RU2820713C2 - Криопротективные агенты для содержащих частицы составов - Google Patents
Криопротективные агенты для содержащих частицы составов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2820713C2 RU2820713C2 RU2020137802A RU2020137802A RU2820713C2 RU 2820713 C2 RU2820713 C2 RU 2820713C2 RU 2020137802 A RU2020137802 A RU 2020137802A RU 2020137802 A RU2020137802 A RU 2020137802A RU 2820713 C2 RU2820713 C2 RU 2820713C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- composition
- mrna
- cationic
- nano
- nucleic acid
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 367
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 109
- 238000009472 formulation Methods 0.000 title abstract description 63
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 title abstract description 9
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims abstract description 109
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 89
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims abstract description 84
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims abstract description 78
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims abstract description 78
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 claims abstract description 67
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims abstract description 52
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 132
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 105
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 102
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 102
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 60
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N monopropylene glycol Natural products CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 claims description 36
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 claims description 35
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 31
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 25
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 23
- -1 cationic lipid Chemical class 0.000 claims description 18
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 17
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 claims description 16
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 claims description 14
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 7
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 claims description 7
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 claims description 5
- BMRWNKZVCUKKSR-UHFFFAOYSA-N butane-1,2-diol Chemical compound CCC(O)CO BMRWNKZVCUKKSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940071648 metered dose inhaler Drugs 0.000 claims description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 abstract description 29
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 26
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical group 0.000 abstract description 25
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 8
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 77
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 63
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 description 51
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 51
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 46
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 44
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 40
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 40
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 37
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 37
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 29
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 22
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 22
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 21
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 21
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 21
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical compound OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 18
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 18
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 18
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 17
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 17
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 17
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 17
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 17
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 16
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 14
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 14
- 229920001223 polyethylene glycol Chemical group 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 13
- 239000002202 Polyethylene glycol Chemical group 0.000 description 12
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 12
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 12
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 12
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 11
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 11
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 11
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 10
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 10
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 9
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 9
- 241000021375 Xenogenes Species 0.000 description 8
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 7
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 7
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 6
- 125000002740 cytidyl group Chemical group 0.000 description 6
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 6
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 6
- 125000002223 uridyl group Chemical group 0.000 description 6
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 5
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 5
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 5
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 5
- 230000036267 drug metabolism Effects 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- OZDGMOYKSFPLSE-UHFFFAOYSA-N 2-Methylaziridine Chemical compound CC1CN1 OZDGMOYKSFPLSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WRJMACJSFGGUGG-UHFFFAOYSA-N 8-chloro-6-(2-fluorophenyl)-1-methyl-4h-imidazo[1,5-a][1,4]benzodiazepine;n-phenyl-n-[1-(2-phenylethyl)piperidin-4-yl]propanamide Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NC=C2CN=C1C1=CC=CC=C1F.C=1C=CC=CC=1N(C(=O)CC)C(CC1)CCN1CCC1=CC=CC=C1 WRJMACJSFGGUGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 4
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108091046869 Telomeric non-coding RNA Proteins 0.000 description 4
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 4
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 4
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 4
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 4
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 4
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 4
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 4
- 229960004592 isopropanol Drugs 0.000 description 4
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- HRLIOXLXPOHXTA-UHFFFAOYSA-N medetomidine Chemical compound C=1C=CC(C)=C(C)C=1C(C)C1=CN=C[N]1 HRLIOXLXPOHXTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960002140 medetomidine Drugs 0.000 description 4
- 238000002663 nebulization Methods 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 4
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 3
- 102100033448 Lysosomal alpha-glucosidase Human genes 0.000 description 3
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000000021 endosomolytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002641 enzyme replacement therapy Methods 0.000 description 3
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000002479 lipoplex Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 3
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 3
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- NYEZZYQZRQDLEH-UHFFFAOYSA-N 2-ethyl-4,5-dihydro-1,3-oxazole Chemical compound CCC1=NCCO1 NYEZZYQZRQDLEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 2
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 2
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000015872 Gaucher disease Diseases 0.000 description 2
- 208000032007 Glycogen storage disease due to acid maltase deficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000032003 Glycogen storage disease due to glucose-6-phosphatase deficiency Diseases 0.000 description 2
- 206010018464 Glycogen storage disease type I Diseases 0.000 description 2
- 206010053185 Glycogen storage disease type II Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 108091007460 Long intergenic noncoding RNA Proteins 0.000 description 2
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Chemical compound C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000002678 Mucopolysaccharidoses Diseases 0.000 description 2
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 108091036407 Polyadenylation Proteins 0.000 description 2
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 2
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 2
- 108020003224 Small Nucleolar RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000042773 Small Nucleolar RNA Human genes 0.000 description 2
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000412 dendrimer Substances 0.000 description 2
- 229920000736 dendritic polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 201000004541 glycogen storage disease I Diseases 0.000 description 2
- 201000004502 glycogen storage disease II Diseases 0.000 description 2
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 208000016245 inborn errors of metabolism Diseases 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 208000015978 inherited metabolic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 229920005684 linear copolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- OIRDBPQYVWXNSJ-UHFFFAOYSA-N methyl trifluoromethansulfonate Chemical compound COS(=O)(=O)C(F)(F)F OIRDBPQYVWXNSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 206010028093 mucopolysaccharidosis Diseases 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 2
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 108091029842 small nuclear ribonucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 150000003408 sphingolipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 2
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- SAJGCUXAHBJVRH-MVNLRXSJSA-N (2r,3r,4r,5r)-hexane-1,2,3,4,5,6-hexol;hydrate Chemical compound O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO SAJGCUXAHBJVRH-MVNLRXSJSA-N 0.000 description 1
- LVNGJLRDBYCPGB-LDLOPFEMSA-N (R)-1,2-distearoylphosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[NH3+])OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC LVNGJLRDBYCPGB-LDLOPFEMSA-N 0.000 description 1
- KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 0.000 description 1
- SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 0.000 description 1
- NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TXLHNFOLHRXMAU-UHFFFAOYSA-N 2-(4-benzylphenoxy)-n,n-diethylethanamine;hydron;chloride Chemical compound Cl.C1=CC(OCCN(CC)CC)=CC=C1CC1=CC=CC=C1 TXLHNFOLHRXMAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MWCBGWLCXSUTHK-UHFFFAOYSA-N 2-methylbutane-1,4-diol Chemical compound OCC(C)CCO MWCBGWLCXSUTHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 206010061424 Anal cancer Diseases 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000007860 Anus Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010073360 Appendix cancer Diseases 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010005949 Bone cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000018084 Bone neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 208000031229 Cardiomyopathies Diseases 0.000 description 1
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 208000025678 Ciliary Motility disease Diseases 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 201000006306 Cor pulmonale Diseases 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- GZDFHIJNHHMENY-UHFFFAOYSA-N Dimethyl dicarbonate Chemical compound COC(=O)OC(=O)OC GZDFHIJNHHMENY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100408379 Drosophila melanogaster piwi gene Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000024720 Fabry Disease Diseases 0.000 description 1
- 201000006328 Fanconi syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000037251 Fanconi-Bickel syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010053249 Glycogen Storage Disease Type IV Diseases 0.000 description 1
- 102100029481 Glycogen phosphorylase, liver form Human genes 0.000 description 1
- 208000011123 Glycogen storage disease due to glycogen branching enzyme deficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000032002 Glycogen storage disease due to liver glycogen phosphorylase deficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000032000 Glycogen storage disease due to muscle glycogen phosphorylase deficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010018462 Glycogen storage disease type V Diseases 0.000 description 1
- 206010053240 Glycogen storage disease type VI Diseases 0.000 description 1
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical class OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- 101000700616 Homo sapiens Glycogen phosphorylase, liver form Proteins 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150008942 J gene Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 208000033868 Lysosomal disease Diseases 0.000 description 1
- 208000015439 Lysosomal storage disease Diseases 0.000 description 1
- 208000032271 Malignant tumor of penis Diseases 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 208000002471 Penile Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010034299 Penile cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000011252 Phenylketonuria Diseases 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 208000004186 Pulmonary Heart Disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000025747 Rheumatic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000024313 Testicular Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010057644 Testis cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010047741 Vulval cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000004354 Vulvar Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 1
- 208000006682 alpha 1-Antitrypsin Deficiency Diseases 0.000 description 1
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 201000011165 anus cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000021780 appendiceal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001818 capillary gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 229920003118 cationic copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 1
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000005056 compaction Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 239000002826 coolant Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 238000002059 diagnostic imaging Methods 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004049 epigenetic modification Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 208000024519 eye neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 208000007345 glycogen storage disease Diseases 0.000 description 1
- 201000004534 glycogen storage disease V Diseases 0.000 description 1
- 201000004510 glycogen storage disease VI Diseases 0.000 description 1
- 208000019061 glycogen storage disease due to GLUT2 deficiency Diseases 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 201000010235 heart cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024348 heart neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000002655 heart sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 description 1
- HIFJCPQKFCZDDL-ACWOEMLNSA-N iloprost Chemical compound C1\C(=C/CCCC(O)=O)C[C@@H]2[C@@H](/C=C/[C@@H](O)C(C)CC#CC)[C@H](O)C[C@@H]21 HIFJCPQKFCZDDL-ACWOEMLNSA-N 0.000 description 1
- 229960002240 iloprost Drugs 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 102000027411 intracellular receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008582 intracellular receptors Proteins 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 201000002273 mucopolysaccharidosis II Diseases 0.000 description 1
- 208000000690 mucopolysaccharidosis VI Diseases 0.000 description 1
- 208000022018 mucopolysaccharidosis type 2 Diseases 0.000 description 1
- 201000006938 muscular dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 201000008106 ocular cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000014207 opsonization Effects 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N pentaerythritol Chemical compound OCC(CO)(CO)CO WXZMFSXDPGVJKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920001987 poloxamine Polymers 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- 108010082974 polysarcosine Proteins 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 201000009266 primary ciliary dyskinesia Diseases 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 150000003815 prostacyclins Chemical class 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 229920005604 random copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000016515 regulation of signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 210000001324 spliceosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 201000003120 testicular cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000011285 therapeutic regimen Methods 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 229960005032 treprostinil Drugs 0.000 description 1
- PAJMKGZZBBTTOY-ZFORQUDYSA-N treprostinil Chemical compound C1=CC=C(OCC(O)=O)C2=C1C[C@@H]1[C@@H](CC[C@@H](O)CCCCC)[C@H](O)C[C@@H]1C2 PAJMKGZZBBTTOY-ZFORQUDYSA-N 0.000 description 1
- 230000037455 tumor specific immune response Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 206010046885 vaginal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000013139 vaginal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 201000005102 vulva cancer Diseases 0.000 description 1
- 229930195727 α-lactose Natural products 0.000 description 1
Abstract
В заявке описана композиция, включающая (i) состав терапевтически активного агента на основе нано- или микрочастиц, который суспендирован в жидкой фазе, и (ii) по меньшей мере одну криопротективную добавку, выбранную из С3-С5-алканов, замещенных одной или двумя гидроксильными группами, которая стабилизирует содержащий частицы состав. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 5 ил., 19 табл., 6 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к стабилизации композиций, которые включают содержащий частицы состав терапевтически активного агента, прежде всего состав, содержащий наночастицы или микрочастицы.
Содержащие наночастицы и микрочастицы составы известны благодаря своей способности доставлять в организм терапевтически активные агенты при введении в дыхательные пути или через них. Однако, многие активные агенты, переработанные в формы нано- или микрочастиц, отличаются сниженной стабильностью при комнатной температуре и даже в охлажденном состоянии (например, при 2-8°С). Замораживание состава могло бы значительно повысить долговременную стабильность и, следовательно, пригодность к применению терапевтически активных агентов в форме нано- или микрочастиц. Однако замораживание, как правило, приводит к процессам агрегации, которые сопровождаются потерей функциональности. Хотя добавление обычных криопротективных добавок предотвращает агрегацию частиц при замораживании (например, статьи: W. Abdelwahed и др., Adv. Drug Del. Rev. 58, 1688-1713 (2006); J.C. Kasper и др., J. Contr. Rel. 151, 246-255 (2011)), остаются проблемы, заключающиеся в том, что получаемый состав оказывается не функциональным после ингаляционного введения. Таким образом, с использованием стандартных криопротекторов, таких как сахара, нельзя обеспечить с высокой степенью надежности стабилизацию нано- и микрочастиц в процессе замораживания с сохранением их функциональности при введении в дыхательные пути или непосредственно через них.
В настоящем изобретении был выявлен класс добавок, который, как неожиданно было установлено, обеспечивает возможность замораживания включающих нано- или микрочастицы составов с сохранением их функциональности при введении в дыхательные пути или через них. Композиции, включающие содержащие частицы составы в смеси с такими криопротективными добавками, делают эти составы пригодными для хранения и/или транспортировки в твердом замороженном состоянии перед их применением.
Таким образом, в настоящем изобретении предлагается, согласно первому объекту изобретения, композиция, включающая:
(i) содержащий нано- или микрочастицы состав терапевтически активного агента, который суспендирован в жидкой фазе, и
(ii) по меньшей мере, одну криопротективную добавку, выбранную из С3-С5 алканов, замещенных одной или двумя гидроксильными группами.
Согласно второму объекту, в изобретении предлагается твердая композиция, включающая
(i) содержащий нано- или микрочастицы состав терапевтически активного агента, и
(ii) по меньшей мере, одну криопротективную добавку, выбранную из С3-С5 алканов, замещенных одной или двумя гидроксильными группами,
которую получают замораживанием композиции по первому объекту изобретения.
В дальнейшем композиция по первому объекту изобретения будет также упоминаться в данном контексте как «суспензионная композиция», и композиция по второму объекту изобретения как «твердая композиция».
Еще один объект настоящего изобретения относится к способу приготовления композиции по вышеописанному первому объекту изобретения, причем указанный способ включает:
а) получение содержащего нано- или микрочастицы состава терапевтически активного агента, который суспендирован в жидкой фазе, и
б) добавление по меньшей мере одной криопротективной добавки, выбранной из С3-С5 алканов, замещенных одной или двумя гидроксильными группами, в жидкую фазу, причем добавление криопротективной добавки в жидкую фазу можно осуществлять до, во время или после приготовления включающего нано- или микрочастицы состава, суспендированного в жидкой фазе.
Подобным образом, согласно еще одному объекту, изобретение относится к способу приготовления твердой композиции по вышеописанному второму объекту настоящего изобретения, причем указанный способ включает:
первую стадию приготовления композиции по вышеописанному первому объекту изобретения способом, включающим
а) получение содержащего нано- или микрочастицы состава терапевтически активного агента, который суспендирован в жидкой фазе, и
б) добавление по меньшей мере одной криопротективной добавки, выбранной из С3-С5 алканов, замещенных одной или двумя гидроксильными группами, в жидкую фазу, причем добавление криопротективной добавки в жидкую фазу можно проводить до, во время или после приготовления включающего нано- или микрочастицы состава, суспендированного в жидкой фазе,
и вторую стадию замораживания композиции, полученной на первой стадии.
Еще один объект настоящего изобретения относится к способу сохранения содержащего нано- или микрочастицы состава терапевтически активного агента, причем указанный способ включает приготовление суспензионной композиции по вышеописанному первому объекту изобретения и замораживание композиции. Еще один объект изобретения относится к применению соединения, выбранного из С3-С5 алканов, замещенных одной или двумя гидроксильными группами, в качестве криопротективной добавки в композицию, включающую содержащий нано- или микрочастицы состав терапевтически активного агента.
В еще одном объекте настоящего изобретения предлагается устройство для формирования аэрозоля из содержащей частицы композиции, суспендированной в жидкости, или для распыления такой композиции, причем устройство включает композицию по первому объекту настоящего изобретения. В еще одном объекте предлагается композиция по первому объекту настоящего изобретения для применения при лечении или профилактике заболевания, причем композиция предназначена для введения в дыхательные пути или через них.
В дальнейшем будет представлено подробное описание изобретения и его объектов, рассмотренных выше. В контексте настоящего изобретения следует принимать во внимание, что эти объекты тесно взаимосвязаны. Соответственно, представляется очевидным, что подробная информация, предоставленная с учетом признаков одного объекта изобретения, будет также применима к другим объектам, которые основаны на этом признаке, если не указано иное.
Терапевтически активный агент
Композиции по настоящему изобретению включают содержащий нано - или микрочастицы состав терапевтически активного агента. Известно множество терапевтически активных агентов, пригодных для использования в таких содержащих частицы составах. В контексте настоящего изобретения ссылка на терапевтическую активность включает как агенты, вводимые пациенту с целью лечения заболевания или расстройства, так и агенты, назначаемые для профилактики воздействия заболевания или расстройства на пациента.
В контексте настоящего изобретения предпочтительным для применения терапевтически активным агентом является нуклеиновая кислота. Среди нуклеиновых кислот, применяемых в качестве терапевтически активных агентов в содержащих нано- или микрочастицы составах, предпочтение отдается РНК, еще более предпочтительна однонитевая РНК, и наиболее предпочтительна иРНК, включая модифицированную иРНК.
Термин «нуклеиновая кислота» охватывает все формы как встречающихся в природе, так и синтезированных химическим и/или ферментативным путем нуклеиновых кислот, а также включает аналоги и производные нуклеиновых кислот, такие как, например, запертые нуклеиновые кислоты (LNA), пептидо-нуклеиновые кислоты (PNA), олигонуклеозидтиофосфаты и фосфотриэфиры, морфолиновые олигонуклеотиды, катионные олигонуклеотиды (см. US 6017700 A, WO/2007/069092), замещенные рибоолигонуклеотиды или фосфотиоаты. Кроме того, термин "нуклеиновая кислота" также относится к любому соединению, которое содержит нуклеотиды или их аналоги. В контексте настоящего изобретения не существует ограничений, касающихся нуклеотидной последовательности или размера молекулы нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота преимущественно определяется по биологическому эффекту, оказываемому на биологическую мишень, который достигается при применении композиции по настоящему изобретению. Например, в случае применения в генной или нуклеиново-кислотной терапии, нуклеиновую кислоту или нуклеотидную последовательность можно определять с помощью гена или генного фрагмента, который следует экспрессировать, или с использованием предполагаемой замены или изменения дефектного гена или любой целевой генной последовательности, или, используя генную последовательность-мишень, которую требуется ингибировать, подвергнуть нокдауну или супрессировать.
Термин «нуклеиновая кислота» охватывает олигонуклеотиды или полинуклеотиды, включая дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК). Что касается РНК, в принципе в контексте настоящего изобретения можно использовать любой тип РНК. В предпочтительном варианте РНК является однонитевой. Термин "однонитевая РНК" обозначает единую последовательную цепь рибонуклеотидов в отличие от молекул РНК, в которых две или более отдельных цепей формируют двухнитевую молекулу за счет гибридизации отдельных цепей. Термин "однонитевая РНК" не исключает, что однонитевые молекулы сами по себе формируют двухнитевые структуры, такие как петли, вторичные или третичные структуры.
Термин "РНК" охватывает как РНК, которые кодируют аминокислотную последовательность, так и РНК, которые не кодируют аминокислотную последовательность. Предполагается, что более 80% генома содержат функциональные элементы ДНК, которые не кодируют белки. Эти некодирующие последовательности включают регуляторные элементы ДНК (связывающие сайты для факторов транскрипции, регуляторов и корегуляторов и т.п.) и последовательности, которые кодируют транскрипты, которые никогда не транслируются в белки. Эти транскрипты, которые кодируются геномом и транскрибируются в РНК, но не транслируются в белки, называются некодирующими РНК (ncРНК). Таким образом, в одном варианте настоящего изобретения РНК представляет собой некодирующую РНК. Предпочтительно, некодирующая РНК является однонитевой молекулой. Исследования свидетельствуют о том, что ncРНК играют решающую роль в регуляции генов, поддержании целостности генома, в дифференциации и в развитии клеток, а при различных заболеваниях человека наблюдается их разрегуляция. Существуют разные типы ncРНК: короткие (20-50 нуклеотидов), средние (50-200 нуклеотидов) и длинные (>200 нуклеотидов) ncРНК. Короткие ncРНК включают микроРНК (miPHK), малые интерферирующие РНК (siPHK), взаимодействующие с piwi-белками РНК (piPHK) и РНК, инициирующие транскрипцию (tiPHK). Примерами средних ncРНК являются малые ядерные РНК (snPHK)), малые ядрышковые РНК (snoPHK), транспортные РНК (тРНК), РНК, ассоциированные с сайтом начала транскрипции (TSSaPHK), малые РНК, ассоциированные с промотором (PASR) и транскрипты - активирующие последовательности промотора (PROMPT). Группа длинных некодирующих РНК (lncPHK) включает длинные межгенные некодирующие РНК (lincРНК), антисмысловые lncPHK, интронные lncPHK, транскрибированные ультраконсервативные РНК (T-UCR) и другие (статья: Bhan A, Mandal SS, ChemMedChem. (2014, 26 марта), doi: 10.1002/cmdc.201300534). Из упомянутых выше некодирующих РНК только siPHK является двухнитевой. Таким образом, с учетом того, что в предпочтительном варианте настоящего изобретения некодирующая РНК является однонитевой, предпочтительно некодирующая РНК не является siPHK. В другом варианте изобретения РНК является кодирующей РНК, т.е. РНК, которая кодирует аминокислотную последовательность. Такие молекулы РНК также называются иРНК (информационная РНК) и являются однонитевыми молекулами РНК. Нуклеиновые кислоты можно получать химическими и ферментативными методами, известными специалисту в данной области, или с использованием методов рекомбинантных ДНК, или их можно выделить из природных источников, или комбинацией вышеуказанных методов. Олиго- или полинуклеотиды необязательно могут включать неприродные нуклеотиды и они могут являться одно-, двух- или трехнитевыми. Термин "нуклеиновая кислота" также относится к смысловым и антисмысловым олиго- или полинуклеотидам, а именно, к нуклеотидной последовательности, которая комплементарна определенной нуклеотидной последовательности в ДНК и/или в РНК.
Термин нуклеиновая кислота в контексте настоящего изобретения предпочтительно относится к РНК, еще более предпочтительно - к однонитевой РНК, и наиболее предпочтительно - к иРНК. Следует понимать, если не указано иное в зависимости от контекста, что термин иРНК в данном контексте охватывает модифицированную иРНК. Иными словами, нано- или микрочастицы, использованные в контексте настоящего изобретения, содержат нуклеиновую кислоту в качестве терапевтически активного агента, и нуклеиновой кислотой предпочтительно является РНК, более предпочтительно - однонитевая РНК, и наиболее предпочтительно - иРНК, которая может являться модифицированной иРНК.
Информационные РНК (иРНК) это сополимеры, которые состоят из нуклеозидфосфатных структурных звеньев, содержащих аденозин, цитидин, уридин и гуанозин в качестве нуклеотидов, которые в качестве промежуточных носителей переносят генетическую информацию от ДНК из клеточного ядра в цитоплазму, где эта информация транслируется в белки. Таким образом, они являются пригодными в качестве альтернативы для генной экспрессии.
В контексте настоящего изобретения термин иРНК означает любую полирибонуклеотидную молекулу, которая при попадании в клетку пригодна для экспрессии белка или его фрагмента, или транслируется в белок или его фрагмент. Термин «белок» в данном контексте охватывает любой тип аминокислотной последовательности, т.е. цепочки двух или более аминокислот, которые связаны друг с другом через пептидные связи и этот термин включает также пептиды и гибридные белки.
иРНК содержит рибонуклеотидную последовательность, кодирующую белок или его фрагмент, функция которого в клетке или в окружающей клетку среде необходима или оказывает положительный эффект, например, белок, недостаток или дефектная форма которого являются основной причиной расстройства или заболевания, и присутствие которого способно смягчить или предотвратить расстройство или заболевание, или белок, который может способствовать благоприятному процессу в организме, в клетке или в ее окружении. иРНК может содержать последовательность для нативного белка или его функционального варианта. Кроме того, рибонуклеотидная последовательность может кодировать белок, который действует как фактор, индуктор, регулятор, стимулятор или фермент, или как их функциональный фрагмент, в случаях, когда функция этого белка необходима для лечения расстройства, в частности, метаболического расстройства, или с целью инициирования процессов in vivo, таких как формирование новых кровеносных сосудов, тканей и т.д. В данном контексте функциональный вариант означает фрагмент, который внутри клетки способен проявлять функцию белка, действие которого необходимого в клетке, либо недостаток или поврежденная форма которого в клетке вызывают патогенный процесс. Помимо этого, иРНК может также включать дополнительные функциональные участки и/или 3' или 5' некодирующие участки. 3' и/или 5' участками могут являться участки, естественным образом фланкирующие кодирующую белок последовательность, или искусственные последовательности, которые способствуют стабилизации РНК. Специалисты в данной области техники могут определять пригодные для этих целей последовательности в каждом случае при проведении рутинных экспериментов.
В предпочтительном варианте настоящего изобретения иРНК содержит m7GpppG кэп, внутренний сайт входа рибосомы (IRES) и/или поли(А)-хвост в 3'-концевом участке, прежде всего, в целях улучшения трансляции. иРНК может включать дополнительные участки, промотирующие трансляцию.
В предпочтительном варианте настоящего изобретения в качестве иРНК используется иРНК, содержащая комбинацию модифицированных и немодифицированных нуклеотидов, предпочтительно иРНК, содержащая комбинацию модифицированных и немодифицированных нуклеотидов, как описано в международном патенте WO 2011/012316. Как сообщалось, описываемая в этом документе иРНК проявляет повышенную стабильность и пониженную иммуногенность. В предпочтительном варианте настоящего изобретения в такой модифицированной иРНК от 5 до 50% цитидиловых нуклеотидов и от 5 до 50% уридиловых нуклеотидов являются модифицированными. Аденозин- и гуанозинсодержащие нуклеотиды могут быть немодифицированными. Аденозиновые и гуанозиновые нуклеотиды могут быть ^модифицированными или частично модифицированными, и в предпочтительном варианте они представлены в немодифицированной форме. Предпочтительно от 10 до 35% цитидиловых и уридиловых нуклеотидов являются модифицированными, и прежде всего предпочтительно содержание модифицированных цитидиловых нуклеотидов находится в диапазоне от 7,5 до 25%, а содержание модифицированных уридиловых нуклеотидов находится в диапазоне от 7,5 до 25%. Было установлено, что в действительности относительно низкое содержание, например, только 10% каждого из модифицированных цитидилового и уридилового нуклеотидов, способно приводить к достижению требуемых свойств. Более предпочтительно, модифицированными цитидиловыми нуклеотидами являются 5-метилцитидиловые остатки, а модифицированными уридиловыми нуклеотидами являются 2-тиоуридиловые остатки. Наиболее предпочтительно, когда содержание модифицированных цитидиловых нуклеотидов и модифицированных уридиловых нуклеотидов составляет 25% соответственно.
В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения иРНК можно объединять с сайтами-мишенями связывания, последовательностями-мишенями и/или с сайтами связывания микроРНК в целях обеспечения активности требуемой иРНК только в релевантных клетках. В еще одном предпочтительном варианте настоящего изобретения РНК можно объединять с микроРНК или короткошпилечной РНК (shPHK) по ходу транскрипции 3' поли(А)-хвоста.
Более того, термин "нуклеиновая кислота(ы)" может относиться к ДНК или РНК или их гибридам, или к любой их модификации, известным специалистам в данной области техники (например, патент США US 8278036, международные патенты WO 2013/052523, WO 2011/012316, патенты США US 5525711, US 4711955, US 5792608 или европейский патент ЕР 302175, (статья Lorenz и др., Bioorg Med Chem Lett, 14, 4975-4977 (2004); статья Soutschek и др., Nature, 432, 173-178 (2004)) в качестве примеров модификаций). Такая молекула(ы) нуклеиновой кислоты может являться одно- или двухнитевой, линейной или кольцевой, природной или синтетической, и без каких-либо ограничений по размеру. Например, молекула(ы) нуклеиновой кислоты может(гут) являться молекулой геномной ДНК, кДНК, иРНК, антисмысловой РНК, рибозимом или малыми интерферирующими РНК (siPHK), микроРНК, антагомирами или короткошпилечной РНК (shPHK), тРНК или длинными двухнитевыми РНК или ДНК-конструкцией, кодирующей такие РНК, или химерапластами (статья Colestrauss и др., Science, 273, 1386-1389 (1996)), или аптамерами, сгруппированными в кластеры с регулярными интервалами короткими палиндромными повторами ("CRISPR" в случае РНК-управляемого сайт-специфического расщепления ДНК) (статья Cong и др., Science, 339, 819-823 (2013)), или РНК и ДНК. Вышеупомянутая(ые) молекула(ы) нуклеиновой кислоты может(гут) существовать в форме плазмид, космид, искусственных хромосом, вирусных ДНК или РНК, ДНК бактериофагов, кодирующих и некодирующих однонитевых (иРНК) или двухнитевых РНК и олигонуклеотида(ов), куда включена любая из известных в данной области техники модификаций в углеводной цепи сахарофосфатном остове и/или в основаниях, как описано выше, а также 3'- или 5'-модификации. В прежде всего предпочтительном варианте настоящего изобретения нуклеиновой кислотой является РНК, более предпочтительно иРНК или siPHK, и наиболее предпочтительно иРНК.
Нуклеиновая кислота(ы) может(гут) содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, который должен экспрессироваться в клетке-мишени. Для конструирования рекомбинантных молекул нуклеиновых кислот можно использовать способы, хорошо известные специалистам в данной области техники, см., например, технологию, описанную в книгах: Sambrook и др., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (2001) N.Y. и Ausubel и др., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989).
Как отмечено выше, нуклеиновая кислота может входить в состав содержащего нано- или микрочастицы состава в качестве предпочтительного терапевтически активного агента. Как правило, терапевтические эффекты могут достигаться в результате взаимодействия нуклеиновой кислоты с клеточными соединениями и органеллами. Такое взаимодействие само по себе может, например, активировать врожденную иммунную систему, как в случае конкретных CpG-олигонуклеотидов и последовательностей, разработанных с целью взаимодействия исключительно с toll-подобными и другими вне- или внутриклеточными рецепторами. Более того, захват клетками или введение нуклеиновых кислот в клетки может предназначаться для экспрессии нуклеотидных последовательностей, таких как гены в составе нуклеиновой кислоты, может предназначаться для регуляции с понижением активности, выключения или нокдауна экспрессии эндогенного гена как следствие присутствия внутри клетки введенной экзогенной нуклеиновой кислоты, или может предназначаться для модификации последовательностей эндогенных нуклеиновых кислот, такой как репарация, вырезание, вставка или замена выбранных оснований или целых участков последовательностей эндогенных нуклеиновых кислот, или может предназначаться для подавления практически любых клеточных процессов вследствие присутствия внутри клетки и взаимодействия с введенной экзогенной нуклеиновой кислотой. Сверхэкспрессия введенных экзогенных нуклеиновых кислот может предназначаться для компенсации или дополнения экспрессии эндогенных генов, прежде всего в случаях, когда эндогенный ген является дефектным или «молчащим», что приводит к отсутствию продукта или к получению непригодного, дефектного или не функционирующего продукта экспрессии генов, как в случае многих связанных с обменом веществ или наследственных заболеваний, таких как, например, кистозный фиброз, гемофилия или мышечная дистрофия, и это только некоторые примеры. Сверхэкспрессия введенных экзогенных нуклеиновых кислот также может предназначаться для того, чтобы продукт экспрессии взаимодействовал или подавлял любой эндогенный клеточный процесс, такой как регуляция генной экспрессии, трансдукция сигнала и другие клеточные процессы. Сверхэкспрессия введенных экзогенных нуклеиновых кислот также может предназначаться для индукции иммунного ответа в условиях конкретного организма, в котором находится трансфектированная или трансдуцированная клетка, или в котором она должна находиться. Примеры включают генетическую модификацию антиген-презентирующих клеток, таких как дендритные клетки, для презентации ими антигена с целью вакцинации. Другие примеры включают сверхэкспрессию цитокинов в опухолях с целью вызвать опухолеспецифичный иммунный ответ. Более того, сверхэкспрессия введенных экзогенных нуклеиновых кислот также может предназначаться для генерирования in vivo или ex vivo транзиентно генетически модифицированных клеток для клеточной терапии, таких как модифицированные Т-клетки, клетки-предшественники, стволовые или другие клетки для регенеративной медицины.
Регуляцию со снижением активности, сайленсинг или нокдаун экспрессию эндогенных генов в терапевтических целях можно осуществлять, например, с использованием РНК-интерференции (RNAi) с рибозимами, антисмысловыми олигонуклеотидами, тРНК, длинными двухнитевыми РНК, причем такое снижение регуляции может быть сиквенс-специфичным или неспецифичным и также может приводить к гибели клетки, как в случае введения длинных двухнитевых РНК внутрь клеток. Регуляция со снижением активности, сайленсинг или нокдаун экспрессия эндогенных или уже существующих генов могут оказывать благоприятное действие при лечении приобретенных, наследственных или спонтанно возникающих заболеваний, включая вирусные инфекции и рак. Можно также предусматривать введение нуклеиновых кислот в клетки в качестве превентивной меры в целях предотвращения, например, вирусной инфекции или новообразований. Регуляция со снижением активности, сайленсинг или нокдаун экспрессия эндогенных генов могут сказываться на транскрипционном уровне и на трансляционном уровне. Многочисленные механизмы, известные специалистам в данной области техники, включают, например, эпигенетические модификации, изменения в структуре хроматина, селективное связывание факторов транскрипции введенной нуклеиновой кислотой, гибридизацию введенной нуклеиновой кислоты с комплементарными последовательностями в геномной ДНК, иРНК или других видах РНК за счет спаривания оснований, включая нетипичные механизмы спаривания оснований, такие как образование тройной спирали. Аналогичным образом, репарацию генов, изменения основания или последовательности можно осуществлять на уровне генома и на уровне иРНК, включая пропуск экзона. Изменения основания или последовательности можно осуществлять, например, за счет РНК-управляемого сайт-специфического расщепления ДНК, с использованием механизмов вырезания и вставки за счет транс-сплайсинга, транс-сплайсинга рибозимов, химерапластов, опосредованного сплайсосомами транс-сплайсинга РНК, или с использованием интронов группы II или перенаправленных интронов, или с использованием вирус-опосредованного инсерционного мутагенеза, или при помощи направленной геномной вставки с использованием прокариотических, эукариотических или вирусных интегразных систем. Так как нуклеиновые кислоты являются носителями схем создания живых систем, и так как они напрямую и косвенно принимают участие во многих клеточных процессах, теоретически на любой клеточный процесс возможно повлиять введением нуклеиновых кислот в клетки извне. Примечательно, что это введение можно проводить напрямую in vivo и ex vivo в культурах клеток или органов с последующей трансплантацией модифицированных таким образом органов или клеток реципиенту. Содержащие нано- или микрочастицы составы в контексте настоящего изобретения в смеси с нуклеиновыми кислотами в качестве терапевтически активных агентов могут оказывать благоприятный эффект для всех вышеописанных целей.
Следует понимать, что содержащие нано- или микрочастицы составы для применения в контексте настоящего изобретения могут включать один терапевтически активный агент, но в альтернативном варианте могут включать комбинацию двух и более терапевтически активных агентов, например, в форме частиц, включающих два или более типов терапевтически активного агента в составе отдельных частиц, или в форме смеси частиц, которые различаются по типу содержащегося в них терапевтически активного агента.
Содержащий частицы состав
Композиции по настоящему изобретению (т.е. суспензионная композиция и твердая композиция) включают содержащий нано- или микрочастицы состав терапевтически активного агента. Специалисту представляется очевидным, что союз "или" используется в данном контексте в общем значении, если не указано иное. Таким образом, ссылка на содержащие нано- или микрочастицы составы охватывает составы, содержащие наночастицы, включающие терапевтически активный агент, составы, содержащие микрочастицы, включающие терапевтически активный агент, и составы, содержащие как наночастицы, так и микрочастицы, включающие терапевтически активный агент. Для удобства определение "содержащий нано- или микрочастицы состав" в обсуждении настоящего изобретения может сокращенно использоваться как "состав на основе частиц" или "содержащий частицы состав". Аналогично, нано- или микрочастицы можно обозначить как "частицы".
Частицы содержащего нано- или микрочастицы состава могут содержать единственный компонент в качестве терапевтически активного агента. Тем не менее, предпочтительно, чтобы частицы содержали терапевтически активный агент в комбинации с одним и более другими компонентами. Эти другие компоненты обычно являются фармацевтически приемлемыми компонентами, например, эксципиентами или добавками, которые являются фармацевтически приемлемыми.
Содержащий нано- или микрочастицы состав, являющийся компонентом композиции по настоящему изобретению, включает нано- или микрочастицы, содержащие терапевтически активный агент. Содержащий частицы состав может состоять из таких нано- или микрочастиц. В контексте настоящего изобретения термин "наночастицы" в основном относится к частицам с диаметром в нанометровом диапазоне, т.е. с диаметром от 1 нм или более и менее 1000 нм. Термин "микрочастицы" означает преимущественно частицы с диаметром в микрометровом диапазоне, т.е. с диаметром от 1000 нм или более и 100 мкм или менее.
Состав на основе нано- или микрочастиц в основном характеризуется средним диаметром частиц в диапазоне от 1 до 4000 нм, более предпочтительно от 2 до 2500 нм, и наиболее предпочтительно от 5 до 1000 нм.
Верхний предел величины диаметра отдельных частиц в содержащем нано- или микрочастицы составе предпочтительно должен составлять 20 мкм, более предпочтительно 10 мкм и наиболее предпочтительно 5 мкм. Таким образом, как будет понятно исходя из вышеизложенного, максимально предпочтительным содержащим частицы составом является состав, средний диаметр частиц которого находится в диапазоне от 5 до 1000 нм, а максимальный диаметр частиц составляет 5 мкм.
Диаметры частиц и средний диаметр частиц содержащего нано- или микрочастицы состава, согласно описанному в данном контексте, можно определить простым методом динамического светорассеяния (DLS). Как правило, диаметры и средний диаметр в данном контексте обозначены как гидродинамические диаметры частиц в суспендированном состоянии, определенные с помощью DLS. Поскольку при представлении результатов учитывалось воздействие температуры с использованием измерительного оборудования (например, Malvern ZetaSizer), было установлено, что измеряемые диаметры, в основном, не зависят от температуры. Тем не менее, измерения обычно проводили при комнатной температуре (25°С). В качестве суспензионной среды для проведения измерений методом DLS, например, при необходимости можно использовать воду или воду, содержащую криопротективную добавку. В случае замороженной твердой композиции диаметры частиц обычно определяют после размораживания композиции. В случаях, когда указан средний размер частиц или средний диаметр частиц, под средним значением, как правило, подразумевается z-среднее значение, если не указано иное.
В предпочтительном варианте содержащий нано- или микрочастицы состав характеризуется содержанием активного агента, выраженным как отношение массы терапевтически активного агента к общей массе частиц в содержащем частицы составе, в диапазоне от 0,1 до 95 мас. %, более предпочтительно от 0,5 до 90 мас. %, наиболее предпочтительно от 1 до 80 мас. %.
Помимо терапевтически активного агента, частицы содержащего нано- или микрочастицы состава для применения в контексте настоящего изобретения могут включать один или более дополнительных компонентов, например, эксципиенты или добавки, которые в большинстве случаев являются фармацевтически приемлемыми компонентами. Например, такие дополнительные компоненты могут способствовать переносу в специфические участки или ускорять дальнейшее потребление частиц в специфических участках после введения их пациенту, или они могут способствовать стабилизации содержащегося в составе частиц терапевтически активного агента.
Если терапевтически активным агентом является нуклеиновая кислота, пригодным компонентом для частиц, содержащих нуклеиновую кислоту, является вирусный вектор. Такие вирусные векторы известны в данной области техники, например, такие как рассмотренные в обзорной статье А.С. Silva и др., Current Drug Metabolism, 16, 3-16, (2015), и в литературе, обсуждаемой в данном контексте.
Помимо этого, в качестве эксципиентов для состава терапевтически активных агентов в содержащих частицы составах, включающих нано- или микрочастицы, рекомендованы различные полимеры. Такими полимерами также может являться дополнительный компонент в содержащих частицы составах при использовании в контексте настоящего изобретения. Например, пригодные полимерные эксципиенты включают полимеры, которые могут всасываться в организме после введения частиц пациенту, такие как полимеры, включая природные полимеры, полученные из аминокислот, углеводов или из молочной и/или гликолевой кислот.
Для содержащего частицы состава, включающего нуклеиновую кислоту, предпочтительно РНК, более предпочтительно однонитевую РНК, и наиболее предпочтительно иРНК, в качестве терапевтически активного агента, предпочтительным другим компонентом является катионный эксципиент. Такой катионный эксципиент и нуклеиновая кислота, которая содержит отрицательные заряды, могут образовывать комплекс друг с другом. Следует понимать, что ссылка на катионный эксципиент не исключает присутствия анионных групп или нейтральных участков в соответствующем эксципиенте, при условии, что катионные группы присутствуют в достаточно большом количестве, чтобы обеспечить суммарный катионный заряд эксципиента.
Таким образом, в соответствии с одним предпочтительным вариантом настоящего изобретения, содержащие нано- или микрочастицы составы, как указано в контексте настоящего изобретения, являются содержащими частицы составами, которые включают нуклеиновую кислоту, предпочтительно РНК, более предпочтительно однонитевую РНК, и наиболее предпочтительно иРНК, в качестве терапевтически активного агента в форме комплекса, образованного нуклеиновой кислотой и катионным олигомером или полимером, предпочтительно полимером в качестве катионного эксципиента. Такой комплекс в данной области техники называется также полиплексом.
Такие полиплексы и пригодные олигомеры или полимеры, способные их образовывать, известны в данной области техники. Приводимые в качестве пригодных примеров катионные олигомеры или полимеры, пригодные для образования полиплексов, которые можно также использовать в содержащих частицы составах, описываемых в контексте настоящего изобретения, обсуждены в статье А.С. Silva и др., Current Drug Metabolism, 16, 3-16 (2015), и в упомянутой в этом источнике литературе, в статье J.C. Kasper и др., J. Contr. Rel. 151, 246-255 (2011), в международном патенте WO 2014/207231 и в упомянутой в этом источнике литературе, а также в международном патенте WO 2016/097377 и в упомянутой в этом источнике литературе.
Пригодные катионные олигомеры или полимеры включают прежде всего катионные олигомеры или полимеры, состоящие из множества звеньев, в которых содержится аминогруппа. Аминогруппы могут присутствовать в протонированной форме и обеспечивать катионный заряд полимера.
В полиплексе, образованном нуклеиновой кислотой и катионным олигомером или полимером, включающем множество звеньев, содержащих аминогруппу, отношение числа атомов аминного азота в катионном олигомере или полимере к числу фосфатных групп в нуклеиновой кислоте - N/P - предпочтительно находится в диапазоне от 1 до 100, более предпочтительно от 2 до 80 и наиболее предпочтительно от 3 до 60.
Среди катионных олигомеров и полимеров, содержащих множество аминогрупп, предпочтительны олигомеры и полимеры, которые включают множество звеньев, независимо выбранных из следующих звеньев: (1), (2), (3) и (4):
где один или более атомов азота из повторяющихся звеньев (1), (2), (3) и/или (4) могут присутствовать в протонированной форме для обеспечения катионного заряда полимера.
Особенно предпочтительны в качестве катионных олигомеров или полимеров для получения содержащего частицы состава следующие четыре класса олигомеров или полимеров, включающих множество звеньев, содержащих аминогруппы.
В качестве первого предпочтительного класса указан полиэтиленимин («PEI»), включая разветвленный полиэтиленимин («brPEI»).
Вторым предпочтительным классом катионных олигомеров или полимеров являются олигомеры или полимеры, включающие множество групп следующей формулы (II) в качестве боковой цепи и/или в качестве концевой группы, как они раскрыты в международном патенте WO 2014/207231 (заявитель Ethris GmbH):
где индексы a, b, р, m, n и группы R2 - R6 определены, как указано далее, независимо для каждой группы в соответствие с формулой (II) во множестве таких групп:
а равен 1 и b равен целому числу от 2 до 4, или а равен целому числу от 2 до 4 и b равен 1,
р равен 1 или 2,
m равен 1 или 2; n равен 0 или 1 и m+n≥2, и
группы R2 - R5 независимо друг от друга выбраны из водорода, группы -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7 или -СН2-СН2-(С=O)-NH-R7 или -CH2-R7, где R7 выбран из С3-С18 алкилов или С3-С18 алкенилов, содержащих одну С-С двойную связь, защитной группы для аминогруппы, и полиэтиленгликолевой цепи,
R6 выбрана из водорода, группы -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH-OH, -СН2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 или -CH2-R7, где R7 выбрана из С3-С18 алкилов или С3-С18 алкенилов, содержащих одну С-С двойную связь, защитной группы для аминогруппы, -C(NH)-NH2, полиэтиленгликолевой цепи, и лиганда рецептора,
и где один или более атомов азота, указанных в формуле (II), могут присутствовать в протонированной форме для обеспечения получения катионной группы формулы (II).
Что касается других предпочтительных определений этих олигомеров или полимеров и групп, содержащихся в формуле (II), представленной выше, то соответствующее описание сущности изобретения в международном патенте WO 2014/207231 также применимо для изобретения, описываемого в данном контексте, если не указано иное. Информация в отношении композиций, которые содержат нуклеиновые кислоты и указанные олигомеры и полимеры в форме полиплексов, приведенная в международном патенте WO 2014/207231, также применима к содержащим частицы составам, упомянутым в данном контексте.
Третьим предпочтительным классом катионных олигомеров или полимеров являются олигомеры или полимеры, включающие определенное число групп следующей формулы (III) в качестве повторяющихся звеньев, как они раскрыты в международном патенте WO 2014/207231 (заявитель Ethris GmbH):
где индексы a, b, р, m, n и группы R2 - R5 определены, как указано далее, независимо для каждой группы в соответствие с формулой (III) во множестве таких групп:
а равен 1 и b равен целому числу от 2 до 4, или а равен целому числу от 2 до 4 и b равен 1,
р равен 1 или 2,
m равен 1 или 2, n равен 0 или 1 и m+n≥2, и
группы R2 - R5 независимо друг от друга выбраны из водорода, группы -CH2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7 или -СН2-СН2-(С=O)-NH-R7 или -CH2-R7, где R7 выбрана из С3-С18 алкилов или С3-С18 алкенилов, содержащих одну С-С двойную связь, защитной группы для аминогруппы, и полиэтиленгликолевой цепи,
и где один или более атомов азота, указанных в формуле (III), могут присутствовать в протонированной форме для образования катионной группы формулы (III).
Что касается других предпочтительных определений этих олигомеров или полимеров и групп, содержащихся в формуле (III), представленной выше, то соответствующее описание изобретения в международном патенте WO 2014/207231 также применимо для изобретения, описываемого в данном контексте, если не указано иное. Информация в отношении композиций, которые содержат нуклеиновые кислоты и указанные олигомеры и полимеры в форме полиплексов, приведенная в международном патенте WO 2014/207231, также применима к содержащим частицы составам, упомянутым в данном контексте.
Четвертый предпочтительный класс катионных олигомеров или полимеров представлен статистическим сополимером, как это раскрыто в международном патенте WO 2016/097377 (заявитель Ethris GmbH). Он включает множество повторяющихся звеньев (а), независимо выбранных из повторяющихся звеньев следующих формул (a1) и (а2):
и множество повторяющихся звеньев (b), независимо выбранных из повторяющихся звеньев следующих формул (b1) - (b4):
и молярное отношение суммы повторяющихся звеньев (а) к сумме повторяющихся звеньев (b) находится в диапазоне от 0,7:1,0 до 1,0:0,7, и один или более атомов азота в повторяющихся звеньях (а) и/или (b) в составе сополимера может присутствовать в протонированной форме для образования катионного сополимера.
Что касается других предпочтительных определений этого сополимера, то соответствующее описание сущности изобретения в международном патенте WO 2016/097377 также применимо к описанному в данном контексте изобретению, если не указано иное. Как отмечено выше в данном контексте, прежде всего предпочтительным сополимером является линейный сополимер, который включает повторяющиеся звенья (a1) и (b1), или который состоит из повторяющихся звеньев (a1) и (b1). Информация в отношении композиций, которые содержат нуклеиновые кислоты и указанные олигомеры и полимеры в форме полиплексов, приведенная в международном патенте WO 2016/097377, также применима к содержащим частицы составам, упомянутым в данном контексте.
В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения, содержащие нано- или микрочастицы составы в контексте настоящего изобретения являются содержащими частицы составами, которые содержат нуклеиновую кислоту, предпочтительно РНК, более предпочтительно однонитевую РНК, и наиболее предпочтительно иРНК, в качестве терапевтически активного агента в форме комплекса, образованного нуклеиновой кислотой и катионным липидом или катионным липидоидом в качестве катионного эксципиента. Если не указано иное, такие комплексы включают прежде всего липоплексы, липосомы и липидные наночастицы ("LNP"), содержащие комплекс нуклеиновой кислоты и катионного липида или катионного липидоида.
Пригодные катионные липиды или катионные липиды и липидоиды, которые также можно использовать для формирования комплекса с нуклеиновой кислотой в контексте настоящего изобретения, известны в данной области техники и описаны, например, в статье А.С. Silva и др., Current Drug Metabolism, 16, 3-16 (2015), и в представленной в ней литературе, в патенте США US 2017/0267631, в международных патентах WO 2016/081029, WO 2011/071860, WO 2016/118697, в патенте США US 8450298 В2, в международном патенте WO 2014/207231 и в статье Lee и др., Human Gene Therapy 7:1701-1717, September 10 (1996). Термин "липидоид" используется для обозначения веществ, не характеризующихся структурой липида, но проявляющих характеристики липида.
Предпочтительным классом липидоидов для применения в содержащих частицы составах, включающих нуклеиновую кислоту, предпочтительно РНК, более предпочтительно однонитевую РНК, и наиболее предпочтительно иРНК, в качестве терапевтического агента в форме комплекса с катионным липидоидом, например, липоплексом, липосомой или LNP, являются липидоиды, характеризующиеся структурой следующей формулы (IV), как раскрыто в международном патенте WO 2014/207231 (заявитель: Ethris GmbH):
где индексы a, b, р, m, n и группы R1 - R6 определены, как указано ниже:
а равен 1 и b равен целому числу от 2 до 4, или а равен целому числу от 2 до 4 и b равен 1,
р равен 1 или 2,
m равен 1 или 2, n равен 0 или 1 и m+n≥2, и группы
R1 - R6 независимо друг от друга выбраны из водорода, группы -СН2-CH(OH)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7
или -CH2-R7, где R7 выбран из С3-С18 алкилов или С3-С18 алкенилов, содержащих одну С-С двойную связь, защитной группы для аминогруппы, -C(NH)-NH2, полиэтиленгликолевой цепи, и лиганда рецептора, при условии, что по меньшей мере два остатка из групп R1 - R6 являются группой -СН2-СН(ОН)-R7, -CH(R7)-CH2-OH, -CH2-CH2-(C=O)-O-R7, -CH2-CH2-(C=O)-NH-R7 или -СН2-
R7, где R7 выбран из С3-С18 алкилов или С3-С18 алкенилов, содержащих одну С-С двойную связь; и где один или более атомов азота, указанных в формуле (IV), могут присутствовать в протонированной форме для образования катионного липидоида формулы (IV).
Что касается других предпочтительных определений этих липидоидов и групп, содержащихся в формуле (IV), представленной выше, то соответствующее описание сущности изобретения в международном патенте WO 2014/207231 также применимо для изобретения, описываемого в настоящем документе, если не указано иное. Информация в отношении композиций, которые содержат нуклеиновые кислоты и указанные липидоиды в форме комплексов, например, в форме липоплексов, липосом или LNP, приведенная в международном патенте WO 2014/207231, также применима к составам на основе частиц, упомянутым в данном контексте.
Еще одним предпочтительным типом липида для получения комплекса нуклеиновой кислоты с катионным липидом, который может содержаться в содержащих частицы составах, как изложено в данном контексте, является катионный липид Genzyme Lipid 67 (GL67). Это катионное производное липида широко используется для образования комплексов с участием нуклеиновых кислот, предпочтительно РНК, более предпочтительно однонитевой РНК, и наиболее предпочтительно иРНК.
Для содержащего частицы состава, включающего комплекс нуклеиновой кислоты, образованный с катионным липидом или с катионным липидоидом, содержащими аминогруппы, например, с липидоидом формулы (IV), отношение N/P в липоплексе составляет предпочтительно от 1 до 100, более предпочтительно от 2 до 80 и наиболее предпочтительно от 3 до 60.
В качестве необязательных компонентов, которые могут содержаться в содержащих частицы составах, включающих терапевтически активный агент в форме комплекса нуклеиновой кислоты с катионным липидом или катионным липидоидом, таким как липоплекс, LNP или липосома, можно упомянуть липиды-хелперы. Их можно выбрать, например, из одного или более стеролов (таких как холестерин или дексаметазон), нейтральных липидов (таких как DMPE, DOPE, DSPE, DPPE, DMPC, DOPC, DSPC или DPPC), сфинголипидов и пегилированных липидов (таких как DMG-PEG, DMPE-PEG или Ceramide-PEG). Такие липиды-хелперы можно применять в отдельности или в комбинации двух или более указанных типов. В качестве эксципиентов в содержащем частицы составе терапевтически активного агента, включающего катионные липиды или липидоиды, также можно использовать сополимеры полиэтиленгликоля (PEG) и алкиленовых звеньев.
Другие компоненты, пригодные для формирования таких комплексов, описаны в статье А.С. Silva и др., Current Drug Metabolism, 16, 3-16 (2015) и в обсуждаемой в ней литературе.
Содержащий частицы состав, включающий комплекс нуклеиновой кислоты с катионным липидом или катионным липидоидом, предпочтительно содержит нуклеиновую кислоту в таком количестве, чтобы отношение общей массы липидов и липидоидов (включая любые присутствующие липиды-хелперы) к массе нуклеиновой кислоты составляло величину в диапазоне от 0,1 до 200, более предпочтительно от 0,2 до 150, и наиболее предпочтительно от 0,5 до 100.
В свете вышеизложенного обсуждения представляется очевидным, что содержащий нано- или микрочастицы состав для применения в контексте настоящего изобретения также предпочтителен в случае, когда терапевтически активным агентом является иРНК, и иРНК включена в содержащий частицы состав в форме комплекса с катионным полимером или олигомером, или в форме комплекса с катионным липидом или катионным липидоидом. Вышеизложенные соображения остаются справедливыми в отношении пригодных и предпочтительных типов катионных эксципиентов. В отношении таких предпочтительных содержащих частицы составов частицы в содержащем частицы составе также характеризуются средним диаметром частиц в диапазоне от 1 до 4000 нм, более предпочтительно от 2 до 2500 нм и наиболее предпочтительно от 5 до 1000 нм. Верхний предел значений диаметра частиц состава на основе нано- или микрочастиц составляет предпочтительно 20 мкм, более предпочтительно 10 мкм, и наиболее предпочтительно 5 мкм.
Помимо терапевтически активного агента, содержащий частицы состав может включать в качестве необязательной добавки или необязательных добавок один или более компонентов, которые воздействуют на эффекторную функцию в процессе доставки терапевтического агента, и предпочтительно в процессе доставки нуклеиновой кислоты в качестве терапевтически активного агента к клетке и внутрь клетки. Такие компоненты могут включать, но не ограничиваясь только ими, полианионы, липиды, такие как описанные выше, дополнительные поликатионы, отличающиеся от обсуждаемых выше поликатионов, для образования полиплексов, таких как катионные пептиды, экранирующие олигомеры или полимеры, полоксамеры (также известные как плюроники), полоксамины, направленные лиганды, эндосомолитические агенты, проникающие в клетки, и сигнальные пептиды, магнитные и немагнитные наночастицы, ингибиторы рибонуклеаз, флуоресцентные красители, радиоизотопы или контрастные агенты для медицинской визуализации. Термин «эффекторная функция» включает любую функцию, которая способствует достижению требуемого биологического эффекта терапевтически активного агента в составе композиции, оказываемого вблизи или внутри биологической мишени или на окружение биологической мишени. Например, композиции для доставки нуклеиновой кислоты были разработаны с целью введения некодирующих нуклеиновых кислот или не являющихся нуклеиновыми кислотами полианионов в качестве «материалов-наполнителей» (см. статью Kichler и др., J Gene Med, 7, 1459-1467 (2005). Такие материалы-наполнители являются пригодными для снижения дозы нуклеиновой кислоты, требуемой для получения требуемого биологического эффекта с сохранением степени или уровня этого эффекта, полученного при более высокой дозе нуклеиновой кислоты при отсутствии такого материала-наполнителя. Полианионы, не являющиеся нуклеиновыми кислотами, также использовали с целью достижения пролонгированной генной экспрессии in vivo при сниженной токсичности (см. статью Uchida и др., J Control Release, 155, 296-302 (2011). Содержащие частицы составы в соответствии с настоящим изобретением, включающие комплекс нуклеиновой кислоты с катионным полимером или олигомером, могут также включать катионные, анионные или нейтральные липиды, такие как в случае липополиплексов (см. книгу Li и Huang в "Nonviral Vectors for Gene Therapy", Academic Press Chapter, 13, 295-303 (1999)). Липополиплексы можно получить предпочтительно из полимеров, соответствующих формулам (II) или (III), как показано выше, в смеси с липидоидами, соответствующими формуле (IV), как показано выше. Более того, содержащий частицы состав, использованный в настоящем изобретении, может включать олиго- или поликатионы, отличающиеся от обсуждаемых выше поликатионов, использованных для формирования полиплексов. Такие дополнительные поликатионы можно использовать для достижения требуемой степени уплотнения нуклеиновой кислоты, или в случае поликатионных пептидов могут осуществлять функцию клеточного сигнала внутриядерной локализации, наподобие описанной ранее (см. статью Ritter и др., J Mol Med, 81, 708-717 (2003)). В содержащие частицы составы, использованные в контексте настоящего изобретения можно также включать экранирующие полимеры, такие как полиэтиленгликоль (PEG), и они часто используются для стабилизации, например, комплексов нуклеиновых кислот с катионными эксципиентами для противодействия агрегации и/или нежелательным взаимодействиям в биологической среде (опсонизации), например, взаимодействиям с компонентами сыворотки, клетками крови или с внеклеточным матриксом. Экранирование также можно использовать для снижения токсичности композиций, содержащих нуклеиновую кислоту (см. статью Finsinger и др., Gene Ther, 7, 1183-1192 (2000)). Например, экранирующие полимеры, такие как PEG, можно ковалентно присоединять непосредственно к другим олигомерам или полимерам, или к липидам или липидоидам, которые могут присутствовать в содержащих частицы составах. Связывание можно осуществлять с основной цепью полимера, предпочтительно, если возможно, по концевым остаткам основной цепи полимера или дендримера. Однако связывание также можно осуществлять с использованием аминогрупп, содержащихся в соединениях, указанных в формулах (1) - (4), (II), (III), (IV) или в любой из формул (a1), (а2) или (b1) - (b4), приведенных выше.
Другие типичные экранирующие полимеры, описанные в литературе, которые могут являться пригодными компонентами содержащего частицы состава, включающего комплекс нуклеиновой кислоты с катионным эксципиентом, включают гидроксиэтилкрахмал (HES: см. статью Noga и др., Journal of Controlled Release, 159(1), 92-103 (2012)), PAS-полипептид (Pro, Ala, Ser полипептид: см. статью Schlapschy и др., Protein Eng Des Sel. 26(8), 489-501 (Aug; 2013)) или полисаркозин (Psar: см. статью Heller и др., Macromol Biosci, 14, 1380-1395 (2014)).
Направленные лиганды могут являться пригодными, например, в содержащих частицы составах для доставки нуклеиновой кислоты с целью избирательной и улучшенной трансфекции клеток-мишеней (см. главу Philipp и Wagner в книге "Gene and Cell Therapy - Therapeutic Mechanisms and Strategy", 3-e изд., Глава 15. CRC Press, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton (2009)). Направленным лигандом может являться соединение, придающее композициям по настоящему изобретению функцию распознавания клетки-мишени и/или связывания с клеткой-мишенью напрямую или косвенно. Типичные направленные лиганды представляют собой аналоги простациклина, раскрытые в международном патенте WO 2011/076391, такие как илопрост или трепростинил. Антитело также может выступать в качестве направленного лиганда. В качестве лигандов для нано- или микрочастиц можно упомянуть фолиевую кислоту и N-ацетилгалактозамин. В большинстве случаев мишень представляет собой отдельную биологическую структуру, с которой направленный лиганд может специфично связываться за счет молекулярного взаимодействия, и при этом такое связывание в конечном счете приведет к преимущественному накоплению терапевтически активного агента, такого как нуклеиновая кислота, включенного в композицию, в ткани-мишени и/или вблизи нее или в клетке-мишени. Аналогично PEG (или HES и PSar) цепям, направленные лиганды можно присоединять, например, к концевым остаткам основной цепи полимера или дендримера. Однако связывание также можно осуществлять с группами формул (1) - (4), (II), (III), (IV) или любой из формул (a1), (а2) или (b1) - (b4), описанных выше.
Кроме того, эндосомолитические агенты, такие как эндосомолитические пептиды (см. статью Plank и др., Adv Drug Deliv Rev, 34, 21-35 (1998)) или любое другое соединение, предназначенное для усиления эндосомального высвобождения эндоцитозированной нуклеиновой кислоты, являются пригодными компонентами композиций по настоящему изобретению. Аналогичным образом, проникающие в клетку пептиды (в ином контексте также известные как домены белковой трансдукции) (см. статью Lindgren и др., Trends Pharmacol Sci, 21, 99-103 (2000)) могут являться пригодными компонентами композиции по настоящему изобретению в качестве медиаторов при внутриклеточной доставке нуклеиновой кислоты. Так называемый ТАТ-пептид подпадает в данную классификацию и также выполняет функцию по обеспечению внутриядерной локализации (см. статью Rudolph и др., J Biol Chem, 278, 11411-11418 9999 (2003).
Криопротективная добавка
В качестве другого компонента в дополнение к составу на основе нано- или микрочастиц, композиции по настоящему изобретению содержат криопротективную добавку, которая выбрана из С3-С5 алканов, замещенных одной или двумя гидроксильными группами. Специалисту в данной области техники представляется очевидным, что эти замещенные алканы могут представлять собой линейные или разветвленные алканы. Они содержат от 3 до 5 атомов углерода. В зависимости от числа гидроксильных заместителей их можно отнести к моноспиртам или диолам, либо к алканолам или алкандиолам.
Предпочтительно криопротективная добавка содержит, по меньшей мере, одну вторичную гидроксильную группу (например, одну вторичную и не содержит дополнительную гидроксильную группу, или одну вторичную и одну первичную гидроксильную группу, или две вторичные гидроксильные группы).
Более предпочтительно криопротективную добавку выбирают из 1,2-пропандиола, 2-пропанола, 1,2-бутандиола и 1,3-бутандиола. Наиболее предпочтительно криопротективная добавка является 1,2-пропандиолом.
Композиции
Как отмечалось выше, в настоящем изобретении в первом объекте предлагается суспензионная композиция, а во втором объекте - твердая композиция, каждая из которых содержит содержащий нано- или микрочастицы состав терапевтически активного агента и криопротективную добавку, которые более подробно обсуждались выше.
Поскольку композиции по настоящему изобретению содержат терапевтически активный агент и являются пригодными для введения терапевтически активного агента пациенту, их можно отнести к терапевтическим композициям или к фармацевтическим композициям.
Прежде всего суспензионная композиция по первому объекту настоящего изобретения включает:
(i) содержащий нано- или микрочастицы состав терапевтически активного агента, который суспендирован в жидкой фазе, и
(ii) по меньшей мере, одну криопротективную добавку, выбранную из С3-С5 алканов, замещенных одной или двумя гидроксильными группами.
Следует отметить, что информацию о пригодных и предпочтительных вариантах осуществления терапевтического агента, содержащего его частицы состава и криопротективной добавки следует далее применять в данном контексте.
Суспензионная композиция предпочтительно включает частицы содержащего частицы состава в количестве, обеспечивающем содержание терапевтически активного агента в содержащем частицы составе в концентрации от 0,01 до 50 мг/мл, более предпочтительно от 0,02 до 30 мг/мл, в расчете на общий объем композиции.
Криопротективная добавка предпочтительно содержится в суспензионной композиции в концентрации от 0,5 до 50 мас. %, более предпочтительно от 1 до 40 мас. %, наиболее предпочтительно от 1 до 30 мас. %, где процентное значение указывает на массу криопротективной добавки в г на 100 мл общего объема композиции. Обычно криопротективная добавка содержится, предпочтительно растворена, в жидкой фазе, в которой суспендирован содержащий частицы состав. Однако это также может отчасти относиться к частицам, суспендированным в жидкой фазе.
Жидкая фаза суспензионной композиции по первому объекту настоящего изобретения как правило содержит воду в качестве растворителя. Предпочтительно 50 об. % или более, более предпочтительно 70 об. % или более (в расчете на общий объем жидкой фазы при 20°С) обеспечивается водой. Более предпочтительно вода и криопротективная добавка являются единственными растворителями, содержащимися в жидкой фазе.
В качестве типичных дополнительных необязательных добавок жидкой фазы можно указать одну или более, выбранных из солей, Сахаров, органических растворителей и буферных веществ.
Используемый в данном контексте термин «суспендированный» означает, что содержащий нано- или микрочастицы состав терапевтически активного агента образует дисперсную твердую фазу в непрерывной жидкой фазе.
В общем случае суспензионная композиция предпочтительно представляет собой двухфазную суспензионную композицию с одной непрерывной жидкой фазой, включающей криопротективную добавку, необязательно в комбинации с другими добавками, растворенными в ней, и содержащий нано- или микрочастицы состав терапевтически активного агента, суспендированный в ней в виде дисперсной твердой фазы.
Твердая композиция по второму объекту изобретения включает:
(i) содержащий нано- или микрочастицы состав терапевтически активного агента, и
(ii) по меньшей мере, одну криопротективную добавку, выбранную из С3-С5 алканов, замещенных одной или двумя гидроксильными группами,
который получают при замораживании композиции по первому объекту изобретения.
Твердая композиция содержит те же компоненты, что и суспензионная композиция, которую можно заморозить для получения твердой композиции. Таким образом, информация, относящаяся к пригодным и предпочтительным вариантам осуществления терапевтического агента, его содержащего частицы состава, криопротективной добавки, жидкой фазы и ее компонентов, предусмотренных для суспензионной композиции, остается справедливой для твердой композиции. Однако, квалифицированному специалисту представляется очевидным, что твердая композиция и суспензионная композиция отличаются тем, что жидкая фаза суспензионной композиции находится в отвержденном состоянии в твердой композиции. А если так, то твердая композиция содержит дисперсию содержащего нано- или микрочастицы состава терапевтического агента в твердой непрерывной фазе замороженной жидкости. В соответствии с вышеизложенным, криопротективная добавка обычно содержится в непрерывной фазе, в которой диспергирован содержащий частицы состав.
Ввиду вышеизложенного становится более очевидным, что также предпочтительны композиции в виде суспензионной композиции или твердой композиции по настоящему изобретению, которые включают (i) содержащий нано- или микрочастицы состав, в котором терапевтически активным агентом является иРНК, и иРНК содержится в содержащем частицы составе в форме комплекса с катионным полимером или олигомером, или в форме комплекса с катионным липидом или катионным липидоидом, и (ii) 1,2-пропандиол в качестве криопротективной добавки. Вышеупомянутые соображения остаются справедливыми в отношении пригодных и предпочтительных типов катионного полимера или олигомера, а также в отношении предпочтительных типов катионных липидов и катионных липидоидов. Для этих предпочтительных композиций частицы в содержащем частицы составе также обычно характеризуются средним диаметром частиц в диапазоне от 1 до 4000 нм, более предпочтительно от 2 до 2500 нм и наиболее предпочтительно от 5 до 1000 нм. Верхний предел диаметра частиц в содержащем нано- или микрочастицы составе составляет предпочтительно 20 мкм, более предпочтительно 10 мкм и наиболее предпочтительно 5 мкм.
Фармацевтические характеристики
Суспензионная композиция по первому объекту настоящего изобретения является пригодной для введения субъекту содержащегося в ней терапевтически активного агента. Как объяснено выше, такая композиция характеризуется неожиданным преимуществом по сравнению с содержащими частицы композициями, включающими другие криопротекторы, заключающимся в том, что ее можно хранить в замороженном состоянии, при этом предотвращается агрегация частиц во время или после замораживания, и в то же время поддерживается их функциональность при введении в дыхательные пути или через них, прежде всего при ингаляционном введении или назальном способе введения. Следовательно, предпочтительным способом введения суспензионной композиции является введение в дыхательные пути или через них, прежде всего ингаляционное введение или назальное введение.
Однако квалифицированному специалисту представляется очевидным, что композиции по настоящему изобретению также можно вводить другими способами введения, которые известны в данной области техники для содержащих нано- или микрочастицы составов терапевтически активного агента, такими как внутривенное введение в виде суспензии, например, используя эффект, заключающийся в том, что агрегация частиц во время или после замораживания предотвращается криопротективным агентом. В связи с этим было установлено, что присутствие С3-С5 алкана, замещенного одной или двумя гидроксильными группами, может оказывать благоприятное действие на эффективность терапевтического агента, прежде всего если терапевтический агент представляет собой нуклеиновую кислоту, предпочтительно РНК, более предпочтительно однонитевую РНК и наиболее предпочтительно иРНК, если суспензионную композицию вводят альтернативными способами, такими как внутривенное введение.
Если терапевтически активный агент представляет собой нуклеиновую кислоту, предпочтительно РНК, более предпочтительно однонитевую РНК и наиболее предпочтительно иРНК, то нуклеиновую кислоту можно доставлять к клеткам-мишеням в дыхательные пути или через них. Термин «доставка в клетки-мишени» предпочтительно означает перенос РНК, предпочтительно однонитевой РНК, такой как иРНК, в клетку.
Композицию можно вводить субъекту в пригодной дозе. Схема дозировки определяется лечащим врачом и клиническими факторами. Как хорошо известно в области медицины, дозировки для любого субъекта зависят от многих факторов, включая размер субъекта, площадь поверхности тела, возраст, конкретное предназначенное для введения соединение, пол, время и способ введения, общее состояние здоровья и одновременное введение других препаратов. Типичная доза терапевтически активных веществ может, например, находиться в диапазоне от 1 нг до нескольких граммов. Применительно к предпочтительному случаю терапии с помощью иРНК, дозировки иРНК, обеспечивающие экспрессию или ингибирование экспрессии, должны соответствовать этому диапазону, однако предусмотрены дозы ниже или выше этого типичного диапазона, прежде всего с учетом вышеупомянутых факторов. Как правило, схема при регулярном введении фармацевтической композиции должна составлять величину в диапазоне от 0,01 мкг до 10 мг на килограмм массы тела в сутки. Соответственно, если схема введения предусматривает непрерывное вливание, доза также должна находиться в диапазоне от 1 мкг до 10 мг на килограмм массы тела. Ход лечения можно контролировать при периодической оценке. Дозировки можно варьировать, но предпочтительная дозировка для введения иРНК в качестве компонентов композиции по настоящему изобретению составляет приблизительно от 106 до 1019 копий молекулы иРНК.
Устройства для образования аэрозоля из содержащей частицы композиции, суспендированной в жидкости, или для распыления такой композиции, известны в данной области техники и коммерчески доступны. Их можно использовать для осуществления введения суспензионной композиции по первому объекту настоящего изобретения в дыхательные пути или через них, прежде всего для введения в легкие. Для введения через нос можно использовать, например, устройство для назального распыления или назальное вливание.
Таким образом, один объект настоящего изобретения относится к устройству для образования аэрозоля из содержащей частицы композиции, суспендированной в жидкости, или для распыления такой композиции, при этом устройство содержит суспензионную композицию по настоящему изобретению. Устройство предпочтительно представляет собой ингалятор, такой как ингалятор с отмеренной дозой, небулайзер или устройство для назального распыления.
Для композиций по настоящему изобретению, используемых в вышеупомянутых устройствах, также остается справедливой информация, представленная выше в отношении предпочтительных вариантов осуществления изобретения. Таким образом, например, предпочтительные суспензионные композиции, используемые в таких устройствах, включают (i) содержащий нано- или микрочастицы состав, в котором терапевтически активным агентом является иРНК, и эта иРНК содержится в содержащем частицы составе в форме комплекса с катионным полимером или олигомером, или в форме комплекса с катионным липидом или катионным липидоидом, и (ii) 1,2-пропандиол в качестве криопротективной добавки. Вышеупомянутые соображения остаются справедливыми в отношении пригодных и предпочтительных типов катионного полимера или олигомера, а также в отношении предпочтительных типов катионных липидов и катионных липидоидов. Для этих предпочтительных композиций частицы в содержащем частицы составе также обычно характеризуются средним диаметром в диапазоне от 1 до 4000 нм, более предпочтительно от 2 до 2500 нм и наиболее предпочтительно от 5 до 1000 нм. Верхний предел диаметра частиц в содержащем нано- или микрочастицы составе составляет предпочтительно 20 мкм, более предпочтительно 10 мкм и наиболее предпочтительно 5 мкм.
Как указано выше, суспензионные композиции по настоящему изобретению можно без затруднений вводить после приготовления, хранения в замороженном состоянии и восстановления при оттаивании. Однако представляется очевидным, что суспензионные композиции по настоящему изобретению также можно вводить непосредственно после их приготовления, и было установлено, что присутствие С3-С5 алкана, замещенного одной или двумя гидроксильными группами, может оказывать благоприятное воздействие на эффективность терапевтического средства, прежде всего если терапевтический агент представляет собой нуклеиновую кислоту, предпочтительно РНК, более предпочтительно однонитевую РНК и наиболее предпочтительно иРНК, даже в составе свежеприготовленной композиции.
Таким образом, в настоящем изобретении также предлагается суспензионная композиция по настоящему изобретению для применения при лечении или профилактике заболевания, предпочтительно при введении композиции в дыхательные пути или через них. Более предпочтительно композицию вводят в легкие или через нос. Пациентами, которым можно вводить композицию, являются животные и люди.
В настоящем изобретении также предлагается способ лечения, включающий введение пациенту суспензионной композиции по настоящему изобретению, предпочтительно при введении в дыхательные пути или через них, более предпочтительно в легкие или в нос для проявления профилактического или терапевтического эффекта терапевтически активным агентом, содержащимся в указанной композиции. В этом контексте термин «пациент» также включает животных и людей.
Для композиций по настоящему изобретению, предназначенных для лечения или профилактики заболевания, также остается справедливой информация, представленная выше в отношении предпочтительных вариантов осуществления изобретения. Таким образом, например, предпочтительные суспензионные композиции для применения при лечении или профилактике заболевания, включают (i) состав на основе нано- или микрочастиц, в котором терапевтически активным агентом является иРНК, и иРНК содержится в содержащем частицы составе в форме комплекса с катионным полимером или олигомером, или в форме комплекса с катионным липидом или катионным липидоидом, и (ii) 1,2-пропандиол в качестве криопротективной добавки. Вышеупомянутые соображения остаются справедливыми в отношении пригодных и предпочтительных типов катионного полимера или олигомера, а также в отношении предпочтительных типов катионных липидов и катионных липидоидов. Для этих предпочтительных композиций частицы в содержащем частицы составе также обычно характеризуются средним диаметром в диапазоне от 1 до 4000 нм, более предпочтительно от 2 до 2500 нм и наиболее предпочтительно от 5 до 1000 нм. Верхний предел диаметра частиц в содержащем нано- или микрочастицы составе составляет предпочтительно 20 мкм, более предпочтительно 10 мкм и наиболее предпочтительно 5 мкм.
Как указано выше, введение можно осуществлять непосредственно после приготовления композиции, однако действие криопротективной добавки четко выражено, если введение осуществляют после замораживания суспензионной композиции и ее размораживания по меньшей мере один раз.
С помощью введения суспензионной композиции по настоящему изобретению можно осуществлять лечение или профилактику заболевания. Термин «заболевание» относится к любому предполагаемому патологическому состоянию, которое можно лечить, предотвращать или от которого можно вакцинировать, используя композицию по настоящему изобретению. Указанные заболевания могут, например, представлять собой наследственные, приобретенные, инфекционные или неинфекционные, возрастные, сердечнососудистые, метаболические, кишечные, опухолевые (прежде всего раковые) или генетические заболевания. В основе заболевания могут лежать, например, нарушения физиологических процессов, молекулярных процессов, биохимических реакций в организме, в основе которых, в свою очередь, могут лежать, например, генетический аппарат организма, поведенческие, социальные или экологические факторы, такие как воздействие химикатов или радиации. Суспензионная композиция по настоящему изобретению прежде всего пригодна для применения при лечении или профилактике заболеваний легких.
Поскольку в соответствии с описанным выше предпочтительным вариантом осуществления изобретения терапевтически активным агентом является РНК, более предпочтительно однонитевая РНК и наиболее предпочтительно иРНК, суспензионную композицию по настоящему изобретению можно использовать в терапии на основе РНК. Молекула РНК, предпочтительно молекула иРНК, содержит последовательность, кодирующую белок, и, соответственно, ее можно использовать в терапии на основе РНК, где РНК, предпочтительно иРНК, кодирует терапевтически или фармацевтически активный полипептид или белок, оказывающий терапевтическое или профилактическое действие. Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления изобретения суспензионную композицию по настоящему изобретению можно использовать в терапии на основе РНК для лечения или профилактики заболевания, как указано в следующей таблице. Соответственно, терапевтические подходы на основе РНК по настоящему изобретению можно использовать для лечения или профилактики заболеваний, как описано в следующей таблице.
Таким образом, суспензионную композицию по настоящему изобретению можно использовать в терапии на основе РНК в случаях, когда дефекты генов, описанные в следующей таблице, приводят к заболеванию, которое затем можно лечить или предотвращать с помощью заместительной транскриптной терапии/заместительной ферментной терапии с помощью молекул РНК, предпочтительно молекул иРНК по настоящему изобретению, где молекула РНК кодирует неповрежденную форму белка или его функционального фрагмента, замещая обнаруженный дефектный ген.
В других вариантах осуществления изобретения суспензионную композицию по настоящему изобретению можно использовать в терапии на основе РНК по настоящему изобретению, где РНК, предпочтительно иРНК, кодирует терапевтически или фармацевтически активный полипептид, белок или пептид, оказывающие терапевтический или профилактический эффект, при котором упомянутые полипептид, белок или пептид выбраны из группы, кодируемой генами, как показано в следующей таблице.
Суспензионная композиция по настоящему изобретению прежде всего является пригодной для применения в терапии на основе РНК при лечении или профилактике заболеваний легких. В качестве типичных заболеваний можно упомянуть недостаточность альфа-1-антитрипсина, астму, кистозный фиброз, дисфункцию метаболизма сурфактанта или первичную цилиарную дискинезию, как указано в следующей таблице.
В других типичных вариантах осуществления изобретения суспензионную композицию по настоящему изобретению можно использовать в терапии на основе РНК при лечении или профилактике лизосомальных заболеваний, таких как болезнь Гоше, болезнь Фабри, мукополисахаридоз (MPS) I, мукополисахаридоз II (синдром Гюнтера), мукополисахаридоз VI и болезни накопления гликогена, такие как, например, болезнь накопления гликогена типа I (болезнь фон Гирке), типа II (болезнь Помпе), типа III (болезнь Кори), типа IV (болезнь Андерсена), типа V (болезнь Мак-Ардла), VI типа (болезнь Герса), типа VII (болезнь Таури), типа VIII, типа IX, типа X, типа XI (синдром Фанкони-Бикеля), типа XI или типа 0. Заместительная транскриптная терапия/заместительная ферментная терапия не оказывают благоприятного эффекта на генетический дефект, являющийся причиной заболевания, но увеличивают концентрацию фермента, недостаточность которого наблюдается у пациента. Например, при болезни Помпе благодаря заместительной транскриптной терапии/заместительной ферментной терапии восстанавливается концентрация недостаточного лизосомального фермента - кислой альфа-глюкозидазы (GAA).
В соответствии с дополнительными примерами, терапевтические схемы лечения на основе РНК по настоящему изобретению можно использовать для лечения рака, сердечно-сосудистого заболевания, вирусной инфекции, иммунной дисфункции, аутоиммунного заболевания, неврологического расстройства, наследственных метаболических нарушений или генетического нарушения, или любого заболевания, при котором белок или белковый фрагмент, продуцируемый в клетке, может оказать благоприятное влияние на пациента. Примеры онкологических заболеваний включают рак головы и шеи, рак молочной железы, рак почек, рак мочевого пузыря, рак легких, рак предстательной железы, рак костей, рак мозга, рак шейки матки, рак анального канала, рак ободочной кишки, колоректальный рак, рак аппендикса, рак глаза, рак желудка, лейкоз, лимфому, рак печени, рак кожи, рак яичников, рак полового члена, рак поджелудочной железы, рак яичек, рак щитовидной железы, рак влагалища, рак вульвы, рак эндометрия, рак сердца и саркому. Примеры сердечно-сосудистых заболеваний включают атеросклероз, ишемическую болезнь сердца, легочно-сердечную недостаточность и кардиомиопатию. Примеры иммунных дисфункций и аутоиммунных заболеваний включают, но не ограничиваясь только ими, ревматические заболевания, рассеянный склероз и астму. Примеры вирусных инфекций включают, но не ограничиваясь только ими, инфекции, вызываемые вирусом иммунодефицита человека, вирусом простого герпеса, вирусом папилломы человека, а также вирусами гепатита В и С. Примеры неврологических расстройств включают, но не ограничиваясь только ими, болезнь Паркинсона, рассеянный склероз и деменцию. Примеры наследственных метаболических расстройств включают, но не ограничиваясь только ими, болезнь Гоше и фенилкетонурию.
Способы получения
Другой объект настоящего изобретения относится к способу получения композиции согласно указанному выше первому объекту, причем способ включает
а) получение содержащего нано- или микрочастицы состава терапевтически активного агента, который суспендирован в жидкой фазе, и
б) добавление по меньшей мере одной криопротективной добавки, выбранной из С3-С5-алканов, замещенных одной или двумя гидроксильными группами, в жидкую фазу, где добавление криопротективной добавки в жидкую фазу можно осуществлять до, в ходе или после получения содержащего частицы состава, суспендированного в жидкой фазе.
Что касается получения содержащего нано- или микрочастицы состава терапевтически активного агента, то способы их получения известны в данной области техники.
Что касается способов получения содержащих частицы составов нуклеиновых кислот в качестве терапевтического агента, предпочтительно РНК, более предпочтительно однонитевой РНК, и наиболее предпочтительно иРНК, то можно снова сослаться на перечисленную выше литературу, такую как статья A.C. Silva и др., Current Drug Metabolism, 16, 3-16 (2015) и перечисленные в ней публикации, статья J.C. Kasper и др., J. Contr. Rel. 151, 246-255 (2011), заявка WO 2014/207231 и перечисленные в ней публикации, заявка WO 2016/097377 и перечисленные в ней публикации, заявки US 2017/0267631, WO 2016/081029, WO 2011/071860, WO 2016/118697, US 8450298 B2 и статья E.R. Lee и др., Human Gene Therapy 7:1701-1717, сентябрь 10, (1996).
Предпочтительные содержащие частицы составы, содержащие нуклеиновую кислоту, предпочтительно РНК, более предпочтительно однонитевую РНК и наиболее предпочтительно иРНК в качестве активного агента в форме комплекса с катионным полимером, олигомером, липидом или липидоидом, таким как полиплексы, липоплексы, липосомы или липидные наночастицы (LNP), можно сформировать простым способом с использованием самосборки отрицательно заряженной нуклеиновой кислоты с положительно заряженным олигомером, солимером, липидом или дипидоидом.
Самосборка может происходить при смешивании растворов компонентов. Самосборку можно осуществлять, например, при смешивании вручную с использованием пипетирования и встряхивания/перемешивания на мешалке Vortex или с использованием автоматического устройства для микросмешивания, такого как устройство, описанное, например, в статье (Hirota и др., Biotechniques, 27, 286-290 (1999)) или Kasper и др., Eur J Pharm Biopharm, 77, 182-185 (2011) или методом микрофлуидного фокусирования, как описано в обзоре (Xuan и др., Microfluidics and Nanofluidics, 9, 1-16 (2010)). Для включения других компонентов, кроме нуклеиновой кислоты и олигомера, полимера, липида или липидоида, необходимых для включения в содержащий частицы состав, можно использовать последовательное перемешивание. В этом случае любой другой компонент можно добавлять после самосборки олигомера, полимера, липида или липидоида и нуклеиновой кислоты, или его можно добавлять к любому из этих компонентов перед смешиванием.
Например, формирование полиплексов можно осуществлять при смешивании раствора, содержащего нуклеиновую кислоту в воде, и раствора, содержащего катионный полимер или олигомер в воде.
Для формирования липосом также доступны известные технологии. Они включают, например, регидратацию липидных или липидоидных компонентов, таких как липидные или липидоидные пленки, при необходимости с последующим применением методов гомогенизации, таких как, например, обработка ультразвуком или экструзия. Другие подходы представляют собой вливание липидного или липидоидного компонента, растворенного в органических растворителях, в воду или водный раствор.
В качестве типичного способа, который можно использовать для формирования липидных наночастиц или липоплексов, можно упомянуть метод замены растворителя.
Частицы на основе вирусного вектора можно получить с использованием известных биологических методов.
В качестве других примеров получения содержащего частицы состава частицы, включающие терапевтически активный агент, можно формировать при эмульгировании раствора, содержащего активный агент, необязательно в комбинации с формирующим матрицу агентом с последующим отверждением частиц. Отверждение можно осуществлять, например, при удалении растворителя из эмульгированной масляной фазы, в которой содержится формирующий матрицу материал, или при сшивке или полимеризации компонентов для формирования матрицы. Материалы и способы для формирования лизосомальных составов также известны в данной области техники.
Криопротективную добавку можно простым способом добавлять в жидкую фазу, в которой суспендирован содержащий нано- или микрочастицы состав, которая предназначена для получения суспензии. Другими словами, добавление криопротективной добавки в жидкую фазу можно осуществлять до, в ходе или после суспендирования содержащего частицы состава в жидкой фазе.
Твердую композицию согласно второму объекту по настоящему изобретению можно получить способом, включающим:
первую стадию получения композиции согласно указанному выше первому объекту способом, включающим
а) получение содержащего нано- или микрочастицы состава терапевтически активного агента, который суспендирован в жидкой фазе, и
б) добавление по меньшей мере одной криопротективной добавки, выбранной из С3-С5-алканов, замещенных одной или двумя гидроксильными группами, в жидкую фазу, где добавление криопротективной добавки в жидкую фазу можно осуществлять до, в ходе или после получения содержащего частицы состава, суспендированного в жидкой фазе,
и вторую стадию замораживания композиции, полученной на первой стадии.
Что касается первой стадии, то следует понимать, что предоставленная выше информация в отношении получения суспендированной композиции в равной степени относится к получению твердой композиции.
Стадию замораживания в качестве второй стадии обычно осуществляют при охлаждении суспендированной композиции до достаточно низкой температуры (например, -10°С или менее, предпочтительно -20°С или менее) в пригодном контейнере. В качестве охлаждающей среды можно использовать, например, охлажденный воздух или охлажденные жидкости.
Кроме того, как было указано выше, твердой композицией по второму объекту изобретения является композиция, которая позволяет хранить содержащий частицы состав терапевтически активного агента на основе нано- или микрочастиц. Соответственно следует понимать, что суспензионную композицию по первому объекту изобретения также можно получить из твердой композиции в соответствии со вторым объектом изобретения при размораживании твердой композиции.
Таким образом в дополнительном объекте настоящего изобретения предлагается также способ получения композиции согласно указанному выше первому объекту способом, причем указанный способ включает:
первую стадию получения композиции согласно указанному выше первому объекту способом, причем указанный способ включает
а) получение содержащего нано- или микрочастицы состава терапевтически активного агента, который суспендирован в жидкой фазе, и
б) добавление по меньшей мере одной криопротективной добавки, выбранной из С3-С5-алканов, замещенных одной или двумя гидроксильными группами, в жидкую фазу, где добавление криопротективной добавки в жидкую фазу можно осуществлять до, в ходе или после получения содержащего частицы состава, суспендированного в жидкой фазе,
вторую стадию замораживания композиции, полученной на первой стадии, и третью стадию размораживания замороженной композиции, полученной на второй стадии.
Способы и применение
Более того, в настоящем изобретении предлагается способ сохранения состава терапевтически активного агента, содержащего нано- или микрочастицы, причем указанный способ включает получение композиции по указанному выше первому объекту изобретения, то есть композиции, включающей
(i) состав терапевтически активного агента, содержащий нано- или микрочастицы, который суспендирован в жидкой фазе, и
ii) по меньшей мере одну криопротективную добавку, выбранную из С3-С5-алканов, замещенных одной или двумя гидроксильными группами,
и замораживание композиции.
Что касается указанного объекта изобретения, то следует понимать, что предоставленная выше информация также применяется к пригодным и предпочтительным вариантам терапевтического агента, его содержащего частицы состава, криопротективной добавки, жидкой фазы, способов, обеспечивающих получение композиции, и к стадии замораживания.
Специалистам в данной области техники представляется очевидным, что термин «сохранение» в данном контексте означает, что соответствующие терапевтические характеристики состава терапевтически активного агента на основе нано- или микрочастиц, в значительной степени остаются неизменными, предпочтительно полностью сохраняются, при его хранении. Способ сохранения содержащего частицы состава обычно дополнительно включает хранение замороженной композиции при условии ее сохранения в замороженном состоянии в течение требуемого периода времени, например, в течение нескольких часов, суток, недель, месяцев или даже лет.
В еще одном объекте настоящего изобретения предлагается применение соединения, выбранного из С3-С5-алканов, замещенных одной или двумя гидроксильными группами, в качестве криопротективной добавки для композиции, включающей состав терапевтически активного агента, содержащего нано- или микрочастицы.
Что касается указанного объекта изобретения, то следует понимать, что предоставленная выше информация также применяется к пригодным и предпочтительным вариантам терапевтического агента, его содержащего частицы состава и криопротективной добавки.
Следует также понимать, что применение криопротективной добавки включает комбинацию соединения, выбранного из С3-С5-алканов, замещенных одной или двумя гидроксильными группами, и содержащего частицы состава терапевтически активного агента, содержащего нано- или микрочастиц, в составе композиции. Композиция, в которой объединены два компонента, представляет собой композицию по первому объекту изобретения. Применение дополнительно включает замораживание композиции, и таким образом соединение, выбранное из С3-С5-алканов, замещенных одной или двумя гидроксильными группами, может действовать в качестве криопротектора, то есть оно может защищать частицы содержащей частицы композиции и может гарантировать, прежде всего, что в значительной степени, предпочтительно будет полностью поддерживаться их функциональность при введении в дыхательные пути или через них.
Краткое изложение важных объектов изобретения представлено в следующих пунктах. Следует понимать, что эти элементы составляют часть общего раскрытия настоящего изобретения, так что информация, представленная в предыдущей части описания, например, в отношении дополнительных предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения или необязательных признаков, также относится к следующим пунктам.
1. Композиция, включающая
(i) состав терапевтически активного агента на основе нано- или микрочастиц, который суспендирован в жидкой фазе, и
ii) по меньшей мере одну криопротективную добавку, выбранную из С3-С5-алканов, замещенных одной или двумя гидроксильными группами.
2. Композиция по п. 1, где терапевтически активный агент представляет собой нуклеиновую кислоту.
3. Композиция по п. 2, где нуклеиновой кислотой является РНК.
4. Композиция по п. 3, где РНК представляет собой иРНК.
5. Композиция по любому из пунктов 1-4, где состав на основе нано- или микрочастиц, характеризуется средним диаметром частиц в интервале от 1 до 4000 нм, более предпочтительно от 2 до 2500 нм и наиболее предпочтительно от 5 до 1000 нм.
6. Композиция по любому из пунктов 1-5, где состав на основе нано- или микрочастиц, характеризуется максимальным диаметром частиц 20 мкм, более предпочтительно 10 мкм и наиболее предпочтительно 5 мкм.
7. Композиция по любому из пунктов 1-6, где состав га основе нано- или микрочастиц, характеризуется активной нагрузкой, выраженной как масса терапевтически активного агента в расчете на общую массу частиц в содержащем частицы составе, в интервале от 0,1 до 95%, более предпочтительно от 0,5 до 90%, наиболее предпочтительно от 1 до 80%.
8. Композиция по любому из пунктов 1-7, где терапевтически активный агент представляет собой нуклеиновую кислоту, а частицы состава на основе нано- или микрочастиц, включают нуклеиновую кислоту и катионный эксципиент.
9. Композиция по п. 8, где частицы в содержащем частицы составе включают нуклеиновую кислоту в форме комплекса, сформированного из нуклеиновой кислоты и катионного олигомера или катионного полимера в качестве катионного эксципиента.
10. Композиция по п. 9, где комплекс сформирован из нуклеиновой кислоты и катионного олигомера или полимера, включающего множество звеньев, содержащих аминогруппу.
11. Композиция по п. 10, где отношение N/P числа атомов аминного азота N в катионном олигомере или полимере к числу фосфатных групп Р в нуклеиновой кислоте находится в интервале от 1 до 100, более предпочтительно от 2 до 80 и наиболее предпочтительно от 3 до 60.
12. Композиция по п. 10 или п. 11, где катионный полимер включает множество звеньев, независимо выбранных из следующих звеньев (1), (2), (3) и (4):
и где один или более атомов азота в повторяющихся звеньях (1), (2), (3) и/или (4) могут быть протонированными для придания катионного заряда полимеру.
13. Композиция по п. 8, где частицы в содержащем частицы составе включают нуклеиновую кислоту в форме комплекса, сформированного из нуклеиновой кислоты и катионного липида или катионного липидоида в качестве катионного эксципиента.
14. Композиция по п. 13, где частицы в содержащем частицы составе включают липоплексы, липосомы или липидные наночастицы.
15. Композиция по п. 13 или п. 14, где частицы в содержащем частицы составе дополнительно включают один или более вспомогательных липидов, выбранных из стеролов, нейтральных липидов, сфинголипидов и пегилированных липидов.
16. Композиция по любому из пунктов 13-15, где отношение общей массы липидов и липидоидов к массе нуклеиновой кислоты находится в интервале от 0,1 до 200, более предпочтительно от 0,2 до 150, наиболее предпочтительно от 0,5 до 100.
17. Композиция по любому из пунктов 1-16, где криопротективная добавка включает по меньшей мере вторичную гидроксильную группу.
18. Композиция по п. 17, где криопротективную добавку выбирают из 1,2-пропандиола, 2-пропанола, 1,2-бутандиола и 1,3-бутандиола.
19. Композиция по п. 17, где криопротективной добавкой является 1,2-пропандиол.
20. Композиция по любому из пунктов 1-19, где криопротективная добавка содержится в концентрации от 0,5 мас./об. % до 50 мас./об. %, более предпочтительно от 1 мас./об. % до 40 мас./об. % и наиболее предпочтительно от 1 мас./об. % до 30 мас./об. %, в расчете на объем жидкой фазы.
21. Композиция по любому из пунктов 1-20, которая включает частицы состава на основе нано- или микрочастиц, в количестве, обеспечивающем присутствие терапевтически активного агента, который содержится в содержащем частицы составе в концентрации от 0,01 до 50 мг/мл, более предпочтительно от 0,02 до 30 мг/мл, в расчете на общий объем композиции.
22. Композиция по любому из пунктов 1-21, в которой вода и криопротективная добавка являются единственными растворителями, содержащимися в жидкой фазе.
23. Твердая композиция, включающая
(i) состав терапевтически активного агента на основе нано- или микрочастиц, и
ii) по меньшей мере одну криопротективную добавку, выбранную из С3-С5-алканов, замещенных одной или двумя гидроксильными группами,
которую получают при замораживании композиции по любому из пунктов 1-22.
24. Способ получения композиции по любому из пунктов 1-22, причем указанный способ включает
а) получение состава терапевтически активного агента на основе нано- или микрочастиц, который суспендирован в жидкой фазе, и
б) добавление по меньшей мере одной криопротективной добавки, выбранной из С3-С5-алканов, замещенных одной или двумя гидроксильными группами, в жидкую фазу, причем добавление криопротективной добавки в жидкую фазу можно осуществлять до, в ходе или после получения содержащего частицы состава, суспендированного в жидкой фазе.
25. Способ получения твердой композиции по п. 23, причем указанный способ включает
первую стадию получения композиции согласно указанному выше первому объекту способом, включающим
а) получение состава терапевтически активного агента на основе нано- или микрочастиц, который суспендируют в жидкой фазе, и
б) добавление по меньшей мере одной криопротективной добавки, выбранной из С3-С5-алканов, замещенных одной или двумя гидроксильными группами, в жидкую фазу, где добавление криопротективной добавки в жидкую фазу можно осуществлять до, в ходе или после получения содержащего частицы состава, суспендированного в жидкой фазе,
и вторую стадию замораживания композиции, полученной на первой стадии.
26. Способ сохранения состава терапевтически активного агента, на основе нано- или микрочастиц, причем указанный способ включает получение суспензионной композиции по любому из пунктов 1-22, и замораживание композиции.
27. Применение соединения, выбранного из С3-С5-алканов, замещенных одной или двумя гидроксильными группами, в качестве криопротективной добавки для композиции на основе нано- или микрочастиц, включающей терапевтически активный агент.
28. Устройство для формирования аэрозоля из содержащей частицы композиции, суспендированной в жидкости или для распыления такой композиции, причем указанное устройство содержит композицию по любому из пунктов 1-22.
29. Устройство по п. 28, где устройство представляет собой ингалятор, выбранный из ингалятора с отмеренной дозой, небулайзера и назального распылителя.
30. Способ лечения, включающий введение композиции по любому из пунктов 1-22 пациенту, предпочтительно при введении в дыхательные пути или через них, предпочтительно при введении в легкие или при назальном введении.
31. Композиция по любому из пунктов 1-22 для применения при лечении или профилактике заболевания, причем композицию вводят в дыхательные пути или через них.
32. Композиция для применения по п. 31, где композиция предназначена для введения в дыхательные пути или для назального введения.
33. Композиция по п. 31 или п. 32, где терапевтически активный агент представляет собой РНК, более предпочтительно иРНК, для применения при лечении или профилактике заболевания с использованием РНК-терапии.
34. Композиция для применения по любому из пунктов 31-33, где заболеванием, предназначенным для лечения или профилактики, является заболевание легких.
Примеры
Пример I
Скрининг соединений различного класса в качестве криопротективных добавок для составов, содержащих нано- или микрочастицы Формирование комплексов
Комплексы разветвленного полиэтиленимина (brPEI) и иРНК, кодирующей люциферазу, формировали при конечной концентрации 0,25 мг/мл. В ходе стандартного процесса смешивания иРНК разбавляли водой до концентрации 0,5 мг/мл. Равный объем раствора brPEI получали при конечной концентрации 0,65 мг/мл в воде. Нано- и микрочастицы формировали при вливании раствора иРНК в раствор brPEI с последующим перемешиванием с использованием электронной пипетки (Mettler-Toledo, Е4 LTS 1000 мкл). После перемешивания комплексы инкубировали в течение 20 мин на льду перед использованием.
Определение размера
Для определения диаметра частиц, 100 мкл суспензии частиц добавляли в кювету (Brand, UV-cuvette Micro) и размер определяли на анализаторе частиц Malvern ZetaSizer Nano ZS (Malvern Instruments), задавая значения гидродинамического диаметра и среднего гидродинамического диаметра (z-среднее) в нм. В качестве суспензионной среды использовали, как указано, воду или воду, содержащую криопротективную добавку.
Обработка в условиях замораживание-размораживание Состав разбавляли 1:2 растворами добавок 2Х (20/10/2%) (табл. 1) и разделяли на две части. Один образец каждого полученного состава использовали для определения размера (Malvern Zetasizer NanoZS) в присутствии добавки. Остальные образцы замораживали при -20°С в течение 16 ч, размораживали при КТ и немедленно хранили на льду до достижения температуры растворов до КТ. Затем каждый растаявший образец использовали для определения размера (Malvern Zetasizer NanoZS) и сравнивали величины отклонения размера (в %) составов перед замораживанием и после размораживания с использованием следующего уравнения, где dh означает z-средний диаметр частицы:
Трансфекция и анализ активности люциферазы
Клетки А549 культивировали в среде MEM, дополненной 10% эмбриональной сывороткой крупного рогатого скота (FBS) и 1% пенициллином/стрептомицином (P/S), при 37°С, 5% CO2. Клетки высеивали в концентрации 20000 клеток/лунка в 100 мл среды в лунки 96-луночного планшета в течение 24 ч перед трансфекцией. В день трансфекции среду заменяли средой MEM без FBS и пенициллина/стрептомицина с последующим добавлением закомплексованной иРНК в 60 мкл/лунка в двойном повторе. Через 4 ч после трансфекции среду заменяли на среду MEM, содержащую 10% FBS и 1% P/S. Планшеты инкубировали в течение 24 ч при 37°С, 5% CO2. После инкубации в течение 24 ч среду удаляли и клетки лизировали в 100 мкл буферного раствора для лизиса (25 мМ трис-HCl, 0,1% тритона Х-100, рН 7,8), затем планшеты инкубировали на качалке для планшетов в течение 30 мин при 600 об/мин. Затем 50 мкл клеточного лизата из каждой лунки переносили в 96-луночный планшет и активность репортерной люциферазы светлячков измеряли по интенсивности биолюминесценции на ридере Tecan Infinite 200 PRO после добавления буферного раствора люциферина (0,47 мМ D-люциферин, 0,27 мМ коэнзим А, 3,33 мМ DTT, 0,53 мМ АТФ, 1,1 мМ MgCO3, 2,7 мМ MgSO4, 20 мМ трицин, 0,1 мМ EDTA).
Приготовление образцов для экспериментов in vivo
Комплексы получали, как описано в разделе «Формирование комплексов», и «Обработка в условиях замораживание-размораживание» со следующими модификациями. Готовили 4 мл раствора комплекса с концентрацией иРНК 0,5 мг/мл и разбавляли 1:2 двойным концентрированным раствором добавки, при этом конечная концентрация иРНК составляла 0,25 мг/мл (8 мл). Образцы хранили замороженными до распыления животным.
Распыление
Животных помещали в клетки для дозировки Buxco Small Size Mass Dosing Chamber (Data Sciences International, Германия). Составы размораживали при КТ, помещали на раздробленный лед перед достижением КТ, а затем распыляли с использованием распылителя Aeroneb Solo (Aeroneb, Германия) при скорости циркуляции воздуха 3 л/мин и рабочем цикле 100%.
Измерение биолюминесценции в эксплантированных легких Через 24 ч после введения животных полностью анестезировали с помощью внутрибрюшинной инъекции фентанила/мидазолама/медетомидина (0,05/5,0/0,5 мг/кг массы тела). 50 мкл D-люциферина (30 мг/мл, растворенного в фосфатно-солевом буферном растворе, рН 7) вводили при вдыхании (ингаляция раствора после его непосредственного введения в ноздри) и 100 мкл D-люциферина вводили системным способом внутрибрюшинной инъекцией. Через 10 мин после введения люциферина мышей умерщвляли с использованием цервикальной дислокации. После перфузии PBS через правое сердце легкие эксплантировали. Биолюминесценцию измеряли с использованием прибора Xenogen IVIS Luminar XR (Caliper LifeSciences) с сортировкой, установленной на 8, и временем экспозиции 5 мин. Биолюминесценцию определяли количественно и анализировали с использованием программного обеспечения Living Image Software 4.4 (Xenogen). В случае перенасыщения картины (детекция экспрессии за пределами линейного диапазона) время экспозиции снижали до 1 мин. Биолюминесценцию измеряли как общий поток от органа (в фотонах/с). Для анализа использовали только снимки без перенасыщения. Легкие мгновенно замораживали и хранили при -80°С.
Активность люциферазы в гомогенизированных легких
Размороженные органы взвешивали и половину эксплантированных легких гомогенизировали в буферном растворе для лизиса с использованием гомогенизатора FastPrep°-24 Homogenisator (MP Biomedicals). 100 мкл буферного раствора люциферина добавляли атоматически с использованием люминометра Lumat LB 9507 Luminometer (Berthold Technologies) в 75 мкл отцентрифугированных лизатов. Активность люциферазы определяли в единицах относительной люминесценции RLU/c и преобразовывали в единицы RLU/орган.
Результаты
Способность предотвращать агрегацию частиц составов полимер/иРНК после одного цикла замораживания/размораживания оценивали для различных типов добавок, включая соединения, признанные в данной области техники в качестве криопротективных добавок. Композицией, содержащей 1,2-пропандиол, является композиция по настоящему изобретению, а другие композиции являются композициями сравнения. Гидродинамические диаметры частиц оценивали перед замораживанием. После выдерживания в течение 16 ч при -20°С составы размораживали и снова измеряли гидродинамический диаметр частиц. Различия в размерах частиц до замораживания и после размораживания показаны в табл. 1б. Высокие числа указывают на значительное увеличение размера и следовательно, на агрегацию.
Таблица 16
Отклонение размера частиц после одного цикла замораживания/размораживания по сравнению со свежеприготовленными комплексами при различных концентрациях добавок различного типа
Условия замораживания/размораживания (-20°С) составов brPEI, 25 кДа/иРНК, N/P 10 при концентрации иРНК 0,25 мг/мл, содержащих указанное количество (мас./об. %) добавки. Моногидрат α-лактозы и D-маннита исследовали при пониженных концентрациях из-за ограниченной растворимости в воде. Хлорид натрия исследовали при пониженных концентрациях, чтобы оставаться в изотоническом интервале концентраций, n=1.
Увеличение размера более, чем на 100% (100%удвоенный диаметр) определяли как процесс агрегации. Добавки, приводящие к различию размера ниже этого предельного значения, были выбраны для тестирования in vitro на эффективность трансфекции на клетках А549 после одного цикла замораживания-размораживания (фиг. 1 и табл. 3). Сахара в условиях in vitro не исследовали.
На фиг. 1 представлены данные по эффективности транфекции составов brPEI/FLuc иРНК N/P 10, содержащих добавки, на клетках А549
На основании сведенных в таблицу данных можно видеть, что все добавки сохраняют эффективность трансфекции, и таким образом, они были выбраны для тестирования при распылении мышам. 8 мл раствора комплекса, содержащего 2 мг иРНК, кодирующей люциферазу светлячков, вводили распылением группе мышей BALB/c (n=3). Через 24 ч после введения мышей умерщвляли. Эффективность доставки иРНК анализировали при количественном определении активности люциферазы в иссеченном органе (с помощью видеосистемы в интерактивном режиме Ivis), а также в гомогенате органа (см. фиг. 2 и табл. 4).
Используемые массовые соотношения иРНК/полимер/1,2-пропандиол приведены в табл. 5.
На фиг. 2 представлены данные по эффективности трансфекции in vivo составов brPEI/иРНК, введенных распылением после одного цикла замораживания-размораживания.
Комплекс получали при смешивании 2 мг FLuc иРНК с brPEI 25 кДа при N/P 10, и комплекс вводили мышам при распылении суспензии 0,25 мг/мл после одного цикла замораживание-размораживание в присутствии указанных добавок. Для сравнения одной группе мышей вводили свежеприготовленные частицы, приготовленные в отсутствии добавок. Высокая вязкость составов, содержащих 10% PGE4k или PGE10k, препятствовала распылению с использованием распылителя Aeroneb. n=3.
Обсуждение результатов и выводы
1,2-Пропандиол (пропиленгликоль, PG) был идентифицирован как добавка, которая предотвращает агрегацию частиц и поддерживает эффективность транфекции после распыления in vivo составов после одного цикла замораживание-размораживание по сравнению со свежеприготовленными нано- или микрочастицами brPEI/иРНК.
Пример II
Сравнение различных добавок, структурно родственных 1,2-пропандиолу. в качестве криопротективных агентов для нано- или микрочастиц
Формирование комплексов
Комплексы разветвленного полиэтиленимина (brPEI) и иРНК, кодирующей люциферазу, формировали при конечной концентрации 0,25 мг/мл. В ходе стандартного процесса смешивания иРНК разбавляли водой до концентрации 0,5 мг/мл. Равный объем раствора brPEI получали при конечной концентрации 0,65 мг/мл в воде. Наночастицы формировали при вливании раствора иРНК в раствор brPEI с последующим перемешиванием с использованием электронной пипетки (Mettler-Toledo, Е4 LTS 1000 мкл). После перемешивания комплексы инкубировали в течение 20 мин на льду перед использованием.
Определение размера
Для определения диаметра частиц, 100 мкл суспензии частиц добавляли в кювету Brand, UV-cuvette Micro) и размер определяли на анализаторе частиц Malvern ZetaSizer Nano ZS (Malvern Instruments), задавая значения гидродинамического диаметра и среднего гидродинамического диаметра (z-среднее) в нм. В качестве суспензионной среды использовали, как указано, воду или воду, содержащую криопротективную добавку.
Обработка в условиях замораживание-размораживание
Состав разбавляли 1:2 растворами добавок 2Х (20/10/2%) (табл. 6) и разделяли на две части. Так как растворимость некоторых добавок была ограничена, следующие вещества тестировали при пониженных концентрациях (см. табл. 6): 2-метил-1,4-бутандиол, пентаэритрит. Один образец каждого полученного состава использовали для определения размера (Malvern Zetasizer NanoZS) в присутствии добавки. Остальные образцы замораживали при -20°С в течение 1 6 ч, размораживали при КТ и немедленно хранили на льду до достижения температуры растворов до КТ. Затем каждый растаявший образец использовали для определения размера (Malvern Zetasizer NanoZS) и сравнивали величины отклонения размера (в %) составов перед замораживанием и после размораживания с использованием следующего уравнения, где dh означает z-средний диаметр частицы:
Приготовление образцов для экспериментов in vivo
Комплексы получали, как описано в разделе «Формирование комплексов», и «Обработка в условиях замораживание-размораживание» со следующими модификациями. Готовили 4 мл раствора комплекса с концентрацией иРНК 0,5 мг/мл и разбавляли 1:2 двойным концентрированным раствором добавки, при этом конечная концентрация иРНК составляла 0,25 мг/мл (8 мл). Образцы хранили замороженными до распыления животным.
Распыление
Животных помещали в клетки для дозировки Buxco Small Size Mass Dosing Chamber (Data Sciences International, Германия). Составы размораживали при КТ, помещали на раздробленный лед перед достижением КТ, а затем распыляли с использованием распылителя Aeroneb Solo (Aeroneb, Германия) при скорости циркуляции воздуха 3 л/мин и рабочем цикле 100%.
Измерение биолюминесценции в эксплантированных легких Через 24 ч после нанесения животных полностью анестезировали с помощью внутрибрюшинной инъекции фентанила/мидазолама/медетомидина (0,05/5,0/0,5 мг/кг массы тела). 50 мкл D-люциферина (30 мг/мл, растворенного в фосфатно-солевом буферном растворе, рН 7) вводили при вдыхании (ингаляция раствора после его непосредственного введения в ноздри) и 100 мкл D-люциферина вводили системным способом внутрибрюшинной инъекцией. Через 10 мин после введения люциферина мышей умерщвляли с использованием цервикальной дислокации. После перфузии PBS через правое сердце легкие эксплантировали. Биолюминесценцию измеряли с использованием прибора Xenogen IVIS Luminar XR (Caliper LifeSciences) с сортировкой, установленной на 8, и временем экспозиции 5 мин. Биолюминесценцию определяли количественно и анализировали с использованием программного обеспечения Living Image Software 4.4 (Xenogen). В случае перенасыщения картины (детекция экспрессии за пределами линейного диапазона) время экспозиции снижали до 1 мин. Биолюминесценцию измеряли как общий поток от органа (в фотонах/с). Для анализа использовали только снимки без перенасыщения. Легкие мгновенно замораживали и хранили при -80°С.
Активность люциферазы в гомогенизированных легких
Размороженные органы взвешивали и половину эксплантированных легких гомогенизировали в буферном растворе для лизиса с использованием гомогенизатора FastPrep°-24 Homogenisator (MP Biomedicals). 100 мкл буферного раствора люциферина добавляли атоматически с использованием люминометра Lumat LB 9507 Luminometer (Berfhold Technologies) в 75 мкл отцентрифугированных лизатов. Активность люциферазы определяли в единицах относительной люминесценции RLU/c и преобразовывали в единицы RLU/орган.
Результаты
В примере I было установлено, что 1,2-пропандиол предотвращает агрегацию нано- или микрочастиц при замораживании, при этом поддерживается активность in vivo, в то время как глицерин (вещество со сходной химической структурой) предотвращает агрегацию в ходе замораживания, но активность in vivo не сохраняется. Результаты этого эксперимента указывают на то, что С3-С5 алканолы и алкандиолы со структурой, сходной с 1,2-пропандиолом, способны предотвращать агрегацию в ходе одного цикла замораживание-размораживание, и поддерживать эффективность трансфекции после последующего распыления. Получали комплексы и смешивали их с растворами добавок (в воде) до конечной концентрации, указанной в табл. 6.
Гидродинамические диаметры частиц оценивали перед замораживанием при -20°С. После выдерживания в течение 16 ч все составы размораживали и снова измеряли гидродинамические диаметры частиц. Различия в размерах частиц до замораживания и после размораживания показаны в табл. 6б. Высокие числа указывают на значительное увеличение размера и следовательно, на агрегацию.
Увеличение размера более, чем на 100% (100%удвоенный диаметр) определяли как процесс агрегации. Добавки, приводящие к различию размера ниже этого предельного значения, были выбраны для тестирования при распылении мышам (фиг. 3 и табл. 7).
На фиг. 3 указаны данные по эффективности трансфекции составов brPEI/иРНК после одного цикла замораживание-размораживание.
Получали комплексы 2 мг/8 мл FLuc иРНК с brPEI 25 кДа при N/P 10 и распыляли мышам в концентрации 0,25 мг/мл после одного цикла замораживание-размораживание в присутствии указанных добавок. Через 24 ч после введения мышей умерщвляли, легкие эксплантировали, гомогенизировали и измеряли активность люциферазы. n=3.
Обсуждение результатов и выводы
В указанном эксперименте было установлено, что алканолы/алкандиолы, структурно родственные 1,2-пропандиолу, способны поддерживать эффективность трансфекции комплекса после распыления в легкие мышей после одного цикла замораживание-размораживание. Биофизические свойства анализировали сначала перед замораживанием и после одного цикла замораживание-размораживание, так как агрегация или разрушение частиц приводит к образованию нефункциональных составов. Результаты, полученные в примере I, можно воспроизводить, поскольку 1,2-пропандиол и глицерин сохраняют размер частиц. Как уже было продемонстрировано в предыдущем исследовании, сохранение размера частиц не обязательно приводит к сохранению функциональных частиц после распыления мышам.
Пример III
Замораживание составов при варьировании концентраций иРНК и/или варьировании соотношений N/P Формирование комплексов
Комплексы разветвленного полиэтиленимина (brPEI), Р7 (сополимер линейного этиленимина и пропиленимина, ММ 20 кДа) или Р12 (сополимер линейного этиленимина и пропиленимина, ММ 24 кДа) с иРНК, кодирующей люциферазу, формировали при конечной концентрации 0,25 мг/мл. В ходе стандартного процесса смешивания иРНК разбавляли водой до концентрации 0,5 мг/мл. Равный объем раствора полимера получали при конечной концентрации 0,65 мг/мл в воде. Наночастицы формировали при вливании раствора иРНК в раствор brPEI с последующим перемешиванием с использованием электронной пипетки (Mettler-Toledo, Е4 LTS 1000 мкл). После перемешивания комплексы инкубировали в течение 20 мин на льду перед использованием.
Концентрирование составов
Перед использованием, мембрану ячейки для центробежной ультрафильтрации Amicon® Ultra 15 (Merck Millipore, мембрана PLHK Ultracel PL, отсечение по молекулярной массе 100 кДа) промывали 15 мл воды (500 х g). Затем состав полиплекса переносили в ячейку для ультрафильтрации и центрифугировали при 500 х g при 4°С. Через каждые 5 мин уровень жидкости контролировали, чтобы исключить сверхконцентрирование, и раствор интенсивно перемешивали пипеткой на 1 мл. Через каждый интервал концентрацию образца контролировали спектрофотометрически, определяя концентрацию нуклеиновой кислоты при 260 нм (А260). Эту процедуру повторяли до достижения требуемой концентрации.
Определение размера
Для определения диаметра частиц 200 мкл суспензии частиц добавляли в кювету (Brand, UV-cuvette Micro) и размер определяли на анализаторе частиц Malvern ZetaSizer Nano ZS (Malvern Instruments), задавая значения гидродинамического диаметра и среднего гидродинамического диаметра (z-среднее) в нм. В качестве суспензионной среды использовали, как указано, воду или воду, содержащую криопротективную добавку.
Обработка в условиях замораживание-размораживание
После определения исходного размера полиплекса (Malvern ZetaSizer Nano ZS), состав распределяли в лунках 95-луночного планшета с низким профилем для ПЦР (прозрачные, не содержащие РНКазу и ДНКазу) и состав разбавляли 1:2 растворами добавок 2Х (20/20/2%) (табл. 1). Один образец каждого полученного состава использовали для определения размера (Malvern Zetasizer NanoZS). Остальные образцы замораживали при -20°С в течение ~16 ч, размораживали при КТ и немедленно хранили на льду до достижения температуры растворов до КТ. Затем каждый размороженный образец использовали для определения размера (Malvern Zetasizer NanoZS) и сравнивали величины отклонения размера (в %) составов перед замораживанием и после размораживания с использованием следующего уравнения, где dh означает z-средний диаметр частицы:
Результаты
В этом эксперименте можно оценивать способность заявленного класса идентифицированных соединений действовать в качестве криопротективной добавки для нано- или микрочастиц как при повышенной концентрации иРНК, так и при сниженном соотношении N/P. С этой целью в качестве типичной добавки был выбран 1,2-пропандиол. В табл. 8 представлены значения отклонения размера (%) частиц до замораживания по сравнению с комплексами после размораживания комплексов, замороженных при различных концентрациях иРНК (0,25, 1,1 или 2,3 мг/мл) и различных соотношениях N/P (N/P 4 или 10). Использованные массовые соотношения иРНК/полимер/1,2-пропандиол указаны в табл. 9.
Полученные данные указывают на то, что с использованием добавки все исследованные условия позволяют исключить агрегацию.
Обсуждение результатов и выводы
Данные, полученные в примере III, свидетельствуют о том, что размер частиц можно поддерживать независимо от соотношения полимер/иРНК, а также от концентрации иРНК в процессе замораживания.
Пример IV
Криопротективный характер идентифицированных добавок для различных поликатионов (добавление перед смешиванием) Формирование комплекса
Комплексы катионного полимера и иРНК, кодирующей люциферазу, формировали с использованием трех различных полимерных структур: разветвленный полиэтиленимин (brPEI, 25 кДа), линейный сополимер этиленимина и пропиленимина (Р7, 20 кДа) или линейный сополимер этиленимина и пропиленимина (Р12, 24 кДа).
Р7 и Р12 являются линейными сополимерами этиленимина и пропиленимина следующей структуры:
Синтез
Смесь сухого 2-этил-2-оксазолина и сухого 2-этил-2-оксазина объединяли с метилтрифлатом в ацетонитриле. Полимеризацию проводили в течение 30 ч при 130°С в атмосфере азота. Полимеризацию останавливали при добавлении воды и смесь инкубировали в течение 3 ч при 130°С. Полимер получали в ходе трех стадий осаждения в холодном диэтиловом эфире. Для гидролиза полимер растворяли в концентрированной соляной кислоте и инкубировали в течение 30 ч при 130°С. рН раствора полимера доводили до 10 с помощью NaOH. Очистку проводили в ходе диализа против деонизированной воды с последующей лиофилизацией. Полученное соотношение этиленимина (С2) и пропиленимина (С3) в полимере можно изменять с помощью модификации соотношения 2-этил-2-оксазолина и 2-этил-2-оксазина. Молекулярную массу можно контролировать, изменяя используемое количество метилтрифлата.
Комплексы смешивали при конечной концентрации 0,25 мг/мл при трех различных соотношениях N/P 4, 6 и 10. В процессе стандартного перемешивания иРНК разбавляли водой до концентрации 0,5 мг/мл. Равный объем раствора полимера (концентрации см. в табл. 10) получали в воде, содержащей 20% или 10% (мас./об.) 1,2-пропандиола. Наночастицы получали при вливании раствора иРНК в раствор полимера с последующим перемешиванием с использованием электронной пипетки (Mettler-Toledo, Е4 LTS 1000 мкл). После смешивания комплексы инкубировали в течение 20 мин на льду перед использованием.
Определение размера
Для определения диаметра частиц 100 мкл суспензии частиц добавляли в кювету (Brand, UV-cuvette Micro) и размер определяли на анализаторе частиц Malvern ZetaSizer Nano ZS (Malvern Instruments), задавая значения гидродинамического диаметра и среднего гидродинамического диаметра (z-среднее) в нм. В качестве суспензионной среды использовали, как указано, воду или воду, содержащую криопротективную добавку.
Обработка в условиях замораживание-размораживание
Один образец каждого полученного состава использовали для определения размера (Malvern Zetasizer NanoZS). Остальные образцы замораживали при -20°С в течение 16 ч, размораживали при КТ и немедленно хранили на льду до достижения температуры образцов до КТ. Один образец из каждого размороженного состава использовали для определения размера (Malvern Zetasizer NanoZS) и сравнивали величины отклонения размера (в %) составов перед замораживанием и после размораживания с использованием следующего уравнения:
Приготовление образцов для экспериментов in vivo
Комплексы получали, как описано в разделе «Формирование комплексов», и «Обработка в условиях замораживание-размораживание» при соотношении N/P 4 в объеме 8 мл. Образцы хранили замороженными до распыления животным.
Распыление
Животных помещали в клетки для дозировки Buxco Small Size Mass Dosing Chamber (Data Sciences International, Германия). Составы размораживали при КТ, помещали на раздробленный лед перед достижением до КТ, а затем распыляли с использованием распылителя Aeroneb Solo (Aeroneb, Германия) при скорости циркуляции воздуха 3 л/мин и рабочем цикле 100%.
Измерение биолюминесценции в эксплантированных легких Через 24 ч после введения животных полностью анестезировали с помощью внутрибрюшинной инъекции фентанила/мидазолама/медетомидина (0,05/5,0/0,5 мг/кг массы тела). 50 мкл D-люциферина (30 мг/мл, растворенного в фосфатно-солевом буферном растворе, рН 7) вводили при вдыхании (ингаляция раствора после его непосредственного введения в ноздри) и 100 мкл D-люциферина вводили системным способом внутрибрюшинной инъекцией. Через 10 мин после введения люциферина мышей умерщвляли с использованием цервикальной дислокации. После перфузии PBS через правое сердце легкие эксплантировали. Биолюминесценцию измеряли с использованием прибора Xenogen IVIS Luminar XR (Caliper LifeSciences) с сортировкой, установленной на 8, и временем экспозиции 5 мин. Биолюминесценцию определяли количественно и анализировали с использованием программного обеспечения Living Image Software 4.4 (Xenogen). В случае перенасыщения картины (детекция экспрессии за пределами линейного диапазона) время экспозиции снижали до 1 мин. Биолюминесценцию измеряли как общий поток от органа (в фотонах/с). Для анализа использовали только снимки без перенасыщения. Легкие мгновенно замораживали и хранили при -80°С.
Активность люциферазы в гомогенизированных легких
Органы взвешивали и половину эксплантированных легких гомогенизировали в буферном растворе для лизиса с использованием гомогенизатора FastPrep°-24 Homogenisator (MP Biomedicals). 100 мкл буферного раствора люциферина добавляли атоматически с использованием люминометра Lumat LB 9507 Luminometer (Berthold Technologies) в 75 мкл отцентрифугированных лизатов. Активность люциферазы определяли в единицах относительной люминесценции RLU/c и преобразовывали в единицы RLU/орган.
Результаты
Полученные в примерах I-III данные свидетельствуют об эффективности добавок в отношении предотвращения агрегации, в то время как поддерживание эффективности in vivo в различных условиях наблюдалось только для частиц, сформированных из разветвленного полиэтиленимина. Чтобы продемонстрировать независимость функциональности этих добавок от характеристик полимеров, были исследованы полимеры различного типа. 1,2-Пропандиол был выбран в качестве типичной добавки. Варьировали тип разветвления полимера (разветвленный или линейный), молекулярную массу (20 кДа, 24 кДа и 25 кДа), состав мономеров (полиэтиленимин и сополимер полиэтиленимина и пропиленимина), а также соотношение N/P (4, 6 и 10). Функциональность выбранных полимеров уже была доказана после распыления. Результаты отклонения размера частиц (%) до замораживания и после размораживания для двух различных концентраций добавок представлены в виде отклонения размера в табл. 10. Для подтверждения функциональности частиц in vivo исследовали также соотношение N/P. Суммированные данные по эффективности представлены на фиг. 4, а также в табл. 13. Использованные массовые соотношения иРНК/полимер/1,2-пропандиол представлены в табл. 12 и табл. 14б.
На фиг. 4 представлена эффективность трансфекции in vivo концентрированных составов полимер/иРНК.
Комплекс иРНК, кодирующей люциферазу светлячков, и brPEI 25 кДа/Р7/Р12 при соотношении N/P 4 (2 мг) распыляли мышам либо непосредственно после приготовления (0,25 мг/мл иРНК, 8 мл/группа), либо после одного цикла замораживание/размораживание (1 мг/мл иРНК, 2 мл/группа) в присутствии указанных добавок. Через 24 ч после введения мышей анестезировали и легкие эксплантировали. Активность люциферазы измеряли в гомогенатах легких, n=3.
Обсуждение результатов и выводы
Полученные в этом эксперименте данные свидетельствуют о том, что стабилизирующий эффект 1,2-пропандиола не зависит от типа разветвления, молекулярной массы, состава мономеров, а также от соотношения N/P. При изменении всех этих параметров наблюдается сохранение целостности комплексов после одного цикла замораживание/размораживание. Кроме того, функциональность этих комплексов после внутрилегочного введения можно продемонстрировать в экспериментах in vivo. В отношении уровней экспрессии репортерного белка не наблюдается значительного различия свежеприготовленных комплексов по сравнению с теми же самыми комплексами, замороженными в 5% или 10% 1,2-пропандиоле. Основные различия эффективности разветвленного полиэтиленимина по сравнению с сополимером этиленимина и пропиленимина полностью согласуются с утверждением в заявке WO 2013182683 A1. Кроме того, данные, полученные в этом эксперименте, подтверждают, что время добавления добавки не влияет на ее эффективность. В то время как добавки добавляли к наночастицам после комплексообразования в экспериментах I и II, в этом эксперименте 1,2-пропандиол был добавлен к раствору полимера перед его смешиванием с раствором иРНК.
Пример V
Стабильность замороженных комплексов
Формирование комплексов
Комплексы разветвленного полиэтиленимина (brPEI) и иРНК, кодирующей люциферазу, формировали при концентрации 0,25 мг/мл. иРНК разбавляли с использованием стандартного процесса перемешивания в воде до концентрации 0,5 мг/мл. Равный объем раствора brPEI готовили при концентрации 0,65 мг/мл либо в воде, либо в 10% 1,2-пропандиоле. Для формирования наночастиц раствор иРНК вливали в раствор brPEI с последующим перемешиванием с использованием электронной пипетки (Mettler-Toledo, Е4 LTS 1000 мкл). После смешивания комплексы инкубировали на льду в течение 20 мин перед использованием.
Обработка в условиях замораживание-размораживание
После исходного определения размера полиплекса (Malvern Zetasizer NanoZS) 100 мкл каждого состава (в трех повторах) замораживали при -20°С в указанные моменты времени, размораживали при КТ и немедленно хранили на льду до достижения температуры растворов до КТ. Один образец из каждого размороженного состава использовали для определения размера (Malvern Zetasizer NanoZS) и сравнивали величины отклонения размера (в %) составов перед замораживанием и после размораживания с использованием следующего уравнения:
Оценка целостности иРНК
Составы наночастиц разбавляли в воде до концентрации иРНК 0,2 мг/мл. 5 мкл этого разбавленного раствора обрабатывали 3 мкл гепарина (40 мг/мл), 2 мкл 2% об./об. Тритона Х-100 и 10 мкл формамида. Смесь инкубировали при 70°С в течение 15 мин для полного разрушения частиц и затем выдерживали на измельченном льду. Затем проводили анализ фрагментов нуклеиновой кислоты методом капиллярного гель-электрофореза (Advanced Analytical Fragment Analyzer, PROSize 2.0). Сигнал полноразмерной иРНК от обработанных составов (иРНКобработанная) сравнивали со свежеприготовленной незакомплексованной иРНК (иРНКсравнения) той же партии иРНК, которая была использована для формирования комплексов в качестве РНК сравнения и рассчитывали целостность иРНК [%] с использованием следующего уравнения:
Результаты
Определяющим параметром нано- или микрочастиц на основе иРНК является стабильность иРНК в составе комплекса. Как показано в табл. 15, хранение комплексов при 25°С приводит к быстрой деградации закомплексованной иРНК. В этом эксперименте исследовали влияние способности замораживания комплексов на стабильность закомплексованной РНК. В первом эксперименте формировали комплексы РНК и замораживали после добавления 1,2-пропандиол в качестве типичного кандидата из группы высокоэффективных добавок. Целостность иРНК (количество полноразмерной иРНК) в составе комплекса исследовали перед замораживанием и через неделю после замораживания при -20°С. Оценивали целостность свежеприготовленной незакомплексованной иРНК и полученную величину принимали за 100% в качестве величины для сравнения. Результаты суммированы в табл. 16.
Во втором эксперименте условия обработки повторяли после хранения комплексов в течение восьми недель при -20°С. Результаты представлены в табл. 17.
Обсуждение результатов и выводы
Описанные эксперименты свидетельствуют о значительном благоприятном эффекте на способность замораживания нано- или микрочастиц для продолжительного хранения. В то время как хранение комплексов при комнатной температуре приводит к процессу деградации иРНК в течение нескольких часов, хранение комплексов в замороженном состоянии приводит к полному сохранению целостности иРНК в течение по меньшей мере восьми недель.
Пример VI
1,2-Пропандиол в качестве криопротективного агента для составов на основе липидов
Формирование комплексов
Липидные компоненты (катионный липиоид, вспомогательный липидный холестерин и PEG-липид) солюбилизировали и смешивали в изопропаноле, а затем вливали в раствор иРНК в цитратном буферном растворе (10 мМ лимонная кислота, 150 мМ NaCl, рН 4,5) в объемном соотношении 1:4, при этом получали концентрацию иРНК 0,2 мг/мл. Комплексы инкубировали в течение 20 мин при КТ. После инкубации раствор диализовали против воды в течение 16 ч. Концентрация иРНК после диализа составляла 0,13 мг/мл. Частицы концентрировали до концентрации 0,2 или 0,5 мг/мл в системе SpeedVac (Concentrator Plus, Eppendorf) при 45°C.
Определение размера
Для определения диаметра частиц 200 мкл суспензии частиц добавляли в кювету (Brand, UV-cuvette Micro) и размер определяли на анализаторе частиц Malvern ZetaSizer Nano ZS (Malvern Instruments), задавая значения гидродинамического диаметра и среднего гидродинамического диаметра (z-среднее) в нм. В качестве суспензионной среды использовали, как указано, воду или воду, содержащую криопротективную добавку.
Обработка в условиях замораживание-размораживание
Составы разбавляли в соотношении 1:2 растворами 2Х (20 или 10%) 1,2 пропанола и разделяли на несколько образцов. Один образец каждого полученного состава использовали для определения размера (Malvern Zetasizer NanoZS) в присутствии добавки. Остальные образцы замораживали при -20°С в течение 16 ч, размораживали при КТ и немедленно хранили на льду до достижения температуры растворов до КТ. Затем каждый размороженный образец использовали для определения размера (Malvern Zetasizer NanoZS) и сравнивали величины отклонения размера (в %) составов перед замораживанием и после размораживания с использованием следующего уравнения, где означает z-средний диаметр частицы:
Введение методом внутритрахеального распыления
50 мкл раствора комплекса вводили при внутритрахеальном распылении с использованием устройства для распыления Micro Sprayer 1A (PennCentury, США) после анестезии животных с помощью ингаляции изофлурана.
Измерение биолюминесценции в эксплантированных легких
Через 24 ч после введения животных полностью анестезировали с помощью внутрибрюшинной инъекции фентанила/мидазолама/медетомидина (0,05/5,0/0,5 мг/кг массы тела). 50 мкл D-люциферина (30 мг/мл, растворенного в фосфатно-солевом буферном растворе, рН 7) вводили при вдыхании (ингаляция раствора после его непосредственного введения в ноздри) и 100 мкл D-люциферина наносили системным способом внутрибрюшинной инъекции. Через 10 мин после введения люциферина мышей умерщвляли с использованием цервикальной дислокации. После перфузии PBS через правое сердце легкие эксплантировали. Биолюминесценцию измеряли с использованием прибора Xenogen IVIS Luminar XR (Caliper LifeSciences) с сортировкой, установленной на 8, и временем экспозиции 5 мин. Биолюминесценцию определяли количественно и анализировали с использованием программного обеспечения Living Image Software 4.4 (Xenogen). В случае перенасыщения картины (детекция экспрессии за пределами линейного диапазона) время экспозиции снижали до 1 мин. Биолюминесценцию измеряли как общий поток от органа (в фотонах/с). Для анализа использовали только снимки без перенасыщения. Легкие мгновенно замораживали и хранили при -80°С.
Активность люциферазы в гомогенизированных легких
Размороженные органы взвешивали и половину эксплантированных легких гомогенизировали в буферном растворе для лизиса с использованием гомогенизатора FastPrep°-24 Homogenisator (MP Biomedicals). 100 мкл буферного раствора люциферина добавляли атоматически с использованием люминометра Lumat LB 9507 Luminometer (Berthold Technologies) в 75 мкл отцентрифугированных лизатов. Активность люциферазы определяли в единицах относительной люминесценции RLU/c и преобразовывали в единицы RLU/орган.
Результаты
Полученные в этом эксперименте результаты свидетельствуют о пригодности добавок, определенных в данном контексте, в качестве криопротективных агентов для комплексов на основе липидов. На первой стадии, наночастицы формировали и обрабатывали их в условиях одного цикла замораживание/размораживание в присутствии или отсутствии добавок. Размер измеряли до замораживания и после размораживания. 1,2-Пропандиол был выбран в качестве типичного представителя группы веществ. Эксперимент проводили при различных концентрациях комплекса (0,2 и 0,5 мг/мл), а также при различных концентрациях добавки (5% и 10% мас./об.). Различие размеров частиц представлено в табл. 18б.
Как показано в табл. 18б, 1,2-пропандиол также стабилизирует размер частиц в условиях цикла замораживание-размораживание для комплексов на основе липидов. Следовательно, на следующей стадии исследовали эффективность трансфекции после внутрилегочной доставки. Для этой цели дозу 10 мкг иРНК, кодирующей люциферазу светлячков, вводили мышам BALB/c с помощью инъекции микроспрея в трахею. Результаты детектирования продуцированного белка в качестве меры эффективности доставки и тем самым функциональности носителя, представлены на фиг. 5 и в табл. 19.
На фиг. 5 показана эффективность трансфекции in vivo частиц, содержащих нано- или микрочастицы на основе липидов после замораживания в присутствии 1,2-пропандиола.
Комплексы, содержащие иРНК, кодирующую люциферазу светлячков, получали в присутствии или отсутствии 1,2-пропандиола и вводили мышам с помощью инъекции микроспрея в трахею либо после хранения при 4°С либо после одного цикла замораживание-размораживание. Через 24 ч после введения мышей анестезировали и легкие эксплантировали для измерения активности люциферазы, n=3.
Как показано на фиг. 5 и в табл. 19, функциональность комплексов, замороженных в присутствии 1,2-пропандиола, полностью сохраняется после введения in vivo. Таким образом добавка не оказывает отрицательное действие на эффективность трансфекции.
Обсуждение результатов и выводы
Представленные в этом примере данные свидетельствуют о том, что 1,2-пропандиол позволяет замораживать не только комплексы на основе полимеров, но и комплексы на основе липидов, предотвращая их агрегацию и сохраняя их активность in vivo.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлена эффективность трансфекции составов brPEI/FLuc иРНК, N/P 10, содержащих добавки, на клетках А549.
На фиг. 2 представлена эффективность трансфекции in vivo составов brPEI/FLuc иРНК после одного цикла замораживание/размораживание.
На фиг. 3 представлена эффективность трансфекции in vivo составов brPEI/FLuc иРНК после одного цикла замораживание/размораживание. Пунктирная линия означает 50% активности свежеприготовленных частиц.
На фиг. 4 представлена эффективность трансфекции концентрированных составов полимер/иРНК.
На фиг. 5 представлена эффективность трансфекции in vivo нано- или микрочастиц на основе липидов после замораживания в 1,2-пропандиоле.
Claims (9)
1. Композиция для применения при лечении или профилактике заболевания, причем композиция предназначена для введения в дыхательные пути или через них, включающая
(i) состав терапевтически активного агента на основе нано- или микрочастиц, который суспендирован в жидкой фазе, и
ii) от 0,5 мас./об.% до 30 мас./об.% в расчете на объем жидкой фазы по меньшей мере одной криопротективной добавки, выбранной из 1,2-пропандиола, 2-пропанола, 1,2-бутандиола и 1,3-бутандиола,
где терапевтически активный агент представляет собой иРНК, и
частицы в содержащем частицы составе включают иРНК в форме комплекса, сформированного из нуклеиновой кислоты и катионного олигомера или катионного полимера в качестве катионного эксципиента, или частицы в содержащем частицы составе включают иРНК в форме комплекса, сформированного из нуклеиновой кислоты и катионного липида или катионного липидоида в качестве катионного эксципиента.
2. Композиция по п. 1, где состав на основе нано- или микрочастиц характеризуется средним диаметром частиц в интервале от 1 до 4000 нм, более предпочтительно от 2 до 2500 нм и наиболее предпочтительно от 5 до 1000 нм.
3. Композиция по п. 1 или 2, где криопротективной добавкой является 1,2-пропандиол.
4. Устройство для формирования аэрозоля из содержащей частицы композиции, суспендированной в жидкости, или для распыления такой композиции, причем указанное устройство содержит композицию по любому из пунктов 1-3, где устройство представляет собой ингалятор, выбранный из ингалятора с отмеренной дозой, небулайзера и назального распылителя.
5. Композиция по любому из пп. 1-3, где композиция предназначена для введения в дыхательные пути или назального введения.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP18169325.0 | 2018-04-25 | ||
EP18189010.4 | 2018-08-14 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2020137802A RU2020137802A (ru) | 2022-07-06 |
RU2820713C2 true RU2820713C2 (ru) | 2024-06-07 |
Family
ID=
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996034109A1 (en) * | 1995-04-25 | 1996-10-31 | Vical Incorporated | Single-vial formulations of dna/lipid complexes |
EP1954252A2 (en) * | 2005-12-02 | 2008-08-13 | Novartis AG | Nanoparticles for use in immunogenic compositions |
WO2018010815A1 (en) * | 2016-07-15 | 2018-01-18 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Formulation for administration of rna |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996034109A1 (en) * | 1995-04-25 | 1996-10-31 | Vical Incorporated | Single-vial formulations of dna/lipid complexes |
EP1954252A2 (en) * | 2005-12-02 | 2008-08-13 | Novartis AG | Nanoparticles for use in immunogenic compositions |
WO2018010815A1 (en) * | 2016-07-15 | 2018-01-18 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Formulation for administration of rna |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
KASPER J.C. ET AL., "Development of a lyophilized plasmid/LPEI polyplex formulation with long-term stability A step closer from promising technology to application", 04 January 2011 (2011-01-04), Vol. 151, 3, page 246-255, найдено онлайн, найдено в Интернете: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S016836591100006X. FARLEY C. ET AL., Efficient cryoprotection of macromolecular crystals using vapor diffusion of volatile alcohols, J. STRUCT. BIOL.,Vol. 188, 2, November 2014 (2014-11), page 102-106, найдено онлайн, найдено в Интернете: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1047847714002081?via%3Dihub. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7256824B2 (ja) | 粒子状製剤用の凍結保護剤 | |
Putnam | Polymers for gene delivery across length scales | |
CN102231979B (zh) | 基因沉默治疗剂的脂质体有效递送方法和组合物 | |
Ko et al. | Self-assembling micelle-like nanoparticles based on phospholipid–polyethyleneimine conjugates for systemic gene delivery | |
KR102285326B1 (ko) | Rna를 세포에 도입하기 위한 조성물 | |
Sokolova et al. | Functionalisation of calcium phosphate nanoparticles by oligonucleotides and their application for gene silencing | |
CA2971284C (en) | Compositions for introducing nucleic acid into cells | |
Li et al. | Ionizable lipid-assisted efficient hepatic delivery of gene editing elements for oncotherapy | |
JP5860409B2 (ja) | 徐放性核酸マトリックス組成物 | |
US20030138407A1 (en) | Therapeutic methods for nucleic acid delivery vehicles | |
KR101870316B1 (ko) | 음이온성 약물을 함유하는 고분자 미셀의 제조방법 | |
CA3209032A1 (en) | Formulations for aerosol formation and aerosols for the delivery of nucleic acid | |
Mok et al. | Direct plasmid DNA encapsulation within PLGA nanospheres by single oil-in-water emulsion method | |
Steele et al. | Factors influencing polycation/siRNA colloidal stability toward aerosol lung delivery | |
Roques et al. | Comparison of toxicity and transfection efficiency of amphiphilic block copolymers and polycationic polymers in striated muscles | |
RU2820713C2 (ru) | Криопротективные агенты для содержащих частицы составов | |
Erdem‐Çakmak et al. | Comparison of VEGF gene silencing efficiencies of chitosan and protamine complexes containing shRNA | |
RU2815001C2 (ru) | Составы на основе липидов для доставки рнк | |
EP4306133A1 (en) | Composition for administration of double-stranded oligonucleotide structures using ultrasonic nebulizer for prevention or treatment of respiratory viral infection including covid-19, pulmonary fibrosis caused by viral infection, or respiratory diseases | |
JP2023506293A (ja) | ポリプロピレンイミンを含む非ウイルスベクター | |
CN114605338A (zh) | 一种含尿嘧啶衍生物的纳米粒、核酸纳米复合物及其制备方法和用途 | |
Enneli et al. | In vitro antisense activity of chitosan/AsODN complexes | |
Katas | Development of nanocarriers for siRNA based on cationic polymers |