JPS622164A - Ｎ４−（置換アミノ）シチジンを含む核酸プロ−ブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は核酸ハイブリダイゼーションプローブに関し、
より詳細には、核酸をハイブリダイゼーションプローブ
として有用ならしめる核酸の化学的標識に関する。

従来の技術 一本鎖ＤＮＡまたはｆｔＮＡプローブを使って、生物学
的試料中の特定のＤＮＡまたはＲＮＡおよびそれに関連
した生物学的物質の存在について試験することはよく知
られている。例えばグルンスタイ７　（Ｇｒｕｎｓｔｅ
ｉｎ）およびホグネス（Ｈｏｇｎｅｓａ）のＰｒｏｃ、
　Ｎａｔ’Ｊ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（［Ｊｓ）　
　７２．３９６１〜３９６５（１９７５）；サザン（Ｓ
　ｏｕｔｈｅｒｎ　）のＬＭｏｌ。

Ｂｉｏｇ、、９８．５０３〜５０５（１９７５）；　ラ
ンガー（Ｌａｎｇｅｒ）らのＰｒｏｃ、　Ｎａｔ’／、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳ）７Ｂ、６６３３〜６
６３７（１９８１）ｐファルコウ（Ｆ’ａｌｋｏｗ）お
よびモーズリ−（Ｍｏｓｅｌｅｙ）の米国特許第４３５
８５３５号；ワード”　（Ｗａｒｄ）らの欧州特許出願
第００６３８７９号；イングルハート（Ｅｎｇｌｅｈａ
ｒｄｔ）らの欧州特許出願第００９７３７３号；マイン
コス（Ｍｅｉｎｋｏｔｈ）およびワール（Ｗａｈｌ）の
Ａｎａｌ。

１１ｏｃｈｅｍ、　１３８．２６７〜２８４　（１９８
４）を参照されたい。

この種のプローブが使用される分野には、病原性の細菌
やウィルスが混入した食品および血液の試験；糞便、血
液またはその他の体液の分析にょる真菌、細菌およびウ
ィルス疾患の診断：遺伝子の不在または欠陥遺伝子の存
在についての細胞の分析による、遺伝病および細胞集団
の遺伝子異常と関係する癌のようなめる種の疾患の診断
；ならびに核型の決定などが含まれる。クラウスナー（
Ｋｌａｕｓｎｅｒ）およびウイルン７　（Ｗｉｌｓｏｎ
）のバイオテクノロジー１，４７１〜４７８（１９８３
）；　　イングルハートらの上記文献：ワードらの上記
文献；７アルコウおよびモー７ズリーの上記文献を参照
されたい。

このようなプ晶−ズの使用の基礎をなす原理は、特定の
プローブが十分な緊縮条件（Ｓｔｒｉｎｐ；θｎｔｃｏ
ｎｄｉｔｉｏｎｓ　）下で相補的塩基対間の水素結合に
より、プローグのヌクレオチド配列（標的配列に特異的
な１プローズ配夕じ）に相補的なヌクレオチド配列（１
標的配列”）を含む（一本＠）ＤＮＡまたはＲＮＡと選
択的にノ・イブリダイズするであろうということである
。従って、試験しようとする生物学的物質（例えばウィ
ルス、微生物、正常染色体、欠陥遺伝子を有する補乳動
物染色体）が試験すべき試料中にその物質にのみ関連す
る少なくとも１つのＤＮＡまたはＲＮＡ配列を有する場
合、その生物学的物質は核酸プローブを使って試験する
ことができる。

試験しようとする物質に関連し、しかもハイブリダイゼ
ーション検定において核酸プローブと選択的にハイブリ
ダイズする標的配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、それ
ぞれプローブの１標的”ＤＮＡまたはＲＮＡと呼ばれる
。

プローグは一般にその標的ＤＮＡまたはＲＮＡ中の標的
配列に相補的なプローブ配列中に少なくとも８個、通常
少なくとも１２個のりボヌクレオチドまたは２′−デオ
キシリボヌクレオチドｅ含ｔｒであろう。プローブはそ
の標的核酸と二本鎖を形成するプローブ配列を除いて、
実際上４種類の塩基をいくつ有していてもよいが、これ
らの追加塩基を含む配列はハイブリダイゼーション検定
条件下で標的核酸以外の核酸と有意なハイブリッドを形
成してはならない。すなわち、プローブはハイブリダイ
ゼーション検定においてその標的ＤＮＡまたはＲＮＡに
対して特異的であるだろう。

標的ＤＮＡまたはＲＮＡの存在について生物学的試料を
分析するためには、ポリヌクレオチドプローブは標的（
−木調）ＤＮＡまたはＲＮＡ中のその相補的配列とハイ
ブリダイズするときに形成される二重らせんを検出し得
る特徴を含まねばならない。一般に、プローブのこの種
の特徴としては、放射性原子または多くの技法のいずれ
かにより簡単にしかも感度よく検出しうる成分を含むよ
うに化学的に修飾されたピリミジ７やプリ７塩基が包含
される。

例えば、プローブは３２Ｐ−標識ヌクレオシド三リン酸
を用いて作ることができ、この場合プローブそれ自体お
よびそのプローブとハイブリダイズした標的ＤＮＡまた
はＲＮＡは　Ｐ−崩壊により発生する放射線によって検
出できる。

放射性崩壊に基づいて検出されるプローブは、安全性の
問題や放射性物質の取扱いにともなうライセンスの必要
性、さらに貯蔵中に放射性崩壊により生ずるプローグの
劣化のために多くの用途に適していない。従って、ピリ
ミジンまたはプリン塩基の化学的修飾に基づいて検出さ
れるプローグが多くの場合に有利である。

プローグ中のプリンまたはピリミジン塩基を修飾する例
は数多く存在し、その場合ある成分（本明結書中では”
標識成分”と呼ぶ）がこれらの塩基に化学的に結合され
、プローグとハイブリダイズした標的Ｉ）ＮＡまたはＲ
ＮＡを検出可能にする。

例えばワードらの上記文献；イングルハートらの上記文
献；クラウスナーおよびウィルソンの上記文献を参照さ
れたい。一般に６標識成分”はタンパク質との高い結合
親和性を有する成分（例えば、抗体と結合する抗原）；
アビジンまたはストレプトアビジンと結合するビオチニ
ルまたはイミノビオチニル成分；酵素と結合する酵素阻
害剤である。

プローグの標識成分に対して高い結合親和性を有するタ
ンパク質は、本明細書において、標識成分の１複合タン
パク質”と呼ばれる。

一般的な検定法では、プローブが標的ＤＮＡまたはＲＮ
Ａとハイブリダイズした後に、”リポータ−グループ（
ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｇｒｏｕｐ）ｓｌがその系に添加さ
れてハイブリダイズしたプローブの標識成分と結合する
。”リポータ−グループ”は標的ＤＮＡまたはＲＮＡと
ハイブリダイズしたプローブを検出可能にする信号を与
える。代表的なリポータ−グループは標識成分の複合タ
ンパク質、または複合タンパク質の標識結合部位を介し
て標識と結合する複合体（上記の複合タンパク質を含む
）である。こうして結合されたリポータ−グループはそ
の後適当な免疫学的、物理的、ま′ｆｃは生化学的方法
を用いて検出される。例えば、リポータ−グループが単
に複合タンパク質である場合、検出はその複合タン、ｅ
り質に対して特異的な抗体に基づいて、多くのよく知ら
れた免疫検定法により行うことができる。リポータ−グ
ループが自然界において発色団または螢光団を含む複合
タンパク質であるか、あるいはこのような成分を含むよ
うに修飾された複合タン、（り質である場合、検出は発
色団や螢光団に基づいた分光法により行われる。リポー
タ−グループが酵素（複合タンパク質を含む）のへテロ
重合体またはホモ重合体である場合、検出はそのポリマ
ー中の酵素により触爽される酵素反応によって生じた物
質の検出をともなう。ワードらの上記文献、イングルハ
ートらの上記文献、およびクラウスナーおよびウィルソ
ンの上記文献はプローブの標識成分に結合したリポータ
−グループを検定するための多くの技法を開示している
。

標識成分それ自体は、リポータ−グループと結合しなく
ても、プローグに検出可能性を与えることができる。例
えば、螢光団や発色団である標識成分は、リポータ−グ
ループに結合することなく適尚な分光法を用いて検出し
うる。例えば１，２ウマン（Ｂａｕｍａｎ）らのＪ　、
　Ｈｌｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、２９　。

２２７〜２３７（１９８１）　　を参照されたい。

ピリミジンまたはプリン塩基が標識成分の付加により化
学的に修飾される場合、いくつかの例においては標識成
分とピリミジンまたはプリン塩基の修飾部位とが結合基
によって分離されるだろう。

例えば、ワードらおよびイングルハートらの上記文献を
参照されたい。いくつかの場合において、このような結
合基はプローグに対して標識成分を結合しやすくするだ
ろう。さらに、結合基は修飾されたプリンまたはピリミ
ジン塩基から標識成分を幾分か引き離し、それによって
リポータ−グループによる結合へ標識成分を接近しゃす
くし、さらに標識成分の分子量が大きい場合にプローブ
と標的ＵＬＮＡまたはＲＮＡとの間の二重らせんの形成
および安定性に対する標識成分の妨害を減するであろう
。

標識成分がシトシン成分のＮ−位置に直接または結合基
金倉して結合された少なくとも１つの修飾シトシンを含
むポリヌクレオチドは今まで使用されたことがなかった
。

シトシ／の４位に存在するアミノ基は核酸の二重らせん
構造においてシトシンとグアニ／との間の水素結合に関
与するので、このアミン基の修飾は核酸プローグにおい
て到底受容されないものと考えられていた。核酸におけ
るこの種の修飾は二重らせんの形成を妨害し、グアノシ
ン−シトシンの水素結合をかなりの程度に破壊すること
によジ特異性および感度の点で受容し得ないプローブを
もたらすと考えられていた。ワードらの上記文献および
ルーズ（Ｒｕｔｈ）の特許協力条約（ＰＣＴ）国際公開
■０・ＷＯ３４１０３２８５（１９８４）を参照された
い。

シトシン成分をそのＮ−窒素において修飾する方法は、
シチジ／および２′−デオキシシチジンならびにそれら
のリン醒エステル（単量体および一木調ポリヌクレオテ
ビに含まれたものの両形体）を用いて研究されてきた。

ニック（Ｎ１ｔｔａ）　ラのＦ’ＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ　１６６＊　１９４〜１９８（１９８４Ｌネギ’／　
（Ｎｅｇｉｓｈｉ）らの（ＩＪ、　　ＮＨｃｌ、　Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｅａ、　Ｓｙｍｐ。

５ｅｒｉｅｓ　ｌ　２．２９−３０　（１９８３）　；
ネギシらの（ＩＩ）、ＮＨｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ
、　１１．５２２３〜５３３３　（１９８３）　；ハヤ
ツ（Ｈａｙａｔｓｕ）のＦｒｏｇ、　ＮＨｃｌｅｉｃ　
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ・ａｎｄＭｏｌ、ＢｉｏＬ１６，７
５〜１２４（１９７６）’に参照されたい。

Ｎ４−アミノシチジンおよびＮ−アミノ−２′−デオキ
シシチジンならびにそれらのリン酸エステル（単量体お
よび一木調ポリヌクレオテドの両形体）のＮ−７ミノ基
は、置換ヒドラジン類に特徴的な反応性を有することが
知られており、従ってアルデヒド、ケト／、インチオシ
アネートおよびイミデート類と反応する。二ツタら：ネ
ギシら（１）；ハヤツのそれぞれの上記文献を参照され
たい。また、スミス（Ｐ、８ｍ１ｔｈ）　　著「開鎖有
機窒素化合物の化学（Ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏ
ｆ　０ｐｅｎ＝Ｃｈａｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｎｉｔ−
ｒｏｇｅｎ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）　Ｊ　Ｗ、Ａ、ベン
ジャミｙ　　工ｎｃａ。

ニューヨーク、■巻、１１９〜２０９頁（１９６６年）
を参照されたい。

ニックらの上記文献は、重亜硫酸塩の存在下でのポリシ
チジン中のシトシン成分とヒドラジンとのアミノ基転移
反応、およびグルタチオンとピルビｙａの付加物による
アミン基転移生成物の誘導体形成反応（この場合、付加
物はぎルピン酸のケト−炭素を介してＮ４−アミノ基と
反応する）を報告している。

発明の要約 本発明はＮ４−（置換アミノ）シトシン（ここでアミノ
基上の置換基は標識成分を含む）へ修飾され九シトシン
成分を含む核酸プローブを提供する。

本発明はさらに、Ｎ−アミノシトシンへ修飾されたシト
シ／を有するポリヌクレオチドを提供し、このポリヌク
レオチドは本発明のポリヌクレオチドプローブの合成用
史間体である。本発明はまた、ちる種の標識成分ｉＮ−
アミノシトシン成分含有ポリヌクレオチドへ結合して本
発明のポリヌクレオチドプローブを作るために使用しう
る新規化合物、ならびにその新規化合物とＮ４−アミノ
シトシン成分含有ポリヌクレオチドとを反応させること
から成る本発明プローブの新規製造方法を提供する。

本発明プローブと標的ＤＮＡまたはＲＮＡとの二重らせ
んも本発明の一部であり、リポータ−グループと結合し
た二重らせんもまた同様である。

本発明のさらに他の面において、本発明は標的ＤＮＡま
たはＲＮＡに関連した生物学的物質の存在について試料
を検定する新規方法を提供する。

この方法は試料から訪導された一本鎖ＤＮＡまたはＲＮ
Ａと、その標的ＤＮＡまたは）（ＭＡに対して特異的な
本発明の核酸プローブとを組み合わせることから成って
いる。この方法は、プローブとその標的核酸の少なくと
も一部との間で安定な二重らせんが形成されるが、プロ
ーブと試料中に存在する非標的核酸との間の有意な二重
らせんの形成が排除される反応条件下で実施される。こ
の方法はまた、直接に標識成分からの信号を受信するか
、または標識成分に結合されたリポータ−グループから
の信号を受信することにより、安定な二重らせんを検出
することを包含する。

最後に、本発明は標的ＤＮＡまたはＲＮＡ（これは生物
学的物質が存在するときにのみ試料中に含まれるだろう
）に関連した生物学的物質の存在について試料を検定す
るためのキラトラ提供する。

このキットは標的ＤＮＡまたはＲＮＡ中の配列に相補的
であるが、試験すべき試料中のその他のＤＮＡまたはＲ
ＮＡとは相補的でない配列を有するポリヌクレオチドを
包含する。１つの実施態様において、このキットは、ポ
リヌクレオチドの他に、ポリヌクレオチド中のシトシン
成分をＮ−アミノシトシ／へ転化するための試薬を包含
する。

別の実施態様において、このキットはポリヌクレオチド
のシ、トシ／がＮ　４−　（置換アミン）シトシン（こ
こでアミノ基上の置換基は標識成分を含む）へ（ＩＳ飾
された本発明プローブを包含する。

発明の構成 本発明は、１つの面において、式Ｉ： ｌ 〔式中Ｒ１け（＋１　−Ｎ＝Ｃ（１？２）−Ｒ５−Ｒ。

（旧　　−ＮＨ−ＯＨ僚２）−Ｒ５”６または　（ｔｉ
ｌｌ　　−ＮＨ＜Ｃ−Ｒ３）ＮＨ−Ｒ５−Ｒ６であり、
ここでＲ２は水素または炭素原子数１〜４のアルキル基
であり、Ｒ３は硫黄または酸素であり、Ｒはリンカ−成
分であり、そしてＲ６は標識成分である〕 で表わされる修飾シトシン成分を含む核酸プローブに関
する。

シトシ／のＮ−位置に結合した式１のＲ０基の末端にあ
る窒素原子は、本明細臀中でＮ−アミノシトシン成分の
Ｎ−アミ廣呼んでいるそのアミノ基の窒素原子に相当す
る。

他の面において、本発明は上記プローブと、そのプロー
グにより試験された試料中のその標的ＤＮＡまたはＲＮ
Ａと、の間に形成された二重らせんを包含する。本発明
はさらに、プローブの標識成分に結合したリポータ−グ
ループを有するこの種の二重らせんを包含する。

さらに他の面において、本発明は標的ＤＮＡまたはＲＮ
Ａについて試料を試験する方法に関し、その方法は （１）　　標的ＤＮＡまたはＲＮＡと、その標的ＤＮＡ
またはＲＮＡに特異的な核酸プローブとを組み合わせ、
その場合前記プローブは式Ｉ： 〔式中Ｒ工は　（＋）　　−Ｎ騨Ｃ（Ｒ２）−Ｒ５−Ｒ
６（ｉｉ）−ＮＨ＝ＣＨ（Ｒｚ）−Ｒｓ−Ｒ６または　
（ｌｉｔ）　　−ＮＨ＜Ｃ−Ｒ３）ＮＨ−Ｒ５−Ｒ６で
あり、ここでＲ２は水素または炭素原子数１〜４のアル
キル基であり、Ｒ３は硫黄または酸素であり、Ｒ５はり
／カー成分であり、そしてＲ６Ｆｉ標識成分である〕 で表わされる修飾シトシン成分を含み、また、試料から
の一本鎖核酸の誘導ならびにその一本鎖核酸とプローブ
との組合せは、プローブと標的核酸の少なくとも一部と
の間で安定な二重らせんが形成されるが、プローグと非
標的ＤＮＡまたはＲＮＡとの間では有意に形成されない
条件下で行われ；そして （ＩＩ）　　（ａ）工程（１）で二重らせんを形成した
プローブから、二重らせんを形成しないプローグを分離
し；（１））標識成分Ｒ６がリポータ−グループのその
標識成分への結合により検出される場合、二重らせんを
形成したプローブと標識成分に結合するリポータ−グル
ープとを、そのリポータグループが存在する標識成分の
少なくとも一部に結合する条件下で組み合わせ、次いで
、このように処理された生成物から標識成分に結合され
ないリポータ−グリープの実質的に全部を分離し；（Ｃ
）工程（１）（ａ）および必要に応じて工程（１）（１
）Ｊでの処理後、工程（１）の生成物を処理して、標識
がリポータ−グループの結合なしに検出可能な信号を発
する場合はその標識から、もしくは標識に結合したリポ
ータ−グループから信号を発生させ；そしてＴｄｌ検出
可能な信号が工程１１）（ｃ）の処理により発生したか
どうかを測定する：ことから成っている。工程（１１（
（りの処理は信号を発生する標識成分またはリポータ−
グループにより、また発せられる信号のタイプによｐ変
化するだろう。例えば、信号が螢光の発光である場合そ
の処理は標識成分またはリポータ−グループからのその
発光を刺激するのに適した波長の電磁線へ暴露するだけ
でよい。その他の例を挙げると、信号がリポータ−グル
ープの一部である酵素により触媒される反応からの可視
的な発色である場合、その処理は工程（Ｉｔ）（ａ）お
よび（１）（１）ｌの処理後の工程（１）の生成物と、
酵素のための基質および着色物質を生ずるのに必要なそ
の他の化合物との組合せを包含するだろう。検出可能な
信号が発生したかどうかについての工程（Ｉｔ）（（１
）の測定は、肉眼での観察または必要に応じて発生した
信号を検出するための適当な器具を用い九観察をともな
うだろう。また一般にこの方法は試験すべき試料（被験
試料）、プローブの標的セグメントをもつＤＮＡまたは
ＲＮＡを含まない既知核酸試料（陰性対照）、あるいは
可能であるならプローブの標的セグメントをもつＤＮＡ
またはＲＮＡを含む既知核酸試料（Ｉｓ性対照）を用い
て、これらの試料について平行して行われるだろう。こ
の方法が被験試料、陰性対照および陽性対照に対して平
行して行われる場合、測定はこれらの試料からの信号を
比較してこの検定系が機能的である（すなわち、陰性対
照からの６バツクグラウンド信号よりも大きい陽性対照
からの信号を生ずる）ことを確かめ、さらに被験試料か
ら検出された信号が１バックグラウンド信号よジ大きい
かどうかを確かめることを包含するだろう。被験試料か
らの信号がバックグラウンド信号より大きいと測定され
るときは、その被験試料の信号は被験試料中の標的ＤＮ
ＡまたはＲＮＡによるものとみなされる。

本発明はまた、生物学的物質が存在するときのみ試料中
に含まれる標的１）ＮＡまたはＲＮＡに関連したその生
物学的物質の存、在について試料を検定するための多数
のキットに関する。前記キットの１つは（１）シトシン
成芥ヲ含み且つ標的ＤＮＡまたはＲＮＡに特異的なプロ
ーブの塩基配列を有する所定量の核酸；および（ＩＩ）
前記量の核酸に含まれるシトシン成分の少なくとも一部
をＮ−アミノシトシン成分に転化するための試薬類；を
含む。別のキットはＮ−アミノシトシン成分を含み且つ
標的ＤＮＡまたはＲＮＡＫ：特異的なプローブの塩基配
列を有する核酸を包含する。本発明によるさらに別のキ
ットは磯釣ＤＮＡまたはＲＮＡＫ４？異的な核酸プロー
ブを含み、そのプローブは式Ｉ：〔式中Ｒ□は　（ｉ）
　−Ｎ＝Ｃ（ｌ（２）−Ｒ５−Ｒ６＋Ｉ＋３　−ａＨ−
ｃＨ＜Ｒ２）−Ｒ，−Ｒ６または　（ｌｉｔ）　　４Ｈ
（Ｃ−Ｒ３）ＮＨ−Ｒ５−Ｒ６であり、ここでＲ２は水
素または炭素原子数１〜４のアルキル基であり、Ｒ３は
硫黄または酸素で、ｌ、Ｒ５はリンカ−成分であり、セ
してＲ６は標識成分である〕 で表わされる修飾シトシン成分を含有する。

本発明はさらに式Ｌ■　： 〔式中Ｒ５□は−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ５□
１）−（ここでアミノ基はカルボニル基に結合し、Ｒ５
□□　は水素ま友は炭素原子数１〜４のアルキル基であ
る）であり：Ｒ５□は＝Ｃｏ２Ｒ，、−（Ｃｏ）Ｒ５４
、（ここでＲ５３は炭素原子数１〜５のアルキル基であ
り；Ｒ５４は水素、炭素原子数１〜５のアルキル基また
はクロルであり；　Ｒ５５％Ｒ５６およびＲ５□は同一
かまたは異なり、それぞれ炭素原子数１〜６のアルキル
基であ！’；Ｒ５８およびＲ５９は同−力、または異な
り、それぞれ炭素原子数１〜５のアルキル基であジ；Ｒ
６ｏは炭素原子数２または３のアルキル基である）であ
り；ｍは２〜２０であシ；ｘｓｏはＳまたはＳ＝Ｏであ
り；そしてＸ５□は０またはＮＨである〕 で表わされる化合物に関する。

本発明はまた、式ＸＸＸＩＩ　： Ｒ３□（Ｃｏ）　（ＧＨ２）ｋＲａａ　　　　　　ＸＸ
刈〔式中Ｒ３□は （ここでＸ３□は水素、〕１０ゲンまたは−Ｎｏ２であ
る）であジ、Ｒ３３は＝ＣＨ０、＝Ｃｏ□Ｈ１（ここで
Ｒ５８およびＲ５９は同一かまたは異なり、それぞれ炭
素原子数１〜５のアルキル基であり；Ｒ６０は炭素原子
数２または３のアルキル基である）であジ：そしてｋは
２〜２０である〕 で表わされる化合物に関する。

―ハロゲン”はフルオル、クロル、ズロムまたはヨード
を意味する。

本発明の別の化合物は式ＸＩ、Ｖ　　：Ｒ４５＜ＮＨ）
＜Ｃ−Ｒ４６）＜ＮＨ）（ＣＨ２）ｊＲ４７ＸＬＶ〔式
中Ｒ４５はフルオレセイ／、テトラメチルローダミンま
たはテトラエテルローダミ／であり；Ｒ４６は酸素また
は硫黄であり；Ｒ４７は＝ＣＨ０。

＝Ｃｏ２Ｈ、＝ＣＨ２Ｃ）Ｈ。

（ここでＲ５８およびＲ５９は同一かまたは異なり、そ
れぞれ炭素原子数１〜５のアルキル基であり；Ｒ６ｏは
炭素原子数２または３のアルキル基であり）であり；そ
してｊは２〜２０である〕で表わされる。

式Ｌｌｌ、ＸＸＸＩＩおよびＸＬＶ　　の化合物は本発
明の好適なプローブの製造用中間体である。

本発明はまた式Ｌ１％ＸＸＭＩおよびＸＬＶの化合物の
製造方法に関する。これらの方法は以下の実施例におい
て詳しく説明する。

本発明はさらに式Ｌ■　： 〔式中ＸｓｏはＳま念はＳ＝０であり；Ｘ５□は０また
はＮＨであり；Ｒ５□は−ＮＨ−ま友は−ＲＨ−Ｎ−〇
（Ｒ５１□）−（ここでアミン基はカルボニル基に結合
し、Ｒ５□□は水素または炭素原子数１〜４のアルキル
基である）であり；セしてｍは２〜２０である〕で表わ
される修飾シトシン成分を含む本発明の好適な核酸プロ
ーグの製造方法に関し、その方法はプローブと同じ塩基
配列ｔ？有し且つＮ−アミノシトンン成分を含む核酸を
、式ＬＸ　： （式中ｘ５０％　　ｘ５２　’　Ｒ５１およびｍは式Ｌ
ＡＸの化合物について先に定義した通りである）の化合
物と反応させることから成っている。より好適なｍの値
は５〜８である。Ｘ５ｏがＳＯであるとき、Ｘ５□はＯ
であるのが好ましい。好適にはＲ５□□は水素であり、
より好適にはＲ５□は−ＮＨ−である。

本発明はさらにまた式Ｌ■　： 〔式中Ｒ３□は （ここでＸ３□は水素、ハロゲンまたは−Ｎｏ２である
）であり：には２〜２０である〕 で表わされる修飾シトシン成分を含む本発明の別の好適
な核酸プローブの製造方法を包含し、その方法はプロー
ブと同じ塩基配列を有し且つＮ−アミノシトシン成分を
含む所定量の核酸を、式％式％： （式中Ｒ３□およびｋは式Ｌ■の化合物について先に定
義し九通りである）の化合物と反応させることから成る
。よυ好適なｋの値は５〜８である。

好適なＲ３□は次式： のアミノテアジアゾールーベンゾールアミト誘導体であ
り、最適にはこれらの誘導体のうちＸ３□が水素である
ものである。Ｘ３□が水素である誘導体は以後ＰＡＢＳ
ＡＴ　　（ｐ−アミノ−ベンゼンスルホンアミド−アミ
ノチアジアゾールの略）と称する。

他の態様において、本発明は式ＸＬＭ　　：！ （式中Ｒ４５はフルオレセイン、テトラメチルローダミ
ンまたはテトラエチルローダミンであり；Ｒ４６は酸素
または硫黄であり；そしてｊは２〜２０である） で表わされる修飾シトシン成分を含む本発明のさらに別
の好適な核酸の製造方法を包含し、その方法はプローグ
と同じ塩基配列を有し且つＮ−アミノシトシン成分を含
む所定量の核酸を、式ＸＬ■：Ｒ４５（ＮＨ）（ＯＨ４
４）（ＮＨ）（ＯＨ２）、ＣＨＯＸＬ■（式中Ｒ４５％
Ｒ４６およびｊは式ＸＬＶＩの化合物について先に定義
した通りである）の化合物と反応させることから成る。

より好適なｊの値は５〜８である。好適にはＲ４５がフ
ルオレセインまたはテトラメチルローダミンであり、Ｒ
４６が硫黄である。

プローブと同じ塩基配列を有し且っＮ−アミノシトシン
を含む核酸は、プローブと同じ塩基配列を有する所定量
の核酸とヒドラジンとを重亜硫酸塩の存在下に反応させ
て、前記量の核酸に含まれるシトシン成分の少なくとも
一部＝ｉＮ−アミノシトシン成分に転化することにより
得ることができる。

プローブの塩基配列を有する核酸は、当分野で知られた
種々のｉｎ　ｖｉｔｒｏ合成法、ならびに意図する塩基
配列を有する核酸の高性能液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）　　または当分野で知られた他の標準方法によ
る精製に従って製造することができる。マテツチ（Ｍａ
ｔｔｅｕｃｃｉ）およびカルサーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒ
ａ　）、ならびにビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）お
よびカルサーズのホスホルアミデート法を利用する段階
的同相自動合成法および意図する配列を有する核酸のＨ
ＰＬＣによる精製を含めたこれらの技法の１つを下記の
実施例Ｉにおいて詳細に説明する。

プローグの塩基配列を有する核酸を段階的１ｎｖｉｔｒ
ｏ化学合成法で製造する場合、全核酸の塩基配列は一般
にハイブリダイゼーション検定においてプローグとハイ
ブリダイズする標的ＤＮＡまたはＲＮＡの特定セグメン
トの塩基配列に相補的であるだろう。標的ＤＮＡまたは
ＲＮＡのこのセグメントはプローグに対応して標的セグ
メントと呼ばれる。

プローブの塩基配列ｔ−有する核酸はまた１ｎｖｉｖｏ
でも作ることができる。例えば、標的セグメントの塩基
配列を含む二本鎖核酸を単離する（例えばプローブを用
いて試験される生物学的物質の染色体ＤＮＡまたはエピ
ソームＤＮＡから制限工／ドヌクレアーゼにより切断す
る）か、またはそれを化学的に製造しく例えば画調を段
階的固相合成法により合成および精製し、次に画調をア
ニーリングする）、その後標準技法を使ってｐＢＲ３２
２のような標準クロー二／グベクター中でクローン化す
る。例えば、標的セグメント挿入物を含むｐＢＲ３２２
はプラスミドＤＮＡについての標準調製法を用いて大量
に生産することができ、それは染色体の複ｉｔ抑製し且
つプラスミドの複Ｍ’に高める之めに形質転換大腸菌を
クロラムフェニコールの存在下に多くの倍加時間の間増
殖させることを包含する。標的セグメント挿入物を含む
ｐＢＲ３２２は既知技法によって単離できる。標的核酸
が二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡである場合、前記ｐＢＲ３
２２の画調はプローグの塩基配列を有する核酸として有
用である。標的核酸が一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡである
場合、：ｐＢＲ３２２の画調のうち一方または他方がプ
ローグの塩基配列を有する核酸であるだろう。シトシン
のアミン基転移およびアミン基転移されたシトシンのＮ
４−アミノ基への標識成分の結合に関する化学的方法（
以下に詳しく説明する）は−重鎖の形のｐＢＲ３２２上
で実施され、それにより本発明プローブが製造される。

プロー１の塩基配列を有する核酸を得るための別の方法
は、標的セグメントヲ含む二本鎖セグメントヲ当分野で
知られ念、商業的に入手しうる線状バクテリオファージ
（例えばＭ１３ｍｐ８．Ｍ１３ｍｐ９．　Ｍｌ　３ｍｐ
１　ＢまたはＭ１３ｍｐ１９）のＲ１’ｆｉＤＮＡ内に
挿入し、その組換えＲＦ’ｕＤ　Ｎ　Ａで大腸菌の適当
な菌株（例えば当分野で知られた、商業的に入手しうる
大腸菌ＪＭＩＯＩまたは３Ｍ１０３）を形質転換し、形
質転換した大腸菌を既知技法により選択および培養し、
培地からファージを単離し、最後に標準技法によりファ
ージから一本鎖ファージＤＮＡを単離することである。

セグメントがＲＦ型ＤＮＡに挿入される場合、得られる
ファージ集団の半分は、渋りの半分に含まれる挿入物に
相補的な塩基配列の挿入物を含むＤＮＡ＝ｊ（［するだ
ろう。標的ＤＮＡまたはＲＮＡが二本鎖である場合、フ
ァージＤＮＡの両方のタイプがプローブの塩基配列を有
する核酸となるだろう。標的ＤＤＮＡ″またはＲＮＡが
一本鎖である場合、ファージＤＮＡの半分のみがプロー
グの塩基配列を有する核酸となるだろう。もちろん、尚
業者には明らかなように、標的セグメントを含むＤＮＡ
は、得られるファージ集団の全てが同じ挿入物を含むＤ
ＮＡを有し且つ得られるファージＤＮＡの全てがプロー
ブの塩基配列を有する核酸となるように、Ｒ１ｉ’型１
１１Ａ内に非対称的に挿入することができる。ファージ
ＤＮＡは、シトシンをアミノ基転移させ、アミノ基転移
嘔れたシトシ／のＲ４−アミノ基に標識を結合させて本
発明プローブを製造すべく、以下に述べるように化学的
に処理されるだろう。

プローブの塩基配列を有するＲＮＡは、２′−デオキシ
リボヌクレオシドの代わりに適切に保護されたりボヌク
レオシドを用いることにより、１ｎｖｉｔｒｏ　化学的
方法で製造することができる。また、プローグ配列金も
つＲＮＡは適当なりＮＡ鋳型を用いて既知方法により酵
素的に調製できる。

ＲＮＡ中のシトシンはＤｊＪＡについて以下に述べるの
と本質的に同じ化学的方法を使ってアミノ基転移され、
続いて標識に結合される。

また、最初にプローグ配列をもつ核酸を製造し、次にそ
の核酸中のシトシ／をアミノ基転移嘔せる方法とは別に
、プローブと同じ塩基配列を有し且つＲ４−アミノシト
シンを含む核酸が、Ｎ−アミノ基転移／またはＮ−アミ
ノ−２′−デオキシシチジ／の適当な類似体を使用して
、酵素的方法および固相法を含めたｉｎ　ＶｉｔｒＯ合
成法により直接に製造される。

さらに他の面において、本発明はＮ−アミノシチジンま
たはＮ−アミノ−２′−デオキ７シチジ／の適切に保護
された類似体を用いる段階的面相合成法により、本発明
プローグの核酸前駆体を製造する方法を提供する。実施
例用はマテツチとカルサーズ、およびビューケージとカ
ルサーズのホスホルアミデート法を利用するこの種の方
法を教示している。実施例■１の教示を考慮して、例え
ばトリエステル法のようなポリヌクレオチドのその他の
段階的化学合成法（溶液法または同相法）を含めた類似
の方法が当業者には明らかだろう。

最後に、本発明はへ一アミノシチジ／およびＲ４−アミ
ノ−２′−デオキシシチジンの新規な、保護された類似
体に関し、これらの類似体は本発明プローブの核酸前駆
体の段階的ｉｎ　ｖｉｔｒｏ合成のために本発明により
提供される方法において利用される。これらの類似体ρ
いくつかは実施例■に記載され、記載されたものから、
他のものが当業者には明らかとなるだろう。

先に示したように、本発明プローブの好適な標識成分は
ビオチン、イミノビオチン、スルフェニルビオチン、ア
ミノチアジアゾール、スルファニルアミド、ＰＡＢＳＡ
Ｔ、フルオレセイ／およびテトラメチルローダミ／であ
る。ビオチンとＰＡＢＳＡＴが最適である。それらは好
ましくはヒドラ１フ合および炭素原子数２〜２０（好ま
しくは炭素原子数５〜８）のｎ−アルキル鎖を介してＮ
−アミノシトシンのＮ−７ミノ基に結合される。

ヒドラジン結合を有するプローグは、ヒドラゾン結合を
有するプローグの形成後そのプローグ（結合標ｌｌ＆ヲ
有する）を単に還元することにより、ヒドラゾン結合を
有するプローブから製造される。

標識が式−（Ｃ−Ｒ３）Ｒｋｌ−の結合基（ここでＲ３
は酸素まｆｃは硫黄であり、好ましくは硫黄である）お
よびリンカ−成分Ｒ５（好ましくは炭素原子数２〜２０
、より好ましくは５〜８のｎ−アルキル鎖）を介してＲ
４−アミノーシトシ／のＲ４−アミノ基に結合している
プローブは、式Ｒ３＝Ｃ，Ｎ−Ｒ５−Ｒ。

（ここでＲ６は標識成分、好ましくは本発明の好適な８
種類の標識成分のうちの１つである）のインシアネート
またはイソチオシアネート−誘導体化標識成分を最初に
作り、次にプローブと同じ塩基配列を有し且つＮ−アミ
ノシトシン成分を含む所定量の核酸を式Ｒ３＃Ｃ−Ｎ−
Ｒ５−Ｒ，の化合物と反応させることによ！Ｉｎ造され
る。

式Ｒ３＝Ｃ−Ｎ−Ｒ５−Ｒ６の化合物は、最初に式ＮＨ
２−Ｒ５−Ｒ６のアミノ−誘導体化標識成分を作り、次
に式Ｉ（２Ｎ−Ｒ，−Ｒ６の化合物をチオホスゲ／また
はホスゲンと反応させることにより、有機化学の分野に
おいて知られた方法を用いて製造される。

ビオチン、イミノビオテ／またはスルフェニルビオチン
標ａｔ有するプローブは、プローグ（好ましくは標的と
のハイブリダイゼーション後）とリポータ−グループ（
標識に対する複合タンバク質としてのストレプトアビジ
ンまたはアビジン分子を含む）との複合体を形成させた
後、リポータ−グループから信号を発生させることによ
り検出できる。発信方法はストレプトアビジンまたはア
ビジン以外にどんな化合物がリポータ−グループに含ま
れるかに依存している。ビオチ／に結合するためのアビ
ジ／またはストレプトアビジ／を■する数種のＩＪ　ホ
ーターグループは当分野で知られており（例えばワード
ら、イングルノ・−トら、クラウスナーおよびウィルソ
／のそれぞれの上記文献を参照されたい）、例えば米国
ニューヨーク州ニューヨークのエンゾ・バイオケミカル
ズ社、米国メリーランド州ガイサースバーグのベテスダ
・リサーチ・ラボラトリーズおよび米国カリフォルニア
州バーリ／ガムのベクター・ラボラトリーズから市販さ
れている。これらのグループにはストレプトアビジンま
たはアビジン−ＤＨと複合体を形成し念酸性ま友はアル
カリ性ホスファターゼ（ホスファターゼにより生じた生
成物を比色定量法により検出）、ストレプトアビジンま
たはアビジン−ＤＨと複合体を形成した西洋ワサビペル
オキシダーゼ（イルオキシダーゼにより生じた生成物を
比色定量法により検出）、およびストレプトアビジン単
独（ストレプトアビジンに結合したフルオレセイン−標
識抗−ストレプトアビジン抗体を螢光測定法により検出
）が含まれる□好適な系はりアリ−（Ｌｅａｒｙ）らＰ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃｉ（ＵＳＡ）
８０．４０４５〜４０４９（１９８３）に記載されるよ
うなアビ：）ｙ−ＤＨ−ビオチニル化アルカリ性ホスフ
ァターゼ重合体系である。

アビジン−ＤＨは米国カリフォルニア州バーリンガムの
ベクター・ラボラトリーズから入手し得る高純度のアビ
ジンである。ベクター・ラボラトリーズ以外から入手し
得る高純度アビジンも本発明に使用することができる。

標識としてアミノチアジアゾール、スル７アニルアミド
またはＰＡＢＳＡＴ　含有するプローブは、複合タンパ
ク質として炭酸脱水酵素（炭酸デヒド９ターゼ）を含む
リポータ−グループにより検出される。好適なリポータ
−グループは哨乳動物（好ましくはウシ）赤血球からの
重合炭酸脱水酵素Ｂであり、前記重合体はニブトン（Ｅ
ｐｔｏｎ）のＢｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　’Ｉ’ｒａ
ｎｓ、　５．２７７〜２７９　（１９７７）に記載され
るようにして製造される。結合した炭酸脱水酵素重合体
の好適な検出方法は、リアジーのＡｎｉｍ、　ｆ３］、
ｏｏｄ　Ｇｒｐｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｇｅｎｅｔ、
　９．６５〜６７（１９７８）に記載のフルオレセイン
ジアセテート検定法により行われる。また、リプセイ（
Ｌｉｖｅ−ｓｅｙ）のＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
７７、５５２〜５６１　（１９７７）を参照されたい。

その他の検出系（例えば炭酸脱水酵素への抗体結合に基
づく免疫学的方法）も使用しうる。さらに、アミノチア
ジアゾール、スルファニルアミドまたはＰＡｆ３ＳＡＴ
で標識された本発明プローブのためのリポータ−グルー
プとして、炭酸脱水酵素と、他の酵素とのへテロ重合体
を使用することができる。この種の他の酵素には検出系
がよく知られた酸性およびアルカリ性ホスファターゼ、
β−ガラクトシダーゼおよび西洋ワサビペルオキシダー
ゼが含まれる。例えばボラ−（ｖ０１１θｒ）らの′″
酵素結合免疫吸着検定法”、マニュアル・オツ・クリニ
カル・イムノロジー、ローズ（Ｎ。

Ｒｏｓｅ）およびフリードマ／（Ｈ、Ｆ’ｒｉｅｄｍａ
ｎ）編集、アメリカン・ソサイエテイ・フォー・マイク
ロバイオロジー、ワシントンＤ、Ｃ・、第２版（１９８
０）を参照されたい。ビオチン、標識炭酸脱水酵素もリ
ポータ−グループとして使用でき、そしてアビジンまタ
ハストレプトアビジンの結合によるビオチンの上記検出
系は全てその結合炭酸脱水酵素を検出するのに使用でき
る。

螢光標識成分を有するプローブは、リポータ−グループ
の結合なしに、当分野で知られた方法を使用する螢光分
光法により簡単に直接検出できる。

例えばバクマン（Ｂａｕｍａｎ）らの上記文献、バウマ
／らのＥｘｐ、　Ｃｅ’ｌｌ　Ｒｅｓ、　　１２８．４
８５〜４９０（１９８０）を参照されたい。

本発明プローブは標準的な、既知の核酸ブローズハイプ
リダイゼーショ／検定法を使用するその標的ＤＮＡまた
はＲＮＡ（およびその標的に関連し次生物学的物質）に
ついてのノ・イグリダイゼーション検定において使用さ
れる。マインコスおよびワールの上記文献およびそこに
引用烙れた文献を参照されたい。

試料の検定は一般に試料と大体同じ債の核酸を含むが、
標的セグメントを有するＤＮＡまたはＲＮＡｙ＆：含ま
ない既知フランク（陰性対照）の検定と平行して行われ
、また標的ＤＮＡ−！たけＲＮＡを含む既知試料（陽性
対照）の検定も平行して行われるだろう。

被験試料（ｔたはプラ／りや陽性対照）の検定は一般に
次のようにして進行するニ 一般に、検定は一本鎖核酸が非共有結合により固定され
るニトロセルロース紙のような固体支持体上で実施され
るだろう。

試料の核酸は単離して、一本領の形で固体支持体に固定
する。これらの単離および固定方法は、試料中に存在す
る標的核酸のプローブに対応する標的セグメントが実質
的に全部完全なままで残るように行われる。

次いで、固体支持体はプローブの非特異的結合に利用さ
れる支持体上の部位を実質的に排除するためにプレハイ
ズリダイゼーションヲ行う。

その後、標的セグメントに対して１０〜１０１２倍、一
般には１０３〜１０６倍モル過剰のプローグを含む溶液
を固体支持体と井に緊縮条件下で、プローグとフィルタ
ー上の標的セグメントの実質的部分（好ましくはほぼ全
部）との間で安定な二重らせんが形成されるのに十分な
時間であるが、プローグと標的セグメント以外のセグメ
ントとの間で荷量な程度の二重らせんが形成されない時
間の間インキュベートする。

その後、実質的に標的セグメントと安定な二重らせんを
形成したプローグのみがその系中に要るように、二重ら
せんを形成しないかまたは部分的に形成したプローブは
、緊縮条件下で通常短時間（分）にわたり洗浄（一般に
は２回または３回）して除去する。

プローブを使用する検定に、許容できる特異性および感
度を与えるノ・イズリダイゼーショ／およびその後の洗
浄のための適当な緊縮条件および時間を、特定のプロー
ブおよび固体支持体について決定することは、当業者に
よって容易であるだろう。マインコスおよびクールの上
記文献を参照されたい。

二重らせんを形成しないプローグをその系から洗いおと
した後、プローブを検定可能にするために標識成分にリ
ポータ−グループを結合しなければならない場合、プロ
ーブの標識成分に結合するリポータ−グループの溶液を
固体支持体と共にインキュベートする。一般に、標識成
分に対して１０〜１０　倍、通常１０〜１０倍モル過剰
のリポータ−グループがその溶液中に含まれ、インキュ
ベーショ／はその系中の実質的に全ての標識がすｙＮ−
ターグループと結合するのに十分な時間にわたって行わ
れるだろう。その後、結合しなかつ九すポーターグルー
プ全その系から洗いおとす。

この場合もまた、実質的に全ての標識がリポータ−グル
ープと結合し且つ標識と結合しなかったリポータ−グル
ープが系中に残存しないようにするためのハイブリダイ
ゼーション条件およびその後の洗浄条件を決定すること
は当業者にとって容易であるだろう。

続いて、この系を適切に処理して標識成分から（プロー
ブを検出可能にするリポータ−グループを標識成分に結
合する必要がない場合）、あるいはリポータ−グループ
から信号全発生させる。その後、この種の信号が発生し
次かどうかを測定する。

陽性対照を使用する場合、その陽性対照からの信号をブ
ランクからの信号と比較してその検定系が機能的である
ことを確かめる。もしその系が機能的であるならば、陽
性対照からの信号はブランクからの信号より大きいだろ
う。

被験試料からの信号はグラ／りからの信号と比較する。

被験試料からの信号がブランクからの信号より大きい場
合、その試料中には標的セグメントが存在することにな
る。

今や、本発明を次の実施例で説明する。

実施例Ｉ ポリヌクレオチド９ 自動化され九固相ホスホルアミデート法〔マテツチおよ
びカルサーズのＪ、Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ。

１０３．３１８５（１９８１）；ビューケージおよびカ
ルサーズのＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　１　
ｇ　Ｂ　１．　Ｉ　Ｂ　５　ｇ〜１８６２参照〕により
、モデル３８０Ａアプライド・バイオシステムズＤＮＡ
合成機（米国カリフォルニア州　フォスターシティ−、
アプライド・バイオシステムズ社）ｔ−使って次のポリ
デオキシリボヌクレオチド類を合成した。この合成機で
製造したオリゴヌクレオチドは５′末端と３′末端の両
方に遊離ヒドロキシル基を有していた。この合成機で製
造したいろいろな長さのポリデオキシリボヌクレオチド
類の混合物から、最も長いもの全単離し、そしてフラン
ク（Ｆｒａｎｋ）らのＮＨｃｌ、　ＡｃｉｄｓＲｅｇ、
１１，４３６５〜４３７７（１９８，３）　　に記載さ
れるような高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
〔ポリデオキシリボヌクレオチ）＃全溶離するためにア
セトニトリル／　０．　Ｉ　Ｍ酢酸トリエチルアンモニ
ウム（ｐＨ７，３）の練状勾配を使用〕で精製した。

ポリヌクレオチド　Ａ： ５’　−ＧＡＡＧＧＧＧＴＡＴＣＴＴＴＧＧＡＴＡＡＡ
ＡＧ−３’ポリヌクレオチド　Ｂ： ５’　＝ＣＣＡＣＧＡＣＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＧＡＴＡ
ＴＣ！−３／ポリヌクレオチド１　Ｃ： ５’　＝ＣＣＡＧＧＣＣＡＧＣＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＣ
ＣＧＧＧＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧ−３／ポリヌクレオチド
Ａの塩基配列はサツカロミセス−セレビシェ（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα交配
因子遺伝子のセグメントのそれに相補的である。ポリヌ
クレオチドＢの塩基配列はピテア・パストリス（Ｐｉｃ
ｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）のアルコールオキシダーゼ
遺伝子のセグメントのそれに相補的である。ポリヌクレ
オチドＣの塩基配列はニブスタイ／−バールウィルス（
Ｅｐｓｔｅｉｎ−ｊ３ａｒｒ　ｖｉｒｕｓ）ゲノムのセ
グメントのそれに相補的である。

ネギシらの上記文献（１）および（ＩＩ）に記載の方法
に使ってデオキシシチジンをＮ−アミノデオキシシチジ
／に転化した。１．０９（４，４ミリモル）のデオキシ
シチジン（米国カリフォルニア州う・ジョン、カルバイ
オケムーベーリング）に１０ｄの４Ｍヒト９ラジ／、０
．１Ｍ重亜硫酸塩、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ７，０に調整するため）を加え、この溶液を６０℃
で４時間撹拌した。次に、９０−の９５％エタノールを
加え、この混合物を一２０℃で一晩放置し念。緩衝塩類
を濾過により除き、Ｆｇを減圧濃縮して粘稠な油状物を
得た。

無水エタノールを加えて２７０■（２５％）の半固体の
Ｎ−アミノ−２′−デオキシシチジン會得り。

１０１ｎ９＜　０．０４１ミリモル）のＮ−アミノ−デ
オキシシチジンに、５−の５０％水性メタノール中の１
０〜（０，０５１ミリモル）の４４−ジニトロベンズア
ルデヒドを加えた。２５℃で１５分撹拌後、形成された
橙色の沈殿物を戸数した。このヒドラゾンを溶離剤とし
て１０％メタノール／クロロホルムを使用するシリカゲ
ルのクロマトグラフィーにより精製した。ピーク分画を
減圧濃縮後、１２ｍｑ（７０％）のＮ−アミノ−デオキ
シシチジン−２，４−ジニトロフェニルヒドラゾンを単
離し、ＮＭＲスにクトルにより測定した。さらに、この
生成物はｕ　Ｖ／　’Ｉ　ｉ　８スペクトルにより同定
して３７５ｎｍにおいて吸光係数１８０００　（ジメチ
ルスルホキシド（ＤＭＳＯ）　：水、１：２０）　　を
与えた。

ポリヌクレオチド中のシトシ／を、４Ｍヒドラジンと１
Ｍ重亜硫酸ナトリウムの混合物（０，１Ｍす／酸ナトリ
ウムでｐＨ７に調整）中３７℃でインキュベートするこ
とにより修飾し、この場合ポリヌクレオチドはシトシン
の濃度が約１．０〜１００μＭとなるような濃度で溶解
し念。これらの条件で、一本領ポリヌクレオチド中のシ
トシンはｔ−が約３０分である偽−次反応速度でもって
Ｎ−アミノシトシンへ転化された。完全な転化は約４時
間で起こった。

一般反応において、２００μ９のポリヌクレオチドＡ　
？　０．５プの４Ｍヒドラジン、１Ｍ重亜硫酸ナトリウ
ム（す／酸ナトリウム緩衝液でｐＨ７，０に調製）中３
７℃でインキュベートした。アミノ基転移の反応速度は
２通りの方法で測定した。１つの方法において、ヒドラ
ジ／と重亜硫酸塩をポリヌクレオチドからゲル透過クロ
マトグラフィーで分離することにより、いろいろな反応
時間後に反応を停止させ、その後１容量のポリヌクレオ
チド溶液を０．１容量のジメチルホルムアミド（ＤＭＩ
’　）中の２４−ジニトロベンズアルデヒド（２０〜／
　ｍｅ　）の溶液と２３℃で３０分反応させ、続いて第
２ゲル透過クロマトグラフイーを行うことにより　Ｎ４
−アミノシトシンの量を測定した。形成され友４４−ジ
ニトロフェニルヒドラゾンー誘導体化ホリヌクレオテド
の量は分光光度計により測定した。他の方法では、ポリ
ヌクレオチドをヘビ毒ホスホジェステラーゼで完全消化
し、その後ＨＰＬＣで単量体を分析することにより反応
速度全測定し次。両方の分析方法とも岡じ結果を与えた
。ポリヌクレオチドの修飾は４時間以内に完了し、約３
０分で半分が完了した。

ポリヌクレオチドプローブは実施例Ｉの固相ホスホルア
ミデート法を使用して、特定位置に４−アミノシトシｙ
を含むように合成することができる。これとは対照的に
、実施例■の方法はポアソン分布の数学および最近接作
用（ｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒθｆｆθｃｔｓ
　）によって決定される、ポリヌクレオチド中の修飾シ
トシンのランダム分布をもたらす。

特定位置にシトシンの代わりにＮ−アミノシトシンを有
するポリヌクレオチドを合成するために、適切に保挿さ
れたＮ−アミノシチジンｔ＊ｈｎ−アミノ−２′−デオ
キシシチジンが自動合成の適当な段階でシテジ／または
２′−デオキシシチジンの代わりに使用される。

シテジ／または２′−デオキシシチジ／は実施例Ｈの方
法〔ネギシらの上記文献（Ｉｌ）も参照〕により４Ｍヒ
ドラジンおよび０．１　Ｍ重亜硫酸ナトリウムの溶液中
で６０℃、４時間インキュベートすることにより、対応
するＮ−アミノ類似体へ変換した。

このＮ−アミノ類似体はネギシらの上記文献（Ｉｌｌに
記載の方法で単離および精製した。

次に、Ｎ−アミノ−修飾ヌクレオシドをその他のヌクレ
オシドと同じ方法で自動合成において使用するために保
膿した。詳細には、Ｎ−アミノ基と、３′および５′ヒ
ドロキシル基を塩化ぺ／ジイルでベンゾイル化した。そ
の後３′および５′ヒドロキシル基を選択的加水分解に
より遊離させた。５′ヒト９０キシル基は４′−ジメト
キシトリチルクロライドでトリチル化し、３′ヒドロキ
シル基はメトキシモノクロル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル
アミノホス７エートでホスホアミダイト化した。

得られたシチジンまたは２′−デオキシシチジンのＮ−
アシル、５’−トリチル、３′−ホスホアミダイト誘導
体を自動合成の適当な段階で使用して、意図する配列の
杉酸を合成し友。得られ７′ｃ修飾ポリヌクレオチドの
Ｎ−アミノ基からのベンゾイル基の除去は、ポリヌクレ
オチドヲ樹脂から切り離す際にその他の保護基の除去と
一緒に進行する。

この実施例においては、１個以上のシトシン成分の代わ
りにＮ−アミノシトシンを含むように修飾されたポリヌ
クレオチドと反応して、標識成分としてのビオテ／を修
飾シトシンのＮ−アミノ基を介して結合させることによ
り本発明プローグを製造し得るビオチン−リンカ−化合
物のいろいろな合成方法を提供する。

種々の方法において、ビオチン類似体の代わりにイミノ
ビオチン類似体が使用できる。さらに、本実施例で製造
されたビオチンリンカ−アルデヒド化合物は混和な酸化
条件下で酸化することによりスルフェニルビオチンへ酸
化される。イミノビオチン（環に結合した酸素原子がＮ
Ｈと置換されたビオチン）およびスルフェニルビオチ／
（硫黄原子がスルフェニル基と置換されたビオチ／）は
水方ともアビジ／およびストレプトアビジンに対して高
い結合親和性を有し、そのために本発明プローグの有用
な標識成分となり得る。

ｆＡＩ　　アルコール中間体ＡＭるビオチ／−リンカ−
アルデヒドの合成： この方法は反応式Ｉに示される。

化合物Ｖ（６−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−１−
へキシルトリフルオルアセトアミド）は次のようにして
合成した： 乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＩ’）　１２．５１１
Ｌｌ！中の６−ドリフルオルアセトアミドー１−ヘキサ
ノール１．００９（４，８ミリモル）およびイミダゾー
ル０．４１９　（６，０ミリモル）にｔ−ブチルジメチ
ルシリルクロライド０．９１９（６，０ミリモル）を２
３℃で加えた。この溶液を３時間撹拌した。溶媒を除き
、試料を高真空下に乾燥した。次に、その固体ｆ　２０
　ｖ／ｖ％酢酸エ酢酸エチル／ヘキサ台した。有機層を
無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して無色油状の化
合物Ｖ１．４０９（８９，６％）を得た。

弐■の化合物（６−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−
１−ヘキシルアミン）は次のようにして合成した： 式■の化合物１．１０９（３，４ミリモル）に７５Ｖ／
　７％メタノール水溶液１８罰、次いで炭酸カリウム０
．７０９（５ばリモル）゛を加えた。この溶液を２３℃
で１５時間撹拌した。溶媒を除き、固体を２０　ｖ／ｖ
％酢酸エ酢酸エチル／ヘキサ台溶媒で抽出した。有機層
全無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して淡黄色油状
の化合物ｉＶ０．７２９（９１％）を得た。

弐■の化合物（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン
）はベラカーらの方法〔Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、６　＆　２６０４　（
１９７１）参照〕に従って次のように合成した： ビオテン（式■の化合物）は米国ミズジー州セントルイ
ス、シグマ・ケミカル・力／パニーカラ入手したＤ（＋
ｌ立体配置のものｔ使用した（カタログ番号Ｂ４５０１
　）。ビオチｙ２４０ｗＩ（１，０ミリモル）を乾燥Ｄ
ＭＦ’５ｄに溶解した。このビオチン溶液にジシクロへ
キシルカルボジイミド（米国ウイスコンシ／州　ミルウ
オーキー、アルドリッチ・ケミカル社から購入）　２１
０７ｎｇ（１，０ミ’Ｊモル）およびＮ−ヒドロキシス
クシンイミド１２０”９　（１，２ミリモル）を加え、
得られた溶液ヲ２３℃で１５時間撹拌した。生成した沈
殿物を濾過により分離した。その後、ろ液を減圧下で蒸
発させ、得られた殉留物をエタノールで２回洗い、最後
に熱アセトニトリルから再結晶して融点が２１６〜２１
８℃の白色結晶生成物（化合物■）２３０〜（６４％）
を得た。

式■１の化合物は次のようにして合成した：Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミドビオチン（式■の化合物）１ｏｏｑ
（０，ａミ＋ｊモル）に、乾燥ＤＭＦ１０ｍ中のＮ、Ｎ
−ジメチルアミノピリジン３７■と６−ｔ−ブチルジメ
チルシリルオキシー】−ヘキシルアミン（式■の化合物
）１０４〜とを加えた。この溶液を２３℃で１６時間撹
拌した。

次にこの溶ｉ’ｉ濃縮し、２０　ｖ／ｖ％／ｖ％−ル／
クロロホルムを使用する７ラツシユクロマトグラフイー
により生成物を単離した。１−ｔ−ブチルジメチルシリ
ルオキシ−６−ビオチニル−へキシルアミド（弐ｍの化
合物）１２６ｒｎｇ（９４％）を白色固体として単離し
た。弐■の化合物の赤外服ス投りトル（ＫＢｒ錠）は１
６４２　オ！び１７０４ｍ−’にピークを示した。弐ｍ
の化合物のプロトンＮＭＲス４ｐ）ｋ（ＤＭＳＯ−ｄ６
）　　は隼でのシフトで０．０２（−重線、５Ｈ）、０
．８６（−重線、９Ｈ）、２．９９（多重線、ＩＢ）、
３．５５（三重線、２Ｈ）、４．１２（多重線、ＩＨ）
、４．２９（多重線、ｘＨ）、６．３５（−重線、ＩＨ
）および６．４１（−重線、ＩＨ）にピークを有してい
た。

本明細書中で使用すゐ”フラッシュクロマトグラフィー
”　とはスｆｋ（ｓｔｔｘｇらのＪ　ｓ　Ｏｒ　ｇ　＝
Ｃｈｅｍ　。

４３．２９２３〜２９２５（１９７８）に記載の方法全
意味する。

式■の化合物（６−ビオチニルアミド−ヘキサンー１−
オール）は次のようにして製造した：ナカイらの方法（
Ｃｈｅｍ、　Ｌｅｔｔ、　１９７９．１４９９ｊｌ”参
照）に従ってシリル保護基を除くために、シリルエーテ
ル（弐■の化合物）１２６７７１ｇ（０，２９ミリモル
）を酢酸／水／テトラヒドロフラン（３：１：１、ｖ／
ｖ）の混合物で２３℃、２４時間処理し、それによりア
ルコール（弐■の化合物）５７ｍｇ（６０％）を得た。

式■の化合物を製造するために使用された別の方法は次
の通りであった： ＤＭＦ５ｍＪ中の化合物ＶＩＯ，５９（１，５ミリモル
）に６−アミノ−１−ヘキサノール０．１５９　（１，
３ミリモル）を加え、この混合物を２３℃で３時間撹拌
した。減圧濃縮および２Ｑ　ｖ／ｖ％メタノール／クロ
ロホルムｌｅ用するフラッシュクロマトグラフィーの後
、９４チの収率で化合物ＩＩｔ得、これは化合物■の酸
加水分解生成物とＮＭＲおよびＩＲが一致した。

最後に、式ＣＶのビオチン−リンカ−アルデヒドは次の
ように製造した： 式■のアルコール１０■（３０μＭ）に、塩化４メチレ
／１０ゴ中の重クロム酸ピリジニウム２８■（７５μＭ
）および３オ／ゲストロームのモレキュラーシーズ５０
巧を加えた。２３℃で３時間撹拌後、この反応混合物に
ジエチルエーテル３０ｍｇｔ加え、シリカゲル６０（米
国ウィスコンシン州ミルウオーキー、アルドリッチ・ケ
ミカル社から購入：メルク級）のプラグを通して濾過し
た。溶離液＋乾燥し、　　１０　ｖ／ｖ％メタノール／
クロロホルムを使用する７２７ツシユクロマトグラフイ
ーにより精製した。式Ｃｖのビオチン−リンカ−アルデ
ヒド３■＜Ａｏ％）を得た。

ｆＢｌ　　酸および酸塩化物中間体を経る合成：酸およ
び酸塩化物中間体を経るビオチン−リンカ−アルデヒド
の合成方法は反応式■に示される。

反応式■ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドビオチン（式■）２５０
７ｎ９（０，７３ミリモル）ニ、ＤＭＦ’５ｄ中（７）
８−アミンオクタン酸０．１１６９（０，７３ミリモル
）および０．１Ｍ！炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，５
）　　０．８−を加えた。この混合物を５５〜６０℃に
温め、その後２３℃に冷却した。２３℃で１４時間撹拌
後、溶媒を減圧除去し、固体全アセトニトリルから結晶
化して８−ビオチニルアミド−１−オクタン酸（式Ｘ）
０．２６４９（９３％）を得た。

８−ビオチニルアミド−１−オクタ／酸は塩化オキサリ
ルで処理して酸塩化物（式■）Ｋ転化した。化合物Ｘ　
１００ｍｑ（０，２６ミ’Ｊモル）Ｋへｙゼン（ＤＭＦ
２滴含有）６１中の塩化オキサリル０．１２５ｍ／（１
，４４ミリモル）１に加えた。２３℃で３０分後、反応
混合物を真空中で乾燥した。酸塩化物は新たに蒸留した
テトラヒドロ７ラン２゜ゴおよび５％パラジウム／硫酸
バリウム１７５ηを加えこの混合物に水素ガスを１２時
間吹き込むことにより、直接アルデヒドに転化した。反
応混合物のＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）による分
析は数個のスポット’を示し、そのうちの１つ（式Ｃ■
の化合物）が４４−ジニトロフェニルヒドラジンを噴霧
したとき陽性であり、アルデヒド化基の存在全示した。

（Ｃ）　　ビオチンヒドラジドからのす／カーアルデヒ
ド９の合成： ビオチン−リンカ−アルデヒド化合物の別の合成方法を
反応式■に示す。

反応式■ １，１０−デカンジアルデヒドは式ＸｆＶの１．１０−
デカ／ジオールから次のようにして展進した：１．１０
−デカ／ジオール４３６■（２，５ミリモル）を塩化メ
チレン２５ｄ中の重クロム酸ピリジニウム２．２６９（
６ミリモル）および３オ／ゲストロームのモレキュラー
シープ２．５ｇに加えた。

２３℃で２時間撹拌後、混合物のＴＬＣ分析はジオール
のジアルデヒドへの完゛全転化を示した。この反応混合
物をジエチルエーテル１００１１！／中に注ぎ、これは
順次シリカゲル６０のプラグを通過させた。プラグを塩
化メチレン５ｏゴで洗い、有機層を合わせて減圧濃縮し
、白色固体を得た。次いで、ジアルデヒドは、溶離剤と
してクロロホルムを使用するシリカゲル６ｏのクロマト
グラフィーにより精製した。澄明な油状物としてジアル
デヒド２５０■（５８％）を単離した。

式Ｃ■のビオチン−リンカ−アルデヒドはビオチン−ヒ
ドラジド（式ＸＩ［Ｉ）と１，１ｏ−デカ／ジアルデヒ
ド（式Ｘ［ｌ）とから次のようにして展進した： ビオチンーヒトリジド（米国カリフォルニア州すンジエ
ゴ、カルバイオケムーヘーリング社）７０’？（０，２
７ミリモル）にＤＭ１１′／Ｈ２０（２０：ｌｐｖ／ｖ
）５ＭＬｌ中の１，１０−デカ／ジアルデヒド１７５■
（１ミリモル）を加えた。２３℃で１時間撹拌後、’ｒ
　Ｌ　Ｃでの反応混合物の分析は生成物〔式Ｃ■の化合
物〕の存在を示した。ｌ　Ｑ　ｖ／ｖ％メタノール／ク
ロロホルムを使用するシリカゲルクロマトノラフイーに
より、ジアルデヒド゛とビオチン−リンカ−アルデヒド
とをはっきシ分離させた。クロマトグラフからのピーク
分画をプールし、乾燥して固体のビオチンアルデヒド（
式Ｃ■の化合物）８（１Ｆ９（７２％）を得た。式Ｃ■
の化合物の赤外線スペクトル（ＫＢｒ錠）は１６６４お
よび１７０３副　にヒータを示した。

前記方法において１，１０−デカンジアルデヒドの代わ
りにグルタルアルデヒドを使用すると、同様の結果が得
られ、その場合の生成化合物はアルデヒド基に連結した
アルキル鎖中に８個ではなく３個の炭素原子全有してい
た。

■）　ビオチ／−リンカーナセタールを経るリンカ−ア
ルデヒドの合成： 反応式■はビオテ／−リンカ−アセタール金繰るビオチ
／−リンカ−アルデヒドの合成を示す。

式Ｘ■の化合物（６−エチレンジオキシ−１−ヘキシル
アミン）は次のようにして６−アミノ−１−ヘキサノー
ルから３工程で製造した：０、０５　Ｍ重炭酸ナトリウ
ム（ｐＨ１ｏ）２０ｒｘｌ中の６−アミノ−１−ヘキサ
ノール４９　（３４ミリモル）にＳ−二チルトリフルオ
ルチオアセテート５．８ｘｅ（４５ミリモル）全２３℃
で撹拌しながら加えた。ＩＭＩＪａＯＨｉ用いてｐＨ９
，５〜１０に維持し１３時間後この水溶液をクロロホル
ム５０ａｅｆっで５回抽出した。クロロホルム溶液を無
水硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。クロロホ
ルムから再結晶して生成物（６−ドリフルオルアセトア
ミドー１−ヘキサノール）５．６９（７９％）を得た。

塩化メチレフ４０ｔａｌ中の６−ドリフルオルアセトア
ばビー１−ヘキサノール２．１９　（１０，１ミリモル
）に、重クロム酸ピリジニウム３９　（１０，６４ミリ
モル）および３オングストロームのモレキュラーシープ
４．４９を加えた。この反応を２３℃で３時間撹拌しな
がら進行させた。酢酸エテル２５０ｍｅ添加後、この反
応混合物をシリカゲル６ｏの小さなｆｆｌ全通して濾過
し、真空濃縮した。５０　ｖ／ｖチ酢酸エテル／ヘキサ
／を使用するフラッシュクロマトグラフィーにより、６
−トリフルオルアセドアミド−１−ヘキサナール１．４
８９（７０％）を得た。

塩化メチレン２１ｍＡ’中の６−ドリフルオルアセトア
ミド−１−ヘキサナール１．４９（６，８ミリモル）に
窒素下−７８℃でＬ２−ビス（トリメチルシリルオキシ
）臣タン１．８ｄ（７，４８ミリモル）およびトリメチ
ルシリルトＩノフルオルメタンスルホネート０．１４ゴ
（０，７３ミリモル）を加え、この溶液全一７８℃で３
時間、その後２３℃でさらに３０分撹拌した。この反応
混合物を塩化メチレン１００ｄ中に抽出し、次いで飽和
重炭酸ナトリウム溶液３０ｄで洗浄した。水層を塩化メ
チレン５０ｍ／で抽出し、有機層全台わせて無水硫酸マ
グネシウムで乾燥し、濃縮し、５０ｖ／ｖ％酢酸エチル
／ヘキサンでフラッシュクロマトグラフにかけ、それに
より生成物の６−ニチレンジオキシー１−へキシルトリ
フルオルアセトアミド１．３ｇ（７７％）を得た。

２　Ｑ　ｖ／ｖ％水／メタノール７、５　ｔｔｄｌ中の
６−ニチレンジオキシー１−へキシルトリフルオルアセ
トアミド０．３８０９（１，４９ミリモル）に炭酸カリ
ウム０．３９　（２，２ミ’Ｊモル）を加え、この反応
混合物を２３℃で１４時間撹拌し念。反応混合物を濃縮
後、ブライ／（飽和ＮａＣｄ水溶液）１５プ中に溶解し
、ジエチルエーテル５０ｍＡ’ずつで３回、さらにクロ
ロホルム５０ゴずつで４回抽出した。

有機層を乾燥し、合わせ、減圧濃縮して０１９９（８０
％）の油状物を得、これはブタノール／酢酸／水（４：
１：１）の混合溶媒で展開したシリカゲルプレート上で
ニンヒドリンにより着色した。

別法として、６−エチレンジオキシ−１−１−リフルオ
ルアセトアミドを１０％ピｄＩＪジ／／水で２３℃、４
５分処理することによジ、定量的収率で同じ転化反応が
進行した。反応混合物を凍結乾燥して目的化合物を全部
回収した。

式Ｘ■の化合物は式Ｘ■の化合物およびＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドビオチ／（実施例ＶＡに記載の方法で製
造される式■の化合物）から次のようにして製造した： 乾燥ＤＭＦ４ｍｌ中のＮ−ヒドロ上シスクシ／イミドビ
オチン０．０９０９（０，２６ミリモル）にＮ、Ｎ−ジ
メチルアミノピリジン０．０３２９　（０，２６ミリモ
ル）および６−エチレンジオキシ−１−ヘキシヤアミン
油状物（化合物１）ｏ、ｏｓ９（０，３１ミ’Ｊモル）
全加え、この混合物を２３℃で１４時間撹拌した。この
溶液を減圧下に濃縮し、続いてローバー（Ｌｏｂａｒ）
予備充填５ｉ６０カラム（西ドイツ国ダームシュタット
、メルク社ま念は米国ニューシャーシー州チェリーヒル
、ＥＥＭインダストリージー）での中圧液体クロマトグ
ラフィーヲ行うことにより、式Ｘ■の目的生成物［ビオ
チニル（Ｎ−６−ニチレンジオキシヘキシル）アミド］
０．０５９（５０％）を得た。式Ｘ■の化合物に対して
次のデータが得られた： 分子ｉ（高分解能質量スペクトル）： 計算値３８５．２０３５　、　　実測値３８５．２０３
９　　；元素分析：計算値Ｃ（５６，０８）、　Ｈ（８
，１０）ｊＮ（１０，９０）：実測値Ｃ（５５，７８）
、　Ｈ（８，０９）。

Ｎ（１０，７２ＣプロトンＮＭＲ（ＤＭＳ〇−ｄ６）（
咽でのシフト）：２．０４（三重線、２Ｈ）、　３．７
１−３．８９　（多重線、’１Ｈ）ｔ　４．１３（多重
線、ＩＨ，）、４．３０（多重線、ＩＨ）４．３旧冬重
線、ＩＨ）、４．７４（三重線、ＩＨ）、６．３５（−
重線、ＩＨ）、６．４２（−重線、ＩＨ）、７．７３＜
三重線、ＩＨ） 化合物Ｘ■のアルデヒド（ＣＶ）への転化は８０チ酢酸
水溶液で３７℃、３時間処理し、続いて凍結乾燥するこ
とにより定量的収率で行われた。

また、式Ｘ■の化合物のアセタール基の代わりに他のア
セタール基もアルデヒド襄造の際の保護基として使用で
きる。この種の他のアセタール保護基は当分野で知られ
ている〔グリーン（Ｔ、Ｇｒｅｅ−ｎθ）の″有機合成
における保護基（Ｐｒｏｔａｃｔｉｖｅ　）Ｇｒｏｕｐ
ｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　）　
”第４章、ウィリー＆サンズ、ニューヨーク（１９８１
）を参照されたい〕。−例として式Ｘ■Ａの化合物を示
す。

ＰＡＢＳＡＴ 本実施例ではＰＡＢＳＡＴの製法を述べる。この製法は
反応式■に示される。

ＰＡＢＳＡＴのハロフェニルマタハ二トロ７工二ル類似
体を製造するために、ｐ′″アセトアミド−ベンゼンス
ルホニルクロライド（式ＸＩＸの化合物）（７）　対応
ｔ　ルハロフェニルまたはニトロフェニル類似体が使用
される。

乾燥ピリジン４プ中のアミノチアジアゾール（ＸＸ）０
．２９　（１，１ミリモル）の溶液に０℃において、乾
燥ピリジ／３−中のｐ−アセトアミド−ベンゼンスルホ
ニルクロライド０．２８９　（１，１２ミリモル）の溶
液を滴下した。その後この反応混合物音２３℃に温めて
１６時間電磁撹拌した。減圧濃縮後、粗生成物全メタノ
ールに溶解し、活性炭で処理し、濾過し、減圧濃縮し、
塩化メテレ／／メタノール（６５：２５）’を使用する
フラッシュクロマトグラフィーで精製してペンゾールア
ミド誘導体（化合物Ｘ■）０．３１９（７５％）を得た
。

化合物Ｘ■０．１４９　（０，３７ミリモル）にｌＮ１
（ＯＡ？　３．５　ｄ′ｆｔ加え、この反応混合物を３
時間還流し次。冷却して、この溶液全水酸化アンモニウ
ムで中和し、減圧濃縮後白色固体を定量的収率で得、こ
れは純粋なＰＡＢＳＡＴ　＜式Ｘ■の化合物）であった
。

反応式■ 本実施例では、Ｎ−アミノシトシン成分を含むポリヌク
レオチドにＰＡＢＳＡＴ　（およびそのハロフェニル、
ニトロフェニル類似体）ヲ結合シ、ソれによって本発明
プロープヲ製造するのに適したす／カーアルデヒド化合
物の製造方法を説明する。

本実施例の方法は反応式■Ａおよび■Ｂに示される。

また、この方法はＮ−アミノシトシン含有ポリヌクレオ
チドにアミノチアジアゾールまたはスルファニルアミド
を結合して本発明ブローズヲ製造するための、これらの
化合物のリンカ−アルデヒドを製造する際にも使用でき
る。これは反応式ＶＩＢ中の式ＸＸｌのアセタールアセ
チルクロライドとの反応において、ＰＡＢＳＡＴ　’ｉ
アミノチアジアゾールまたはスルファニルアミドと置換
し、得られる式ＸＸＩＩのアセタールのアミノチアジア
ゾールまたはスルファニルアミド類似体からそれぞれア
ミノチアジアゾール−リンカ−アルデヒドまたはスルフ
ァニルアミド−リンカ−アルデヒドを製造することによ
り達成される。

反応式■Ａ 反応式■Ｂ ＸＸＩ 乾燥ベン４フ１５ｍ／中のブロモヘキサン酸１．１９（
５，７ミリモル）に、塩化オキサリル２ｄ（２３ミリモ
ル）およびＤＭ１’２滴を２３℃において加えた。反応
からのガスの発生がやんだ１０分後に、この溶液χ真空
濃縮し、粗塩化物を乾燥ＣＨ２Ｃ！２５ｄに溶解した。

この溶液にＣｆ（２（４２２ｄ中の２−メチル−２−ア
ミノメチル−１−プロパツール０．５５９　（６ミ！７
モル）を窒素下Ｏ℃で加え、この混合物？１５分撹拌し
、その後２３℃に温めｔ０真空濃縮後、過剰の塩化チオ
ニル？加え、３０分後反応混合物を減圧濃縮した。粗生
成物は５０％酢酸エチル／ヘキサンを使用するフラッシ
ュクロマトグラフィーによシ精製して、高純度の式豆■
のオキサシリ１０．７５９（５３％）全得た。

テトラヒドロフ２ン１ｄ中の２−（２−ブロモエチル）
−Ｌ３−ジオキソラン（式ＸＸ■の化合物）０．２２０
９（１，２ミリモル）に窒素下−７８℃でペンタン中の
ｔ−ブチルリチウムの１．７Ｍ溶液１．４ｄ（２，４ミ
リモル）を加え、この黄色溶液″ｆｒ：１５分撹拌した
。この溶液全窒素下二重尖端針（ｄｏｕｂｌｅ−ｔｉｐ
ｐｅｄ　ｎｅｅｄｌｅ）　ｆ用いてヨウ化第−銅０、１
２９　（０，６ミリモル）含有フラスコに移し、この反
応混合物を一７８℃で３０分撹拌した。この銅（ＩＩ）
酸塩（式ＸＸ■の化合物）に、テトラヒドロフ２ン１ｄ
中の式ＸＸＭのブロム−オキサゾール０．０５ｇ（０，
２ミリモル）の溶液を加え、−５０℃で５時間反応させ
、次いで２３℃に温めて２時間撹拌した。この反応混合
物を真空濃縮し、次いでメタノールに溶解してシリカゲ
ル−６０プラグを通して濾過することにより粗生成物を
得た。これは２０％酢酸エチル／ヘキサンを使用するフ
ラッシュクロマトグラフィーでｎｇし、澄明な油状物と
して純粋な式ＸＸ■のオキサシリ／−アセタール０．０
３９（５６％）を得た。

式ＸＸｖのアセタール−オキサシリ１０．０４０９　（
０，１５ミリモル）にヨウ化メチル０．５ｔ／’ｉ加え
、この混合物を２３℃で１６時間撹拌した。窒素流のも
とて濃縮後、ＩＮ水酸化ナトリウム溶液１１１ＬＩ！を
加え、この混合物を２３℃で１５時間撹拌した。１０％
塩酸で中和後、エーテルで抽出し、真空濃縮して式ＸＸ
■のアセタール−酸を得た。

乾燥ベンゼン２−中の式ＸＸ■のアセタール−酸０．０
３０９（０，１４ミリモル）に塩化オキサリル０．０５
ｍ（０，５６ミリモル）およびＤＭＦ’１滴？加えた。

この溶液？１０分撹拌して真空濃縮した。得られた油状
物（式ＸＸ■のアシルクロライド）をピリジン１Ｍに溶
解し、ＰＡＢＳＡＴ　＜式Ｘ■）　０．０４５９　（０
，１４ミリモル）をピリジ／１ゴの溶液として加えた。

この混合物を５時間撹拌し、次いで真空濃縮した。粗生
成物は３０％メタノール／クロロホルムヲ使用するフラ
ッシュクロマトグラフィーにより精製して式ＸＸＩＩの
アセタールーリ／カーイ／シールアばド誘導体を得た。

式ＸＸＩＩの化合物は８０％酢酸水溶液で３７℃、３時
間処理し、その後凍結乾燥することにより所望の式ＸＸ
ＩのＰＡＢＳＡＴ　　リンカ−アルデヒドへ転化した。

乾燥ピリジン１．５フ中のフルオレセイ／インチオシア
ネート１０．８１１１９（０，２８ミリモル）および６
−エチレンジオキシ−１−ヘキシルアミン２３ηｔｏ、
１４ミリモル）の混合物を２３℃で１時間撹拌した。こ
の溶液を減圧濃縮後、粗生成物を１０％メタノール／塩
化メテレ／を使用するフラッシュクロマトグラフィーで
！＃裏して、フルオレセイ／−リンカ−アセタールＩＩ
Ｗ！９（７２％）を得た。これは８０％酢酸水溶液で３
７℃、３時間処理し、続いて凍結乾燥することにより定
量的収率でアルデヒドへ転化した。

上記方法はテトラメチルローダミ／インチオシアネート
やテトラエチルローダミンインチオシアネートのような
他のインチオシアネート−誘導体化螢光成分を用いて実
施することにより、他の螢光標識成分−リンカ−アルデ
ヒドを製造することができる。

この方法はまた螢光成分のインチオシアネート誘導体の
代わりにインシアネート誘導体を用いても実施できる。

イノチオシアネート誘導体と同様に、イソシアネール誘
導体も知られている。

実施例■ 標識成分としてビオチニル、イミノビオチニルまたはス
ルフェニルビオチニルを有する本発明プローブを製造す
るために、実施例Ｖで製造したり／カーアルデヒド化合
物を使って次の方法を実施した： プローグの塩基配列を有するポリヌクレオチド１００μ
ｇを実施例■のように処理して、ポリヌクレオチド中の
約１０〜５０％のシトシン成分をアミノ基転移（Ｎ−ア
ミノ基転移／へ転化）Ｌ＆。

この溶液をセファデックスＧ−，２５スピンカラムに適
し、流出液を回収することにより修飾ポリヌクレオチド
を単離した。この流出液（約１５０μ！中に約７５μ９
のポリヌクレオチドを含む）にり／カー化合物溶液（Ｄ
ＭＳＯ中５η／ｄ）４０μノを加えた。３７℃で３０分
後、この混合物？セファデックスＧ−２５スピンカラム
に適し、標識ポリヌク　レオチドを流出液中に得た。

標識プローブの濃度は２６０ｎｍでのＵＶ吸光度により
定量し、ビオチニル化はプローブ溶液１μｌを３トロセ
ルロ一ス紙に点在させ、リアジーらの上記文献（１９８
３）　　に記載のようにしてアビジン−Ｄ）ｌおよびビ
オチニル化アルカリ性ホスファターゼポリマーを用いて
プローブを検出することにより確認し次。

標識としてＰＡＥＳＡＴ、　　アミノチアジアゾールま
たはスルファニルアミドを有する本発明プローズｔａ造
するために、次の方法を実施した：まず初めに、実施例
■の方法に従って、プローブの塩基配列？有するポリヌ
クレオチドを修飾して約１０〜５０％のシトシン、　Ｎ
　４−アミノシトシンに転化した。次に、修飾ポリヌク
レオチド（約１５０μ！中約７５μ９）を実施例■で製
造したスルホ／アミトリ／カーアルデヒド（例えば弐Ｘ
Ｍの化合物）の溶液ｔ　ＤＭＳＯ中５巧／ｍＡ’）５０
μｌと混合した。３７℃で３０分後、実施例■のように
スピンカラムクロマトグラフィーを使って、未反応アル
デヒドと標識プループとを分離した。

標識プループの濃度は２６０ｎｍでのＵＶ吸光度により
測定した。標識の結合は、実施例Ｘ■の方法に従って、
標識に結合した炭酸脱水酵素重合体リポータ−グループ
全検出することにより確認した。

標識成分としてフルオレセインまたはテトラメチルロー
ダミンを有する本発明プローブ？製造するために、次の
方法を実施した： まず第一に、実施例■の方法に従って、プローグの塩基
配列？有するポリヌクレオチド全修飾して約１０〜５０
％のそのシトシｙｆＲ−アミノシトシ／へ転化した。次
に、修飾ポリヌクレオチド（約１５０μｊ中約７５μ９
）を実施例■で製造し九フルオレセインーリッカーアル
デヒドまたはテトラメテルロ−ダミノーリンカ−アルデ
ヒドの溶液（ＤＭＳＯ中５　’ｎ９／　ｍｅ　）　５Ｃ
１／と混合シ次。３７℃で３０分後、実施例■のように
スピンカラムクロマトグラフィーを使って、未反応アル
デヒドと標識プローブとを分離した。

標識プローブの濃度は分光法により測定し、螢光標識の
結合は螢光発光ス被りトルにより確認し念。

ハイブリダイゼーション検定における本発明プローブの
能力はサザ／（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ハイブリダイゼーシ
ョン法により証明した。

ポリヌクレオチ）”Ｂ（実施例１）？実施例■１に従っ
て１０分反応させることによジアミノ基転移きせ、それ
によりポリヌクレオチド１分子あたり平均して１〜２個
のシトシ／ｉＮ−アミノシトシンへ転化した。次に％Ｎ
−アミノシトシン含有ポリヌクレオチドを実施例■に従
って式Ｃ■のリンカ−アルデヒドでビオチニル化した。

このビオチニル化ポリヌクレオチドを使ってブザ／法を
行った。

アルコールオキシダーゼ遺伝子のコーディングセグメン
トの一部である７３０塩基対のＨｌｎｄｌｌ−５ａｌｌ
　ＤＮＡ　７ラグメ／トをピチア・パストリス（Ｐｉｃ
ｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉθ）から標準方法により単離し
た。エリス（Ｅｘｌｔｓ）　　らのＭｏｌ　、Ｃｅ１ｌ
ｌ　、ＢｉｏＪ。

５．１１１１〜１１２１（１９８５）を参照されたい。

標準方法を使って、このフラグメント全大腸菌ＪＭ１０
３中のＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９　内でクロ
ーン化した。Ｍ１３ｍｐ１８　　クローンはポリヌクレ
オチドＢと同一の塩基配列のセグメントヲ有するＤＮＡ
を含むファージ會生産し、Ｍｌ　３ｌｌ１９クローンは
ポリヌクレオチドＢと相補的な塩基配列のセグメント會
有するＤＮＡｙ含むファージを生産する。

それぞれのタイプのファージは標準方法により大腸菌Ｊ
Ｍ１０３を用いて大量に生産した。精製後、Ｍ１３ｍｐ
１８およびＭ１３ｍｐ１９ファージからのＤＮＡはマニ
ホールド■スロット・プロッター装置（米国ニューハン
プシャー州キー／、シュライサー＆シュネル社）を使っ
て別々のニトロセルロースフィルターに固定した。陽性
対照として、変性した二本鎖大腸菌プラスミドｐＵ０１
９に’同じ方法を使ってフィルターに固定した。各フィ
ルター上には５００ｎ９．１１００ｎ、１０ｎ９．１ｎ
９．１１００ｐ・１０ｐ９および１ｐ９のバンドでＩＩ
ＪＡヲ分配した。

固定は真空炉内８０℃でイーキングすることにより行っ
た。次に、フィルターは６　ｘ　Ｅ３ＳＰＥ。

Ｑ、　５　ｗ／ｖ％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
、］　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１！／ｍＡ’ニシン
精子ＤＮＡを用いて４２℃、２時間プレハイブリダイゼ
ーションを行った。その後、フィルターを次のようにし
てプローブとハイブリダイズさせたニル化ポリヌクレオ
チド３１μ９ を加えた。

ル化ポリヌクレオチドＢ１μ９ を加えた。

（ＵＳＡ）７８．６６３３〜６６３７ （１９８］　）に記載の方法に従っ て、ハイブリダイゼーション溶 液中１０Ｏｎ９／ｄの濃度で、ビ オチニル化２′−デオキシウリジ ノー５′−三り／酸でニックトラ ンスレーションされ７’ＣｐＵＣｌ　９ＤＮＡ３００ｎ
９ｔ−加えた（米国メ リーランド州ガイサースバーグ、 ベテスダ・リサーチ・ラボラト リーズから購入したニックトラ ンスレーション用キットヲ使用）。

ハイブリダイゼーシヨ／は４２℃で１５時間行った。ハ
イブリダイゼーション溶液は６　Ｘ　５ＳＰＥ。

０、５　ｗ／ｖ％ＳＤＳおよびｌ　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄ
ｔ溶液であった。ハイブリダイゼーション後、フィルタ
ーを次のようにして洗浄した： フィルター１：　　ｚｘｓｓｃで室温、１５分、２回洗
う。

２ＸＳＳＣで室温、１５分、１ 回洗う。

フィルター２：　フィルター１と同じ。

フィルター３＝　　２×ＳＳＣおよびＱ、　ｌ　ｗ／ｖ
％ＳＤＳで室温、１５分、２回洗う。

２ｘＳＳＣおよび０．１　ｗ／ｖ％ＳＤＳで４２℃、１
５分、２回洗う。

２ＸＳＳＣで室温、１５分、１回洗 う。

ＳＳＣ，５ＳＰＥおよびＤｅｎｈａｒｄｔ溶液の内容は
核酸ハイブリダイゼーションの分野で知られている。

マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉθ）うのモレキュラーク
ローニンク：ラホラトリーマニュアル〔米国二ｊ−一ヨ
−り州コールド・スプリング・ハーバ−コールド・スプ
リング・ハーバ−・ラボラトリ−・プレス（１９８２）
）を参照されたい。

次に、フィルターはリアジーらの上記文献（１９８３）
　に記載の方法により製造したリポータ−グループとし
てのストレプトアビジン−ビオチニル化アルカリ性ホス
ファターゼ重合体により、比色定量指示（これもリアジ
ーらの上記文献に従って行われる）のための関連色素と
共にアルカリ性ホスファターゼの基質音用いて発色させ
た。

発色は１．５時間後に調べた。

試験フィルター（フィルター１）は１ｏｏｐｇのＤＮＡ
１２含むバンドまでハイブリダイゼーション全示し、陰
性対照フィルター（フィルター２）はハイブリ“グイゼ
ーションを全く示さず、そして陽性対照フィルター（フ
ィルター３）は１ｐ９のＤＮＡｙ含むバンドまでハイブ
リダイゼーションを示した。

の使用 本冥ｍ　例では、　ＰＡＥｓＡＴのようなアミノチアジ
アゾール−ペンゾールアミド誘導体で標識されたプロー
ブの使用を開示する。

実施例■の方法に従って、５′末端から数えて６位、２
０位、２８位および３４位にＮ−アミノシトシンを有す
るポリヌクレオチドＣ＝ｉ合成した。

実施例Ｘの方法により、実施例■で製造した式ＸＸＩＩ
のＰＡＢＳＡＴＩＪンヵーアルデヒドを用いて、Ｎ−ア
ばノシトシン含育ポリヌクレオチドＣ？ＰＡＢＳＡＴが
修飾シトシンのＮ４−アミン窒素に結合したプローブへ
転化した。

おり、他方はＥＢＶを含まない）から単離した。

各培養物からのタンバク質不含りへＡ約５μｇを、標準
プロッティング技法を用いて、予め湿らせた別々のニト
ロセルロースフィルターに固定した。

次に、これらのフィルターは実施例刈のようにしてプレ
ハイブリダイゼーションを行った。

その後、各フィルターは実施例刈のようにハイプリダイ
ゼーショ／溶液中３０Ｏｎ９／ｄの濃度の、ＰＡＢＳＡ
Ｔ−誘導体化ポリヌクレオチド０１μｌＪ−に用いてハ
イブリダイゼーションを行った。

ハイブリダイゼーション後、各フィルターをやはり実施
例刈のようにして洗浄した。

その後、フィルターはウシ赤血球炭酸脱水酵素Ｂについ
てのりアリ−らの上記文献（１９７８）記載のフルオレ
セイン−ジアセテート検定に基づいたリポータ−系を用
いて次のように発色させた。

ウシ赤血球炭酸脱水酵素Ｂは米国ミズーリ州セントルイ
ス、シグマ・ケミカル社から購入し、アームストロング
（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ）らのＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２４４．５１３７〜５１４９（１９６６）に記載の方法
により精製し次。この精製タンパク質はニブトンらの上
記文献の方法を用いて重合した。

プローブとハイブリダイズさせたフィルターはトリス緩
衝液（ｐＨ７，５）　中タンバク質重合体含有溶液（２
０μ９／ｒｒｔｌ）と室温で５分インキユイートシた。

インキュベーション後、フィルター’ｋｏ、０５Ｍ　＋
７７酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，８）　で５回洗い、Ｐ
ＡＢＳＡＴ　＠識を介してプローブに結合しなかつ次タ
ンパク質重合体を除いた。

最後に、フィルターは０．０５　Ｍリン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ６，８）　中１　ｍＭ　フルオレセインジアセ
テート含有溶液と室温で４時間インキュベートした。

フルオレセインジアセテートとのインキュベーション後
、ＥＢＶ　ＤＮＡ　１に含むフィルターは黄緑色の螢光
を発するが、他のフィルターは螢光を発しない。

前記実施例は本発明を例示するものであって、本発明の
範囲を限定するものではない。ここに記載の本発明の精
神および範囲に含まれる多くの修飾ならびに変更がこれ
らの実施例から可能であることは轟業者の認めるところ
である。

（外５名）

Claims (66)

【特許請求の範囲】
1. （１）式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼ I 〔式中Ｒ＿１は（ｉ）−Ｎ＝Ｃ（Ｒ＿２）−Ｒ＿５−Ｒ
   ＿６（ｉｉ）−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ＿２）−Ｒ＿５−Ｒ＿６
   または（ｉｉｉ）−ＮＨ（Ｃ＝Ｒ＿３）ＮＨ−Ｒ＿５−
   Ｒ＿６であり、ここでＲ＿２は水素または炭素原子数１
   〜４のアルキル基であり、Ｒ＿３は硫黄または酸素であ
   り、Ｒ＿５はリンカー成分であり、そしてＲ＿６は標識
   成分である〕 で表わされる修飾シトシン成分を含む核酸プローブ。
2. （２）ポリデオキシリボヌクレオチドである特許請求の
   範囲第１項記載のプローブ。
3. （３）ポリリボヌクレオチドである特許請求の範囲第１
   項記載のプローブ。
4. （４）Ｒ＿１は−Ｎ＝Ｃ（Ｈ）−Ｒ＿１＿５−Ｒ＿１＿
   ６であり、ここでＲ＿１＿６はビオチニル、イミノビオ
   チニルまたはスルフエニルビオチニルであり、Ｒ＿１＿
   ５は−（ＣＨ＿２）＿ｎ−Ｒ＿１＿５＿１−〔ここでＲ
   ＿１＿５＿１は−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ（Ｈ）−
   であつて−ＮＨ−を介してＲ＿１＿６に結合しており、
   ｎは２〜２０である〕であり；且つ約１２〜約１０００
   ０個の塩基を有する、特許請求の範囲第２項記載のプロ
   ーブ。
5. （５）Ｒ＿１＿６はビオチニルであり、Ｒ＿１＿５＿１
   は−ＮＨ−であり、そしてｎは５〜８である特許請求の
   範囲第４項記載のプローブ。
6. （６）Ｒ＿１は−Ｎ＝Ｃ（Ｈ）−Ｒ＿２＿５−Ｒ＿２＿
   ６であり、ここでＲ＿２＿６はアミノ基を介してＲ＿２
   ＿５に結合したＰＡＢＳＡＴ、アミノチアジアゾールま
   たはスルフアニルアミドであり、Ｒ＿２＿５は−（ＣＨ
   ＿２）＿ｐＣＯ−〔ここで−（ＣＨ＿２）＿ｐ−は−Ｎ
   ＝Ｃ（Ｈ）−に結合し、ｐは２〜２０である〕であり；
   且つ約１２〜約１００００個の塩基を有する、特許請求
   の範囲第２項記載のプローブ。
7. （７）ｐは５〜８である特許請求の範囲第６項記載のプ
   ローブ。
8. （８）Ｒ＿１は−Ｎ＝ＣＨ−Ｒ＿３＿５−Ｒ＿３＿６で
   あり、ここでＲ＿３＿６はフルオレセイン、テトラメチ
   ルローダミンまたはテトラエチルローダミンであり、Ｒ
   ＿３＿５は−（ＣＨ＿２）＿ｑ（ＮＨ）（Ｃ＝Ｒ＿３＿
   ７）（ＮＨ）−〔ここで−（ＣＨ＿２）＿ｑ−は−Ｎ＝
   ＣＨ−に結合し、ｑは２〜２０であり、Ｒ＿３＿７は硫
   黄または酸素である〕であり；且つ約１２〜約１０００
   ０個の塩基を有する、特許請求の範囲第２項記載のプロ
   ーブ。
9. （９）ｑは５〜８であり、Ｒ＿３＿７は硫黄である特許
   請求の範囲第８項記載のプローブ。
10. （１０）Ｒ＿１は−Ｎ＝Ｃ（Ｈ）−Ｒ＿１＿５−Ｒ＿１
    ＿６であり、ここでＲ＿１＿６はビオチニル、イミノビ
    オチニルまたはスルフエニルビオチニルであり、Ｒ＿１
    ＿５は−（ＣＨ＿２）＿ｎ−Ｒ＿１＿５＿１−〔ここで
    Ｒ＿１＿５＿１は−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ（Ｈ）
    −であつて−ＮＨ−を介してＲ＿１＿６に結合しており
    、ｎは２〜２０である〕であり；且つ約１２〜約１００
    ００個の塩基を有する、特許請求の範囲第３項記載のプ
    ローブ。
11. （１１）Ｒ＿１＿６はビオチニルであり、Ｒ＿１＿５＿
    １は−ＮＨ−であり、そしてｎは５〜８である特許請求
    の範囲第１０項記載のプローブ。
12. （１２）Ｒ＿１は−Ｎ＝Ｃ（Ｈ）−Ｒ＿２＿５−Ｒ＿２
    ＿６であり、ここでＲ＿２＿６はアミノ基を介してＲ＿
    ２＿５に結合したＰＡＢＳＡＴ、アミノチアジアゾール
    またはスルフアニルアミドであり、Ｒ＿２＿５は−（Ｃ
    Ｈ＿２）＿ｐＣＯ−〔ここで−（ＣＨ＿２）＿ｐ−は−
    Ｎ＝Ｃ（Ｈ）−に結合し、ｐは２〜２０である〕であり
    ；且つ約１２〜約１００００個の塩基を有する、特許請
    求の範囲第３項記載のプローブ。
13. （１３）ｐは５〜８である特許請求の範囲第１２項記載
    のプローブ。
14. （１４）Ｒ＿１は−Ｎ＝ＣＨ−Ｒ＿３＿５−Ｒ＿３＿６
    であり、ここでＲ＿３＿６はフルオレセイン、テトラメ
    チルローダミンまたはテトラエチルローダミンであり、
    Ｒ＿３＿５は−（ＣＨ＿２）＿ｑ（ＮＨ）（Ｃ＝Ｒ＿３
    ＿７）（ＮＨ）−〔ここで−（ＣＨ＿２）＿ｑ−は−Ｎ
    ＝ＣＨ−に結合し、ｑは２〜２０であり、Ｒ＿３＿７は
    硫黄または酸素である〕であり；且つ約１２〜約１００
    ００個の塩基を有する、特許請求の範囲第３項記載のプ
    ローブ。
15. （１５）ｑは５〜８であり、Ｒ＿３＿７は硫黄である特
    許請求の範囲第１４項記載のプローブ。
16. （１６）標的ＤＮＡまたはＲＮＡに関連した生物学的物
    質の存在について試料を検定する方法であつて、 （ｉ）試料の一本鎖核酸と、標的ＤＮＡまたはＲＮＡに
    特異的な核酸プローブとを組み合わせ、その場合前記プ
    ローブは式 I ： ▲数式、化学式、表等があります▼ I 〔式中Ｒ＿１は（ｉ）−Ｎ＝Ｃ（Ｒ＿２）−Ｒ＿５−Ｒ
    ＿６（ｉｉ）−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ＿２）−Ｒ＿５−Ｒ＿６
    または（ｉｉｉ）−ＮＨ（Ｃ＝Ｒ＿３）ＮＨ−Ｒ＿５−
    Ｒ＿６であり、ここでＲ＿２は水素または炭素原子数１
    〜４のアルキル基であり、Ｒ＿３は硫黄または酸素であ
    り、Ｒ＿５はリンカー成分であり、そしてＲ＿６は標識
    成分である〕 で表わされる修飾シトシン成分を含み、また、試料から
    の一本鎖核酸の誘導ならびにその一本鎖核酸とプローブ
    との組合せは、安定な二重らせんがプローブと試料中に
    存在する標的ＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも一部との
    間で形成されるが、プローブと非標的ＤＮＡまたはＲＮ
    Ａとの間では有意に形成されない条件下で行われ；そし
    て （ｉｉ）（ａ）工程（ｉ）で二重らせんを形成したプロ
    ーブから、二重らせんを形成しないプローブを分離し； （ｂ）標識成分の検出可能性がその標識へリポーターグ
    ループを結合することによりもたらされる場合、二重ら
    せんを形成したプローブと標識成分に結合するリポータ
    ーグループとを、そのリポーターグループが存在する標
    識成分の少なくとも一部に結合する条件下で組み合わせ
    、次いで斯く処理された生成物から実質的に全ての非結
    合リポーターグループを分離し； （ｃ）工程（ｉｉ）（ａ）および場合により工程（ｉｉ
    ）（ｂ）での処理の後、工程（ｉ）の生成物を処理して
    標識成分から、あるいは工程（ｉｉ）（ｂ）を行つた場
    合はリポーターグループから信号を発生させ；そして （ｄ）検出可能な信号が工程（ｉｉ）（ｃ）の処理によ
    り発生したかどうかを測定する； ことから成る上記検定方法。
17. （１７）プローブはポリデオキシリボヌクレオチドであ
    る特許請求の範囲第１６項記載の方法。
18. （１８）プローブはポリリボヌクレオチドである特許請
    求の範囲第１６項記載の方法。
19. （１９）Ｒ＿１は−Ｎ＝Ｃ（Ｈ）−Ｒ＿１＿５−Ｒ＿１
    ＿６であり、ここでＲ＿１＿６はビオチニル、イミノビ
    オチニルまたはスルフエニルビオチニルであり、Ｒ＿１
    ＿５は−（ＣＨ＿２）＿ｎ−Ｒ＿１＿５＿１−〔ここで
    Ｒ＿１＿５＿１は−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ（Ｈ）
    −であつて−ＮＨ−を介してＲ＿１＿６に結合し、ｎは
    ２〜２０である〕であり；プローブは約１２〜約１００
    ００個の塩基を有し；試料の一本鎖核酸はプローブとの
    組合せに先立つて固体支持体に固定され；ビオチニル、
    イミノビオチニルまたはスルフエニルビオチニルの検出
    可能性は複合タンパク質としてアビジンまたはストレプ
    トアビジンを含むリポーターグループをそれに結合させ
    ることによつてもたらされる、特許請求の範囲第１７項
    記載の方法。
20. （２０）Ｒ＿１＿６はビオチニルであり、Ｒ＿１＿５＿
    １は−ＮＨ−であり、ｎは５〜８であり、そして固体支
    持体はニトロセルロースである特許請求の範囲第１９項
    記載の方法。
21. （２１）Ｒ＿１は−Ｎ＝Ｃ（Ｈ）−Ｒ＿２＿５−Ｒ＿２
    ＿６であり、ここでＲ＿２＿６はアミノ基を介してＲ＿
    ２＿５に結合したＰＡＢＳＡＴ、アミノチアジアゾール
    またはスルフアニルアミドであり、Ｒ＿２＿５は−（Ｃ
    Ｈ＿２）＿ｐＣＯ−〔ここで−（ＣＨ＿２）＿ｐ−は−
    Ｎ＝Ｃ（Ｈ）−に結合し、ｐは２〜２０である〕であり
    ；試料の一本鎖核酸はプローブとの組合せに先立つて固
    体支持体に固定され；プローブは約１２〜約１００００
    個の塩基を有し；ＰＡＢＳＡＴ、アミノチアジアゾール
    またはスルフアニルアミドの検出可能性は複合タンパク
    質として炭酸脱水酵素を含むリポーターグループをそれ
    に結合させることによりもたらされる、特許請求の範囲
    第１７項記載の方法。
22. （２２）ｐは５〜８であり、固体支持体はニトロセルロ
    ースであり、リポーターグループは複合タンパク質とし
    て哺乳動物赤血球の炭酸脱水酵素Ｂを含む、特許請求の
    範囲第２１項記載の方法。
23. （２３）Ｒ＿１は−Ｎ＝ＣＨ−Ｒ＿３＿５−Ｒ＿３＿６
    であり、ここでＲ＿３＿６はフルオレセイン、テトラメ
    チルローダミンまたはテトラエチルローダミンであり、
    Ｒ＿３＿５は−（ＣＨ＿２）＿ｑ（ＮＨ）（Ｃ＝Ｒ＿３
    ＿７）（ＮＨ）−〔ここで−（ＣＨ＿２）＿ｑ−は−Ｎ
    ＝ＣＨ−に結合し、ｑは２〜２０であり、Ｒ＿３＿７は
    硫黄または酸素である〕であり；試料の一本鎖核酸はプ
    ローブとの組合せに先立つて固体支持体に固定され；プ
    ローブは約１２〜約１００００個の塩基を有し；そして
    フルオレセイン、テトラメチルローダミンまたはテトラ
    エチルローダミン標識成分はリポーターグループと結合
    することなく螢光分光法により検出される、特許請求の
    範囲第１７項記載の方法。
24. （２４）ｑは５〜８であり、Ｒ＿３＿７は硫黄である特
    許請求の範囲第２３項記載の方法。
25. （２５）Ｒ＿１は−Ｎ＝Ｃ（Ｈ）−Ｒ＿１＿５−Ｒ＿１
    ＿６であり、ここでＲ＿１＿６はビオチニル、イミノビ
    オチニルまたはスルフエニルビオチニルであり、Ｒ＿１
    ＿５は−（ＣＨ＿２）＿ｎ−Ｒ＿１＿５＿１−〔ここで
    Ｒ＿１＿５＿１は−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ（Ｈ）
    −であつて−ＮＨ−を介してＲ＿１＿６に結合し、ｎは
    ２〜２０である〕であり；プローブは約１２〜約１００
    ００個の塩基を有し；試料の一本鎖核酸はプローブとの
    組合せに先立つて固体支持体に固定され；ビオチニル、
    イミノビオチニルまたはスルフエニルビオチニルの検出
    可能性は複合タンパク質としてアビジンまたはストレプ
    トアビジンを含むリポーターグループをそれに結合させ
    ることによつてもたらされる、特許請求の範囲第１８項
    記載の方法。
26. （２６）Ｒ＿１＿６はビオチニルであり、Ｒ＿１＿５＿
    １は−ＮＨ−であり、ｎは５〜８であり、そして固体支
    持体はニトロセルロースである特許請求の範囲第２５項
    記載の方法。
27. （２７）Ｒ＿１は−Ｎ＝Ｃ（Ｈ）−Ｒ＿２＿５−Ｒ＿２
    ＿６であり、ここで、Ｒ＿２＿６はアミノ基を介してＲ
    ＿２＿５に結合したＰＡＢＳＡＴ、アミノチアジアゾー
    ルまたはスルフアニルアミドであり、Ｒ＿２＿５は−（
    ＣＨ＿２）＿ｐＣＯ−〔ここで−（ＣＨ＿２）＿ｐ−は
    −Ｎ＝Ｃ（Ｈ）−に結合し、ｐは２〜２０である〕であ
    り；試料の一本鎖核酸はプローブとの組合せに先立つて
    固体支持体に固定され；プローブは約１２〜約１０００
    ０個の塩基を有し；ＰＡＢＳＡＴ、アミノチアジアゾー
    ルまたはスルフアニルアミドの検出可能性は複合タンパ
    ク質として炭酸脱水酵素を含むリポーターグループをそ
    れに結合させることによりもたらされる、特許請求の範
    囲第１８項記載の方法。
28. （２８）ｐは５〜８であり、固体支持体はニトロセルロ
    ースであり、リポータグループは複合タンパク質として
    哺乳動物赤血球の炭酸脱水酵素Ｂを含む、特許請求の範
    囲第２７項記載の方法。
29. （２９）Ｒ＿１は−Ｎ＝ＣＨ−Ｒ＿３＿５−Ｒ＿３＿６
    であり、ここでＲ＿３＿６はフルオレセイン、テトラメ
    チルローダミンまたはテトラエチルローダミンであり、
    Ｒ＿３＿５は−（ＣＨ＿２）＿ｑ（ＮＨ）（Ｃ＝Ｒ＿３
    ＿７）（ＮＨ）−〔ここで−（ＣＨ＿２）＿ｑ−は−Ｎ
    ＝ＣＨ−に結合し、ｑは２〜２０であり、Ｒ＿３＿７は
    硫黄または酸素である〕であり；試料の一本鎖核酸はプ
    ローブとの組合せに先立つて固体支持体に固定され；プ
    ローブは約１２〜約１００００個の塩基を有し；そして
    フルオレセイン、テトラメチローダミンまたはテトラエ
    チルローダミン標識成分はリポーターグループと結合す
    ることなく螢光分光法により検出される、特許請求の範
    囲第１８項記載の方法。
30. （３０）ｑは５〜８であり、Ｒ＿３＿７は硫黄である特
    許請求の範囲第２９項記載の方法。
31. （３１）式ＬＩＩ： ▲数式、化学式、表等があります▼ＬＩＩ 〔式中Ｒ＿５＿１は−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ
    ＿５＿１＿１）−（ここでアミノ基はカルボニル基に結
    合し、Ｒ＿５＿１＿１は水素または炭素原子数１〜４の
    アルキル基である）であり；Ｒ＿５＿２は−ＣＯ＿２Ｒ
    ＿５＿３、−（ＣＯ）Ｒ＿５＿４、▲数式、化学式、表
    等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼ま
    たは▲数式、化学式、表等があります▼ （ここでＲ＿５＿３は炭素原子数１〜５のアルキル基で
    あり；Ｒ＿５＿４は水素、炭素原子数１〜５のアルキル
    基またはクロルであり；Ｒ＿５＿５、Ｒ＿５＿６および
    Ｒ＿５＿７は同一かまたは異なり、それぞれ炭素原子数
    １〜６のアルキル基であり；Ｒ＿５＿８およびＲ＿５＿
    ９は同一かまたは異なり、それぞれ炭素原子数１〜５の
    アルキル基であり；Ｒ＿６＿０は炭素原子数２または３
    のアルキル基である）であり；ｍは２〜２０であり；Ｘ
    ＿５＿０はＳまたはＳ＝Ｏであり；そしてＸ＿５＿２は
    ＯまたはＮＨである〕 で表わされる化合物。
32. （３２）Ｒ＿５＿２は−ＣＨＯである特許請求の範囲第
    ３１項記載の化合物。
33. （３３）Ｒ＿５＿１は−ＮＨ−である特許請求の範囲第
    ３２項記載の化合物。
34. （３４）Ｘ＿５＿０はＳであり、Ｘ＿５＿２はＯである
    特許請求の範囲第３３項記載の化合物。
35. （３５）ｍは５〜８である特許請求の範囲第３４項記載
    の化合物。
36. （３６）Ｒ＿５＿２は−ＣＯＣｌ、 ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学
    式、表等があります▼ である特許請求の範囲第３１項記載の化合物。
37. （３７）Ｒ＿５＿１は−ＮＨ−である特許請求の範囲第
    ３６項記載の化合物。
38. （３８）Ｘ＿５＿０はＳであり、Ｘ＿５＿２はＯである
    特許請求の範囲第３７項記載の化合物。
39. （３９）ｍは５〜８である特許請求の範囲第３８項記載
    の化合物。
40. （４０）式ＸＸＸＶ： Ｒ＿３＿２（ＣＯ）（ＣＨ＿２）＿ｋＲ＿３＿４　ＸＸ
    ＸＶ〔式中Ｒ＿３＿２は ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、
    表等があります▼、 または▲数式、化学式、表等があります▼ （ここでＸ＿３＿２は水素、ハロゲンまたは−ＮＯ＿２
    である）であり、Ｒ＿３＿４は−ＣＨＯまたは ▲数式、化学式、表等があります▼（ここでＲ＿６＿０
    は炭素原子数２または３のアルキル基である）であり、
    そしてｋは２〜２０である〕 で表わされる化合物。
41. （４１）ｋは５〜８である特許請求の範囲第４０項記載
    の化合物。
42. （４２）Ｒ＿３＿２は▲数式、化学式、表等があります
    ▼ である特許請求の範囲第４１項記載の化合物。
43. （４３）式ＸＬVIII： Ｒ＿４＿５（ＮＨ）（Ｃ＝Ｒ＿４＿６）（ＮＨ）（ＣＨ
    ＿２）＿ｊＲ＿４＿８　ＸＬVIII〔式中Ｒ＿４＿５はフ
    ルオレセイン、テトラメチルローダミンまたはテトラエ
    チルローダミンであり、Ｒ＿４＿６は酸素または硫黄で
    あり；Ｒ＿４＿８は−ＣＨＯまたは ▲数式、化学式、表等があります▼（ここでＲ＿６＿０
    は炭素原子数２または３のアルキル基である）であり、
    そしてｊは２〜２０である〕 で表わされる化合物。
44. （４４）ｊは５〜８である特許請求の範囲第４３項記載
    の化合物。
45. （４５）Ｒ＿４＿６は硫黄である特許請求の範囲第４４
    項記載の化合物。
46. （４６）式ＬIX： ▲数式、化学式、表等があります▼ＬIX 〔式中Ｘ＿５＿０はＳまたはＳ＝Ｏであり；Ｘ＿５＿２
    はＯまたはＮＨであり；Ｒ＿５＿１は−ＮＨ−または−
    ＮＨ−Ｎ＝Ｃ（Ｒ＿５＿１＿１）−（ここでアミノ基は
    カルボニル基に結合し、Ｒ＿５＿１＿１は水素または炭
    素原子数１〜４のアルキル基である）であり；そしてｍ
    は２〜２０である〕で表わされる修飾シトシン成分を含
    む核酸プローブの製造方法であつて、 プローブと同じ塩基配列を有し且つＮ＾４−アミノシト
    シン成分を含む核酸を、式ＬＸ： ▲数式、化学式、表等があります▼ＬＸ （式中Ｘ＿５＿０、Ｘ＿５＿２、Ｒ＿５＿１およびｍは
    式ＬＸの化合物について先に定義した通りである）の化
    合物と反応させることから成る上記方法。
47. （４７）核酸は約１２〜約１００００個の塩基から成る
    ＤＮＡであり、そのＤＮＡのシトシンの約１０〜約６０
    ％がＮ＾４−アミノシトシンへ修飾される、特許請求の
    範囲第４６項記載の方法。
48. （４８）Ｒ＿５＿１は−ＮＨ−である特許請求の範囲第
    ４７項記載の方法。
49. （４９）Ｘ＿５＿０はＳであり、Ｘ＿５＿２はＯである
    特許請求の範囲第４８項記載の方法。
50. （５０）ｍは５〜８である特許請求の範囲第４９項記載
    の方法。
51. （５１）核酸は約１２〜約１００００個の塩基から成る
    ＲＮＡであり、そのＲＮＡのシトシンの約１０〜約６０
    ％がＮ＾４−アミノシトシンへ修飾される、特許請求の
    範囲第４６項記載の方法。
52. （５２）Ｒ＿５＿１は−ＮＨ−である特許請求の範囲第
    ５１項記載の方法。
53. （５３）Ｘ＿５＿０はＳであり、Ｘ＿５＿２はＯである
    特許請求の範囲第５２項記載の方法。
54. （５４）ｍは５〜８である特許請求の範囲第５３項記載
    の方法。
55. （５５）式ＬVII： ▲数式、化学式、表等があります▼ＬVII 〔式中Ｒ＿３＿２は ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、
    表等があります▼ または▲数式、化学式、表等があります▼ （ここでＸ＿３＿２は水素、ハロゲンまたは−ＮＯ＿２
    である）であり；ｋは２〜２０である〕 で表わされる修飾シトシン成分を含む核酸プローブの製
    造方法であつて、 プローブと同じ塩基配列を有し且つＮ＾４−アミノシト
    シン成分を含む所定量の核酸を、式ＸＸＸIV：Ｒ＿３＿
    ２（ＣＯ）（ＣＨ＿２）＿ｋＣＨＯ　ＸＸＸIV（式中Ｒ
    ＿３＿２およびｋは式ＬVIIの化合物について先に定義
    した通りである）の化合物と反応させることから成る上
    記方法。
56. （５６）核酸は約１２〜約１００００個の塩基から成る
    ＤＮＡであり、そのＤＮＡに含まれるシトシンの約１０
    〜約６０％がＮ＾４−アミノシトシンへ修飾される、特
    許請求の範囲第５５項記載の方法。
57. （５７）核酸は約１２〜約１００００個の塩基から成る
    ＲＮＡであり、そのＲＮＡに含まれるシトシンの約１０
    〜約６０％がＮ＾４−アミノシトシンへ修飾される、特
    許請求の範囲第５５項記載の方法。
58. （５８）Ｒ＿３＿２は ▲数式、化学式、表等があります▼ である特許請求の範囲第５６項記載の方法。
59. （５９）ｋは５〜８である特許請求の範囲第５８項記載
    の方法。
60. （６０）Ｒ＿３＿２は ▲数式、化学式、表等があります▼ である特許請求の範囲第５７項記載の方法。
61. （６１）ｋは５〜８である特許請求の範囲第６０項記載
    の方法。
62. （６２）式ＬＸII： ▲数式、化学式、表等があります▼ＬＸII （式中Ｒ＿４＿５はフルオレセイン、テトラメチルロー
    ダミンまたはテトラエチルローダミンであり；Ｒ＿４＿
    ６は酸素または硫黄であり；そしてｑは２〜２０である
    ） で表わされる修飾シトシン成分を含む核酸プローブの製
    造方法であつて、 プローブと同じ塩基配列を有し且つＮ＾４−アミノシト
    シン成分を含む所定量の核酸を、式ＬＸIII：Ｒ＿４＿
    ５（ＮＨ）（Ｃ＝Ｒ＿４＿６）（ＮＨ）（ＣＨ＿２）＿
    ｑＣＨＯ　ＬＸIII（式中Ｒ＿４＿５、Ｒ＿４＿６およ
    びｑは式ＬＸIIの化合物について先に定義した通りであ
    る）の化合物と反応させることから成る上記方法。
63. （６３）核酸は約１２〜約１００００個の塩基から成る
    ＤＮＡであり、そのＤＮＡに含まれるシトシンの約１０
    〜約６０％がＮ＾４−アミノシトシンへ修飾される、特
    許請求の範囲第６２項記載の方法。
64. （６４）核酸は約１２〜約１００００個の塩基から成る
    ＲＮＡであり、そのＲＮＡに含まれるシトシンの約１０
    〜約６０％がＮ＾４−アミノシトシンへ修飾される、特
    許請求の範囲第６２項記載の方法。
65. （６５）Ｒ＿４＿６は硫黄であり、ｑは５〜８である特
    許請求の範囲第６３項記載の方法。
66. （６６）Ｒ＿４＿６は硫黄であり、ｑは５〜８である特
    許請求の範囲第６４項記載の方法。