずれかに記載のコポリマーの製造方法。

実施例１
材料：
化学修飾ＬｕｃｍＲＮＡの製造
インビトロ転写（ＩＶＴ）のためのテンプレートを作製するために、プラスミドｐＶＡＸＡ１２０−Ｌｕｃを、ＮｏｔＩによる制限消化によって線状化した。テンプレートをクロロホルム−エタノール沈殿によって更に精製した。テンプレートの品質を天然アガロースゲル電気泳動により決定した。リボヌクレオチド三リン酸およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含有する標準的なＩＶＴミックスを用いてインビトロ転写（ＩＶＴ）を行った。２５％の５−メチル−シチジン−５’−三リン酸および２５％の２−チオ−ウリジン−５’−三リン酸を用いて修飾を導入した。ワクシニアウイルスキャッピング酵素、ｒＧＴＰ、および、メチル供与体としてＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を用いて、ｍＲＮＡの５’末端に７−メチルグアニレートｃａｐ−０構造（ｍ７ＧｐｐｐＧ）を付加してキャッピングを行った。酢酸アンモニウム沈殿によりｍＲＮＡの精製を行った。修飾されたＬｕｃＲＮＡを注射用水に再懸濁させ、ＵＶ測定、天然アガロースゲル電気泳動およびＮＩＨ３Ｔ３細胞へのトランスフェクションにより品質管理を行った。

ポリマーおよびポリマー繰り返し単位の平均分子量
アジリジン（Ｅ）およびアゼチジン（Ｐ）、または、アジリジン（Ｅ）およびアゼチジン（Ｐ）の化学量論的混合物から、モノマーのモル比（Ｅ：Ｐ）を１：０、０．８：１および０：１として、ポリマーをそれぞれ合成した。モノマー水溶液（モノマーの全濃度：５０％（ｗ／ｗ））から開始して、アジリジンおよびアゼチジンを単重合および共重合した。重合は、１３０℃で２０〜７０時間、０．００１当量の硫酸を用いて行った。Ｅ：Ｐ比がそれぞれ１：０および０：１であるホモポリマーは比較のために製造した。

このようにして、モノマーの化学量論比を反映した、エチルアミン（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｎ＜；「Ｅ」；分子量４２ｇ／ｍｏｌ）およびプロピルアミン（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｎ＜；「Ｐ」；分子量５６ｇ／ｍｏｌ）の繰り返し単位のランダム分岐コポリマーを調整した。重合された単位の平均分子量を下記の式に従って算出した。

結果は以下のとおりである。

ストック溶液：
ポリマーストック溶液：注射用水中０．５ｍｇ／ｍｌ
ｍＲＮＡストック溶液：注射用水中０．０５ｍｇ／ｍのストック溶液

Ｎ／Ｐ比およびポリマーとｍＲＮＡとの複合体の調製
Ｎ／Ｐ比は、ポリマー／ｍＲＮＡ複合体を調製するために使用される、所定量のｍＲＮＡ中のリン酸に対する所定量のポリマー中の窒素の添加モル比を反映する。ｍＲＮＡ中のリボヌクレオチド一リン酸の平均分子量は３４６ｇ／ｍｏｌである。

したがって、所望のＮ／Ｐ比で所定重量のｍＲＮＡ（ｗ_ＲＮＡ）に対して必要とされる、所定濃度（ｃ_{ｐｏｌｙｍｅｒ}）のポリマーストック溶液（ｖ_{ｐｏｌｙｍｅｒ}）の容量は下記のとおりとなる。

したがって、以下の表に示すポリマーストック溶液を、９６ウェルプレートのＡ行およびＥ行の各ウェルで、所定量の注射用水で２５μＬに希釈した。

続いて、２５μＬのｍＲＮＡストック溶液（１．２５μｇのｍＲＮＡに相当）をポリマー溶液に添加して所望のＮ／Ｐ比とした。９６ウェルプレートのＢ〜Ｄ行およびＦ〜Ｈ行のウェルに、それぞれ、２５μＬの注射用水を入れた。３０分間のインキュベーション後、マルチチャネルピペッターを用いて、Ａ行またはＥ行の複合体２５μＬを、それぞれ、Ｂ行またはＦ行に移して混合した。続いて２５μＬをＢ行からＣ行に、またはＦ行からＧ行にそれぞれ移して混合し、そして、Ｃ行からＤ行、またはＧ行からＨ行にそれぞれ移した。

細胞、トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞（ＤＳＭＺＡＣＣ３０５、Ｌｏｔ２１）を、それぞれ１０％ＦＢＳ＋１％Ｐ／Ｓを含むＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＭＥＭ中で培養した。トランスフェクションの２４時間前に、９６ウェルプレート内で、細胞培養培地１００μＬ中５，０００個の細胞密度で細胞を播種した。

ポリマー／ｍＲＮＡ複合体希釈系列各２０μＬを細胞に移した（１ウェル当たり１２５ｎｇ／６２．５ｎｇのｍＲＮＡに相当）。２４時間のインキュベーション後、細胞培養物の上清を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで１００μＬの溶解バッファー（２５ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ｐＨ７．８）を加えた。

ルシフェラーゼアッセイ：溶解物８０μＬを白色の９６ウェルプレートのウェルに添加し、ＷａｌｌａｃＶｉｃｔｏｒ２（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）によるルシフェラーゼ活性測定に使用した。この目的のために、１００μＬのルシフェラーゼアッセイ試薬（０．５ｍＭＤ−ルシフェリン、０．３ｍＭ補酵素Ａ、３３ｍＭＤＴＴ、０．５ｍＭＡＴＰ、１ｍＭ炭酸マグネシウム、２．７ｍＭ硫酸マグネシウム、０．１ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭトリシン）を加え、化学発光を測定した。実験はトリプリケートで行った。

結果：
この実験は、コポリマー（０．８／１）と複合体化した化学修飾ＬｕｃｍＲＮＡが、分枝ＰＥＩ（１／０）またはＰＰＩ（０／１）と複合体形成するよりも、細胞のトランスフェクション後より効率的に発現することを示す（図１）。これはまた、本発明の目的が本発明の方法および医薬製剤によって適切に達成できることを示している。

実施例２
コポリマーと配合した、ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードする化学修飾ｍＲＮＡのブタ肺へのインビボでのエアロゾル投与

化学薬品
上記の実施例１を参照

化学修飾ＬｕｃｍＲＮＡの製造
上記の例１を参照

実験手順
ブタの鎮静をアザペロン２ｍｇ／ｋｇ体重、ケタミン１５ｍｇ／ｋｇ体重、アトロピン０．１ｍｇ／ｋｇ体重を前投与して開始し、続いて静脈ラインを側方耳静脈に挿入した。必要に応じてプロポフォールを３〜５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で静脈内注射してブタを麻酔した。必要に応じて１％プロポフォールを静脈内に連続的に注入して麻酔を維持した。換気パラメータは、終末呼気二酸化炭素と一致させ、必要に応じて調整した。麻酔パラメータ、呼吸器パラメータおよび心臓血管パラメータを、パルスオキシメトリー、カプノグラフィー、直腸温度プローブおよび反射状態を用いて連続的にモニタリングした。平衡電解液を１０ｍｌ／ｋｇ／時でブタに注入した。麻酔の持続時間は約８０〜１２０分間であった。エアロゾル投与（Ａｅｒｏｎｅｂメッシュネブライザー）完了後の鎮静後、耳静脈を介してペントバルビタール（１００ｍｇ／ｋｇ体重）をボーラス注射してブタを屠殺した。肺を切除し、約１ｃｍ厚のスライスした組織標本を様々な肺領域から収集し、続いて培養器中、３７℃（５％二酸化炭素）で２４時間、細胞培養培地中でインキュベートした。ルシフェラーゼ活性の測定のために、組織標本を３７℃で３０分間、ＰＢＳ（１００μｇ／ｍｌ）中にＤ−ルシフェリン基質を含む培地浴中でインキュベートし、ex vivoルシフェラーゼ生物発光イメージング（IVIS 100、Xenogen、Alameda、USA）に供した。

コポリマー／ｍＲＮＡポリプレックスの調製
２チャンネルシリンジポンプ（ＫＤＳ−２１０−ＣＥ、ＫＤＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてポリプレックスを形成した。ｍＲＮＡおよびコポリマー（０．８／１、１／０、０／１またはＰＥＩ２５ｋＤａ）をそれぞれ二重蒸留水１２．０ｍｌに希釈して、ｍＲＮＡ濃度を５００μｇ／ｍｌ（コポリマーまたは分岐ＰＥＩ２５ｋＤａの濃度＝Ｎ／Ｐ比１０に相当）とした。両溶液を、シリンジポンプの吸引機能を使用して５ｍＬ／分の速度で別々の２０ｍＬシリンジに充填した。両サンプルを混合するために、これら２本のシリンジをチューブ（Safeflow Extension Set, B.Braun）を介してｔ−ピースに接続した。４０ｍＬ／分の速度でシリンジポンプの注入機能を用いて混合を行った。使用前に複合体を周囲温度で３０分間インキュベートした。ナノ粒子がマウス肺で凝集したり効果がないことがあるため（Rudolph et al., J. Mol Ther. 2005, 12: 493-501）、本発明の過程では、錯体形成用緩衝液を使用せずに水のみを用いることが特に有利であることが観察された。

結果：
この実験は、肺へエアロゾル送達した際、コポリマー（０．８／１）と複合化した化学修飾ＬｕｃｍＲＮＡが、ＰＥＩ２５ｋＤａ（１／０）またはＰＰＩ（０／１）と複合体化するよりもブタ肺細胞においてより効率的に発現することを示す（図２）。これは、本発明の目的が本発明の方法および医薬製剤によって適切に達成できることも示している。

実施例３
コポリマーと配合した、ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードする化学修飾ｍＲＮＡのマウス肺へのインビボ投与

化学薬品
上記の実施例１を参照

化学修飾ＬｕｃｍＲＮＡの製造
上記の実施例１を参照

実験手順
分枝０．８／１（エチルアミン／プロピルアミン単位）コポリマー（「ｂｒ−Ｈｏｍｏ」）とホタルルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡとのポリプレックス、および、分岐ポリエチレンイミン（「ｂｒ−ＰＥＩ」）と当該ｍＲＮＡとのポリプレックスを調製し、気管内液剤（ｎ＝３）（１００μＬ体積中、ｍＲＮＡ２５μｇ）として、または、高圧Ｍｉｃｒｏｓｐｒａｙｅｒ装置（ＰｅｎｎＣｅｎｔｕｒｙ、ＵＳＡ）を使用して気管内スプレー剤（５０μＬ体積中、ｍＲＮＡ１２．５μｇ）として投与した。すべての実験は地方自治体（Regierung von Oberbayern）によって承認され、ドイツ動物福祉法に従って行った。雌の成体Ｂａｌｂ／ｃマウスをイソフルラン吸入チャンバー中で麻酔した。続いて、試験配合物を、カスタマイズした光源および小型動物用スパーテルを用いて気管内に直接適用した。マウスは数分以内に麻酔から回復した。６時間後、フェンタニル／ミダゾラム／メデトミジン（０．０５ｍｇ／５．０ｍｇ／０．５ｍｇ／ｋｇ体重）を腹腔内注射してマウスを麻酔した。Ｄ−ルシフェリン（１．５ｍｇを５０μＬのＰＢＳに希釈）を麻酔したマウスの鼻孔に適用し、より深い気道に吸引させた。生物発光イメージングをＩＶＩＳＬｕｍｉｎａＸＲイメージングシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、ＵＳＡ）を用いて行った。結果を図３に示す。

Claims

核酸と；
下記式（ａ１）および（ａ２）の繰り返し単位から独立して選択される複数の繰り返し単位（ａ）、および、
下記式（ｂ１）〜（ｂ４）の繰り返し単位から独立して選択される複数の繰り返し単位（ｂ）を含む統計コポリマーと、を含む組成物であって、
繰り返し単位（ｂ）の合計に対する繰り返し単位（ａ）の合計のモル比が０．７／１．０〜１．０／０．７の範囲にあり、
前記コポリマーは、前記コポリマー中に含まれる繰り返し単位（ａ）および／または（ｂ）の窒素原子の１または２以上がプロトン化されてカチオン性コポリマーとされてもよい、組成物。
前記コポリマーは、繰り返し単位（ａ２）、（ｂ２）および（ｂ４）から選択される繰り返し単位の１または２種以上を含む分岐または樹状コポリマーである、請求項１に記載の組成物。
前記コポリマーは、繰り返し単位（ａ１）および（ｂ１）を含む直鎖コポリマーである、請求項１に記載の組成物。
繰り返し単位（ａ）および（ｂ）が、前記コポリマー中の全ての繰り返し単位の８０モル％以上を占める、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
繰り返し単位（ａ１）および（ａ２）から選択される繰り返し単位（ａ）と、繰り返し単位（ｂ１）および（ｂ２）から選択される繰り返し単位（ｂ）とが、前記コポリマー中の全ての繰り返し単位の８０モル％以上を占める、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
前記コポリマーの末端基が、下記式（ｃ１）〜（ｃ３）の基から独立して選択される１または２種以上の基（ｃ）を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
前記コポリマーの、繰り返し単位（ｂ）に対する繰り返し単位（ａ）のモル比が、０．８／１．０〜１．０／０．８の範囲である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
前記核酸がｍＲＮＡである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
前記コポリマーがカチオン性コポリマーであり、前記カチオン性コポリマーが前記核酸と複合体を形成する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物と、任意で、追加の薬学的に許容される担体および／または希釈剤とを含む、医薬組成物。
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物または請求項１０に記載の医薬組成物の、細胞（ヒトを除く）内へ核酸を送達するための使用。
組成物に含まれる核酸を、疾患を有する患者の体内の組織または器官へ提供することにより治療可能な疾患を治療するための医薬組成物を調製するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物の使用。
アジリジン、アゼチジン、および、任意でピロリジンを含むモノマー混合物を重合させることにより前記コポリマーを製造するステップと；
前記コポリマーを前記核酸と接触させるステップとを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物の製造方法。