BR112017012482B1

BR112017012482B1 - Composição, usos de uma composição, e, métodos para liberar um ácido nucleico a uma célula ou tecido alvo e para a produção da composição

Info

Publication number: BR112017012482B1
Application number: BR112017012482-3A
Authority: BR
Inventors: Christian Dohmen; Christian Plank; Carsten Rudolph
Original assignee: Ethris Gmbh
Priority date: 2014-12-19
Filing date: 2015-12-18
Publication date: 2021-10-19
Also published as: CN107001627A; WO2016097377A1; US20180236090A1; JP6745272B2; EP3242903A1; CN107001627B; RU2017122022A; ES2887404T3; EP3034539A1; AU2015366220B2; JP2018502956A; RU2017122022A3; RU2715227C2; US11020487B2; EP3242903B1; CA2971284C; DK3242903T3; AU2015366220A1; CA2971284A1; KR20170097124A

Abstract

a presente invenção refere-se a polímeros compreendendo uma combinação característica de porções de alquileno amina que são úteis como veículos para transfectar uma célula com um ácido nucleico. a presente invenção refere-se ainda a uma composição compreendendo um ácido nucleico e um tal polímero, e a um método para transfectar uma célula utilizando a referida composição. além disso, a presente invenção refere-se a composições farmacêuticas e usos.

Description

[001] A presente invenção refere-se a polímeros que compreendem unidades repetitivas caracterizadas por alquileno amina que são úteis como veículos para transfectar uma célula com um ácido nucleico, em particular RNA. A presente invenção refere-se ainda a uma composição compreendendo pelo menos um ácido nucleico e um polímero compreendendo tais unidades de repetição de alquileno amina e a um método de transfecção de uma célula utilizando a referida composição. Além disso, a presente invenção refere-se a composições farmacêuticas e usos.

[002] A viabilidade de terapias com ácidos nucleicos depende em última análise da disponibilidade de métodos eficientes para distribuir ácidos nucleicos em células.

[003] Na liberação de ácido nucleico em geral, a utilização de ácidos nucleicos nus é adequada e suficiente em alguns casos para transfectar células (Wolff et al., 1990, Science, 247, 1465-1468). No entanto, na maioria das aplicações práticas previstas é vantajoso ou mesmo necessário formular o ácido nucleico com pelo menos um segundo agente que protege o ácido nucleico da degradação durante a liberação e/ou facilita a distribuição para e em um tecido alvo e/ou facilita a absorção celular e permite processamento intracelular adequado. Tais formulações para liberação de ácido nucleico são referidas como vetores na literatura científica. Uma grande variedade de compostos para a vetorização de ácidos nucleicos, os chamados reagentes de transfecção, foram descritos anteriormente. Estes compostos são usualmente policátions ou composições compreendendo lipídeos catiônicos ou compostos semelhantes a lipídeos tais como lipidoides (US 8.450.298). Os complexos de ácidos nucleicos com policátions são referidos como poliplexos, aqueles com lipídeos catiônicos são referidos como lipoplexos (Felgner et al., 1997, Hum Gene Ther, 8, 511-512). Os complexos compreendendo tanto um policátion como os lipídeos foram também descritos (Li e Huang em "Nonviral Vectors for Gene Therapy", Academic Press 1999, Capítulo 13, 295-303). Os reagentes de transfecção são utilizados para ligar e compactar ácidos nucleicos para resultar em complexos primários na faixa de tamanho nanométrico. Em meios contendo sais, estes complexos tendem a se agregar, também conhecidos como agregação induzida por sal, o que pode ser vantajoso para transfecção em cultura celular ou administração localizada in vivo (Ogris et al., 1998, Gene Ther, 5, 1425-1433, Ogris Et al., 2001, AAPS PharmSci, 3, E21). A agregação pode ser evitada e os complexos de ácidos nucleicos com reagentes de transfecção podem ser estabilizados por proteção de superfície com polímeros tais como poli(etileno glicol). O escudo é também utilizado para evitar a opsonização e a ativação do complemento por complexos de ácido nucleico com reagentes de transfecção (Finsinger et al., 2000, Gene Ther, 7, 1183-1192). A compactação de ácidos nucleicos por reagentes de transfecção não só os protege contra degradação por nucleases mas também os torna adequados para a captação celular por endocitose. Numerosos policátions lineares e ramificados são adequados para ligar e compactar ácidos nucleicos, incluindo mas não se limitando a dendrímeros de poli(etilenimina), poli(amidoamina), metacrilato de poli(2- (dimetilamino)etila) (pDMAEMA) ou derivados catiônicos de poli(2- hidroxipropil)metacrilamida) (pHPMA), poli(beta-aminoéster)s (Akinc et al., 2003, Bioconj Chem 14(5): 979-88), poli(aminoácidos) catiônicos naturais e sintéticos ou peptídeos tais como poli(lisinas), histonas, proteínas HMG ou carboidratos catiônicos tais como quitosanos. Além dos polímeros contendo aminas primárias, secundárias e/ou terciárias mencionadas acima, as estruturas que contêm porções guanidila são uma classe importante de moléculas com o objetivo de complexação e liberação de ácido nucleico. Os polímeros modificados com guanidila, como as estruturas à base de arginina (Yamanouchi et al., 2008, Biomaterials 29(22):3269-77), PAMAM modificado com arginina (Son et al., 2013, Bull. Guadinylated-PEI (Lee et al., 2008, Bull. Korean Chem. Soc. 2008, Vol. 29, No. 3) realçaram a eficiência de tais sistemas. Especialmente no caso de interação com RNA, as características moleculares da porção guanidila exibem propriedades de ligação únicas (Calnan et al., 19991, Science 252 (5009), 1167-1171). Para a geração de tais estruturas podem ser utilizados métodos como revisto por Katritzky e Rogovoy (Katritzky & Rogovoy 2005, ARKIVOC (iv) 49-87). Frequentemente, os poliplexos são ainda modificados para conterem uma célula direcionada ou uma porção de direcionamento intracelular e/ou um componente desestabilizante da membrana tal como um vírus inativado (Curiel et al., 1991, ProcNatl Acad Sci USA, 88, 8850-8854), uma proteína viral ou capsídeo viral ou peptídeo (Fender et al., 1997, Nat Biotechnol, 15, 52-56, Zhang et al., 1999, Gene Ther, 6, 171-181) ou um peptídeo sintético disruptivo de membrana (Wagner et al. 1992, Proc Natl Acad Sci USA, 89, 7934-7938, Plank et al., 1994, J Biol Chem, 269, 12918-12924).

[004] Após a captação endocitótica, os complexos são sequestrados em vesículas intracelulares tais como endossomas e lisossomas onde são expostos à maquinaria de degradação celular. Deste modo, reconheceu-se que a evacuação das vesículas intracelulares é essencial para a liberação eficiente de ácido nucleico funcional, uma exigência que também se aplica para a infecção viral funcional (Wagner et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA, 89, 7934-7938, Plank Et al., 1994, J Biol Chem, 269, 12918-12924). Os mecanismos que a natureza evoluiu para a infectividade viral foram imitados para conseguir uma liberação eficiente de ácido nucleico por vetores sintéticos. Para este fim, foram utilizados com grande sucesso peptídeos anfifílicos desestabilizadores da membrana tais como os peptídeos INF, GALA e KALA ou derivados de melitina e melitina (Boeckle et al., 2006, J Control Release, 112, 240-248) para complementar a transfecção policatiônica s com funcionalidade de escape endossomal (Plank et al., 1998, Adv Drug Deliv Rev, 34, 21-35). Em lipoplexos, tal funcionalidade é inerente pela capacidade de suas porções lipídicas de se fundirem com membranas celulares (Xu e Szoka 1996, Biochemistry, 35, 5616-5623, Zelphati e Szoka 1996, Proc Natl Acad Sci USA, 93, 11493-11498). Uma vez que o papel central de Boussif et al. (Boussif et al., 1995, Proc Natl Acad Sci USA, 92, 7297-7301) é sabido que a funcionalidade de escape endossomal dos poliplexos pode ser realizada por meios físico-químicos. Quando a poli(etilenimina) (PEI) é utilizada como um policátion para formar poliplexos, a sua capacidade de tamponamento a pH ácido é suficiente para desencadear o escape endossomal. É conhecido que o lúmen dos endossomas é acidificado por uma bomba de prótons que reside nas membranas endossômicas (Lafourcade et al., 2008, PLoS One, 3, e2758). Esta acidificação é o gatilho para o escape endossomal de alguns vírus, como gripe ou adenovírus. A chamada teoria da esponja de prótons, apoiada por evidência experimental, descreve a ação mecanicista putativa de polímeros que compreendem características estruturais químicas de PEI: Uma fração substancial dos aminogrupos de PEI são não protonados a pH neutro (fisiológico) (Ziebarth e Wang 2010, Biomacromolecules, 11, 29-38). Em virtude dos aminogrupos protonados e assim carregados positivamente, os polímeros do tipo PEI podem ligar-se e compactar ácidos nucleicos. As aminas não protonadas podem tornar-se protonadas a pH ácido e, assim, têm capacidade de tamponamento dentro dos endossomas. A acidificação endossomal pela bomba de prótons vem com a acumulação de íons cloreto (Sonawane et al., 2003, J Biol Chem, 278, 44826-44831). Na presença de uma molécula tampão tal como PEI no lúmen endossomal, a bomba de prótons irá transferir mais prótons para dentro do lúmen endossomal, juntamente com a acumulação de cloreto, como seria na sua ausência até o pH endosomal ácido natural ser atingido. Acredita-se que a acumulação desproporcional de íons dentro dos endossomas conduza a uma desestabilização osmótica das vesículas, levando em última análise à ruptura da vesícula e à liberação do complexo de ácido nucleico para o citoplasma.

[005] Com base na teoria da esponja de prótons, numerosos investigadores recolheram as características estruturais de PEI na criação de novas bibliotecas de polímeros compreendendo aminas com capacidade de tamponamento a pH ácido. Em US 7.780.957 e US 7.829.657 Kataoka et al. descrevem polímeros com base em uma espinha dorsal de poli(ácido glutâmico) ou poli(ácido aspártico) em que as cadeias laterais de ácido carboxílico são derivadas com cadeias laterais de amina protonáveis a pH ácido. No entanto, não foi explorado o rico espaço estrutural de oligo (alquileno-aminas) contendo unidades de alquileno amina alternadas e não idênticas para servir como porções que melhoram a transfecção em policátions. Em particular, não foi investigado previamente para a transfecção de mRNA.

[006] Em contraste, grande parte do trabalho científico de Kataoka et al. tem-se centrado em poli{N-[N'-(2-aminoetil)-2-aminoetil]aspartamida}. Em uma publicação de Uchida et al. (2011, J Am Chem Soc, 133, 1552415532), o mesmo grupo examinou uma série de poliaspartamidas N- substituídas possuindo unidades de repetição de aminoetileno nas cadeias laterais da fórmula geral -(CH2-CH2-NH)m-H. Curiosamente, quando os autores examinaram a eficiência da família de polímero na transfecção de DNA plasmídico, foi observado “um efeito par-ímpar distinto das unidades de repetição de aminoetileno na cadeia lateral de polímero sobre as eficiências de escape endossomal e transfecção para várias linhas de células. Os poliplexos dos polímeros com um número par de unidades de repetição de aminoetileno (PA-Es) obtiveram uma eficiência de transfecção de ordem de magnitude superior, sem citotoxicidade marcada, do que os dos polímeros com um número ímpar de unidades de repetição de aminoetileno (PA-Os). Este efeito ímpar-igual concordou bem com a capacidade tampão destes polímeros, bem como a sua capacidade para interromper a integridade da membrana seletivamente ao pH endossomal, levando a um escape endossomal altamente eficaz dos poliplexos PA-E. Além disso, foi mostrado que a formação de uma matriz carregada polivalente com espaçamento preciso entre os grupos amino protonados na cadeia lateral do polímero é essencial para a ruptura eficaz da membrana endossomal, facilitando assim o transporte do poliplexo para o citoplasma "(Resumo de Uchida et al , 2011, J Am Chem Soc, 133, 1552415532). Curiosamente, quando o mesmo grupo de pesquisadores comparou os derivados de poli(aspartamida) com cadeias laterais de 1,2-diaminoetano, [PAsp (DET)] versus análogos com cadeias laterais de 1,3-diaminopropano [PAsp (DPT)], observaram que os poliplexos PAsp (DPT) mostraram uma queda significativa na eficácia de transfecção do DNA plasmídico em altas proporções N/P devido ao aumento progressivo da citotoxicidade com relação N/P, embora as diferenças físico-químicas para o tamanho das partículas e potencial-Z foram insignificantes (Miyata et al., 2008, J Am Chem Soc, 130, 16287-16294). Assim, com base na regra ímpar-par, seria de esperar que os polímeros compreendendo 3 grupos amino protonáveis e grupos espaçadores de propileno seriam inferiores a PAsp(DET) e que as cadeias laterais que compreendem 1,3-diaminopropano estão associadas a problemas de toxicidade. Não se conhece nada sobre as relações estrutura-atividade de tais polímeros para a transfecção de mRNA.

[007] M. Kramer “Polymeric Nanocarriers with Dendritic Core-Shell Architectures”, Dissertation, Albert-Ludwigs-Universitat Freiburg i.Br., 2004, descreve a transfecção de genes utilizando partículas de dendrímeros baseados em PEI que podem ser enxertados com cadeias laterais ou grupos terminais de propilenoimina.

[008] Geall e colegas descreveram os carbamatos de colesterol- poliamina com a porção de poliamina possuindo a fórmula geral: -NH-CH2-(CH2)n-CH2-NH-CH2-(CH2)m-CH2-NH-CH2-(CH2)n-NH2, onde m = 0, 1 ou 2 e onde n = 0 ou 1 (Geall et al., 1999, FEBS Lett, 459, 337342). Eles examinaram os valores de pKa dessas substâncias e suas características na condensação do DNA do timo de vitelo. Eles verificaram que a distribuição regioquímica de cargas positivas ao longo de carbamatos de colesterol-poliamina desempenha papéis significativos na modulação da afinidade de ligação do DNA e eficiência de lipofecção. Eles verificaram que entre os carbamatos de colesterol-poliamina examinados, a espermina constituindo a porção de poliamina, -HN-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2- CH2-NH- CH2-CH2-CH2-NH2 (propil/butil/propil) produziu, de longe, a expressão do gene repórter mais elevado após transfecção de DNA de plasmídeo que codifica beta galactosidase em cultura de células, enquanto que por exemplo -HN-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-NH2 (etil/ propil/etil) era três a dez vezes menos eficiente. Assim, tendo em conta os ensinamentos de Kataoka et al. (regra ímpar-par) e os achados de Geall et al., o especialista na técnica descartará a última estrutura no contexto da liberação de ácido nucleico.

[009] Wang et al. descreveram as oligoaminas de enxerto de poli(metacrilato de metila) como reagentes de transfecção eficientes e de baixa citotoxicidade para o DNA plasmídico (Wang et al., 2010, Molecular BioSystems, 6, 256-263). Estes polímeros foram obtidos por aminólise de poli(metacrilato de metila) com oligoaminas de fórmula geral H2N-CH2-CH2- (NH2-CH2)m-NH2, em que m = 1, 2 ou 3. Os autores verificaram que a transfecção Eficiência aumentou com um comprimento crescente de aminas.

[0010] Ou et al. descreveram poli(dissulfureto de amido aminas) que derivam de oligo aminas terminalmente protegidas possuindo a estrutura de D-NH(CH2)a-NH-(CH2)b-NH-(CH2)a-NH-D de por copolimerização com N,N'-cistaminabisacrilamida (Ou et al., 2009, Biomaterials 30, 5804-5814; WO 2010/065660). Eles examinaram as combinações a = 2 e b = 2, a = 2 e b = 3, a = 3 e b = 2, a = 3 e b = 3, a = 3 e b = 4 (espermina). D é o grupo protetor 2-acetildimedona. Após a remoção do grupo protetor, a síntese produz poli(dissulfureto amidas) em que as aminas internas, originalmente secundárias, tornam-se aminas terciárias como parte da cadeia principal de polímero e as aminas terminais tornam-se parte de cadeias laterais de etileno ou propileno-amina pendentes. Tais polímeros têm capacidade de tamponamento na faixa de pH relevante para a liberação de ácido nucleico e são úteis para transfectar DNA plasmídico em células.

[0011] Recentemente, foi descoberta a utilidade de uma nova classe de estruturas sintéticas semelhantes a lipídeos, mas não lipídicas, os chamados lipidoides, para a liberação de ácido nucleico in vitro e in vivo (US 8.450.298, Love et al., 2010, PNAS 107, 1864 -1869, WO2006/138380, Akinc et al., 2008, Nat Biotechnol 26, 561-569). Os lipidoides são obtidos fazendo reagir compostos contendo amina com epóxidos alifáticos, acrilatos, acrilamidas ou aldeídos. Os autores/inventores proporcionaram procedimentos sintéticos para a obtenção de bibliotecas de lipidoide e procedimentos de rastreio para a seleção de compostos úteis com utilidade na liberação de ácido nucleico para células in vitro.

[0012] Como é evidente a partir do acima, muito trabalho de investigação e desenvolvimento tem sido feito no passado sobre a liberação de outras moléculas de ácido nucleico, tais como DNA plasmídico, oligonucleotídeos, siRNA ou análogos de ácido nucleico. A liberação de mRNA não foi investigada em grande profundidade. Alguns autores alegaram que os compostos e formulações que funcionam bem para a liberação de DNA ou siRNA iria trabalhar tanto para a liberação de mRNA. No entanto, em contraste com o DNA plasmídico ou siRNA, o mRNA é uma molécula de cadeia simples. Assim, com base apenas em considerações estruturais, seria de esperar diferentes requisitos para compostos e formulações para liberação de mRNA versus liberação de DNA ou siRNA.

[0013] A literatura anterior citada acima descreve a liberação de ácidos nucleicos de cadeia dupla, tais como ADN plasmídico ou siRNA em células, mas não se sabe se os métodos e compostos descritos são capazes de fornecer ácidos nucleicos de cadeia simples tais como mRNA em células. Notavelmente, foi observado previamente que a transfecção de mRNA difere substancialmente da transfecção de DNA plasmídico em células (Bettinger et al., 2001, Nucleic Acids Res, 29, 38882-91, Uzgün et al, 2011, Pharm Res, 28, 2223-32).

[0014] Em conformidade com isto, os presentes inventores verificaram que, quando se rastreia mais de 100 membros de uma família de polímeros descritos no documento WO 2011/154331 para a sua adequação na liberação de RNA, preferencialmente liberação de RNA de cadeia simples tal como mRNA, a células, nenhum dos compostos foram úteis para transfectar mRNA de uma forma que deu origem à expressão de um gene codificado pelo mRNA. Em contraste, todos estes compostos são eficientes no fornecimento de DNA plasmídico e/ou siRNA. Assim, as regras estabelecidas para a liberação de ácidos nucleicos de cadeia dupla em células não se aplicam a priori para mRNA de cadeia simples. A descrição do documento WO 2011/154331 compreende oligômeros quimicamente definidos de 2 a 60 unidades de unidades de ácido oligo (alquileno amino) que correspondem à fórmula geral HOOC-Z-R-NH-[(CH2)b-NH]a-H, onde Z é uma série de metileno ou uma variedade de outros grupos, R é um resíduo metileno ou carboxi e a e b são independentemente números inteiros de 1-7 ou 2-7, respectivamente. Os oligômeros desta família compreendem grupos amino protonáveis capazes de exercer o chamado efeito de esponja de prótons e demonstraram ser altamente ativos na transfecção de DNA plasmídico e siRNA in vitro e in vivo. De um modo importante, o documento WO 2011/154331 e as publicações científicas associadas ensinam em grande pormenor como bibliotecas de oligômeros/polímeros definidos por sequências podem ser estabelecidas a partir de blocos de construção correspondentes à fórmula geral HOOC-Z-R-NH-[(CH2)b-NH]a-H.

[0015] A tarefa técnica subjacente a presente invenção foi assim proporcionar uma composição que seja adequada para a liberação de ácidos nucleicos, e em particular RNA, de preferência RNA de cadeia simples, tal como mRNA, com uma elevada eficiência em uma célula ou em num tecido.

[0016] Esta tarefa foi conseguida pela provisão das formas de realização caracterizadas nas reivindicações e ilustradas com mais pormenor na seguinte descrição geral e nos exemplos.

[0017] Foi surpreendentemente verificado que os copolímeros contendo uma disposição estatística/aleatória de unidades de repetição de alquileno amina de comprimento alternado em composições para transfectar uma célula com um ácido nucleico, em particular RNA, de preferência um RNA de cadeia simples tal como mRNA, era consistentemente mais eficaz do que polímeros contendo disposições análogas de unidades de repetição de alquileno-amina de comprimento não alternado.

[0018] Deste modo, a invenção proporciona, em um primeiro aspecto, um copolímero estatístico que compreende uma pluralidade de unidades de repetição (a) selecionadas independentemente a partir de unidades de repetição das seguintes fórmulas (a1) e (a2):

uma pluralidade de unidades de repetição (b) selecionadas independentemente entre unidades de repetição das seguintes fórmulas (b1) a (b4):

em que a razão molar da soma das unidades de repetição (a) à soma das unidades de repetição (b) está dentro da faixa de 0,7/1,0 a 1,0/0,7, e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio das unidades de repetição (a) e/ou (b) contidas no copolímero podem ser protonados para proporcionar um copolímero catiônico.

[0019] Em outros aspectos, a invenção proporciona uma composição compreendendo um ácido nucleico, em particular um RNA, de preferência um RNA de cadeia simples tal como mRNA, e o copolímero acima.

[0020] Em outros aspectos, a invenção refere-se a composições farmacêuticas compreendendo as composições de acordo com a invenção. A invenção engloba também métodos para a preparação dos copolímeros de acordo com a invenção, bem como as composições e composições farmacêuticas de acordo com a invenção.

[0021] Ainda outros aspectos são dirigidos ao uso de uma composição de acordo com a invenção ou a um copolímero de acordo com a invenção para liberar um ácido nucleico, em particular RNA, de preferência um RNA de cadeia simples tal como mRNA, em uma célula alvo ou tecido, e a um método para distribuir um ácido nucleico, em particular RNA, de preferência RNA de cadeia simples, tal como mRNA, em uma célula compreendendo a etapa de trazer uma composição de acordo com a invenção em contato com a célula.

[0022] Os copolímeros de acordo com a presente invenção combinam unidades de repetição mais curtas (a) com unidades de repetição mais longas (b) na forma de um copolímero estatístico, em particular um copolímero aleatório e em razões definidas. Foi verificado que esta disposição das unidades de repetição (a) e (b) proporciona vantagens inesperadas em termos da adequação do copolímero resultante como um veículo para liberar um ácido nucleico, em particular um RNA, de preferência um RNA de cadeia simples tal como mRNA, em uma célula.

[0023] Conforme referido acima, o copolímero de acordo com a invenção é um copolímero estatístico que compreende uma pluralidade de unidades de repetição (a) selecionadas independentemente a partir de unidades de repetição das seguintes fórmulas (a1) e (a2):

uma pluralidade de unidades de repetição (b) selecionadas independentemente entre unidades de repetição das seguintes fórmulas (b1) a (b4): em que a razão molar da soma das unidades de repetição (a) à soma das unidades de repetição (b) está dentro da faixa de 0,7/1,0 a 1,0/0,7, e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio das unidades de repetição (a) e/ou (b) contidas no copolímero podem ser protonados para proporcionar um copolímero catiônico.

[0024] O copolímero é um copolímero estatístico, em que quaisquer unidades de repetição (a) e quaisquer unidades de repetição (b) são estatisticamente distribuídas na macromolécula de copolímero. É tipicamente obtido a partir da copolimerização de uma mistura de monômeros produzindo, durante a reação de polimerização, as unidades de repetição (a) com monômeros produzindo, durante a reação de polimerização, as unidades de repetição (b). De preferência, o copolímero é um copolímero aleatório em que quaisquer unidades de repetição (a) e quaisquer unidades de repetição (b) são distribuídas aleatoriamente na macromolécula de polímero.

[0025] O copolímero de acordo com a invenção pode ser um copolímero linear, ramificado ou dendrítico. Como será entendido pelo leitor experiente, uma unidade de repetição da fórmula (a1), (b1) ou (b3) com duas valências (isto é, ligações abertas a unidades vizinhas) conduz a uma propagação da estrutura de copolímero de uma maneira linear. Assim, um copolímero linear da invenção compreende unidades de repetição de fórmula (a1) e um ou mais tipos das unidades de repetição de fórmulas (b1) e (b3), mas não unidades de repetição de fórmula (a2), (b2) ou (b4). Como será adicionalmente entendido, a presença de uma unidade de repetição de fórmula (a2), (b2) ou (b4) com três valências proporciona um ponto de ramificação na estrutura de copolímero. Assim, um copolímero ramificado compreende um ou mais tipos das unidades de repetição de fórmulas (a2), (b2) e (b4) e pode ainda compreender um ou mais tipos das unidades de repetição de fórmulas (a1), (b1) e (b3).

[0026] O copolímero de acordo com a invenção compreende uma pluralidade de unidades de repetição (a) selecionadas independentemente a partir de unidades de repetição de fórmulas (a1) e (a2) definidas acima, e uma pluralidade de unidades de repetição (b) selecionadas independentemente a partir de unidades de repetição de fórmulas (b1) a (b4) definidas acima. São preferidos os copolímeros que compreendem uma pluralidade de unidades de repetição (a) selecionadas independentemente a partir de unidades de repetição de fórmulas (a1) e (a2) definidas acima e uma pluralidade de unidades de repetição (b) selecionadas independentemente a partir de unidades de repetição de fórmulas (b1) e (b2) definidas acima.

[0027] É também preferido que o copolímero de acordo com a invenção seja um copolímero ramificado compreendendo um ou mais tipos de unidades de repetição selecionadas a partir de unidades de repetição (a2), (b2) e (b4), e que opcionalmente compreende ainda um ou mais tipos de unidades de repetição de fórmulas (a1), (b1) e (b3), e em particular um copolímero que compreende unidades de repetição de fórmula (a2) e um ou mais tipos das unidades repetidas de fórmulas (b2) e (b4) , e que opcionalmente compreende ainda um ou mais tipos das unidades de repetição de fórmulas (a1), (b1) e (b3). Em conformidade com o anterior, um copolímero mais preferido é assim um copolímero ramificado que compreende unidades de repetição de fórmula (a2) e unidades de repetição de fórmula (b2), e que opcionalmente compreende ainda um ou mais tipos das unidades de repetição de fórmulas (a1) e (b1).

[0028] Nos copolímeros de acordo com a invenção, o número total de unidades de repetição (a) e unidades de repetição (b) é tipicamente 20 ou mais, de preferência 50 ou mais e mais preferencialmente 100 ou mais. Tipicamente, o número total de unidades de repetição (a) e unidades de repetição (b) é de 5000 ou menos, de preferência 2500 ou menos, mais preferencialmente 1000 ou menos e em particular 500 ou menos.

[0029] Além disso, é preferido para os copolímeros de acordo com a invenção que as unidades de repetição (a) e (b) representem 80% molar ou mais, mais preferencialmente 90% molar ou mais de todas as unidades de repetição no copolímero. São ainda preferidos os copolímeros em que as unidades de repetição (a) selecionadas de entre (a1) e (a2) e unidades de repetição (b) selecionadas de (b1) e (b2) representam 80% molar ou mais, mais preferencialmente 90% molar ou mais de todas as unidades de repetição no copolímero. É mais preferido que todas as unidades de repetição no copolímero sejam unidades de repetição (a) ou (b), em particular que todas as unidades de repetição no copolímero são unidades de repetição (a) selecionadas de (a1) e (a2) ou unidades de repetição (b) selecionadas de (b1) e (b2).

[0030] O peso molecular ponderal médio do copolímero de acordo com a presente invenção, tal como medido, por exemplo, através de cromatografia de exclusão de tamanho em relação aos padrões de poli(óxido de etileno) linear, varia geralmente entre 1.000 e 500.000 Da, de preferência entre 2.000 e 250.000 Da e mais preferencialmente 5.000 a 50.000 Da.

[0031] Os grupos terminais do copolímero de acordo com a invenção compreendem tipicamente um ou mais tipos de grupos (c) independentemente selecionados de grupos das fórmulas (c1) a (c3) abaixo, de preferência de grupos das fórmulas (c1) e (c2) abaixo:

[0032] Preferivelmente, os grupos terminais no copolímero consistem em um ou mais tipos de grupos (c) independentemente selecionados de grupos das fórmulas (c1) a (c3) abaixo, de preferência de grupos das fórmulas (c1) e (c2). Como será entendido pelo especialista na técnica, o número de grupos terminais depende da estrutura do copolímero de acordo com a invenção. Enquanto um copolímero linear tem apenas dois terminais, um maior número de grupos terminais estão contidos em um copolímero ramificado, em particular em um dendrítico. Como será adicionalmente entendido, também um ou mais dos átomos de nitrogênio dos grupos terminais (c) contidos no copolímero podem ser protonados para proporcionar um copolímero catiônico.

[0033] No copolímero de acordo com a invenção, a razão molar da soma das unidades de repetição (a) para a soma das unidades de repetição (b) situa-se dentro da faixa de 0,7/1,0 a 1,0/0,7 e de preferência dentro da faixa de 0,8/1,0 a 1,0/0,8. Esta razão molar pode ser determinada, por exemplo, via RMN. Será assim entendido que a razão é usualmente determinada para uma pluralidade de macromoléculas do copolímero de acordo com a invenção e tipicamente indica a razão total da soma das unidades de repetição (a) à soma das unidades de repetição (b) na pluralidade de macromoléculas.

[0034] Conforme indicado acima, um ou mais dos átomos de nitrogênio do copolímero de acordo com a invenção podem ser protonados para resultar em um copolímero em uma forma catiônica, tipicamente uma forma oligocatiônica ou policatiônica. Será assim entendido que os grupos amino primários, secundários ou terciários nas unidades de repetição (a) ou (b) ou nos grupos terminais (c) podem atuar como aceitadores de prótons, especialmente em água e soluções aquosas, incluindo fluidos fisiológicos. Assim, os copolímeros da presente invenção têm tipicamente uma carga positiva total em uma solução aquosa a um pH inferior a 7,5. Uma solução aquosa, como referido aqui, é uma solução em que o solvente compreende 50% (vol./vol.) ou mais, de preferência 80 ou 90% ou mais, e mais preferencialmente 100% de água. Além disso, se as composições de acordo com a invenção estiverem em contato com um fluido fisiológico com um pH inferior a 7,5, incluindo, por exemplo, sangue e fluido pulmonar, contêm tipicamente unidades de repetição (a) e (b) em que os átomos de nitrogênio são protonados. Os valores de pKa dos copolímeros utilizados nas composições de acordo com a invenção podem ser determinados por titulação ácido-base utilizando um titulador de pKa automatizado. A carga líquida a um determinado valor de pH pode então ser calculada por exemplo, da equação de Henderson-Hasselbach. Qualquer cobrança pode ser compartilhada entre vários centros básicos e não pode necessariamente ser atribuída a um único ponto. Tipicamente, em soluções a pH fisiológico, os copolímeros utilizados nas composições de acordo com a invenção compreendem unidades de repetição com grupos amino em estado protonado e unidades de repetição com grupos amino em estado não protonado.

[0035] Contudo, tal como será compreendido pelo leitor experiente, os copolímeros de acordo com a invenção, bem como as composições de acordo com a invenção, podem também ser proporcionados como uma forma de sal seco que contém o copolímero em uma forma catiônica.

[0036] Como será adicionalmente entendido, os contra íons (ânions) para as cargas positivas dos grupos amino protonados nas composições de acordo com a invenção compreendendo o copolímero e o ácido nucleico, em particular o RNA, de preferência o RNA de cadeia simples tal como o mRNA, são tipicamente proporcionados por porções aniônicas contido no ácido nucleico. Se os grupos positivamente carregados estiverem presentes em excesso em comparação com as porções aniônicas no ácido nucleico, as cargas positivas podem ser equilibradas por outros ânions, em particular os tipicamente encontrados em fluidos fisiológicos, tais como Cl- ou HCO3-.

[0037] Em conformidade com o anterior, um copolímero preferido de acordo com a invenção é um copolímero aleatório, em que 80% molar ou mais de todas as unidades de repetição, mais preferencialmente todas as unidades de repetição, são formadas por uma pluralidade de unidades de repetição (a) selecionadas independentemente a partir de unidades de repetição das seguintes fórmulas (a1) e (a2):

uma pluralidade de independentemente selecionadas a partir de unidades de repetição das seguintes fórmulas (b1) e (b2):

em que a razão molar da soma das unidades de repetição (a) à soma das unidades de repetição (b) está dentro da faixa de 0,7/1,0 a 1,0/0,7, mais preferencialmente na faixa de 0,8/1,0 a 1,0/0,8 ; em que os grupos terminais do copolímero são formados por grupos (c) independentemente selecionados de grupos das fórmulas (c1) e (c2):

em que um ou mais dos átomos de nitrogênio das unidades de repetição (a) e/ou (b) e/ou dos grupos terminais (c) contidos no copolímero podem ser protonados para proporcionar um copolímero catiônico. É ainda preferido que o copolímero seja um copolímero ramificado, compreendendo unidades (a2) e (b2), opcionalmente em conjunto com unidades (a1) e/ou (b1).

[0038] Os copolímeros de acordo com a invenção podem ser convenientemente preparados com procedimentos análogos aos conhecidos para a preparação de polialquilenoiminas, tais como polietilenoimina ramificada ou linear (PEI). Será entendido que os monômeros utilizados para a produção dos copolímeros terão de ser ajustados em conformidade. No contexto da presente invenção, foi verificado que os monômeros podem ser convenientemente reagidos de uma maneira quantitativa, de tal modo que a razão das unidades (a) e (b) no copolímero pode ser ajustada ajustando a razão de monômero de acordo na mistura de monômeros submetida à polimerização. Embora a polietilenoimina, também referida como poliaziridina, possa ser preparada, por exemplo, através de polimerização de aziridina de abertura de anel, os copolímeros de acordo com a invenção podem ser preparados por meio de polimerização de abertura de anel de uma mistura de monômeros compreendendo ou consistindo de aziridina, azetidina e, quando aplicável, pirrolidina, ou em formas de realização preferidas de aziridina e azetidina. Será entendido que a expressão "quando aplicável"refere-se à presença ou ausência de unidades de repetição (b3) e (b4) ou grupos terminais (c3) que seriam formados pela pirrolidina. A polimerização de abertura do anel das aminas cíclicas não substituídas conduz habitualmente a copolímeros ramificados. Os copolímeros lineares de acordo com a invenção podem ser preparados, por exemplo, através da polimerização de aziridinas N-substituídas adequadas, azetidinas N-substituídas e pirrolidinas N-substituídas, ou aziridinas N-substituídas e azetidinas N-substituídas, que podem ser seguidas, por exemplo, por uma clivagem hidrolítica de N- substituintes ligados à cadeia de polialquilenoimina resultante, por exemplo, em analogia com o procedimento publicado em Katrien F. Weyts, Eric J. Goethals, Nova síntese de polietilenoimina linear, Polymer Bulletin, janeiro 1988, Volume 19, Edição 1, pp 13-19.

[0039] Para a preparação de um dendrímero (ou copolímero dendrítico), podem ser analogamente aplicadas estratégias sintéticas que são conhecidas para a produção de dendrímeros de polietilenoimina ou polipropilenoamina. Os dendrímeros de polipropilenimina podem ser sintetizados a partir de blocos de construção de acrilonitrila utilizando uma sequência de repetição de uma adição de Michael a uma amina primária, seguida de uma hidrogenação heterogeneamente catalisada (Newkome e Shreiner Poli(amidoamina), polipropilenimina e dendrímeros e dendrons relacionados possuindo diferentes motivos de ramificações 1 ^ 2: Uma visão geral dos procedimentos divergentes. Polymer 49 (2008) 1-173, De Brabander-Van Den Berg et al.. Produção em larga escala de dendrímeros de polipropilenimina, Macromolecular Symposia (1994) 77 (1) 51-62). Os dendrímeros de polietilenimina podem ser produzidos utilizando uma sequência de repetição de uma adição de Michael de um bloco de construção de brometo de vinila a uma amina primária seguida por uma conversão de brometo de alquila em amina utilizando um método de síntese de amina de Gabriel (Yemul & Imae, Síntese e caracterização de dendrímeros de poli(etilenoimina), Colloid Polym Sci (2008) 286: 747-752). Por conseguinte, o especialista na técnica será capaz de produzir não só dendrímeros com camadas estritamente alternadas de, por exemplo, propilenimina e etilenimina podem ser produzidos. Da mesma forma, gerações de dendrímeros com camadas compreendendo ou consistindo de composições aleatórias de unidades de repetição de fórmula (a2), (b2) e (b4) e de preferência unidades de repetição (a2) e (b2).

[0040] A polimerização de abertura de anel de aziridina e azetidina, ou de aziridina, azetidina e pirrolidina, pode ser realizada em solução, por exemplo, na água. A concentração total de monômeros não é particularmente limitada, concentrações típicas variam de 10% p/p a 80% p/p, de preferi^/cia 30% p/p a 60% p/p. Tipicamente, a polimerização é iniciada por prótons, de modo que é preferível adicionar um ácido de Br0nsted, em particular um ácido mineral, tal como ácido sulfúrico, ao sistema de reação. Pequenas quantidades de ácido são geralmente suficientes, tais como 0,001 a 0,01 equivalentes, com base na concentração total de monômeros. A reação prossegue a taxas convenientes, por exemplo, na faixa de temperatura de 50 a 150°C, em particular de 90 a 140°C. Nestas faixas, copolímeros de peso molecular mais elevado são usualmente a temperaturas mais elevadas, e copolímeros de peso molecular mais baixo a temperaturas mais baixas.

Ácido nucleico

[0041] Como referido acima, um aspecto central da invenção é uma composição compreendendo um ácido nucleico, em particular um RNA, de preferência um RNA de cadeia simples tal como mRNA, e o copolímero acima de acordo com a invenção.

[0042] O termo "ácido nucleico" engloba todas as formas de tipos de ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente bem como ácidos nucleicos quimicamente e/ou enzimaticamente sintetizados e também engloba análogos de ácido nucleico e derivados de ácido nucleico tais como, por exemplo, ácidos nucleicos bloqueados (LNA), ácidos nucleicos peptídicos (PNA), tiofosfatos e fosfotriésteres de oligonucleosídeo, morfolino de oligonucleotídeos, oligonucleotídeos catiônicos (US6017700 A, WO/2007/069092), ribo-oligonucleotídeos ou fosforotioatos substituídos. Além disso, o termo "ácido nucleico" refere-se também a qualquer molécula que compreenda nucleotídeos ou análogos de nucleotídeos. Não existem limitações relativas à sequência ou tamanho de um ácido nucleico compreendido na composição da presente invenção. O ácido nucleico é predominantemente definido pelo efeito biológico que se pretende alcançar no alvo biológico ao qual a composição da presente invenção é liberada. Por exemplo, no caso de uma aplicação em terapia genética ou de ácido nucleico, a sequência de ácido nucleico ou de ácido nucleico pode ser definida pelo gene ou fragmento de gene a ser expresso ou pela pretendida substituição ou reparação de um gene defeituoso ou qualquer sequência alvo do gene ou pela sequência alvo de um gene a ser inibido, knock-down ou down-regulado.

[0043] De preferência, o termo "ácido nucleico" refere-se a oligonucleotídeos ou polinucleotídeos, incluindo ácido desoxirribonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA). Em relação ao RNA, em princípio, qualquer tipo de RNA pode ser utilizado no contexto da presente invenção. Em uma forma de realização preferida o RNA é um RNA de cadeia simples. O termo "RNA de cadeia simples" significa uma única cadeia consecutiva de ribonucleotídeos em contraste com as moléculas de RNA em que duas ou mais cadeias separadas formam uma molécula de cadeia dupla devido à hibridação das cadeias separadas. O termo "RNA de cadeia simples"não exclui que a molécula de cadeia simples forme em si estruturas de cadeia dupla, tais como loops, estruturas secundárias ou terciárias.

[0044] O termo "RNA" abrange o RNA que codifica uma sequência de aminoácidos assim como o RNA que não codifica para uma sequência de aminoácidos. Foi sugerido que mais de 80% do genoma contém elementos funcionais de DNA que não codificam proteínas. Estas sequências não codificadoras incluem elementos de DNA reguladores (locais de ligação para fatores de transcrição, reguladores e coreguladores, etc.) e sequências que codificam para transcritos que nunca são traduzidos em proteínas. Estes transcritos, que são codificados pelo genoma e transcritos em RNA mas não são traduzidos em proteínas, são chamados RNAs não codificantes (ncRNAs). Assim, em uma forma de realização, o RNA é um RNA não codificante. De preferência, o RNA não codificante é uma molécula de cadeia simples. Estudos demonstram que ncRNAs são jogadores críticos na regulação de genes, manutenção da integridade genômica, diferenciação celular e desenvolvimento, e são mal regulados em várias doenças humanas. Existem diferentes tipos de ncRNAs: ncRNAs curtos (20-50 nt), médio (50-200 nt) e longos (> 200 nt). O ncRNA curto inclui microARN (miRNA), RNA de interferência pequeno (siRNA), RNA de interação piwi (piRNA) e RNA de iniciação de transcrição (tiRNA). Exemplos de ncRNAs médios são RNAs pequenos (snARNAs), RNAs nucleolares pequenos (snoRNAs), RNAs de transferência (tRNtAs), RNAs de início de local associados de transcrição (TSSaRNAs), RNAs pequenos associados a promotor (PASRs) e transcritos de promotor a montante PROMPTs). Os RNAs não codificantes longos (lncRNA) incluem RNA não codificante intergênico (lincRNA), lncRNA antissentido, incRNA intrônico, RNA ultra conservados transcritos (T-UCRs) e outros (Bhan A, Mandal SS, ChemMedChem. 26 março 2014. doi: 10.1002/cmdc.201300534). Dos RNAs não codificantes acima mencionados apenas siRNA é de cadeia dupla. Deste modo, uma vez que em uma forma de realização preferida o RNA não codificante é de cadeia simples, é preferível que o RNA não codificante não seja siRNA. Em outra forma de realização o RNA é um RNA de codificação, isto é, um RNA que codifica uma sequência de aminoácidos. Tais moléculas de RNA são também referidas como mRNA (RNA mensageiro) e são moléculas de RNA de cadeia simples. Os ácidos nucleicos podem ser preparados por uma metodologia química sintética e enzimática conhecida por um especialista na matéria, ou pelo uso de tecnologia recombinante, ou podem ser isolados a partir de fontes naturais, ou por uma combinação dos mesmos. Os oligo ou polinucleotídeos podem opcionalmente compreender nucleotídeos não naturais e podem ser de cadeia simples ou dupla ou tripla. "Ácido nucleico" refere-se também a oligo ou polinucleotídeos senso e antissentido, isto é, uma sequência nucleotídica que é complementar a uma sequência nucleotídica específica em um DNA e/ou RNA.

[0045] De preferência, o termo ácido nucleico no contexto da presente invenção refere-se a RNA, mais preferencialmente o RNA de cadeia simples, em particular o mRNA e mais preferencialmente o mRNA modificado.

[0046] Os RNAs mensageiros (mRNA) são copolímeros que são constituídos por blocos de construção de fosfato de nucleosídeo principalmente com adenosina, citidina, uridina e guanosina como nucleosídeos, que como veículos intermediários trazem a informação genética do DNA no núcleo celular no citoplasma, onde é traduzido em proteínas. São assim adequados como alternativas para a expressão de genes.

[0047] No contexto da presente invenção, mRNA deve ser entendido como significando qualquer molécula de polirribonucleotídeo que, se entrar na célula, é adequada para a expressão de uma proteína ou fragmento do mesmo ou é traduzível para uma proteína ou um seu fragmento. O termo “proteína” engloba aqui qualquer tipo de sequência de aminoácidos, isto é, cadeias de dois ou mais aminoácidos que estão ligados cada um através de ligações peptídicas e também inclui peptídeos e proteínas de fusão.

[0048] O mRNA contém uma sequência de ribonucleotídeos que codifica uma proteína ou um seu fragmento cuja função na célula ou na vizinhança da célula é necessária ou benéfica, por exemplo, uma proteína cuja ausência ou forma defeituosa é um gatilho para uma doença ou uma enfermidade, cuja provisão da qual pode moderar ou prevenir uma doença ou uma enfermidade, ou uma proteína que pode promover um processo que é benéfico para o corpo, em uma célula ou sua vizinhança. O mRNA pode conter a sequência para a proteína completa ou uma variante funcional da mesma. Além disso, a sequência de ribonucleotídeos pode codificar uma proteína que atua como fator, indutor, regulador, estimulador ou enzima, ou um seu fragmento funcional, em que esta proteína é uma cuja função é necessária para remediar um distúrbio, em particular um distúrbio metabólico ou para iniciar processos in vivo tais como a formação de novos vasos sanguíneos, tecidos, etc. Aqui, variação funcional é entendida como significando um fragmento que na célula pode desempenhar a função da proteína cuja função na célula é necessária ou a ausência ou forma defeituosa é patogênica. Além disso, o mRNA pode também ter outras regiões funcionais e/ou regiões 3' ou 5'não codificadoras. As regiões 3' e/ou 5'não codificadoras podem ser as regiões que naturalmente flanqueiam a sequência que codifica a proteína ou sequências artificiais que contribuem para a estabilização do RNA. Os especialistas na técnica podem determinar as sequências adequadas para isto em cada caso por experimentos de rotina.

[0049] Em uma forma de realização preferida, o mRNA contém uma tampa m7GpppG, um local de entrada de ribossoma interno (IRES) e/ou uma cauda poliA na extremidade 3', em particular para melhorar a tradução. O mRNA pode ter outras regiões promovendo a tradução.

[0050] Em uma forma de realização preferida o mRNA é um mRNA que contém uma combinação de nucleotídeos modificados e não modificados. Preferencialmente, é um mRNA contendo uma combinação de nucleotídeos modificados e não modificados como descrito em WO2011/012316. O mRNA aqui descrito descreve uma estabilidade aumentada e uma imunogenicidade diminuída. Em uma forma de realização preferida, em um tal mRNA modificado, 5 a 50% dos nucleotídeos de citidina e 5 a 50% dos nucleotídeos de uridina são modificados. Os nucleotídeos contendo adenosina e guanosina podem ser não modificados. Os nucleotídeos de adenosina e guanosina podem ser não modificados ou parcialmente modificados e estão preferencialmente presentes na forma não modificada. De preferência 10 a 35% dos nucleotídeos de citidina e uridina são modificados e particularmente preferencialmente o teor dos nucleotídeo de citidina modificados situa-se em uma faixa de 7,5 a 25% e o teor dos nucleotídeos de uridina modificados em uma faixa de 7,5 a 25%. Foi verificado que, de fato, um teor relativamente baixo, por exemplo, apenas 10% cada, de nucleotídeos de citidina e de uridina modificados podem conseguir as propriedades desejadas. É particularmente preferido que os nucleotídeos de citidina modificados sejam resíduos de 5- metilcitidina e os nucleotídeos de uridina modificados sejam resíduos de 2- tiouridina. Mais preferivelmente, o teor de nucleotídeos de citidina modificados e o teor de nucleotídeos de uridina modificados é de 25%, respectivamente.

[0051] Em outra forma de realização preferida, o mRNA pode ser combinado com locais de ligação alvo, sequências de direcionamento e/ou com locais de ligação de microRNA, de modo a permitir a atividade do mRNA desejado apenas nas células relevantes. Em uma outra forma de realização preferida, o RNA pode ser combinado com microRNAs ou shRNAs a jusante da cauda 3' poliA.

[0052] Além disso, o termo "ácido(s) nucleico(s)" pode referir-se a DNA ou RNA ou a seus híbridos ou a qualquer modificação do mesmo que seja conhecida no estado da técnica (ver, por exemplo, US 8278036, WO 2013/052523, WO 2011/012316 , US 5525711, US 4711955, US 5792608 ou EP 302175 (Lorenz et al., 2004, Bioorg Med Chem Lett, 14, 4975-4977; Soutschek et al., 2004, Nature, 432, 173-178) para exemplos de modificações). Tal (s) molécula (s) de ácido nucleico são de cadeia simples ou dupla, linear ou circular, natural ou sintética, e sem nenhuma limitação de tamanho. Por exemplo, a(s) molécula(s) de ácido nucleico pode ser DNA, cADNA, mRNA, genômico, RNA antissentido, ribozima, ou RNAs de pequena interferência (siRNAs), microRNAs, antagomirs ou RNAs de gancho curto (shRNAs), tRNAs RNAs de cadeias duplas longas ou um construto DNA codificando tais RNAs ou quimeraplastos (Colestrauss et al., 1996, Science, 273, 1386-1389), ou aptâmeros, repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente intercaladas ("CRISPR" para a clivagem de DNA específica do local guiada por RNA) (Cong et al., 2013, Science, 339, 819-823), ou RNA e DNA. A(s) referida(s) molécula(s) de ácido nucleico pode(m) estar na forma de plasmídeos, cosmídeos, cromossomas artificiais, RNA e DNA virais, DNA bacteriófago, RNA de codificante e não codificante de cadeia simples (mRNA) ou de cadeia dupla e oligonucleotídeo(s), em que qualquer das modificações do estado da técnica na espinha dorsal de açúcar e/ou nas bases como descrito acima e modificações 3' ou 5'estão incluídas. Em uma forma de realização particularmente preferida o ácido nucleico é RNA, mais preferencialmente mRNA ou siRNA.

[0053] O(s) ácido(s) nucleico(s) pode(m) conter uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que se pretende expressar em uma célula alvo. Métodos que são bem conhecidos dos especialistas na técnica podem ser utilizados para construir moléculas de ácido nucleico recombinantes; ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (2001) N.Y. e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates e Wiley Interscience, N.Y. (1989).).

[0054] Em uma forma de realização preferida, o referido ácido nucleico é um ácido nucleico ativo sob o ponto de vista terapêutico ou farmacêutico incluindo todos os tipos de ácidos nucleicos e modificações listadas acima e aqueles conhecidos pelos especialistas na técnica que podem ter um efeito terapêutico ou preventivo. Em geral, os efeitos terapêuticos ou preventivos podem ser conseguidos pela interação do ácido nucleico com moléculas celulares e organelas. Tal interação por si só pode, por exemplo, ativar o sistema imune inato, como é o caso de certos oligonucleotídeos de CpG e sequências concebidas para especificamente interagir com receptores de tipo toll e outros receptores extracelulares ou intracelulares. Além disso, a captação ou introdução de ácidos nucleicos em células pode pretender conduzir à expressão de sequências nucleotídicas, tais como genes compreendidos no ácido nucleico, pode ser pretendida para o downregulation, silenciamento ou knockdown da expressão genética endógena como consequência da presença intracelular de um ácido nucleico exógeno introduzido, ou pode ser pretendido para a modificação de sequências endógenas de ácido nucleico tais como reparação, excisão, inserção ou permuta de bases selecionadas ou de trechos inteiros de sequências endógenas de ácido nucleico ou pode ser intencionada para interferência com praticamente qualquer processo celular como consequência da presença intracelular e interação de um ácido nucleico exógeno introduzido. A sobre- expressão de ácidos nucleicos exógenos introduzidos pode pretender compensar ou complementar a expressão de genes endógenos, em particular nos casos em que um gene endógeno é defeituoso ou silencioso, conduzindo a um produto não insuficiente ou defeituoso ou um produto disfuncional de expressão génica tal como é o caso com muitas doenças metabólicas e hereditárias como fibrose cística, hemofilia ou distrofia muscular para citar algumas. A sobre-expressão de ácidos nucleicos exógenos introduzidos também pode pretender que o produto da expressão interaja ou interfira com qualquer processo celular endógeno tal como a regulação da expressão genética, transdução de sinal e outros processos celulares. A sobre-expressão de ácidos nucleicos exógenos introduzidos pode também ser pretendida para dar origem a uma resposta imunitária no contexto do organismo em que uma célula transfectada ou transduzida reside ou é feita para residir. Exemplos são a modificação genética de células apresentadoras de antígenos tais como células dendríticas de modo a tê-las a apresentar um antígeno para fins de vacinação. Outros exemplos são a sobre-expressão de citocinas em tumores de modo a provocar uma resposta imunitária específica de tumor. Além disso, a sobre-expressão de ácidos nucleicos exógenos introduzidos pode também ser pretendida para gerar células transientemente geneticamente modificadas in vivo ou ex vivo para terapias celulares tais como células T modificadas ou precursoras ou tronco ou outras células para medicina regenerativa.

[0055] O downregulation, o silenciamento ou knockdown da expressão endógena de genes para fins terapêuticos podem, por exemplo, ser conseguidos por interferência de RNA (RNAi), com ribozimas, oligonucleotídeos antissentido, tRNAs, RNA de cadeia dupla longos onde essa desregulação pode ser específica da sequência ou inespecífica e pode também levar à morte celular como é o caso quando os RNA de cadeia dupla longos são introduzidos nas células. O downregulation, o silenciamento ou o knockdown da expressão gênica endógena ou preexistente pode ser útil no tratamento de doenças adquiridas, hereditárias ou que envolvem espontaneamente incluindo infecções virais e câncer. Também pode ser considerado que a introdução de ácidos nucleicos nas células pode ser praticada como uma medida preventiva para prevenir, por exemplo, infecção viral ou neoplasias. O downregulation, o silenciamento ou o knockdown da expressão endógena do gene pode ser exercido no nível transcripcional e no nível translacional. Múltiplos mecanismos são conhecidos dos especialistas na técnica e incluem, por exemplo, modificações epigenéticas, alterações na estrutura da cromatina, ligação seletiva de fatores de transcrição pelo ácido nucleico introduzido, hibridação do ácido nucleico introduzido em sequências complementares no DNA genético, mRNA ou outros RNA por emparelhamento de bases incluindo mecanismos de emparelhamento de bases não convencionais tais como formação de hélice tripla. De modo semelhante, as alterações de reparação genética, de base ou de sequência podem ser conseguidas ao nível genético e ao nível de mRNA incluindo o salto de exon. As alterações da base ou da sequência podem, por exemplo, ser conseguidas por clivagem de DNA específica do local guiada por RNA, através de mecanismos de corte e colagem que exploram trans-splicing, ribozimas de trans-splicing, quimeraplastos, splicosome-mediado por RNA trans-splicing ou explorando o grupo II ou íntrons reencontrados ou explorando a mutagênese de inserção mediada por vírus ou explorando a inserção genética direcionada utilizando sistemas de integrase procariótica, eucarioica ou viral. Como os ácidos nucleicos são os veículos dos planos de construção dos sistemas vivos e como eles participam de muitos processos celulares de forma direta e indireta, em teoria, qualquer processo celular pode ser influenciado pela introdução de ácidos nucleicos em células de fora. Particularmente, esta introdução pode ser realizada diretamente in vivo e ex vivo em cultura de células ou órgãos, seguida pela transplantação de órgãos ou células assim modificados para um receptor. Os complexos da presente invenção com ácidos nucleicos como agentes ativos podem ser úteis para todos os fins descritos acima.

Composição

[0056] Como descrito acima, a composição de acordo com a invenção compreende um ácido nucleico, em particular RNA, de preferência RNA de cadeia simples, tal como mRNA, e o copolímero de acordo com a invenção.

[0057] A invenção engloba também uma composição que consiste do ácido nucleico, em particular RNA, de preferência RNA de cadeia simples tal como mRNA, e o copolímero de acordo com a invenção. No entanto, a composição pode também compreender outros componentes, por exemplo, componentes para formulação de lipídeos e/ou componentes que exercem uma função efetora durante a liberação do ácido nucleico para e para dentro de uma célula. Tipicamente, os pesos combinados do ácido nucleico e do copolímero de acordo com a invenção representam 50% em peso ou mais, de preferência 70% em peso ou mais, do peso total da composição.

[0058] Será entendido que as composições de acordo com a invenção proporcionam geralmente uma associação do ácido nucleico, em particular RNA, de preferência RNA de cadeia simples, tal como mRNA, com o copolímero e outros componentes opcionais que estão associados em uma entidade finita, suficientemente estável para manter a associação de uma proporção significativa dos referidos componentes até atingir um alvo biológico ou o ambiente de um alvo biológico durante uma aplicação, por exemplo durante uma via desejada de liberação de ácido nucleico, em particular RNA, de preferência RNA de cadeia simples tal como mRNA.

[0059] Devido à presença dos grupos amino protonáveis no copolímero de acordo com a invenção, este copolímero pode compreender cargas catiônicas nas unidades de repetição de fórmula (a) e/ou (b), de tal modo que o copolímero forme um cátion, tipicamente um oligo ou policátion contendo uma pluralidade de porções catiônicas, na presença de prótons, por exemplo, em água ou soluções aquosas, ou na presença de um ácido doador de prótons. Assim, de preferência, a composição de acordo com a invenção contém ou consiste em um complexo de ácido nucleico, em particular RNA, de preferência RNA de cadeia simples, tal como mRNA, e um copolímero de acordo com a invenção que é um copolímero catiônico. Será entendido que um copolímero catiônico e um ácido nucleico aniônico estão geralmente associados através de interação eletrostática em um tal complexo. No entanto, outras interações atraentes também podem participar na estabilização do complexo, incluindo ligações de hidrogênio e ligações covalentes.

[0060] Nas composições da presente invenção, o copolímero e o ácido nucleico, em particular o RNA, de preferência o RNA de cadeia simples, tal como o mRNA=, estão tipicamente contidos, por exemplo, em uma relação em peso de copolímero/peso de ácido nucleico (p/p) de 0,25/1 - 50/1, preferencialmente de 0,5/1 - 30/1, mais preferencialmente de 1/1 - 20/1.

[0061] De um modo mais preferido, nos casos em que a composição contém um complexo do ácido nucleico, particularmente RNA, de preferência RNA de cadeia simples, tal como mRNA, e um copolímero catiônico de acordo com a invenção, razões relativas do copolímero e do ácido nucleico, as composições da invenção podem ser selecionadas considerando o grau de neutralização de carga mútua. No ácido nucleico, em particular RNA, preferencialmente RNA de cadeia simples, tal como mRNA, liberação com complexos do ácido nucleico, com um copolímero catiônico, em geral, quantidades do copolímero catiônico são misturados com uma determinada quantidade do ácido nucleico, que conduzem a pelo menos uma neutralização de carga das cargas negativas do ácido nucleico, de preferência a uma sobre- compensação das cargas negativas do ácido nucleico.

[0062] As razões adequadas entre o copolímero catiônico e o ácido nucleico, particularmente o RNA, de preferência o RNA de cadeia simples, tal como o mRNA, podem ser facilmente determinadas por ensaios de retardamento de gel, métodos de extinção por fluorescência tais como o ensaio de deslocamento/extinção de brometo de etídio. As razões úteis entre o copolímero e o ácido nucleico, em particular o RNA, de preferência o RNA de cadeia simples, tal como o mRNA, são normalmente caracterizadas por um retardamento pelo menos parcial, preferencialmente completo do ácido nucleico compreendido no complexo com o copolímero catiônico quando sujeito a eletroforese em um gel de agarose, por um elevado grau de extinção por fluorescência de corantes tais como brometo de etídio, RiboGreen ou YOYO quando intercalados nos ácidos nucleicos ou pela formação de (nano)partículas ao misturar copolímero e ácido nucleico.

[0063] Para as composições que contêm os copolímeros catiônicos quimicamente bem definidos da presente invenção, a razão N/P calculada é um fator adequado para escolher e definir as razões relativas do copolímero e do ácido nucleico, particularmente RNA, de preferência RNA de cadeia simples tal como mRNA. A razão N/P designa a razão molar dos átomos de nitrogênio protonáveis nas unidades de repetição (a) e (b) do copolímero da presente invenção sobre os grupos fosfato do ácido nucleico na composição da presente invenção. A relação N/P é um parâmetro estabelecido para a caracterização de tais complexos de ácido nucleico com veículos catiônicos. Será entendido pelo leitor experiente que os átomos de nitrogênio nos grupos amino que ligam as unidades de repetição (a) e (b) a unidades de repetição vizinhas e grupos amino terminais são considerados como átomos de nitrogênio protonáveis. Por outro lado, os átomos de nitrogênio nas ligações amida (que não estão geralmente presentes nos copolímeros da invenção), não contariam como átomos de nitrogênio protonáveis. Para as composições da presente invenção contendo um copolímero catiônico da invenção e ácido nucleico, particularmente RNA, de preferência RNA de cadeia simples tal como mRNA, a razão de N/P pode ser calculada convenientemente, por exemplo, de acordo com a fórmula

em que wp é o peso do copolímero em gramas, n é o número de grupos amino protonáveis por unidade de repetição, Mwp é o peso molecular médio das unidades de repetição (a) e (b) contidas no copolímero, wna é o peso do ácido nucleico em gramas e Mbase é o peso molecular médio de um nucleotídeo no ácido nucleico, por exemplo, 346 g/mol no caso de RNA.

[0064] Especificamente para os copolímeros da presente invenção, n é 1. Mwp pode ser calculado com base na razão das unidades de repetição polimerizadas, por exemplo, determinado por RMN, e respectivos pesos moleculares. Por exemplo, em um copolímero ramificado contendo unidades polimerizadas (a2) e (b2) com pesos moleculares de 42 g/mol (a2) e 56 g/mol (b2), respectivamente, em uma razão molar de (a)/(b) de 0,9/1,0, Mwp calcula como

[0065] Em complexos binários de acordo com a invenção que consistem no copolímero de acordo com a invenção e o ácido nucleico, particularmente RNA, de preferência RNA de cadeia simples tal como mRNA, para liberação de ácido nucleico de acordo com a invenção, quantidades relativas do copolímero para o ácido nucleico deve ser de preferência utilizadas que proporcione uma razão N/P resultando em um potencial zeta positivo da composição binária final. No contexto da presente invenção, para composições binárias da presente invenção, são preferidas razões de N/P de 1 a 100, são mais preferidas razões de N/P de 3 a 60 e as mais preferidas são razões de N/P de 4 a 44.

[0066] A composição da invenção compreende opcionalmente outros componentes, em particular componentes que podem exercer uma função efetora durante o ácido nucleico, em particular RNA, de preferência RNA de cadeia simples tal como mRNA, liberação para e para dentro de uma célula. Tais componentes podem ser, mas não estão limitados a, poliânions, lipídeos, policátions diferentes dos copolímeros da presente invenção, incluindo peptídeos catiônicos, oligômero ou polímeros de proteção, poloxâmeros (também conhecidos como plurônicos), poloxaminas, ligantes de direcionamento, agentes endossomolíticos, penetradores de célula, peptídeos de sinal, nanopartículas magnéticas e não magnéticas, inibidores de RNAase, corantes fluorescentes, radioisótopos ou agentes de contraste para imagiologia médica. O termo "função efetora" engloba qualquer função que suporte a obtenção de um efeito biológico pretendido de um ácido nucleico, em particular RNA, de preferência RNA de cadeia simples, tal como mRNA, da composição em ou em um alvo biológico ou ao redor de um alvo biológico. Por exemplo, as composições para liberação de ácido nucleico foram formuladas para compreender ácidos nucleicos não codificantes ou poliânions de ácidos não nucleicos como materiais de absorção (Kichler et al., 2005, J Gene Med, 7, 1459-1467). Esses materiais de absorção são adequados para reduzir a dose de um ácido nucleico com um efeito biológico pretendido mantendo a extensão ou o grau desse efeito obtido a uma dose de ácido nucleico mais elevada na ausência de tal material de enchimento. Também foram utilizados poliânions de ácido não nucleico para obter expressão gênica prolongada in vivo com toxicidade reduzida (Uchida et al., 2011, J Control Release, 155, 296-302). As composições da presente invenção podem também compreender lipídeos catiônicos, aniônicos ou neutros, tal como é o caso em lipopoliplexos (Li e Huang em "Nonviral Vectors for Gene Therapy", Academic Press 1999, Capítulo 13, 295-303). Além disso, as composições da presente invenção podem compreender oligo- ou policátions diferentes dos copolímeros da presente invenção. Tais oligo- ou policátions adicionais podem ser úteis para alcançar um grau desejado de compactação de um ácido nucleico ou no caso de peptídeos policatiônicos podem ter uma função de sinal de localização nuclear tal como descrita anteriormente (Ritter et al., 2003, J Mol Med, 81, 708-717). Os polímeros de proteção, tais como o poli(etileno glicol) (PEG) podem também ser incluídos nas composições da presente invenção e são frequentemente utilizados para estabilizar poliplexos e lipoplexos contra a agregação e/ou interações indesejáveis em um ambiente biológico (opsonização), por exemplo, interações com componentes do soro, células sanguíneas ou matriz extracelular. A proteção também pode ser adequada para reduzir a toxicidade de composições que compreendem ácido nucleico (Finsinger et al., 2000, Gene Ther, 7, 1183-1192). Os polímeros de proteção tais como PEG podem ser acoplados covalentemente diretamente a copolímeros da presente invenção. O acoplamento pode ser conseguido, por exemplo, a grupos terminais (c), ou a um grupo amino das unidades de repetição de fórmulas (a1), (b1) ou (b3).

[0067] Os derivados de polivinila tais como PVP e poloxâmeros têm sido encontrados úteis para aumentar a transfecção por injeção intramuscular (Mumper et al., 1996, Pharm Res, 13, 701-709, Lemieux et al., 2000, Gene Ther, 7, 986-991) e, pode ser útil para ser compreendido nas composições da presente invenção.

[0068] Os ligantes de direcionamento incluindo os anticorpos compreendidos nas composições para a liberação de ácido nucleico são úteis para transfecção preferencial e melhorada de células alvo (Philipp e Wagner em "Gene and Cell Therapy - Therapeutic Mechanisms and Strategy", 3a edição, Capítulo 15. CRC Press, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton, 2009). Um ligante de direcionamento pode ser qualquer composto que confira às composições da presente invenção uma função de reconhecimento de alvo e/ou de ligação alvo de uma maneira direta ou indireta. Em termos mais gerais, um alvo é uma estrutura biológica distinta à qual um ligante de direcionamento pode ligar-se especificamente através de interação molecular e em que tal ligação conduzirá em última instância à acumulação preferencial do ácido nucleico compreendido na composição em um tecido alvo e/ou a ou em uma célula alvo. Semelhante às cadeias de PEG, os ligantes de direcionamento podem ser acoplados, por exemplo, a grupos terminais (c), ou a um grupo amino das unidades de repetição de fórmulas (a1), (b1) ou (b3).

[0069] Além disso, os agentes endossomolíticos tais como os peptídeos endossomolíticos (Plank et al., 1998, Adv Drug Deliv Rev, 34, 2135) ou qualquer outro composto que seja adequado para aumentar a liberação endossomal de um ácido nucleico endocitado são componentes úteis das composições da presente invenção. De um modo semelhante, os peptídeos de penetração celular (em outro contexto também conhecido como domínios de transdução de proteínas) (Lindgren et al., 2000, Trends Pharmacol Sci, 21, 99103) podem ser componentes úteis da composição da presente invenção para mediar a liberação intracelular de um ácido nucleico. O chamado peptídeo TAT cai dentro desta classe e também tem função de localização nuclear (Rudolph et al., 2003, J Biol Chem, 278, 11411-11418).

[0070] As nanopartículas magnéticas que podem ser incluídas nas composições da presente invenção são úteis para o direcionamento físico da liberação por força magnética e para um aumento drástico da eficiência da transferência de ácido nucleico, um mecanismo também conhecido como Magnetofecção (EP1297169, Plank et al., 2011, Adv Drug Deliv Rev, 63, 1300-1331). De modo semelhante, uma composição da presente invenção também pode ser uma microbolha não magnética ou magnética utilizada para o aumento físico e direcionamento da liberação de ácido nucleico através de ultrassons e opcionalmente aplicação de campo magnético (Holzbach et al., 2010, J Cell Mol Med, 14, 587-599, Vlaskou et al., 2010, Adv Funct Mater, 20, 3881-3894). Os pontos quânticos (Zintchenko et al., 2009, Mol Ther, 17, 1849-1856), marcadores radioativos e agentes de contraste para imagiologia médica podem ser utilizados vantajosamente para monitorar a liberação de ácido nucleico e para determinar a biodistribuição de composições para liberação de ácido nucleico. Resumindo, numerosos efetores para liberação de ácido nucleico foram descritos e podem ser componentes úteis em composições compreendendo ácido nucleico, em particular RNA, de preferência RNA de cadeia simples tal como mRNA e um copolímero de acordo com a invenção.

[0071] É bem conhecido pelos especialistas na técnica que existe um grande grau de flexibilidade em relação à quantidade de substância de cada componente compreendido na composição de acordo com a presente invenção. Por exemplo, os chamados poliplexos binários monomoleculares foram descritos para DNA plasmídico, onde a composição consiste em nanopartículas formadas por mistura do policátion e do DNA plasmídico que compreendem exatamente uma única molécula de DNA plasmídico e tantas moléculas de policátion que são necessárias para a neutralização de carga ou sobrecompensação de carga (positiva sobre negativa) (DeRouchey et al., 2006, J Phys Chem. 110 (10): 4548-54). Para PEI-DNA, complexos a razões N/P que são frequentemente utilizadas em transfecções, foi verificado por espectroscopia de correlação de fluorescência que eles contêm em média 3,5 (+/-1) moléculas de plasmídeo de DNA e 30 moléculas PEI enquanto que cerca de 86% das moléculas PEI utilizadas para preparar os complexos estavam numa forma livre (Clamme et al., 2003, Biophys J 84, 1960-1968). No outro extremo, foi verificado que os complexos agregados de PEI e DNA plasmídico, compreendendo supostamente um grande número (dezenas a centenas) das moléculas componentes, apresentaram melhor na transfecção do que pequenas nanopartículas de PEI-ADN discretas (Ogris et al., Gene Ther, 5, 1425-1433, Ogris et al., 2001, AAPS PharmSci, 3, E21). Assim, a composição de acordo com a presente invenção pode ser uma partícula, em particular uma nanopartícula compreendendo alguns ácidos nucleicos, em particular RNA, de preferência RNA de cadeia simples, tais como mRNA, moléculas, mas também podem ser um objeto macroscópico tal como um precipitado ou um pó seco compreendendo números enormes de ácido nucleico, em particular RNA, de preferência RNA de cadeia simples, tais como mRNA, moléculas. Resumindo, as composições da presente invenção são caracterizadas pelas relações de entrada dos seus componentes antes da automontagem. As razões típicas de entrada p/p de componentes individuais em relação ao ácido nucleico, em particular RNA, de preferência RNA de cadeia simples, tal como mRNA, componente estão entre 1 e 50. A razão N/P é uma medida adequada da razão de entrada para as composições binárias contendo o copolímero da invenção e o ácido nucleico, em particular RNA, de preferência RNA de cadeia simples, tal como mRNA, quando o copolímero é quimicamente bem definido. Como se referido acima, são preferidos valores para a razão N/P de 1 a 100, são mais preferidas razões de N/P de 3 a 60 e as mais preferidas são razões de N/P de 4 a 44.

[0072] Se a composição da presente invenção compreende outros componentes, uma atribuição de uma razão N/P pode ser ambígua. Neste caso, as razões de entrada adequadas são determinadas por experimento incluindo, mas não se limitando a ensaios de retardamento de gel, ensaios de extinção de fluorescência tais como o ensaio de deslocamento/extinção de brometo de etídio, por dimensionamento de partículas e medições de potencial zeta e por ensaios funcionais tais como ensaios de transfecção, aqui descritos. Em complexos ternários compreendendo um poliânion adicional ou polímeros de proteção, a razão de carga líquida (positiva sobre negativa) pode ser menor do que 1 e o potencial zeta pode ser neutro ou negativo.

[0073] A composição da invenção pode ser produzida como descrito abaixo. Tipicamente, o ácido nucleico, em particular RNA, preferencialmente RNA de cadeia simples, tal como mRNA com uma carga negativa e os copolímeros da presente invenção, de preferência em uma forma catiônica, podem automontar quando são colocados em contato especialmente em um solvente adequado. Após o processo de automontagem, a composição da presente invenção pode ser separada de quaisquer componentes não incorporados e na mesma etapa o meio de suspensão pode ser substituído por centrifugação ou por ultrafiltração ou cromatografia de exclusão de tamanho ou diálise ou quaisquer métodos relacionados. A estequiometria dos componentes da composição da presente invenção, purificada ou não purificada, pode ser determinada por uma variedade de métodos analíticos incluindo métodos espectroscópicos tais como espectrometria UV/VIS ou espectroscopia de correlação de fluorescência (DeRouchey et al., 2006, J Phys Chem B. 110 (10): 4548-54), por marcação por fluorescência ortogonal ou radioisótopo dos componentes individuais, por espectroscopia de RMN e IR ou análise cromatográfica e quantificação por desmontagem da composição. A desmontagem pode ser conseguida, por exemplo, pela adição de excesso de poliânion tal como heparina como aqui descrito ou sulfato de condroitina ou pela adição de dodecilsulfato de sódio.

[0074] A presente invenção também se refere a um método para produzir a composição da invenção. Os copolímeros de acordo com a presente invenção podem ser produzidos e purificados como aqui descrito. Os copolímeros podem ser armazenados em solução aquosa ou em forma seca, tal como um pó seco, caso em que podem ser redissolvidos em meio aquoso, de preferência água, antes de se produzir a composição. O pH da solução é ajustado a neutro ou ligeiramente ácido (até pH 4,5) com um ácido, preferencialmente com ácido clorídrico ou cítrico, se necessário. No caso de RNA, de preferência RNA de cadeia simples tal como mRNA, sendo o ácido nucleico compreendido na composição, é preferido que o pH seja ajustado para cerca de 4,5 a 5,5, de preferência para cerca de 4,9 a 5,1, mais preferencialmente para cerca de 5,0. Os ácidos nucleicos são produzidos e purificados de acordo com o estado da técnica bem conhecidos dos especialistas na matéria. O ácido nucleico é fornecido como solução em meio aquoso, de preferência água. Opcionalmente, o copolímero ou o RNA como ácido nucleico ou ambos estão quimicamente ligados a moléculas efetoras tais como ligantes de direcionamento, peptídeos de sinal, peptídeos de penetração celular, substâncias endossomolíticas ou polímeros de proteção. No entanto, dependendo da natureza química das moléculas efetoras, podem não necessitar de ser ligadas por ligação química, mas podem ser incorporadas na composição da presente invenção por automontagem com base na ligação não covalente, isto é, interação eletrostática, hidrofóbica ou de Van-der-Waals com qualquer dos outros componentes da composição. Para este fim, pode ser vantajoso ajustar a concentração iônica, o tipo de contra íon, o pH ou o teor de solvente orgânico das soluções componentes individuais.

[0075] Como uma alternativa ao processo de mistura acima descrito, o ácido nucleico, em particular RNA, de preferência RNA de cadeia simples, tal como mRNA, e componente de copolímero pode ser misturado com um dispositivo automatizado para micromistura tal como descrito por exemplo por Hirota et al. (Hirota et al., 1999, Biotechniques, 27, 286-290) ou Kasper et al. (Kasper et al., 2011, Eur J Pharm Biopharm, 77, 182-185) ou por focagem microfluídica tal como revista por Xuan et al. (Xuan et al., 2010, Microfluidics and Nanofluidics, 9, 1-16).

[0076] A composição da presente invenção compreendendo ácido nucleico, em particular RNA, de preferência RNA de cadeia simples, tal como mRNA, pode então ser preparada por automontagem ao misturar as soluções dos componentes. A automontagem pode ser conseguida por mistura manual utilizando pipetagem e agitação/agitação em vórtice ou utilizando um dispositivo automatizado para micromistura tal como descrito por exemplo por Hirota et al. (Hirota et al., 1999, Biotechniques, 27, 286-290) ou Kasper et al. (Kasper et al., 2011, Eur J Pharm Biopharm, 77, 182-185) ou por focagem microfluídica tal como revista por Xuan et al. (Xuan et al., 2010, Microfluidics and Nanofluidics, 9, 1-16). Se a composição da presente invenção compreende outros componentes além do ácido nucleico, em particular RNA, de preferência RNA de cadeia simples, tal como mRNA e o copolímero da presente invenção, pode ser necessário uma mistura sequencial. Neste caso, qualquer componente adicional pode ser adicionado após a automontagem do copolímero e o ácido nucleico, ou pode ser adicionado a qualquer um destes antes da mistura. A sequência mais adequada de etapas de mistura será dependente da natureza química de componentes adicionais. Por exemplo, se o componente adicional estiver carregado negativamente, pode ser mais adequado adicioná-lo ao componente de ácido nucleico antes da mistura com o copolímero ou a um complexo pré-formado do copolímero e do ácido nucleico, em que o copolímero da presente invenção está presente em excesso em termos da relação de cargas positivas sobre a soma das cargas negativas do ácido nucleico e do componente adicional aniônico. Vice-versa, se o componente adicional for catiônico, pode ser mais adequado adicioná-lo ao copolímero da invenção antes da mistura com o ácido nucleico. Ou pode ser utilizado em uma estequiometria para neutralizar parcialmente as cargas negativas do ácido nucleico seguido pela mistura com a solução do copolímero da presente invenção. No caso de ácido nucleico, em particular RNA, de preferência RNA de cadeia simples, tal como mRNA compreendendo complexos para magnetofecção, tem sido demonstrado que a agregação coloidal induzida por sal é um meio adequado para preparar composições compreendendo um ácido nucleico, um policátion ou um lipídeo catiônico e partículas magnéticas (EP1297169). No caso especial do ácido nucleico, em particular o RNA, de preferência o RNA de cadeia simples tal como o mRNA, o componente sendo um oligonucleotídeo catiônico, um poliânion pode ser utilizado para automontar o copolímero da presente invenção com o ácido nucleico. Neste caso, o copolímero da presente invenção é misturado com o oligonucleotídeo catiônico seguido de mistura com o poliânion. Será facilmente evidente para os especialistas na técnica que estão disponíveis numerosas opções de formulação para obter a composição da presente invenção. As concentrações dos componentes individuais são escolhidas de acordo com a utilização pretendida da composição da presente invenção. Os parâmetros relevantes são a concentração final do ácido nucleico, em particular o RNA, de preferência o RNA de cadeia simples tal como o componente de mRNA e a razão de componentes como descrito acima. Para o ácido nucleico, em particular o RNA, de preferência o RNA de cadeia simples, tal como o fornecimento de mRNA em cultura de células, as concentrações finais de ácido nucleico entre 1 e 100 μg/ml são geralmente preferidas. Para aplicações in vivo, as concentrações de ácido nucleico final exemplificativas úteis podem ser até 5 mg/ml.

[0077] A composição da presente invenção pode ser armazenada em suspensão aquosa ou pode ser seca. Assim, em uma forma de realização preferida, a composição da presente invenção é armazenada na forma seca, opcionalmente liofilizada (liofilizada). Em uma forma de realização mais preferida, o complexo ou composição seca ou liofilizada também compreende um lioprotetor. Os lioprotetores são moléculas que protegem o material (congelado). Tais moléculas são tipicamente compostos poli-hidroxílicos tais como açúcares (mono-, di- e polissacarídeos), poliálcoois e seus derivados. Trealose e sacarose são conhecidos protetores naturais para processos de secagem. A trealose é produzida por uma variedade de plantas, fungos e animais invertebrados que permanecem em estado de animação suspensa durante períodos de seca (também conhecido como anidrobiose). Açúcares, tais como trealose, lactose, rafinose, sacarose, manose, sorbitol, manitol, xilitol, polietileno glicol, dextrinas, ureia, maltodextrinas, frutanos, malto-ar mano-oligossacarídeos, cicloinulo-hexaose, hidroxietil amido, dextranos, inulina, polivinilpirrolidona ou aminoácidos tais como triptofano, glicina e fenilalanina são liso-protetores particularmente adequados no âmbito da presente invenção. Mais preferencialmente a trealose é utilizada neste contexto.

Aspectos farmacêuticos

[0078] Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se à utilização da composição da presente invenção ou do copolímero da presente invenção para a liberação de um ácido nucleico, em particular RNA, de preferência RNA de cadeia simples, tal como mRNA, em tecido ou em uma célula alvo. O termo "liberar um ácido nucleico, em particular RNA, de preferência RNA de cadeia simples, tal como mRNA, a uma célula"significa preferencialmente a transferência do ácido nucleico, em particular RNA, de preferência RNA de cadeia simples, tal como mRNA, para dentro da célula. O referido uso pode ser in vivo ou in vitro.

[0079] A presente invenção refere-se também a um método para liberar um ácido nucleico, em particular RNA, de preferência RNA de cadeia simples, tal como mRNA, a uma célula ou tecido alvo compreendendo a etapa de colocar uma composição de acordo com a invenção em contato com a célula alvo ou tecido. Um tal método pode ser realizado in vitro ou in vivo. A entrada em contato pode ser conseguida por meios e métodos conhecidos do especialista na técnica. Por exemplo, se o método for realizado in vitro, a entrada em contato pode ser conseguida cultivando as células na presença da composição no meio de cultura ou adicionando a composição às células. Se o método for realizado in vivo, a colocação em contato com células ou tecidos pode, por exemplo, ser conseguida pela administração da composição a um indivíduo por vias de administração conhecidas do especialista na matéria, em particular por qualquer via da administração que é usualmente empregada no campo da terapia genética. As formas possíveis de formular a composição e de administrá-la a um indivíduo são também descritas mais adiante.

[0080] O termo "in vivo" refere-se a qualquer aplicação que seja efetuada ao corpo de um organismo vivo em que o referido organismo é preferencialmente multicelular, mais preferencialmente um mamífero e mais preferencialmente um humano. O termo "in vitro" refere-se a qualquer aplicação que seja efetuada a partes do corpo de um organismo vivo isolado e fora do referido organismo, por exemplo, células, tecidos e órgãos, em que o referido organismo é preferencialmente multicelular, mais preferencialmente um mamífero e mais preferencialmente um humano.

[0081] A presente invenção refere-se também a uma composição farmacêutica compreendendo a composição de acordo com a invenção e opcionalmente um veículo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável. Neste contexto, deve ser entendido que a composição de acordo com a invenção tal como aqui definida pode ser/pode ser utilizada como uma composição farmacêutica por si própria. O termo "composição farmacêutica"refere-se a uma forma farmaceuticamente aceitável da composição da presente invenção que pode ser administrada a um indivíduo. A composição farmacêutica é adequada para utilização no tratamento do corpo humano ou animal por terapia (incluindo profilaxia).

[0082] O termo "forma farmaceuticamente aceitável"significa que a composição é formulada como uma composição farmacêutica, em que a referida composição farmacêutica pode compreender ainda um veículo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são bem conhecidos na técnica e incluem soluções salinas tamponadas com fosfato, água, emulsões, tais como emulsões de óleo/água, vários tipos de agentes umectantes, soluções estéreis, etc. As composições compreendendo tais veículos podem ser formuladas por métodos bem conhecidos convencionais. Estas composições farmacêuticas podem ser administradas ao indivíduo a uma dose adequada. O regime de dosagem será determinado pelo médico assistente e por fatores clínicos. Como é bem conhecido nas técnicas médicas, as dosagens para qualquer indivíduo dependem de muitos fatores, incluindo o tamanho do indivíduo, a área de superfície corporal, a idade, o composto particular a ser administrado, o sexo, o tempo e a via de administração, a saúde geral e outros administrados simultaneamente. Uma dose típica de substâncias ativas pode estar, por exemplo, na faixa de 1 ng a vários gramas. Aplicado a ácido nucleico, em particular RNA, preferencialmente RNA de cadeia simples tal como mRNA, terapia, a dosagem do ácido nucleico para expressão ou para inibição de expressão deve corresponder a este intervalo; no entanto, são previstas doses abaixo ou acima deste intervalo exemplar, especialmente considerando os fatores acima mencionados. Geralmente, o regime como uma administração regular da composição farmacêutica deve estar na faixa de 0,1 μg a 10 mg de unidades por quilograma de peso corporal por dia. Se o regime for uma infusão contínua, também deve estar na faixa de 1 μg a 10 mg unidades por quilograma de peso corporal, respectivamente. Os progressos podem ser acompanhados por avaliações periódicas. As dosagens irão variar, mas uma dosagem preferida para administração intravenosa de ácido nucleico, em particular RNA, de preferência RNA de cadeia simples, tal como mRNA, como constituintes da composição da presente invenção é de aproximadamente 106 a 1019cópias da molécula de ácido nucleico.

[0083] O termo "administrado" engloba qualquer método adequado para introduzir a composição no corpo de um indivíduo. A administração de composições adequadas pode ser realizada de diferentes maneiras, por exemplo, por administração intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, subcutânea, transdérmica, intratecal, intramuscular, tópica, intradérmica, intranasal, pulmonar por inalação ou intrabronquial ou oral ou retal. As composições da presente invenção podem, em particular, ser administradas como uma matriz ativada por um gene tal como descrita por Shea et al. (Shea et al., 1999, Nat Biotechnol, 17, 551-554) e na EP1198489.

[0084] Em princípio, as composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas localmente ou sistematicamente. A administração será preferencialmente parentérica, por exemplo, intravenosamente, embora outras formas de administração estejam dentro do âmbito da invenção. É também concebível a administração diretamente para o local alvo, por exemplo, por cateter para um local em um vaso sanguíneo. A administração pode, por exemplo, também ocorrer por injeção direta em um local alvo tal como um tumor. Também dentro do âmbito da invenção é a administração por aerossolização ou nebulização ou administração oral. As preparações para administração parentérica incluem soluções aquosas ou não aquosas estéreis, suspensões e emulsões. Exemplos de solventes não aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, fluorocarbonetos, óleos vegetais tais como azeite e ésteres orgânicos injetáveis tais como oleato de etila. Os veículos aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo soro fisiológico e meios tamponados. Os veículos parentéricos incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer de lactato ou óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem reabastecedores de fluidos e nutrientes, reabastecedores de eletrólitos (tais como os baseados em dextrose de Ringer) e semelhantes. Podem também estar presentes conservantes e outros aditivos tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes e semelhantes. Além disso, a composição farmacêutica pode compreender agentes adicionais tais como interleucinas ou interferons dependendo da utilização pretendida da composição farmacêutica.

[0085] Em uma outra forma de realização, a presente invenção refere- se a um método de tratamento que compreende administrar a composição farmacêutica da presente invenção a um paciente de modo a ter o ácido nucleico, em particular RNA, de preferência RNA de cadeia simples, tal como mRNA, contido na referida composição causa um efeito preventivo ou terapêutico. Particularmente, o termo "paciente" compreende animais e seres humanos.

[0086] Por administração da composição farmacêutica da presente invenção, as doenças podem ser tratadas ou prevenidas. O termo "doença"refere-se a qualquer estado patológico concebível que possa ser tratado, prevenido ou vacinado contra utilizando uma forma de realização da presente invenção. Em uma forma de realização preferida do referido método, as referidas doenças podem ser hereditárias, adquiridas, infecciosas ou não infecciosas, relacionadas com a idade, cardiovasculares, metabólicas, intestinais, neoplásicas (em particular câncer) ou genéticas. Uma doença pode basear-se, por exemplo, em irregularidades de processos fisiológicos, processos moleculares, reações bioquímicas dentro de um organismo que, por sua vez, pode se basear, por exemplo, no equipamento genético de um organismo, em fatores comportamentais, sociais ou ambientais como a exposição a produtos químicos ou radiações. Em uma forma de realização particularmente preferida, a composição farmacêutica da presente invenção é utilizada para tratamentos como descrito no pedido de patente WO2011/012316.

[0087] De acordo com o método de tratamento acima descrito, a presente invenção refere-se em outra forma de realização à utilização da composição da presente invenção para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença que pode ser tratada proporcionando o referido ácido nucleico, em particular RNA, preferencialmente RNA de cadeia simples tal como mRNA, contido na referida composição a um tecido ou órgão no interior do corpo de um paciente afetado por uma doença.

[0088] Para uma ilustração adicional, os aspectos preferidos da invenção são resumidos nos seguintes aspectos, que fazem parte da descrição geral precedente e as formas de realização preferidas aqui descritas também se aplicam. 1. Copolímero estatístico que compreende uma pluralidade de unidades de repetição (a) selecionadas independentemente a partir de unidades de repetição das fórmulas (a1) e (a2) seguintes:

uma pluralidade de unidades de independentemente entre unidades fórmulas (b1) a (b4):

em que a razão molar da soma das unidades de repetição (a) à soma das unidades de repetição (b) está dentro da faixa de 0,7/1,0 a 1,0/0,7, e em que um ou mais dos átomos de nitrogênio das unidades de repetição (a) e/ou (b) contidas no copolímero podem ser protonados para proporcionar um copolímero catiônico. 2. O copolímero do aspecto 1, que é um copolímero ramificado ou dendrítico compreendendo um ou mais tipos de unidades de repetição selecionadas de unidades de repetição (a2), (b2) e (b4). 3. O copolímero do aspecto 1, que é um copolímero linear compreendendo unidades de repetição (a1) e (b1). 4. O copolímero de qualquer dos aspectos 1 a 3, em que as unidades de repetição (a) e (b) representam 80% molar ou mais de todas as unidades de repetição no copolímero. 5. O copolímero de qualquer dos aspectos 1 a 3, em que todas as unidades de repetição no copolímero são unidades de repetição (a) ou (b). 6. Copolímero de qualquer um dos aspectos 1 a 3, em que unidades de repetição (a) selecionadas de (a1) e (a2) e unidades de repetição (b) selecionadas de (b1) e (b2) representam 80% molar ou mais de todas as unidades de repetição no copolímero. 7. O copolímero de qualquer dos aspectos 1 a 3, em que todas as unidades de repetição no copolímero são unidades de repetição (a) selecionadas de (a1) e (a2) ou unidades de repetição (b) selecionadas de (b1) e (b2 ). 8. O copolímero de qualquer dos aspectos 1 a 7, que é um copolímero aleatório. 9. O copolímero de qualquer dos aspectos 1 a 8, em que o número total de unidades de repetição (a) e unidades de repetição (b) é 20 ou mais, de preferência 50 ou mais e mais preferencialmente 100 ou mais. 10. O copolímero de qualquer dos aspectos 1 a 9, em que o número total de unidades de repetição (a) e unidades de repetição (b) é de 5000 ou menos, preferencialmente de 2500 ou menos, e mais preferencialmente de 1000 ou menos. 11. O copolímero de qualquer dos aspectos 1 a 10, que tem um peso molecular ponderal médio que varia de 2.000 a 250.000 Da, de preferência de 5.000 a 50.000 Da. 12. O copolímero de qualquer dos aspectos 1 a 11, em que os grupos terminais do copolímero compreendem um ou mais tipos de grupos (c) independentemente selecionados de entre os grupos das fórmulas (c1) a (c3):

13. O copolímero do aspecto 12, em que os grupos terminais do copolímero compreendem um ou mais tipos de grupos (c) independentemente selecionados do grupos das fórmulas (c1) e (c2). 14. O copolímero de qualquer dos aspectos 1 a 13, em que a razão molar das unidades de repetição (a) para as unidades de repetição (b) está dentro da faixa de 0,8/1,0 a 1,0/0,8. 15. O copolímero de qualquer dos aspectos 1 a 14, que é um copolímero catiônico. 16. O copolímero de qualquer dos aspectos 1 a 15, que pode ser obtido por polimerização de uma mistura de monômeros compreendendo aziridina, azetidina e opcionalmente pirrolidina. 17. Composição compreendendo um ácido nucleico e um copolímero de acordo com qualquer dos aspectos 1 a 16. 18. A composição do aspecto 17, em que o ácido nucleico é um RNA. 19. A composição do aspecto 17, em que o ácido nucleico é um RNA de cadeia simples. 20. A composição do aspecto 17, em que o ácido nucleico é mRNA, preferencialmente mRNA modificado. 21. A composição de qualquer dos aspectos 17 a 20, em que o copolímero é um copolímero catiônico, e em que o copolímero catiônico forma um complexo com o ácido nucleico. 22. A composição de qualquer dos aspectos 1 a 21, que está na forma liofilizada. 23. A composição do aspecto 22, que compreende ainda um lioprotetor. 24. A composição do aspecto 23, em que o lioprotetor é trealose. 25. A composição de qualquer dos aspectos 1 a 22, que é uma composição farmacêutica. 26. Uma composição farmacêutica compreendendo uma composição de qualquer um dos aspectos 17 a 25, e opcionalmente um veículo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável adicional. 27. Uso de um copolímero de qualquer dos aspectos 1 a 16 para liberar um ácido nucleico em uma célula. 28. Uso de uma composição ou uma composição farmacêutica de qualquer dos aspectos 17 a 26 para liberar um ácido nucleico em uma célula. 29. O uso do aspecto 27 ou 28, em que o ácido nucleico é um RNA. 30. O uso do aspecto 27 ou 28, em que o ácido nucleico é um RNA de cadeia simples. 31. O uso do aspecto 27 ou 28, em que o ácido nucleico é mRNA, de preferência mRNA modificado. 32. Processo para administrar um ácido nucleico a uma célula ou tecido alvo compreendendo a etapa de colocar uma composição ou composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos 17 a 26 em contato com a célula ou tecido alvo. 33. Um método para a produção do copolímero de qualquer um dos aspectos 1 a 15, compreendendo a etapa de polimerização de uma mistura de monômeros compreendendo aziridina, azetidina e opcionalmente pirrolidina.

Exemplos Exemplo 1 Materiais: Produção de mRNA do Luc quimicamente modificado

[0089] Para gerar o modelo para a transcrição in vitro (IVT), o plasmídeo pVAXA120-Luc foi linearizado por digestão de restrição com Notl. O modelo foi ainda purificado por Clorofórmio-Etanol-Precipitação. A qualidade do modelo foi determinada por eletroforese nativa em gel de agarose. A IVT foi realizada com uma mistura IVT padrão contendo trifosfatos de ribonucleotídeo e T7 RNA Polimerase. As modificações foram introduzidas utilizando 25% de 5-metil-citidina-5'-trifosfato e 25% de 2-tio- uridina-5'-trifosfato. O capeamento foi realizado utilizando a enzima de capeamento do vírus Vaccinia, rGTP e S-Adenosil metionina (SAM) como um doador de metila para adicionar uma estrutura de 7-metilguanilato cap-0 (m7GpppG) a extremidade 5' do mRNA. A purificação de mRNA foi realizada por precipitação com acetato de amônio. O RNA do Luc modificado foi ressuspenso em aqua ad injectabilia e o controle de qualidade foi realizado utilizando medição UV, eletroforese nativa em gel de agarose e transfecção em células NIH3T3.

Polímeros e pesos moleculares médios da unidade de repetição de polímero:

[0090] Os polímeros foram sintetizados a partir de aziridina (E), azetidina (P) ou uma mistura estequiométrica de aziridina (E) e azetidina (P) em razões molares de monômeros (E: P) de 1:0, 0,8:1 e 0:1. A aziridina e azetidina foram homopolimerizadas e copolimerizadas a partir de uma solução dos monômeros em água (concentração total de monômero (s): 50% p/p). As polimerizações foram realizadas a 130°C durante 20 - 70 h com ácido sulfúrico equivalente a 0,001. Os homopolímeros com uma razão E: P de 1: 0 e 0: 1, respectivamente, foram produzidos para fins comparativos.

[0091] Deste modo, copolímeros ramificados aleatórios de etilamina (-CH2-CH2-N<; "E", peso molecular 42 g/mol) e propilamina (-CH2-CH2- CH2-N<; "P"; peso molecular 56 g/mol) de unidades de repetição que refletem a estequiometria dos monômeros. O peso molecular médio das unidades polimerizadas foi calculado de acordo com a fórmula

[0092] Isto produz os seguintes resultados:

Soluções de estoque:

[0093] Solução de estoque de polímero: 0,5 mg/ml em aqua ad injectabilia

[0094] Solução de estoque de mRNA: 0,05 mg/ml de solução de reserva em aqua ad injectabilia

Razão N/P e preparação de complexos de mRNA com polímeros

[0095] A razão N/P reflete a razão molar de entrada de nitrogênio em uma determinada quantidade de polímero para fosfato em uma determinada quantidade de mRNA utilizada para preparar um complexo polímero-mRNA. O peso molecular médio de um monofosfato de ribonucleotídeo em um mRNA é de 346 g/mol.

[0096] Assim, o volume de solução de estoque de material polimérico (vpolímero) de uma dada concentração (cpolímero) requerido para um dado peso de mRNA (wRNA) em uma proporção N/P desejada é como se segue:

[0097] Por conseguinte, os volumes de soluções de estoque de polímero indicados na tabela abaixo foram diluídos com os volumes dados de aqua ad injectabilia para 25μl em poços individuais da fileira A e E, respectivamente, de uma placa de 96 poços.

[0098] Subsequentemente, foram adicionados 25 μl de solução de mRNA de estoque (correspondente a 1,25 μg de mRNA) às soluções de polímero para produzir a razão N/P desejada. Os poços nas filas B a D e F a H, respectivamente, foram fornecidos com 25 μl de aqua ad injectabilia cada. Após 30 min de incubação, 25 μl dos complexos na linha A ou E, respectivamente, foram transferidos para a linha B ou F, respectivamente, utilizando um pipetador multicanal e misturados. Subsequentemente, 25 μl foram transferidos da linha B para a linha C ou de F para G, respectivamente, misturados e de C para D ou G para H, respectivamente.

Células, transfecção e ensaio de luciferase

[0099] Células HEK293 (DSMZ ACC305, Lot21) foram cultivadas em DMEM, MEM, MEM, cada uma delas com FBS a 10% e P/S a 1%. Vinte e quatro horas antes da transfecção, as células foram semeadas a uma densidade de 5000 células em 100 μl do meio de cultura celular em uma placa de 96 poços.

[00100] Vinte μl de cada uma das séries de diluição do complexo polímero-mRNA foram transferidas para as células, correspondendo a 125/ 62,5 ng de mRNA por poço. Após 24h de incubação, os sobrenadantes da cultura de células foram removidos, as células foram lavadas com PBS e depois fornecidas com 100 μl de tampão de lise (Tris HCl 25 mM, TritonX 100 a 0,1%, pH 7,8).

[00101] Ensaio de luciferase: 80 μl do lisado foram introduzidos em um poço de uma placa branca de 96 poços e utilizados para a medição da atividade da luciferase em um Wallac Victor2 (Perkin Elmer). Para este efeito foram adicionados 100 μl de reagente de ensaio de luciferase (D-luciferina 0,5 mM, Coenzima A 0,3 mM, DTT 33 mM, ATP 0,5 mM, carbonato de magnésio 1 mM, sulfato de magnésio 2,7 mM, EDTA 0,1 mM, tricina 20 mM) e a quimioluminescência foi determinada. Os experimentos foram realizados em triplicata.

Resultados:

[00102] O experimento mostra que o mRNA do Luc quimicamente modificado complexado com copolímero (0,8/1) é mais eficientemente expresso após transfecção de células do que complexado com PEI ramificado (1/0) ou PPI (0/1) (Figura 1). Juntos, isto mostra que o objeto da presente invenção pode ser adequadamente tratado pelo método e pelas preparações farmacêuticas de acordo com a presente invenção.

Exemplo 2 Aplicação em aerossol in vivo de mRNA quimicamente modificado que codifica a luciferase do firefly (Luc) formulada com copolímeros para os pulmões de porco Produtos químicos

[00103] Ver exemplo 1 acima

Produção de mRNA do Luc quimicamente modificado

[00104] Ver exemplo 1 acima

Procedimento experimental

[00105] A sedação do suíno foi iniciada por pré-medicação com azaperona 2 mg/kg de peso corporal, cetamina 15 mg/kg de peso corporal, atropina 0,1 mg/kg de peso corporal e seguida pela inserção de uma linha intravenosa na veia auricular lateral. O porco foi anestesiado por injeção intravenosa de propofol 3-5 mg/kg de peso corporal, conforme necessário. A anestesia foi mantida com infusão intravenosa contínua de propofol a 1%, conforme necessário. Os parâmetros de ventilação foram combinados com dióxido de carbono exdentipiratório e ajustados se necessário. Os parâmetros anestésicos, respiratórios e cardiovasculares foram monitorados continuamente por oximetria de pulso, capnografia, sonda de temperatura retal e estado reflexo. O porco recebeu infusão de solução de eletrólito equilibrada a 10 ml/kg/h. A duração da anestesia foi de aproximadamente 80120 min. O porco foi morto com a injeção em bolo de 100 mg/kg de pentobarbital de peso corporal através da veia da orelha lateral após sedação após a aplicação do aerossol (nebulizador de malha Aeroneb). Os pulmões foram excisados e foram cortadas amostras de tecido com aproximadamente 1 cm de espessura foram coletadas de várias regiões de pulmão seguido por incubação em meio de cultura de células durante 24 horas a 37°C (5% de dióxido de carbono) em uma incubadora. Para a medição da atividade da luciferase, as amostras de tecido foram incubadas em um banho de meio compreendendo substrato de D-Luciferina em PBS (100 μg/ml) a 37°C durante 30 min e sujeitos a imagens de bioluminescência de luciferase ex vivo (IVIS 100, Xenogen, Alameda, EUA).

Preparação de copolímeros-poliplexos de mRNA

[00106] Os poliplexos foram formados utilizando uma bomba de seringa de dois canais (KDS-210-CE, KD Scientific). mRNA e copolímero (0,8/1, 1/0, 0/1 ou PEI 25 kDa) foram diluídos cada um em 12,0 ml de água destilada dupla resultando em uma concentração de 500 μg/ml de mRNA (concentração de copolímero ou PEI ramificado 25 kDa correspondente a uma razão N/P de 10). Ambas as soluções foram introduzidas em uma seringa separada de 20 ml utilizando a função de retirada da bomba de seringa a uma velocidade de 5 ml/min. Para misturar ambas as amostras as duas seringas foram ligadas através de uma tubagem (Safeflow Extension Set, B.Braun) foi para um peça t. A mistura foi realizada utilizando a função de infusão da bomba de seringa a uma velocidade de 40 ml/min. Os complexos foram incubados durante 30 min à temperatura ambiente antes da utilização. Foi observado no decurso da presente invenção que é especificamente vantajoso utilizar apenas água sem quaisquer tampões para complexação porque de outro modo as nanopartículas podem se agregar ou ser ineficazes em pulmões de ratinho (Rudolph et al., J. Mol. Ther. 2005, 12: 493-501).

Resultados:

[00107] O experimento mostra que mRNA do Luc quimicamente modificado complexado com copolímero (0,8/1) é mais eficientemente expresso nas células de pulmão de um porco após a administração de aerossol pulmonar do que complexado com PEI 25 kDa (1/0) ou PPI (0/1) (Figura 2). Juntos, isto mostra que o objeto da presente invenção pode ser adequadamente tratado pelo método e pelas preparações farmacêuticas de acordo com a presente invenção.

Exemplo 3 A aplicação in vivo de mRNA quimicamente modificado que codifica luciferase de firefly (Luc) formulado com copolímeros para os pulmões de ratinhos Produtos químicos

[00108] Ver exemplo 1 acima

Produção de mRNA do Luc quimicamente modificado

[00109] Ver exemplo 1 acima

Procedimento experimental

[00110] Poliplexos de um copolímero ramificado de 0,8/1 (unidades de etilamina/propilamina) ("br-Homo") e mRNA que codifica a luciferase de firefly de polietilenoimina ramificada ("br-PEI") e o mRNA foram preparados e aplicados como um líquido intratraqueal (n = 3), (25 μg de mRNA em um volume de 100 μl) ou como uma pulverização intratraqueal (12,5 μg de mRNA em um volume de 50 μl) utilizando um dispositivo Microsprayer de alta pressão (PennCentury, EUA). Todos os experimentos foram aprovados pelas autoridades locais (Regierung von Oberbayern) e foram conduzidos de acordo com a lei alemã de bem-estar animal. Ratinhos Balb/c fêmeas adultos foram anestesiados em uma câmara de inalação de isoflurano. Subsequentemente, as formulações de teste foram aplicadas diretamente na traqueia utilizando uma fonte de luz personalizada e uma pequena espátula de animal. Animais recuperaram da anestesia em poucos minutos. Após 6 horas os animais foram anestesiados através de injeção intraperitoneal de Fentanil/ Midazolam/Medetomidina (0,05/ 5,0/0,5 mg/kg de peso corporal). D- Luciferina (1,5 mg diluído em 50 μl de PBS) foi aplicado nas narinas dos animais anestesiados e assim inalou para as vias aéreas mais profundas. A imagem de bioluminescência foi realizada utilizando um sistema IVIS Lumina XR Imaging System (Perkin Elmer, EUA). Os resultados são mostrados na Figura 3.

Descrição das Figuras Figura 1

[00111] Os poliplexos foram formados utilizando copolímero 0,8/1, 1/0 ou 0/1 (unidades de etilamina/propilamina) e mRNA que codificam a luciferase de firefly a razões N/P indicadas. Após 24 h, células HEK293 transfectadas com diferentes quantidades de mRNA (125 ou 62,5 ng) foram lisadas e analisadas quanto à atividade de luciferase.

Figura 2

[00112] Os poliplexos foram formados utilizando copolímero 0,8/1, 1/0 ou 0/1 (unidades de etilamina/unidades de propilamina), PEI (e PEI ramificado comercialmente disponível, 25 kDa, Sigma-Aldrich) e mRNA que codificam a luciferase de firefly a razão N/P de 10. Vinte e quatro horas após a administração de aerossol em porcos, os pulmões foram excisados e a atividade de luciferase de firefly foi analisada por imagem bioluminescente em fatias de tecido pulmonar.

Figura 3

[00113] Os poliplexos de um copolímero ramificado de 0,8/1 (unidades de etilamina/propilamina) ("br-Homo") e mRNA que codificam a luciferase de firefly e de polietilenoimina ramificada ("br-PEI") e o mRNA foram aplicados a ratinhos como um líquido intratraqueal e como uma pulverização intratraqueal. A figura mostra os resultados de testes de imagem de bioluminescência utilizando um sistema de imagiologia IVIS Lumina XR (Perkin Elmer, EUA).

Claims

1. Composição, caracterizadapelo fato de que compreende um ácido nucleico e um copolímero estatístico compreendendo uma pluralidade de unidades de repetição (a) selecionadas independentemente a partir de unidades de repetição das fórmulas (a1) e (a2) seguintes:

uma pluralidade de unidades de repetição (b) independentemente selecionadas entre unidades de repetição das seguintes fórmulas (b1) a (b4):

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o copolímero é um copolímero ramificado ou dendrítico compreendendo um ou mais tipos de unidades de repetição selecionadas a partir de unidades de repetição (a2), (b2) e (b4).

3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o copolímero é um copolímero linear compreendendo unidades de repetição (a1) e (b1).

4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que as unidades de repetição (a) e (b) representam 80% molar ou mais de todas as unidades de repetição no copolímero.

5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que as unidades de repetição (a) selecionadas de entre (a1) e (a2) e unidades de repetição (b) selecionadas de (b1) e (b2) representam 80% molar ou mais de todas as unidades de repetição no copolímero.

6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que os grupos terminais do copolímero compreendem um ou mais tipos de grupos (c) independentemente selecionados de grupos das fórmulas (c1) a (c3):

7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a razão molar das unidades de repetição (a) para as unidades de repetição (b) do copolímero está dentro da faixa de 0,8/1,0 a 1,0/0,8.

8. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o copolímero é obtido por polimerização de uma mistura de monômeros compreendendo aziridina, azetidina e opcionalmente pirrolidina.

9. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico é mRNA.

10. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o copolímero é um copolímero catiônico, e em que o copolímero catiônico forma um complexo com o ácido nucleico.

11. Composição farmacêutica, caracterizadapelo fato de que compreende uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, e opcionalmente um veículo e/ou diluente farmaceuticamente aceitável adicional.

12. Uso de uma composição ou uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizadopelo fato de que é para liberar um ácido nucleico em uma célula IN VITRO.

13. Método para liberar um ácido nucleico em uma célula ou tecido alvo, caracterizadopelo fato de que compreende a etapa de colocar uma composição ou composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 em contato com a célula ou tecido alvo IN VITRO.

14. Método para a produção da composição como definida em qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizadopelo fato de que compreende a etapa de produzir o copolímero através da polimerização de uma mistura de monômeros compreendendo aziridina, azetidina e opcionalmente pirrolidina.